遺伝子組換え抗体の製造方法
【課題】 親和性が高い特徴を有するウサギモノクローナル抗体を、ウサギミエローマ細胞を使用することなく製造すること。
【解決の手段】 抗原を免疫したウサギから抗体産生細胞を単離後、目的とする抗体遺伝子を保有する細胞を増殖させてから選別し、選別した細胞から重鎖および軽鎖の抗体遺伝子を単離、増幅し、発現ベクターに導入後、ホスト細胞に導入することで遺伝子組換えウサギモノクローナル抗体を発現させる遺伝子組換え抗体の製造を可能にした。
【解決の手段】 抗原を免疫したウサギから抗体産生細胞を単離後、目的とする抗体遺伝子を保有する細胞を増殖させてから選別し、選別した細胞から重鎖および軽鎖の抗体遺伝子を単離、増幅し、発現ベクターに導入後、ホスト細胞に導入することで遺伝子組換えウサギモノクローナル抗体を発現させる遺伝子組換え抗体の製造を可能にした。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組換えウサギモノクローナル抗体の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体はその特異性と親和性の高さから、ある特定の物質を検出するための実験用試薬としてだけではなく、がん治療用医薬品、免疫診断薬の中核材料として広く利用されている。
【０００３】
モノクローナル抗体といえば、マウス由来のモノクローナル抗体が一般には認知されている。通常の実験で使用する抗体あるいは免疫測定試薬であればマウス由来のモノクローナル抗体が有する親和性の程度で十分な場合が多い。しかし、免疫診断薬のような、測定感度の高感度化が近年ますます要求されている領域では、マウス由来モノクローナル抗体では親和性が足りない場合がある。たとえば競合法においては、抗体の親和性が高くなるほど検出感度が高くなることは、理論的に証明することができ、高感度競合法を構築するためには、親和性の高い抗体が必要となる。また、サンドイッチ法でも、親和性の高い抗体により、微量の抗原を検出できるようになり、高感度測定系が構築できる。
【０００４】
たとえば、ステロイドは低分子であるため、競合法で測定されている。特にステロイド類の中でもエストラジオール（Ｅ２）は、高感度測定系が要求されており、親和性の高い抗体の要求が強い。
【０００５】
マウス以外の種々のモノクローナル抗体も報告されており、非特許文献１で紹介されているように、体の大きい動物種から抗体をとれば親和性の高い抗体が単離される傾向にある。しかしながら、同じ動物種に同じ抗原を免疫しても、個体差の影響が大きく、得られる抗血清も異なるため、親和性の高い抗体を単離するためには、少なくとも数匹以上の個体に抗原を免疫し、免疫応答の高い個体からモノクローナル抗体を単離する必要がある。そのため、現実的には免疫動物としてウサギが選ばれる。また、ウサギは免疫診断薬用の抗血清にウサギの血清がよく利用されていることからも、免疫動物種としては適していると考えられる。
【０００６】
マウスモノクローナル抗体の製造方法は確立されており、以下に示す方法で製造している。まず、抗原を免疫したマウスの脾臓細胞（抗体産生細胞）をマウスミエローマ細胞（骨髄腫細胞）と細胞融合させ、無限増殖能を持ち、かつ、目的抗体を産生するハイブリドーマを作製する。その後、当該細胞を培養し産生された抗体を精製して、マウスモノクローナル抗体を製造する。
【０００７】
ウサギモノクローナル抗体も理論上はマウスモノクローナル抗体の製造方法と同様な方法で生産できる。しかしながら、抗体産生細胞と細胞融合させるのに用いるウサギミエローマ細胞（非特許文献２）が、マウスミエローマ細胞とは異なり、一般には流通していないため、マウスモノクローナル抗体の製造方法と同様な方法で生産できる施設は限られており、通常の実験室レベルでは当該方法によりウサギモノクローナル抗体を製造することは出来ない。このため、ウサギミエローマ細胞を用いずに、ウサギモノクローナル抗体を生産する方法について、これまでいくつか検討されている。
【０００８】
まず、ウサギ抗体産生細胞をマウスミエローマ細胞と融合する方法がある。しかしながら、当該方法は異種動物間の融合であり、融合効率が低いため、得られるハイブリドーマ数は少なく、また得られたハイブリドーマも、短期間のうちに抗体生産能力が消失する（非特許文献３、４）。さらに、ウサギ血清の存在下で当該融合細胞を培養することで抗体生産能力を維持可能との報告もあるが、生産されたモノクローナル抗体の精製が困難であり、長期間の抗体生産性についての報告もない（非特許文献５）。
【０００９】
次に、抗原を免疫したウサギ脾臓から重鎖（Ｈ鎖）および軽鎖（Ｌ鎖）の抗体遺伝子を単離、増幅後、ウサギ抗体ライブラリーを作製し、ファージディスプレイ法などにより、ウサギ抗体を単離する方法が報告されている（非特許文献６から８）。しかし本方法によると、ライブラリーから抗体を選別する過程において「パニング」という操作が必須となる。当該操作を簡単に述べると、抗原が固定化された水不溶性担体をライブラリーに接触させ、抗原に結合した抗体を回収する。その後抗原に結合した抗体を何らかの方法で増幅させ新たなライブラリーを作製し、さらに抗原を固定化した水不溶性担体と反応させる操作を繰り返す。当該操作により、抗原と結合する抗体は濃縮され、最終的に抗原に結合する抗体を単離することができる。しかしながら、抗原抗体反応が平衡反応である以上、抗原と抗体の結合には濃度の影響をうける。例えばライブラリーの中に微量しか存在しない親和性の高い抗体を選択的に濃縮してくることは原理上不可能である。また、一般的に親和性の高い抗体を得るためには、抗体が本来ウサギの作製したＨ鎖とＬ鎖の組み合わせである必要があるが、当該操作によって得られる抗体は、本来ウサギの作製したＨ鎖とＬ鎖の組み合わせが再現される可能性が極めて低いため、当該操作で親和性が向上した抗体を回収するのは極めて困難である。
【００１０】
上記方法以外には、ウサギ抗体産生細胞を軟寒天培地中で保持した後、赤血球溶血法により目的抗体を発現している抗体産生細胞を探し、一個の抗体産生細胞から抗体遺伝子を単離し、遺伝子組換え抗体として作製する方法がある（非特許文献９）。当該方法を用いることで本来ウサギの作製したＨ鎖とＬ鎖の組み合わせを再現できるが、極めて高い抗体性能（親和性、特異性、保存安定性、生産性など）が要求される免疫診断薬で使用するような抗体は簡単に得られるものではない。つまり、単に抗原に結合するウサギモノクローナル抗体を単離するのであれば非特許文献９の方法でも良いが、免疫診断薬で使用可能な性能の高いモノクローナル抗体を単離しようと、数千から数万クローンの遺伝子組換え抗体を作製しても、目的とする抗体を単離できる保障はない。さらに、上記作業を行なうには、膨大な実験工数を必要とするため、現実的に実施は困難である。また、一個の細胞から遺伝子を単離するため、抗体を発現している細胞を見つけても抗体遺伝子の増幅効率は低く、非特許文献９で報告されている抗体遺伝子の増幅確率はＨ鎖で２７％、Ｌ鎖で５５％程度である。
【００１１】
以上より、ウサギモノクローナル抗体の性能が高いことは報告されているものの、ウサギモノクローナル抗体自体はウサギミエローマ細胞を有する一部の施設でしか生産できないため、当該抗体の工業的な利用を困難にしていた。
【００１２】
【特許文献１】特開平１０−２６２６５７号
【非特許文献１】Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１９、２０１；２０００
【非特許文献２】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２，９３４８；１９９５
【非特許文献３】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、５８、１１０４；１９６７
【非特許文献４】Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５４，１０９５；１９６６
【非特許文献５】Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０、１７８８；１９８８
【非特許文献６】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５、１３６６８；２０００
【非特許文献７】Ｇｅｎｅ、１７２、２９５；１９９６
【非特許文献８】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ．、２１３、２０１；１９９８
【非特許文献９】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、７８４３；１９９６
【非特許文献１０】Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，”Ｔｈｅ ＥＢＶ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｉｔｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ” Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ Ｉｎｃ．７７−９６；１９８５
【非特許文献１１】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２、３９３５；１９９４
【非特許文献１２】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３２５、３２５；２００３
【非特許文献１３】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１３、６１７１；１９９５
【非特許文献１４】Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１５、６１７１；１９８７
【非特許文献１５】Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１０、１５３５；１９８２
【非特許文献１６】Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０８、６７３；１９９０
【非特許文献１７】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１７、１３５；１９９５
【非特許文献１８】Ｊ．Ｆｅｒｍ．Ｂｉｏｅｎｇ．、７９、４０５；１９９５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明が解決しようとする課題は、ウサギミエローマ細胞を有する特定の機関でのみ作製可能であったウサギモノクローナル抗体を、通常の実験施設と分子生物学の知識があれば製造できる技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を鑑みてなされた本発明は、以下の発明を包含する。
【００１５】
第一の発明は、抗原を免疫したウサギから抗体産生細胞を単離し、目的とする抗体遺伝子を保有する細胞を選別し、選別した細胞から重鎖および軽鎖の抗体遺伝子を単離、増幅し、発現ベクターに導入後、ホスト細胞に導入することで遺伝子組換えウサギモノクローナル抗体を発現させる遺伝子組換え抗体の製造方法において、目的とする抗体遺伝子を保有する細胞を選別するにあたり、抗体産生細胞を増殖させてから選別することを特徴とする、遺伝子組換え抗体の製造方法である。
【００１６】
第二の発明は、選別した細胞から重鎖および軽鎖の抗体遺伝子を単離する操作を、選別した細胞から抗体遺伝子の脱落が起きない期間内で実施することを特徴とする、第一の発明に記載の遺伝子組換え抗体の製造方法である。
【００１７】
第三の発明は、選別した細胞から重鎖および軽鎖の抗体遺伝子を単離する操作を、抗体産生細胞増殖開始後１４日以内に実施することを特徴とする、第一の発明に記載の遺伝子組換え抗体の製造方法である。
【００１８】
第四の発明は、抗体産生細胞が、抗原を免疫したウサギの脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞のいずれかであることを特徴とする、第一から第三の発明に記載の遺伝子組換え抗体の製造方法である。
【００１９】
第五の発明は、抗体産生細胞を増殖させる方法が、抗体産生細胞を培地中で培養する方法であることを特徴とする、第一から第四の発明に記載の遺伝子組換え抗体の製造方法である。
【００２０】
第六の発明は、抗体産生細胞を増殖させる方法が、不死化能を与えることのできる細胞を融合させて培養する方法であることを特徴とする、第一から第四の発明に記載の遺伝子組換え抗体の製造方法である。
【００２１】
第七の発明は、ウサギに免疫する抗原が、ハプテンまたはペプチドであることを特徴とする、第一から第六の発明に記載の遺伝子組換え抗体の製造方法である。
【００２２】
第八の発明は、ホスト細胞が動物細胞であることを特徴とする、第一から第七の発明に記載の遺伝子組換え抗体の製造方法である。
【００２３】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２４】
（１）抗原の種類
ウサギに免疫する抗原は、特に限定されず、ハプテン、ペプチド、タンパク質、核酸、細胞、脂質、糖鎖、細菌、蛍光物質、ビタミン類の中から任意に選択することができるが、特に、親和性および特異性などにおいて高い抗体性能が要求される抗原に対して本発明を適用するのが好ましい。具体的には、測定原理上高感度測定系を構築するために高い親和性が要求される競合法用の抗原、例えば、エストロン（Ｅ１）、エストラジオール（Ｅ２）、エストリオール（Ｅ３）、プロゲステロン、コルチゾールなどのステロイドホルモン類、サイロニン、サイロキシン、トリヨードサイロニンなどの甲状腺ホルモン類といったハプテンがあげられる。また、競合法用の抗原以外でも、例えば、Ｃペプチド、および脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）といった、高感度が要求されるペプチドへの適用も好ましい一例である。
【００２５】
（２）抗原免疫方法
抗原を免疫するウサギは、抗原の種類によって免疫応答は異なるため、できるだけ多くの系統と匹数に免疫するのが好ましい。ウサギの系統としては、一般に入手可能な日本白色種、およびニュージーランドホワイトが例示されるが、当該系統に限定されるものではない。また、同じ系統のウサギを用いても個体差があるため数匹から１０匹程度の個体に免疫することで、免疫応答の高いウサギ由来の抗体産生細胞を入手するのが好ましい。
【００２６】
ウサギへの免疫方法は特に限定されるものではなく、通常一般的に行なわれている方法で免疫すればよい。例えば、アジュバントとエマルジョンを作製し免疫する方法やタンパク質あるいはペプチドをコードしているＤＮＡを免疫する方法があげられる。
【００２７】
免疫場所も特に限定されない。皮下、腹腔、フットパットといった通常行なわれている場所でウサギに免疫すればよい。
【００２８】
免疫回数は、抗原の種類およびウサギへの応答性によって変動があるため、ＥＬＩＳＡ法あるいはＢＩＡｃｏｒｅ（商品名）（ビアコア社製）で測定することで血清の抗体価を解析し、当該血清の経過を観察して決定するのが好ましい。通常は４回程度の免疫で良いが、場合によってはさらに複数回（期間にして数ヶ月から１年間程度）の免疫が必要な場合もある。
【００２９】
（３）抗体産生細胞の単離
単離の対象となる抗体産生細胞は、抗体を産生する細胞であれば特に限定はされないが、脾臓由来の細胞、リンパ節由来の細胞、末梢血由来の細胞のいずれかを使うのが好ましい。また、抗体産生細胞の単離は通常実施されている方法で実施すればよい。単離した細胞はすぐに使用するのが好ましいが、一般的に入手できる細胞保存溶液中に分散させた状態で、液体窒素あるいはディープフリーザー中で保存することが可能であり、必要に応じて使用することが出来る。
【００３０】
（４）抗体産生細胞の選別
上記（３）で単離した抗体産生細胞から目的とする抗体遺伝子を保有する細胞を選別する必要がある。選別方法としては、非特許文献９にあるように、抗体を産生している細胞から一個の細胞を選別し、選別した細胞から抗体遺伝子を単離、増幅させる方法があるが、当該選別方法では抗原結合能しか評価ができないため、目的の性能を有した抗体を取得するのは困難である。そのため、本発明では、（３）で単離した抗体産生細胞を増殖させ、培養上清中に発現した抗体の有する競合特性、特異性、反応性といった性能を評価し、当該性能が高い抗体を発現している細胞を選別後、抗体遺伝子を単離することを特徴としている。
【００３１】
本発明の製造方法における、抗体産生細胞の増殖方法としては以下の方法が例示できる。
【００３２】
ａ）マイクロウエルプレート中にて、抗体産生細胞を増殖用培地で培養上清中の抗体
性能が評価できるまで培養する方法。
【００３３】
ｂ）通常のハイブリドーマを得る方法のように、抗体産生細胞に不死化能を与えるよ
うな細胞と融合させることで、培養上清中の抗体性能を評価する方法。
【００３４】
ｃ）エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）などのウイルスにより抗体産生細胞を不
死化し培養することで、抗体遺伝子を単離する細胞を選別する方法。
このうち、ａ）またはｂ）の方法を用いて増殖させる方法が好ましい。
【００３５】
ａ）の増殖方法で用いる培地としては、通常用いられる動物細胞用の培地、あるいはＩＬ−４やＬＰＳといった通常よく知られているサイトカイン類を添加した培地が使用できる。
【００３６】
ｂ）の増殖方法で用いる不死化能を与える細胞としては、融合後に抗体を分泌できる融合細胞が得られる細胞であり、かつ、増殖後、抗体の性能を評価した時点で融合細胞中に抗体遺伝子が残存している細胞であれば限定はされないが、抗体産生能を長期間維持できる融合細胞が得られる細胞が特に好ましい。不死化能を与える細胞としては、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）、Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１（ＪＣＲＢ ０００９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（ＪＣＲＢ ９０８５）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８、６５３（ＪＣＲＢ ００２８）、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ−１４（ＪＣＲＢ ００２９）、ＮＳＯ／Ｕ（ＲＣＢ ０２１３）、Ｓ１９４／５ＸＸＯ、ＢＵ１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−８８３７）、ＦＯ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６４６）といったマウスミエローマ関連の細胞や、ＳＫ０−００７、ＨＯ−３２３といったヒト骨髄腫細胞株、ＧＭ１５００ ６ＧＴ−Ａｌ２といったヒトＢ細胞株、Ｙ３−Ａｇ１・２・３といったラット骨髄腫細胞株、ＴＰ−３のウサギ形質転換細胞株、ＶＸ−２といったウサギがん細胞を例示することができる。また、マウスミエローマ細胞株を出発とした細胞株（たとえば特許文献１に記載の２−３Ａ）も、本発明における、好ましい不死化能を与える細胞の一例である。
【００３７】
ｂ）の増殖方法で用いる細胞融合方法は、通常用いられる方法で実施すればよく、例えば、ポリエチレングリコール法、電気融合法、センダイウイルスを用いる方法をあげることができる。
【００３８】
ｃ）の増殖方法は、当業者によく知られている、ヒトリンパ球にＥＢＶなどのウイルスを感染させて増殖させる（非特許文献１０）のと同様な手法で、抗体生産能を有するウサギＢ細胞にＥＢＶなどのウイルスを感染させ、一時的に不死化させる方法である。なお、ウサギＢ細胞に感染させるウイルスとしては前記目的を達成できるものであれば良く、特にＥＢＶに限定されるものではない。
【００３９】
（５）抗体性能の評価方法
抗体遺伝子を保有する細胞を選別するための抗体性能の評価方法は、対象抗体の評価内容に応じて適宜選択すればよい。例えば、評価内容としては、抗原結合能、競合特性、特異性、抗体生産性があげられ、評価方法としてはＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光偏光法をあげることができる。
【００４０】
（６）抗体遺伝子の単離時期
上記（４）で選別した細胞から重鎖（Ｈ鎖）および軽鎖（Ｌ鎖）の抗体遺伝子を単離する時期としては、抗原およびウサギの系統によって最適時期が異なるため、培養上清中に評価するための十分な抗体量が確保でき、かつ、抗体遺伝子の脱落が起きない期間であれば特に限定されないが、実施例１２にあるように抗体産生細胞増殖開始後１６日後で抗体遺伝子を単離すると、抗体遺伝子の増幅効率、および抗原結合活性を持った発現ベクターの取得率が低下していることから、抗体遺伝子の単離は抗体産生細胞増殖開始後１４日以内に実施するのが好ましい。
【００４１】
（７）抗体遺伝子の増幅方法
抗体遺伝子の増幅方法としては通常用いられるＲＴ−ＰＣＲ法が使用できる。また、ＲＴ−ＰＣＲ反応の際に用いる逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼは通常市販の酵素が使用できるが、特にＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡ増幅の際、変異が導入されるのを避けるため、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名）（第一化学薬品社製）やＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名）（タカラバイオ社製）といったフィデリティーの高い酵素を使用するのが好ましい。
【００４２】
抗体遺伝子を増幅するためのプライマーは、抗体の可変領域をコードする領域が増幅されるような位置に設計してあれば、特に場所は限定されない。抗体遺伝子を増幅するために用いるプライマーの組み合わせとしては、抗体遺伝子の全長を増幅することを目的とした開始コドンより上流と終始コドンより下流の非翻訳領域に設計したプライマーの組み合わせ、抗体遺伝子の可変領域を増幅することを目的とした抗体遺伝子内部に設計したプライマーの組み合わせ、あるいは上記プライマーを適宜組み合わせた系を例示することができる。なお、一回のＰＣＲ反応で抗体遺伝子の増幅効率が低い場合には、１回目のＰＣＲ反応産物を鋳型とし、２回目のＰＣＲ反応を行うことで効率よく抗体遺伝子を増幅することが出来る。この際１回目の増幅領域の少し内側に新たなプライマーを作製するほうが効率よく遺伝子を増幅することが出来る場合が多いが、それに限定されるものではない。
【００４３】
また、ウサギＨ鎖は８割以上でＶＨ１を使用していること（非特許文献１１）、およびＬ鎖は８割以上がκ鎖であることが報告されていること（非特許文献１２）から、それぞれの遺伝子に特異的なプライマーセットを用いて増幅するのが好ましい。さらに、抗体遺伝子を増幅するためのプライマーの一態様として、非特許文献１０及び１３から１５に記載のプライマー配列、およびＧｅｎＢａｎｋを参考に設計したプライマー配列（配列番号１から１１）を開示するが、上記目的を達成できるものであれば、他の配列を用いてもかまわない。
【００４４】
（８）発現ベクター
発現用ベクターについては、一般的に報告されているベクターであれば限定されないが、特にｐＥＣＥｄｈｆｒ（非特許文献１６、図４）を発現ベクターとして使用するのが好ましい。また、発現させる抗体の領域も、抗体の可変領域を含むように発現させればよく、発現の形としてはＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ＦＶ、ｓｃＦＶが例示できる。また、単離した抗体遺伝子を出発材料として、種々のアミノ酸変異を加えることで抗体の性能を変化させることは、当業者であれば容易に想到可能である。
【００４５】
（９）ホスト細胞
発現ベクターは適切なホスト細胞に導入することにより、遺伝子組換え抗体を産生させることができる。一過的に遺伝子組換え抗体を高発現させるためには、ＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔ抗原タンパク質発現細胞をホスト細胞として用いるのが好ましく、その一例として、実施例７、１３、１４で使用のＣＯＳ１細胞（非特許文献１７、１８）や、２９３Ｔ細胞、ＣＯＳ７細胞をあげることができる。
【００４６】
また、安定的に遺伝子組換え抗体を発現させるためには、遺伝子組み換え動物／昆虫／植物を用いて発現させることも可能であるが、動物細胞、および酵母や大腸菌に代表される微生物をホスト細胞として用いるのが好ましく、特に動物細胞、その中でもＣＨＯ細胞を用いるのが好ましい。さらに好ましい安定生産株は、抗体遺伝子を増幅することができるｄｈｆｒ遺伝子増幅系を組み込んだベクターをＣＨＯ細胞に導入したホストベクター系である。
【発明の効果】
【００４７】
本発明のウサギモノクローナル抗体の製造方法は、一般に流通していないウサギミエローマ細胞を使用することなく、抗原を免疫したウサギから単離した抗体産生細胞を増殖させてから、抗体遺伝子を保有する細胞を選別し、選別した細胞から抗体遺伝子を単離、増幅することを特徴としており、通常の実験施設と分子生物学の知識があればウサギモノクローナル抗体の製造を可能にする方法である。また、本発明の製造方法は従来技術では困難であった、本来ウサギが作製した重鎖と軽鎖の組み合わせを有するモノクローナル抗体を容易に製造することができるため、これまで限られた施設でしか取り扱うことができない、高い親和性を有したウサギモノクローナル抗体を通常の実験室レベルで容易に取り扱うことが可能となる。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４９】
実施例１ 免疫抗原およびスクリーニング抗原の作製
免疫抗原としてはＥ２−ＢＳＡ（商品名）（Ｓｉｇｍａ社製）を使用した。またＥＬＩＳＡでのスクリーニング用抗原は、下記の方法で作製した。
（１）ＢＣＰ（Ｂｌｕｅ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｐｉｅｒｃｅ社製）１００ｍｇを１０ｍｇ／ｍＬになるようにＰＢＳを加え、６位をＮ−ヒドロキシスクシイミドで活性化したエストラジオール（Ｅ２） １．２５ｍｇをＤＭＦ １ｍＬに溶解したものと混合した。
（２）室温で２時間撹拌後、ＰＢＳで透析（１Ｌ×３回）することでＥ２−ＢＣＰを得た。
【００５０】
実施例２ 動物と抗原免疫方法
免疫動物はウサギ（日本白色種）の１２週齢メスを使用した。初回免疫はフロイント完全アジュバント、２次免疫以降はフロイントの不完全アジュバントを用い、抗原溶液（５００μｇ／ｍＬ）と等量のアジュバントを混合後、エマルジョンを作製した後に２週間間隔で免疫した。免疫抗抗原量は、初回５００μｇで２次免疫以降は２５０μｇである。
【００５１】
次に、以下に示すＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）で、十分な抗体価の上昇を確認した。
（１）Ｅ２−ＢＣＰ（０．５μｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡプレートに固定化後、１％スキムミルクでブロッキングした。
（２）ウサギから採血した血清と反応させた。Ｅ２に結合した抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体は、アルカリホスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を結合させ、未反応の酵素標識抗体をＢ／Ｆ分離後、酵素基質である４―メチルウンベリフェリルリン酸（４−ＭＵＰ）を分注し、蛍光強度を測定することで検出した。
【００５２】
実施例３ 脾臓細胞を用いた抗体産生細胞の増殖（培地での培養）
十分に抗体価が上昇したウサギの脾臓を摘出し、定法に従い脾臓細胞を単離した。脾臓細胞を１０％ＦＣＳを含むＧＩＴ培地（日水製薬社製）に懸濁し、マイクロプレートにまいて培養した。一週間後に培養上清を実施例２に記載の方法で、１９２クローンの培養上清中の抗体を評価した結果を図１に示した。このように、マイクロウエルプレートの上清中に抗体の産生を確認することができた。
【００５３】
実施例４ 末梢血細胞由来のリンパ球を用いた抗体産生細胞の増殖（細胞融合を用いた培養）
以下に示す方法で、末梢血細胞由来のリンパ球と不死化能を与える細胞とを融合させた。
（１）十分に抗体価が上昇したウサギ末梢血から採取したリンパ球と、マウスミエローマ細胞の遺伝子にウサギの染色体が一部組み込まれている細胞（２−３Ａ、特許文献１）を融合した。なお、本細胞（２−３Ａ）は、栄研化学株式会社により樹立されたもので、栄研化学株式会社の好意により譲渡して頂いたものである。
（２）定法（ＰＥＧ法）に従い、２−３Ａ細胞と末梢血細胞由来のリンパ球とを融合させた。
（３）融合後の細胞浮遊液を１０％ＦＣＳ、１×ＨＡＴを含むＧＩＴ培地（日水製薬社製）で懸濁し、マイクロタイタープレートにまいた。
【００５４】
３８４クローンの培養上清中の抗体を実施例２に記載の方法で評価した結果を図２に示した。このように、マイクロウエルプレートの上清中に抗体の産生を確認することができた。
【００５５】
実施例５ 脾臓細胞を用いた抗体産生細胞の増殖（細胞融合を用いた培養）
以下に示す方法で、脾臓細胞と不死化能を与える細胞とを融合させた。
（１）十分に抗体価が上昇したウサギの脾臓を摘出し、定法に従って脾臓細胞を調製した。なお、ウサギ脾臓細胞と細胞融合する細胞は、実施例４で使用した細胞（２−３Ａ、特許文献１）を使用した。
（２）定法（ＰＥＧ法）に従い、２−３Ａ細胞とウサギ脾臓細胞を融合させた。
（３）融合後の細胞浮遊液を１０％ＦＣＳ、１×ＨＡＴを含むＧＩＴ培地（日水製薬社製）で懸濁し、マイクロタイタープレートにまいた。
（４）培養上清中の抗Ｅ２抗体の性能を下記の３つのＥＬＩＳＡにより評価した。
（４−１）反応性：Ｅ２−ＢＣＰ（０．５μｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡプレートに固定化した後、１％スキムミルクでブロッキングした。その後、細胞融合後の培養上清を反応させた。Ｅ２に結合した抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体は、アルカリホスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を結合させ、未反応の酵素標識抗体をＢ／Ｆ分離後、酵素基質である４−メチルウンベリフェリルリン酸（４−ＭＵＰ）を分注し、蛍光強度を測定することで検出した。
（４−２）競合特性：反応性を評価する実験系に、Ｅ２（５００ｐｇ／ｍＬ）を共存させる実験を行なった。ここで得られた値（Ｂ）を、反応性で得られた値（Ｂ０）で割ることで、競合特性（Ｂ／Ｂ０値）を算出した。
（４−３）特異性：反応性を評価する実験系に、各種ステロイド（エストロン：Ｅ１、エストリオール：Ｅ３、エチニルエストラジオール：ＥｔＥ２、テストステロン：ＴＳ、各５００ ｐｇ／ｍＬ）を共存させる実験をおこなった。ここで得られた値（Ｂ）を、反応性で得られた値（Ｂ０）で割ることで、特異性（Ｂ／Ｂ０値）を算出した。
【００５６】
以上得られた３つのデータをグラフ化した（図３）。横軸に特異性（Ｂ／Ｂ０値）を、縦軸に競合特性（Ｂ／Ｂ０値）を、反応性は円の大きさでプロットした。このグラフの中で、黒丸で塗りつぶしたクローンは、競合特性が高く、特異性も高く、かつ、反応性も高いクローンである。
【００５７】
実施例６ 抗体遺伝子の単離・増幅と発現ベクターの作製
実施例５の結果、図３で黒丸で塗りつぶしたクローンを選別後、当該クローンから以下の方法で抗体遺伝子を単離、増幅後、発現ベクターを作製した。
（１）ＭａｇＭａｘＴＭ−９６ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（商品名）（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用い、添付されているプロトコルに従って細胞からのＲＮＡの単離を行なった。
（２）単離したＲＮＡを鋳型とし、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ Ｙｏｕ−Ｐｒｉｍｅ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｂｅａｄｓ（商品名）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、逆転写反応を行ないｃＤＮＡを合成した。
（３）ウサギ抗体遺伝子に特異的なプライマー（重鎖（Ｈ鎖）および軽鎖（Ｌ鎖）に特異的なプライマー、配列番号１から４、なお配列１と２はＨ鎖、配列３と４はＬ鎖にそれぞれ特異的なプライマーである）を用いＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名）（第一化学薬品社製）で、抗体遺伝子をＰＣＲ反応で増幅させた。条件を以下に示す。
【００５８】
（試薬組成）
キットに添付の緩衝液で、ｄＮＴＰ ０．２μＭ、プライマーはそれぞれ０．５
μＭで行なった。
【００５９】
（反応条件）
９８℃で３０秒保持後、９８℃で１０秒、７２℃で５０秒のサイクルを３５サイ
クル繰り返し、その後７２℃で１０分間保持した。
（４）電気泳動で遺伝子の増幅を確認した。
（５）得られたＨ鎖及びＬ鎖のＰＣＲフラグメントを、ＢｇｌＩＩとＸｂａＩで制限酵素処理した後、動物細胞用発現ベクター（ｐＥＣＥｄｈｆｒ：図４）のＢｇｌＩＩ／ＸｂａＩサイトに導入し、Ｈ鎖、Ｌ鎖用の発現ベクターを調製した。
【００６０】
実施例７ 遺伝子組換え抗体の発現（ＣＯＳ細胞による一過性発現）と精製
実施例６で得られたＨ鎖、Ｌ鎖用の発現ベクターからＣＯＳ１細胞（非特許文献１７、１８）での遺伝子組換え抗体の生産を行なった。なお、実施例６における抗体遺伝子の単離操作は細胞融合後８日目に実施した。
（１）９６ウエルプレート上で対数増殖期にあるＣＯＳ細胞に、Ｈ鎖発現ベクターとＬ鎖発現ベクター各２００ｎｇを、リポフェクトアミン２０００（商品名）（インビトロジェン社製）で導入した。遺伝子導入時の培地は、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商品名）（インビトロジェン社製）を使用した。
（２）遺伝子導入から３日後に培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡで抗体の存在を確認した。
（３）抗原結合能が確認された抗体遺伝子ペアを有するＣＯＳ細胞を、培養スケールを上昇させて培養し、抗体の一過性発現を行なった。
（４）定法に従い培養上清からＰｒｏｔｅｉｎ Ｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）で抗Ｅ２抗体を精製した。抗体の性能を評価し、競合特性、特異性、生産性などの点から性能が高かった抗体を選定した。
【００６１】
実施例８ ウサギモノクローナル抗体安定産生株の作製
実施例７で選定した抗体の発現ベクターをＣＨＯ細胞に導入することで、抗体安定産生株を作製した。
【００６２】
対数増殖期にある、ＣＨＯ細胞（ＤＸＢ１１：ｄｈｆｒ欠損株）に実施例７と同じ条件で遺伝子を導入し、アルファーＭＥＭ（−）に１０％透析血清を添加した培地で、細胞を培養した。その後、ＭＴＸ（メソトレキセート）の濃度を５ｎＭから５００ｎＭまで段階的に上昇させ、ウサギモノクローナル抗体Ｕ−１発現ＣＨＯ細胞を得た。
【００６３】
実施例９ 発現抗体の親和性測定
ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ−１００（商品名）（ビアコア社製）を用いて、以下に示す３種類のモノクローナル抗体の親和性を測定した。
【００６４】
（ａ）東ソー株式会社で単離したマウスモノクローナル抗体Ｍａ−１
（ｂ）東ソー株式会社で単離したラットモノクローナル抗体Ｒａ−１
（ｃ）本発明で製造したウサギモノクローナル抗体Ｕ−１
親和性は以下に示す方法で測定した。
（１）Ｅ２誘導体（６位にアミノ基が導入されたもの）をアミンカップリング法で、センサーチップ（ＣＭ５）上に結合させたものを使用した。
（２）緩衝液：ＨＢＳ−ＥＰ、温度：２５℃、流速３０μＬ／ｍｉｎ、結合時間：１分、解離時間：１０分、の条件で解析を行なった。
（３）得られたデータを、解析ソフト（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ｖｅｒｓｉｏｎ １．１）を用い、ｂｉｖａｌｅｎｔモデルで解析し、Ｋｄ（Ｍ）の値を算出した。
【００６５】
解離定数（Ｋｄ）を横軸に、縦軸に競合特性（１０００ｐｇ／ｍＬのＥ２が共存したときの値をＥ２が存在しないときの値で割った値。東ソー株式会社製のＡＩＡ−６００ＩＩを用いて測定した結果）を測定すると、親和性の高い抗体ほど競合特性も高く、高感度な測定系を構築できることがわかる（図５）。マウスモノクローナル抗体Ｍａ−１（Ｋｄ＝８．１×１０−１０Ｍ）、ラットモノクローナル抗体Ｒａ−１（Ｋｄ＝５．２×１０−１１Ｍ）はそれぞれ一般的には親和性の高い抗体に分類されるが、本発明で製造したウサギモノクローナル抗体Ｕ−１（Ｋｄ＝３．３×１０−１３Ｍ）はＭａ−１よりも約２５００倍、Ｒａ−１よりも約１６０倍、それぞれ親和性が向上していた。
【００６６】
実施例１０ 単離した抗体の蛍光偏光解消法による評価
単離した抗体を蛍光偏光解消法で結合性を評価した（図６）。テトラメチルローダミンで標識したＥ２を使用し、横軸に抗体濃度を、縦軸に蛍光偏光度（ｍＰ）をプロットしたものである。テトラメチルローダミン標識Ｅ２のｍＰ値を２０としたとき、抗体濃度を増加させた場合の偏光度の変化を示している。抗体濃度が高くなるにつれ、テトラメチルローダミンで標識されたＥ２が抗体と結合するため、大きい偏光度を得るようになる。本発明で製造したウサギモノクローナル抗体Ｕ−１は、マウスモノクローナル抗体Ｍａ−１、ラットモノクローナル抗体Ｒａ−１と比較して１００倍以上低い濃度で偏光度が増加している。このことは、Ｕ−１が、Ｍａ−１およびＲａ−１より親和性が極めて高いことを示している。
【００６７】
実施例１１ ＡＩＡ試薬形態でのモノクローナル抗体の評価
本発明で製造したウサギモノクローナル抗体Ｕ−１を使用した免疫反応試薬を、ポリクローナル抗体を使用した免疫反応試薬（Ｅテスト「ＴＯＳＯＨ」ＩＩ Ｅ２、東ソー社製）と性能を比較した。両免疫反応試薬の検量線を図７に示す。Ｅ２の検出限界はポリクローナル抗体を使用した免疫反応試薬が２５．２ｐｇ／ｍＬであるのに対し、Ｕ−１を使用した免疫反応試薬は２２．４ｐｇ／ｍＬと、ポリクローナル抗体を使用した免疫反応試薬より高感度な測定系が構築できることが明らかとなった。
【００６８】
また、エストロン（Ｅ１）およびエストリオール（Ｅ３）といった、類似ステロイドへの交差反応性（１０ｎｇ／ｍＬ）を測定したところ、Ｅ１の場合（市販のＡＩＡ試薬：４．７７％、ウサギモノクローナル抗体Ｕ−１を用いたＡＩＡ試薬：０．９２％）、Ｅ３の場合（市販のＡＩＡ試薬：４．１９％、ウサギモノクローナル抗体Ｕ−１を用いたＡＩＡ試薬：０．２８％）、いずれもステロイド類に対する交差反応性が大幅に改善された。
【００６９】
次に、４０例の実検体を用いて両測定系の相関性を見た結果を図８に示した。回帰係数０．９２４、ｙ切片−２．３８７ｐｇ／ｍＬ、相関係数ｒ＝０．９９８というきわめて高い相関性を示した。
【００７０】
実施例１２ 遺伝子単離時期と単離される遺伝子の割合
ヘテロハイブリドーマは遺伝子が脱落しやすいとの情報はあるが、それがどの程度の時間で消失してしまうかなどの詳細な解析は報告されていなかった。本発明者らも、細胞融合後の培養上清をＥＬＩＳＡで評価し、抗体が培養上清に発現していることを確認した後、その細胞から抗体遺伝子の増幅を試みても、抗体遺伝子が増幅できないという問題に直面した。ＰＣＲの条件、プライマーの配列などの種々の観点から遺伝子が増幅できない理由を検討した結果、細胞融合後に得られたヘテロハイブリドーマを経代培養する際、通常のマウスモノクローナル抗体を取り扱うのと同じ感覚で取り扱うと、抗体を発現しなくなる時期の特定が難しいことを見出した。通常、細胞を継代培養する際は、細胞懸濁液を約１０倍量程度の新しい培地に移して培養を継続するため、はじめの培養上清中は、新しい培地に移すことで希釈されてゆく。つまり、細胞が安定に抗体を発現していない場合は、培養上清が希釈されるため、継代培養後の培養上清のシグナルは激減する。しかし、ウサギモノクローナル抗体の場合はこの理論は当てはまらなかった。ウサギモノクローナル抗体はマウスモノクローナル抗体と比較して、極端に親和性が高く、継代培養により培養上清が１０倍あるいは１００倍程度希釈されてもＥＬＩＳＡでは十分なシグナルが得られるため、すでにヘテロハイブリドーマから抗体遺伝子は脱落し、抗体は発現していないにもかかわらず、ＥＬＩＳＡでは陽性判定となってしまう。このことは、実施例１０において、本特許で単離したウサギモノクローナル抗体とマウスモノクローナル抗体の結合性の比較を行なった結果、ウサギモノクローナル抗体はマウスモノクローナル抗体より１００倍以上低い濃度でも抗原結合能が観察されていることからも裏づけできる。
【００７１】
そこで、実施例６において、細胞融合後に抗体遺伝子を単離する時期を変更し、最適な単離時期について検討した。結果を表１に示す。
【００７２】
【表１】
細胞融合後８日目で遺伝子を増幅すると、３回の実験の平均で、Ｈ鎖遺伝子は８６．１％、Ｌ鎖遺伝子は９４．４％の確率で増幅できた。そして、増幅した遺伝子から発現ベクターを作製しＣＯＳ細胞で発現させた抗体を評価したところ、７５．０％の抗体は抗原結合能を有していた。また、３回の実験を通じ、安定した増幅率および抗体取得率を示したことから、当該期間で増幅すると抗体結合活性を持ったベクターを安定的に取得できることがわかる。
【００７３】
一方、細胞融合後１６日目で遺伝子を単離すると、それぞれの数値は、２５．０％、８８．９％、９．５２％と低下した。このことから、単離する時期が遅いと特にＨ鎖遺伝子で急速な抗体遺伝子の脱落が起きていることがわかる。
【００７４】
実施例１３ 抗トリヨードサイロニン（Ｔ３）抗体の単離
抗トリヨードサイロニン（Ｔ３）ウサギモノクローナル抗体を以下の方法で単離した。
【００７５】
（１）免疫抗原の作製
ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社製）２５ｍｇを１０ｍｇ／ｍＬになるように、ホウ酸バッファー（０．０５Ｍ、ｐＨ８．５）を加え、カルボン酸をメチルエステルとして保護した後、アミノ基からリンカーを伸ばした。次に、前記溶液と、Ｎ−ヒドロキシスクシイミドで活性化したＴ３ ７ｍｇをＤＭＳＯ １００μＬに溶解した液とを混合した。室温で３０分撹拌後、ＰＢＳで透析（５００ｍＬ×３回）することで、免疫抗原であるＴ３−ＢＳＡを得た。
【００７６】
（２）スクリーニング抗原の作製
ＢＣＰ（Ｂｌｕｅ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて（１）と同様の方法で作製した。ＢＣＰ ２５ｍｇを１０ｍｇ／ｍＬになるように、ホウ酸バッファー（０．０５Ｍ、ｐＨ８．５）を加えた。前記溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシイミドで活性化したＴ３ ７ｍｇをＤＭＳＯ １００μＬに溶解した液とを混合した。室温で３０分撹拌後、ＰＢＳで透析（５００ｍＬ×３回）することで、ＥＬＩＳＡでのスクリーニング抗原であるＴ３−ＢＣＰを得た。
【００７７】
（３）動物と抗原免疫方法
免疫動物はウサギ（日本白色種）の１２週齢メスを使用した。初回免疫はフロイント完全アジュバント、２次免疫以降はフロイントの不完全アジュバントを用い、抗原溶液（５００μｇ／ｍＬ）と等量のアジュバントを混合後、エマルジョンを作製した後に２週間間隔で免疫した。免疫抗抗原量は、初回１ｍｇで２次免疫以降は５００μｇである。
【００７８】
次に、以下に示すＥＬＩＳＡで十分な抗体価の上昇を確認した。
（３−１）Ｔ３−ＢＣＰ（０．５μｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡプレートに固定化後、１％スキムミルクでブロッキングした。
（３−２）ウサギから採血した血清と反応させた。Ｔ３に結合した抗Ｔ３ウサギモノクローナル抗体は、アルカリホスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を結合させ、未反応の酵素標識抗体をＢ／Ｆ分離後、酵素基質である４―メチルウンベリフェリルリン酸（４−ＭＵＰ）を分注し、蛍光強度を測定することで検出した。
【００７９】
（４）抗体産生細胞の増殖（培地での培養）
十分に抗体価が上昇したウサギの脾臓を摘出し、細胞凍結保存液（セルバンカー１（商品名）、日本全薬工業社製）中に分散させた状態で、ディープフリーザー中（−８０℃）で保存した。保存細胞は定法に従って解凍し、ＧＩＴ培地（日水製薬社製）で懸濁し、マイクロタイタープレートにまいた。５日間培養後の培養上清中にある抗Ｔ３抗体の性能は下記の３つのＥＬＩＳＡにより評価した。
（４−１）反応性：Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（０．５μｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡプレートに固定化した後、１％スキムミルクでブロッキングした。その後、培養上清とアルカリホスファターゼ標識Ｔ３を同時に反応させた。ウサギモノクローナル抗体に未反応の酵素標識Ｔ３をＢ／Ｆ分離後、酵素基質である４−メチルウンベリフェリルリン酸（４−ＭＵＰ）を分注し、蛍光強度を測定することで検出した。
（４−２）競合特性：反応性を評価する実験系に、Ｔ３（２ｎＭ）を共存させる実験を行なった。ここで得られた値（Ｂ）を、反応性で得られた値（Ｂ０）で割ることで、競合特性（Ｂ／Ｂ０値）を算出した。
（４−３）競合特性：反応性を評価する実験系に、Ｔ４（２０ｎＭ）を共存させる実験を行なった。ここで得られた値（Ｂ）を、反応性で得られた値（Ｂ０）で割ることで、特異性（Ｂ／Ｂ０値）を算出した。
【００８０】
以上得られた３つのデータをグラフ化した（図９）。横軸に特異性（Ｂ／Ｂ０値）を、縦軸に競合特性（Ｂ／Ｂ０値）を、反応性は円の大きさでプロットした。このグラフの中で、黒丸で塗りつぶしたクローンは、競合性能が高く、特異性も高く、かつ反応性も高いクローンである。
【００８１】
（５）抗体遺伝子の単離・増幅と発現ベクターの作製
（４）の結果、図９で黒丸で塗りつぶしたクローンを選別後、選別した次の日に以下の方法で抗体遺伝子の単離を行なった。
（５−１）ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（商品名）（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、添付されているプロトコルに従って、細胞からのＲＮＡの抽出を行なった。
（５−２）（５−１）で得られたＲＮＡを鋳型とし、Ｓｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｋｉｔ（商品名）（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて逆転写反応を行ない、ｃＤＮＡを合成した。
（５−３）ウサギ抗体遺伝子に特異的なプライマー（Ｈ鎖およびＬ鎖に特異的なプライマー。配列番号１から３、５から７）を用いＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名）（第一化学薬品社製）で、抗体遺伝子を増幅させた。条件は以下に示す。なお、Ｈ鎖を増幅させる際の二回目のＰＣＲは、一回目のＰＣＲ産物（２μＬ）を鋳型とした他は、一回目のＰＣＲと同じ試薬組成／反応条件で行なっている。
【００８２】
（試薬組成）
キットに添付の緩衝液で、ｄＮＴＰ ０．２μＭ、プライマーはそれぞれ０．５
μＭで行なった。
【００８３】
（反応条件）
９８℃で３０秒保持後、９８℃で１０秒、７２℃で５０秒のサイクルを３５サイ
クル繰り返し、その後７２℃で１０分間保持した。
【００８４】
（プライマー）
Ｈ鎖：一回目のＰＣＲでは配列２及び５、二回目のＰＣＲでは配列１及び６
Ｌ鎖：配列番号３及び７
（５−４）電気泳動で遺伝子の増幅を確認した。
（５−５）得られたＨ鎖及びＬ鎖のＰＣＲフラグメントを、ＢｇｌＩＩとＸｂａＩで制限酵素処理した後、動物細胞用発現ベクター（ｐＥＣＥｄｈｆｒ：図４）のＢｇｌＩＩ／ＸｂａＩサイトに導入し、Ｈ鎖、Ｌ鎖用の発現ベクターを調製した。
【００８５】
（６）遺伝子組み換え抗体の発現（ＣＯＳ細胞による一過性発現）
（５）で得られたＨ鎖、Ｌ鎖用発現ベクターからＣＯＳ１細胞（非特許文献１７、１８）での遺伝子組み換え抗体の生産を行なった。
（６−１）９６ウエルプレート上で対数増殖期にあるＣＯＳ細胞に、Ｈ鎖発現ベクターを１６．６ｎｇ、及びＬ鎖発現ベクターを８．３ｎｇを、リポフェクトアミン２０００（商品名）（インビトロジェン社）で導入した。遺伝子導入時の培地は、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商品名）（インビトロジェン社）を使用した。
（６−２）遺伝子導入から３日後に培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡで抗体の存在を確認した。
（６−３）抗原結合能が確認された抗体遺伝子ペアを有するＣＯＳ細胞を、培養スケールを上昇させて培養し、抗体の一過性発現を行なった。
【００８６】
（７）ＡＩＡ試薬形態でのモノクローナル抗体の評価
（６）で作製した、ウサギ由来抗Ｔ３モノクローナル抗体（ＵＴ１Ｄ−５）を用いて、ＡＩＡ用テストカップを作製した。ＡＩＡは東ソー株式会社で販売している全自動免疫診断システムであり、今回作製した抗体を使用してＡＩＡ用の免疫反応試薬を作製し評価を行なった。
【００８７】
今回単離したウサギモノクローナル抗体ＵＴ１Ｄ−５を用いた免疫反応試薬、及びマウス由来抗Ｔ３モノクローナル抗体を用いた免疫反応試薬の検量線を図１０に示した。図１０に示すように、今回単離した抗体を用いることで、マウス由来の試薬より高感度な測定系を構築できることが明らかとなった。
【００８８】
今回作製したＵＴ１Ｄ−５を用いた免疫反応試薬を用いて交差反応性を評価した結果を図１１に示す。図１１より、今回単離した抗体はＴ３の類似化合物のサイロキシン（Ｔ４）には全く交差反応性を有しておらず、Ｔ３に対して非常に高い特異性を有していることがわかる。
【００８９】
実施例１４ 抗脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）抗体の単離
抗脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）ウサギモノクローナル抗体を以下の方法で単離した。
【００９０】
（１）免疫抗原の作製
ＢＮＰのＣ末端側７アミノ酸に相当するペプチド（ＣＫＶＬＲＲＨ、配列番号１２）を合成した。合成したペプチドのＮ末端にあるシステインを利用して、マレイミド−ＫＬＨ（ＰＩＥＲＣＥ社製）と反応させ、これを免疫抗原として使用した。反応方法は添付されたプロトコルに従い、ペプチド１ｍｇに対して、マレイミド−ＫＬＨを１ｍｇ反応させた。
【００９１】
（２）スクリーニング抗原の作製
ＢＮＰのＣ末端の７アミノ酸に相当するペプチド（ＣＫＶＬＲＲＨ、配列番号１２）のＮ末端に、リンカー配列（ＧＧＧＳＧＧＧＳ、配列番号１３）を付加し、さらにＮ末端をビオチン化したペプチド（ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧＳＧＧＧＳＣＫＶＬＲＲＨ、配列番号１４、以降Ｂｉｏ−ＢＮＣと表記）を作成し、これをＥＬＩＳＡでのスクリーニング抗原として使用した。
【００９２】
（３）動物と抗原免疫方法
免疫動物はウサギ（日本白色種）の１２週齢メスを使用した。初回免疫はフロイント完全アジュバント、２次免疫以降はフロイントの不完全アジュバントを用い、抗原溶液（５００μｇ／ｍＬ）と等量のアジュバントを混合後、エマルジョンを作製した後に２週間間隔で免疫した。免疫抗抗原量は、初回５００μｇで２次免疫以降は２５０μｇである。
【００９３】
次に、以下に示すＥＬＩＳＡで、十分な抗体価の上昇を確認した。
（３−１）ストレプトアビジン（０．５μｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡプレートに固定化後、１％スキムミルクでブロッキングした。
（３−２）Ｂｉｏ−ＢＮＣ（０．５μｇ／ｍＬ）を反応させたＥＬＩＳＡプレートを作製した。その後、抗原を免疫したウサギの血清を反応させた。Ｂｉｏ−ＢＮＣに結合した抗ＢＮＰウサギモノクローナル抗体は、アルカリホスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を結合させ、未反応の酵素標識抗体をＢ／Ｆ分離後、酵素基質である４―メチルウンベリフェリルリン酸（４−ＭＵＰ）を分注し、蛍光強度を測定することで検出した。
【００９４】
（４）抗体産生細胞の増殖（培地での培養）
十分に抗体価が上昇したウサギの脾臓を摘出し、細胞凍結保存液（セルバンカー１（商品名）、日本全薬工業社製）中に分散させた状態で、ディープフリーザー中（−８０℃）で保存した。保存細胞は定法に従って解凍し、ＧＩＴ培地（日水製薬社製）で懸濁し、マイクロタイタープレートにまいた。５日間培養後の培養上清中にある抗ＢＮＰ抗体の性能は下記のＥＬＩＳＡにより評価した。
（４−１）ストレプトアビジン（０．５μｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡプレートに固定化後、１％スキムミルクでブロッキングし、その後、Ｂｉｏ−ＢＮＣ（０．５μｇ／ｍＬ）を反応させたＥＬＩＳＡプレートを作製した。
（４−２）培養上清と反応させた。Ｂｉｏ−ＢＮＣに結合した抗ＢＮＰウサギモノクローナル抗体は、アルカリホスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を結合させ、未反応の酵素標識抗体をＢ／Ｆ分離後、酵素基質である４―メチルウンベリフェリルリン酸（４−ＭＵＰ）を分注し、蛍光強度を測定することで検出した。
【００９５】
得られた結果を図１２に示す。図１２の結果よりシグナルが強いクローンを選別し、抗体遺伝子を単離した。
【００９６】
（５）抗体遺伝子の単離と発現ベクターの作製
（４）で選別したクローンから以下の方法で抗体遺伝子の単離を行なった。
（５−１）ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（商品名）（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、添付されているプロトコルに従い、細胞からのＲＮＡの抽出を行なった。
（５−２）得られたＲＮＡを鋳型とし、Ｓｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｋｉｔ（商品名）（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、逆転写反応を行ないｃＤＮＡを合成した。
（５−３）ウサギ抗体遺伝子に特異的なプライマー（Ｈ鎖およびＬ鎖に特異的なプライマー。配列番号２、３、６から１１参照）を用いＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（第一化学薬品社製）で、抗体遺伝子を増幅させた。条件は以下に示す。なお、二回目のＰＣＲ（反応液量５０μＬ）を行なう際、Ｈ鎖を増幅させる場合は、一回目のＰＣＲ産物（２μＬ）を鋳型とした他は、一回目のＰＣＲと同じ試薬組成／反応条件で行なっており、Ｌ鎖を増幅させる場合は、一回目のＰＣＲ産物をＴＥで１０００倍希釈した液（２μＬ）を鋳型とした他は、一回目のＰＣＲと同じ試薬組成／反応条件で行なっている。
【００９７】
（試薬組成）
キットに添付の緩衝液で、ｄＮＴＰ ０．２μＭ、プライマーはそれぞれ０．５
μＬで行なった。
【００９８】
（反応条件）
９８℃で３０秒保持後、９８℃で１０秒、７２℃で５０秒のサイクルを３５サイ
クル繰り返し、その後７２℃で１０分間保持した。
【００９９】
（プライマー）
Ｈ鎖：一回目のＰＣＲでは配列２及び６、二回目のＰＣＲでは配列８及び９
Ｌ鎖：一回目のＰＣＲでは配列３及び７、二回目のＰＣＲでは配列１０及び１１
（５−４）電気泳動で遺伝子の増幅を確認した。
（５−５）得られたＨ鎖及びＬ鎖のＰＣＲフラグメントは、ＢｇｌＩＩ／ＸｂａＩで制限酵素処理した後、動物細胞用発現ベクター（ｐＥＣＥｄｈｆｒ：図４）のＢｇｌＩＩ／ＸｂａＩサイトにＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（商品名）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて導入し、Ｈ鎖、Ｌ鎖用の発現ベクターを調製した。
【０１００】
（６）遺伝子組み換え抗体の発現（ＣＯＳ細胞による一過性発現）
（５）で得られたＨ鎖、Ｌ鎖用発現ベクターからＣＯＳ１細胞（非特許文献１７、１８）での遺伝子組み換え抗体の生産を行なった。
（６−１）９６ウエルプレート上で対数増殖期にあるＣＯＳ細胞に、Ｈ鎖発現ベクターを２０ｎｇ、及びＬ鎖発現ベクターを２０ｎｇを、リポフェクトアミン２０００（商品名）（インビトロジェン社製）で導入した。遺伝子導入時の培地は、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商品名）（インビトロジェン社製）を使用した。
（６−２）遺伝子導入から３日後に培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡで抗体の存在を確認した。抗原結合能が確認された２つのクローン（２７、４５）を取得した。
【０１０１】
（７）サンドイッチアッセイ系でのモノクローナル抗体の評価
（６）で取得したクローンより得られたウサギ由来抗ＢＮＰモノクローナル抗体（２７、４５）を、以下の方法でＥＬＩＳＡにより評価した。
（７−１）抗ウサギ抗体（１０μｇ／ｍＬ）を固定化したＥＬＩＳＡプレートに、（６）で取得したクローンから抗体を一過性発現させた後の培養上清を反応させ、その後ＢＮＰ（０．１μｇ／ｍＬ）を反応させた。
（７−２）さらに、アルカリフォスファターゼで標識されたＢＮＰの環状部位を認識する抗体（タンパク質濃度として、Ａ２８０ｎｍ＝０．００３）を反応させた。
（７−３）未反応の酵素標識抗体をＢ／Ｆ分離後、酵素基質である４―メチルウンベリフェリルリン酸（４−ＭＵＰ）を分注し、蛍光強度を測定することで検出した。
【０１０２】
得られた結果を図１３に示した。図１３の結果より、ＢＮＰの有無で、反応性に明確な差が見られたことから、ＢＮＰのＣ末端を認識するウサギモノクローナル抗体が単離されたことが確認できた。
【０１０３】
実施例１５ 細胞融合後のＥＬＩＳＡのシグナル値の変化
Ｅ２−ＢＳＡを免疫したウサギ凍結脾臓細胞を使用して以下に示す実験を行なった。
（１）実施例５に示す方法に従い、細胞融合を行ない、マイクロタイタープレートに融合細胞をまいた。
（２）培養１、２、３、４、７、１１日目に培養上清を同量とった。なお、培養上清をとる際に、同量の同じ組成の培地を加えることで培地の量を維持している。
（３）得られた培養上清を、実施例２に示すＥＬＩＳＡで評価した。
【０１０４】
結果を図１４に示す。細胞融合後１日目から７日目まではシグナル強度が上昇していたが、７日目以降はシグナルの強度にほとんど変化がなかった。以上の結果より、抗体遺伝子を単離する際、細胞融合した後、７日前後培養した培養上清から単離するのが好ましいことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１０５】
本発明の製造方法により、親和性が高い特徴を有するウサギモノクローナル抗体を、通常の実験施設と分子生物学の知識があれば製造することができる。また、本発明の方法で製造したウサギモノクローナル抗体を免疫診断薬に用いることで、高感度で夾雑物の影響を受けない測定系を構築できる。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】脾臓由来の細胞を培養し、１９２クローンの培養上清の抗原結合能力を評価した結果。
【図２】末梢血由来のリンパ球を使った細胞融合後の培養上清中の抗体をＥＬＩＳＡで評価した結果。
【図３】３８４０クローンの培養上清のスクリーニングの結果。縦軸は競合特性を、横軸は特異性を、各プロットの大きさは反応性を、それぞれ示す。また、図中の黒丸のプロットで示す抗体は、競合性能が高く、特異性も高く、かつ、反応性も高いクローンであり、当該クローンから、抗体遺伝子を単離した。
【図４】発現ベクターｐＥＣＥｄｈｆｒの構造。図中のＳＶ４０ＰはＳＶ４０のプロモーターを、ｄｈｆｒはジヒドロフォレート・リダクターゼ遺伝子を、ｐｏｌｙＡはポリアデニレートアタッチメントシグナルを、Ａｍｐはアンピシリン耐性遺伝子を、ＭＣＳはマルチクローニングサイトを、それぞれ示す。
【図５】マウスモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体、および本発明で製造したウサギモノクローナル抗体を用いて、競合特性を比較した結果。縦軸は１０００ｐｇ／ｍＬの濃度のＥ２を測定した際のＢ／Ｂ０値を、横軸は解離定数を、それぞれ示す。
【図６】各抗体の性能を蛍光偏光解消法で評価した結果。縦軸は偏光度を、横軸は抗体の濃度を、それぞれ示す。抗原として使用した蛍光物質標識Ｅ２の偏光度は２０とした。図中の黒丸はマウスモノクローナル抗体Ｍａ−１を、白丸はラットモノクローナル抗体Ｒａ−１を、黒四角は本発明で製造したウサギモノクローナル抗体Ｕ−１を、それぞれ使用したときの結果である。
【図７】東ソー社製の全自動免疫診断システム用の試薬を作製し、検量線を描いた結果。図中の白丸はポリクローナル抗体を使用した免疫反応試薬（Ｅテスト「ＴＯＳＯＨ」ＩＩ Ｅ２、東ソー社製）を、黒丸は本発明で製造したウサギモノクローナル抗体Ｕ−１を使用した免疫反応試薬を、それぞれ使用したときの結果である。
【図８】ポリクローナル抗体を使用した免疫反応試薬（Ｅテスト「ＴＯＳＯＨ」ＩＩ Ｅ２）と、本発明で製造したウサギモノクローナル抗体Ｕ−１を使用した免疫反応試薬にて、実検体を測定し相関をとった結果。
【図９】３８４０クローンの培養上清のスクリーニングの結果。縦軸は競合特性を、横軸は特異性を、各プロットの大きさは反応性を、それぞれ示す。また、図中の黒丸のプロットで示す抗体は、競合性能が高く、特異性も高く、かつ反応性も高いクローンであり、当該クローンから、抗体遺伝子を単離した。
【図１０】東ソー社製の全自動免疫診断システム用の試薬を作製し、検量線を描いた結果。図中の黒丸は本発明で製造したウサギモノクローナル抗体ＵＴ１Ｄ−５を用いた免疫反応試薬を、白四角はマウスモノクロナール抗体を用いた免疫反応試薬を、それぞれ使用したときの結果である。
【図１１】交差反応性を評価した結果。横軸にＴ３またはＴ４の濃度を示し，縦軸はＢ／Ｂ０値を示す。
【図１２】３８４０クローンの培養上清のスクリーニングの結果。縦軸は蛍光強度を示し横軸はクローンを示す。
【図１３】一過性発現で得られた抗ＢＮＰ抗体（Ｃ末端認識）とＢＮＰの環状部位を認識する抗体によるＢＮＰのサンドイッチアッセイ結果。
【図１４】細胞融合後の培養上清中の抗体量の推移をＥＬＩＳＡで評価した結果。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組換えウサギモノクローナル抗体の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体はその特異性と親和性の高さから、ある特定の物質を検出するための実験用試薬としてだけではなく、がん治療用医薬品、免疫診断薬の中核材料として広く利用されている。
【０００３】
モノクローナル抗体といえば、マウス由来のモノクローナル抗体が一般には認知されている。通常の実験で使用する抗体あるいは免疫測定試薬であればマウス由来のモノクローナル抗体が有する親和性の程度で十分な場合が多い。しかし、免疫診断薬のような、測定感度の高感度化が近年ますます要求されている領域では、マウス由来モノクローナル抗体では親和性が足りない場合がある。たとえば競合法においては、抗体の親和性が高くなるほど検出感度が高くなることは、理論的に証明することができ、高感度競合法を構築するためには、親和性の高い抗体が必要となる。また、サンドイッチ法でも、親和性の高い抗体により、微量の抗原を検出できるようになり、高感度測定系が構築できる。
【０００４】
たとえば、ステロイドは低分子であるため、競合法で測定されている。特にステロイド類の中でもエストラジオール（Ｅ２）は、高感度測定系が要求されており、親和性の高い抗体の要求が強い。
【０００５】
マウス以外の種々のモノクローナル抗体も報告されており、非特許文献１で紹介されているように、体の大きい動物種から抗体をとれば親和性の高い抗体が単離される傾向にある。しかしながら、同じ動物種に同じ抗原を免疫しても、個体差の影響が大きく、得られる抗血清も異なるため、親和性の高い抗体を単離するためには、少なくとも数匹以上の個体に抗原を免疫し、免疫応答の高い個体からモノクローナル抗体を単離する必要がある。そのため、現実的には免疫動物としてウサギが選ばれる。また、ウサギは免疫診断薬用の抗血清にウサギの血清がよく利用されていることからも、免疫動物種としては適していると考えられる。
【０００６】
マウスモノクローナル抗体の製造方法は確立されており、以下に示す方法で製造している。まず、抗原を免疫したマウスの脾臓細胞（抗体産生細胞）をマウスミエローマ細胞（骨髄腫細胞）と細胞融合させ、無限増殖能を持ち、かつ、目的抗体を産生するハイブリドーマを作製する。その後、当該細胞を培養し産生された抗体を精製して、マウスモノクローナル抗体を製造する。
【０００７】
ウサギモノクローナル抗体も理論上はマウスモノクローナル抗体の製造方法と同様な方法で生産できる。しかしながら、抗体産生細胞と細胞融合させるのに用いるウサギミエローマ細胞（非特許文献２）が、マウスミエローマ細胞とは異なり、一般には流通していないため、マウスモノクローナル抗体の製造方法と同様な方法で生産できる施設は限られており、通常の実験室レベルでは当該方法によりウサギモノクローナル抗体を製造することは出来ない。このため、ウサギミエローマ細胞を用いずに、ウサギモノクローナル抗体を生産する方法について、これまでいくつか検討されている。
【０００８】
まず、ウサギ抗体産生細胞をマウスミエローマ細胞と融合する方法がある。しかしながら、当該方法は異種動物間の融合であり、融合効率が低いため、得られるハイブリドーマ数は少なく、また得られたハイブリドーマも、短期間のうちに抗体生産能力が消失する（非特許文献３、４）。さらに、ウサギ血清の存在下で当該融合細胞を培養することで抗体生産能力を維持可能との報告もあるが、生産されたモノクローナル抗体の精製が困難であり、長期間の抗体生産性についての報告もない（非特許文献５）。
【０００９】
次に、抗原を免疫したウサギ脾臓から重鎖（Ｈ鎖）および軽鎖（Ｌ鎖）の抗体遺伝子を単離、増幅後、ウサギ抗体ライブラリーを作製し、ファージディスプレイ法などにより、ウサギ抗体を単離する方法が報告されている（非特許文献６から８）。しかし本方法によると、ライブラリーから抗体を選別する過程において「パニング」という操作が必須となる。当該操作を簡単に述べると、抗原が固定化された水不溶性担体をライブラリーに接触させ、抗原に結合した抗体を回収する。その後抗原に結合した抗体を何らかの方法で増幅させ新たなライブラリーを作製し、さらに抗原を固定化した水不溶性担体と反応させる操作を繰り返す。当該操作により、抗原と結合する抗体は濃縮され、最終的に抗原に結合する抗体を単離することができる。しかしながら、抗原抗体反応が平衡反応である以上、抗原と抗体の結合には濃度の影響をうける。例えばライブラリーの中に微量しか存在しない親和性の高い抗体を選択的に濃縮してくることは原理上不可能である。また、一般的に親和性の高い抗体を得るためには、抗体が本来ウサギの作製したＨ鎖とＬ鎖の組み合わせである必要があるが、当該操作によって得られる抗体は、本来ウサギの作製したＨ鎖とＬ鎖の組み合わせが再現される可能性が極めて低いため、当該操作で親和性が向上した抗体を回収するのは極めて困難である。
【００１０】
上記方法以外には、ウサギ抗体産生細胞を軟寒天培地中で保持した後、赤血球溶血法により目的抗体を発現している抗体産生細胞を探し、一個の抗体産生細胞から抗体遺伝子を単離し、遺伝子組換え抗体として作製する方法がある（非特許文献９）。当該方法を用いることで本来ウサギの作製したＨ鎖とＬ鎖の組み合わせを再現できるが、極めて高い抗体性能（親和性、特異性、保存安定性、生産性など）が要求される免疫診断薬で使用するような抗体は簡単に得られるものではない。つまり、単に抗原に結合するウサギモノクローナル抗体を単離するのであれば非特許文献９の方法でも良いが、免疫診断薬で使用可能な性能の高いモノクローナル抗体を単離しようと、数千から数万クローンの遺伝子組換え抗体を作製しても、目的とする抗体を単離できる保障はない。さらに、上記作業を行なうには、膨大な実験工数を必要とするため、現実的に実施は困難である。また、一個の細胞から遺伝子を単離するため、抗体を発現している細胞を見つけても抗体遺伝子の増幅効率は低く、非特許文献９で報告されている抗体遺伝子の増幅確率はＨ鎖で２７％、Ｌ鎖で５５％程度である。
【００１１】
以上より、ウサギモノクローナル抗体の性能が高いことは報告されているものの、ウサギモノクローナル抗体自体はウサギミエローマ細胞を有する一部の施設でしか生産できないため、当該抗体の工業的な利用を困難にしていた。
【００１２】
【特許文献１】特開平１０−２６２６５７号
【非特許文献１】Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１９、２０１；２０００
【非特許文献２】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２，９３４８；１９９５
【非特許文献３】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、５８、１１０４；１９６７
【非特許文献４】Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５４，１０９５；１９６６
【非特許文献５】Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０、１７８８；１９８８
【非特許文献６】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５、１３６６８；２０００
【非特許文献７】Ｇｅｎｅ、１７２、２９５；１９９６
【非特許文献８】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ．、２１３、２０１；１９９８
【非特許文献９】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、７８４３；１９９６
【非特許文献１０】Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，”Ｔｈｅ ＥＢＶ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｉｔｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ” Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ Ｉｎｃ．７７−９６；１９８５
【非特許文献１１】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２、３９３５；１９９４
【非特許文献１２】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３２５、３２５；２００３
【非特許文献１３】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１３、６１７１；１９９５
【非特許文献１４】Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１５、６１７１；１９８７
【非特許文献１５】Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１０、１５３５；１９８２
【非特許文献１６】Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０８、６７３；１９９０
【非特許文献１７】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１７、１３５；１９９５
【非特許文献１８】Ｊ．Ｆｅｒｍ．Ｂｉｏｅｎｇ．、７９、４０５；１９９５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明が解決しようとする課題は、ウサギミエローマ細胞を有する特定の機関でのみ作製可能であったウサギモノクローナル抗体を、通常の実験施設と分子生物学の知識があれば製造できる技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を鑑みてなされた本発明は、以下の発明を包含する。
【００１５】
第一の発明は、抗原を免疫したウサギから抗体産生細胞を単離し、目的とする抗体遺伝子を保有する細胞を選別し、選別した細胞から重鎖および軽鎖の抗体遺伝子を単離、増幅し、発現ベクターに導入後、ホスト細胞に導入することで遺伝子組換えウサギモノクローナル抗体を発現させる遺伝子組換え抗体の製造方法において、目的とする抗体遺伝子を保有する細胞を選別するにあたり、抗体産生細胞を増殖させてから選別することを特徴とする、遺伝子組換え抗体の製造方法である。
【００１６】
第二の発明は、選別した細胞から重鎖および軽鎖の抗体遺伝子を単離する操作を、選別した細胞から抗体遺伝子の脱落が起きない期間内で実施することを特徴とする、第一の発明に記載の遺伝子組換え抗体の製造方法である。
【００１７】
第三の発明は、選別した細胞から重鎖および軽鎖の抗体遺伝子を単離する操作を、抗体産生細胞増殖開始後１４日以内に実施することを特徴とする、第一の発明に記載の遺伝子組換え抗体の製造方法である。
【００１８】
第四の発明は、抗体産生細胞が、抗原を免疫したウサギの脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞のいずれかであることを特徴とする、第一から第三の発明に記載の遺伝子組換え抗体の製造方法である。
【００１９】
第五の発明は、抗体産生細胞を増殖させる方法が、抗体産生細胞を培地中で培養する方法であることを特徴とする、第一から第四の発明に記載の遺伝子組換え抗体の製造方法である。
【００２０】
第六の発明は、抗体産生細胞を増殖させる方法が、不死化能を与えることのできる細胞を融合させて培養する方法であることを特徴とする、第一から第四の発明に記載の遺伝子組換え抗体の製造方法である。
【００２１】
第七の発明は、ウサギに免疫する抗原が、ハプテンまたはペプチドであることを特徴とする、第一から第六の発明に記載の遺伝子組換え抗体の製造方法である。
【００２２】
第八の発明は、ホスト細胞が動物細胞であることを特徴とする、第一から第七の発明に記載の遺伝子組換え抗体の製造方法である。
【００２３】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２４】
（１）抗原の種類
ウサギに免疫する抗原は、特に限定されず、ハプテン、ペプチド、タンパク質、核酸、細胞、脂質、糖鎖、細菌、蛍光物質、ビタミン類の中から任意に選択することができるが、特に、親和性および特異性などにおいて高い抗体性能が要求される抗原に対して本発明を適用するのが好ましい。具体的には、測定原理上高感度測定系を構築するために高い親和性が要求される競合法用の抗原、例えば、エストロン（Ｅ１）、エストラジオール（Ｅ２）、エストリオール（Ｅ３）、プロゲステロン、コルチゾールなどのステロイドホルモン類、サイロニン、サイロキシン、トリヨードサイロニンなどの甲状腺ホルモン類といったハプテンがあげられる。また、競合法用の抗原以外でも、例えば、Ｃペプチド、および脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）といった、高感度が要求されるペプチドへの適用も好ましい一例である。
【００２５】
（２）抗原免疫方法
抗原を免疫するウサギは、抗原の種類によって免疫応答は異なるため、できるだけ多くの系統と匹数に免疫するのが好ましい。ウサギの系統としては、一般に入手可能な日本白色種、およびニュージーランドホワイトが例示されるが、当該系統に限定されるものではない。また、同じ系統のウサギを用いても個体差があるため数匹から１０匹程度の個体に免疫することで、免疫応答の高いウサギ由来の抗体産生細胞を入手するのが好ましい。
【００２６】
ウサギへの免疫方法は特に限定されるものではなく、通常一般的に行なわれている方法で免疫すればよい。例えば、アジュバントとエマルジョンを作製し免疫する方法やタンパク質あるいはペプチドをコードしているＤＮＡを免疫する方法があげられる。
【００２７】
免疫場所も特に限定されない。皮下、腹腔、フットパットといった通常行なわれている場所でウサギに免疫すればよい。
【００２８】
免疫回数は、抗原の種類およびウサギへの応答性によって変動があるため、ＥＬＩＳＡ法あるいはＢＩＡｃｏｒｅ（商品名）（ビアコア社製）で測定することで血清の抗体価を解析し、当該血清の経過を観察して決定するのが好ましい。通常は４回程度の免疫で良いが、場合によってはさらに複数回（期間にして数ヶ月から１年間程度）の免疫が必要な場合もある。
【００２９】
（３）抗体産生細胞の単離
単離の対象となる抗体産生細胞は、抗体を産生する細胞であれば特に限定はされないが、脾臓由来の細胞、リンパ節由来の細胞、末梢血由来の細胞のいずれかを使うのが好ましい。また、抗体産生細胞の単離は通常実施されている方法で実施すればよい。単離した細胞はすぐに使用するのが好ましいが、一般的に入手できる細胞保存溶液中に分散させた状態で、液体窒素あるいはディープフリーザー中で保存することが可能であり、必要に応じて使用することが出来る。
【００３０】
（４）抗体産生細胞の選別
上記（３）で単離した抗体産生細胞から目的とする抗体遺伝子を保有する細胞を選別する必要がある。選別方法としては、非特許文献９にあるように、抗体を産生している細胞から一個の細胞を選別し、選別した細胞から抗体遺伝子を単離、増幅させる方法があるが、当該選別方法では抗原結合能しか評価ができないため、目的の性能を有した抗体を取得するのは困難である。そのため、本発明では、（３）で単離した抗体産生細胞を増殖させ、培養上清中に発現した抗体の有する競合特性、特異性、反応性といった性能を評価し、当該性能が高い抗体を発現している細胞を選別後、抗体遺伝子を単離することを特徴としている。
【００３１】
本発明の製造方法における、抗体産生細胞の増殖方法としては以下の方法が例示できる。
【００３２】
ａ）マイクロウエルプレート中にて、抗体産生細胞を増殖用培地で培養上清中の抗体
性能が評価できるまで培養する方法。
【００３３】
ｂ）通常のハイブリドーマを得る方法のように、抗体産生細胞に不死化能を与えるよ
うな細胞と融合させることで、培養上清中の抗体性能を評価する方法。
【００３４】
ｃ）エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）などのウイルスにより抗体産生細胞を不
死化し培養することで、抗体遺伝子を単離する細胞を選別する方法。
このうち、ａ）またはｂ）の方法を用いて増殖させる方法が好ましい。
【００３５】
ａ）の増殖方法で用いる培地としては、通常用いられる動物細胞用の培地、あるいはＩＬ−４やＬＰＳといった通常よく知られているサイトカイン類を添加した培地が使用できる。
【００３６】
ｂ）の増殖方法で用いる不死化能を与える細胞としては、融合後に抗体を分泌できる融合細胞が得られる細胞であり、かつ、増殖後、抗体の性能を評価した時点で融合細胞中に抗体遺伝子が残存している細胞であれば限定はされないが、抗体産生能を長期間維持できる融合細胞が得られる細胞が特に好ましい。不死化能を与える細胞としては、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）、Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１（ＪＣＲＢ ０００９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（ＪＣＲＢ ９０８５）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８、６５３（ＪＣＲＢ ００２８）、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ−１４（ＪＣＲＢ ００２９）、ＮＳＯ／Ｕ（ＲＣＢ ０２１３）、Ｓ１９４／５ＸＸＯ、ＢＵ１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−８８３７）、ＦＯ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６４６）といったマウスミエローマ関連の細胞や、ＳＫ０−００７、ＨＯ−３２３といったヒト骨髄腫細胞株、ＧＭ１５００ ６ＧＴ−Ａｌ２といったヒトＢ細胞株、Ｙ３−Ａｇ１・２・３といったラット骨髄腫細胞株、ＴＰ−３のウサギ形質転換細胞株、ＶＸ−２といったウサギがん細胞を例示することができる。また、マウスミエローマ細胞株を出発とした細胞株（たとえば特許文献１に記載の２−３Ａ）も、本発明における、好ましい不死化能を与える細胞の一例である。
【００３７】
ｂ）の増殖方法で用いる細胞融合方法は、通常用いられる方法で実施すればよく、例えば、ポリエチレングリコール法、電気融合法、センダイウイルスを用いる方法をあげることができる。
【００３８】
ｃ）の増殖方法は、当業者によく知られている、ヒトリンパ球にＥＢＶなどのウイルスを感染させて増殖させる（非特許文献１０）のと同様な手法で、抗体生産能を有するウサギＢ細胞にＥＢＶなどのウイルスを感染させ、一時的に不死化させる方法である。なお、ウサギＢ細胞に感染させるウイルスとしては前記目的を達成できるものであれば良く、特にＥＢＶに限定されるものではない。
【００３９】
（５）抗体性能の評価方法
抗体遺伝子を保有する細胞を選別するための抗体性能の評価方法は、対象抗体の評価内容に応じて適宜選択すればよい。例えば、評価内容としては、抗原結合能、競合特性、特異性、抗体生産性があげられ、評価方法としてはＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光偏光法をあげることができる。
【００４０】
（６）抗体遺伝子の単離時期
上記（４）で選別した細胞から重鎖（Ｈ鎖）および軽鎖（Ｌ鎖）の抗体遺伝子を単離する時期としては、抗原およびウサギの系統によって最適時期が異なるため、培養上清中に評価するための十分な抗体量が確保でき、かつ、抗体遺伝子の脱落が起きない期間であれば特に限定されないが、実施例１２にあるように抗体産生細胞増殖開始後１６日後で抗体遺伝子を単離すると、抗体遺伝子の増幅効率、および抗原結合活性を持った発現ベクターの取得率が低下していることから、抗体遺伝子の単離は抗体産生細胞増殖開始後１４日以内に実施するのが好ましい。
【００４１】
（７）抗体遺伝子の増幅方法
抗体遺伝子の増幅方法としては通常用いられるＲＴ−ＰＣＲ法が使用できる。また、ＲＴ−ＰＣＲ反応の際に用いる逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼは通常市販の酵素が使用できるが、特にＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡ増幅の際、変異が導入されるのを避けるため、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名）（第一化学薬品社製）やＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名）（タカラバイオ社製）といったフィデリティーの高い酵素を使用するのが好ましい。
【００４２】
抗体遺伝子を増幅するためのプライマーは、抗体の可変領域をコードする領域が増幅されるような位置に設計してあれば、特に場所は限定されない。抗体遺伝子を増幅するために用いるプライマーの組み合わせとしては、抗体遺伝子の全長を増幅することを目的とした開始コドンより上流と終始コドンより下流の非翻訳領域に設計したプライマーの組み合わせ、抗体遺伝子の可変領域を増幅することを目的とした抗体遺伝子内部に設計したプライマーの組み合わせ、あるいは上記プライマーを適宜組み合わせた系を例示することができる。なお、一回のＰＣＲ反応で抗体遺伝子の増幅効率が低い場合には、１回目のＰＣＲ反応産物を鋳型とし、２回目のＰＣＲ反応を行うことで効率よく抗体遺伝子を増幅することが出来る。この際１回目の増幅領域の少し内側に新たなプライマーを作製するほうが効率よく遺伝子を増幅することが出来る場合が多いが、それに限定されるものではない。
【００４３】
また、ウサギＨ鎖は８割以上でＶＨ１を使用していること（非特許文献１１）、およびＬ鎖は８割以上がκ鎖であることが報告されていること（非特許文献１２）から、それぞれの遺伝子に特異的なプライマーセットを用いて増幅するのが好ましい。さらに、抗体遺伝子を増幅するためのプライマーの一態様として、非特許文献１０及び１３から１５に記載のプライマー配列、およびＧｅｎＢａｎｋを参考に設計したプライマー配列（配列番号１から１１）を開示するが、上記目的を達成できるものであれば、他の配列を用いてもかまわない。
【００４４】
（８）発現ベクター
発現用ベクターについては、一般的に報告されているベクターであれば限定されないが、特にｐＥＣＥｄｈｆｒ（非特許文献１６、図４）を発現ベクターとして使用するのが好ましい。また、発現させる抗体の領域も、抗体の可変領域を含むように発現させればよく、発現の形としてはＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ＦＶ、ｓｃＦＶが例示できる。また、単離した抗体遺伝子を出発材料として、種々のアミノ酸変異を加えることで抗体の性能を変化させることは、当業者であれば容易に想到可能である。
【００４５】
（９）ホスト細胞
発現ベクターは適切なホスト細胞に導入することにより、遺伝子組換え抗体を産生させることができる。一過的に遺伝子組換え抗体を高発現させるためには、ＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔ抗原タンパク質発現細胞をホスト細胞として用いるのが好ましく、その一例として、実施例７、１３、１４で使用のＣＯＳ１細胞（非特許文献１７、１８）や、２９３Ｔ細胞、ＣＯＳ７細胞をあげることができる。
【００４６】
また、安定的に遺伝子組換え抗体を発現させるためには、遺伝子組み換え動物／昆虫／植物を用いて発現させることも可能であるが、動物細胞、および酵母や大腸菌に代表される微生物をホスト細胞として用いるのが好ましく、特に動物細胞、その中でもＣＨＯ細胞を用いるのが好ましい。さらに好ましい安定生産株は、抗体遺伝子を増幅することができるｄｈｆｒ遺伝子増幅系を組み込んだベクターをＣＨＯ細胞に導入したホストベクター系である。
【発明の効果】
【００４７】
本発明のウサギモノクローナル抗体の製造方法は、一般に流通していないウサギミエローマ細胞を使用することなく、抗原を免疫したウサギから単離した抗体産生細胞を増殖させてから、抗体遺伝子を保有する細胞を選別し、選別した細胞から抗体遺伝子を単離、増幅することを特徴としており、通常の実験施設と分子生物学の知識があればウサギモノクローナル抗体の製造を可能にする方法である。また、本発明の製造方法は従来技術では困難であった、本来ウサギが作製した重鎖と軽鎖の組み合わせを有するモノクローナル抗体を容易に製造することができるため、これまで限られた施設でしか取り扱うことができない、高い親和性を有したウサギモノクローナル抗体を通常の実験室レベルで容易に取り扱うことが可能となる。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４９】
実施例１ 免疫抗原およびスクリーニング抗原の作製
免疫抗原としてはＥ２−ＢＳＡ（商品名）（Ｓｉｇｍａ社製）を使用した。またＥＬＩＳＡでのスクリーニング用抗原は、下記の方法で作製した。
（１）ＢＣＰ（Ｂｌｕｅ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｐｉｅｒｃｅ社製）１００ｍｇを１０ｍｇ／ｍＬになるようにＰＢＳを加え、６位をＮ−ヒドロキシスクシイミドで活性化したエストラジオール（Ｅ２） １．２５ｍｇをＤＭＦ １ｍＬに溶解したものと混合した。
（２）室温で２時間撹拌後、ＰＢＳで透析（１Ｌ×３回）することでＥ２−ＢＣＰを得た。
【００５０】
実施例２ 動物と抗原免疫方法
免疫動物はウサギ（日本白色種）の１２週齢メスを使用した。初回免疫はフロイント完全アジュバント、２次免疫以降はフロイントの不完全アジュバントを用い、抗原溶液（５００μｇ／ｍＬ）と等量のアジュバントを混合後、エマルジョンを作製した後に２週間間隔で免疫した。免疫抗抗原量は、初回５００μｇで２次免疫以降は２５０μｇである。
【００５１】
次に、以下に示すＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）で、十分な抗体価の上昇を確認した。
（１）Ｅ２−ＢＣＰ（０．５μｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡプレートに固定化後、１％スキムミルクでブロッキングした。
（２）ウサギから採血した血清と反応させた。Ｅ２に結合した抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体は、アルカリホスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を結合させ、未反応の酵素標識抗体をＢ／Ｆ分離後、酵素基質である４―メチルウンベリフェリルリン酸（４−ＭＵＰ）を分注し、蛍光強度を測定することで検出した。
【００５２】
実施例３ 脾臓細胞を用いた抗体産生細胞の増殖（培地での培養）
十分に抗体価が上昇したウサギの脾臓を摘出し、定法に従い脾臓細胞を単離した。脾臓細胞を１０％ＦＣＳを含むＧＩＴ培地（日水製薬社製）に懸濁し、マイクロプレートにまいて培養した。一週間後に培養上清を実施例２に記載の方法で、１９２クローンの培養上清中の抗体を評価した結果を図１に示した。このように、マイクロウエルプレートの上清中に抗体の産生を確認することができた。
【００５３】
実施例４ 末梢血細胞由来のリンパ球を用いた抗体産生細胞の増殖（細胞融合を用いた培養）
以下に示す方法で、末梢血細胞由来のリンパ球と不死化能を与える細胞とを融合させた。
（１）十分に抗体価が上昇したウサギ末梢血から採取したリンパ球と、マウスミエローマ細胞の遺伝子にウサギの染色体が一部組み込まれている細胞（２−３Ａ、特許文献１）を融合した。なお、本細胞（２−３Ａ）は、栄研化学株式会社により樹立されたもので、栄研化学株式会社の好意により譲渡して頂いたものである。
（２）定法（ＰＥＧ法）に従い、２−３Ａ細胞と末梢血細胞由来のリンパ球とを融合させた。
（３）融合後の細胞浮遊液を１０％ＦＣＳ、１×ＨＡＴを含むＧＩＴ培地（日水製薬社製）で懸濁し、マイクロタイタープレートにまいた。
【００５４】
３８４クローンの培養上清中の抗体を実施例２に記載の方法で評価した結果を図２に示した。このように、マイクロウエルプレートの上清中に抗体の産生を確認することができた。
【００５５】
実施例５ 脾臓細胞を用いた抗体産生細胞の増殖（細胞融合を用いた培養）
以下に示す方法で、脾臓細胞と不死化能を与える細胞とを融合させた。
（１）十分に抗体価が上昇したウサギの脾臓を摘出し、定法に従って脾臓細胞を調製した。なお、ウサギ脾臓細胞と細胞融合する細胞は、実施例４で使用した細胞（２−３Ａ、特許文献１）を使用した。
（２）定法（ＰＥＧ法）に従い、２−３Ａ細胞とウサギ脾臓細胞を融合させた。
（３）融合後の細胞浮遊液を１０％ＦＣＳ、１×ＨＡＴを含むＧＩＴ培地（日水製薬社製）で懸濁し、マイクロタイタープレートにまいた。
（４）培養上清中の抗Ｅ２抗体の性能を下記の３つのＥＬＩＳＡにより評価した。
（４−１）反応性：Ｅ２−ＢＣＰ（０．５μｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡプレートに固定化した後、１％スキムミルクでブロッキングした。その後、細胞融合後の培養上清を反応させた。Ｅ２に結合した抗Ｅ２ウサギモノクローナル抗体は、アルカリホスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を結合させ、未反応の酵素標識抗体をＢ／Ｆ分離後、酵素基質である４−メチルウンベリフェリルリン酸（４−ＭＵＰ）を分注し、蛍光強度を測定することで検出した。
（４−２）競合特性：反応性を評価する実験系に、Ｅ２（５００ｐｇ／ｍＬ）を共存させる実験を行なった。ここで得られた値（Ｂ）を、反応性で得られた値（Ｂ０）で割ることで、競合特性（Ｂ／Ｂ０値）を算出した。
（４−３）特異性：反応性を評価する実験系に、各種ステロイド（エストロン：Ｅ１、エストリオール：Ｅ３、エチニルエストラジオール：ＥｔＥ２、テストステロン：ＴＳ、各５００ ｐｇ／ｍＬ）を共存させる実験をおこなった。ここで得られた値（Ｂ）を、反応性で得られた値（Ｂ０）で割ることで、特異性（Ｂ／Ｂ０値）を算出した。
【００５６】
以上得られた３つのデータをグラフ化した（図３）。横軸に特異性（Ｂ／Ｂ０値）を、縦軸に競合特性（Ｂ／Ｂ０値）を、反応性は円の大きさでプロットした。このグラフの中で、黒丸で塗りつぶしたクローンは、競合特性が高く、特異性も高く、かつ、反応性も高いクローンである。
【００５７】
実施例６ 抗体遺伝子の単離・増幅と発現ベクターの作製
実施例５の結果、図３で黒丸で塗りつぶしたクローンを選別後、当該クローンから以下の方法で抗体遺伝子を単離、増幅後、発現ベクターを作製した。
（１）ＭａｇＭａｘＴＭ−９６ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（商品名）（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用い、添付されているプロトコルに従って細胞からのＲＮＡの単離を行なった。
（２）単離したＲＮＡを鋳型とし、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ Ｙｏｕ−Ｐｒｉｍｅ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｂｅａｄｓ（商品名）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、逆転写反応を行ないｃＤＮＡを合成した。
（３）ウサギ抗体遺伝子に特異的なプライマー（重鎖（Ｈ鎖）および軽鎖（Ｌ鎖）に特異的なプライマー、配列番号１から４、なお配列１と２はＨ鎖、配列３と４はＬ鎖にそれぞれ特異的なプライマーである）を用いＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名）（第一化学薬品社製）で、抗体遺伝子をＰＣＲ反応で増幅させた。条件を以下に示す。
【００５８】
（試薬組成）
キットに添付の緩衝液で、ｄＮＴＰ ０．２μＭ、プライマーはそれぞれ０．５
μＭで行なった。
【００５９】
（反応条件）
９８℃で３０秒保持後、９８℃で１０秒、７２℃で５０秒のサイクルを３５サイ
クル繰り返し、その後７２℃で１０分間保持した。
（４）電気泳動で遺伝子の増幅を確認した。
（５）得られたＨ鎖及びＬ鎖のＰＣＲフラグメントを、ＢｇｌＩＩとＸｂａＩで制限酵素処理した後、動物細胞用発現ベクター（ｐＥＣＥｄｈｆｒ：図４）のＢｇｌＩＩ／ＸｂａＩサイトに導入し、Ｈ鎖、Ｌ鎖用の発現ベクターを調製した。
【００６０】
実施例７ 遺伝子組換え抗体の発現（ＣＯＳ細胞による一過性発現）と精製
実施例６で得られたＨ鎖、Ｌ鎖用の発現ベクターからＣＯＳ１細胞（非特許文献１７、１８）での遺伝子組換え抗体の生産を行なった。なお、実施例６における抗体遺伝子の単離操作は細胞融合後８日目に実施した。
（１）９６ウエルプレート上で対数増殖期にあるＣＯＳ細胞に、Ｈ鎖発現ベクターとＬ鎖発現ベクター各２００ｎｇを、リポフェクトアミン２０００（商品名）（インビトロジェン社製）で導入した。遺伝子導入時の培地は、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商品名）（インビトロジェン社製）を使用した。
（２）遺伝子導入から３日後に培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡで抗体の存在を確認した。
（３）抗原結合能が確認された抗体遺伝子ペアを有するＣＯＳ細胞を、培養スケールを上昇させて培養し、抗体の一過性発現を行なった。
（４）定法に従い培養上清からＰｒｏｔｅｉｎ Ｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）で抗Ｅ２抗体を精製した。抗体の性能を評価し、競合特性、特異性、生産性などの点から性能が高かった抗体を選定した。
【００６１】
実施例８ ウサギモノクローナル抗体安定産生株の作製
実施例７で選定した抗体の発現ベクターをＣＨＯ細胞に導入することで、抗体安定産生株を作製した。
【００６２】
対数増殖期にある、ＣＨＯ細胞（ＤＸＢ１１：ｄｈｆｒ欠損株）に実施例７と同じ条件で遺伝子を導入し、アルファーＭＥＭ（−）に１０％透析血清を添加した培地で、細胞を培養した。その後、ＭＴＸ（メソトレキセート）の濃度を５ｎＭから５００ｎＭまで段階的に上昇させ、ウサギモノクローナル抗体Ｕ−１発現ＣＨＯ細胞を得た。
【００６３】
実施例９ 発現抗体の親和性測定
ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ−１００（商品名）（ビアコア社製）を用いて、以下に示す３種類のモノクローナル抗体の親和性を測定した。
【００６４】
（ａ）東ソー株式会社で単離したマウスモノクローナル抗体Ｍａ−１
（ｂ）東ソー株式会社で単離したラットモノクローナル抗体Ｒａ−１
（ｃ）本発明で製造したウサギモノクローナル抗体Ｕ−１
親和性は以下に示す方法で測定した。
（１）Ｅ２誘導体（６位にアミノ基が導入されたもの）をアミンカップリング法で、センサーチップ（ＣＭ５）上に結合させたものを使用した。
（２）緩衝液：ＨＢＳ−ＥＰ、温度：２５℃、流速３０μＬ／ｍｉｎ、結合時間：１分、解離時間：１０分、の条件で解析を行なった。
（３）得られたデータを、解析ソフト（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ｖｅｒｓｉｏｎ １．１）を用い、ｂｉｖａｌｅｎｔモデルで解析し、Ｋｄ（Ｍ）の値を算出した。
【００６５】
解離定数（Ｋｄ）を横軸に、縦軸に競合特性（１０００ｐｇ／ｍＬのＥ２が共存したときの値をＥ２が存在しないときの値で割った値。東ソー株式会社製のＡＩＡ−６００ＩＩを用いて測定した結果）を測定すると、親和性の高い抗体ほど競合特性も高く、高感度な測定系を構築できることがわかる（図５）。マウスモノクローナル抗体Ｍａ−１（Ｋｄ＝８．１×１０−１０Ｍ）、ラットモノクローナル抗体Ｒａ−１（Ｋｄ＝５．２×１０−１１Ｍ）はそれぞれ一般的には親和性の高い抗体に分類されるが、本発明で製造したウサギモノクローナル抗体Ｕ−１（Ｋｄ＝３．３×１０−１３Ｍ）はＭａ−１よりも約２５００倍、Ｒａ−１よりも約１６０倍、それぞれ親和性が向上していた。
【００６６】
実施例１０ 単離した抗体の蛍光偏光解消法による評価
単離した抗体を蛍光偏光解消法で結合性を評価した（図６）。テトラメチルローダミンで標識したＥ２を使用し、横軸に抗体濃度を、縦軸に蛍光偏光度（ｍＰ）をプロットしたものである。テトラメチルローダミン標識Ｅ２のｍＰ値を２０としたとき、抗体濃度を増加させた場合の偏光度の変化を示している。抗体濃度が高くなるにつれ、テトラメチルローダミンで標識されたＥ２が抗体と結合するため、大きい偏光度を得るようになる。本発明で製造したウサギモノクローナル抗体Ｕ−１は、マウスモノクローナル抗体Ｍａ−１、ラットモノクローナル抗体Ｒａ−１と比較して１００倍以上低い濃度で偏光度が増加している。このことは、Ｕ−１が、Ｍａ−１およびＲａ−１より親和性が極めて高いことを示している。
【００６７】
実施例１１ ＡＩＡ試薬形態でのモノクローナル抗体の評価
本発明で製造したウサギモノクローナル抗体Ｕ−１を使用した免疫反応試薬を、ポリクローナル抗体を使用した免疫反応試薬（Ｅテスト「ＴＯＳＯＨ」ＩＩ Ｅ２、東ソー社製）と性能を比較した。両免疫反応試薬の検量線を図７に示す。Ｅ２の検出限界はポリクローナル抗体を使用した免疫反応試薬が２５．２ｐｇ／ｍＬであるのに対し、Ｕ−１を使用した免疫反応試薬は２２．４ｐｇ／ｍＬと、ポリクローナル抗体を使用した免疫反応試薬より高感度な測定系が構築できることが明らかとなった。
【００６８】
また、エストロン（Ｅ１）およびエストリオール（Ｅ３）といった、類似ステロイドへの交差反応性（１０ｎｇ／ｍＬ）を測定したところ、Ｅ１の場合（市販のＡＩＡ試薬：４．７７％、ウサギモノクローナル抗体Ｕ−１を用いたＡＩＡ試薬：０．９２％）、Ｅ３の場合（市販のＡＩＡ試薬：４．１９％、ウサギモノクローナル抗体Ｕ−１を用いたＡＩＡ試薬：０．２８％）、いずれもステロイド類に対する交差反応性が大幅に改善された。
【００６９】
次に、４０例の実検体を用いて両測定系の相関性を見た結果を図８に示した。回帰係数０．９２４、ｙ切片−２．３８７ｐｇ／ｍＬ、相関係数ｒ＝０．９９８というきわめて高い相関性を示した。
【００７０】
実施例１２ 遺伝子単離時期と単離される遺伝子の割合
ヘテロハイブリドーマは遺伝子が脱落しやすいとの情報はあるが、それがどの程度の時間で消失してしまうかなどの詳細な解析は報告されていなかった。本発明者らも、細胞融合後の培養上清をＥＬＩＳＡで評価し、抗体が培養上清に発現していることを確認した後、その細胞から抗体遺伝子の増幅を試みても、抗体遺伝子が増幅できないという問題に直面した。ＰＣＲの条件、プライマーの配列などの種々の観点から遺伝子が増幅できない理由を検討した結果、細胞融合後に得られたヘテロハイブリドーマを経代培養する際、通常のマウスモノクローナル抗体を取り扱うのと同じ感覚で取り扱うと、抗体を発現しなくなる時期の特定が難しいことを見出した。通常、細胞を継代培養する際は、細胞懸濁液を約１０倍量程度の新しい培地に移して培養を継続するため、はじめの培養上清中は、新しい培地に移すことで希釈されてゆく。つまり、細胞が安定に抗体を発現していない場合は、培養上清が希釈されるため、継代培養後の培養上清のシグナルは激減する。しかし、ウサギモノクローナル抗体の場合はこの理論は当てはまらなかった。ウサギモノクローナル抗体はマウスモノクローナル抗体と比較して、極端に親和性が高く、継代培養により培養上清が１０倍あるいは１００倍程度希釈されてもＥＬＩＳＡでは十分なシグナルが得られるため、すでにヘテロハイブリドーマから抗体遺伝子は脱落し、抗体は発現していないにもかかわらず、ＥＬＩＳＡでは陽性判定となってしまう。このことは、実施例１０において、本特許で単離したウサギモノクローナル抗体とマウスモノクローナル抗体の結合性の比較を行なった結果、ウサギモノクローナル抗体はマウスモノクローナル抗体より１００倍以上低い濃度でも抗原結合能が観察されていることからも裏づけできる。
【００７１】
そこで、実施例６において、細胞融合後に抗体遺伝子を単離する時期を変更し、最適な単離時期について検討した。結果を表１に示す。
【００７２】
【表１】
細胞融合後８日目で遺伝子を増幅すると、３回の実験の平均で、Ｈ鎖遺伝子は８６．１％、Ｌ鎖遺伝子は９４．４％の確率で増幅できた。そして、増幅した遺伝子から発現ベクターを作製しＣＯＳ細胞で発現させた抗体を評価したところ、７５．０％の抗体は抗原結合能を有していた。また、３回の実験を通じ、安定した増幅率および抗体取得率を示したことから、当該期間で増幅すると抗体結合活性を持ったベクターを安定的に取得できることがわかる。
【００７３】
一方、細胞融合後１６日目で遺伝子を単離すると、それぞれの数値は、２５．０％、８８．９％、９．５２％と低下した。このことから、単離する時期が遅いと特にＨ鎖遺伝子で急速な抗体遺伝子の脱落が起きていることがわかる。
【００７４】
実施例１３ 抗トリヨードサイロニン（Ｔ３）抗体の単離
抗トリヨードサイロニン（Ｔ３）ウサギモノクローナル抗体を以下の方法で単離した。
【００７５】
（１）免疫抗原の作製
ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社製）２５ｍｇを１０ｍｇ／ｍＬになるように、ホウ酸バッファー（０．０５Ｍ、ｐＨ８．５）を加え、カルボン酸をメチルエステルとして保護した後、アミノ基からリンカーを伸ばした。次に、前記溶液と、Ｎ−ヒドロキシスクシイミドで活性化したＴ３ ７ｍｇをＤＭＳＯ １００μＬに溶解した液とを混合した。室温で３０分撹拌後、ＰＢＳで透析（５００ｍＬ×３回）することで、免疫抗原であるＴ３−ＢＳＡを得た。
【００７６】
（２）スクリーニング抗原の作製
ＢＣＰ（Ｂｌｕｅ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて（１）と同様の方法で作製した。ＢＣＰ ２５ｍｇを１０ｍｇ／ｍＬになるように、ホウ酸バッファー（０．０５Ｍ、ｐＨ８．５）を加えた。前記溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシイミドで活性化したＴ３ ７ｍｇをＤＭＳＯ １００μＬに溶解した液とを混合した。室温で３０分撹拌後、ＰＢＳで透析（５００ｍＬ×３回）することで、ＥＬＩＳＡでのスクリーニング抗原であるＴ３−ＢＣＰを得た。
【００７７】
（３）動物と抗原免疫方法
免疫動物はウサギ（日本白色種）の１２週齢メスを使用した。初回免疫はフロイント完全アジュバント、２次免疫以降はフロイントの不完全アジュバントを用い、抗原溶液（５００μｇ／ｍＬ）と等量のアジュバントを混合後、エマルジョンを作製した後に２週間間隔で免疫した。免疫抗抗原量は、初回１ｍｇで２次免疫以降は５００μｇである。
【００７８】
次に、以下に示すＥＬＩＳＡで十分な抗体価の上昇を確認した。
（３−１）Ｔ３−ＢＣＰ（０．５μｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡプレートに固定化後、１％スキムミルクでブロッキングした。
（３−２）ウサギから採血した血清と反応させた。Ｔ３に結合した抗Ｔ３ウサギモノクローナル抗体は、アルカリホスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を結合させ、未反応の酵素標識抗体をＢ／Ｆ分離後、酵素基質である４―メチルウンベリフェリルリン酸（４−ＭＵＰ）を分注し、蛍光強度を測定することで検出した。
【００７９】
（４）抗体産生細胞の増殖（培地での培養）
十分に抗体価が上昇したウサギの脾臓を摘出し、細胞凍結保存液（セルバンカー１（商品名）、日本全薬工業社製）中に分散させた状態で、ディープフリーザー中（−８０℃）で保存した。保存細胞は定法に従って解凍し、ＧＩＴ培地（日水製薬社製）で懸濁し、マイクロタイタープレートにまいた。５日間培養後の培養上清中にある抗Ｔ３抗体の性能は下記の３つのＥＬＩＳＡにより評価した。
（４−１）反応性：Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（０．５μｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡプレートに固定化した後、１％スキムミルクでブロッキングした。その後、培養上清とアルカリホスファターゼ標識Ｔ３を同時に反応させた。ウサギモノクローナル抗体に未反応の酵素標識Ｔ３をＢ／Ｆ分離後、酵素基質である４−メチルウンベリフェリルリン酸（４−ＭＵＰ）を分注し、蛍光強度を測定することで検出した。
（４−２）競合特性：反応性を評価する実験系に、Ｔ３（２ｎＭ）を共存させる実験を行なった。ここで得られた値（Ｂ）を、反応性で得られた値（Ｂ０）で割ることで、競合特性（Ｂ／Ｂ０値）を算出した。
（４−３）競合特性：反応性を評価する実験系に、Ｔ４（２０ｎＭ）を共存させる実験を行なった。ここで得られた値（Ｂ）を、反応性で得られた値（Ｂ０）で割ることで、特異性（Ｂ／Ｂ０値）を算出した。
【００８０】
以上得られた３つのデータをグラフ化した（図９）。横軸に特異性（Ｂ／Ｂ０値）を、縦軸に競合特性（Ｂ／Ｂ０値）を、反応性は円の大きさでプロットした。このグラフの中で、黒丸で塗りつぶしたクローンは、競合性能が高く、特異性も高く、かつ反応性も高いクローンである。
【００８１】
（５）抗体遺伝子の単離・増幅と発現ベクターの作製
（４）の結果、図９で黒丸で塗りつぶしたクローンを選別後、選別した次の日に以下の方法で抗体遺伝子の単離を行なった。
（５−１）ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（商品名）（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、添付されているプロトコルに従って、細胞からのＲＮＡの抽出を行なった。
（５−２）（５−１）で得られたＲＮＡを鋳型とし、Ｓｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｋｉｔ（商品名）（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて逆転写反応を行ない、ｃＤＮＡを合成した。
（５−３）ウサギ抗体遺伝子に特異的なプライマー（Ｈ鎖およびＬ鎖に特異的なプライマー。配列番号１から３、５から７）を用いＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名）（第一化学薬品社製）で、抗体遺伝子を増幅させた。条件は以下に示す。なお、Ｈ鎖を増幅させる際の二回目のＰＣＲは、一回目のＰＣＲ産物（２μＬ）を鋳型とした他は、一回目のＰＣＲと同じ試薬組成／反応条件で行なっている。
【００８２】
（試薬組成）
キットに添付の緩衝液で、ｄＮＴＰ ０．２μＭ、プライマーはそれぞれ０．５
μＭで行なった。
【００８３】
（反応条件）
９８℃で３０秒保持後、９８℃で１０秒、７２℃で５０秒のサイクルを３５サイ
クル繰り返し、その後７２℃で１０分間保持した。
【００８４】
（プライマー）
Ｈ鎖：一回目のＰＣＲでは配列２及び５、二回目のＰＣＲでは配列１及び６
Ｌ鎖：配列番号３及び７
（５−４）電気泳動で遺伝子の増幅を確認した。
（５−５）得られたＨ鎖及びＬ鎖のＰＣＲフラグメントを、ＢｇｌＩＩとＸｂａＩで制限酵素処理した後、動物細胞用発現ベクター（ｐＥＣＥｄｈｆｒ：図４）のＢｇｌＩＩ／ＸｂａＩサイトに導入し、Ｈ鎖、Ｌ鎖用の発現ベクターを調製した。
【００８５】
（６）遺伝子組み換え抗体の発現（ＣＯＳ細胞による一過性発現）
（５）で得られたＨ鎖、Ｌ鎖用発現ベクターからＣＯＳ１細胞（非特許文献１７、１８）での遺伝子組み換え抗体の生産を行なった。
（６−１）９６ウエルプレート上で対数増殖期にあるＣＯＳ細胞に、Ｈ鎖発現ベクターを１６．６ｎｇ、及びＬ鎖発現ベクターを８．３ｎｇを、リポフェクトアミン２０００（商品名）（インビトロジェン社）で導入した。遺伝子導入時の培地は、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商品名）（インビトロジェン社）を使用した。
（６−２）遺伝子導入から３日後に培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡで抗体の存在を確認した。
（６−３）抗原結合能が確認された抗体遺伝子ペアを有するＣＯＳ細胞を、培養スケールを上昇させて培養し、抗体の一過性発現を行なった。
【００８６】
（７）ＡＩＡ試薬形態でのモノクローナル抗体の評価
（６）で作製した、ウサギ由来抗Ｔ３モノクローナル抗体（ＵＴ１Ｄ−５）を用いて、ＡＩＡ用テストカップを作製した。ＡＩＡは東ソー株式会社で販売している全自動免疫診断システムであり、今回作製した抗体を使用してＡＩＡ用の免疫反応試薬を作製し評価を行なった。
【００８７】
今回単離したウサギモノクローナル抗体ＵＴ１Ｄ−５を用いた免疫反応試薬、及びマウス由来抗Ｔ３モノクローナル抗体を用いた免疫反応試薬の検量線を図１０に示した。図１０に示すように、今回単離した抗体を用いることで、マウス由来の試薬より高感度な測定系を構築できることが明らかとなった。
【００８８】
今回作製したＵＴ１Ｄ−５を用いた免疫反応試薬を用いて交差反応性を評価した結果を図１１に示す。図１１より、今回単離した抗体はＴ３の類似化合物のサイロキシン（Ｔ４）には全く交差反応性を有しておらず、Ｔ３に対して非常に高い特異性を有していることがわかる。
【００８９】
実施例１４ 抗脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）抗体の単離
抗脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）ウサギモノクローナル抗体を以下の方法で単離した。
【００９０】
（１）免疫抗原の作製
ＢＮＰのＣ末端側７アミノ酸に相当するペプチド（ＣＫＶＬＲＲＨ、配列番号１２）を合成した。合成したペプチドのＮ末端にあるシステインを利用して、マレイミド−ＫＬＨ（ＰＩＥＲＣＥ社製）と反応させ、これを免疫抗原として使用した。反応方法は添付されたプロトコルに従い、ペプチド１ｍｇに対して、マレイミド−ＫＬＨを１ｍｇ反応させた。
【００９１】
（２）スクリーニング抗原の作製
ＢＮＰのＣ末端の７アミノ酸に相当するペプチド（ＣＫＶＬＲＲＨ、配列番号１２）のＮ末端に、リンカー配列（ＧＧＧＳＧＧＧＳ、配列番号１３）を付加し、さらにＮ末端をビオチン化したペプチド（ｂｉｏｔｉｎ−ＧＧＧＳＧＧＧＳＣＫＶＬＲＲＨ、配列番号１４、以降Ｂｉｏ−ＢＮＣと表記）を作成し、これをＥＬＩＳＡでのスクリーニング抗原として使用した。
【００９２】
（３）動物と抗原免疫方法
免疫動物はウサギ（日本白色種）の１２週齢メスを使用した。初回免疫はフロイント完全アジュバント、２次免疫以降はフロイントの不完全アジュバントを用い、抗原溶液（５００μｇ／ｍＬ）と等量のアジュバントを混合後、エマルジョンを作製した後に２週間間隔で免疫した。免疫抗抗原量は、初回５００μｇで２次免疫以降は２５０μｇである。
【００９３】
次に、以下に示すＥＬＩＳＡで、十分な抗体価の上昇を確認した。
（３−１）ストレプトアビジン（０．５μｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡプレートに固定化後、１％スキムミルクでブロッキングした。
（３−２）Ｂｉｏ−ＢＮＣ（０．５μｇ／ｍＬ）を反応させたＥＬＩＳＡプレートを作製した。その後、抗原を免疫したウサギの血清を反応させた。Ｂｉｏ−ＢＮＣに結合した抗ＢＮＰウサギモノクローナル抗体は、アルカリホスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を結合させ、未反応の酵素標識抗体をＢ／Ｆ分離後、酵素基質である４―メチルウンベリフェリルリン酸（４−ＭＵＰ）を分注し、蛍光強度を測定することで検出した。
【００９４】
（４）抗体産生細胞の増殖（培地での培養）
十分に抗体価が上昇したウサギの脾臓を摘出し、細胞凍結保存液（セルバンカー１（商品名）、日本全薬工業社製）中に分散させた状態で、ディープフリーザー中（−８０℃）で保存した。保存細胞は定法に従って解凍し、ＧＩＴ培地（日水製薬社製）で懸濁し、マイクロタイタープレートにまいた。５日間培養後の培養上清中にある抗ＢＮＰ抗体の性能は下記のＥＬＩＳＡにより評価した。
（４−１）ストレプトアビジン（０．５μｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡプレートに固定化後、１％スキムミルクでブロッキングし、その後、Ｂｉｏ−ＢＮＣ（０．５μｇ／ｍＬ）を反応させたＥＬＩＳＡプレートを作製した。
（４−２）培養上清と反応させた。Ｂｉｏ−ＢＮＣに結合した抗ＢＮＰウサギモノクローナル抗体は、アルカリホスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を結合させ、未反応の酵素標識抗体をＢ／Ｆ分離後、酵素基質である４―メチルウンベリフェリルリン酸（４−ＭＵＰ）を分注し、蛍光強度を測定することで検出した。
【００９５】
得られた結果を図１２に示す。図１２の結果よりシグナルが強いクローンを選別し、抗体遺伝子を単離した。
【００９６】
（５）抗体遺伝子の単離と発現ベクターの作製
（４）で選別したクローンから以下の方法で抗体遺伝子の単離を行なった。
（５−１）ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（商品名）（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、添付されているプロトコルに従い、細胞からのＲＮＡの抽出を行なった。
（５−２）得られたＲＮＡを鋳型とし、Ｓｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｋｉｔ（商品名）（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、逆転写反応を行ないｃＤＮＡを合成した。
（５−３）ウサギ抗体遺伝子に特異的なプライマー（Ｈ鎖およびＬ鎖に特異的なプライマー。配列番号２、３、６から１１参照）を用いＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（第一化学薬品社製）で、抗体遺伝子を増幅させた。条件は以下に示す。なお、二回目のＰＣＲ（反応液量５０μＬ）を行なう際、Ｈ鎖を増幅させる場合は、一回目のＰＣＲ産物（２μＬ）を鋳型とした他は、一回目のＰＣＲと同じ試薬組成／反応条件で行なっており、Ｌ鎖を増幅させる場合は、一回目のＰＣＲ産物をＴＥで１０００倍希釈した液（２μＬ）を鋳型とした他は、一回目のＰＣＲと同じ試薬組成／反応条件で行なっている。
【００９７】
（試薬組成）
キットに添付の緩衝液で、ｄＮＴＰ ０．２μＭ、プライマーはそれぞれ０．５
μＬで行なった。
【００９８】
（反応条件）
９８℃で３０秒保持後、９８℃で１０秒、７２℃で５０秒のサイクルを３５サイ
クル繰り返し、その後７２℃で１０分間保持した。
【００９９】
（プライマー）
Ｈ鎖：一回目のＰＣＲでは配列２及び６、二回目のＰＣＲでは配列８及び９
Ｌ鎖：一回目のＰＣＲでは配列３及び７、二回目のＰＣＲでは配列１０及び１１
（５−４）電気泳動で遺伝子の増幅を確認した。
（５−５）得られたＨ鎖及びＬ鎖のＰＣＲフラグメントは、ＢｇｌＩＩ／ＸｂａＩで制限酵素処理した後、動物細胞用発現ベクター（ｐＥＣＥｄｈｆｒ：図４）のＢｇｌＩＩ／ＸｂａＩサイトにＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（商品名）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて導入し、Ｈ鎖、Ｌ鎖用の発現ベクターを調製した。
【０１００】
（６）遺伝子組み換え抗体の発現（ＣＯＳ細胞による一過性発現）
（５）で得られたＨ鎖、Ｌ鎖用発現ベクターからＣＯＳ１細胞（非特許文献１７、１８）での遺伝子組み換え抗体の生産を行なった。
（６−１）９６ウエルプレート上で対数増殖期にあるＣＯＳ細胞に、Ｈ鎖発現ベクターを２０ｎｇ、及びＬ鎖発現ベクターを２０ｎｇを、リポフェクトアミン２０００（商品名）（インビトロジェン社製）で導入した。遺伝子導入時の培地は、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商品名）（インビトロジェン社製）を使用した。
（６−２）遺伝子導入から３日後に培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡで抗体の存在を確認した。抗原結合能が確認された２つのクローン（２７、４５）を取得した。
【０１０１】
（７）サンドイッチアッセイ系でのモノクローナル抗体の評価
（６）で取得したクローンより得られたウサギ由来抗ＢＮＰモノクローナル抗体（２７、４５）を、以下の方法でＥＬＩＳＡにより評価した。
（７−１）抗ウサギ抗体（１０μｇ／ｍＬ）を固定化したＥＬＩＳＡプレートに、（６）で取得したクローンから抗体を一過性発現させた後の培養上清を反応させ、その後ＢＮＰ（０．１μｇ／ｍＬ）を反応させた。
（７−２）さらに、アルカリフォスファターゼで標識されたＢＮＰの環状部位を認識する抗体（タンパク質濃度として、Ａ２８０ｎｍ＝０．００３）を反応させた。
（７−３）未反応の酵素標識抗体をＢ／Ｆ分離後、酵素基質である４―メチルウンベリフェリルリン酸（４−ＭＵＰ）を分注し、蛍光強度を測定することで検出した。
【０１０２】
得られた結果を図１３に示した。図１３の結果より、ＢＮＰの有無で、反応性に明確な差が見られたことから、ＢＮＰのＣ末端を認識するウサギモノクローナル抗体が単離されたことが確認できた。
【０１０３】
実施例１５ 細胞融合後のＥＬＩＳＡのシグナル値の変化
Ｅ２−ＢＳＡを免疫したウサギ凍結脾臓細胞を使用して以下に示す実験を行なった。
（１）実施例５に示す方法に従い、細胞融合を行ない、マイクロタイタープレートに融合細胞をまいた。
（２）培養１、２、３、４、７、１１日目に培養上清を同量とった。なお、培養上清をとる際に、同量の同じ組成の培地を加えることで培地の量を維持している。
（３）得られた培養上清を、実施例２に示すＥＬＩＳＡで評価した。
【０１０４】
結果を図１４に示す。細胞融合後１日目から７日目まではシグナル強度が上昇していたが、７日目以降はシグナルの強度にほとんど変化がなかった。以上の結果より、抗体遺伝子を単離する際、細胞融合した後、７日前後培養した培養上清から単離するのが好ましいことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０１０５】
本発明の製造方法により、親和性が高い特徴を有するウサギモノクローナル抗体を、通常の実験施設と分子生物学の知識があれば製造することができる。また、本発明の方法で製造したウサギモノクローナル抗体を免疫診断薬に用いることで、高感度で夾雑物の影響を受けない測定系を構築できる。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】脾臓由来の細胞を培養し、１９２クローンの培養上清の抗原結合能力を評価した結果。
【図２】末梢血由来のリンパ球を使った細胞融合後の培養上清中の抗体をＥＬＩＳＡで評価した結果。
【図３】３８４０クローンの培養上清のスクリーニングの結果。縦軸は競合特性を、横軸は特異性を、各プロットの大きさは反応性を、それぞれ示す。また、図中の黒丸のプロットで示す抗体は、競合性能が高く、特異性も高く、かつ、反応性も高いクローンであり、当該クローンから、抗体遺伝子を単離した。
【図４】発現ベクターｐＥＣＥｄｈｆｒの構造。図中のＳＶ４０ＰはＳＶ４０のプロモーターを、ｄｈｆｒはジヒドロフォレート・リダクターゼ遺伝子を、ｐｏｌｙＡはポリアデニレートアタッチメントシグナルを、Ａｍｐはアンピシリン耐性遺伝子を、ＭＣＳはマルチクローニングサイトを、それぞれ示す。
【図５】マウスモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体、および本発明で製造したウサギモノクローナル抗体を用いて、競合特性を比較した結果。縦軸は１０００ｐｇ／ｍＬの濃度のＥ２を測定した際のＢ／Ｂ０値を、横軸は解離定数を、それぞれ示す。
【図６】各抗体の性能を蛍光偏光解消法で評価した結果。縦軸は偏光度を、横軸は抗体の濃度を、それぞれ示す。抗原として使用した蛍光物質標識Ｅ２の偏光度は２０とした。図中の黒丸はマウスモノクローナル抗体Ｍａ−１を、白丸はラットモノクローナル抗体Ｒａ−１を、黒四角は本発明で製造したウサギモノクローナル抗体Ｕ−１を、それぞれ使用したときの結果である。
【図７】東ソー社製の全自動免疫診断システム用の試薬を作製し、検量線を描いた結果。図中の白丸はポリクローナル抗体を使用した免疫反応試薬（Ｅテスト「ＴＯＳＯＨ」ＩＩ Ｅ２、東ソー社製）を、黒丸は本発明で製造したウサギモノクローナル抗体Ｕ−１を使用した免疫反応試薬を、それぞれ使用したときの結果である。
【図８】ポリクローナル抗体を使用した免疫反応試薬（Ｅテスト「ＴＯＳＯＨ」ＩＩ Ｅ２）と、本発明で製造したウサギモノクローナル抗体Ｕ−１を使用した免疫反応試薬にて、実検体を測定し相関をとった結果。
【図９】３８４０クローンの培養上清のスクリーニングの結果。縦軸は競合特性を、横軸は特異性を、各プロットの大きさは反応性を、それぞれ示す。また、図中の黒丸のプロットで示す抗体は、競合性能が高く、特異性も高く、かつ反応性も高いクローンであり、当該クローンから、抗体遺伝子を単離した。
【図１０】東ソー社製の全自動免疫診断システム用の試薬を作製し、検量線を描いた結果。図中の黒丸は本発明で製造したウサギモノクローナル抗体ＵＴ１Ｄ−５を用いた免疫反応試薬を、白四角はマウスモノクロナール抗体を用いた免疫反応試薬を、それぞれ使用したときの結果である。
【図１１】交差反応性を評価した結果。横軸にＴ３またはＴ４の濃度を示し，縦軸はＢ／Ｂ０値を示す。
【図１２】３８４０クローンの培養上清のスクリーニングの結果。縦軸は蛍光強度を示し横軸はクローンを示す。
【図１３】一過性発現で得られた抗ＢＮＰ抗体（Ｃ末端認識）とＢＮＰの環状部位を認識する抗体によるＢＮＰのサンドイッチアッセイ結果。
【図１４】細胞融合後の培養上清中の抗体量の推移をＥＬＩＳＡで評価した結果。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原を免疫したウサギから抗体産生細胞を単離し、目的とする抗体遺伝子を保有する細胞を選別し、選別した細胞から重鎖および軽鎖の抗体遺伝子を単離、増幅し、発現ベクターに導入後、ホスト細胞に導入することで遺伝子組換えウサギモノクローナル抗体を発現させる遺伝子組換え抗体の製造方法において、目的とする抗体遺伝子を保有する細胞を選別するにあたり、抗体産生細胞を増殖させてから選別することを特徴とする、遺伝子組換え抗体の製造方法。
【請求項２】
選別した細胞から重鎖および軽鎖の抗体遺伝子を単離する操作を、選別した細胞から抗体遺伝子の脱落が起きない期間内で実施することを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子組換え抗体の製造方法。
【請求項３】
選別した細胞から重鎖および軽鎖の抗体遺伝子を単離する操作を、抗体産生細胞増殖開始後１４日以内に実施することを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子組換え抗体の製造方法。
【請求項４】
抗体産生細胞が、抗原を免疫したウサギの脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞のいずれかであることを特徴とする、請求項１から３に記載の遺伝子組換え抗体の製造方法。
【請求項５】
抗体産生細胞を増殖させる方法が、抗体産生細胞を培地中で培養する方法であることを特徴とする、請求項１から４に記載の遺伝子組換え抗体の製造方法。
【請求項６】
抗体産生細胞を増殖させる方法が、不死化能を与えることのできる細胞を融合させて培養する方法であることを特徴とする、請求項１から４に記載の遺伝子組換え抗体の製造方法。
【請求項７】
ウサギに免疫する抗原が、ハプテンまたはペプチドであることを特徴とする、請求項１から６に記載の遺伝子組換え抗体の製造方法。
【請求項８】
ホスト細胞が動物細胞であることを特徴とする、請求項１から７に記載の遺伝子組換え抗体の製造方法。
【請求項１】
抗原を免疫したウサギから抗体産生細胞を単離し、目的とする抗体遺伝子を保有する細胞を選別し、選別した細胞から重鎖および軽鎖の抗体遺伝子を単離、増幅し、発現ベクターに導入後、ホスト細胞に導入することで遺伝子組換えウサギモノクローナル抗体を発現させる遺伝子組換え抗体の製造方法において、目的とする抗体遺伝子を保有する細胞を選別するにあたり、抗体産生細胞を増殖させてから選別することを特徴とする、遺伝子組換え抗体の製造方法。
【請求項２】
選別した細胞から重鎖および軽鎖の抗体遺伝子を単離する操作を、選別した細胞から抗体遺伝子の脱落が起きない期間内で実施することを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子組換え抗体の製造方法。
【請求項３】
選別した細胞から重鎖および軽鎖の抗体遺伝子を単離する操作を、抗体産生細胞増殖開始後１４日以内に実施することを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子組換え抗体の製造方法。
【請求項４】
抗体産生細胞が、抗原を免疫したウサギの脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞のいずれかであることを特徴とする、請求項１から３に記載の遺伝子組換え抗体の製造方法。
【請求項５】
抗体産生細胞を増殖させる方法が、抗体産生細胞を培地中で培養する方法であることを特徴とする、請求項１から４に記載の遺伝子組換え抗体の製造方法。
【請求項６】
抗体産生細胞を増殖させる方法が、不死化能を与えることのできる細胞を融合させて培養する方法であることを特徴とする、請求項１から４に記載の遺伝子組換え抗体の製造方法。
【請求項７】
ウサギに免疫する抗原が、ハプテンまたはペプチドであることを特徴とする、請求項１から６に記載の遺伝子組換え抗体の製造方法。
【請求項８】
ホスト細胞が動物細胞であることを特徴とする、請求項１から７に記載の遺伝子組換え抗体の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２００９−２４０３００（Ｐ２００９−２４０３００Ａ）
【公開日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３０６７１３（Ｐ２００８−３０６７１３）
【出願日】平成２０年１２月１日（２００８．１２．１）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月１日（２００８．１２．１）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
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