遺伝的に操作された細胞培養適応感染性嚢胞疾患ウイルス（ＩＢＤＶ）突然変異体
【課題】感染性嚢胞疾患ウイルス（ＩＢＤＶ）をＣＥＦ細胞培養内での増殖に適応させるための方法を提供する。
【解決手段】ＩＢＤＶのゲノムセグメントＡおよびＢのｃＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を別々に調製し、該セグメントＡを含むｃＤＮＡ上の、変異体Ｅまたは古典的ＩＢＤＶ株のＶＰ２遺伝子のアミノ酸残基２５３および２８４の１以上のコドン内またはＧＬＳ ＩＢＤＶ株のＶＰ２遺伝子のアミノ酸残基２８４のコドン内に突然変異を導入して、変異体Ｅまたは古典的ＩＢＤＶ株の場合には、該突然変異ＶＰ２遺伝子のアミノ酸残基２５３および２８４のコドンがそれぞれヒスチジンおよびトレオニン残基をコードするようにし、該セグメントＡと該セグメントＢとを含むｃＤＮＡのＲＮＡ転写産物に、培地内の宿主細胞内で該ＩＢＤＶ突然変異体の複製を開始させ、該培養から該ＩＢＤＶ突然変異体を単離する工程を含んでなる、感染性ＩＢＤＶ突然変異体の製造方法。
【解決手段】ＩＢＤＶのゲノムセグメントＡおよびＢのｃＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を別々に調製し、該セグメントＡを含むｃＤＮＡ上の、変異体Ｅまたは古典的ＩＢＤＶ株のＶＰ２遺伝子のアミノ酸残基２５３および２８４の１以上のコドン内またはＧＬＳ ＩＢＤＶ株のＶＰ２遺伝子のアミノ酸残基２８４のコドン内に突然変異を導入して、変異体Ｅまたは古典的ＩＢＤＶ株の場合には、該突然変異ＶＰ２遺伝子のアミノ酸残基２５３および２８４のコドンがそれぞれヒスチジンおよびトレオニン残基をコードするようにし、該セグメントＡと該セグメントＢとを含むｃＤＮＡのＲＮＡ転写産物に、培地内の宿主細胞内で該ＩＢＤＶ突然変異体の複製を開始させ、該培養から該ＩＢＤＶ突然変異体を単離する工程を含んでなる、感染性ＩＢＤＶ突然変異体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＥＦ細胞培養内で複製する能力を有する感染性ＩＢＤＶ突然変異体の製造方法、遺伝的に操作されたＩＢＤＶ突然変異体、およびそのようなＩＢＤＶ突然変異体を含むワクチン関する。
【背景技術】
【０００２】
感染性嚢胞疾患ウイルス（ＩＢＤＶ）はビルナウイルス科のメンバーである。この科のウイルスは、非常に類似したゲノム体制および類似した複製周期を有する。これらのウイルスのゲノムは、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡの２つのセグメント（ＡおよびＢ）よりなる。大きい方のセグメントＡは、自己タンパク質分解により切断されて成熟ウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４を形成するポリタンパク質をコードする。ＶＰ２およびＶＰ３は、ビリオンの主要構造タンパク質である。ＶＰ２はビルナウイルスの主要な宿主防御免疫原であり、中和抗体の誘導を引き起こす抗原領域を含有する。ＶＰ４タンパク質は、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４タンパク質の前駆体ポリタンパク質のプロセシングに関与するウイルスコード化プロテアーゼであるらしい。大きい方のセグメントＡはまた、該ポリタンパク質遺伝子に先行する及び部分的に重複する第２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する。この第２のオープンリーディングフレームは、ＩＢＤＶ感染細胞内に存在する未知機能のタンパク質ＶＰ５をコードする。小さい方のセグメントＢは、ポリメラーゼおよびキャッピング酵素活性を有する９０ｋＤａの多機能タンパク質であるＶＰ１をコードする。
【０００３】
ＩＢＤＶには、血清型１および２の２つの血清型が存在する。それらの２つの血清型はウイルス中和（ＶＮ）試験により識別されうる。さらに、血清型１の亜型が既に分離されている。血清型１のこれらのいわゆる「変異（体）」ウイルスは、交差中和試験、モノクローナル抗体のパネル、またはＲＴ−ＰＣＲにより同定されうる。また、ＩＢＤＶの血清型１のこれらの亜型、例えば、古典的、変異体Ｅ、ＧＬＳ、ＲＳ５９３およびＤＳ３２６株が文献に記載されている（Ｖａｎ Ｌｏｏｎら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｃｈｉｃｋｅｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｎａｅｍｉａ，Ｒａｕｉｓｃｈｈｏｌｚｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１７９−１８７，１９９４）。
【０００４】
ガンボロー病とも称される感染性嚢胞疾患（ＩＢＤ）は、ファブリキウス嚢の細胞に対して選択指向性を有しリンパ系組織を一次標的とする、ニワトリにおける高伝染性急性ウイルス感染症である。感受性集団における罹患率は高く、急激な体重減少および中等度の死亡率を伴う。該疾患から回復したニワトリは、ニワトリの防御機構に不可欠であるファブリキウス嚢の破壊のため、免疫不全を有することがある。ＩＢＤウイルスは、３週齢未満のニワトリにおいては重篤な免疫抑制を引き起こし、３月齢までのニワトリにおいては嚢の病変を誘発する。
【０００５】
該疾患は、弱毒化生ＩＢＤＶワクチンで初回抗原刺激されたニワトリに対する不活化ワクチンの適用により種禽（ｂｒｅｅｄｅｒ）集団において高レベルの抗体を誘導することにより長年にわたり予防されうる。このため、ＩＢＤにより引き起こされる経済的損失が最小限に維持されている。ワクチン接種された種禽に由来するニワトリにおける移行抗体は、ＩＢＤＶによる初期感染を予防し、免疫抑制に伴う問題を減少させる。さらに、移行抗体が減弱した後の商業用のニワトリ集団においても、弱毒化生ワクチンが成功裡に使用されている。
【０００６】
最近、ヨーロッパにおいて、非常にビルレントなＩＢＤＶ株が、高い死亡率の疾患の発生を引き起こした。現在のワクチン接種計画では、ニワトリを十分に防御することができなかった。ワクチン接種の失敗は、主として、ビルレントな野外ウイルスによる攻撃の前に生ワクチンがニワトリに感染できなかったことによるものであった。
【０００７】
したがって、既存のワクチンを改良し、新規タイプのワクチンを開発することが絶えず要求されている。生ワクチンの開発のためには、弱毒化形態のＩＢＤウイルスが必要とされる。通常、これは、適当な基質上でのＩＢＤＶ野外分離体の連続継代により得ることができる。不活化ＩＢＤＶワクチンの開発のためには、該基質上でのＩＢＤウイルスの増殖から生じる大量のＩＢＤＶ抗原塊の作製のための適当な基質が必要である。
【０００８】
野外ＩＢＤＶは、感染したトリの嚢内または発育鶏卵内でインビボで容易に増殖しうることが公知である。一方、ニワトリ胚由来のインビトロ細胞培養にいくつかのＩＢＤＶ株の増殖を適応させるのに成功したことが報告されているにもかかわらず、野外の感染嚢から分離されたほとんどのＩＢＤＶ株、特に、いわゆるビルレントまたは非常にビルレントなＩＢＤＶ株は、ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）などのニワトリ胚由来の細胞または腎臓、肝臓などの他の器官に由来する細胞には適応させることができないことが一般に認められている（Ｂｒｏｗｎら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５，６７５−６８０，１９９４，ｖａｎ Ｌｏｏｎら，１９９４，前掲）。
【０００９】
インビボ培養基質の欠点は明らかである。そのような培養方法は、動物に対する思いやりがない方法であり、多数の動物を必要とし、長時間を要し、標準化されたストリンジェントな条件下で行なうことができない。また、インビトロ細胞培養基質に対する適応に不応性でない限られた数のＩＢＤＶ株は、ＩＢＤＶ株の適応につながる連続継代法の結果、ランダムな突然変異が該ウイルスのゲノム内に無制御に導入されるという欠点を有する。そのような突然変異は、細胞培養に対するウイルスの適応に関連したもの以外のウイルスの特性、例えば、ウイルスの免疫原性に関連した特性に影響を及ぼしうる。そのような追加的なランダムな突然変異は望ましくない。
【００１０】
ＣＥＦ細胞培養内のインビトロでのウイルスの継代によるＩＢＤＶの適応は、感染したトリの嚢内の病変を該ウイルスが誘発する能力の減少により示されるとおり、ビルレンスの弱毒化を伴う。Ｙａｍａｇｕｃｈｉら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２３，２１９−２２３，１９９６）は、ＩＢＤウイルスのビルレンスに関する、およびＣＥＦ細胞培養に対する嚢ＩＢＤＶの適応の結果としてこれらのウイルスが弱毒化されることに関する分子的根拠について検討している。野生型ＩＢＤＶの弱毒化に関与する明確な突然変異を同定することはできないと、Ｙａｍａｇｕｃｈｉらが行なった研究から結論づけられた。セグメントＡの長いオープンリーディングフレームにコードされるポリタンパク質の２７９位（Ａｓｐ／Ａｓｎ）および２８４位（Ａｌａ／Ｔｈｒ）のアミノ酸残基が、ＣＥＦ細胞内でのＩＢＤＶのビルレンスまたは増殖に重要であると示唆された。後者は、Ｌｉｍ，Ｂ−Ｌ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ４ｔｈ Ａｓｉａ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，２２−２６，１９９８年１１月，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ，Ａｂｓｔ．７９）により確認された。ＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質内のアミノ酸残基２７９および２８４の置換（それぞれＡｓｐ→ＡｓｎおよびＡｌａ→Ｔｈｒ）は、ＣＥＦ細胞培養内で増殖しうるＩＢＤＶ突然変異体を与える、と該刊行物に開示されている。しかしながら、先行技術においては、ＣＥＦ細胞培養に対する嚢ＩＢＤＶの適応を可能にするのに必要かつ十分であるアミノ酸の突然変異のタイプおよび最小数の別態様は開示されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｖａｎ Ｌｏｏｎら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｃｈｉｃｋｅｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｎａｅｍｉａ，Ｒａｕｉｓｃｈｈｏｌｚｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１７９−１８７，１９９４
【非特許文献２】Ｂｒｏｗｎら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５，６７５−６８０，１９９４，ｖａｎ Ｌｏｏｎら，１９９４
【非特許文献３】Ｙａｍａｇｕｃｈｉら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２３，２１９−２２３，１９９６）
【非特許文献４】Ｌｉｍ，Ｂ−Ｌ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ４ｔｈ Ａｓｉａ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，２２−２６，１９９８年１１月，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ，Ａｂｓｔ．７９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
感染したトリの嚢内においてインビボでしか増殖しないＩＢＤＶ分離体を、細胞培養内での増殖に適応させるために一般に適用可能な方法を提供することが、本発明の目的である。
【００１３】
突然変異をＩＢＤＶゲノム内に制御的に導入することによる弱毒化ＩＢＤＶ突然変異体の製造方法を提供することが、本発明のもう１つの目的である。
【００１４】
さらに、遺伝的に操作されたＩＢＤＶ突然変異体であって、該突然変異体が細胞培養内で増殖することを可能にする適当なアミノ酸残基を含むことを特徴とするＩＢＤＶ突然変異体を提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
この目的は、以下の工程を含んでなる、ＣＥＦ細胞培養内で複製されうる感染性ＩＢＤＶ突然変異体の製造方法により達成されることが判明した：
（ｉ）ＣＥＦ細胞培養内で複製する能力を有さないＩＢＤＶのゲノムセグメントＡおよびＢのｃＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を別々に調製し、
（ｉｉ）該セグメントＡを含むｃＤＮＡ上の、
（ａ）変異体Ｅまたは古典的ＩＢＤＶ株のＶＰ２ゲノムのアミノ酸残基２５３および２８４の１以上のコドン内または
（ｂ）ＧＬＳ ＩＢＤＶ株のＶＰ２遺伝子のアミノ酸残基２８４のコドン内に突然変異を導入して、変異体Ｅまたは古典的ＩＢＤＶ株の場合には、該突然変異ＶＰ２遺伝子のアミノ酸残基２５３および２８４のコドンがそれぞれヒスチジンおよびトレオニン残基をコードするようにし、あるいはＧＬＳ ＩＢＤＶ株の場合には、該突然変異ＶＰ２遺伝子のアミノ酸残基２８４のコドンがトレオニン残基をコードするようにし、
（ｉｉｉ）該セグメントＡと該セグメントＢとを含むｃＤＮＡのＲＮＡ転写産物に、培地内の宿主細胞内で該ＩＢＤＶ突然変異体の複製を開始させ、
（ｉｖ）該培養から該ＩＢＤＶ突然変異体を分離する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】ｐＥＤＥＬ２２ＢａｃＩＩ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢおよびｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤＥＬの線状プラスミド地図を示す。
【図１Ｂ】ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤＥＬ−ＧＬＳ−ＢおよびｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤＥＬ−ＧＬＳ−ＴＣの線状プラスミド地図を示す。
【図１Ｃ】ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤＥＬ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤＥＬ−ＱＨ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤＥＬ−ＡＴおよびｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤＥＬ−ＳＲの線状プラスミド地図を示す。
【図１Ｄ】ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤＥＬ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤＥＬ−ＱＨ−ＡＴ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤＥＬ−ＡＴ−ＳＲおよびｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤＥＬ−ＱＨ−ＳＲの線状プラスミド地図を示す。
【図１Ｅ】ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤＥＬおよびｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤＥＬ−ＱＨ−ＡＴ−ＳＲの線状プラスミド地図を示す。
【図２】ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−ＱＨ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−ＴＡ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−ＲＳおよびｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−ＱＨ−ＴＡ−ＳＲの線状プラスミド地図を示す。
【図３】ｐＵＣ１８ＢＤ７８の線状プラスミド地図を示す。
【図４】ｐＤ７８Ａ−Ｅ／ＤＥＬ、ｐ６６１Ａｐａｒｔ、ｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１、ｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＤＮ−ＡＴ、ｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＱＨ、ｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−Ｅ−ＡＴおよびｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＱＨ−ＡＴの線状プラスミド地図を示す。
【図５】ｐＵＫ６６１Ｂ１、ｐＵＫ６６１Ｂ２、ｐＵＫ６６１Ｂ３およびｐＢ６６１の線状プラスミド地図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、いずれのアミノ酸残基が、ＣＥＦ細胞培養内でＩＢＤＶの複製を可能にするのに必要かつ十分であるかを、初めて同定するものである。ほとんどのＩＢＤＶ嚢分離体はＶＰ２タンパク質のアミノ酸残基２５３（Ｇｌｎ）、２８４（Ａｌａ）および３３０（Ｓｅｒ）を含むが、２５３位および２８４位のコドンがアミノ酸残基２５３（Ｈｉｓ）および２８４（Ｔｈｒ）をコードするように変化している変異体Ｅまたは古典的ＩＢＤＶ突然変異体はＣＥＦ細胞培養内で増殖しうる。ＧＬＳ ＩＢＤＶ突然変異体の場合、２８４位のコドンがアミノ酸残基２８４（Ｔｈｒ）をコードするように該コドンを変化させることで十分であることが判明している。また、アミノ酸３３０位は、ＣＥＦ内での古典的または変異体Ｅ ＩＢＤＶ突然変異体の複製に決定的に重要ではないことが判明している。しかしながら、本発明においては、その位置にセリン、アルギニンまたはリシン残基が存在するのが最も好ましい。また、ＧＬＳ ＩＢＤＶの場合には、アミノ酸２５３位は複製に決定的に重要ではなく、それは通常はグルタミン残基であることが判明している。したがって、好ましい方法においては、ＶＰ２タンパク質内のこの位置に、これらの３つのアミノ酸残基のいずれか、特に３３０（Ａｒｇ）を含むＩＢＤＶ突然変異体を製造する。ＧＬＳ ＩＢＤＶ突然変異体の場合、２５３位の好ましいアミノ酸残基はグルタミンである。
【００１８】
【表１】
【００１９】
感染したニワトリの嚢内のみで複製する能力を有していた（キメラ）変異体Ｅ ＩＢＤＶ（Ｄ７８／変異体Ｅ）のゲノムにおいては、ＣＥＦ細胞培養に対するＩＢＤＶ分離体の適応のためには２つの変化が必要であることが判明している。これらの位置はアミノ酸残基２５３および２８４を含む。これらの位置のそれぞれのアミノ酸残基ヒスチジンおよびトレオニンは、該ＩＢＤＶ突然変異体がＣＥＦ細胞培養内で複製するのを可能にする（表１および実施例１）。さらにまた、本発明方法によりＣＥＦ細胞培養に適応したＩＢＤＶ突然変異体は弱毒化されることが判明している（実施例２）。
【００２０】
古典的ＩＢＤＶ株における嚢からＣＥＦ細胞への適応がそれらの２つのアミノ酸によっても決定されることを更に確認するために、ＣＥＦ細胞培養内で複製する能力を有するＩＢＤＶ株Ｄ７８のコドンを２５３、２８４および３３０位で変化させた。その結果を表２Ａに示す。
【００２１】
【表２】
【００２２】
古典的な「非常にビルレントな」（ＶＶ）欧州分離体ＵＫ６６１（Ｂｒｏｗｎら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５，６７５−６８０，１９９４； Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．４０，１−１５，１９９６）はインビトロでは増殖できないため、ニワトリにおいてインビボで増殖させる必要がある。ニワトリにＶＶ株を感染させる必要があり、感染の数日後、生存したトリを殺し、その嚢を摘出する。ついで、さらなる使用のために、該ウイルスを嚢ホモジネートから抽出することができる。本発明を裏付ける実験は、前記のとおりの２５３位および２８４位のアミノ酸変化が、ＶＶ株ＵＫ６６１が細胞培養内で増殖するのを可能にすることを示した。古典的ＩＢＤＶ株に関する突然変異誘発およびトランスフェクション実験の結果を、表２Ｂに要約する。
【００２３】
【表３】
【００２４】
これらのデータは更に、古典的嚢ＩＢＤＶ株が細胞培養内で増殖するのが可能となるためには２５３位および２８４位のアミノ酸変化で十分であることを示している。他のすべての突然変異は、細胞培養内で複製されないか又は非常に不十分にしか複製されない突然変異体を与える（Ｌｉｍら，Ｊ．Ｖｉｏｌ．７３，２８５４−６２，１９９９）。
【００２５】
また、ＧＬＳ ＩＢＤＶにおいては、嚢に適応したＩＢＤＶがＣＥＦ細胞内で複製されるのが可能となるためには２８４位における単一のアミノ酸残基の置換で十分であることが確認された（表３）。
【００２６】
【表４】
【００２７】
したがって、本発明の方法は、組換えＤＮＡ技術を用いて、細胞培養内での増殖に対するＩＢＤＶ嚢分離体の適応を可能にする。本発明の利点は、該適応方法の結果、専ら、ＩＢＤＶのゲノム内の２５３位および２８４位のコドンの１以上に突然変異が導入されることである。それらの番号は、該ポリタンパク質およびＩＢＤＶゲノムのセグメントＡ上の大きなオープンリーディングフレームの、それぞれアミノ酸およびコドンの位置を示している（ＭｕｎｄｔおよびＭｕｌｌｅｒ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７７，４３７−４４３，１９９５； ＮＣＢＩ受託番号Ｘ８４０３４）。
【００２８】
ＣＥＦ細胞培養上で増殖しない全てではなくともほとんどのＩＢＤＶ株は、ＶＰ２遺伝子内にコドン２５３（Ｇｌｎ）、２８４（Ａｌａ）および３３０（Ｓｅｒ）を含有する。ＣＥＦ細胞培養上で増殖しないいくつかの変異体Ｅまたは古典的ＩＢＤＶ株は、必要なコドンである２５３（Ｈｉｓ）および２８４（Ｔｈｒ）の１つを既に有しているかもしれない。したがって、本発明の方法は、生じるＩＢＤＶ突然変異体が、アミノ酸残基２５３（Ｈｉｓ）および２８４（Ｔｈｒ）をコードするコドンをＶＰ２遺伝子内に含むよう、前記の必要なコドンの１以上において突然変異を導入することを含む。
【００２９】
より好ましくは、本発明の方法は、ＣＥＦ細胞内で複製する能力を有さずアミノ酸残基２５３（Ｇｌｎ）および２８４（Ａｌａ）、より一層好ましくは３３０（Ｓｅｒ）のコドンを含むＩＢＤＶに適用する。古典的および変異体Ｅ株の場合には、ＶＰ２遺伝子のコドンの２または３つにおいて突然変異を導入して、コドン２５３（Ｈｉｓ）および２８４（Ｔｈｒ）、そして所望により３３０（Ａｒｇ）を得る。これらの位置におけるアミノ酸の新たなコドンは、Ｈｉｓ（ＣＡＴまたはＣＡＣ）、Ｔｈｒ（ＡＣＴ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、ＡＣＧ）およびＡｒｇ（ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、ＡＧＧ）であってもよい。
【００３０】
より一層好ましくは、本発明の方法は、ＣＥＦ細胞内で複製する能力を有さずコドンＧｌｎ２５３（ＣＡＡ）、Ａｌａ２８４（ＧＣＣ）および所望によりＳｅｒ３３０（ＡＧＴ）またはそれらの任意の組合せを含むＩＢＤＶに適用する。
【００３１】
特に、本発明の方法は、ＣＥＦ細胞内で複製する能力を有さずコドン２５３（ＣＡＡ）、２８４（ＧＣＣ）および３３０（ＡＧＴ）を含むＩＢＤＶに適用する。
【００３２】
本発明のＩＢＤＶ突然変異体の製造方法は、ビルナウイルスに関する最近確立された「逆遺伝学（ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」系（ＭｕｎｄｔおよびＶａｋｈａｒｉａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３，１１１３１−１１１３６，１９９６ならびにＷＯ ９８／０９６４６）を含む。この逆遺伝学系は、ＩＢＤウイルスのＲＮＡゲノム内に突然変異を導入する可能性を開いた。本発明の逆遺伝学法の原理は、ゲノムＲＮＡセグメントＡおよびＢを該ウイルスから単離し、ついで該ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写を行ない、ついで該ｃＤＮＡをＲＮＡに転写させるというものである。該ウイルスのセグメントＡ（またはＢ）内への必要な突然変異の導入は、ｃＤＮＡレベルで生じる。この逆遺伝子学系における重要な工程は、ＤＮＡベクター分子（例えば、プラスミド）とＩＢＤＶのセグメントＡまたはＢの完全長ｃＤＮＡクローンとを含む別々のＤＮＡ構築物を準備することである。これらの両方のセグメントの５’および３’末端のヌクレオチドを含む、セグメントＡまたはＢ ｃＤＮＡよりなるＤＮＡ構築物は、ＭｕｎｄｔおよびＶａｋｈａｒｉａ（１９９６，前掲）に記載の方法に従い作製することができる。該逆遺伝学法における後続の工程においては、適当なセグメントＡおよびＢ遺伝物質を適当な宿主細胞にトランスフェクトし、それにより該トランスフェクト化宿主細胞内で、ｃＤＮＡセグメントＡおよびＢのＲＮＡ転写産物に該ウイルスの複製を開始させて感染性ＩＢＤＶを得、それを、該宿主細胞が培養される培地から単離することができる。
【００３３】
逆遺伝学系の最終工程には、いくつかの方法を用いることができる。好ましくは、本発明の方法は、セグメントＡおよびＢの両方のｃＤＮＡからインビトロで合成ＲＮＡ転写産物を調製することを含む。この場合、該ＤＮＡ構築物は、それらのセグメントのいずれかに作動的に結合したＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む。該プロモーターは、Ｔ７、ＳＰ６またはＴ３ポリメラーゼのプロモーターであってもよく、Ｔ７プロモーターが好ましい。ＡおよびＢセグメントの合成転写産物を単離し、それを使用して適当な宿主細胞にトランスフェクトする。
【００３４】
あるいは、提供するもう１つの方法においては、セグメントＢのＲＮＡ転写産物が構成的に発現されるよう、セグメントＢのｃＤＮＡとＲＮＡポリメラーゼプロモーターとを含むＤＮＡ構築物で形質転換された、ＲＮＡポリメラーゼを発現しうる宿主細胞を含む細胞系を提供する。突然変異セグメントＡを含むｃＤＮＡの合成ＲＮＡ転写産物でそのような細胞をトランスフェクトした後、ＩＢＤＶ突然変異体の複製を宿主細胞内で開始させる。特に、バクテリオファージＴ７ ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを発現しうる（例えば、これは組換えワクチンウイルスから細胞質的で発現される）宿主細胞を使用することができる。
【００３５】
所望の突然変異は、この目的のために当技術分野で一般に知られている方法によりＶＰ２遺伝子内に導入することができる。特に、部位特異的突然変異誘発により突然変異を導入する。ＩＢＤＶゲノム内に突然変異を導入するための方法は、本明細書に記載されているが、当技術分野においても一般に用いられている（ＭｕｎｄｔおよびＶａｋｈａｒｉａ，１９９６，前掲；Ｙａｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２，２６４７−２６５４，１９９８； Ｍｕｎｄｔら，欧州特許出願第０８８７，４１２号およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｗｉｌｅｙ Ｎ．Ｙ．，１９９５版，ｐ．８．５．１−８．５．９．）。
【００３６】
本発明の方法は、ＣＥＦ細胞培養内で複製する能力を有さない、ＩＢＤＶの古典的、変異体ＥまたはＧＬＳ抗原亜型である全てのＩＢＤＶ株に適用することができる。
【００３７】
さらに、本発明の方法は、株のビルレンスとは無関係に、非常にビルレントな株（例えば、ＣＳ８９およびＵＫ６６１）、ビルレント株（例えば、Ｆ５２／７０およびＳＴＣ）およびワクチン株（例えば、２２８Ｅおよび２５１２）を含む、ＣＥＦ細胞培養内で複製する能力を有さない全てのＩＢＤＶ株に適用することができる。非常にビルレントな及びビルレントな株に由来する細胞培養内での複製に適応したＩＢＤＶ突然変異体は、それより低いビルレンスを有することとなり、生ワクチン株として使用することができる。あるいは、そのようなＩＢＤＶ突然変異体は、細胞培養内で簡便に増殖させることができ、不活化ワクチンとして製剤化することができる。
【００３８】
また、本発明の方法は、ＣＥＦ細胞培養内で複製する能力を有さないＩＢＤＶ弱毒化株に有利に適用することができる。そのような弱毒化ウイルスに由来する突然変異体を、ワクチンの製造のために、インビボ産生系の代わりに細胞培養系内で使用することができる。
【００３９】
もう１つの態様において、本発明は、ＣＥＦ細胞培養内で複製する能力を有する「キメラ」ＩＢＤＶ突然変異体の製造方法を提供する。該方法は、第１ ＩＢＤＶのセグメントＡの遺伝子（特に、ＶＰ２遺伝子）内に突然変異を導入する追加的工程を含み、その結果、その遺伝子により発現されるタンパク質は、第２ ＩＢＤＶのエピトープ決定基を含む。
【００４０】
キメラＩＢＤＶは、第１抗原亜型のセグメントＡまたはＶＰ２遺伝子を遺伝子バックボーンとして含み、さらに、第２ ＩＢＤＶエピトープ決定基をコードする遺伝情報を含むウイルスである。特に、そのようなキメラＩＢＤＶは、第１抗原亜型のＩＢＤＶのＶＰタンパク質上に１以上の追加的エピトープ決定基を発現する。そのようなキメラＩＢＤＶの利点は、それが、ＩＢＤＶの少なくとも２つの抗原亜型に対する免疫を誘導する単一の免疫原として使用可能なことである。
【００４１】
特に、古典的、ＧＬＳまたは変異体Ｅ ＩＢＤＶのセグメントＡバックボーンまたはＶＰ２遺伝子を含むＩＢＤＶ突然変異体を製造する。種々のＩＢＤＶ株のセグメントＡの全コード領域を含有するｃＤＮＡクローンを、標準的なクローニング法および当技術分野において記載されている方法（Ｖａｋｈａｒｉａら，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ３６，７３６−７４２，１９９２；Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４，１２０１−１２０６，１９９３）を用いて調製することができる。種々のＩＢＤＶ株のセグメントＡのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列が、当技術分野において開示されている（例えば、ＷＯ ９５／２６１９６およびＶａｋｈａｒｉａら，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ３６，７３６−７４２，１９９２）。
【００４２】
さらに、ＷＯ ９５／２６１９６は、各抗原亜型に特徴的なＩＢＤＶ抗原亜型のいくつかのエピトープ決定基のアミノ酸配列を開示している。また、ＷＯ ９５／２６１９６は、中和モノクローナル抗体のパネルに対する反応性により、種々のＩＢＤＶ株の抗原の特徴づけを開示している。そのような中和モノクローナル抗体に反応性である重要なエピトープ決定基は、Ｂ６９（古典的亜型）、Ｒ６３および６７（変異体Ｅ）および５７（ＧＬＳ）エピトープ決定基である。これらのエピトープ決定基のアミノ酸配列を含むＶＰ２タンパク質の領域は、Ｖａｋｈａｒｉａら，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．３１，２６５−２７３，１９９４に記載されている。
【００４３】
好ましくは、本発明の方法においては、古典的セグメントＡバックボーンと変異体Ｅエピトープ決定基６７またはＧＬＳエピトープ決定基５７をコードするヌクレオチド配列とを含む、ＣＥＦ細胞培養内で複製する能力を有するキメラＩＢＤＶ突然変異体を製造する。あるいは、該キメラＩＢＤＶ突然変異体は、ＧＬＳバックボーンとＢ６９、Ｒ６３または６７エピトープ決定基をコードするヌクレオチド配列とを含む。
【００４４】
特に、本発明の方法は、（ｉ）該ＶＰ２遺伝子が変異体Ｅ株のＶＰ２遺伝子により置換されている、および（ｉｉ）２５３、２８４および３３０位のコドンが前記のとおりに改変されている（実施例１）、株Ｄ７８（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂ．Ｖ．，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから商業的に入手可能）に由来するキメラＩＢＤＶ株（Ｄ７８／変異体Ｅ）の製造を含む。
【００４５】
基本的には、第１ ＩＢＤＶのバックボーンセグメントＡ内に、該エピトープ決定基をコードするヌクレオチド配列を導入するための工程は、前記の突然変異を導入するための工程と実質的に同じである。これは、ゲノムセグメントＡおよびＢのｃＤＮＡを準備し、（ｉ）第１ ＩＢＤＶのエピトープ決定基のコード配列を、第２ ＩＢＤＶのものにより置換し、あるいは（ｉｉ）部位特異的突然変異誘発により第１ ＩＢＤＶ内の特定のコドンを改変することにより、最も簡便に行われる。そのような方法もまた、ＷＯ ９５／２６１９６に記載されている。最後に、これらのｃＤＮＡ分子のＲＮＡ転写産物に、該トランスフェクト化宿主細胞内で複製を開始させて、感染性キメラＩＢＤＶを得る。
【００４６】
本発明のもう１つの実施形態においては、前記のＩＢＤＶ突然変異体の製造方法であって、得られるＩＢＤＶ突然変異体が、該ウイルスを弱毒化する他の突然変異をも含むことを特徴とする製造方法を提供する。そのような突然変異の一例は、天然ＶＰ５タンパク質を発現する能力を有さないＩＢＤＶ突然変異体を与える、ＩＢＤＶゲノムのセグメントＡのＶＰ５遺伝子内の突然変異である。ＩＢＤＶ ＶＰ５−突然変異体の製造は欧州特許出願第８８７，４１２号に記載されている。
【００４７】
もう１つの態様においては、本発明は、古典的または変異体Ｅ株のＶＰ２遺伝子内にコドン２５３（Ｈｉｓ）および２８４（Ｔｈｒ）、そして所望により３３０（Ａｒｇ）を、あるいはＧＬＳ株のコドン２８４（Ｔｈｒ）を含む、ＣＥＦ細胞培養内で複製する能力を有する遺伝的に操作された感染性ＩＢＤＶ突然変異体を提供する。そのようなＩＢＤＶ突然変異体は、遺伝子操作技術により制御的に導入された前記の新たなコドンを除き、ＣＥＦ細胞培養内で複製する能力を有さない嚢ＩＢＤＶの遺伝情報を依然として含む。
【００４８】
特に、３１８位および３２５位にそれぞれグリシンおよび／またはバリンを有さない前記の変異体Ｅ ＩＢＤＶ突然変異体を提供する。これらの位置にそれぞれアスパラギン酸および／またはメチオニンを有する遺伝的に操作された変異体Ｅ突然変異体が、最も好ましい。
【００４９】
好ましい実施形態においては、変異体Ｅ株のＶＰ２遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含み、前記で特定した３つの新たなコドンを有する、本発明の遺伝的に操作されたＩＢＤＶ突然変異体は、キメラＩＢＤＶ突然変異体、特に、株Ｄ７８に由来するキメラＩＢＤＶ突然変異体である。
【００５０】
本発明は、インビトロ細胞培養内での複製に予め不応性であったＩＢＤＶ株からＩＢＤＶワクチンを容易に製造する可能性を与える。本発明の追加的な利点は、ＩＢＤＶが、前記方法により制御的に（さらに）弱毒化されうることである。そのような弱毒化ＩＢＤＶ突然変異体は、生ＩＢＤＶワクチン内の有効成分として使用することができる。
【００５１】
したがって、本発明のもう１つの態様は、ＩＢＤＶ感染により生じる疾患に対して家禽を防御するのに使用するためのワクチンである。該ワクチンは、前記のとおりに製造された遺伝的に操作されたＩＢＤＶ突然変異体と医薬上許容される担体または希釈剤とを含む。
【００５２】
該ＩＢＤＶ突然変異体は、生弱毒化または不活化ウイルスとして該ワクチン内に含有させることができる。
【００５３】
本発明のワクチンは、例えば、商業的に入手可能な生および不活化ＩＢＤＶワクチンに一般に用いられる方法などの通常の方法により製造することができる。簡単に説明すると、感受性基質に本発明のＩＢＤＶ突然変異体を接種し、所望の感染力価まで該ウイルスが複製されるまで該基質を増殖させ、ついでＩＢＤＶ含有物質を収穫する。
【００５４】
本発明のワクチンを製造するために、ＩＢＤＶ突然変異体の複製を支持しうる各基質を使用することができ、それらには、初代（トリ）細胞培養、例えば、ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）またはニワトリ胚肝細胞（ＣＥＬ）、哺乳動物細胞系、例えばベロ細胞系またはＢＧＭ−７０細胞系、またはトリ細胞系、例えばＱＴ−３５、ＱＭ−７またはＬＭＨが含まれる。通常、該細胞の接種後、該ウイルスを３〜１０日間増殖させ、ついで該細胞培養上清を収穫し、所望により濾過または遠心分離して細胞残渣を除去する。
【００５５】
あるいは、該ＩＢＤＶ突然変異体を発育鶏卵内で増殖させる。特に、これらのＩＢＤＶを増殖させる基質として、ＳＰＦ発育卵が挙げられる。発育卵に、例えば、少なくとも１０２ ＴＣＩＤ５０／卵を含む懸濁液またはホモジネートを含有する０．２ｍｌのＩＢＤＶ突然変異体を接種し、ついで該卵を３７℃でインキュベートする。約２〜５日後、該胚および／または該膜および／または該尿膜腔液を集め、この物質を適当にホモジナイズすることにより、該ＩＢＤウイルス産物を収穫することができる。ついで該ホモジネートを２５００ ｘ ｇで１０分間遠心分離し、該上清をフィルター（１００μｍ）で濾過することができる。
【００５６】
該生ウイルスを含有する本発明のワクチンは、懸濁液の形態または凍結乾燥形態で製造し販売することができ、そのような組成物に一般に用いられる医薬上許容される担体または希釈剤を更に含有する。担体には、安定化剤、保存剤およびバッファーが含まれる。適当な安定化剤としては、例えば、ＳＰＧＡ、炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、ショ糖、デキストラン、グルタマートまたはグルコース）、タンパク質（例えば、乾燥乳血清、アルブミンまたはカゼイン）またはそれらの分解産物が挙げられる。適当なバッファーとしては、例えば、アルカリ金属ホスファターゼが挙げられる。適当な保存剤としては、チメロサール、メルチオラートおよびゲンタマイシンが挙げられる。希釈剤には、水、水性バッファー（例えば、緩衝食塩水）、アルコールおよびポリオール（例えば、グリセロール）が含まれる。
【００５７】
所望により、本発明の生ワクチンはアジュバントを含有しうる。アジュバント活性を有する適当な化合物および組成物としては、例えば、後記のものと同様のものが挙げられる。
【００５８】
本発明の生ワクチンの注射（例えば、筋肉内、皮下）による投与は可能であるが、該ワクチンは、好ましくは、ＩＢＤＶのワクチン接種に一般に用いられる安価な大量適用技術により投与する。ＩＢＤＶのワクチン接種のためのこれらの技術には、飲水および噴霧ワクチン接種が含まれる。
【００５９】
該生ワクチンの投与のためのもう１つの方法には、卵内、点眼および嘴の浸漬による投与が含まれる。
【００６０】
本発明のもう１つの態様においては、不活化形態のＩＢＤＶ突然変異体を含むワクチンを提供する。不活化ワクチンの大きな利点は、得られうる長期持続性の防御抗体のレベルが高いことである。
【００６１】
増殖工程後に収穫したウイルスの不活化の目的は、該ウイルスの再生を排除することである。一般に、これは、化学的または物理的手段により達成することができる。化学的不活化は、例えば酵素、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、エチレン−イミンまたはそれらの誘導体で該ウイルスを処理することにより行なうことができる。必要に応じて、後で該不活化化合物を中和する。ホルムアルデヒドで不活化した物質は、例えば、チオスルファートで中和することができる。物理的不活化は、好ましくは、該ウイルスを高エネルギー放射（例えば、ＵＶ光またはγ線）に付すことにより行なうことができる。所望により、処理後、該ｐＨを約７の値に調節することができる。
【００６２】
該不活化ＩＢＤＶ突然変異体を含有するワクチンは、例えば、この目的に適した前記の医薬上許容される担体または希釈剤の１以上を含んでいてもよい。
【００６３】
好ましくは、本発明の不活化ワクチンは、アジュバント活性を有する１以上の化合物を含む。この目的のための適当な化合物または組成物には、水酸化、リン酸または酸化アルミニウム、例えば鉱油（例えばＢａｙｏｌ Ｆ（登録商標）またはＭａｒｃｏｌ ５２（登録商標））または植物油（例えばビタミンＥアセタート）に基づく水中油滴型または油中水滴型エマルション、およびサポニンが含まれる。
【００６４】
本発明のワクチンは、有効成分としての該ＩＢＤＶ突然変異体の有効量（すなわち、ワクチン接種された鳥において、ビルレントウイルスによる攻撃に対して免疫を誘導する免疫性ＩＢＤＶ物質の量）を含む。本発明においては、免疫は、ワクチン接種後の鳥集団において、非ワクチン接種群と比べて有意に高いレベルの防御を誘導することと定義される。
【００６５】
典型的には、本発明の生ワクチンは、１０２〜１０９ ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染量）／動物の用量、好ましくは１０５．０〜１０７．０ ＴＣＩＤ５０の用量で投与することが可能であり、不活化ワクチンは、１０５〜１０９ ＴＣＩＤ５０／動物の抗原相当量を含有していてもよい。
【００６６】
不活化ワクチンは、通常、非経口的（例えば、筋肉内または皮下）に投与する。
【００６７】
本発明のＩＢＤＶワクチンはニワトリにおいて有効に使用することができ、他の家禽（例えば、シチメンチョウ、ホロホロチョウおよびウズラ）にも該ワクチンを成功裡に接種することができる。ニワトリには、ブロイラー、繁殖ストックおよび産卵ストックが含まれる。
【００６８】
本発明の生または不活化ワクチンを投与する動物の齢は、通常の生または不活化ＩＢＤＶワクチンを投与する動物の齢と同じである。例えば、ブロイラー（母親に由来する抗体ＭＤＡを有さないもの）には１日齢でワクチン接種することが可能であり、一方、高レベルのＭＤＡを有するブロイラーには、好ましくは、２〜３週齢でワクチン接種する。低レベルのＭＤＡを有する産卵ストックまたは繁殖ストックには、１〜１０日齢でワクチン接種し、ついで６〜８週齢および１６〜２０週齢で不活化ワクチンをブースター接種することができる。
【００６９】
本発明はまた、前記のＩＢＤＶ突然変異体と、それぞれ家禽または魚類に対して感染性である他の病原体に由来する１以上の免疫原とを含んでなる混合（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）ワクチンを含む。
【００７０】
好ましくは、該混合ワクチンは更に、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、産卵低下症候群（ＥＤＳ）ウイルスおよびシチメンチョウ鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴＶ）のワクチン株の１以上を含む。
【実施例】
【００７１】
実施例１
ＩＢＤＶ突然変異体の構築およびＣＥＦ細胞培養内でのそれらの複製特性
材料および方法
ＩＢＤＶの古典的、変異体ＥまたはＧＬＳ株のＶＰ２の可変領域を含む（属間）ＩＢＤＶプラスミドの構築
（ｉ）古典的ＩＢＤＶ株のＶＰ２
Ｄ７８
以下の部位特異的突然変異誘発のための必要条件は、プラスミドｐＵＣ１８の修飾であった。この目的のために、ｐＵＣ１８をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで切断し、電気溶出し、クレノウ酵素により平滑末端化し、再連結して、ｐＵＣ１８ ΔＮｄｅ Ｉ−ＢａｍＨ Ｉ（ｐＵＣ１８／ΔＮＢ）を得た。プラスミドｐＡＤ７８／ＥＫ（Ｍｕｎｄｔら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１，５６４７−５１，１９９７）をＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで切断して、Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位を含む血清型Ｉ株Ｄ７８のセグメントＡの完全長配列を得た。この断片を、ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで切断されたｐＵＣ１８／ΔＮＢ中に連結して、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢを得た（図１Ａ）。プラスミドｐＤ７８Ａ／ΔＮＢを、クローニングおよび部位特異的突然変異誘発法のためのバックボーンとして使用した。
【００７２】
ＵＫ６６１
プラスミドｐＤ７８−Ｅ／ＤＥＬ（後記を参照されたい）を、株ＵＫ６６１のセグメントＡの配列を含有するキメラプラスミドの構築のために使用した。ウイルスＲＮＡの沈降後、標準的な方法に従い、オリゴヌクレオチドＵＫ６６１ＡＦｏｒ１およびＵＫ６６１ＡＲｅｖ１（ＢｒｏｗｎおよびＳｋｉｎｎｅｒ，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．４０，１−１５，１９９６，それぞれヌクレオチド番号６２１−６４４−センスおよび１２０１−１２２３−アンチセンス）を使用することにより、逆転写およびＰＣＲを行なった。得られたＰＣＲ断片を平滑末端化し、ＳｍａＩで切断されたベクターｐＵＣ １８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）中にクローニングしてｐ６６１Ａｐａｒｔを得た。配列決定後、ｐ６６１Ａｐａｒｔを制限酵素ＮｄｅＩおよびＳｐｅＩでそれぞれヌクレオチド６４７および１１８２で切断して（番号づけは、株Ｐ２：ＮＣＢＩ受託番号Ｘ ８４０３４の完全長配列に基づいている）、株ＵＫ６６１のＶＰ２の可変領域のコード配列を含む５３５ｂｐの断片を得た。ＮｄｅＩ−ＳｐｅＩで切断されたｐＤ７８−Ｅ／ＤＥＬ中への連結後、株Ｄ７８、Ｅ／ＤｅｌおよびＵＫ６６１のセグメントＡの配列を含有するキメラ完全長プラスミドｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１を得た（図４）。
【００７３】
（ｉｉ）変異体Ｅ ＩＢＤＶのＶＰ２
ＩＢＤＶ特異的配列の置換のためには、変異体Ｅ株Ｅ／Ｄｅｌの完全なコード領域を含有するプラスミドを使用した（ｐＥＤＥＬ２２ＢａｃＩＩ，Ｖａｋｈａｒｉａ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ３，１５１−１６８，１９９７）。ｐＥＤＥＬ２２ＢａｃＩＩ（図１Ａ）を制限酵素ＮｄｅＩおよびＳａｌＩでそれぞれヌクレオチド６４７および１７２５（株Ｐ２（ＮＣＢＩ受託番号Ｘ ８４０３４）の完全長配列に基づく）で切断して、ＶＰ２の可変領域のコード配列および株Ｅ／ＤｅｌのＶＰ４の配列を含む１０７８ｂｐの断片を得た。ＮｄｅＩ−ＳａｌＩで切断されたｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ中への連結後、株Ｄ７８およびＥ／ＤｅｌのセグメントＡの配列を含有するキメラ完全長プラスミドｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ（図１）を得た。プラスミドｐＡＤ７８／ΔＮＢおよびｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌを部位特異的突然変異誘発に使用した。
【００７４】
（ｉｉｉ）ＧＬＳ ＩＢＤＶのＶＰ２
さらに、それぞれＧＬＳ−ＢおよびＧＬＳ−ＴＣの可変領域を含有する１対のプラスミドを構築した。超可変領域のクローニングのために、ＧＬＳ−ＴＣをＣＥＦ内で増殖させ、超遠心により精製した。ＧＬＳ−Ｂの嚢ホモジネートを低速遠心により精製し、該上清を以下の操作に使用した。プロテイナーゼＫ（０．５ｍｇ／ｍｌ）／ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ，０．５％）での消化の後、ウイルスＲＮＡを精製し、ｃＤＮＡに逆転写し、標準的な方法に従いオリゴヌクレオチドＡ１４およびＡ４４（表４）を使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。増幅産物を平滑末端化によりクローニングし、適当なＰＣＲ断片を含有するプラスミドを配列決定した。ＧＬＳ−ＴＣ（ｐＧＬＳ−ＴＣ）およびＧＬＳ−Ｂ（ｐＧＬＳ−Ｂ）のいずれかの各インサートを含有するプラスミドを以下の実験に使用した。属間セグメントＡの構築には、完全長クローンｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌを使用した。ｐＧＬＳ−ＴＣおよびｐＧＬＳ−ＢをそれぞれＳａｃＩおよびＳｐｅＩで消化した。ついで、電気溶出された断片を、予めＳａｃＩ−ＳｐｅＩで消化されたｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ中に連結して、それぞれｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＧＬＳ−ＴＣおよびｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＧＬＳ−Ｂを得た。両方のプラスミドのプラスミド地図を図１Ｂに示す。
【００７５】
部位特異的突然変異誘発
ＰＣＲにより部位特異的突然変異誘発を行なった。オリゴヌクレオチドは、アミノ酸の置換をもたらす突然変異および追加的な制限酵素切断部位を含有していた（表４）。それぞれｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤｅｌおよびｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１を使用するＰＣＲ増幅の後、断片を平滑末端化によりクローニングし、配列決定した（ｐｆｒａｇ）。突然変異したコドンを含有するクローンを、以下のとおり予め切断されたプラスミド中に連結した。
【００７６】
（ｉ）変異体Ｅ ＩＢＤＶ
突然変異したコドンを含有するプラスミドｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤｅｌのセグメントＡの完全長クローンの樹立のために、以下のＰＣＲ断片を得た：プライマーＥ／Ｄｅｌ−ＭｕｔＱＨおよびＡ１４（ｐｆｒａｇＱＨ）、Ｅ／Ｄｅｌ−ＭｕｔＡＴおよびＡ１４（ｐｆｒａｇ ＡＴ）、Ｅ／Ｄｅｌ−ＭｕｔＳＲおよびＰ２１Ｆ（ｐｆｒａｇＳＲ）を使用して、Ｅ−Ｄｅｌ配列の適当な単一アミノ酸置換（それぞれＱ２５３Ｈ、Ａ２８４ＴおよびＳ３３０Ｒ）を有する断片を得た。ＰｆｒａｇＱＨおよびｐｆｒａｇＳＲをＳｃａＩおよびＳｐｅＩで切断し、予めＳａｃＩ−ＳｐｅＩで消化されたｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ中に連結して、それぞれｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤｅｌＱＨ（図１）およびｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤｅｌＳＲ（図１Ｃ）を得た。ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤｅｌＡＴ（図１Ｃ）を構築するために、ｐｆｒａｇＡＴをＮａｒＩ−ＳｐｅＩで切断し、ついで、予め切断されたｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ中に連結した。２個の突然変異コドンを含有するプラスミドを得るために、以下のＰＣＲを行なった。プライマーＥ／Ｄｅｌ−ＭｕｔＱＨおよびＥ／Ｄｅｌ−ＭｕｔＳＲ、ならびにＥ／Ｄｅｌ−ＭｕｔＡＴおよびＥ／Ｄｅｌ−ＭｕｔＳＲを、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ上のそれぞれｆｒａｇＱＨ−ＳＲおよびｆｒａｇＡＴ−ＳＲの増幅に使用した。クローニングおよび配列決定の後、ｐｆｒａｇＱＨ−ＳＲをＳｃａＩ−ＳｐｅＩで消化し、ついで、予め切断されたｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ中に連結して、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤｅｌＱＨ−ＳＲ（図１Ｄ）を得た。ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤｅｌＡＴ−ＳＲ（図１Ｄ）の構築のために、プラスミドｐｆｒａｇＡＴ−ＳＲをＮａｒＩおよびＳｐｅＩで消化し、同じように切断されたｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ中に連結した。２個のアミノ酸置換（Ｑ２５３Ｈ； Ａ２８４Ｔ）のための突然変異コドンを含有するプラスミドの構築のために、プラスミドｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤｅｌＡＴおよびプライマーＥ／Ｄｅｌ−ＭｕｔＱＨ； Ａ１４を使用してＰＣＲを行なった。得られたプラスミドｐｆｒａｇＱＨ−ＡＴをＳａｃＩ−ＳｐｅＩで切断し、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ中に連結して、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤｅｌＱＨ−ＡＴ（図１Ｄ）を得た。全３個のアミノ酸置換（Ｑ２５３Ｈ、Ａ２８４ＴおよびＳ３３０Ｒ）のための突然変異コドンを含有するプラスミドのクローニングのために、プライマーＥ／Ｄｅｌ−ＭｕｔＱＨおよびＥ／Ｄｅｌ−ＭｕｔＳＲを、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＡＴ上でのｆｒａｇ ＱＨ−ＡＴ−ＳＲの増幅のために使用した。ｐｆｒａｇ ＱＨ−ＡＴ−ＳＲをＳａｃＩおよびＳｐｅＩで切断した後、溶出した断片を、ＳａｃＩおよびＳｐｅＩで切断されたｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ中に連結して、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＡＴ−ＳＲ（図１Ｅ）を得た。
【００７７】
（ｉｉ）古典的ＩＢＤＶ
Ｄ７８
突然変異コドンを含有するプラスミドｐＤ７８Ａ／ΔＮＢのセグメントＡの完全長クローンの樹立のために、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢのＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、予めＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで切断されたｐＵＣ１９中にサブクローニングして、以下の操作のための単一の制限酵素部位（ｐＵＣ１９／ＮＨ−Ｄ７８Ａ）を得た。オリゴヌクレオチドＤ７８−ＭｕｔＨＱおよびＡ１４（ｐｆｒａｇＨＱ）、Ｄ７８−ＭｕｔＴＡおよびＡ１４（ｐｆｒａｇＴＡ）、Ｄ７８−ＭｕｔＲＳおよびＰ２１Ｆ（ｐｆｒａｇＲＳ）をＰＣＲ増幅に使用して、Ｄ７８配列の適当な単一のアミノ酸置換（それぞれＨ２５３Ｑ、Ｔ２８４ＡおよびＲ３３０Ｓ）を有する断片を得た。断片ｐｆｒａｇＨＱをＳａｃＩおよびＳｔｙＩで切断し、ｐｆｒａｇＴＡをＮａｒＩおよびＳｔｙＩで切断し、ｐｆｒａｇＲＳをＳａｃＩおよびＳｔｙＩで切断し、適当に切断されたｐＵＣ１９／ＮＨ−Ｄ７８Ａ中に再連結した。該突然変異コドンを含有するプラスミドｐＵＣ１９／ＮＨ−Ｄ７８ＡをＮｄｅＩおよびＳａｃＩＩで切断し、適当な断片を電気溶出し、予めＮｄｅＩおよびＳａｃＩＩで切断されたｐＤ７８／ΔＮＢ中に連結して、それぞれｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−ＨＱ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−ＴＡおよびｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−ＲＳを得た。全３個のアミノ酸（Ｈ２５３Ｑ、Ａ２８４Ｔ、Ｒ３３０Ｓ）の置換につながるヌクレオチド置換を含有する完全長クローンの構築のために、オリゴヌクレオチドＤ７８−ＭｕｔＨＱ、Ｄ７８−ＭｕｔＲＳおよびプラスミドｐＤ７８／ΔＮＢ−ＴＡを使用するＰＣＲを行なった。得られたＰＣＲ断片を平滑末端化によりクローニングして、ｐｆｒａｇＨＱ−ＴＡ−ＲＳを得た。ｐｆｒａｇＨＱ−ＴＡ−ＲＳをＳａｃＩおよびＳｔｙＩで切断した後、電気溶出した断片を、ＳａｃＩおよびＳｔｙＩで切断されたｐＵＣ１９／ＮＨ−Ｄ７８Ａ中にクローニングした。得られたプラスミドをＮｄｅＩおよびＳａｃＩＩで切断し、適当な断片を電気溶出し、最後に、予めＮｄｅＩおよびＳａｃＩＩで切断されたｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ中に連結して、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−ＨＱ−ＴＡ−ＲＳを得た。得られた突然変異プラスミドのヌクレオチド配列を配列決定により確認した。配列は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ，バージョン８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）で分析した。プラスミドｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−ＨＱ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−ＴＡ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−ＲＳおよびｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−ＨＱ−ＴＡ−ＲＳを図２に示す。
【００７８】
ＵＫ６６１
部位特異的突然変異誘発のために、プラスミドｐＤ７８Ａ−Ｅ−ＵＫ６６１をＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩで切断し、ついでセグメントＡを含有する断片の完全長配列を、ＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩで切断されたプラスミドベクターｐＢＳ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に連結した。得られたプラスミドｐＢＳＤ７８Ａ−Ｅ−６６１を、既に記載されている方法（Ｋｕｎｋｅｌら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３６７−３８２，１９８７）に従い部位特異的突然変異誘発実験で使用した。Ｌｉｍら（１９９９ 前掲）の結果に基づき、アンチセンス配向オリゴヌクレオチドＭｕｔ １（ＢｒｏｗｎおよびＳｋｉｎｎｅｒ前掲；ヌクレオチド番号９４７−１００１，９４６−９６６はＡＡＣ、および９７９−９８１はＡＣＧであり、アミノ酸置換Ｄ２７９ＮおよびＡ２８４Ｔを引き起こす）を使用してプラスミドｐＢＳＤ７８Ａ−Ｅ−６６１のアミノ酸２７９および２８４のヌクレオチド配列を置換（Ｄ２７９Ｎ，Ａ２８４Ｔ）した。得られたプラスミドｐＢＳＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＤＮ−ＡＴの適当な部分を配列決定した。ｐＢＳＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＤＮ−ＡＴをＮｄｅＩ／ＳｐｅＩで切断した後、５３５ｂｐの断片を、適当に切断されたｐＤ７８Ａ− Ｅ−６６１中に連結して、ｐＤ７８Ａ− Ｅ−６６１−ＤＮ−ＡＴを得た。
【００７９】
さらに、アンチセンス配向オリゴヌクレオチドＭｕｔ ２（ＢｒｏｗｎおよびＳｋｉｎｎｅｒ，前掲；ヌクレオチド番号８７４−９００、８８６−８８８は、アミノ酸置換Ｏ２５３Ｈを与えるＣＡＴである）を使用して、アミノ酸Ｑ２５３のヌクレオチド配列を、Ｈ２５３をコードするヌクレオチド配列に置換した。得られたプラスミドｐＤ７８Ａ− Ｅ−６６１−ＱＨは、アミノ酸置換Ｑ２５３Ｈを含有していた。アンチセンス配向オリゴヌクレオチドＭｕｔ ３（Ｂｒｏｗｎら，前掲；ヌクレオチド番号９６６−９９３、９７９−９８１は、アミノ酸置換Ａ２８４Ｔを与えるＡＣＣである）を使用することにより、アミノ酸２８４の置換（Ａ２８４Ｔ）を行なって、プラスミドｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＡＴを得た。第４のプラスミドであるｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＱＨ−ＡＴは、１つの部位特異的突然変異誘発反応において両方のオリゴヌクレオチド（Ｍｕｔ２，Ｍｕｔ３）を使用することによる両アミノ酸（Ｑ２５３ＨおよびＡ２８４Ｔ）の置換を含有していた。プラスミドｐ６６１Ａｐａｒｔ、ｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１、ｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＤＮ−ＡＴ、ｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＱＨ、ｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＡＴおよびｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＱＨ−ＡＴを図４に示す。
【００８０】
【表５】
ａ 部位特異的突然変異誘発およびクローニングに使用するオリゴヌクレオチドプライマーの組成および位置。用いる制限部位には下線が付されており、適当な制限酵素が表示されている。突然変異誘発で変更されたヌクレオチドは小文字で示されており、コードヌクレオチドトリプレットは太字で示されている。該位置は、プライマー結合（ヌクレオチド番号）であり、アミノ酸の番号づけは、Ｐ２株の公開されている配列（ＭｕｎｄｔおよびＭｕｌｌｅｒ，１９９５，前掲；ＮＣＢＩ受託番号 Ｘ８４０３４）に基づいている。
【００８１】
セグメントＢの完全長ｃＤＮＡクローンの構築
株Ｄ７８
血清型Ｉ株Ｄ７８のセグメントＢの完全長ｃＤＮＡのクローニングのために、ウイルスをＣＥＦ内で増殖させ、超遠心により精製した。株Ｄ７８のゲノムウイルスＲＮＡを精製し、ｃＤＮＡに逆転写し、標準的な方法に従い、記載されているオリゴヌクレオチド（ＭｕｎｄｔおよびＶａｋｈａｒｉａ，１９９６）を使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。増幅産物を平滑末端化によりクローニングし、適当なＰＣＲ断片を含有するプラスミドを配列決定した。Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下でセグメントＢの完全長ｃＤＮＡを含有するプラスミド（ｐＵＣ１８ＢＤ７８）を得るためのクローニング法は、株Ｐ２のセグメントＢに関してＭｕｎｄｔおよびＶａｋｈａｒｉａ（１９９６ 前掲）により記載されている方法に対応するものであった（図３）。
【００８２】
株ＵＫ６６１
ＢｒｏｗｎおよびＳｋｉｎｎｅｒ（１９９６，前掲）に記載の配列情報から導き出した以下の３対のオリゴヌクレオチドを使用した。ｉ）ＵＫ６６１ＢＦｏｒ１（オリゴヌクレオチド配列Ｂ５’−Ｐ２（ＭｕｎｄｔおよびＶａｋｈａｒｉａ，１９９６ 前掲）に基づく配列）、アンチセンス配向のＵＫ６６１ＢＲｅｖ１（ヌクレオチド番号７０８−７３６）。オリゴヌクレオチドＵＫ６６１ＢＲｅｖ１の５’末端は、株ＵＫ−６６１のセグメントＢの配列に加え、９ヌクレオチド配列５’−ＣＴＣＴＡＧＡＧＧを含有する制限酵素切断部位ＸｂａＩを含有する。ｉｉ）ＵＫ６６１ＢＦｏｒ２（ヌクレオチド番号７５１−６７７）、アンチセンス配向のＵＫ６６１Ｒｅｖ２（ヌクレオチド番号２０８９−２１１３）。オリゴヌクレオチドＵＫ６６１ＢＲｅｖ２の５’末端は、株ＵＫ−６６１のセグメントＢの配列に加え、９ヌクレオチド配列５’−ＣＴＣＴＡＧＡＧＧを含有する制限酵素切断部位ＸｂａＩを含有する。ｉｉｉ）ＵＫ６６１ＢＦｏｒ３（ヌクレオチド番号２０１１−２０３５）、アンチセンス配向のＵＫ６６１Ｒｅｖ３（ＭｕｎｄｔおよびＭｕｌｌｅｒ，１９９５，前掲，ヌクレオチド番号２８０４−２８２７）。オリゴヌクレオチドＵＫ６６１ＢＲｅｖ３の５’末端は、株ＵＫ−６６１のセグメントＢの配列に加え、９ヌクレオチド配列５’−ＴＣＴＡＧＡＧＣＣＣを含有する制限酵素切断部位ＸｂａＩを含有する。この場合、トリプレットＣＣＣは、セグメントＢのウイルスゲノム配列の最後の３ヌクレオチド（ヌクレオチド番号２８２５−２８２７）と共にＳｍａＩ切断部位を生成した。ＲＴ−ＰＣＲ中にこれらの３対のオリゴヌクレオチドＵＫ６６１ＢＦｏｒ１；ＵＫ６６１ＢＲｅｖ１、ＵＫ６６１ＢＦｏｒ２；ＵＫ６６１ＢＲｅｖ２およびＵＫ６６１ＢＦｏｒ３；ＵＫ６６１ＢＲｅｖ３を使用することにより、３個のｃＤＮＡ断片を増幅し、ＳｍａＩで切断されたベクターｐＵＣ１８中に平滑末端化によりクローニングして、それぞれｐＵＫ６６１Ｂ１、ｐＵＫ６６１Ｂ２およびｐＵＫ６６１Ｂ３を得た。それらの３個の挿入断片の配列決定後、ｐＵＫ６６１Ｂ２をＡｇｅＩおよびＸｂａＩで切断して、１４４１ｂｐの断片を得、ついでそれを、ＡｇｅＩ／ＸｂａＩで切断されたｐＵＫ６６１Ｂ１中に連結して、ｐＵＫ６６１Ｂ１２を得た。セグメントＢの完全長ｃＤＮＡクローンの構築のために、ｐＵＫ６６１Ｂ３をＢｓｔＢＩ／ＸｂａＩで切断し、得られた６９４ｂｐの断片を、ＢｓｔＢＩ／ＸｂａＩで切断されたｐＵＫ６６１Ｂ１２中に連結した。得られたプラスミドｐＢ６６１は、Ｔ７プロモーターの制御下で株ＵＫ６６１のセグメントＢの完全長ｃＤＮＡ配列を含有していた。ｐＢ６６１を図５に示す（番号づけは、ＭｕｎｄｔおよびＭｕｌｌｅｒ，１９９５，前掲に記載のＰ２株の配列に基づく）。
【００８３】
組織培養内のｃＲＮＡからのウイルスの回収
ＲＮＡのインビトロ転写のために、プラスミドｐＡＤ７８／ΔＮＢ、ｐＡＤ７８／ΔＮＢ−ＨＱ、ｐＡＤ７８／ΔＮＢ−ＴＡ、ｐＡＤ７８／ΔＮＢ−ＲＳ、ｐＡＤ７８／ΔＮＢ−ＨＱ−ＴＡ−ＲＳ、ｐＤ７８／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＱＨ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＡＴ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＳＲ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＱＨ−ＡＴ、ｐＡＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＡＴ−ＳＲ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＱＨ−ＳＲ、ｐＡＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＱＨ−ＡＴ−ＳＲおよびｐＤ７８Ｂを、ＢｓｒＧＩまたはＰｓｔＩで切断することにより線状化した。線状化ＤＮＡの更なる処理および転写は、ｉ）該転写混合物をフェノール／クロロホルム精製に付さなかったこと及びｉｉ）ＱＭ−７細胞をトランスフェクション実験に使用したことの２点を除き、ＭｕｎｄｔおよびＶａｋｈａｒｉａ （１９９６）に記載のとおりに行なった。トランスフェクションの２日後、細胞を凍結／融解し、７００ ｘ ｇで遠心分離して細胞残渣を除去し、得られた上清を０．４５μｍフィルターで更に清澄化し、−７０℃で保存した。免疫蛍光研究のために、ＱＭ−７細胞を無菌カバーグラス上で増殖させた。ＲＮＡのインビトロ転写のために、ＵＫ６６１のセグメントＡを含有するプラスミド（図５）を、ＢｓｒＧＩで切断することにより線状化した。株Ｄ７８のセグメントＢはＰｓｔＩで線状化し、一方、株ＵＫ６６１のセグメントＢはＳｍａＩで線状化した。線状化ＤＮＡの更なる処理および転写を前記のとおりに行なった。
【００８４】
ＩＢＤＶ抗原の検出
ＩＢＤＶ抗原を、ウサギ抗ＩＢＤＶ抗血清を使用する間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）およびウエスタンブロット法により検出した。ＩＦＡの場合には、カバーグラス上で増殖させたＣＥＦを、継代のために使用したそれぞれトランスフェクト化ＱＭ−７、ＣＥＦおよびＣＡＭの上清と共にインキュベートした。１６時間のインキュベーション時間の後、ＣＥＦをアセトンで固定し、ＩＦＡのために加工した。トランスフェクション後のＩＢＤＶの複製を調べるために、カバーガラス上で増殖させたＱＭ−７細胞を２４時間または４８時間インキュベートし、アセトンで固定し、ＩＦＡのために加工した。
【００８５】
結果
属間ｃＲＮＡでのトランスフェクション実験
トランスフェクション実験のために、株Ｄ７８のセグメントＡの完全長ｃＤＮＡクローン（ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ）および属間セグメントＡ ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌを合成ｃＲＮＡへ転写させ、セグメントＢ（ｐＤ７８Ｂ）の完全長ｃＲＮＡと共にＱＭ−７細胞内およびＣＥＦ内に同時にコトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞を凍結／融解し、得られた上清をＣＥＦ上で２回継代した。ＣＥＦを、各継代において感染後５日間までインキュベートした。凍結／融解後、各トランスフェクションの各トランスフェクション上清および各継代を、ＣＥＦを使用するＩＦＡにより、ＩＢＤＶ抗原に関して試験した。トランスフェクション実験を３回繰返した。株Ｄ７８ｒの生成をもたらすｐＡＤ７８／ΔＮＢおよびプラスミドｐＤ７８ＢからのｃＲＮＡのトランスフェクション後、ウイルスを得た。これに対して、ｐＤ７８／ΔＮＢ−Ｅ／ＤｅｌおよびｐＤ７８ＢからのｃＲＮＡを使用するトランスフェクション実験の後では、ウイルスに感染した組織培養を全く単離することができなかった。トランスフェクションの後に複製が生じたか否かを分析するために、カバーガラス上で増殖中のＱＭ−７細胞を使用してトランスフェクションを行なった。ここではどちらの場合においても、トランスフェクションの２４時間後にＩＦＡでウイルス抗原が検出された。このように、本発明者らは、どちらの場合にもウイルスの複製が生じるが、Ｄ７８ｒの場合のみにおいて、組織培養に感染したＩＢＤＶを得るのが可能であることを確認した。
【００８６】
突然変異ｃＲＮＡでのトランスフェクション実験
配列の比較の結果に基づいて、多数の異なる突然変異完全長ｃＤＮＡクローンを部位特異的突然変異誘発により樹立した。
【００８７】
（ｉ）変異体Ｅ ＩＢＤＶ
可能なすべての７つの組合せにおいて２５３、２８４および３３０位にアミノ酸（ａａ）の置換を含有するｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌの突然変異プラスミドを作製した（表５）。トランスフェクション実験および継代を、ＣＥＦおよびＱＭ−７細胞上で同時に３回行なった。得られた上清を、ＩＦＡにより感染性に関して分析した。プラスミドｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＱＨ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＡＴ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＳＲ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＡＴ−ＳＲおよびｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＱＨ−ＳＲのｃＲＮＡをｐＤ７８ＢのｃＲＮＡと共にトランスフェクトした後は、ＱＭ−７細胞またはＣＥＦ感染ウイルスを単離することができなかった。ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＱＨ−ＡＴまたはｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＱＨ−ＡＴ−ＳＲから得たｃＲＮＡのトランスフェクションは、感染性ウイルス（Ｄ７８Ａ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＱＨ−ＡＴおよびＤ７８Ａ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＱＨ−ＡＴ−ＳＲ）の生成を引き起こした。ＣＥＦおよびＱＭ−７細胞上でのＩＦＡにより特異性が確認された。これは、ＩＢＤＶのＶＰ２が、組織培養への感染において決定的に重要な役割を果たしていることを示している。アミノ酸置換（ＢＵ）Ｑ−２５３−Ｈ（ＴＣ）および（ＢＵ）Ａ−２８４−Ｔ（ＴＣ）は、使用した組織培養に対して感染性のＩＢＤＶを得るために必要かつ十分であった。３個のアミノ酸置換を有するＩＢＤＶ突然変異体（Ｄ７８／変異体Ｅ ＣＥＦ適応）を、さらなる検査に使用した（実施例２）。
【００８８】
（ｉｉ）古典的ＩＢＤＶ
Ｄ７８
これらの結果を確認するために、部位特異的突然変異誘発のためにｐＡＤ７８／ΔＮＢを使用してもう１組のプラスミドを構築して、単一のアミノ酸（ｐＡＤ７８／ΔＮＢ−ＨＱ、ｐＡＤ７８／ΔＮＢ−ＴＡ、ｐＡＤ７８／ΔＮＢ−ＲＳ）または全３個のアミノ酸（ｐＡＤ７８／ΔＮＢ−ＨＱ−ＴＡ−ＲＳ）の置換プラスミドを得た。これらの４個のプラスミドをｐＤ７８Ｂと共に、前記のとおりにトランスフェクション実験に使用した。ｐＡＤ７８／ΔＮＢ−ＲＳからのｃＲＮＡのトランスフェクションの後、感染性ＩＢＤＶの生成をＩＦＡにより検出することができた。この場合もまた、アミノ酸３３０は、組織培養への生成ウイルスの感染能に何ら影響を及ぼさなかった。
【００８９】
トランスフェクション後、ＩＦＡにより全ての構築物を複製に関して試験した。トランスフェクションの特に２４時間および４８時間後にＩＢＤＶ抗原を検出することができた。これは、濃く染色された典型的な細胞質内集合体を示している。
【００９０】
ＵＫ６６１
トランスフェクション実験のために、キメラセグメントＡ ｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１、ｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＤＮ−ＡＴ、ｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＱＨ、ｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＡＴおよびｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＱＨ−ＡＴの完全長ｃＤＮＡクローンを合成ｃＲＮＡに転写し、株Ｄ７８のセグメントＢまたは株ＵＫ６６１のセグメントＢの完全長ｃＲＮＡと共にＱＭ−７細胞内およびＣＥＣ内に同時にコトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞を凍結／融解し、得られた上清をＣＥＣ上で１回継代した。ＣＥＣを、感染後２４または４８時間インキュベートし、固定し、免疫蛍光法のために加工した。キメラＩＢＤＶ Ｄ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＱＨ−ＡＴを与えるｐＤ７８ＢおよびｐＢ６６１の両方とプラスミドｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＱＨ−ＡＴとからのｃＲＮＡのトランスフェクションの後、ＣＥＣに対して感染性のウイルスを得た。これに対して、ｐＢＤ７８またはｐＢ６６１のいずれかからのｃＲＮＡと共にｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１、ｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＤＮ−ＡＴ、ｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＱＨ、ｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＡＴからのｃＲＮＡを使用するトランスフェクションの後では、組織培養に感染したウイルスは単離することができなかった。Ｄ７８−Ｅ−６６１−ＤＮ−ＡＴの場合には、感染の７２時間後、該トランスフェクション上清のインキュベーションに際して単一の感染ＣＥＦが検出可能である。
【００９１】
（ｉｉｉ）ＧＬＳ ＩＢＤＶ
属間および突然変異プラスミドを使用するトランスフェクション実験の結果を確認するために、本発明者らは、天然に存在する１対のＩＢＤＶ株を利用した。嚢由来のＧＬＳ株（ＧＬＳ−Ｂ）のＶＰ２の可変領域および組織培養適応変異体ＧＬＳ−ＴＣを増幅し、クローニングし、分析した。それぞれｐＧＬＳ−ＢおよびｐＧＬＳ−ＴＣから得た２つのＧＬＳ株のアミノ酸配列の比較は、２８４位における１つのアミノ酸の両配列間での置換 ［（ＧＬＳ−Ｂ）Ａ→Ｔ（ＧＬＳ−ＴＣ）］を示した（図１Ｂ）。アミノ酸２５３（Ｑ）および３３０（Ｓ）は、前記のとおりＢＵ群のアミノ酸と同一であった。感染性ウイルスの生成のためには２８４位における置換（Ａ→Ｔ）で十分であるか否かを分析するために、それらの両方のＧＬＳ変異体のＶＰ２の超可変領域を含有する２つのプラスミド（ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＧＬＳ−ＴＣおよびｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＧＬＳ−Ｂ）を構築した。それぞれｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＧＬＳ−ＴＣおよびｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＧＬＳ−ＢのｃＲＮＡを、ｐＤ７８ＢのｃＲＮＡと共にＱＭ−７細胞内およびＣＥＦ内に同時にトランスフェクトした。組織培養内の上清の継代後、ＩＦＡによる感染性ウイルスの検出が、また、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＧＬＳ−ＴＣのｃＲＮＡのトランスフェクション後、ＣＰＥの検出が可能であった。何回かの試みにおいて、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＧＬＳ−ＢからのｃＲＮＡのトランスフェクションは、組織培養に感染性のＩＢＤＶを含有する上清を産生しなかった。ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＧＬＳ−ＴＣおよびｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＧＬＳＢの両プラスミドのインビトロ転写／翻訳は、該ポリタンパク質の完全なプロセシングを示した。両プラスミドのｃＲＮＡをｐＤ７８ＢからのｃＲＮＡと共にトランスフェクションした後、ウイルス抗原がＩＦＡにより検出された。したがって、両方のキメラ体は複製適合性であることが判明した。この場合を総合すると、２８４位における単一のアミノ酸置換につながるＶＰ２の超可変領域の置換は、感染性属間ＩＢＤＶの生成に十分なものであった。
【００９２】
【表６】
ａ プラスミドは、組織培養適応血清型Ｉ株Ｄ７８のセグメントＡの完全長ｃＤＮＡクローンに基づく。嚢由来血清型Ｉ株ＧＬＳ−ＢＵ、Ｄｅｌａｗａｒｅ Ｅ（Ｅ／Ｄｅｌ）および組織培養適応血清型Ｉ株ＧＬＳ−ＴＣの配列をＤ７８配列で置換した。
ｂ Ｐ２株の公開されている配列（ＭｕｎｄｔおよびＭｕｌｌｅｒ，１９９５，前掲；ＮＣＢＩ受託番号Ｘ８４０３４）に基づくアミノ酸（ａａ）の番号づけ。天然に存在するアミノ酸はイタリックで表示されており、変化したアミノ酸は太字で表示されている。
ｃ トランスフェクション実験にはニワトリ胚細胞（ＣＥＦ）およびＱＭ−７細胞を使用した。トランスフェクションの２４時間後、ウサギ抗ＩＢＤＶ血清（Ｍｕｎｄｔら，１９９５）を使用する間接免疫蛍光法によりＩＢＤＶ抗原が検出された。抗原陽性（＋）、抗原陰性（−）。
ｄ トランスフェクション上清の継代にはＣＥＦを使用した。ＣＥＦ上への継代後、ウサギ抗ＩＢＤＶ血清（Ｍｕｎｄｔら，１９９５，前掲）を使用する間接免疫蛍光法によりＩＢＤＶ抗原が検出された。抗原陽性（＋）、抗原陰性（−）。
【００９３】
実施例２
ＣＥＦ適応変異体Ｅ ＩＢＤＶ突然変異体の生物学的特性
材料および方法
ＩＢＤＶワクチンの製造
キメラＤ７８／変異体Ｅ（嚢適応）
９〜１２日齢のＳＰＦ卵に、滴下（ｄｒｏｐｐｅｄ）漿尿膜（ＣＡＭ）経路によりキメラＤ７８／変異体ＥＤ（Ｑ２５３Ｈ、Ａ２８４ＴおよびＳ３３０Ｒにおける３つのアミノ酸置換を有さないＤ７８／変異体Ｅ／Ｄ７８）を感染させた。感染の５日後、該ＣＡＭおよび胚を集め、ホモジナイズした。該ホモジネートをＣＡＭ上で力価測定した。該上清を希釈して、点眼経路による適用のための１０２．０ＥＩＤ５０／動物のワクチン用量を得た。
【００９４】
キメラＤ７８／変異体Ｅ（ＣＥＦ適応体）
初代ニワトリ胚繊維芽（ＣＥＦ）細胞を２×１０６／ｍｌの最終濃度で調製した。該細胞を、５％ウシ胎仔血清を含有するイーグルの最小必須培地内で培養した。この細胞懸濁液１５ｍｌに、１ｍｌ中に溶解されたＩＢＤＶ（Ｑ２５３Ｈ、Ａ２８４ＴおよびＳ３３０Ｒにおける３つのアミノ酸置換を有するＤ７８／変異体Ｅ／Ｄ７８）ウイルス０．１ｍｌを加えた。高加湿インキュベーター内で３７℃で３〜６日間のインキュベーションの後、該上清を希釈して、点眼または筋肉内注射による適用のためのそれぞれ１０５．３または１０３．５ＴＣＩＤ５０／動物のワクチン用量を得た。
【００９５】
商業的に入手可能な古典的ＩＢＤＶワクチンＮｏｂｉｌｉｓ株Ｄ７８
該ワクチンを希釈して、点眼経路による適用のための１０３．３ＴＣＩＤ５０／動物のワクチン用量を得た。
【００９６】
パネル試験によるＩＢＤＶワクチンの同定
両ＩＢＤＶ株を、（Ｖａｎ Ｌｏｏｎ，Ａ．Ａ．Ｗ．Ｍ．，Ｄ．ＬｕｔｔｉｃｋｅｎおよびＤ．Ｂ．Ｓｎｙｄｅｒ．Ｒａｐｉｄ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ （ＩＢＤ） ｃｈａｌｌｅｎｇｅ，ｆｉｅｌｄ ｏｒ ｖａｃｃｉｎｅ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒａｉｎｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｃｈｉｃｋｅｎ ｉｎｆｅｔｉｏｕｓ ａｎｅｍｉａ，Ｒａｕｉｓｃｈｈｉｌｚｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１７９−１８７，１９９４）に従い、異なるモノクローナル抗体を使用するＥＬＩＳＡにより同定した。
【００９７】
ＣＥＦ上での増殖
両ＩＢＤＶ株を使用してＣＥＦに感染させた。ＩＢＤＶに関する特異的ＣＰＥ（細胞変性効果）の誘導を、６日間顕微鏡検査した。
【００９８】
ワクチン接種
ワクチン接種の１４日後、攻撃ウイルス（ビルレントＩＢＤＶ株変異体Ｅ）の投与から得られる攻撃に対する抵抗性の測定により、種々のワクチンの効果を評価する。キメラワクチンＤ７８／変異体Ｅ（嚢適応体）（１０２．０ＥＩＤ５０／動物）を、２週齢の時点で点眼経路で適用した。キメラワクチンＤ７８／変異体Ｅ（ＣＥＦ適応体）（１０５．５または１０３．５ＴＣＩＤ５０／動物）を、２週齢の時点でそれぞれ点眼経路または筋肉内注射により適用した。商業的に入手可能な古典的ワクチンＮｏｂｉｌｉｓ株Ｄ７８（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂ．Ｖ．，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）（１０３．３ＴＣＩＤ５０／動物）を、２週齢の時点で点眼経路により適用した。ワクチン接種の３、７、１０および１３日後ならびに攻撃の３日後、５匹／群におけるファブリキウス嚢内のＩＢＤＶおよび該嚢内の顕微鏡的病変の存在を調べた。攻撃に対する防御が確認された。
【００９９】
結果
パネル試験によるＩＢＤＶワクチンの同定
表６に示されるとおり、キメラＤ７８／変異体Ｅ（嚢適応体）およびキメラＤ７８／変異体Ｅ（ＣＥＦ適応体）は、異なるＭＣＡに対して同一の反応パターンを有する。このことは、３アミノ酸の変化が、種々のＭＣＡによる測定において、該ウイルス上に存在するエピトープに何ら影響を及ぼさないことを意味する。古典的な市販ワクチンは、異なるＭＣＡに対して異なる反応パターンを有する。
【０１００】
【表７】
【０１０１】
ＣＥＦ上での増殖
表７に示されるとおり、キメラＤ７８／変異体Ｅ（嚢）はＣＥＦ上で増殖する能力を有していない。キメラＤ７８／変異体Ｅおよび古典的な市販ワクチンＮｏｂｉｌｉｓ株Ｄ７８は共にＣＥＦ上で複製する能力を有し、ＣＰＥを誘導しうる。
【０１０２】
【表８】
【０１０３】
ワクチン接種の３、７、１０および１３日後ならびに攻撃の３および１０日後の嚢における平均顕微鏡的病変指数
結果を表８に示す。表８に示されるとおり、非ＣＥＦ適応株キメラＤ７８／変異体Ｅ（嚢）はビルレントであり、ワクチン接種の７日後には既に完全なリンパ球喪失を誘発する。これに対して、組織培養適応株Ｄ７８／変異体Ｅ（ＣＥＦ）はワクチン接種後に病変を誘発しない。該市販ワクチンは軽度ないしは中等度の病変を誘発する。個々のデータは、キメラＤ７８／変異体Ｅ（嚢）またはＤ７８でワクチン接種された動物が攻撃に対して防御されたことを示している。眼または筋肉内経路によりＤ７８／変異体Ｅでワクチン接種された動物も、ビルレントな親株による誘導より弱かったものの攻撃の３日後に防御を示した。
【０１０４】
【表９】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＥＦ細胞培養内で複製する能力を有する感染性ＩＢＤＶ突然変異体の製造方法、遺伝的に操作されたＩＢＤＶ突然変異体、およびそのようなＩＢＤＶ突然変異体を含むワクチン関する。
【背景技術】
【０００２】
感染性嚢胞疾患ウイルス（ＩＢＤＶ）はビルナウイルス科のメンバーである。この科のウイルスは、非常に類似したゲノム体制および類似した複製周期を有する。これらのウイルスのゲノムは、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡの２つのセグメント（ＡおよびＢ）よりなる。大きい方のセグメントＡは、自己タンパク質分解により切断されて成熟ウイルスタンパク質ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４を形成するポリタンパク質をコードする。ＶＰ２およびＶＰ３は、ビリオンの主要構造タンパク質である。ＶＰ２はビルナウイルスの主要な宿主防御免疫原であり、中和抗体の誘導を引き起こす抗原領域を含有する。ＶＰ４タンパク質は、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４タンパク質の前駆体ポリタンパク質のプロセシングに関与するウイルスコード化プロテアーゼであるらしい。大きい方のセグメントＡはまた、該ポリタンパク質遺伝子に先行する及び部分的に重複する第２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する。この第２のオープンリーディングフレームは、ＩＢＤＶ感染細胞内に存在する未知機能のタンパク質ＶＰ５をコードする。小さい方のセグメントＢは、ポリメラーゼおよびキャッピング酵素活性を有する９０ｋＤａの多機能タンパク質であるＶＰ１をコードする。
【０００３】
ＩＢＤＶには、血清型１および２の２つの血清型が存在する。それらの２つの血清型はウイルス中和（ＶＮ）試験により識別されうる。さらに、血清型１の亜型が既に分離されている。血清型１のこれらのいわゆる「変異（体）」ウイルスは、交差中和試験、モノクローナル抗体のパネル、またはＲＴ−ＰＣＲにより同定されうる。また、ＩＢＤＶの血清型１のこれらの亜型、例えば、古典的、変異体Ｅ、ＧＬＳ、ＲＳ５９３およびＤＳ３２６株が文献に記載されている（Ｖａｎ Ｌｏｏｎら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｃｈｉｃｋｅｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｎａｅｍｉａ，Ｒａｕｉｓｃｈｈｏｌｚｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１７９−１８７，１９９４）。
【０００４】
ガンボロー病とも称される感染性嚢胞疾患（ＩＢＤ）は、ファブリキウス嚢の細胞に対して選択指向性を有しリンパ系組織を一次標的とする、ニワトリにおける高伝染性急性ウイルス感染症である。感受性集団における罹患率は高く、急激な体重減少および中等度の死亡率を伴う。該疾患から回復したニワトリは、ニワトリの防御機構に不可欠であるファブリキウス嚢の破壊のため、免疫不全を有することがある。ＩＢＤウイルスは、３週齢未満のニワトリにおいては重篤な免疫抑制を引き起こし、３月齢までのニワトリにおいては嚢の病変を誘発する。
【０００５】
該疾患は、弱毒化生ＩＢＤＶワクチンで初回抗原刺激されたニワトリに対する不活化ワクチンの適用により種禽（ｂｒｅｅｄｅｒ）集団において高レベルの抗体を誘導することにより長年にわたり予防されうる。このため、ＩＢＤにより引き起こされる経済的損失が最小限に維持されている。ワクチン接種された種禽に由来するニワトリにおける移行抗体は、ＩＢＤＶによる初期感染を予防し、免疫抑制に伴う問題を減少させる。さらに、移行抗体が減弱した後の商業用のニワトリ集団においても、弱毒化生ワクチンが成功裡に使用されている。
【０００６】
最近、ヨーロッパにおいて、非常にビルレントなＩＢＤＶ株が、高い死亡率の疾患の発生を引き起こした。現在のワクチン接種計画では、ニワトリを十分に防御することができなかった。ワクチン接種の失敗は、主として、ビルレントな野外ウイルスによる攻撃の前に生ワクチンがニワトリに感染できなかったことによるものであった。
【０００７】
したがって、既存のワクチンを改良し、新規タイプのワクチンを開発することが絶えず要求されている。生ワクチンの開発のためには、弱毒化形態のＩＢＤウイルスが必要とされる。通常、これは、適当な基質上でのＩＢＤＶ野外分離体の連続継代により得ることができる。不活化ＩＢＤＶワクチンの開発のためには、該基質上でのＩＢＤウイルスの増殖から生じる大量のＩＢＤＶ抗原塊の作製のための適当な基質が必要である。
【０００８】
野外ＩＢＤＶは、感染したトリの嚢内または発育鶏卵内でインビボで容易に増殖しうることが公知である。一方、ニワトリ胚由来のインビトロ細胞培養にいくつかのＩＢＤＶ株の増殖を適応させるのに成功したことが報告されているにもかかわらず、野外の感染嚢から分離されたほとんどのＩＢＤＶ株、特に、いわゆるビルレントまたは非常にビルレントなＩＢＤＶ株は、ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）などのニワトリ胚由来の細胞または腎臓、肝臓などの他の器官に由来する細胞には適応させることができないことが一般に認められている（Ｂｒｏｗｎら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５，６７５−６８０，１９９４，ｖａｎ Ｌｏｏｎら，１９９４，前掲）。
【０００９】
インビボ培養基質の欠点は明らかである。そのような培養方法は、動物に対する思いやりがない方法であり、多数の動物を必要とし、長時間を要し、標準化されたストリンジェントな条件下で行なうことができない。また、インビトロ細胞培養基質に対する適応に不応性でない限られた数のＩＢＤＶ株は、ＩＢＤＶ株の適応につながる連続継代法の結果、ランダムな突然変異が該ウイルスのゲノム内に無制御に導入されるという欠点を有する。そのような突然変異は、細胞培養に対するウイルスの適応に関連したもの以外のウイルスの特性、例えば、ウイルスの免疫原性に関連した特性に影響を及ぼしうる。そのような追加的なランダムな突然変異は望ましくない。
【００１０】
ＣＥＦ細胞培養内のインビトロでのウイルスの継代によるＩＢＤＶの適応は、感染したトリの嚢内の病変を該ウイルスが誘発する能力の減少により示されるとおり、ビルレンスの弱毒化を伴う。Ｙａｍａｇｕｃｈｉら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２３，２１９−２２３，１９９６）は、ＩＢＤウイルスのビルレンスに関する、およびＣＥＦ細胞培養に対する嚢ＩＢＤＶの適応の結果としてこれらのウイルスが弱毒化されることに関する分子的根拠について検討している。野生型ＩＢＤＶの弱毒化に関与する明確な突然変異を同定することはできないと、Ｙａｍａｇｕｃｈｉらが行なった研究から結論づけられた。セグメントＡの長いオープンリーディングフレームにコードされるポリタンパク質の２７９位（Ａｓｐ／Ａｓｎ）および２８４位（Ａｌａ／Ｔｈｒ）のアミノ酸残基が、ＣＥＦ細胞内でのＩＢＤＶのビルレンスまたは増殖に重要であると示唆された。後者は、Ｌｉｍ，Ｂ−Ｌ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ４ｔｈ Ａｓｉａ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，２２−２６，１９９８年１１月，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ，Ａｂｓｔ．７９）により確認された。ＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質内のアミノ酸残基２７９および２８４の置換（それぞれＡｓｐ→ＡｓｎおよびＡｌａ→Ｔｈｒ）は、ＣＥＦ細胞培養内で増殖しうるＩＢＤＶ突然変異体を与える、と該刊行物に開示されている。しかしながら、先行技術においては、ＣＥＦ細胞培養に対する嚢ＩＢＤＶの適応を可能にするのに必要かつ十分であるアミノ酸の突然変異のタイプおよび最小数の別態様は開示されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｖａｎ Ｌｏｏｎら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｃｈｉｃｋｅｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｎａｅｍｉａ，Ｒａｕｉｓｃｈｈｏｌｚｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１７９−１８７，１９９４
【非特許文献２】Ｂｒｏｗｎら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５，６７５−６８０，１９９４，ｖａｎ Ｌｏｏｎら，１９９４
【非特許文献３】Ｙａｍａｇｕｃｈｉら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２３，２１９−２２３，１９９６）
【非特許文献４】Ｌｉｍ，Ｂ−Ｌ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ４ｔｈ Ａｓｉａ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｈｅａｌｔｈ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，２２−２６，１９９８年１１月，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ，Ａｂｓｔ．７９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
感染したトリの嚢内においてインビボでしか増殖しないＩＢＤＶ分離体を、細胞培養内での増殖に適応させるために一般に適用可能な方法を提供することが、本発明の目的である。
【００１３】
突然変異をＩＢＤＶゲノム内に制御的に導入することによる弱毒化ＩＢＤＶ突然変異体の製造方法を提供することが、本発明のもう１つの目的である。
【００１４】
さらに、遺伝的に操作されたＩＢＤＶ突然変異体であって、該突然変異体が細胞培養内で増殖することを可能にする適当なアミノ酸残基を含むことを特徴とするＩＢＤＶ突然変異体を提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
この目的は、以下の工程を含んでなる、ＣＥＦ細胞培養内で複製されうる感染性ＩＢＤＶ突然変異体の製造方法により達成されることが判明した：
（ｉ）ＣＥＦ細胞培養内で複製する能力を有さないＩＢＤＶのゲノムセグメントＡおよびＢのｃＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を別々に調製し、
（ｉｉ）該セグメントＡを含むｃＤＮＡ上の、
（ａ）変異体Ｅまたは古典的ＩＢＤＶ株のＶＰ２ゲノムのアミノ酸残基２５３および２８４の１以上のコドン内または
（ｂ）ＧＬＳ ＩＢＤＶ株のＶＰ２遺伝子のアミノ酸残基２８４のコドン内に突然変異を導入して、変異体Ｅまたは古典的ＩＢＤＶ株の場合には、該突然変異ＶＰ２遺伝子のアミノ酸残基２５３および２８４のコドンがそれぞれヒスチジンおよびトレオニン残基をコードするようにし、あるいはＧＬＳ ＩＢＤＶ株の場合には、該突然変異ＶＰ２遺伝子のアミノ酸残基２８４のコドンがトレオニン残基をコードするようにし、
（ｉｉｉ）該セグメントＡと該セグメントＢとを含むｃＤＮＡのＲＮＡ転写産物に、培地内の宿主細胞内で該ＩＢＤＶ突然変異体の複製を開始させ、
（ｉｖ）該培養から該ＩＢＤＶ突然変異体を分離する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】ｐＥＤＥＬ２２ＢａｃＩＩ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢおよびｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤＥＬの線状プラスミド地図を示す。
【図１Ｂ】ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤＥＬ−ＧＬＳ−ＢおよびｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤＥＬ−ＧＬＳ−ＴＣの線状プラスミド地図を示す。
【図１Ｃ】ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤＥＬ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤＥＬ−ＱＨ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤＥＬ−ＡＴおよびｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤＥＬ−ＳＲの線状プラスミド地図を示す。
【図１Ｄ】ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤＥＬ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤＥＬ−ＱＨ−ＡＴ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤＥＬ−ＡＴ−ＳＲおよびｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤＥＬ−ＱＨ−ＳＲの線状プラスミド地図を示す。
【図１Ｅ】ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤＥＬおよびｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤＥＬ−ＱＨ−ＡＴ−ＳＲの線状プラスミド地図を示す。
【図２】ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−ＱＨ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−ＴＡ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−ＲＳおよびｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−ＱＨ−ＴＡ−ＳＲの線状プラスミド地図を示す。
【図３】ｐＵＣ１８ＢＤ７８の線状プラスミド地図を示す。
【図４】ｐＤ７８Ａ−Ｅ／ＤＥＬ、ｐ６６１Ａｐａｒｔ、ｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１、ｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＤＮ−ＡＴ、ｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＱＨ、ｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−Ｅ−ＡＴおよびｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＱＨ−ＡＴの線状プラスミド地図を示す。
【図５】ｐＵＫ６６１Ｂ１、ｐＵＫ６６１Ｂ２、ｐＵＫ６６１Ｂ３およびｐＢ６６１の線状プラスミド地図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、いずれのアミノ酸残基が、ＣＥＦ細胞培養内でＩＢＤＶの複製を可能にするのに必要かつ十分であるかを、初めて同定するものである。ほとんどのＩＢＤＶ嚢分離体はＶＰ２タンパク質のアミノ酸残基２５３（Ｇｌｎ）、２８４（Ａｌａ）および３３０（Ｓｅｒ）を含むが、２５３位および２８４位のコドンがアミノ酸残基２５３（Ｈｉｓ）および２８４（Ｔｈｒ）をコードするように変化している変異体Ｅまたは古典的ＩＢＤＶ突然変異体はＣＥＦ細胞培養内で増殖しうる。ＧＬＳ ＩＢＤＶ突然変異体の場合、２８４位のコドンがアミノ酸残基２８４（Ｔｈｒ）をコードするように該コドンを変化させることで十分であることが判明している。また、アミノ酸３３０位は、ＣＥＦ内での古典的または変異体Ｅ ＩＢＤＶ突然変異体の複製に決定的に重要ではないことが判明している。しかしながら、本発明においては、その位置にセリン、アルギニンまたはリシン残基が存在するのが最も好ましい。また、ＧＬＳ ＩＢＤＶの場合には、アミノ酸２５３位は複製に決定的に重要ではなく、それは通常はグルタミン残基であることが判明している。したがって、好ましい方法においては、ＶＰ２タンパク質内のこの位置に、これらの３つのアミノ酸残基のいずれか、特に３３０（Ａｒｇ）を含むＩＢＤＶ突然変異体を製造する。ＧＬＳ ＩＢＤＶ突然変異体の場合、２５３位の好ましいアミノ酸残基はグルタミンである。
【００１８】
【表１】
【００１９】
感染したニワトリの嚢内のみで複製する能力を有していた（キメラ）変異体Ｅ ＩＢＤＶ（Ｄ７８／変異体Ｅ）のゲノムにおいては、ＣＥＦ細胞培養に対するＩＢＤＶ分離体の適応のためには２つの変化が必要であることが判明している。これらの位置はアミノ酸残基２５３および２８４を含む。これらの位置のそれぞれのアミノ酸残基ヒスチジンおよびトレオニンは、該ＩＢＤＶ突然変異体がＣＥＦ細胞培養内で複製するのを可能にする（表１および実施例１）。さらにまた、本発明方法によりＣＥＦ細胞培養に適応したＩＢＤＶ突然変異体は弱毒化されることが判明している（実施例２）。
【００２０】
古典的ＩＢＤＶ株における嚢からＣＥＦ細胞への適応がそれらの２つのアミノ酸によっても決定されることを更に確認するために、ＣＥＦ細胞培養内で複製する能力を有するＩＢＤＶ株Ｄ７８のコドンを２５３、２８４および３３０位で変化させた。その結果を表２Ａに示す。
【００２１】
【表２】
【００２２】
古典的な「非常にビルレントな」（ＶＶ）欧州分離体ＵＫ６６１（Ｂｒｏｗｎら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５，６７５−６８０，１９９４； Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．４０，１−１５，１９９６）はインビトロでは増殖できないため、ニワトリにおいてインビボで増殖させる必要がある。ニワトリにＶＶ株を感染させる必要があり、感染の数日後、生存したトリを殺し、その嚢を摘出する。ついで、さらなる使用のために、該ウイルスを嚢ホモジネートから抽出することができる。本発明を裏付ける実験は、前記のとおりの２５３位および２８４位のアミノ酸変化が、ＶＶ株ＵＫ６６１が細胞培養内で増殖するのを可能にすることを示した。古典的ＩＢＤＶ株に関する突然変異誘発およびトランスフェクション実験の結果を、表２Ｂに要約する。
【００２３】
【表３】
【００２４】
これらのデータは更に、古典的嚢ＩＢＤＶ株が細胞培養内で増殖するのが可能となるためには２５３位および２８４位のアミノ酸変化で十分であることを示している。他のすべての突然変異は、細胞培養内で複製されないか又は非常に不十分にしか複製されない突然変異体を与える（Ｌｉｍら，Ｊ．Ｖｉｏｌ．７３，２８５４−６２，１９９９）。
【００２５】
また、ＧＬＳ ＩＢＤＶにおいては、嚢に適応したＩＢＤＶがＣＥＦ細胞内で複製されるのが可能となるためには２８４位における単一のアミノ酸残基の置換で十分であることが確認された（表３）。
【００２６】
【表４】
【００２７】
したがって、本発明の方法は、組換えＤＮＡ技術を用いて、細胞培養内での増殖に対するＩＢＤＶ嚢分離体の適応を可能にする。本発明の利点は、該適応方法の結果、専ら、ＩＢＤＶのゲノム内の２５３位および２８４位のコドンの１以上に突然変異が導入されることである。それらの番号は、該ポリタンパク質およびＩＢＤＶゲノムのセグメントＡ上の大きなオープンリーディングフレームの、それぞれアミノ酸およびコドンの位置を示している（ＭｕｎｄｔおよびＭｕｌｌｅｒ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７７，４３７−４４３，１９９５； ＮＣＢＩ受託番号Ｘ８４０３４）。
【００２８】
ＣＥＦ細胞培養上で増殖しない全てではなくともほとんどのＩＢＤＶ株は、ＶＰ２遺伝子内にコドン２５３（Ｇｌｎ）、２８４（Ａｌａ）および３３０（Ｓｅｒ）を含有する。ＣＥＦ細胞培養上で増殖しないいくつかの変異体Ｅまたは古典的ＩＢＤＶ株は、必要なコドンである２５３（Ｈｉｓ）および２８４（Ｔｈｒ）の１つを既に有しているかもしれない。したがって、本発明の方法は、生じるＩＢＤＶ突然変異体が、アミノ酸残基２５３（Ｈｉｓ）および２８４（Ｔｈｒ）をコードするコドンをＶＰ２遺伝子内に含むよう、前記の必要なコドンの１以上において突然変異を導入することを含む。
【００２９】
より好ましくは、本発明の方法は、ＣＥＦ細胞内で複製する能力を有さずアミノ酸残基２５３（Ｇｌｎ）および２８４（Ａｌａ）、より一層好ましくは３３０（Ｓｅｒ）のコドンを含むＩＢＤＶに適用する。古典的および変異体Ｅ株の場合には、ＶＰ２遺伝子のコドンの２または３つにおいて突然変異を導入して、コドン２５３（Ｈｉｓ）および２８４（Ｔｈｒ）、そして所望により３３０（Ａｒｇ）を得る。これらの位置におけるアミノ酸の新たなコドンは、Ｈｉｓ（ＣＡＴまたはＣＡＣ）、Ｔｈｒ（ＡＣＴ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、ＡＣＧ）およびＡｒｇ（ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、ＡＧＧ）であってもよい。
【００３０】
より一層好ましくは、本発明の方法は、ＣＥＦ細胞内で複製する能力を有さずコドンＧｌｎ２５３（ＣＡＡ）、Ａｌａ２８４（ＧＣＣ）および所望によりＳｅｒ３３０（ＡＧＴ）またはそれらの任意の組合せを含むＩＢＤＶに適用する。
【００３１】
特に、本発明の方法は、ＣＥＦ細胞内で複製する能力を有さずコドン２５３（ＣＡＡ）、２８４（ＧＣＣ）および３３０（ＡＧＴ）を含むＩＢＤＶに適用する。
【００３２】
本発明のＩＢＤＶ突然変異体の製造方法は、ビルナウイルスに関する最近確立された「逆遺伝学（ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」系（ＭｕｎｄｔおよびＶａｋｈａｒｉａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３，１１１３１−１１１３６，１９９６ならびにＷＯ ９８／０９６４６）を含む。この逆遺伝学系は、ＩＢＤウイルスのＲＮＡゲノム内に突然変異を導入する可能性を開いた。本発明の逆遺伝学法の原理は、ゲノムＲＮＡセグメントＡおよびＢを該ウイルスから単離し、ついで該ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写を行ない、ついで該ｃＤＮＡをＲＮＡに転写させるというものである。該ウイルスのセグメントＡ（またはＢ）内への必要な突然変異の導入は、ｃＤＮＡレベルで生じる。この逆遺伝子学系における重要な工程は、ＤＮＡベクター分子（例えば、プラスミド）とＩＢＤＶのセグメントＡまたはＢの完全長ｃＤＮＡクローンとを含む別々のＤＮＡ構築物を準備することである。これらの両方のセグメントの５’および３’末端のヌクレオチドを含む、セグメントＡまたはＢ ｃＤＮＡよりなるＤＮＡ構築物は、ＭｕｎｄｔおよびＶａｋｈａｒｉａ（１９９６，前掲）に記載の方法に従い作製することができる。該逆遺伝学法における後続の工程においては、適当なセグメントＡおよびＢ遺伝物質を適当な宿主細胞にトランスフェクトし、それにより該トランスフェクト化宿主細胞内で、ｃＤＮＡセグメントＡおよびＢのＲＮＡ転写産物に該ウイルスの複製を開始させて感染性ＩＢＤＶを得、それを、該宿主細胞が培養される培地から単離することができる。
【００３３】
逆遺伝学系の最終工程には、いくつかの方法を用いることができる。好ましくは、本発明の方法は、セグメントＡおよびＢの両方のｃＤＮＡからインビトロで合成ＲＮＡ転写産物を調製することを含む。この場合、該ＤＮＡ構築物は、それらのセグメントのいずれかに作動的に結合したＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む。該プロモーターは、Ｔ７、ＳＰ６またはＴ３ポリメラーゼのプロモーターであってもよく、Ｔ７プロモーターが好ましい。ＡおよびＢセグメントの合成転写産物を単離し、それを使用して適当な宿主細胞にトランスフェクトする。
【００３４】
あるいは、提供するもう１つの方法においては、セグメントＢのＲＮＡ転写産物が構成的に発現されるよう、セグメントＢのｃＤＮＡとＲＮＡポリメラーゼプロモーターとを含むＤＮＡ構築物で形質転換された、ＲＮＡポリメラーゼを発現しうる宿主細胞を含む細胞系を提供する。突然変異セグメントＡを含むｃＤＮＡの合成ＲＮＡ転写産物でそのような細胞をトランスフェクトした後、ＩＢＤＶ突然変異体の複製を宿主細胞内で開始させる。特に、バクテリオファージＴ７ ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを発現しうる（例えば、これは組換えワクチンウイルスから細胞質的で発現される）宿主細胞を使用することができる。
【００３５】
所望の突然変異は、この目的のために当技術分野で一般に知られている方法によりＶＰ２遺伝子内に導入することができる。特に、部位特異的突然変異誘発により突然変異を導入する。ＩＢＤＶゲノム内に突然変異を導入するための方法は、本明細書に記載されているが、当技術分野においても一般に用いられている（ＭｕｎｄｔおよびＶａｋｈａｒｉａ，１９９６，前掲；Ｙａｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２，２６４７−２６５４，１９９８； Ｍｕｎｄｔら，欧州特許出願第０８８７，４１２号およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｗｉｌｅｙ Ｎ．Ｙ．，１９９５版，ｐ．８．５．１−８．５．９．）。
【００３６】
本発明の方法は、ＣＥＦ細胞培養内で複製する能力を有さない、ＩＢＤＶの古典的、変異体ＥまたはＧＬＳ抗原亜型である全てのＩＢＤＶ株に適用することができる。
【００３７】
さらに、本発明の方法は、株のビルレンスとは無関係に、非常にビルレントな株（例えば、ＣＳ８９およびＵＫ６６１）、ビルレント株（例えば、Ｆ５２／７０およびＳＴＣ）およびワクチン株（例えば、２２８Ｅおよび２５１２）を含む、ＣＥＦ細胞培養内で複製する能力を有さない全てのＩＢＤＶ株に適用することができる。非常にビルレントな及びビルレントな株に由来する細胞培養内での複製に適応したＩＢＤＶ突然変異体は、それより低いビルレンスを有することとなり、生ワクチン株として使用することができる。あるいは、そのようなＩＢＤＶ突然変異体は、細胞培養内で簡便に増殖させることができ、不活化ワクチンとして製剤化することができる。
【００３８】
また、本発明の方法は、ＣＥＦ細胞培養内で複製する能力を有さないＩＢＤＶ弱毒化株に有利に適用することができる。そのような弱毒化ウイルスに由来する突然変異体を、ワクチンの製造のために、インビボ産生系の代わりに細胞培養系内で使用することができる。
【００３９】
もう１つの態様において、本発明は、ＣＥＦ細胞培養内で複製する能力を有する「キメラ」ＩＢＤＶ突然変異体の製造方法を提供する。該方法は、第１ ＩＢＤＶのセグメントＡの遺伝子（特に、ＶＰ２遺伝子）内に突然変異を導入する追加的工程を含み、その結果、その遺伝子により発現されるタンパク質は、第２ ＩＢＤＶのエピトープ決定基を含む。
【００４０】
キメラＩＢＤＶは、第１抗原亜型のセグメントＡまたはＶＰ２遺伝子を遺伝子バックボーンとして含み、さらに、第２ ＩＢＤＶエピトープ決定基をコードする遺伝情報を含むウイルスである。特に、そのようなキメラＩＢＤＶは、第１抗原亜型のＩＢＤＶのＶＰタンパク質上に１以上の追加的エピトープ決定基を発現する。そのようなキメラＩＢＤＶの利点は、それが、ＩＢＤＶの少なくとも２つの抗原亜型に対する免疫を誘導する単一の免疫原として使用可能なことである。
【００４１】
特に、古典的、ＧＬＳまたは変異体Ｅ ＩＢＤＶのセグメントＡバックボーンまたはＶＰ２遺伝子を含むＩＢＤＶ突然変異体を製造する。種々のＩＢＤＶ株のセグメントＡの全コード領域を含有するｃＤＮＡクローンを、標準的なクローニング法および当技術分野において記載されている方法（Ｖａｋｈａｒｉａら，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ３６，７３６−７４２，１９９２；Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４，１２０１−１２０６，１９９３）を用いて調製することができる。種々のＩＢＤＶ株のセグメントＡのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列が、当技術分野において開示されている（例えば、ＷＯ ９５／２６１９６およびＶａｋｈａｒｉａら，Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ３６，７３６−７４２，１９９２）。
【００４２】
さらに、ＷＯ ９５／２６１９６は、各抗原亜型に特徴的なＩＢＤＶ抗原亜型のいくつかのエピトープ決定基のアミノ酸配列を開示している。また、ＷＯ ９５／２６１９６は、中和モノクローナル抗体のパネルに対する反応性により、種々のＩＢＤＶ株の抗原の特徴づけを開示している。そのような中和モノクローナル抗体に反応性である重要なエピトープ決定基は、Ｂ６９（古典的亜型）、Ｒ６３および６７（変異体Ｅ）および５７（ＧＬＳ）エピトープ決定基である。これらのエピトープ決定基のアミノ酸配列を含むＶＰ２タンパク質の領域は、Ｖａｋｈａｒｉａら，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．３１，２６５−２７３，１９９４に記載されている。
【００４３】
好ましくは、本発明の方法においては、古典的セグメントＡバックボーンと変異体Ｅエピトープ決定基６７またはＧＬＳエピトープ決定基５７をコードするヌクレオチド配列とを含む、ＣＥＦ細胞培養内で複製する能力を有するキメラＩＢＤＶ突然変異体を製造する。あるいは、該キメラＩＢＤＶ突然変異体は、ＧＬＳバックボーンとＢ６９、Ｒ６３または６７エピトープ決定基をコードするヌクレオチド配列とを含む。
【００４４】
特に、本発明の方法は、（ｉ）該ＶＰ２遺伝子が変異体Ｅ株のＶＰ２遺伝子により置換されている、および（ｉｉ）２５３、２８４および３３０位のコドンが前記のとおりに改変されている（実施例１）、株Ｄ７８（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂ．Ｖ．，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから商業的に入手可能）に由来するキメラＩＢＤＶ株（Ｄ７８／変異体Ｅ）の製造を含む。
【００４５】
基本的には、第１ ＩＢＤＶのバックボーンセグメントＡ内に、該エピトープ決定基をコードするヌクレオチド配列を導入するための工程は、前記の突然変異を導入するための工程と実質的に同じである。これは、ゲノムセグメントＡおよびＢのｃＤＮＡを準備し、（ｉ）第１ ＩＢＤＶのエピトープ決定基のコード配列を、第２ ＩＢＤＶのものにより置換し、あるいは（ｉｉ）部位特異的突然変異誘発により第１ ＩＢＤＶ内の特定のコドンを改変することにより、最も簡便に行われる。そのような方法もまた、ＷＯ ９５／２６１９６に記載されている。最後に、これらのｃＤＮＡ分子のＲＮＡ転写産物に、該トランスフェクト化宿主細胞内で複製を開始させて、感染性キメラＩＢＤＶを得る。
【００４６】
本発明のもう１つの実施形態においては、前記のＩＢＤＶ突然変異体の製造方法であって、得られるＩＢＤＶ突然変異体が、該ウイルスを弱毒化する他の突然変異をも含むことを特徴とする製造方法を提供する。そのような突然変異の一例は、天然ＶＰ５タンパク質を発現する能力を有さないＩＢＤＶ突然変異体を与える、ＩＢＤＶゲノムのセグメントＡのＶＰ５遺伝子内の突然変異である。ＩＢＤＶ ＶＰ５−突然変異体の製造は欧州特許出願第８８７，４１２号に記載されている。
【００４７】
もう１つの態様においては、本発明は、古典的または変異体Ｅ株のＶＰ２遺伝子内にコドン２５３（Ｈｉｓ）および２８４（Ｔｈｒ）、そして所望により３３０（Ａｒｇ）を、あるいはＧＬＳ株のコドン２８４（Ｔｈｒ）を含む、ＣＥＦ細胞培養内で複製する能力を有する遺伝的に操作された感染性ＩＢＤＶ突然変異体を提供する。そのようなＩＢＤＶ突然変異体は、遺伝子操作技術により制御的に導入された前記の新たなコドンを除き、ＣＥＦ細胞培養内で複製する能力を有さない嚢ＩＢＤＶの遺伝情報を依然として含む。
【００４８】
特に、３１８位および３２５位にそれぞれグリシンおよび／またはバリンを有さない前記の変異体Ｅ ＩＢＤＶ突然変異体を提供する。これらの位置にそれぞれアスパラギン酸および／またはメチオニンを有する遺伝的に操作された変異体Ｅ突然変異体が、最も好ましい。
【００４９】
好ましい実施形態においては、変異体Ｅ株のＶＰ２遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含み、前記で特定した３つの新たなコドンを有する、本発明の遺伝的に操作されたＩＢＤＶ突然変異体は、キメラＩＢＤＶ突然変異体、特に、株Ｄ７８に由来するキメラＩＢＤＶ突然変異体である。
【００５０】
本発明は、インビトロ細胞培養内での複製に予め不応性であったＩＢＤＶ株からＩＢＤＶワクチンを容易に製造する可能性を与える。本発明の追加的な利点は、ＩＢＤＶが、前記方法により制御的に（さらに）弱毒化されうることである。そのような弱毒化ＩＢＤＶ突然変異体は、生ＩＢＤＶワクチン内の有効成分として使用することができる。
【００５１】
したがって、本発明のもう１つの態様は、ＩＢＤＶ感染により生じる疾患に対して家禽を防御するのに使用するためのワクチンである。該ワクチンは、前記のとおりに製造された遺伝的に操作されたＩＢＤＶ突然変異体と医薬上許容される担体または希釈剤とを含む。
【００５２】
該ＩＢＤＶ突然変異体は、生弱毒化または不活化ウイルスとして該ワクチン内に含有させることができる。
【００５３】
本発明のワクチンは、例えば、商業的に入手可能な生および不活化ＩＢＤＶワクチンに一般に用いられる方法などの通常の方法により製造することができる。簡単に説明すると、感受性基質に本発明のＩＢＤＶ突然変異体を接種し、所望の感染力価まで該ウイルスが複製されるまで該基質を増殖させ、ついでＩＢＤＶ含有物質を収穫する。
【００５４】
本発明のワクチンを製造するために、ＩＢＤＶ突然変異体の複製を支持しうる各基質を使用することができ、それらには、初代（トリ）細胞培養、例えば、ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）またはニワトリ胚肝細胞（ＣＥＬ）、哺乳動物細胞系、例えばベロ細胞系またはＢＧＭ−７０細胞系、またはトリ細胞系、例えばＱＴ−３５、ＱＭ−７またはＬＭＨが含まれる。通常、該細胞の接種後、該ウイルスを３〜１０日間増殖させ、ついで該細胞培養上清を収穫し、所望により濾過または遠心分離して細胞残渣を除去する。
【００５５】
あるいは、該ＩＢＤＶ突然変異体を発育鶏卵内で増殖させる。特に、これらのＩＢＤＶを増殖させる基質として、ＳＰＦ発育卵が挙げられる。発育卵に、例えば、少なくとも１０２ ＴＣＩＤ５０／卵を含む懸濁液またはホモジネートを含有する０．２ｍｌのＩＢＤＶ突然変異体を接種し、ついで該卵を３７℃でインキュベートする。約２〜５日後、該胚および／または該膜および／または該尿膜腔液を集め、この物質を適当にホモジナイズすることにより、該ＩＢＤウイルス産物を収穫することができる。ついで該ホモジネートを２５００ ｘ ｇで１０分間遠心分離し、該上清をフィルター（１００μｍ）で濾過することができる。
【００５６】
該生ウイルスを含有する本発明のワクチンは、懸濁液の形態または凍結乾燥形態で製造し販売することができ、そのような組成物に一般に用いられる医薬上許容される担体または希釈剤を更に含有する。担体には、安定化剤、保存剤およびバッファーが含まれる。適当な安定化剤としては、例えば、ＳＰＧＡ、炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、ショ糖、デキストラン、グルタマートまたはグルコース）、タンパク質（例えば、乾燥乳血清、アルブミンまたはカゼイン）またはそれらの分解産物が挙げられる。適当なバッファーとしては、例えば、アルカリ金属ホスファターゼが挙げられる。適当な保存剤としては、チメロサール、メルチオラートおよびゲンタマイシンが挙げられる。希釈剤には、水、水性バッファー（例えば、緩衝食塩水）、アルコールおよびポリオール（例えば、グリセロール）が含まれる。
【００５７】
所望により、本発明の生ワクチンはアジュバントを含有しうる。アジュバント活性を有する適当な化合物および組成物としては、例えば、後記のものと同様のものが挙げられる。
【００５８】
本発明の生ワクチンの注射（例えば、筋肉内、皮下）による投与は可能であるが、該ワクチンは、好ましくは、ＩＢＤＶのワクチン接種に一般に用いられる安価な大量適用技術により投与する。ＩＢＤＶのワクチン接種のためのこれらの技術には、飲水および噴霧ワクチン接種が含まれる。
【００５９】
該生ワクチンの投与のためのもう１つの方法には、卵内、点眼および嘴の浸漬による投与が含まれる。
【００６０】
本発明のもう１つの態様においては、不活化形態のＩＢＤＶ突然変異体を含むワクチンを提供する。不活化ワクチンの大きな利点は、得られうる長期持続性の防御抗体のレベルが高いことである。
【００６１】
増殖工程後に収穫したウイルスの不活化の目的は、該ウイルスの再生を排除することである。一般に、これは、化学的または物理的手段により達成することができる。化学的不活化は、例えば酵素、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、エチレン−イミンまたはそれらの誘導体で該ウイルスを処理することにより行なうことができる。必要に応じて、後で該不活化化合物を中和する。ホルムアルデヒドで不活化した物質は、例えば、チオスルファートで中和することができる。物理的不活化は、好ましくは、該ウイルスを高エネルギー放射（例えば、ＵＶ光またはγ線）に付すことにより行なうことができる。所望により、処理後、該ｐＨを約７の値に調節することができる。
【００６２】
該不活化ＩＢＤＶ突然変異体を含有するワクチンは、例えば、この目的に適した前記の医薬上許容される担体または希釈剤の１以上を含んでいてもよい。
【００６３】
好ましくは、本発明の不活化ワクチンは、アジュバント活性を有する１以上の化合物を含む。この目的のための適当な化合物または組成物には、水酸化、リン酸または酸化アルミニウム、例えば鉱油（例えばＢａｙｏｌ Ｆ（登録商標）またはＭａｒｃｏｌ ５２（登録商標））または植物油（例えばビタミンＥアセタート）に基づく水中油滴型または油中水滴型エマルション、およびサポニンが含まれる。
【００６４】
本発明のワクチンは、有効成分としての該ＩＢＤＶ突然変異体の有効量（すなわち、ワクチン接種された鳥において、ビルレントウイルスによる攻撃に対して免疫を誘導する免疫性ＩＢＤＶ物質の量）を含む。本発明においては、免疫は、ワクチン接種後の鳥集団において、非ワクチン接種群と比べて有意に高いレベルの防御を誘導することと定義される。
【００６５】
典型的には、本発明の生ワクチンは、１０２〜１０９ ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染量）／動物の用量、好ましくは１０５．０〜１０７．０ ＴＣＩＤ５０の用量で投与することが可能であり、不活化ワクチンは、１０５〜１０９ ＴＣＩＤ５０／動物の抗原相当量を含有していてもよい。
【００６６】
不活化ワクチンは、通常、非経口的（例えば、筋肉内または皮下）に投与する。
【００６７】
本発明のＩＢＤＶワクチンはニワトリにおいて有効に使用することができ、他の家禽（例えば、シチメンチョウ、ホロホロチョウおよびウズラ）にも該ワクチンを成功裡に接種することができる。ニワトリには、ブロイラー、繁殖ストックおよび産卵ストックが含まれる。
【００６８】
本発明の生または不活化ワクチンを投与する動物の齢は、通常の生または不活化ＩＢＤＶワクチンを投与する動物の齢と同じである。例えば、ブロイラー（母親に由来する抗体ＭＤＡを有さないもの）には１日齢でワクチン接種することが可能であり、一方、高レベルのＭＤＡを有するブロイラーには、好ましくは、２〜３週齢でワクチン接種する。低レベルのＭＤＡを有する産卵ストックまたは繁殖ストックには、１〜１０日齢でワクチン接種し、ついで６〜８週齢および１６〜２０週齢で不活化ワクチンをブースター接種することができる。
【００６９】
本発明はまた、前記のＩＢＤＶ突然変異体と、それぞれ家禽または魚類に対して感染性である他の病原体に由来する１以上の免疫原とを含んでなる混合（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）ワクチンを含む。
【００７０】
好ましくは、該混合ワクチンは更に、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、産卵低下症候群（ＥＤＳ）ウイルスおよびシチメンチョウ鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴＶ）のワクチン株の１以上を含む。
【実施例】
【００７１】
実施例１
ＩＢＤＶ突然変異体の構築およびＣＥＦ細胞培養内でのそれらの複製特性
材料および方法
ＩＢＤＶの古典的、変異体ＥまたはＧＬＳ株のＶＰ２の可変領域を含む（属間）ＩＢＤＶプラスミドの構築
（ｉ）古典的ＩＢＤＶ株のＶＰ２
Ｄ７８
以下の部位特異的突然変異誘発のための必要条件は、プラスミドｐＵＣ１８の修飾であった。この目的のために、ｐＵＣ１８をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで切断し、電気溶出し、クレノウ酵素により平滑末端化し、再連結して、ｐＵＣ１８ ΔＮｄｅ Ｉ−ＢａｍＨ Ｉ（ｐＵＣ１８／ΔＮＢ）を得た。プラスミドｐＡＤ７８／ＥＫ（Ｍｕｎｄｔら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１，５６４７−５１，１９９７）をＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで切断して、Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位を含む血清型Ｉ株Ｄ７８のセグメントＡの完全長配列を得た。この断片を、ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで切断されたｐＵＣ１８／ΔＮＢ中に連結して、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢを得た（図１Ａ）。プラスミドｐＤ７８Ａ／ΔＮＢを、クローニングおよび部位特異的突然変異誘発法のためのバックボーンとして使用した。
【００７２】
ＵＫ６６１
プラスミドｐＤ７８−Ｅ／ＤＥＬ（後記を参照されたい）を、株ＵＫ６６１のセグメントＡの配列を含有するキメラプラスミドの構築のために使用した。ウイルスＲＮＡの沈降後、標準的な方法に従い、オリゴヌクレオチドＵＫ６６１ＡＦｏｒ１およびＵＫ６６１ＡＲｅｖ１（ＢｒｏｗｎおよびＳｋｉｎｎｅｒ，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．４０，１−１５，１９９６，それぞれヌクレオチド番号６２１−６４４−センスおよび１２０１−１２２３−アンチセンス）を使用することにより、逆転写およびＰＣＲを行なった。得られたＰＣＲ断片を平滑末端化し、ＳｍａＩで切断されたベクターｐＵＣ １８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）中にクローニングしてｐ６６１Ａｐａｒｔを得た。配列決定後、ｐ６６１Ａｐａｒｔを制限酵素ＮｄｅＩおよびＳｐｅＩでそれぞれヌクレオチド６４７および１１８２で切断して（番号づけは、株Ｐ２：ＮＣＢＩ受託番号Ｘ ８４０３４の完全長配列に基づいている）、株ＵＫ６６１のＶＰ２の可変領域のコード配列を含む５３５ｂｐの断片を得た。ＮｄｅＩ−ＳｐｅＩで切断されたｐＤ７８−Ｅ／ＤＥＬ中への連結後、株Ｄ７８、Ｅ／ＤｅｌおよびＵＫ６６１のセグメントＡの配列を含有するキメラ完全長プラスミドｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１を得た（図４）。
【００７３】
（ｉｉ）変異体Ｅ ＩＢＤＶのＶＰ２
ＩＢＤＶ特異的配列の置換のためには、変異体Ｅ株Ｅ／Ｄｅｌの完全なコード領域を含有するプラスミドを使用した（ｐＥＤＥＬ２２ＢａｃＩＩ，Ｖａｋｈａｒｉａ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ３，１５１−１６８，１９９７）。ｐＥＤＥＬ２２ＢａｃＩＩ（図１Ａ）を制限酵素ＮｄｅＩおよびＳａｌＩでそれぞれヌクレオチド６４７および１７２５（株Ｐ２（ＮＣＢＩ受託番号Ｘ ８４０３４）の完全長配列に基づく）で切断して、ＶＰ２の可変領域のコード配列および株Ｅ／ＤｅｌのＶＰ４の配列を含む１０７８ｂｐの断片を得た。ＮｄｅＩ−ＳａｌＩで切断されたｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ中への連結後、株Ｄ７８およびＥ／ＤｅｌのセグメントＡの配列を含有するキメラ完全長プラスミドｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ（図１）を得た。プラスミドｐＡＤ７８／ΔＮＢおよびｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌを部位特異的突然変異誘発に使用した。
【００７４】
（ｉｉｉ）ＧＬＳ ＩＢＤＶのＶＰ２
さらに、それぞれＧＬＳ−ＢおよびＧＬＳ−ＴＣの可変領域を含有する１対のプラスミドを構築した。超可変領域のクローニングのために、ＧＬＳ−ＴＣをＣＥＦ内で増殖させ、超遠心により精製した。ＧＬＳ−Ｂの嚢ホモジネートを低速遠心により精製し、該上清を以下の操作に使用した。プロテイナーゼＫ（０．５ｍｇ／ｍｌ）／ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ，０．５％）での消化の後、ウイルスＲＮＡを精製し、ｃＤＮＡに逆転写し、標準的な方法に従いオリゴヌクレオチドＡ１４およびＡ４４（表４）を使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。増幅産物を平滑末端化によりクローニングし、適当なＰＣＲ断片を含有するプラスミドを配列決定した。ＧＬＳ−ＴＣ（ｐＧＬＳ−ＴＣ）およびＧＬＳ−Ｂ（ｐＧＬＳ−Ｂ）のいずれかの各インサートを含有するプラスミドを以下の実験に使用した。属間セグメントＡの構築には、完全長クローンｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌを使用した。ｐＧＬＳ−ＴＣおよびｐＧＬＳ−ＢをそれぞれＳａｃＩおよびＳｐｅＩで消化した。ついで、電気溶出された断片を、予めＳａｃＩ−ＳｐｅＩで消化されたｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ中に連結して、それぞれｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＧＬＳ−ＴＣおよびｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＧＬＳ−Ｂを得た。両方のプラスミドのプラスミド地図を図１Ｂに示す。
【００７５】
部位特異的突然変異誘発
ＰＣＲにより部位特異的突然変異誘発を行なった。オリゴヌクレオチドは、アミノ酸の置換をもたらす突然変異および追加的な制限酵素切断部位を含有していた（表４）。それぞれｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤｅｌおよびｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１を使用するＰＣＲ増幅の後、断片を平滑末端化によりクローニングし、配列決定した（ｐｆｒａｇ）。突然変異したコドンを含有するクローンを、以下のとおり予め切断されたプラスミド中に連結した。
【００７６】
（ｉ）変異体Ｅ ＩＢＤＶ
突然変異したコドンを含有するプラスミドｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤｅｌのセグメントＡの完全長クローンの樹立のために、以下のＰＣＲ断片を得た：プライマーＥ／Ｄｅｌ−ＭｕｔＱＨおよびＡ１４（ｐｆｒａｇＱＨ）、Ｅ／Ｄｅｌ−ＭｕｔＡＴおよびＡ１４（ｐｆｒａｇ ＡＴ）、Ｅ／Ｄｅｌ−ＭｕｔＳＲおよびＰ２１Ｆ（ｐｆｒａｇＳＲ）を使用して、Ｅ−Ｄｅｌ配列の適当な単一アミノ酸置換（それぞれＱ２５３Ｈ、Ａ２８４ＴおよびＳ３３０Ｒ）を有する断片を得た。ＰｆｒａｇＱＨおよびｐｆｒａｇＳＲをＳｃａＩおよびＳｐｅＩで切断し、予めＳａｃＩ−ＳｐｅＩで消化されたｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ中に連結して、それぞれｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤｅｌＱＨ（図１）およびｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤｅｌＳＲ（図１Ｃ）を得た。ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤｅｌＡＴ（図１Ｃ）を構築するために、ｐｆｒａｇＡＴをＮａｒＩ−ＳｐｅＩで切断し、ついで、予め切断されたｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ中に連結した。２個の突然変異コドンを含有するプラスミドを得るために、以下のＰＣＲを行なった。プライマーＥ／Ｄｅｌ−ＭｕｔＱＨおよびＥ／Ｄｅｌ−ＭｕｔＳＲ、ならびにＥ／Ｄｅｌ−ＭｕｔＡＴおよびＥ／Ｄｅｌ−ＭｕｔＳＲを、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ上のそれぞれｆｒａｇＱＨ−ＳＲおよびｆｒａｇＡＴ−ＳＲの増幅に使用した。クローニングおよび配列決定の後、ｐｆｒａｇＱＨ−ＳＲをＳｃａＩ−ＳｐｅＩで消化し、ついで、予め切断されたｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ中に連結して、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤｅｌＱＨ−ＳＲ（図１Ｄ）を得た。ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤｅｌＡＴ−ＳＲ（図１Ｄ）の構築のために、プラスミドｐｆｒａｇＡＴ−ＳＲをＮａｒＩおよびＳｐｅＩで消化し、同じように切断されたｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ中に連結した。２個のアミノ酸置換（Ｑ２５３Ｈ； Ａ２８４Ｔ）のための突然変異コドンを含有するプラスミドの構築のために、プラスミドｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤｅｌＡＴおよびプライマーＥ／Ｄｅｌ−ＭｕｔＱＨ； Ａ１４を使用してＰＣＲを行なった。得られたプラスミドｐｆｒａｇＱＨ−ＡＴをＳａｃＩ−ＳｐｅＩで切断し、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ中に連結して、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／ＤｅｌＱＨ−ＡＴ（図１Ｄ）を得た。全３個のアミノ酸置換（Ｑ２５３Ｈ、Ａ２８４ＴおよびＳ３３０Ｒ）のための突然変異コドンを含有するプラスミドのクローニングのために、プライマーＥ／Ｄｅｌ−ＭｕｔＱＨおよびＥ／Ｄｅｌ−ＭｕｔＳＲを、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＡＴ上でのｆｒａｇ ＱＨ−ＡＴ−ＳＲの増幅のために使用した。ｐｆｒａｇ ＱＨ−ＡＴ−ＳＲをＳａｃＩおよびＳｐｅＩで切断した後、溶出した断片を、ＳａｃＩおよびＳｐｅＩで切断されたｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ中に連結して、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＡＴ−ＳＲ（図１Ｅ）を得た。
【００７７】
（ｉｉ）古典的ＩＢＤＶ
Ｄ７８
突然変異コドンを含有するプラスミドｐＤ７８Ａ／ΔＮＢのセグメントＡの完全長クローンの樹立のために、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢのＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、予めＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで切断されたｐＵＣ１９中にサブクローニングして、以下の操作のための単一の制限酵素部位（ｐＵＣ１９／ＮＨ−Ｄ７８Ａ）を得た。オリゴヌクレオチドＤ７８−ＭｕｔＨＱおよびＡ１４（ｐｆｒａｇＨＱ）、Ｄ７８−ＭｕｔＴＡおよびＡ１４（ｐｆｒａｇＴＡ）、Ｄ７８−ＭｕｔＲＳおよびＰ２１Ｆ（ｐｆｒａｇＲＳ）をＰＣＲ増幅に使用して、Ｄ７８配列の適当な単一のアミノ酸置換（それぞれＨ２５３Ｑ、Ｔ２８４ＡおよびＲ３３０Ｓ）を有する断片を得た。断片ｐｆｒａｇＨＱをＳａｃＩおよびＳｔｙＩで切断し、ｐｆｒａｇＴＡをＮａｒＩおよびＳｔｙＩで切断し、ｐｆｒａｇＲＳをＳａｃＩおよびＳｔｙＩで切断し、適当に切断されたｐＵＣ１９／ＮＨ−Ｄ７８Ａ中に再連結した。該突然変異コドンを含有するプラスミドｐＵＣ１９／ＮＨ−Ｄ７８ＡをＮｄｅＩおよびＳａｃＩＩで切断し、適当な断片を電気溶出し、予めＮｄｅＩおよびＳａｃＩＩで切断されたｐＤ７８／ΔＮＢ中に連結して、それぞれｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−ＨＱ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−ＴＡおよびｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−ＲＳを得た。全３個のアミノ酸（Ｈ２５３Ｑ、Ａ２８４Ｔ、Ｒ３３０Ｓ）の置換につながるヌクレオチド置換を含有する完全長クローンの構築のために、オリゴヌクレオチドＤ７８−ＭｕｔＨＱ、Ｄ７８−ＭｕｔＲＳおよびプラスミドｐＤ７８／ΔＮＢ−ＴＡを使用するＰＣＲを行なった。得られたＰＣＲ断片を平滑末端化によりクローニングして、ｐｆｒａｇＨＱ−ＴＡ−ＲＳを得た。ｐｆｒａｇＨＱ−ＴＡ−ＲＳをＳａｃＩおよびＳｔｙＩで切断した後、電気溶出した断片を、ＳａｃＩおよびＳｔｙＩで切断されたｐＵＣ１９／ＮＨ−Ｄ７８Ａ中にクローニングした。得られたプラスミドをＮｄｅＩおよびＳａｃＩＩで切断し、適当な断片を電気溶出し、最後に、予めＮｄｅＩおよびＳａｃＩＩで切断されたｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ中に連結して、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−ＨＱ−ＴＡ−ＲＳを得た。得られた突然変異プラスミドのヌクレオチド配列を配列決定により確認した。配列は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ，バージョン８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）で分析した。プラスミドｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−ＨＱ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−ＴＡ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−ＲＳおよびｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−ＨＱ−ＴＡ−ＲＳを図２に示す。
【００７８】
ＵＫ６６１
部位特異的突然変異誘発のために、プラスミドｐＤ７８Ａ−Ｅ−ＵＫ６６１をＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩで切断し、ついでセグメントＡを含有する断片の完全長配列を、ＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩで切断されたプラスミドベクターｐＢＳ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に連結した。得られたプラスミドｐＢＳＤ７８Ａ−Ｅ−６６１を、既に記載されている方法（Ｋｕｎｋｅｌら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３６７−３８２，１９８７）に従い部位特異的突然変異誘発実験で使用した。Ｌｉｍら（１９９９ 前掲）の結果に基づき、アンチセンス配向オリゴヌクレオチドＭｕｔ １（ＢｒｏｗｎおよびＳｋｉｎｎｅｒ前掲；ヌクレオチド番号９４７−１００１，９４６−９６６はＡＡＣ、および９７９−９８１はＡＣＧであり、アミノ酸置換Ｄ２７９ＮおよびＡ２８４Ｔを引き起こす）を使用してプラスミドｐＢＳＤ７８Ａ−Ｅ−６６１のアミノ酸２７９および２８４のヌクレオチド配列を置換（Ｄ２７９Ｎ，Ａ２８４Ｔ）した。得られたプラスミドｐＢＳＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＤＮ−ＡＴの適当な部分を配列決定した。ｐＢＳＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＤＮ−ＡＴをＮｄｅＩ／ＳｐｅＩで切断した後、５３５ｂｐの断片を、適当に切断されたｐＤ７８Ａ− Ｅ−６６１中に連結して、ｐＤ７８Ａ− Ｅ−６６１−ＤＮ−ＡＴを得た。
【００７９】
さらに、アンチセンス配向オリゴヌクレオチドＭｕｔ ２（ＢｒｏｗｎおよびＳｋｉｎｎｅｒ，前掲；ヌクレオチド番号８７４−９００、８８６−８８８は、アミノ酸置換Ｏ２５３Ｈを与えるＣＡＴである）を使用して、アミノ酸Ｑ２５３のヌクレオチド配列を、Ｈ２５３をコードするヌクレオチド配列に置換した。得られたプラスミドｐＤ７８Ａ− Ｅ−６６１−ＱＨは、アミノ酸置換Ｑ２５３Ｈを含有していた。アンチセンス配向オリゴヌクレオチドＭｕｔ ３（Ｂｒｏｗｎら，前掲；ヌクレオチド番号９６６−９９３、９７９−９８１は、アミノ酸置換Ａ２８４Ｔを与えるＡＣＣである）を使用することにより、アミノ酸２８４の置換（Ａ２８４Ｔ）を行なって、プラスミドｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＡＴを得た。第４のプラスミドであるｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＱＨ−ＡＴは、１つの部位特異的突然変異誘発反応において両方のオリゴヌクレオチド（Ｍｕｔ２，Ｍｕｔ３）を使用することによる両アミノ酸（Ｑ２５３ＨおよびＡ２８４Ｔ）の置換を含有していた。プラスミドｐ６６１Ａｐａｒｔ、ｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１、ｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＤＮ−ＡＴ、ｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＱＨ、ｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＡＴおよびｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＱＨ−ＡＴを図４に示す。
【００８０】
【表５】
ａ 部位特異的突然変異誘発およびクローニングに使用するオリゴヌクレオチドプライマーの組成および位置。用いる制限部位には下線が付されており、適当な制限酵素が表示されている。突然変異誘発で変更されたヌクレオチドは小文字で示されており、コードヌクレオチドトリプレットは太字で示されている。該位置は、プライマー結合（ヌクレオチド番号）であり、アミノ酸の番号づけは、Ｐ２株の公開されている配列（ＭｕｎｄｔおよびＭｕｌｌｅｒ，１９９５，前掲；ＮＣＢＩ受託番号 Ｘ８４０３４）に基づいている。
【００８１】
セグメントＢの完全長ｃＤＮＡクローンの構築
株Ｄ７８
血清型Ｉ株Ｄ７８のセグメントＢの完全長ｃＤＮＡのクローニングのために、ウイルスをＣＥＦ内で増殖させ、超遠心により精製した。株Ｄ７８のゲノムウイルスＲＮＡを精製し、ｃＤＮＡに逆転写し、標準的な方法に従い、記載されているオリゴヌクレオチド（ＭｕｎｄｔおよびＶａｋｈａｒｉａ，１９９６）を使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。増幅産物を平滑末端化によりクローニングし、適当なＰＣＲ断片を含有するプラスミドを配列決定した。Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下でセグメントＢの完全長ｃＤＮＡを含有するプラスミド（ｐＵＣ１８ＢＤ７８）を得るためのクローニング法は、株Ｐ２のセグメントＢに関してＭｕｎｄｔおよびＶａｋｈａｒｉａ（１９９６ 前掲）により記載されている方法に対応するものであった（図３）。
【００８２】
株ＵＫ６６１
ＢｒｏｗｎおよびＳｋｉｎｎｅｒ（１９９６，前掲）に記載の配列情報から導き出した以下の３対のオリゴヌクレオチドを使用した。ｉ）ＵＫ６６１ＢＦｏｒ１（オリゴヌクレオチド配列Ｂ５’−Ｐ２（ＭｕｎｄｔおよびＶａｋｈａｒｉａ，１９９６ 前掲）に基づく配列）、アンチセンス配向のＵＫ６６１ＢＲｅｖ１（ヌクレオチド番号７０８−７３６）。オリゴヌクレオチドＵＫ６６１ＢＲｅｖ１の５’末端は、株ＵＫ−６６１のセグメントＢの配列に加え、９ヌクレオチド配列５’−ＣＴＣＴＡＧＡＧＧを含有する制限酵素切断部位ＸｂａＩを含有する。ｉｉ）ＵＫ６６１ＢＦｏｒ２（ヌクレオチド番号７５１−６７７）、アンチセンス配向のＵＫ６６１Ｒｅｖ２（ヌクレオチド番号２０８９−２１１３）。オリゴヌクレオチドＵＫ６６１ＢＲｅｖ２の５’末端は、株ＵＫ−６６１のセグメントＢの配列に加え、９ヌクレオチド配列５’−ＣＴＣＴＡＧＡＧＧを含有する制限酵素切断部位ＸｂａＩを含有する。ｉｉｉ）ＵＫ６６１ＢＦｏｒ３（ヌクレオチド番号２０１１−２０３５）、アンチセンス配向のＵＫ６６１Ｒｅｖ３（ＭｕｎｄｔおよびＭｕｌｌｅｒ，１９９５，前掲，ヌクレオチド番号２８０４−２８２７）。オリゴヌクレオチドＵＫ６６１ＢＲｅｖ３の５’末端は、株ＵＫ−６６１のセグメントＢの配列に加え、９ヌクレオチド配列５’−ＴＣＴＡＧＡＧＣＣＣを含有する制限酵素切断部位ＸｂａＩを含有する。この場合、トリプレットＣＣＣは、セグメントＢのウイルスゲノム配列の最後の３ヌクレオチド（ヌクレオチド番号２８２５−２８２７）と共にＳｍａＩ切断部位を生成した。ＲＴ−ＰＣＲ中にこれらの３対のオリゴヌクレオチドＵＫ６６１ＢＦｏｒ１；ＵＫ６６１ＢＲｅｖ１、ＵＫ６６１ＢＦｏｒ２；ＵＫ６６１ＢＲｅｖ２およびＵＫ６６１ＢＦｏｒ３；ＵＫ６６１ＢＲｅｖ３を使用することにより、３個のｃＤＮＡ断片を増幅し、ＳｍａＩで切断されたベクターｐＵＣ１８中に平滑末端化によりクローニングして、それぞれｐＵＫ６６１Ｂ１、ｐＵＫ６６１Ｂ２およびｐＵＫ６６１Ｂ３を得た。それらの３個の挿入断片の配列決定後、ｐＵＫ６６１Ｂ２をＡｇｅＩおよびＸｂａＩで切断して、１４４１ｂｐの断片を得、ついでそれを、ＡｇｅＩ／ＸｂａＩで切断されたｐＵＫ６６１Ｂ１中に連結して、ｐＵＫ６６１Ｂ１２を得た。セグメントＢの完全長ｃＤＮＡクローンの構築のために、ｐＵＫ６６１Ｂ３をＢｓｔＢＩ／ＸｂａＩで切断し、得られた６９４ｂｐの断片を、ＢｓｔＢＩ／ＸｂａＩで切断されたｐＵＫ６６１Ｂ１２中に連結した。得られたプラスミドｐＢ６６１は、Ｔ７プロモーターの制御下で株ＵＫ６６１のセグメントＢの完全長ｃＤＮＡ配列を含有していた。ｐＢ６６１を図５に示す（番号づけは、ＭｕｎｄｔおよびＭｕｌｌｅｒ，１９９５，前掲に記載のＰ２株の配列に基づく）。
【００８３】
組織培養内のｃＲＮＡからのウイルスの回収
ＲＮＡのインビトロ転写のために、プラスミドｐＡＤ７８／ΔＮＢ、ｐＡＤ７８／ΔＮＢ−ＨＱ、ｐＡＤ７８／ΔＮＢ−ＴＡ、ｐＡＤ７８／ΔＮＢ−ＲＳ、ｐＡＤ７８／ΔＮＢ−ＨＱ−ＴＡ−ＲＳ、ｐＤ７８／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＱＨ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＡＴ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＳＲ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＱＨ−ＡＴ、ｐＡＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＡＴ−ＳＲ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＱＨ−ＳＲ、ｐＡＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＱＨ−ＡＴ−ＳＲおよびｐＤ７８Ｂを、ＢｓｒＧＩまたはＰｓｔＩで切断することにより線状化した。線状化ＤＮＡの更なる処理および転写は、ｉ）該転写混合物をフェノール／クロロホルム精製に付さなかったこと及びｉｉ）ＱＭ−７細胞をトランスフェクション実験に使用したことの２点を除き、ＭｕｎｄｔおよびＶａｋｈａｒｉａ （１９９６）に記載のとおりに行なった。トランスフェクションの２日後、細胞を凍結／融解し、７００ ｘ ｇで遠心分離して細胞残渣を除去し、得られた上清を０．４５μｍフィルターで更に清澄化し、−７０℃で保存した。免疫蛍光研究のために、ＱＭ−７細胞を無菌カバーグラス上で増殖させた。ＲＮＡのインビトロ転写のために、ＵＫ６６１のセグメントＡを含有するプラスミド（図５）を、ＢｓｒＧＩで切断することにより線状化した。株Ｄ７８のセグメントＢはＰｓｔＩで線状化し、一方、株ＵＫ６６１のセグメントＢはＳｍａＩで線状化した。線状化ＤＮＡの更なる処理および転写を前記のとおりに行なった。
【００８４】
ＩＢＤＶ抗原の検出
ＩＢＤＶ抗原を、ウサギ抗ＩＢＤＶ抗血清を使用する間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）およびウエスタンブロット法により検出した。ＩＦＡの場合には、カバーグラス上で増殖させたＣＥＦを、継代のために使用したそれぞれトランスフェクト化ＱＭ−７、ＣＥＦおよびＣＡＭの上清と共にインキュベートした。１６時間のインキュベーション時間の後、ＣＥＦをアセトンで固定し、ＩＦＡのために加工した。トランスフェクション後のＩＢＤＶの複製を調べるために、カバーガラス上で増殖させたＱＭ−７細胞を２４時間または４８時間インキュベートし、アセトンで固定し、ＩＦＡのために加工した。
【００８５】
結果
属間ｃＲＮＡでのトランスフェクション実験
トランスフェクション実験のために、株Ｄ７８のセグメントＡの完全長ｃＤＮＡクローン（ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ）および属間セグメントＡ ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌを合成ｃＲＮＡへ転写させ、セグメントＢ（ｐＤ７８Ｂ）の完全長ｃＲＮＡと共にＱＭ−７細胞内およびＣＥＦ内に同時にコトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞を凍結／融解し、得られた上清をＣＥＦ上で２回継代した。ＣＥＦを、各継代において感染後５日間までインキュベートした。凍結／融解後、各トランスフェクションの各トランスフェクション上清および各継代を、ＣＥＦを使用するＩＦＡにより、ＩＢＤＶ抗原に関して試験した。トランスフェクション実験を３回繰返した。株Ｄ７８ｒの生成をもたらすｐＡＤ７８／ΔＮＢおよびプラスミドｐＤ７８ＢからのｃＲＮＡのトランスフェクション後、ウイルスを得た。これに対して、ｐＤ７８／ΔＮＢ−Ｅ／ＤｅｌおよびｐＤ７８ＢからのｃＲＮＡを使用するトランスフェクション実験の後では、ウイルスに感染した組織培養を全く単離することができなかった。トランスフェクションの後に複製が生じたか否かを分析するために、カバーガラス上で増殖中のＱＭ−７細胞を使用してトランスフェクションを行なった。ここではどちらの場合においても、トランスフェクションの２４時間後にＩＦＡでウイルス抗原が検出された。このように、本発明者らは、どちらの場合にもウイルスの複製が生じるが、Ｄ７８ｒの場合のみにおいて、組織培養に感染したＩＢＤＶを得るのが可能であることを確認した。
【００８６】
突然変異ｃＲＮＡでのトランスフェクション実験
配列の比較の結果に基づいて、多数の異なる突然変異完全長ｃＤＮＡクローンを部位特異的突然変異誘発により樹立した。
【００８７】
（ｉ）変異体Ｅ ＩＢＤＶ
可能なすべての７つの組合せにおいて２５３、２８４および３３０位にアミノ酸（ａａ）の置換を含有するｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌの突然変異プラスミドを作製した（表５）。トランスフェクション実験および継代を、ＣＥＦおよびＱＭ−７細胞上で同時に３回行なった。得られた上清を、ＩＦＡにより感染性に関して分析した。プラスミドｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＱＨ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＡＴ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＳＲ、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＡＴ−ＳＲおよびｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＱＨ−ＳＲのｃＲＮＡをｐＤ７８ＢのｃＲＮＡと共にトランスフェクトした後は、ＱＭ−７細胞またはＣＥＦ感染ウイルスを単離することができなかった。ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＱＨ−ＡＴまたはｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＱＨ−ＡＴ−ＳＲから得たｃＲＮＡのトランスフェクションは、感染性ウイルス（Ｄ７８Ａ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＱＨ−ＡＴおよびＤ７８Ａ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＱＨ−ＡＴ−ＳＲ）の生成を引き起こした。ＣＥＦおよびＱＭ−７細胞上でのＩＦＡにより特異性が確認された。これは、ＩＢＤＶのＶＰ２が、組織培養への感染において決定的に重要な役割を果たしていることを示している。アミノ酸置換（ＢＵ）Ｑ−２５３−Ｈ（ＴＣ）および（ＢＵ）Ａ−２８４−Ｔ（ＴＣ）は、使用した組織培養に対して感染性のＩＢＤＶを得るために必要かつ十分であった。３個のアミノ酸置換を有するＩＢＤＶ突然変異体（Ｄ７８／変異体Ｅ ＣＥＦ適応）を、さらなる検査に使用した（実施例２）。
【００８８】
（ｉｉ）古典的ＩＢＤＶ
Ｄ７８
これらの結果を確認するために、部位特異的突然変異誘発のためにｐＡＤ７８／ΔＮＢを使用してもう１組のプラスミドを構築して、単一のアミノ酸（ｐＡＤ７８／ΔＮＢ−ＨＱ、ｐＡＤ７８／ΔＮＢ−ＴＡ、ｐＡＤ７８／ΔＮＢ−ＲＳ）または全３個のアミノ酸（ｐＡＤ７８／ΔＮＢ−ＨＱ−ＴＡ−ＲＳ）の置換プラスミドを得た。これらの４個のプラスミドをｐＤ７８Ｂと共に、前記のとおりにトランスフェクション実験に使用した。ｐＡＤ７８／ΔＮＢ−ＲＳからのｃＲＮＡのトランスフェクションの後、感染性ＩＢＤＶの生成をＩＦＡにより検出することができた。この場合もまた、アミノ酸３３０は、組織培養への生成ウイルスの感染能に何ら影響を及ぼさなかった。
【００８９】
トランスフェクション後、ＩＦＡにより全ての構築物を複製に関して試験した。トランスフェクションの特に２４時間および４８時間後にＩＢＤＶ抗原を検出することができた。これは、濃く染色された典型的な細胞質内集合体を示している。
【００９０】
ＵＫ６６１
トランスフェクション実験のために、キメラセグメントＡ ｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１、ｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＤＮ−ＡＴ、ｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＱＨ、ｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＡＴおよびｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＱＨ−ＡＴの完全長ｃＤＮＡクローンを合成ｃＲＮＡに転写し、株Ｄ７８のセグメントＢまたは株ＵＫ６６１のセグメントＢの完全長ｃＲＮＡと共にＱＭ−７細胞内およびＣＥＣ内に同時にコトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞を凍結／融解し、得られた上清をＣＥＣ上で１回継代した。ＣＥＣを、感染後２４または４８時間インキュベートし、固定し、免疫蛍光法のために加工した。キメラＩＢＤＶ Ｄ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＱＨ−ＡＴを与えるｐＤ７８ＢおよびｐＢ６６１の両方とプラスミドｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＱＨ−ＡＴとからのｃＲＮＡのトランスフェクションの後、ＣＥＣに対して感染性のウイルスを得た。これに対して、ｐＢＤ７８またはｐＢ６６１のいずれかからのｃＲＮＡと共にｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１、ｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＤＮ−ＡＴ、ｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＱＨ、ｐＤ７８Ａ−Ｅ−６６１−ＡＴからのｃＲＮＡを使用するトランスフェクションの後では、組織培養に感染したウイルスは単離することができなかった。Ｄ７８−Ｅ−６６１−ＤＮ−ＡＴの場合には、感染の７２時間後、該トランスフェクション上清のインキュベーションに際して単一の感染ＣＥＦが検出可能である。
【００９１】
（ｉｉｉ）ＧＬＳ ＩＢＤＶ
属間および突然変異プラスミドを使用するトランスフェクション実験の結果を確認するために、本発明者らは、天然に存在する１対のＩＢＤＶ株を利用した。嚢由来のＧＬＳ株（ＧＬＳ−Ｂ）のＶＰ２の可変領域および組織培養適応変異体ＧＬＳ−ＴＣを増幅し、クローニングし、分析した。それぞれｐＧＬＳ−ＢおよびｐＧＬＳ−ＴＣから得た２つのＧＬＳ株のアミノ酸配列の比較は、２８４位における１つのアミノ酸の両配列間での置換 ［（ＧＬＳ−Ｂ）Ａ→Ｔ（ＧＬＳ−ＴＣ）］を示した（図１Ｂ）。アミノ酸２５３（Ｑ）および３３０（Ｓ）は、前記のとおりＢＵ群のアミノ酸と同一であった。感染性ウイルスの生成のためには２８４位における置換（Ａ→Ｔ）で十分であるか否かを分析するために、それらの両方のＧＬＳ変異体のＶＰ２の超可変領域を含有する２つのプラスミド（ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＧＬＳ−ＴＣおよびｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＧＬＳ−Ｂ）を構築した。それぞれｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＧＬＳ−ＴＣおよびｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＧＬＳ−ＢのｃＲＮＡを、ｐＤ７８ＢのｃＲＮＡと共にＱＭ−７細胞内およびＣＥＦ内に同時にトランスフェクトした。組織培養内の上清の継代後、ＩＦＡによる感染性ウイルスの検出が、また、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＧＬＳ−ＴＣのｃＲＮＡのトランスフェクション後、ＣＰＥの検出が可能であった。何回かの試みにおいて、ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＧＬＳ−ＢからのｃＲＮＡのトランスフェクションは、組織培養に感染性のＩＢＤＶを含有する上清を産生しなかった。ｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＧＬＳ−ＴＣおよびｐＤ７８Ａ／ΔＮＢ−Ｅ／Ｄｅｌ−ＧＬＳＢの両プラスミドのインビトロ転写／翻訳は、該ポリタンパク質の完全なプロセシングを示した。両プラスミドのｃＲＮＡをｐＤ７８ＢからのｃＲＮＡと共にトランスフェクションした後、ウイルス抗原がＩＦＡにより検出された。したがって、両方のキメラ体は複製適合性であることが判明した。この場合を総合すると、２８４位における単一のアミノ酸置換につながるＶＰ２の超可変領域の置換は、感染性属間ＩＢＤＶの生成に十分なものであった。
【００９２】
【表６】
ａ プラスミドは、組織培養適応血清型Ｉ株Ｄ７８のセグメントＡの完全長ｃＤＮＡクローンに基づく。嚢由来血清型Ｉ株ＧＬＳ−ＢＵ、Ｄｅｌａｗａｒｅ Ｅ（Ｅ／Ｄｅｌ）および組織培養適応血清型Ｉ株ＧＬＳ−ＴＣの配列をＤ７８配列で置換した。
ｂ Ｐ２株の公開されている配列（ＭｕｎｄｔおよびＭｕｌｌｅｒ，１９９５，前掲；ＮＣＢＩ受託番号Ｘ８４０３４）に基づくアミノ酸（ａａ）の番号づけ。天然に存在するアミノ酸はイタリックで表示されており、変化したアミノ酸は太字で表示されている。
ｃ トランスフェクション実験にはニワトリ胚細胞（ＣＥＦ）およびＱＭ−７細胞を使用した。トランスフェクションの２４時間後、ウサギ抗ＩＢＤＶ血清（Ｍｕｎｄｔら，１９９５）を使用する間接免疫蛍光法によりＩＢＤＶ抗原が検出された。抗原陽性（＋）、抗原陰性（−）。
ｄ トランスフェクション上清の継代にはＣＥＦを使用した。ＣＥＦ上への継代後、ウサギ抗ＩＢＤＶ血清（Ｍｕｎｄｔら，１９９５，前掲）を使用する間接免疫蛍光法によりＩＢＤＶ抗原が検出された。抗原陽性（＋）、抗原陰性（−）。
【００９３】
実施例２
ＣＥＦ適応変異体Ｅ ＩＢＤＶ突然変異体の生物学的特性
材料および方法
ＩＢＤＶワクチンの製造
キメラＤ７８／変異体Ｅ（嚢適応）
９〜１２日齢のＳＰＦ卵に、滴下（ｄｒｏｐｐｅｄ）漿尿膜（ＣＡＭ）経路によりキメラＤ７８／変異体ＥＤ（Ｑ２５３Ｈ、Ａ２８４ＴおよびＳ３３０Ｒにおける３つのアミノ酸置換を有さないＤ７８／変異体Ｅ／Ｄ７８）を感染させた。感染の５日後、該ＣＡＭおよび胚を集め、ホモジナイズした。該ホモジネートをＣＡＭ上で力価測定した。該上清を希釈して、点眼経路による適用のための１０２．０ＥＩＤ５０／動物のワクチン用量を得た。
【００９４】
キメラＤ７８／変異体Ｅ（ＣＥＦ適応体）
初代ニワトリ胚繊維芽（ＣＥＦ）細胞を２×１０６／ｍｌの最終濃度で調製した。該細胞を、５％ウシ胎仔血清を含有するイーグルの最小必須培地内で培養した。この細胞懸濁液１５ｍｌに、１ｍｌ中に溶解されたＩＢＤＶ（Ｑ２５３Ｈ、Ａ２８４ＴおよびＳ３３０Ｒにおける３つのアミノ酸置換を有するＤ７８／変異体Ｅ／Ｄ７８）ウイルス０．１ｍｌを加えた。高加湿インキュベーター内で３７℃で３〜６日間のインキュベーションの後、該上清を希釈して、点眼または筋肉内注射による適用のためのそれぞれ１０５．３または１０３．５ＴＣＩＤ５０／動物のワクチン用量を得た。
【００９５】
商業的に入手可能な古典的ＩＢＤＶワクチンＮｏｂｉｌｉｓ株Ｄ７８
該ワクチンを希釈して、点眼経路による適用のための１０３．３ＴＣＩＤ５０／動物のワクチン用量を得た。
【００９６】
パネル試験によるＩＢＤＶワクチンの同定
両ＩＢＤＶ株を、（Ｖａｎ Ｌｏｏｎ，Ａ．Ａ．Ｗ．Ｍ．，Ｄ．ＬｕｔｔｉｃｋｅｎおよびＤ．Ｂ．Ｓｎｙｄｅｒ．Ｒａｐｉｄ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ （ＩＢＤ） ｃｈａｌｌｅｎｇｅ，ｆｉｅｌｄ ｏｒ ｖａｃｃｉｎｅ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒａｉｎｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｃｈｉｃｋｅｎ ｉｎｆｅｔｉｏｕｓ ａｎｅｍｉａ，Ｒａｕｉｓｃｈｈｉｌｚｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１７９−１８７，１９９４）に従い、異なるモノクローナル抗体を使用するＥＬＩＳＡにより同定した。
【００９７】
ＣＥＦ上での増殖
両ＩＢＤＶ株を使用してＣＥＦに感染させた。ＩＢＤＶに関する特異的ＣＰＥ（細胞変性効果）の誘導を、６日間顕微鏡検査した。
【００９８】
ワクチン接種
ワクチン接種の１４日後、攻撃ウイルス（ビルレントＩＢＤＶ株変異体Ｅ）の投与から得られる攻撃に対する抵抗性の測定により、種々のワクチンの効果を評価する。キメラワクチンＤ７８／変異体Ｅ（嚢適応体）（１０２．０ＥＩＤ５０／動物）を、２週齢の時点で点眼経路で適用した。キメラワクチンＤ７８／変異体Ｅ（ＣＥＦ適応体）（１０５．５または１０３．５ＴＣＩＤ５０／動物）を、２週齢の時点でそれぞれ点眼経路または筋肉内注射により適用した。商業的に入手可能な古典的ワクチンＮｏｂｉｌｉｓ株Ｄ７８（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂ．Ｖ．，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）（１０３．３ＴＣＩＤ５０／動物）を、２週齢の時点で点眼経路により適用した。ワクチン接種の３、７、１０および１３日後ならびに攻撃の３日後、５匹／群におけるファブリキウス嚢内のＩＢＤＶおよび該嚢内の顕微鏡的病変の存在を調べた。攻撃に対する防御が確認された。
【００９９】
結果
パネル試験によるＩＢＤＶワクチンの同定
表６に示されるとおり、キメラＤ７８／変異体Ｅ（嚢適応体）およびキメラＤ７８／変異体Ｅ（ＣＥＦ適応体）は、異なるＭＣＡに対して同一の反応パターンを有する。このことは、３アミノ酸の変化が、種々のＭＣＡによる測定において、該ウイルス上に存在するエピトープに何ら影響を及ぼさないことを意味する。古典的な市販ワクチンは、異なるＭＣＡに対して異なる反応パターンを有する。
【０１００】
【表７】
【０１０１】
ＣＥＦ上での増殖
表７に示されるとおり、キメラＤ７８／変異体Ｅ（嚢）はＣＥＦ上で増殖する能力を有していない。キメラＤ７８／変異体Ｅおよび古典的な市販ワクチンＮｏｂｉｌｉｓ株Ｄ７８は共にＣＥＦ上で複製する能力を有し、ＣＰＥを誘導しうる。
【０１０２】
【表８】
【０１０３】
ワクチン接種の３、７、１０および１３日後ならびに攻撃の３および１０日後の嚢における平均顕微鏡的病変指数
結果を表８に示す。表８に示されるとおり、非ＣＥＦ適応株キメラＤ７８／変異体Ｅ（嚢）はビルレントであり、ワクチン接種の７日後には既に完全なリンパ球喪失を誘発する。これに対して、組織培養適応株Ｄ７８／変異体Ｅ（ＣＥＦ）はワクチン接種後に病変を誘発しない。該市販ワクチンは軽度ないしは中等度の病変を誘発する。個々のデータは、キメラＤ７８／変異体Ｅ（嚢）またはＤ７８でワクチン接種された動物が攻撃に対して防御されたことを示している。眼または筋肉内経路によりＤ７８／変異体Ｅでワクチン接種された動物も、ビルレントな親株による誘導より弱かったものの攻撃の３日後に防御を示した。
【０１０４】
【表９】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＣＥＦ細胞培養内で複製する能力を有さないＩＢＤＶのゲノムセグメントＡおよびＢのｃＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を別々に調製し、
（ｉｉ）該セグメントＡを含むｃＤＮＡ上の、
（ａ）変異体Ｅまたは古典的ＩＢＤＶ株のＶＰ２遺伝子のアミノ酸残基２５３および２８４の１以上のコドン内または
（ｂ）ＧＬＳ ＩＢＤＶ株のＶＰ２遺伝子のアミノ酸残基２８４のコドン内に突然変異を導入して、変異体Ｅまたは古典的ＩＢＤＶ株の場合には、該突然変異ＶＰ２遺伝子のアミノ酸残基２５３および２８４のコドンがそれぞれヒスチジンおよびトレオニン残基をコードするようにし、あるいはＧＬＳ ＩＢＤＶ株の場合には、該突然変異ＶＰ２遺伝子のアミノ酸残基２８４のコドンがトレオニン残基をコードするようにし、
（ｉｉｉ）該セグメントＡと該セグメントＢとを含むｃＤＮＡのＲＮＡ転写産物に、培地内の宿主細胞内で該ＩＢＤＶ突然変異体の複製を開始させ、
（ｉｖ）該培養から該ＩＢＤＶ突然変異体を単離する工程を含んでなる、ＣＥＦ細胞培養内で複製する能力を有する感染性ＩＢＤＶ突然変異体の製造方法。
【請求項２】
ＣＥＦ細胞培養に適応したＩＢＤＶ突然変異体が、セリン、アルギニンまたはリシン、好ましくはアルギニンアミノ酸残基を該ＶＰ２タンパク質の３３０位に含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
古典的または変異体Ｅ ＩＢＤＶのＶＰ２遺伝子のコドン２５３、２８４および３３０のすべてに突然変異を導入する、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
コドン２５３（Ｇｌｎ）、２８４（Ａｌａ）および３３０（Ｓｅｒ）内に該突然変異を導入する、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
該突然変異セグメントＡと該セグメントＢとを含むｃＤＮＡから合成ＲＮＡ転写産物を調製し、該合成ＲＮＡ転写産物を宿主細胞にトランスフェクトする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
キメラＩＢＤＶを調製する追加的な工程を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
古典的または変異体Ｅ ＩＢＤＶのＶＰ２遺伝子内にアミノ酸２５３（Ｈｉｓ）および２８４（Ｔｈｒ）、そして所望により３３０（Ａｒｇ）のコドンを、あるいはＧＬＳ ＩＢＤＶのＶＰ２遺伝子内にアミノ酸２８４（Ｔｈｒ）のコドンを含んでなる、ＣＥＦ細胞培養内で複製する能力を有する遺伝的に操作された感染性ＩＢＤＶ突然変異体。
【請求項８】
キメラＩＢＤＶ突然変異体である、請求項７に記載の遺伝的に操作された感染性ＩＢＤＶ突然変異体。
【請求項９】
該突然変異体がＤ７８／変異体Ｅ（ＣＥＦ適応体）である、請求項７に記載の遺伝的に操作された感染性ＩＢＤＶ突然変異体。
【請求項１０】
前記請求項のいずれか１項に記載のとおりに製造された遺伝的に操作されたＩＢＤＶ突然変異体と、医薬上許容される担体または希釈剤とを含んでなる、ＩＢＤＶ感染により生じる疾患に対して家禽を防御するのに使用するためのワクチン。
【請求項１】
（ｉ）ＣＥＦ細胞培養内で複製する能力を有さないＩＢＤＶのゲノムセグメントＡおよびＢのｃＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を別々に調製し、
（ｉｉ）該セグメントＡを含むｃＤＮＡ上の、
（ａ）変異体Ｅまたは古典的ＩＢＤＶ株のＶＰ２遺伝子のアミノ酸残基２５３および２８４の１以上のコドン内または
（ｂ）ＧＬＳ ＩＢＤＶ株のＶＰ２遺伝子のアミノ酸残基２８４のコドン内に突然変異を導入して、変異体Ｅまたは古典的ＩＢＤＶ株の場合には、該突然変異ＶＰ２遺伝子のアミノ酸残基２５３および２８４のコドンがそれぞれヒスチジンおよびトレオニン残基をコードするようにし、あるいはＧＬＳ ＩＢＤＶ株の場合には、該突然変異ＶＰ２遺伝子のアミノ酸残基２８４のコドンがトレオニン残基をコードするようにし、
（ｉｉｉ）該セグメントＡと該セグメントＢとを含むｃＤＮＡのＲＮＡ転写産物に、培地内の宿主細胞内で該ＩＢＤＶ突然変異体の複製を開始させ、
（ｉｖ）該培養から該ＩＢＤＶ突然変異体を単離する工程を含んでなる、ＣＥＦ細胞培養内で複製する能力を有する感染性ＩＢＤＶ突然変異体の製造方法。
【請求項２】
ＣＥＦ細胞培養に適応したＩＢＤＶ突然変異体が、セリン、アルギニンまたはリシン、好ましくはアルギニンアミノ酸残基を該ＶＰ２タンパク質の３３０位に含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
古典的または変異体Ｅ ＩＢＤＶのＶＰ２遺伝子のコドン２５３、２８４および３３０のすべてに突然変異を導入する、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
コドン２５３（Ｇｌｎ）、２８４（Ａｌａ）および３３０（Ｓｅｒ）内に該突然変異を導入する、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
該突然変異セグメントＡと該セグメントＢとを含むｃＤＮＡから合成ＲＮＡ転写産物を調製し、該合成ＲＮＡ転写産物を宿主細胞にトランスフェクトする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
キメラＩＢＤＶを調製する追加的な工程を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
古典的または変異体Ｅ ＩＢＤＶのＶＰ２遺伝子内にアミノ酸２５３（Ｈｉｓ）および２８４（Ｔｈｒ）、そして所望により３３０（Ａｒｇ）のコドンを、あるいはＧＬＳ ＩＢＤＶのＶＰ２遺伝子内にアミノ酸２８４（Ｔｈｒ）のコドンを含んでなる、ＣＥＦ細胞培養内で複製する能力を有する遺伝的に操作された感染性ＩＢＤＶ突然変異体。
【請求項８】
キメラＩＢＤＶ突然変異体である、請求項７に記載の遺伝的に操作された感染性ＩＢＤＶ突然変異体。
【請求項９】
該突然変異体がＤ７８／変異体Ｅ（ＣＥＦ適応体）である、請求項７に記載の遺伝的に操作された感染性ＩＢＤＶ突然変異体。
【請求項１０】
前記請求項のいずれか１項に記載のとおりに製造された遺伝的に操作されたＩＢＤＶ突然変異体と、医薬上許容される担体または希釈剤とを含んでなる、ＩＢＤＶ感染により生じる疾患に対して家禽を防御するのに使用するためのワクチン。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１１−３６２５５（Ｐ２０１１−３６２５５Ａ）
【公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１０−２０１２９８（Ｐ２０１０−２０１２９８）
【出願日】平成２２年９月８日（２０１０．９．８）
【分割の表示】特願２０００−５７１４６（Ｐ２０００−５７１４６）の分割
【原出願日】平成１２年３月２日（２０００．３．２）
【出願人】（５０６１９６２４７）インターベツト・インターナシヨナル・ベー・ベー (85)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２０１２９８（Ｐ２０１０−２０１２９８）
【出願日】平成２２年９月８日（２０１０．９．８）
【分割の表示】特願２０００−５７１４６（Ｐ２０００−５７１４６）の分割
【原出願日】平成１２年３月２日（２０００．３．２）
【出願人】（５０６１９６２４７）インターベツト・インターナシヨナル・ベー・ベー (85)
【Ｆターム（参考）】
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