部位特異的遺伝子組換法
【課題】ＴＧ１インテグラーゼを利用した部位特異的遺伝子組換法および該部位特異的遺伝子組換法による微生物ゲノム改変法の提供の提供。
【解決手段】ＴＧ１ファージの特異的部位（ａｔｔＰTG1）に対応する宿主菌Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの特異的部位（ａｔｔＢTG1）と相同性が高い塩基配列をゲノム上に有する放線菌およびプロテオバクテリアを用い、ＴＧ１インテグラーゼを利用した部位特異的遺伝子組換法および該部位特異的遺伝子組換法による微生物ゲノム改変法を提供する。
【解決手段】ＴＧ１ファージの特異的部位（ａｔｔＰTG1）に対応する宿主菌Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓの特異的部位（ａｔｔＢTG1）と相同性が高い塩基配列をゲノム上に有する放線菌およびプロテオバクテリアを用い、ＴＧ１インテグラーゼを利用した部位特異的遺伝子組換法および該部位特異的遺伝子組換法による微生物ゲノム改変法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバクテリオファージＴＧ１（以下、ＴＧ１ファージとする）が産生するファージインテグラーゼ（以下、ＴＧ１インテグラーゼとする）を利用した部位特異的遺伝子組換法に関する。さらに、該部位特異的遺伝子組変法による微生物ゲノム改変法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バクテリオファージは細菌を宿主とするウイルスの総称であり、細菌ウイルスとも呼ばれる。バクテリオファージは、ウイルス粒子の形態やサイズ、感染増殖様式、遺伝情報物質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの存在様式）、感染し得る細菌の範囲（宿主域）等に関して多種多様な種類が存在する。感染増殖様式について見ると、宿主菌に感染すると直ちに複製増殖を開始し、溶菌を行って子ファージを放出する（溶菌サイクル）タイプのファージと感染後溶菌サイクルに入るか、あるいは直ちに溶菌サイクルに入らずに宿主菌中に維持される（溶原化サイクル）かのいずれかの道を辿るタイプとに大きく分けることができる。後者のタイプのファージ（溶原性ファージ）の多くは、溶原化に伴い自身のゲノムを宿主菌ゲノム中に挿入して、潜在化（プロファージ化）する。
溶原化における宿主菌ゲノム中へのファージゲノムの挿入は、ファージゲノム上の特異的部位（ファージ・アタッチメント部位：ａｔｔＰ）と宿主菌ゲノム上の特異的部位（バクテリア・アタッチメント部位：ａｔｔＢ）との間の部位特異的組換え反応によって起こり、２つのゲノムは一つのゲノムへと一体化する。
【０００３】
このような部位特異的組換え反応は、バクテリオファージが産生するインテグラーゼ（ファージインテグラーゼ）によって触媒され、バクテリオファージの種類によってＴＧ１インテグラーゼ、Ｒ４インテグラーゼ、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼ等の様々なファージインテグラーゼが存在することが知られている。
部位特異的組換え反応において、これらのファージインテグラーゼが認識する部位（ａｔｔＰ、ａｔｔＢ）はファージインテグラーゼ毎に特異的であり、相互に認識されない。また、一つのａｔｔＰに対して対応するａｔｔＢは一つであり、他のファージインテグラーゼに対応するａｔｔＢとは反応が起こらないことから、ファージインテグラーゼによる部位特異的組換え反応には、高い厳密性があるものとされてきた。
【０００４】
そして、この部位特異的組換反応を利用して、例えば、エリスロマイシン、テイコプラニン等の抗菌剤、ドキソルビシン等のような抗腫瘍化合物等、医薬品において重要な用途を有する天然物を製造する方法（例えば、特許文献１参照）や、所望の核酸を組み込んだベクターをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属等の細菌中で増殖および／または複製することでクローニングまたはサブクローニングする方法（例えば、特許文献２参照）等が開発されている。
【０００５】
本発明者らは、バクテリオファージのひとつであるＴＧ１ファージにおいて、この部位特異的組換反応が放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属において広く行われることを確認しており（例えば、非特許文献１〜３参照）、この部位特異的組換反応を触媒するＴＧ１ インテグラーゼを見出している（例えば、特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００２−５１８０４５号公報
【特許文献２】特許第４３０３４１８号
【特許文献３】特開２００７−２２８９２０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．ＦＥＭＳ Ｌｅｔｔ．２９７ ２３４−２４０（２００９）
【非特許文献２】Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． ２８２ ６０７−６１６（２００９）
【非特許文献３】Ｆｏｏｒ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ．３９ １１−１６（１９８５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＴＧ１インテグラーゼを利用した部位特異的遺伝子組換法の提供を課題とする。さらに、該部位特異的遺伝子組変法による、微生物ゲノム改変法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ＴＧ１ファージの特異的部位（以下、ａｔｔＰTG1とする）に対応する宿主菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ（以下、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓとする）の特異的部位（以下、ａｔｔＢTG1とする）と相同性が高い塩基配列をゲノム上に有するＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ以外の放線菌およびプロテオバクテリアを見出した。
そして、これらのＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ以外の放線菌およびプロテオバクテリアのゲノム上の塩基配列と、ＴＧ１ファージの特異的部位（ａｔｔＰTG1）との間で高い頻度でＴＧ１インテグラーゼによる部位特異的組換反応が起こることを確認し、本発明の部位特異的遺伝子組換法、および該部位特異的遺伝子組換法による微生物ゲノム改変法を完成するに至った。
このようなＴＧ１インテグラーゼが認識する特異的部位（ａｔｔＢTG1）と同様の作用を有する部位が、プロテオバクテリア等の放線菌群以外の細菌群でも存在することは本発明で初めて見出されたものであり、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼ等の他のファージインテグラーゼにおいても認められていない。
【００１０】
すなわち、本発明は次の（１）〜（８）の部位特異的遺伝子組換法、微生物ゲノム改変法等に関する。
（１）ＴＧ１インテグラーゼを用いることにより、ＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1と、ＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1に対応するａｔｔＢTG1と相同性の高い塩基配列を有する部位との間で遺伝子組換えを行う部位特異的遺伝子組換法。
（２）ＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1に対応するａｔｔＢTG1が、配列表配列番号２に記載の塩基配列を含むａｔｔＢTG1である上記（１）に記載の部位特異的遺伝子組換法。
（３）ＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1に対応するａｔｔＢTG1と相同性の高い塩基配列を有する部位が、配列表配列番号３〜５３のいずれかに記載の塩基配列を有する部位である上記（１）または（２）に記載の部位特異的遺伝子組換法。
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の部位特異的遺伝子組換法による微生物ゲノム改変法。
（５）微生物がＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1に対応するａｔｔＢTG1と相同性の高い塩基配列を有する部位をゲノム上に含む微生物である上記（４）に記載の微生物ゲノム改変法。
（６）ＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1に対応するａｔｔＢTG1と相同性の高い塩基配列を有する部位が、配列表配列番号３〜５３のいずれかに記載の塩基配列を有する部位である上記（５）に記載の微生物ゲノム変換法。
（７）微生物がＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ以外の放線菌またはプロテオバクテリアである上記（４）〜（６）のいずれかに記載の微生物ゲノム変換法。
（８）Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ以外の放線菌がＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｃａｂｉｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｃａｔｅｎｕｌｉｓｐｏｒａ ａｃｉｄｉｐｈｉｌａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｉｌｖｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｆａｒｃｉｎｉｃａ、Ｋｙｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｅｄｅｎｔａｒｉｕｓ、Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｔｒｏｐｉｃａ、Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ａｒｅｎｉｃｏｌａ、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ 、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ、Ｋｏｃｕｒｉａ ｒｈｉｚｏｐｈｉｌａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ、Ｂｒａｃｈｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓまたはＢｅｕｔｅｎｂｅｒｇｉａ ｃａｖｅｒｎａｅのいずれかであり、プロテオバクテリアがＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｏｄｕｌａｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ、Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ ｃａｒｂｏｘｉｄｏｖｏｒａｎｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｗｉｔｔｉｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｐｕｌｉ、Ｐｈｅｎｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｚｕｃｉｎｅｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｉｃｕｍ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙｉ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍまたはＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｃｅｎｔｅｎｕｍのいずれかである上記（７）に記載の微生物ゲノム変換法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の部位特異的遺伝子組換法および微生物ゲノム改変法により、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ以外の放線菌やプロテオバクテリア属の菌においても、目的遺伝子の導入が可能となる。
本発明の微生物ゲノム改変法により、菌自体を改変することで生物分解性プラスチックの生産菌、バイオ燃料の生産菌、メタン分解菌等のプロテオバクテリア属の菌における生物分解性プラスチックやバイオ燃料の生産能、メタン分解能の向上等に応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ａｔｔＰTG1に対応するａｔｔＢ TG1と相同性の高い塩基配列を有する微生物の検索結果を示した図である（実施例１）。
【図２】ａｔｔＰTG1に対応するａｔｔＢ TG1と相同性の高い塩基配列を有する微生物の検索結果の一部を示した図である（実施例１）。
【図３】ｐＵＣＩＰ−ＴＧ１のプラスミドマップを示した図である（実施例１）。
【図４】各微生物における部位特異的組換反応を示した図である（実施例１）。
【図５】ｐｈｉＣ３１ファージのａｔｔＰに対応するａｔｔＢと相同性の高い塩基配列を有する微生物の検索結果を示した図である（実施例１）。
【図６】微生物ゲノム改変法に用いるプラスミドベクターを示した図である（実施例２）。
【図７】微生物ゲノム改変法の一例を示した図である（実施例２）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の「部位特異的遺伝子組換法」とは、ＴＧ１インテグラーゼを用いることにより、ＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1と、ＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1に対応するａｔｔＢTG1と相同性の高い塩基配列を有する部位との間で遺伝子組換えを行うことをいう。
ここで、「ＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1」とは、ＴＧ１インテグラーゼによって認識されるＴＧ１ファージゲノム上の特異的部位のことをいい、この「ＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1」は、配列表配列番号１で示されたａｔｔＰTG1として機能する最小塩基配列を含む部位であることが好ましい。
また、「ＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1に対応するａｔｔＢTG1」とは、ＴＧ１インテグラーゼによって認識される宿主菌ゲノム上の特異的部位のことをいい、本願発明においては放線菌Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓのゲノム上に存在する、配列表配列番号２で示された塩基配列を含む部位のことをいう。
【００１４】
このａｔｔＢTG1と「相同性の高い塩基配列を有する部位」とは、ａｔｔＢTG1の塩基配列と相同性が高く、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ以外の微生物ゲノム上に存在するＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1によって認識され得る部位のことをいう。
ａｔｔＢTG1の塩基配列のうち、コアとなる塩基配列（配列表配列番号２に示された塩基配列のうち左から２３番目と２４番目の塩基（ＴＴ）からなる配列）を有する部位であることが好ましく、さらに、配列表配列番号２で示されたａｔｔＢTG1の一部の塩基配列（４６ｂｐ）と、ＦＡＳＴＡ ｐｒｏｇｒａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｔｏｐ−ｊ．ｈｔｍｌ）で、Ｅ−ｖａｌｕｅ＜５、ｉｄｅｎｔｉｔｙ＞７５％の条件で検索した場合に該当する塩基配列を有する部位であることが好ましい。このような部位としては、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ以外の放線菌やプロテオバクテリア等のゲノム上に存在する配列表配列番号３〜５３のいずれかに示される塩基配列を含む部位等が挙げられる。
【００１５】
本発明の「微生物ゲノム改変法」とは、本発明の「部位特異的遺伝子組換法」により、微生物のゲノム上に発現させたい遺伝子等を組み込み、微生物ゲノムを改変することをいう。
この「微生物ゲノム改変法」の対象となる微生物は、本発明の「部位特異的遺伝子組換法」により、ゲノムの改変が可能な微生物であればいずれの微生物であっても良いが、ＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1に対応するａｔｔＢTG1と相同性の高い塩基配列を有する部位をゲノム上に含む微生物であることが好ましい。
このような微生物として、配列表配列番号３〜５３のいずれかに記載の塩基配列を有する部位をゲノム上に含む微生物が挙げられる。配列表配列番号３〜５３のいずれかに記載の塩基配列を有する部位をゲノム上に含むＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ以外の放線菌またはプロテオバクテリア等が該当する。
【００１６】
例えば、配列表配列番号３〜５３のいずれかに記載の塩基配列を有する部位をゲノム上に含むＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ以外の放線菌として、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｃａｂｉｅｓ（配列表配列番号３）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）（同配列番号４）等のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｃａｔｅｎｕｌｉｓｐｏｒａ ａｃｉｄｉｐｈｉｌａ ＤＳＭ ４４９２８（同配列番号５）等のＣａｔｅｎｕｌｉｓｐｏｒａ ａｃｉｄｉｐｈｉｌａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ ＮＣＴＣ ２６６５（同配列番号６）等のＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｖｉｒｉｄｉｓ ＤＳＭ ４３０１（同配列番号７）等のＳａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｉｌｖｕｍ ＰＹＲ−ＧＣＫ（同配列番号８）等のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｉｌｖｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｆａｒｃｉｎｉｃａ ＩＦＭ １０１５２（同配列番号９）等のＮｏｃａｒｄｉａ ｆａｒｃｉｎｉｃａ、Ｋｙｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｅｄｅｎｔａｒｉｕｓ ＤＳＭ ２０５４７（同配列番号１０）等のＫｙｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｅｄｅｎｔａｒｉｕｓ、Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｔｒｏｐｉｃａ ＣＮＢ−４４０（同配列番号１１）等のＳａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｔｒｏｐｉｃａ、Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ａｒｅｎｉｃｏｌａ ＣＮＳ−２０５（同配列番号１２）等のＳａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ａｒｅｎｉｃｏｌａ、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ（同配列番号１３、１４）等のＣｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ ＴＣ１（同配列番号１５）等のＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＦＢ２４（同配列番号１６）等のＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｄａ ｆｕｓｃａ ＹＸ（同配列番号１７）等のＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ、Ｋｏｃｕｒｉａ ｒｈｉｚｏｐｈｉｌａ ＤＣ２２０１（同配列番号１８）等のＫｏｃｕｒｉａ ｒｈｉｚｏｐｈｉｌａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｃｉｅｎｓ ＹＳ−３１４（同配列番号１９）等のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ Ａ６（同配列番号２０）等のＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ、Ｂｒａｃｈｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆａｅｃｉｕｍ ＤＳＭ ４８１０（同配列番号２１）等のＢｒａｃｈｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．（同配列番号２２）等のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、 ｇｒｉｓｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．またはＢｅｕｔｅｎｂｅｒｇｉａ ｃａｖｅｒｎａｅ ＤＳＭ １２３３３（同配列番号２３）等のＢｅｕｔｅｎｂｅｒｇｉａ ｃａｖｅｒｎａｅが挙げられる。
【００１７】
また、プロテオバクテリアとして、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ ＴＩＥ−１（同配列番号２４）、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ ＣＧＡ００９（同配列番号２５）、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ ＢｉｓＡ５３（同配列番号２６）、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ ＢｉｓＢ１８（同配列番号３０）、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ ＢｉｓＢ５（同配列番号３４）あるいはＲｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ ＨａＡ２（同配列番号３５）等のＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ＵＳＤＡ １１０（同配列番号２７）等のＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＯＲＳ２７８（同配列番号２８）あるいはＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＢＴＡｉ１（同配列番号２９）等のＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．４−４６（同配列番号３１）等のＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｏｄｕｌａｎｓ ＯＲＳ ２０６０（同配列番号３２）等のＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｏｄｕｌａｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ ＪＣＭ（同配列番号３３）等のＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ ＡＭＢ−１（同配列番号３６）等のＭａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ、Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ ｃａｒｂｏｘｉｄｏｖｏｒａｎｓ ＯＭ５（同配列番号３７）等のＯｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ ｃａｒｂｏｘｉｄｏｖｏｒａｎｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｗｉｔｔｉｃｈｉｉ ＲＷ１（同配列番号３８）等のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｗｉｔｔｉｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｐｕｌｉ ＢＪ００１（同配列番号３９）等のＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｐｕｌｉ、Ｐｈｅｎｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｚｕｃｉｎｅｕｍ ＨＬＫ１（同配列番号４０）等のＰｈｅｎｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｚｕｃｉｎｅｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ ＰＡ１（同配列番号４１）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ ＡＭ１（同配列番号４２）あるいはＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ ＤＭ４（同配列番号４４）等のＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｉｃｕｍ（同配列番号４３）、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．Ｋ３１（同配列番号４５）等のＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ（同配列番号４６）、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙｉ Ｎｂ−２５５（同配列番号４７）等のＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙｉ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ（同配列番号４８、４９）、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ ６２１Ｈ（同配列番号５０）等のＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ ＤＳ−１（同配列番号５１）等のＰａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ ＡＴＣＣ １１１７０（同配列番号５２）等のＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍまたはＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｃｅｎｔｅｎｕｍ ＳＷ（同配列番号５３）等のＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｃｅｎｔｅｎｕｍ等が挙げられる。
【００１８】
本発明の「微生物ゲノム改変法」により、例えば、生物分解性プラスチックの生産菌として知られるＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｃｅｎｔｅｎｕｍに生物分解性プラスチックの生産に関連する遺伝子を組み込んだり、バイオ燃料の生産菌として知られるＲｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓにバイオ燃料の生産に関連する遺伝子を組み込んだり、メタン分解菌として知られるＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．にメタン分解に関連する遺伝子を組み込んだりすることで、それぞれの微生物ゲノムを改変し、より有用な微生物を得ることができる。
【００１９】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２０】
＜Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ以外の放線菌およびプロテオバクテリアの検討＞
ＴＧ１ファージの宿主菌のひとつである Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ以外の微生物について、部位特異的組換反応を行う可能性があるものを探索した。
即ち、ＴＧ１インテグラーゼが認識するａｔｔＢTG1のうち、コアとなる塩基配列（配列表配列番号２に示された塩基配列のうち左から２３番目と２４番目の塩基（ＴＴ）からなる配列）を中心にａｔｔＢTG1の一部の塩基配列（配列表配列番号２）を取り出し、これを用いてＦＡＳＴＡ ｐｒｏｇｒａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｔｏｐ−ｊ．ｈｔｍｌ）で、Ｅ−ｖａｌｕｅ＜５、ｉｄｅｎｔｉｔｙ＞７５％の条件で区切り、相同性の高い塩基配列を検索した。
その結果、図１に示したように、ゲノム上にａｔｔＢTG1と同様に認識される可能性がある塩基配列（配列表配列番号３〜５３）を有する微生物が複数見つかった。これらの微生物はいずれも放線菌（図１、青線内）またはプロテオバクテリア（図１、赤線内）であった。
図１に示された微生物のうち、特にａｔｔＢTG1の一部の塩基配列（配列表配列番号２）に相同性の高い塩基配列を有する上位１０種の微生物とその塩基配列を図２に示した。図２の上部はＦＡＳＴＡ ｐｒｏｇｒａｍによる相同性の高い塩基配列の検索結果を示したものであり、下部はこれらの塩基配列の比較結果を示したものである。
【００２１】
これらの微生物のうち、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属ではない２種の放線菌Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｔｒｏｐｉｃａ（配列表配列番号１１）、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ（配列表配列番号１５）（以下、Ｓ．ｔｒｏｐｉｃａまたはＡ．ａｕｒｅｓｃｅｎｓとする）と、３種のプロテオバクテリア属Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｃｅｎｔｅｎｕｍ（配列表配列番号５３）、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ（配列表配列番号２４）（以下、Ｒ．ｃｅｎｔｅｎｕｍ、Ｒ．ｐａｌｕｓｔｒｉｓとする）およびＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．（配列表配列番号３１）について、ａｔｔＢTG1の一部の塩基配列（配列表配列番号２）と相同性の高い塩基配列（上記、各配列表配列番号）からなるＤＮＡ断片を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1と部位特異的組換反応が生じるかどうかを検討した。
検討にあたり、０．０３ｐｍｏｌのｐＵＣＩＰ−ＴＧ１（図３）と３ｐｍｏｌのＴＧ１インテグラーゼを用いた。ｐＵＣＩＰ−ＴＧ１は、ｐＵＣ１９（タカラバイオ株式会社）をＨｉｎｃＩＩで切断したところに、ｐＫＵ４６２（北里大学から供与、下記文献参照）をＮｓｉＩとＸｈｏＩで切断した、配列表配列番号１で示された塩基配列を含むａｔｔＰTG1とＴＧ１インテグラーゼ遺伝子（配列表配列番号５４）とを含む領域を挿入することで構築した。
即ち、３ｐｍｏｌの精製したＴＧ１インテグラーゼ、０．０３ｐｍｏｌのａｔｔＰTG1を含むｐＵＣＩＰ−ＴＧ１と、０、０．０１、０．０３、０．０９または０．３ｐｍｏｌのａｔｔＢTG1に相同性の高い塩基配列からなる各ＤＮＡ断片とを全量１０μｌになるようにＲｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）に混合し、３０℃で２時間反応を行った。反応後、７５℃で１０分間反応を行い、反応を停止させた。２μｌの１０×Ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを添加し、１．０％のアガロースゲル電気泳動により確認した。
文献：Ｋｏｍａｔｓｕ Ｍ， Ｔｓｕｄａ Ｍ， Ｏｍｕｒａ Ｓ， Ｏｉｋａｗａ Ｈ＆Ｉｋｅｄａ Ｈ （２００８） Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ２−ｍｅｔｈｙｌｉｓｏｂｏｒｎｅｏｌ． Ｐ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０５：７４２２-７４２７．
【００２２】
その結果、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓと同様に、これらの微生物においてもＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1と部位特異的組換反応が生じることが確認された（図４）。図４においては、各微生物のａｔｔＢTG1に相同性の高い塩基配列からなるＤＮＡ断片の量を０、０．０１、０．０３、０．０９、０．３ｐｍｏｌとした場合の結果を左から示している。
これらの結果より、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属ではない２種の放線菌および３種のプロテオバクテリア属を用いて、本発明の部位特異的遺伝子組換法および微生物ゲノム改変法を行うことが可能であることが示された。
【００２３】
なお、ＴＧ１ファージと同じく放線菌を宿主菌とするｐｈｉＣ３１ファージのａｔｔＰに対応するａｔｔＢと相同性の高い塩基配列を有する微生物をＦＡＳＴＡ ｐｒｏｇｒａｍで同様に検索をしたところ、放線菌のみが見つかり、ＴＧ１ファージのように、プロテオバクテリア属が検出されることはなかった（図５）。
【実施例２】
【００２４】
＜微生物ゲノム改変法＞
本発明の部位特異的遺伝子組換法による微生物ゲノム改変法の一例を以下に示した。
１）プラスミドベクター（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）の構築
大腸菌の複製開始地点（ｏｒｉ）を持つプラスミドベクターに、カナマイシン、ネオマイシン耐性遺伝子（ａｐｈＩＩ）、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）、ＴＧ１ファージの配列表配列番号１で示された塩基配列を含むａｔｔＰ TG1およびＴＧ１インテグラーゼ遺伝子（配列表配列番号５４）を有するプラスミドベクターを構築した（図６）。このプラスミドベクターのマルチクローニングサイトに、微生物ゲノムに導入したい目的遺伝子を挿入し、プラスミドベクター（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）（図７ａ、上部）を構築した。
【００２５】
２）微生物ゲノム改変法
上記１）のプラスミドベクター（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）をエレクトロポレーション法またはプロトプラスト法によってゲノムを改変したい微生物に導入した（図７ａ）。
導入された微生物体内にてＴＧ１インテグラーゼ遺伝子が発現し、プラスミドベクター（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）上のａｔｔＰTG1と微生物ゲノム上の対応する部位（ａｔｔＢTG1に相同性の高い塩基配列からなる部位またはａｔｔＢTG1に相同性の高い塩基配列を含む部位）間で部位特異的組換反応が生じ（図７ｂ）、目的遺伝子を含むプラスミドベクター（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）がゲノムに導入された（図７ｃ）。
プラスミドベクター（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）上の抗生物質耐性遺伝子に対応する抗生物質で選抜を行うことにより、目的遺伝子が導入されたかどうかの判別を行った。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明の部位特異的遺伝子組換法および微生物ゲノム改変法により、放線菌やプロテオバクテリア属の菌に目的遺伝子を導入したり、菌自体を改変したりすることが可能となる。これにより、有用なタンパク質の産生や、生物分解性プラスチックの生産菌、バイオ燃料の生産菌、メタン分解菌等のプロテオバクテリア属の菌における生物分解性プラスチックやバイオ燃料の生産能、メタン分解能の向上等に応用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明はバクテリオファージＴＧ１（以下、ＴＧ１ファージとする）が産生するファージインテグラーゼ（以下、ＴＧ１インテグラーゼとする）を利用した部位特異的遺伝子組換法に関する。さらに、該部位特異的遺伝子組変法による微生物ゲノム改変法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バクテリオファージは細菌を宿主とするウイルスの総称であり、細菌ウイルスとも呼ばれる。バクテリオファージは、ウイルス粒子の形態やサイズ、感染増殖様式、遺伝情報物質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの存在様式）、感染し得る細菌の範囲（宿主域）等に関して多種多様な種類が存在する。感染増殖様式について見ると、宿主菌に感染すると直ちに複製増殖を開始し、溶菌を行って子ファージを放出する（溶菌サイクル）タイプのファージと感染後溶菌サイクルに入るか、あるいは直ちに溶菌サイクルに入らずに宿主菌中に維持される（溶原化サイクル）かのいずれかの道を辿るタイプとに大きく分けることができる。後者のタイプのファージ（溶原性ファージ）の多くは、溶原化に伴い自身のゲノムを宿主菌ゲノム中に挿入して、潜在化（プロファージ化）する。
溶原化における宿主菌ゲノム中へのファージゲノムの挿入は、ファージゲノム上の特異的部位（ファージ・アタッチメント部位：ａｔｔＰ）と宿主菌ゲノム上の特異的部位（バクテリア・アタッチメント部位：ａｔｔＢ）との間の部位特異的組換え反応によって起こり、２つのゲノムは一つのゲノムへと一体化する。
【０００３】
このような部位特異的組換え反応は、バクテリオファージが産生するインテグラーゼ（ファージインテグラーゼ）によって触媒され、バクテリオファージの種類によってＴＧ１インテグラーゼ、Ｒ４インテグラーゼ、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼ等の様々なファージインテグラーゼが存在することが知られている。
部位特異的組換え反応において、これらのファージインテグラーゼが認識する部位（ａｔｔＰ、ａｔｔＢ）はファージインテグラーゼ毎に特異的であり、相互に認識されない。また、一つのａｔｔＰに対して対応するａｔｔＢは一つであり、他のファージインテグラーゼに対応するａｔｔＢとは反応が起こらないことから、ファージインテグラーゼによる部位特異的組換え反応には、高い厳密性があるものとされてきた。
【０００４】
そして、この部位特異的組換反応を利用して、例えば、エリスロマイシン、テイコプラニン等の抗菌剤、ドキソルビシン等のような抗腫瘍化合物等、医薬品において重要な用途を有する天然物を製造する方法（例えば、特許文献１参照）や、所望の核酸を組み込んだベクターをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属等の細菌中で増殖および／または複製することでクローニングまたはサブクローニングする方法（例えば、特許文献２参照）等が開発されている。
【０００５】
本発明者らは、バクテリオファージのひとつであるＴＧ１ファージにおいて、この部位特異的組換反応が放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属において広く行われることを確認しており（例えば、非特許文献１〜３参照）、この部位特異的組換反応を触媒するＴＧ１ インテグラーゼを見出している（例えば、特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００２−５１８０４５号公報
【特許文献２】特許第４３０３４１８号
【特許文献３】特開２００７−２２８９２０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．ＦＥＭＳ Ｌｅｔｔ．２９７ ２３４−２４０（２００９）
【非特許文献２】Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． ２８２ ６０７−６１６（２００９）
【非特許文献３】Ｆｏｏｒ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ．３９ １１−１６（１９８５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＴＧ１インテグラーゼを利用した部位特異的遺伝子組換法の提供を課題とする。さらに、該部位特異的遺伝子組変法による、微生物ゲノム改変法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ＴＧ１ファージの特異的部位（以下、ａｔｔＰTG1とする）に対応する宿主菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ（以下、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓとする）の特異的部位（以下、ａｔｔＢTG1とする）と相同性が高い塩基配列をゲノム上に有するＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ以外の放線菌およびプロテオバクテリアを見出した。
そして、これらのＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ以外の放線菌およびプロテオバクテリアのゲノム上の塩基配列と、ＴＧ１ファージの特異的部位（ａｔｔＰTG1）との間で高い頻度でＴＧ１インテグラーゼによる部位特異的組換反応が起こることを確認し、本発明の部位特異的遺伝子組換法、および該部位特異的遺伝子組換法による微生物ゲノム改変法を完成するに至った。
このようなＴＧ１インテグラーゼが認識する特異的部位（ａｔｔＢTG1）と同様の作用を有する部位が、プロテオバクテリア等の放線菌群以外の細菌群でも存在することは本発明で初めて見出されたものであり、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼ等の他のファージインテグラーゼにおいても認められていない。
【００１０】
すなわち、本発明は次の（１）〜（８）の部位特異的遺伝子組換法、微生物ゲノム改変法等に関する。
（１）ＴＧ１インテグラーゼを用いることにより、ＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1と、ＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1に対応するａｔｔＢTG1と相同性の高い塩基配列を有する部位との間で遺伝子組換えを行う部位特異的遺伝子組換法。
（２）ＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1に対応するａｔｔＢTG1が、配列表配列番号２に記載の塩基配列を含むａｔｔＢTG1である上記（１）に記載の部位特異的遺伝子組換法。
（３）ＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1に対応するａｔｔＢTG1と相同性の高い塩基配列を有する部位が、配列表配列番号３〜５３のいずれかに記載の塩基配列を有する部位である上記（１）または（２）に記載の部位特異的遺伝子組換法。
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の部位特異的遺伝子組換法による微生物ゲノム改変法。
（５）微生物がＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1に対応するａｔｔＢTG1と相同性の高い塩基配列を有する部位をゲノム上に含む微生物である上記（４）に記載の微生物ゲノム改変法。
（６）ＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1に対応するａｔｔＢTG1と相同性の高い塩基配列を有する部位が、配列表配列番号３〜５３のいずれかに記載の塩基配列を有する部位である上記（５）に記載の微生物ゲノム変換法。
（７）微生物がＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ以外の放線菌またはプロテオバクテリアである上記（４）〜（６）のいずれかに記載の微生物ゲノム変換法。
（８）Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ以外の放線菌がＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｃａｂｉｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｃａｔｅｎｕｌｉｓｐｏｒａ ａｃｉｄｉｐｈｉｌａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｉｌｖｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｆａｒｃｉｎｉｃａ、Ｋｙｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｅｄｅｎｔａｒｉｕｓ、Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｔｒｏｐｉｃａ、Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ａｒｅｎｉｃｏｌａ、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ 、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ、Ｋｏｃｕｒｉａ ｒｈｉｚｏｐｈｉｌａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ、Ｂｒａｃｈｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓまたはＢｅｕｔｅｎｂｅｒｇｉａ ｃａｖｅｒｎａｅのいずれかであり、プロテオバクテリアがＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｏｄｕｌａｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ、Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ ｃａｒｂｏｘｉｄｏｖｏｒａｎｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｗｉｔｔｉｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｐｕｌｉ、Ｐｈｅｎｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｚｕｃｉｎｅｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｉｃｕｍ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙｉ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍまたはＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｃｅｎｔｅｎｕｍのいずれかである上記（７）に記載の微生物ゲノム変換法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の部位特異的遺伝子組換法および微生物ゲノム改変法により、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ以外の放線菌やプロテオバクテリア属の菌においても、目的遺伝子の導入が可能となる。
本発明の微生物ゲノム改変法により、菌自体を改変することで生物分解性プラスチックの生産菌、バイオ燃料の生産菌、メタン分解菌等のプロテオバクテリア属の菌における生物分解性プラスチックやバイオ燃料の生産能、メタン分解能の向上等に応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ａｔｔＰTG1に対応するａｔｔＢ TG1と相同性の高い塩基配列を有する微生物の検索結果を示した図である（実施例１）。
【図２】ａｔｔＰTG1に対応するａｔｔＢ TG1と相同性の高い塩基配列を有する微生物の検索結果の一部を示した図である（実施例１）。
【図３】ｐＵＣＩＰ−ＴＧ１のプラスミドマップを示した図である（実施例１）。
【図４】各微生物における部位特異的組換反応を示した図である（実施例１）。
【図５】ｐｈｉＣ３１ファージのａｔｔＰに対応するａｔｔＢと相同性の高い塩基配列を有する微生物の検索結果を示した図である（実施例１）。
【図６】微生物ゲノム改変法に用いるプラスミドベクターを示した図である（実施例２）。
【図７】微生物ゲノム改変法の一例を示した図である（実施例２）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の「部位特異的遺伝子組換法」とは、ＴＧ１インテグラーゼを用いることにより、ＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1と、ＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1に対応するａｔｔＢTG1と相同性の高い塩基配列を有する部位との間で遺伝子組換えを行うことをいう。
ここで、「ＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1」とは、ＴＧ１インテグラーゼによって認識されるＴＧ１ファージゲノム上の特異的部位のことをいい、この「ＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1」は、配列表配列番号１で示されたａｔｔＰTG1として機能する最小塩基配列を含む部位であることが好ましい。
また、「ＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1に対応するａｔｔＢTG1」とは、ＴＧ１インテグラーゼによって認識される宿主菌ゲノム上の特異的部位のことをいい、本願発明においては放線菌Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓのゲノム上に存在する、配列表配列番号２で示された塩基配列を含む部位のことをいう。
【００１４】
このａｔｔＢTG1と「相同性の高い塩基配列を有する部位」とは、ａｔｔＢTG1の塩基配列と相同性が高く、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ以外の微生物ゲノム上に存在するＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1によって認識され得る部位のことをいう。
ａｔｔＢTG1の塩基配列のうち、コアとなる塩基配列（配列表配列番号２に示された塩基配列のうち左から２３番目と２４番目の塩基（ＴＴ）からなる配列）を有する部位であることが好ましく、さらに、配列表配列番号２で示されたａｔｔＢTG1の一部の塩基配列（４６ｂｐ）と、ＦＡＳＴＡ ｐｒｏｇｒａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｔｏｐ−ｊ．ｈｔｍｌ）で、Ｅ−ｖａｌｕｅ＜５、ｉｄｅｎｔｉｔｙ＞７５％の条件で検索した場合に該当する塩基配列を有する部位であることが好ましい。このような部位としては、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ以外の放線菌やプロテオバクテリア等のゲノム上に存在する配列表配列番号３〜５３のいずれかに示される塩基配列を含む部位等が挙げられる。
【００１５】
本発明の「微生物ゲノム改変法」とは、本発明の「部位特異的遺伝子組換法」により、微生物のゲノム上に発現させたい遺伝子等を組み込み、微生物ゲノムを改変することをいう。
この「微生物ゲノム改変法」の対象となる微生物は、本発明の「部位特異的遺伝子組換法」により、ゲノムの改変が可能な微生物であればいずれの微生物であっても良いが、ＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1に対応するａｔｔＢTG1と相同性の高い塩基配列を有する部位をゲノム上に含む微生物であることが好ましい。
このような微生物として、配列表配列番号３〜５３のいずれかに記載の塩基配列を有する部位をゲノム上に含む微生物が挙げられる。配列表配列番号３〜５３のいずれかに記載の塩基配列を有する部位をゲノム上に含むＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ以外の放線菌またはプロテオバクテリア等が該当する。
【００１６】
例えば、配列表配列番号３〜５３のいずれかに記載の塩基配列を有する部位をゲノム上に含むＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ以外の放線菌として、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｃａｂｉｅｓ（配列表配列番号３）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）（同配列番号４）等のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｃａｔｅｎｕｌｉｓｐｏｒａ ａｃｉｄｉｐｈｉｌａ ＤＳＭ ４４９２８（同配列番号５）等のＣａｔｅｎｕｌｉｓｐｏｒａ ａｃｉｄｉｐｈｉｌａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ ＮＣＴＣ ２６６５（同配列番号６）等のＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｖｉｒｉｄｉｓ ＤＳＭ ４３０１（同配列番号７）等のＳａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｉｌｖｕｍ ＰＹＲ−ＧＣＫ（同配列番号８）等のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｉｌｖｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｆａｒｃｉｎｉｃａ ＩＦＭ １０１５２（同配列番号９）等のＮｏｃａｒｄｉａ ｆａｒｃｉｎｉｃａ、Ｋｙｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｅｄｅｎｔａｒｉｕｓ ＤＳＭ ２０５４７（同配列番号１０）等のＫｙｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｅｄｅｎｔａｒｉｕｓ、Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｔｒｏｐｉｃａ ＣＮＢ−４４０（同配列番号１１）等のＳａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｔｒｏｐｉｃａ、Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ａｒｅｎｉｃｏｌａ ＣＮＳ−２０５（同配列番号１２）等のＳａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ａｒｅｎｉｃｏｌａ、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ（同配列番号１３、１４）等のＣｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ ＴＣ１（同配列番号１５）等のＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＦＢ２４（同配列番号１６）等のＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｄａ ｆｕｓｃａ ＹＸ（同配列番号１７）等のＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ、Ｋｏｃｕｒｉａ ｒｈｉｚｏｐｈｉｌａ ＤＣ２２０１（同配列番号１８）等のＫｏｃｕｒｉａ ｒｈｉｚｏｐｈｉｌａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｃｉｅｎｓ ＹＳ−３１４（同配列番号１９）等のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ Ａ６（同配列番号２０）等のＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ、Ｂｒａｃｈｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆａｅｃｉｕｍ ＤＳＭ ４８１０（同配列番号２１）等のＢｒａｃｈｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．（同配列番号２２）等のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、 ｇｒｉｓｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．またはＢｅｕｔｅｎｂｅｒｇｉａ ｃａｖｅｒｎａｅ ＤＳＭ １２３３３（同配列番号２３）等のＢｅｕｔｅｎｂｅｒｇｉａ ｃａｖｅｒｎａｅが挙げられる。
【００１７】
また、プロテオバクテリアとして、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ ＴＩＥ−１（同配列番号２４）、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ ＣＧＡ００９（同配列番号２５）、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ ＢｉｓＡ５３（同配列番号２６）、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ ＢｉｓＢ１８（同配列番号３０）、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ ＢｉｓＢ５（同配列番号３４）あるいはＲｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ ＨａＡ２（同配列番号３５）等のＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ＵＳＤＡ １１０（同配列番号２７）等のＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＯＲＳ２７８（同配列番号２８）あるいはＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＢＴＡｉ１（同配列番号２９）等のＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．４−４６（同配列番号３１）等のＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｏｄｕｌａｎｓ ＯＲＳ ２０６０（同配列番号３２）等のＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｏｄｕｌａｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ ＪＣＭ（同配列番号３３）等のＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ ＡＭＢ−１（同配列番号３６）等のＭａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ、Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ ｃａｒｂｏｘｉｄｏｖｏｒａｎｓ ＯＭ５（同配列番号３７）等のＯｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ ｃａｒｂｏｘｉｄｏｖｏｒａｎｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｗｉｔｔｉｃｈｉｉ ＲＷ１（同配列番号３８）等のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｗｉｔｔｉｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｐｕｌｉ ＢＪ００１（同配列番号３９）等のＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｐｕｌｉ、Ｐｈｅｎｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｚｕｃｉｎｅｕｍ ＨＬＫ１（同配列番号４０）等のＰｈｅｎｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｚｕｃｉｎｅｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ ＰＡ１（同配列番号４１）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ ＡＭ１（同配列番号４２）あるいはＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ ＤＭ４（同配列番号４４）等のＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｉｃｕｍ（同配列番号４３）、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．Ｋ３１（同配列番号４５）等のＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ（同配列番号４６）、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙｉ Ｎｂ−２５５（同配列番号４７）等のＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙｉ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ（同配列番号４８、４９）、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ ６２１Ｈ（同配列番号５０）等のＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ ＤＳ−１（同配列番号５１）等のＰａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ ＡＴＣＣ １１１７０（同配列番号５２）等のＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍまたはＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｃｅｎｔｅｎｕｍ ＳＷ（同配列番号５３）等のＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｃｅｎｔｅｎｕｍ等が挙げられる。
【００１８】
本発明の「微生物ゲノム改変法」により、例えば、生物分解性プラスチックの生産菌として知られるＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｃｅｎｔｅｎｕｍに生物分解性プラスチックの生産に関連する遺伝子を組み込んだり、バイオ燃料の生産菌として知られるＲｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓにバイオ燃料の生産に関連する遺伝子を組み込んだり、メタン分解菌として知られるＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．にメタン分解に関連する遺伝子を組み込んだりすることで、それぞれの微生物ゲノムを改変し、より有用な微生物を得ることができる。
【００１９】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２０】
＜Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ以外の放線菌およびプロテオバクテリアの検討＞
ＴＧ１ファージの宿主菌のひとつである Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ以外の微生物について、部位特異的組換反応を行う可能性があるものを探索した。
即ち、ＴＧ１インテグラーゼが認識するａｔｔＢTG1のうち、コアとなる塩基配列（配列表配列番号２に示された塩基配列のうち左から２３番目と２４番目の塩基（ＴＴ）からなる配列）を中心にａｔｔＢTG1の一部の塩基配列（配列表配列番号２）を取り出し、これを用いてＦＡＳＴＡ ｐｒｏｇｒａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｔｏｐ−ｊ．ｈｔｍｌ）で、Ｅ−ｖａｌｕｅ＜５、ｉｄｅｎｔｉｔｙ＞７５％の条件で区切り、相同性の高い塩基配列を検索した。
その結果、図１に示したように、ゲノム上にａｔｔＢTG1と同様に認識される可能性がある塩基配列（配列表配列番号３〜５３）を有する微生物が複数見つかった。これらの微生物はいずれも放線菌（図１、青線内）またはプロテオバクテリア（図１、赤線内）であった。
図１に示された微生物のうち、特にａｔｔＢTG1の一部の塩基配列（配列表配列番号２）に相同性の高い塩基配列を有する上位１０種の微生物とその塩基配列を図２に示した。図２の上部はＦＡＳＴＡ ｐｒｏｇｒａｍによる相同性の高い塩基配列の検索結果を示したものであり、下部はこれらの塩基配列の比較結果を示したものである。
【００２１】
これらの微生物のうち、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属ではない２種の放線菌Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｔｒｏｐｉｃａ（配列表配列番号１１）、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ（配列表配列番号１５）（以下、Ｓ．ｔｒｏｐｉｃａまたはＡ．ａｕｒｅｓｃｅｎｓとする）と、３種のプロテオバクテリア属Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｃｅｎｔｅｎｕｍ（配列表配列番号５３）、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ（配列表配列番号２４）（以下、Ｒ．ｃｅｎｔｅｎｕｍ、Ｒ．ｐａｌｕｓｔｒｉｓとする）およびＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．（配列表配列番号３１）について、ａｔｔＢTG1の一部の塩基配列（配列表配列番号２）と相同性の高い塩基配列（上記、各配列表配列番号）からなるＤＮＡ断片を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1と部位特異的組換反応が生じるかどうかを検討した。
検討にあたり、０．０３ｐｍｏｌのｐＵＣＩＰ−ＴＧ１（図３）と３ｐｍｏｌのＴＧ１インテグラーゼを用いた。ｐＵＣＩＰ−ＴＧ１は、ｐＵＣ１９（タカラバイオ株式会社）をＨｉｎｃＩＩで切断したところに、ｐＫＵ４６２（北里大学から供与、下記文献参照）をＮｓｉＩとＸｈｏＩで切断した、配列表配列番号１で示された塩基配列を含むａｔｔＰTG1とＴＧ１インテグラーゼ遺伝子（配列表配列番号５４）とを含む領域を挿入することで構築した。
即ち、３ｐｍｏｌの精製したＴＧ１インテグラーゼ、０．０３ｐｍｏｌのａｔｔＰTG1を含むｐＵＣＩＰ−ＴＧ１と、０、０．０１、０．０３、０．０９または０．３ｐｍｏｌのａｔｔＢTG1に相同性の高い塩基配列からなる各ＤＮＡ断片とを全量１０μｌになるようにＲｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）に混合し、３０℃で２時間反応を行った。反応後、７５℃で１０分間反応を行い、反応を停止させた。２μｌの１０×Ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを添加し、１．０％のアガロースゲル電気泳動により確認した。
文献：Ｋｏｍａｔｓｕ Ｍ， Ｔｓｕｄａ Ｍ， Ｏｍｕｒａ Ｓ， Ｏｉｋａｗａ Ｈ＆Ｉｋｅｄａ Ｈ （２００８） Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ２−ｍｅｔｈｙｌｉｓｏｂｏｒｎｅｏｌ． Ｐ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０５：７４２２-７４２７．
【００２２】
その結果、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓと同様に、これらの微生物においてもＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1と部位特異的組換反応が生じることが確認された（図４）。図４においては、各微生物のａｔｔＢTG1に相同性の高い塩基配列からなるＤＮＡ断片の量を０、０．０１、０．０３、０．０９、０．３ｐｍｏｌとした場合の結果を左から示している。
これらの結果より、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属ではない２種の放線菌および３種のプロテオバクテリア属を用いて、本発明の部位特異的遺伝子組換法および微生物ゲノム改変法を行うことが可能であることが示された。
【００２３】
なお、ＴＧ１ファージと同じく放線菌を宿主菌とするｐｈｉＣ３１ファージのａｔｔＰに対応するａｔｔＢと相同性の高い塩基配列を有する微生物をＦＡＳＴＡ ｐｒｏｇｒａｍで同様に検索をしたところ、放線菌のみが見つかり、ＴＧ１ファージのように、プロテオバクテリア属が検出されることはなかった（図５）。
【実施例２】
【００２４】
＜微生物ゲノム改変法＞
本発明の部位特異的遺伝子組換法による微生物ゲノム改変法の一例を以下に示した。
１）プラスミドベクター（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）の構築
大腸菌の複製開始地点（ｏｒｉ）を持つプラスミドベクターに、カナマイシン、ネオマイシン耐性遺伝子（ａｐｈＩＩ）、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）、ＴＧ１ファージの配列表配列番号１で示された塩基配列を含むａｔｔＰ TG1およびＴＧ１インテグラーゼ遺伝子（配列表配列番号５４）を有するプラスミドベクターを構築した（図６）。このプラスミドベクターのマルチクローニングサイトに、微生物ゲノムに導入したい目的遺伝子を挿入し、プラスミドベクター（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）（図７ａ、上部）を構築した。
【００２５】
２）微生物ゲノム改変法
上記１）のプラスミドベクター（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）をエレクトロポレーション法またはプロトプラスト法によってゲノムを改変したい微生物に導入した（図７ａ）。
導入された微生物体内にてＴＧ１インテグラーゼ遺伝子が発現し、プラスミドベクター（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）上のａｔｔＰTG1と微生物ゲノム上の対応する部位（ａｔｔＢTG1に相同性の高い塩基配列からなる部位またはａｔｔＢTG1に相同性の高い塩基配列を含む部位）間で部位特異的組換反応が生じ（図７ｂ）、目的遺伝子を含むプラスミドベクター（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）がゲノムに導入された（図７ｃ）。
プラスミドベクター（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）上の抗生物質耐性遺伝子に対応する抗生物質で選抜を行うことにより、目的遺伝子が導入されたかどうかの判別を行った。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明の部位特異的遺伝子組換法および微生物ゲノム改変法により、放線菌やプロテオバクテリア属の菌に目的遺伝子を導入したり、菌自体を改変したりすることが可能となる。これにより、有用なタンパク質の産生や、生物分解性プラスチックの生産菌、バイオ燃料の生産菌、メタン分解菌等のプロテオバクテリア属の菌における生物分解性プラスチックやバイオ燃料の生産能、メタン分解能の向上等に応用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＧ１インテグラーゼを用いることにより、ＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1と、ＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1に対応するａｔｔＢTG1と相同性の高い塩基配列を有する部位との間で遺伝子組換えを行う部位特異的遺伝子組換法。
【請求項２】
ＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1に対応するａｔｔＢTG1が、配列表配列番号２に記載の塩基配列を含むａｔｔＢTG1である請求項１に記載の部位特異的遺伝子組換法。
【請求項３】
ＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1に対応するａｔｔＢTG1と相同性の高い塩基配列を有する部位が、配列表配列番号３〜５３のいずれかに記載の塩基配列を有する部位である請求項１または２に記載の部位特異的遺伝子組換法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の部位特異的遺伝子組換法による微生物ゲノム改変法。
【請求項５】
微生物がＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1に対応するａｔｔＢTG1と相同性の高い塩基配列を有する部位をゲノム上に含む微生物である請求項４に記載の微生物ゲノム改変法。
【請求項６】
ＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1に対応するａｔｔＢTG1と相同性の高い塩基配列を有する部位が、配列表配列番号３〜５３のいずれかに記載の塩基配列を有する部位である請求項５に記載の微生物ゲノム変換法。
【請求項７】
微生物がＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ以外の放線菌またはプロテオバクテリアである請求項４〜６のいずれかに記載の微生物ゲノム変換法。
【請求項８】
Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ以外の放線菌がＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｃａｂｉｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｃａｔｅｎｕｌｉｓｐｏｒａ ａｃｉｄｉｐｈｉｌａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｉｌｖｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｆａｒｃｉｎｉｃａ、Ｋｙｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｅｄｅｎｔａｒｉｕｓ、Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｔｒｏｐｉｃａ、Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ａｒｅｎｉｃｏｌａ、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ、Ｋｏｃｕｒｉａ ｒｈｉｚｏｐｈｉｌａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ、Ｂｒａｃｈｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓまたはＢｅｕｔｅｎｂｅｒｇｉａ ｃａｖｅｒｎａｅのいずれかであり、プロテオバクテリアがＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｏｄｕｌａｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ、Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ ｃａｒｂｏｘｉｄｏｖｏｒａｎｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｗｉｔｔｉｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｐｕｌｉ、Ｐｈｅｎｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｚｕｃｉｎｅｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｉｃｕｍ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙｉ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍまたはＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｃｅｎｔｅｎｕｍのいずれかである請求項７に記載の微生物ゲノム変換法。
【請求項１】
ＴＧ１インテグラーゼを用いることにより、ＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1と、ＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1に対応するａｔｔＢTG1と相同性の高い塩基配列を有する部位との間で遺伝子組換えを行う部位特異的遺伝子組換法。
【請求項２】
ＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1に対応するａｔｔＢTG1が、配列表配列番号２に記載の塩基配列を含むａｔｔＢTG1である請求項１に記載の部位特異的遺伝子組換法。
【請求項３】
ＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1に対応するａｔｔＢTG1と相同性の高い塩基配列を有する部位が、配列表配列番号３〜５３のいずれかに記載の塩基配列を有する部位である請求項１または２に記載の部位特異的遺伝子組換法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の部位特異的遺伝子組換法による微生物ゲノム改変法。
【請求項５】
微生物がＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1に対応するａｔｔＢTG1と相同性の高い塩基配列を有する部位をゲノム上に含む微生物である請求項４に記載の微生物ゲノム改変法。
【請求項６】
ＴＧ１ファージのａｔｔＰTG1に対応するａｔｔＢTG1と相同性の高い塩基配列を有する部位が、配列表配列番号３〜５３のいずれかに記載の塩基配列を有する部位である請求項５に記載の微生物ゲノム変換法。
【請求項７】
微生物がＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ以外の放線菌またはプロテオバクテリアである請求項４〜６のいずれかに記載の微生物ゲノム変換法。
【請求項８】
Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ以外の放線菌がＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｃａｂｉｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｃａｔｅｎｕｌｉｓｐｏｒａ ａｃｉｄｉｐｈｉｌａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｉｌｖｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｆａｒｃｉｎｉｃａ、Ｋｙｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｅｄｅｎｔａｒｉｕｓ、Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ｔｒｏｐｉｃａ、Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ ａｒｅｎｉｃｏｌａ、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ、Ｋｏｃｕｒｉａ ｒｈｉｚｏｐｈｉｌａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ、Ｂｒａｃｈｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓまたはＢｅｕｔｅｎｂｅｒｇｉａ ｃａｖｅｒｎａｅのいずれかであり、プロテオバクテリアがＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｏｄｕｌａｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｍａｇｎｅｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍａｇｎｅｔｉｃｕｍ、Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ ｃａｒｂｏｘｉｄｏｖｏｒａｎｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｗｉｔｔｉｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｐｕｌｉ、Ｐｈｅｎｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｚｕｃｉｎｅｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｉｃｕｍ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙｉ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍまたはＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｃｅｎｔｅｎｕｍのいずれかである請求項７に記載の微生物ゲノム変換法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１１−１４２８６７（Ｐ２０１１−１４２８６７Ａ）
【公開日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−６８０１（Ｐ２０１０−６８０１）
【出願日】平成２２年１月１５日（２０１０．１．１５）
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月１５日（２０１０．１．１５）
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【Ｆターム（参考）】
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