配糖体含有リポソーム
本発明は、抗腫瘍剤として有用なコレスタノール配糖体の効果を最大限に発揮し得る製剤を提供するものである。 すなわち、本発明は、抗腫瘍活性を有し、糖としてＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−、ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−、Ｆｕｃ−Ｇａｌ−、Ｇａｌ−Ｇｌｃ又はＧａｌ−を有するリポソーム化可能な疎水性化合物の配糖体、リン脂質及び正電荷供与物質を含有するリポソームに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌剤として有用な配糖体を含有するリポソームに関する。
【背景技術】
【０００２】
例えばコレステロールのＢ環の二重結合が飽和されたコレスタノールに特定の糖鎖を結合させた下記のコレスタノール配糖体（１）は、癌細胞の増殖抑制作用を有し、抗癌剤として有用な化合物である（特許文献１及び２参照）。
【０００３】
【化１】
【０００４】
［式中、ＧはＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−、ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−、Ｆｕｃ−Ｇａｌ−、Ｇａｌ−Ｇｌｃ−又はＧａｌ−を示す。］
【０００５】
コレスタノールのような疎水性化合物は、細胞膜に親和性を有し、細胞に容易に取り込まれることから、それらの配糖体は種々の癌細胞に容易に取り込まれ十分にその効果を発揮できると考えられていた。しかしながら、当該配糖体は、溶解性の低さから使用が困難であったり、癌腫によってはその効果を充分に発揮できない場合があった。
【特許文献１】特開平１１−６０５９２号公報
【特許文献２】特開平２０００−１９１６８５号公報
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、抗腫瘍活性を有する配糖体に対し、該化合物の本来有する抗腫瘍効果をより効率的に発揮せしめる製剤を提供することを目的とする。
【０００７】
本発明者らは、斯かる実情に鑑み、抗腫瘍活性を有する疎水性化合物の配糖体について、その投与形態を種々検討したところ、膜脂質として少なくともリン脂質を用い、且つ正電荷供与物質を共存させて、当該配糖体をリポソーム化した場合に、溶解性の低さのために使用が困難であった化合物の使用が可能になり、更に配糖体をそのまま投与した場合には殆ど効果を示さなかった腫瘍株に対しても強い抗腫瘍活性を示す等、該化合物の本来有する抗腫瘍効果をより効率的に発揮せしめる製剤となり得ることを見出した。
【０００８】
すなわち本発明は、抗腫瘍活性を有し、糖としてＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−、ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−、Ｆｕｃ−Ｇａｌ−、Ｇａｌ−Ｇｌｃ又はＧａｌ−を有するリポソーム化可能な疎水性化合物の配糖体、リン脂質及び正電荷供与物質を含有するリポソームを提供するものである。
【０００９】
また、本発明は、下記の式（１）〜（３）：
【化２】
【００１０】
［式中、ＧはＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−、ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−、Ｆｕｃ−Ｇａｌ−、Ｇａｌ−Ｇｌｃ−又はＧａｌ−を示し、ｎは１２〜２６の整数を示す。］
から選ばれる配糖体、リン脂質及び正電荷供与物質を含有するリポソームを提供するものである。
【００１１】
更に本発明は、当該リポソームを含有する抗癌剤を提供するものである。
【００１２】
本発明によれば、抗腫瘍活性を有する配糖体の溶解性が向上し、当該配糖体が本来有する抗腫瘍効果をより効率的に発揮せしめる製剤が提供できる。特に、コレスタノール配糖体（１）を用いた製剤は、そのまま投与した場合には抗腫瘍作用を発揮しづらかった癌細胞に対しても強い抗腫瘍活性を示し、当該化合物の持つ抗腫瘍作用を最大限に発揮せしめることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】リポソーム化ＧｌｃＮＡｃβ１，４ＧａｌＣｈｏｌの癌細胞増殖阻害効果を表した図である。図中、−Ｌｉｐｏはリポソームであることを示す。
【図２】リポソーム化Ｆｕｃα１，３ＧａｌＣｈｏｌの癌細胞増殖阻害効果を表した図である。図中、−Ｌｉｐｏはリポソームであることを示す。
【図３】リポソーム化ＧａｌβＣｈｏｌの癌細胞増殖阻害効果を表した図である。図中、−Ｌｉｐｏはリポソームであることを示す。
【図４】リポソーム化ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１，１ＮＭおよびリポソーム化ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃβ１，１Ｃｅｒａｍｉｄｅの癌細胞増殖阻害効果を示した図である。図中、−Ｌｉｐｏはリポソームであることを示す。
【図５】リポソーム化Ｆｕｃα１，３ＧａｌＣｈｏｌの粒子径の違いによる腹膜播腫抑制効果を表した図である。
【図６】リポソーム化ＧｌｃＮＡｃβ１，４ＧａｌＣｈｏｌの腹膜播腫抑制効果を表したもので、特に腫瘍形成数を測定した図である。
【図７】リポソーム化ＧｌｃＮＡｃβ１，４ＧａｌＣｈｏｌの腹膜播腫抑制効果を表したもので、特に腫瘍重量（ｇ）を測定した図である。
【図８】リポソーム化ＦｕｃＧａｌＣｈｏｌ及びＦｕｃＧａｌＣｈｏｌ単独投与での腹膜播種抑制効果を比較したもので、特に腫瘍形成数を測定した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明リポソームに含有される配糖体は、糖として、ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−、ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−、Ｆｕｃ−Ｇａｌ−、Ｇａｌ−Ｇｌｃ又はＧａｌ−を有し、リポソーム化可能な疎水性化合物をアグリコンとする化合物であり、且つ抗腫瘍活性を有するものである。
ここで、リポソーム化可能な疎水性化合物としては、例えばコレステロール、セラミド、疎水性アミノ酸、脂肪酸（オレイン酸、リノール酸、リノレイン酸等）、脂溶性ビタミン等の生体構成成分や、例えばナフタレン誘導体（例えばナフタレンメタノール）等の芳香環を有する化合物、コレステロール誘導体（例えばコレスタノール）等が挙げられる。このうち、セラミド、ナフタレン誘導体、コレステロール誘導体が好ましく、コレステロールのＢ環の二重結合が飽和されたコレスタノールが特に好ましい。
【００１５】
また、糖部分がＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−であるものは、好ましくはＧｌｃＮＡｃβ１，３−Ｇａｌβ−又はＧｌｃＮＡｃβ１，４−Ｇａｌβ−であり、ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−であるものは、好ましくはＧｌｃＮＡｃβ１，３−Ｇａｌβ１，４−Ｇｌｃ−であり、Ｆｕｃ−Ｇａｌ−であるものは、好ましくはＦｕｃα１，３Ｇａｌ−であり、Ｇａｌ−Ｇｌｃ−であるものは、好ましくはＧａｌβ１，４Ｇｌｃβ−であり、Ｇａｌ−であるものは、好ましくはＧａｌβ−である。
【００１６】
更に好適な配糖体として、以下のコレスタノール配糖体（１）、ナフタレンメタノール配糖体（２）及びセラミド配糖体（３）が挙げられる。
【化３】
【００１７】
［式中、ＧはＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−、ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−、Ｆｕｃ−Ｇａｌ−、Ｇａｌ−Ｇｌｃ−又はＧａｌ−を示し、ｎは１２〜２６の整数を示す。］
【００１８】
中でも、抗癌作用の点から、コレスタノール配糖体（１）が特に好ましく、更に式（１）中の好ましい化合物として、以下に示すものが挙げられる。
（１）Ｇ＝ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−：
３−β−コレスタニル ３−Ｏ−（２−アセタミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、
３−β−コレスタニル ４−Ｏ−（２−アセタミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
（２）Ｇ＝ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−：
３−β−コレスタニル ４−Ｏ−｛３−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル｝−β−Ｄ−グルコピラノシド
（３）Ｇ＝Ｆｕｃ−Ｇａｌ−：
３−β−コレスタニル ３−Ｏ−（α−Ｌ−フコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
（４）Ｇ＝Ｇａｌ−Ｇｌｃ−：
３−β−コレスタニル ４−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）β−Ｄ−グルコピラノシド
（５）Ｇ＝Ｇａｌ−：
３−β−コレスタニル β−Ｄ−ガラクトピラノシド
【００１９】
本発明の配糖体は、生体内からの抽出、公知の化学反応、或いはこれらを組み合わせて製造することができる。例えば、上記コレスタノール配糖体（１）については、特開平１１−６０５９２号公報又は特開平２０００−１９１６８５号公報に記載の方法により、ナフタレンメタノール配糖体（２）については、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（４１）２５６０８，１９９７記載の方法により製造することができ、セラミド配糖体（３）については、ヒト赤血球、肝臓、消化管粘膜、胎便などからの抽出により得ることができる。
【００２０】
当該配糖体は、抗腫瘍活性を有するものであるが、ここで抗腫瘍活性を有するとは、インビボにおいては、少なくとも１種の癌種に対して抗腫瘍効果を発揮し得ることを意味し、インビトロにあっては、少なくとも１種の癌細胞株に対して増殖阻害活性又は、増殖抑制活性を有することを意味する。
【００２１】
本発明リポソームにおいて、配糖体は、リン脂質１モルに対して、０．３〜２．０モル、好ましくは０．８〜１．５モル含有するのが好ましい。
【００２２】
本発明のリポソームにおいては、膜成分脂質として少なくともリン脂質が用いられる。
斯かるリン脂質としては、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ミリストイルパルミトイルホスファチジルコリン、ミリストイルステアロイルホスファチジルコリン、パルミトイルアラキドイルホスファチジルコリン等のホスファチジルコリン類、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸等が挙げられ、これらは天然、又は半合成若しくは全合成により得ることができる。また、水素添加リン脂質等の加工リン脂質を用いることもできる。斯かるリン脂質は、単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
このうち、電気的中性で安定なリポソームを形成し得る点から、ホスファチジルコリン類を用いるのが好ましく、特に１αジパルミトイルフォスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）を用いるのが好ましい。
【００２３】
正電荷供与物質は、脂質膜の表面を正に荷電させるために添加される物質である。リポソームの表面を正に荷電させることにより、膜表面が負の荷電状態にある細胞との無理のない接触が期待できる。
【００２４】
正電荷供与物質としては、ステアリルアミン、オレイルアミン等の脂肪族アミン、フルオレンエチルアミン等の芳香族アミンが挙げられ、このうち脂肪族アミンが好ましく、特にステアリルアミンを用いるのが好ましい。
正電荷供与物質は、リン脂質１モルに対して、０．０４〜０．１５モル、好ましくは０．１〜０．１５モル含有するのが好ましい。
【００２５】
本発明のリポソームには、上記成分の他に、膜構造の安定剤としてコレステロール、脂肪酸、ジアセチルホスフェート等を必要に応じて加えることができる。
【００２６】
膜成分を分散させる水溶液としては、水、生理食塩水、各種緩衝液、糖類の水溶液及びこれらの混合物が好ましく用いられる。緩衝液としては、有機系、無機系を問わず体液水素イオン濃度付近に緩衝作用を有する緩衝液が好適に用いられ、例えばリン酸緩衝液を挙げることができる。
【００２７】
本発明リポソームの調製は、特に限定されず常法に従って行えばよい。例えば特開昭５７−８２３１０号公報、特開昭６０−１２１２７号公報、特開昭６０−５８９１５号公報、特開平１−１１７８２４号公報、特開平１−１６７２１８号公報、特開平４−２９９２５号公報、特開平９−８７１６８号公報、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９８８）３３，ｐ３３７、或いは「リポソーム」（南江堂）に記載の方法に準じて行えばよい。
【００２８】
以下に、特開平９−８７１６８号公報に記載された方法に準じた本発明リポソームの調製手順について述べる。
【００２９】
まず、本発明の配糖体、リン脂質及び正電荷供与物質に有機溶媒及び水を加え混合した後、ロータリーエヴァポレーター等を用い完全に有機溶媒を除去し、次いで水分除去を行なう。ここで、膜成分物質、正電荷供与物質及び配糖体の混合比率は、例えば、５２：８：２０（モル比）を例示できるが、その近辺の混合比率であれば特に問題はない。配糖体の混合比率が小さい場合はコレステロールに代表される膜構造安定剤を必要に応じて添加することができるが、該混合比率が高くなれば必ずしも膜構造の安定剤の添加を必要とはしない。
【００３０】
有機溶媒は、水に対し不溶性の揮発性有機溶媒であれば特に制限はなく、例えばクロロホルム、クロルメタン、ベンゼン及びヘキサン等を用いることができ、溶解性を考慮する場合は、エタノールあるいはメタノール等の比較的極性の高い有機溶媒を適宜添加調製した混合有機溶媒を使用することができる。該混合有機溶媒と水との混合比率は、均一になる比率であれば、特に制限はない。
【００３１】
また、水分を添加調製した場合、水分除去法としては凍結乾燥法がごく一般に用いられるが、これに限定されるものではなく、減圧デシケーター中で乾燥してもよい。水分除去後、前述の分散水溶液を添加し、Ｖｏｒｔｅｘミキサー等で浸透することによりリポソーム化が達成される。
【００３２】
本発明リポソームの粒子径は、腫瘍抑制効果の点から１０μｍ以下であるのが好ましく、３μｍ以下であるのがより好ましい。
リポソームのサイズを揃える場合は、例えば超音波処理、多孔質メンブレンフィルターに対する押出し処理、高圧噴射乳化装置による処理、あるいはこれらを組み合わせることによってサイズの均一化が可能である。また、より小さいリポソーム粒子を得たい場合は、たとえば超音波処理時間を長くすることにより達成することができる。
【００３３】
斯くして調製された本発明リポソームは、後記実施例に示すように、極めて優れた癌細胞の増殖阻害作用を有する。特に、コレスタノール配糖体（１）については、そのまま投与した場合には抗腫瘍作用を発揮しづらかった癌細胞に対しても強い抗腫瘍活性を示す。リポソームは、一般にリン脂質二重膜を形成した小胞球であり、薬剤を内部に包み込む形で分散させ、細胞膜との融合により薬剤を細胞内に到達せしめることを目的として作製されるものであることから、薬剤自体の性質はリポソーム化によって変わるものではないと考えられていた。従って、当該コレスタノール配糖体をリポソーム化することにより、当該化合物の抗腫瘍活性が飛躍的に向上したことは、全く意外であった。
かように、当該リポソームを含有する製剤は、配糖体の本来有する抗腫瘍効果をより効率的に発揮せしめる抗癌剤として有用である。
【００３４】
本発明の抗癌剤は、治療部位、治療目的に応じて適宜剤形を選択でき、リポソーム形状の安定性を損う添加剤等の使用がない限り、公知の調製方法に従い、例えば、経口剤、注射剤、坐剤、軟膏剤、貼付剤等とすることができる。
【００３５】
経口用固形製剤を調製する場合は、本発明リポソームに、賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。そのような添加剤としては、当該分野で一般的に使用されるものでよく、例えば、賦形剤としては、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸等を、結合剤としては、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等を、崩壊剤としては乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等を、滑沢剤としては精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール等を、矯味剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等を例示できる。
【００３６】
経口用液体製剤を調製する場合は、本発明リポソームに、矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。この場合矯味剤としては上記に挙げられたもので良く、緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム等が、安定化剤としてはトラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が挙げられる。
【００３７】
注射剤を調製する場合は、本発明リポソームに、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下、筋肉内及び静脈内用注射剤を製造することができる。この場合のｐＨ調節剤及び緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。安定化剤としてはピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸等が挙げられる。局所麻酔剤としては塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等が挙げられる。等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖等が例示できる。
【００３８】
坐剤を調製する場合は、本発明リポソームに公知の製剤用担体、例えば、ポリエチレングリコール、ラノリン、カカオ脂、脂肪酸トリグリセライド等を、更に必要に応じてツイーン（登録商標）のような界面活性剤等を加えた後、常法により製造することができる。
【００３９】
軟膏剤を調製する場合は、本発明リポソームに、通常使用される基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等を必要に応じて配合し、常法により混合、製剤化することができる。基剤としては、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィン等が挙げられ、保存剤としては、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等が挙げられる。
【００４０】
貼付剤を製造する場合は、通常の支持体に前記軟膏、クリーム、ゲル、ペースト等を常法により塗布すれば良い。支持体としては、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布や軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルムあるいは発泡体シートが適当である。
【００４１】
本発明抗癌剤の投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、通常成人１日あたり、コレスタノール配糖体（１）として約０．０１〜２００ｍｇ／Ｋｇ、好適には０．１〜５０ｍｇ／Ｋｇとすれば良く、これを１日一回又は２〜４回程度に分けて投与するのが好ましい。
【実施例】
【００４２】
次に、本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例１ コレスタノール配糖体のリポソーム化
コレスタノール配糖体として、前記式（１）中のＧがＧｌｃＮＡｃβ１，４Ｇａｌである「ＧｌｃＮＡｃβ１，４ＧａｌＣｈｏｌ」、ＧがＦｕｃα１，３Ｇａｌである「Ｆｕｃα１，３ＧａｌＣｈｏｌ」、ＧがＧａｌβである「ＧａｌβＣｈｏｌ」及び比較としてＧがＨである「Ｃｈｏｌ」を用い、これらの２０μｍｏｌ／ｍｌ（クロロホルム／メタノール＝５／１，ｖ／ｖに溶解）溶液を出発物質とした。
１αジパルミトイルフォスファチジルコリン、ステアリルアミン及び上記のコレスタノール配糖体を５２／８／２０（モル比）の割合で７００μｌとなるように混合し、次いで有機溶媒（クロロホルム／メタノール＝２／１，Ｖ／Ｖ）３００μｌ及び蒸留水１ｍｌを添加混合した。その後、ロータリーエヴァポレーターにて有機溶媒を完全に除去した後、凍結乾燥操作を行ない、水分を完全に除去した。該凍結乾燥品は、ＰＢＳ１ｍｌ中に溶解し、超音波処理（１５Ｗ，１５分）を行なうことによりリポソームを粒子径２−４μｍ程度に均一化し、実施例２及び３に供した。
【００４３】
実施例２ ナフタレンメタノール配糖体のリポソーム化
ナフタレンメタノール配糖体として、前記式（２）中のＧがＧｌｃＮａｃβ１，４−Ｇａｌβ１，１−である「ＧｌｃＮＡｃβ１，４Ｇａｌβ１，１ＮＭ」（ＮＭ：ナフタレンメタノール）を用い、コレスタノール配糖体のリポソーム化と同様の条件にてリポソーム化を行なった。
【００４４】
実施例３ セラミド配糖体のリポソーム化
セラミド配糖体として、前記式（３）中のＧがＧｌｃＮａｃβ１，３−Ｇａｌβ１，４−Ｇｌｃ−である「ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃβ１，１Ｃｅｒａｍｉｄｅ」を用い、コレスタノール配糖体のリポソーム化と同様の方法にてリポソーム化を行なった。但し、該リポソーム化の場合は安定化剤としてコレステロールを添加した。
【００４５】
実施例４ リポソーム化コレスタノール配糖体による細胞増殖阻害効果
培養癌細胞株（ｃｏｌｏｎ２６ ｗｉｌｄ）を９６穴プレートに、１×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ｗｅｌｌとなるように幡種した後、コレスタノール配糖体（ＧｌｃＮＡｃβ１，４ＧａｌＣｈｏｌ、Ｆｕｃα１，３ＧａｌＣｈｏｌ、ＧａｌβＣｈｏｌ、Ｃｈｏｌ）及び実施例１で得られたリポソーム化コレスタノール配糖体を添加し、３日間３７℃にてインキュベートした。その後、ＭＴＴアッセイを行ない細胞数を決定した。なお、増殖抑制率は以下の式に従って求めた。
【００４６】
細胞増殖阻害率（ＣＰＩ率）（％）
＝（１＝処理細胞におけるＯＤ／未処理細胞におけるＯＤ）×１００
【００４７】
その結果、単独ではほとんど効果を示さなかったＦｕｃα１，３ＧａｌＣｈｏｌは、リポソーム化することによって著しい細胞増殖抑制効果を示した。また、従来より細胞増殖阻害効果を示していたＧｌｃＮＡｃβ１，４ＧａｌＣｈｏｌは、リポソーム化することにより更に強い細胞増殖阻害効果を示すことが判明した（図１、２及び３）。
【００４８】
実施例５ リポソーム化ナフタレンメタノール配糖体及びリポソーム化セラミド配糖体による細胞増殖阻害効果
培養癌細胞株（ｃｏｌｏ２０１）を９６穴プレートに、１Ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ｗｅｌｌとなるように播種した後、実施例２及び３で得られたリポソーム化ナフタレンメタノール配糖体およびリポソーム化セラミド配糖体を添加し、３日間３７℃にてインキュベートした。その後、ＭＴＴアッセイを行ない細胞数を決定した。なお、増殖抑制率は実施例４にと同様にして求めた。
その結果、単独では不溶性のため殆ど効果を示さないＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１ＮＭおよびＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃβ１，１Ｃｅｒａｍｉｄｅが、リポソーム化することによって著しい細胞増殖阻害効果を示すことが判明した（図４）。
【００４９】
実施例６ リポソーム化コレスタノール配糖体による腹膜播腫抑制効果
（１）リポソーム化Ｆｕｃα１，３ＧａｌＣｈｏｌの粒子径による影響
Ｂａｌｂ／ｃマウス（８週齢、雌）に対し、癌細胞株（ｃｏｌｏｎ２６ ｗｉｌｄ，５×１０４ｃｅｌｌｓ／２００μｌ）を腹空内投与した。次いで、１２時間、２４時間及び４８時間後に異なる超音波処理時間（１５Ｗ×５，１０，１５分）により調製したリポソーム化Ｆｕｃα１，３ＧａｌＣｈｏｌ（２μｍｏｌ／１００μｌ）を腹腔内投与した。１０日後、腸間膜における腫瘍数を測定した。超音波処理時間を長くしリポソーム粒子径を小さくするほど、腹膜播腫抑制効果示すことが判明した（図５）。
【００５０】
（２）リポソーム化ＧｌｃＮＡｃβ１，４ＧａｌＣｈｏｌの腹膜播腫抑制効果
Ｂａｌｂ／ｃマウス（８週齢、雌）に対し、癌細胞株（ｃｏｌｏｎ２６ ｗｉｌｄ，５×１０４ｃｅｌｌｓ／２００μｌ）を腹腔内投与した。次いで、２４時間及び４８時間後、超音波処理（１５Ｗ、１５分間）により調製したリポソーム化ＧｌｃＮＡｃβ１，４ＧａｌＣｈｏｌ（２μｍｏｌ／１００μｌ）を腹腔内投与した。１０日後、腸間膜における腫瘍数を、２１日後に大網及び腸間膜において形成した腫瘍重量を測定した。その結果、リポソーム化ＧｌｃＮＡｃβ１，４ＧａｌＣｈｏｌ投与により良好な腹膜播腫抑制効果を示すことが判明した（図６及び７）。
【００５１】
（３）リポソーム化ＦｕｃＧａｌＣｈｏｌ及びＦｕｃＧａｌＣｈｏｌ単独投与での腹膜播種抑制効果の比較
Ｂａｌｂ／ｃマウス（８週齢、雌）に対し、癌細胞株（ｃｏｌｏｎ２６ ｗｉｌｄ，５×１０４ｃｅｌｌｓ／２００μｌ）を腹腔内投与した。次いで、０、２４及び４８時間後に超音波処理（１５Ｗ、１５分間）により調製したリポソーム化ＦｕｃＧａｌＣｈｏｌ及びＦｕｃＧａｌＣｈｏｌの腹腔内投与を行った（いずれも２μｍｏｌ／１００μｌ）。１０日後、腸間膜に形成された腫瘍数を測定した。
その結果、無処理、ＦｕｃＧａｌＣｈｏｌ投与群に比べて、リポソーム化ＦｕｃＧａｌＣｈｏｌ投与群では、腫瘍の形成が強く抑制されていることが判明した（図８）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌剤として有用な配糖体を含有するリポソームに関する。
【背景技術】
【０００２】
例えばコレステロールのＢ環の二重結合が飽和されたコレスタノールに特定の糖鎖を結合させた下記のコレスタノール配糖体（１）は、癌細胞の増殖抑制作用を有し、抗癌剤として有用な化合物である（特許文献１及び２参照）。
【０００３】
【化１】
【０００４】
［式中、ＧはＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−、ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−、Ｆｕｃ−Ｇａｌ−、Ｇａｌ−Ｇｌｃ−又はＧａｌ−を示す。］
【０００５】
コレスタノールのような疎水性化合物は、細胞膜に親和性を有し、細胞に容易に取り込まれることから、それらの配糖体は種々の癌細胞に容易に取り込まれ十分にその効果を発揮できると考えられていた。しかしながら、当該配糖体は、溶解性の低さから使用が困難であったり、癌腫によってはその効果を充分に発揮できない場合があった。
【特許文献１】特開平１１−６０５９２号公報
【特許文献２】特開平２０００−１９１６８５号公報
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、抗腫瘍活性を有する配糖体に対し、該化合物の本来有する抗腫瘍効果をより効率的に発揮せしめる製剤を提供することを目的とする。
【０００７】
本発明者らは、斯かる実情に鑑み、抗腫瘍活性を有する疎水性化合物の配糖体について、その投与形態を種々検討したところ、膜脂質として少なくともリン脂質を用い、且つ正電荷供与物質を共存させて、当該配糖体をリポソーム化した場合に、溶解性の低さのために使用が困難であった化合物の使用が可能になり、更に配糖体をそのまま投与した場合には殆ど効果を示さなかった腫瘍株に対しても強い抗腫瘍活性を示す等、該化合物の本来有する抗腫瘍効果をより効率的に発揮せしめる製剤となり得ることを見出した。
【０００８】
すなわち本発明は、抗腫瘍活性を有し、糖としてＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−、ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−、Ｆｕｃ−Ｇａｌ−、Ｇａｌ−Ｇｌｃ又はＧａｌ−を有するリポソーム化可能な疎水性化合物の配糖体、リン脂質及び正電荷供与物質を含有するリポソームを提供するものである。
【０００９】
また、本発明は、下記の式（１）〜（３）：
【化２】
【００１０】
［式中、ＧはＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−、ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−、Ｆｕｃ−Ｇａｌ−、Ｇａｌ−Ｇｌｃ−又はＧａｌ−を示し、ｎは１２〜２６の整数を示す。］
から選ばれる配糖体、リン脂質及び正電荷供与物質を含有するリポソームを提供するものである。
【００１１】
更に本発明は、当該リポソームを含有する抗癌剤を提供するものである。
【００１２】
本発明によれば、抗腫瘍活性を有する配糖体の溶解性が向上し、当該配糖体が本来有する抗腫瘍効果をより効率的に発揮せしめる製剤が提供できる。特に、コレスタノール配糖体（１）を用いた製剤は、そのまま投与した場合には抗腫瘍作用を発揮しづらかった癌細胞に対しても強い抗腫瘍活性を示し、当該化合物の持つ抗腫瘍作用を最大限に発揮せしめることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】リポソーム化ＧｌｃＮＡｃβ１，４ＧａｌＣｈｏｌの癌細胞増殖阻害効果を表した図である。図中、−Ｌｉｐｏはリポソームであることを示す。
【図２】リポソーム化Ｆｕｃα１，３ＧａｌＣｈｏｌの癌細胞増殖阻害効果を表した図である。図中、−Ｌｉｐｏはリポソームであることを示す。
【図３】リポソーム化ＧａｌβＣｈｏｌの癌細胞増殖阻害効果を表した図である。図中、−Ｌｉｐｏはリポソームであることを示す。
【図４】リポソーム化ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１，１ＮＭおよびリポソーム化ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃβ１，１Ｃｅｒａｍｉｄｅの癌細胞増殖阻害効果を示した図である。図中、−Ｌｉｐｏはリポソームであることを示す。
【図５】リポソーム化Ｆｕｃα１，３ＧａｌＣｈｏｌの粒子径の違いによる腹膜播腫抑制効果を表した図である。
【図６】リポソーム化ＧｌｃＮＡｃβ１，４ＧａｌＣｈｏｌの腹膜播腫抑制効果を表したもので、特に腫瘍形成数を測定した図である。
【図７】リポソーム化ＧｌｃＮＡｃβ１，４ＧａｌＣｈｏｌの腹膜播腫抑制効果を表したもので、特に腫瘍重量（ｇ）を測定した図である。
【図８】リポソーム化ＦｕｃＧａｌＣｈｏｌ及びＦｕｃＧａｌＣｈｏｌ単独投与での腹膜播種抑制効果を比較したもので、特に腫瘍形成数を測定した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明リポソームに含有される配糖体は、糖として、ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−、ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−、Ｆｕｃ−Ｇａｌ−、Ｇａｌ−Ｇｌｃ又はＧａｌ−を有し、リポソーム化可能な疎水性化合物をアグリコンとする化合物であり、且つ抗腫瘍活性を有するものである。
ここで、リポソーム化可能な疎水性化合物としては、例えばコレステロール、セラミド、疎水性アミノ酸、脂肪酸（オレイン酸、リノール酸、リノレイン酸等）、脂溶性ビタミン等の生体構成成分や、例えばナフタレン誘導体（例えばナフタレンメタノール）等の芳香環を有する化合物、コレステロール誘導体（例えばコレスタノール）等が挙げられる。このうち、セラミド、ナフタレン誘導体、コレステロール誘導体が好ましく、コレステロールのＢ環の二重結合が飽和されたコレスタノールが特に好ましい。
【００１５】
また、糖部分がＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−であるものは、好ましくはＧｌｃＮＡｃβ１，３−Ｇａｌβ−又はＧｌｃＮＡｃβ１，４−Ｇａｌβ−であり、ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−であるものは、好ましくはＧｌｃＮＡｃβ１，３−Ｇａｌβ１，４−Ｇｌｃ−であり、Ｆｕｃ−Ｇａｌ−であるものは、好ましくはＦｕｃα１，３Ｇａｌ−であり、Ｇａｌ−Ｇｌｃ−であるものは、好ましくはＧａｌβ１，４Ｇｌｃβ−であり、Ｇａｌ−であるものは、好ましくはＧａｌβ−である。
【００１６】
更に好適な配糖体として、以下のコレスタノール配糖体（１）、ナフタレンメタノール配糖体（２）及びセラミド配糖体（３）が挙げられる。
【化３】
【００１７】
［式中、ＧはＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−、ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−、Ｆｕｃ−Ｇａｌ−、Ｇａｌ−Ｇｌｃ−又はＧａｌ−を示し、ｎは１２〜２６の整数を示す。］
【００１８】
中でも、抗癌作用の点から、コレスタノール配糖体（１）が特に好ましく、更に式（１）中の好ましい化合物として、以下に示すものが挙げられる。
（１）Ｇ＝ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−：
３−β−コレスタニル ３−Ｏ−（２−アセタミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、
３−β−コレスタニル ４−Ｏ−（２−アセタミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
（２）Ｇ＝ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−：
３−β−コレスタニル ４−Ｏ−｛３−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル｝−β−Ｄ−グルコピラノシド
（３）Ｇ＝Ｆｕｃ−Ｇａｌ−：
３−β−コレスタニル ３−Ｏ−（α−Ｌ−フコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
（４）Ｇ＝Ｇａｌ−Ｇｌｃ−：
３−β−コレスタニル ４−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）β−Ｄ−グルコピラノシド
（５）Ｇ＝Ｇａｌ−：
３−β−コレスタニル β−Ｄ−ガラクトピラノシド
【００１９】
本発明の配糖体は、生体内からの抽出、公知の化学反応、或いはこれらを組み合わせて製造することができる。例えば、上記コレスタノール配糖体（１）については、特開平１１−６０５９２号公報又は特開平２０００−１９１６８５号公報に記載の方法により、ナフタレンメタノール配糖体（２）については、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（４１）２５６０８，１９９７記載の方法により製造することができ、セラミド配糖体（３）については、ヒト赤血球、肝臓、消化管粘膜、胎便などからの抽出により得ることができる。
【００２０】
当該配糖体は、抗腫瘍活性を有するものであるが、ここで抗腫瘍活性を有するとは、インビボにおいては、少なくとも１種の癌種に対して抗腫瘍効果を発揮し得ることを意味し、インビトロにあっては、少なくとも１種の癌細胞株に対して増殖阻害活性又は、増殖抑制活性を有することを意味する。
【００２１】
本発明リポソームにおいて、配糖体は、リン脂質１モルに対して、０．３〜２．０モル、好ましくは０．８〜１．５モル含有するのが好ましい。
【００２２】
本発明のリポソームにおいては、膜成分脂質として少なくともリン脂質が用いられる。
斯かるリン脂質としては、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ミリストイルパルミトイルホスファチジルコリン、ミリストイルステアロイルホスファチジルコリン、パルミトイルアラキドイルホスファチジルコリン等のホスファチジルコリン類、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸等が挙げられ、これらは天然、又は半合成若しくは全合成により得ることができる。また、水素添加リン脂質等の加工リン脂質を用いることもできる。斯かるリン脂質は、単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
このうち、電気的中性で安定なリポソームを形成し得る点から、ホスファチジルコリン類を用いるのが好ましく、特に１αジパルミトイルフォスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）を用いるのが好ましい。
【００２３】
正電荷供与物質は、脂質膜の表面を正に荷電させるために添加される物質である。リポソームの表面を正に荷電させることにより、膜表面が負の荷電状態にある細胞との無理のない接触が期待できる。
【００２４】
正電荷供与物質としては、ステアリルアミン、オレイルアミン等の脂肪族アミン、フルオレンエチルアミン等の芳香族アミンが挙げられ、このうち脂肪族アミンが好ましく、特にステアリルアミンを用いるのが好ましい。
正電荷供与物質は、リン脂質１モルに対して、０．０４〜０．１５モル、好ましくは０．１〜０．１５モル含有するのが好ましい。
【００２５】
本発明のリポソームには、上記成分の他に、膜構造の安定剤としてコレステロール、脂肪酸、ジアセチルホスフェート等を必要に応じて加えることができる。
【００２６】
膜成分を分散させる水溶液としては、水、生理食塩水、各種緩衝液、糖類の水溶液及びこれらの混合物が好ましく用いられる。緩衝液としては、有機系、無機系を問わず体液水素イオン濃度付近に緩衝作用を有する緩衝液が好適に用いられ、例えばリン酸緩衝液を挙げることができる。
【００２７】
本発明リポソームの調製は、特に限定されず常法に従って行えばよい。例えば特開昭５７−８２３１０号公報、特開昭６０−１２１２７号公報、特開昭６０−５８９１５号公報、特開平１−１１７８２４号公報、特開平１−１６７２１８号公報、特開平４−２９９２５号公報、特開平９−８７１６８号公報、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９８８）３３，ｐ３３７、或いは「リポソーム」（南江堂）に記載の方法に準じて行えばよい。
【００２８】
以下に、特開平９−８７１６８号公報に記載された方法に準じた本発明リポソームの調製手順について述べる。
【００２９】
まず、本発明の配糖体、リン脂質及び正電荷供与物質に有機溶媒及び水を加え混合した後、ロータリーエヴァポレーター等を用い完全に有機溶媒を除去し、次いで水分除去を行なう。ここで、膜成分物質、正電荷供与物質及び配糖体の混合比率は、例えば、５２：８：２０（モル比）を例示できるが、その近辺の混合比率であれば特に問題はない。配糖体の混合比率が小さい場合はコレステロールに代表される膜構造安定剤を必要に応じて添加することができるが、該混合比率が高くなれば必ずしも膜構造の安定剤の添加を必要とはしない。
【００３０】
有機溶媒は、水に対し不溶性の揮発性有機溶媒であれば特に制限はなく、例えばクロロホルム、クロルメタン、ベンゼン及びヘキサン等を用いることができ、溶解性を考慮する場合は、エタノールあるいはメタノール等の比較的極性の高い有機溶媒を適宜添加調製した混合有機溶媒を使用することができる。該混合有機溶媒と水との混合比率は、均一になる比率であれば、特に制限はない。
【００３１】
また、水分を添加調製した場合、水分除去法としては凍結乾燥法がごく一般に用いられるが、これに限定されるものではなく、減圧デシケーター中で乾燥してもよい。水分除去後、前述の分散水溶液を添加し、Ｖｏｒｔｅｘミキサー等で浸透することによりリポソーム化が達成される。
【００３２】
本発明リポソームの粒子径は、腫瘍抑制効果の点から１０μｍ以下であるのが好ましく、３μｍ以下であるのがより好ましい。
リポソームのサイズを揃える場合は、例えば超音波処理、多孔質メンブレンフィルターに対する押出し処理、高圧噴射乳化装置による処理、あるいはこれらを組み合わせることによってサイズの均一化が可能である。また、より小さいリポソーム粒子を得たい場合は、たとえば超音波処理時間を長くすることにより達成することができる。
【００３３】
斯くして調製された本発明リポソームは、後記実施例に示すように、極めて優れた癌細胞の増殖阻害作用を有する。特に、コレスタノール配糖体（１）については、そのまま投与した場合には抗腫瘍作用を発揮しづらかった癌細胞に対しても強い抗腫瘍活性を示す。リポソームは、一般にリン脂質二重膜を形成した小胞球であり、薬剤を内部に包み込む形で分散させ、細胞膜との融合により薬剤を細胞内に到達せしめることを目的として作製されるものであることから、薬剤自体の性質はリポソーム化によって変わるものではないと考えられていた。従って、当該コレスタノール配糖体をリポソーム化することにより、当該化合物の抗腫瘍活性が飛躍的に向上したことは、全く意外であった。
かように、当該リポソームを含有する製剤は、配糖体の本来有する抗腫瘍効果をより効率的に発揮せしめる抗癌剤として有用である。
【００３４】
本発明の抗癌剤は、治療部位、治療目的に応じて適宜剤形を選択でき、リポソーム形状の安定性を損う添加剤等の使用がない限り、公知の調製方法に従い、例えば、経口剤、注射剤、坐剤、軟膏剤、貼付剤等とすることができる。
【００３５】
経口用固形製剤を調製する場合は、本発明リポソームに、賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。そのような添加剤としては、当該分野で一般的に使用されるものでよく、例えば、賦形剤としては、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸等を、結合剤としては、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等を、崩壊剤としては乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等を、滑沢剤としては精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール等を、矯味剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等を例示できる。
【００３６】
経口用液体製剤を調製する場合は、本発明リポソームに、矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。この場合矯味剤としては上記に挙げられたもので良く、緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム等が、安定化剤としてはトラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が挙げられる。
【００３７】
注射剤を調製する場合は、本発明リポソームに、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下、筋肉内及び静脈内用注射剤を製造することができる。この場合のｐＨ調節剤及び緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。安定化剤としてはピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸等が挙げられる。局所麻酔剤としては塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等が挙げられる。等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖等が例示できる。
【００３８】
坐剤を調製する場合は、本発明リポソームに公知の製剤用担体、例えば、ポリエチレングリコール、ラノリン、カカオ脂、脂肪酸トリグリセライド等を、更に必要に応じてツイーン（登録商標）のような界面活性剤等を加えた後、常法により製造することができる。
【００３９】
軟膏剤を調製する場合は、本発明リポソームに、通常使用される基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等を必要に応じて配合し、常法により混合、製剤化することができる。基剤としては、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィン等が挙げられ、保存剤としては、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等が挙げられる。
【００４０】
貼付剤を製造する場合は、通常の支持体に前記軟膏、クリーム、ゲル、ペースト等を常法により塗布すれば良い。支持体としては、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布や軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルムあるいは発泡体シートが適当である。
【００４１】
本発明抗癌剤の投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、通常成人１日あたり、コレスタノール配糖体（１）として約０．０１〜２００ｍｇ／Ｋｇ、好適には０．１〜５０ｍｇ／Ｋｇとすれば良く、これを１日一回又は２〜４回程度に分けて投与するのが好ましい。
【実施例】
【００４２】
次に、本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例１ コレスタノール配糖体のリポソーム化
コレスタノール配糖体として、前記式（１）中のＧがＧｌｃＮＡｃβ１，４Ｇａｌである「ＧｌｃＮＡｃβ１，４ＧａｌＣｈｏｌ」、ＧがＦｕｃα１，３Ｇａｌである「Ｆｕｃα１，３ＧａｌＣｈｏｌ」、ＧがＧａｌβである「ＧａｌβＣｈｏｌ」及び比較としてＧがＨである「Ｃｈｏｌ」を用い、これらの２０μｍｏｌ／ｍｌ（クロロホルム／メタノール＝５／１，ｖ／ｖに溶解）溶液を出発物質とした。
１αジパルミトイルフォスファチジルコリン、ステアリルアミン及び上記のコレスタノール配糖体を５２／８／２０（モル比）の割合で７００μｌとなるように混合し、次いで有機溶媒（クロロホルム／メタノール＝２／１，Ｖ／Ｖ）３００μｌ及び蒸留水１ｍｌを添加混合した。その後、ロータリーエヴァポレーターにて有機溶媒を完全に除去した後、凍結乾燥操作を行ない、水分を完全に除去した。該凍結乾燥品は、ＰＢＳ１ｍｌ中に溶解し、超音波処理（１５Ｗ，１５分）を行なうことによりリポソームを粒子径２−４μｍ程度に均一化し、実施例２及び３に供した。
【００４３】
実施例２ ナフタレンメタノール配糖体のリポソーム化
ナフタレンメタノール配糖体として、前記式（２）中のＧがＧｌｃＮａｃβ１，４−Ｇａｌβ１，１−である「ＧｌｃＮＡｃβ１，４Ｇａｌβ１，１ＮＭ」（ＮＭ：ナフタレンメタノール）を用い、コレスタノール配糖体のリポソーム化と同様の条件にてリポソーム化を行なった。
【００４４】
実施例３ セラミド配糖体のリポソーム化
セラミド配糖体として、前記式（３）中のＧがＧｌｃＮａｃβ１，３−Ｇａｌβ１，４−Ｇｌｃ−である「ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃβ１，１Ｃｅｒａｍｉｄｅ」を用い、コレスタノール配糖体のリポソーム化と同様の方法にてリポソーム化を行なった。但し、該リポソーム化の場合は安定化剤としてコレステロールを添加した。
【００４５】
実施例４ リポソーム化コレスタノール配糖体による細胞増殖阻害効果
培養癌細胞株（ｃｏｌｏｎ２６ ｗｉｌｄ）を９６穴プレートに、１×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ｗｅｌｌとなるように幡種した後、コレスタノール配糖体（ＧｌｃＮＡｃβ１，４ＧａｌＣｈｏｌ、Ｆｕｃα１，３ＧａｌＣｈｏｌ、ＧａｌβＣｈｏｌ、Ｃｈｏｌ）及び実施例１で得られたリポソーム化コレスタノール配糖体を添加し、３日間３７℃にてインキュベートした。その後、ＭＴＴアッセイを行ない細胞数を決定した。なお、増殖抑制率は以下の式に従って求めた。
【００４６】
細胞増殖阻害率（ＣＰＩ率）（％）
＝（１＝処理細胞におけるＯＤ／未処理細胞におけるＯＤ）×１００
【００４７】
その結果、単独ではほとんど効果を示さなかったＦｕｃα１，３ＧａｌＣｈｏｌは、リポソーム化することによって著しい細胞増殖抑制効果を示した。また、従来より細胞増殖阻害効果を示していたＧｌｃＮＡｃβ１，４ＧａｌＣｈｏｌは、リポソーム化することにより更に強い細胞増殖阻害効果を示すことが判明した（図１、２及び３）。
【００４８】
実施例５ リポソーム化ナフタレンメタノール配糖体及びリポソーム化セラミド配糖体による細胞増殖阻害効果
培養癌細胞株（ｃｏｌｏ２０１）を９６穴プレートに、１Ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ｗｅｌｌとなるように播種した後、実施例２及び３で得られたリポソーム化ナフタレンメタノール配糖体およびリポソーム化セラミド配糖体を添加し、３日間３７℃にてインキュベートした。その後、ＭＴＴアッセイを行ない細胞数を決定した。なお、増殖抑制率は実施例４にと同様にして求めた。
その結果、単独では不溶性のため殆ど効果を示さないＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１ＮＭおよびＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃβ１，１Ｃｅｒａｍｉｄｅが、リポソーム化することによって著しい細胞増殖阻害効果を示すことが判明した（図４）。
【００４９】
実施例６ リポソーム化コレスタノール配糖体による腹膜播腫抑制効果
（１）リポソーム化Ｆｕｃα１，３ＧａｌＣｈｏｌの粒子径による影響
Ｂａｌｂ／ｃマウス（８週齢、雌）に対し、癌細胞株（ｃｏｌｏｎ２６ ｗｉｌｄ，５×１０４ｃｅｌｌｓ／２００μｌ）を腹空内投与した。次いで、１２時間、２４時間及び４８時間後に異なる超音波処理時間（１５Ｗ×５，１０，１５分）により調製したリポソーム化Ｆｕｃα１，３ＧａｌＣｈｏｌ（２μｍｏｌ／１００μｌ）を腹腔内投与した。１０日後、腸間膜における腫瘍数を測定した。超音波処理時間を長くしリポソーム粒子径を小さくするほど、腹膜播腫抑制効果示すことが判明した（図５）。
【００５０】
（２）リポソーム化ＧｌｃＮＡｃβ１，４ＧａｌＣｈｏｌの腹膜播腫抑制効果
Ｂａｌｂ／ｃマウス（８週齢、雌）に対し、癌細胞株（ｃｏｌｏｎ２６ ｗｉｌｄ，５×１０４ｃｅｌｌｓ／２００μｌ）を腹腔内投与した。次いで、２４時間及び４８時間後、超音波処理（１５Ｗ、１５分間）により調製したリポソーム化ＧｌｃＮＡｃβ１，４ＧａｌＣｈｏｌ（２μｍｏｌ／１００μｌ）を腹腔内投与した。１０日後、腸間膜における腫瘍数を、２１日後に大網及び腸間膜において形成した腫瘍重量を測定した。その結果、リポソーム化ＧｌｃＮＡｃβ１，４ＧａｌＣｈｏｌ投与により良好な腹膜播腫抑制効果を示すことが判明した（図６及び７）。
【００５１】
（３）リポソーム化ＦｕｃＧａｌＣｈｏｌ及びＦｕｃＧａｌＣｈｏｌ単独投与での腹膜播種抑制効果の比較
Ｂａｌｂ／ｃマウス（８週齢、雌）に対し、癌細胞株（ｃｏｌｏｎ２６ ｗｉｌｄ，５×１０４ｃｅｌｌｓ／２００μｌ）を腹腔内投与した。次いで、０、２４及び４８時間後に超音波処理（１５Ｗ、１５分間）により調製したリポソーム化ＦｕｃＧａｌＣｈｏｌ及びＦｕｃＧａｌＣｈｏｌの腹腔内投与を行った（いずれも２μｍｏｌ／１００μｌ）。１０日後、腸間膜に形成された腫瘍数を測定した。
その結果、無処理、ＦｕｃＧａｌＣｈｏｌ投与群に比べて、リポソーム化ＦｕｃＧａｌＣｈｏｌ投与群では、腫瘍の形成が強く抑制されていることが判明した（図８）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗腫瘍活性を有し、糖としてＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−、ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−、Ｆｕｃ−Ｇａｌ−、Ｇａｌ−Ｇｌｃ又はＧａｌ−を有するリポソーム化可能な疎水性化合物の配糖体、リン脂質及び正電荷供与物質を含有するリポソーム。
【請求項２】
下記の式（１）〜（３）：
【化１】
［式中、ＧはＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−、ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−、Ｆｕｃ−Ｇａｌ−、Ｇａｌ−Ｇｌｃ−又はＧａｌ−を示し、ｎは１２〜２６の整数を示す。］
から選ばれる配糖体、リン脂質及び正電荷供与物質を含有するリポソーム。
【請求項３】
正電荷供与物質が、脂肪族アミンである請求項１又は２に記載のリポソーム。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載のリポソームを含有する抗癌剤。
【請求項１】
抗腫瘍活性を有し、糖としてＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−、ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−、Ｆｕｃ−Ｇａｌ−、Ｇａｌ−Ｇｌｃ又はＧａｌ−を有するリポソーム化可能な疎水性化合物の配糖体、リン脂質及び正電荷供与物質を含有するリポソーム。
【請求項２】
下記の式（１）〜（３）：
【化１】
［式中、ＧはＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−、ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−、Ｆｕｃ−Ｇａｌ−、Ｇａｌ−Ｇｌｃ−又はＧａｌ−を示し、ｎは１２〜２６の整数を示す。］
から選ばれる配糖体、リン脂質及び正電荷供与物質を含有するリポソーム。
【請求項３】
正電荷供与物質が、脂肪族アミンである請求項１又は２に記載のリポソーム。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載のリポソームを含有する抗癌剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００７１７２
【国際公開日】平成１７年１月２７日（２００５．１．２７）
【発行日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１１８４０（Ｐ２００５−５１１８４０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１０１０３
【国際出願日】平成１６年７月１５日（２００４．７．１５）
【出願人】（０００２０６９５６）大塚製薬株式会社 (230)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年１月２７日（２００５．１．２７）
【発行日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１０１０３
【国際出願日】平成１６年７月１５日（２００４．７．１５）
【出願人】（０００２０６９５６）大塚製薬株式会社 (230)
【Ｆターム（参考）】
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