酵母におけるアセチルＣｏＡを経由する代謝経路を利用した物質の製造法
【課題】アセチルＣｏＡを経由する代謝産物を高生産し得る酵母菌株の提供。
【解決手段】以下の酵素：（ａ）アセチルＣｏＡ合成酵素（ＡＣＳ）；および（ｂ）アセチルＣｏＡアセチル基転移酵素（ＥＲＧ１０）の活性が増強されている、酵母菌株。
【解決手段】以下の酵素：（ａ）アセチルＣｏＡ合成酵素（ＡＣＳ）；および（ｂ）アセチルＣｏＡアセチル基転移酵素（ＥＲＧ１０）の活性が増強されている、酵母菌株。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
技術分野
本発明は、酵母において、アセチルＣｏＡを経由する代謝経路を利用した物質の製造方法に関する。
【０００２】
背景技術
深刻化する環境問題を背景に、バイオ燃料が石油の代替燃料として注目を集めている。エタノールはバイオ燃料としてよく知られているが、ガソリンより低いエネルギー密度しか有さないこと、輸送燃料として機能させるためには限られた濃度範囲でガソリンと混合する必要があることから、燃料としての欠点も多い。イソプロパノールは、１−ブタノールよりも高いオクタン価を有し、また、工業原料としても利用される汎用性の高い溶剤である。イソプロパノールは、ナフサ由来のプロピレンの水和によって製造されており、再生可能な供給源から商業的に生産されたことはない。
【０００３】
微生物によるアセトンやブタノールの発酵生産は、２０世紀初頭に産業的に行われていた。絶対嫌気性菌のある種のクロストリジウム属細菌はアセトンとブタノールを同時に生産することができる（アセトン・ブタノール発酵）。アセトンは細菌細胞内に存在するアセチルＣｏＡを原料として生産される。アセチルＣｏＡは、アセチルＣｏＡアセチル基転移酵素（チオラーゼ）によってアセトアセチルＣｏＡに変換され、さらにＣｏＡ転移酵素によってアセト酢酸に変換され、さらにアセト酢酸脱炭酸酵素によってアセトンへと変換される。ある種のクロストリジウム属細菌はさらに二級アルコールの脱水素酵素を有し、アセトンからイソプロパノールを生産する。Ｃｈｅｎらは、クロストリジウム・ベイジェリンキを含む５２株のクロストリジウム属細菌の中で、最大で３０ｍＭ（１．８ｇ／Ｌ）のイソプロパノールを生産する株が存在したことを報告している（非特許文献１：Chen, J.-S., and S. F. Hiu. Acetone-butanol-isopropanol production by Clostridium beijerinckii (synonym, Clostridium butylicum). Biotechnol. Lett. 1986. 8:371-376）。また、最近になってＨａｎａｉらおよびＪｏｊｉｍａらは、大腸菌にクロストリジウム属由来のＣｏＡ転移酵素、アセト酢酸脱炭酸酵素、二級アルコール脱水素酵素を導入し、内在性のアセチルＣｏＡアセチル基転移酵素を過剰発現させることによってイソプロパノールを効率的に生産できる大腸菌株を報告している（非特許文献２：T. Hanai, S. Atsumi, and J. C. Liao. Engineered Synthetic Pathway for Isopropanol Production in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol, Dec. 2007, p. 7814-7818；非特許文献３：Toru Jojima & Masayuki Inui & Hideaki Yukawa. Production of isopropanol by metabolically engineered Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol 2008 77:1219-1224）。しかしながら、大腸菌は、糖耐性、浸透圧耐性、塩耐性、有機溶剤耐性など各種ストレス耐性はあまり高くないことが多く、ファージ汚染によるリスクもある。また、イソプロパノール耐性が低いことは生産物による発酵の阻害が起こることを意味する。発酵阻害を回避するためにガスストリッピング法などを用いて生産物を培地から除去しながら発酵を続ける方法が知られているが、該方法の使用は発酵生産の工程を煩雑化させるだけでなく、コスト増加につながる。これらの問題を解決するための一つの手段として、高い有機溶剤耐性を有する微生物を用いてイソプロパノール生産をすることが考えられる。
【０００４】
単細胞真核微生物である酵母は高い有機溶剤耐性を示し、また、大腸菌などの微生物と同様に、培養設備、培養時間および培養コストの面で高等生物の細胞よりも安価に培養することができるという特徴を有する。特に、出芽酵母はビールやワインなどの酒類やパンの製造に用いられ、その食品としての安全性が確認されている。
【０００５】
酵母でイソプロパノールを生産するためには、その酵母菌株に、外因性のＣｏＡ転移酵素、アセト酢酸脱炭酸酵素、および二級アルコール脱水素酵素を導入する必要がある。これまで、酵母によるイソプロパノールの製造例としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）にイソプロピルアルコール生産酵素群の遺伝子を導入し、この形質転換体を培養することによりイソプロパノールを製造したことが報告されている（特許文献１：特開２０１１−９７９２９号公報）。しかし、この方法によるイソプロパノールの生産量は、培養液中の濃度として１００ｍｇ／Ｌ前後という少量に過ぎない。酵母は真核生物であり、オルガネラが存在することから、イソプロパノール合成の基質であるアセチルＣｏＡを細胞質に供給する経路が複数存在している。どの経路からアセチルＣｏＡを細胞質に供給することがイソプロパノール合成にとって有利であるのか、あるいはどのような酵母がそういった能力に優れているか、これまでに調査された例はない。
【０００６】
キャンディダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびサッカロマイセス・フラジリス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）と同様に、ＦＤＡ（米国連邦食品医薬品局）によって食用酵母として認定されており、食品添加物として安全に使用できることが認められている食用酵母である。実際に、現在でも、キャンディダ・ユティリスは、日本をはじめとして、ドイツやアメリカなど世界各国で生産され、食飼料として利用されている。また、キャンディダ・ユティリスは、ペントースの資化による菌体生産、エチルアセテート、Ｌ−グルタミン酸、グルタチオン、インベルターゼなどの生産株として広く産業界で利用されてきた。近年、キャンディダ・ユティリスにおいても形質転換法が開発され、様々な化合物が代謝工学的に生産される技術が開発されている（非特許文献４：Hiroshi Shimada, Keiji Kondo, Paul D. Fraser, Yutaka Miura, Toshiko Saito, and Norihiko Misawa., Increased Carotenoid Production by the Food Yeast Candida utilis through Metabolic Engineering of the Isoprenoid Pathway., Appl Environ Microbiol, July 1998, p. 2676-2680, Vol. 64, No. 7；非特許文献５：Yutaka Miura, Keiji Kondo, Toshiko Saito, Hiroshi Shimada, Paul D. Fraser, and Norihiko MisawaProduction of the Carotenoids Lycopene, β-Carotene, and Astaxanthin in the Food Yeast Candida utilis., Appl Environ Microbiol, April 1998, p. 1226-1229, Vol. 64, No. 4；非特許文献６：Keiji Kondo,, Yutaka Miura, Hidetaka Sone, Kazuo Kobayashi & Hiroshi lijima., High-level expression of a sweet protein, monellin, in the food yeast Candida utilis., Nature Biotechnology 15, 453 - 457 (1997)；非特許文献７：Yutaka Miura, Keiji Kondo, Hiroshi Shimada, Toshiko Saito, Katsumi Nakamura, Norihiko Misawa., Production of lycopene by the food yeast, Candida utilis that does not naturally synthesize carotenoid., Biotechnology and Bioengineering Volume 58 Issue 2-3, Pages 306-308；非特許文献８：Shigehito IKUSHIMA, Toshio FUJII, Osamu KOBAYASHI, Satoshi YOSHIDA and Aruto YOSHIDA., Genetic Engineering of Candida utilis Yeast for Efficient Production of L-Lactic Acid., Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry Vol. 73 (2009) , No. 8 pp.1818-1824；非特許文献９：Yi-Ren Hong, Ya-Lei Chen, Lynn Farh, Wen-Jen Yang, Chen-Hua Liao and David Shiuan.,Recombinant Candida utilis for the production of biotin., Applied Microbiology and Biotechnology.,Volume 71(2006), Number 2, 211-221）。また、キャンディダ・ユティリスは、サッカロマイセス属とは異なり、クラブツリー（Ｃｒａｂｔｒｅｅ）効果陰性酵母であることから、グルコース存在下でも呼吸活性が低下しない。これにより、十分に通気を行う条件を採用することにより、エタノールの生成を抑えることができる。さらに、キャンディダ・ユティリスは呼吸活性も高く、一旦生成したエタノールも速やかに再同化されることから、効率的な菌体や代謝産物の生産を可能とする。
【０００７】
酵母でイソプロパノールのような物質を生産する場合、一般に、副産物としてのエタノールの生成が問題となる。このエタノール副生を抑制するために、エタノール生産の重要酵素であるピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（ＰＤＣ）を欠損させる取り組みがなされている（特許文献２：国際公開第２０１０／０９５７５１号パンフレット；特許文献３：国際公開第２０１０／０９５７５０号パンフレット；非特許文献１０：Flikweert MT, Van Der Zanden L, Janssen WM, et al. Pyruvate decarboxylase: an indispensable enzyme for growth of Saccharomyces cerevisiae on glucose. Yeast 12(1996): 247-257；非特許文献１１：van Maris AJA, Winkler AA, Porro D, et al. Homofermentative lactate production cannot sustain anaerobic growth of engineered Saccharomyces cerevisiae: Possible consequence of energy-dependent lactate export. Appl Environ Microbiol 70(2004): 2898-2905）。
【０００８】
【非特許文献１】Chen, J.-S., and S. F. Hiu. Acetone-butanol-isopropanol production by Clostridium beijerinckii (synonym, Clostridium butylicum). Biotechnol. Lett. 1986. 8:371-376
【非特許文献２】T. Hanai, S. Atsumi, and J. C. Liao. Engineered Synthetic Pathway for Isopropanol Production in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol, Dec. 2007, p. 7814-7818
【非特許文献３】Toru Jojima & Masayuki Inui & Hideaki Yukawa. Production of isopropanol by metabolically engineered Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol 2008 77:1219-1224
【非特許文献４】Hiroshi Shimada, Keiji Kondo, Paul D. Fraser, Yutaka Miura, Toshiko Saito, and Norihiko Misawa., Increased Carotenoid Production by the Food Yeast Candida utilis through Metabolic Engineering of the Isoprenoid Pathway., Appl Environ Microbiol, July 1998, p. 2676-2680, Vol. 64, No. 7
【非特許文献５】Yutaka Miura, Keiji Kondo, Toshiko Saito, Hiroshi Shimada, Paul D. Fraser, and Norihiko MisawaProduction of the Carotenoids Lycopene, β-Carotene, and Astaxanthin in the Food Yeast Candida utilis., Appl Environ Microbiol, April 1998, p. 1226-1229, Vol. 64, No. 4
【非特許文献６】Keiji Kondo,, Yutaka Miura, Hidetaka Sone, Kazuo Kobayashi & Hiroshi lijima., High-level expression of a sweet protein, monellin, in the food yeast Candida utilis., Nature Biotechnology 15, 453 - 457 (1997)
【非特許文献７】Yutaka Miura, Keiji Kondo, Hiroshi Shimada, Toshiko Saito, Katsumi Nakamura, Norihiko Misawa., Production of lycopene by the food yeast, Candida utilis that does not naturally synthesize carotenoid., Biotechnology and Bioengineering Volume 58 Issue 2-3, Pages 306-308
【非特許文献８】Shigehito IKUSHIMA, Toshio FUJII, Osamu KOBAYASHI, Satoshi YOSHIDA and Aruto YOSHIDA., Genetic Engineering of Candida utilis Yeast for Efficient Production of L-Lactic Acid., Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry Vol. 73 (2009) , No. 8 pp.1818-1824
【非特許文献９】Yi-Ren Hong, Ya-Lei Chen, Lynn Farh, Wen-Jen Yang, Chen-Hua Liao and David Shiuan.,Recombinant Candida utilis for the production of biotin., Applied Microbiology and Biotechnology.,Volume 71(2006), Number 2, 211-221
【非特許文献１０】Flikweert MT, Van Der Zanden L, Janssen WM, et al. Pyruvate decarboxylase: an indispensable enzyme for growth of Saccharomyces cerevisiae on glucose. Yeast 12(1996): 247-257
【非特許文献１１】van Maris AJA, Winkler AA, Porro D, et al. Homofermentative lactate production cannot sustain anaerobic growth of engineered Saccharomyces cerevisiae: Possible consequence of energy-dependent lactate export. Appl Environ Microbiol 70(2004): 2898-2905
【特許文献１】特開２０１１−９７９２９号公報
【特許文献２】国際公開第２０１０／０９５７５１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２０１０／０９５７５０号パンフレット
【発明の概要】
【０００９】
本発明者らは、酵母におけるアセチルＣｏＡ合成酵素（ＡＣＳ）およびアセチルＣｏＡアセチル基転移酵素（ＥＲＧ１０）の活性を増強することにより、酵母内におけるアセチルＣｏＡを経由する物質の生産量が顕著に増加することを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
【００１０】
従って、本発明の目的は、様々な物質の発酵生産において中間物質として関与するアセチルＣｏＡならびにアセトアセチルＣｏＡの合成・代謝に係る酵素活性が増強された酵母菌株、ならびに該酵母菌株を用いた物質の製造法を提供することにある。
【００１１】
そして、本発明による酵母菌株は、以下の酵素：
（ａ）アセチルＣｏＡ合成酵素（ＡＣＳ）；および
（ｂ）アセチルＣｏＡアセチル基転移酵素（ＥＲＧ１０）
の活性が増強されている酵母菌株である。
【００１２】
さらに、本発明による製造法は、本発明による酵母菌株を培養することを含んでなる、物質を製造する方法である。
【００１３】
本発明によれば、アセチルＣｏＡやアセトアセチルＣｏＡが関与する酵母の代謝経路が活性化される。アセチルＣｏＡやアセトアセチルＣｏＡが関与する代謝経路は多岐にわたるため、生成する代謝産物も多種多様である。従って、本発明によれば、酵母菌株の培養によって様々な物質を高効率で製造することが可能となる。また、製造しようとする物質に応じて、必要な酵素の遺伝子を発現可能な形で酵母に組み込み、得られた酵母菌株を培養することによりその物質を製造することも可能である。
【発明の具体的説明】
【００１４】
本発明による酵母菌株では、以下の遺伝子：（ａ）アセチルＣｏＡ合成酵素（ＡＣＳ）の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；および（ｂ）アセチルＣｏＡアセチル基転移酵素（ＥＲＧ１０）の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現が増強されている。
【００１５】
本明細書では、上記のアセチルＣｏＡ合成酵素（ＡＣＳ）遺伝子およびアセチルＣｏＡアセチル基転移酵素（ＥＲＧ１０）遺伝子とともに、イソプロパノールを合成するための４つの遺伝子を過剰発現する酵母菌株を作製し、これを培養することにより、極めて高濃度のイソプロパノールが生産されることが実証されている。この酵母菌株におけるイソプロパノール生産の経路は図１に示す通りである。図１に示される経路から、イソプロパノールの高い生産量が、アセチルＣｏＡおよびアセトアセチルＣｏＡの合成・代謝に係る酵素活性の増強に起因することは明らかである。従って、本発明によって、イソプロパノールのみならず、アセチルＣｏＡおよびアセトアセチルＣｏＡを経由する様々な物質を高生産することができる。また、図１に示されるように、ＡＣＳおよびＥＲＧ１０は細胞質において機能する酵素である。
【００１６】
細胞質に供給されるアセチルＣｏＡは、フラボノイド骨格を有する化合物、テルぺノイド骨格を有する化合物、ステロール骨格を有する化合物、脂肪酸など、様々な有用な二次代謝物質の基幹物質である。よって、酵母菌株が天然の状態もしくは人為的に遺伝子を改変された状態でこれらの二次代謝産物の合成経路を有していれば、本発明の方法によりこれらの物質を高生産させることができる。
【００１７】
一般的に、微生物による物質生産を行う際には、副産物生産を抑制する取り組みがなされる場合が多い。例えば、酵母において物質を生産する場合、一般に、副産物としてのエタノールの生成を抑制するために、エタノール生産に関与する酵素遺伝子、例えばピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（ＰＤＣ）を欠損させる取り組みがなされている（国際公開第２０１０／０９５７５１号パンフレット；国際公開第２０１０／０９５７５０号パンフレット；Flikweert MT, Van Der Zanden L, Janssen WM, et al. Pyruvate decarboxylase: an indispensable enzyme for growth of Saccharomyces cerevisiae on glucose. Yeast 12(1996): 247-257；van Maris AJA, Winkler AA, Porro D, et al. Homofermentative lactate production cannot sustain anaerobic growth of engineered Saccharomyces cerevisiae: Possible consequence of energy-dependent lactate export. Appl Environ Microbiol 70(2004): 2898-2905）。しかし、本明細書では、上記のＰＤＣを欠損させた酵母菌株よりも、ＰＤＣを欠損させなかった酵母菌株の方が顕著に高いイソプロパノール生産量を示すことが実証されている。よって、本発明による酵母菌株は、ＰＤＣなどのエタノール生産に関与する酵素遺伝子を欠失させずにそのまま維持していることも特徴の一つであり、これによりイソプロパノール生産量、ひいてはアセチルＣｏＡやその代謝産物であるアセトアセチルＣｏＡの生産量が顕著に向上することは、驚くべきことである。
【００１８】
本明細書において酵素活性が「増強されている」とは、培養過程の少なくとも一時期において、活性増強のための手段を施されていない酵母と比較してより強い酵素活性が観察されることを意味する。酵素活性の増強は、当該酵素遺伝子の発現を増強すること、あるいは比活性のより高い酵素遺伝子への置き換えや、タンパク質工学的な方法による酵素遺伝子の改変によって実現することができる。本明細書において遺伝子の発現が「増強されている」とは、酵母の遺伝的改変により該酵母におけるその遺伝子の発現量が増加すること、つまり、その遺伝子を過剰発現させることを意味する。このような遺伝的改変の方法としては、例えば、その遺伝子により酵母を形質転換する方法（つまり、その遺伝子を発現し得る形で酵母にトランスフェクトする方法）、その酵母のゲノム上に存在する遺伝子のプロモーター活性を強化する方法、その酵母のゲノム上に存在する遺伝子のプロモーターを他のプロモーターと置換することにより該遺伝子の発現を増強する方法など、様々な方法が知られているが、好ましくはその遺伝子により酵母を形質転換する方法とされる。
【００１９】
酵母
本発明による酵母菌株は、特定の遺伝子が過剰発現するように遺伝的に改変された酵母である。遺伝的改変に用いる酵母は、アセチルＣｏＡまたはアセトアセチルＣｏＡを経由する代謝経路を有する酵母であればよく、特に制限されないが、好ましくは呼吸活性の高いクラブツリー効果陰性酵母とされ、より好ましくはクラブトゥリー陰性酵母であるキャンディダ・ユティリスとされる。キャンディダ・ユティリスの菌株は当技術分野において公知の様々な株、例えば、ＮＢＲＣ０３９６株、ＮＢＲＣ０６１９株、ＮＢＲＣ０９８８株、ＮＢＲＣ０６３９株、ＮＢＲＣ０６２６株、ＮＢＲＣ１０８６株、ＮＢＲＣ１０７０７株、ＡＴＣＣ９２５５株、ＡＴＣＣ２８９５５株、ＡＴＣＣ４４６３８株、ＡＴＣＣ９２０６株、ＡＴＣＣ９６６２１株、ＡＴＣＣ１８２０１株、およびＡＴＣＣ１５２３９株等であってよいが、好ましくはＮＢＲＣ１０８６株、ＡＴＣＣ９２５５株またはＡＴＣＣ１５２３９株とされる。
【００２０】
活性が増強される酵素およびその遺伝子
本発明による酵母菌株において活性が増強される酵素は、以下の酵素：（ａ）アセチルＣｏＡ合成酵素（ＡＣＳ）；および（ｂ）アセチルＣｏＡアセチル基転移酵素（ＥＲＧ１０）である。本発明の好ましい実施態様によれば、本発明による酵母菌株においてはこれら２種類の酵素の遺伝子が過剰発現され、すなわち、以下の遺伝子：（ａ）アセチルＣｏＡ合成酵素（ＡＣＳ）の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；および（ｂ）アセチルＣｏＡアセチル基転移酵素（ＥＲＧ１０）の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現が増強されている。
【００２１】
本発明による酵母菌株では、さらに、以下の遺伝子：（ｃ）ＡＴＰ−クエン酸除去付加酵素（ＡＣＬ）の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；（ｄ）ミトコンドリア内膜カルニチン輸送体（ＣＲＣ１）の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；および（ｅ）カルニチンアセチル転移酵素遺伝子（ＹＡＴ１）の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子からなる群から選択される少なくとも一種の遺伝子の発現が増強されていてもよく、好ましくはこれら（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）の全ての遺伝子の発現が増強される。
【００２２】
これらの酵素および遺伝子は様々な酵母に由来するものが知られており、その起源は特に制限されない。これらの酵素および遺伝子は、育種に用いられる酵母の内在性遺伝子およびその発現産物であってよく、あるいは、育種に用いられる酵母以外の他の酵母に由来するものであってもよい。例えば、これらの酵素および遺伝子は、それぞれ独立に、キャンディダ・ユティリスまたはヤロウィア・リポリティカに由来するものとすることができる。それぞれの酵素の起源としては、例えば、アセチルＣｏＡ合成酵素（ＡＣＳ）はキャンディダ・ユティリス酵母、アセチルＣｏＡアセチル基転移酵素（ＥＲＧ１０）はキャンディダ・ユティリス酵母、ミトコンドリア内膜カルニチン輸送体（ＣＲＣ１）はキャンディダ・ユティリス酵母、カルニチンアセチル転移酵素遺伝子（ＹＡＴ１）はキャンディダ・ユティリス酵母、ＡＴＰ−クエン酸除去付加酵素（ＡＣＬ）はヤロウィア・リポリティカ酵母（ヤロウィア・リポリティカ由来のＡＣＬ１とＡＣＬＹがサブユニットを構成する遺伝子）が好ましい。
【００２３】
キャンディダ・ユティリス由来のアセチルＣｏＡ合成酵素（ＡＣＳ）遺伝子には、ＡＣＳ１遺伝子とＡＣＳ２遺伝子がある。ＡＣＳ１遺伝子のコード配列は配列番号１１で表され、コードされるアミノ酸配列は配列番号１２で表される。ＡＣＳ２遺伝子のコード配列は配列番号１３で表され、コードされるアミノ酸配列は配列番号１４で表される。アセチルＣｏＡ合成酵素（ＡＣＳ）は、酢酸をアセチルＣｏＡに変換する酵素である。本発明に用いられるＡＣＳ遺伝子はＡＣＳ１およびＡＣＳ２のいずれであってもよいが、好ましくはＡＣＳ２とされる。また、アセチルＣｏＡ合成酵素（ＡＣＳ）の活性を有するポリペプチドは、配列番号１２または配列番号１４で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＡＣＳ活性を有するポリペプチドであってもよい。
【００２４】
キャンディダ・ユティリス由来のアセチルＣｏＡアセチル基転移酵素（ＥＲＧ１０）遺伝子のコード配列は配列番号６１で表され、コードされるアミノ酸配列は配列番号６２で表される。アセチルＣｏＡアセチル基転移酵素（ＥＲＧ１０）は、アセチルＣｏＡをアセトアセチルＣｏＡに変換する酵素である。また、アセチルＣｏＡアセチル基転移酵素（ＥＲＧ１０）の活性を有するポリペプチドは、配列番号６２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＥＲＧ１０活性を有するポリペプチドであってもよい。
【００２５】
ヤロウィア・リポリティカ由来のＡＣＬ１遺伝子のコード配列は配列番号３１で表され、コードされるアミノ酸配列は配列番号３２で表される。また、ＡＣＬ１の活性を有するポリペプチドは、配列番号３２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＡＣＬ１活性を有するポリペプチドであってもよい。さらに、ヤロウィア・リポリティカ由来のＡＣＬＹ遺伝子のコード配列は配列番号３３で表され、コードされるアミノ酸配列は配列番号３４で表される。また、ＡＣＬＹの活性を有するポリペプチドは、配列番号３４で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＡＣＬＹ活性を有するポリペプチドであってもよい。これらのＡＣＬ１とＡＣＬＹをサブユニットとするＡＴＰ−クエン酸除去付加酵素（ＡＣＬ）は、クエン酸をアセチルＣｏＡに変換する酵素である。
【００２６】
キャンディダ・ユティリス由来のミトコンドリア内膜カルニチン輸送体（ＣＲＣ１）遺伝子のコード配列は配列番号２３で表され、コードされるアミノ酸配列は配列番号２４で表される。ミトコンドリア内膜カルニチン輸送体（ＣＲＣ１）は、アセチルカルニチンをミトコンドリアから細胞質へ輸送する酵素である。また、ミトコンドリア内膜カルニチン輸送体（ＣＲＣ１）の活性を有するポリペプチドは、配列番号２４で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＣＲＣ１活性を有するポリペプチドであってもよい。
【００２７】
キャンディダ・ユティリス由来のカルニチンアセチル転移酵素遺伝子（ＹＡＴ１）遺伝子のコード配列は配列番号２７で表され、コードされるアミノ酸配列は配列番号２８で表される。カルニチンアセチル転移酵素遺伝子（ＹＡＴ１）は、アセチルカルニチンをアセチルＣｏＡに変換する酵素である。また、カルニチンアセチル転移酵素遺伝子（ＹＡＴ１）の活性を有するポリペプチドは、配列番号２８で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＹＡＴ１活性を有するポリペプチドであってもよい。
【００２８】
アミノ酸の欠失、置換、付加、又は挿入は、上記ポリペプチドをコードする遺伝子を、当技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法又はＧａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（タカラバイオ社）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（タカラバイオ社）などを用いて、あるいは、タカラバイオ社のＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキット、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）などを用いて変異を導入することができる。上記の各酵素の活性は、当技術分野において公知の手法により確認することができる。
【００２９】
上記の遺伝子に代えて、それぞれの同等物を用いることもできる。この同等物は、それぞれの遺伝子と同等の機能を有することを条件に、一部のヌクレオチド残基が異なる遺伝子を意味する。このような同等物としては、それぞれのヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性（配列同一性）があり、かつ各酵素の活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子が挙げられる。前記同等物としてはさらに、それぞれのヌクレオチド配列もしくはその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ各酵素の活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子が挙げられる。前記同等物としてはさらに、それぞれのヌクレオチド配列において１もしくは数個のヌクレオチド残基が欠失、置換、付加、または挿入された配列を含み、かつ各酵素の活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子が挙げられる。
【００３０】
ここで、ヌクレオチド残基の欠失、置換、付加、又は挿入は、上記配列を含む遺伝子を、当技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法又はＧａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キットを用いればよい。例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（タカラバイオ社）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（タカラバイオ社）などを用いて、あるいは、タカラバイオ社のＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキット、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）などを用いて変異を導入することができる。各酵素の活性は、当技術分野において公知の手法により確認することができる。
【００３１】
相同性（配列同一性）を示す数値（％）は、塩基配列比較用プログラム：例えばＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ７．０．０を用いて、デフォルト（初期設定）のパラメーターにより算出されるものである。すなわち、酵母染色体上の各遺伝子が、同一ではないが同等の機能、すなわち各活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子によって相同組換え等を介して置換されていてもよい。各酵素の活性は、当技術分野において公知の手法により確認することができる。
【００３２】
ストリンジェントな条件とは、例えば、Ｒａｐｉｄ−Ｈｙｂ Ｂｕｆｆｅｒ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用い、温度条件を好ましくは４０〜７０℃、より好ましくは６０℃として、その他は添付のプロトコールに従って行うハイブリダイゼーション条件である。その後、例えば当業者に公知の一般的な方法を用い、２×ＳＳＣと０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳから成り立つ溶液での５分間の洗浄、続いて１×ＳＳＣと０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳから成り立つ溶液での１０分間の洗浄、さらに０．１×ＳＳＣと０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳから成り立つ溶液での１０分間の洗浄を行うことを指す。ただしハイブリダイゼーション時の温度条件や、その後のメンブレンの洗浄に用いる溶液の塩濃度等の条件を適宜設定することにより、ある一定（７０％、８０％、８５％、９０％、９５％のいずれか）以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡをクローニングできる。そのようにして得られる遺伝子が、配列上は同一ではないが同等の機能、すなわち各活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子によって相同組換え等を介して置換されていてもよい。各酵素の活性は、当技術分野において公知の手法により確認することができる。
【００３３】
有用物質を合成するための遺伝子
本発明による酵母菌株は、所望の有用物質の製造に用いるために、該物質の生産に必要となる遺伝子で形質転換されていてもよい。例えば、本発明の方法によってアセチルＣｏＡを経由する代謝産物を製造するために、本発明による酵母菌株は、アセチルＣｏＡを経由する代謝産物を合成するための遺伝子により形質転換されていてもよい。必要な遺伝子は、製造しようとする物質に応じて、当業者であれば適切に選択することができる。
【００３４】
例えば、イソプロパノールを製造しようとする場合には、さらなる遺伝的改変として、イソプロパノール合成遺伝子で酵母菌株を形質転換することができる。イソプロパノール合成遺伝子としては、特開２０１１−９７９２９号公報に記載の酵素遺伝子群など、当業者に公知の遺伝子を用いることができ、例えば、ＣｏＡ基転移酵素サブユニットＡ（ｃｔｆＡ）、同サブユニットＢ（ｃｔｆＢ）、アセト酢酸脱炭酸酵素（ａｄｃ）および二級アルコール脱水素酵素（ｓａｄｈ）の４つの遺伝子の組み合わせを用いることができる。
【００３５】
本発明の一つの実施態様によれば、本発明による酵母菌株は、さらなる遺伝的改変として、ＣｏＡ基転移酵素サブユニットＡ（ｃｔｆＡ）、ＣｏＡ転移酵素サブユニットＢ（ｃｔｆＢ）、アセト酢酸脱炭酸酵素（ａｄｃ）および二級アルコール脱水素酵素（ｓａｄｈ）の活性を有するポリペプチドをコードしている４種の遺伝子により形質転換されている。このような酵母菌株はイソプロパノールの製造に用いることができ、この製造法は、本実施態様による酵母菌株を培養することを含む。
【００３６】
これらの遺伝子は様々な生物に由来するものが知られており、その起源は特に制限されない。例えば、これらの遺伝子は、それぞれ独立に、クロストリジウム・アセトブチリカムまたはクロストリジウム・ベイジェリンキに由来するものとすることができる。それぞれの酵素の起源としては、例えば、ＣｏＡ転移酵素遺伝子サブユニットＡ（ｃｔｆＡ）および同サブユニットＢ（ｃｔｆＢ）はクロストリジウム・アセトブチリカムが好ましく、アセト酢酸脱炭酸酵素（ａｄｃ）および二級アルコール脱水素酵素（ｓａｄｈ）はクロストリジウム・ベイジェリンキが好ましい。
【００３７】
クロストリジウム・アセトブチリカム由来のＣｏＡ転移酵素サブユニットＡ（ｃｔｆＡ）のアミノ酸配列は配列番号２で表される。ＣｏＡ転移酵素サブユニットＡ（ｃｔｆＡ）は、同サブユニットＢ（ｃｔｆＢ）と一緒になって、アセトアセチルＣｏＡをアセト酢酸に変換する酵素である。配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子配列は、クロストリジウム・アセトブチリカム由来の同遺伝子の配列など、当業者であれば適宜選択することができるため、特に制限されないが、好ましくは本発明による酵母菌株の種において頻度の高いコドンを使用した配列とされる。例えば、キャンディダ・ユティリスにおけるコドン頻度に適合した遺伝子配列としては、配列番号１で表されるヌクレオチド配列が挙げられる。ＣｏＡ転移酵素サブユニットＡ（ｃｔｆＡ）の活性を有するポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつｃｔｆＡ活性を有するポリペプチドであってもよい。
【００３８】
クロストリジウム・アセトブチリカム由来のＣｏＡ転移酵素サブユニットＢ（ｃｔｆＢ）のアミノ酸配列は配列番号４で表される。ＣｏＡ転移酵素サブユニットＢ（ｃｔｆＢ）は、同サブユニットＡ（ｃｔｆＡ）と一緒になって、アセトアセチルＣｏＡをアセト酢酸に変換する酵素である。配列番号４で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子配列は、クロストリジウム・アセトブチリカム由来の同遺伝子の配列など、当業者であれば適宜選択することができるため、特に制限されないが、好ましくは本発明による酵母菌株の種において頻度の高いコドンを使用した配列とされる。例えば、キャンディダ・ユティリスにおけるコドン頻度に適合した遺伝子配列としては、配列番号３で表されるヌクレオチド配列が挙げられる。ＣｏＡ転移酵素サブユニットＢ（ｃｔｆＢ）の活性を有するポリペプチドは、配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつｃｔｆＢ活性を有するポリペプチドであってもよい。
【００３９】
クロストリジウム・ベイジェリンキ由来のアセト酢酸脱炭酸酵素（ａｄｃ）のアミノ酸配列は配列番号６で表される。アセト酢酸脱炭酸酵素（ａｄｃ）は、アセト酢酸をアセトンに変換する酵素である。配列番号６で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子配列は、クロストリジウム・ベイジェリンキ由来の同遺伝子の配列など、当業者であれば適宜選択することができるため、特に制限されないが、好ましくは本発明による酵母菌株の種において頻度の高いコドンを使用した配列とされる。例えば、キャンディダ・ユティリスにおけるコドン頻度に適合した遺伝子配列としては、配列番号５で表されるヌクレオチド配列が挙げられる。アセト酢酸脱炭酸酵素（ａｄｃ）の活性を有するポリペプチドは、配列番号６で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつａｄｃ活性を有するポリペプチドであってもよい。
【００４０】
クロストリジウム・ベイジェリンキ由来の二級アルコール脱水素酵素（ｓａｄｈ）のアミノ酸配列は配列番号８で表される。二級アルコール脱水素酵素（ｓａｄｈ）は、アセトンをイソプロパノールに変換する酵素である。配列番号８で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子配列は、クロストリジウム・ベイジェリンキ由来の同遺伝子の配列など、当業者であれば適宜選択することができるため、特に制限されないが、好ましくは本発明による酵母菌株の種において頻度の高いコドンを使用した配列とされる。例えば、キャンディダ・ユティリスにおけるコドン頻度に適合した遺伝子配列としては、配列番号７で表されるヌクレオチド配列が挙げられる。二級アルコール脱水素酵素（ｓａｄｈ）の活性を有するポリペプチドは、配列番号８で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつｓａｄｈ活性を有するポリペプチドであってもよい。
【００４１】
アミノ酸の欠失、置換、付加、又は挿入は、上記ポリペプチドをコードする遺伝子を、当技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法又はＧａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（タカラバイオ社）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（タカラバイオ社）などを用いて、あるいは、タカラバイオ社のＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキット、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）などを用いて変異を導入することができる。上記の各酵素の活性は、当技術分野において公知の手法により確認することができる。
【００４２】
上記の遺伝子に代えて、それぞれの同等物を用いることもできる。この同等物は、それぞれの遺伝子と同等の機能を有することを条件に、一部のヌクレオチド残基が異なる遺伝子を意味する。このような同等物としては、それぞれのヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性（配列同一性）があり、かつ各酵素の活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子が挙げられる。前記同等物としてはさらに、それぞれのヌクレオチド配列もしくはその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ各酵素の活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子が挙げられる。前記同等物としてはさらに、それぞれのヌクレオチド配列において１もしくは数個のヌクレオチド残基が欠失、置換、付加、または挿入された配列を含み、かつ各酵素の活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子が挙げられる。
【００４３】
ここで、ヌクレオチド残基の欠失、置換、付加、又は挿入は、上記配列を含む遺伝子を、当技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法又はＧａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キットを用いればよい。例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（タカラバイオ社）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（タカラバイオ社）などを用いて、あるいは、タカラバイオ社のＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキット、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）などを用いて変異を導入することができる。各酵素の活性は、当技術分野において公知の手法により確認することができる。
【００４４】
相同性（配列同一性）を示す数値（％）は、塩基配列比較用プログラム：例えばＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ７．０．０を用いて、デフォルト（初期設定）のパラメーターにより算出されるものである。すなわち、酵母染色体上の各遺伝子が、同一ではないが同等の機能、すなわち各活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子によって相同組換え等を介して置換されていてもよい。各酵素の活性は、当技術分野において公知の手法により確認することができる。
【００４５】
ストリンジェントな条件とは、例えば、Ｒａｐｉｄ−Ｈｙｂ Ｂｕｆｆｅｒ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用い、温度条件を好ましくは４０〜７０℃、より好ましくは６０℃として、その他は添付のプロトコールに従って行うハイブリダイゼーション条件である。その後、例えば当業者に公知の一般的な方法を用い、２×ＳＳＣと０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳから成り立つ溶液での５分間の洗浄、続いて１×ＳＳＣと０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳから成り立つ溶液での１０分間の洗浄、さらに０．１×ＳＳＣと０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳから成り立つ溶液での１０分間の洗浄を行うことを指す。ただしハイブリダイゼーション時の温度条件や、その後のメンブレンの洗浄に用いる溶液の塩濃度等の条件を適宜設定することにより、ある一定（７０％、８０％、８５％、９０％、９５％のいずれか）以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡをクローニングできる。そのようにして得られる遺伝子が、配列上は同一ではないが同等の機能、すなわち各活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子によって相同組換え等を介して置換されていてもよい。各酵素の活性は、当技術分野において公知の手法により確認することができる。
【００４６】
イソプロパノール以外にも、リコペンなどの特定のカロテノイド、スクアレンあるいはスクアレンから生産される特定のステロールなどの物質を生産する酵母菌株を構築することが可能である。例えば、Ｅｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａ由来のＧＧＰＰ合成酵素遺伝子、フィトエン合成酵素遺伝子、フィトエン不飽和化酵素遺伝子を発現し、内在性のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子（ＨＭＧ１）を過剰発現するキャンディダ・ユティリスはリコペンを高蓄積することが報告されている（Shimada H, Kondo K, Fraser PD, Miura Y, Saito T, Misawa N. Increased carotenoid production by the food yeast Candida utilis through metabolic engineering of the isoprenoid pathway. Appl Environ Microbiol. 1998 Jul;64(7):2676-80）。また、ザイモステロール-２４-メチルトランスフェラーゼ遺伝子およびエルゴスタ５，７，２４，（２８）−トリエノール−２２−脱水素酵素遺伝子の発現に欠損を持ち、ＨＭＧ１が過剰発現するように操作されたサッカロマイセス・セレビシエ組み換え株は、高濃度のスクアレンを蓄積することが知られている（特開平５−１９２１８４号公報）。これらの手法を用いることにより、リコペン、スクアレンを生産する酵母菌株を構築することが可能である。
【００４７】
酵母菌株の分子育種
本発明による酵母菌株の分子育種は、上記の遺伝子群を過剰発現させるための遺伝的改変を酵母菌株に施すこと、例えば、上記の遺伝子群を発現可能な状態で酵母菌株に導入することによって行うことができる。これら遺伝子群は、相同組換え等の技術により酵母の染色体上に組み込まれることが好ましい。このような染色体上への組込みを実現するための相同組換え用遺伝子配列の選択は、当業者において周知であり、当業者であれば必要に応じて適切な相同組換え用遺伝子配列を選択して相同組換え用ＤＮＡ断片を構成することができる。
【００４８】
上記の遺伝子群が酵母ゲノムに組込まれる染色体上の位置は特に制限されるものではないが、例えば、オロチジン５’リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ＵＲＡ３）座、アルファアミノアジピン酸還元酵素遺伝子（ＬＹＳ２）座などを選択することができる。また、これらの遺伝子は、組み込まれた遺伝子座に当初から存在するプロモーター、例えばＵＲＡ３遺伝子プロモーター、ＬＹＳ２遺伝子プロモーターなどの制御下に置いてもよいが、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰ）遺伝子プロモーターなどの他のプロモーターの制御下に置いてもよい。
【００４９】
本発明の好ましい実施態様によれば、本発明による酵母菌株の育種に用いられる酵母はキャンディダ・ユティリスとされる。キャンディダ・ユティリスは、その倍数性が高く、胞子を形成しない。倍数性の高い株の遺伝子に変異を導入しようとする場合、１倍体の株に比べて、その変異を重度に加える必要があるが、その際に、変異を与えたい遺伝子ではない遺伝子にも変異が加えられる可能性が高まると考えられる。従って、キャンディダ・ユティリスの遺伝子に変異を導入する場合には、標的とする遺伝子のみに効率よく多重に変異を加えることができる技術を用いることが好ましい。キャンディダ・ユティリスの形質転換法としては、特開２００３−１４４１８５号公報に記載の技術が挙げられる。この文献では、利用可能なベクターとして、キャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡと相同な配列と、選択マーカー遺伝子とを含んでなり、相同組換えによって異種遺伝子をキャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡに組み込むことができるもの、あるいは、キャンディダ・ユティリスで自律複製機能を有するＤＮＡ配列と、選択マーカー遺伝子とを含んでなり、高い頻度でキャンディダ・ユティリスを形質転換できるものが開発されている。
【００５０】
形質転換系で利用可能な選択マーカー遺伝子としては、酵母において機能し得る薬剤耐性マーカー、好ましくはシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子、ジェネティシン（Ｇ４１８）耐性を付与する遺伝子、またはハイグロマイシンＢ耐性を付与する遺伝子などがある。ジェネティシン（Ｇ４１８）耐性を付与する遺伝子、またはハイグロマイシンＢ耐性を付与する遺伝子は、野生の酵母には存在しない配列であるため、標的の遺伝子座に組込まれる確率が高いと考えられている。また、これらの薬剤耐性遺伝子は、その宿主の形質に与える影響も小さいと考えられている（Ｂａｇａｎｚ Ｆら，１３（１６）：１５６３−７３．，１９９７）（Ｃｏｒｄｅｒｏ Ｏｔｅｒｏ Ｒら，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，４６（２）：１４３−８．，１９９６）。
【００５１】
他の形質転換系として、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ−ｌｏｘＰ系が挙げられる。これは、２つの３４ｂｐのｌｏｘＰ配列間での部位特異的組換えシステムであり、この組換えはＣｒｅ遺伝子がコードするＣｒｅ組換え酵素によって触媒される。このシステムは、サッカロマイセス・セレビシエなどの酵母細胞においても機能することが報告されており、２つのｌｏｘＰ配列の間に配置された選択マーカー遺伝子は、ｌｏｘＰ配列間の組換えによって除去されることが知られている（Ｇｕｌｄｅｎｅｒ，Ｕ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２４，２５１９−２４．，１９９６）。このシステムはクルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）など、複数の酵母種で利用されている（Ｓｔｅｅｎｓｍａ，Ｈ．Ｙ．ら，Ｙｅａｓｔ，１８，４６９−７２．，２００１）。
【００５２】
物質の製造方法
本発明による酵母菌株を適当な炭素源の存在下で培養することにより、培養物中に物質（例えばイソプロパノール）を製造することができる。本発明による物質（例えばイソプロパノール）製造法によれば、培養系から物質（例えばイソプロパノール）を分離する工程を実施することにより、物質（例えばイソプロパノール）を得ることができる。なお、本発明において培養物とは、培養上清の他、培養細胞あるいは菌体、細胞もしくは菌体の破砕物を包含している。
【００５３】
本発明による酵母菌株の培養にあたっては、酵母の種類に応じて培養方法や培養条件を選択することができる。培養方法としては、例えば、試験管、フラスコあるいはジャーファーメンターを用いた液体培養法を挙げることができ、回分培養、半回分培養などの培養形式を採用できる。振盪速度および通気量は、一般的には５０〜２００ｒｐｍ、好ましくは８０〜１５０ｒｐｍ、あるいはこの振盪速度に相当する通気量とされる。初期の菌体量としてのＯＤ６００は、一般的には０．１〜３０、好ましくは０．５〜１０とされる。さらに、本発明による酵母菌株の培養にあたっては、振盪速度は速い方が好ましく（つまり通気量は多い方が好ましく）、初期ＯＤ６００は高い方が好ましい。例えば、試験管やフラスコでの培養では、振盪速度は約１２０ｒｐｍまたはそれ以上、初期ＯＤ６００は約１０とすることが好ましい。
【００５４】
本発明による物質（例えばイソプロパノール）製造法において、培地の組成は、酵母が生育し、且つ目的の物質を製造できる各種栄養素を含む組成であればよく、特に限定されない。培地に含まれる資化炭素源としては、例えば、グルコースのほかにもキシロースやスクロースでも資化できれば用いることができる。本発明の好ましい実施態様によれば、炭素源はグルコースを含む。培地中のグルコース濃度は、目的の物質の生産効率を確認しながら、当業者であれば適宜調節することができる。特に、本発明による酵母菌株の培養では、培地中のグルコース濃度は、比較的低濃度に保つことが好ましい。例えば、１９２時間の培養において、グルコースの初期濃度を１００ｇ／Ｌとし、培養７２時間後に終濃度１００ｇ／Ｌとなるようにグルコース固体を添加した場合に比べて、グルコースの初期濃度を５０ｇ／Ｌとし、４８時間後、９６時間後および１４４時間後に終濃度５０ｇ／Ｌとなるようにグルコース固体を添加した場合の方が、物質の生産効率が高い。
【００５５】
培地に含まれる栄養源としては、例えば、酵母エキス、ペプトン、ホエーなどが用いられるが、ＹＰ（１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌペプトン）に上記の資化炭素源を加えた培地、例えばＹＰＤ５（５０ｇ／Ｌグルコース、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌペプトン）等の培地で、さらに適宜ｐＨ調整されたものが便利である。
【００５６】
発酵温度は、用いる酵母の生育可能な範囲で選択することができる。発酵温度は、例えば、約１５℃〜４５℃とすることができ、より好ましくは２０〜４０℃、さらに好ましくは２５〜３５℃、最も好ましくは約３０℃とする。また、発酵過程における培地のｐＨは３〜８に保持することが好ましく、より好ましくはｐＨ４〜７であり、必要に応じてｐＨ調節剤を用いることができる。用いるｐＨ調節剤としては、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等が挙げられるが、好ましくは炭酸カルシウムとされる。
【００５７】
物質（例えばイソプロパノール）製造に要する反応時間は特に限定されず、本発明の効果が認められる限り任意の反応時間で実施される。これらの条件の最適化は、当業者であれば容易に行うことができる。
【００５８】
本発明による物質（例えばイソプロパノール）の製造法においては、このようにして製造した物質（例えばイソプロパノール）成分を培地から分離・回収するが、そのための具体的な手順は、分離・回収しようとする物質に応じて、当業者であれば容易に選択することができる。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体例に説明するが、これら実施例は本発明の技術的範囲を制限するものではない。
【００６０】
実施例１：高いイソプロパノール耐性を示すキャンディダ・ユティリス株の選抜
キャンディダ・ユティリス ＮＢＲＣ０３９６株、ＮＢＲＣ０６１９株、ＮＢＲＣ０９８８株、ＮＢＲＣ０６３９株、ＮＢＲＣ０６２６株、ＮＢＲＣ１０８６株、ＮＢＲＣ１０７０７株、ＡＴＣＣ９２５５株、ＡＴＣＣ２８９５５株、ＡＴＣＣ４４６３８株、ＡＴＣＣ９２０６株、ＡＴＣＣ９６６２１株、ＡＴＣＣ１８２０１株、およびＡＴＣＣ１５２３９株を、ＹＰＤ２（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌグルコース）に接種し、３０℃で培養を行った。定常期の酵母培養液を１０倍ごとに段階希釈し、１０〜１００ｇ／Ｌのイソプロパノールを含むＹＰＤ２寒天培地にスポットし、３０℃で培養した。３日間培養を継続し、コロニーの形成を観察した。結果を表１に記載する。
【００６１】
【表１】
【００６２】
以上の結果より、アッセイを行った株の中では、ＮＢＲＣ１０８６株、ＡＴＣＣ９２５５株、およびＡＴＣＣ１５２３９株が、最も高い６５ｇ／ＬのＩＰＡ耐性を示すことが明らかとなった。
【００６３】
実施例２：ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子が破壊されたキャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ１５２３９株の構築
キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ１５２３９株において、その内因性遺伝子であるピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（ＰＤＣ）を破壊した。この遺伝子破壊は、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを用いて国際公開第２０１０／０９５７５０号パンフレットと同様の方法で行った。２回の破壊により、ＰＤＣ１アレルが完全に欠損した株（ｄＰＤＣ１株）を構築した。ｄＰＤＣ１株は完全にはエタノール生産能を欠損しなかったが、エタノール生産能は著しく低下していた。
【００６４】
実施例３：クロストリジウム・アセトブチリカム由来のＣｏＡ転移酵素サブユニットＡ遺伝子、同サブユニットＢ遺伝子、クロストリジウム・ベイジェリンキ由来のアセト酢酸脱炭酸酵素遺伝子および二級アルコール脱水素酵素遺伝子を発現するベクターの構築
イソプロパノール生合成に関わる４つの遺伝子、クロストリジウム・アセトブチリカム由来のＣｏＡ転移酵素遺伝子サブユニットＡ（ｃｔｆＡ）、同サブユニットＢ（ｃｔｆＢ）、クロストリジウム・ベイジェリンキ由来のアセト酢酸脱炭酸酵素（ａｄｃ）および二級アルコール脱水素酵素（ｓａｄｈ）を効率良くキャンディダ・ユティリスで発現させるために、以下の項目を指標として、天然に存在しない新規な遺伝子配列を設計し、合成した：
（１）キャンディダ・ユティリスにおいて多用されているコドンの使用；
（２）遺伝子クローニングに不適当な制限酵素部位の排除；および
（３）染色体組み込み型発現ベクターに導入するための、５’末端におけるＸｂａＩサイトおよび３’末端におけるＢａｍＨＩサイトの付与。
【００６５】
合成されたＣｏＡ転移酵素遺伝子サブユニットＡ遺伝子、同サブユニットＢ遺伝子、アセト酢酸脱炭酸酵素遺伝子および二級アルコール脱水素酵素遺伝子のヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号１、３、５および７に示す。また、これらのヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２、４、６および８に示す。これらの遺伝子を有するプラスミドをそれぞれＧＡ０９１４２−ｃｔｆＡ、ＧＡ０９１４２−ｃｔｆＢ、ＧＡ０９１４２−ａｄｃ、ＧＡ０９１４２−ｓａｄｈと名付けた。
【００６６】
ｐＶＴ９２は、キャンディダ・ユティリスのオロチジン５’酸脱炭酸酵素遺伝子（ＵＲＡ３）座への組み込みベクターであり、ハイグロマイシン耐性遺伝子を選択マーカーとして有している（国際公開第２０１０／０９５７５０号パンフレット）。ｐＶＴ９２は、ＢｇｌｌＩＩ処理してリニアＤＮＡにすることにより、染色体導入することができる。ｐＶＴ９２は、外来遺伝子を発現させるために、ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩギャップの外側にそれぞれ、グリセルアルデヒド脱水素酵素遺伝子プロモーターとグリセリン酸３’リン酸リン酸化酵素遺伝子ターミネーターを有している。また、ｐＶＴ９２は、プロモーターの５’末端側およびターミネーターの３’末端側には、それぞれＮｈｅＩサイトおよびＳｐｅＩサイトを有している。
【００６７】
ｐＶＴ２３９は、キャンディダ・ユティリスのアルファアミノアジピン酸還元酵素遺伝子（ＬＹＳ２）座への組み込みベクターであり、ジェネティシン耐性遺伝子を選択マーカーとして有している（国際公開第２０１０／０９５７５０号パンフレット）。ｐＶＴ２３９は、ＮｏｔＩ処理してリニアＤＮＡにすることにより、染色体導入することができる。また、ｐＶＴ２３９は、ジェネティシン耐性遺伝子の５’末端側にＳｐｅＩサイトを有している。
【００６８】
各イソプロパノール合成酵素遺伝子を含む４つのベクターＧＡ０９１４２−ｃｔｆＡ、ＧＡ０９１４２−ｃｔｆＢ、ＧＡ０９１４２−ａｄｃ、およびＧＡ０９１４２−ｓａｄｈを、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ処理し、アガロースゲル抽出による精製を行った後、同制限酵素で処理したｐＶＴ９２にライゲーションして、ｐＶＴ２９６、ｐＶＴ２９８、ｐＶＴ３００およびｐＶＴ３０２を得た。ｐＶＴ２９６およびｐＶＴ３００はＳｐｅＩ処理し、脱リン酸化を行った。また、ｐＶＴ２９８およびｐＶＴ３０２はＮｈｅＩ、ＳｐｅＩ処理を行った後、ｃｔｆＢ発現カセット、ｓａｄｈ発現カセットをそれぞれ含むＤＮＡ断片の精製を行い、それぞれｐＶＴ２９６およびｐＶＴ３００に連結して、ｐＶＴ３２１およびｐＶＴ３２５を得た。ｐＶＴ３２５をＮｈｅＩおよびＳｐｅＩで処理した後、ａｄｃ発現カセットとｓａｄｈ発現カセットを含むＤＮＡ断片の精製を行い、ｐＶＴ２３９のＳｐｅＩサイトに導入し、ｐＶＴ３４６を得た。最終的に得られたｐＶＴ３２１はｃｔｆＡとｃｔｆＢのそれぞれの発現カセットとハイグロマイシン耐性遺伝子を有し、キャンディダ・ユティリスのＵＲＡ３座に組み込まれるベクターであり、ｐＶＴ３４６はａｄｃとｓａｄｈのそれぞれの発現カセットとジェネティシン耐性遺伝子を有し、キャンディダ・ユティリスのＬＹＳ２座に組み込まれるベクターである。
【００６９】
実施例４：４つのイソプロパノール合成遺伝子を有するキャンディダ・ユティリス株の構築
ｐＶＴ３２１をＢｇｌｌＩＩで消化し、エタノール沈殿により濃縮した。得られたＤＮＡ断片を用いて、Ｃ. ｕｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ１５２３９株、および実施例２で得られたｄＰＤＣ１株を形質転換し、６００μｇ／ｍＬハイグロマイシンを含むＹＰＤ培地に塗抹し、３０℃で２日間培養した。導入した全ての遺伝子を有する株を選抜した。
【００７０】
さらにｐＶＴ３４６をＮｏｔＩで消化し、エタノール沈殿により濃縮した。得られたそれぞれのＤＮＡ断片を用いて上記で得られた２株をそれぞれ形質転換し、６００μｇ／ｍＬハイグロマイシンと２００μｇ／ｍＬジェネティシンを含むＹＰＤ培地に塗抹し、３０℃で２日間培養した。導入した全ての遺伝子を有する株を選抜し、ＡＴＣＣ１５２３９株由来のイソプロパノール生産株をＴＭＳ２７２株、ｄＰＤＣ株由来のイソプロパノール生産株をＴＭＳ２９０株とした。
【００７１】
実施例５：イソプロパノール生産試験
実施例４で得られた形質転換体のイソプロパノール生産能の評価を、以下に示すように実施した。
【００７２】
各種形質転換体を２ｍＬ ＹＰＤ液体培地（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌグルコース）／１４ｍＬ容試験管に接種し、１４０ｒｐｍ、３０℃で２４時間振とう培養した。得られた前培養液を１００ｍＬ ＹＰＤ１０（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、１００ｇ／Ｌグルコース）／２００ｍＬ容三角フラスコもしくはＹＰＤ１０Ｃ（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、１００ｇ／Ｌグルコース、４５ｇ／Ｌ炭酸カルシウム）／２００ｍＬ容三角フラスコに接種し、初期ＯＤ６００＝１、１００ｒｐｍ、３０℃で振とう培養した。培養液から経時的にサンプリングし、０．２μｍフィルターでろ過した後に、各種成分の定量分析を行った。グルコース、酢酸、エタノールおよびグリセロールは、高速液体クロマトフラフィー（島津製作所製）、ＩＳｅｐ−ＩＯＮ３００カラム（東京化成工業製）および示唆屈折計を用いて定量した。イソプロパノールおよびアセトンは、ガスクロマトフラフィーＧＣ−２０１０ Ｐｌｕｓ（島津製作所製）を用いて定量した。
【００７３】
また、フラスコでの簡易的な中和培養としてＹＰＤ１０Ｃ（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、１００ｇ／Ｌグルコース、４５ｇ／Ｌ炭酸カルシウム）培地を用いても同様の実験を行った。
【００７４】
非中和条件下での培養試験の結果を図２、中和条件下での培養試験の結果を図３に記載する。なお、データは３反復試行の平均で示した。
【００７５】
図２によれば、親株であるＡＴＣＣ１５２３９株およびｄＰＤＣ１株ではイソプロパノールの生産が認められなかったのに対し、イソプロパノール合成遺伝子を導入したＴＭＳ２７２株およびＴＭＳ２９０株では、それぞれ最大で０．１６ｇ／Ｌおよび０．１３ｇ／Ｌのイソプロパノールの生産が認められた。また、ＰＤＣ１遺伝子を破壊した株では糖の消費速度および増殖能が著しく低下していた。ＴＭＳ２７２株では培養２４時間でグルコースが完全に消費され、エタノールの蓄積が認められたが、その後の培養の継続に伴ってエタノール濃度が低下した。エタノール濃度が低下している間もイソプロパノールの生産が認められたことから、ＴＭＳ２７２株は、一度生産したエタノールを二次消費することによりイソプロパノールを生産していることが考えられた。ｄＰＤＣ１株に由来するＴＭＳ２９０株ではイソプロパノール生産速度が低下したことから、酵母におけるイソプロパノール生産においては、基質である細胞質のアセチルＣｏＡがエタノールから供給される経路が最も重要であることが示唆された。エタノールの同化は酸化的反応であることから、これらの結果は、酵母によるイソプロパノール生産においてはキャンディダ・ユティリスのような呼吸活性の高いクラブツリー陰性酵母が適している可能性を示唆している。
【００７６】
図３によれば、培地に炭酸カルシウムを添加したことにより、ＴＭＳ２７２株は１．１ｇ／Ｌのイソプロパノールを生産し、非中和条件より生産量が増大した。また、ＴＭＳ２７２株は、１６．２ｇ／Ｌの酢酸を蓄積しており、何らかの理由により酢酸が蓄積したことでｐＨが低下し、イソプロパノールの生産を阻害していたことが考えられた。また、ＴＭＳ２９０株においても、中和条件下ではイソプロパノール生産量が０．９ｇ／Ｌまで増大しており、一方で３７．４ｇ／Ｌという高濃度のグリセロールを蓄積していた。
【００７７】
実施例６：過剰発現によってイソプロパノール生産性を向上させる遺伝子の選抜
過剰発現することによりイソプロパノールの生産性を向上させる遺伝子の選抜を行った。候補遺伝子が触媒する代謝経路を図１に記載する。
【００７８】
キャンディダ・ユティリス内在性のアセチルＣｏＡ加水分解酵素遺伝子（ＡＣＨ１；ヌクレオチド配列：配列番号９；アミノ酸配列：配列番号１０）、アセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子（ＡＣＳ１；ヌクレオチド配列：配列番号１１；アミノ酸配列：配列番号１２、ＡＣＳ２；ヌクレオチド配列：配列番号１３；アミノ酸配列：配列番号１４）、細胞質局在型エタノール脱水素酵素遺伝子（ＡＤＨ２；ヌクレオチド配列：配列番号１５；アミノ酸配列：配列番号１６）、ミトコンドリア局在型エタノール脱水素酵素遺伝子（ＡＤＨ３；ヌクレオチド配列：配列番号１７；アミノ酸配列：配列番号１８）、細胞質局在型アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子（ＡＬＤ１；ヌクレオチド配列：配列番号１９；アミノ酸配列：配列番号２０）、ミトコンドリア局在型アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子（ＡＬＤ２；ヌクレオチド配列：配列番号２１；アミノ酸配列：配列番号２２）、ミトコンドリア内膜カルニチン輸送体（ＣＲＣ１；ヌクレオチド配列：配列番号２３；アミノ酸配列：配列番号２４）、ミトコンドリア局在型カルニチンアセチルCoA転移酵素（ＣＡＴ２；ヌクレオチド配列：配列番号２５；アミノ酸配列：配列番号２６）、カルニチンアセチル転移酵素遺伝子（ＹＡＴ１；ヌクレオチド配列：配列番号２７；アミノ酸配列：配列番号２８、ＹＡＴ２；ヌクレオチド配列：配列番号２９；アミノ酸配列：配列番号３０）、アセチルＣｏＡアセチル基転移酵素（ＥＲＧ１０；ヌクレオチド配列：配列番号６１；アミノ酸配列：配列番号６２）、ヤロウィア・リポリティカ由来のＡＴＰ−クエン酸除去付加酵素遺伝子（ＡＣＬ１；ヌクレオチド配列：配列番号３１；アミノ酸配列：配列番号３２と、ＡＣＬＹ；ヌクレオチド配列：配列番号３３；アミノ酸配列：配列番号３４がサブユニットを構成する遺伝子）を、それぞれのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲに用いたプライマーは以下の通りである：（ＡＣＨ１；配列番号３５と配列番号３６）、（ＡＣＳ１；配列番号３７と配列番号３８）、（ＡＣＳ２；配列番号３９と配列番号４０）、（ＡＤＨ２；配列番号４１と配列番号４２）、（ＡＤＨ３；配列番号４３と配列番号４４）、（ＡＬＤ１；配列番号４５と配列番号４６）、（ＡＬＤ２；配列番号４７と配列番号４８）、（ＣＡＴ２；配列番号４９と配列番号５０）、（ＣＲＣ１；配列番号５１と配列番号５２）、（ＹＡＴ１；配列番号５３と配列番号５４）、（ＹＡＴ２；配列番号５５と配列番号５６）、（ＡＣＬ１；配列番号５７と配列番号５８）、（ＡＣＬＹ；配列番号５９と配列番号６０）、（ＥＲＧ１０；配列番号６３と配列番号６４）。
【００７９】
得られたＰＣＲ産物をＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ処理して、同制限酵素で処理したｐＣＵ１５５（Keiji Kondo, , Yutaka Miura, Hidetaka Sone, Kazuo Kobayashi & Hiroshi lijima., High-level expression of a sweet protein, monellin, in the food yeast Candida utilis., Nature Biotechnology 15, 453 - 457 (1997)）にクローニングした。ｐＣＵ１５５は、シクロヘキシミド耐性遺伝子を選抜マーカーとして有し、ＵＲＡ３座にマルチコピーインテグレーションされるベクターであり、ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩギャップの外側にそれぞれ、グリセルアルデヒド脱水素酵素遺伝子プロモーターと同ターミネーターを有している。これまでに構築しているイソプロパノール生産株のＵＲＡ３座にはイソプロパノール合成酵素遺伝子が組み込まれているが、Ｃ.ｕｔｉｌｉｓは高次倍数体であり、ＵＲＡ３座が複数コピー存在するため、さらにＵＲＡ３座に遺伝子の導入が可能である。また、イソプロパノール合成遺伝子はＵＲＡ３座に二点組み換えにより挿入されているため、ｐＣＵ１５５の組み込みにより、導入された遺伝子の置換が起こることはない。候補遺伝子がクローン化されたプラスミドはＢｇｌｌＩＩで消化し、エタノール沈殿により濃縮した。得られたＤＮＡ断片を用いてＣ.ｕｔｉｌｉｓ ＴＭＳ２７２株を形質転換し、６００μｇ／ｍＬハイグロマイシン、２００μｇ／ｍＬジェネティシンおよび２０μｇ／ｍＬシクロヘキシミドを含むＹＰＤ培地に塗抹し、３０℃で４日間培養した。なお、ＡＣＬ１とＡＣＬＹのＤＮＡは混合し、同時に形質転換を行った。得られた各４クローンについて発酵試験を行い、イソプロパノール生産性を調査した。結果を図４に示す。
【００８０】
図４によると、ＡＣＳ１、ＡＣＳ２、ＣＲＣ１、ＹＡＴ１、ＥＲＧ１０、またはＡＣＬの過剰発現により、イソプロパノール生産量が１．５〜４．０倍になることが明らかとなった。ＡＣＳ１、ＡＣＳ２、ＹＡＴ１、およびＡＣＬの各遺伝子はアセチルＣｏＡの合成に関わる酵素遺伝子であり、ＣＲＣ１遺伝子はアセチルＣｏＡ合成の前駆物質をミトコンドリアから細胞質に輸送するキャリアタンパク質遺伝子であり、ＥＲＧ１０遺伝子はアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する遺伝子である。これらの結果により、酵母によるイソプロパノール高生産のためには、細胞質のアセチルＣｏＡを効率的に生産するための酵素遺伝子の発現または活性をアップレギュレートすることが重要であることが示される。
【００８１】
実施例７：ＡＣＬ１／ＡＣＬＹ、ＡＣＳ２、ＥＲＧ１０、ＣＲＣ１およびＹＡＴ１を同時に過剰発現するイソプロパノール生産株の構築と培養試験
ＡＣＬ１、ＡＣＬＹ、ＡＣＳ２、ＥＲＧ１０、ＣＲＣ１およびＹＡＴ１の各遺伝子がクローン化されたプラスミドをＢｇｌｌＩＩで消化し、エタノール沈殿により濃縮した。得られた各５μｇのＤＮＡ断片を混合し、この混合物を用いてＴＭＳ２７２株を形質転換し、６００μｇ／ｍＬハイグロマイシン、２００μｇ／ｍＬジェネティシンおよび１０μｇ／ｍＬシクロヘキシミドを含むＹＰＤ培地に塗抹し、３０℃で４日間培養した。得られた８０クローンについて発酵試験を行い、イソプロパノール生産量が最も高い株を選抜し、ＴＭＳ３７８株とした。
【００８２】
ＴＭＳ３７８株の培養試験を行った結果を図５に示す。ＴＭＳ２７２株が１．３ｇ／Ｌのイソプロパノールを生産したのに対して、ＴＭＳ３７８株は９．８ｇ／Ｌと約７．５倍のイソプロパノール生産量を示した。また、ＴＭＳ２７２株では酢酸が１８．１ｇ／Ｌ蓄積したのに対して、ＴＭＳ３７８株は４．５ｇ／Ｌと、主要な副産物である酢酸が約４分の１に低下していた。
【００８３】
実施例８：ＴＭＳ３７８株のイソプロパノール生産における初期ＯＤ６００および振とう速度の影響
イソプロパノール生産に適したＴＭＳ３７８株の培養条件の検討を行った。ＴＭＳ３７８株を２ｍＬ ＹＰＤ液体培地（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌグルコース）／１４ｍＬ容試験管に接種し、１４０ｒｐｍ、３０℃で２４時間振とう培養した。得られた前培養液を１００ｍＬ ＹＰＤ１０Ｃ（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、１００ｇ／Ｌグルコース、４５ｇ／Ｌ炭酸カルシウム）／３００ｍＬ容三角フラスコに接種し、初期ＯＤ６００を１もしくは１０とし、１００ｒｐｍもしくは１２０ｒｐｍ、３０℃で振とう培養した。培養７２時間後に終濃度１００ｇ／Ｌとなるようにグルコース固体を培養液に添加し、さらに１４４時間まで培養を行った。経時的にサンプリングして０．２μｍフィルターでろ過した。各種定量分析は、実施例５に記載の方法に従って行った。なお、データは３反復試行の平均で示した。結果を図６に示す。
【００８４】
図６によると、初期ＯＤ６００＝１０、１２０ｒｐｍで培養したときに最も高いイソプロパノール生産量が見られ、培養１４４時間後に最大で１８．５ｇ／Ｌのイソプロパノールが生産された。その際の対糖収率は３０．８％であった。このことから、振とう速度が速いほど（通気量が多いほど）、また、初期ＯＤが高いほど、イソプロパノール生産には好ましいことが明らかとなった。
【００８５】
実施例９：ＴＭＳ３７８株のイソプロパノール生産における添加グルコース濃度の影響
イソプロパノール生産に適したＴＭＳ３７８株の培養条件の検討を行った。ＴＭＳ３７８株を２ｍＬ ＹＰＤ液体培地（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌグルコース）／１４ｍＬ容試験管に接種し、１４０ｒｐｍ、３０℃で２４時間振とう培養した。得られた前培養液を１００ｍＬ ＹＰＤ１０Ｃ（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、１００ｇ／Ｌグルコース、４５ｇ／Ｌ炭酸カルシウム）／３００ｍＬ容三角フラスコもしくはＹＰＤ５Ｃ（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、５０ｇ／Ｌグルコース、４５ｇ／Ｌ炭酸カルシウム）／３００ｍＬ容三角フラスコに接種し、初期ＯＤ６００＝１、１２０ｒｐｍ、３０℃で振とう培養した。ＹＰＤ１０Ｃで培養を行ったサンプルについては、培養７２時間後に終濃度１００ｇ／Ｌとなるようにグルコース固体を添加し、さらに１９２時間まで培養を行った。また、ＹＰＤ５Ｃで培養を行ったサンプルについては、培養４８時間おきに３回終濃度５０ｇ／Ｌとなるようにグルコース固体を添加し、さらに１９２時間まで培養を行った。いずれの条件も最終のグルコース濃度は２００ｇ／Ｌである。経時的にサンプリングして０．２μｍフィルターでろ過した。各種定量分析は、実施例５に記載の方法に従って行った。なお、データは３反復試行の平均で示した。結果を図７に示す。
【００８６】
図７によると、ＹＰＤ１０Ｃで培養し、培養７２時間後に１００ｇ／Ｌのグルコースを添加した場合は、培養１２２時間後に最大で１９．２ｇ／Ｌのイソプロパノールが生産された。しかし、それ以降はイソプロパノール生産量の増大は認められず、酢酸が蓄積した(２７．２ｇ／Ｌ）。イソプロパノールの生産における最大の対糖収率は２９．０％であった。一方、ＹＰＤ５Ｃで培養し、４８時間おきに５０ｇ／Ｌのグルコースを３回添加した場合は、培養１９２時間までイソプロパノールの増大が認められ、培養１９２時間後に最大で２７．４ｇ／Ｌのイソプロパノールが生産された。また、酢酸の蓄積はほとんど認めれらなかった。この条件でのイソプロパノールの生産における最大の対糖収率は４１．５％であった。このことから、添加するグルコースの濃度を比較的低濃度に保つことはイソプロパノール生産において好ましいことが明らかとなった。
【００８７】
実施例１０：イソプロパノール生産量向上に寄与の大きい遺伝子の特定
同時に過剰発現することによってイソプロパノール生産量を向上させる寄与の大きい遺伝子を特定するために、(i)ＡＣＬ１、ＡＣＬＹおよびＡＣＳ２の組み合わせを過剰発現する株、(ii)ＡＣＬ１、ＡＣＬＹおよびＥＲＧ１０の組み合わせを過剰発現する株、(iii)ＡＣＳ２およびＥＲＧ１０の組み合わせを過剰発現する株、(iv)ＡＣＬ１、ＡＣＬＹ、ＡＣＳ２およびＥＲＧ１０の組み合わせを過剰発現する株をそれぞれ構築し、ＡＣＬ１、ＡＣＬＹ、ＡＣＳ２、ＣＲＣ１、ＥＲＧ１０およびＹＡＴ１の組み合わせを過剰発現する株（ＴＭＳ３７８株）およびそれぞれの単独遺伝子の過剰発現株との間で、イソプロパノール生産量の比較を行った。組み換え株の構築は実施例６および実施例７と同様の方法を用いて行い、組み込みたい遺伝子ＤＮＡを混合し、同時に形質転換を行った。得られた各３２クローンについて発酵試験を行い、それぞれの導入遺伝子の組み合わせにおいて平均的なイソプロパノール生産量を示す株を選抜した。各構築株を２ｍＬ ＹＰＤ液体培地（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌグルコース）／１４ｍＬ容試験管に接種し、１４０ｒｐｍ、３０℃で２４時間振とう培養した。得られた前培養液を３ｍＬ ＹＰＤ１０Ｃ（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、１００ｇ／Ｌグルコース、４５ｇ／Ｌ炭酸カルシウム）／ガラス試験管に接種し、初期ＯＤ６００＝１、１００ｒｐｍ、３０℃で振とう培養した。経時的にサンプリングを行い、高速液体クロマトフラフィーおよびガスクロマトフラフィーＧＣ−２０１０でイソプロパノール生産量を評価した。なお、データは３反復試行の平均で示した。
【００８８】
図８によると、ＡＣＳ１、ＡＣＳ２およびＥＲＧ１０のそれぞれ単独の過剰発現により、イソプロパノール生産量が２．２〜２．７倍になることが明らかとなった。(i)ＡＣＬ１、ＡＣＬＹおよびＡＣＳ２の組み合わせを過剰発現する株、ならびに(ii)ＡＣＬ１、ＡＣＬＹおよびＥＲＧ１０の組み合わせを過剰発現する株のイソプロパノール生産量は、それぞれＡＣＳ２およびＥＲＧ１０を単独で過剰発現する株と有意な差は認められなかった。一方、(iii)ＡＣＳ２およびＥＲＧ１０の組み合わせを過剰発現する株ではイソプロパノール生産の飛躍的な向上が認められ、生産量が１１．６倍に向上した。また、(iii)ＡＣＳ２およびＥＲＧ１０の組み合わせを過剰発現する株、(iv)ＡＣＬ１、ＡＣＬＹ、ＡＣＳ２およびＥＲＧ１０の組み合わせを過剰発現する株、ＴＭＳ３７８株（ＡＣＬ１、ＡＣＬＹ、ＡＣＳ２、ＣＲＣ１、ＥＲＧ１０およびＹＡＴ１の組み合わせを過剰発現する株）の株間において、イソプロパノール生産量に有意な差は認められなかった。
【００８９】
これらの結果より、同時に過剰発現した際にはＡＣＬ、ＣＲＣ１およびＹＡＴ１の過剰発現がイソプロパノールの生産性向上に与える寄与は小さく、イソプロパノール生産性を向上させるためにはＡＣＳ２とＥＲＧ１０を同時に過剰発現することが最も重要であることが示された。以上の結果は、酵母によるイソプロパノール高生産のためにはエタノールからアセチルＣｏＡを合成する代謝経路、すなわち酢酸からアセチルＣｏＡを合成する代謝経路に関わる酵素遺伝子の発現または活性を増強することが重要であることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】図１は、酵母によるイソプロパノール合成経路を示す図である。
【図２】図２は、イソプロパノール生産遺伝子を導入した株の非中和条件での発酵試験の結果を示す図であり、培養液中のイソプロパノール濃度（パネルＡ）、グルコース濃度（パネルＢ）、エタノール濃度（パネルＣ）、酢酸濃度（パネルＤ）、グリセロール濃度（パネルＥ）およびＯＤ６００（パネルＦ）の経時変化を示している。各パネルにおいて、黒丸はＡＴＣＣ１５２３９株の結果を示し、白丸はＴＭＳ２７２株（ＡＴＣＣ１５２３９株＋ＩＰＡ合成遺伝子）の結果を示し、黒三角はＰＤＣ１破壊株の結果を示し、白三角はＴＭＳ２９０株（ＰＤＣ破壊株＋ＩＰＡ合成遺伝子）の結果を示す。
【図３】図３は、イソプロパノール生産遺伝子を導入した株の中和条件での発酵試験の結果を示す図であり、培養液中のイソプロパノール濃度（パネルＡ）、グルコース濃度（パネルＢ）、エタノール濃度（パネルＣ）、酢酸濃度（パネルＤ）およびグリセロール濃度（パネルＥ）の経時変化を示している。各パネルにおいて、黒丸はＡＴＣＣ１５２３９株の結果を示し、白丸はＴＭＳ２７２株（ＡＴＣＣ１５２３９株＋ＩＰＡ合成遺伝子）の結果を示し、黒三角はＰＤＣ１破壊株の結果を示し、白三角はＴＭＳ２９０株（ＰＤＣ破壊株＋ＩＰＡ合成遺伝子）の結果を示す。
【図４】図４は、ＴＭＳ２７２株において、各種遺伝子を過剰発現させた場合におけるイソプロパノール生産量を、ＴＭＳ２７２株によるイソプロパノール生産量に対する相対量として示したグラフである。
【図５】図５は、イソプロパノール生酸性を向上させる遺伝子を全て過剰発現する株の発酵試験の結果を示す図であり、培養液中のイソプロパノール濃度（パネルＡ）、グルコース濃度（パネルＢ）、エタノール濃度（パネルＣ）、酢酸濃度（パネルＤ）、グリセロール濃度（パネルＥ）およびアセトン濃度（パネルＦ）の経時変化を示している。各パネルにおいて、黒丸はＴＭＳ２７２株の結果を示し、白丸はＴＭＳ３７８株（ＴＭＳ２７２株＋ＡＣＬ１：ＡＣＬＹ：ＡＣＳ２：ＥＲＧ１０：ＣＲＣ１：ＹＡＴ１）の結果を示す。
【図６】図６は、イソプロパノール生産性を向上させる遺伝子を全て過剰発現するＴＭＳ３７８株の３０℃での発酵試験（初期ＯＤ６００および振とう速度の影響）の結果を示す図であり、培養液中のイソプロパノール濃度（パネルＡ）、グルコース濃度（パネルＢ）、エタノール濃度（パネルＣ）、酢酸濃度（パネルＤ）、グリセロール濃度（パネルＥ）およびアセトン濃度（パネルＦ）の経時変化を示している。各パネルにおいて、黒丸は初期ＯＤ６００＝１かつ攪拌数＝１００ｒｐｍの条件下での結果を示し、黒三角は初期ＯＤ６００＝１かつ攪拌数＝１２０ｒｐｍの条件下での結果を示し、白丸は初期ＯＤ６００＝１０かつ攪拌数＝１００ｒｐｍの条件下での結果を示し、白三角は初期ＯＤ６００＝１０かつ攪拌数＝１２０ｒｐｍの条件下での結果を示す。
【図７】図７は、イソプロパノール生産性を向上させる遺伝子を全て過剰発現するＴＭＳ３７８株の３０℃での発酵試験（流加グルコース濃度の影響）の結果を示す図である。パネルＡは、初期グルコース濃度を１００ｇ／Ｌとし、培養７２時間後に１００ｇ／ｌのグルコースを流加して、１９２時間培養を行った結果を示す。パネルＢは、初期グルコース濃度を５０ｇ／Ｌとし、培養４８時間後、９６時間後および１４４時間後にそれぞれ５０ｇ／ｌのグルコースを流加して、１９２時間培養を行った結果を示す。各パネルにおいて、イソプロパノール濃度（黒三角）、グルコース濃度（黒丸）、エタノール濃度（白丸）および酢酸濃度（白三角）の経時変化を示している。
【図８】図８は、ＴＭＳ２７２株において、各種遺伝子を過剰発現させた場合におけるイソプロパノール生産量を示したグラフである。
【発明の背景】
【０００１】
技術分野
本発明は、酵母において、アセチルＣｏＡを経由する代謝経路を利用した物質の製造方法に関する。
【０００２】
背景技術
深刻化する環境問題を背景に、バイオ燃料が石油の代替燃料として注目を集めている。エタノールはバイオ燃料としてよく知られているが、ガソリンより低いエネルギー密度しか有さないこと、輸送燃料として機能させるためには限られた濃度範囲でガソリンと混合する必要があることから、燃料としての欠点も多い。イソプロパノールは、１−ブタノールよりも高いオクタン価を有し、また、工業原料としても利用される汎用性の高い溶剤である。イソプロパノールは、ナフサ由来のプロピレンの水和によって製造されており、再生可能な供給源から商業的に生産されたことはない。
【０００３】
微生物によるアセトンやブタノールの発酵生産は、２０世紀初頭に産業的に行われていた。絶対嫌気性菌のある種のクロストリジウム属細菌はアセトンとブタノールを同時に生産することができる（アセトン・ブタノール発酵）。アセトンは細菌細胞内に存在するアセチルＣｏＡを原料として生産される。アセチルＣｏＡは、アセチルＣｏＡアセチル基転移酵素（チオラーゼ）によってアセトアセチルＣｏＡに変換され、さらにＣｏＡ転移酵素によってアセト酢酸に変換され、さらにアセト酢酸脱炭酸酵素によってアセトンへと変換される。ある種のクロストリジウム属細菌はさらに二級アルコールの脱水素酵素を有し、アセトンからイソプロパノールを生産する。Ｃｈｅｎらは、クロストリジウム・ベイジェリンキを含む５２株のクロストリジウム属細菌の中で、最大で３０ｍＭ（１．８ｇ／Ｌ）のイソプロパノールを生産する株が存在したことを報告している（非特許文献１：Chen, J.-S., and S. F. Hiu. Acetone-butanol-isopropanol production by Clostridium beijerinckii (synonym, Clostridium butylicum). Biotechnol. Lett. 1986. 8:371-376）。また、最近になってＨａｎａｉらおよびＪｏｊｉｍａらは、大腸菌にクロストリジウム属由来のＣｏＡ転移酵素、アセト酢酸脱炭酸酵素、二級アルコール脱水素酵素を導入し、内在性のアセチルＣｏＡアセチル基転移酵素を過剰発現させることによってイソプロパノールを効率的に生産できる大腸菌株を報告している（非特許文献２：T. Hanai, S. Atsumi, and J. C. Liao. Engineered Synthetic Pathway for Isopropanol Production in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol, Dec. 2007, p. 7814-7818；非特許文献３：Toru Jojima & Masayuki Inui & Hideaki Yukawa. Production of isopropanol by metabolically engineered Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol 2008 77:1219-1224）。しかしながら、大腸菌は、糖耐性、浸透圧耐性、塩耐性、有機溶剤耐性など各種ストレス耐性はあまり高くないことが多く、ファージ汚染によるリスクもある。また、イソプロパノール耐性が低いことは生産物による発酵の阻害が起こることを意味する。発酵阻害を回避するためにガスストリッピング法などを用いて生産物を培地から除去しながら発酵を続ける方法が知られているが、該方法の使用は発酵生産の工程を煩雑化させるだけでなく、コスト増加につながる。これらの問題を解決するための一つの手段として、高い有機溶剤耐性を有する微生物を用いてイソプロパノール生産をすることが考えられる。
【０００４】
単細胞真核微生物である酵母は高い有機溶剤耐性を示し、また、大腸菌などの微生物と同様に、培養設備、培養時間および培養コストの面で高等生物の細胞よりも安価に培養することができるという特徴を有する。特に、出芽酵母はビールやワインなどの酒類やパンの製造に用いられ、その食品としての安全性が確認されている。
【０００５】
酵母でイソプロパノールを生産するためには、その酵母菌株に、外因性のＣｏＡ転移酵素、アセト酢酸脱炭酸酵素、および二級アルコール脱水素酵素を導入する必要がある。これまで、酵母によるイソプロパノールの製造例としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）にイソプロピルアルコール生産酵素群の遺伝子を導入し、この形質転換体を培養することによりイソプロパノールを製造したことが報告されている（特許文献１：特開２０１１−９７９２９号公報）。しかし、この方法によるイソプロパノールの生産量は、培養液中の濃度として１００ｍｇ／Ｌ前後という少量に過ぎない。酵母は真核生物であり、オルガネラが存在することから、イソプロパノール合成の基質であるアセチルＣｏＡを細胞質に供給する経路が複数存在している。どの経路からアセチルＣｏＡを細胞質に供給することがイソプロパノール合成にとって有利であるのか、あるいはどのような酵母がそういった能力に優れているか、これまでに調査された例はない。
【０００６】
キャンディダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびサッカロマイセス・フラジリス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）と同様に、ＦＤＡ（米国連邦食品医薬品局）によって食用酵母として認定されており、食品添加物として安全に使用できることが認められている食用酵母である。実際に、現在でも、キャンディダ・ユティリスは、日本をはじめとして、ドイツやアメリカなど世界各国で生産され、食飼料として利用されている。また、キャンディダ・ユティリスは、ペントースの資化による菌体生産、エチルアセテート、Ｌ−グルタミン酸、グルタチオン、インベルターゼなどの生産株として広く産業界で利用されてきた。近年、キャンディダ・ユティリスにおいても形質転換法が開発され、様々な化合物が代謝工学的に生産される技術が開発されている（非特許文献４：Hiroshi Shimada, Keiji Kondo, Paul D. Fraser, Yutaka Miura, Toshiko Saito, and Norihiko Misawa., Increased Carotenoid Production by the Food Yeast Candida utilis through Metabolic Engineering of the Isoprenoid Pathway., Appl Environ Microbiol, July 1998, p. 2676-2680, Vol. 64, No. 7；非特許文献５：Yutaka Miura, Keiji Kondo, Toshiko Saito, Hiroshi Shimada, Paul D. Fraser, and Norihiko MisawaProduction of the Carotenoids Lycopene, β-Carotene, and Astaxanthin in the Food Yeast Candida utilis., Appl Environ Microbiol, April 1998, p. 1226-1229, Vol. 64, No. 4；非特許文献６：Keiji Kondo,, Yutaka Miura, Hidetaka Sone, Kazuo Kobayashi & Hiroshi lijima., High-level expression of a sweet protein, monellin, in the food yeast Candida utilis., Nature Biotechnology 15, 453 - 457 (1997)；非特許文献７：Yutaka Miura, Keiji Kondo, Hiroshi Shimada, Toshiko Saito, Katsumi Nakamura, Norihiko Misawa., Production of lycopene by the food yeast, Candida utilis that does not naturally synthesize carotenoid., Biotechnology and Bioengineering Volume 58 Issue 2-3, Pages 306-308；非特許文献８：Shigehito IKUSHIMA, Toshio FUJII, Osamu KOBAYASHI, Satoshi YOSHIDA and Aruto YOSHIDA., Genetic Engineering of Candida utilis Yeast for Efficient Production of L-Lactic Acid., Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry Vol. 73 (2009) , No. 8 pp.1818-1824；非特許文献９：Yi-Ren Hong, Ya-Lei Chen, Lynn Farh, Wen-Jen Yang, Chen-Hua Liao and David Shiuan.,Recombinant Candida utilis for the production of biotin., Applied Microbiology and Biotechnology.,Volume 71(2006), Number 2, 211-221）。また、キャンディダ・ユティリスは、サッカロマイセス属とは異なり、クラブツリー（Ｃｒａｂｔｒｅｅ）効果陰性酵母であることから、グルコース存在下でも呼吸活性が低下しない。これにより、十分に通気を行う条件を採用することにより、エタノールの生成を抑えることができる。さらに、キャンディダ・ユティリスは呼吸活性も高く、一旦生成したエタノールも速やかに再同化されることから、効率的な菌体や代謝産物の生産を可能とする。
【０００７】
酵母でイソプロパノールのような物質を生産する場合、一般に、副産物としてのエタノールの生成が問題となる。このエタノール副生を抑制するために、エタノール生産の重要酵素であるピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（ＰＤＣ）を欠損させる取り組みがなされている（特許文献２：国際公開第２０１０／０９５７５１号パンフレット；特許文献３：国際公開第２０１０／０９５７５０号パンフレット；非特許文献１０：Flikweert MT, Van Der Zanden L, Janssen WM, et al. Pyruvate decarboxylase: an indispensable enzyme for growth of Saccharomyces cerevisiae on glucose. Yeast 12(1996): 247-257；非特許文献１１：van Maris AJA, Winkler AA, Porro D, et al. Homofermentative lactate production cannot sustain anaerobic growth of engineered Saccharomyces cerevisiae: Possible consequence of energy-dependent lactate export. Appl Environ Microbiol 70(2004): 2898-2905）。
【０００８】
【非特許文献１】Chen, J.-S., and S. F. Hiu. Acetone-butanol-isopropanol production by Clostridium beijerinckii (synonym, Clostridium butylicum). Biotechnol. Lett. 1986. 8:371-376
【非特許文献２】T. Hanai, S. Atsumi, and J. C. Liao. Engineered Synthetic Pathway for Isopropanol Production in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol, Dec. 2007, p. 7814-7818
【非特許文献３】Toru Jojima & Masayuki Inui & Hideaki Yukawa. Production of isopropanol by metabolically engineered Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol 2008 77:1219-1224
【非特許文献４】Hiroshi Shimada, Keiji Kondo, Paul D. Fraser, Yutaka Miura, Toshiko Saito, and Norihiko Misawa., Increased Carotenoid Production by the Food Yeast Candida utilis through Metabolic Engineering of the Isoprenoid Pathway., Appl Environ Microbiol, July 1998, p. 2676-2680, Vol. 64, No. 7
【非特許文献５】Yutaka Miura, Keiji Kondo, Toshiko Saito, Hiroshi Shimada, Paul D. Fraser, and Norihiko MisawaProduction of the Carotenoids Lycopene, β-Carotene, and Astaxanthin in the Food Yeast Candida utilis., Appl Environ Microbiol, April 1998, p. 1226-1229, Vol. 64, No. 4
【非特許文献６】Keiji Kondo,, Yutaka Miura, Hidetaka Sone, Kazuo Kobayashi & Hiroshi lijima., High-level expression of a sweet protein, monellin, in the food yeast Candida utilis., Nature Biotechnology 15, 453 - 457 (1997)
【非特許文献７】Yutaka Miura, Keiji Kondo, Hiroshi Shimada, Toshiko Saito, Katsumi Nakamura, Norihiko Misawa., Production of lycopene by the food yeast, Candida utilis that does not naturally synthesize carotenoid., Biotechnology and Bioengineering Volume 58 Issue 2-3, Pages 306-308
【非特許文献８】Shigehito IKUSHIMA, Toshio FUJII, Osamu KOBAYASHI, Satoshi YOSHIDA and Aruto YOSHIDA., Genetic Engineering of Candida utilis Yeast for Efficient Production of L-Lactic Acid., Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry Vol. 73 (2009) , No. 8 pp.1818-1824
【非特許文献９】Yi-Ren Hong, Ya-Lei Chen, Lynn Farh, Wen-Jen Yang, Chen-Hua Liao and David Shiuan.,Recombinant Candida utilis for the production of biotin., Applied Microbiology and Biotechnology.,Volume 71(2006), Number 2, 211-221
【非特許文献１０】Flikweert MT, Van Der Zanden L, Janssen WM, et al. Pyruvate decarboxylase: an indispensable enzyme for growth of Saccharomyces cerevisiae on glucose. Yeast 12(1996): 247-257
【非特許文献１１】van Maris AJA, Winkler AA, Porro D, et al. Homofermentative lactate production cannot sustain anaerobic growth of engineered Saccharomyces cerevisiae: Possible consequence of energy-dependent lactate export. Appl Environ Microbiol 70(2004): 2898-2905
【特許文献１】特開２０１１−９７９２９号公報
【特許文献２】国際公開第２０１０／０９５７５１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２０１０／０９５７５０号パンフレット
【発明の概要】
【０００９】
本発明者らは、酵母におけるアセチルＣｏＡ合成酵素（ＡＣＳ）およびアセチルＣｏＡアセチル基転移酵素（ＥＲＧ１０）の活性を増強することにより、酵母内におけるアセチルＣｏＡを経由する物質の生産量が顕著に増加することを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
【００１０】
従って、本発明の目的は、様々な物質の発酵生産において中間物質として関与するアセチルＣｏＡならびにアセトアセチルＣｏＡの合成・代謝に係る酵素活性が増強された酵母菌株、ならびに該酵母菌株を用いた物質の製造法を提供することにある。
【００１１】
そして、本発明による酵母菌株は、以下の酵素：
（ａ）アセチルＣｏＡ合成酵素（ＡＣＳ）；および
（ｂ）アセチルＣｏＡアセチル基転移酵素（ＥＲＧ１０）
の活性が増強されている酵母菌株である。
【００１２】
さらに、本発明による製造法は、本発明による酵母菌株を培養することを含んでなる、物質を製造する方法である。
【００１３】
本発明によれば、アセチルＣｏＡやアセトアセチルＣｏＡが関与する酵母の代謝経路が活性化される。アセチルＣｏＡやアセトアセチルＣｏＡが関与する代謝経路は多岐にわたるため、生成する代謝産物も多種多様である。従って、本発明によれば、酵母菌株の培養によって様々な物質を高効率で製造することが可能となる。また、製造しようとする物質に応じて、必要な酵素の遺伝子を発現可能な形で酵母に組み込み、得られた酵母菌株を培養することによりその物質を製造することも可能である。
【発明の具体的説明】
【００１４】
本発明による酵母菌株では、以下の遺伝子：（ａ）アセチルＣｏＡ合成酵素（ＡＣＳ）の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；および（ｂ）アセチルＣｏＡアセチル基転移酵素（ＥＲＧ１０）の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現が増強されている。
【００１５】
本明細書では、上記のアセチルＣｏＡ合成酵素（ＡＣＳ）遺伝子およびアセチルＣｏＡアセチル基転移酵素（ＥＲＧ１０）遺伝子とともに、イソプロパノールを合成するための４つの遺伝子を過剰発現する酵母菌株を作製し、これを培養することにより、極めて高濃度のイソプロパノールが生産されることが実証されている。この酵母菌株におけるイソプロパノール生産の経路は図１に示す通りである。図１に示される経路から、イソプロパノールの高い生産量が、アセチルＣｏＡおよびアセトアセチルＣｏＡの合成・代謝に係る酵素活性の増強に起因することは明らかである。従って、本発明によって、イソプロパノールのみならず、アセチルＣｏＡおよびアセトアセチルＣｏＡを経由する様々な物質を高生産することができる。また、図１に示されるように、ＡＣＳおよびＥＲＧ１０は細胞質において機能する酵素である。
【００１６】
細胞質に供給されるアセチルＣｏＡは、フラボノイド骨格を有する化合物、テルぺノイド骨格を有する化合物、ステロール骨格を有する化合物、脂肪酸など、様々な有用な二次代謝物質の基幹物質である。よって、酵母菌株が天然の状態もしくは人為的に遺伝子を改変された状態でこれらの二次代謝産物の合成経路を有していれば、本発明の方法によりこれらの物質を高生産させることができる。
【００１７】
一般的に、微生物による物質生産を行う際には、副産物生産を抑制する取り組みがなされる場合が多い。例えば、酵母において物質を生産する場合、一般に、副産物としてのエタノールの生成を抑制するために、エタノール生産に関与する酵素遺伝子、例えばピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（ＰＤＣ）を欠損させる取り組みがなされている（国際公開第２０１０／０９５７５１号パンフレット；国際公開第２０１０／０９５７５０号パンフレット；Flikweert MT, Van Der Zanden L, Janssen WM, et al. Pyruvate decarboxylase: an indispensable enzyme for growth of Saccharomyces cerevisiae on glucose. Yeast 12(1996): 247-257；van Maris AJA, Winkler AA, Porro D, et al. Homofermentative lactate production cannot sustain anaerobic growth of engineered Saccharomyces cerevisiae: Possible consequence of energy-dependent lactate export. Appl Environ Microbiol 70(2004): 2898-2905）。しかし、本明細書では、上記のＰＤＣを欠損させた酵母菌株よりも、ＰＤＣを欠損させなかった酵母菌株の方が顕著に高いイソプロパノール生産量を示すことが実証されている。よって、本発明による酵母菌株は、ＰＤＣなどのエタノール生産に関与する酵素遺伝子を欠失させずにそのまま維持していることも特徴の一つであり、これによりイソプロパノール生産量、ひいてはアセチルＣｏＡやその代謝産物であるアセトアセチルＣｏＡの生産量が顕著に向上することは、驚くべきことである。
【００１８】
本明細書において酵素活性が「増強されている」とは、培養過程の少なくとも一時期において、活性増強のための手段を施されていない酵母と比較してより強い酵素活性が観察されることを意味する。酵素活性の増強は、当該酵素遺伝子の発現を増強すること、あるいは比活性のより高い酵素遺伝子への置き換えや、タンパク質工学的な方法による酵素遺伝子の改変によって実現することができる。本明細書において遺伝子の発現が「増強されている」とは、酵母の遺伝的改変により該酵母におけるその遺伝子の発現量が増加すること、つまり、その遺伝子を過剰発現させることを意味する。このような遺伝的改変の方法としては、例えば、その遺伝子により酵母を形質転換する方法（つまり、その遺伝子を発現し得る形で酵母にトランスフェクトする方法）、その酵母のゲノム上に存在する遺伝子のプロモーター活性を強化する方法、その酵母のゲノム上に存在する遺伝子のプロモーターを他のプロモーターと置換することにより該遺伝子の発現を増強する方法など、様々な方法が知られているが、好ましくはその遺伝子により酵母を形質転換する方法とされる。
【００１９】
酵母
本発明による酵母菌株は、特定の遺伝子が過剰発現するように遺伝的に改変された酵母である。遺伝的改変に用いる酵母は、アセチルＣｏＡまたはアセトアセチルＣｏＡを経由する代謝経路を有する酵母であればよく、特に制限されないが、好ましくは呼吸活性の高いクラブツリー効果陰性酵母とされ、より好ましくはクラブトゥリー陰性酵母であるキャンディダ・ユティリスとされる。キャンディダ・ユティリスの菌株は当技術分野において公知の様々な株、例えば、ＮＢＲＣ０３９６株、ＮＢＲＣ０６１９株、ＮＢＲＣ０９８８株、ＮＢＲＣ０６３９株、ＮＢＲＣ０６２６株、ＮＢＲＣ１０８６株、ＮＢＲＣ１０７０７株、ＡＴＣＣ９２５５株、ＡＴＣＣ２８９５５株、ＡＴＣＣ４４６３８株、ＡＴＣＣ９２０６株、ＡＴＣＣ９６６２１株、ＡＴＣＣ１８２０１株、およびＡＴＣＣ１５２３９株等であってよいが、好ましくはＮＢＲＣ１０８６株、ＡＴＣＣ９２５５株またはＡＴＣＣ１５２３９株とされる。
【００２０】
活性が増強される酵素およびその遺伝子
本発明による酵母菌株において活性が増強される酵素は、以下の酵素：（ａ）アセチルＣｏＡ合成酵素（ＡＣＳ）；および（ｂ）アセチルＣｏＡアセチル基転移酵素（ＥＲＧ１０）である。本発明の好ましい実施態様によれば、本発明による酵母菌株においてはこれら２種類の酵素の遺伝子が過剰発現され、すなわち、以下の遺伝子：（ａ）アセチルＣｏＡ合成酵素（ＡＣＳ）の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；および（ｂ）アセチルＣｏＡアセチル基転移酵素（ＥＲＧ１０）の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現が増強されている。
【００２１】
本発明による酵母菌株では、さらに、以下の遺伝子：（ｃ）ＡＴＰ−クエン酸除去付加酵素（ＡＣＬ）の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；（ｄ）ミトコンドリア内膜カルニチン輸送体（ＣＲＣ１）の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；および（ｅ）カルニチンアセチル転移酵素遺伝子（ＹＡＴ１）の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子からなる群から選択される少なくとも一種の遺伝子の発現が増強されていてもよく、好ましくはこれら（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）の全ての遺伝子の発現が増強される。
【００２２】
これらの酵素および遺伝子は様々な酵母に由来するものが知られており、その起源は特に制限されない。これらの酵素および遺伝子は、育種に用いられる酵母の内在性遺伝子およびその発現産物であってよく、あるいは、育種に用いられる酵母以外の他の酵母に由来するものであってもよい。例えば、これらの酵素および遺伝子は、それぞれ独立に、キャンディダ・ユティリスまたはヤロウィア・リポリティカに由来するものとすることができる。それぞれの酵素の起源としては、例えば、アセチルＣｏＡ合成酵素（ＡＣＳ）はキャンディダ・ユティリス酵母、アセチルＣｏＡアセチル基転移酵素（ＥＲＧ１０）はキャンディダ・ユティリス酵母、ミトコンドリア内膜カルニチン輸送体（ＣＲＣ１）はキャンディダ・ユティリス酵母、カルニチンアセチル転移酵素遺伝子（ＹＡＴ１）はキャンディダ・ユティリス酵母、ＡＴＰ−クエン酸除去付加酵素（ＡＣＬ）はヤロウィア・リポリティカ酵母（ヤロウィア・リポリティカ由来のＡＣＬ１とＡＣＬＹがサブユニットを構成する遺伝子）が好ましい。
【００２３】
キャンディダ・ユティリス由来のアセチルＣｏＡ合成酵素（ＡＣＳ）遺伝子には、ＡＣＳ１遺伝子とＡＣＳ２遺伝子がある。ＡＣＳ１遺伝子のコード配列は配列番号１１で表され、コードされるアミノ酸配列は配列番号１２で表される。ＡＣＳ２遺伝子のコード配列は配列番号１３で表され、コードされるアミノ酸配列は配列番号１４で表される。アセチルＣｏＡ合成酵素（ＡＣＳ）は、酢酸をアセチルＣｏＡに変換する酵素である。本発明に用いられるＡＣＳ遺伝子はＡＣＳ１およびＡＣＳ２のいずれであってもよいが、好ましくはＡＣＳ２とされる。また、アセチルＣｏＡ合成酵素（ＡＣＳ）の活性を有するポリペプチドは、配列番号１２または配列番号１４で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＡＣＳ活性を有するポリペプチドであってもよい。
【００２４】
キャンディダ・ユティリス由来のアセチルＣｏＡアセチル基転移酵素（ＥＲＧ１０）遺伝子のコード配列は配列番号６１で表され、コードされるアミノ酸配列は配列番号６２で表される。アセチルＣｏＡアセチル基転移酵素（ＥＲＧ１０）は、アセチルＣｏＡをアセトアセチルＣｏＡに変換する酵素である。また、アセチルＣｏＡアセチル基転移酵素（ＥＲＧ１０）の活性を有するポリペプチドは、配列番号６２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＥＲＧ１０活性を有するポリペプチドであってもよい。
【００２５】
ヤロウィア・リポリティカ由来のＡＣＬ１遺伝子のコード配列は配列番号３１で表され、コードされるアミノ酸配列は配列番号３２で表される。また、ＡＣＬ１の活性を有するポリペプチドは、配列番号３２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＡＣＬ１活性を有するポリペプチドであってもよい。さらに、ヤロウィア・リポリティカ由来のＡＣＬＹ遺伝子のコード配列は配列番号３３で表され、コードされるアミノ酸配列は配列番号３４で表される。また、ＡＣＬＹの活性を有するポリペプチドは、配列番号３４で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＡＣＬＹ活性を有するポリペプチドであってもよい。これらのＡＣＬ１とＡＣＬＹをサブユニットとするＡＴＰ−クエン酸除去付加酵素（ＡＣＬ）は、クエン酸をアセチルＣｏＡに変換する酵素である。
【００２６】
キャンディダ・ユティリス由来のミトコンドリア内膜カルニチン輸送体（ＣＲＣ１）遺伝子のコード配列は配列番号２３で表され、コードされるアミノ酸配列は配列番号２４で表される。ミトコンドリア内膜カルニチン輸送体（ＣＲＣ１）は、アセチルカルニチンをミトコンドリアから細胞質へ輸送する酵素である。また、ミトコンドリア内膜カルニチン輸送体（ＣＲＣ１）の活性を有するポリペプチドは、配列番号２４で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＣＲＣ１活性を有するポリペプチドであってもよい。
【００２７】
キャンディダ・ユティリス由来のカルニチンアセチル転移酵素遺伝子（ＹＡＴ１）遺伝子のコード配列は配列番号２７で表され、コードされるアミノ酸配列は配列番号２８で表される。カルニチンアセチル転移酵素遺伝子（ＹＡＴ１）は、アセチルカルニチンをアセチルＣｏＡに変換する酵素である。また、カルニチンアセチル転移酵素遺伝子（ＹＡＴ１）の活性を有するポリペプチドは、配列番号２８で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＹＡＴ１活性を有するポリペプチドであってもよい。
【００２８】
アミノ酸の欠失、置換、付加、又は挿入は、上記ポリペプチドをコードする遺伝子を、当技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法又はＧａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（タカラバイオ社）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（タカラバイオ社）などを用いて、あるいは、タカラバイオ社のＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキット、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）などを用いて変異を導入することができる。上記の各酵素の活性は、当技術分野において公知の手法により確認することができる。
【００２９】
上記の遺伝子に代えて、それぞれの同等物を用いることもできる。この同等物は、それぞれの遺伝子と同等の機能を有することを条件に、一部のヌクレオチド残基が異なる遺伝子を意味する。このような同等物としては、それぞれのヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性（配列同一性）があり、かつ各酵素の活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子が挙げられる。前記同等物としてはさらに、それぞれのヌクレオチド配列もしくはその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ各酵素の活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子が挙げられる。前記同等物としてはさらに、それぞれのヌクレオチド配列において１もしくは数個のヌクレオチド残基が欠失、置換、付加、または挿入された配列を含み、かつ各酵素の活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子が挙げられる。
【００３０】
ここで、ヌクレオチド残基の欠失、置換、付加、又は挿入は、上記配列を含む遺伝子を、当技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法又はＧａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キットを用いればよい。例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（タカラバイオ社）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（タカラバイオ社）などを用いて、あるいは、タカラバイオ社のＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキット、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）などを用いて変異を導入することができる。各酵素の活性は、当技術分野において公知の手法により確認することができる。
【００３１】
相同性（配列同一性）を示す数値（％）は、塩基配列比較用プログラム：例えばＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ７．０．０を用いて、デフォルト（初期設定）のパラメーターにより算出されるものである。すなわち、酵母染色体上の各遺伝子が、同一ではないが同等の機能、すなわち各活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子によって相同組換え等を介して置換されていてもよい。各酵素の活性は、当技術分野において公知の手法により確認することができる。
【００３２】
ストリンジェントな条件とは、例えば、Ｒａｐｉｄ−Ｈｙｂ Ｂｕｆｆｅｒ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用い、温度条件を好ましくは４０〜７０℃、より好ましくは６０℃として、その他は添付のプロトコールに従って行うハイブリダイゼーション条件である。その後、例えば当業者に公知の一般的な方法を用い、２×ＳＳＣと０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳから成り立つ溶液での５分間の洗浄、続いて１×ＳＳＣと０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳから成り立つ溶液での１０分間の洗浄、さらに０．１×ＳＳＣと０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳから成り立つ溶液での１０分間の洗浄を行うことを指す。ただしハイブリダイゼーション時の温度条件や、その後のメンブレンの洗浄に用いる溶液の塩濃度等の条件を適宜設定することにより、ある一定（７０％、８０％、８５％、９０％、９５％のいずれか）以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡをクローニングできる。そのようにして得られる遺伝子が、配列上は同一ではないが同等の機能、すなわち各活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子によって相同組換え等を介して置換されていてもよい。各酵素の活性は、当技術分野において公知の手法により確認することができる。
【００３３】
有用物質を合成するための遺伝子
本発明による酵母菌株は、所望の有用物質の製造に用いるために、該物質の生産に必要となる遺伝子で形質転換されていてもよい。例えば、本発明の方法によってアセチルＣｏＡを経由する代謝産物を製造するために、本発明による酵母菌株は、アセチルＣｏＡを経由する代謝産物を合成するための遺伝子により形質転換されていてもよい。必要な遺伝子は、製造しようとする物質に応じて、当業者であれば適切に選択することができる。
【００３４】
例えば、イソプロパノールを製造しようとする場合には、さらなる遺伝的改変として、イソプロパノール合成遺伝子で酵母菌株を形質転換することができる。イソプロパノール合成遺伝子としては、特開２０１１−９７９２９号公報に記載の酵素遺伝子群など、当業者に公知の遺伝子を用いることができ、例えば、ＣｏＡ基転移酵素サブユニットＡ（ｃｔｆＡ）、同サブユニットＢ（ｃｔｆＢ）、アセト酢酸脱炭酸酵素（ａｄｃ）および二級アルコール脱水素酵素（ｓａｄｈ）の４つの遺伝子の組み合わせを用いることができる。
【００３５】
本発明の一つの実施態様によれば、本発明による酵母菌株は、さらなる遺伝的改変として、ＣｏＡ基転移酵素サブユニットＡ（ｃｔｆＡ）、ＣｏＡ転移酵素サブユニットＢ（ｃｔｆＢ）、アセト酢酸脱炭酸酵素（ａｄｃ）および二級アルコール脱水素酵素（ｓａｄｈ）の活性を有するポリペプチドをコードしている４種の遺伝子により形質転換されている。このような酵母菌株はイソプロパノールの製造に用いることができ、この製造法は、本実施態様による酵母菌株を培養することを含む。
【００３６】
これらの遺伝子は様々な生物に由来するものが知られており、その起源は特に制限されない。例えば、これらの遺伝子は、それぞれ独立に、クロストリジウム・アセトブチリカムまたはクロストリジウム・ベイジェリンキに由来するものとすることができる。それぞれの酵素の起源としては、例えば、ＣｏＡ転移酵素遺伝子サブユニットＡ（ｃｔｆＡ）および同サブユニットＢ（ｃｔｆＢ）はクロストリジウム・アセトブチリカムが好ましく、アセト酢酸脱炭酸酵素（ａｄｃ）および二級アルコール脱水素酵素（ｓａｄｈ）はクロストリジウム・ベイジェリンキが好ましい。
【００３７】
クロストリジウム・アセトブチリカム由来のＣｏＡ転移酵素サブユニットＡ（ｃｔｆＡ）のアミノ酸配列は配列番号２で表される。ＣｏＡ転移酵素サブユニットＡ（ｃｔｆＡ）は、同サブユニットＢ（ｃｔｆＢ）と一緒になって、アセトアセチルＣｏＡをアセト酢酸に変換する酵素である。配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子配列は、クロストリジウム・アセトブチリカム由来の同遺伝子の配列など、当業者であれば適宜選択することができるため、特に制限されないが、好ましくは本発明による酵母菌株の種において頻度の高いコドンを使用した配列とされる。例えば、キャンディダ・ユティリスにおけるコドン頻度に適合した遺伝子配列としては、配列番号１で表されるヌクレオチド配列が挙げられる。ＣｏＡ転移酵素サブユニットＡ（ｃｔｆＡ）の活性を有するポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつｃｔｆＡ活性を有するポリペプチドであってもよい。
【００３８】
クロストリジウム・アセトブチリカム由来のＣｏＡ転移酵素サブユニットＢ（ｃｔｆＢ）のアミノ酸配列は配列番号４で表される。ＣｏＡ転移酵素サブユニットＢ（ｃｔｆＢ）は、同サブユニットＡ（ｃｔｆＡ）と一緒になって、アセトアセチルＣｏＡをアセト酢酸に変換する酵素である。配列番号４で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子配列は、クロストリジウム・アセトブチリカム由来の同遺伝子の配列など、当業者であれば適宜選択することができるため、特に制限されないが、好ましくは本発明による酵母菌株の種において頻度の高いコドンを使用した配列とされる。例えば、キャンディダ・ユティリスにおけるコドン頻度に適合した遺伝子配列としては、配列番号３で表されるヌクレオチド配列が挙げられる。ＣｏＡ転移酵素サブユニットＢ（ｃｔｆＢ）の活性を有するポリペプチドは、配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつｃｔｆＢ活性を有するポリペプチドであってもよい。
【００３９】
クロストリジウム・ベイジェリンキ由来のアセト酢酸脱炭酸酵素（ａｄｃ）のアミノ酸配列は配列番号６で表される。アセト酢酸脱炭酸酵素（ａｄｃ）は、アセト酢酸をアセトンに変換する酵素である。配列番号６で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子配列は、クロストリジウム・ベイジェリンキ由来の同遺伝子の配列など、当業者であれば適宜選択することができるため、特に制限されないが、好ましくは本発明による酵母菌株の種において頻度の高いコドンを使用した配列とされる。例えば、キャンディダ・ユティリスにおけるコドン頻度に適合した遺伝子配列としては、配列番号５で表されるヌクレオチド配列が挙げられる。アセト酢酸脱炭酸酵素（ａｄｃ）の活性を有するポリペプチドは、配列番号６で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつａｄｃ活性を有するポリペプチドであってもよい。
【００４０】
クロストリジウム・ベイジェリンキ由来の二級アルコール脱水素酵素（ｓａｄｈ）のアミノ酸配列は配列番号８で表される。二級アルコール脱水素酵素（ｓａｄｈ）は、アセトンをイソプロパノールに変換する酵素である。配列番号８で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子配列は、クロストリジウム・ベイジェリンキ由来の同遺伝子の配列など、当業者であれば適宜選択することができるため、特に制限されないが、好ましくは本発明による酵母菌株の種において頻度の高いコドンを使用した配列とされる。例えば、キャンディダ・ユティリスにおけるコドン頻度に適合した遺伝子配列としては、配列番号７で表されるヌクレオチド配列が挙げられる。二級アルコール脱水素酵素（ｓａｄｈ）の活性を有するポリペプチドは、配列番号８で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつｓａｄｈ活性を有するポリペプチドであってもよい。
【００４１】
アミノ酸の欠失、置換、付加、又は挿入は、上記ポリペプチドをコードする遺伝子を、当技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法又はＧａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（タカラバイオ社）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（タカラバイオ社）などを用いて、あるいは、タカラバイオ社のＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキット、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）などを用いて変異を導入することができる。上記の各酵素の活性は、当技術分野において公知の手法により確認することができる。
【００４２】
上記の遺伝子に代えて、それぞれの同等物を用いることもできる。この同等物は、それぞれの遺伝子と同等の機能を有することを条件に、一部のヌクレオチド残基が異なる遺伝子を意味する。このような同等物としては、それぞれのヌクレオチド配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性（配列同一性）があり、かつ各酵素の活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子が挙げられる。前記同等物としてはさらに、それぞれのヌクレオチド配列もしくはその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ各酵素の活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子が挙げられる。前記同等物としてはさらに、それぞれのヌクレオチド配列において１もしくは数個のヌクレオチド残基が欠失、置換、付加、または挿入された配列を含み、かつ各酵素の活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子が挙げられる。
【００４３】
ここで、ヌクレオチド残基の欠失、置換、付加、又は挿入は、上記配列を含む遺伝子を、当技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法又はＧａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キットを用いればよい。例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（タカラバイオ社）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（タカラバイオ社）などを用いて、あるいは、タカラバイオ社のＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキット、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）などを用いて変異を導入することができる。各酵素の活性は、当技術分野において公知の手法により確認することができる。
【００４４】
相同性（配列同一性）を示す数値（％）は、塩基配列比較用プログラム：例えばＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ７．０．０を用いて、デフォルト（初期設定）のパラメーターにより算出されるものである。すなわち、酵母染色体上の各遺伝子が、同一ではないが同等の機能、すなわち各活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子によって相同組換え等を介して置換されていてもよい。各酵素の活性は、当技術分野において公知の手法により確認することができる。
【００４５】
ストリンジェントな条件とは、例えば、Ｒａｐｉｄ−Ｈｙｂ Ｂｕｆｆｅｒ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用い、温度条件を好ましくは４０〜７０℃、より好ましくは６０℃として、その他は添付のプロトコールに従って行うハイブリダイゼーション条件である。その後、例えば当業者に公知の一般的な方法を用い、２×ＳＳＣと０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳから成り立つ溶液での５分間の洗浄、続いて１×ＳＳＣと０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳから成り立つ溶液での１０分間の洗浄、さらに０．１×ＳＳＣと０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳから成り立つ溶液での１０分間の洗浄を行うことを指す。ただしハイブリダイゼーション時の温度条件や、その後のメンブレンの洗浄に用いる溶液の塩濃度等の条件を適宜設定することにより、ある一定（７０％、８０％、８５％、９０％、９５％のいずれか）以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡをクローニングできる。そのようにして得られる遺伝子が、配列上は同一ではないが同等の機能、すなわち各活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子によって相同組換え等を介して置換されていてもよい。各酵素の活性は、当技術分野において公知の手法により確認することができる。
【００４６】
イソプロパノール以外にも、リコペンなどの特定のカロテノイド、スクアレンあるいはスクアレンから生産される特定のステロールなどの物質を生産する酵母菌株を構築することが可能である。例えば、Ｅｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａ由来のＧＧＰＰ合成酵素遺伝子、フィトエン合成酵素遺伝子、フィトエン不飽和化酵素遺伝子を発現し、内在性のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素遺伝子（ＨＭＧ１）を過剰発現するキャンディダ・ユティリスはリコペンを高蓄積することが報告されている（Shimada H, Kondo K, Fraser PD, Miura Y, Saito T, Misawa N. Increased carotenoid production by the food yeast Candida utilis through metabolic engineering of the isoprenoid pathway. Appl Environ Microbiol. 1998 Jul;64(7):2676-80）。また、ザイモステロール-２４-メチルトランスフェラーゼ遺伝子およびエルゴスタ５，７，２４，（２８）−トリエノール−２２−脱水素酵素遺伝子の発現に欠損を持ち、ＨＭＧ１が過剰発現するように操作されたサッカロマイセス・セレビシエ組み換え株は、高濃度のスクアレンを蓄積することが知られている（特開平５−１９２１８４号公報）。これらの手法を用いることにより、リコペン、スクアレンを生産する酵母菌株を構築することが可能である。
【００４７】
酵母菌株の分子育種
本発明による酵母菌株の分子育種は、上記の遺伝子群を過剰発現させるための遺伝的改変を酵母菌株に施すこと、例えば、上記の遺伝子群を発現可能な状態で酵母菌株に導入することによって行うことができる。これら遺伝子群は、相同組換え等の技術により酵母の染色体上に組み込まれることが好ましい。このような染色体上への組込みを実現するための相同組換え用遺伝子配列の選択は、当業者において周知であり、当業者であれば必要に応じて適切な相同組換え用遺伝子配列を選択して相同組換え用ＤＮＡ断片を構成することができる。
【００４８】
上記の遺伝子群が酵母ゲノムに組込まれる染色体上の位置は特に制限されるものではないが、例えば、オロチジン５’リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ＵＲＡ３）座、アルファアミノアジピン酸還元酵素遺伝子（ＬＹＳ２）座などを選択することができる。また、これらの遺伝子は、組み込まれた遺伝子座に当初から存在するプロモーター、例えばＵＲＡ３遺伝子プロモーター、ＬＹＳ２遺伝子プロモーターなどの制御下に置いてもよいが、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰ）遺伝子プロモーターなどの他のプロモーターの制御下に置いてもよい。
【００４９】
本発明の好ましい実施態様によれば、本発明による酵母菌株の育種に用いられる酵母はキャンディダ・ユティリスとされる。キャンディダ・ユティリスは、その倍数性が高く、胞子を形成しない。倍数性の高い株の遺伝子に変異を導入しようとする場合、１倍体の株に比べて、その変異を重度に加える必要があるが、その際に、変異を与えたい遺伝子ではない遺伝子にも変異が加えられる可能性が高まると考えられる。従って、キャンディダ・ユティリスの遺伝子に変異を導入する場合には、標的とする遺伝子のみに効率よく多重に変異を加えることができる技術を用いることが好ましい。キャンディダ・ユティリスの形質転換法としては、特開２００３−１４４１８５号公報に記載の技術が挙げられる。この文献では、利用可能なベクターとして、キャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡと相同な配列と、選択マーカー遺伝子とを含んでなり、相同組換えによって異種遺伝子をキャンディダ・ユティリスの染色体ＤＮＡに組み込むことができるもの、あるいは、キャンディダ・ユティリスで自律複製機能を有するＤＮＡ配列と、選択マーカー遺伝子とを含んでなり、高い頻度でキャンディダ・ユティリスを形質転換できるものが開発されている。
【００５０】
形質転換系で利用可能な選択マーカー遺伝子としては、酵母において機能し得る薬剤耐性マーカー、好ましくはシクロヘキシミド耐性型Ｌ４１遺伝子、ジェネティシン（Ｇ４１８）耐性を付与する遺伝子、またはハイグロマイシンＢ耐性を付与する遺伝子などがある。ジェネティシン（Ｇ４１８）耐性を付与する遺伝子、またはハイグロマイシンＢ耐性を付与する遺伝子は、野生の酵母には存在しない配列であるため、標的の遺伝子座に組込まれる確率が高いと考えられている。また、これらの薬剤耐性遺伝子は、その宿主の形質に与える影響も小さいと考えられている（Ｂａｇａｎｚ Ｆら，１３（１６）：１５６３−７３．，１９９７）（Ｃｏｒｄｅｒｏ Ｏｔｅｒｏ Ｒら，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，４６（２）：１４３−８．，１９９６）。
【００５１】
他の形質転換系として、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ−ｌｏｘＰ系が挙げられる。これは、２つの３４ｂｐのｌｏｘＰ配列間での部位特異的組換えシステムであり、この組換えはＣｒｅ遺伝子がコードするＣｒｅ組換え酵素によって触媒される。このシステムは、サッカロマイセス・セレビシエなどの酵母細胞においても機能することが報告されており、２つのｌｏｘＰ配列の間に配置された選択マーカー遺伝子は、ｌｏｘＰ配列間の組換えによって除去されることが知られている（Ｇｕｌｄｅｎｅｒ，Ｕ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２４，２５１９−２４．，１９９６）。このシステムはクルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）など、複数の酵母種で利用されている（Ｓｔｅｅｎｓｍａ，Ｈ．Ｙ．ら，Ｙｅａｓｔ，１８，４６９−７２．，２００１）。
【００５２】
物質の製造方法
本発明による酵母菌株を適当な炭素源の存在下で培養することにより、培養物中に物質（例えばイソプロパノール）を製造することができる。本発明による物質（例えばイソプロパノール）製造法によれば、培養系から物質（例えばイソプロパノール）を分離する工程を実施することにより、物質（例えばイソプロパノール）を得ることができる。なお、本発明において培養物とは、培養上清の他、培養細胞あるいは菌体、細胞もしくは菌体の破砕物を包含している。
【００５３】
本発明による酵母菌株の培養にあたっては、酵母の種類に応じて培養方法や培養条件を選択することができる。培養方法としては、例えば、試験管、フラスコあるいはジャーファーメンターを用いた液体培養法を挙げることができ、回分培養、半回分培養などの培養形式を採用できる。振盪速度および通気量は、一般的には５０〜２００ｒｐｍ、好ましくは８０〜１５０ｒｐｍ、あるいはこの振盪速度に相当する通気量とされる。初期の菌体量としてのＯＤ６００は、一般的には０．１〜３０、好ましくは０．５〜１０とされる。さらに、本発明による酵母菌株の培養にあたっては、振盪速度は速い方が好ましく（つまり通気量は多い方が好ましく）、初期ＯＤ６００は高い方が好ましい。例えば、試験管やフラスコでの培養では、振盪速度は約１２０ｒｐｍまたはそれ以上、初期ＯＤ６００は約１０とすることが好ましい。
【００５４】
本発明による物質（例えばイソプロパノール）製造法において、培地の組成は、酵母が生育し、且つ目的の物質を製造できる各種栄養素を含む組成であればよく、特に限定されない。培地に含まれる資化炭素源としては、例えば、グルコースのほかにもキシロースやスクロースでも資化できれば用いることができる。本発明の好ましい実施態様によれば、炭素源はグルコースを含む。培地中のグルコース濃度は、目的の物質の生産効率を確認しながら、当業者であれば適宜調節することができる。特に、本発明による酵母菌株の培養では、培地中のグルコース濃度は、比較的低濃度に保つことが好ましい。例えば、１９２時間の培養において、グルコースの初期濃度を１００ｇ／Ｌとし、培養７２時間後に終濃度１００ｇ／Ｌとなるようにグルコース固体を添加した場合に比べて、グルコースの初期濃度を５０ｇ／Ｌとし、４８時間後、９６時間後および１４４時間後に終濃度５０ｇ／Ｌとなるようにグルコース固体を添加した場合の方が、物質の生産効率が高い。
【００５５】
培地に含まれる栄養源としては、例えば、酵母エキス、ペプトン、ホエーなどが用いられるが、ＹＰ（１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌペプトン）に上記の資化炭素源を加えた培地、例えばＹＰＤ５（５０ｇ／Ｌグルコース、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌペプトン）等の培地で、さらに適宜ｐＨ調整されたものが便利である。
【００５６】
発酵温度は、用いる酵母の生育可能な範囲で選択することができる。発酵温度は、例えば、約１５℃〜４５℃とすることができ、より好ましくは２０〜４０℃、さらに好ましくは２５〜３５℃、最も好ましくは約３０℃とする。また、発酵過程における培地のｐＨは３〜８に保持することが好ましく、より好ましくはｐＨ４〜７であり、必要に応じてｐＨ調節剤を用いることができる。用いるｐＨ調節剤としては、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等が挙げられるが、好ましくは炭酸カルシウムとされる。
【００５７】
物質（例えばイソプロパノール）製造に要する反応時間は特に限定されず、本発明の効果が認められる限り任意の反応時間で実施される。これらの条件の最適化は、当業者であれば容易に行うことができる。
【００５８】
本発明による物質（例えばイソプロパノール）の製造法においては、このようにして製造した物質（例えばイソプロパノール）成分を培地から分離・回収するが、そのための具体的な手順は、分離・回収しようとする物質に応じて、当業者であれば容易に選択することができる。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体例に説明するが、これら実施例は本発明の技術的範囲を制限するものではない。
【００６０】
実施例１：高いイソプロパノール耐性を示すキャンディダ・ユティリス株の選抜
キャンディダ・ユティリス ＮＢＲＣ０３９６株、ＮＢＲＣ０６１９株、ＮＢＲＣ０９８８株、ＮＢＲＣ０６３９株、ＮＢＲＣ０６２６株、ＮＢＲＣ１０８６株、ＮＢＲＣ１０７０７株、ＡＴＣＣ９２５５株、ＡＴＣＣ２８９５５株、ＡＴＣＣ４４６３８株、ＡＴＣＣ９２０６株、ＡＴＣＣ９６６２１株、ＡＴＣＣ１８２０１株、およびＡＴＣＣ１５２３９株を、ＹＰＤ２（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌグルコース）に接種し、３０℃で培養を行った。定常期の酵母培養液を１０倍ごとに段階希釈し、１０〜１００ｇ／Ｌのイソプロパノールを含むＹＰＤ２寒天培地にスポットし、３０℃で培養した。３日間培養を継続し、コロニーの形成を観察した。結果を表１に記載する。
【００６１】
【表１】
【００６２】
以上の結果より、アッセイを行った株の中では、ＮＢＲＣ１０８６株、ＡＴＣＣ９２５５株、およびＡＴＣＣ１５２３９株が、最も高い６５ｇ／ＬのＩＰＡ耐性を示すことが明らかとなった。
【００６３】
実施例２：ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子が破壊されたキャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ１５２３９株の構築
キャンディダ・ユティリスＡＴＣＣ１５２３９株において、その内因性遺伝子であるピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（ＰＤＣ）を破壊した。この遺伝子破壊は、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを用いて国際公開第２０１０／０９５７５０号パンフレットと同様の方法で行った。２回の破壊により、ＰＤＣ１アレルが完全に欠損した株（ｄＰＤＣ１株）を構築した。ｄＰＤＣ１株は完全にはエタノール生産能を欠損しなかったが、エタノール生産能は著しく低下していた。
【００６４】
実施例３：クロストリジウム・アセトブチリカム由来のＣｏＡ転移酵素サブユニットＡ遺伝子、同サブユニットＢ遺伝子、クロストリジウム・ベイジェリンキ由来のアセト酢酸脱炭酸酵素遺伝子および二級アルコール脱水素酵素遺伝子を発現するベクターの構築
イソプロパノール生合成に関わる４つの遺伝子、クロストリジウム・アセトブチリカム由来のＣｏＡ転移酵素遺伝子サブユニットＡ（ｃｔｆＡ）、同サブユニットＢ（ｃｔｆＢ）、クロストリジウム・ベイジェリンキ由来のアセト酢酸脱炭酸酵素（ａｄｃ）および二級アルコール脱水素酵素（ｓａｄｈ）を効率良くキャンディダ・ユティリスで発現させるために、以下の項目を指標として、天然に存在しない新規な遺伝子配列を設計し、合成した：
（１）キャンディダ・ユティリスにおいて多用されているコドンの使用；
（２）遺伝子クローニングに不適当な制限酵素部位の排除；および
（３）染色体組み込み型発現ベクターに導入するための、５’末端におけるＸｂａＩサイトおよび３’末端におけるＢａｍＨＩサイトの付与。
【００６５】
合成されたＣｏＡ転移酵素遺伝子サブユニットＡ遺伝子、同サブユニットＢ遺伝子、アセト酢酸脱炭酸酵素遺伝子および二級アルコール脱水素酵素遺伝子のヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号１、３、５および７に示す。また、これらのヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２、４、６および８に示す。これらの遺伝子を有するプラスミドをそれぞれＧＡ０９１４２−ｃｔｆＡ、ＧＡ０９１４２−ｃｔｆＢ、ＧＡ０９１４２−ａｄｃ、ＧＡ０９１４２−ｓａｄｈと名付けた。
【００６６】
ｐＶＴ９２は、キャンディダ・ユティリスのオロチジン５’酸脱炭酸酵素遺伝子（ＵＲＡ３）座への組み込みベクターであり、ハイグロマイシン耐性遺伝子を選択マーカーとして有している（国際公開第２０１０／０９５７５０号パンフレット）。ｐＶＴ９２は、ＢｇｌｌＩＩ処理してリニアＤＮＡにすることにより、染色体導入することができる。ｐＶＴ９２は、外来遺伝子を発現させるために、ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩギャップの外側にそれぞれ、グリセルアルデヒド脱水素酵素遺伝子プロモーターとグリセリン酸３’リン酸リン酸化酵素遺伝子ターミネーターを有している。また、ｐＶＴ９２は、プロモーターの５’末端側およびターミネーターの３’末端側には、それぞれＮｈｅＩサイトおよびＳｐｅＩサイトを有している。
【００６７】
ｐＶＴ２３９は、キャンディダ・ユティリスのアルファアミノアジピン酸還元酵素遺伝子（ＬＹＳ２）座への組み込みベクターであり、ジェネティシン耐性遺伝子を選択マーカーとして有している（国際公開第２０１０／０９５７５０号パンフレット）。ｐＶＴ２３９は、ＮｏｔＩ処理してリニアＤＮＡにすることにより、染色体導入することができる。また、ｐＶＴ２３９は、ジェネティシン耐性遺伝子の５’末端側にＳｐｅＩサイトを有している。
【００６８】
各イソプロパノール合成酵素遺伝子を含む４つのベクターＧＡ０９１４２−ｃｔｆＡ、ＧＡ０９１４２−ｃｔｆＢ、ＧＡ０９１４２−ａｄｃ、およびＧＡ０９１４２−ｓａｄｈを、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ処理し、アガロースゲル抽出による精製を行った後、同制限酵素で処理したｐＶＴ９２にライゲーションして、ｐＶＴ２９６、ｐＶＴ２９８、ｐＶＴ３００およびｐＶＴ３０２を得た。ｐＶＴ２９６およびｐＶＴ３００はＳｐｅＩ処理し、脱リン酸化を行った。また、ｐＶＴ２９８およびｐＶＴ３０２はＮｈｅＩ、ＳｐｅＩ処理を行った後、ｃｔｆＢ発現カセット、ｓａｄｈ発現カセットをそれぞれ含むＤＮＡ断片の精製を行い、それぞれｐＶＴ２９６およびｐＶＴ３００に連結して、ｐＶＴ３２１およびｐＶＴ３２５を得た。ｐＶＴ３２５をＮｈｅＩおよびＳｐｅＩで処理した後、ａｄｃ発現カセットとｓａｄｈ発現カセットを含むＤＮＡ断片の精製を行い、ｐＶＴ２３９のＳｐｅＩサイトに導入し、ｐＶＴ３４６を得た。最終的に得られたｐＶＴ３２１はｃｔｆＡとｃｔｆＢのそれぞれの発現カセットとハイグロマイシン耐性遺伝子を有し、キャンディダ・ユティリスのＵＲＡ３座に組み込まれるベクターであり、ｐＶＴ３４６はａｄｃとｓａｄｈのそれぞれの発現カセットとジェネティシン耐性遺伝子を有し、キャンディダ・ユティリスのＬＹＳ２座に組み込まれるベクターである。
【００６９】
実施例４：４つのイソプロパノール合成遺伝子を有するキャンディダ・ユティリス株の構築
ｐＶＴ３２１をＢｇｌｌＩＩで消化し、エタノール沈殿により濃縮した。得られたＤＮＡ断片を用いて、Ｃ. ｕｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ１５２３９株、および実施例２で得られたｄＰＤＣ１株を形質転換し、６００μｇ／ｍＬハイグロマイシンを含むＹＰＤ培地に塗抹し、３０℃で２日間培養した。導入した全ての遺伝子を有する株を選抜した。
【００７０】
さらにｐＶＴ３４６をＮｏｔＩで消化し、エタノール沈殿により濃縮した。得られたそれぞれのＤＮＡ断片を用いて上記で得られた２株をそれぞれ形質転換し、６００μｇ／ｍＬハイグロマイシンと２００μｇ／ｍＬジェネティシンを含むＹＰＤ培地に塗抹し、３０℃で２日間培養した。導入した全ての遺伝子を有する株を選抜し、ＡＴＣＣ１５２３９株由来のイソプロパノール生産株をＴＭＳ２７２株、ｄＰＤＣ株由来のイソプロパノール生産株をＴＭＳ２９０株とした。
【００７１】
実施例５：イソプロパノール生産試験
実施例４で得られた形質転換体のイソプロパノール生産能の評価を、以下に示すように実施した。
【００７２】
各種形質転換体を２ｍＬ ＹＰＤ液体培地（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌグルコース）／１４ｍＬ容試験管に接種し、１４０ｒｐｍ、３０℃で２４時間振とう培養した。得られた前培養液を１００ｍＬ ＹＰＤ１０（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、１００ｇ／Ｌグルコース）／２００ｍＬ容三角フラスコもしくはＹＰＤ１０Ｃ（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、１００ｇ／Ｌグルコース、４５ｇ／Ｌ炭酸カルシウム）／２００ｍＬ容三角フラスコに接種し、初期ＯＤ６００＝１、１００ｒｐｍ、３０℃で振とう培養した。培養液から経時的にサンプリングし、０．２μｍフィルターでろ過した後に、各種成分の定量分析を行った。グルコース、酢酸、エタノールおよびグリセロールは、高速液体クロマトフラフィー（島津製作所製）、ＩＳｅｐ−ＩＯＮ３００カラム（東京化成工業製）および示唆屈折計を用いて定量した。イソプロパノールおよびアセトンは、ガスクロマトフラフィーＧＣ−２０１０ Ｐｌｕｓ（島津製作所製）を用いて定量した。
【００７３】
また、フラスコでの簡易的な中和培養としてＹＰＤ１０Ｃ（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、１００ｇ／Ｌグルコース、４５ｇ／Ｌ炭酸カルシウム）培地を用いても同様の実験を行った。
【００７４】
非中和条件下での培養試験の結果を図２、中和条件下での培養試験の結果を図３に記載する。なお、データは３反復試行の平均で示した。
【００７５】
図２によれば、親株であるＡＴＣＣ１５２３９株およびｄＰＤＣ１株ではイソプロパノールの生産が認められなかったのに対し、イソプロパノール合成遺伝子を導入したＴＭＳ２７２株およびＴＭＳ２９０株では、それぞれ最大で０．１６ｇ／Ｌおよび０．１３ｇ／Ｌのイソプロパノールの生産が認められた。また、ＰＤＣ１遺伝子を破壊した株では糖の消費速度および増殖能が著しく低下していた。ＴＭＳ２７２株では培養２４時間でグルコースが完全に消費され、エタノールの蓄積が認められたが、その後の培養の継続に伴ってエタノール濃度が低下した。エタノール濃度が低下している間もイソプロパノールの生産が認められたことから、ＴＭＳ２７２株は、一度生産したエタノールを二次消費することによりイソプロパノールを生産していることが考えられた。ｄＰＤＣ１株に由来するＴＭＳ２９０株ではイソプロパノール生産速度が低下したことから、酵母におけるイソプロパノール生産においては、基質である細胞質のアセチルＣｏＡがエタノールから供給される経路が最も重要であることが示唆された。エタノールの同化は酸化的反応であることから、これらの結果は、酵母によるイソプロパノール生産においてはキャンディダ・ユティリスのような呼吸活性の高いクラブツリー陰性酵母が適している可能性を示唆している。
【００７６】
図３によれば、培地に炭酸カルシウムを添加したことにより、ＴＭＳ２７２株は１．１ｇ／Ｌのイソプロパノールを生産し、非中和条件より生産量が増大した。また、ＴＭＳ２７２株は、１６．２ｇ／Ｌの酢酸を蓄積しており、何らかの理由により酢酸が蓄積したことでｐＨが低下し、イソプロパノールの生産を阻害していたことが考えられた。また、ＴＭＳ２９０株においても、中和条件下ではイソプロパノール生産量が０．９ｇ／Ｌまで増大しており、一方で３７．４ｇ／Ｌという高濃度のグリセロールを蓄積していた。
【００７７】
実施例６：過剰発現によってイソプロパノール生産性を向上させる遺伝子の選抜
過剰発現することによりイソプロパノールの生産性を向上させる遺伝子の選抜を行った。候補遺伝子が触媒する代謝経路を図１に記載する。
【００７８】
キャンディダ・ユティリス内在性のアセチルＣｏＡ加水分解酵素遺伝子（ＡＣＨ１；ヌクレオチド配列：配列番号９；アミノ酸配列：配列番号１０）、アセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子（ＡＣＳ１；ヌクレオチド配列：配列番号１１；アミノ酸配列：配列番号１２、ＡＣＳ２；ヌクレオチド配列：配列番号１３；アミノ酸配列：配列番号１４）、細胞質局在型エタノール脱水素酵素遺伝子（ＡＤＨ２；ヌクレオチド配列：配列番号１５；アミノ酸配列：配列番号１６）、ミトコンドリア局在型エタノール脱水素酵素遺伝子（ＡＤＨ３；ヌクレオチド配列：配列番号１７；アミノ酸配列：配列番号１８）、細胞質局在型アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子（ＡＬＤ１；ヌクレオチド配列：配列番号１９；アミノ酸配列：配列番号２０）、ミトコンドリア局在型アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子（ＡＬＤ２；ヌクレオチド配列：配列番号２１；アミノ酸配列：配列番号２２）、ミトコンドリア内膜カルニチン輸送体（ＣＲＣ１；ヌクレオチド配列：配列番号２３；アミノ酸配列：配列番号２４）、ミトコンドリア局在型カルニチンアセチルCoA転移酵素（ＣＡＴ２；ヌクレオチド配列：配列番号２５；アミノ酸配列：配列番号２６）、カルニチンアセチル転移酵素遺伝子（ＹＡＴ１；ヌクレオチド配列：配列番号２７；アミノ酸配列：配列番号２８、ＹＡＴ２；ヌクレオチド配列：配列番号２９；アミノ酸配列：配列番号３０）、アセチルＣｏＡアセチル基転移酵素（ＥＲＧ１０；ヌクレオチド配列：配列番号６１；アミノ酸配列：配列番号６２）、ヤロウィア・リポリティカ由来のＡＴＰ−クエン酸除去付加酵素遺伝子（ＡＣＬ１；ヌクレオチド配列：配列番号３１；アミノ酸配列：配列番号３２と、ＡＣＬＹ；ヌクレオチド配列：配列番号３３；アミノ酸配列：配列番号３４がサブユニットを構成する遺伝子）を、それぞれのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲに用いたプライマーは以下の通りである：（ＡＣＨ１；配列番号３５と配列番号３６）、（ＡＣＳ１；配列番号３７と配列番号３８）、（ＡＣＳ２；配列番号３９と配列番号４０）、（ＡＤＨ２；配列番号４１と配列番号４２）、（ＡＤＨ３；配列番号４３と配列番号４４）、（ＡＬＤ１；配列番号４５と配列番号４６）、（ＡＬＤ２；配列番号４７と配列番号４８）、（ＣＡＴ２；配列番号４９と配列番号５０）、（ＣＲＣ１；配列番号５１と配列番号５２）、（ＹＡＴ１；配列番号５３と配列番号５４）、（ＹＡＴ２；配列番号５５と配列番号５６）、（ＡＣＬ１；配列番号５７と配列番号５８）、（ＡＣＬＹ；配列番号５９と配列番号６０）、（ＥＲＧ１０；配列番号６３と配列番号６４）。
【００７９】
得られたＰＣＲ産物をＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ処理して、同制限酵素で処理したｐＣＵ１５５（Keiji Kondo, , Yutaka Miura, Hidetaka Sone, Kazuo Kobayashi & Hiroshi lijima., High-level expression of a sweet protein, monellin, in the food yeast Candida utilis., Nature Biotechnology 15, 453 - 457 (1997)）にクローニングした。ｐＣＵ１５５は、シクロヘキシミド耐性遺伝子を選抜マーカーとして有し、ＵＲＡ３座にマルチコピーインテグレーションされるベクターであり、ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩギャップの外側にそれぞれ、グリセルアルデヒド脱水素酵素遺伝子プロモーターと同ターミネーターを有している。これまでに構築しているイソプロパノール生産株のＵＲＡ３座にはイソプロパノール合成酵素遺伝子が組み込まれているが、Ｃ.ｕｔｉｌｉｓは高次倍数体であり、ＵＲＡ３座が複数コピー存在するため、さらにＵＲＡ３座に遺伝子の導入が可能である。また、イソプロパノール合成遺伝子はＵＲＡ３座に二点組み換えにより挿入されているため、ｐＣＵ１５５の組み込みにより、導入された遺伝子の置換が起こることはない。候補遺伝子がクローン化されたプラスミドはＢｇｌｌＩＩで消化し、エタノール沈殿により濃縮した。得られたＤＮＡ断片を用いてＣ.ｕｔｉｌｉｓ ＴＭＳ２７２株を形質転換し、６００μｇ／ｍＬハイグロマイシン、２００μｇ／ｍＬジェネティシンおよび２０μｇ／ｍＬシクロヘキシミドを含むＹＰＤ培地に塗抹し、３０℃で４日間培養した。なお、ＡＣＬ１とＡＣＬＹのＤＮＡは混合し、同時に形質転換を行った。得られた各４クローンについて発酵試験を行い、イソプロパノール生産性を調査した。結果を図４に示す。
【００８０】
図４によると、ＡＣＳ１、ＡＣＳ２、ＣＲＣ１、ＹＡＴ１、ＥＲＧ１０、またはＡＣＬの過剰発現により、イソプロパノール生産量が１．５〜４．０倍になることが明らかとなった。ＡＣＳ１、ＡＣＳ２、ＹＡＴ１、およびＡＣＬの各遺伝子はアセチルＣｏＡの合成に関わる酵素遺伝子であり、ＣＲＣ１遺伝子はアセチルＣｏＡ合成の前駆物質をミトコンドリアから細胞質に輸送するキャリアタンパク質遺伝子であり、ＥＲＧ１０遺伝子はアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する遺伝子である。これらの結果により、酵母によるイソプロパノール高生産のためには、細胞質のアセチルＣｏＡを効率的に生産するための酵素遺伝子の発現または活性をアップレギュレートすることが重要であることが示される。
【００８１】
実施例７：ＡＣＬ１／ＡＣＬＹ、ＡＣＳ２、ＥＲＧ１０、ＣＲＣ１およびＹＡＴ１を同時に過剰発現するイソプロパノール生産株の構築と培養試験
ＡＣＬ１、ＡＣＬＹ、ＡＣＳ２、ＥＲＧ１０、ＣＲＣ１およびＹＡＴ１の各遺伝子がクローン化されたプラスミドをＢｇｌｌＩＩで消化し、エタノール沈殿により濃縮した。得られた各５μｇのＤＮＡ断片を混合し、この混合物を用いてＴＭＳ２７２株を形質転換し、６００μｇ／ｍＬハイグロマイシン、２００μｇ／ｍＬジェネティシンおよび１０μｇ／ｍＬシクロヘキシミドを含むＹＰＤ培地に塗抹し、３０℃で４日間培養した。得られた８０クローンについて発酵試験を行い、イソプロパノール生産量が最も高い株を選抜し、ＴＭＳ３７８株とした。
【００８２】
ＴＭＳ３７８株の培養試験を行った結果を図５に示す。ＴＭＳ２７２株が１．３ｇ／Ｌのイソプロパノールを生産したのに対して、ＴＭＳ３７８株は９．８ｇ／Ｌと約７．５倍のイソプロパノール生産量を示した。また、ＴＭＳ２７２株では酢酸が１８．１ｇ／Ｌ蓄積したのに対して、ＴＭＳ３７８株は４．５ｇ／Ｌと、主要な副産物である酢酸が約４分の１に低下していた。
【００８３】
実施例８：ＴＭＳ３７８株のイソプロパノール生産における初期ＯＤ６００および振とう速度の影響
イソプロパノール生産に適したＴＭＳ３７８株の培養条件の検討を行った。ＴＭＳ３７８株を２ｍＬ ＹＰＤ液体培地（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌグルコース）／１４ｍＬ容試験管に接種し、１４０ｒｐｍ、３０℃で２４時間振とう培養した。得られた前培養液を１００ｍＬ ＹＰＤ１０Ｃ（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、１００ｇ／Ｌグルコース、４５ｇ／Ｌ炭酸カルシウム）／３００ｍＬ容三角フラスコに接種し、初期ＯＤ６００を１もしくは１０とし、１００ｒｐｍもしくは１２０ｒｐｍ、３０℃で振とう培養した。培養７２時間後に終濃度１００ｇ／Ｌとなるようにグルコース固体を培養液に添加し、さらに１４４時間まで培養を行った。経時的にサンプリングして０．２μｍフィルターでろ過した。各種定量分析は、実施例５に記載の方法に従って行った。なお、データは３反復試行の平均で示した。結果を図６に示す。
【００８４】
図６によると、初期ＯＤ６００＝１０、１２０ｒｐｍで培養したときに最も高いイソプロパノール生産量が見られ、培養１４４時間後に最大で１８．５ｇ／Ｌのイソプロパノールが生産された。その際の対糖収率は３０．８％であった。このことから、振とう速度が速いほど（通気量が多いほど）、また、初期ＯＤが高いほど、イソプロパノール生産には好ましいことが明らかとなった。
【００８５】
実施例９：ＴＭＳ３７８株のイソプロパノール生産における添加グルコース濃度の影響
イソプロパノール生産に適したＴＭＳ３７８株の培養条件の検討を行った。ＴＭＳ３７８株を２ｍＬ ＹＰＤ液体培地（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌグルコース）／１４ｍＬ容試験管に接種し、１４０ｒｐｍ、３０℃で２４時間振とう培養した。得られた前培養液を１００ｍＬ ＹＰＤ１０Ｃ（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、１００ｇ／Ｌグルコース、４５ｇ／Ｌ炭酸カルシウム）／３００ｍＬ容三角フラスコもしくはＹＰＤ５Ｃ（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、５０ｇ／Ｌグルコース、４５ｇ／Ｌ炭酸カルシウム）／３００ｍＬ容三角フラスコに接種し、初期ＯＤ６００＝１、１２０ｒｐｍ、３０℃で振とう培養した。ＹＰＤ１０Ｃで培養を行ったサンプルについては、培養７２時間後に終濃度１００ｇ／Ｌとなるようにグルコース固体を添加し、さらに１９２時間まで培養を行った。また、ＹＰＤ５Ｃで培養を行ったサンプルについては、培養４８時間おきに３回終濃度５０ｇ／Ｌとなるようにグルコース固体を添加し、さらに１９２時間まで培養を行った。いずれの条件も最終のグルコース濃度は２００ｇ／Ｌである。経時的にサンプリングして０．２μｍフィルターでろ過した。各種定量分析は、実施例５に記載の方法に従って行った。なお、データは３反復試行の平均で示した。結果を図７に示す。
【００８６】
図７によると、ＹＰＤ１０Ｃで培養し、培養７２時間後に１００ｇ／Ｌのグルコースを添加した場合は、培養１２２時間後に最大で１９．２ｇ／Ｌのイソプロパノールが生産された。しかし、それ以降はイソプロパノール生産量の増大は認められず、酢酸が蓄積した(２７．２ｇ／Ｌ）。イソプロパノールの生産における最大の対糖収率は２９．０％であった。一方、ＹＰＤ５Ｃで培養し、４８時間おきに５０ｇ／Ｌのグルコースを３回添加した場合は、培養１９２時間までイソプロパノールの増大が認められ、培養１９２時間後に最大で２７．４ｇ／Ｌのイソプロパノールが生産された。また、酢酸の蓄積はほとんど認めれらなかった。この条件でのイソプロパノールの生産における最大の対糖収率は４１．５％であった。このことから、添加するグルコースの濃度を比較的低濃度に保つことはイソプロパノール生産において好ましいことが明らかとなった。
【００８７】
実施例１０：イソプロパノール生産量向上に寄与の大きい遺伝子の特定
同時に過剰発現することによってイソプロパノール生産量を向上させる寄与の大きい遺伝子を特定するために、(i)ＡＣＬ１、ＡＣＬＹおよびＡＣＳ２の組み合わせを過剰発現する株、(ii)ＡＣＬ１、ＡＣＬＹおよびＥＲＧ１０の組み合わせを過剰発現する株、(iii)ＡＣＳ２およびＥＲＧ１０の組み合わせを過剰発現する株、(iv)ＡＣＬ１、ＡＣＬＹ、ＡＣＳ２およびＥＲＧ１０の組み合わせを過剰発現する株をそれぞれ構築し、ＡＣＬ１、ＡＣＬＹ、ＡＣＳ２、ＣＲＣ１、ＥＲＧ１０およびＹＡＴ１の組み合わせを過剰発現する株（ＴＭＳ３７８株）およびそれぞれの単独遺伝子の過剰発現株との間で、イソプロパノール生産量の比較を行った。組み換え株の構築は実施例６および実施例７と同様の方法を用いて行い、組み込みたい遺伝子ＤＮＡを混合し、同時に形質転換を行った。得られた各３２クローンについて発酵試験を行い、それぞれの導入遺伝子の組み合わせにおいて平均的なイソプロパノール生産量を示す株を選抜した。各構築株を２ｍＬ ＹＰＤ液体培地（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌグルコース）／１４ｍＬ容試験管に接種し、１４０ｒｐｍ、３０℃で２４時間振とう培養した。得られた前培養液を３ｍＬ ＹＰＤ１０Ｃ（２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、１００ｇ／Ｌグルコース、４５ｇ／Ｌ炭酸カルシウム）／ガラス試験管に接種し、初期ＯＤ６００＝１、１００ｒｐｍ、３０℃で振とう培養した。経時的にサンプリングを行い、高速液体クロマトフラフィーおよびガスクロマトフラフィーＧＣ−２０１０でイソプロパノール生産量を評価した。なお、データは３反復試行の平均で示した。
【００８８】
図８によると、ＡＣＳ１、ＡＣＳ２およびＥＲＧ１０のそれぞれ単独の過剰発現により、イソプロパノール生産量が２．２〜２．７倍になることが明らかとなった。(i)ＡＣＬ１、ＡＣＬＹおよびＡＣＳ２の組み合わせを過剰発現する株、ならびに(ii)ＡＣＬ１、ＡＣＬＹおよびＥＲＧ１０の組み合わせを過剰発現する株のイソプロパノール生産量は、それぞれＡＣＳ２およびＥＲＧ１０を単独で過剰発現する株と有意な差は認められなかった。一方、(iii)ＡＣＳ２およびＥＲＧ１０の組み合わせを過剰発現する株ではイソプロパノール生産の飛躍的な向上が認められ、生産量が１１．６倍に向上した。また、(iii)ＡＣＳ２およびＥＲＧ１０の組み合わせを過剰発現する株、(iv)ＡＣＬ１、ＡＣＬＹ、ＡＣＳ２およびＥＲＧ１０の組み合わせを過剰発現する株、ＴＭＳ３７８株（ＡＣＬ１、ＡＣＬＹ、ＡＣＳ２、ＣＲＣ１、ＥＲＧ１０およびＹＡＴ１の組み合わせを過剰発現する株）の株間において、イソプロパノール生産量に有意な差は認められなかった。
【００８９】
これらの結果より、同時に過剰発現した際にはＡＣＬ、ＣＲＣ１およびＹＡＴ１の過剰発現がイソプロパノールの生産性向上に与える寄与は小さく、イソプロパノール生産性を向上させるためにはＡＣＳ２とＥＲＧ１０を同時に過剰発現することが最も重要であることが示された。以上の結果は、酵母によるイソプロパノール高生産のためにはエタノールからアセチルＣｏＡを合成する代謝経路、すなわち酢酸からアセチルＣｏＡを合成する代謝経路に関わる酵素遺伝子の発現または活性を増強することが重要であることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】図１は、酵母によるイソプロパノール合成経路を示す図である。
【図２】図２は、イソプロパノール生産遺伝子を導入した株の非中和条件での発酵試験の結果を示す図であり、培養液中のイソプロパノール濃度（パネルＡ）、グルコース濃度（パネルＢ）、エタノール濃度（パネルＣ）、酢酸濃度（パネルＤ）、グリセロール濃度（パネルＥ）およびＯＤ６００（パネルＦ）の経時変化を示している。各パネルにおいて、黒丸はＡＴＣＣ１５２３９株の結果を示し、白丸はＴＭＳ２７２株（ＡＴＣＣ１５２３９株＋ＩＰＡ合成遺伝子）の結果を示し、黒三角はＰＤＣ１破壊株の結果を示し、白三角はＴＭＳ２９０株（ＰＤＣ破壊株＋ＩＰＡ合成遺伝子）の結果を示す。
【図３】図３は、イソプロパノール生産遺伝子を導入した株の中和条件での発酵試験の結果を示す図であり、培養液中のイソプロパノール濃度（パネルＡ）、グルコース濃度（パネルＢ）、エタノール濃度（パネルＣ）、酢酸濃度（パネルＤ）およびグリセロール濃度（パネルＥ）の経時変化を示している。各パネルにおいて、黒丸はＡＴＣＣ１５２３９株の結果を示し、白丸はＴＭＳ２７２株（ＡＴＣＣ１５２３９株＋ＩＰＡ合成遺伝子）の結果を示し、黒三角はＰＤＣ１破壊株の結果を示し、白三角はＴＭＳ２９０株（ＰＤＣ破壊株＋ＩＰＡ合成遺伝子）の結果を示す。
【図４】図４は、ＴＭＳ２７２株において、各種遺伝子を過剰発現させた場合におけるイソプロパノール生産量を、ＴＭＳ２７２株によるイソプロパノール生産量に対する相対量として示したグラフである。
【図５】図５は、イソプロパノール生酸性を向上させる遺伝子を全て過剰発現する株の発酵試験の結果を示す図であり、培養液中のイソプロパノール濃度（パネルＡ）、グルコース濃度（パネルＢ）、エタノール濃度（パネルＣ）、酢酸濃度（パネルＤ）、グリセロール濃度（パネルＥ）およびアセトン濃度（パネルＦ）の経時変化を示している。各パネルにおいて、黒丸はＴＭＳ２７２株の結果を示し、白丸はＴＭＳ３７８株（ＴＭＳ２７２株＋ＡＣＬ１：ＡＣＬＹ：ＡＣＳ２：ＥＲＧ１０：ＣＲＣ１：ＹＡＴ１）の結果を示す。
【図６】図６は、イソプロパノール生産性を向上させる遺伝子を全て過剰発現するＴＭＳ３７８株の３０℃での発酵試験（初期ＯＤ６００および振とう速度の影響）の結果を示す図であり、培養液中のイソプロパノール濃度（パネルＡ）、グルコース濃度（パネルＢ）、エタノール濃度（パネルＣ）、酢酸濃度（パネルＤ）、グリセロール濃度（パネルＥ）およびアセトン濃度（パネルＦ）の経時変化を示している。各パネルにおいて、黒丸は初期ＯＤ６００＝１かつ攪拌数＝１００ｒｐｍの条件下での結果を示し、黒三角は初期ＯＤ６００＝１かつ攪拌数＝１２０ｒｐｍの条件下での結果を示し、白丸は初期ＯＤ６００＝１０かつ攪拌数＝１００ｒｐｍの条件下での結果を示し、白三角は初期ＯＤ６００＝１０かつ攪拌数＝１２０ｒｐｍの条件下での結果を示す。
【図７】図７は、イソプロパノール生産性を向上させる遺伝子を全て過剰発現するＴＭＳ３７８株の３０℃での発酵試験（流加グルコース濃度の影響）の結果を示す図である。パネルＡは、初期グルコース濃度を１００ｇ／Ｌとし、培養７２時間後に１００ｇ／ｌのグルコースを流加して、１９２時間培養を行った結果を示す。パネルＢは、初期グルコース濃度を５０ｇ／Ｌとし、培養４８時間後、９６時間後および１４４時間後にそれぞれ５０ｇ／ｌのグルコースを流加して、１９２時間培養を行った結果を示す。各パネルにおいて、イソプロパノール濃度（黒三角）、グルコース濃度（黒丸）、エタノール濃度（白丸）および酢酸濃度（白三角）の経時変化を示している。
【図８】図８は、ＴＭＳ２７２株において、各種遺伝子を過剰発現させた場合におけるイソプロパノール生産量を示したグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の酵素：
（ａ）アセチルＣｏＡ合成酵素（ＡＣＳ）；および
（ｂ）アセチルＣｏＡアセチル基転移酵素（ＥＲＧ１０）
の活性が増強されている、酵母菌株。
【請求項２】
以下の遺伝子：
（ａ）アセチルＣｏＡ合成酵素（ＡＣＳ）の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；および
（ｂ）アセチルＣｏＡアセチル基転移酵素（ＥＲＧ１０）の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
の発現が増強されている、請求項１に記載の酵母菌株。
【請求項３】
ＡＣＳ活性を有するポリペプチドが、
（i）配列番号１２または配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
（ii）配列番号１２または配列番号１４で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＡＣＳ活性を有するポリペプチド
である、請求項２に記載の酵母菌株。
【請求項４】
ＥＲＧ１０活性を有するポリペプチドが、
（i）配列番号６２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
（ii）配列番号６２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＥＲＧ１０活性を有するポリペプチド
である、請求項２または３に記載の酵母菌株。
【請求項５】
さらに、以下の遺伝子：
（ｃ）ＡＴＰ−クエン酸除去付加酵素（ＡＣＬ）の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｄ）ミトコンドリア内膜カルニチン輸送体（ＣＲＣ１）の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；および
（ｅ）カルニチンアセチル転移酵素遺伝子（ＹＡＴ１）の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
からなる群から選択される少なくとも一種の遺伝子の発現が増強されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵母菌株。
【請求項６】
ＡＣＬ活性を有するポリペプチドが、ＡＣＬ１活性を有するポリペプチドおよびＡＣＬＹ活性を有するポリペプチドからなるものであり、
ＡＣＬ１活性を有するポリペプチドが、
（i）配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
（ii）配列番号３２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＡＣＬ１活性を有するポリペプチド
であり、
ＡＣＬＹ活性を有するポリペプチドが、
（i）配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
（ii）配列番号３４で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＡＣＬＹ活性を有するポリペプチド
である、請求項５に記載の酵母菌株。
【請求項７】
ＣＲＣ１活性を有するポリペプチドが、
（i）配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
（ii）配列番号２４で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＣＲＣ１活性を有するポリペプチド
である、請求項５または６に記載の酵母菌株。
【請求項８】
ＹＡＴ１活性を有するポリペプチドが、
（i）配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
（ii）配列番号２８で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＹＡＴ１活性を有するポリペプチド
である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の酵母菌株。
【請求項９】
クラブツリー効果陰性酵母である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の酵母菌株。
【請求項１０】
キャンディダ・ユティリスである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の酵母菌株。
【請求項１１】
アセチルＣｏＡを経由する代謝産物を合成するための遺伝子により形質転換されているものである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵母菌株。
【請求項１２】
ＣｏＡ転移酵素サブユニットＡ（ｃｔｆＡ）、ＣｏＡ転移酵素サブユニットＢ（ｃｔｆＢ）、アセト酢酸脱炭酸酵素（ａｄｃ）および二級アルコール脱水素酵素（ｓａｄｈ）の活性を有するポリペプチドをコードしている４種の遺伝子により形質転換されてなる、請求項１１に記載の酵母菌株。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の酵母菌株を培養することを含んでなる、物質を製造する方法。
【請求項１４】
前記物質が、アセチルＣｏＡを経由する代謝産物である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記物質がイソプロパノールである、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１】
以下の酵素：
（ａ）アセチルＣｏＡ合成酵素（ＡＣＳ）；および
（ｂ）アセチルＣｏＡアセチル基転移酵素（ＥＲＧ１０）
の活性が増強されている、酵母菌株。
【請求項２】
以下の遺伝子：
（ａ）アセチルＣｏＡ合成酵素（ＡＣＳ）の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；および
（ｂ）アセチルＣｏＡアセチル基転移酵素（ＥＲＧ１０）の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
の発現が増強されている、請求項１に記載の酵母菌株。
【請求項３】
ＡＣＳ活性を有するポリペプチドが、
（i）配列番号１２または配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
（ii）配列番号１２または配列番号１４で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＡＣＳ活性を有するポリペプチド
である、請求項２に記載の酵母菌株。
【請求項４】
ＥＲＧ１０活性を有するポリペプチドが、
（i）配列番号６２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
（ii）配列番号６２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＥＲＧ１０活性を有するポリペプチド
である、請求項２または３に記載の酵母菌株。
【請求項５】
さらに、以下の遺伝子：
（ｃ）ＡＴＰ−クエン酸除去付加酵素（ＡＣＬ）の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｄ）ミトコンドリア内膜カルニチン輸送体（ＣＲＣ１）の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；および
（ｅ）カルニチンアセチル転移酵素遺伝子（ＹＡＴ１）の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
からなる群から選択される少なくとも一種の遺伝子の発現が増強されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵母菌株。
【請求項６】
ＡＣＬ活性を有するポリペプチドが、ＡＣＬ１活性を有するポリペプチドおよびＡＣＬＹ活性を有するポリペプチドからなるものであり、
ＡＣＬ１活性を有するポリペプチドが、
（i）配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
（ii）配列番号３２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＡＣＬ１活性を有するポリペプチド
であり、
ＡＣＬＹ活性を有するポリペプチドが、
（i）配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
（ii）配列番号３４で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＡＣＬＹ活性を有するポリペプチド
である、請求項５に記載の酵母菌株。
【請求項７】
ＣＲＣ１活性を有するポリペプチドが、
（i）配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
（ii）配列番号２４で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＣＲＣ１活性を有するポリペプチド
である、請求項５または６に記載の酵母菌株。
【請求項８】
ＹＡＴ１活性を有するポリペプチドが、
（i）配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
（ii）配列番号２８で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含み、かつＹＡＴ１活性を有するポリペプチド
である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の酵母菌株。
【請求項９】
クラブツリー効果陰性酵母である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の酵母菌株。
【請求項１０】
キャンディダ・ユティリスである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の酵母菌株。
【請求項１１】
アセチルＣｏＡを経由する代謝産物を合成するための遺伝子により形質転換されているものである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵母菌株。
【請求項１２】
ＣｏＡ転移酵素サブユニットＡ（ｃｔｆＡ）、ＣｏＡ転移酵素サブユニットＢ（ｃｔｆＢ）、アセト酢酸脱炭酸酵素（ａｄｃ）および二級アルコール脱水素酵素（ｓａｄｈ）の活性を有するポリペプチドをコードしている４種の遺伝子により形質転換されてなる、請求項１１に記載の酵母菌株。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の酵母菌株を培養することを含んでなる、物質を製造する方法。
【請求項１４】
前記物質が、アセチルＣｏＡを経由する代謝産物である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記物質がイソプロパノールである、請求項１３または１４に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１２−２５４０４４（Ｐ２０１２−２５４０４４Ａ）
【公開日】平成２４年１２月２７日（２０１２．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１２９５２７（Ｐ２０１１−１２９５２７）
【出願日】平成２３年６月９日（２０１１．６．９）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２２年度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構・グリーン・サステイナブルケミカルプロセス基盤技術開発委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００２５３５０３）キリンホールディングス株式会社 (247)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１２月２７日（２０１２．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年６月９日（２０１１．６．９）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２２年度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構・グリーン・サステイナブルケミカルプロセス基盤技術開発委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００２５３５０３）キリンホールディングス株式会社 (247)
【Ｆターム（参考）】
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