説明

酵母におけるHPV45L1の最適化された発現

【課題】HPV45L1タンパク質をコードする合成DNA分子を提供する。
【解決手段】酵母細胞において高レベルで発現されるようにコドン最適化されてた、HPV45L1タンパク質をコードするポリヌクレオチド。前記合成ポリヌクレオチド分子の、HPV45ウイルス様粒子(VLP)の製造、並びにHPV45VLPを含むワクチン及び薬剤組成物の製造への使用。該ワクチンによる、パピローマウイルス感染に対して、中和抗体及び細胞性免疫による有効な免疫学的予防方法。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、一般に、ヒトパピローマウイルス(HPV)の治療に関する。より詳細には、本発明は、HPV45 L1タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチド並びに前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター及び宿主に関する。本発明は、酵母細胞中で組換えHPV 45 L1又はL1+L2を発現させることによって産生されるHPV45ウイルス様粒子(VLP)、並びにHPVを予防し、治療するワクチン及び薬剤組成物におけるそれらの使用にも関する。
【背景技術】
【0002】
ヒトパピローマウイルス(HPV)には80を超えるタイプがあり、それらの多くは、良性の増殖性いぼから悪性癌腫まで多種多様な生物学的表現型を伴う(総説としてMcMurray等、Int. J. Exp. Pathol. 82(1):15−33(2001)を参照されたい)。HPV6及びHPV11は、生殖器又は呼吸器粘膜の良性のいぼ及び/又は非悪性尖圭コンジローマに最も一般的に付随するタイプである。HPV16及びHPV18は、頚部、膣、外陰部及び肛門管の原位置の浸潤癌に最も頻繁に付随するハイリスクなタイプである。90%を超える子宮頚癌がHPV16、HPV18の感染を伴い、又はそれよりも蔓延していない腫瘍形成タイプHPV31、−33、−45、−52及び−58の感染を伴う(Schiffman等、J. Natl. Cancer Inst. 85(12):958−64(1993))。90%を超える子宮頚癌においてHPV DNAが検出されるという観察結果は、HPVが子宮頚癌を引き起こすという強力な疫学的証拠である(Bosch等、J. Natl. Cancer Inst. 87(11):796−802(1995)参照)。
【0003】
パピローマウイルスは、最高8個の初期遺伝子と2個の後期遺伝子をコードする小さく(50から60nm)、エンベロープを持たない正二十面体DNAウイルスである。ウイルスゲノムのオープンリーディングフレーム(ORF)はE1からE7並びにL1及びL2と称される。ここで、「E」は初期、「L」は後期を表す。L1及びL2はウイルスカプシッドタンパク質をコードし、E遺伝子はウイルスの複製、細胞の形質転換などの機能と関連がある。
【0004】
L1タンパク質は、主要なカプシッドタンパク質であり、分子量が55から60kDaである。L2タンパク質は、副次的なカプシッドタンパク質である。免疫学的データによれば、L2タンパク質の大部分は、ウイルスカプシッド中のL1タンパク質の内側にある。L1とL2の両方のタンパク質は、さまざまなパピローマウイルス間で高度に保存されている。
【0005】
酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞又は細菌におけるL1タンパク質又はL1とL2タンパク質の組み合わせの発現によって、ウイルス様粒子(VLP)が自己集合される(総説として、Schiller及びRoden、Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomaviruses; Lacey, ed. Leeds、UK: Leeds Medical Information pp 101−12(1996)を参照されたい)。VLPは、真正のビリオンに形態学的に類似しており、動物に投与すると高力価の中和抗体を誘導することができる。VLPは、潜在的発癌性ウイルスゲノムを含んでいないので、HPVワクチン開発において、生きているウイルスの使用を安全に代替するものである(総説として、Schiller及びHidesheim、J. Clin. Virol. 19:67−74(2000)を参照されたい)。このため、L1及びL2遺伝子は、HPV感染及び疾患の予防及び治療ワクチンを開発するための免疫学的標的とされてきた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】McMurray等、Int. J. Exp. Pathol. 82(1):15−33(2001)
【非特許文献1】Schiffman等、J. Natl. Cancer Inst. 85(12):958−64(1993)
【非特許文献1】Bosch等、J. Natl. Cancer Inst. 87(11):796−802(1995)
【非特許文献1】Schiller及びRoden、Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomaviruses; Lacey, ed. Leeds、UK: Leeds Medical Information pp 101−12(1996)
【非特許文献1】Schiller及びHidesheim、J. Clin. Virol. 19:67−74(2000)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
HPVワクチンの開発及び上市は、首尾よく形質転換された宿主生物において外来性遺伝子の高発現レベルを得ることに付随する困難によって妨げられ、精製タンパク質の製造を制限されてきた。したがって、HPV45 L1タンパク質などのHPV L1タンパク質をコードする野生型ヌクレオチド配列が特定されたにもかかわらず、目的宿主細胞における発現に対して最適化されたHPV45 L1をコードするヌクレオチド配列を利用する容易に更新可能な粗製HPV L1タンパク質源を開発することがきわめて望ましい。また、ワクチン開発において使用される未変性タンパク質の免疫感作特性を有する多量のHPV45 L1 VLPを製造することが有用である。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明は、子宮頚癌に関連するHPV45 L1遺伝子によって発現されるタンパク質産物に対して免疫を誘発又は増強する組成物及び方法に関する。具体的には、本発明は、HPV45 L1タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。このポリヌクレオチドは、酵母細胞において高レベルで発現されるように、コドン最適化されている。本発明は、さらに、酵母細胞中で組換えHPV45 L1又はL1+L2を発現させることによって産生されるHPV45ウイルス様粒子(VLP)を提供し、HPVに関連する癌の予防及び/又は治療用薬剤組成物及びワクチンにおけるHPV45 VLPの使用を開示する。
【0009】
本発明は、HPV45 L1タンパク質をコードする合成DNA分子に関する。合成分子のコドンは、酵母細胞に好ましいコドンを使用するように設計されている。合成分子は、自己集合してVLPになることができるHPV45 L1タンパク質源として使用することができる。前記VLPは、VLP系ワクチンに使用することができる。
【0010】
本発明の例示的な実施態様は、配列番号2で示されるHPV45 L1タンパク質をコードする合成核酸分子を含む。前記核酸分子は、配列番号1で示されるヌクレオチド配列を含む。
【0011】
本明細書を通して開示される核酸分子を含む、組換えベクター及び原核生物と真核生物の両方の組換え宿主細胞も提供される。
【0012】
本発明は、(a)HPV45 L1タンパク質をコードする核酸を含むベクターを酵母宿主細胞に導入する段階と、(b)前記HPV45 L1タンパク質の発現を可能にする諸条件下で前記酵母宿主細胞を培養する段階とを含む、組換え宿主細胞中でHPV45 L1タンパク質を発現させる方法にも関する。
【0013】
本発明は、さらに、(a)HPV45 L1タンパク質をコードする核酸を含むベクターを酵母宿主細胞に導入する段階であって、前記核酸分子が、前記酵母宿主細胞における最適な発現用にコドン最適化された段階と、(b)前記HPV45 L1タンパク質の発現を可能にする諸条件下で前記酵母宿主細胞を培養する段階とを含む、組換え宿主細胞中でHPV45 L1タンパク質を発現させる方法にも関する。
【0014】
好ましい実施態様においては、核酸は、配列番号1で示されるヌクレオチド配列(45 L1 R配列)を含む。
【0015】
本発明は、酵母細胞において産生されるHPV45ウイルス様粒子(VLP)、HPV45 VLPを産生する方法及びHPV45 VLPを使用する方法にも関する。
【0016】
本発明の好ましい実施態様においては、酵母は、サッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ハンゼヌラ ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、ピキア パストリス(Pichia pastoris)、クルイベロミセス フラギリス(Kluyveromyces fragilis)、クルイベロミセス ラクチス(Kluyveromyces lactis)及びシゾサッカロミセス ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)からなる群から選択される。
【0017】
本発明の別の側面は、酵母細胞中でHPV45 L1又はHPV45 L1+L2の組換え発現によって産生されるHPV45 VLPである。
【0018】
本発明のさらに別の側面は、コドン最適化されたHPV45 L1遺伝子によってコードされるHPV45 L1タンパク質を含むHPV45 VLPである。本発明のこの側面の例示的な実施態様においては、コドン最適化HPV45 L1遺伝子は、配列番号1で示されるヌクレオチド配列を含む。
【0019】
本発明は、HPV45ウイルス様粒子を動物に投与する段階を含む、動物において免疫応答を誘導する方法も提供する。好ましい実施態様においては、HPV45 VLPは、コドン最適化された遺伝子によって産生される。
【0020】
本発明のさらに別の側面は、HPV45 VLPを含むワクチンを哺乳動物に投与する段階を含む、HPV関連子宮頚癌を予防又は治療する方法である。本発明のこの側面の好ましい実施態様においては、HPV45 VLPは酵母中で産生される。
【0021】
本発明は、HPV45ウイルス様粒子(VLP)を含むワクチンにも関する。
【0022】
本発明のこの側面の別の実施態様においては、ワクチンは、少なくとも1個の別のHPVタイプのVLPをさらに含む。少なくとも1個の別のHPVタイプは、当分野で記述される任意のHPVタイプ又は引き続き特定される任意のHPVタイプを含めて、任意の目的とするHPVタイプとすることができる。好ましい実施態様においては、HPVタイプは、いぼ、子宮頚癌などの臨床表現型に関連するタイプである。さらに好ましい実施態様においては、少なくとも1個のさらに別のHPVタイプは、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59及びHPV68からなる群から選択される。
【0023】
本発明は、HPV 45ウイルス様粒子を含む薬剤組成物にも関する。また、本発明は、HPV45 VLP及び少なくとも1個の別のHPVタイプのVLPを含む薬剤組成物に関する。好ましい実施態様においては、少なくとも1個のさらに別のHPVタイプは、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59及びHPV68からなる群から選択される。
【0024】
本明細書を通して、また、添付された特許請求の範囲において、単数形「a」、「an」及び「the」は、特段の明示がない限り、複数形も含む。
【0025】
本明細書及び添付された特許請求の範囲を通して、以下の定義及び略語が使用される。
【0026】
「プロモーター」という用語は、RNAポリメラーゼが結合するDNA鎖上の認識部位を指す。プロモーターは、RNAポリメラーゼと開始複合体を形成して転写活動を惹起し、推進する。この複合体は、「エンハンサー」又は「上流活性化配列」と称される配列を活性化することによって、或いは「サイレンサー」と称される配列を阻害することによって改変することができる。
【0027】
「ベクター」という用語は、宿主生物又は宿主組織にDNA断片を導入することができるいくつかの媒介手段を指す。プラスミド、(アデノウイルスを含めた)ウイルス、バクテリオファージ及びコスミドを含めて、さまざまなタイプのベクターがある。
【0028】
「45 L1野生型配列」という名称は、本明細書では配列番号3(45 L1 wt)で示されるHPV45 L1 DNA配列を指す。HPV 45 L1野生型DNA配列はすでに記述されているが、臨床分離株から得られるDNA間の小さな配列変化を発見することは珍しいことではない。したがって、代表的な45 L1野生型DNA配列は、HPV 45DNAを含むことがすでに判明している臨床試料から単離された(実施例1参照)。45 L1野生型配列は、本明細書に開示されるコドン最適化45 L1配列を比較するための参照配列として使用された(図1参照)。
【0029】
「HPV 45 L1 R」又は「45 L1 R」という名称は、本明細書に開示される例示的な合成HPV45 L1ヌクレオチド配列(配列番号1)を指す。この配列は、酵母細胞による高レベル発現に好ましいコドンを含むように再構築されている。
【0030】
「有効量」という用語は、十分なワクチン組成物が導入されて適切なレベルのポリペプチドが産生され、その結果、免疫応答が生じることを意味する。当業者は、このレベルが変わり得ることを認識している。
【0031】
「保存的アミノ酸置換」とは、1個のアミノ酸残基が化学的に類似した別のアミノ酸残基で置換されることを指す。かかる保存的置換の例は、1個の疎水性残基(イソロイシン、ロイシン、バリン又はメチオニン)と別の疎水性残基との置換、1個の極性残基と別の同じ電荷の極性残基との置換(例えば、アルギニンとリジン;グルタミン酸とアスパラギン酸)である。
【0032】
「哺乳動物の」という用語は、ヒトを含めて、任意の哺乳動物を指す。
【0033】
「VLP」又は「VLPs」とは、ウイルス様粒子又は複数のウイルス様粒子を意味する。
【0034】
「合成」とは、指定された天然の野生型HPV45 L1遺伝子(45 L1 wt、配列番号3)中に存在するヌクレオチド配列と同じでないヌクレオチド配列を含むように、HPV45 L1遺伝子が生成されたことを意味する。上述したとおり、酵母細胞による発現に好ましいコドンを含むヌクレオチド配列を含む合成分子が本発明では提供される。本発明によって提供される合成分子は、野生型HPV45 L1遺伝子(配列番号2)と同じアミノ酸配列をコードする。
【図面の簡単な説明】
【0035】
【図1A】本発明の合成HPV45 L1遺伝子(「45 L1 R」と示された配列番号1)中の変化したヌクレオチドを示すDNA配列アラインメントを示す図である(実施例2参照)。参照配列は、45 L1野生型配列(「45 L1 wt」と示された配列番号3;実施例1参照)である。変化したヌクレオチドは、その対応する場所に示されている。ヌクレオチド番号は括弧内に記載されている。45 L1再構築配列中の同一ヌクレオチドはドットで示されている。
【図1B】本発明の合成HPV45 L1遺伝子(「45 L1 R」と示された配列番号1)中の変化したヌクレオチドを示すDNA配列アラインメントを示す図である(実施例2参照)。参照配列は、45 L1野生型配列(「45 L1 wt」と示された配列番号3;実施例1参照)である。変化したヌクレオチドは、その対応する場所に示されている。ヌクレオチド番号は括弧内に記載されている。45 L1再構築配列中の同一ヌクレオチドはドットで示されている。
【図1C】本発明の合成HPV45 L1遺伝子(「45 L1 R」と示された配列番号1)中の変化したヌクレオチドを示すDNA配列アラインメントを示す図である(実施例2参照)。参照配列は、45 L1野生型配列(「45 L1 wt」と示された配列番号3;実施例1参照)である。変化したヌクレオチドは、その対応する場所に示されている。ヌクレオチド番号は括弧内に記載されている。45 L1再構築配列中の同一ヌクレオチドはドットで示されている。
【図2A】再構築合成HPV 45 L1ヌクレオチド及び単一コードアミノ酸配列(single−code amino acid sequence)を示す図である。ヌクレオチド番号は左側に示されている。
【図2B】再構築合成HPV 45 L1ヌクレオチド及び単一コードアミノ酸配列(single−code amino acid sequence)を示す図である。ヌクレオチド番号は左側に示されている。
【図2C】再構築合成HPV 45 L1ヌクレオチド及び単一コードアミノ酸配列(single−code amino acid sequence)を示す図である。ヌクレオチド番号は左側に示されている。
【図3】厳密性の高い条件下でHPV 45 L1 RNAを特異的に探索したノーザンブロットである(実施例4参照)。レーン(1)はHPV 45 L1 R RNA 5μgを含み、レーン(2)はHPV 45 L1 R RNA 10μgを含む。単一完全長RNA転写物はこのブロットで明らかである。左側の矢印は、完全長HPV 45 L1転写物の予測位置を示す。
【図4】HPV 45 L1 wt及び3個のHPV 45 L1 R分離株のウエスタンブロットである。レーンの内容は、45 L1 wt(レーン1)、45 L1 R #4(レーン2)、45 L1 R #7(レーン3)、45 L1 R #11(レーン4)、HPV 16 L1対照(レーン5)である。全酵母タンパク質抽出物15マイクログラムを、10%SDS−PAGEゲルの各レーンに充填した。TrpE−HPV 45 L1融合タンパク質に対するヤギポリクローナル抗血清を使用してHPV 45 L1タンパク質を特定した。左側の矢印は55kDaの位置を示す。
【図5】2つのELISA実験から得られたng VLP/μg総タンパク質量単位のデータの一部を示す表である(実施例7参照)。45 L1 wtと45 L1 Rの2個の別個のクローンとの比較を示す。再構築されたHPV 45 L1 VLPの発現は45 L1 wtの約2倍であった。
【図6】透過型電子顕微鏡法によって可視化された、本明細書に記載されたHPV 45 L1 Rタンパク質分子で構成されたHPV 45 VLPの代表的な試料を示す図である(実施例8参照)。バーは約100nmである。
【発明を実施するための形態】
【0036】
子宮頚癌の大多数は、ヒトパピローマウイルス(HPV)の特定の腫瘍形成タイプの感染と関連がある。本発明は、発癌性HPVタイプの遺伝子によって発現されるタンパク質産物に対して免疫を誘発又は増強する組成物及び方法に関する。具体的には、本発明は、自己集合してHPV45ウイルス様粒子(VLP)になるHPV45 L1タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供し、HPVに関連する癌の予防及び/又は治療用薬剤組成物及びワクチンにおける前記ポリヌクレオチド及びVLPの使用を開示する。
【0037】
野生型HPV45 L1ヌクレオチド配列は報告されている(Genbank受託# NC_001590;Delius及びHofmann、Curr. Top. Microbiol. Immunol. 186:13−31(1994)も参照されたい)。本発明は、HPV45 L1タンパク質をコードする合成DNA分子を提供する。本発明の合成分子は、高レベル発現のために酵母細胞に好ましいコドンを使用するようにその少なくとも一部が改変されたコドン配列を含む。合成分子は、自己集合してVLPになることができるHPV45 L1タンパク質の発現用コード配列として使用することができる。前記VLPは、パピローマウイルス感染に対して、中和抗体及び細胞性免疫による有効な免疫学的予防を提供するVLP系ワクチンに使用することができる。
【0038】
酵母細胞におけるHPV VLPの発現は、費用効果が高く、発酵槽中での大規模増殖に容易に適合する利点がある。しかし、HPV45 L1を含めて多数のHPV L1タンパク質は、酵母細胞において、市販のスケールアップに望ましいレベルよりも低いレベルで発現される。
【0039】
したがって、本発明は、酵母細胞環境における高レベル発現用に「最適化された」HPV45 L1遺伝子配列に関する。
【0040】
考えられる4個のヌクレオチド塩基の「トリプレット」コドンには60個を上回る変形が存在し得る。これらのコドンは、わずか20個の異なるアミノ酸(並びに転写開始及び終結)のメッセージしか与えないので、一部のアミノ酸は2個以上のコドンによってコードされる(コドンの重複性として知られる現象)。代替コドンは、完全には解明されていない理由のために、さまざまな細胞タイプの内因性DNA中に均一には存在しない。実際、ある種の細胞タイプにおいてはある種のコドンに対して可変の自然階層又は「優先度」が存在すると考えられる。一例として、アミノ酸ロイシンは、CTA、CTC、CTG、CTT、TTA及びTTGを含めた6個のDNAコドンのいずれかによって指定される。微生物についてのゲノムコドン使用頻度の徹底的な分析によれば、E.コリ(E.coli)の内因性DNAは最も一般的にはCTGロイシン指定コドンを含むが、酵母及び粘菌のDNAは最も一般的にはTTAロイシン指定コドンを含む。この階層を考慮すると、ロイシンの豊富なポリペプチドがE.コリ宿主によって高発現レベルで得られる可能性は、コドン使用頻度にある程度依存すると一般に考えられる。例えば、TTAコドンが豊富な遺伝子はE.コリ中で発現が不十分であるのに対し、CTGが豊富な遺伝子はこの宿主においておそらく高度に発現される可能性がある。同様に、酵母宿主細胞において、ロイシンが豊富なポリペプチドの発現に好ましいコドンはTTAである。
【0041】
組換えDNA技術に対するコドン優先現象の含意は明白であり、この現象は、首尾よく形質転換された宿主生物において外来性遺伝子の高発現レベルを達成する先の多数の失敗を説明するのに役立ち得る。すなわち、さほど「好まし」くないコドンが挿入遺伝子中に繰り返して存在し、宿主細胞の発現機構が効率的に働かない可能性がある。この現象によれば、計画された宿主細胞の好ましいコドンを含むように設計された合成遺伝子は、組換えタンパク質発現を実施するのに最適な形の外来遺伝物質を提供する。したがって、本発明の一側面は、酵母細胞における高レベル発現用にコドン最適化されたHPV45 L1遺伝子である。本発明の好ましい実施態様においては、同じタンパク質配列をコードする代替コドンの使用は、酵母細胞によるHPV45 L1タンパク質の発現に対する制約を排除できることが見出された。
【0042】
本発明によれば、HPV45 L1遺伝子セグメントは、同一の翻訳配列を有するが、Sharp及びCoweによって記述されたように代替コドンの使用された配列に変換された(Synonymous Codon Usage in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 7:657−678(1991))。これを参照により本明細書に組込む。この方法は、一般に、高度に発現される酵母遺伝子に共通して関連しない野生型配列中のコドンを特定する段階と、酵母細胞における高発現に最適なコドンでそれを置換する段階とからなる。次いで、新しい遺伝子配列は、これらのコドン置換によって望ましくない配列が生成されたかどうか検査される(例えば、「ATTTA」配列、イントロンスプライス認識部位の不意の生成、望ましくない制限酵素部位、高GC含量、酵母によって認識される転写終結シグナルの有無など)。望ましくない配列は、同じアミノ酸をコードする異なるコドンで既存のコドンを置換することによって除去される。次いで、合成遺伝子セグメントは、発現が改善されたかどうか試験される。
【0043】
上記方法を使用してHPV45 L1の合成遺伝子セグメントが作製され、酵母細胞環境における高レベル発現用に最適化されたコドンを含む遺伝子が得られた。上記手順は、HPVワクチンに使用されるコドン最適化遺伝子を設計する本発明者らの方法の概要であるが、類似のワクチン効力又は遺伝子発現の増大は、手順をわずかに変えることによって、又は配列をわずかに変えることによって達成できることを当業者は理解されたい。
【0044】
したがって、本発明は、HPV45 L1タンパク質或いはHPV45 L1タンパク質の生物学的に活性な断片又は変異型をコードするヌクレオチド配列を含み、ポリヌクレオチド配列が酵母宿主細胞における発現用に最適化されたコドンを含む合成ポリヌクレオチドに関する。HPV45 L1タンパク質の前記変異型としては、保存的アミノ酸置換、アミノ末端切断、カルボキシ末端切断、欠失、付加などが挙げられるが、これらだけに限定されない。任意のかかる生物学的に活性な断片及び/又は変異体は、配列番号2で示されるHPV45 L1タンパク質の免疫学的諸特性を少なくとも実質的に模倣したタンパク質又はタンパク質断片をコードする。本発明の合成ポリヌクレオチドは、治療又は予防HPVワクチンの開発に有用であるように機能的HPV45 L1タンパク質を発現するmRNA分子をコードする。
【0045】
本発明の一側面は、配列番号2で示されるHPV45 L1タンパク質をコードするコドン最適化核酸分子を含む。前記核酸分子は、配列番号1で示されるヌクレオチド配列を含む。
【0046】
本発明は、本明細書を通して開示される核酸分子を含む、組換えベクター及び原核生物と真核生物の両方の組換え宿主細胞にも関する。
【0047】
本明細書に記載の方法によって構築される合成HPV45 DNA又はその断片は、適切なプロモーターと他の適切な転写制御要素とを含む発現ベクター中への分子クローニングによって組換え発現され、原核生物又は真核生物宿主細胞に移されて組換えHPV45 L1を産生することができる。かかる操作技術は、Sambrook等(Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、New York、(1989);Current Protocols in Molecular Biology、Ausubel等、Green Pub. Associates and Wiley−Interscience、New York(1988);Yeast Genetics: A Laboratory Course Manual、Rose等、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、New York、(1990))に詳細に記載されている。これらは参照により全体が組込まれる。
【0048】
したがって、本発明は、(a)HPV45 L1タンパク質をコードする核酸を含むベクターを酵母宿主細胞に導入する段階と、(b)前記HPV45 L1タンパク質の発現を可能にする諸条件下で前記酵母宿主細胞を培養する段階とを含む、組換え宿主細胞中でHPV45 L1タンパク質を発現させる方法に関する。
【0049】
本発明は、さらに、(a)HPV45 L1タンパク質をコードする核酸を含むベクターを酵母宿主細胞に導入する段階であって、前記核酸分子のコドンが、前記酵母宿主細胞における最適な発現用に最適化された段階と、(b)前記HPV45 L1タンパク質の発現を可能にする諸条件下で前記酵母宿主細胞を培養する段階とを含む、組換え宿主細胞中でHPV45 L1タンパク質を発現させる方法にも関する。
【0050】
本発明は、さらに、(a)配列番号1で示される核酸を含むベクターを酵母宿主細胞に導入する段階と、(b)前記HPV45 L1タンパク質の発現を可能にする諸条件下で前記酵母宿主細胞を培養する段階とを含む、組換え宿主細胞中でHPV45 L1タンパク質を発現させる方法にも関する。
【0051】
本発明の合成遺伝子は、宿主細胞においてHPV45 L1タンパク質を効率的に発現するように設計された配列を含む発現カセットに組み立てることができる。このカセットは、好ましくは、合成遺伝子と、プロモーター、終結配列などの作用可能にそれに連結された関係する転写及び翻訳制御配列とを含む。好ましい実施態様においては、プロモーターはS.セレビシエGAL1プロモーターである。ただし、当業者は、GAL10、GAL7、ADH1、TDH3、PGKプロモーターなどのいくつかの他の公知の酵母プロモーター又は他の真核生物遺伝子プロモーターのいずれかを使用できることを承知しているはずである。好ましい転写ターミネーターはS.セレビシエADH1ターミネーターであるが、他の公知の転写ターミネーターも使用することができる。GAL1プロモーター−ADH1ターミネーターの組み合わせが特に好ましい。
【0052】
本発明の別の側面は、遺伝子酵母細胞においてHPV45 L1又はL1+L2を組換え発現することによって産生されるHPV45ウイルス様粒子(VLP)、HPV45 VLPを産生する方法及びHPV45 VLPを使用する方法である。VLPは、ヒト及び動物パピローマウイルスの主要なカプシッドタンパク質であるL1が、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞又は細菌において発現されるときに自己集合することができる(総説として、Schiller及びRoden、Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomaviruses; Lacey, ed. Leeds、UK: Leeds Medical Information pp 101−12(1996)を参照されたい)。形態学的に不明瞭なHPV VLPも、L1とL2カプシッドタンパク質の組み合わせを発現させることによって産生することができる。VLPは、T=7正二十面体構造中の72個のL1 5量体で構成される(Baker等、Biophys. J. 60(6):1445−56(1991))。
【0053】
VLPは、真正のビリオンに形態学的に類似しており、動物に投与すると高力価の中和抗体を誘導することができる。ウサギ(Breitburd等、J. Virol. 69(6):3959−63(1995))及びイヌ(Suzich等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(25):11553−57(1995))をVLPで免疫すると、中和抗体を誘発し、実験的なパピローマウイルス感染を防御することが示された。しかし、VLPは、潜在的発癌性ウイルスゲノムを含んでおらず、単一遺伝子から発現されたときに自己集合することができるので、HPVワクチン開発において、生きているウイルスの使用を安全に代替するものである(総説として、Schiller及びHidesheim、J. Clin. Virol. 19:67−74(2000)を参照されたい)。
【0054】
Marais及び同僚(J. Med. Virol. 60:331−336(2000))は、バキュロウイルスから発現されるHPV45 L1遺伝子から昆虫細胞中で産生されたHPV 45 VLPを開示している。昆虫細胞におけるVLPの発現は、付随するコストが高いのでワクチン開発に有利ではない。また、昆虫細胞培養においてHPV L1遺伝子の発現を市販製品開発に必要な大容量にスケールアップすることは困難なことが多い。酵母細胞において産生されるHPV 45 VLPはまだ記述されていない。酵母細胞におけるHPV VLPの発現は、費用効果が高く、発酵槽中での大規模増殖に容易に適合する利点がある。また、酵母ゲノムは、潜在的な増殖及び発現能力が増強された組換え形質転換酵母が確実に選択されるように容易に変更することができる。
【0055】
したがって、本発明は、酵母細胞中で発現されるHPV45の組換えL1タンパク質又は組換えL1+L2タンパク質を含むウイルス様粒子に関する。
【0056】
本発明の好ましい実施態様においては、HPV45 VLPは、サッカロミセス セレビシエ、ハンゼヌラ ポリモルファ、ピキア パストリス、クルイベロミセス フラギリス、クルイベロミセス ラクチス及びシゾサッカロミセス ポンベからなる群から選択される酵母中でHPV 45 L1又はHPV 45 L1+L2を発現させることによって産生される。
【0057】
本発明の別の側面は、コドン最適化されたHPV45 L1遺伝子を発現させることによって産生されるHPV45 L1タンパク質を含むHPV45 VLPである。本発明のこの側面の好ましい実施態様においては、コドン最適化HPV45 L1遺伝子は、配列番号1で示されるヌクレオチド配列を含む。
【0058】
本発明のさらに別の側面は、(a)HPV45 L1タンパク質又はHPV45 L1+L2タンパク質をコードする組換えDNA分子で酵母を形質転換する段階と、(b)前記組換えDNA分子の発現が可能な諸条件下で、前記形質転換された酵母を培養して、組換えHPV45タンパク質を産生する段階と、(c)前記組換えHPV45タンパク質を単離して、HPV45 VLPを産生する段階とを含む、HPV45 VLPを産生する方法である。
【0059】
本発明のこの側面の好ましい実施態様においては、酵母は、コドン最適化HPV45 L1遺伝子で形質転換されてHPV45 VLPを産生する。特に好ましい実施態様においては、コドン最適化HPV45 L1遺伝子は、配列番号1で示されるヌクレオチド配列を含む。
【0060】
本発明は、HPV45ウイルス様粒子を動物に投与する段階を含む、動物において免疫応答を誘導する方法も提供する。好ましい実施態様においては、HPV45 VLPは、コドン最適化された遺伝子によって産生される。
【0061】
本発明のさらに別の側面は、HPV45 VLPを含むワクチンを哺乳動物に投与する段階を含む、HPV関連子宮頚癌を予防又は治療する方法である。本発明のこの側面の好ましい実施態様においては、HPV45 VLPは酵母中で産生される。
【0062】
本発明は、HPV45ウイルス様粒子(VLP)を含むワクチンにも関する。
【0063】
本発明のこの側面の別の実施態様においては、ワクチンは、少なくとも1個のさらに別のHPVタイプのVLPをさらに含む。好ましい実施態様においては、少なくとも1個のさらに別のHPVタイプは、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59及びHPV68からなる群から選択される。
【0064】
本発明のこの側面の好ましい実施態様においては、ワクチンはさらにHPV16 VLPを含む。
【0065】
別の本発明の好ましい実施態様においては、ワクチンはさらにHPV16 VLP及びHPV 18 VLPを含む。
【0066】
さらに別の本発明の好ましい実施態様においては、ワクチンはさらにHPV6 VLP、HPV11 VLP、HPV 16 VLP及びHPV18 VLPを含む。
【0067】
本発明は、HPV 45ウイルス様粒子を含む薬剤組成物にも関する。また、本発明は、HPV45 VLP及び少なくとも1個のさらに別のHPVタイプのVLPを含む薬剤組成物に関する。好ましい実施態様においては、少なくとも1個のさらに別のHPVタイプは、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59及びHPV68からなる群から選択される。
【0068】
本発明のワクチン組成物は、あらゆる潜在的毒性を最小限に抑えながらHPV45感染を最適に阻害するために、定常試験によって規定される適切な投与量で単体で使用することができる。また、他の薬剤の同時投与又は逐次投与が望ましい場合もある。
【0069】
ワクチンレシピエントに導入されるウイルス様粒子の量は、発現される遺伝子産物の免疫原性によって決まる。一般に、VLPの約10μgから100μg、好ましくは約20μgから60μgの免疫学的又は予防的有効量が筋組織に直接投与される。皮下注射、皮内導入、皮膚を介した圧入及び腹腔内、静脈内、吸入送達などの他の投与方法も企図される。追加免疫ワクチン接種を施し得ることも企図される。本発明のワクチンの非経口導入と同時の、又はそれに続く、静脈内、筋肉内、皮下などの非経口投与又はミョウバン、Merckアルミニウムアジュバントなどのアジュバントを用いた他の投与手段も有利である。
【0070】
本発明に関連して使用することができる方法及び材料を説明し、開示するために、本明細書に記載するすべての刊行物は参照により本明細書に組込まれる。本発明が、先行発明の効力によってかかる開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈すべきではない。
【0071】
添付図面を参照して本発明の好ましい実施態様を説明したが、本発明はこれらの厳密な実施態様に限定されず、さまざまな変更及び改変が、添付された特許請求の範囲に規定される本発明の範囲又は精神から逸脱することなく、当業者によって実施され得ることを理解されたい。
【0072】
以下の実施例は、本発明を説明するものであって、限定するものではない。
【実施例1】
【0073】
代表的HPV 45 L1配列の決定
HPV 45 L1配列はすでに記述されている(Genbank受託# NC_001590;Delius及びHofmann Curr. Top. Microbiol. Immunol. 186:13−31(1994)参照)。しかし、臨床分離株から得られるDNA間の小さな配列変化を発見することは珍しいことではない。代表的HPV45 L1野生型配列を決定するために、HPV 45DNAを含むことがすでに判明している4個の臨床試料からDNAが単離された。HPV 45 L1配列は、Taq DNAポリメラーゼ及び以下のプライマー、すなわち、HPV 45 L1 F
【0074】
【化1】

とHPV45L1B
【0075】
【化2】

を用いたポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)によって増幅された。増幅された生成物をアガロースゲル上で電気泳動させ、臭化エチジウム染色によって可視化した。約1500bpのL1バンドを切り取り、QIA quick PCR精製キット(Qiagen、Hilden、Germany)を用いてDNAを精製した。次いで、DNAをTAクローニングベクター(Invitrogen Corp.、Carlsbad、CA)に連結し、E.コリを連結混合物で形質転換し、アンピシリン+IPTG及びX−galを含む青/白コロニー選択用LB寒天上に蒔いた。プレートを反転させ、37℃で16時間インキュベートした。
【0076】
PCR増幅された4個の臨床分離株の各々に由来する8個の白コロニーについてコロニーPCRを実施した。HPV 45 L1 DNAは、プライマーHPV 45 L1 F及びHPV 45 L1 Bを用いてPCR増幅された。特定のPCRプロトコルは、98℃15秒(変性)、50℃30秒(アニーリング)及び68℃2分(伸長)の25サイクルからなった。PCR産物は、アガロースゲル電気泳動後に臭化エチジウム染色によって可視化された。各分離株由来のいくつかのコロニーはL1バンドを含んだ。各分離株由来の第2のコロニーは、アンピシリンを含むLB培地中で37℃で16時間振とうしながら培養された。ミニプレップを実施してコロニーからプラスミドDNAを抽出した。
【0077】
4個の臨床分離株由来の増幅されクローン化されたHPV 45 L1 DNAを含むプラスミドについてDNA配列を決定した。DNAと翻訳されたアミノ酸配列を互いに比較し、Genbank HPV 45 L1配列と比較した。4個の臨床分離株の配列分析によれば、Genbank配列と同一な配列のないことが判明した。分離株#33由来のHPV 45 L1プラスミドが代表的な45 L1野生型(wt)配列として選択され、本明細書では「45 L1野生型配列」(配列番号3、図1参照)と称される。この配列は、9個のヌクレオチド、3個のアミノ酸、後続の配列読み枠を維持する欠失、5つのアミノ酸変化を生じる5個の点突然変異及び8つのさらなるサイレントな点突然変異を含んだ。Genbank配列のアミノ酸495から497は45 L1 wtにおいて欠失している。Genbankアミノ酸番号23(S−>N)、55(N−>S)、303(I−>T)、357(S−>N)及び356(Q−>H)は、5つのアミノ酸変化を表す(Genbank aa−>45 L1 wt aa)。8つのサイレントな突然変異は配列全体に分布した。図1を参照されたい。
【0078】
45 L1野生型配列をLS−112
【0079】
【化3】

とHPV 45 L1 EAS
【0080】
【化4】

プライマーを用いて増幅してBglII伸長部を付加した。PCRは、Ventポリメラーゼを用いて実施された。PCR産物はアガロースゲルの臭化エチジウム染色によって可視化された。約1500bpのバンドを切り取り、QIAEX IIゲル抽出キット(Qiagen)を用いてDNAを精製した。次いで、PCR産物は、BglIIを用いて37℃で2時間消化され、QIA quick PCR精製キットを用いて精製された。BglIIによって消化されたHPV 45 L1 PCR産物を、(Hofmann等、Virology 209:506−18(1995)に記載された)BamHIによって消化されたpGAL110に連結し、E.コリDH5をこの連結混合物で形質転換した。
【0081】
コロニーを正確な配向のHPV 45 L1挿入断片についてPCRによってスクリーニングした。配列及び配向はDNA配列決定によって確認された。選択されたクローンは、pGAL110−HPV 45 L1 #6と命名された。このクローンは、PstI、EcoRI及びHindIIIを用いて消化されて、pGAL110ベクター内のHPV 45 L1遺伝子の制限酵素断片プロファイルが求められた。DNA断片はアガロースゲル上を電気泳動された。得られた制限酵素断片プロファイルは臭化エチジウム染色によって可視化され、UV光を用いて観察された。
【0082】
Maxiprep DNAを調製した。サッカロミセス セレビシエ細胞は、Glusulaseを用いたスフェロプラスト化によって形質転換受容性とされ、pGAL110−HPV 45 L1 #6で形質転換された。酵母形質転換混合物は、Leu(−)ソルビトールプレート上のLeu(−)ソルビトール上層寒天中に蒔かれ、30℃で5から7日間反転インキュベートされた。コロニーが選択され、Leu(−)ソルビトールプレート上でのクローン単離のために画線された。続いて、単離されたコロニーは、回転試験管培養物中の1.6%グルコース及び4%ガラクトースを含む5× Leu(−)Ade(−)ソルビトール5mL中で30℃で増殖されてL1転写及びタンパク質発現が誘発された。
【実施例2】
【0083】
酵母コドン最適化
酵母に好ましいコドンは記述されている(Sharp,Paul M及びCowe,Elizabeth 1991 Synonymous Codon Usage in Saccharomyces cerevisiae YEAST 7:657−678)。HPV 45 L1 wtタンパク質の発現は検出可能であった。しかし、市販の製品開発に必要な高い発現を得るために、酵母に好ましいコドンを用いてHPV 45 L1遺伝子を再構築した。前記再構築配列は、ワクチン開発に使用される野生型をかなり上回る高いHPV45 L1発現をもたらす。45 L1 wtのヌクレオチド配列は、酵母に最適化なコドン配列を利用して配列が再構築されると、392位が変化して45 L1 R(R=再構築)が生成された。しかし、アミノ酸配列は変わらなかった。HPV 45 L1 Rのヌクレオチド(配列番号1)及びアミノ酸(配列番号2)配列を図2に示す。
【0084】
遺伝子再構築のために採用された戦略は、遺伝子にまたがり、長くオーバーラップするセンスオリゴマーとアンチセンスオリゴマーを設計し、もとのアミノ酸配列を維持しながら酵母に好ましいコドン配列でヌクレオチドを置換することであった。これらのオリゴマーは、PCR反応においてテンプレートDNAの代わりに使用された。テンプレートオリゴマー由来の再構築配列を増幅するために、追加の増幅プライマーが設計され、使用された。25サイクルのPCRにおいてPfu DNAポリメラーゼが使用された。
【0085】
最適増幅条件はセクション特異的(section−specific)であったが、94℃5分(変性)と、それに続く95℃30秒(変性)、55から50℃30秒(アニール)及び72℃1.5分(伸長)の25サイクルと、それに続く72℃7分の最終伸長並びに4℃保持に類似したプログラムが最も使用された。PCR産物はアガロースゲル電気泳動によって検査された。適切なサイズのバンドが切り取られ、DNAゲルが精製された。次いで、増幅断片は、1533 nt 再構築HPV 45 L1遺伝子を組み立てるためのテンプレートとして使用された。
【0086】
再構築後、1533 ntバンドはゲル精製され、pCR4 Blunt(Invitrogen)に連結され、E.コリTOP10細胞はこの連結混合物で形質転換された。コロニーは、アンピシリンを含むLB 4mL中で増殖され、プラスミドDNAが標準ミニプレップ技術によって抽出された。プラスミドDNAは、45 L1再構築のための所望の変化の存在を確認するために配列決定された。45 L1 R(再構築)は、BamHI伸長部を両末端に付加し、さらにATG開始コドンの上流の酵母5’非翻訳リーダー配列を付加するためにpCR4Blunt−45 L1 Rから再増幅された。増幅断片は上記のようにクローン化され、プラスミドDNAは配列決定された。プラスミドpCR4 Blunt−45 L1 R(Bam)はBamHIで消化され、DNA断片はアガロースゲル上を電気泳動された。約1550bpの45 L1 R(Bam)断片はゲル精製され、BamHIで消化されたpGAL110に連結され、TOP10F’ E.コリ(Invitrogen)に形質転換された。
【0087】
コロニーは、pGAL110における正確な配向のHPV 45 L1挿入断片についてPCRによってスクリーニングされた。配列及び配向はDNA配列決定によって確認された。MaxiprepプラスミドDNAが調製され、スフェロプラスト化によって形質転換受容性とされたS.セレビシエ細胞の形質転換に使用された。形質転換された酵母は、Leu(−)ソルビトールプレート上のLeu(−)ソルビトール上層寒天中に蒔かれ、7日間反転インキュベートされた。コロニーは、Leu(−)ソルビトールプレート上でのクローン単離のために画線された。続いて、単離されたコロニーは、回転試験管培養物中の1.6%グルコース及び4%ガラクトースを含む5× Leu(−)Ade(−)ソルビトール5mL中で30℃で増殖されてL1転写及びタンパク質発現が誘発された。48時間後、OD600=10相当の培養体積をペレット化し、上清を除去し、ペレットを凍結し、−70℃で保存した。
【実施例3】
【0088】
RNA調製
ガラクトース誘導によってHPV 45 L1を発現するように誘導された形質転換酵母の細胞ペレットを氷上で解凍し、Trizol試薬(Life Technologies、Gibco BRL)0.8mLに懸濁させ、室温で5分間インキュベートした。クロロホルム1/5体積をバイアルに添加した。次いで、それを15秒間激しく振とうして混合し、室温で3分間インキュベートした。13krpmで5分間遠心分離した後、上相を収集し新しいバイアルに移した。イソプロパノール0.4mLを添加し、室温で10分間インキュベートした。13krpmで10分間遠心分離してRNAをペレット化した。上清をデカントし、RNAペレットを75%EtOHで洗浄し、遠心分離を繰り返した。上清をデカントし、RNAペレットを15分間風乾し、続いてRNaseを含まない水に懸濁させた。分光測光法を実施し、A260280が1.7から2.0であるときの1のA260の読み=40μg/ml RNAと仮定して試料中のRNA濃度を求めた。
【実施例4】
【0089】
ノーザンブロット分析
1.1%アガロースホルムアルデヒドゲルを成型した。RNA 5及び10マイクログラムを変性緩衝剤(最終濃度:6%ホルムアルデヒド、50%ホルムアミド及び0.1×MOPS)と混合し、65℃に10分間加熱した。ゲルローディングバッファー1/10体積を添加し、試料をゲルに載せた。電気泳動を1×MOPS緩衝剤中75ボルトで約3時間実施した。ゲルを10×SSCで60分間洗浄した。
【0090】
RNAを10×SSC中で毛管作用によって16時間かけてHybond−N+ナイロン膜(Amersham Biosciences、Piscataway、NJ)に移した。次いで、Stratagene UV Stratalinker(Stratagene、La Jolla、CA)自動架橋機能を用いた架橋によってRNAをナイロン膜に固定した。固定後、ナイロン膜を風乾させた。
【0091】
Roche DIG High Prime DNA Labeling and Detection Kit I(F. Hoffmann−La Roche Ltd.、Basel、Switzerland)を使用して、ノーザンブロットで45 L1 R RNAを検出するプローブとして使用されるDIGで45 L1 R DNA配列を標識した。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション及び抗DIGアルカリホスファターゼ複合抗体を用いた免疫発生(immunological development)を製造者の推奨に従って実施した。手短に述べると、ブロットを静かに振とうしながら37℃で30分間プレハイブリッド形成させた。プローブを95℃で5分間加熱して変性させ、氷上でクエンチした。プローブをプレハイブリダイゼーション溶液に添加し、静かに振とうしながら膜に44.6℃で4時間塗布した。次いで、ハイブリダイゼーション溶液を除去し、0.1%SDSを含む2×SSCを用いてブロットを室温で5分間2回洗浄し、続いて0.5×SSC及び0.1%SDSを用いて65℃でさらに洗浄した。次いで、ブロットを30分間ブロックし、抗DIGアルカリホスファターゼ複合抗体を1:5000希釈で30分間塗布した。ブロットを洗浄し、プローブに結合したRNAの有無をアルカリホスファターゼ複合抗DIG結合抗体のNBT/BCIP基質検出によって求めた。
【0092】
45 L1 wtを発現する酵母の初期の分析によれば、機能的HPV 45 L1転写及び翻訳が存在することが示唆された。しかし、配列は、酵母に好ましいコドン配列で再構築され、ワクチン開発に有用な高い発現レベルが得られた。再構築45 L1配列は、考えられるあらゆる中途の転写終結点を取り除いて頑強な転写が確実になされるように操作された。45 L1 R転写物のノーザンブロット分析によって、完全長転写物が生成されたことが判明した(図3)。
【実施例5】
【0093】
HPV 45 L1タンパク質発現
ガラクトースによって誘導されたOD600=10相当の培養物の凍結酵母細胞ペレットを氷上で解凍し、PC緩衝剤(100mM NaHPO及び0.5M NaCl、pH7.0)300μlに2mM PMSFと一緒に懸濁させた。酸洗された0.5mmガラスビーズを約0.5g/試験管で添加した。1分間の中断をはさみ4℃5分間の3サイクルで試験管をボルテックス撹拌した。20%Triton100 7.5μlを添加し、ボルテックス撹拌を4℃で5分間繰り返した。試験管を氷上に15分間置き、次いで4℃で10分間遠心分離した。上清を無菌微量遠心管に移し、全酵母タンパク質抽出物のラベルを貼り、日付けを記入し、−70℃で保存した。
【実施例6】
【0094】
ウエスタンブロット分析
各45 L1構築体に対する20個の単離酵母コロニーから得られた全酵母タンパク質抽出物は、ウエスタンブロットによって分析されてガラクトース誘導後の45 L1タンパク質の発現が確認された。
【0095】
全酵母タンパク質抽出物10マイクログラムをSDS−PAGEローディングバッファーと混合し、95℃に10分間加熱した。タンパク質を10%SDS−PAGEゲルに載せ、Tris−グリシン緩衝剤中で電気泳動させた。タンパク質分離後、タンパク質をウェスタン法によってゲルからニトロセルロースに移し、ブロットを揺動させながら1×希釈緩衝剤(Kirkegaard and Perry Laboratories)で室温で1時間ブロックした。ブロットを3回洗浄し、次いでヤギ抗trpE−HPV 45 L1血清の1:2500希釈物と一緒に室温で16時間インキュベートした。次いで、ブロットを3回洗浄し、抗ヤギ−HRP複合抗体の1:2500希釈物と一緒に1時間インキュベートした。ブロットを再度3回洗浄し、NBT/BCIP検出基質を塗布した(Kirkegaard and Perry Laboratories)。免疫反応性タンパク質は、ブロット上で紫色のバンドとして検出された。
【0096】
その結果、すべての場合において、45 L1タンパク質は、ニトロセルロース上で約57kDaに相当する明瞭な免疫反応性バンドとして検出された(図4)。約55kDaである16 L1タンパク質は、HPV L1を含まない負の対照の全酵母タンパク質抽出物と一緒に、正の対照として含まれた(データ示さず)。
【実施例7】
【0097】
ELISAアッセイ
HPV 45 L1を発現する酵母細胞は、回転試験管培養、振とうフラスコ及び発酵槽を含めてさまざまな方法によって増殖された。酵母を溶解し、総タンパク質量の1マイクログラム当たり産生されるHPV 45 L1ウイルス様粒子(VLP)の量を測定するためにタンパク質抽出物を調製した。HPV 45 L1 VLP発現を実証するためにサンドイッチELISAが設計された。
【0098】
酵母タンパク質抽出物中に存在する45 L1 VLPに結合させるために、HPVタイプ18と45 L1 VLPの両方を認識するH18R.5モノクローナル抗体(mAb)を使用した。非結合タンパク質を洗浄除去し、HPV 45 L1 VLPタイプの高次構造特異的mAbであるH45.10B11.A5を検出抗体として塗布した。真の高次構造的に正しい45 L1 VLPは結合し、抗マウスIgG1 HRP複合抗体及びTMB基質を使用することによって検出が容易になった。
【0099】
具体的には、H18R.5を使用してImmulon 4 HBX96ウェルプレートの底部を終夜4℃で被覆した。プレートをPBS及び0.05%Tween 20で3回洗浄し、続いてブロッキング溶液(PBS+0.05%Tween 20+1%BSA)でブロックした。プレートを3回洗浄し、抗原(ブロッキング溶液で100μg/mlに希釈された全酵母細胞溶解物)を列Aに2つ組で塗布した。精製HPV 45 L1 VLPの比較基準を列Aカラム1及び2に100μg/ml全酵母タンパク質中3300ng/mlで塗布した。次いで、基準試料と試験試料を各カラム連続して2倍希釈した。室温で3時間後、過剰の抗原を吸引除去し、プレートを3回洗浄した。HPV 45 L1 VLP高次構造特異的mAb H45.10B11.A5を含む細胞上清をブロッキング溶液で1:80希釈し、各ウェルに室温で1時間適用した。プレートを3回洗浄し、ブロッキング溶液で1:8000希釈された抗マウスIgG1 HRP複合抗体を室温で1時間塗布した。プレートを洗浄し、TMB(Pierce)を5分間適用して、HRP複合抗体複合体を検出した。2M HSOを添加して検出反応を停止した。プレートを波長450nmで読取り、比較基準と比較してHPV 45 L1 VLPの濃度をng VLP/μg総タンパク質量単位で測定した。
【0100】
すべて2回分析された45 L1 wtと2個の別個の45 L1 Rクローンの比較を図5に示す。再構築HPV 45 L1 VLP発現は45 L1 wtの観測結果の約2倍であった(図6)。
【実施例8】
【0101】
透過型電子顕微鏡法
45 L1タンパク質が実際に自己集合して(自己集合してウイルス様粒子になる)5量体L1カプソメアを形成することを実証するために、ある程度精製された45 L1 Rタンパク質抽出物を透過型EMによって分析した。
【0102】
酵母細胞を小規模発酵条件下で増殖させ、ペレット化し、ペレットを精製処理した。L1タンパク質が発現され精製手順を通して保持されることを実証するために、ペレット及び浄化された酵母エキスを免疫ブロットによって分析した。次いで、浄化酵母エキスを45%スクロースクッション上で遠心分離にかけ、生成したペレットを緩衝剤に懸濁させて透過型電子顕微鏡法(EM)によって分析した。
【0103】
産生された45 L1 R VLPの代表的試料を図6に示す。この粗製試料中の球状粒子の直径は40から60nmであり、一部の粒子は、規則的な配列のカプソメアを示した。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号2で示されるHPV45 L1タンパク質をコードするヌクレオチドの配列を含み、核酸配列が酵母細胞における高レベル発現のためコドン最適化されている、核酸分子。
【請求項2】
請求項1に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項3】
請求項3に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項4】
宿主細胞が、サッカロミセス セレビシエ、ハンゼヌラ ポリモルファ、ピキア パストリス、クルイベロミセス フラギリス、クルイベロミセス ラクチス及びシゾサッカロミセス ポンベからなる群から選択される、請求項3に記載の宿主細胞。
【請求項5】
宿主細胞がサッカロミセス セレビシエである、請求項4に記載の宿主細胞。
【請求項6】
ヌクレオチドの配列が、配列番号1で示されるヌクレオチドの配列を含む、請求項1に記載の核酸分子。
【請求項7】
請求項6に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項8】
請求項7に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項9】
HPV45の組換えL1タンパク質又は組換えL1+L2タンパク質を含み、前記組換えL1タンパク質又は組換えL1+L2タンパク質が酵母中で産生される、ウイルス様粒子(VLP)。
【請求項10】
組換えL1タンパク質又は組換えL1+L2タンパク質が、コドン最適化されたHPV45 L1核酸分子によってコードされる、請求項9に記載のVLP。
【請求項11】
コドン最適化された核酸分子が、本質的に配列番号1で示されるヌクレオチドの配列からなる、請求項10に記載のVLP。
【請求項12】
(a)HPV45 L1タンパク質又はHPV45 L1+L2タンパク質をコードするコドン最適化DNA分子で酵母を形質転換すること、
(b)組換えパピローマウイルスタンパク質を産生するために、前記コドン最適化DNA分子の発現が可能な条件下で前記形質転換された酵母を培養すること、および
(c)請求項10に記載のVLPを産生するために、前記組換えパピローマウイルスタンパク質を単離すること、
を含む、請求項10に記載のVLPを産生する方法。
【請求項13】
請求項10に記載のVLPを含むワクチン。
【請求項14】
請求項10に記載のVLPを含む薬剤組成物。
【請求項15】
請求項13に記載のワクチンを哺乳動物に投与することを含む、HPV感染を予防する方法。
【請求項16】
請求項10に記載のVLPを動物に投与することを含む、動物において免疫応答を誘導する方法。
【請求項17】
酵母が、サッカロミセス セレビシエ、ハンゼヌラ ポリモルファ、ピキア パストリス、クルイベロミセス フラギリス、クルイベロミセス ラクチス及びシゾサッカロミセス ポンベからなる群から選択される、請求項10に記載のウイルス様粒子。
【請求項18】
酵母がサッカロミセス セレビシエである、請求項17に記載のウイルス様粒子。
【請求項19】
少なくとも1個の別のHPVタイプのVLPをさらに含む、請求項13に記載のワクチン。
【請求項20】
少なくとも1個の別のHPVタイプが、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59及びHPV68からなる群から選択される、請求項19に記載のワクチン。
【請求項21】
少なくとも1個のHPVタイプがHPV16を含む、請求項20に記載のワクチン。
【請求項22】
HPV18 VLPをさらに含む、請求項21に記載のワクチン。
【請求項23】
HPV6 VLP及びHPV11 VLPをさらに含む、請求項22に記載のワクチン。
【請求項24】
HPV31 VLPをさらに含む、請求項23に記載のワクチン。
【請求項25】
HPV31 VLPをさらに含む、請求項22に記載のワクチン。

【図1A】
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【図1B】
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【図1C】
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【図2A】
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【図2B】
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【図2C】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【図6】
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【公開番号】特開2011−152137(P2011−152137A)
【公開日】平成23年8月11日(2011.8.11)
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願2011−45589(P2011−45589)
【出願日】平成23年3月2日(2011.3.2)
【分割の表示】特願2006−528190(P2006−528190)の分割
【原出願日】平成16年9月24日(2004.9.24)
【出願人】(390023526)メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション (924)
【Fターム(参考)】