酵母細胞の表面上にポリペプチドをディスプレイするための方法および組成物
酵母細胞の表面上にポリペプチド（例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片）をディスプレイするのに用いる方法および組成物が本明細書に提供される。本明細書に開示された様々な方法および組成物と共に用いることができる例示的な酵母には、Ｙａｒｒｏｗｉａ属の酵母、例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。本発明で提供される組成物は、融合配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含み、その融合配列は、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸配列にインフレームで融合した、アンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
酵母細胞の表面上にポリペプチド（例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片）をディスプレイするのに用いる方法および組成物が本明細書に提供される。本明細書に開示された様々な方法および組成物と共に用いることができる例示的な酵母には、Ｙａｒｒｏｗｉａ属の酵母、例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。
【背景技術】
【０００２】
高親和性試薬、例えば、抗体またはその断片は、臨床的適用および研究的適用の両方にとって有用なツールである。いくつかのインビトロおよびインビボのプラットフォームが抗体の単離および特徴づけに用いられており、それらには、リボソームディスプレイ、ファージディスプレイ、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるペリプラズム発現が挙げられる。用いられている別のプラットフォームは、酵母細胞表面ディスプレイ（ＹＳＤ）である。
【０００３】
Ｙａｒｒｏｗｉａ株細胞表面上に抗体およびその断片をディスプレイするための組成物および方法は、有利であろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
酵母細胞の表面上にポリペプチド（例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片）をディスプレイするのに用いる方法および組成物が本明細書に提供される。本明細書に開示された様々な方法および組成物と共に用いることができる例示的な酵母には、Ｙａｒｒｏｗｉａ属の酵母、例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。
【０００５】
特定の実施形態において、本明細書に提供される組成物は、融合配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含み、その融合配列は、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸配列にインフレームで融合した、アンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列を含む。特定の実施形態において、本明細書に提供される組成物は、第１の核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含み、その第１の核酸配列は、アンカーポリペプチドをコードするアンカーヌクレオチド配列を含み、第１の核酸配列は、第２の核酸配列によってコードされる目的の第２の融合パートナーを含む融合ポリペプチドにおける第１の融合パートナーとして発現することができる。特定の実施形態において、発現カセットは、目的の第２の融合パートナーをコードする第２の核酸配列、例えば、制限部位の全部または一部をさらに含む。特定の実施形態において、目的の第２の融合パートナーは、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を含む。特定の実施形態において、抗体ポリペプチド断片は、ｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ断片の重鎖、またはＦａｂ断片の軽鎖である。
【０００６】
特定の実施形態において、発現カセットの第１の核酸配列は、第２の核酸配列の３’に融合しており、その結果、その融合配列から産生される融合ポリペプチドは、Ｎ末端の抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片、およびＣ末端のアンカーポリペプチドを含む。特定の実施形態において、発現カセットの第１の核酸配列は、第２の核酸配列の５’に融合しており、その結果、その融合配列から産生される融合ポリペプチドは、Ｎ末端のアンカーポリペプチド、およびＣ末端の抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を含む。
【０００７】
特定の実施形態において、発現カセットは、構成的プロモーターを含む。特定の実施形態において、発現カセットは、誘導性プロモーター、例えば、ＰＯＸ２またはＬＩＰ２プロモーターを含む。特定の実施形態において、発現カセットは、半誘導性（ｓｅｍｉ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）プロモーター、例えば、ｐｈ４ｄプロモーターを含む。
【０００８】
特定の実施形態において、発現カセットは、リーダーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むリーダー核酸配列を含み、リーダー核酸配列は、第１および第２の核酸配列の５’にインフレームで融合している。例示的なリーダー核酸配列には、非限定的に、ＬＩＰ２ ｐｒｅ、ＬＩＰ２ ｐｒｅｐｒｏ、ＸＰＲ２ ｐｒｅ、およびＸＰＲ２ ｐｒｅｐｒｏが挙げられる。
【０００９】
特定の実施形態において、発現カセットは、リンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むリンカー核酸配列を含む。例えば、リンカー核酸配列は、第１の核酸配列と第２の核酸配列との間にインフレームで融合することができる。特定の実施形態において、抗体ポリペプチドは、ｓｃＦｖ抗体ポリペプチドを含み、リンカー核酸配列は、ｓｃＦｖポリペプチドの可変領域をコードする重鎖核酸配列と、ｓｃＦｖポリペプチドの可変領域をコードする軽鎖核酸配列との間にインフレームで融合している。リンカーポリペプチドの非限定的例には、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３または（ＧｌｙＳｅｒ）５が挙げられる。
【００１０】
特定の実施形態において、発現カセットは、１つまたは複数のエピトープタグをコードするヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の核酸配列を含む。例示的なエピトープタグには、非限定的に、ｃ−Ｍｙｃ、Ｖ５、ヘキサヒスチジン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ストレプトアビジン、ビオチン、赤血球凝集素、Ｆｌａｇ−タグ、およびＥ−タグが挙げられる。
【００１１】
特定の実施形態において、発現カセットは、アンカーポリペプチドを含む。アンカーポリペプチドの非限定的例には、Ａｇａ１ｐポリペプチドまたはその断片、Ａｇａ２ｐポリペプチドまたはその断片、およびＳａｇ１ｐポリペプチドまたはその断片が挙げられる。
【００１２】
特定の実施形態において、発現カセットは、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞における発現のためにコドン最適化されている、抗体ポリペプチドもしくは抗体ポリペプチド断片、アンカーポリペプチド、または両方を含む。
【００１３】
特定の実施形態において、本明細書に提供される組成物は、上記の発現カセットのいずれかを含むベクターを含む。特定の実施形態において、ベクターは、ゼータエレメントを含む。例示的なゼータエレメントには、非限定的に、例えば、Ｙｌｔ１またはＴｙｌ６レトロトランスポゾンなどのレトロトランスポゾンの長い末端反復が挙げられる。特定の実施形態において、ベクターは、１つまたは複数の常染色体複製エレメント、例えば、セントロメア（ＣＥＮ）および複製起点（ＯＲＩ）を含む常染色体複製エレメントを含む。例示的なセントロメアには、非限定的に、ＣＥＮ１およびＣＥＮ３が挙げられる。例示的な複製起点には、非限定的に、ＯＲＩ１０６８またはＯＲＩ３０１８が挙げられる。特定の実施形態において、ベクターは、セントロメアおよび複製起点を含む自律複製配列（ＡＲＳ）を含む。例示的なＡＲＳには、非限定的に、ＡＲＳ１８およびＡＲＳ６８が挙げられる。特定の実施形態において、ベクターは、１つまたは複数の選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の核酸配列を含む。選択マーカーの非限定的例には、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３ｄ１、ＡＤＥ２、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｕｔ、Ｔｒｐ、Ｇ３ｐ、およびｈｐｈが挙げられる。
【００１４】
特定の実施形態において、本明細書に提供される方法は、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞の表面上に抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をディスプレイするための方法を含む。例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片は、アンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸配列にインフレームで融合した、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列を含む融合配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む第１のベクターを第１のＹａｒｒｏｗｉａ細胞へ導入し、ある期間、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件下で第１のＹａｒｒｏｗｉａ細胞をインキュベートすることによって、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞の表面上にディスプレイされてもよい。例示的な第１のベクターには、非限定的に、上記のベクターのいずれかが挙げられる。特定の実施形態において、抗体ポリペプチド断片は、ｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ断片の重鎖、またはＦａｂ断片の軽鎖である。特定の実施形態において、方法は、Ｆａｂ断片の軽鎖またはＦａｂ断片の重鎖をコードする核酸配列に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２のベクターを第１のＹａｒｒｏｗｉａ細胞へ導入する工程を含んでもよい。特定の実施形態において、第１のＹａｒｒｏｗｉａ細胞は一倍体であり、第２のベクターを導入する工程は、第１のベクターを含む第１の一倍体Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を、第２のベクターを含む第２の一倍体Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞と接合させることを含み、ここで、第１のＹａｒｒｏｗｉａ細胞と第２のＹａｒｒｏｗｉａ細胞は反対の接合型である。
【００１５】
特定の実施形態において、第１の核酸配列は、第２の核酸配列の５’に融合しており、その結果、その融合配列から産生される融合ポリペプチドは、Ｎ末端の抗体ポリペプチドまたはその抗体ポリペプチド断片、およびＣ末端のアンカーポリペプチドを含む。特定の実施形態において、第１の核酸配列は、第２の核酸配列の３’に融合しており、その結果、その融合配列から産生される融合ポリペプチドは、Ｎ末端のアンカーポリペプチド、およびＣ末端の抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を含む。
【００１６】
特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件は、低い誘導温度、例えば、約摂氏１５度から摂氏２５度の温度を含む。非限定的な低い誘導温度は、約摂氏２０度の温度を含む。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件は、短い誘導時間、例えば、約２４時間以下、約１６時間以下、または約１６時間を含む。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件は、低いｐＨ、例えば、約２から約４のｐＨ、または約３のｐＨを含む。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件は、高い通気条件、例えば、振盪フラスコ内でのインキュベーションを含む。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件は、最少培地、例えば、酵母抽出物、Ｂａｃｔｏペプトン、または両方を欠く培地中でのインキュベーションを含む。
【００１７】
特定の実施形態において、第１のベクターは、Ｙａｒｒｏｗｉａゲノムへ組み込まれる。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞は、シャペロン、例えば、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよび／またはＫａｒ２／Ｂｉｐを発現する。
【００１８】
特定の実施形態において、本明細書に提供される組成物は、上記の方法のいずれかによって得られる抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を含む。特定の実施形態において、標的ポリペプチドを結合する抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を含むＹａｒｒｏｗｉａ細胞を選択するための方法が提供される。例えば、標的ポリペプチドを結合する抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を含むＹａｒｒｏｗｉａ細胞は、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を表面上にディスプレイする親Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞は上記の方法のいずれかによって産生される）を供給し、親Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を試験ポリペプチドと接触させ、ディスプレイされた抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片が標的ポリペプチドを結合する場合には、その親Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を選択することによって、選択されてもよい。特定の実施形態において、そのような方法は、選択された親Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞から、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片の第１の発現カセットを単離する工程、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列に１つまたは複数の変化を導入して、改変型発現カセットを作製する工程、第１の発現カセットを欠く第２のＹａｒｒｏｗｉａ細胞へ改変型発現カセットを導入して、改変型Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を作製する工程、改変型Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞をある期間、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件下でインキュベートする工程、改変型Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を標的ポリペプチドと接触させる工程、およびその改変型Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞が親Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞より高い親和性またはアビディティで標的ポリペプチドを結合する場合には、それを選択する工程を含む。
【００１９】
特定の実施形態において、キットが本明細書に提供される。特定の実施形態において、本明細書に提供されるキットは、上記の発現カセットのいずれかなどの発現カセットを含む。特定の実施形態において、本明細書に提供されるキットは、上記のベクターのいずれかなどのベクターを含む。特定の実施形態において、本明細書に提供されるキットは、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を含む。特定の実施形態において、本明細書に提供されるキットは、発現カセット、ベクター、または両方を用いるための書面による使用説明書を含む。
【００２０】
他に定義がない限り、本明細書に用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。方法および材料は、本発明に用いるために、本明細書に記載されている；当技術分野において知られた他の適切な方法および材料もまた用いることができる。材料、方法、および例は、例証となるのみであり、限定することを意図されない。本明細書で言及された全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベース登録、および他の参考文献は、全体として参照により組み入れられている。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先するものとする。
【００２１】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、ｓｃＦｖ断片およびＦａｂ断片のＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａディスプレイに用いられる発現プラスミドおよび発現カセットの概略図である。図１Ａは、ランダムな組込みのためのＹａｒｒｏｗｉａ発現プラスミドの構成要素およびマップを示す。標的遺伝子の発現は、誘導性ｐＰＯＸ２プロモーターによって駆動される。完全に相補された株の作製を可能にするために異なる形質転換マーカーが利用可能である（Ｌｅｕ２、Ａｄｅ２、Ｕｒａ３）。このプラスミドを、異なる抗体断片をクローニングするための鋳型として用いた。図１Ｂは、ＡＧＡ１、ｓｃＦｖ断片、およびＦａｂ断片軽鎖ｃｋ１ドメインの可溶性発現のための発現カセットを示す。合成カセットを、Ｙａｒｒｏｗｉａ発現プラスミドへ、示された制限部位を用いてクローニングした。軽鎖可変ドメインは、生じたプラスミドへ別個にクローニングされ、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域を含有する完全長Ｆａｂ軽鎖断片（ＶＬ−Ｃｋ１）のディスプレイプラスミドを作製することができる。図１Ｃは、Ｙａｒｒｏｗｉａ発現プラスミドへ、示された制限部位を用いてクローニングされたｓｃＦｖ抗体断片を示す。異なる融合様式、かつ異なるアンカー分子を用いてのアンカリングを可能にする、合計４個の合成構築物を作製した。図１Ｄは、Ｙａｒｒｏｗｉａ発現プラスミドへ、示された制限部位を用いてクローニングされたＦａｂ ＣＨ１抗体断片（重鎖定常領域ＣＨ１ドメインを含有するＦａｂ断片）を示す。異なる融合様式、かつ異なるアンカー分子を用いてのアンカリングを可能にする、合計４個の合成構築物を作製した。重鎖可変ドメインは、生じたプラスミドへ別個にクローニングされ、ＶＨおよび重鎖定常領域ＣＨ１ドメインで構成される完全長Ｆａｂ重鎖（ＶＨ−ＣＨ１）のディスプレイプラスミドを作製することができる。図１Ｅは、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞の表面上で発現するように、適切なアンカーポリペプチドを伴ったｓｃＦｖ断片およびＦａｂ断片のそれぞれから発現する様々なポリペプチドの共形質転換ストラテジーおよび概略図を示す。
【図２】図２は、ＦＡＬＣＯＮ培養および振盪フラスコ（ＳＦ）培養（８６％）の両方について、最少補充培地（ＭＭ）およびリッチな培地（ＲＭ）中、２０℃で２０時間、誘導されたＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞におけるｃ−Ｍｙｃタグ付きｓｃＦｖ発現を示す、一連の１次元蛍光フローサイトメトリー（ＦＦＣ）ヒストグラムである。細胞をまた、振盪フラスコ内、ＭＭ中、２８℃で増殖させた。上部のパネルは、ｃ−Ｍｙｃタグ付きｓｃＦｖ断片についてのＦＦＣヒストグラムを示し、一方、下部パネルは、完全なサイズのモノクローナルのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ抗体を発現する株１Ｔ２についてのＦＦＣヒストグラムを示す。蛍光を、下記の実施例１に記載されているように検出した。網掛けヒストグラムは、自己蛍光を示し（陰性対照）、一方、実線はｃ−ｍｙｃ発現を表す。
【図３】図３は、様々な時間量で誘導されたＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞におけるｃ−Ｍｙｃタグ付きｓｃＦｖ発現を示す、一連の１次元ＦＦＣヒストグラムである。そのヒストグラムは、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞におけるｃ−Ｍｙｃタグ付きｓｃＦｖの表面ディスプレイレベルへの誘導時間の効果を示す。細胞を、１６時間、２０時間、２４時間、３２時間、および４３時間、増殖させた。ｃ−Ｍｙｃを発現する細胞の相対的割合は、誘導時間が長くなるにつれて減少した（２４時間後５４％、３２時間後１９％、および４３時間後７％）。蛍光を、実施例１に記載されているように検出した。網掛けヒストグラムは、自己蛍光を示し（陰性対照）、一方、実線はｃ−ｍｙｃ発現を表す。
【図４】図４は、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞におけるｃ−Ｍｙｃタグ付きｓｃＦｖの表面ディスプレイレベルへのｐＨの効果を示す、一連の１次元ＦＦＣヒストグラムである。細胞を、ｐＨ６．８、ｐＨ５、およびｐＨ３で、２４時間（上部パネル）および３２時間（下部パネル）、増殖させた。左側のパネルは、表面上にｓｃＦｖを発現していない細胞のバックグラウンド蛍光を示す。右側のパネルは、表面上にｓｃＦｖを発現している細胞の蛍光を示す。蛍光を、実施例１に記載されているように検出した。
【図５】図５は、２つの異なるｃ−Ｍｙｃタグ付きｓｃＦｖ断片：４−４−２０ ｓｃＦｖ（「４−４−２０ ｓｃＦｖ」表示の下のグラフ）およびｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ｓｃＦｖ（「ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ｓｃＦｖ」表示の下のグラフ）の表面発現を示す、一連の１次元ＦＦＣヒストグラムである。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓａｇ１ｐのＣ末端部分（３２０個のＣ末端アミノ酸）へのＮ末端融合（「Ａ１」と表示された行におけるヒストグラム）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｇａ２ｐへのＮ末端融合（「Ａ２」と表示された行におけるヒストグラム）、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＣｗｐＩｐのＣ末端部分（１１０個のＣ末端アミノ酸）へのＮ末端融合（「Ａ３」と表示された行におけるヒストグラム）、およびＡｇａ２ｐへのＣ末端融合（「Ａ４」と表示された行におけるヒストグラム）としてのｓｃＦｖ断片のディスプレイを可能にする、合計４個のディスプレイプラスミドを作製した。ｓｃＦｖ断片は抗原を結合することができた（「リガンド結合」と表示された列におけるパネル）。リガンド結合検出について、ビオチン化抗原を、ストレプトアビジン−フィコエリトリンで検出した。蛍光を、実施例１に記載されているように検出した。各グラフについて、網掛けヒストグラムは、自己蛍光を示す（陰性対照）。実線は、各列の上に示されているように、ｃ−ｍｙｃ発現またはリガンド結合を表す。
【図６】図６は、ｃ−Ｍｙｃタグ付き４−４−２０ ｓｃＦｖ融合タンパク質か（図６Ａ）、またはｃ−Ｍｙｃタグ付き４−４−２０重鎖および軽鎖の融合タンパク質か（図６Ｂ）のいずれかを発現する細胞の一連の免疫蛍光顕微鏡写真である。発現を、抗ｃ−Ｍｙｃ抗体で染色することによって検出した。
【図７】図７は、２つの異なるｃ−Ｍｙｃタグ付きＦａｂ断片：４−４−２０ Ｆａｂ（「４−４−２０ Ｆａｂ」の見出しの下のヒストグラム）およびｈｅｒｃｅｐｔｉｎ Ｆａｂ（「ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ Ｆａｂ」の見出しの下のヒストグラム）の表面発現を示す、一連の１次元ＦＦＣヒストグラムである。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓａｇ１ｐのＣ末端部分（３２０個のＣ末端アミノ酸）へのＮ末端融合（「Ａ１」と表示された行におけるヒストグラム）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｇａ２ｐへのＮ末端融合（「Ａ２」と表示された行におけるヒストグラム）、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＣｗｐＩｐのＣ末端部分（１１０個のＣ末端アミノ酸）へのＮ末端融合（「Ａ３」と表示された行におけるヒストグラム）、およびＡｇａ２ｐへのＣ末端融合（「Ａ４」と表示された行におけるヒストグラム）としてのＦａｂ重鎖断片のディスプレイを可能にする、合計４個のディスプレイプラスミドを作製した。Ｆａｂ軽鎖は、可溶性断片として発現した。重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）発現を検出した。リガンド結合検出について、ビオチン化抗原を、ストレプトアビジン−フィコエリトリンで検出した。蛍光を、実施例１に記載されているように検出した。各グラフについて、網掛けヒストグラムは、自己蛍光を示す（陰性対照）。実線は、各列の上に示されているように、ｃ−ｍｙｃ発現（アンカー型重鎖断片発現を示す）、Ｖ５発現（軽鎖発現を示す）、またはリガンド結合を表す。
【図８】図８は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ Ｆａｂの表面発現を示す、一連の１次元ＦＦＣヒストグラムである。重鎖は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｇａ２ｐへのＮ末端融合であった。軽鎖は、可溶性発現であった。重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）を個々に検出した（それぞれ、「ＨＣ」および「ＬＣ」と表示された行におけるヒストグラム）。２色のＦＡＣＳ分析を用いたＨＣおよびＬＣの同時標識（「ＨＣ＋ＬＣ」と表示された行におけるヒストグラム）により、個々の酵母細胞の表面上での両方の鎖の対形成が示された。蛍光を、実施例１に記載されているように検出した。網掛けヒストグラムは、自己蛍光を示し（陰性対照）、一方、実線は、示されているように、ＨＣ発現かまたはＬＣ発現のいずれかを表す。
【図９】図９は、Ｈｅｒ−ｓｃＦｖ発現およびＨｅｒ−Ｆａｂ発現へのシャペロンの効果を示す１組の棒グラフである。ＷＴ＝野生型。ＴＥＦ ＰＤ＝ＴＥＦプロモーターの調節下で発現したＰＤＩ（タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ）。ＰＯＸ２ ＨＡＣＩ＝ＰＯＸ２プロモーターの調節下で発現したＨＡＣＩ（ＵＰＲ（小胞体ストレス応答）を誘導した転写因子）。
【図１０】図１０は、ディスプレイされたＨｅｒｃｅｐｔｉｎ ｓｃＦｖについての用量反応曲線を示す、一連の線グラフである。３つの独立した力価測定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）が示されている。ｐｒｅＡ１−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ｓｃＦｖ＝Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓａｇ１ｐのＣ末端の３２０個のアミノ酸へのＮ末端融合として融合し、かつＬｉｐ２ｐｒｅリーダー配列と共に発現したＨｅｒｃｅｐｔｉｎ ｓｃＦｖ。ｐｒｅｐｒｏＡ１−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ｓｃＦｖ＝Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓａｇ１ｐのＣ末端の３２０個のアミノ酸へのＮ末端融合として融合し、かつＬｉｐ２ｐｒｅｐｒｏリーダー配列と共に発現したＨｅｒｃｅｐｔｉｎ ｓｃＦｖ。ｐｒｅＡ２−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ｓｃＦｖ＝Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｇａ２ｐへのＮ末端融合として融合し、かつＬｉｐ２ｐｒｅリーダー配列と共に発現したＨｅｒｃｅｐｔｉｎ ｓｃＦｖ。「［Ａｇ］」＝ＨＥＲ２−Ｆｃキメラタンパク質（抗原）濃度。Ｙ軸は、結合割合を示し、その結合割合は、ＭＦＩ／（ＭＦＩｍａｘ−ＭＦＩｍｉｎ）として計算され、標準化され、パーセンテージとして表される。計算されたｋＤは、各力価測定曲線について示されている。
【図１１】図１１は、ディスプレイされたｓｃＦｖのＤ１．３および変異体Ｍ３（それぞれ、鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ）を認識する）についての用量反応曲線を示す１組の線グラフである。Ｍ３は、Ｄ１．３より２倍高い、鶏卵リゾチームに対する親和性を有する。ディスプレイされたポリペプチドは、Ｓａｇ１ｐ融合ポリペプチド（「ｐｒｅＡ１ Ｄ１．３ 対 Ｍ３」と表示された線グラフ）およびＡｇａ２ｐ融合ポリペプチド（「ｐｒｅＡ２ Ｄ１．３ 対 Ｍ３」と表示された線グラフ）として発現した。Ｄ１．３またはＭ３をディスプレイする細胞を、様々な濃度のビオチン化鶏卵リゾチーム（ｎＭでの濃度を示すＸ軸）とインキュベートした。計算されたｋＤは各力価測定曲線に示されている。
【図１２】図１２は、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを形質転換するために用いられる複製型ベクターの概略図である。複製型ベクターを、ｐＰＯＸ２プロモーターによって駆動されるｓｃＦｖ−ＡＧＡ２発現カセット、および複製増殖のためのＡＲＳ１８を含有するように構築した。
【図１３】図１３は、ゼータに基づいた組込み型プラスミド（図１３Ａ）または複製型プラスミド（図１３Ｂ）で形質転換されたＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞におけるｓｃＦｖ−ＡＧＡ２の細胞表面発現を示す１組のヒストグラムである。複製型プラスミドについてのデータは、１０個のクローンの平均を表す。複製型ベクターで形質転換された細胞を、非選択条件下および選択条件下で増殖させた。（「ＦＬ２−Ｈ」と表示された）Ｘ軸は、フィコエリトリン連結型二次抗体を用いてチャネル２において記録されたｃ−ｍｙｃ蛍光シグナルを示す。（「カウント」と表示された）Ｙ軸は、細胞の数を示す。
【図１４Ａ】図１４は、単一のｃ−Ｍｙｃタグ付き完全長トラスツズマブ（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）ＩｇＧの表面発現を示す、一連の１次元ＦＦＣヒストグラムである。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｇａ２ｐへのＮ末端融合としてのＩｇＧ重鎖（「Ａ２」と表示された行におけるヒストグラム）、およびＡｇａ２ｐへのＣ末端融合としてのＩｇＧ重鎖（「Ａ４」と表示された行におけるヒストグラム）のディスプレイを可能にする、合計２個のディスプレイプラスミドを作製した。ＩｇＧ軽鎖は、可溶性断片として発現した。重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）の発現を検出した。蛍光を、実施例１に記載されているように検出した。図１４Ａは、ｃ−ｍｙｃおよびＶ５の発現を示すドットブロットである。明らかに、全ての細胞が、ＡＧＡ２へのＮ末端融合およびＣ末端融合の両方について、完全長重鎖および軽鎖の発現を同時に示している。非標識細胞は、そのエピトープタグの検出を示していない。図１４Ｂ：網掛けヒストグラムは、両方の融合についてのｃ−ｍｙｃおよびＶ５の発現を示す。ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ Ｆａｂディスプレイについて観察されたことと類似して、重鎖がＡＧＡ２アンカーのＣ末端に融合している細胞について、Ｎ末端融合と比較して、ディスプレイ効率の劇的な向上を（点線によって示されているように）観察することができる。図１４Ｃは、発現したＨＣおよびＬＣの概略図を示す。
【図１４Ｂ】図１４は、単一のｃ−Ｍｙｃタグ付き完全長トラスツズマブ（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）ＩｇＧの表面発現を示す、一連の１次元ＦＦＣヒストグラムである。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｇａ２ｐへのＮ末端融合としてのＩｇＧ重鎖（「Ａ２」と表示された行におけるヒストグラム）、およびＡｇａ２ｐへのＣ末端融合としてのＩｇＧ重鎖（「Ａ４」と表示された行におけるヒストグラム）のディスプレイを可能にする、合計２個のディスプレイプラスミドを作製した。ＩｇＧ軽鎖は、可溶性断片として発現した。重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）の発現を検出した。蛍光を、実施例１に記載されているように検出した。図１４Ａは、ｃ−ｍｙｃおよびＶ５の発現を示すドットブロットである。明らかに、全ての細胞が、ＡＧＡ２へのＮ末端融合およびＣ末端融合の両方について、完全長重鎖および軽鎖の発現を同時に示している。非標識細胞は、そのエピトープタグの検出を示していない。図１４Ｂ：網掛けヒストグラムは、両方の融合についてのｃ−ｍｙｃおよびＶ５の発現を示す。ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ Ｆａｂディスプレイについて観察されたことと類似して、重鎖がＡＧＡ２アンカーのＣ末端に融合している細胞について、Ｎ末端融合と比較して、ディスプレイ効率の劇的な向上を（点線によって示されているように）観察することができる。図１４Ｃは、発現したＨＣおよびＬＣの概略図を示す。
【図１４Ｃ】図１４は、単一のｃ−Ｍｙｃタグ付き完全長トラスツズマブ（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）ＩｇＧの表面発現を示す、一連の１次元ＦＦＣヒストグラムである。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｇａ２ｐへのＮ末端融合としてのＩｇＧ重鎖（「Ａ２」と表示された行におけるヒストグラム）、およびＡｇａ２ｐへのＣ末端融合としてのＩｇＧ重鎖（「Ａ４」と表示された行におけるヒストグラム）のディスプレイを可能にする、合計２個のディスプレイプラスミドを作製した。ＩｇＧ軽鎖は、可溶性断片として発現した。重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）の発現を検出した。蛍光を、実施例１に記載されているように検出した。図１４Ａは、ｃ−ｍｙｃおよびＶ５の発現を示すドットブロットである。明らかに、全ての細胞が、ＡＧＡ２へのＮ末端融合およびＣ末端融合の両方について、完全長重鎖および軽鎖の発現を同時に示している。非標識細胞は、そのエピトープタグの検出を示していない。図１４Ｂ：網掛けヒストグラムは、両方の融合についてのｃ−ｍｙｃおよびＶ５の発現を示す。ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ Ｆａｂディスプレイについて観察されたことと類似して、重鎖がＡＧＡ２アンカーのＣ末端に融合している細胞について、Ｎ末端融合と比較して、ディスプレイ効率の劇的な向上を（点線によって示されているように）観察することができる。図１４Ｃは、発現したＨＣおよびＬＣの概略図を示す。
【図１５】図１５は、ｓｃＦｖ親和性成熟スクリーニングから単離されたクローンのうちの２個（クローン１３およびクローン３８）についての用量反応曲線を示す線グラフである。Ｋｄを、平衡力価測定曲線から決定し、野生型Ｄ１．３のＫｄと比較した。Ｋｄ値は、クローン１３およびクローン３８について、それぞれ、２．２ｎＭおよび１．８ｎＭであることが決定された。これは、野生型Ｋｄ（４．０ｎＭ）と比較して、それぞれ、１．８倍および２．４倍の向上を表し、Ｍ３変異体についてと同じ範囲内にある。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
特定の実施形態の説明
酵母細胞の表面上にポリペプチド（例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片）をディスプレイするのに用いる方法および組成物が本明細書に提供される。本明細書に開示された様々な方法および組成物と共に用いることができる例示的な酵母として、Ｙａｒｒｏｗｉａ属の酵母、例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｙｌ）が挙げられる。
【００２４】
抗体ポリペプチドおよび抗体ポリペプチド断片
様々な抗体ポリペプチドまたはその断片のいずれもを、本明細書に記載された方法および組成物に従って、酵母細胞の表面上に発現させることができる。
【００２５】
「抗体ポリペプチド」とは、その用語が本明細書で用いられる場合、免疫グロブリン重鎖ポリペプチドおよび／または免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド、またはそれらに由来するポリペプチドを指す。当技術分野において知られているように、野生型ＩｇＧ抗体は、一般的に、２つの同一の重鎖ポリペプチドおよび２つの同一の軽鎖ポリペプチドを含む。所定の抗体は、α、δ、ε、γ、およびμ（それらの分類は、重鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいている）と呼ばれる５つの型の重鎖のうちの１つを含む。ヒトにおいては、α定常領域の２つのサブタイプおよびγ定常領域の４つのサブタイプがある。これらの異なる型の重鎖が、それぞれ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２のサブクラスを含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４のサブクラスを含む）、およびＩｇＭという５つのクラスの抗体を生じる。所定の抗体はまた、κまたはλ（それらの分類は、軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列に基づいている）と呼ばれる２つの型の軽鎖のうちの１つを含む。特定の実施形態において、本明細書に開示された方法は、酵母、例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ株の細胞表面上に抗体ポリペプチドの発現をもたらす。特定の実施形態において、完全長重鎖、完全長軽鎖、または両方が酵母において発現する。特定の実施形態において、完全長重鎖の断片、完全長軽鎖の断片、またはその両方が酵母において発現する。
【００２６】
「抗体断片」または「抗体ポリペプチド断片」とは、その用語が本明細書で用いられる場合、上記で定義されているような完全長抗体ポリペプチドを含まないが、依然として完全長抗体ポリペプチドの少なくとも一部を含む、抗体ポリペプチド分子に由来するポリペプチドを指す。抗体ポリペプチド断片は、完全長抗体ポリペプチドの切断された部分を含むポリペプチドを含むことが多いが、その用語は、そのような切断された断片に限定されない。本明細書で用いられる場合、抗体ポリペプチド断片は、抗体ポリペプチド（例えば、重鎖抗体ポリペプチドまたは軽鎖抗体ポリペプチド）に由来する単一のポリペプチド鎖を含む断片を包含するので、抗体ポリペプチド断片がそれ自体では抗原を結合しない場合があることは理解されているであろう。例えば、抗体ポリペプチド断片は、Ｆａｂ断片に含有される、重鎖抗体ポリペプチドの部分を含んでもよい；そのような抗体ポリペプチド断片は、典型的には、それが軽鎖抗体ポリペプチドに由来する別の抗体ポリペプチド断片（例えば、Ｆａｂ断片に含有される、軽鎖抗体ポリペプチドの部分）と会合して、抗原結合部位が再構成されない限り、抗原を結合しないであろう。抗体ポリペプチド断片には、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、直鎖抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、および多重特異性抗体（例えば、ダイアボディ、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ））などの多重特異性抗体断片、ミニボディ、キレート組換え抗体、トリボディ（ｔｒｉｂｏｄｙ）またはバイボディ（ｂｉｂｏｄｙ）、イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、小モジュール免疫薬剤（ＳＭＩＰ）、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化抗体、およびＶＨＨ含有抗体を挙げることができる。「抗体断片」または「抗体ポリペプチド断片」は、「抗原結合性抗体断片」および「抗原結合性抗体ポリペプチド断片」を含むことは認識されているであろう。例えば、米国特許第７，４２２，８９０号、第７，４２２，７４２号、および第７，３９０，８８４号（それぞれ、全体として参照により本明細書に組み入れられている）を参照されたい。
【００２７】
「ヒト化抗体ポリペプチド」とは、その用語が本明細書で用いられる場合、可変領域における重鎖ポリペプチドおよび／または軽鎖ポリペプチドの非ヒト（例えば、マウス、ラット、またはハムスター）相補性決定領域（ＣＤＲ）と１つまたは複数のヒト可変領域（軽鎖および／または重鎖）フレームワーク領域、ならびにヒト重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域を含むように操作された抗体ポリペプチドを指す。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域を除いて、完全にヒトである配列を含む。ヒト化抗体は、典型的には、非ヒト化抗体と比べて、ヒトに対する免疫原性が低く、したがって、治療的適用においていくらかの利益をもたらす。当業者はヒト化抗体を知っているであろうし、ヒト化抗体ポリペプチドを作製するための適切な技術もまた知っているであろう。例えば、米国特許第７，４４２，７７２号、第７，４３１，９２７号、第６，８７２，３９２号、および第５，５８５，０８９号（それぞれ、全体として参照により本明細書に組み入れられている）を参照されたい。
【００２８】
「キメラ抗体ポリペプチド」とは、その用語が本明細書で用いられる場合、少なくとも１つのヒト定常領域を含むように操作された抗体ポリペプチドを指す。重鎖および／または軽鎖は、ヒト定常領域を有し得る。キメラ抗体は、典型的には、非キメラ抗体と比べて、ヒトに対する免疫原性が低く、したがって、治療的適用においていくらかの利益をもたらす。当業者はキメラ抗体を知っているであろうし、キメラ抗体ポリペプチドを作製するための適切な技術もまた知っているであろう。例えば、米国特許第７，４４２，７７２号、第７，４３１，９２７号、第６，８７２，３９２号、および第５，５８５，０８９号（それぞれ、全体として参照により本明細書に組み入れられている）を参照されたい。
【００２９】
特定の実施形態において、発現した抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片は、ヒト抗体ポリペプチドまたは断片である。特定の実施形態において、発現した抗体ポリペプチドまたはその断片は、非ヒト抗体ポリペプチドまたはその断片、例えば、マウスまたはラットの抗体ポリペプチドまたはその断片である。特定の実施形態において、発現した抗体ポリペプチドまたはその断片は、それがヒト重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域を含有する点においてキメラである。特定の実施形態において、発現した抗体ポリペプチドまたはその断片は、それが可変領域において、重鎖および／または軽鎖の非ヒト（例えば、マウス、ラット、またはハムスター）相補性決定領域（ＣＤＲ）と共に、１つまたは複数のヒトフレームワーク領域を含有する点においてヒト化されている。
【００３０】
特定の実施形態において、酵母細胞の表面上に発現する抗体ポリペプチドは、抗体の重鎖ポリペプチドを含む。特定の実施形態において、重鎖ポリペプチドの断片、例えば、Ｆａｂ断片内（例えば、ＶＨ−ＣＨ１）、Ｆｖ断片内、またはｓｃＦｖ断片内に含有される重鎖ポリペプチドの部分が、酵母細胞の表面上に発現する。特定の実施形態において、酵母細胞の表面上に発現する抗体ポリペプチドは、重鎖定常領域の全部または一部、例えば、Ｆｃ領域、ヒンジ領域などを含む。特定の実施形態において、酵母細胞の表面上に発現する抗体ポリペプチドは、重鎖定常領域を欠く。特定の実施形態において、酵母細胞の表面上に発現する抗体ポリペプチドは、重鎖定常領域の一部、例えば、Ｆｃ領域を欠く。
【００３１】
特定の実施形態において、酵母細胞の表面上に発現する抗体ポリペプチドは、抗体の軽鎖ポリペプチドを含む。特定の実施形態において、軽鎖ポリペプチドの断片、例えば、Ｆｖ断片またはｓｃＦｖ断片が、酵母細胞の表面上に発現する。特定の実施形態において、酵母細胞の表面上に発現する抗体ポリペプチドは、軽鎖定常領域を含む。特定の実施形態において、酵母細胞の表面上に発現する抗体ポリペプチドは、軽鎖定常領域を欠く。
【００３２】
特定の実施形態において、抗体ポリペプチド断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、直鎖抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、もしくは多重特異性抗体（例えば、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ）などの多重特異性抗体断片、ミニボディ、キレート組換え抗体、トリボディもしくはバイボディ、イントラボディ、ナノボディ、小モジュール免疫薬剤（ＳＭＩＰ）、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化抗体、またはＶＨＨ含有抗体の部分であるアミノ酸鎖を含むポリペプチドである。特定の実施形態において、抗体ポリペプチド断片は、ｓｃＦｖ断片である。
【００３３】
特定の実施形態において、重鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片と軽鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片の両方が、酵母細胞の表面上に発現する。例えば、完全な重鎖抗体ポリペプチドおよび完全な軽鎖抗体ポリペプチドが、本明細書に記載された酵母（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のいずれかにおいて発現してもよい。別の例として、Ｆａｂ断片内、Ｆｖ断片内、またはｓｃＦｖ断片内に含まれる重鎖抗体ポリペプチドの部分が、Ｆａｂ断片内、Ｆｖ断片内、またはｓｃＦｖ断片内に含まれる軽鎖抗体ポリペプチドの部分と共に酵母において発現してもよい。当業者によって理解されているように、重鎖抗体ポリペプチドおよび軽鎖抗体ポリペプチド（またはそれらの抗体ポリペプチド断片）が酵母細胞の表面上に発現する場合、そのような抗体ポリペプチドまたは断片は、機能しうる抗原結合性分子を再構成するようにお互いに会合することができる。
【００３４】
特定の実施形態において、重鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片は、第１の接合型の第１の一倍体酵母細胞の表面上に発現し、軽鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片は、第２の接合型の第２の一倍体酵母細胞の表面上に発現し、第１の一倍体酵母細胞と第２の一倍体酵母細胞が接合して、二倍体酵母細胞を生じる。逆に、軽鎖抗体ポリペプチドまたはその断片は、第１の接合型の第１の一倍体酵母細胞の表面上に発現し、重鎖抗体ポリペプチドまたはその断片は、第２の接合型の第２の一倍体酵母細胞の表面上に発現し、第１の一倍体酵母細胞と第２の一倍体酵母細胞が接合して、二倍体酵母細胞を生じる。そのような接合の結果として生成されたそのような二倍体酵母細胞は、重鎖抗体ポリペプチドおよび軽鎖抗体ポリペプチド（またはそれらの抗体ポリペプチド断片）を発現するであろう。酵母接合型は当技術分野において知られている。例えば、一倍体の形をとる場合、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、２つの接合型：ＭＡＴＡおよびＭＡＴＢのうちの１つとして存在する。さらに、ＭＡＴＡ接合型Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞を、ＭＡＴＢ接合型へと操作することができる。一倍体ＭＡＴＡ酵母細胞およびＭＡＴＢ酵母細胞は、お互いに接合して、二倍体酵母細胞を形成することができる。当業者は、接合することができる酵母種を知っているであろうし、適切な接合型も知っているであろう。
【００３５】
特定の実施形態において、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を発現する一倍体酵母細胞は、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードする核酸配列を含むベクターまたは発現カセット（「発現カセットおよびベクター」と題するセクションを参照）で一倍体酵母細胞を形質転換することによって作製することができる。あるいは、抗体ポリペプチドまたはその断片を発現する一倍体酵母細胞は、抗体ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸配列を含むベクターで二倍体酵母細胞を形質転換し、形質転換された二倍体酵母細胞を胞子形成させて、一倍体酵母細胞を生成させることにより、作製することができる。
【００３６】
特定の実施形態において、重鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片と軽鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片の両方は、２つのベクターまたは発現カセット：重鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードする核酸配列を含む第１のベクターまたは発現カセット、および軽鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードする核酸配列を含む第２のベクターまたは発現カセットで一倍体酵母細胞を形質転換することによって酵母細胞の表面上に発現する。特定の実施形態において、重鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片と軽鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片の両方は、単一のベクターで一倍体酵母細胞を形質転換することによって酵母細胞の表面上に発現し、そのベクターは、重鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片および軽鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードする核酸配列を含む発現カセットを含む。そのような酵母細胞は一倍体かまたは二倍体のいずれでもあり得る。
【００３７】
特定の実施形態において、酵母細胞の表面上に発現する重鎖抗体ポリペプチドもしくは抗体ポリペプチド断片および／または軽鎖抗体ポリペプチドもしくは抗体ポリペプチド断片は、アンカーポリペプチド（下記の「アンカーポリペプチド」と題するセクションを参照）を含む融合ポリペプチドである。抗体ポリペプチドまたは断片をそれの重鎖抗体ポリペプチドまたは断片を介してアンカリングすることが典型的であるが、軽鎖抗体ポリペプチドまたは断片を介してのアンカリングもまた可能である。例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ｌｉｎら、Ａｐｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌ、２００３、Ａｕｇ；６２（２−３）：２２６−３２を参照されたい。特定の実施形態において、抗体ポリペプチドまたはその断片の重鎖のみがアンカーポリペプチドに融合している。特定の実施形態において、抗体ポリペプチドまたはその断片の軽鎖のみがアンカーポリペプチドに融合している。特定の実施形態において、抗体ポリペプチドまたはその断片の重鎖と抗体ポリペプチドまたはその断片の軽鎖の両方がアンカーポリペプチドに融合している。特定の実施形態において、アンカーポリペプチドは、融合ポリペプチドのアミノ末端で融合している。特定の実施形態において、アンカーポリペプチドは、融合ポリペプチドのカルボキシ末端で融合している。
【００３８】
特定の実施形態において、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片は、本明細書に開示された様々な方法のいずれかによって得られる。そのような抗体ポリペプチドまたはその断片は、細胞の一部として得られてもよい。あるいは、抗体ポリペプチドまたはその断片は、それが発現した後、細胞から精製されてもよい。ポリペプチドを精製するための標準技術を用いてもよい。
【００３９】
目的のポリペプチドを発現する酵母細胞は、当業者に知られた様々な方法のいずれかによって検出およびスクリーニングすることができる。例えば、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離装置）を用いることができる。ＦＡＣＳにおいて、酵母細胞を、目的のポリペプチドを結合する標識化作用物質（例えば、本開示の抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片によって結合される抗原）と接触させる。検出可能である限り、いずれの標識も用いることができる。適切な標識として、非限定的に、蛍光部分、化学発光部分などが挙げられる。当業者は適切な標識を知っているであろう。特定の実施形態において、作用物質は、間接的標識で標識され、これは、間接的標識に結合する検出可能に標識された作用物質（例えば、蛍光部分または化学発光部分）との結合によって検出することができる。様々な間接的標識が当技術分野において知られており、それらには、ビオチン（アビジンまたはストレプトアビジンによって結合され得る）、エピトープタグ（例えば、本明細書に記載されたエピトープタグのいずれか）などが挙げられるが、それらに限定されない。エピトープタグは、特定のエピトープタグに特異的な標識抗体またはその断片を用いて検出することができる。あるいは、エピトープタグは、特定のエピトープタグに特異的な第１の抗体またはその断片と結合させ、標識された第２の抗体またはその断片で第１の抗体または断片を検出することによって検出することができる。その後、酵母細胞を細胞ソーターに通して、細胞を分離し、標識化作用物質が各個々の細胞と会合しているか否かを決定する。蛍光を示す細胞が、それらの表面上に目的のポリペプチドを発現している。あるいは、目的の抗体ポリペプチドまたは断片に結合する作用物質（例えば、抗原）でコーティングされたプレート上で細胞を「パニング」してもよい。あるいは、目的の抗体ポリペプチドまたは断片に結合する作用物質（例えば、抗原）に連結されている固体支持体（例えば、ビーズ）に細胞を結合させてもよい。その後、固体支持体を（例えば、遠心分離、支持体が常磁性である場合には磁気的取り出しなどにより）単離することができる；固体支持体に結合した任意の細胞がそれらの表面上に目的のポリペプチドを発現している。当業者は、表面上に目的のポリペプチドを発現する酵母細胞を同定および単離するための他の適切な方法を知っているであろう。例えば、ＹｅｕｎｇおよびＷｉｔｔｒｕｐ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．、Ｍａｒ−Ａｐｒ；１８（２）：２１２−２０、２００２；Ａｃｋｅｒｍａｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．、Ｍａｙ−Ｊｕｎ；２５（３）：７７４−８３、２００９；Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｓｅｐ；３０４（１−２）：３０−４２、２００５；およびＣｈａｏら、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．、１（２）：７５５−６８、２００６（それぞれ、全体として参照により本明細書に組み入れられている）を参照。
【００４０】
当業者は、本明細書に記載された方法および組成物に従って、酵母（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞の表面上に発現させることができる他の抗体ポリペプチドおよび断片を知っているであろう。
【００４１】
アンカーポリペプチド
本明細書に記載された方法および組成物に従って酵母細胞の表面上にポリペプチド（例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片）を発現させるために、様々なアンカーポリペプチドのいずれかを用いることができる。
【００４２】
「アンカーポリペプチド」とは、その用語が本明細書で用いられる場合、細胞の表面に繋ぎ止められているポリペプチドであって、したがって、他のポリペプチド（例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片）を細胞の表面に繋ぎ止めるために用いることができるポリペプチドを指す。例えば、アンカーポリペプチドは、膜貫通タンパク質、または例えば、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）細胞壁タンパク質などの細胞壁タンパク質であってもよい。様々なアンカーポリペプチドが当技術分野において知られており、酵母の表面上にポリペプチドを発現させるための本明細書に開示された組成物および方法に従って用いることができる。そのようなアンカーペプチドには、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｇａ１−Ａｇａ２（接合型Ａ凝集素遺伝子）ヘテロダイマー、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α−凝集素（Ｓａｇ１ｐ）、Ｐｉｒ１ｐ、Ｐｉｒ２ｐ、Ｐｉｒ４ｐ、Ｆｌｏ１ｐ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ＣＷＰＩ、およびその断片が挙げられるが、それらに限定されない（例えば、Ｕｅｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９０：１２５−３６、２０００；Ａｂｅ，Ｈ．、Ｓｈｉｍｍａら、Ｐｉｒ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １３、８７−９５、２００３；Ａｎｄｒｅｓ，Ｉ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８９、６９０−７、２００５；Ｗａｎｇ，Ｑ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６、３５２−７、２００８；Ｔａｎｉｎｏ，Ｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２２、９８９−９３、２００６；Ｙｕｅら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００８ Ｆｅｂ；７２（２）：１１６−２３参照；それぞれ、全体として参照により本明細書に組み入れられている）。
【００４３】
特定の実施形態において、アンカーポリペプチドは、酵母細胞の表面、例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞の表面に、目的のポリペプチド（例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片）を繋ぎ止めるために用いられる。例えば、アンカーポリペプチドと目的のポリペプチドの両方が細胞表面上に発現するように、アンカーポリペプチドは、目的のポリペプチドに融合していてもよい。
【００４４】
特定の実施形態において、目的のポリペプチド（例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片）を発現する酵母細胞は、アンカーポリペプチドをコードする第２の核酸配列にインフレームで融合した、目的のポリペプチドをコードする第１の核酸配列を含むベクターまたは発現カセット（「発現カセットおよびベクター」と題するセクションを参照）で酵母細胞を形質転換することによって作製することができる。特定の実施形態において、第１の核酸配列は、第２の核酸配列の５’に融合しており、その結果、その融合配列から産生される融合ポリペプチドは、Ｎ末端の目的のポリペプチドおよびＣ末端のアンカーポリペプチドを含む。特定の実施形態において、第１の核酸配列は、第２の核酸配列の３’に融合しており、その結果、その融合配列から産生される融合ポリペプチドは、Ｎ末端のアンカーポリペプチドおよびＣ末端の目的のポリペプチドを含む。特定の実施形態において、第１の核酸配列は、第２の核酸配列にインフレームで直接、融合している。特定の実施形態において、第１の核酸配列は、リンカー配列に融合しており、そのリンカー配列が、第２の核酸配列に融合している。「発現カセットおよびベクター」と題するセクションにおいてより詳細に記載されているように、リンカー配列は、典型的には、非限定的に、ＧｌｙＳｅｒリンカーポリペプチド、例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３または（ＧｌｙＳｅｒ）５などのリンカーポリペプチドをコードする。
【００４５】
発現カセットおよびベクター
特定の実施形態において、ポリペプチド（例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片）は、そのポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現カセットで酵母を形質転換することによって、酵母細胞の表面上に発現する。本明細書で用いられる場合、用語「発現カセット」は、（１）目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および（２）目的のポリペプチドの発現を駆動するヌクレオチド配列（例えば、プロモーター）を含む最小限の核酸配列を指す。
【００４６】
特定の実施形態において、発現カセットのヌクレオチド配列によってコードされる目的のポリペプチドは、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を含む。発現カセットは、本明細書に記載された任意の抗体ポリペプチドまたは断片、例えば、抗体ポリペプチド、またはＦａｂ断片、Ｆｖ断片、もしくはｓｃＦｖ断片に由来する断片をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。特定の実施形態において、目的のポリペプチドは、Ｆａｂ断片の重鎖である。特定の実施形態において、目的のポリペプチドは、Ｆａｂ断片の軽鎖である。
【００４７】
特定の実施形態において、発現カセットのヌクレオチド配列によってコードされる目的のポリペプチドは、アンカーポリペプチドを含む。発現カセットは、本明細書に記載された任意のアンカーポリペプチド、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｇａ１−Ａｇａ２ヘテロダイマー、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α−凝集素（Ｓａｇ１ｐ）、Ｐｉｒ１ｐ、Ｐｉｒ２ｐ、Ｐｉｒ４ｐ、Ｆｌｏ１ｐ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ＣＷＰＩ、およびその断片をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。
【００４８】
特定の実施形態において、発現カセットのヌクレオチド配列によってコードされる目的のポリペプチドは、アンカーポリペプチドにインフレームで融合した抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を含む。例えば、発現カセットは、抗体ポリペプチドまたは断片をコードする第１のヌクレオチド配列を含むことができ、その第１のヌクレオチド配列は、アンカーポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列にインフレームで融合している。特定の実施形態において、抗体ポリペプチドまたは断片をコードする第１のヌクレオチド配列は、アンカーポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列の５’にインフレームで融合しており、その結果、そのヌクレオチド配列が発現した場合、抗体ポリペプチドまたは断片は、アンカーポリペプチドのＮ末端側である。特定の実施形態において、抗体ポリペプチドまたは断片をコードする第１のヌクレオチド配列は、アンカーポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列の３’にインフレームで融合しており、その結果、そのヌクレオチド配列が発現した場合、抗体ポリペプチドまたは断片は、アンカーポリペプチドのＣ末端側である。
【００４９】
特定の実施形態において、発現カセットは、介在ヌクレオチド残基がないように、アンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にインフレームで融合している抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含む。そのような実施形態において、発現カセットから発現したポリペプチドは、介在アミノ酸残基なしで、アンカーポリペプチドに直接融合した抗体ポリペプチドまたは断片を含むであろう。特定の実施形態において、発現カセットは、リンカーポリペプチドをコードするリンカー配列にインフレームで融合している抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含み、そのリンカー配列は、アンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にインフレームで融合しており、その結果、リンカー配列は、抗体ポリペプチドまたは断片をコードする第１のヌクレオチド配列と、アンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との間にインフレームで融合している。そのような実施形態において、発現カセットから発現するポリペプチドは、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片、リンカーポリペプチド、およびアンカーポリペプチドを含むであろう。この段落に記載された実施形態のいずれにおいても、抗体ポリペプチドまたは断片をコードするヌクレオチド配列は、アンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’と３’のどちらに融合してもよい。
【００５０】
ここに記載されている組成物および方法に従って、様々なリンカーポリペプチドのいずれを用いてもよい。リンカーポリペプチドは、融合ポリペプチド内に含まれる２つの目的のポリペプチドの間のスペーサーとしての役割を果たす。リンカーポリペプチドは、有利には、２つの目的のポリペプチドの機能に干渉しないか、または最小の程度でのみ干渉する。特定の実施形態において、リンカーポリペプチドは、２つの目的のポリペプチドに有意なコンフォメーションの自由をもたらし、その結果、２つの目的のポリペプチドは、お互いに対して様々な空間的位置および配向をとることができる。リンカーポリペプチドの非限定的例は、ＧｌｙＳｅｒリンカーポリペプチド、例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号１４）または（ＧｌｙＳｅｒ）５（配列番号１５）である。特定の実施形態において、リンカーポリペプチドは、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片の２つの部分の間に位置することができる。例えば、リンカーポリペプチドをコードするリンカー配列は、１）ｓｃＦｖ断片の重鎖可変領域をコードする重鎖核酸配列と、２）ｓｃＦｖ断片の軽鎖可変領域をコードする軽鎖核酸配列との間にインフレームで融合することができる。特定の実施形態において、目的のポリペプチドは、１つより多いリンカー配列を含む。例えば、融合ポリペプチドは、１）ｓｃＦｖ断片の重鎖可変領域ポリペプチドと軽鎖可変領域ポリペプチドとの間に第１のリンカーポリペプチドを含むｓｃＦｖ抗体ポリペプチド断片、２）アンカーポリペプチド、および３）ｓｃＦｖ抗体ポリペプチドとアンカーポリペプチドとの間の第２のリンカーポリペプチドを含むことができる。当業者は、他の適切なリンカーポリペプチドおよびそれらをコードするヌクレオチド配列を知っているであろう。
【００５１】
特定の実施形態において、発現カセットは、リーダーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むリーダー核酸配列を含む。ここに記載されている組成物および方法に従って、様々なリーダーポリペプチドのいずれでも用いることができる。リーダーポリペプチドは、分泌装置を介したポリペプチドのプロセシングを駆動するのを助ける機能を果たし、最終的には、正しくプロセシングされた、表面にディスプレイされるポリペプチドを生じる。リーダー配列は、プロセシング中にポリペプチドから切断され、完全にプロセシングされたポリペプチドの部分をなさない。当業者によって理解されているように、リーダー核酸配列は、典型的には、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’にインフレームで融合しており、その結果、リーダーポリペプチドは、発現した融合ポリペプチドのＮ末端にある。リーダーポリペプチドの非限定的例には、ＬＩＰ２ ｐｒｅ、ＬＩＰ２ ｐｒｅｐｒｏ、ＸＰＲ２ ｐｒｅ、およびＸＰＲ２ ｐｒｅｐｒｏが挙げられる。例えば、Ｐｉｇｎｅｄｅら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、Ｍａｙ；１８２（１０）：２８０２−１０、２０００；Ｄａｖｉｄｏｗら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、Ｏｃｔ；１６９（１０）：４６２１−９、１９８７；およびＭａｄｚａｋら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、Ａｐｒ ８；１０９（１−２）：６３−８１、２００４（それぞれ、全体として参照により本明細書に組み入れられている）を参照。当業者は、他の適切なリーダーポリペプチド、およびそれらをコードするヌクレオチド配列を知っているであろう。
【００５２】
特定の実施形態において、発現カセットは、エピトープタグをコードするヌクレオチド配列を含むエピトープ核酸配列を含む。ここに記載されている組成物および方法に従って、様々なエピトープタグのいずれを用いてもよい。エピトープタグは、典型的には、発現したポリペプチドの検出、測定、定量化、および／または精製（もしくは単離）を容易にする短いポリペプチド配列である。エピトープタグは、所定のポリペプチド内のどこにでも、例えば、Ｎ末端に、Ｃ末端に、または内部に、位置してもよい。エピトープタグの非限定的例には、ｃ−Ｍｙｃ（骨髄球腫症細胞性がん遺伝子）、Ｖ５（サルウイルス５のＰタンパク質およびＶタンパク質のＣ末端配列由来）、ポリヒスチジン（例えば、６−ｈｉｓまたはヘキサヒスチジン）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ストレプトアビジン、ビオチン、赤血球凝集素、Ｆｌａｇ−タグ（ＦＬＡＧオクタペプチド）、およびＥ−タグ［ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ、配列番号１３］が挙げられる。当業者は、他の適切なエピトープタグ、およびそれらをコードするヌクレオチド配列を知っているであろう。
【００５３】
特定の実施形態において、発現カセットはプロモーターを含む。当技術分野において知られているように、プロモーターは、下流のヌクレオチド配列のリボ核酸（ＲＮＡ）への転写を駆動するヌクレオチド配列であり、その転写は、様々な転写因子のいずれかを介して媒介される。特定の実施形態において、転写されたＲＮＡは、目的のポリペプチドをコードする。特定の実施形態において、発現カセットは、（２）アンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含む第２の核酸配列にインフレームで融合した、（１）抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列を含む融合配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。
【００５４】
有利なプロモーターは、典型的には目的の細胞において機能するものである。例えば、酵母、例えば、非限定的にＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ種において機能するいくつかのプロモーターが知られている。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいて機能するプロモーターは、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするＲＮＡの発現を駆動するために用いられる。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいて機能するプロモーターは、アンカーポリペプチドをコードするＲＮＡの発現を駆動するために用いられる。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいて機能するプロモーターは、アンカーポリペプチドに融合した抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするＲＮＡの発現を駆動するために用いられる。
【００５５】
酵母細胞の表面上に目的のポリペプチドを発現させるために、ここに記載されている組成物および方法に従って、様々なプロモーターのいずれでも用いることができる。特定の実施形態において、ポリペプチド（例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片）を発現させるために用いられるプロモーターは構成的である。いくつかの構成的プロモーターが当技術分野において知られており、それらには、非限定的に、ＴＥＦ１プロモーターおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターが挙げられる。特定の実施形態において、ポリペプチド（例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片）を発現させるために用いられるプロモーターは誘導性である。誘導性プロモーターは、実施者が、目的のポリペプチドがいつ発現するかを制御したい場合、有用である。いくつかの誘導性プロモーターが当技術分野において知られており、それらには、非限定的に、ＰＯＸ３プロモーターおよびＬＩＰ２プロモーターが挙げられる。特定の実施形態において、ポリペプチド（例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片）を発現させるために用いられるプロモーターは半構成的（ｓｅｍｉ−ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）である。「半構成的プロモーター」とは、その用語が本明細書に用いられる場合、完全に構成的というわけではないプロモーターであって、特定の遺伝子の発現を、主として特定の条件下で、または特定の条件下でのみ、駆動するプロモーターを指す。例えば、半構成的プロモーターは、増殖相依存性様式で遺伝子発現を駆動する場合がある。いくつかの半構成的プロモーターが当技術分野において知られており、それらには、非限定的に、ｈｐ４ｄプロモーターが挙げられる。当業者は、目的の細胞、例えば、非限定的にＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ種において機能する、適切な構成的、誘導性、および半構成的プロモーターを知っているであろう。
【００５６】
特定の実施形態において、ポリペプチド（例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片）は、発現カセット、例えば、本明細書に記載された発現カセットのいずれかを含むベクターで酵母を形質転換することによって、酵母細胞の表面上に発現する。「ベクター」とは、その用語が本明細書で用いられる場合、発現カセットを含み、さらに１つまたは複数の追加のエレメントを含む核酸を指す。特定の実施形態において、ベクターは、選択条件下で、ベクターの複製、相同もしくは非相同組込み、および／または維持を促進するエレメントを含む。
【００５７】
酵母細胞の表面上に目的のポリペプチドを発現させるために、ここに記載されている組成物および方法に従って、様々なベクターのいずれでも用いることができる。用いることができるベクターの非限定的例には、全体として参照により本明細書に組み入れられた、米国特許公開第２００８−０１７１３５９号に開示されたものが挙げられる。当業者は、目的の所定の細胞（例えば、酵母細胞）に用いる他の適切なベクターを知っているであろう。さらに、酵母細胞の表面上に目的のポリペプチドを発現させることに用いるために、様々なベクターのいずれでも改変することができる。例えば、市販のベクターまたは他のベクターが所定の酵母種において用いるのに適している場合があるが、そのようなベクターは、（２）アンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含む第２の核酸配列にインフレームで融合した、（１）抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列を含む融合配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含まない場合がある。そのようなベクターは、プロモーター、ならびに抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片およびアンカーポリペプチドをコードする核酸配列を含むように改変されてもよい。いくつかの分子技術がベクターを改変するのに適しており、それらの多くは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．、およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９（その内容は全体として参照により本明細書に組み入れられている）に見出すことができる。当業者は、酵母（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞の表面上に目的のポリペプチドを発現するのに用いるためにベクターを改変する様々な他の適切な分子技術を知っているであろう。
【００５８】
特定の実施形態において、ベクターは、選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を含む。「選択マーカー」とは、その用語が本明細書で用いられる場合、選択マーカーを欠く細胞が生存および／または増殖することができない条件下で、選択マーカーを含有する細胞が生存および／または増殖することを可能にするポリペプチドを指す。選択マーカーの用語および概念は、当業者にとって周知である。選択マーカーの非限定的例には、ロイシン（例えば、ＬＥＵ２）、ウラシル（例えば、ＵＲＡ３ｄ１）、アデニン（例えば、ＡＤＥ２）、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、グリセロール利用（Ｇｕｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ｐ）、およびハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｈ）についてのマーカーが挙げられる。当業者は、本明細書に開示された組成物および方法に従って用いることができる他の適切なマーカーを知っているであろう。
【００５９】
特定の実施形態において、ベクターは、細胞（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ細胞）のゲノムへ組み込まれる。ベクターを細胞のゲノムへ組み込むための様々な技術は、当技術分野において知られている。特定の実施形態において、ベクターはゼータエレメントを含む。ゼータエレメントは、Ｙｌｔ１レトロトランスポゾンを有するＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株のゲノムへの相同組換えにより、またはＹｌｔ１レトロトランスポゾンを欠く酵母における非相同組換えにより、ベクターが組み込まれるのを可能にする配列である。特定の実施形態において、ゼータエレメントは、非限定的にＹｌｔ１またはＴｙｌ６レトロトランスポゾンなどの、レトロトランスポゾンの長い末端反復を含む。当業者は、他のエレメントを知っているであろうし、本明細書に開示された組成物および方法に従って、それらをベクターにおいて用いることができるであろう。
【００６０】
特定の実施形態において、ベクターは、細胞のゲノムへ組み込まれない。例えば、複製型ベクターを、酵母細胞へ、例えば、形質転換により、導入してもよい。複製型ベクターは、宿主細胞における維持、複製、および／または他の機能のための適切なエレメントを含有する。例えば、ベクターは、１つまたは複数の常染色体複製エレメントを含有してもよい。そのような常染色体複製エレメントの非限定的例には、セントロメア（ＣＥＮ）および複製起点（ＯＲＩ）が挙げられる。特定の実施形態において、セントロメアは、ＣＥＮ１またはＣＥＮ３を含む（全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ｖｅｒｎｉｓ，Ｌ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７、１９９５−２００４、２００７）。特定の実施形態において、複製起点は、ＯＲＩ１０６８またはＯＲＩ３０１８を含む（全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ｆｏｕｒｎｉｅｒら、Ｙｅａｓｔ、Ｊａｎ；７（１）：２５−３６、１９９１）。特定の実施形態において、細胞のゲノムへ組み込まれないベクターは、自律複製配列（ＡＲＳ）を含有してもよい。例えば、Ｆｏｕｒｎｉｅｒら、Ｙｅａｓｔ ７、２５−３６、１９９１およびＭａｔｓｕｏｋａら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３７、３２７−３３３、１９９３（それぞれ、全体として参照により本明細書に組み入れられている）を参照。特定の実施形態において、ＡＲＳは、セントロメアおよび複製起点を含む。ＡＲＳの非限定的例には、ＡＲＳ１８およびＡＲＳ１８が挙げられる。
【００６１】
特定の実施形態において、発現カセットは、アンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むアンカー核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含み、アンカー核酸配列は、目的の第２の融合パートナーを含む融合タンパク質における第１の融合パートナーとして発現することができる。そのような特定の実施形態において、発現カセットは、目的の第２の融合パートナーをコードするヌクレオチド配列を含む別の核酸配列を含む。目的の第２の融合パートナーは、様々なポリペプチドのいずれかであり得る。例えば、目的の第２の融合パートナーは、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片であってもよいが、第２の融合パートナーはそのような抗体ポリペプチドまたは断片に限定されない。第２の融合パートナーはアンカーポリペプチドに融合しているので、第２の融合パートナーもまた細胞の表面上に発現するであろう。特定の実施形態において、この段落で具体化された発現カセットは、目的の第２の融合パートナーの融合を容易にするために制限部位を含む核酸配列を含む。様々な制限部位のいずれでも発現カセットに含むことができる。当業者は、適切な制限部位を知っているであろうし、それらを含む発現カセットを操作することができるであろう。
【００６２】
特定の実施形態において、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、そのポリペプチドが発現する生物体（例えば、酵母細胞）において用いるためにコドン最適化されている。コドン最適化は、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が改変されるプロセスであり、ここで、そのヌクレオチド配列は、特定の生物体における発現のために最適化されるが、そのポリペプチドのアミノ酸配列は同じままである。コドンは、細胞により所定のアミノ酸へ翻訳される、３ヌクレオチド配列である。２０個の天然にコードされたアミノ酸があるが、３ヌクレオチド配列の６４個の可能な組み合わせがあるので、たいていのアミノ酸は、複数のコドンによってコードされている。所定の種において、特定のコドンが同じアミノ酸をコードする他のコドンよりも良好に翻訳される場合が多く、種ごとにそのコドン優先度が異なる。そのため、１つの種由来の遺伝子は、別の種へ導入された場合、あまり発現しない場合がある。この問題を克服する１つの方法は、遺伝暗号の縮重を利用し、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を改変して、そのヌクレオチド配列が目的の種において効率的に用いられるコドンを含有するが、なお同じポリペプチドをコードするようにすることである。どのコドンが、目的の生物体において最も広く用いられているかを決定することは可能である。実際、これは、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含む様々な生物体についてすでに行われている。２，９４５，９１９個のコドンに基づいたＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａについてのサンプルのコドン最適化チャートは、下記の表１に示されている。当業者は、他の生物体についてのコドン出現頻度を知っているであろうし、それを決定することができるであろう。
【００６３】
【表１】
説明：表欄は、［トリプレット］［頻度：千個あたり］（［数］）として示されている。データは、５，９６７個のコード配列に存在する２，９４５，９１９個のコドンから導き出された。表の内容は、ＵＲＬ ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｈｏｗｃｏｄｏｎ．ｃｇｉ？ｓｐｅｃｉｅｓ＝２８４５９１に見出されるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅから入手された。
【００６４】
特定の実施形態において、下記に示された配列番号１〜１２のＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａコドン最適化核酸配列のうちの１つまたは複数を含むベクターまたは発現カセットで、発現のためにＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを形質転換することができる。下記のコドン最適化核酸配列のそれぞれの中における関連するコード配列は、太字で、下線を引かれたテキストによって示されている。
【００６５】
配列番号１：合成Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａコドン最適化Ｃ末端Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＡＧ１ｐ（３２０個のＣ末端アミノ酸）（側面にＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ）
【００６６】
【数１】
【００６７】
【数２】
配列番号２：合成Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａコドン最適化Ｃ末端Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＧＡ２ｐ（側面にＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ）
【００６８】
【数３】
配列番号３：合成Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａコドン最適化Ｃ末端Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＣＷＰＩ（側面にＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ）
【００６９】
【数４】
配列番号４：合成Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａコドン最適化Ｎ末端Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＡＧＡ２（側面にＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ）
【００７０】
【数５】
【００７１】
【数６】
配列番号５：合成Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａコドン最適化Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ｓｃＦｖ（側面にＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ）
【００７２】
【数７】
配列番号６：合成Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａコドン最適化４−４−２０ ｓｃＦｖ（側面にＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ）
【００７３】
【数８】
配列番号７：合成Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａコドン最適化抗ＨＥＬ Ｄ１．３ ｓｃＦｖ（側面にＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ）
【００７４】
【数９】
【００７５】
【数１０】
配列番号８：合成Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａコドン最適化抗ＨＥＬ Ｍ３ ｓｃＦｖ（側面にＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ）
【００７６】
【数１１】
配列番号９：合成Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａコドン最適化４−４−２０ Ｆａｂ重鎖（側面にＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ）
【００７７】
【数１２】
配列番号１０：合成Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａコドン最適化４−４−２０ Ｆａｂ軽鎖（側面にＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ）
【００７８】
【数１３】
【００７９】
【数１４】
配列番号１１：合成Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａコドン最適化Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ Ｆａｂ重鎖（側面にＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ）
【００８０】
【数１５】
配列番号１２：合成Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａコドン最適化Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ Ｆａｂ軽鎖（側面にＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ）
【００８１】
【数１６】
酵母
様々な酵母のいずれも、本明細書に記載された方法および組成物に従って用いることができる。酵母は、真菌の真核生物の微生物である。酵母は主として、単細胞の形で存在するが、いくつかの種、例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ種は、二相性であり、すなわち、それらは、単細胞または菌糸の形でも存在することができる。さらに、いくつかの種は、「偽性菌糸」として知られた、一続きの連結した出芽細胞の形成を通して多細胞になる。
【００８２】
いくつかの酵母は、当業者に知られている。ここに開示されている組成物および方法に従って用いることができる例示的な酵母には、以下が挙げられるが、それらに限定されない：
【００８３】
【数１７】
当業者は、ここに開示されている組成物および方法に従って用いることができる他の適切な酵母を知っているであろう。
【００８４】
特定の実施形態において、本明細書に開示された抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をディスプレイするための組成物および方法に従って用いられる酵母種は、Ｙａｒｒｏｗｉａ属の酵母である。例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片、例えば、本明細書に記載された抗体ポリペプチドまたは断片のいずれかを、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ酵母細胞の表面上にディスプレイしてもよい。
【００８５】
Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは、好気条件下で、炭化水素を同化し、ｎ−アルカン、植物油、またはグルコースからクエン酸を生成することが知られている、半子嚢菌の酵母の商業的に有用な種である。例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは、パーム油工場廃水、ＴＮＴ、ならびにアルカン、脂肪酸、脂肪、および油などの他の炭化水素を分解することが知られている。Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは、ほとんどの他の酵母種と遠縁であり、糸状真菌といくつかの共通した性質を共有する。Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは、一倍体相と二倍体相とを交互にとるという点において単複世代交代型（ｈａｐｌｏ−ｄｉｐｌｏｎｔｉｃ）の周期を有する。
【００８６】
特定の実施形態において、酵母細胞は、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターまたは発現カセットで形質転換される。様々な酵母形質転換方法のいずれも、本明細書に開示された組成物および方法に従って用いてもよい。形質転換方法の非限定的例には、熱ショック、エレクトロポレーション、および酢酸リチウム媒介型形質転換が挙げられる。当業者は、酵母を形質転換するのに適した酵母形質転換方法を知っているであろう。
【００８７】
増殖条件
特定の実施形態において、酵母細胞（例えば、本明細書に記載された酵母細胞のいずれか）を、培養で増殖または成長させる。例えば、本明細書で「発現カセットまたはベクター」と題するセクションにおいて記載されているような１つまたは複数の発現カセットまたはベクターで形質転換された酵母細胞を、培養で増殖または成長させてもよい。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ属の酵母、例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを培養で増殖または成長させる。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件下で培養する。本明細書で用いられる場合、用語「Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件」とは、そのＹａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件下で増殖していないＹａｒｒｏｗｉａ細胞と比較して、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞がその表面上のポリペプチド（例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片）のディスプレイの向上を示す、増殖条件または培養条件を指す。例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件下で増殖したＹａｒｒｏｗｉａ細胞は、表面上のポリペプチドのレベルの増加、発現したポリペプチドの安定性、コンフォメーション、もしくは機能の向上、またはポリペプチドの発現が維持する時間の長さの増加を示し得る。
【００８８】
特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件は、低い誘導温度を含む。例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を発現するためのベクターまたは発現カセットを含むＹａｒｒｏｗｉａ細胞を、その細胞培養の一期間または全期間、低い誘導温度で増殖させてもよい。下記の実施例３に記載されているように、フォールディングストレスは、一般的に、低い培養温度で減少する。したがって、フォールディングストレスおよび他の有害なプロセスは、そのようなＹａｒｒｏｗｉａ細胞を低い誘導温度で増殖させることによって、減少または排除される可能性がある。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を、摂氏約１５度から約２５度の範囲、例えば、摂氏約１５度から約２４度、摂氏約１５度から約２３度、摂氏約１５度から約２２度、摂氏約１５度から約２１度、摂氏約１５度から約２０度、摂氏約１６度から約２５度、摂氏約１７度から約２５度、摂氏約１８度から約２５度、摂氏約１９度から約２５度、摂氏約２０度から約２５度、およびその間にある任意の範囲の誘導温度で増殖させる。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を、摂氏約１５度、摂氏約１６度、摂氏約１７度、摂氏約１８度、摂氏約１９度、摂氏約２０度、摂氏約２１度、摂氏約２２度、摂氏約２３度、摂氏約２４度、または摂氏約２５度の誘導温度で増殖させる。「約」とは、その用語が温度に関して本明細書で用いられる場合、所定の温度の値付近の範囲を指す。一般的に、所定の温度の値に関して用いられる場合、用語「約」とは、その値の＋／−１０％内、例えば、その値の＋／−９％内、その値の＋／−８％内、その値の＋／−７％内、その値の＋／−６％内、その値の５％内、その値の＋／−４％内、その値の＋／−３％内、その値の＋／−２％内、その値の＋／−１％内、またはその値の＋／−１％以下内の値の範囲を指す。所定の温度の値に関して用いられる場合、用語「約」は、例えば、実験誤差内で決定されたような、その正確な値を包含する。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を、細胞培養の一期間（例えば、初期）中、高い誘導温度または温度範囲で増殖させるが、細胞培養の異なる一期間（例えば、終期）中、低い誘導温度または温度範囲で増殖させる。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を、目的のポリペプチドが発現しているとき、細胞培養のその一期間中、低い誘導温度または温度範囲で増殖させる。例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに作動可能に連結されてもよく、プロモーターが抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を発現するように誘導されるとき、細胞培養のその一期間中、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を低い誘導温度または温度範囲で増殖させてもよい。
【００８９】
特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件は、短い誘導時間を含む。例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を発現させるためのベクターまたは発現カセットを含むＹａｒｒｏｗｉａ細胞を、短い誘導時間の間、細胞培養で増殖させてもよい。下記の実施例４に記載されているように、短い誘導時間によって、抗体ポリペプチド断片の発現レベルの増加がもたらされた。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間の誘導時間の間、またはこれらの値の間の任意の誘導時間の間、増殖させる。「約」とは、その用語が誘導時間の値に関して本明細書で用いられる場合、所定の値付近の範囲を指す。一般的に、所定の誘導時間の値に関して用いられる場合、用語「約」とは、その値の＋／−１０％内、例えば、その値の＋／−９％内、その値の＋／−８％内、その値の＋／−７％内、その値の＋／−６％内、その値の５％内、その値の＋／−４％内、その値の＋／−３％内、その値の＋／−２％内、その値の＋／−１％内、またはその値の＋／−１％以下内の値の範囲を指す。所定の誘導時間の値に関して用いられる場合、用語「約」は、例えば、実験誤差内で決定されたような、その正確な値を包含する。
【００９０】
特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件は、低いｐＨを含む。例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を発現させるためのベクターまたは発現カセットを含むＹａｒｒｏｗｉａ細胞を、その細胞培養の一期間または全期間、低いｐＨで増殖させてもよい。下記の実施例５に記載されているように、ｐＨは、Ｙａｒｒｏｗｉａの二相性転移を制御する１つの因子であり、増殖培地のｐＨである；菌糸体形成は、中性近くのｐＨにおいて最大であり、ｐＨが低下するにつれて減少し、ｐＨ３でほとんどゼロになる。したがって、低いｐＨ培養でＹａｒｒｏｗｉａ細胞を増殖させることによって、菌糸体形成を減少または排除することができる。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を、約２から約４、例えば、約２．１から約４、約２．２から約４、約２．３から約４、約２．４から約４、約２．５から約４、約２．６から約４、約２．７から約４、約２．８から約４、約２．９から約４、約３から約４、約２から約３．９、約２から約３．８、約２から約３．７、約２から約３．６、約２から約３．５、約２から約３．４、約２から約３．３、約２から約３．２、約２から約３．１、約２から約３、約２．５から約３．５、約２．５から約３、約３から約３．５のｐＨ範囲、またはその間にある任意のｐＨ範囲で、増殖させる。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を、約２、約２．１、約２、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、または約４のｐＨで増殖させる。「約」とは、その用語がｐＨに関して本明細書で用いられる場合、所定の値付近の範囲を指す。一般的に、所定のｐＨの値に関して用いられる場合、用語「約」とは、その値の＋／−１０％内、例えば、その値の＋／−９％内、その値の＋／−８％内、その値の＋／−７％内、その値の＋／−６％内、その値の５％内、その値の＋／−４％内、その値の＋／−３％内、その値の＋／−２％内、その値の＋／−１％内、またはその値の＋／−１％以下内の値の範囲を指す。所定のｐＨ値に関して用いられる場合、用語「約」は、例えば、実験誤差内で決定されたような、その正確な値を包含する。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を、細胞培養の一期間（例えば、初期）中、高いｐＨまたはｐＨ範囲で増殖させるが、細胞培養の異なる一期間（例えば、終期）中、低いｐＨまたはｐＨ範囲で増殖させる。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を、目的のポリペプチドが発現しているとき、細胞培養のその一期間中、低いｐＨまたはｐＨ範囲で増殖させる。例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに作動可能に連結されてもよく、プロモーターが抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を発現するように誘導されるとき、細胞培養のその一期間中、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を低いｐＨまたはｐＨ範囲で増殖させてもよい。
【００９１】
特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件は、高い通気性を含む。例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を発現させるためのベクターまたは発現カセットを含むＹａｒｒｏｗｉａ細胞を、その細胞培養の一期間または全期間、高い通気条件下で増殖させてもよい。下記の実施例３に記載されているように、細胞培養の通気の増加は、発現した抗体ポリペプチド断片の細胞表面ディスプレイを向上させる。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を、通気を向上させるために振盪フラスコ内で増殖させる。特定の実施形態において、培養のパーセント酸素飽和が測定され、培養物が十分な高通気条件下で増殖することを確実にするように所定のレベルより上に保持される。例えば、発酵槽条件下、高通気条件は、３０〜５０％の酸素飽和で達成することができ、例えば、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の酸素飽和である。細胞培養通気を向上させるのに有用な他の容器は、当業者に知られているであろう。
【００９２】
特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件は、培養物を最少培地中で増殖させることを含む。下記の実施例３に記載されているように、細胞培養物を最少培地中でインキュベートすることによって、発現した抗体ポリペプチド断片の細胞表面ディスプレイが向上する。「最少培地」とは、その用語が本明細書に用いられる場合、細胞培養物（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞培養物）の増殖を支持するのに必要とされる最少の要素を含む培地を指す。最少培地は、典型的には、増殖のための炭素源（例えば、グルコース）、塩の形をとった様々な微量元素（例えば、マグネシウム、窒素、リン、および／または硫黄）、窒素源、および水を含有する。最少培地は、酵母抽出物、Ｂａｃｔｏペプトン、またはその両方を欠く。所定の生物体を、ある最少培地中で増殖させた場合、増殖することができる可能性があるが、別の最少培地中で増殖させた場合、増殖することができない可能性がある。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件は、最少補充培地中で培養物を増殖させることを含む。「最少補充培地」とは、その用語が本明細書で用いられる場合、アミノ酸を補充している最少培地を指す。最少補充培地は、１個もしくは２、３個のアミノ酸を補充されていてもよいし、またはたいていの生物体によって用いられる全２０個のアミノ酸の完全なセットを補充されていてもよい。当業者は、様々な最少培地を知っているであろうし、本明細書に開示された組成物および方法に従って所定の生物体の増殖を支持するためにどの最少培地を用いることができるかを決定することができるであろう。
【００９３】
特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を、同時に２つ以上のＹａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件下で、増殖させる。例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を、低い誘導温度、短い誘導時間、低いｐＨ、高い通気性、最少培地中での増殖、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される２つ以上のＹａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件下で増殖させる。
【００９４】
ポリペプチドの表面ディスプレイのためのベクターで形質転換されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞の６０〜８０％が、実際にその表面上にポリペプチドを発現することが一般的に報告されている。対照的に、本明細書に記載された方法および組成物を用いて、１つまたは複数のＹａｒｒｏｗｉａ作動条件下で増殖したＹａｒｒｏｗｉａ細胞のもっと高いパーセンテージの細胞が、その表面上に抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を示す。例えば、１つまたは複数のＹａｒｒｏｗｉａ作動条件下で増殖したＹａｒｒｏｗｉａ細胞の少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％が、その表面上に抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を示す。「約」とは、表面上に抗体ポリペプチドまたは断片を示すＹａｒｒｏｗｉａ細胞の数に関して用いられる場合、その値から５％以内の値を指し、正確な値も含む。特定の実施形態において、１つまたは複数のＹａｒｒｏｗｉａ作動条件下で増殖したＹａｒｒｏｗｉａ細胞の約９９％より多く（例えば、１００％）がその表面上に抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を示す。
【００９５】
特定の実施形態において、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を発現するためのベクターまたは発現カセットを含むＹａｒｒｏｗｉａ細胞は、シャペロンポリペプチドをさらに含む。当技術分野において知られているように、シャペロンポリペプチドは、他のポリペプチドの非共有結合性フォールディングおよび／またはアッセンブリを援助する。実施例７に記載されているように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）および免疫グロブリン結合タンパク質（Ｋａｒ２／ＢｉＰ）などの分子シャペロンの過剰発現は、ｓｃＦｖ断片およびＦａｂ断片の発現を向上させた。酵母において、ＢｉＰ／ＧＲＰ７８は、ＫＡＲ２遺伝子によってコードされる。したがって、特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞は、シャペロンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換される。本明細書で開示された組成物および方法に従って有利に用いることができるシャペロンポリペプチドの非限定的例には、ＰＤＩ、Ｋａｒ２／Ｂｉｐ、およびＨＡＣＩが挙げられる。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞は、プロモーターの調節下のシャペロンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換される。例えば、シャペロンは、構成的、半構成的、または誘導性プロモーターの調節下であってもよい。特定の実施形態において、シャペロンポリペプチドは、目的のポリペプチド（例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片）と同じ細胞培養の一期間中に発現する。当業者は、他のシャペロンポリペプチドを知っているであろうし、それらを用いることも、ここに開示されている組成物および方法と共に用いる場合、それらの効力を評価することもできるであろう。
【００９６】
適用
本明細書に開示された組成物および方法は、様々な適用において用いることができる。１つの非限定的例として、本明細書に開示された組成物および方法は、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片のライブラリーを、所定の抗原を結合する能力についてスクリーニングするために用いることができる。
【００９７】
特定の実施形態において、酵母細胞（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ細胞）は、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をその表面上にディスプレイし、所定の抗原を結合する能力について、その細胞は試験される。特定の実施形態において、酵母細胞は、２つの抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を発現し、その抗体ポリペプチドまたはその断片は、一緒になって抗原を結合することができるように、お互いに会合する。例えば、重鎖Ｆａｂ断片および軽鎖Ｆａｂ断片を、酵母の細胞表面上にディスプレイすることができ、それらのＦａｂ断片は、お互いに会合して、機能しうる抗原結合部分を形成する。特定の実施形態において、ｓｃＦｖ抗体ポリペプチド断片は、酵母の細胞表面上にディスプレイされ、そのｓｃＦｖ断片は所定の抗原を結合することができる。特定の実施形態において、酵母細胞（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ細胞）は、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含むベクターまたは発現カセットで形質転換される。特定の実施形態において、酵母細胞（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ細胞）は、２つ以上のベクターおよび／または発現カセットで形質転換され、それぞれは、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含む。特定の実施形態において、酵母細胞（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ細胞）は、２つ以上の核酸配列を含むベクターまたは発現カセットで形質転換され、それぞれは、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００９８】
特定の実施形態において、抗体ポリペプチド酵母ライブラリーを作製するために、複数の酵母細胞（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ細胞）は、ベクターまたは発現カセットのライブラリーで形質転換され、そのライブラリーは、複数の抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含む複数の核酸配列を含む。本明細書で用いられる場合、用語「抗体ポリペプチド酵母ライブラリー」は、複数の抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を表面上にディスプレイする複数の酵母細胞を指す。そのような抗体ポリペプチド酵母ライブラリーは、１つまたは複数の特定の抗原を結合する抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片について、ライブラリーにおいてスクリーニングするために用いることができる。
【００９９】
特定の実施形態において、複数の酵母細胞（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ細胞）は、ベクターまたは発現カセットのライブラリーで形質転換され、そのライブラリーは、複数の抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含む複数の核酸配列を含む。例えば、ベクターまたは発現カセットのライブラリーは、複数のｓｃＦｖ抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含む複数の核酸配列を含んでもよい。そのような複数の形質転換された酵母細胞を、１つまたは複数の特定抗原を結合するｓｃＦｖ抗体ポリペプチド断片についてスクリーニングするために用いてもよい。
【０１００】
特定の実施形態において、第１の複数の一倍体酵母細胞（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ細胞）は、ベクターまたは発現カセットのライブラリーで形質転換され、そのライブラリーは、複数の抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含む複数の核酸配列を含み、第２の複数の一倍体酵母細胞（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ細胞）は、ベクターまたは発現カセットのライブラリーで形質転換され、そのライブラリーは、複数の抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含む複数の核酸配列を含む。特定の実施形態において、第１および第２の複数の一倍体酵母細胞は、同じライブラリーで形質転換される。例えば、第１および第２の複数の一倍体酵母細胞は、重鎖抗体ポリペプチドまたは断片と軽鎖抗体ポリペプチドまたは断片の両方をコードするヌクレオチド配列を含むライブラリーで形質転換されてもよい。特定の実施形態において、第１および第２の複数の一倍体酵母細胞は、異なるライブラリーで形質転換される。例えば、第１の複数の一倍体酵母細胞は、重鎖抗体ポリペプチドまたは断片をコードするヌクレオチド配列を含むライブラリーで形質転換されてもよく、一方、第２の複数の一倍体酵母細胞は、軽鎖抗体ポリペプチドまたは断片をコードするヌクレオチド配列を含むライブラリーで形質転換されてもよい。
【０１０１】
特定の実施形態において、ライブラリーで形質転換された第１および第２の複数の一倍体酵母細胞は、お互いに接合して、各ライブラリー由来のベクターまたは発現カセットを含む複数の二倍体酵母を形成する。例えば、重鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含むライブラリーで形質転換された第１の複数の一倍体酵母細胞は、軽鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含むライブラリーで形質転換された第２の複数の一倍体酵母細胞に接合して、重鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片と軽鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片の両方を含む複数の二倍体酵母細胞を生成してもよい。そのような複数の二倍体酵母細胞は、１つまたは複数の特定抗原を結合する抗体ポリペプチドまたは断片についてスクリーニングするために用いられてもよい。そのような実施形態は、重鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片と軽鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片の多くの種類の異なる組み合わせのスクリーニングを可能にする点において、有利である。
【０１０２】
特定の実施形態において、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片の特定の抗原に対する結合特異性は、向上または最適化される。抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片の結合特異性を向上または最適化するために定方向進化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）または親和性成熟を用いることができる。例えば、Ｆｕｊｉｉ（全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２４８巻、３４５−３５９ページ、２００４）は、抗体についての親和性成熟のプロセスを記載する。同様に、Ｂｏｄｅｒら（参照により本明細書に組み入れられた、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． Ｓｅｐ ２６；９７（２０）：１０７０１−５、２０００）は、ｓｃＦｖ断片の定方向進化を記載する。これらおよび他の技術は、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片の結合特異性を向上または最適化するのに用いることができる。
【０１０３】
特定の実施形態において、特定の抗原を結合するか、または結合するのではないかと思われる抗体ポリペプチドまたは断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を単離することができる。その後、そのような核酸配列を、１つまたは複数のヌクレオチド残基を変化させることによって改変してもよい。特定の実施形態において、核酸配列は、ベクターまたは発現カセットの一部である。その後、改変型核酸（複数可）を、抗原（例えば、最初の抗原または別の異なる抗原）を結合する能力について試験してもよい。例えば、改変型核酸を酵母細胞に（例えば、形質転換によって）導入してもよく、その酵母細胞を、抗体ポリペプチドまたはその抗体ポリペプチド断片がその細胞表面上に発現するような増殖条件（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ作動条件）下でインキュベートする。その後、その酵母を、目的の抗原と接触させてもよく、結合を試験してもよい。
【０１０４】
核酸配列を改変するための様々な技術は、当技術分野において知られており、それらのいずれも、ここに開示されている方法および組成物に従って用いることができる。例えば、放射線照射、化学変異原、エラープローン（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、または飽和変異誘発を用いてもよい。他の技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．、およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２．ｓｕｐ．ｎｄ ｅｄ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９（その内容は全体として参照により本明細書に組み入れられている）に見出すことができる。当業者は、核酸配列を改変するための適切な技術を知っているであろう。
【０１０５】
抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をディスプレイする細胞の所定の抗原への結合を試験するための様々な技術は、当技術分野において知られており、それらのいずれも、ここに開示されている方法および組成物に従って用いることができる。１つの非限定的例として、ＥＬＩＳＡアッセイを用いてもよい。
【０１０６】
特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞は、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードする親ベクターまたは親発現カセットを含み、その抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片は、細胞表面上にディスプレイされ、特定の抗原（例えば、標的ポリペプチド）を結合する。特定の実施形態において、親ベクターまたは親発現カセットは、単離され、上記のような改変に供され、１つまたは複数の改変型ベクターまたは発現構築物を生じる。特定の実施形態において、そのような改変は、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列内に生じる。その後、１つまたは複数の改変型ベクターまたは発現構築物は、親ベクターまたは親発現カセットを欠く、１つまたは複数の第２のＹａｒｒｏｗｉａ細胞へ形質転換されてもよい。例えば、１つまたは複数の改変型ベクターまたは発現構築物は、その後、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件下で増殖する複数のＹａｒｒｏｗｉａ細胞へ形質転換され、Ｙａｒｒｏｗｉａ抗体ポリペプチド酵母ライブラリーを生じることができ、そのライブラリーのメンバーは、複数の改変型抗体ポリペプチドまたはその抗体ポリペプチド断片をそれらの表面上にディスプレイする。その後、Ｙａｒｒｏｗｉａ抗体ポリペプチド酵母ライブラリーのメンバーは、特定の抗原、例えば、親ベクターまたは親発現カセットによってコードされる抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片によって結合された抗原を結合するそれらの能力について試験されてもよい。抗原への結合の向上を示す（例えば、より高い、またはより特異的な親和性またはアビディティを示す）Ｙａｒｒｏｗｉａ抗体ポリペプチド酵母ライブラリーのメンバー由来の改変型ベクターまたは発現カセットを単離してもよい。特定の実施形態において、この一連の工程が、１回または複数回、繰り返される。特定の実施形態において、所望のレベルの結合を示す抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片が得られるまで、この一連の工程が繰り返される。
【０１０７】
特定の実施形態において、改変型抗体ポリペプチドまたは断片が、親ベクターまたは親発現カセットによってコードされる抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片によって結合される同じ抗原への結合の向上または最適化を示すように、親ベクターまたは親発現カセットにおけるヌクレオチド配列によってコードされる抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片は改変される。特定の実施形態において、改変型抗体ポリペプチドまたは断片が、親ベクターまたは親発現カセットによってコードされる抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片によって結合されるのとは異なる抗原への結合の向上または最適化を示すように、親ベクターまたは親発現カセットにおけるヌクレオチド配列によってコードされる抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片は改変される。例えば、第１の抗原を結合することが知られた抗体ポリペプチドまたは断片は、その抗原特異性が変化するように改変されてもよい。
【０１０８】
当業者は、他の適用を知っているであろうし、そのような適用において使用するために本明細書に開示された組成物および方法を用いることができるであろう。
【０１０９】
キット
特定の実施形態において、本明細書に記載された１つまたは複数の組成物を含むキットが提供される。特定の実施形態において、本明細書に記載された１つまたは複数の方法を実施するためのキットが提供される。特定の実施形態において、キットは、目的のポリペプチド、例えば、抗体ポリペプチドもしくは抗体ポリペプチド断片、アンカーポリペプチド、またはその両方を酵母細胞の表面上に発現するための構成要素を含む。例えば、キットは、酵母を形質転換または培養するための１つまたは複数の発現カセット、ベクター、酵母、および／または構成要素を含んでもよい。特定の実施形態において、酵母を形質転換または培養するための発現カセット、ベクター、酵母、および／または構成要素は、本明細書に記載されているようなものである。
【０１１０】
特定の実施形態において、キットは、抗体ポリペプチドもしくは抗体ポリペプチド断片、アンカーポリペプチド、またはその両方をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含む発現カセットまたはベクターを含む。特定の実施形態において、キットは、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞、例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞などの酵母を含む。特定の実施形態において、キットのＹａｒｒｏｗｉａ細胞は、形質転換受容性である。特定の実施形態において、キットのＹａｒｒｏｗｉａ細胞は、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を形質転換受容性にするために用いることができる１つまたは複数の構成要素と共にパッケージングされる。
【０１１１】
特定の実施形態において、キットは、キットの発現カセット、ベクター、または他の構成要素を用いるための書面による使用説明書、例えば、目的のポリペプチド（例えば、抗体ポリペプチドもしくは抗体ポリペプチド断片、アンカーポリペプチド、またはその両方）を酵母細胞の表面上に発現するためにキットの発現カセット、ベクター、または他の構成要素を用いるための書面による使用説明書を含む。
【実施例】
【０１１２】
実施例１：材料および方法
用いられる菌株：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１を、標準ＤＮＡ増幅およびクローニングのために用いた。Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＰＯ１ｄ（ＭａｔＡ、ｌｅｕ２−２７０、ｘｐｒ２−３２２）、ＰＯ１ｄ（ＭａｔＡ、ｕｒａ３−３０２、ｌｅｕ２−２７０、ｘｐｒ２−３２２）、およびＰＯ１ｄ（ＭａｔＡ、ｕｒａ３−３０２、ｌｅｕ２−２７０、Ａｄｅ２−８４４、ｘｐｒ２−３２２）を、ベクター形質転換のレシピエントとして用いた。
【０１１３】
ｓｃＦｖ発現プラスミド：分子アンカー配列の上流のｓｃＦｖ断片のＳｆｉＩ／ＮｏｔＩクローニングを可能にするように４つの合成構築物を作製した。ＳｆｉＩ制限部位のＮ末端に、最終発現プラスミドでのＬＩＰ２ｐｒｅまたはＬＩＰ２ｐｒｅｐｒｏのいずれかのＣ末端における融合のためにＢｓｍＩ制限部位を付加した。ＮｏｔＩ制限部位の下流に、ｃ−Ｍｙｃタグを付加し、続いて、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカー、およびアンカリングドメインを交換するためにＮｄｅＩ ＆ ＡｖｒＩＩ制限部位を付加した。アンカリングのために、以下のＹａｒｒｏｗｉａコドン最適化配列を、合成構築物へＮｈｅＩ部位とＡｖｒＩＩ部位との間に挿入した：１）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＡＧ１（ＩＤ ８５３４６０）のＣ末端（９６０ｂｐ）、２）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＧＡ２（ＩＤ ８５２８５１）、または３）Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＣＷＰＩ（アクセション番号ＡＹ０８４０７７）のＣ末端（３３３ｂｐ）。ＡＧＡ２分子アンカーがｓｃＦｖのＮ末端に位置している第２の合成構築物を作製した。ここにおいて、コドン最適化成熟Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＧＡ２の前に、ＢｓｍＩ部位があり、後に、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカー、ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩに囲まれたｓｃＦｖコード配列、ｃ−ｍｙｃおよび６−ｈｉｓエピトープタグ、ならびにＡｖｒＩＩ制限部位が続いた。完全な合成構築物を、ＢｓｍＩ（Ｔ４）およびＡｖｒＩＩで消化し、ＳａｃＩＩ（Ｔ４）／ＡｖｒＩＩ消化ｐＹＬＰＬＸＬ２ｐｒｅへクローニングした。ＡＧＡ１の発現のために、前にＢｓｍＩ、後にＡｖｒＩＩが続くコドン最適化成熟Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＧＡ１を、ＢｓｍＩ（Ｔ４）およびＡｖｒＩＩで消化し、ＳａｃＩＩ（Ｔ４）／ＡｖｒＩＩ消化ｐＹＬＰＵＸＬ２ｐｒｅへクローニングした。
【０１１４】
ｓｃＦｖ断片の可溶性発現を可能にするために、Ｙａｒｒｏｗｉａコドン最適化分泌構築物を合成的に作製した。この構築物は、Ｖ５および６−ｈｉｓエピトープタグを含有し、その５’末端で、ｓｃＦｖクローニングのためのＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ制限部位が先行した。この構築物をＢｓｍＩ（Ｔ４）およびＡｖｒＩＩで消化し、ＳａｃＩＩ（Ｔ４）／ＡｖｒＩＩ消化ｐＹＬＰＵＸＬ２ｐｒｅへクローニングした。コドン最適化トラスツズマブｓｃＦｖおよび４−４−２０ ｓｃＦｖ、ならびに抗ＨＥＬ ｓｃＦｖのＤ１．３およびＭ３を合成し、記載されたプラスミドへＳｆｉＩ制限部位とＮｏｔＩ制限部位との間にクローニングした。抗フルオレセイン４−４−２０抗体が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ表面ディスプレイプラットフォームの開発のためのモデルタンパク質としての役割を果たした（全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ｂｏｄｅｒ，Ｅ．Ｔ． ＆ Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｋ．Ｄ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５、５５３−７、１９９７）。細胞表面抗原ＨＥＲ−２／ｎｅｕがん原遺伝子に結合するトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））は、乳がんの処置として臨床的に認可されている（全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ｃｈｏら、Ｎａｔｕｒｅ、４２１、７５６−７６０、２００３）。
【０１１５】
Ｆａｂ発現構築物：重鎖発現プラスミドのために、ｓｃＦｖクローニングについて記載されているように、Ｙａｒｒｏｗｉａコドン最適化重鎖定常領域ＣＨ１ドメインを、ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩを用いて、４つの合成構築物へクローニングした。その後、ＶＨについてのｃＤＮＡを、ＳｆｉＩおよびＮｈｅＩを用いて、これらのプラスミドへクローニングした。最後に、Ｆａｂ発現カセットを、ｓｃＦｖについて行ったことと同様に、ｐＹＬＰＬＸＬ２ｐｒｅへクローニングした。
【０１１６】
軽鎖発現プラスミドを、ｓｃＦｖ発現プラスミド上で構築した。したがって、Ｙａｒｒｏｗｉａコドン最適化Ｃκ１（軽鎖定常領域カッパ）を、ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩを用いてこのベクターへ挿入した。その後、ＶＬについてのｃＤＮＡを、ＳｆｉＩおよびＢｓｉＷＩを用いてこのプラスミドへクローニングした。
【０１１７】
ｓｃＦｖ発現プラスミドからＰＣＲにより、トラスツズマブおよび４−４−２０の可変ドメインを増幅し、開発されたＦａｂ発現プラスミドへのクローニングのために必要とされる制限部位を付加した。最終プラスミドを、上記のような適切なＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株へ形質転換して、完全に相補された最終株を作製した。
【０１１８】
増殖条件：Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株を、リッチなＹＰＤ培地（１％酵母抽出物、１％Ｂａｃｔｏペプトン、１％グルコース）上か、またはＣＳＭを補充され（ＭＳＭ；アミノ酸および硫酸アンモニウムを含まない、０．６７％イーストニトロゲンベース、０．４％ＮＨ４Ｃｌ、０．０７９％ＣＳＭ）、かつ５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．８中、炭素源としてのグルコース２％もしくはオレイン酸２％を補充された最少培地上かのいずれかで、２８℃で培養した。ｐＨ試験に関する実験については、５０ｍＭリン酸−クエン酸緩衝液を、ｐＨ５またはｐＨ３で用いた。
【０１１９】
細胞表面ディスプレイを誘導するために、酵母細胞を、最少グルコース培地中、２８℃、１８０ｒｐｍで、２４時間、増殖させた。次の日、培養物のＯＤ６００を測定した；細胞をｄＨ２Ｏで２回、洗浄し、最少オレイン酸培地中に０．１のＯＤ６００で再懸濁し、２０℃、１８０ｒｐｍで１６時間、増殖させた。細胞を、５０ｍＬのＦＡＬＣＯＮチューブ中５ｍＬの培養物としてか、または２５０ｍＬのバッフル付き振盪フラスコ中２０ｍＬの培養物としてかのいずれかで増殖させた。
【０１２０】
フローサイトメトリー：ｃ−ＭｙｃまたはＶ５エピトープに対する抗体での間接的免疫染色により、表面発現を実証した。したがって、誘導後、０．１％ＢＳＡを補充された１ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２）（ＰＢＳ／ＢＳＡ）中の２×１０６個の細胞を、１μｇ／ｍｌの抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（Ｓｉｇｍａ）または抗Ｖ５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に３０分間、インキュベートした。必要に応じて、ビオチン化ＨＥＬ（Ｓｉｇｍａ）または組換えＨＥＲ２−Ｆｃキメラタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。ＨＥＬのビオチン化のために、Ｐｉｅｒｃｅ製のＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｍｉｃｒｏ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔｓを用いた。その後、細胞を、氷冷ＰＢＳ／ＢＳＡで洗浄し、二次検出試薬と共に３０分間、インキュベートした。ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ−４８８またはフィコエリトリン連結型抗体を用いて、結合した抗ｃ−Ｍｙｃまたは抗Ｖ５抗体を検出した。ビオチン化抗原の検出について、検出は、ストレプトアビジン−フィコエリトリンを用いた。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー上での分析の前に、細胞を氷冷ＰＢＳ／ＢＳＡで２回、洗浄した。
【０１２１】
Ｋｄ決定：前に記載されているように、細胞を増殖させ、誘導した。２００μｌ ＰＢＳ／ＢＳＡ中１×１０６個の細胞のアリコートを、０．０１ｎＭから１μＭまでの濃度範囲での適切な抗原とインキュベートし、６０分間のインキュベーションにより２５℃において平衡に近づくようにさせた。次に、細胞を遠心分離によりペレット化し、氷冷ＰＢＳ／ＢＳＡ中で洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターでの分析のために１ｍｌの氷冷ＰＢＳ／ＢＳＡ中に再懸濁した。細胞の平均蛍光強度を記録した。非線形最小二乗曲線当てはめを用いて、蛍光データから平衡解離定数（Ｋｄ）を決定した。
【０１２２】
エラープローンＰＣＲを用いる多様化したレパートリーの構築：抗ＨＥＬ ｓｃＦｖ断片Ｄ１．３を、以前に記載されているように（全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ｃｈａｏら、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ． １、７５５−６８、２００６参照）、エラープローンＰＣＲを用いてランダムに変異させた。簡単に述べれば、ｓｃＦＶ ＯＲＦを、プライマーｐＰＯＸ２ＦｗおよびｚｅｔａＲｖを用いて、ｐＹＬＰＵＸＬ２ｐｒｅＡ２Ｄ１．３から増幅した（Ｃｈａｏら、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ． １、７５５−６８、２００６）。精製後、ＰＣＲ産物をＳｆｉＩおよびＮｏｔＩで消化した。消化された産物を、ゲル精製し、同様に処理された（ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩで消化された）、野生型Ｄ１．３を含有するベクターへクローニングした。これらのライブラリーからＱｉａｇｅｎプラスミド精製キットを用いてプラスミドＤＮＡを調製し、その後、上記のようにＹａｒｒｏｗｉａ株ｐＯ１ｄへ形質転換した。
【０１２３】
ライブラリー選択：変異体Ｄ１．３レパートリーを増殖させ、抗体発現を、上記のように１６時間、誘導した。そのレパートリーを抗ｃ−Ｍｙｃ（１μｇ／ｍｌ）および３００ｎＭビオチン化ＨＥＬで平衡に達するまで（３時間）、標識し、その後、非標識ＨＥＬと２０分間、競合させた。次に、細胞を、二次Ａｌｅｘａ−４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（１μｇ／ｍｌ）およびストレプトアビジン−フィコエリトリン（１μｇ／ｍｌ）で標識した。全てのインキュベーション工程後、細胞を、１ｍｌ ＰＢＳ／ＢＳＡで２回、洗浄した。最後の洗浄後、細胞を、抗原解離を防ぐために氷上で保持した。試料を、Ｅｐｉｃｓ Ａｌｔｒａフローサイトメーター上、約２０００細胞／秒のソーティング速度でソーティングした。最も高い抗原結合性集団のより小さなパーセンテージをゲーティングすることにより、ストリンジェンシーを増加させながら、３回の連続したラウンドにおいて細胞をソーティングした。選択されたクローンの配列分析により、２つのクローン（クローン１３およびクローン３８）が変異［Ｉ１６０Ｖ］（クローン１３）および［Ｉ１６０Ｖ；Ｔ２２８Ａ］（クローン３８）を含有することが明らかにされた。これらのクローンを、平衡力価測定によって抗原結合について評価し、１．８倍および２．４倍の親和性の向上が示され、それは、Ｍ３変異体についてと同じ範囲にある（図１８参照）。
【０１２４】
実施例２：ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、および完全長ＩｇＧディスプレイプラスミドのセットの構築
異なるアンカリング分子を用いてｓｃＦｖ断片のディスプレイを可能にするように、一般的な表面ディスプレイプラットフォームを作製した。１）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓａｇ１ｐのＣ末端部分（３２０個のＣ末端アミノ酸）へのＮ末端融合（Ａ１）、２）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｇａ２ｐへのＮ末端融合（Ａ２）、３）Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＣｗｐＩｐのＣ末端部分（１１０個のＣ末端アミノ酸）へのＮ末端融合（Ａ３）、および４）Ａｇａ２ｐへのＣ末端融合（Ａ４）としてｓｃＦｖ断片のディスプレイを可能にする合計４つのディスプレイプラスミドを作製した。発現は誘導性ｐＰＯＸ２プロモーターによって駆動される。ＬＩＰ２ｐｒｅリーダー配列をｓｃＦｖのＮ末端に付加して、分泌装置を介した各ポリペプチドのプロセシングを駆動し、最終的に正しくプロセシングされた表面ディスプレイ化タンパク質を生じるようにする。変形として、ディスプレイレベルの比較を可能にするために、ＬＩＰ２ｐｒｅｐｒｏもまた、α−凝集素（ａｇｇｌｔｉｎｉｎ）融合体（Ａ１）におけるトラスツズマブｓｃＦｖについてのリーダーとして用いた。この実験ストラテジーは、複数のディスプレイ型式を用いることにより、成功の機会が増加するだけでなく、アンカーがｓｃＦｖまたはＦａｂ断片のＮ末端に融合したかＣ末端に融合したかに依存して、遊離カルボキシ末端かまたは遊離アミノ末端のいずれかを有する抗体断片のディスプレイ（その特徴は、ディスプレイされたｓｃＦｖの結合特性に影響することが以前に示された（全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ｗａｎｇ，Ｚ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ． １８、３３７−４３、２００５））も可能にするであろうという推論に基づいた。エピトープタグ（ｃ−Ｍｙｃ）の付加によって、各ポリペプチドのディスプレイがモニターでき、選択の標準化が可能になった。
【０１２５】
Ｆａｂディスプレイについて、重鎖Ｆａｂ断片を、ｓｃＦｖ断片について記載されたものと同じアンカリング分子（Ａ１〜４）を用いて、酵母表面へアンカリングさせたが、軽鎖Ｆａｂについては、可溶性断片として発現させた（ＦａｂＬＣ）。両方の鎖が化学量論的（ｓｔｏｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ）量で存在することを可能にするために、両方の発現カセットを誘導性ｐＰＯＸ２プロモーターによって駆動し、リーダー配列としてＬＩＰ２ｐｒｅを用いた。Ｆａｂ重鎖（ＣＨ１−ＶＨ）（ｃ−Ｍｙｃ）および軽鎖（Ｃ末端のＶ５および６−ｈｉｓエピトープタグ）についての異なるエピトープタグの存在により、各ポリペプチドの同時的かつ非依存的可視化を可能にした。
【０１２６】
完全長ＩｇＧディスプレイについて、完全長トラスツズマブ重鎖を、ｓｃＦｖおよびＦａｂについて記載されているようなアンカリング分子のうちの２つ：Ａ２およびＡ４（それぞれ、ＡＧＡ２のＮ末端およびＣ末端繋ぎ止め）を用いて酵母細胞表面へアンカリングさせた。両方の鎖が化学量論的量で存在することを可能にするために、両方の発現カセットを誘導性ｐＰＯＸ２プロモーターによって駆動し、リーダー配列としてＬＩＰ２ｐｒｅを用いた。重鎖（ＨＣ）（ｃ−Ｍｙｃ）および軽鎖（ＬＣ）（Ｃ末端のＶ５および６−ｈｉｓエピトープタグ）についての異なるエピトープタグの存在により、各ポリペプチドの同時的かつ非依存的可視化を可能にした。
【０１２７】
コドン最適化は、一般的に、結果として、異種タンパク質の発現レベルの２倍の向上を生じることが示されたため、全てのディスプレイカセットを、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａについてコドン最適化した。ディスプレイ系を、以下の２つの十分特徴づけられた抗体のパネルを用いて分析した：抗フルオレセイン４−４−２０抗体（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ表面ディスプレイプラットフォームの開発のためのモデルタンパク質としての役割を果たしている（全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ｂｏｄｅｒ，Ｅ．Ｔ． ＆ Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｋ．Ｄ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５、５５３−７、１９９７））、およびトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））（細胞表面抗原ＨＥＲ−２／ｎｅｕがん原遺伝子に結合し、乳がんの処置として臨床的に認可されている）。
【０１２８】
全てのベクターは、ゼータエレメント（Ｙｌｔ１レトロトランスポゾン由来の長い末端反復（ＬＴＲ））を有し、これにより、Ｙｌｔ１を有するＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株における相同組換えによるか、またはこのレトロトランスポゾンを欠く株における非相同組換えによるかのいずれかによって、ベクターが組み込まれるのを可能にした。全てのｓｃＦｖ発現構築物、およびＦａｂ重鎖（ＣＨ１−ＶＨ）発現構築物は、ＬＥＵ２栄養要求性マーカーを有した。Ｆａｂ軽鎖断片発現プラスミドは、ＵＲＡ３ｄ１マーカーを有した。Ａｇａ２ｐ融合体のディスプレイのために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＧＡ１を発現する追加の発現構築物が存在した。ＡＧＡ１は、ＡＧＡ２のヘテロダイマー化のパートナーである。したがって、ｐＰＯＸ２プロモーター下で、成熟Ａｇａ１ｐについてのリーダーとしてＬＩＰ２ｐｒｅを用いて、ＡＧＡ１の発現を可能にするように、２つの構築物（栄養要求性マーカーＵＲＡ３およびＡＤＥ２を含む）を作製した。発現構築物の形質転換により、どの場合においても、完全に相補された株が生じた。図１は、ｓｃＦｖおよびＦａｂ断片のディスプレイのために構築された発現プラスミドについての概略図を示す。
【０１２９】
実施例３：細胞ディスプレイの向上
最初の実験として、ディスプレイ株の陽性形質転換体を、２５０ｍｌフラスコ内の５０ｍｌのＹＰＤ培地中、２８℃で一晩、増殖させた。その後、細胞を、ｄＨ２Ｏ中で洗浄し、オレイン酸リッチな培地中に再懸濁し、２５０ｍｌフラスコ内、２８℃で４８時間、増殖させた。最初の実験において、ｃ−Ｍｙｃエピトープタグにおける免疫学的染色およびＦＡＣＳ分析を用いて、表面発現は検出することができなかった（データは示していない）。したがって、異なる増殖条件を試験した。
【０１３０】
ストレス応答およびタンパク質フォールディングを含む多くの重要な細胞プロセスは、増殖温度を変化させることによって影響される。フォールディングストレスは、一般的に、低い培養温度で減少し、これにより、より効率的な異種タンパク質分泌／表面ディスプレイのレベルを可能にする。例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ｄｒａｇｏｓｉｔｓ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．、２００９を参照。したがって、ｓｃＦｖおよびＦａｂ断片の表面発現レベルを、２０℃および２８℃の誘導温度で比較した。
【０１３１】
細胞壁は、非常に多様なタンパク質集団を含有する高度に適応可能な小器官である。新しい巨大分子（例えば、ＧＰＩアンカー型タンパク質）の既存のポリマーネットワークへの挿入は、主として、活発な細胞壁生合成の部位、すなわち、増殖中の娘細胞の部位で起こることがＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて示されている（全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ｋｌｉｓ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｙｅａｓｔ ２３、１８５−２０２、２００６）。Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの細胞壁の分子構成は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの分子構成と類似していると考えられている。２０℃での増殖が、細胞壁形成を減速させ、それによって、異種タンパク質のより多くが細胞壁生合成の部位に蓄積することを可能にするか否かを試験した。また、通気の効果を研究するために、細胞を、通気がない５０ｍｌ ＦＡＬＣＯＮチューブ内、および２５０ｍｌ振盪フラスコ内で増殖させた。最後に、最少補充培地（ＭＭ）中での増殖を試験した。４−４−２０ α−凝集素（Ｓａｇ１ｐ）をディスプレイする株をこの実験に用いた。対照株として、フルサイズのモノクローナルのトラスツズマブ抗体産生株を選択した（表面発現カセットを含有しない株１Ｔ２）。
【０１３２】
図２に示されているように、ＦＡＬＣＯＮ培養（７６％）および振盪フラスコ培養（８６％）の両方について、細胞が最少補充培地中、２０℃で２０時間、誘導された場合、ＦＡＣＳ分析により、大きなｃ−Ｍｙｃ陽性集団が現れ、振盪フラスコ培養がわずかにより高いディスプレイレベルを示した（ＭＦＩ（平均蛍光強度）が２倍、異なる）。細胞をＭＭ中、２８℃で増殖させた場合、わずかな割合の細胞だけが、抗体断片をディスプレイした。また、細胞をＲＭ中、２０℃で増殖させた場合、表面ディスプレイは、はっきりとは見えなかった。４０時間の誘導における分析により、試験された全ての増殖条件について、全てのｃ−Ｍｙｃ検出が消滅した（データは示していない）。理論に縛られるつもりはないが、これは、ディスプレイされたタンパク質のタンパク質分解、または細胞壁構造における形態変化（複数可）によってｃ−Ｍｙｃエピトープが隠されることによって説明することができると思われる。
【０１３３】
実施例４：誘導時間の表面ディスプレイレベルへの効果
ｃ−Ｍｙｃ陽性細胞が長い誘導時間で消失したため、様々な誘導時間においてディスプレイレベルを測定する時間動態学実験を行った。したがって、１６時間、２０時間、２４時間、３２時間、および４３時間の誘導時点において、株ｎ１（４−４−２０ ｓｃＦｖ Ｓａｇ１を形質転換されたｐＯ１ｄ）のＦＡＣＳ分析を行った。
【０１３４】
図３の最初のパネルに示されているように、最大発現レベルは、１６時間の誘導時点で達せられ、細胞の９５％が中程度の発現レベルを示した（バックグラウンドより１０倍高い）。ｃ−Ｍｙｃを発現する細胞の相対的割合は、誘導時間が長くなるにつれて減少した（１６時間後９５％、２０時間後８６％、２４時間後５３％、３２時間後１９％、および４３時間後７％）。また、自己蛍光の減少（５分の１）、および陽性細胞の平均蛍光の減少（２０分の１）が、誘導中観察された。理論に縛られるつもりはないが、自己蛍光の減少は、細胞サイズの減少の結果である可能性が高い。ＦＳＣ／ＳＳＣ（前方−側方散乱：これらの測定はそれぞれ、細胞サイズおよび細胞の顆粒性を示している）について、有意な変化が観察され、それは、形態学的発生における劇的な変化を反映した。理論に縛られるつもりはないが、これらの変化についての１つの説明は、細胞が誘導中に酵母−菌糸転移を起こすことである。顕微鏡法で立証されているように、細胞は、より長い誘導によってより伸長した構造を形成し、この仮説を支持する。重要なことに、菌糸の形をとる場合、細胞壁タンパク質含量は減少することが以前に示されており、このこともまた、表面ディスプレイレベルの低下を説明することができると思われる。
【０１３５】
実施例５：ｐＨの表面ディスプレイレベルへの効果
Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは、酵母様細胞および短い菌糸型細胞の混合物として増殖する。二相性転移を制御する１つの因子は、増殖培地のｐＨである（全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ｒｕｉｚ−Ｈｅｒｒｅｒａ，Ｊ． ＆ Ｓｅｎｔａｎｄｒｅｕ，Ｒ．、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７８、４７７−８３、２００２）。菌糸体形成は、中性近くのｐＨで最大であり、ｐＨが低下するにつれて減少し、ｐＨ３でほとんどゼロになることが記載されている（同上）。
【０１３６】
誘導の初期相中に酵母−菌糸転移を避ける試みにおいて、ｓｃＦｖディスプレイ株を、異なるｐＨ値：ｐＨ６．８、ｐＨ５、およびｐＨ３で増殖させた。図４に示されているように、誘導の２４時間目において、ｐＨ５およびｐＨ６．８で増殖した培養物についてシフトが起こり、ディスプレイ細胞の５０％損失があった。一方、ｐＨ３においては、１００％の細胞が、細胞ディスプレイを保持した。ｐＨ３における全体的なディスプレイレベルは、ｐＨ６．８と比較して増加しなかった。誘導の３２時間目において、ｐＨ５およびｐＨ６．８でｃ−Ｍｙｃシグナルの完全な喪失が観察され、一方、ｐＨ３で全ての細胞がｓｃＦｖディスプレイを保持した。ｐＨ３において、より長い誘導時間について、最大発現レベルのほんのわずかな減少が観察された。同様の変化は、表面ディスプレイされたＦａｂ断片について見られた（データは示していない）。異なるｐＨで増殖した培養物間で、ＦＳＣ／ＳＳＣプロフィールに劇的な違いが観察され、形態学的変化を反映した。ｐＨ３において、ごく少数の菌糸型細胞を含む酵母集団が、より長い誘導時間の時点で、保持されたが、ｐＨ５およびｐＨ６．８において、より分散した細胞集団が観察され、おそらく、それは、偽性菌糸増殖への転移を反映していると思われる。
【０１３７】
要約すれば、この実施例は、低いｐＨでの増殖が、表面ディスプレイタンパク質の検出を長く持続させるが、全体的なディスプレイレベルを増加させないことを実証している。
【０１３８】
実施例６：開発されたｓｃＦｖ株、Ｆａｂ株、および完全長ＩｇＧ株の発現分析
２つの異なるｓｃＦｖ断片融合タンパク質：４−４−２０ ｓｃＦｖおよびトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）ｓｃＦｖを用いて、新しいディスプレイ系をＦＡＣＳで確認した。ｃ−Ｍｙｃタグの免疫蛍光顕微鏡法およびフローサイトメトリー検出によって、ｓｃＦｖ発現を検証し、ｓｃＦｖ産物の発現および正しいフォールディングが示された。図５は、異なるディスプレイ型式における両方のｓｃＦｖ断片についての発現およびリガンド結合データを示す。示されているように、Ｓａｇ１ｐへのＮ末端融合（図５、「Ａ１」と表示された行におけるヒストグラム）およびＡｇａ２ｐへのＮ末端融合（図５、「Ａ２」と表示された行におけるヒストグラム）としての両方のｓｃＦｖ断片に関して、発現が見られ、最高レベルは、Ａｇａ２ｐ融合体について達成された（ＭＦＩはバックグラウンドより３０倍高かった）。重要なことには、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、存在する細胞のうち、表面タンパク質を発現しない陰性集団（４０〜８０％）が常にあるが、いずれの融合体を用いたＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいても、ｓｃＦｖをディスプレイする場合、この現象は観察されなかった。理論に縛られるつもりはないが、これについての一つの可能性のある説明とは、エピソームプラスミドが用いられるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅと対照的に、その発現カセットは、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのゲノムへ安定的に組み込まれることである。リガンド結合検出について、ビオチン化抗原をストレプトアビジン−フィコエリトリンで検出した。ｓｃＦｖもまた、抗原に結合することができ、それらの正しいプロセシングおよびフォールディングが確認された（図５の「リガンド結合」と表示された列を参照）。ＣｗｐＩｐへのＮ末端融合（図５、「Ａ３」と表示された行におけるヒストグラム）およびＡｇａ２ｐへのＣ末端融合（図５、「Ａ４」と表示された行におけるヒストグラム）について、複数のクローンを試験した場合でも、発現を検出することができなかった。これらの場合においてｃ−Ｍｙｃが検出されなかったことについて、いくつかの理由で説明することができると思われる。第１に、ＣＷＰＩを用いたＹａｒｒｏｗｉａにおける、成功したタンパク質のディスプレイは、今までのところ、ｈｐ４ｄプロモーターおよびリーダー配列としてＸｐｒ２ ｐｒｅを用いている。１つの可能性は、発現構築物の違いが、観察された発現の欠如の原因であることである。第２に、ディスプレイされたタンパク質を検出不可能にさせ得る、エピトープタグのタンパク質分解に起因する可能性がある。ＬＩＰ２ ｐｒｅｐｒｏをリーダーとして用いた場合、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）Ｓａｇ１ｐ融合体について約３倍の増加が見られた（データは示していない）。免疫蛍光顕微鏡法により、ディスプレイされたｓｃＦｖの細胞表面局在化が明らかに示されている（図６Ａ参照）。
【０１３９】
Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞がそれらの表面上でヘテロダイマーＦａｂ断片を機能的にアッセンブルすることができるか否かを評価するために、２つの異なるＦａｂ断片（４−４−２０抗体由来およびトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）抗体由来）の発現を誘導し、その後、免疫蛍光顕微鏡法およびフローサイトメトリーによって発現を分析した。Ｙａｒｒｏｗｉａ株ｐＯ１ｄを、ＡＧＡ１（ＡＤＥ２マーカーを用いる）、重鎖断片（ＵＲＡ３マーカーを用いる）、および軽鎖断片（ＬＥＵ２マーカーを用いる）についての発現カセットで連続的に形質転換して、最終的に、完全に相補された株が生じた。実施例１に記載されているように、細胞を増殖させ、誘導した。融合したエピトープタグ（ＨＣ Ｆａｂ断片についてのｃ−ｍｙｃ、およびＬＣ断片についてのＶ５）に対する免疫学的染色によって、重鎖および軽鎖の発現についてＹａｒｒｏｗｉａ細胞を標識し、抗原結合を評価した（図７参照）。ＣｗｐＩｐへの融合体を除く全ての構築物について、Ｆａｂ重鎖（ＣＨ１−ＶＨ）および軽鎖の両方のディスプレイが確認された。全ての場合において、細胞集団の１００％が、機能し得るヘテロダイマーＦａｂ断片を発現し、上記のｓｃＦｖ断片で得られた結果（図７参照；２つのピーク（１つの陰性（自己蛍光）ピークおよび１つの陽性ピーク）の出現ではなく、完全ピークのシフトが観察された）が確認された。２色のＦＡＣＳ分析を用いるＨＣおよびＬＣトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）Ｆａｂ断片の同時標識により、個々の酵母細胞の表面上での両方の鎖の対形成が示された（図８、「ＨＣ＋ＬＣ」と表示された行におけるヒストグラム参照）。さらに、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ＨＣ Ｆａｂ断片の非存在下において、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）ＬＣ断片を、酵母細胞の表面上で検出することができず、その複合体のヘテロダイマー構成が実証された（図８、中央行のヒストグラム参照）。両方の抗体について、抗原結合が確認された（図７、「リガンド結合」と表示された列のヒストグラム）。しかしながら、抗原が結合した程度は、抗体融合体の分子構成によって異なった。また、その２つの抗体クローンについて異なるディスプレイ様式を比較した場合、ディスプレイ効率の変化が観察された（図７、点線）。免疫蛍光顕微鏡法により、重鎖と軽鎖の両方の共局在が示された（図６Ｂ参照）。図６において、Ｆａｂ断片およびｓｃＦｖ ４−４−２０抗体断片が発現した。検出は、アンカー型重鎖断片についてｃ−ｍｙｃ染色、および軽鎖断片についてＶ５染色によって行った。
【０１４０】
Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞がそれらの表面上で完全長ＩｇＧを機能的にアッセンブルすることができるか否かを評価するために、単一のＩｇＧ Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラスツズマブ）の発現を誘導し、その後、免疫蛍光顕微鏡法およびフローサイトメトリーによって発現を分析した。したがって、Ｆａｂについて行ったのと同様に、両方の鎖の発現カセットで単一のＹａｒｒｏｗｉａ ｐＯ１ｄ株を形質転換して、完全に相補された株を作製した。重鎖および軽鎖を同時に染色することにより（それぞれ、ｃ−ｍｙｃ染色およびＶ５染色）、ＦＡＣＳを用いて、ディスプレイを確認した。図１７は、２つの様式Ａ２およびＡ４（それぞれ、ＡＧＡ２へのＮ末端融合およびＣ末端融合）における完全長トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）ディスプレイのフローサイトメトリー分析を示す。図に示されているように、全ての細胞が、完全長重鎖および軽鎖の発現を同時に示している。トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）Ｆａｂディスプレイについて観察されたのと同様に、Ｎ末端融合と比較して、重鎖がＡＧＡ２アンカーのＣ末端に融合している場合について、ディスプレイ効率の劇的な向上が観察された。
【０１４１】
実施例７：抗体断片の発現の向上のためのディスプレイ株の操作
抗体断片（ｓｃＦｖおよびＦａｂ）の産生における律速工程は、タンパク質フォールディング、ジスルフィド架橋形成、および小胞体（ＥＲ）における機能的アッセンブリである場合が多い。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＰＤＩおよびＫａｒ２／Ｂｉｐなどの分子シャペロンの過剰発現は、ｓｃＦｖ産生にプラスの効果を生じることが示されている（全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ｓｈｕｓｔａ，Ｅ．Ｖ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６、７７３−７、１９９８）。また、ＰＤＩの共発現が、Ｆａｂ過剰発現でのフォールディングストレスを軽減し、その結果として、産生レベルの中程度の増加を生じることが、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて示されている（全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ｇａｓｓｅｒ，Ｂ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９４、３５３−６１、２００６）。しかしながら、いくつかの場合、シャペロンの共発現によって、結果として、発現レベルに変化が生じず、さらには減少さえ生じた。抗体分泌を向上させる別の可能性は、ＨＡＣＩ転写因子の過剰発現により小胞体ストレス応答（ｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（ＵＰＲ）を誘導することである；Ｆａｂ分泌の中程度の向上が以前に報告されている（同上）。
【０１４２】
表面にディスプレイされるタンパク質および分泌されるタンパク質の両方が、同じ分泌経路を介して移動するため、細胞表面ディスプレイが、分泌能力とよく相関することは知られている（全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ｓｈｕｓｔａ，Ｅ．Ｖ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９２、９４９−５６、１９９９）。このように、表面ディスプレイレベルは、個々の細胞を発現レベルに関連づける容易な読み取りとしての役割を果たす。
【０１４３】
ここで、ＹａｒｒｏｗｉａのＰＤＩおよびＨＡＣＩ発現のｓｃＦｖおよびＦａｂ産生への効果を、上記で開発されたディスプレイプラットフォームを用いてＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいて初めて試験した。Ｙａｒｒｏｗｉａ ＰＤＩは、ＴＥＦプロモーターの調節下で構成的に発現し、Ｙａｒｒｏｗｉａ ＨＡＣＩ転写因子は、ｐＰＯＸ２プロモーターの調節下で誘導性に発現した。両方のカセットで、（上記の）トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）ｓｃＦｖディスプレイ株およびＦａｂディスプレイ株を共形質転換し、正しいゲノム組込みをＰＣＲによって確認した。図９に示されているように、構成的ＰＤＩ共発現は、結果として、ｃ−ｍｙｃ ＭＦＩによって測定した場合、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）ｓｃＦｖ−Ｓａｇ１ｐディスプレイの２倍の増加、およびトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）Ｆａｂ−Ａｇａ２ディスプレイの１．２倍の増加を生じた。これとは反対に、誘導性ＨＡＣＩ共発現は、結果として、ｓｃＦｖ断片およびＦａｂ断片の両方の減少を生じた。これらの結果は、ジスルフィド結合が、ｓｃＦｖ断片およびＦａｂ断片の分泌における律速工程であることを示している。しかしながら、ＵＰＲ（小胞体ストレス応答）経路の誘導が、劇的なマイナスの影響を生じた。これは、以前に、ｓｃＦｖのディスプレイについて観察されており（全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ｒａｋｅｓｔｒａｗ，Ａ． ＆ Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｋ．Ｄ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９３、８９６−９０５、２００６）、正しくフォールディングされていないタンパク質がＥＲ分解経路（ＥＲＡＤ）へ送られるという事実（このこともまた、ＵＰＲ誘導中に上方制御される）によって説明することができると思われる。
【０１４４】
実施例８：ディスプレイされるトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）ｓｃＦｖについての用量反応曲線
トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）の表面ディスプレイされたｓｃＦｖ融合タンパク質の結合親和性を、平衡結合力価測定曲線から決定した。いずれかの抗体融合体をディスプレイする細胞を、様々な濃度のＨＥＲ２−Ｆｃキメラタンパク質中、２５℃で３時間、インキュベートした。細胞集団の平均蛍光を、フローサイトメトリーによって測定した。図１０は、３つの独立した力価測定の結果を示す。「ｐｒｅＡ１−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ｓｃＦｖ」と表示された線グラフは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓａｇ１ｐのＣ末端の３２０個のアミノ酸へのＮ末端融合として融合し、かつＬｉｐ２ｐｒｅリーダー配列と共に発現したトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）ｓｃＦｖについての用量反応曲線を示す。「ｐｒｅｐｒｏＡ１−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ｓｃＦｖ」と表示された線グラフは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓａｇ１ｐのＣ末端の３２０個のアミノ酸へのＮ末端融合として融合し、かつＬｉｐ２ｐｒｅｐｒｏリーダー配列と共に発現したトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）ｓｃＦｖについての用量反応曲線を示す。「ｐｒｅＡ２−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ｓｃＦｖ」と表示された線グラフは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｇａ２ｐへのＮ末端融合として融合し、かつＬｉｐ２ｐｒｅリーダー配列と共に発現したトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）ｓｃＦｖについての用量反応曲線を示す。Ｙ軸は、結合割合を示し、その結合割合は、ＭＦＩ／（ＭＦＩｍａｘ−ＭＦＩｍｉｎ）として計算され、標準化され、パーセンテージとして表される。非線形最小二乗によって平衡解離定数、Ｋｄを当てはめた。ＨＥＲ２−Ｆｃに対する酵母ディスプレイされたトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）−Ｓａｇ１ｐ融合体の親和性（Ｋｄ＝１．９ｎＭ）は、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）−Ａｇａ２ｐ融合体についての親和性（Ｋｄ＝０．７ｎＭ）より２．７倍高かった。
【０１４５】
実施例９：定方向進化のための足場としてのＹａｒｒｏｗｉａディスプレイプラットフォームの実証
最大定方向進化効率を得るために、足場は、クローン間を親和性におけるわずかな差だけで効果的に識別することができるべきである。以前に、酵母ディスプレイが、親和性における２倍の差での抗体クローン間の微細な識別を可能にすることが示された。全体として参照により本明細書に組み入れられた、ＶａｎＡｎｔｗｅｒｐ，Ｊ．Ｊ． ＆ Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｋ．Ｄ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１６、３１−７、２０００を参照。抗鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ）ｓｃＦｖ Ｍ３は、抗ＨＥＬ ｓｃＦｖ Ｄ１．３が有するより、ＨＥＬに対して２倍高い親和性を有する。ディスプレイされたポリペプチドは、Ｓａｇ１ｐ融合ポリペプチド（「ｐｒｅＡ１ Ｄ１．３ 対 Ｍ３」と表示された線グラフ）およびＡｇａ２ｐ融合ポリペプチド（「ｐｒｅＡ２ Ｄ１．３ 対 Ｍ３」と表示された線グラフ）として発現した。Ｄ１．３またはＭ３をディスプレイする細胞を、様々な濃度のビオチン化ＨＥＬとインキュベートした。次に、平均蛍光を、フローサイトメトリーによって測定した。それぞれの表面ディスプレイされた抗体の結合親和性を、平衡結合力価測定曲線によって決定した。図１１は、３つの独立した力価測定の平均結果を示し、それに曲線を非線形最小二乗によって当てはめた。Ｄ１．３のＨＥＬに対する親和性は、Ｍ３のＨＥＬに対する親和性と比較して、Ｓａｇ１ｐ融合体およびＡｇａ２ｐ融合体、それぞれについて、２．９分の１および２．７分の１であることが決定された。
【０１４６】
この実施例は、開発されたＹａｒｒｏｗｉａディスプレイ足場が、親和性におけるわずかな差だけでクローン間を効果的に識別することを示し、この系のスクリーニングの潜在能力を確認した。
【０１４７】
実施例１０：ＦＡＣＳを用いるモデル濃縮実験
Ｄ１．３をディスプレイする酵母細胞および向上した変異体Ｍ３をディスプレイする酵母細胞の混合物を用いる単一パス濃縮を実施した。Ｍ３変異体ｓｃＦｖをディスプレイする細胞を、さらに、ハイグロマイシン発現カセットで形質転換した。発現レベルへの有意な効果は観察されなかった。Ｍ３細胞を、１／１０００の比率でバックグラウンドＤ１．３細胞へ混合し、最適な識別のために、０．３ｎＭの抗原濃度において平衡に達するまで、インキュベートした。約０．１％のソーティングウィンドウでの高純度モードで細胞をソーティングした（示していない）。濃縮係数を、選択プレート上での力価測定により決定し、８００の最大濃縮が得られた。濃縮は、濃縮前および後の選択プレート上でのレプリカプレーティング（ｒｅｐｌｉｃａ ｐｌａｔｉｎｇ）によって計算することができる。
【０１４８】
実施例１１：Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける複製型ベクターを用いた表面ディスプレイ
ｐＰＯＸ２プロモーターにより駆動されるｓｃＦｖ−ＡＧＡ２発現カセット、およびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける複製増殖のためのＡＲＳ１８を含有するように、複製型ベクターを構築した（図１５）。（ＡＧＡ１−ＡＧＡ２ヘテロダイマー化のための）ＡＧＡ１発現カセットを含有するＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株への形質転換により、１．２×１０６／μｇの形質転換効率が得られた。この効率は、ゼータに基づいた組込みを用いるランダム組込みについて観察することができたものと比較して、２０倍高かった。ライブラリー構築について、高い形質転換効率は、所望の複雑度を得るのに有利である。プラスミド増殖を保つために、細胞を、ロイシンの非存在での選択条件下で増殖させた。
【０１４９】
選択条件（ＣＳＭ−ロイシンを補充した最少培地）下および非選択条件（ＣＳＭを補充したＭＭ）下の両方に関して、増殖した１０個のクローンについて発現研究を、ＦＡＣＳを用いて実施した。組込み型プラスミドについて観察されたこと（図１６Ａ）とは違って、複製型ベクターで形質転換された細胞の誘導により、ｓｃＦｖを発現しなかった細胞集団が存在する。この陰性集団は、細胞が選択圧下で増殖した場合でさえも存在し（図１６Ｂ）、プラスミド喪失がこの観察の根拠ではなかったことを示した。この現象は、表面ディスプレイのために複製型プラスミドを用いたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて観察することができることと類似している。１０個のクローンの分析により、細胞の平均４３％がｓｃＦｖの表面発現に関して陽性であることが明らかにされた（図１６Ｂ参照）。平均蛍光強度は、組込み型プラスミドを用いて得られた結果と異ならなかった（すなわち、平均蛍光は同じ範囲内であった）。
【０１５０】
実施例１２：ＦＡＣＳを用いる濃縮実験
Ｄ１．３の多様化ライブラリーをディスプレイする酵母細胞の混合物を用いる濃縮を、１ｎＭの抗原濃度で実施した。約０．１％のソーティングウィンドウでの高純度モードで細胞をソーティングした（示していない）。連続した３ラウンドのソーティングを実行した。以下の２個のより高い親和性のクローンを単離した：１．７ｎＭの親和性を示すクローン１（Ｉｌｅ１６０Ｖａｌ、Ｔｈｒ２２８Ａｌａ）、および２．２ｎＭの親和性を示すクローン２（Ｉｌｅ１６０Ｖａｌ）。
【０１５１】
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と共に記載されているが、前記の説明は例示を意図し、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は、添付された特許請求の範囲の範囲によって定義されることは理解されているはずである。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【技術分野】
【０００１】
酵母細胞の表面上にポリペプチド（例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片）をディスプレイするのに用いる方法および組成物が本明細書に提供される。本明細書に開示された様々な方法および組成物と共に用いることができる例示的な酵母には、Ｙａｒｒｏｗｉａ属の酵母、例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。
【背景技術】
【０００２】
高親和性試薬、例えば、抗体またはその断片は、臨床的適用および研究的適用の両方にとって有用なツールである。いくつかのインビトロおよびインビボのプラットフォームが抗体の単離および特徴づけに用いられており、それらには、リボソームディスプレイ、ファージディスプレイ、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるペリプラズム発現が挙げられる。用いられている別のプラットフォームは、酵母細胞表面ディスプレイ（ＹＳＤ）である。
【０００３】
Ｙａｒｒｏｗｉａ株細胞表面上に抗体およびその断片をディスプレイするための組成物および方法は、有利であろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
酵母細胞の表面上にポリペプチド（例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片）をディスプレイするのに用いる方法および組成物が本明細書に提供される。本明細書に開示された様々な方法および組成物と共に用いることができる例示的な酵母には、Ｙａｒｒｏｗｉａ属の酵母、例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。
【０００５】
特定の実施形態において、本明細書に提供される組成物は、融合配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含み、その融合配列は、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸配列にインフレームで融合した、アンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列を含む。特定の実施形態において、本明細書に提供される組成物は、第１の核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含み、その第１の核酸配列は、アンカーポリペプチドをコードするアンカーヌクレオチド配列を含み、第１の核酸配列は、第２の核酸配列によってコードされる目的の第２の融合パートナーを含む融合ポリペプチドにおける第１の融合パートナーとして発現することができる。特定の実施形態において、発現カセットは、目的の第２の融合パートナーをコードする第２の核酸配列、例えば、制限部位の全部または一部をさらに含む。特定の実施形態において、目的の第２の融合パートナーは、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を含む。特定の実施形態において、抗体ポリペプチド断片は、ｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ断片の重鎖、またはＦａｂ断片の軽鎖である。
【０００６】
特定の実施形態において、発現カセットの第１の核酸配列は、第２の核酸配列の３’に融合しており、その結果、その融合配列から産生される融合ポリペプチドは、Ｎ末端の抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片、およびＣ末端のアンカーポリペプチドを含む。特定の実施形態において、発現カセットの第１の核酸配列は、第２の核酸配列の５’に融合しており、その結果、その融合配列から産生される融合ポリペプチドは、Ｎ末端のアンカーポリペプチド、およびＣ末端の抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を含む。
【０００７】
特定の実施形態において、発現カセットは、構成的プロモーターを含む。特定の実施形態において、発現カセットは、誘導性プロモーター、例えば、ＰＯＸ２またはＬＩＰ２プロモーターを含む。特定の実施形態において、発現カセットは、半誘導性（ｓｅｍｉ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）プロモーター、例えば、ｐｈ４ｄプロモーターを含む。
【０００８】
特定の実施形態において、発現カセットは、リーダーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むリーダー核酸配列を含み、リーダー核酸配列は、第１および第２の核酸配列の５’にインフレームで融合している。例示的なリーダー核酸配列には、非限定的に、ＬＩＰ２ ｐｒｅ、ＬＩＰ２ ｐｒｅｐｒｏ、ＸＰＲ２ ｐｒｅ、およびＸＰＲ２ ｐｒｅｐｒｏが挙げられる。
【０００９】
特定の実施形態において、発現カセットは、リンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むリンカー核酸配列を含む。例えば、リンカー核酸配列は、第１の核酸配列と第２の核酸配列との間にインフレームで融合することができる。特定の実施形態において、抗体ポリペプチドは、ｓｃＦｖ抗体ポリペプチドを含み、リンカー核酸配列は、ｓｃＦｖポリペプチドの可変領域をコードする重鎖核酸配列と、ｓｃＦｖポリペプチドの可変領域をコードする軽鎖核酸配列との間にインフレームで融合している。リンカーポリペプチドの非限定的例には、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３または（ＧｌｙＳｅｒ）５が挙げられる。
【００１０】
特定の実施形態において、発現カセットは、１つまたは複数のエピトープタグをコードするヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の核酸配列を含む。例示的なエピトープタグには、非限定的に、ｃ−Ｍｙｃ、Ｖ５、ヘキサヒスチジン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ストレプトアビジン、ビオチン、赤血球凝集素、Ｆｌａｇ−タグ、およびＥ−タグが挙げられる。
【００１１】
特定の実施形態において、発現カセットは、アンカーポリペプチドを含む。アンカーポリペプチドの非限定的例には、Ａｇａ１ｐポリペプチドまたはその断片、Ａｇａ２ｐポリペプチドまたはその断片、およびＳａｇ１ｐポリペプチドまたはその断片が挙げられる。
【００１２】
特定の実施形態において、発現カセットは、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞における発現のためにコドン最適化されている、抗体ポリペプチドもしくは抗体ポリペプチド断片、アンカーポリペプチド、または両方を含む。
【００１３】
特定の実施形態において、本明細書に提供される組成物は、上記の発現カセットのいずれかを含むベクターを含む。特定の実施形態において、ベクターは、ゼータエレメントを含む。例示的なゼータエレメントには、非限定的に、例えば、Ｙｌｔ１またはＴｙｌ６レトロトランスポゾンなどのレトロトランスポゾンの長い末端反復が挙げられる。特定の実施形態において、ベクターは、１つまたは複数の常染色体複製エレメント、例えば、セントロメア（ＣＥＮ）および複製起点（ＯＲＩ）を含む常染色体複製エレメントを含む。例示的なセントロメアには、非限定的に、ＣＥＮ１およびＣＥＮ３が挙げられる。例示的な複製起点には、非限定的に、ＯＲＩ１０６８またはＯＲＩ３０１８が挙げられる。特定の実施形態において、ベクターは、セントロメアおよび複製起点を含む自律複製配列（ＡＲＳ）を含む。例示的なＡＲＳには、非限定的に、ＡＲＳ１８およびＡＲＳ６８が挙げられる。特定の実施形態において、ベクターは、１つまたは複数の選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の核酸配列を含む。選択マーカーの非限定的例には、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３ｄ１、ＡＤＥ２、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｕｔ、Ｔｒｐ、Ｇ３ｐ、およびｈｐｈが挙げられる。
【００１４】
特定の実施形態において、本明細書に提供される方法は、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞の表面上に抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をディスプレイするための方法を含む。例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片は、アンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸配列にインフレームで融合した、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列を含む融合配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む第１のベクターを第１のＹａｒｒｏｗｉａ細胞へ導入し、ある期間、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件下で第１のＹａｒｒｏｗｉａ細胞をインキュベートすることによって、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞の表面上にディスプレイされてもよい。例示的な第１のベクターには、非限定的に、上記のベクターのいずれかが挙げられる。特定の実施形態において、抗体ポリペプチド断片は、ｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ断片の重鎖、またはＦａｂ断片の軽鎖である。特定の実施形態において、方法は、Ｆａｂ断片の軽鎖またはＦａｂ断片の重鎖をコードする核酸配列に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２のベクターを第１のＹａｒｒｏｗｉａ細胞へ導入する工程を含んでもよい。特定の実施形態において、第１のＹａｒｒｏｗｉａ細胞は一倍体であり、第２のベクターを導入する工程は、第１のベクターを含む第１の一倍体Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を、第２のベクターを含む第２の一倍体Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞と接合させることを含み、ここで、第１のＹａｒｒｏｗｉａ細胞と第２のＹａｒｒｏｗｉａ細胞は反対の接合型である。
【００１５】
特定の実施形態において、第１の核酸配列は、第２の核酸配列の５’に融合しており、その結果、その融合配列から産生される融合ポリペプチドは、Ｎ末端の抗体ポリペプチドまたはその抗体ポリペプチド断片、およびＣ末端のアンカーポリペプチドを含む。特定の実施形態において、第１の核酸配列は、第２の核酸配列の３’に融合しており、その結果、その融合配列から産生される融合ポリペプチドは、Ｎ末端のアンカーポリペプチド、およびＣ末端の抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を含む。
【００１６】
特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件は、低い誘導温度、例えば、約摂氏１５度から摂氏２５度の温度を含む。非限定的な低い誘導温度は、約摂氏２０度の温度を含む。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件は、短い誘導時間、例えば、約２４時間以下、約１６時間以下、または約１６時間を含む。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件は、低いｐＨ、例えば、約２から約４のｐＨ、または約３のｐＨを含む。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件は、高い通気条件、例えば、振盪フラスコ内でのインキュベーションを含む。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件は、最少培地、例えば、酵母抽出物、Ｂａｃｔｏペプトン、または両方を欠く培地中でのインキュベーションを含む。
【００１７】
特定の実施形態において、第１のベクターは、Ｙａｒｒｏｗｉａゲノムへ組み込まれる。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞は、シャペロン、例えば、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよび／またはＫａｒ２／Ｂｉｐを発現する。
【００１８】
特定の実施形態において、本明細書に提供される組成物は、上記の方法のいずれかによって得られる抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を含む。特定の実施形態において、標的ポリペプチドを結合する抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を含むＹａｒｒｏｗｉａ細胞を選択するための方法が提供される。例えば、標的ポリペプチドを結合する抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を含むＹａｒｒｏｗｉａ細胞は、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を表面上にディスプレイする親Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞は上記の方法のいずれかによって産生される）を供給し、親Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を試験ポリペプチドと接触させ、ディスプレイされた抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片が標的ポリペプチドを結合する場合には、その親Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を選択することによって、選択されてもよい。特定の実施形態において、そのような方法は、選択された親Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞から、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片の第１の発現カセットを単離する工程、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列に１つまたは複数の変化を導入して、改変型発現カセットを作製する工程、第１の発現カセットを欠く第２のＹａｒｒｏｗｉａ細胞へ改変型発現カセットを導入して、改変型Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を作製する工程、改変型Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞をある期間、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件下でインキュベートする工程、改変型Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を標的ポリペプチドと接触させる工程、およびその改変型Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞が親Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞より高い親和性またはアビディティで標的ポリペプチドを結合する場合には、それを選択する工程を含む。
【００１９】
特定の実施形態において、キットが本明細書に提供される。特定の実施形態において、本明細書に提供されるキットは、上記の発現カセットのいずれかなどの発現カセットを含む。特定の実施形態において、本明細書に提供されるキットは、上記のベクターのいずれかなどのベクターを含む。特定の実施形態において、本明細書に提供されるキットは、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を含む。特定の実施形態において、本明細書に提供されるキットは、発現カセット、ベクター、または両方を用いるための書面による使用説明書を含む。
【００２０】
他に定義がない限り、本明細書に用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。方法および材料は、本発明に用いるために、本明細書に記載されている；当技術分野において知られた他の適切な方法および材料もまた用いることができる。材料、方法、および例は、例証となるのみであり、限定することを意図されない。本明細書で言及された全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベース登録、および他の参考文献は、全体として参照により組み入れられている。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先するものとする。
【００２１】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、ｓｃＦｖ断片およびＦａｂ断片のＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａディスプレイに用いられる発現プラスミドおよび発現カセットの概略図である。図１Ａは、ランダムな組込みのためのＹａｒｒｏｗｉａ発現プラスミドの構成要素およびマップを示す。標的遺伝子の発現は、誘導性ｐＰＯＸ２プロモーターによって駆動される。完全に相補された株の作製を可能にするために異なる形質転換マーカーが利用可能である（Ｌｅｕ２、Ａｄｅ２、Ｕｒａ３）。このプラスミドを、異なる抗体断片をクローニングするための鋳型として用いた。図１Ｂは、ＡＧＡ１、ｓｃＦｖ断片、およびＦａｂ断片軽鎖ｃｋ１ドメインの可溶性発現のための発現カセットを示す。合成カセットを、Ｙａｒｒｏｗｉａ発現プラスミドへ、示された制限部位を用いてクローニングした。軽鎖可変ドメインは、生じたプラスミドへ別個にクローニングされ、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域を含有する完全長Ｆａｂ軽鎖断片（ＶＬ−Ｃｋ１）のディスプレイプラスミドを作製することができる。図１Ｃは、Ｙａｒｒｏｗｉａ発現プラスミドへ、示された制限部位を用いてクローニングされたｓｃＦｖ抗体断片を示す。異なる融合様式、かつ異なるアンカー分子を用いてのアンカリングを可能にする、合計４個の合成構築物を作製した。図１Ｄは、Ｙａｒｒｏｗｉａ発現プラスミドへ、示された制限部位を用いてクローニングされたＦａｂ ＣＨ１抗体断片（重鎖定常領域ＣＨ１ドメインを含有するＦａｂ断片）を示す。異なる融合様式、かつ異なるアンカー分子を用いてのアンカリングを可能にする、合計４個の合成構築物を作製した。重鎖可変ドメインは、生じたプラスミドへ別個にクローニングされ、ＶＨおよび重鎖定常領域ＣＨ１ドメインで構成される完全長Ｆａｂ重鎖（ＶＨ−ＣＨ１）のディスプレイプラスミドを作製することができる。図１Ｅは、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞の表面上で発現するように、適切なアンカーポリペプチドを伴ったｓｃＦｖ断片およびＦａｂ断片のそれぞれから発現する様々なポリペプチドの共形質転換ストラテジーおよび概略図を示す。
【図２】図２は、ＦＡＬＣＯＮ培養および振盪フラスコ（ＳＦ）培養（８６％）の両方について、最少補充培地（ＭＭ）およびリッチな培地（ＲＭ）中、２０℃で２０時間、誘導されたＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞におけるｃ−Ｍｙｃタグ付きｓｃＦｖ発現を示す、一連の１次元蛍光フローサイトメトリー（ＦＦＣ）ヒストグラムである。細胞をまた、振盪フラスコ内、ＭＭ中、２８℃で増殖させた。上部のパネルは、ｃ−Ｍｙｃタグ付きｓｃＦｖ断片についてのＦＦＣヒストグラムを示し、一方、下部パネルは、完全なサイズのモノクローナルのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ抗体を発現する株１Ｔ２についてのＦＦＣヒストグラムを示す。蛍光を、下記の実施例１に記載されているように検出した。網掛けヒストグラムは、自己蛍光を示し（陰性対照）、一方、実線はｃ−ｍｙｃ発現を表す。
【図３】図３は、様々な時間量で誘導されたＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞におけるｃ−Ｍｙｃタグ付きｓｃＦｖ発現を示す、一連の１次元ＦＦＣヒストグラムである。そのヒストグラムは、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞におけるｃ−Ｍｙｃタグ付きｓｃＦｖの表面ディスプレイレベルへの誘導時間の効果を示す。細胞を、１６時間、２０時間、２４時間、３２時間、および４３時間、増殖させた。ｃ−Ｍｙｃを発現する細胞の相対的割合は、誘導時間が長くなるにつれて減少した（２４時間後５４％、３２時間後１９％、および４３時間後７％）。蛍光を、実施例１に記載されているように検出した。網掛けヒストグラムは、自己蛍光を示し（陰性対照）、一方、実線はｃ−ｍｙｃ発現を表す。
【図４】図４は、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞におけるｃ−Ｍｙｃタグ付きｓｃＦｖの表面ディスプレイレベルへのｐＨの効果を示す、一連の１次元ＦＦＣヒストグラムである。細胞を、ｐＨ６．８、ｐＨ５、およびｐＨ３で、２４時間（上部パネル）および３２時間（下部パネル）、増殖させた。左側のパネルは、表面上にｓｃＦｖを発現していない細胞のバックグラウンド蛍光を示す。右側のパネルは、表面上にｓｃＦｖを発現している細胞の蛍光を示す。蛍光を、実施例１に記載されているように検出した。
【図５】図５は、２つの異なるｃ−Ｍｙｃタグ付きｓｃＦｖ断片：４−４−２０ ｓｃＦｖ（「４−４−２０ ｓｃＦｖ」表示の下のグラフ）およびｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ｓｃＦｖ（「ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ｓｃＦｖ」表示の下のグラフ）の表面発現を示す、一連の１次元ＦＦＣヒストグラムである。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓａｇ１ｐのＣ末端部分（３２０個のＣ末端アミノ酸）へのＮ末端融合（「Ａ１」と表示された行におけるヒストグラム）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｇａ２ｐへのＮ末端融合（「Ａ２」と表示された行におけるヒストグラム）、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＣｗｐＩｐのＣ末端部分（１１０個のＣ末端アミノ酸）へのＮ末端融合（「Ａ３」と表示された行におけるヒストグラム）、およびＡｇａ２ｐへのＣ末端融合（「Ａ４」と表示された行におけるヒストグラム）としてのｓｃＦｖ断片のディスプレイを可能にする、合計４個のディスプレイプラスミドを作製した。ｓｃＦｖ断片は抗原を結合することができた（「リガンド結合」と表示された列におけるパネル）。リガンド結合検出について、ビオチン化抗原を、ストレプトアビジン−フィコエリトリンで検出した。蛍光を、実施例１に記載されているように検出した。各グラフについて、網掛けヒストグラムは、自己蛍光を示す（陰性対照）。実線は、各列の上に示されているように、ｃ−ｍｙｃ発現またはリガンド結合を表す。
【図６】図６は、ｃ−Ｍｙｃタグ付き４−４−２０ ｓｃＦｖ融合タンパク質か（図６Ａ）、またはｃ−Ｍｙｃタグ付き４−４−２０重鎖および軽鎖の融合タンパク質か（図６Ｂ）のいずれかを発現する細胞の一連の免疫蛍光顕微鏡写真である。発現を、抗ｃ−Ｍｙｃ抗体で染色することによって検出した。
【図７】図７は、２つの異なるｃ−Ｍｙｃタグ付きＦａｂ断片：４−４−２０ Ｆａｂ（「４−４−２０ Ｆａｂ」の見出しの下のヒストグラム）およびｈｅｒｃｅｐｔｉｎ Ｆａｂ（「ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ Ｆａｂ」の見出しの下のヒストグラム）の表面発現を示す、一連の１次元ＦＦＣヒストグラムである。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓａｇ１ｐのＣ末端部分（３２０個のＣ末端アミノ酸）へのＮ末端融合（「Ａ１」と表示された行におけるヒストグラム）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｇａ２ｐへのＮ末端融合（「Ａ２」と表示された行におけるヒストグラム）、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＣｗｐＩｐのＣ末端部分（１１０個のＣ末端アミノ酸）へのＮ末端融合（「Ａ３」と表示された行におけるヒストグラム）、およびＡｇａ２ｐへのＣ末端融合（「Ａ４」と表示された行におけるヒストグラム）としてのＦａｂ重鎖断片のディスプレイを可能にする、合計４個のディスプレイプラスミドを作製した。Ｆａｂ軽鎖は、可溶性断片として発現した。重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）発現を検出した。リガンド結合検出について、ビオチン化抗原を、ストレプトアビジン−フィコエリトリンで検出した。蛍光を、実施例１に記載されているように検出した。各グラフについて、網掛けヒストグラムは、自己蛍光を示す（陰性対照）。実線は、各列の上に示されているように、ｃ−ｍｙｃ発現（アンカー型重鎖断片発現を示す）、Ｖ５発現（軽鎖発現を示す）、またはリガンド結合を表す。
【図８】図８は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ Ｆａｂの表面発現を示す、一連の１次元ＦＦＣヒストグラムである。重鎖は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｇａ２ｐへのＮ末端融合であった。軽鎖は、可溶性発現であった。重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）を個々に検出した（それぞれ、「ＨＣ」および「ＬＣ」と表示された行におけるヒストグラム）。２色のＦＡＣＳ分析を用いたＨＣおよびＬＣの同時標識（「ＨＣ＋ＬＣ」と表示された行におけるヒストグラム）により、個々の酵母細胞の表面上での両方の鎖の対形成が示された。蛍光を、実施例１に記載されているように検出した。網掛けヒストグラムは、自己蛍光を示し（陰性対照）、一方、実線は、示されているように、ＨＣ発現かまたはＬＣ発現のいずれかを表す。
【図９】図９は、Ｈｅｒ−ｓｃＦｖ発現およびＨｅｒ−Ｆａｂ発現へのシャペロンの効果を示す１組の棒グラフである。ＷＴ＝野生型。ＴＥＦ ＰＤ＝ＴＥＦプロモーターの調節下で発現したＰＤＩ（タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ）。ＰＯＸ２ ＨＡＣＩ＝ＰＯＸ２プロモーターの調節下で発現したＨＡＣＩ（ＵＰＲ（小胞体ストレス応答）を誘導した転写因子）。
【図１０】図１０は、ディスプレイされたＨｅｒｃｅｐｔｉｎ ｓｃＦｖについての用量反応曲線を示す、一連の線グラフである。３つの独立した力価測定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）が示されている。ｐｒｅＡ１−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ｓｃＦｖ＝Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓａｇ１ｐのＣ末端の３２０個のアミノ酸へのＮ末端融合として融合し、かつＬｉｐ２ｐｒｅリーダー配列と共に発現したＨｅｒｃｅｐｔｉｎ ｓｃＦｖ。ｐｒｅｐｒｏＡ１−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ｓｃＦｖ＝Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓａｇ１ｐのＣ末端の３２０個のアミノ酸へのＮ末端融合として融合し、かつＬｉｐ２ｐｒｅｐｒｏリーダー配列と共に発現したＨｅｒｃｅｐｔｉｎ ｓｃＦｖ。ｐｒｅＡ２−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ｓｃＦｖ＝Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｇａ２ｐへのＮ末端融合として融合し、かつＬｉｐ２ｐｒｅリーダー配列と共に発現したＨｅｒｃｅｐｔｉｎ ｓｃＦｖ。「［Ａｇ］」＝ＨＥＲ２−Ｆｃキメラタンパク質（抗原）濃度。Ｙ軸は、結合割合を示し、その結合割合は、ＭＦＩ／（ＭＦＩｍａｘ−ＭＦＩｍｉｎ）として計算され、標準化され、パーセンテージとして表される。計算されたｋＤは、各力価測定曲線について示されている。
【図１１】図１１は、ディスプレイされたｓｃＦｖのＤ１．３および変異体Ｍ３（それぞれ、鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ）を認識する）についての用量反応曲線を示す１組の線グラフである。Ｍ３は、Ｄ１．３より２倍高い、鶏卵リゾチームに対する親和性を有する。ディスプレイされたポリペプチドは、Ｓａｇ１ｐ融合ポリペプチド（「ｐｒｅＡ１ Ｄ１．３ 対 Ｍ３」と表示された線グラフ）およびＡｇａ２ｐ融合ポリペプチド（「ｐｒｅＡ２ Ｄ１．３ 対 Ｍ３」と表示された線グラフ）として発現した。Ｄ１．３またはＭ３をディスプレイする細胞を、様々な濃度のビオチン化鶏卵リゾチーム（ｎＭでの濃度を示すＸ軸）とインキュベートした。計算されたｋＤは各力価測定曲線に示されている。
【図１２】図１２は、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを形質転換するために用いられる複製型ベクターの概略図である。複製型ベクターを、ｐＰＯＸ２プロモーターによって駆動されるｓｃＦｖ−ＡＧＡ２発現カセット、および複製増殖のためのＡＲＳ１８を含有するように構築した。
【図１３】図１３は、ゼータに基づいた組込み型プラスミド（図１３Ａ）または複製型プラスミド（図１３Ｂ）で形質転換されたＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞におけるｓｃＦｖ−ＡＧＡ２の細胞表面発現を示す１組のヒストグラムである。複製型プラスミドについてのデータは、１０個のクローンの平均を表す。複製型ベクターで形質転換された細胞を、非選択条件下および選択条件下で増殖させた。（「ＦＬ２−Ｈ」と表示された）Ｘ軸は、フィコエリトリン連結型二次抗体を用いてチャネル２において記録されたｃ−ｍｙｃ蛍光シグナルを示す。（「カウント」と表示された）Ｙ軸は、細胞の数を示す。
【図１４Ａ】図１４は、単一のｃ−Ｍｙｃタグ付き完全長トラスツズマブ（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）ＩｇＧの表面発現を示す、一連の１次元ＦＦＣヒストグラムである。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｇａ２ｐへのＮ末端融合としてのＩｇＧ重鎖（「Ａ２」と表示された行におけるヒストグラム）、およびＡｇａ２ｐへのＣ末端融合としてのＩｇＧ重鎖（「Ａ４」と表示された行におけるヒストグラム）のディスプレイを可能にする、合計２個のディスプレイプラスミドを作製した。ＩｇＧ軽鎖は、可溶性断片として発現した。重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）の発現を検出した。蛍光を、実施例１に記載されているように検出した。図１４Ａは、ｃ−ｍｙｃおよびＶ５の発現を示すドットブロットである。明らかに、全ての細胞が、ＡＧＡ２へのＮ末端融合およびＣ末端融合の両方について、完全長重鎖および軽鎖の発現を同時に示している。非標識細胞は、そのエピトープタグの検出を示していない。図１４Ｂ：網掛けヒストグラムは、両方の融合についてのｃ−ｍｙｃおよびＶ５の発現を示す。ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ Ｆａｂディスプレイについて観察されたことと類似して、重鎖がＡＧＡ２アンカーのＣ末端に融合している細胞について、Ｎ末端融合と比較して、ディスプレイ効率の劇的な向上を（点線によって示されているように）観察することができる。図１４Ｃは、発現したＨＣおよびＬＣの概略図を示す。
【図１４Ｂ】図１４は、単一のｃ−Ｍｙｃタグ付き完全長トラスツズマブ（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）ＩｇＧの表面発現を示す、一連の１次元ＦＦＣヒストグラムである。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｇａ２ｐへのＮ末端融合としてのＩｇＧ重鎖（「Ａ２」と表示された行におけるヒストグラム）、およびＡｇａ２ｐへのＣ末端融合としてのＩｇＧ重鎖（「Ａ４」と表示された行におけるヒストグラム）のディスプレイを可能にする、合計２個のディスプレイプラスミドを作製した。ＩｇＧ軽鎖は、可溶性断片として発現した。重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）の発現を検出した。蛍光を、実施例１に記載されているように検出した。図１４Ａは、ｃ−ｍｙｃおよびＶ５の発現を示すドットブロットである。明らかに、全ての細胞が、ＡＧＡ２へのＮ末端融合およびＣ末端融合の両方について、完全長重鎖および軽鎖の発現を同時に示している。非標識細胞は、そのエピトープタグの検出を示していない。図１４Ｂ：網掛けヒストグラムは、両方の融合についてのｃ−ｍｙｃおよびＶ５の発現を示す。ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ Ｆａｂディスプレイについて観察されたことと類似して、重鎖がＡＧＡ２アンカーのＣ末端に融合している細胞について、Ｎ末端融合と比較して、ディスプレイ効率の劇的な向上を（点線によって示されているように）観察することができる。図１４Ｃは、発現したＨＣおよびＬＣの概略図を示す。
【図１４Ｃ】図１４は、単一のｃ−Ｍｙｃタグ付き完全長トラスツズマブ（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）ＩｇＧの表面発現を示す、一連の１次元ＦＦＣヒストグラムである。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｇａ２ｐへのＮ末端融合としてのＩｇＧ重鎖（「Ａ２」と表示された行におけるヒストグラム）、およびＡｇａ２ｐへのＣ末端融合としてのＩｇＧ重鎖（「Ａ４」と表示された行におけるヒストグラム）のディスプレイを可能にする、合計２個のディスプレイプラスミドを作製した。ＩｇＧ軽鎖は、可溶性断片として発現した。重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）の発現を検出した。蛍光を、実施例１に記載されているように検出した。図１４Ａは、ｃ−ｍｙｃおよびＶ５の発現を示すドットブロットである。明らかに、全ての細胞が、ＡＧＡ２へのＮ末端融合およびＣ末端融合の両方について、完全長重鎖および軽鎖の発現を同時に示している。非標識細胞は、そのエピトープタグの検出を示していない。図１４Ｂ：網掛けヒストグラムは、両方の融合についてのｃ−ｍｙｃおよびＶ５の発現を示す。ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ Ｆａｂディスプレイについて観察されたことと類似して、重鎖がＡＧＡ２アンカーのＣ末端に融合している細胞について、Ｎ末端融合と比較して、ディスプレイ効率の劇的な向上を（点線によって示されているように）観察することができる。図１４Ｃは、発現したＨＣおよびＬＣの概略図を示す。
【図１５】図１５は、ｓｃＦｖ親和性成熟スクリーニングから単離されたクローンのうちの２個（クローン１３およびクローン３８）についての用量反応曲線を示す線グラフである。Ｋｄを、平衡力価測定曲線から決定し、野生型Ｄ１．３のＫｄと比較した。Ｋｄ値は、クローン１３およびクローン３８について、それぞれ、２．２ｎＭおよび１．８ｎＭであることが決定された。これは、野生型Ｋｄ（４．０ｎＭ）と比較して、それぞれ、１．８倍および２．４倍の向上を表し、Ｍ３変異体についてと同じ範囲内にある。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
特定の実施形態の説明
酵母細胞の表面上にポリペプチド（例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片）をディスプレイするのに用いる方法および組成物が本明細書に提供される。本明細書に開示された様々な方法および組成物と共に用いることができる例示的な酵母として、Ｙａｒｒｏｗｉａ属の酵母、例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｙｌ）が挙げられる。
【００２４】
抗体ポリペプチドおよび抗体ポリペプチド断片
様々な抗体ポリペプチドまたはその断片のいずれもを、本明細書に記載された方法および組成物に従って、酵母細胞の表面上に発現させることができる。
【００２５】
「抗体ポリペプチド」とは、その用語が本明細書で用いられる場合、免疫グロブリン重鎖ポリペプチドおよび／または免疫グロブリン軽鎖ポリペプチド、またはそれらに由来するポリペプチドを指す。当技術分野において知られているように、野生型ＩｇＧ抗体は、一般的に、２つの同一の重鎖ポリペプチドおよび２つの同一の軽鎖ポリペプチドを含む。所定の抗体は、α、δ、ε、γ、およびμ（それらの分類は、重鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいている）と呼ばれる５つの型の重鎖のうちの１つを含む。ヒトにおいては、α定常領域の２つのサブタイプおよびγ定常領域の４つのサブタイプがある。これらの異なる型の重鎖が、それぞれ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２のサブクラスを含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４のサブクラスを含む）、およびＩｇＭという５つのクラスの抗体を生じる。所定の抗体はまた、κまたはλ（それらの分類は、軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列に基づいている）と呼ばれる２つの型の軽鎖のうちの１つを含む。特定の実施形態において、本明細書に開示された方法は、酵母、例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ株の細胞表面上に抗体ポリペプチドの発現をもたらす。特定の実施形態において、完全長重鎖、完全長軽鎖、または両方が酵母において発現する。特定の実施形態において、完全長重鎖の断片、完全長軽鎖の断片、またはその両方が酵母において発現する。
【００２６】
「抗体断片」または「抗体ポリペプチド断片」とは、その用語が本明細書で用いられる場合、上記で定義されているような完全長抗体ポリペプチドを含まないが、依然として完全長抗体ポリペプチドの少なくとも一部を含む、抗体ポリペプチド分子に由来するポリペプチドを指す。抗体ポリペプチド断片は、完全長抗体ポリペプチドの切断された部分を含むポリペプチドを含むことが多いが、その用語は、そのような切断された断片に限定されない。本明細書で用いられる場合、抗体ポリペプチド断片は、抗体ポリペプチド（例えば、重鎖抗体ポリペプチドまたは軽鎖抗体ポリペプチド）に由来する単一のポリペプチド鎖を含む断片を包含するので、抗体ポリペプチド断片がそれ自体では抗原を結合しない場合があることは理解されているであろう。例えば、抗体ポリペプチド断片は、Ｆａｂ断片に含有される、重鎖抗体ポリペプチドの部分を含んでもよい；そのような抗体ポリペプチド断片は、典型的には、それが軽鎖抗体ポリペプチドに由来する別の抗体ポリペプチド断片（例えば、Ｆａｂ断片に含有される、軽鎖抗体ポリペプチドの部分）と会合して、抗原結合部位が再構成されない限り、抗原を結合しないであろう。抗体ポリペプチド断片には、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、直鎖抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、および多重特異性抗体（例えば、ダイアボディ、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ））などの多重特異性抗体断片、ミニボディ、キレート組換え抗体、トリボディ（ｔｒｉｂｏｄｙ）またはバイボディ（ｂｉｂｏｄｙ）、イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、小モジュール免疫薬剤（ＳＭＩＰ）、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化抗体、およびＶＨＨ含有抗体を挙げることができる。「抗体断片」または「抗体ポリペプチド断片」は、「抗原結合性抗体断片」および「抗原結合性抗体ポリペプチド断片」を含むことは認識されているであろう。例えば、米国特許第７，４２２，８９０号、第７，４２２，７４２号、および第７，３９０，８８４号（それぞれ、全体として参照により本明細書に組み入れられている）を参照されたい。
【００２７】
「ヒト化抗体ポリペプチド」とは、その用語が本明細書で用いられる場合、可変領域における重鎖ポリペプチドおよび／または軽鎖ポリペプチドの非ヒト（例えば、マウス、ラット、またはハムスター）相補性決定領域（ＣＤＲ）と１つまたは複数のヒト可変領域（軽鎖および／または重鎖）フレームワーク領域、ならびにヒト重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域を含むように操作された抗体ポリペプチドを指す。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域を除いて、完全にヒトである配列を含む。ヒト化抗体は、典型的には、非ヒト化抗体と比べて、ヒトに対する免疫原性が低く、したがって、治療的適用においていくらかの利益をもたらす。当業者はヒト化抗体を知っているであろうし、ヒト化抗体ポリペプチドを作製するための適切な技術もまた知っているであろう。例えば、米国特許第７，４４２，７７２号、第７，４３１，９２７号、第６，８７２，３９２号、および第５，５８５，０８９号（それぞれ、全体として参照により本明細書に組み入れられている）を参照されたい。
【００２８】
「キメラ抗体ポリペプチド」とは、その用語が本明細書で用いられる場合、少なくとも１つのヒト定常領域を含むように操作された抗体ポリペプチドを指す。重鎖および／または軽鎖は、ヒト定常領域を有し得る。キメラ抗体は、典型的には、非キメラ抗体と比べて、ヒトに対する免疫原性が低く、したがって、治療的適用においていくらかの利益をもたらす。当業者はキメラ抗体を知っているであろうし、キメラ抗体ポリペプチドを作製するための適切な技術もまた知っているであろう。例えば、米国特許第７，４４２，７７２号、第７，４３１，９２７号、第６，８７２，３９２号、および第５，５８５，０８９号（それぞれ、全体として参照により本明細書に組み入れられている）を参照されたい。
【００２９】
特定の実施形態において、発現した抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片は、ヒト抗体ポリペプチドまたは断片である。特定の実施形態において、発現した抗体ポリペプチドまたはその断片は、非ヒト抗体ポリペプチドまたはその断片、例えば、マウスまたはラットの抗体ポリペプチドまたはその断片である。特定の実施形態において、発現した抗体ポリペプチドまたはその断片は、それがヒト重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域を含有する点においてキメラである。特定の実施形態において、発現した抗体ポリペプチドまたはその断片は、それが可変領域において、重鎖および／または軽鎖の非ヒト（例えば、マウス、ラット、またはハムスター）相補性決定領域（ＣＤＲ）と共に、１つまたは複数のヒトフレームワーク領域を含有する点においてヒト化されている。
【００３０】
特定の実施形態において、酵母細胞の表面上に発現する抗体ポリペプチドは、抗体の重鎖ポリペプチドを含む。特定の実施形態において、重鎖ポリペプチドの断片、例えば、Ｆａｂ断片内（例えば、ＶＨ−ＣＨ１）、Ｆｖ断片内、またはｓｃＦｖ断片内に含有される重鎖ポリペプチドの部分が、酵母細胞の表面上に発現する。特定の実施形態において、酵母細胞の表面上に発現する抗体ポリペプチドは、重鎖定常領域の全部または一部、例えば、Ｆｃ領域、ヒンジ領域などを含む。特定の実施形態において、酵母細胞の表面上に発現する抗体ポリペプチドは、重鎖定常領域を欠く。特定の実施形態において、酵母細胞の表面上に発現する抗体ポリペプチドは、重鎖定常領域の一部、例えば、Ｆｃ領域を欠く。
【００３１】
特定の実施形態において、酵母細胞の表面上に発現する抗体ポリペプチドは、抗体の軽鎖ポリペプチドを含む。特定の実施形態において、軽鎖ポリペプチドの断片、例えば、Ｆｖ断片またはｓｃＦｖ断片が、酵母細胞の表面上に発現する。特定の実施形態において、酵母細胞の表面上に発現する抗体ポリペプチドは、軽鎖定常領域を含む。特定の実施形態において、酵母細胞の表面上に発現する抗体ポリペプチドは、軽鎖定常領域を欠く。
【００３２】
特定の実施形態において、抗体ポリペプチド断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、直鎖抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、もしくは多重特異性抗体（例えば、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ）などの多重特異性抗体断片、ミニボディ、キレート組換え抗体、トリボディもしくはバイボディ、イントラボディ、ナノボディ、小モジュール免疫薬剤（ＳＭＩＰ）、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化抗体、またはＶＨＨ含有抗体の部分であるアミノ酸鎖を含むポリペプチドである。特定の実施形態において、抗体ポリペプチド断片は、ｓｃＦｖ断片である。
【００３３】
特定の実施形態において、重鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片と軽鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片の両方が、酵母細胞の表面上に発現する。例えば、完全な重鎖抗体ポリペプチドおよび完全な軽鎖抗体ポリペプチドが、本明細書に記載された酵母（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のいずれかにおいて発現してもよい。別の例として、Ｆａｂ断片内、Ｆｖ断片内、またはｓｃＦｖ断片内に含まれる重鎖抗体ポリペプチドの部分が、Ｆａｂ断片内、Ｆｖ断片内、またはｓｃＦｖ断片内に含まれる軽鎖抗体ポリペプチドの部分と共に酵母において発現してもよい。当業者によって理解されているように、重鎖抗体ポリペプチドおよび軽鎖抗体ポリペプチド（またはそれらの抗体ポリペプチド断片）が酵母細胞の表面上に発現する場合、そのような抗体ポリペプチドまたは断片は、機能しうる抗原結合性分子を再構成するようにお互いに会合することができる。
【００３４】
特定の実施形態において、重鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片は、第１の接合型の第１の一倍体酵母細胞の表面上に発現し、軽鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片は、第２の接合型の第２の一倍体酵母細胞の表面上に発現し、第１の一倍体酵母細胞と第２の一倍体酵母細胞が接合して、二倍体酵母細胞を生じる。逆に、軽鎖抗体ポリペプチドまたはその断片は、第１の接合型の第１の一倍体酵母細胞の表面上に発現し、重鎖抗体ポリペプチドまたはその断片は、第２の接合型の第２の一倍体酵母細胞の表面上に発現し、第１の一倍体酵母細胞と第２の一倍体酵母細胞が接合して、二倍体酵母細胞を生じる。そのような接合の結果として生成されたそのような二倍体酵母細胞は、重鎖抗体ポリペプチドおよび軽鎖抗体ポリペプチド（またはそれらの抗体ポリペプチド断片）を発現するであろう。酵母接合型は当技術分野において知られている。例えば、一倍体の形をとる場合、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、２つの接合型：ＭＡＴＡおよびＭＡＴＢのうちの１つとして存在する。さらに、ＭＡＴＡ接合型Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞を、ＭＡＴＢ接合型へと操作することができる。一倍体ＭＡＴＡ酵母細胞およびＭＡＴＢ酵母細胞は、お互いに接合して、二倍体酵母細胞を形成することができる。当業者は、接合することができる酵母種を知っているであろうし、適切な接合型も知っているであろう。
【００３５】
特定の実施形態において、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を発現する一倍体酵母細胞は、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードする核酸配列を含むベクターまたは発現カセット（「発現カセットおよびベクター」と題するセクションを参照）で一倍体酵母細胞を形質転換することによって作製することができる。あるいは、抗体ポリペプチドまたはその断片を発現する一倍体酵母細胞は、抗体ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸配列を含むベクターで二倍体酵母細胞を形質転換し、形質転換された二倍体酵母細胞を胞子形成させて、一倍体酵母細胞を生成させることにより、作製することができる。
【００３６】
特定の実施形態において、重鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片と軽鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片の両方は、２つのベクターまたは発現カセット：重鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードする核酸配列を含む第１のベクターまたは発現カセット、および軽鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードする核酸配列を含む第２のベクターまたは発現カセットで一倍体酵母細胞を形質転換することによって酵母細胞の表面上に発現する。特定の実施形態において、重鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片と軽鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片の両方は、単一のベクターで一倍体酵母細胞を形質転換することによって酵母細胞の表面上に発現し、そのベクターは、重鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片および軽鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードする核酸配列を含む発現カセットを含む。そのような酵母細胞は一倍体かまたは二倍体のいずれでもあり得る。
【００３７】
特定の実施形態において、酵母細胞の表面上に発現する重鎖抗体ポリペプチドもしくは抗体ポリペプチド断片および／または軽鎖抗体ポリペプチドもしくは抗体ポリペプチド断片は、アンカーポリペプチド（下記の「アンカーポリペプチド」と題するセクションを参照）を含む融合ポリペプチドである。抗体ポリペプチドまたは断片をそれの重鎖抗体ポリペプチドまたは断片を介してアンカリングすることが典型的であるが、軽鎖抗体ポリペプチドまたは断片を介してのアンカリングもまた可能である。例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ｌｉｎら、Ａｐｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌ、２００３、Ａｕｇ；６２（２−３）：２２６−３２を参照されたい。特定の実施形態において、抗体ポリペプチドまたはその断片の重鎖のみがアンカーポリペプチドに融合している。特定の実施形態において、抗体ポリペプチドまたはその断片の軽鎖のみがアンカーポリペプチドに融合している。特定の実施形態において、抗体ポリペプチドまたはその断片の重鎖と抗体ポリペプチドまたはその断片の軽鎖の両方がアンカーポリペプチドに融合している。特定の実施形態において、アンカーポリペプチドは、融合ポリペプチドのアミノ末端で融合している。特定の実施形態において、アンカーポリペプチドは、融合ポリペプチドのカルボキシ末端で融合している。
【００３８】
特定の実施形態において、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片は、本明細書に開示された様々な方法のいずれかによって得られる。そのような抗体ポリペプチドまたはその断片は、細胞の一部として得られてもよい。あるいは、抗体ポリペプチドまたはその断片は、それが発現した後、細胞から精製されてもよい。ポリペプチドを精製するための標準技術を用いてもよい。
【００３９】
目的のポリペプチドを発現する酵母細胞は、当業者に知られた様々な方法のいずれかによって検出およびスクリーニングすることができる。例えば、ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離装置）を用いることができる。ＦＡＣＳにおいて、酵母細胞を、目的のポリペプチドを結合する標識化作用物質（例えば、本開示の抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片によって結合される抗原）と接触させる。検出可能である限り、いずれの標識も用いることができる。適切な標識として、非限定的に、蛍光部分、化学発光部分などが挙げられる。当業者は適切な標識を知っているであろう。特定の実施形態において、作用物質は、間接的標識で標識され、これは、間接的標識に結合する検出可能に標識された作用物質（例えば、蛍光部分または化学発光部分）との結合によって検出することができる。様々な間接的標識が当技術分野において知られており、それらには、ビオチン（アビジンまたはストレプトアビジンによって結合され得る）、エピトープタグ（例えば、本明細書に記載されたエピトープタグのいずれか）などが挙げられるが、それらに限定されない。エピトープタグは、特定のエピトープタグに特異的な標識抗体またはその断片を用いて検出することができる。あるいは、エピトープタグは、特定のエピトープタグに特異的な第１の抗体またはその断片と結合させ、標識された第２の抗体またはその断片で第１の抗体または断片を検出することによって検出することができる。その後、酵母細胞を細胞ソーターに通して、細胞を分離し、標識化作用物質が各個々の細胞と会合しているか否かを決定する。蛍光を示す細胞が、それらの表面上に目的のポリペプチドを発現している。あるいは、目的の抗体ポリペプチドまたは断片に結合する作用物質（例えば、抗原）でコーティングされたプレート上で細胞を「パニング」してもよい。あるいは、目的の抗体ポリペプチドまたは断片に結合する作用物質（例えば、抗原）に連結されている固体支持体（例えば、ビーズ）に細胞を結合させてもよい。その後、固体支持体を（例えば、遠心分離、支持体が常磁性である場合には磁気的取り出しなどにより）単離することができる；固体支持体に結合した任意の細胞がそれらの表面上に目的のポリペプチドを発現している。当業者は、表面上に目的のポリペプチドを発現する酵母細胞を同定および単離するための他の適切な方法を知っているであろう。例えば、ＹｅｕｎｇおよびＷｉｔｔｒｕｐ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．、Ｍａｒ−Ａｐｒ；１８（２）：２１２−２０、２００２；Ａｃｋｅｒｍａｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．、Ｍａｙ−Ｊｕｎ；２５（３）：７７４−８３、２００９；Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｓｅｐ；３０４（１−２）：３０−４２、２００５；およびＣｈａｏら、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．、１（２）：７５５−６８、２００６（それぞれ、全体として参照により本明細書に組み入れられている）を参照。
【００４０】
当業者は、本明細書に記載された方法および組成物に従って、酵母（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞の表面上に発現させることができる他の抗体ポリペプチドおよび断片を知っているであろう。
【００４１】
アンカーポリペプチド
本明細書に記載された方法および組成物に従って酵母細胞の表面上にポリペプチド（例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片）を発現させるために、様々なアンカーポリペプチドのいずれかを用いることができる。
【００４２】
「アンカーポリペプチド」とは、その用語が本明細書で用いられる場合、細胞の表面に繋ぎ止められているポリペプチドであって、したがって、他のポリペプチド（例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片）を細胞の表面に繋ぎ止めるために用いることができるポリペプチドを指す。例えば、アンカーポリペプチドは、膜貫通タンパク質、または例えば、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）細胞壁タンパク質などの細胞壁タンパク質であってもよい。様々なアンカーポリペプチドが当技術分野において知られており、酵母の表面上にポリペプチドを発現させるための本明細書に開示された組成物および方法に従って用いることができる。そのようなアンカーペプチドには、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｇａ１−Ａｇａ２（接合型Ａ凝集素遺伝子）ヘテロダイマー、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α−凝集素（Ｓａｇ１ｐ）、Ｐｉｒ１ｐ、Ｐｉｒ２ｐ、Ｐｉｒ４ｐ、Ｆｌｏ１ｐ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ＣＷＰＩ、およびその断片が挙げられるが、それらに限定されない（例えば、Ｕｅｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９０：１２５−３６、２０００；Ａｂｅ，Ｈ．、Ｓｈｉｍｍａら、Ｐｉｒ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １３、８７−９５、２００３；Ａｎｄｒｅｓ，Ｉ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８９、６９０−７、２００５；Ｗａｎｇ，Ｑ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６、３５２−７、２００８；Ｔａｎｉｎｏ，Ｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２２、９８９−９３、２００６；Ｙｕｅら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００８ Ｆｅｂ；７２（２）：１１６−２３参照；それぞれ、全体として参照により本明細書に組み入れられている）。
【００４３】
特定の実施形態において、アンカーポリペプチドは、酵母細胞の表面、例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞の表面に、目的のポリペプチド（例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片）を繋ぎ止めるために用いられる。例えば、アンカーポリペプチドと目的のポリペプチドの両方が細胞表面上に発現するように、アンカーポリペプチドは、目的のポリペプチドに融合していてもよい。
【００４４】
特定の実施形態において、目的のポリペプチド（例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片）を発現する酵母細胞は、アンカーポリペプチドをコードする第２の核酸配列にインフレームで融合した、目的のポリペプチドをコードする第１の核酸配列を含むベクターまたは発現カセット（「発現カセットおよびベクター」と題するセクションを参照）で酵母細胞を形質転換することによって作製することができる。特定の実施形態において、第１の核酸配列は、第２の核酸配列の５’に融合しており、その結果、その融合配列から産生される融合ポリペプチドは、Ｎ末端の目的のポリペプチドおよびＣ末端のアンカーポリペプチドを含む。特定の実施形態において、第１の核酸配列は、第２の核酸配列の３’に融合しており、その結果、その融合配列から産生される融合ポリペプチドは、Ｎ末端のアンカーポリペプチドおよびＣ末端の目的のポリペプチドを含む。特定の実施形態において、第１の核酸配列は、第２の核酸配列にインフレームで直接、融合している。特定の実施形態において、第１の核酸配列は、リンカー配列に融合しており、そのリンカー配列が、第２の核酸配列に融合している。「発現カセットおよびベクター」と題するセクションにおいてより詳細に記載されているように、リンカー配列は、典型的には、非限定的に、ＧｌｙＳｅｒリンカーポリペプチド、例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３または（ＧｌｙＳｅｒ）５などのリンカーポリペプチドをコードする。
【００４５】
発現カセットおよびベクター
特定の実施形態において、ポリペプチド（例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片）は、そのポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現カセットで酵母を形質転換することによって、酵母細胞の表面上に発現する。本明細書で用いられる場合、用語「発現カセット」は、（１）目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および（２）目的のポリペプチドの発現を駆動するヌクレオチド配列（例えば、プロモーター）を含む最小限の核酸配列を指す。
【００４６】
特定の実施形態において、発現カセットのヌクレオチド配列によってコードされる目的のポリペプチドは、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を含む。発現カセットは、本明細書に記載された任意の抗体ポリペプチドまたは断片、例えば、抗体ポリペプチド、またはＦａｂ断片、Ｆｖ断片、もしくはｓｃＦｖ断片に由来する断片をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。特定の実施形態において、目的のポリペプチドは、Ｆａｂ断片の重鎖である。特定の実施形態において、目的のポリペプチドは、Ｆａｂ断片の軽鎖である。
【００４７】
特定の実施形態において、発現カセットのヌクレオチド配列によってコードされる目的のポリペプチドは、アンカーポリペプチドを含む。発現カセットは、本明細書に記載された任意のアンカーポリペプチド、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｇａ１−Ａｇａ２ヘテロダイマー、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α−凝集素（Ｓａｇ１ｐ）、Ｐｉｒ１ｐ、Ｐｉｒ２ｐ、Ｐｉｒ４ｐ、Ｆｌｏ１ｐ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ＣＷＰＩ、およびその断片をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。
【００４８】
特定の実施形態において、発現カセットのヌクレオチド配列によってコードされる目的のポリペプチドは、アンカーポリペプチドにインフレームで融合した抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を含む。例えば、発現カセットは、抗体ポリペプチドまたは断片をコードする第１のヌクレオチド配列を含むことができ、その第１のヌクレオチド配列は、アンカーポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列にインフレームで融合している。特定の実施形態において、抗体ポリペプチドまたは断片をコードする第１のヌクレオチド配列は、アンカーポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列の５’にインフレームで融合しており、その結果、そのヌクレオチド配列が発現した場合、抗体ポリペプチドまたは断片は、アンカーポリペプチドのＮ末端側である。特定の実施形態において、抗体ポリペプチドまたは断片をコードする第１のヌクレオチド配列は、アンカーポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列の３’にインフレームで融合しており、その結果、そのヌクレオチド配列が発現した場合、抗体ポリペプチドまたは断片は、アンカーポリペプチドのＣ末端側である。
【００４９】
特定の実施形態において、発現カセットは、介在ヌクレオチド残基がないように、アンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にインフレームで融合している抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含む。そのような実施形態において、発現カセットから発現したポリペプチドは、介在アミノ酸残基なしで、アンカーポリペプチドに直接融合した抗体ポリペプチドまたは断片を含むであろう。特定の実施形態において、発現カセットは、リンカーポリペプチドをコードするリンカー配列にインフレームで融合している抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含み、そのリンカー配列は、アンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にインフレームで融合しており、その結果、リンカー配列は、抗体ポリペプチドまたは断片をコードする第１のヌクレオチド配列と、アンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との間にインフレームで融合している。そのような実施形態において、発現カセットから発現するポリペプチドは、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片、リンカーポリペプチド、およびアンカーポリペプチドを含むであろう。この段落に記載された実施形態のいずれにおいても、抗体ポリペプチドまたは断片をコードするヌクレオチド配列は、アンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’と３’のどちらに融合してもよい。
【００５０】
ここに記載されている組成物および方法に従って、様々なリンカーポリペプチドのいずれを用いてもよい。リンカーポリペプチドは、融合ポリペプチド内に含まれる２つの目的のポリペプチドの間のスペーサーとしての役割を果たす。リンカーポリペプチドは、有利には、２つの目的のポリペプチドの機能に干渉しないか、または最小の程度でのみ干渉する。特定の実施形態において、リンカーポリペプチドは、２つの目的のポリペプチドに有意なコンフォメーションの自由をもたらし、その結果、２つの目的のポリペプチドは、お互いに対して様々な空間的位置および配向をとることができる。リンカーポリペプチドの非限定的例は、ＧｌｙＳｅｒリンカーポリペプチド、例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号１４）または（ＧｌｙＳｅｒ）５（配列番号１５）である。特定の実施形態において、リンカーポリペプチドは、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片の２つの部分の間に位置することができる。例えば、リンカーポリペプチドをコードするリンカー配列は、１）ｓｃＦｖ断片の重鎖可変領域をコードする重鎖核酸配列と、２）ｓｃＦｖ断片の軽鎖可変領域をコードする軽鎖核酸配列との間にインフレームで融合することができる。特定の実施形態において、目的のポリペプチドは、１つより多いリンカー配列を含む。例えば、融合ポリペプチドは、１）ｓｃＦｖ断片の重鎖可変領域ポリペプチドと軽鎖可変領域ポリペプチドとの間に第１のリンカーポリペプチドを含むｓｃＦｖ抗体ポリペプチド断片、２）アンカーポリペプチド、および３）ｓｃＦｖ抗体ポリペプチドとアンカーポリペプチドとの間の第２のリンカーポリペプチドを含むことができる。当業者は、他の適切なリンカーポリペプチドおよびそれらをコードするヌクレオチド配列を知っているであろう。
【００５１】
特定の実施形態において、発現カセットは、リーダーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むリーダー核酸配列を含む。ここに記載されている組成物および方法に従って、様々なリーダーポリペプチドのいずれでも用いることができる。リーダーポリペプチドは、分泌装置を介したポリペプチドのプロセシングを駆動するのを助ける機能を果たし、最終的には、正しくプロセシングされた、表面にディスプレイされるポリペプチドを生じる。リーダー配列は、プロセシング中にポリペプチドから切断され、完全にプロセシングされたポリペプチドの部分をなさない。当業者によって理解されているように、リーダー核酸配列は、典型的には、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’にインフレームで融合しており、その結果、リーダーポリペプチドは、発現した融合ポリペプチドのＮ末端にある。リーダーポリペプチドの非限定的例には、ＬＩＰ２ ｐｒｅ、ＬＩＰ２ ｐｒｅｐｒｏ、ＸＰＲ２ ｐｒｅ、およびＸＰＲ２ ｐｒｅｐｒｏが挙げられる。例えば、Ｐｉｇｎｅｄｅら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、Ｍａｙ；１８２（１０）：２８０２−１０、２０００；Ｄａｖｉｄｏｗら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、Ｏｃｔ；１６９（１０）：４６２１−９、１９８７；およびＭａｄｚａｋら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、Ａｐｒ ８；１０９（１−２）：６３−８１、２００４（それぞれ、全体として参照により本明細書に組み入れられている）を参照。当業者は、他の適切なリーダーポリペプチド、およびそれらをコードするヌクレオチド配列を知っているであろう。
【００５２】
特定の実施形態において、発現カセットは、エピトープタグをコードするヌクレオチド配列を含むエピトープ核酸配列を含む。ここに記載されている組成物および方法に従って、様々なエピトープタグのいずれを用いてもよい。エピトープタグは、典型的には、発現したポリペプチドの検出、測定、定量化、および／または精製（もしくは単離）を容易にする短いポリペプチド配列である。エピトープタグは、所定のポリペプチド内のどこにでも、例えば、Ｎ末端に、Ｃ末端に、または内部に、位置してもよい。エピトープタグの非限定的例には、ｃ−Ｍｙｃ（骨髄球腫症細胞性がん遺伝子）、Ｖ５（サルウイルス５のＰタンパク質およびＶタンパク質のＣ末端配列由来）、ポリヒスチジン（例えば、６−ｈｉｓまたはヘキサヒスチジン）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ストレプトアビジン、ビオチン、赤血球凝集素、Ｆｌａｇ−タグ（ＦＬＡＧオクタペプチド）、およびＥ−タグ［ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ、配列番号１３］が挙げられる。当業者は、他の適切なエピトープタグ、およびそれらをコードするヌクレオチド配列を知っているであろう。
【００５３】
特定の実施形態において、発現カセットはプロモーターを含む。当技術分野において知られているように、プロモーターは、下流のヌクレオチド配列のリボ核酸（ＲＮＡ）への転写を駆動するヌクレオチド配列であり、その転写は、様々な転写因子のいずれかを介して媒介される。特定の実施形態において、転写されたＲＮＡは、目的のポリペプチドをコードする。特定の実施形態において、発現カセットは、（２）アンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含む第２の核酸配列にインフレームで融合した、（１）抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列を含む融合配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。
【００５４】
有利なプロモーターは、典型的には目的の細胞において機能するものである。例えば、酵母、例えば、非限定的にＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ種において機能するいくつかのプロモーターが知られている。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいて機能するプロモーターは、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするＲＮＡの発現を駆動するために用いられる。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいて機能するプロモーターは、アンカーポリペプチドをコードするＲＮＡの発現を駆動するために用いられる。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいて機能するプロモーターは、アンカーポリペプチドに融合した抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするＲＮＡの発現を駆動するために用いられる。
【００５５】
酵母細胞の表面上に目的のポリペプチドを発現させるために、ここに記載されている組成物および方法に従って、様々なプロモーターのいずれでも用いることができる。特定の実施形態において、ポリペプチド（例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片）を発現させるために用いられるプロモーターは構成的である。いくつかの構成的プロモーターが当技術分野において知られており、それらには、非限定的に、ＴＥＦ１プロモーターおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターが挙げられる。特定の実施形態において、ポリペプチド（例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片）を発現させるために用いられるプロモーターは誘導性である。誘導性プロモーターは、実施者が、目的のポリペプチドがいつ発現するかを制御したい場合、有用である。いくつかの誘導性プロモーターが当技術分野において知られており、それらには、非限定的に、ＰＯＸ３プロモーターおよびＬＩＰ２プロモーターが挙げられる。特定の実施形態において、ポリペプチド（例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片）を発現させるために用いられるプロモーターは半構成的（ｓｅｍｉ−ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）である。「半構成的プロモーター」とは、その用語が本明細書に用いられる場合、完全に構成的というわけではないプロモーターであって、特定の遺伝子の発現を、主として特定の条件下で、または特定の条件下でのみ、駆動するプロモーターを指す。例えば、半構成的プロモーターは、増殖相依存性様式で遺伝子発現を駆動する場合がある。いくつかの半構成的プロモーターが当技術分野において知られており、それらには、非限定的に、ｈｐ４ｄプロモーターが挙げられる。当業者は、目的の細胞、例えば、非限定的にＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ種において機能する、適切な構成的、誘導性、および半構成的プロモーターを知っているであろう。
【００５６】
特定の実施形態において、ポリペプチド（例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片）は、発現カセット、例えば、本明細書に記載された発現カセットのいずれかを含むベクターで酵母を形質転換することによって、酵母細胞の表面上に発現する。「ベクター」とは、その用語が本明細書で用いられる場合、発現カセットを含み、さらに１つまたは複数の追加のエレメントを含む核酸を指す。特定の実施形態において、ベクターは、選択条件下で、ベクターの複製、相同もしくは非相同組込み、および／または維持を促進するエレメントを含む。
【００５７】
酵母細胞の表面上に目的のポリペプチドを発現させるために、ここに記載されている組成物および方法に従って、様々なベクターのいずれでも用いることができる。用いることができるベクターの非限定的例には、全体として参照により本明細書に組み入れられた、米国特許公開第２００８−０１７１３５９号に開示されたものが挙げられる。当業者は、目的の所定の細胞（例えば、酵母細胞）に用いる他の適切なベクターを知っているであろう。さらに、酵母細胞の表面上に目的のポリペプチドを発現させることに用いるために、様々なベクターのいずれでも改変することができる。例えば、市販のベクターまたは他のベクターが所定の酵母種において用いるのに適している場合があるが、そのようなベクターは、（２）アンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含む第２の核酸配列にインフレームで融合した、（１）抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列を含む融合配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含まない場合がある。そのようなベクターは、プロモーター、ならびに抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片およびアンカーポリペプチドをコードする核酸配列を含むように改変されてもよい。いくつかの分子技術がベクターを改変するのに適しており、それらの多くは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．、およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９（その内容は全体として参照により本明細書に組み入れられている）に見出すことができる。当業者は、酵母（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞の表面上に目的のポリペプチドを発現するのに用いるためにベクターを改変する様々な他の適切な分子技術を知っているであろう。
【００５８】
特定の実施形態において、ベクターは、選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を含む。「選択マーカー」とは、その用語が本明細書で用いられる場合、選択マーカーを欠く細胞が生存および／または増殖することができない条件下で、選択マーカーを含有する細胞が生存および／または増殖することを可能にするポリペプチドを指す。選択マーカーの用語および概念は、当業者にとって周知である。選択マーカーの非限定的例には、ロイシン（例えば、ＬＥＵ２）、ウラシル（例えば、ＵＲＡ３ｄ１）、アデニン（例えば、ＡＤＥ２）、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、グリセロール利用（Ｇｕｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ｐ）、およびハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｈ）についてのマーカーが挙げられる。当業者は、本明細書に開示された組成物および方法に従って用いることができる他の適切なマーカーを知っているであろう。
【００５９】
特定の実施形態において、ベクターは、細胞（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ細胞）のゲノムへ組み込まれる。ベクターを細胞のゲノムへ組み込むための様々な技術は、当技術分野において知られている。特定の実施形態において、ベクターはゼータエレメントを含む。ゼータエレメントは、Ｙｌｔ１レトロトランスポゾンを有するＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株のゲノムへの相同組換えにより、またはＹｌｔ１レトロトランスポゾンを欠く酵母における非相同組換えにより、ベクターが組み込まれるのを可能にする配列である。特定の実施形態において、ゼータエレメントは、非限定的にＹｌｔ１またはＴｙｌ６レトロトランスポゾンなどの、レトロトランスポゾンの長い末端反復を含む。当業者は、他のエレメントを知っているであろうし、本明細書に開示された組成物および方法に従って、それらをベクターにおいて用いることができるであろう。
【００６０】
特定の実施形態において、ベクターは、細胞のゲノムへ組み込まれない。例えば、複製型ベクターを、酵母細胞へ、例えば、形質転換により、導入してもよい。複製型ベクターは、宿主細胞における維持、複製、および／または他の機能のための適切なエレメントを含有する。例えば、ベクターは、１つまたは複数の常染色体複製エレメントを含有してもよい。そのような常染色体複製エレメントの非限定的例には、セントロメア（ＣＥＮ）および複製起点（ＯＲＩ）が挙げられる。特定の実施形態において、セントロメアは、ＣＥＮ１またはＣＥＮ３を含む（全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ｖｅｒｎｉｓ，Ｌ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７、１９９５−２００４、２００７）。特定の実施形態において、複製起点は、ＯＲＩ１０６８またはＯＲＩ３０１８を含む（全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ｆｏｕｒｎｉｅｒら、Ｙｅａｓｔ、Ｊａｎ；７（１）：２５−３６、１９９１）。特定の実施形態において、細胞のゲノムへ組み込まれないベクターは、自律複製配列（ＡＲＳ）を含有してもよい。例えば、Ｆｏｕｒｎｉｅｒら、Ｙｅａｓｔ ７、２５−３６、１９９１およびＭａｔｓｕｏｋａら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３７、３２７−３３３、１９９３（それぞれ、全体として参照により本明細書に組み入れられている）を参照。特定の実施形態において、ＡＲＳは、セントロメアおよび複製起点を含む。ＡＲＳの非限定的例には、ＡＲＳ１８およびＡＲＳ１８が挙げられる。
【００６１】
特定の実施形態において、発現カセットは、アンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むアンカー核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含み、アンカー核酸配列は、目的の第２の融合パートナーを含む融合タンパク質における第１の融合パートナーとして発現することができる。そのような特定の実施形態において、発現カセットは、目的の第２の融合パートナーをコードするヌクレオチド配列を含む別の核酸配列を含む。目的の第２の融合パートナーは、様々なポリペプチドのいずれかであり得る。例えば、目的の第２の融合パートナーは、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片であってもよいが、第２の融合パートナーはそのような抗体ポリペプチドまたは断片に限定されない。第２の融合パートナーはアンカーポリペプチドに融合しているので、第２の融合パートナーもまた細胞の表面上に発現するであろう。特定の実施形態において、この段落で具体化された発現カセットは、目的の第２の融合パートナーの融合を容易にするために制限部位を含む核酸配列を含む。様々な制限部位のいずれでも発現カセットに含むことができる。当業者は、適切な制限部位を知っているであろうし、それらを含む発現カセットを操作することができるであろう。
【００６２】
特定の実施形態において、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、そのポリペプチドが発現する生物体（例えば、酵母細胞）において用いるためにコドン最適化されている。コドン最適化は、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が改変されるプロセスであり、ここで、そのヌクレオチド配列は、特定の生物体における発現のために最適化されるが、そのポリペプチドのアミノ酸配列は同じままである。コドンは、細胞により所定のアミノ酸へ翻訳される、３ヌクレオチド配列である。２０個の天然にコードされたアミノ酸があるが、３ヌクレオチド配列の６４個の可能な組み合わせがあるので、たいていのアミノ酸は、複数のコドンによってコードされている。所定の種において、特定のコドンが同じアミノ酸をコードする他のコドンよりも良好に翻訳される場合が多く、種ごとにそのコドン優先度が異なる。そのため、１つの種由来の遺伝子は、別の種へ導入された場合、あまり発現しない場合がある。この問題を克服する１つの方法は、遺伝暗号の縮重を利用し、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を改変して、そのヌクレオチド配列が目的の種において効率的に用いられるコドンを含有するが、なお同じポリペプチドをコードするようにすることである。どのコドンが、目的の生物体において最も広く用いられているかを決定することは可能である。実際、これは、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含む様々な生物体についてすでに行われている。２，９４５，９１９個のコドンに基づいたＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａについてのサンプルのコドン最適化チャートは、下記の表１に示されている。当業者は、他の生物体についてのコドン出現頻度を知っているであろうし、それを決定することができるであろう。
【００６３】
【表１】
説明：表欄は、［トリプレット］［頻度：千個あたり］（［数］）として示されている。データは、５，９６７個のコード配列に存在する２，９４５，９１９個のコドンから導き出された。表の内容は、ＵＲＬ ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｈｏｗｃｏｄｏｎ．ｃｇｉ？ｓｐｅｃｉｅｓ＝２８４５９１に見出されるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅから入手された。
【００６４】
特定の実施形態において、下記に示された配列番号１〜１２のＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａコドン最適化核酸配列のうちの１つまたは複数を含むベクターまたは発現カセットで、発現のためにＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを形質転換することができる。下記のコドン最適化核酸配列のそれぞれの中における関連するコード配列は、太字で、下線を引かれたテキストによって示されている。
【００６５】
配列番号１：合成Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａコドン最適化Ｃ末端Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＡＧ１ｐ（３２０個のＣ末端アミノ酸）（側面にＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ）
【００６６】
【数１】
【００６７】
【数２】
配列番号２：合成Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａコドン最適化Ｃ末端Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＧＡ２ｐ（側面にＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ）
【００６８】
【数３】
配列番号３：合成Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａコドン最適化Ｃ末端Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＣＷＰＩ（側面にＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ）
【００６９】
【数４】
配列番号４：合成Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａコドン最適化Ｎ末端Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＡＧＡ２（側面にＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ）
【００７０】
【数５】
【００７１】
【数６】
配列番号５：合成Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａコドン最適化Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ｓｃＦｖ（側面にＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ）
【００７２】
【数７】
配列番号６：合成Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａコドン最適化４−４−２０ ｓｃＦｖ（側面にＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ）
【００７３】
【数８】
配列番号７：合成Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａコドン最適化抗ＨＥＬ Ｄ１．３ ｓｃＦｖ（側面にＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ）
【００７４】
【数９】
【００７５】
【数１０】
配列番号８：合成Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａコドン最適化抗ＨＥＬ Ｍ３ ｓｃＦｖ（側面にＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ）
【００７６】
【数１１】
配列番号９：合成Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａコドン最適化４−４−２０ Ｆａｂ重鎖（側面にＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ）
【００７７】
【数１２】
配列番号１０：合成Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａコドン最適化４−４−２０ Ｆａｂ軽鎖（側面にＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ）
【００７８】
【数１３】
【００７９】
【数１４】
配列番号１１：合成Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａコドン最適化Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ Ｆａｂ重鎖（側面にＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ）
【００８０】
【数１５】
配列番号１２：合成Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａコドン最適化Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ Ｆａｂ軽鎖（側面にＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ）
【００８１】
【数１６】
酵母
様々な酵母のいずれも、本明細書に記載された方法および組成物に従って用いることができる。酵母は、真菌の真核生物の微生物である。酵母は主として、単細胞の形で存在するが、いくつかの種、例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ種は、二相性であり、すなわち、それらは、単細胞または菌糸の形でも存在することができる。さらに、いくつかの種は、「偽性菌糸」として知られた、一続きの連結した出芽細胞の形成を通して多細胞になる。
【００８２】
いくつかの酵母は、当業者に知られている。ここに開示されている組成物および方法に従って用いることができる例示的な酵母には、以下が挙げられるが、それらに限定されない：
【００８３】
【数１７】
当業者は、ここに開示されている組成物および方法に従って用いることができる他の適切な酵母を知っているであろう。
【００８４】
特定の実施形態において、本明細書に開示された抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をディスプレイするための組成物および方法に従って用いられる酵母種は、Ｙａｒｒｏｗｉａ属の酵母である。例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片、例えば、本明細書に記載された抗体ポリペプチドまたは断片のいずれかを、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ酵母細胞の表面上にディスプレイしてもよい。
【００８５】
Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは、好気条件下で、炭化水素を同化し、ｎ−アルカン、植物油、またはグルコースからクエン酸を生成することが知られている、半子嚢菌の酵母の商業的に有用な種である。例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは、パーム油工場廃水、ＴＮＴ、ならびにアルカン、脂肪酸、脂肪、および油などの他の炭化水素を分解することが知られている。Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは、ほとんどの他の酵母種と遠縁であり、糸状真菌といくつかの共通した性質を共有する。Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは、一倍体相と二倍体相とを交互にとるという点において単複世代交代型（ｈａｐｌｏ−ｄｉｐｌｏｎｔｉｃ）の周期を有する。
【００８６】
特定の実施形態において、酵母細胞は、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターまたは発現カセットで形質転換される。様々な酵母形質転換方法のいずれも、本明細書に開示された組成物および方法に従って用いてもよい。形質転換方法の非限定的例には、熱ショック、エレクトロポレーション、および酢酸リチウム媒介型形質転換が挙げられる。当業者は、酵母を形質転換するのに適した酵母形質転換方法を知っているであろう。
【００８７】
増殖条件
特定の実施形態において、酵母細胞（例えば、本明細書に記載された酵母細胞のいずれか）を、培養で増殖または成長させる。例えば、本明細書で「発現カセットまたはベクター」と題するセクションにおいて記載されているような１つまたは複数の発現カセットまたはベクターで形質転換された酵母細胞を、培養で増殖または成長させてもよい。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ属の酵母、例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを培養で増殖または成長させる。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件下で培養する。本明細書で用いられる場合、用語「Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件」とは、そのＹａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件下で増殖していないＹａｒｒｏｗｉａ細胞と比較して、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞がその表面上のポリペプチド（例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片）のディスプレイの向上を示す、増殖条件または培養条件を指す。例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件下で増殖したＹａｒｒｏｗｉａ細胞は、表面上のポリペプチドのレベルの増加、発現したポリペプチドの安定性、コンフォメーション、もしくは機能の向上、またはポリペプチドの発現が維持する時間の長さの増加を示し得る。
【００８８】
特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件は、低い誘導温度を含む。例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を発現するためのベクターまたは発現カセットを含むＹａｒｒｏｗｉａ細胞を、その細胞培養の一期間または全期間、低い誘導温度で増殖させてもよい。下記の実施例３に記載されているように、フォールディングストレスは、一般的に、低い培養温度で減少する。したがって、フォールディングストレスおよび他の有害なプロセスは、そのようなＹａｒｒｏｗｉａ細胞を低い誘導温度で増殖させることによって、減少または排除される可能性がある。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を、摂氏約１５度から約２５度の範囲、例えば、摂氏約１５度から約２４度、摂氏約１５度から約２３度、摂氏約１５度から約２２度、摂氏約１５度から約２１度、摂氏約１５度から約２０度、摂氏約１６度から約２５度、摂氏約１７度から約２５度、摂氏約１８度から約２５度、摂氏約１９度から約２５度、摂氏約２０度から約２５度、およびその間にある任意の範囲の誘導温度で増殖させる。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を、摂氏約１５度、摂氏約１６度、摂氏約１７度、摂氏約１８度、摂氏約１９度、摂氏約２０度、摂氏約２１度、摂氏約２２度、摂氏約２３度、摂氏約２４度、または摂氏約２５度の誘導温度で増殖させる。「約」とは、その用語が温度に関して本明細書で用いられる場合、所定の温度の値付近の範囲を指す。一般的に、所定の温度の値に関して用いられる場合、用語「約」とは、その値の＋／−１０％内、例えば、その値の＋／−９％内、その値の＋／−８％内、その値の＋／−７％内、その値の＋／−６％内、その値の５％内、その値の＋／−４％内、その値の＋／−３％内、その値の＋／−２％内、その値の＋／−１％内、またはその値の＋／−１％以下内の値の範囲を指す。所定の温度の値に関して用いられる場合、用語「約」は、例えば、実験誤差内で決定されたような、その正確な値を包含する。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を、細胞培養の一期間（例えば、初期）中、高い誘導温度または温度範囲で増殖させるが、細胞培養の異なる一期間（例えば、終期）中、低い誘導温度または温度範囲で増殖させる。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を、目的のポリペプチドが発現しているとき、細胞培養のその一期間中、低い誘導温度または温度範囲で増殖させる。例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに作動可能に連結されてもよく、プロモーターが抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を発現するように誘導されるとき、細胞培養のその一期間中、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を低い誘導温度または温度範囲で増殖させてもよい。
【００８９】
特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件は、短い誘導時間を含む。例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を発現させるためのベクターまたは発現カセットを含むＹａｒｒｏｗｉａ細胞を、短い誘導時間の間、細胞培養で増殖させてもよい。下記の実施例４に記載されているように、短い誘導時間によって、抗体ポリペプチド断片の発現レベルの増加がもたらされた。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間の誘導時間の間、またはこれらの値の間の任意の誘導時間の間、増殖させる。「約」とは、その用語が誘導時間の値に関して本明細書で用いられる場合、所定の値付近の範囲を指す。一般的に、所定の誘導時間の値に関して用いられる場合、用語「約」とは、その値の＋／−１０％内、例えば、その値の＋／−９％内、その値の＋／−８％内、その値の＋／−７％内、その値の＋／−６％内、その値の５％内、その値の＋／−４％内、その値の＋／−３％内、その値の＋／−２％内、その値の＋／−１％内、またはその値の＋／−１％以下内の値の範囲を指す。所定の誘導時間の値に関して用いられる場合、用語「約」は、例えば、実験誤差内で決定されたような、その正確な値を包含する。
【００９０】
特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件は、低いｐＨを含む。例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を発現させるためのベクターまたは発現カセットを含むＹａｒｒｏｗｉａ細胞を、その細胞培養の一期間または全期間、低いｐＨで増殖させてもよい。下記の実施例５に記載されているように、ｐＨは、Ｙａｒｒｏｗｉａの二相性転移を制御する１つの因子であり、増殖培地のｐＨである；菌糸体形成は、中性近くのｐＨにおいて最大であり、ｐＨが低下するにつれて減少し、ｐＨ３でほとんどゼロになる。したがって、低いｐＨ培養でＹａｒｒｏｗｉａ細胞を増殖させることによって、菌糸体形成を減少または排除することができる。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を、約２から約４、例えば、約２．１から約４、約２．２から約４、約２．３から約４、約２．４から約４、約２．５から約４、約２．６から約４、約２．７から約４、約２．８から約４、約２．９から約４、約３から約４、約２から約３．９、約２から約３．８、約２から約３．７、約２から約３．６、約２から約３．５、約２から約３．４、約２から約３．３、約２から約３．２、約２から約３．１、約２から約３、約２．５から約３．５、約２．５から約３、約３から約３．５のｐＨ範囲、またはその間にある任意のｐＨ範囲で、増殖させる。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を、約２、約２．１、約２、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、または約４のｐＨで増殖させる。「約」とは、その用語がｐＨに関して本明細書で用いられる場合、所定の値付近の範囲を指す。一般的に、所定のｐＨの値に関して用いられる場合、用語「約」とは、その値の＋／−１０％内、例えば、その値の＋／−９％内、その値の＋／−８％内、その値の＋／−７％内、その値の＋／−６％内、その値の５％内、その値の＋／−４％内、その値の＋／−３％内、その値の＋／−２％内、その値の＋／−１％内、またはその値の＋／−１％以下内の値の範囲を指す。所定のｐＨ値に関して用いられる場合、用語「約」は、例えば、実験誤差内で決定されたような、その正確な値を包含する。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を、細胞培養の一期間（例えば、初期）中、高いｐＨまたはｐＨ範囲で増殖させるが、細胞培養の異なる一期間（例えば、終期）中、低いｐＨまたはｐＨ範囲で増殖させる。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を、目的のポリペプチドが発現しているとき、細胞培養のその一期間中、低いｐＨまたはｐＨ範囲で増殖させる。例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに作動可能に連結されてもよく、プロモーターが抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を発現するように誘導されるとき、細胞培養のその一期間中、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を低いｐＨまたはｐＨ範囲で増殖させてもよい。
【００９１】
特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件は、高い通気性を含む。例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を発現させるためのベクターまたは発現カセットを含むＹａｒｒｏｗｉａ細胞を、その細胞培養の一期間または全期間、高い通気条件下で増殖させてもよい。下記の実施例３に記載されているように、細胞培養の通気の増加は、発現した抗体ポリペプチド断片の細胞表面ディスプレイを向上させる。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を、通気を向上させるために振盪フラスコ内で増殖させる。特定の実施形態において、培養のパーセント酸素飽和が測定され、培養物が十分な高通気条件下で増殖することを確実にするように所定のレベルより上に保持される。例えば、発酵槽条件下、高通気条件は、３０〜５０％の酸素飽和で達成することができ、例えば、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の酸素飽和である。細胞培養通気を向上させるのに有用な他の容器は、当業者に知られているであろう。
【００９２】
特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件は、培養物を最少培地中で増殖させることを含む。下記の実施例３に記載されているように、細胞培養物を最少培地中でインキュベートすることによって、発現した抗体ポリペプチド断片の細胞表面ディスプレイが向上する。「最少培地」とは、その用語が本明細書に用いられる場合、細胞培養物（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞培養物）の増殖を支持するのに必要とされる最少の要素を含む培地を指す。最少培地は、典型的には、増殖のための炭素源（例えば、グルコース）、塩の形をとった様々な微量元素（例えば、マグネシウム、窒素、リン、および／または硫黄）、窒素源、および水を含有する。最少培地は、酵母抽出物、Ｂａｃｔｏペプトン、またはその両方を欠く。所定の生物体を、ある最少培地中で増殖させた場合、増殖することができる可能性があるが、別の最少培地中で増殖させた場合、増殖することができない可能性がある。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件は、最少補充培地中で培養物を増殖させることを含む。「最少補充培地」とは、その用語が本明細書で用いられる場合、アミノ酸を補充している最少培地を指す。最少補充培地は、１個もしくは２、３個のアミノ酸を補充されていてもよいし、またはたいていの生物体によって用いられる全２０個のアミノ酸の完全なセットを補充されていてもよい。当業者は、様々な最少培地を知っているであろうし、本明細書に開示された組成物および方法に従って所定の生物体の増殖を支持するためにどの最少培地を用いることができるかを決定することができるであろう。
【００９３】
特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を、同時に２つ以上のＹａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件下で、増殖させる。例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を、低い誘導温度、短い誘導時間、低いｐＨ、高い通気性、最少培地中での増殖、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される２つ以上のＹａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件下で増殖させる。
【００９４】
ポリペプチドの表面ディスプレイのためのベクターで形質転換されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞の６０〜８０％が、実際にその表面上にポリペプチドを発現することが一般的に報告されている。対照的に、本明細書に記載された方法および組成物を用いて、１つまたは複数のＹａｒｒｏｗｉａ作動条件下で増殖したＹａｒｒｏｗｉａ細胞のもっと高いパーセンテージの細胞が、その表面上に抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を示す。例えば、１つまたは複数のＹａｒｒｏｗｉａ作動条件下で増殖したＹａｒｒｏｗｉａ細胞の少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％が、その表面上に抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を示す。「約」とは、表面上に抗体ポリペプチドまたは断片を示すＹａｒｒｏｗｉａ細胞の数に関して用いられる場合、その値から５％以内の値を指し、正確な値も含む。特定の実施形態において、１つまたは複数のＹａｒｒｏｗｉａ作動条件下で増殖したＹａｒｒｏｗｉａ細胞の約９９％より多く（例えば、１００％）がその表面上に抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を示す。
【００９５】
特定の実施形態において、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を発現するためのベクターまたは発現カセットを含むＹａｒｒｏｗｉａ細胞は、シャペロンポリペプチドをさらに含む。当技術分野において知られているように、シャペロンポリペプチドは、他のポリペプチドの非共有結合性フォールディングおよび／またはアッセンブリを援助する。実施例７に記載されているように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）および免疫グロブリン結合タンパク質（Ｋａｒ２／ＢｉＰ）などの分子シャペロンの過剰発現は、ｓｃＦｖ断片およびＦａｂ断片の発現を向上させた。酵母において、ＢｉＰ／ＧＲＰ７８は、ＫＡＲ２遺伝子によってコードされる。したがって、特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞は、シャペロンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換される。本明細書で開示された組成物および方法に従って有利に用いることができるシャペロンポリペプチドの非限定的例には、ＰＤＩ、Ｋａｒ２／Ｂｉｐ、およびＨＡＣＩが挙げられる。特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞は、プロモーターの調節下のシャペロンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換される。例えば、シャペロンは、構成的、半構成的、または誘導性プロモーターの調節下であってもよい。特定の実施形態において、シャペロンポリペプチドは、目的のポリペプチド（例えば、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片）と同じ細胞培養の一期間中に発現する。当業者は、他のシャペロンポリペプチドを知っているであろうし、それらを用いることも、ここに開示されている組成物および方法と共に用いる場合、それらの効力を評価することもできるであろう。
【００９６】
適用
本明細書に開示された組成物および方法は、様々な適用において用いることができる。１つの非限定的例として、本明細書に開示された組成物および方法は、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片のライブラリーを、所定の抗原を結合する能力についてスクリーニングするために用いることができる。
【００９７】
特定の実施形態において、酵母細胞（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ細胞）は、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をその表面上にディスプレイし、所定の抗原を結合する能力について、その細胞は試験される。特定の実施形態において、酵母細胞は、２つの抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を発現し、その抗体ポリペプチドまたはその断片は、一緒になって抗原を結合することができるように、お互いに会合する。例えば、重鎖Ｆａｂ断片および軽鎖Ｆａｂ断片を、酵母の細胞表面上にディスプレイすることができ、それらのＦａｂ断片は、お互いに会合して、機能しうる抗原結合部分を形成する。特定の実施形態において、ｓｃＦｖ抗体ポリペプチド断片は、酵母の細胞表面上にディスプレイされ、そのｓｃＦｖ断片は所定の抗原を結合することができる。特定の実施形態において、酵母細胞（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ細胞）は、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含むベクターまたは発現カセットで形質転換される。特定の実施形態において、酵母細胞（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ細胞）は、２つ以上のベクターおよび／または発現カセットで形質転換され、それぞれは、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含む。特定の実施形態において、酵母細胞（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ細胞）は、２つ以上の核酸配列を含むベクターまたは発現カセットで形質転換され、それぞれは、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００９８】
特定の実施形態において、抗体ポリペプチド酵母ライブラリーを作製するために、複数の酵母細胞（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ細胞）は、ベクターまたは発現カセットのライブラリーで形質転換され、そのライブラリーは、複数の抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含む複数の核酸配列を含む。本明細書で用いられる場合、用語「抗体ポリペプチド酵母ライブラリー」は、複数の抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を表面上にディスプレイする複数の酵母細胞を指す。そのような抗体ポリペプチド酵母ライブラリーは、１つまたは複数の特定の抗原を結合する抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片について、ライブラリーにおいてスクリーニングするために用いることができる。
【００９９】
特定の実施形態において、複数の酵母細胞（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ細胞）は、ベクターまたは発現カセットのライブラリーで形質転換され、そのライブラリーは、複数の抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含む複数の核酸配列を含む。例えば、ベクターまたは発現カセットのライブラリーは、複数のｓｃＦｖ抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含む複数の核酸配列を含んでもよい。そのような複数の形質転換された酵母細胞を、１つまたは複数の特定抗原を結合するｓｃＦｖ抗体ポリペプチド断片についてスクリーニングするために用いてもよい。
【０１００】
特定の実施形態において、第１の複数の一倍体酵母細胞（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ細胞）は、ベクターまたは発現カセットのライブラリーで形質転換され、そのライブラリーは、複数の抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含む複数の核酸配列を含み、第２の複数の一倍体酵母細胞（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ細胞）は、ベクターまたは発現カセットのライブラリーで形質転換され、そのライブラリーは、複数の抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含む複数の核酸配列を含む。特定の実施形態において、第１および第２の複数の一倍体酵母細胞は、同じライブラリーで形質転換される。例えば、第１および第２の複数の一倍体酵母細胞は、重鎖抗体ポリペプチドまたは断片と軽鎖抗体ポリペプチドまたは断片の両方をコードするヌクレオチド配列を含むライブラリーで形質転換されてもよい。特定の実施形態において、第１および第２の複数の一倍体酵母細胞は、異なるライブラリーで形質転換される。例えば、第１の複数の一倍体酵母細胞は、重鎖抗体ポリペプチドまたは断片をコードするヌクレオチド配列を含むライブラリーで形質転換されてもよく、一方、第２の複数の一倍体酵母細胞は、軽鎖抗体ポリペプチドまたは断片をコードするヌクレオチド配列を含むライブラリーで形質転換されてもよい。
【０１０１】
特定の実施形態において、ライブラリーで形質転換された第１および第２の複数の一倍体酵母細胞は、お互いに接合して、各ライブラリー由来のベクターまたは発現カセットを含む複数の二倍体酵母を形成する。例えば、重鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含むライブラリーで形質転換された第１の複数の一倍体酵母細胞は、軽鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含むライブラリーで形質転換された第２の複数の一倍体酵母細胞に接合して、重鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片と軽鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片の両方を含む複数の二倍体酵母細胞を生成してもよい。そのような複数の二倍体酵母細胞は、１つまたは複数の特定抗原を結合する抗体ポリペプチドまたは断片についてスクリーニングするために用いられてもよい。そのような実施形態は、重鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片と軽鎖抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片の多くの種類の異なる組み合わせのスクリーニングを可能にする点において、有利である。
【０１０２】
特定の実施形態において、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片の特定の抗原に対する結合特異性は、向上または最適化される。抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片の結合特異性を向上または最適化するために定方向進化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）または親和性成熟を用いることができる。例えば、Ｆｕｊｉｉ（全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２４８巻、３４５−３５９ページ、２００４）は、抗体についての親和性成熟のプロセスを記載する。同様に、Ｂｏｄｅｒら（参照により本明細書に組み入れられた、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． Ｓｅｐ ２６；９７（２０）：１０７０１−５、２０００）は、ｓｃＦｖ断片の定方向進化を記載する。これらおよび他の技術は、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片の結合特異性を向上または最適化するのに用いることができる。
【０１０３】
特定の実施形態において、特定の抗原を結合するか、または結合するのではないかと思われる抗体ポリペプチドまたは断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を単離することができる。その後、そのような核酸配列を、１つまたは複数のヌクレオチド残基を変化させることによって改変してもよい。特定の実施形態において、核酸配列は、ベクターまたは発現カセットの一部である。その後、改変型核酸（複数可）を、抗原（例えば、最初の抗原または別の異なる抗原）を結合する能力について試験してもよい。例えば、改変型核酸を酵母細胞に（例えば、形質転換によって）導入してもよく、その酵母細胞を、抗体ポリペプチドまたはその抗体ポリペプチド断片がその細胞表面上に発現するような増殖条件（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ作動条件）下でインキュベートする。その後、その酵母を、目的の抗原と接触させてもよく、結合を試験してもよい。
【０１０４】
核酸配列を改変するための様々な技術は、当技術分野において知られており、それらのいずれも、ここに開示されている方法および組成物に従って用いることができる。例えば、放射線照射、化学変異原、エラープローン（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、または飽和変異誘発を用いてもよい。他の技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．、およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２．ｓｕｐ．ｎｄ ｅｄ．、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９（その内容は全体として参照により本明細書に組み入れられている）に見出すことができる。当業者は、核酸配列を改変するための適切な技術を知っているであろう。
【０１０５】
抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をディスプレイする細胞の所定の抗原への結合を試験するための様々な技術は、当技術分野において知られており、それらのいずれも、ここに開示されている方法および組成物に従って用いることができる。１つの非限定的例として、ＥＬＩＳＡアッセイを用いてもよい。
【０１０６】
特定の実施形態において、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞は、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードする親ベクターまたは親発現カセットを含み、その抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片は、細胞表面上にディスプレイされ、特定の抗原（例えば、標的ポリペプチド）を結合する。特定の実施形態において、親ベクターまたは親発現カセットは、単離され、上記のような改変に供され、１つまたは複数の改変型ベクターまたは発現構築物を生じる。特定の実施形態において、そのような改変は、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列内に生じる。その後、１つまたは複数の改変型ベクターまたは発現構築物は、親ベクターまたは親発現カセットを欠く、１つまたは複数の第２のＹａｒｒｏｗｉａ細胞へ形質転換されてもよい。例えば、１つまたは複数の改変型ベクターまたは発現構築物は、その後、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件下で増殖する複数のＹａｒｒｏｗｉａ細胞へ形質転換され、Ｙａｒｒｏｗｉａ抗体ポリペプチド酵母ライブラリーを生じることができ、そのライブラリーのメンバーは、複数の改変型抗体ポリペプチドまたはその抗体ポリペプチド断片をそれらの表面上にディスプレイする。その後、Ｙａｒｒｏｗｉａ抗体ポリペプチド酵母ライブラリーのメンバーは、特定の抗原、例えば、親ベクターまたは親発現カセットによってコードされる抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片によって結合された抗原を結合するそれらの能力について試験されてもよい。抗原への結合の向上を示す（例えば、より高い、またはより特異的な親和性またはアビディティを示す）Ｙａｒｒｏｗｉａ抗体ポリペプチド酵母ライブラリーのメンバー由来の改変型ベクターまたは発現カセットを単離してもよい。特定の実施形態において、この一連の工程が、１回または複数回、繰り返される。特定の実施形態において、所望のレベルの結合を示す抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片が得られるまで、この一連の工程が繰り返される。
【０１０７】
特定の実施形態において、改変型抗体ポリペプチドまたは断片が、親ベクターまたは親発現カセットによってコードされる抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片によって結合される同じ抗原への結合の向上または最適化を示すように、親ベクターまたは親発現カセットにおけるヌクレオチド配列によってコードされる抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片は改変される。特定の実施形態において、改変型抗体ポリペプチドまたは断片が、親ベクターまたは親発現カセットによってコードされる抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片によって結合されるのとは異なる抗原への結合の向上または最適化を示すように、親ベクターまたは親発現カセットにおけるヌクレオチド配列によってコードされる抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片は改変される。例えば、第１の抗原を結合することが知られた抗体ポリペプチドまたは断片は、その抗原特異性が変化するように改変されてもよい。
【０１０８】
当業者は、他の適用を知っているであろうし、そのような適用において使用するために本明細書に開示された組成物および方法を用いることができるであろう。
【０１０９】
キット
特定の実施形態において、本明細書に記載された１つまたは複数の組成物を含むキットが提供される。特定の実施形態において、本明細書に記載された１つまたは複数の方法を実施するためのキットが提供される。特定の実施形態において、キットは、目的のポリペプチド、例えば、抗体ポリペプチドもしくは抗体ポリペプチド断片、アンカーポリペプチド、またはその両方を酵母細胞の表面上に発現するための構成要素を含む。例えば、キットは、酵母を形質転換または培養するための１つまたは複数の発現カセット、ベクター、酵母、および／または構成要素を含んでもよい。特定の実施形態において、酵母を形質転換または培養するための発現カセット、ベクター、酵母、および／または構成要素は、本明細書に記載されているようなものである。
【０１１０】
特定の実施形態において、キットは、抗体ポリペプチドもしくは抗体ポリペプチド断片、アンカーポリペプチド、またはその両方をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含む発現カセットまたはベクターを含む。特定の実施形態において、キットは、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞、例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ細胞などの酵母を含む。特定の実施形態において、キットのＹａｒｒｏｗｉａ細胞は、形質転換受容性である。特定の実施形態において、キットのＹａｒｒｏｗｉａ細胞は、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を形質転換受容性にするために用いることができる１つまたは複数の構成要素と共にパッケージングされる。
【０１１１】
特定の実施形態において、キットは、キットの発現カセット、ベクター、または他の構成要素を用いるための書面による使用説明書、例えば、目的のポリペプチド（例えば、抗体ポリペプチドもしくは抗体ポリペプチド断片、アンカーポリペプチド、またはその両方）を酵母細胞の表面上に発現するためにキットの発現カセット、ベクター、または他の構成要素を用いるための書面による使用説明書を含む。
【実施例】
【０１１２】
実施例１：材料および方法
用いられる菌株：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１を、標準ＤＮＡ増幅およびクローニングのために用いた。Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＰＯ１ｄ（ＭａｔＡ、ｌｅｕ２−２７０、ｘｐｒ２−３２２）、ＰＯ１ｄ（ＭａｔＡ、ｕｒａ３−３０２、ｌｅｕ２−２７０、ｘｐｒ２−３２２）、およびＰＯ１ｄ（ＭａｔＡ、ｕｒａ３−３０２、ｌｅｕ２−２７０、Ａｄｅ２−８４４、ｘｐｒ２−３２２）を、ベクター形質転換のレシピエントとして用いた。
【０１１３】
ｓｃＦｖ発現プラスミド：分子アンカー配列の上流のｓｃＦｖ断片のＳｆｉＩ／ＮｏｔＩクローニングを可能にするように４つの合成構築物を作製した。ＳｆｉＩ制限部位のＮ末端に、最終発現プラスミドでのＬＩＰ２ｐｒｅまたはＬＩＰ２ｐｒｅｐｒｏのいずれかのＣ末端における融合のためにＢｓｍＩ制限部位を付加した。ＮｏｔＩ制限部位の下流に、ｃ−Ｍｙｃタグを付加し、続いて、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカー、およびアンカリングドメインを交換するためにＮｄｅＩ ＆ ＡｖｒＩＩ制限部位を付加した。アンカリングのために、以下のＹａｒｒｏｗｉａコドン最適化配列を、合成構築物へＮｈｅＩ部位とＡｖｒＩＩ部位との間に挿入した：１）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＡＧ１（ＩＤ ８５３４６０）のＣ末端（９６０ｂｐ）、２）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＧＡ２（ＩＤ ８５２８５１）、または３）Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＣＷＰＩ（アクセション番号ＡＹ０８４０７７）のＣ末端（３３３ｂｐ）。ＡＧＡ２分子アンカーがｓｃＦｖのＮ末端に位置している第２の合成構築物を作製した。ここにおいて、コドン最適化成熟Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＧＡ２の前に、ＢｓｍＩ部位があり、後に、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカー、ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩに囲まれたｓｃＦｖコード配列、ｃ−ｍｙｃおよび６−ｈｉｓエピトープタグ、ならびにＡｖｒＩＩ制限部位が続いた。完全な合成構築物を、ＢｓｍＩ（Ｔ４）およびＡｖｒＩＩで消化し、ＳａｃＩＩ（Ｔ４）／ＡｖｒＩＩ消化ｐＹＬＰＬＸＬ２ｐｒｅへクローニングした。ＡＧＡ１の発現のために、前にＢｓｍＩ、後にＡｖｒＩＩが続くコドン最適化成熟Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＧＡ１を、ＢｓｍＩ（Ｔ４）およびＡｖｒＩＩで消化し、ＳａｃＩＩ（Ｔ４）／ＡｖｒＩＩ消化ｐＹＬＰＵＸＬ２ｐｒｅへクローニングした。
【０１１４】
ｓｃＦｖ断片の可溶性発現を可能にするために、Ｙａｒｒｏｗｉａコドン最適化分泌構築物を合成的に作製した。この構築物は、Ｖ５および６−ｈｉｓエピトープタグを含有し、その５’末端で、ｓｃＦｖクローニングのためのＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ制限部位が先行した。この構築物をＢｓｍＩ（Ｔ４）およびＡｖｒＩＩで消化し、ＳａｃＩＩ（Ｔ４）／ＡｖｒＩＩ消化ｐＹＬＰＵＸＬ２ｐｒｅへクローニングした。コドン最適化トラスツズマブｓｃＦｖおよび４−４−２０ ｓｃＦｖ、ならびに抗ＨＥＬ ｓｃＦｖのＤ１．３およびＭ３を合成し、記載されたプラスミドへＳｆｉＩ制限部位とＮｏｔＩ制限部位との間にクローニングした。抗フルオレセイン４−４−２０抗体が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ表面ディスプレイプラットフォームの開発のためのモデルタンパク質としての役割を果たした（全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ｂｏｄｅｒ，Ｅ．Ｔ． ＆ Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｋ．Ｄ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５、５５３−７、１９９７）。細胞表面抗原ＨＥＲ−２／ｎｅｕがん原遺伝子に結合するトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））は、乳がんの処置として臨床的に認可されている（全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ｃｈｏら、Ｎａｔｕｒｅ、４２１、７５６−７６０、２００３）。
【０１１５】
Ｆａｂ発現構築物：重鎖発現プラスミドのために、ｓｃＦｖクローニングについて記載されているように、Ｙａｒｒｏｗｉａコドン最適化重鎖定常領域ＣＨ１ドメインを、ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩを用いて、４つの合成構築物へクローニングした。その後、ＶＨについてのｃＤＮＡを、ＳｆｉＩおよびＮｈｅＩを用いて、これらのプラスミドへクローニングした。最後に、Ｆａｂ発現カセットを、ｓｃＦｖについて行ったことと同様に、ｐＹＬＰＬＸＬ２ｐｒｅへクローニングした。
【０１１６】
軽鎖発現プラスミドを、ｓｃＦｖ発現プラスミド上で構築した。したがって、Ｙａｒｒｏｗｉａコドン最適化Ｃκ１（軽鎖定常領域カッパ）を、ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩを用いてこのベクターへ挿入した。その後、ＶＬについてのｃＤＮＡを、ＳｆｉＩおよびＢｓｉＷＩを用いてこのプラスミドへクローニングした。
【０１１７】
ｓｃＦｖ発現プラスミドからＰＣＲにより、トラスツズマブおよび４−４−２０の可変ドメインを増幅し、開発されたＦａｂ発現プラスミドへのクローニングのために必要とされる制限部位を付加した。最終プラスミドを、上記のような適切なＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株へ形質転換して、完全に相補された最終株を作製した。
【０１１８】
増殖条件：Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株を、リッチなＹＰＤ培地（１％酵母抽出物、１％Ｂａｃｔｏペプトン、１％グルコース）上か、またはＣＳＭを補充され（ＭＳＭ；アミノ酸および硫酸アンモニウムを含まない、０．６７％イーストニトロゲンベース、０．４％ＮＨ４Ｃｌ、０．０７９％ＣＳＭ）、かつ５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．８中、炭素源としてのグルコース２％もしくはオレイン酸２％を補充された最少培地上かのいずれかで、２８℃で培養した。ｐＨ試験に関する実験については、５０ｍＭリン酸−クエン酸緩衝液を、ｐＨ５またはｐＨ３で用いた。
【０１１９】
細胞表面ディスプレイを誘導するために、酵母細胞を、最少グルコース培地中、２８℃、１８０ｒｐｍで、２４時間、増殖させた。次の日、培養物のＯＤ６００を測定した；細胞をｄＨ２Ｏで２回、洗浄し、最少オレイン酸培地中に０．１のＯＤ６００で再懸濁し、２０℃、１８０ｒｐｍで１６時間、増殖させた。細胞を、５０ｍＬのＦＡＬＣＯＮチューブ中５ｍＬの培養物としてか、または２５０ｍＬのバッフル付き振盪フラスコ中２０ｍＬの培養物としてかのいずれかで増殖させた。
【０１２０】
フローサイトメトリー：ｃ−ＭｙｃまたはＶ５エピトープに対する抗体での間接的免疫染色により、表面発現を実証した。したがって、誘導後、０．１％ＢＳＡを補充された１ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２）（ＰＢＳ／ＢＳＡ）中の２×１０６個の細胞を、１μｇ／ｍｌの抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（Ｓｉｇｍａ）または抗Ｖ５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に３０分間、インキュベートした。必要に応じて、ビオチン化ＨＥＬ（Ｓｉｇｍａ）または組換えＨＥＲ２−Ｆｃキメラタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。ＨＥＬのビオチン化のために、Ｐｉｅｒｃｅ製のＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｍｉｃｒｏ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔｓを用いた。その後、細胞を、氷冷ＰＢＳ／ＢＳＡで洗浄し、二次検出試薬と共に３０分間、インキュベートした。ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ−４８８またはフィコエリトリン連結型抗体を用いて、結合した抗ｃ−Ｍｙｃまたは抗Ｖ５抗体を検出した。ビオチン化抗原の検出について、検出は、ストレプトアビジン−フィコエリトリンを用いた。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー上での分析の前に、細胞を氷冷ＰＢＳ／ＢＳＡで２回、洗浄した。
【０１２１】
Ｋｄ決定：前に記載されているように、細胞を増殖させ、誘導した。２００μｌ ＰＢＳ／ＢＳＡ中１×１０６個の細胞のアリコートを、０．０１ｎＭから１μＭまでの濃度範囲での適切な抗原とインキュベートし、６０分間のインキュベーションにより２５℃において平衡に近づくようにさせた。次に、細胞を遠心分離によりペレット化し、氷冷ＰＢＳ／ＢＳＡ中で洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターでの分析のために１ｍｌの氷冷ＰＢＳ／ＢＳＡ中に再懸濁した。細胞の平均蛍光強度を記録した。非線形最小二乗曲線当てはめを用いて、蛍光データから平衡解離定数（Ｋｄ）を決定した。
【０１２２】
エラープローンＰＣＲを用いる多様化したレパートリーの構築：抗ＨＥＬ ｓｃＦｖ断片Ｄ１．３を、以前に記載されているように（全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ｃｈａｏら、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ． １、７５５−６８、２００６参照）、エラープローンＰＣＲを用いてランダムに変異させた。簡単に述べれば、ｓｃＦＶ ＯＲＦを、プライマーｐＰＯＸ２ＦｗおよびｚｅｔａＲｖを用いて、ｐＹＬＰＵＸＬ２ｐｒｅＡ２Ｄ１．３から増幅した（Ｃｈａｏら、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ． １、７５５−６８、２００６）。精製後、ＰＣＲ産物をＳｆｉＩおよびＮｏｔＩで消化した。消化された産物を、ゲル精製し、同様に処理された（ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩで消化された）、野生型Ｄ１．３を含有するベクターへクローニングした。これらのライブラリーからＱｉａｇｅｎプラスミド精製キットを用いてプラスミドＤＮＡを調製し、その後、上記のようにＹａｒｒｏｗｉａ株ｐＯ１ｄへ形質転換した。
【０１２３】
ライブラリー選択：変異体Ｄ１．３レパートリーを増殖させ、抗体発現を、上記のように１６時間、誘導した。そのレパートリーを抗ｃ−Ｍｙｃ（１μｇ／ｍｌ）および３００ｎＭビオチン化ＨＥＬで平衡に達するまで（３時間）、標識し、その後、非標識ＨＥＬと２０分間、競合させた。次に、細胞を、二次Ａｌｅｘａ−４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（１μｇ／ｍｌ）およびストレプトアビジン−フィコエリトリン（１μｇ／ｍｌ）で標識した。全てのインキュベーション工程後、細胞を、１ｍｌ ＰＢＳ／ＢＳＡで２回、洗浄した。最後の洗浄後、細胞を、抗原解離を防ぐために氷上で保持した。試料を、Ｅｐｉｃｓ Ａｌｔｒａフローサイトメーター上、約２０００細胞／秒のソーティング速度でソーティングした。最も高い抗原結合性集団のより小さなパーセンテージをゲーティングすることにより、ストリンジェンシーを増加させながら、３回の連続したラウンドにおいて細胞をソーティングした。選択されたクローンの配列分析により、２つのクローン（クローン１３およびクローン３８）が変異［Ｉ１６０Ｖ］（クローン１３）および［Ｉ１６０Ｖ；Ｔ２２８Ａ］（クローン３８）を含有することが明らかにされた。これらのクローンを、平衡力価測定によって抗原結合について評価し、１．８倍および２．４倍の親和性の向上が示され、それは、Ｍ３変異体についてと同じ範囲にある（図１８参照）。
【０１２４】
実施例２：ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、および完全長ＩｇＧディスプレイプラスミドのセットの構築
異なるアンカリング分子を用いてｓｃＦｖ断片のディスプレイを可能にするように、一般的な表面ディスプレイプラットフォームを作製した。１）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓａｇ１ｐのＣ末端部分（３２０個のＣ末端アミノ酸）へのＮ末端融合（Ａ１）、２）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｇａ２ｐへのＮ末端融合（Ａ２）、３）Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＣｗｐＩｐのＣ末端部分（１１０個のＣ末端アミノ酸）へのＮ末端融合（Ａ３）、および４）Ａｇａ２ｐへのＣ末端融合（Ａ４）としてｓｃＦｖ断片のディスプレイを可能にする合計４つのディスプレイプラスミドを作製した。発現は誘導性ｐＰＯＸ２プロモーターによって駆動される。ＬＩＰ２ｐｒｅリーダー配列をｓｃＦｖのＮ末端に付加して、分泌装置を介した各ポリペプチドのプロセシングを駆動し、最終的に正しくプロセシングされた表面ディスプレイ化タンパク質を生じるようにする。変形として、ディスプレイレベルの比較を可能にするために、ＬＩＰ２ｐｒｅｐｒｏもまた、α−凝集素（ａｇｇｌｔｉｎｉｎ）融合体（Ａ１）におけるトラスツズマブｓｃＦｖについてのリーダーとして用いた。この実験ストラテジーは、複数のディスプレイ型式を用いることにより、成功の機会が増加するだけでなく、アンカーがｓｃＦｖまたはＦａｂ断片のＮ末端に融合したかＣ末端に融合したかに依存して、遊離カルボキシ末端かまたは遊離アミノ末端のいずれかを有する抗体断片のディスプレイ（その特徴は、ディスプレイされたｓｃＦｖの結合特性に影響することが以前に示された（全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ｗａｎｇ，Ｚ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ． １８、３３７−４３、２００５））も可能にするであろうという推論に基づいた。エピトープタグ（ｃ−Ｍｙｃ）の付加によって、各ポリペプチドのディスプレイがモニターでき、選択の標準化が可能になった。
【０１２５】
Ｆａｂディスプレイについて、重鎖Ｆａｂ断片を、ｓｃＦｖ断片について記載されたものと同じアンカリング分子（Ａ１〜４）を用いて、酵母表面へアンカリングさせたが、軽鎖Ｆａｂについては、可溶性断片として発現させた（ＦａｂＬＣ）。両方の鎖が化学量論的（ｓｔｏｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ）量で存在することを可能にするために、両方の発現カセットを誘導性ｐＰＯＸ２プロモーターによって駆動し、リーダー配列としてＬＩＰ２ｐｒｅを用いた。Ｆａｂ重鎖（ＣＨ１−ＶＨ）（ｃ−Ｍｙｃ）および軽鎖（Ｃ末端のＶ５および６−ｈｉｓエピトープタグ）についての異なるエピトープタグの存在により、各ポリペプチドの同時的かつ非依存的可視化を可能にした。
【０１２６】
完全長ＩｇＧディスプレイについて、完全長トラスツズマブ重鎖を、ｓｃＦｖおよびＦａｂについて記載されているようなアンカリング分子のうちの２つ：Ａ２およびＡ４（それぞれ、ＡＧＡ２のＮ末端およびＣ末端繋ぎ止め）を用いて酵母細胞表面へアンカリングさせた。両方の鎖が化学量論的量で存在することを可能にするために、両方の発現カセットを誘導性ｐＰＯＸ２プロモーターによって駆動し、リーダー配列としてＬＩＰ２ｐｒｅを用いた。重鎖（ＨＣ）（ｃ−Ｍｙｃ）および軽鎖（ＬＣ）（Ｃ末端のＶ５および６−ｈｉｓエピトープタグ）についての異なるエピトープタグの存在により、各ポリペプチドの同時的かつ非依存的可視化を可能にした。
【０１２７】
コドン最適化は、一般的に、結果として、異種タンパク質の発現レベルの２倍の向上を生じることが示されたため、全てのディスプレイカセットを、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａについてコドン最適化した。ディスプレイ系を、以下の２つの十分特徴づけられた抗体のパネルを用いて分析した：抗フルオレセイン４−４−２０抗体（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ表面ディスプレイプラットフォームの開発のためのモデルタンパク質としての役割を果たしている（全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ｂｏｄｅｒ，Ｅ．Ｔ． ＆ Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｋ．Ｄ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５、５５３−７、１９９７））、およびトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））（細胞表面抗原ＨＥＲ−２／ｎｅｕがん原遺伝子に結合し、乳がんの処置として臨床的に認可されている）。
【０１２８】
全てのベクターは、ゼータエレメント（Ｙｌｔ１レトロトランスポゾン由来の長い末端反復（ＬＴＲ））を有し、これにより、Ｙｌｔ１を有するＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株における相同組換えによるか、またはこのレトロトランスポゾンを欠く株における非相同組換えによるかのいずれかによって、ベクターが組み込まれるのを可能にした。全てのｓｃＦｖ発現構築物、およびＦａｂ重鎖（ＣＨ１−ＶＨ）発現構築物は、ＬＥＵ２栄養要求性マーカーを有した。Ｆａｂ軽鎖断片発現プラスミドは、ＵＲＡ３ｄ１マーカーを有した。Ａｇａ２ｐ融合体のディスプレイのために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＧＡ１を発現する追加の発現構築物が存在した。ＡＧＡ１は、ＡＧＡ２のヘテロダイマー化のパートナーである。したがって、ｐＰＯＸ２プロモーター下で、成熟Ａｇａ１ｐについてのリーダーとしてＬＩＰ２ｐｒｅを用いて、ＡＧＡ１の発現を可能にするように、２つの構築物（栄養要求性マーカーＵＲＡ３およびＡＤＥ２を含む）を作製した。発現構築物の形質転換により、どの場合においても、完全に相補された株が生じた。図１は、ｓｃＦｖおよびＦａｂ断片のディスプレイのために構築された発現プラスミドについての概略図を示す。
【０１２９】
実施例３：細胞ディスプレイの向上
最初の実験として、ディスプレイ株の陽性形質転換体を、２５０ｍｌフラスコ内の５０ｍｌのＹＰＤ培地中、２８℃で一晩、増殖させた。その後、細胞を、ｄＨ２Ｏ中で洗浄し、オレイン酸リッチな培地中に再懸濁し、２５０ｍｌフラスコ内、２８℃で４８時間、増殖させた。最初の実験において、ｃ−Ｍｙｃエピトープタグにおける免疫学的染色およびＦＡＣＳ分析を用いて、表面発現は検出することができなかった（データは示していない）。したがって、異なる増殖条件を試験した。
【０１３０】
ストレス応答およびタンパク質フォールディングを含む多くの重要な細胞プロセスは、増殖温度を変化させることによって影響される。フォールディングストレスは、一般的に、低い培養温度で減少し、これにより、より効率的な異種タンパク質分泌／表面ディスプレイのレベルを可能にする。例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ｄｒａｇｏｓｉｔｓ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．、２００９を参照。したがって、ｓｃＦｖおよびＦａｂ断片の表面発現レベルを、２０℃および２８℃の誘導温度で比較した。
【０１３１】
細胞壁は、非常に多様なタンパク質集団を含有する高度に適応可能な小器官である。新しい巨大分子（例えば、ＧＰＩアンカー型タンパク質）の既存のポリマーネットワークへの挿入は、主として、活発な細胞壁生合成の部位、すなわち、増殖中の娘細胞の部位で起こることがＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて示されている（全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ｋｌｉｓ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｙｅａｓｔ ２３、１８５−２０２、２００６）。Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの細胞壁の分子構成は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの分子構成と類似していると考えられている。２０℃での増殖が、細胞壁形成を減速させ、それによって、異種タンパク質のより多くが細胞壁生合成の部位に蓄積することを可能にするか否かを試験した。また、通気の効果を研究するために、細胞を、通気がない５０ｍｌ ＦＡＬＣＯＮチューブ内、および２５０ｍｌ振盪フラスコ内で増殖させた。最後に、最少補充培地（ＭＭ）中での増殖を試験した。４−４−２０ α−凝集素（Ｓａｇ１ｐ）をディスプレイする株をこの実験に用いた。対照株として、フルサイズのモノクローナルのトラスツズマブ抗体産生株を選択した（表面発現カセットを含有しない株１Ｔ２）。
【０１３２】
図２に示されているように、ＦＡＬＣＯＮ培養（７６％）および振盪フラスコ培養（８６％）の両方について、細胞が最少補充培地中、２０℃で２０時間、誘導された場合、ＦＡＣＳ分析により、大きなｃ−Ｍｙｃ陽性集団が現れ、振盪フラスコ培養がわずかにより高いディスプレイレベルを示した（ＭＦＩ（平均蛍光強度）が２倍、異なる）。細胞をＭＭ中、２８℃で増殖させた場合、わずかな割合の細胞だけが、抗体断片をディスプレイした。また、細胞をＲＭ中、２０℃で増殖させた場合、表面ディスプレイは、はっきりとは見えなかった。４０時間の誘導における分析により、試験された全ての増殖条件について、全てのｃ−Ｍｙｃ検出が消滅した（データは示していない）。理論に縛られるつもりはないが、これは、ディスプレイされたタンパク質のタンパク質分解、または細胞壁構造における形態変化（複数可）によってｃ−Ｍｙｃエピトープが隠されることによって説明することができると思われる。
【０１３３】
実施例４：誘導時間の表面ディスプレイレベルへの効果
ｃ−Ｍｙｃ陽性細胞が長い誘導時間で消失したため、様々な誘導時間においてディスプレイレベルを測定する時間動態学実験を行った。したがって、１６時間、２０時間、２４時間、３２時間、および４３時間の誘導時点において、株ｎ１（４−４−２０ ｓｃＦｖ Ｓａｇ１を形質転換されたｐＯ１ｄ）のＦＡＣＳ分析を行った。
【０１３４】
図３の最初のパネルに示されているように、最大発現レベルは、１６時間の誘導時点で達せられ、細胞の９５％が中程度の発現レベルを示した（バックグラウンドより１０倍高い）。ｃ−Ｍｙｃを発現する細胞の相対的割合は、誘導時間が長くなるにつれて減少した（１６時間後９５％、２０時間後８６％、２４時間後５３％、３２時間後１９％、および４３時間後７％）。また、自己蛍光の減少（５分の１）、および陽性細胞の平均蛍光の減少（２０分の１）が、誘導中観察された。理論に縛られるつもりはないが、自己蛍光の減少は、細胞サイズの減少の結果である可能性が高い。ＦＳＣ／ＳＳＣ（前方−側方散乱：これらの測定はそれぞれ、細胞サイズおよび細胞の顆粒性を示している）について、有意な変化が観察され、それは、形態学的発生における劇的な変化を反映した。理論に縛られるつもりはないが、これらの変化についての１つの説明は、細胞が誘導中に酵母−菌糸転移を起こすことである。顕微鏡法で立証されているように、細胞は、より長い誘導によってより伸長した構造を形成し、この仮説を支持する。重要なことに、菌糸の形をとる場合、細胞壁タンパク質含量は減少することが以前に示されており、このこともまた、表面ディスプレイレベルの低下を説明することができると思われる。
【０１３５】
実施例５：ｐＨの表面ディスプレイレベルへの効果
Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａは、酵母様細胞および短い菌糸型細胞の混合物として増殖する。二相性転移を制御する１つの因子は、増殖培地のｐＨである（全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ｒｕｉｚ−Ｈｅｒｒｅｒａ，Ｊ． ＆ Ｓｅｎｔａｎｄｒｅｕ，Ｒ．、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７８、４７７−８３、２００２）。菌糸体形成は、中性近くのｐＨで最大であり、ｐＨが低下するにつれて減少し、ｐＨ３でほとんどゼロになることが記載されている（同上）。
【０１３６】
誘導の初期相中に酵母−菌糸転移を避ける試みにおいて、ｓｃＦｖディスプレイ株を、異なるｐＨ値：ｐＨ６．８、ｐＨ５、およびｐＨ３で増殖させた。図４に示されているように、誘導の２４時間目において、ｐＨ５およびｐＨ６．８で増殖した培養物についてシフトが起こり、ディスプレイ細胞の５０％損失があった。一方、ｐＨ３においては、１００％の細胞が、細胞ディスプレイを保持した。ｐＨ３における全体的なディスプレイレベルは、ｐＨ６．８と比較して増加しなかった。誘導の３２時間目において、ｐＨ５およびｐＨ６．８でｃ−Ｍｙｃシグナルの完全な喪失が観察され、一方、ｐＨ３で全ての細胞がｓｃＦｖディスプレイを保持した。ｐＨ３において、より長い誘導時間について、最大発現レベルのほんのわずかな減少が観察された。同様の変化は、表面ディスプレイされたＦａｂ断片について見られた（データは示していない）。異なるｐＨで増殖した培養物間で、ＦＳＣ／ＳＳＣプロフィールに劇的な違いが観察され、形態学的変化を反映した。ｐＨ３において、ごく少数の菌糸型細胞を含む酵母集団が、より長い誘導時間の時点で、保持されたが、ｐＨ５およびｐＨ６．８において、より分散した細胞集団が観察され、おそらく、それは、偽性菌糸増殖への転移を反映していると思われる。
【０１３７】
要約すれば、この実施例は、低いｐＨでの増殖が、表面ディスプレイタンパク質の検出を長く持続させるが、全体的なディスプレイレベルを増加させないことを実証している。
【０１３８】
実施例６：開発されたｓｃＦｖ株、Ｆａｂ株、および完全長ＩｇＧ株の発現分析
２つの異なるｓｃＦｖ断片融合タンパク質：４−４−２０ ｓｃＦｖおよびトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）ｓｃＦｖを用いて、新しいディスプレイ系をＦＡＣＳで確認した。ｃ−Ｍｙｃタグの免疫蛍光顕微鏡法およびフローサイトメトリー検出によって、ｓｃＦｖ発現を検証し、ｓｃＦｖ産物の発現および正しいフォールディングが示された。図５は、異なるディスプレイ型式における両方のｓｃＦｖ断片についての発現およびリガンド結合データを示す。示されているように、Ｓａｇ１ｐへのＮ末端融合（図５、「Ａ１」と表示された行におけるヒストグラム）およびＡｇａ２ｐへのＮ末端融合（図５、「Ａ２」と表示された行におけるヒストグラム）としての両方のｓｃＦｖ断片に関して、発現が見られ、最高レベルは、Ａｇａ２ｐ融合体について達成された（ＭＦＩはバックグラウンドより３０倍高かった）。重要なことには、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、存在する細胞のうち、表面タンパク質を発現しない陰性集団（４０〜８０％）が常にあるが、いずれの融合体を用いたＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいても、ｓｃＦｖをディスプレイする場合、この現象は観察されなかった。理論に縛られるつもりはないが、これについての一つの可能性のある説明とは、エピソームプラスミドが用いられるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅと対照的に、その発現カセットは、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのゲノムへ安定的に組み込まれることである。リガンド結合検出について、ビオチン化抗原をストレプトアビジン−フィコエリトリンで検出した。ｓｃＦｖもまた、抗原に結合することができ、それらの正しいプロセシングおよびフォールディングが確認された（図５の「リガンド結合」と表示された列を参照）。ＣｗｐＩｐへのＮ末端融合（図５、「Ａ３」と表示された行におけるヒストグラム）およびＡｇａ２ｐへのＣ末端融合（図５、「Ａ４」と表示された行におけるヒストグラム）について、複数のクローンを試験した場合でも、発現を検出することができなかった。これらの場合においてｃ−Ｍｙｃが検出されなかったことについて、いくつかの理由で説明することができると思われる。第１に、ＣＷＰＩを用いたＹａｒｒｏｗｉａにおける、成功したタンパク質のディスプレイは、今までのところ、ｈｐ４ｄプロモーターおよびリーダー配列としてＸｐｒ２ ｐｒｅを用いている。１つの可能性は、発現構築物の違いが、観察された発現の欠如の原因であることである。第２に、ディスプレイされたタンパク質を検出不可能にさせ得る、エピトープタグのタンパク質分解に起因する可能性がある。ＬＩＰ２ ｐｒｅｐｒｏをリーダーとして用いた場合、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）Ｓａｇ１ｐ融合体について約３倍の増加が見られた（データは示していない）。免疫蛍光顕微鏡法により、ディスプレイされたｓｃＦｖの細胞表面局在化が明らかに示されている（図６Ａ参照）。
【０１３９】
Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞がそれらの表面上でヘテロダイマーＦａｂ断片を機能的にアッセンブルすることができるか否かを評価するために、２つの異なるＦａｂ断片（４−４−２０抗体由来およびトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）抗体由来）の発現を誘導し、その後、免疫蛍光顕微鏡法およびフローサイトメトリーによって発現を分析した。Ｙａｒｒｏｗｉａ株ｐＯ１ｄを、ＡＧＡ１（ＡＤＥ２マーカーを用いる）、重鎖断片（ＵＲＡ３マーカーを用いる）、および軽鎖断片（ＬＥＵ２マーカーを用いる）についての発現カセットで連続的に形質転換して、最終的に、完全に相補された株が生じた。実施例１に記載されているように、細胞を増殖させ、誘導した。融合したエピトープタグ（ＨＣ Ｆａｂ断片についてのｃ−ｍｙｃ、およびＬＣ断片についてのＶ５）に対する免疫学的染色によって、重鎖および軽鎖の発現についてＹａｒｒｏｗｉａ細胞を標識し、抗原結合を評価した（図７参照）。ＣｗｐＩｐへの融合体を除く全ての構築物について、Ｆａｂ重鎖（ＣＨ１−ＶＨ）および軽鎖の両方のディスプレイが確認された。全ての場合において、細胞集団の１００％が、機能し得るヘテロダイマーＦａｂ断片を発現し、上記のｓｃＦｖ断片で得られた結果（図７参照；２つのピーク（１つの陰性（自己蛍光）ピークおよび１つの陽性ピーク）の出現ではなく、完全ピークのシフトが観察された）が確認された。２色のＦＡＣＳ分析を用いるＨＣおよびＬＣトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）Ｆａｂ断片の同時標識により、個々の酵母細胞の表面上での両方の鎖の対形成が示された（図８、「ＨＣ＋ＬＣ」と表示された行におけるヒストグラム参照）。さらに、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ＨＣ Ｆａｂ断片の非存在下において、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）ＬＣ断片を、酵母細胞の表面上で検出することができず、その複合体のヘテロダイマー構成が実証された（図８、中央行のヒストグラム参照）。両方の抗体について、抗原結合が確認された（図７、「リガンド結合」と表示された列のヒストグラム）。しかしながら、抗原が結合した程度は、抗体融合体の分子構成によって異なった。また、その２つの抗体クローンについて異なるディスプレイ様式を比較した場合、ディスプレイ効率の変化が観察された（図７、点線）。免疫蛍光顕微鏡法により、重鎖と軽鎖の両方の共局在が示された（図６Ｂ参照）。図６において、Ｆａｂ断片およびｓｃＦｖ ４−４−２０抗体断片が発現した。検出は、アンカー型重鎖断片についてｃ−ｍｙｃ染色、および軽鎖断片についてＶ５染色によって行った。
【０１４０】
Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞がそれらの表面上で完全長ＩｇＧを機能的にアッセンブルすることができるか否かを評価するために、単一のＩｇＧ Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラスツズマブ）の発現を誘導し、その後、免疫蛍光顕微鏡法およびフローサイトメトリーによって発現を分析した。したがって、Ｆａｂについて行ったのと同様に、両方の鎖の発現カセットで単一のＹａｒｒｏｗｉａ ｐＯ１ｄ株を形質転換して、完全に相補された株を作製した。重鎖および軽鎖を同時に染色することにより（それぞれ、ｃ−ｍｙｃ染色およびＶ５染色）、ＦＡＣＳを用いて、ディスプレイを確認した。図１７は、２つの様式Ａ２およびＡ４（それぞれ、ＡＧＡ２へのＮ末端融合およびＣ末端融合）における完全長トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）ディスプレイのフローサイトメトリー分析を示す。図に示されているように、全ての細胞が、完全長重鎖および軽鎖の発現を同時に示している。トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）Ｆａｂディスプレイについて観察されたのと同様に、Ｎ末端融合と比較して、重鎖がＡＧＡ２アンカーのＣ末端に融合している場合について、ディスプレイ効率の劇的な向上が観察された。
【０１４１】
実施例７：抗体断片の発現の向上のためのディスプレイ株の操作
抗体断片（ｓｃＦｖおよびＦａｂ）の産生における律速工程は、タンパク質フォールディング、ジスルフィド架橋形成、および小胞体（ＥＲ）における機能的アッセンブリである場合が多い。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＰＤＩおよびＫａｒ２／Ｂｉｐなどの分子シャペロンの過剰発現は、ｓｃＦｖ産生にプラスの効果を生じることが示されている（全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ｓｈｕｓｔａ，Ｅ．Ｖ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６、７７３−７、１９９８）。また、ＰＤＩの共発現が、Ｆａｂ過剰発現でのフォールディングストレスを軽減し、その結果として、産生レベルの中程度の増加を生じることが、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて示されている（全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ｇａｓｓｅｒ，Ｂ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９４、３５３−６１、２００６）。しかしながら、いくつかの場合、シャペロンの共発現によって、結果として、発現レベルに変化が生じず、さらには減少さえ生じた。抗体分泌を向上させる別の可能性は、ＨＡＣＩ転写因子の過剰発現により小胞体ストレス応答（ｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（ＵＰＲ）を誘導することである；Ｆａｂ分泌の中程度の向上が以前に報告されている（同上）。
【０１４２】
表面にディスプレイされるタンパク質および分泌されるタンパク質の両方が、同じ分泌経路を介して移動するため、細胞表面ディスプレイが、分泌能力とよく相関することは知られている（全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ｓｈｕｓｔａ，Ｅ．Ｖ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９２、９４９−５６、１９９９）。このように、表面ディスプレイレベルは、個々の細胞を発現レベルに関連づける容易な読み取りとしての役割を果たす。
【０１４３】
ここで、ＹａｒｒｏｗｉａのＰＤＩおよびＨＡＣＩ発現のｓｃＦｖおよびＦａｂ産生への効果を、上記で開発されたディスプレイプラットフォームを用いてＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいて初めて試験した。Ｙａｒｒｏｗｉａ ＰＤＩは、ＴＥＦプロモーターの調節下で構成的に発現し、Ｙａｒｒｏｗｉａ ＨＡＣＩ転写因子は、ｐＰＯＸ２プロモーターの調節下で誘導性に発現した。両方のカセットで、（上記の）トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）ｓｃＦｖディスプレイ株およびＦａｂディスプレイ株を共形質転換し、正しいゲノム組込みをＰＣＲによって確認した。図９に示されているように、構成的ＰＤＩ共発現は、結果として、ｃ−ｍｙｃ ＭＦＩによって測定した場合、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）ｓｃＦｖ−Ｓａｇ１ｐディスプレイの２倍の増加、およびトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）Ｆａｂ−Ａｇａ２ディスプレイの１．２倍の増加を生じた。これとは反対に、誘導性ＨＡＣＩ共発現は、結果として、ｓｃＦｖ断片およびＦａｂ断片の両方の減少を生じた。これらの結果は、ジスルフィド結合が、ｓｃＦｖ断片およびＦａｂ断片の分泌における律速工程であることを示している。しかしながら、ＵＰＲ（小胞体ストレス応答）経路の誘導が、劇的なマイナスの影響を生じた。これは、以前に、ｓｃＦｖのディスプレイについて観察されており（全体として参照により本明細書に組み入れられた、Ｒａｋｅｓｔｒａｗ，Ａ． ＆ Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｋ．Ｄ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９３、８９６−９０５、２００６）、正しくフォールディングされていないタンパク質がＥＲ分解経路（ＥＲＡＤ）へ送られるという事実（このこともまた、ＵＰＲ誘導中に上方制御される）によって説明することができると思われる。
【０１４４】
実施例８：ディスプレイされるトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）ｓｃＦｖについての用量反応曲線
トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）の表面ディスプレイされたｓｃＦｖ融合タンパク質の結合親和性を、平衡結合力価測定曲線から決定した。いずれかの抗体融合体をディスプレイする細胞を、様々な濃度のＨＥＲ２−Ｆｃキメラタンパク質中、２５℃で３時間、インキュベートした。細胞集団の平均蛍光を、フローサイトメトリーによって測定した。図１０は、３つの独立した力価測定の結果を示す。「ｐｒｅＡ１−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ｓｃＦｖ」と表示された線グラフは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓａｇ１ｐのＣ末端の３２０個のアミノ酸へのＮ末端融合として融合し、かつＬｉｐ２ｐｒｅリーダー配列と共に発現したトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）ｓｃＦｖについての用量反応曲線を示す。「ｐｒｅｐｒｏＡ１−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ｓｃＦｖ」と表示された線グラフは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓａｇ１ｐのＣ末端の３２０個のアミノ酸へのＮ末端融合として融合し、かつＬｉｐ２ｐｒｅｐｒｏリーダー配列と共に発現したトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）ｓｃＦｖについての用量反応曲線を示す。「ｐｒｅＡ２−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ ｓｃＦｖ」と表示された線グラフは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｇａ２ｐへのＮ末端融合として融合し、かつＬｉｐ２ｐｒｅリーダー配列と共に発現したトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）ｓｃＦｖについての用量反応曲線を示す。Ｙ軸は、結合割合を示し、その結合割合は、ＭＦＩ／（ＭＦＩｍａｘ−ＭＦＩｍｉｎ）として計算され、標準化され、パーセンテージとして表される。非線形最小二乗によって平衡解離定数、Ｋｄを当てはめた。ＨＥＲ２−Ｆｃに対する酵母ディスプレイされたトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）−Ｓａｇ１ｐ融合体の親和性（Ｋｄ＝１．９ｎＭ）は、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）−Ａｇａ２ｐ融合体についての親和性（Ｋｄ＝０．７ｎＭ）より２．７倍高かった。
【０１４５】
実施例９：定方向進化のための足場としてのＹａｒｒｏｗｉａディスプレイプラットフォームの実証
最大定方向進化効率を得るために、足場は、クローン間を親和性におけるわずかな差だけで効果的に識別することができるべきである。以前に、酵母ディスプレイが、親和性における２倍の差での抗体クローン間の微細な識別を可能にすることが示された。全体として参照により本明細書に組み入れられた、ＶａｎＡｎｔｗｅｒｐ，Ｊ．Ｊ． ＆ Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｋ．Ｄ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１６、３１−７、２０００を参照。抗鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ）ｓｃＦｖ Ｍ３は、抗ＨＥＬ ｓｃＦｖ Ｄ１．３が有するより、ＨＥＬに対して２倍高い親和性を有する。ディスプレイされたポリペプチドは、Ｓａｇ１ｐ融合ポリペプチド（「ｐｒｅＡ１ Ｄ１．３ 対 Ｍ３」と表示された線グラフ）およびＡｇａ２ｐ融合ポリペプチド（「ｐｒｅＡ２ Ｄ１．３ 対 Ｍ３」と表示された線グラフ）として発現した。Ｄ１．３またはＭ３をディスプレイする細胞を、様々な濃度のビオチン化ＨＥＬとインキュベートした。次に、平均蛍光を、フローサイトメトリーによって測定した。それぞれの表面ディスプレイされた抗体の結合親和性を、平衡結合力価測定曲線によって決定した。図１１は、３つの独立した力価測定の平均結果を示し、それに曲線を非線形最小二乗によって当てはめた。Ｄ１．３のＨＥＬに対する親和性は、Ｍ３のＨＥＬに対する親和性と比較して、Ｓａｇ１ｐ融合体およびＡｇａ２ｐ融合体、それぞれについて、２．９分の１および２．７分の１であることが決定された。
【０１４６】
この実施例は、開発されたＹａｒｒｏｗｉａディスプレイ足場が、親和性におけるわずかな差だけでクローン間を効果的に識別することを示し、この系のスクリーニングの潜在能力を確認した。
【０１４７】
実施例１０：ＦＡＣＳを用いるモデル濃縮実験
Ｄ１．３をディスプレイする酵母細胞および向上した変異体Ｍ３をディスプレイする酵母細胞の混合物を用いる単一パス濃縮を実施した。Ｍ３変異体ｓｃＦｖをディスプレイする細胞を、さらに、ハイグロマイシン発現カセットで形質転換した。発現レベルへの有意な効果は観察されなかった。Ｍ３細胞を、１／１０００の比率でバックグラウンドＤ１．３細胞へ混合し、最適な識別のために、０．３ｎＭの抗原濃度において平衡に達するまで、インキュベートした。約０．１％のソーティングウィンドウでの高純度モードで細胞をソーティングした（示していない）。濃縮係数を、選択プレート上での力価測定により決定し、８００の最大濃縮が得られた。濃縮は、濃縮前および後の選択プレート上でのレプリカプレーティング（ｒｅｐｌｉｃａ ｐｌａｔｉｎｇ）によって計算することができる。
【０１４８】
実施例１１：Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける複製型ベクターを用いた表面ディスプレイ
ｐＰＯＸ２プロモーターにより駆動されるｓｃＦｖ−ＡＧＡ２発現カセット、およびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける複製増殖のためのＡＲＳ１８を含有するように、複製型ベクターを構築した（図１５）。（ＡＧＡ１−ＡＧＡ２ヘテロダイマー化のための）ＡＧＡ１発現カセットを含有するＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ株への形質転換により、１．２×１０６／μｇの形質転換効率が得られた。この効率は、ゼータに基づいた組込みを用いるランダム組込みについて観察することができたものと比較して、２０倍高かった。ライブラリー構築について、高い形質転換効率は、所望の複雑度を得るのに有利である。プラスミド増殖を保つために、細胞を、ロイシンの非存在での選択条件下で増殖させた。
【０１４９】
選択条件（ＣＳＭ−ロイシンを補充した最少培地）下および非選択条件（ＣＳＭを補充したＭＭ）下の両方に関して、増殖した１０個のクローンについて発現研究を、ＦＡＣＳを用いて実施した。組込み型プラスミドについて観察されたこと（図１６Ａ）とは違って、複製型ベクターで形質転換された細胞の誘導により、ｓｃＦｖを発現しなかった細胞集団が存在する。この陰性集団は、細胞が選択圧下で増殖した場合でさえも存在し（図１６Ｂ）、プラスミド喪失がこの観察の根拠ではなかったことを示した。この現象は、表面ディスプレイのために複製型プラスミドを用いたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて観察することができることと類似している。１０個のクローンの分析により、細胞の平均４３％がｓｃＦｖの表面発現に関して陽性であることが明らかにされた（図１６Ｂ参照）。平均蛍光強度は、組込み型プラスミドを用いて得られた結果と異ならなかった（すなわち、平均蛍光は同じ範囲内であった）。
【０１５０】
実施例１２：ＦＡＣＳを用いる濃縮実験
Ｄ１．３の多様化ライブラリーをディスプレイする酵母細胞の混合物を用いる濃縮を、１ｎＭの抗原濃度で実施した。約０．１％のソーティングウィンドウでの高純度モードで細胞をソーティングした（示していない）。連続した３ラウンドのソーティングを実行した。以下の２個のより高い親和性のクローンを単離した：１．７ｎＭの親和性を示すクローン１（Ｉｌｅ１６０Ｖａｌ、Ｔｈｒ２２８Ａｌａ）、および２．２ｎＭの親和性を示すクローン２（Ｉｌｅ１６０Ｖａｌ）。
【０１５１】
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と共に記載されているが、前記の説明は例示を意図し、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は、添付された特許請求の範囲の範囲によって定義されることは理解されているはずである。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットであって、該融合配列は、
アンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列、および
該第１の核酸配列にインフレームで融合した抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸配列
を含む、発現カセット。
【請求項２】
アンカーポリペプチドをコードするアンカーヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットであって、該第１の核酸配列は、第２の核酸配列によってコードされる目的の第２の融合パートナーを含む融合ポリペプチドにおける第１の融合パートナーとして発現され得る、発現カセット。
【請求項３】
前記目的の第２の融合パートナーをコードする第２の核酸配列をさらに含む、請求項２に記載の発現カセット。
【請求項４】
制限部位の全部または一部をさらに含む、請求項３に記載の発現カセット。
【請求項５】
前記目的の第２の融合パートナーが抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を含む、請求項３に記載の発現カセット。
【請求項６】
前記抗体ポリペプチド断片がｓｃＦｖ断片である、請求項１または請求項５に記載の発現カセット。
【請求項７】
前記抗体ポリペプチド断片がＦａｂ断片の重鎖である、請求項１または請求項５に記載の発現カセット。
【請求項８】
前記抗体ポリペプチド断片がＦａｂ断片の軽鎖である、請求項１に記載の発現カセットベクター。
【請求項９】
前記第１の核酸配列が前記第２の核酸配列の３’に融合しており、ここで、前記融合配列から産生される融合ポリペプチドが、Ｎ末端の抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片およびＣ末端のアンカーポリペプチドを含む、請求項１または３〜８のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項１０】
前記第１の核酸配列が前記第２の核酸配列の５’に融合しており、ここで、前記融合配列から産生される融合ポリペプチドが、Ｎ末端のアンカーポリペプチドおよびＣ末端の抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を含む、請求項１〜８に記載の発現カセット。
【請求項１１】
前記プロモーターが構成的である、前述の請求項のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項１２】
前記プロモーターが誘導性である、前述の請求項のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項１３】
前記プロモーターがＰＯＸ２またはＬＩＰ２プロモーターである、請求項１２に記載の発現カセット。
【請求項１４】
前記プロモーターが半構成的である、前述の請求項のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項１５】
前記プロモーターがｈｐ４ｄプロモーターである、請求項１４に記載の発現カセット。
【請求項１６】
リーダーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むリーダー核酸配列をさらに含む前述の請求項のいずれか一項に記載の発現カセットであって、該リーダー核酸配列が、前記第１の核酸配列および前記第２の核酸配列の５’にインフレームで融合している、発現カセット。
【請求項１７】
前記リーダーポリペプチドが、ＬＩＰ２ ｐｒｅ、ＬＩＰ２ ｐｒｅｐｒｏ、ＸＰＲ２ ｐｒｅ、およびＸＰＲ２ ｐｒｅｐｒｏからなる群より選択される、請求項１６に記載の発現カセット。
【請求項１８】
リンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むリンカー核酸配列をさらに含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項１９】
前記リンカー核酸配列が、前記第１の核酸配列と前記第２の核酸配列との間にインフレームで融合している、請求項１８に記載の発現カセット。
【請求項２０】
前記抗体ポリペプチドがｓｃＦｖ抗体ポリペプチドを含み、前記リンカー核酸配列が、該ｓｃＦｖポリペプチドの可変領域をコードする重鎖核酸配列と可変領域をコードする軽鎖核酸配列との間にインフレームで融合している、請求項１８に記載の発現カセット。
【請求項２１】
前記リンカーポリペプチドが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号１４）または（ＧｌｙＳｅｒ）５（配列番号１５）を含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項２２】
１つまたは複数のエピトープタグをコードするヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の核酸配列をさらに含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項２３】
前記１つまたは複数のエピトープタグが、ｃ−Ｍｙｃ、Ｖ５、ヘキサヒスチジン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ストレプトアビジン、ビオチン、赤血球凝集素、Ｆｌａｇ−タグ、およびＥ−タグからなる群より選択される、請求項２２に記載の発現カセット。
【請求項２４】
前記アンカーポリペプチドが、Ａｇａ１ｐポリペプチドまたはその断片、Ａｇａ２ｐポリペプチドまたはその断片、およびＳａｇ１ｐポリペプチドまたはその断片からなる群より選択される、前述の請求項のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項２５】
前記抗体ポリペプチドもしくは抗体ポリペプチド断片、前記アンカーポリペプチド、またはその両方が、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞における発現のためにコドン最適化されている、前述の請求項のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項２６】
前述の請求項のいずれか一項に記載の発現カセットを含むベクター。
【請求項２７】
ゼータエレメントをさらに含む、請求項２６に記載のベクター。
【請求項２８】
前記ゼータエレメントがレトロトランスポゾンの長い末端反復である、請求項２７に記載のベクター。
【請求項２９】
前記ゼータエレメントがＹｌｔ１またはＴｙｌ６レトロトランスポゾンの長い末端反復である、請求項２８に記載の発現カセット。
【請求項３０】
１つまたは複数の常染色体複製エレメントをさらに含む、請求項２６に記載のベクター。
【請求項３１】
少なくとも１つの常染色体複製エレメントがセントロメア（ＣＥＮ）および複製起点（ＯＲＩ）を含む、請求項３０に記載のベクター。
【請求項３２】
前記セントロメアがＣＥＮ１またはＣＥＮ３であり、前記複製起点がＯＲＩ１０６８またはＯＲＩ３０１８である、請求項３１に記載のベクター。
【請求項３３】
自律複製配列（ＡＲＳ）をさらに含む請求項２６に記載のベクターであって、該ＡＲＳがセントロメアおよび複製起点を含む、ベクター。
【請求項３４】
前記ＡＲＳがＡＲＳ１８を含む、請求項３３に記載のベクター。
【請求項３５】
前記ＡＲＳがＡＲＳ６８を含む、請求項３３に記載のベクター。
【請求項３６】
１つまたは複数の選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の核酸配列をさらに含む、請求項２６〜３５のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項３７】
前記１つまたは複数の選択マーカーが、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３ｄ１、ＡＤＥ２、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｕｔ、Ｔｒｐ、Ｇ３ｐ、およびｈｐｈからなる群より選択される、請求項３０に記載のベクター。
【請求項３８】
Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞の表面上に抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をディスプレイする方法であって、
融合配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む第１のベクターであって、該融合配列は、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列、および該第１の核酸配列にインフレームで融合したアンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸配列を含む、第１のベクターを、第１のＹａｒｒｏｗｉａ細胞へ導入する工程、および
ある期間、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件下で該第１のＹａｒｒｏｗｉａ細胞をインキュベートする工程
を含む、方法。
【請求項３９】
前記第１のベクターが請求項２０〜２５のいずれか一項に記載のベクターである、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記抗体ポリペプチド断片がｓｃＦｖ断片である、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗体ポリペプチド断片がＦａｂ断片の重鎖である、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４２】
Ｆａｂ断片の軽鎖をコードする核酸配列に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２のベクターを、前記第１のＹａｒｒｏｗｉａ細胞へ導入する工程をさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記抗体ポリペプチド断片がＦａｂ断片の軽鎖である、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４４】
Ｆａｂ断片の重鎖をコードする核酸配列に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２のベクターを、前記第１のＹａｒｒｏｗｉａ細胞へ導入する工程をさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記第１のＹａｒｒｏｗｉａ細胞が一倍体であり、前記第２のベクターを導入する工程が、前記第１のベクターを含む該第１の一倍体Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を、該第２のベクターを含む第２の一倍体Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞と接合させる工程を含み、該第１のＹａｒｒｏｗｉａ細胞と該第２のＹａｒｒｏｗｉａ細胞とが反対の接合型である、請求項４２または４４に記載の方法。
【請求項４６】
第１の核酸配列が第２の核酸配列の５’に融合しており、ここで、前記融合配列から産生される融合ポリペプチドが、Ｎ末端の抗体ポリペプチドまたはその抗体ポリペプチド断片およびＣ末端のアンカーポリペプチドを含む、請求項３８〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
第１の核酸配列が第２の核酸配列の３’に融合しており、ここで、前記融合配列から産生される融合ポリペプチドが、Ｎ末端のアンカーポリペプチドおよびＣ末端の抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を含む、請求項３８〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件が低い誘導温度を含む、請求項３８〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記低い誘導温度が、約摂氏１５度から摂氏２５度の温度を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記低い誘導温度が、約摂氏２０度の温度を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件が短い誘導時間を含む、請求項３８〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記短い誘導時間が約２４時間以下を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記短い誘導時間が約１６時間以下を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記短い誘導時間が約１６時間を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件が低いｐＨを含む、請求項３８〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記低いｐＨが約２から約４のｐＨを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記低いｐＨが約３のｐＨを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件が高い通気条件を含む、請求項３８〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記高い通気条件が振盪フラスコ内でのインキュベーションを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件が、前記第１のＹａｒｒｏｗｉａ細胞を最少培地中でインキュベートすることを含む、請求項３８〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記最少培地が、酵母抽出物、Ｂａｃｔｏペプトン、またはその両方を欠く培地である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記第１のベクターがＹａｒｒｏｗｉａゲノムへ組み込まれる、請求項３８〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞がシャペロンを発現する、請求項３８〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記シャペロンが、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、Ｋａｒ２／Ｂｉｐ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記アンカーポリペプチドが、Ａｇａ１ｐポリペプチドもしくはその断片、Ａｇａ２ｐポリペプチドもしくはその断片、またはＳａｇ１ｐポリペプチドもしくはその断片からなる群より選択される、請求項３８〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
請求項３８〜６５のいずれか一項に記載の方法によって得られる抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片。
【請求項６７】
標的ポリペプチドを結合する抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を含むＹａｒｒｏｗｉａ細胞を選択する方法であって、
抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を表面上にディスプレイする親Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を供給する工程、
該親Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を試験ポリペプチドと接触させる工程、および
該ディスプレイされた抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片が該標的ポリペプチドを結合する場合に、該親Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を選択する工程
を含む、方法。
【請求項６８】
前記親Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞が、請求項３８〜６５のいずれか一項に記載の方法によって産生される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記選択された親Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞から、前記抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片の第１の発現カセットを単離する工程、
該抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列に１つまたは複数の変化を導入して、改変型発現カセットを作製する工程、
該第１の発現カセットを欠く第２のＹａｒｒｏｗｉａ細胞へ該改変型発現カセットを導入して、改変型Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を作製する工程、
該改変型Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞をある期間、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件下でインキュベートする工程、
該改変型Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を前記標的ポリペプチドと接触させる工程、および
該改変型Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞が、該親Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞より高い親和性またはアビディティで該標的ポリペプチドを結合する場合に、該改変型Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を選択する工程
をさらに含む、請求項６７または６８に記載の方法。
【請求項７０】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の発現カセットを含むキット。
【請求項７１】
請求項２６〜３７のいずれか一項に記載のベクターを含むキット。
【請求項７２】
Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞をさらに含む、請求項７０または７１に記載のキット。
【請求項７３】
前記発現カセットを用いるための書面による使用説明書をさらに含む、請求項７０または７２に記載のキット。
【請求項７４】
前記ベクターを用いるための書面による使用説明書をさらに含む、請求項７１または７２に記載のキット。
【請求項１】
融合配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットであって、該融合配列は、
アンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列、および
該第１の核酸配列にインフレームで融合した抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸配列
を含む、発現カセット。
【請求項２】
アンカーポリペプチドをコードするアンカーヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットであって、該第１の核酸配列は、第２の核酸配列によってコードされる目的の第２の融合パートナーを含む融合ポリペプチドにおける第１の融合パートナーとして発現され得る、発現カセット。
【請求項３】
前記目的の第２の融合パートナーをコードする第２の核酸配列をさらに含む、請求項２に記載の発現カセット。
【請求項４】
制限部位の全部または一部をさらに含む、請求項３に記載の発現カセット。
【請求項５】
前記目的の第２の融合パートナーが抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を含む、請求項３に記載の発現カセット。
【請求項６】
前記抗体ポリペプチド断片がｓｃＦｖ断片である、請求項１または請求項５に記載の発現カセット。
【請求項７】
前記抗体ポリペプチド断片がＦａｂ断片の重鎖である、請求項１または請求項５に記載の発現カセット。
【請求項８】
前記抗体ポリペプチド断片がＦａｂ断片の軽鎖である、請求項１に記載の発現カセットベクター。
【請求項９】
前記第１の核酸配列が前記第２の核酸配列の３’に融合しており、ここで、前記融合配列から産生される融合ポリペプチドが、Ｎ末端の抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片およびＣ末端のアンカーポリペプチドを含む、請求項１または３〜８のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項１０】
前記第１の核酸配列が前記第２の核酸配列の５’に融合しており、ここで、前記融合配列から産生される融合ポリペプチドが、Ｎ末端のアンカーポリペプチドおよびＣ末端の抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を含む、請求項１〜８に記載の発現カセット。
【請求項１１】
前記プロモーターが構成的である、前述の請求項のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項１２】
前記プロモーターが誘導性である、前述の請求項のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項１３】
前記プロモーターがＰＯＸ２またはＬＩＰ２プロモーターである、請求項１２に記載の発現カセット。
【請求項１４】
前記プロモーターが半構成的である、前述の請求項のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項１５】
前記プロモーターがｈｐ４ｄプロモーターである、請求項１４に記載の発現カセット。
【請求項１６】
リーダーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むリーダー核酸配列をさらに含む前述の請求項のいずれか一項に記載の発現カセットであって、該リーダー核酸配列が、前記第１の核酸配列および前記第２の核酸配列の５’にインフレームで融合している、発現カセット。
【請求項１７】
前記リーダーポリペプチドが、ＬＩＰ２ ｐｒｅ、ＬＩＰ２ ｐｒｅｐｒｏ、ＸＰＲ２ ｐｒｅ、およびＸＰＲ２ ｐｒｅｐｒｏからなる群より選択される、請求項１６に記載の発現カセット。
【請求項１８】
リンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むリンカー核酸配列をさらに含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項１９】
前記リンカー核酸配列が、前記第１の核酸配列と前記第２の核酸配列との間にインフレームで融合している、請求項１８に記載の発現カセット。
【請求項２０】
前記抗体ポリペプチドがｓｃＦｖ抗体ポリペプチドを含み、前記リンカー核酸配列が、該ｓｃＦｖポリペプチドの可変領域をコードする重鎖核酸配列と可変領域をコードする軽鎖核酸配列との間にインフレームで融合している、請求項１８に記載の発現カセット。
【請求項２１】
前記リンカーポリペプチドが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号１４）または（ＧｌｙＳｅｒ）５（配列番号１５）を含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項２２】
１つまたは複数のエピトープタグをコードするヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の核酸配列をさらに含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項２３】
前記１つまたは複数のエピトープタグが、ｃ−Ｍｙｃ、Ｖ５、ヘキサヒスチジン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ストレプトアビジン、ビオチン、赤血球凝集素、Ｆｌａｇ−タグ、およびＥ−タグからなる群より選択される、請求項２２に記載の発現カセット。
【請求項２４】
前記アンカーポリペプチドが、Ａｇａ１ｐポリペプチドまたはその断片、Ａｇａ２ｐポリペプチドまたはその断片、およびＳａｇ１ｐポリペプチドまたはその断片からなる群より選択される、前述の請求項のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項２５】
前記抗体ポリペプチドもしくは抗体ポリペプチド断片、前記アンカーポリペプチド、またはその両方が、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞における発現のためにコドン最適化されている、前述の請求項のいずれか一項に記載の発現カセット。
【請求項２６】
前述の請求項のいずれか一項に記載の発現カセットを含むベクター。
【請求項２７】
ゼータエレメントをさらに含む、請求項２６に記載のベクター。
【請求項２８】
前記ゼータエレメントがレトロトランスポゾンの長い末端反復である、請求項２７に記載のベクター。
【請求項２９】
前記ゼータエレメントがＹｌｔ１またはＴｙｌ６レトロトランスポゾンの長い末端反復である、請求項２８に記載の発現カセット。
【請求項３０】
１つまたは複数の常染色体複製エレメントをさらに含む、請求項２６に記載のベクター。
【請求項３１】
少なくとも１つの常染色体複製エレメントがセントロメア（ＣＥＮ）および複製起点（ＯＲＩ）を含む、請求項３０に記載のベクター。
【請求項３２】
前記セントロメアがＣＥＮ１またはＣＥＮ３であり、前記複製起点がＯＲＩ１０６８またはＯＲＩ３０１８である、請求項３１に記載のベクター。
【請求項３３】
自律複製配列（ＡＲＳ）をさらに含む請求項２６に記載のベクターであって、該ＡＲＳがセントロメアおよび複製起点を含む、ベクター。
【請求項３４】
前記ＡＲＳがＡＲＳ１８を含む、請求項３３に記載のベクター。
【請求項３５】
前記ＡＲＳがＡＲＳ６８を含む、請求項３３に記載のベクター。
【請求項３６】
１つまたは複数の選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の核酸配列をさらに含む、請求項２６〜３５のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項３７】
前記１つまたは複数の選択マーカーが、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３ｄ１、ＡＤＥ２、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｕｔ、Ｔｒｐ、Ｇ３ｐ、およびｈｐｈからなる群より選択される、請求項３０に記載のベクター。
【請求項３８】
Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞の表面上に抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をディスプレイする方法であって、
融合配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む第１のベクターであって、該融合配列は、抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸配列、および該第１の核酸配列にインフレームで融合したアンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸配列を含む、第１のベクターを、第１のＹａｒｒｏｗｉａ細胞へ導入する工程、および
ある期間、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件下で該第１のＹａｒｒｏｗｉａ細胞をインキュベートする工程
を含む、方法。
【請求項３９】
前記第１のベクターが請求項２０〜２５のいずれか一項に記載のベクターである、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記抗体ポリペプチド断片がｓｃＦｖ断片である、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗体ポリペプチド断片がＦａｂ断片の重鎖である、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４２】
Ｆａｂ断片の軽鎖をコードする核酸配列に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２のベクターを、前記第１のＹａｒｒｏｗｉａ細胞へ導入する工程をさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記抗体ポリペプチド断片がＦａｂ断片の軽鎖である、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４４】
Ｆａｂ断片の重鎖をコードする核酸配列に作動可能に連結された第２のプロモーターを含む第２のベクターを、前記第１のＹａｒｒｏｗｉａ細胞へ導入する工程をさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記第１のＹａｒｒｏｗｉａ細胞が一倍体であり、前記第２のベクターを導入する工程が、前記第１のベクターを含む該第１の一倍体Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を、該第２のベクターを含む第２の一倍体Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞と接合させる工程を含み、該第１のＹａｒｒｏｗｉａ細胞と該第２のＹａｒｒｏｗｉａ細胞とが反対の接合型である、請求項４２または４４に記載の方法。
【請求項４６】
第１の核酸配列が第２の核酸配列の５’に融合しており、ここで、前記融合配列から産生される融合ポリペプチドが、Ｎ末端の抗体ポリペプチドまたはその抗体ポリペプチド断片およびＣ末端のアンカーポリペプチドを含む、請求項３８〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
第１の核酸配列が第２の核酸配列の３’に融合しており、ここで、前記融合配列から産生される融合ポリペプチドが、Ｎ末端のアンカーポリペプチドおよびＣ末端の抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を含む、請求項３８〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件が低い誘導温度を含む、請求項３８〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記低い誘導温度が、約摂氏１５度から摂氏２５度の温度を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記低い誘導温度が、約摂氏２０度の温度を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件が短い誘導時間を含む、請求項３８〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記短い誘導時間が約２４時間以下を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記短い誘導時間が約１６時間以下を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記短い誘導時間が約１６時間を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件が低いｐＨを含む、請求項３８〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記低いｐＨが約２から約４のｐＨを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記低いｐＨが約３のｐＨを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件が高い通気条件を含む、請求項３８〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記高い通気条件が振盪フラスコ内でのインキュベーションを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件が、前記第１のＹａｒｒｏｗｉａ細胞を最少培地中でインキュベートすることを含む、請求項３８〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記最少培地が、酵母抽出物、Ｂａｃｔｏペプトン、またはその両方を欠く培地である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記第１のベクターがＹａｒｒｏｗｉａゲノムへ組み込まれる、請求項３８〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞がシャペロンを発現する、請求項３８〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記シャペロンが、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、Ｋａｒ２／Ｂｉｐ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記アンカーポリペプチドが、Ａｇａ１ｐポリペプチドもしくはその断片、Ａｇａ２ｐポリペプチドもしくはその断片、またはＳａｇ１ｐポリペプチドもしくはその断片からなる群より選択される、請求項３８〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
請求項３８〜６５のいずれか一項に記載の方法によって得られる抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片。
【請求項６７】
標的ポリペプチドを結合する抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を含むＹａｒｒｏｗｉａ細胞を選択する方法であって、
抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片を表面上にディスプレイする親Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を供給する工程、
該親Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を試験ポリペプチドと接触させる工程、および
該ディスプレイされた抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片が該標的ポリペプチドを結合する場合に、該親Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を選択する工程
を含む、方法。
【請求項６８】
前記親Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞が、請求項３８〜６５のいずれか一項に記載の方法によって産生される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記選択された親Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞から、前記抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片の第１の発現カセットを単離する工程、
該抗体ポリペプチドまたは抗体ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列に１つまたは複数の変化を導入して、改変型発現カセットを作製する工程、
該第１の発現カセットを欠く第２のＹａｒｒｏｗｉａ細胞へ該改変型発現カセットを導入して、改変型Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を作製する工程、
該改変型Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞をある期間、Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞作動条件下でインキュベートする工程、
該改変型Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を前記標的ポリペプチドと接触させる工程、および
該改変型Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞が、該親Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞より高い親和性またはアビディティで該標的ポリペプチドを結合する場合に、該改変型Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞を選択する工程
をさらに含む、請求項６７または６８に記載の方法。
【請求項７０】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の発現カセットを含むキット。
【請求項７１】
請求項２６〜３７のいずれか一項に記載のベクターを含むキット。
【請求項７２】
Ｙａｒｒｏｗｉａ細胞をさらに含む、請求項７０または７１に記載のキット。
【請求項７３】
前記発現カセットを用いるための書面による使用説明書をさらに含む、請求項７０または７２に記載のキット。
【請求項７４】
前記ベクターを用いるための書面による使用説明書をさらに含む、請求項７１または７２に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１５】
【公表番号】特表２０１３−５１７７６１（Ｐ２０１３−５１７７６１Ａ）
【公表日】平成２５年５月２０日（２０１３．５．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４９４４１（Ｐ２０１２−５４９４４１）
【出願日】平成２３年１月２１日（２０１１．１．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１１／０００２２７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８９５２７
【国際公開日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【出願人】（５０９２７５５０７）オキシレイン ユーケー リミテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月２０日（２０１３．５．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月２１日（２０１１．１．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１１／０００２２７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８９５２７
【国際公開日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【出願人】（５０９２７５５０７）オキシレイン ユーケー リミテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
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