酵素検出デバイス
提供された基質１０を修飾することができる酵素の試料中での有無を検出するための酵素検出デバイス１。デバイス１は、未修飾状態から修飾状態への酵素による修飾に感受性のある被修飾性領域１４を有する基質を備える。さらにデバイス１は、修飾状態または未修飾状態のいずれかの被修飾性領域１４と結合する基質認識分子１６を備える。混合されたとき、基質の被修飾性領域１４は基質認識分子１６によって、酵素と比較して、優先的に結合される。デバイスは、基質認識分子１７とカップリングされた検出可能な標識１８をさらに備える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素検出デバイス、より具体的には、修飾または未修飾いずれかの状態の特異的結合分子によって認識可能な、提供された基質を修飾することができる酵素を検出するための酵素検出デバイスに関する。本発明は、また基質を修飾することができる酵素を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床および研究の多くの状況で、特定の触媒活性を有する酵素の、試料中での存在を検出できることは有用である。この種の酵素の一例はプロテアーゼであり、ペプチド結合の加水分解および開裂によりタンパク質を消化する。したがって、プロテアーゼで分解されるタンパク質は２個以上のより小さなペプチドに開裂される。別の例は、より大きい炭水化物からシアル酸部分を開裂するシアリダーゼである。
【０００３】
試料の酵素を検出する診断試験キットがＵＳ２００６／０００３３９４に開示されている。このキットは、リポーターおよび特異的結合メンバーに結合された標的リガントをそれぞれ備える「反応性複合」を備える。標的リガントは、検出すべき酵素によって開裂して、リポーターを放出し得る。反応性複合および試料の混合物は、続いてクロマトグラフ媒質に施される。クロマトグラフ媒質は、標的リガント上の特異的結合メンバーを捕捉することができる第１の検出ゾーン、およびリポーターを結合することができる第２の検出ゾーンを備える。したがって、使用の際、試料および反応性複合の混合物はクロマトグラフ媒質に施され、まず第１の検出ゾーン、次いで第２の検出ゾーンを流れる。第１の検出ゾーンで標的リガントは捕捉される。試料中の任意の酵素は、標的リガントからリポーターを開裂し、開裂されたリポーターは第２の検出ゾーンで捕捉され、標的リガントに結合したままの開裂されていない任意のリポーターは第１の検出ゾーンに留まる。したがって、試料中に酵素が存在すると、第２の検出ゾーンでのリポーターの存在（または第１の検出ゾーンでのリポーターの欠如）によって判定される。
【０００４】
ＵＳ２００６／０００３３９４に開示されたキットに関する１つの問題は、混合物がクロマトグラフ媒質に沿って流れている間、酵素が引き続き活性であるので、キットは不正確な結果を出す傾向があり得るということである。反応性複合は第１の捕捉ゾーンで固定されているが、酵素は標的リガントからリポーターを開裂し続ける。したがって、第１の検出ゾーンおよび第２の検出ゾーンでの信号は、経時的に変わる傾向があり得、明確な反応終点がない。
【０００５】
ＵＳ２００６／０００３３９４のキットに関する別の問題は、それが標的リガントを開裂する酵素だけが検出でき、標的リガント（例えばリン酸化またはグリコシル化）への部分の付加などの他の作用がある酵素を検出することができないということである。
【０００６】
ＵＳ２００６／０００３３９４のキットに関するさらなる問題は、標的リガントの末端を開裂しなければならないエキソペプチダーゼまたはエキソカルボヒドラーゼなどの酵素の活性を検出することができないということである。それは、末端にリポーターを接合するために必要な条件が、酵素の活性部位との相互作用を妨げるであろう程度まで末端の化学的性質を変えるであろうからである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／０００３３９４号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記の問題の１つまたは複数を緩和しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一態様によると、
（ｉ）未修飾状態から修飾状態への酵素による修飾に感受性のある被修飾性領域を備える基質、
（ｉｉ）修飾状態または未修飾状態のいずれかの被修飾性領域と特異的に結合できる基質認識分子であり、基質認識分子の結合部位は、混合したときに、基質認識分子と酵素が競合的に被修飾性領域に結合されるような部位である基質認識分子、および
（ｉｉｉ）基質認識分子にカップリング可能な検出可能な標識
を含む、提供された基質を修飾できる酵素の試料中での有無を検出する酵素検出デバイスが提供される。
【００１０】
本発明の別の態様によると、
（ｉ）未修飾状態から修飾状態への酵素による修飾に感受性のある被修飾性領域を備える基質、
（ｉｉ）未修飾状態の基質の被修飾性領域と特異的に結合できる基質認識分子であり、基質認識分子の結合部位は、基質の被修飾性領域が、混合したときに酵素と比較して、前記基質認識分子により優先的に（または競合的に）結合されるような部位である基質認識分子、および
（ｉｉｉ）基質認識分子にカップリング可能な検出可能な標識
を含む、提供された基質を修飾できる酵素の試料中での有無を検出する酵素検出デバイスが提供される。
【００１１】
基質に対する基質認識分子の親和性は、比較的低い解離速度（ｋｄ）を有するのが有利である。
【００１２】
基質に対する基質認識分子の親和性は、比較的低い解離速度（ｋｄ）および比較的高い会合速度（ｋａ）を有するのが好ましい。
【００１３】
基質認識分子の解離速度（ｋｄ）は、１０−４．ｓ−１から１０−７．ｓ−１の間であるのが好ましく、より好ましくは１０−５．ｓ−１から１０−６．ｓ−１の間である。
【００１４】
基質認識分子の会合速度（ｋａ）は、１０５．ｓ−１から１０９．ｓ−１の間であるのが好ましく、より好ましくは１０７．ｓ−１から１０８．ｓ−１の間である。
【００１５】
基質認識分子は基質に対して、酵素が基質に対するより、低い解離速度（ｋｄ）および高い会合速度（ｋａ）を有するのが有利である。
【００１６】
基質は、固体担体に結着可能な結着領域をさらに備え、酵素検出デバイスは固体担体をさらに備えるのが好都合である。
【００１７】
酵素検出デバイスはクロマトグラフ媒質をさらに備えるのが好ましい。
【００１８】
基質はクロマトグラフ媒質に結着可能な結着領域をさらに備えるのが有利である。
【００１９】
クロマトグラフ媒質は、クロマトグラフ媒質上または中で固定され、基質の結着領域と結合することができる、第１の捕捉認識分子を備えるのが好都合である。
【００２０】
クロマトグラフ媒質は、基質の断片と場合によって組み合わせて、クロマトグラフ媒質上または中で固定され、基質認識分子と結合することができる第２の捕捉認識分子をさらに備えるのが好ましい。
【００２１】
第１の捕捉認識分子と結着領域および／または第２の捕捉認識分子と基質認識分子は、それぞれ、結合対の半分それぞれであるのが有利であり、結合対は次のとおりである：抗原と抗体またはこれに対して特異的な抗原結合性断片；ビオチンとアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンまたはキャプトアビジン；プロテインＡおよびＧ；炭水化物とレクチン；相補的な２つのヌクレオチド配列；エフェクターと受容体分子；ホルモンとホルモン結合タンパク質；酵素補助因子と酵素；酵素阻害剤と酵素；セルロース結合領域とセルロース繊維；固定されたアミノフェニルボロン酸とシス−ジオールを有する分子；キシログルカンとセルロース繊維およびその類似体、誘導体および断片。
【００２２】
基質認識分子は、抗体もしくはこの抗原結合性断片；レクチン；ヌクレオチド配列；受容体分子；または修飾状態もしくは未修飾状態のいずれかの被修飾性領域と結合することができるホルモン結合タンパク質であるのが好都合である。
【００２３】
代替として、基質認識分子は、未修飾ビオチンと結合できるアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンまたはキャプトアビジンである。
【００２４】
好ましくは、酵素は、加水分解酵素、好ましくはペプチダーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、カルボヒドラーゼ、ホスファターゼ、スルファターゼ、ノイラミニダーゼ、エステラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼである。
【００２５】
代替として、酵素は、キナーゼ、グリコシル転移酵素、オキシダーゼ、還元酵素またはトランスアミナーゼである。
【００２６】
酵素検出デバイスは、基質認識分子に結合した検出可能な標識をさらに備えるのが有利である。
【００２７】
検出可能な標識は、基質認識分子と共有結合で結合されるのが好都合である。
【００２８】
好ましくは、標識は蛍光団、金粒子、色原体、発光化合物；放射性化合物；可視化合物、信号発生物質を含有するリポソームまたは他の小胞、電気活性種または酵素およびその基質の組合せである。
【００２９】
酵素検出デバイスは、第１の酵素による修飾に感受性のある第１の基質の被修飾性領域および第２の酵素による修飾に感受性がある第２の基質の被修飾性領域をそれぞれ含む第１の基質および第２の基質を備えるのが有利である。
【００３０】
本発明の別の態様によると、
（ｉ）未修飾状態から修飾状態への酵素による修飾に感受性のある被修飾性領域を備える基質を設けるステップ、
（ｉｉ）酵素を含む疑いのある試料を準備するステップ、
（ｉｉｉ）未修飾状態または修飾状態のいずれかの被修飾性領域と特異的に結合できる基質認識分子であり、基質認識分子の結合部位は、混合したときに、基質認識分子と酵素が競合的に被修飾性領域に結合されるような部位である基質認識分子を設けるステップ、
（ｉｖ）試料中の酵素のうちの少なくとも一部が基質を修飾するように、試料と基質を混合するステップ、および
（ｖ）基質と基質認識分子を接触させ、基質と基質認識分子との間の相互作用を検出するステップ
を含む、基質を修飾することができる酵素を検出する方法が提供される。
【００３１】
本発明のさらなる態様によると、
（ｉ）未修飾状態から修飾状態への酵素による修飾に感受性のある被修飾性領域を備える基質を設けるステップ、
（ｉｉ）酵素を含む疑いのある試料を準備するステップ、
（ｉｉｉ）未修飾状態の被修飾性領域と特異的に結合する基質認識分子であり、基質認識分子の結合部位は、基質の被修飾性領域が、混合したときに酵素と比較して、前記基質認識分子により優先的に（または競合的に）結合されるような部位である基質認識分子を設けるステップ、
（ｉｖ）試料中の酵素のうちの少なくとも一部が基質を修飾するように、試料と基質を混合するステップ、および
（ｖ）基質と基質認識分子を接触させ、基質と基質認識分子との間の相互作用を検出するステップを含む、基質を修飾することができる酵素を検出する方法が提供される。
【００３２】
基質に対する基質認識分子の親和性は、比較的低い解離速度（ｋｄ）を含むのが有利である。
【００３３】
基質に対する基質認識分子の親和性は、比較的低い解離速度（ｋｄ）および比較的高い会合速度（ｋａ）を含むのが好ましい。
【００３４】
好ましくは、基質認識分子の解離速度（ｋｄ）は１０−４．ｓ−１および１０−７．ｓ−１の間、より好ましくは１０−５．ｓ−１および１０−６．ｓ−１の間である。
【００３５】
好ましくは、基質認識分子の会合速度（ｋａ）は１０５．ｓ−１および１０９．ｓ−１の間、より好ましくは１０７．ｓ−１および１０８．ｓ−１の間である。
【００３６】
基質認識分子は、酵素が基質に対して有するより低い解離速度（ｋｄ）およびより高い会合速度（ｋａ）を基質に対して有するのが有利である。
【００３７】
基質がさらに結着領域を含み、ステップ（ｉ）が、固体担体を設け、固体担体に基質の結着領域を結合させるステップをさらに含むのが好都合である。
【００３８】
ステップ（ｉ）は、固体担体上に、結着領域と結合することができる第１の捕捉認識分子を設けるステップを含むのが好ましい。
【００３９】
（ｖ）は、クロマトグラフ媒質上または中に基質および基質認識分子を置くステップをさらに含むのが有利である。
【００４０】
クロマトグラフ媒質は、クロマトグラフ媒質上または中に固定された第１の捕捉認識分子を含み、基質が結着領域をさらに備え、第１の捕捉認識分子は結着領域と結合することができ、方法が、基質認識分子の固定化を第１の捕捉認識分子で検出するステップをさらに含むのが好都合である。
【００４１】
クロマトグラフ媒質は、クロマトグラフ媒質上または中に固定された、基質の断片と場合によって組み合わせて、基質認識分子と結合することができる第２の捕捉認識分子をさらに備え、この方法は、第２の捕捉認識分子で基質認識分子の存在を検出するステップをさらに含むのが好ましい。
【００４２】
第１の捕捉認識分子および結着領域ならびに／または第２の捕捉認識分子および基質認識分子は、結合対の半分それぞれであるのが有利であり、結合対は、抗原と抗体またはこの抗原結合性断片；ビオチンとアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンまたはキャプトアビジン；免疫グロブリン（またはその適切な領域）とプロテインＡおよびＧ；炭水化物とレクチン；相補的な２つのヌクレオチド配列；エフェクターと受容体分子；ホルモンとホルモン結合タンパク質；酵素補助因子と酵素；酵素阻害剤と酵素；セルロース結合領域とセルロース繊維；固定されたアミノフェニルボロン酸とシス−ジオールを有する分子；もしくはキシログルカンおよびセルロース繊維ならびに類似体、この誘導体および断片である。
【００４３】
基質認識分子は、抗体またはこの抗原結合性断片；レクチン；ヌクレオチド配列；受容体分子；もしくは修飾状態または未修飾状態のいずれかの被修飾性領域と結合することができるホルモン結合タンパク質であるのが好都合である。
【００４４】
代替として、基質認識分子は、未修飾ビオチンと結合できるアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンまたはキャプトアビジンである。
【００４５】
好ましくは、酵素は、加水分解酵素、好ましくはペプチダーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、ホモまたはヘテロオリゴサッカリデダーゼ（ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｄａｓｅ）、ホモまたはヘテロポリサッカリダーゼ、カルボヒドラーゼ、ホスファターゼ、スルファターゼ、ノイラミニダーゼ、エステラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼである。
【００４６】
代替として、酵素は、キナーゼ、グリコシル転移酵素、オキシダーゼ、還元酵素またはトランスアミナーゼである。
【００４７】
この方法は、基質認識分子に結合した標識を設けるステップをさらに含み、ステップ（ｖ）が標識の存在を検出するステップを含むのが有利である。
【００４８】
標識は、基質認識分子と共有結合で結合されるのが好都合である。
【００４９】
好ましくは、標識は蛍光団、金の粒子、色原体、発光化合物；放射性化合物；可視化合物、信号発生物質を含むリポソームまたは他の小胞；電気活性種；または酵素およびその基質の組合せである。
【００５０】
有利には、ステップ（ｉ）が、それぞれが被修飾性領域を有する第１の基質および第２の基質を設けるステップを含み、第１の基質の被修飾性領域は第１の酵素に感受性があり、第２の基質の被修飾性領域は第２の酵素による修飾に感受性があり、ステップ（ｖ）が、第１の基質および第２の基質と基質認識分子との間の相互作用を検出するステップを含む。
【００５１】
好都合には、ステップ（ｉｉｉ）が、修飾状態および未修飾状態のいずれかで、それぞれ第１の基質および第２の基質の被修飾性領域と特異的に結合する第１の基質認識分子および第２の基質認識分子を設けるステップを含み、第１の基質認識分子および第２の基質認識分子の結合部位は、第１の基質の被修飾性領域が、第１の酵素と比較して、前記第１の基質認識分子により優先的に（または競合的に）結合され、第２の基質の被修飾性領域が、第２の酵素と比較して、前記第２の基質認識分子により優先的に（または競合的に）結合されるような部位であり、ステップ（ｖ）が、第１の基質および第２の基質と第１の基質認識分子および第２の基質認識分子との間の相互作用を検出するステップを含む。
【００５２】
したがって、本発明の態様は、未修飾状態から修飾状態への酵素による修飾に感受性のある被修飾性領域を持つ、提供された基質を修飾することができる酵素の、試料中での有無を検出するための酵素検出デバイスを提供する。本デバイスは、酵素活性を信号線の相対強度などの結合標識として酵素活性の存在が表される親和性結合アッセイに変換する。この方法において、未修飾基質は、未修飾状態の基質の被修飾性領域と結合する基質認識分子によって検出され結合される。使用の際、混合されると、基質は、酵素分子と比較して優先的に（または競合的に）基質認識分子によって結合される。これは、基質認識分子が酵素より低い解離速度（ｋｄ）を有するからである。通常、酵素は、高い代謝回転を得るために生成物が酵素活性部位を速く空けるように、高い解離速度（ｋｄ）を有している。基質認識分子は、また基質に対して高い会合速度（ｋａ）を有しており、酵素が基質に結合するより優先的に、さらに基質と結合可能にする。この種の解離および会合速度はＢｉａｃｏｒｅなどの技術を用いて測定される。酵素に対する基質認識分子の親和性は、基質に対する酵素の親和性より相当高い。すなわち基質認識分子および酵素の両方が存在するとき、混合物中に存在する基質の量に顕著な減少はない。さらに本デバイスは、基質認識分子とカップリングされた検出可能な標識を備える。
【００５３】
本発明の基質認識分子は、基質の修飾可能な領域を隔離し、そうする際に、酵素がさらに基質を修飾するのを妨害する。この特徴はエンドポイントアッセイ（カイネティックアッセイ参照）において使用するのに有利である。所定時間の後に酵素の触媒活性を正確に停止することができるので、アッセイの進行をしっかりと制御することができる。これは、基質変換作用の変動し制御されないランオンを防ぐ。すなわち、基質認識分子によって基質被修飾性領域を正確に隔離することによって、アッセイの終点を制御し規定する。
【００５４】
本発明がより十分に理解することができるように、また本発明のさらなる特徴が認識され得るように、本発明の実施形態を、付随する図に関して、例として記載する。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】本発明の一実施形態による酵素検出デバイスの１つの要素についての概略図である。
【図２】本発明の一実施形態による酵素検出デバイスの別の要素の作用を表す図である。
【図３】本発明の一実施形態による酵素検出デバイスの別の要素についての概略図である。
【図４】本発明の一実施形態による酵素検出デバイスを使用している状態の概略図である。
【図５】本発明の一実施形態による酵素検出デバイスを使用している状態の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
図１を参照して、分析種酵素を検出するための酵素検出デバイス１のいくつかの要素の概略の断面図を示す。酵素検出デバイス１は、クロマトグラフ媒質を形成するニトロセルロース試験ストリップ２を備える。試験ストリップ２には上流および下流側端部３、４がある。試験ストリップ２の上流端部３に隣接して吸収性パッドを備える試料受け取りゾーン５が設けられる。試験ストリップ２の下流側端部４の方にさらに、試験ストリップ２の表面に固定された複数の第１の捕捉認識分子６が設けられる。第１の捕捉認識分子は第１の検出ゾーン７を形成する。第１の検出ゾーン７から試験ストリップ２の下流側端部４の方へさらに、試験ストリップ２の表面に固定された複数の第２の捕捉認識分子８が設けられる。第２の捕捉認識分子８は第２の検出ゾーン９を形成する。
【００５７】
ここで図２を参照して、酵素検出デバイスの別の要素、すなわち基質１０を記載する。基質１０は、第２の領域１２に連結された修飾できないリガント１１を備える。修飾できないリガント１１は、第１の検出ゾーン７の第１の捕捉認識分子６によって認識され捕捉され得る。すなわち、修飾できないリガント１１は、結合対の半分を形成し、結合対の他の半分は、第１の捕捉認識分子６の１個である。第２の領域１２は、任意の不活性のコア（スペーサー）構造１３を介して修飾できないリガント１１に連結される第２のリガント（「被修飾性領域」として知られている）１４を備える。第２のリガント１４は分析種酵素によって修飾可能である。図２に示されたように分析種酵素は、一部の構造の開裂により第２のリガント１４を修飾するプロテアーゼであり、断片１５を放出する。しかし、他の実施形態において、被修飾性領域１４（すなわち第２のリガント）の種々の修飾は、酵素（例えばリン酸基の付加）によってなされる。他の典型的な修飾は、供与体分子から受け取り部位へ糖基を移すグリコシル転移酵素、標的部位を酸化させるオキシダーゼ、標的部位を還元する還元酵素、およびアミノ酸およびケト酸の間のアミノ基を移動させるトランスアミナーゼを含む。
【００５８】
図３を参照して、酵素検出の要素をさらに記載する。結合メンバー１６は、基質１０の被修飾性領域１４と特異的に結合することができる基質認識分子１７を備える。さらに、基質認識分子１７は、検出する酵素によって修飾され結合される領域（被修飾性領域１４）で、基質１０と結合している。すなわち、酵素および基質認識分子が被修飾性領域１４と混合された場合、基質の被修飾性領域１４は、酵素と比較して優先的に（または競合的に）、基質認識分子１７によって結合される。さらに、基質認識分子１７は、被修飾性領域１４に対して酵素が有するより高い結合親和性を有することができる。したがって、一旦被修飾性領域１４が基質認識分子１７によって結合されたら、酵素は被修飾性領域１４と結合することができず、そのため、被修飾性領域１４の修飾に触媒作用を及ぼすことができない。
【００５９】
検出可能な標識またはリポーター１８、例えば蛍光団は基質認識分子１７とカップリングされる。
【００６０】
本実施形態による酵素検出デバイス１の使用を、図４を参照して記載する。この例では酵素を含まない試料が提供される。試料は、試料中の任意の酵素が被修飾性領域１４を修飾することを可能にする条件下で基質１０と混合される。前に述べたように、この具体例において試料は酵素を含んでいないので、被修飾性領域１４の修飾は起こらない。次いで、試料と基質１０の混合物を、結合メンバー１６が基質１０を結合することを可能にする条件下で、結合メンバー１６と接触させる。次いで、試料、基質１０および結合メンバー１６の混合物は、試験ストリップ２上の試料受け取りゾーン５に置かれる。試験ストリップ２のクロマトグラフィーの性質により、試験ストリップ２の上流端部３から試験ストリップ２の下流側端部４、すなわち矢印１９の方向の液体流路に沿って、試験ストリップ２に沿っておよび／または通して、混合物は流れる。
【００６１】
この混合物は第１の検出ゾーン７と接触し、各基質１０の修飾できないリガント１１は、第１の検出ゾーン７の捕捉認識分子６と結合する。したがって、基質１０は、第１の検出ゾーン７で固定されるようになる。さらに、結合メンバー１６が基質１０に結合されるので、結合メンバー１６もまた第１の検出ゾーン７で固定されるようになる。混合物の他の要素は試験ストリップ２に沿った矢印１９の方向に流れ続けるが、第２の検出ゾーン９で結合する結合メンバー１６は、ほとんどまたはまったくない。したがって、試料中の酵素の欠如は、第１の検出ゾーン７のリポーター１８の存在、および第２の検出ゾーン９でのリポーター１８の欠如によって示される。
【００６２】
ここで図５を参照して、本発明のこの実施形態による酵素検出デバイス１の、試料中の酵素の存在を検出する使用状態を記載する。基質１０は、酵素が基質１０の被修飾性領域１４を修飾することができる条件下で、試料と混合される。この実施形態において、酵素は被修飾性領域１４を開裂し、断片１５を放出する。所定の時間の後、結合メンバー１６が未修飾の被修飾性領域１４のうちのいずれかと結合する条件下で、基質１０と酵素の混合物は、結合メンバー１６と接触される。そうする際に、結合メンバー１６は、酵素の触媒活性に終止符を打って、被修飾性領域１４から酵素を遮断する。より具体的には、この実施形態において、基質１０は、酵素によって開裂されるのを止める。
【００６３】
次いで、混合物２０は試料受け取りゾーン５に置かれ、矢印１９の方向に試験ストリップ２中または沿って流れる。試料２０は、まず第１の検出ゾーン７と接触し、そこで各基質１０の修飾できないリガント１１は第１の捕捉認識分子と結合する。こうして、修飾および未修飾の基質１０は第１の検出ゾーン７で固定される。さらに、被修飾性領域１４が開裂され断片１５を失っているため、結合メンバー１６は基質１０と結合することができない。結合メンバー１６は、未修飾（すなわちこの実施形態では「無傷である」）の被修飾性領域に対して特異的で、不完全なリガント１４には結合することができない。したがって、試料２０の残りは、第２の検出ゾーン９と接触するまで、矢印１９の方向に試験ストリップ２に沿って流れ続け、そこで基質認識分子１６は、第２の捕捉認識分子８によって結合され固定される。したがって、リポーター１８を含む結合メンバー１６は、第２の検出ゾーン９で固定される。したがって、試料中の酵素の存在は、第２の検出ゾーン９で固定されたリポーター１８の存在および第１の検出ゾーン７でのリポーター１８の欠如によって示される。
【００６４】
被修飾性領域１４への修飾がその開裂であることは、本発明にとって必須でないことを認識されたい。例えば、他のいくつかの実施形態において、検出する酵素は被修飾性領域１４への部分の付加により被修飾性領域１４を修飾する。この試料中に酵素が存在すると、結合メンバー１６は、やはり第１の検出ゾーン７ではなく、第２の検出ゾーン９で固定されるが、断片１５は放出されないという違いがある。代わりに、基質１０は無傷のままである。しかし、結合メンバー１６は、その修飾状態の被修飾性領域と結合することができず、そのため、第１の検出ゾーン７を抜け第２の検出ゾーン９上へ流れ、そこで結合する。
【００６５】
さらに、結合メンバー１６がその修飾状態の被修飾性領域に対して特異的であるデバイスおよび方法が本明細書に開示される。例えば、ある部分が存在し欠如していない場合、被修飾性領域１４への部分の添加により、酵素が被修飾性領域１４を修飾する実施形態において、結合メンバー１６は被修飾性領域１４と結合する。このようにして、結合メンバー１６は、酵素が試料中に存在しない場合、第２の検出ゾーン９で、酵素が試料中に存在する場合、第１の検出ゾーン７で固定される。したがって、試料中の酵素の存在は、第１の検出ゾーン７で固定されたリポーター１８の存在および第２の検出ゾーン９でのリポーター１８の不在によって示される。
【００６６】
いくつかの実施形態において、第１および第２の検出ゾーン７および９のリポーター１８の相対濃度は、試料中の酵素の相対濃度を示すために算定される。例えば、リポーター１８が金の物質などの可視の標識である実施形態において、標識の相対強度は第１、第２の検出ゾーン７および９の間で比較される。
【００６７】
本発明の実施形態において、検出する酵素は加水分解酵素であってもよい。例えば、酵素はプロテアーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、ホモ−またはヘテロ−オリゴサッカリデダーゼ、ホモまたはヘテロポリサッカリダーゼ、カルボヒドラーゼ、ホスファターゼ、スルファターゼ、ノイラミニダーゼ（例えばシアリダーゼ）、エステラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼであってもよい。他の実施形態において、酵素はその開裂以外の仕方によって被修飾性領域を修飾する。例えば、酵素はキナーゼ、グリコシル転移酵素、還元酵素またはトランスアミナーゼであってもよい。
【００６８】
もちろん、被修飾性領域１４は検出する酵素にとって適切でなければならない。すなわち、酵素がプロテアーゼである場合、被修飾性領域１４は、酵素が開裂するペプチドでなければならない。別の例として、酵素がシアリダーゼである場合、被修飾性領域１４はシアリルルイス抗原を備えることができる。他の被修飾性領域は核酸、炭水化物、脂質、エステルおよび糖タンパク質を含む。グリコシル転移酵素である酵素の場合には、糖基は供与体分子から受け取り部位へ移動される。酵素がオキシダーゼである場合、標的部位は酸化される（例えば、グルコースはグルコン酸に酸化される。）。酵素が還元酵素である場合、酵素は標的部位（例えば、キニーネ還元酵素はキノンをフェノールにする。）を還元する。トランスアミナーゼは、アミノ酸およびケト酸の間のアミノ基を移動させる。
【００６９】
捕捉認識分子６および修飾できないリガント１１は特異的結合対の任意の適切な成分であってもよい。例えば、そのような成分は、抗原とその抗体または抗原結合性断片；ビオチンとアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンまたはキャプトアビジン；免疫グロブリン（またはその適切な結合領域）とプロテインＡおよびＧ；炭水化物とレクチン；相補的な２つのヌクレオチド配列；エフェクターと受容体分子；ホルモンとホルモン結合タンパク質；酵素補助因子と酵素；酵素阻害剤と酵素；セルロース結合領域とセルロース繊維；固定されたアミノフェニルボロン酸とシス−ジオールを有する分子；キシログルカンとセルロース繊維およびその類似体、誘導体および断片であってもよい。
【００７０】
修飾できないリガント１１がビオチン部分であり、第１の捕捉認識分子が、試験ストリップ２の表面で固定されたストレプトアビジン部分であるのはとりわけ好ましい。
【００７１】
基質認識分子１７は、被修飾性領域１４に対して特異的な抗体またはその抗原結合性断片であるのが好ましい。この種の抗体は、それらの結合アッセイ性能、すなわちｋｄおよびｋａが所望のアッセイ（例えば高い会合速度、低い解離速度）に最適になるように作られる。これは、当業者によく知られている免疫技術によって行われる。高度親和性抗体は動物に抗原の濃度を減らしながら繰り返し投与することにより製造される。通常、ヤギおよびヒツジが高度親和性抗体を製造するために用いられる。
【００７２】
他の実施形態において、基質認識分子１７はレクチン；ヌクレオチド配列；受容体分子；または修飾状態または未修飾状態のいずれかの被修飾性領域と結合することができるホルモン結合タンパク質である。代替として、以上記載された特異的結合分子対のうちのいずれを用いてもよいが、ただし基質認識分子１７が被修飾性領域１４と相互作用する能力を変えるように、基質１０に組み込むことができ、なおかつ、分析種酵素によって修飾できる適切な標的リガントを、基質認識分子１７が認識する場合である。例えば、被修飾性領域がビオチンを備える実施形態において、基質認識分子は、未修飾ビオチンと結合できるが、検出する酵素の作用によって修飾されたビオチンとは結合できない、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンまたはキャプトアビジンであってもよい。基質認識分子１７がヒツジ抗体であり、第２の捕捉認識分子８が抗ヒツジ抗体であることはとりわけ好ましい。
【００７３】
本発明のいくつかの実施形態において、結合メンバー１６は、試料受け取りゾーン５、または試料受け取りゾーン５と第１の検出ゾーン７の間で試験ストリップ２の構造体に乾燥される。これらの実施形態において、酵素が基質１０の被修飾性領域１４を修飾することができる条件下で、試料は基質１０と混合される。次いで、この混合物は試料受け取りゾーン５に施され、試験ストリップ２の表面の結合メンバー１６と接触する。すなわち、試験ストリップ２に試料を置く前に、結合メンバー１６と試料の混合はない。
【００７４】
いくつかの実施形態において、可溶性障壁が、試料受け取りゾーン５のすぐ下流の試験ストリップ２上に設けられる。可溶性障壁は、試料および基質の混合物を所定の時間、浸透させず、その後に障壁は破られ、混合物が試験ストリップに沿って流れ続ける。この特徴を、可溶性障壁のすぐ下流の試験ストリップ２上に結合メンバー１６を乾燥させるという特徴と組み合わせるととりわけ好ましい。このような実施形態において、試料および基質に、混合し任意の酵素が被修飾性領域１４を修飾するのに十分な時間を与え、その後に、混合物は、可溶性障壁を溶かし、結合メンバー１６と接触し、結合メンバー１６は被修飾性領域１４と結合し酵素が被修飾性領域１４でそれ以上の反応の触媒作用を及ぼすのを妨害する。次いで、前述のように試験ストリップ２は動作する。可溶性障壁は、例えば、ＰＶＡ、とりわけ低分子量（ＭＷ）ＰＶＡ、または冷水可溶性ゼラチンから製造されてもよい。
【００７５】
いずれかの実施形態のリポーター１８は、直接的または間接的に検出可能な信号を発生させることができる任意の物質であってもよい。適切なリポーターは色原体、発光化合物（例えば、蛍光性か燐光性の）；放射性化合物；可視化合物（例えばラテックス、または金色などの金属粒子）、信号発生物質を含有するリポソームまたは他の小胞；電気活性種；または酵素およびその基質の組合せである。好ましいリポーターは、第１および／または第２の検出ゾーン７、９で蓄積し、肉眼で見えるゾーンを形成する金粒子である（図１参照）。また、本発明のいくつかの実施形態において、基質認識分子１７は、リポーター１８と永続的にカップリングされないが、その代わりに、前述のような特異的結合対を介してリポーター１８とカップリング可能であることを認識されたい。
【００７６】
特定の実施形態において、酵素検出デバイス１は、２種の異なる基質１０を備え、各基質には異なる酵素による修飾に感受性のある被修飾性領域１４がある。そうでない場合、いくつかの実施形態において、両方の基質１０は同一であり、どちらの酵素が試料中にあろうと無関係に、試験ストリップ２は同じ信号を提供する。他の実施形態において、それぞれ基質１０の被修飾性領域１４の一方に特異的で他方には特異的ではない第１、第２の結合メンバー１６が設けられる。一方の基質の被修飾性領域１４は、一方の酵素と比較して優先的に（または競合的に）、第１の結合メンバー１６によって結合され、他方の基質の被修飾性領域１４は、他方の酵素と比較して優先的に（または競合的に）、第２の結合メンバー１６によって結合される。さらに、第１の結合メンバー１６のリポーター１８は、第２の結合メンバー１６のリポーター１８とは異なる信号を提供する。したがって、各酵素の存在は、どちらかの信号の存在によって区別することができる。さらなる実施形態において、前の実施形態と同様に、第１および第２の結合メンバーが設けられる。ただし、両方の結合メンバーは同一のリポーター１８を持ち、第２の検出ゾーンは第３の検出ゾーンで補われる。第２および第３の検出ゾーンには第２および第３の捕捉認識分子がそれぞれある。第２および第３の捕捉認識分子は、第１および第２の結合メンバーに対してそれぞれ特異的である。したがって、どちらかの酵素の存在は、第２または第３の捕捉ゾーンのいずれかのリポーター１８の存在または欠如によって区別できる。
【００７７】
第１および第２の結合メンバー１６が設けられる場合の実施形態のいくつかの変形において、酵素検出デバイス１は、第１および第２の試験ストリップ（例えば、試料受け取りゾーン５と、互いに平行、または外側に向かって放射状に配置された）と流体連通状態の単一の試料受け取りゾーン５を備える。第１の試験ストリップには、第１の基質と結合する第１の検出ゾーン７、および第１の基質に対して特異的な結合メンバー１６と結合する、第２の検出ゾーン９がある。同様に、第２の試験ストリップには、第２の基質と結合する第１の検出ゾーン７、および第２の基質に特異的な結合メンバー１６と結合する、第２の検出ゾーン９がある。このように、第１および第２の試験ストリップは、試料中に第１および第２の酵素の存在または欠如を示す結果を別々に提供する。
【００７８】
以上記載された具体的な実施形態において、本デバイスは試験ストリップ２の方式のクロマトグラフ媒質を備える。しかし、代替実施形態においては、クロマトグラフ媒質は設けられない。例えば、一実施形態において、第１の捕捉認識分子６は、カラムまたはビーズなどの固体担体上に固定される。前述の実施形態のように、試料は、基質１０、続いて結合メンバー１６と混合される。次いで、試料、基質１０および結合メンバー１６の混合物は担体上で洗浄され、特異的結合メンバー１１が捕捉認識分子６と結合するのを可能にする。次いで、未結合物質を洗い流すまたは流出させる。酵素が試料中にある場合、被修飾性領域１４は開裂され、結合メンバー１６は基質１０と結合することができない。このようにして、リポーター１８は固体担体上で固定されない。したがって、試料中の酵素の存在は固体担体中のリポーターの欠如によって示される。酵素が試料中にない場合、結合メンバー１６は基質１０と結合し、固体担体上のリポーター１８をこのように固定させる。したがって、試料中の酵素の欠如は、固体担体上で固定されたリポーター１８の存在によって示される。
【００７９】
いくつかの実施形態において、この種の手順は当業者に周知の方法で、９６ウェルマイクロタイタープレート中で行われる。代替として、その手順は様々な固相捕捉物質を用いて、またはマイクロアレーシステムを用いて、ロボットシステム中で行われてもよい。
【実施例】
【００８０】
キットは下記構成要素を備える。
１）サンプル流体（例えば傷からの）回収用の綿棒
２）プラスチックケースに取り付けられるラテラルフロー試験ストリップ。試験ストリップは、試験ストリップの流路を横切る第１の試験ラインとして吸着されたストレプトアビジンを備える第１の検出ゾーンおよび第１の試験ラインの下流に試験ストリップの流路を横切る第２の試験ラインとして吸着された抗ヒツジ抗体を含む第２の検出ゾーンを有する。プラスチックケースには、第１および第２の試験ラインを覗く観測窓がある。第１の試験ラインの上流にまた、統合試料を受けるパッドがある。さらに、試験ストリップには、試料を受け取るパッドおよび第１の試験ラインの間の試験ストリップに乾燥させた、または試料を受け取るパッド自体に乾燥させたヒツジ抗体（基質認識分子）を有する金粒子がある。
３）綿球が試料抽出緩衝液および基質と一緒に入れられてもよい試験管。試験管は押し上げ蓋式の口で構成され、試料／抽出流体／基質混合物を試験ストリップ上に施す準備ができている場合、口は所定位置にはめてある。試料は逆さまにしたチューブから口を通して滴下して施してもよい。
４）ｐＨ７．２のホスパヘート（ｐｈｏｓｐａｈａｔｅ）緩衝食塩水（ＰＢＳ）および０．１％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０から成る抽出流体。
５）基質（抽出流体にあらかじめ溶かしてもよい）。基質は、ＭＭＰ−９に対してバイアスをかけたアミノ酸の配列を含むペプチドから成る。配列（Ｇ）ＰＱＧＩＦＧ（Ｑ）は特に適切である。しかし、他に多くのものが入手可能で、これらは科学文献に由来してもよい。基質はポリエチレングリコールスペーサー／リンカーを介して連結された、末端ビオチン基を有する。ペプチドは、金粒子に結合したヒツジ抗体によって認識される。
【００８１】
キットの使用手順は以下のとおりである：
ステップ１：流体の試料（試験サンプル）は、キットで供給される綿球で集める。流体試料を有する綿球を、抽出緩衝液および規定量の基質と一緒に試験管に入れる（試験サンプル中に酵素が存在しない場合、第１のラインをちょうど飽和させる、限定した量でなければならないので、正確な量の基質が重要である。）。流体試料がリガントと混じることができ、流体試料を放出させるために、綿球を抽出流体内で激しく回転する。この反応混合物は、規定された時間（例えば１０分）の間、周囲温度で温置する。
【００８２】
ステップ２：温置時間が終わると、綿球を除去する、または、軸を切り離し、開けていたふたを閉じる。次いで、チューブを逆さまに絞り出して、４滴の液体を、試料を受け取るパッド上に垂らす。液体が試験ストリップへ移動すると、液体は金粒子に結合した乾燥ヒツジ抗体と接触する。これらは試験サンプルによって再水和され、ヒツジ抗体は任意の未修飾基質と結合する。液体と金粒子がラテラルフロー試験ストリップを介して移動すると、それらはその第１のラインに届き、ここでビオチン（基質上の）は認識され捕捉される。無傷の基質に結合されたいずれの金粒子も、基質の末端ビオチンによってこの第１のラインで捕捉される。基質に結合されないまたは開裂された基質に結合されるものは、通過して第２の（抗ヒツジ）ラインで捕捉されることになる。
【００８３】
ユーザーは、形成したラインを観察し、これらの相対強度を評価する。第１のラインの欠如および全強度の第２のラインの存在は、試験サンプル中の高レベルのプロテアーゼを示す。逆の結果は、ゼロまたは検出可能な限界より下の低レベルのプロテアーゼを示す。この両極端の中間段階は、試験サンプルの異なるレベルのプロテアーゼを示す。いくつかの実施形態において、結果は光電子工学ストリップリーダによって読み取る。また、読み取り値は、ユーザーに提示される単純な結果とともに単純なアルゴリズムによって自動的に解釈される。
【００８４】
この例の変形においては、試験ストリップに組み込む代わりに、（ヒツジ抗体を有する）金粒子を、温置時間が終わると、反応混合物に加える。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素検出デバイス、より具体的には、修飾または未修飾いずれかの状態の特異的結合分子によって認識可能な、提供された基質を修飾することができる酵素を検出するための酵素検出デバイスに関する。本発明は、また基質を修飾することができる酵素を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床および研究の多くの状況で、特定の触媒活性を有する酵素の、試料中での存在を検出できることは有用である。この種の酵素の一例はプロテアーゼであり、ペプチド結合の加水分解および開裂によりタンパク質を消化する。したがって、プロテアーゼで分解されるタンパク質は２個以上のより小さなペプチドに開裂される。別の例は、より大きい炭水化物からシアル酸部分を開裂するシアリダーゼである。
【０００３】
試料の酵素を検出する診断試験キットがＵＳ２００６／０００３３９４に開示されている。このキットは、リポーターおよび特異的結合メンバーに結合された標的リガントをそれぞれ備える「反応性複合」を備える。標的リガントは、検出すべき酵素によって開裂して、リポーターを放出し得る。反応性複合および試料の混合物は、続いてクロマトグラフ媒質に施される。クロマトグラフ媒質は、標的リガント上の特異的結合メンバーを捕捉することができる第１の検出ゾーン、およびリポーターを結合することができる第２の検出ゾーンを備える。したがって、使用の際、試料および反応性複合の混合物はクロマトグラフ媒質に施され、まず第１の検出ゾーン、次いで第２の検出ゾーンを流れる。第１の検出ゾーンで標的リガントは捕捉される。試料中の任意の酵素は、標的リガントからリポーターを開裂し、開裂されたリポーターは第２の検出ゾーンで捕捉され、標的リガントに結合したままの開裂されていない任意のリポーターは第１の検出ゾーンに留まる。したがって、試料中に酵素が存在すると、第２の検出ゾーンでのリポーターの存在（または第１の検出ゾーンでのリポーターの欠如）によって判定される。
【０００４】
ＵＳ２００６／０００３３９４に開示されたキットに関する１つの問題は、混合物がクロマトグラフ媒質に沿って流れている間、酵素が引き続き活性であるので、キットは不正確な結果を出す傾向があり得るということである。反応性複合は第１の捕捉ゾーンで固定されているが、酵素は標的リガントからリポーターを開裂し続ける。したがって、第１の検出ゾーンおよび第２の検出ゾーンでの信号は、経時的に変わる傾向があり得、明確な反応終点がない。
【０００５】
ＵＳ２００６／０００３３９４のキットに関する別の問題は、それが標的リガントを開裂する酵素だけが検出でき、標的リガント（例えばリン酸化またはグリコシル化）への部分の付加などの他の作用がある酵素を検出することができないということである。
【０００６】
ＵＳ２００６／０００３３９４のキットに関するさらなる問題は、標的リガントの末端を開裂しなければならないエキソペプチダーゼまたはエキソカルボヒドラーゼなどの酵素の活性を検出することができないということである。それは、末端にリポーターを接合するために必要な条件が、酵素の活性部位との相互作用を妨げるであろう程度まで末端の化学的性質を変えるであろうからである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／０００３３９４号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記の問題の１つまたは複数を緩和しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一態様によると、
（ｉ）未修飾状態から修飾状態への酵素による修飾に感受性のある被修飾性領域を備える基質、
（ｉｉ）修飾状態または未修飾状態のいずれかの被修飾性領域と特異的に結合できる基質認識分子であり、基質認識分子の結合部位は、混合したときに、基質認識分子と酵素が競合的に被修飾性領域に結合されるような部位である基質認識分子、および
（ｉｉｉ）基質認識分子にカップリング可能な検出可能な標識
を含む、提供された基質を修飾できる酵素の試料中での有無を検出する酵素検出デバイスが提供される。
【００１０】
本発明の別の態様によると、
（ｉ）未修飾状態から修飾状態への酵素による修飾に感受性のある被修飾性領域を備える基質、
（ｉｉ）未修飾状態の基質の被修飾性領域と特異的に結合できる基質認識分子であり、基質認識分子の結合部位は、基質の被修飾性領域が、混合したときに酵素と比較して、前記基質認識分子により優先的に（または競合的に）結合されるような部位である基質認識分子、および
（ｉｉｉ）基質認識分子にカップリング可能な検出可能な標識
を含む、提供された基質を修飾できる酵素の試料中での有無を検出する酵素検出デバイスが提供される。
【００１１】
基質に対する基質認識分子の親和性は、比較的低い解離速度（ｋｄ）を有するのが有利である。
【００１２】
基質に対する基質認識分子の親和性は、比較的低い解離速度（ｋｄ）および比較的高い会合速度（ｋａ）を有するのが好ましい。
【００１３】
基質認識分子の解離速度（ｋｄ）は、１０−４．ｓ−１から１０−７．ｓ−１の間であるのが好ましく、より好ましくは１０−５．ｓ−１から１０−６．ｓ−１の間である。
【００１４】
基質認識分子の会合速度（ｋａ）は、１０５．ｓ−１から１０９．ｓ−１の間であるのが好ましく、より好ましくは１０７．ｓ−１から１０８．ｓ−１の間である。
【００１５】
基質認識分子は基質に対して、酵素が基質に対するより、低い解離速度（ｋｄ）および高い会合速度（ｋａ）を有するのが有利である。
【００１６】
基質は、固体担体に結着可能な結着領域をさらに備え、酵素検出デバイスは固体担体をさらに備えるのが好都合である。
【００１７】
酵素検出デバイスはクロマトグラフ媒質をさらに備えるのが好ましい。
【００１８】
基質はクロマトグラフ媒質に結着可能な結着領域をさらに備えるのが有利である。
【００１９】
クロマトグラフ媒質は、クロマトグラフ媒質上または中で固定され、基質の結着領域と結合することができる、第１の捕捉認識分子を備えるのが好都合である。
【００２０】
クロマトグラフ媒質は、基質の断片と場合によって組み合わせて、クロマトグラフ媒質上または中で固定され、基質認識分子と結合することができる第２の捕捉認識分子をさらに備えるのが好ましい。
【００２１】
第１の捕捉認識分子と結着領域および／または第２の捕捉認識分子と基質認識分子は、それぞれ、結合対の半分それぞれであるのが有利であり、結合対は次のとおりである：抗原と抗体またはこれに対して特異的な抗原結合性断片；ビオチンとアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンまたはキャプトアビジン；プロテインＡおよびＧ；炭水化物とレクチン；相補的な２つのヌクレオチド配列；エフェクターと受容体分子；ホルモンとホルモン結合タンパク質；酵素補助因子と酵素；酵素阻害剤と酵素；セルロース結合領域とセルロース繊維；固定されたアミノフェニルボロン酸とシス−ジオールを有する分子；キシログルカンとセルロース繊維およびその類似体、誘導体および断片。
【００２２】
基質認識分子は、抗体もしくはこの抗原結合性断片；レクチン；ヌクレオチド配列；受容体分子；または修飾状態もしくは未修飾状態のいずれかの被修飾性領域と結合することができるホルモン結合タンパク質であるのが好都合である。
【００２３】
代替として、基質認識分子は、未修飾ビオチンと結合できるアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンまたはキャプトアビジンである。
【００２４】
好ましくは、酵素は、加水分解酵素、好ましくはペプチダーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、カルボヒドラーゼ、ホスファターゼ、スルファターゼ、ノイラミニダーゼ、エステラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼである。
【００２５】
代替として、酵素は、キナーゼ、グリコシル転移酵素、オキシダーゼ、還元酵素またはトランスアミナーゼである。
【００２６】
酵素検出デバイスは、基質認識分子に結合した検出可能な標識をさらに備えるのが有利である。
【００２７】
検出可能な標識は、基質認識分子と共有結合で結合されるのが好都合である。
【００２８】
好ましくは、標識は蛍光団、金粒子、色原体、発光化合物；放射性化合物；可視化合物、信号発生物質を含有するリポソームまたは他の小胞、電気活性種または酵素およびその基質の組合せである。
【００２９】
酵素検出デバイスは、第１の酵素による修飾に感受性のある第１の基質の被修飾性領域および第２の酵素による修飾に感受性がある第２の基質の被修飾性領域をそれぞれ含む第１の基質および第２の基質を備えるのが有利である。
【００３０】
本発明の別の態様によると、
（ｉ）未修飾状態から修飾状態への酵素による修飾に感受性のある被修飾性領域を備える基質を設けるステップ、
（ｉｉ）酵素を含む疑いのある試料を準備するステップ、
（ｉｉｉ）未修飾状態または修飾状態のいずれかの被修飾性領域と特異的に結合できる基質認識分子であり、基質認識分子の結合部位は、混合したときに、基質認識分子と酵素が競合的に被修飾性領域に結合されるような部位である基質認識分子を設けるステップ、
（ｉｖ）試料中の酵素のうちの少なくとも一部が基質を修飾するように、試料と基質を混合するステップ、および
（ｖ）基質と基質認識分子を接触させ、基質と基質認識分子との間の相互作用を検出するステップ
を含む、基質を修飾することができる酵素を検出する方法が提供される。
【００３１】
本発明のさらなる態様によると、
（ｉ）未修飾状態から修飾状態への酵素による修飾に感受性のある被修飾性領域を備える基質を設けるステップ、
（ｉｉ）酵素を含む疑いのある試料を準備するステップ、
（ｉｉｉ）未修飾状態の被修飾性領域と特異的に結合する基質認識分子であり、基質認識分子の結合部位は、基質の被修飾性領域が、混合したときに酵素と比較して、前記基質認識分子により優先的に（または競合的に）結合されるような部位である基質認識分子を設けるステップ、
（ｉｖ）試料中の酵素のうちの少なくとも一部が基質を修飾するように、試料と基質を混合するステップ、および
（ｖ）基質と基質認識分子を接触させ、基質と基質認識分子との間の相互作用を検出するステップを含む、基質を修飾することができる酵素を検出する方法が提供される。
【００３２】
基質に対する基質認識分子の親和性は、比較的低い解離速度（ｋｄ）を含むのが有利である。
【００３３】
基質に対する基質認識分子の親和性は、比較的低い解離速度（ｋｄ）および比較的高い会合速度（ｋａ）を含むのが好ましい。
【００３４】
好ましくは、基質認識分子の解離速度（ｋｄ）は１０−４．ｓ−１および１０−７．ｓ−１の間、より好ましくは１０−５．ｓ−１および１０−６．ｓ−１の間である。
【００３５】
好ましくは、基質認識分子の会合速度（ｋａ）は１０５．ｓ−１および１０９．ｓ−１の間、より好ましくは１０７．ｓ−１および１０８．ｓ−１の間である。
【００３６】
基質認識分子は、酵素が基質に対して有するより低い解離速度（ｋｄ）およびより高い会合速度（ｋａ）を基質に対して有するのが有利である。
【００３７】
基質がさらに結着領域を含み、ステップ（ｉ）が、固体担体を設け、固体担体に基質の結着領域を結合させるステップをさらに含むのが好都合である。
【００３８】
ステップ（ｉ）は、固体担体上に、結着領域と結合することができる第１の捕捉認識分子を設けるステップを含むのが好ましい。
【００３９】
（ｖ）は、クロマトグラフ媒質上または中に基質および基質認識分子を置くステップをさらに含むのが有利である。
【００４０】
クロマトグラフ媒質は、クロマトグラフ媒質上または中に固定された第１の捕捉認識分子を含み、基質が結着領域をさらに備え、第１の捕捉認識分子は結着領域と結合することができ、方法が、基質認識分子の固定化を第１の捕捉認識分子で検出するステップをさらに含むのが好都合である。
【００４１】
クロマトグラフ媒質は、クロマトグラフ媒質上または中に固定された、基質の断片と場合によって組み合わせて、基質認識分子と結合することができる第２の捕捉認識分子をさらに備え、この方法は、第２の捕捉認識分子で基質認識分子の存在を検出するステップをさらに含むのが好ましい。
【００４２】
第１の捕捉認識分子および結着領域ならびに／または第２の捕捉認識分子および基質認識分子は、結合対の半分それぞれであるのが有利であり、結合対は、抗原と抗体またはこの抗原結合性断片；ビオチンとアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンまたはキャプトアビジン；免疫グロブリン（またはその適切な領域）とプロテインＡおよびＧ；炭水化物とレクチン；相補的な２つのヌクレオチド配列；エフェクターと受容体分子；ホルモンとホルモン結合タンパク質；酵素補助因子と酵素；酵素阻害剤と酵素；セルロース結合領域とセルロース繊維；固定されたアミノフェニルボロン酸とシス−ジオールを有する分子；もしくはキシログルカンおよびセルロース繊維ならびに類似体、この誘導体および断片である。
【００４３】
基質認識分子は、抗体またはこの抗原結合性断片；レクチン；ヌクレオチド配列；受容体分子；もしくは修飾状態または未修飾状態のいずれかの被修飾性領域と結合することができるホルモン結合タンパク質であるのが好都合である。
【００４４】
代替として、基質認識分子は、未修飾ビオチンと結合できるアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンまたはキャプトアビジンである。
【００４５】
好ましくは、酵素は、加水分解酵素、好ましくはペプチダーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、ホモまたはヘテロオリゴサッカリデダーゼ（ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｄａｓｅ）、ホモまたはヘテロポリサッカリダーゼ、カルボヒドラーゼ、ホスファターゼ、スルファターゼ、ノイラミニダーゼ、エステラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼである。
【００４６】
代替として、酵素は、キナーゼ、グリコシル転移酵素、オキシダーゼ、還元酵素またはトランスアミナーゼである。
【００４７】
この方法は、基質認識分子に結合した標識を設けるステップをさらに含み、ステップ（ｖ）が標識の存在を検出するステップを含むのが有利である。
【００４８】
標識は、基質認識分子と共有結合で結合されるのが好都合である。
【００４９】
好ましくは、標識は蛍光団、金の粒子、色原体、発光化合物；放射性化合物；可視化合物、信号発生物質を含むリポソームまたは他の小胞；電気活性種；または酵素およびその基質の組合せである。
【００５０】
有利には、ステップ（ｉ）が、それぞれが被修飾性領域を有する第１の基質および第２の基質を設けるステップを含み、第１の基質の被修飾性領域は第１の酵素に感受性があり、第２の基質の被修飾性領域は第２の酵素による修飾に感受性があり、ステップ（ｖ）が、第１の基質および第２の基質と基質認識分子との間の相互作用を検出するステップを含む。
【００５１】
好都合には、ステップ（ｉｉｉ）が、修飾状態および未修飾状態のいずれかで、それぞれ第１の基質および第２の基質の被修飾性領域と特異的に結合する第１の基質認識分子および第２の基質認識分子を設けるステップを含み、第１の基質認識分子および第２の基質認識分子の結合部位は、第１の基質の被修飾性領域が、第１の酵素と比較して、前記第１の基質認識分子により優先的に（または競合的に）結合され、第２の基質の被修飾性領域が、第２の酵素と比較して、前記第２の基質認識分子により優先的に（または競合的に）結合されるような部位であり、ステップ（ｖ）が、第１の基質および第２の基質と第１の基質認識分子および第２の基質認識分子との間の相互作用を検出するステップを含む。
【００５２】
したがって、本発明の態様は、未修飾状態から修飾状態への酵素による修飾に感受性のある被修飾性領域を持つ、提供された基質を修飾することができる酵素の、試料中での有無を検出するための酵素検出デバイスを提供する。本デバイスは、酵素活性を信号線の相対強度などの結合標識として酵素活性の存在が表される親和性結合アッセイに変換する。この方法において、未修飾基質は、未修飾状態の基質の被修飾性領域と結合する基質認識分子によって検出され結合される。使用の際、混合されると、基質は、酵素分子と比較して優先的に（または競合的に）基質認識分子によって結合される。これは、基質認識分子が酵素より低い解離速度（ｋｄ）を有するからである。通常、酵素は、高い代謝回転を得るために生成物が酵素活性部位を速く空けるように、高い解離速度（ｋｄ）を有している。基質認識分子は、また基質に対して高い会合速度（ｋａ）を有しており、酵素が基質に結合するより優先的に、さらに基質と結合可能にする。この種の解離および会合速度はＢｉａｃｏｒｅなどの技術を用いて測定される。酵素に対する基質認識分子の親和性は、基質に対する酵素の親和性より相当高い。すなわち基質認識分子および酵素の両方が存在するとき、混合物中に存在する基質の量に顕著な減少はない。さらに本デバイスは、基質認識分子とカップリングされた検出可能な標識を備える。
【００５３】
本発明の基質認識分子は、基質の修飾可能な領域を隔離し、そうする際に、酵素がさらに基質を修飾するのを妨害する。この特徴はエンドポイントアッセイ（カイネティックアッセイ参照）において使用するのに有利である。所定時間の後に酵素の触媒活性を正確に停止することができるので、アッセイの進行をしっかりと制御することができる。これは、基質変換作用の変動し制御されないランオンを防ぐ。すなわち、基質認識分子によって基質被修飾性領域を正確に隔離することによって、アッセイの終点を制御し規定する。
【００５４】
本発明がより十分に理解することができるように、また本発明のさらなる特徴が認識され得るように、本発明の実施形態を、付随する図に関して、例として記載する。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】本発明の一実施形態による酵素検出デバイスの１つの要素についての概略図である。
【図２】本発明の一実施形態による酵素検出デバイスの別の要素の作用を表す図である。
【図３】本発明の一実施形態による酵素検出デバイスの別の要素についての概略図である。
【図４】本発明の一実施形態による酵素検出デバイスを使用している状態の概略図である。
【図５】本発明の一実施形態による酵素検出デバイスを使用している状態の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
図１を参照して、分析種酵素を検出するための酵素検出デバイス１のいくつかの要素の概略の断面図を示す。酵素検出デバイス１は、クロマトグラフ媒質を形成するニトロセルロース試験ストリップ２を備える。試験ストリップ２には上流および下流側端部３、４がある。試験ストリップ２の上流端部３に隣接して吸収性パッドを備える試料受け取りゾーン５が設けられる。試験ストリップ２の下流側端部４の方にさらに、試験ストリップ２の表面に固定された複数の第１の捕捉認識分子６が設けられる。第１の捕捉認識分子は第１の検出ゾーン７を形成する。第１の検出ゾーン７から試験ストリップ２の下流側端部４の方へさらに、試験ストリップ２の表面に固定された複数の第２の捕捉認識分子８が設けられる。第２の捕捉認識分子８は第２の検出ゾーン９を形成する。
【００５７】
ここで図２を参照して、酵素検出デバイスの別の要素、すなわち基質１０を記載する。基質１０は、第２の領域１２に連結された修飾できないリガント１１を備える。修飾できないリガント１１は、第１の検出ゾーン７の第１の捕捉認識分子６によって認識され捕捉され得る。すなわち、修飾できないリガント１１は、結合対の半分を形成し、結合対の他の半分は、第１の捕捉認識分子６の１個である。第２の領域１２は、任意の不活性のコア（スペーサー）構造１３を介して修飾できないリガント１１に連結される第２のリガント（「被修飾性領域」として知られている）１４を備える。第２のリガント１４は分析種酵素によって修飾可能である。図２に示されたように分析種酵素は、一部の構造の開裂により第２のリガント１４を修飾するプロテアーゼであり、断片１５を放出する。しかし、他の実施形態において、被修飾性領域１４（すなわち第２のリガント）の種々の修飾は、酵素（例えばリン酸基の付加）によってなされる。他の典型的な修飾は、供与体分子から受け取り部位へ糖基を移すグリコシル転移酵素、標的部位を酸化させるオキシダーゼ、標的部位を還元する還元酵素、およびアミノ酸およびケト酸の間のアミノ基を移動させるトランスアミナーゼを含む。
【００５８】
図３を参照して、酵素検出の要素をさらに記載する。結合メンバー１６は、基質１０の被修飾性領域１４と特異的に結合することができる基質認識分子１７を備える。さらに、基質認識分子１７は、検出する酵素によって修飾され結合される領域（被修飾性領域１４）で、基質１０と結合している。すなわち、酵素および基質認識分子が被修飾性領域１４と混合された場合、基質の被修飾性領域１４は、酵素と比較して優先的に（または競合的に）、基質認識分子１７によって結合される。さらに、基質認識分子１７は、被修飾性領域１４に対して酵素が有するより高い結合親和性を有することができる。したがって、一旦被修飾性領域１４が基質認識分子１７によって結合されたら、酵素は被修飾性領域１４と結合することができず、そのため、被修飾性領域１４の修飾に触媒作用を及ぼすことができない。
【００５９】
検出可能な標識またはリポーター１８、例えば蛍光団は基質認識分子１７とカップリングされる。
【００６０】
本実施形態による酵素検出デバイス１の使用を、図４を参照して記載する。この例では酵素を含まない試料が提供される。試料は、試料中の任意の酵素が被修飾性領域１４を修飾することを可能にする条件下で基質１０と混合される。前に述べたように、この具体例において試料は酵素を含んでいないので、被修飾性領域１４の修飾は起こらない。次いで、試料と基質１０の混合物を、結合メンバー１６が基質１０を結合することを可能にする条件下で、結合メンバー１６と接触させる。次いで、試料、基質１０および結合メンバー１６の混合物は、試験ストリップ２上の試料受け取りゾーン５に置かれる。試験ストリップ２のクロマトグラフィーの性質により、試験ストリップ２の上流端部３から試験ストリップ２の下流側端部４、すなわち矢印１９の方向の液体流路に沿って、試験ストリップ２に沿っておよび／または通して、混合物は流れる。
【００６１】
この混合物は第１の検出ゾーン７と接触し、各基質１０の修飾できないリガント１１は、第１の検出ゾーン７の捕捉認識分子６と結合する。したがって、基質１０は、第１の検出ゾーン７で固定されるようになる。さらに、結合メンバー１６が基質１０に結合されるので、結合メンバー１６もまた第１の検出ゾーン７で固定されるようになる。混合物の他の要素は試験ストリップ２に沿った矢印１９の方向に流れ続けるが、第２の検出ゾーン９で結合する結合メンバー１６は、ほとんどまたはまったくない。したがって、試料中の酵素の欠如は、第１の検出ゾーン７のリポーター１８の存在、および第２の検出ゾーン９でのリポーター１８の欠如によって示される。
【００６２】
ここで図５を参照して、本発明のこの実施形態による酵素検出デバイス１の、試料中の酵素の存在を検出する使用状態を記載する。基質１０は、酵素が基質１０の被修飾性領域１４を修飾することができる条件下で、試料と混合される。この実施形態において、酵素は被修飾性領域１４を開裂し、断片１５を放出する。所定の時間の後、結合メンバー１６が未修飾の被修飾性領域１４のうちのいずれかと結合する条件下で、基質１０と酵素の混合物は、結合メンバー１６と接触される。そうする際に、結合メンバー１６は、酵素の触媒活性に終止符を打って、被修飾性領域１４から酵素を遮断する。より具体的には、この実施形態において、基質１０は、酵素によって開裂されるのを止める。
【００６３】
次いで、混合物２０は試料受け取りゾーン５に置かれ、矢印１９の方向に試験ストリップ２中または沿って流れる。試料２０は、まず第１の検出ゾーン７と接触し、そこで各基質１０の修飾できないリガント１１は第１の捕捉認識分子と結合する。こうして、修飾および未修飾の基質１０は第１の検出ゾーン７で固定される。さらに、被修飾性領域１４が開裂され断片１５を失っているため、結合メンバー１６は基質１０と結合することができない。結合メンバー１６は、未修飾（すなわちこの実施形態では「無傷である」）の被修飾性領域に対して特異的で、不完全なリガント１４には結合することができない。したがって、試料２０の残りは、第２の検出ゾーン９と接触するまで、矢印１９の方向に試験ストリップ２に沿って流れ続け、そこで基質認識分子１６は、第２の捕捉認識分子８によって結合され固定される。したがって、リポーター１８を含む結合メンバー１６は、第２の検出ゾーン９で固定される。したがって、試料中の酵素の存在は、第２の検出ゾーン９で固定されたリポーター１８の存在および第１の検出ゾーン７でのリポーター１８の欠如によって示される。
【００６４】
被修飾性領域１４への修飾がその開裂であることは、本発明にとって必須でないことを認識されたい。例えば、他のいくつかの実施形態において、検出する酵素は被修飾性領域１４への部分の付加により被修飾性領域１４を修飾する。この試料中に酵素が存在すると、結合メンバー１６は、やはり第１の検出ゾーン７ではなく、第２の検出ゾーン９で固定されるが、断片１５は放出されないという違いがある。代わりに、基質１０は無傷のままである。しかし、結合メンバー１６は、その修飾状態の被修飾性領域と結合することができず、そのため、第１の検出ゾーン７を抜け第２の検出ゾーン９上へ流れ、そこで結合する。
【００６５】
さらに、結合メンバー１６がその修飾状態の被修飾性領域に対して特異的であるデバイスおよび方法が本明細書に開示される。例えば、ある部分が存在し欠如していない場合、被修飾性領域１４への部分の添加により、酵素が被修飾性領域１４を修飾する実施形態において、結合メンバー１６は被修飾性領域１４と結合する。このようにして、結合メンバー１６は、酵素が試料中に存在しない場合、第２の検出ゾーン９で、酵素が試料中に存在する場合、第１の検出ゾーン７で固定される。したがって、試料中の酵素の存在は、第１の検出ゾーン７で固定されたリポーター１８の存在および第２の検出ゾーン９でのリポーター１８の不在によって示される。
【００６６】
いくつかの実施形態において、第１および第２の検出ゾーン７および９のリポーター１８の相対濃度は、試料中の酵素の相対濃度を示すために算定される。例えば、リポーター１８が金の物質などの可視の標識である実施形態において、標識の相対強度は第１、第２の検出ゾーン７および９の間で比較される。
【００６７】
本発明の実施形態において、検出する酵素は加水分解酵素であってもよい。例えば、酵素はプロテアーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、ホモ−またはヘテロ−オリゴサッカリデダーゼ、ホモまたはヘテロポリサッカリダーゼ、カルボヒドラーゼ、ホスファターゼ、スルファターゼ、ノイラミニダーゼ（例えばシアリダーゼ）、エステラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼであってもよい。他の実施形態において、酵素はその開裂以外の仕方によって被修飾性領域を修飾する。例えば、酵素はキナーゼ、グリコシル転移酵素、還元酵素またはトランスアミナーゼであってもよい。
【００６８】
もちろん、被修飾性領域１４は検出する酵素にとって適切でなければならない。すなわち、酵素がプロテアーゼである場合、被修飾性領域１４は、酵素が開裂するペプチドでなければならない。別の例として、酵素がシアリダーゼである場合、被修飾性領域１４はシアリルルイス抗原を備えることができる。他の被修飾性領域は核酸、炭水化物、脂質、エステルおよび糖タンパク質を含む。グリコシル転移酵素である酵素の場合には、糖基は供与体分子から受け取り部位へ移動される。酵素がオキシダーゼである場合、標的部位は酸化される（例えば、グルコースはグルコン酸に酸化される。）。酵素が還元酵素である場合、酵素は標的部位（例えば、キニーネ還元酵素はキノンをフェノールにする。）を還元する。トランスアミナーゼは、アミノ酸およびケト酸の間のアミノ基を移動させる。
【００６９】
捕捉認識分子６および修飾できないリガント１１は特異的結合対の任意の適切な成分であってもよい。例えば、そのような成分は、抗原とその抗体または抗原結合性断片；ビオチンとアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンまたはキャプトアビジン；免疫グロブリン（またはその適切な結合領域）とプロテインＡおよびＧ；炭水化物とレクチン；相補的な２つのヌクレオチド配列；エフェクターと受容体分子；ホルモンとホルモン結合タンパク質；酵素補助因子と酵素；酵素阻害剤と酵素；セルロース結合領域とセルロース繊維；固定されたアミノフェニルボロン酸とシス−ジオールを有する分子；キシログルカンとセルロース繊維およびその類似体、誘導体および断片であってもよい。
【００７０】
修飾できないリガント１１がビオチン部分であり、第１の捕捉認識分子が、試験ストリップ２の表面で固定されたストレプトアビジン部分であるのはとりわけ好ましい。
【００７１】
基質認識分子１７は、被修飾性領域１４に対して特異的な抗体またはその抗原結合性断片であるのが好ましい。この種の抗体は、それらの結合アッセイ性能、すなわちｋｄおよびｋａが所望のアッセイ（例えば高い会合速度、低い解離速度）に最適になるように作られる。これは、当業者によく知られている免疫技術によって行われる。高度親和性抗体は動物に抗原の濃度を減らしながら繰り返し投与することにより製造される。通常、ヤギおよびヒツジが高度親和性抗体を製造するために用いられる。
【００７２】
他の実施形態において、基質認識分子１７はレクチン；ヌクレオチド配列；受容体分子；または修飾状態または未修飾状態のいずれかの被修飾性領域と結合することができるホルモン結合タンパク質である。代替として、以上記載された特異的結合分子対のうちのいずれを用いてもよいが、ただし基質認識分子１７が被修飾性領域１４と相互作用する能力を変えるように、基質１０に組み込むことができ、なおかつ、分析種酵素によって修飾できる適切な標的リガントを、基質認識分子１７が認識する場合である。例えば、被修飾性領域がビオチンを備える実施形態において、基質認識分子は、未修飾ビオチンと結合できるが、検出する酵素の作用によって修飾されたビオチンとは結合できない、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンまたはキャプトアビジンであってもよい。基質認識分子１７がヒツジ抗体であり、第２の捕捉認識分子８が抗ヒツジ抗体であることはとりわけ好ましい。
【００７３】
本発明のいくつかの実施形態において、結合メンバー１６は、試料受け取りゾーン５、または試料受け取りゾーン５と第１の検出ゾーン７の間で試験ストリップ２の構造体に乾燥される。これらの実施形態において、酵素が基質１０の被修飾性領域１４を修飾することができる条件下で、試料は基質１０と混合される。次いで、この混合物は試料受け取りゾーン５に施され、試験ストリップ２の表面の結合メンバー１６と接触する。すなわち、試験ストリップ２に試料を置く前に、結合メンバー１６と試料の混合はない。
【００７４】
いくつかの実施形態において、可溶性障壁が、試料受け取りゾーン５のすぐ下流の試験ストリップ２上に設けられる。可溶性障壁は、試料および基質の混合物を所定の時間、浸透させず、その後に障壁は破られ、混合物が試験ストリップに沿って流れ続ける。この特徴を、可溶性障壁のすぐ下流の試験ストリップ２上に結合メンバー１６を乾燥させるという特徴と組み合わせるととりわけ好ましい。このような実施形態において、試料および基質に、混合し任意の酵素が被修飾性領域１４を修飾するのに十分な時間を与え、その後に、混合物は、可溶性障壁を溶かし、結合メンバー１６と接触し、結合メンバー１６は被修飾性領域１４と結合し酵素が被修飾性領域１４でそれ以上の反応の触媒作用を及ぼすのを妨害する。次いで、前述のように試験ストリップ２は動作する。可溶性障壁は、例えば、ＰＶＡ、とりわけ低分子量（ＭＷ）ＰＶＡ、または冷水可溶性ゼラチンから製造されてもよい。
【００７５】
いずれかの実施形態のリポーター１８は、直接的または間接的に検出可能な信号を発生させることができる任意の物質であってもよい。適切なリポーターは色原体、発光化合物（例えば、蛍光性か燐光性の）；放射性化合物；可視化合物（例えばラテックス、または金色などの金属粒子）、信号発生物質を含有するリポソームまたは他の小胞；電気活性種；または酵素およびその基質の組合せである。好ましいリポーターは、第１および／または第２の検出ゾーン７、９で蓄積し、肉眼で見えるゾーンを形成する金粒子である（図１参照）。また、本発明のいくつかの実施形態において、基質認識分子１７は、リポーター１８と永続的にカップリングされないが、その代わりに、前述のような特異的結合対を介してリポーター１８とカップリング可能であることを認識されたい。
【００７６】
特定の実施形態において、酵素検出デバイス１は、２種の異なる基質１０を備え、各基質には異なる酵素による修飾に感受性のある被修飾性領域１４がある。そうでない場合、いくつかの実施形態において、両方の基質１０は同一であり、どちらの酵素が試料中にあろうと無関係に、試験ストリップ２は同じ信号を提供する。他の実施形態において、それぞれ基質１０の被修飾性領域１４の一方に特異的で他方には特異的ではない第１、第２の結合メンバー１６が設けられる。一方の基質の被修飾性領域１４は、一方の酵素と比較して優先的に（または競合的に）、第１の結合メンバー１６によって結合され、他方の基質の被修飾性領域１４は、他方の酵素と比較して優先的に（または競合的に）、第２の結合メンバー１６によって結合される。さらに、第１の結合メンバー１６のリポーター１８は、第２の結合メンバー１６のリポーター１８とは異なる信号を提供する。したがって、各酵素の存在は、どちらかの信号の存在によって区別することができる。さらなる実施形態において、前の実施形態と同様に、第１および第２の結合メンバーが設けられる。ただし、両方の結合メンバーは同一のリポーター１８を持ち、第２の検出ゾーンは第３の検出ゾーンで補われる。第２および第３の検出ゾーンには第２および第３の捕捉認識分子がそれぞれある。第２および第３の捕捉認識分子は、第１および第２の結合メンバーに対してそれぞれ特異的である。したがって、どちらかの酵素の存在は、第２または第３の捕捉ゾーンのいずれかのリポーター１８の存在または欠如によって区別できる。
【００７７】
第１および第２の結合メンバー１６が設けられる場合の実施形態のいくつかの変形において、酵素検出デバイス１は、第１および第２の試験ストリップ（例えば、試料受け取りゾーン５と、互いに平行、または外側に向かって放射状に配置された）と流体連通状態の単一の試料受け取りゾーン５を備える。第１の試験ストリップには、第１の基質と結合する第１の検出ゾーン７、および第１の基質に対して特異的な結合メンバー１６と結合する、第２の検出ゾーン９がある。同様に、第２の試験ストリップには、第２の基質と結合する第１の検出ゾーン７、および第２の基質に特異的な結合メンバー１６と結合する、第２の検出ゾーン９がある。このように、第１および第２の試験ストリップは、試料中に第１および第２の酵素の存在または欠如を示す結果を別々に提供する。
【００７８】
以上記載された具体的な実施形態において、本デバイスは試験ストリップ２の方式のクロマトグラフ媒質を備える。しかし、代替実施形態においては、クロマトグラフ媒質は設けられない。例えば、一実施形態において、第１の捕捉認識分子６は、カラムまたはビーズなどの固体担体上に固定される。前述の実施形態のように、試料は、基質１０、続いて結合メンバー１６と混合される。次いで、試料、基質１０および結合メンバー１６の混合物は担体上で洗浄され、特異的結合メンバー１１が捕捉認識分子６と結合するのを可能にする。次いで、未結合物質を洗い流すまたは流出させる。酵素が試料中にある場合、被修飾性領域１４は開裂され、結合メンバー１６は基質１０と結合することができない。このようにして、リポーター１８は固体担体上で固定されない。したがって、試料中の酵素の存在は固体担体中のリポーターの欠如によって示される。酵素が試料中にない場合、結合メンバー１６は基質１０と結合し、固体担体上のリポーター１８をこのように固定させる。したがって、試料中の酵素の欠如は、固体担体上で固定されたリポーター１８の存在によって示される。
【００７９】
いくつかの実施形態において、この種の手順は当業者に周知の方法で、９６ウェルマイクロタイタープレート中で行われる。代替として、その手順は様々な固相捕捉物質を用いて、またはマイクロアレーシステムを用いて、ロボットシステム中で行われてもよい。
【実施例】
【００８０】
キットは下記構成要素を備える。
１）サンプル流体（例えば傷からの）回収用の綿棒
２）プラスチックケースに取り付けられるラテラルフロー試験ストリップ。試験ストリップは、試験ストリップの流路を横切る第１の試験ラインとして吸着されたストレプトアビジンを備える第１の検出ゾーンおよび第１の試験ラインの下流に試験ストリップの流路を横切る第２の試験ラインとして吸着された抗ヒツジ抗体を含む第２の検出ゾーンを有する。プラスチックケースには、第１および第２の試験ラインを覗く観測窓がある。第１の試験ラインの上流にまた、統合試料を受けるパッドがある。さらに、試験ストリップには、試料を受け取るパッドおよび第１の試験ラインの間の試験ストリップに乾燥させた、または試料を受け取るパッド自体に乾燥させたヒツジ抗体（基質認識分子）を有する金粒子がある。
３）綿球が試料抽出緩衝液および基質と一緒に入れられてもよい試験管。試験管は押し上げ蓋式の口で構成され、試料／抽出流体／基質混合物を試験ストリップ上に施す準備ができている場合、口は所定位置にはめてある。試料は逆さまにしたチューブから口を通して滴下して施してもよい。
４）ｐＨ７．２のホスパヘート（ｐｈｏｓｐａｈａｔｅ）緩衝食塩水（ＰＢＳ）および０．１％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０から成る抽出流体。
５）基質（抽出流体にあらかじめ溶かしてもよい）。基質は、ＭＭＰ−９に対してバイアスをかけたアミノ酸の配列を含むペプチドから成る。配列（Ｇ）ＰＱＧＩＦＧ（Ｑ）は特に適切である。しかし、他に多くのものが入手可能で、これらは科学文献に由来してもよい。基質はポリエチレングリコールスペーサー／リンカーを介して連結された、末端ビオチン基を有する。ペプチドは、金粒子に結合したヒツジ抗体によって認識される。
【００８１】
キットの使用手順は以下のとおりである：
ステップ１：流体の試料（試験サンプル）は、キットで供給される綿球で集める。流体試料を有する綿球を、抽出緩衝液および規定量の基質と一緒に試験管に入れる（試験サンプル中に酵素が存在しない場合、第１のラインをちょうど飽和させる、限定した量でなければならないので、正確な量の基質が重要である。）。流体試料がリガントと混じることができ、流体試料を放出させるために、綿球を抽出流体内で激しく回転する。この反応混合物は、規定された時間（例えば１０分）の間、周囲温度で温置する。
【００８２】
ステップ２：温置時間が終わると、綿球を除去する、または、軸を切り離し、開けていたふたを閉じる。次いで、チューブを逆さまに絞り出して、４滴の液体を、試料を受け取るパッド上に垂らす。液体が試験ストリップへ移動すると、液体は金粒子に結合した乾燥ヒツジ抗体と接触する。これらは試験サンプルによって再水和され、ヒツジ抗体は任意の未修飾基質と結合する。液体と金粒子がラテラルフロー試験ストリップを介して移動すると、それらはその第１のラインに届き、ここでビオチン（基質上の）は認識され捕捉される。無傷の基質に結合されたいずれの金粒子も、基質の末端ビオチンによってこの第１のラインで捕捉される。基質に結合されないまたは開裂された基質に結合されるものは、通過して第２の（抗ヒツジ）ラインで捕捉されることになる。
【００８３】
ユーザーは、形成したラインを観察し、これらの相対強度を評価する。第１のラインの欠如および全強度の第２のラインの存在は、試験サンプル中の高レベルのプロテアーゼを示す。逆の結果は、ゼロまたは検出可能な限界より下の低レベルのプロテアーゼを示す。この両極端の中間段階は、試験サンプルの異なるレベルのプロテアーゼを示す。いくつかの実施形態において、結果は光電子工学ストリップリーダによって読み取る。また、読み取り値は、ユーザーに提示される単純な結果とともに単純なアルゴリズムによって自動的に解釈される。
【００８４】
この例の変形においては、試験ストリップに組み込む代わりに、（ヒツジ抗体を有する）金粒子を、温置時間が終わると、反応混合物に加える。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）未修飾状態から修飾状態への酵素による修飾に感受性のある被修飾性領域を備える基質、
（ｉｉ）未修飾状態の被修飾性領域と特異的に結合できる基質認識分子であり、基質認識分子の結合部位は、基質の被修飾性領域が、混合したときに酵素と比較して、前記基質認識分子により優先的に結合されるような部位である基質認識分子、および
（ｉｉｉ）基質認識分子にカップリング可能な検出可能な標識
を含む、提供された基質を修飾できる酵素の試料中での有無を検出する酵素検出デバイス。
【請求項２】
基質に対する基質認識分子の親和性が、比較的低い解離速度を含む、請求項１の酵素検出デバイス。
【請求項３】
基質に対する基質認識分子の親和性が、比較的低い解離速度および比較的高い会合速度を含む、請求項１の酵素検出デバイス。
【請求項４】
酵素が基質に対するより、基質認識分子が基質に対して、低い解離速度および高い会合速度を有する、請求項１の酵素検出デバイス。
【請求項５】
基質が結着領域をさらに備え、酵素検出デバイスが固体担体をさらに備え、結着領域が固体担体に結着できる、請求項１に記載の酵素検出デバイス。
【請求項６】
クロマトグラフ媒質をさらに備える、請求項１に記載の酵素検出デバイス。
【請求項７】
基質がクロマトグラフ媒質に結着可能な結着領域をさらに備える、請求項６に記載の酵素検出デバイス。
【請求項８】
クロマトグラフ媒質が、クロマトグラフ媒質上または中に固定され、基質の結着領域と結合することができる第１の捕捉認識分子を備える、請求項７に記載の酵素検出デバイス。
【請求項９】
クロマトグラフ媒質が、クロマトグラフ媒質上または中に固定され、基質の断片と場合によって組み合わせて、基質認識分子と結合することができる第２の捕捉認識分子をさらに備える、請求項８に記載の酵素検出デバイス。
【請求項１０】
第１の捕捉認識分子と結着領域および／または第２の捕捉認識分子と基質認識分子が、それぞれ結合対の半分であり、結合対それぞれが、抗原と抗体またはこれに特異的な抗原結合性断片；ビオチンとアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンまたはキャプトアビジン；プロテインＡおよびＧ；炭水化物とレクチン；相補的な２つのヌクレオチド配列；エフェクターと受容体分子；ホルモンとホルモン結合タンパク質；酵素補助因子と酵素；酵素阻害剤と酵素；セルロース結合領域とセルロース繊維；固定されたアミノフェニルボロン酸とシス−ジオールを有する分子；キシログルカンとセルロース繊維およびその類似体、この誘導体および断片である、請求項８または９に記載の酵素検出デバイス。
【請求項１１】
基質認識分子が、修飾状態または未修飾状態のいずれかの被修飾性領域と結合することができる抗体もしくはその抗原結合性断片、レクチン、ヌクレオチド配列、受容体分子、またはホルモン結合タンパク質である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の酵素検出デバイス。
【請求項１２】
基質認識分子が、未修飾ビオチンと結合できるアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンまたはキャプトアビジンである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の酵素検出デバイス。
【請求項１３】
酵素が、加水分解酵素、好ましくはペプチダーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、カルボヒドラーゼ、ホスファターゼ、スルファターゼ、ノイラミニダーゼ、エステラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の酵素検出デバイス。
【請求項１４】
酵素が、キナーゼ、グリコシル転移酵素、オキシダーゼ、還元酵素またはトランスアミナーゼである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の酵素検出デバイス。
【請求項１５】
基質認識分子に結合された検出可能な標識をさらに備える、請求項１から１４のいずれか一項に記載の酵素検出デバイス。
【請求項１６】
検出可能な標識が基質認識分子と共有結合で結合されている、請求項１５に記載の酵素検出デバイス。
【請求項１７】
標識が、蛍光団、金粒子、色原体、発光化合物；放射性化合物；可視化合物、信号発生物質を含有するリポソームまたは他の小胞、電気活性種または酵素とその基質の組合せである、請求項１５または１６に記載の酵素検出デバイス。
【請求項１８】
それぞれが被修飾性領域を有する第１の基質および第２の基質を備え、第１の基質の被修飾性領域は第１の酵素による修飾に感受性があり、第２の基質の被修飾性領域は第２の酵素による修飾に感受性がある、請求項１から１７のいずれか一項に記載の酵素検出デバイス。
【請求項１９】
（ｉ）未修飾状態から修飾状態への酵素による修飾に感受性のある被修飾性領域を備える基質を設けるステップ、
（ｉｉ）酵素を含む疑いのある試料を準備するステップ、
（ｉｉｉ）未修飾状態の被修飾性領域と特異的に結合する基質認識分子であり、基質認識分子の結合部位は、基質の被修飾性領域が、混合したときに酵素と比較して、前記基質認識分子により優先的に結合されるような部位である基質認識分子を設けるステップ、
（ｉｖ）試料中の酵素のうちの少なくとも一部が基質を修飾するように、試料と基質を混合するステップ、および
（ｖ）基質と基質認識分子を接触させ、基質と基質認識分子との間の相互作用を検出するステップ
を含む、基質を修飾することができる酵素を検出する方法。
【請求項２０】
基質に対する基質認識分子の親和性が比較的低い解離速度を含む、請求項１９の方法。
【請求項２１】
基質に対する基質認識分子の親和性が比較的低い解離速度および比較的高い会合速度を含む、請求項１９の方法。
【請求項２２】
基質認識分子が基質に対して、酵素が基質に対するより、低い解離速度および高い会合速度を有する、請求項１９の方法。
【請求項２３】
基質が結着領域をさらに備え、ステップ（ｉ）が固体担体を設け、固体担体に基質の結着領域を結合させるステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（ｉ）が、固体担体に結着領域を結合することができる第１の捕捉認識分子を設けるステップを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（ｖ）が、クロマトグラフ媒質上または中に基質および基質認識分子を配置するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
クロマトグラフ媒質がクロマトグラフ媒質上または中に固定された第１の捕捉認識分子を備え、基質が結着領域をさらに備え、第１の捕捉認識分子が結着領域と結合することができ、第１の捕捉認識分子での基質認識分子の固定化を検出するステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
クロマトグラフ媒質がクロマトグラフ媒質上または中に固定された第２の捕捉認識分子をさらに備え、第２の捕捉認識分子が基質の断片と場合によって組み合わせて、基質認識分子と結合することができ、第２の捕捉認識分子での基質認識分子の存在を検出するステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
第１の捕捉認識分子と結着領域および／または第２の捕捉認識分子と基質認識分子が結合対の半分それぞれであり、結合対が抗原と抗体またはその抗原結合性断片；ビオチンとアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンまたはキャプトアビジン；免疫グロブリン（またはその適切な領域）とプロテインＡおよびＧ；炭水化物とレクチン；相補的な２つのヌクレオチド配列；エフェクターと受容体分子；ホルモンとホルモン結合タンパク質；酵素補助因子と酵素；酵素阻害剤と酵素；セルロース結合領域とセルロース繊維；固定されたアミノフェニルボロン酸とシス−ジオールを有する分子；またはキシログルカンとセルロース繊維、およびその類似体、誘導体および断片である、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
基質認識分子が、抗体もしくはこの抗原結合性断片；レクチン；ヌクレオチド配列；受容体分子；または修飾状態もしくは未修飾状態のいずれかの被修飾性領域と結合することができるホルモン結合タンパク質である、請求項１９から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
基質認識分子が、未修飾ビオチンと結合できるアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンまたはキャプトアビジンである、請求項１９から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
酵素が、加水分解酵素、好ましくはペプチダーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、ホモまたはヘテロオリゴサッカリデダーゼ、ホモまたはヘテロポリサッカリダーゼ、カルボヒドラーゼ、ホスファターゼ、スルファターゼ、ノイラミニダーゼ、エステラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼである、請求項１９から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
酵素が、キナーゼ、グリコシル転移酵素、オキシダーゼ、還元酵素またはトランスアミナーゼである、請求項１９から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
基質認識分子に結合した標識を準備するステップをさらに含み、ステップ（ｖ）が標識の存在を検出するステップを含む、請求項１９から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
標識が基質認識分子に共有結合で結合されている、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
標識が、蛍光団、金粒子、色原体、発光化合物；放射性化合物；可視化合物、信号発生物質を含むリポソームまたは他の小胞；電気活性種；または酵素およびその基質の組合せである、請求項３３または３２に記載の方法。
【請求項３６】
ステップ（ｉ）が、それぞれが被修飾性領域を有する第１の基質および第２の基質を設けるステップを含み、第１の基質の被修飾性領域は第１の酵素に感受性があり、第２の基質の被修飾性領域は第２の酵素による修飾に感受性があり、ステップ（ｖ）が、第１の基質および第２の基質と基質認識分子との間の相互作用を検出するステップを含む、請求項１９から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
ステップ（ｉｉｉ）が、未修飾状態でそれぞれ第１の基質および第２の基質の被修飾性領域と特異的に結合する第１の基質認識分子および第２の基質認識分子を設けるステップを含み、第１の基質の被修飾性領域は、第１の酵素と比較して優先的に前記第１の基質認識分子により結合され、第２の基質の被修飾性領域は、第２の酵素と比較して優先的に前記第２の基質認識分子により結合され、ステップ（ｖ）が、第１の基質および第２の基質と第１の基質認識分子および第２の基質認識分子との間の相互作用を検出するステップを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項１】
（ｉ）未修飾状態から修飾状態への酵素による修飾に感受性のある被修飾性領域を備える基質、
（ｉｉ）未修飾状態の被修飾性領域と特異的に結合できる基質認識分子であり、基質認識分子の結合部位は、基質の被修飾性領域が、混合したときに酵素と比較して、前記基質認識分子により優先的に結合されるような部位である基質認識分子、および
（ｉｉｉ）基質認識分子にカップリング可能な検出可能な標識
を含む、提供された基質を修飾できる酵素の試料中での有無を検出する酵素検出デバイス。
【請求項２】
基質に対する基質認識分子の親和性が、比較的低い解離速度を含む、請求項１の酵素検出デバイス。
【請求項３】
基質に対する基質認識分子の親和性が、比較的低い解離速度および比較的高い会合速度を含む、請求項１の酵素検出デバイス。
【請求項４】
酵素が基質に対するより、基質認識分子が基質に対して、低い解離速度および高い会合速度を有する、請求項１の酵素検出デバイス。
【請求項５】
基質が結着領域をさらに備え、酵素検出デバイスが固体担体をさらに備え、結着領域が固体担体に結着できる、請求項１に記載の酵素検出デバイス。
【請求項６】
クロマトグラフ媒質をさらに備える、請求項１に記載の酵素検出デバイス。
【請求項７】
基質がクロマトグラフ媒質に結着可能な結着領域をさらに備える、請求項６に記載の酵素検出デバイス。
【請求項８】
クロマトグラフ媒質が、クロマトグラフ媒質上または中に固定され、基質の結着領域と結合することができる第１の捕捉認識分子を備える、請求項７に記載の酵素検出デバイス。
【請求項９】
クロマトグラフ媒質が、クロマトグラフ媒質上または中に固定され、基質の断片と場合によって組み合わせて、基質認識分子と結合することができる第２の捕捉認識分子をさらに備える、請求項８に記載の酵素検出デバイス。
【請求項１０】
第１の捕捉認識分子と結着領域および／または第２の捕捉認識分子と基質認識分子が、それぞれ結合対の半分であり、結合対それぞれが、抗原と抗体またはこれに特異的な抗原結合性断片；ビオチンとアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンまたはキャプトアビジン；プロテインＡおよびＧ；炭水化物とレクチン；相補的な２つのヌクレオチド配列；エフェクターと受容体分子；ホルモンとホルモン結合タンパク質；酵素補助因子と酵素；酵素阻害剤と酵素；セルロース結合領域とセルロース繊維；固定されたアミノフェニルボロン酸とシス−ジオールを有する分子；キシログルカンとセルロース繊維およびその類似体、この誘導体および断片である、請求項８または９に記載の酵素検出デバイス。
【請求項１１】
基質認識分子が、修飾状態または未修飾状態のいずれかの被修飾性領域と結合することができる抗体もしくはその抗原結合性断片、レクチン、ヌクレオチド配列、受容体分子、またはホルモン結合タンパク質である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の酵素検出デバイス。
【請求項１２】
基質認識分子が、未修飾ビオチンと結合できるアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンまたはキャプトアビジンである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の酵素検出デバイス。
【請求項１３】
酵素が、加水分解酵素、好ましくはペプチダーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、カルボヒドラーゼ、ホスファターゼ、スルファターゼ、ノイラミニダーゼ、エステラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の酵素検出デバイス。
【請求項１４】
酵素が、キナーゼ、グリコシル転移酵素、オキシダーゼ、還元酵素またはトランスアミナーゼである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の酵素検出デバイス。
【請求項１５】
基質認識分子に結合された検出可能な標識をさらに備える、請求項１から１４のいずれか一項に記載の酵素検出デバイス。
【請求項１６】
検出可能な標識が基質認識分子と共有結合で結合されている、請求項１５に記載の酵素検出デバイス。
【請求項１７】
標識が、蛍光団、金粒子、色原体、発光化合物；放射性化合物；可視化合物、信号発生物質を含有するリポソームまたは他の小胞、電気活性種または酵素とその基質の組合せである、請求項１５または１６に記載の酵素検出デバイス。
【請求項１８】
それぞれが被修飾性領域を有する第１の基質および第２の基質を備え、第１の基質の被修飾性領域は第１の酵素による修飾に感受性があり、第２の基質の被修飾性領域は第２の酵素による修飾に感受性がある、請求項１から１７のいずれか一項に記載の酵素検出デバイス。
【請求項１９】
（ｉ）未修飾状態から修飾状態への酵素による修飾に感受性のある被修飾性領域を備える基質を設けるステップ、
（ｉｉ）酵素を含む疑いのある試料を準備するステップ、
（ｉｉｉ）未修飾状態の被修飾性領域と特異的に結合する基質認識分子であり、基質認識分子の結合部位は、基質の被修飾性領域が、混合したときに酵素と比較して、前記基質認識分子により優先的に結合されるような部位である基質認識分子を設けるステップ、
（ｉｖ）試料中の酵素のうちの少なくとも一部が基質を修飾するように、試料と基質を混合するステップ、および
（ｖ）基質と基質認識分子を接触させ、基質と基質認識分子との間の相互作用を検出するステップ
を含む、基質を修飾することができる酵素を検出する方法。
【請求項２０】
基質に対する基質認識分子の親和性が比較的低い解離速度を含む、請求項１９の方法。
【請求項２１】
基質に対する基質認識分子の親和性が比較的低い解離速度および比較的高い会合速度を含む、請求項１９の方法。
【請求項２２】
基質認識分子が基質に対して、酵素が基質に対するより、低い解離速度および高い会合速度を有する、請求項１９の方法。
【請求項２３】
基質が結着領域をさらに備え、ステップ（ｉ）が固体担体を設け、固体担体に基質の結着領域を結合させるステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（ｉ）が、固体担体に結着領域を結合することができる第１の捕捉認識分子を設けるステップを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（ｖ）が、クロマトグラフ媒質上または中に基質および基質認識分子を配置するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
クロマトグラフ媒質がクロマトグラフ媒質上または中に固定された第１の捕捉認識分子を備え、基質が結着領域をさらに備え、第１の捕捉認識分子が結着領域と結合することができ、第１の捕捉認識分子での基質認識分子の固定化を検出するステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
クロマトグラフ媒質がクロマトグラフ媒質上または中に固定された第２の捕捉認識分子をさらに備え、第２の捕捉認識分子が基質の断片と場合によって組み合わせて、基質認識分子と結合することができ、第２の捕捉認識分子での基質認識分子の存在を検出するステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
第１の捕捉認識分子と結着領域および／または第２の捕捉認識分子と基質認識分子が結合対の半分それぞれであり、結合対が抗原と抗体またはその抗原結合性断片；ビオチンとアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンまたはキャプトアビジン；免疫グロブリン（またはその適切な領域）とプロテインＡおよびＧ；炭水化物とレクチン；相補的な２つのヌクレオチド配列；エフェクターと受容体分子；ホルモンとホルモン結合タンパク質；酵素補助因子と酵素；酵素阻害剤と酵素；セルロース結合領域とセルロース繊維；固定されたアミノフェニルボロン酸とシス−ジオールを有する分子；またはキシログルカンとセルロース繊維、およびその類似体、誘導体および断片である、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
基質認識分子が、抗体もしくはこの抗原結合性断片；レクチン；ヌクレオチド配列；受容体分子；または修飾状態もしくは未修飾状態のいずれかの被修飾性領域と結合することができるホルモン結合タンパク質である、請求項１９から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
基質認識分子が、未修飾ビオチンと結合できるアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンまたはキャプトアビジンである、請求項１９から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
酵素が、加水分解酵素、好ましくはペプチダーゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、ホモまたはヘテロオリゴサッカリデダーゼ、ホモまたはヘテロポリサッカリダーゼ、カルボヒドラーゼ、ホスファターゼ、スルファターゼ、ノイラミニダーゼ、エステラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼである、請求項１９から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
酵素が、キナーゼ、グリコシル転移酵素、オキシダーゼ、還元酵素またはトランスアミナーゼである、請求項１９から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
基質認識分子に結合した標識を準備するステップをさらに含み、ステップ（ｖ）が標識の存在を検出するステップを含む、請求項１９から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
標識が基質認識分子に共有結合で結合されている、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
標識が、蛍光団、金粒子、色原体、発光化合物；放射性化合物；可視化合物、信号発生物質を含むリポソームまたは他の小胞；電気活性種；または酵素およびその基質の組合せである、請求項３３または３２に記載の方法。
【請求項３６】
ステップ（ｉ）が、それぞれが被修飾性領域を有する第１の基質および第２の基質を設けるステップを含み、第１の基質の被修飾性領域は第１の酵素に感受性があり、第２の基質の被修飾性領域は第２の酵素による修飾に感受性があり、ステップ（ｖ）が、第１の基質および第２の基質と基質認識分子との間の相互作用を検出するステップを含む、請求項１９から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
ステップ（ｉｉｉ）が、未修飾状態でそれぞれ第１の基質および第２の基質の被修飾性領域と特異的に結合する第１の基質認識分子および第２の基質認識分子を設けるステップを含み、第１の基質の被修飾性領域は、第１の酵素と比較して優先的に前記第１の基質認識分子により結合され、第２の基質の被修飾性領域は、第２の酵素と比較して優先的に前記第２の基質認識分子により結合され、ステップ（ｖ）が、第１の基質および第２の基質と第１の基質認識分子および第２の基質認識分子との間の相互作用を検出するステップを含む、請求項３６に記載の方法。
【図３】
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１０−５３７１８６（Ｐ２０１０−５３７１８６Ａ）
【公表日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２１４８３（Ｐ２０１０−５２１４８３）
【出願日】平成２０年８月２６日（２００８．８．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００２８８９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２４８０５
【国際公開日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【出願人】（５０８２５７３４８）モロジック リミテッド (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月２６日（２００８．８．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／００２８８９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２４８０５
【国際公開日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【出願人】（５０８２５７３４８）モロジック リミテッド (6)
【Ｆターム（参考）】
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