酵素的活性化およびカップリングを使用したペプチド合成
（ｉ）Ｎ−末端保護アミノ酸、Ｎ−末端保護アミノ酸Ｃ−末端エステル、Ｎ−末端保護ペプチド、またはＮ−末端保護ペプチドＣ−末端エステル、および（ｉｉ）それぞれ式ＨＯ−ＣＸ２−Ｚで表されるアルコール、式ＨＳ−ＣＸ２−Ｚで表されるチオールからエステルまたはチオエステルを酵素的に調製するステップであって、各Ｘが独立してハロゲン原子または水素原子を表し、Ｚがｓｐ３−混成炭素に直接付着するヘテロ原子を含んでなる少なくとも２個の置換基を含んでなるｓｐ３−混成炭素、およびｓｐ２−混成炭素に直接付着するヘテロ原子を含んでなる１または２個の置換基を含んでなるｓｐ２−混成炭素の群から選択され、エステルまたはチオエステルの調製が、反応媒体中の液体の重量を基準として２重量％以下の水を含んでなる反応媒体中で実施される、ステップと、調製されたエステルまたはチオエステルを、場合によりＣ−末端保護されていてもよいアミノ酸、または場合によりＣ−末端保護されていてもよいペプチドに酵素的にカップリングし、それによって反応媒体総重量を基準にして２重量％以下の水を含んでなる反応媒体中でペプチドを合成するステップとを含んでなる、ペプチドを酵素的に合成する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ペプチドを酵素的に合成する方法に関する。
【０００２】
ペプチド、特にオリゴペプチドは、例えば医薬品、食品または飼料成分、農薬または化粧品成分として、多数の用途を有する。
【０００３】
本発明の目的では、ペプチドとは２個以上のアミノ酸のあらゆる鎖を意味する。本発明の目的では、「オリゴペプチド」とは２〜２００個のアミノ酸ベースの、特に２〜１００個のアミノ酸ベースの、より特には２〜５０個のアミノ酸ベースの、好ましくは２〜２００個のアミノ酸、より好ましくは２〜１００個のまたは２〜５０個のアミノ酸のあらゆる直鎖のペプチドを意味する。「ポリペプチド」という用語は、オリゴペプチドについて規定されるよりもさらに多数のアミノ酸をベースとするペプチドに対して使用される。
【０００４】
本発明の目的では、その中で１つ以上のペプチド結合が酵素的カップリング反応によって形成されるペプチド合成と定義される化学酵素的ペプチド合成は、化学ペプチド合成に優るいくつかの利点を有する。例えばアミノ酸側鎖保護の必要性が皆無または限定的であるという事実のために、大規模生産した場合の原価がより低い。また方法は環境により優しい。例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）または１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドメチオジド（ＥＤＣｌ）などのいかなる理論量の有害試薬も不要である。さらにこのような方法は、より少ない有機溶剤を使用して実施してもよい。さらに酵素触媒カップリングにはラセミ化がなく（例えばＳｅｗａｌｄおよびＨ．−Ｄ．Ｊａｋｕｂｋｅ，「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，重版第１刷，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ ２００２年，２５０頁を参照されたい）、より純粋な生成物および／またはより容易な単離がもたらされる。
【０００５】
化学酵素的カップリング法に関して、ペプチド結合を作り出す２つの選択肢がある。いわゆる熱力学的（または平衡状態制御）アプローチでは、カルボキシ構成要素、すなわちそのＣ末端でカップリングされる構成要素が遊離カルボン酸官能基を有するのに対し、動力学的制御アプローチでは、一級ｎ−アルキルエステルなどの反応性カルボキシ構成要素が使用される。
【０００６】
熱力学的アプローチには、３つの主要な不都合がある。ｉ）平衡状態はペプチド結合切断の側に通常あるためカップリング収率が不良であり、ｉｉ）大量の酵素が通常必要とされ、ｉｉｉ）反応速度が通常非常に遅い。動力学的制御アプローチでは、出発原料としてアルキルエステルが必要とされるが、はるかにより少ない酵素が必要とされ、反応時間は顕著により短く、とりわけ最大可能収率が通常大幅により高い。したがって産業上の利用のためには、動力学的アプローチに基づく、すなわち活性化カルボキシ構成要素を使用した、酵素的ペプチド合成構想が最も魅力的である。（例えばＮ．ＳｅｗａｌｄおよびＨ．−Ｄ．Ｊａｋｕｂｋｅ，「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，重版第１刷，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ ２００２年，セクション４．６．２を参照されたい）。
【０００７】
化学酵素的ペプチド合成は、Ｃ→Ｎ末端方向またはＮ→Ｃ末端方向で段階的に実施し得るが、化学合成を使用して、または化学および化学酵素的カップリング工程の組み合わせによって、個々に合成された断片の酵素的カップリングもまた内含し得る。Ｃｈｅｎらは、「低水性」有機溶剤と、有機溶剤中で活性で安定しているプロテアーゼとのカップリングについて記載する。（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９２年，５７，６９６０〜６５頁；Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １９９１年，５０，１８１頁；Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１９９１年，１，４４５頁）。そこで記載される方法の不都合は、これらの出版物に記載される方法では、わずかな酵素のみが低水性条件において活性で安定しており、酵素の基質範囲が限定的なことである。したがって長い反応時間と、多量の過剰なアミノ酸またはペプチド求核剤が通常必要とされる。さらにペプチド中の他の位置でいくらかの加水分解があり、また断片の１つにおいて既存のペプチド結合上でアミノ基転移が起きることが多い（＝既存のペプチド結合の１つの上のアミノ酸またはペプチド求核剤の酵素触媒求核攻撃）。したがって収率が低いことがある。さらに生成物の精製が困難であることが多い。
【０００８】
別のアプローチは、Ｆ．Ｂｏｒｄｕｓａら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２年，３，１５９〜１８０頁でレビューされたいわゆる「基質模倣剤」の使用である。このアプローチでは、Ｃ−活性化アミノ酸またはペプチドが特定アミノ酸と似ているエステル部分を有し、その類似性は、その特定アミノ酸に対して選択的な酵素が、そのエステル部分を有するあらゆるアミノ酸と迅速に反応するほどである。好個の一例はＢｏｒｄｕｓａらによって発見された４−グアニジノフェニル（Ｇｐ）エステルの使用であり、それは、その加水分解特性においてＡｒｇ−Ｘ（Ｘはあらゆるタンパク新生アミノ酸を表す）配列に対して特異的なトリプシンが、ほとんどあらゆるＣ末端（Ｇｐエステルを有する）を様々なアミノ酸およびペプチド求核剤にカップリングし得る程度にまで、Ａｒｇと似ている。例えばＮ−保護Ｄ−Ａｌａ−ＯＧｐは、Ｍ．Ｔｈｏｒｍａｎｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９年，３８，６０５６頁によって実証されたように、様々なアミノ酸およびペプチド求核剤とカップリングし得る。したがってＤ−アミノ酸および非タンパク新生アミノ酸もまた、高効率で酵素的に組み込み得て、さらにカップリング酵素がそれに対して特異的であるペプチド結合がある場合（例えばトリプシンの場合Ａｒｇ−Ｘ結合）を除き、断片中のペプチド結合の加水分解が起きない。基質模倣剤アプローチの不都合は、基質模倣剤（Ｇｐエステルなど）が、規模拡大が困難な、またそれによってアミノ酸のラセミ化が生じることが多い、骨の折れる多段階化学合成を要することである。基質模倣剤はまた不安定でもあり、したがって大規模な取り扱いが困難であり、水溶液に対するそれらの溶解度は低いことがある。
【０００９】
「Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００１年，第３巻，第２６号，４１５７〜４１５９頁」で、ＬｉｕおよびＴａｍは、１〜２．５％の水を含んでなる１，３−プロパンジオールおよび１，４−ブタンジオール中で、特定のＮ末端Ｂｏｃ−保護アミノ酸と非保護ペプチドのＣ末端３−ヒドロキシプロピルまたは４−ヒドロキシブチルエステルの形成を触媒するために、サブチリシンカールスバーグを使用する方法を報告する。さらに反応媒体（その中でエステル形成が起きた媒体とは異なる）中における、アミノ酸（ロイシン）またはペプチドと、得られたエステルとの酵素的カップリングについて記載している。その中でカップリングが起きる反応媒体は、相当量の水を含んでなる。
【００１０】
「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１９９年，第５４巻，第３号，２８７〜２９０頁」でＭｉｔｉｎらは、少なくとも１０重量％の水を含有するグリセロール中において、Ｎ末端ＢｏｃおよびＮ末端Ｃｂｚ保護アミノ酸とペプチドとのＣ末端グリセリルエステル形成を触媒するために、パパインを使用して最大７０％の収率でエステルを得る方法を報告する。１０重量％未満の水を含有する溶液の使用は、パパイン変性のせいではるかにより低いエステル収率をもたらす。
【００１１】
（例えばＴ．Ｍｉｙａｚａｗａら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１，２００２年，３９０〜３９５頁で記載されるような）さらに別のアプローチは、カルバモイルメチル（Ｃａｍ）エステル、または（Ａ．Ｙａｎら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，６１，２００５年，５９３３〜５９４１頁で記載されるような）２，２，２−トリフルオロエチルエステルなどの「活性化」エステルの使用である。これらのエステルは通常、「真正」基質模倣剤に比べてより容易に調製され、より安定しているが、なおも高価で環境に優しくない化学的工程を必要とする。さらにこれらのエステルの調製は、アミノ酸のいくらかのラセミ化をもたらすことが多い。例えばＣａｍエステルは、アシル供与体のＣｓ塩を２−クロロアセトアミドによって処理することで調製し得て、Ｔｆｅエステルはカルボジイミドの化学的性質を使用して調製し得る。ＣａｍおよびＴｆｅエステルは、通常、パパインおよびサブチリシンなどの安価で容易に入手できるプロテアーゼを使用して、アミノ酸またはペプチド求核剤とカップリングされる。したがってＤ−アミノ酸もまた、ペプチドに組み込み得る（Ｐｒｏは未だに組み込まれていない）。
【００１２】
ペプチドを合成するための、および／または一般にペプチド合成に使用し得る中間体化合物を調製するための、代案の方法に対する必要性が残されている。このような方法は、例えばペプチド合成における順応性を増大させる、および／または既知の方法を使用して得られない、または得ることが比較的困難である特定ペプチドの合成を可能にする、追加的方法を提供するかもしれない。例えば許容可能な時間内に、良好な収率で、様々なアミノ酸を酵素的にカップリングすることはなおも難題である。したがってタンパク新生アミノ酸だけでなく、Ｄ−α−アミノ酸、β−アミノ酸、フェニルグリシン、ＤＯＰＡ、α−アルキル化アミノ酸、またはＮ末端アミノ酸残基がこれらのアミノ酸のいずれかの残基であるペプチドなどの非タンパク新生アミノ酸をそれらのＮ末端アミン官能基を通じて別のアミノ酸またはペプチドのＣ末端カルボン酸官能基にカップリングする、改善された方法に対する必要性が依然として存在する。さらにタンパク新生アミノ酸だけでなく、Ｄ−α−アミノ酸、β−アミノ酸、フェニルグリシン、ＤＯＰＡ、α−アルキル化アミノ酸、またはＣ末端アミノ酸残基がこれらのアミノ酸のいずれかの残基であるペプチドなどの非タンパク新生アミノ酸をそれらのＣ末端カルボキシル官能基を通じて別のアミノ酸またはペプチドのＮ末端アミン官能基にカップリングする、改善された技術に対する必要性が依然として存在する。
【００１３】
さらにあらゆるアミノ酸またはペプチドをそのＮ末端アミン官能基を通じて、バリンまたはイソロイシンなどの立体障害アミノ酸のＣ末端カルボン酸官能基に、またはそのＣ末端アミノ酸残基がバリンまたはイソロイシンなどの立体障害ヒンダードアミノ酸であるペプチドに、酵素的にカップリングすることに関する、改善された技術に対する必要性が特に存在する。
【００１４】
さらに比較的環境に優しい、新しい比較的単純な方法に対する必要性が残されている。
【００１５】
アミノ酸またはペプチドの活性化Ｃ末端エステルまたは活性化Ｃ末端チオエステルの酵素的調製を組み合わせ、この活性化エステルまたは活性化チオエステルを別のアミノ酸またはペプチドに特定のやり方で酵素的にカップリングすることによって、このような方法を提供できることが今や分かった。
【００１６】
したがって本発明は、
（ｉ）Ｎ−末端保護アミノ酸、Ｎ−末端保護アミノ酸Ｃ−末端エステル、Ｎ−末端保護ペプチド、またはＮ−末端保護ペプチドＣ−末端エステル、および
（ｉｉ）それぞれ式ＨＯ−ＣＸ２−Ｚで表されるアルコール、式ＨＳ−ＣＸ２−Ｚで表されるチオール
からエステルまたはチオエステルを酵素的に調製するステップであって、
各Ｘが独立してハロゲン原子または水素原子を表し、
Ｚがｓｐ３−混成炭素に直接付着するヘテロ原子を含んでなる少なくとも２個の置換基を含んでなるｓｐ３−混成炭素、およびｓｐ２−混成炭素に直接付着するヘテロ原子を含んでなる１または２個の置換基を含んでなるｓｐ２−混成炭素の群から選択され、
前記エステルまたはチオエステルの調製が、反応媒体中の液体の重量を基準として２重量％以下の水を含んでなる反応媒体中で実施される、ステップと、
前記調製されたエステルまたはチオエステルを、場合によりＣ−末端保護されていてもよいアミノ酸、または場合によりＣ−末端保護されていてもよいペプチドに酵素的にカップリングし、それによって反応媒体総重量を基準にして２重量％以下の水を含んでなる反応媒体中でペプチドを合成するステップと
を含んでなる、ペプチドを酵素的に合成する方法に関する。
【００１７】
「Ｃ末端保護」という用語は、Ｃ末端カルボキシル基に保護基が付与されて、カルボキシル基が別の分子のアミン基とカップリングすることから一般に実質的に保護されることを示すために、本明細書で使用される。特にＣ末端保護基はＣ末端エステルであってもよく、それによって使用されるペプチド合成条件下で、Ｃ末端カルボキシル基がアミンとカップリングすることから少なくとも実質的に保護される。ｔ−アルキル基が、一般に使用される保護基である。
【００１８】
「Ｎ末端保護」という用語は、Ｎ末端アミン基に保護基が付与されて、Ｎ末端アミン基がＣ末端カルボキシル基とＮ末端アミン基とのカップリングに関与することから一般に少なくとも実質的に保護されることを示すために、本明細書で使用される。
【００１９】
本発明の方法で調製されたエステルまたはチオエステルはカップリング反応に関与できるので、このようなエステルはそれぞれ「活性化エステル」または「活性化チオエステル」と称されてもよい。対照的に活性化エステルの調製のために使用してもよい遊離Ｃ末端カルボン酸またはエステルは、カップリングに参与できず、またはカップリング反応において少なくとも実質的により低い反応性を有し、例えば本発明の方法で酵素的に調製された活性化エステルの半分未満の反応性、１０分の１未満の反応性または１００分の１未満の反応性を有する。特にＣ末端アミノ酸残基またはＮ末端アミノ酸残基が従来法ではカップリング困難な（低カップリング速度を有する）アミノ酸では、アミノ酸またはＣ末端アミノ酸残基の活性化のおかげで、本発明の方法によってカップリング速度の大幅な増大を達成し得る。カップリングが困難なアミノ酸またはアミノ酸残基の典型的な例は、Ｄ−アミノ酸またはそのアミノ酸残基、およびその他の非タンパク新生アミノ酸またはそのアミノ酸残基である。さらなる例としては、例えばバリンおよびイソロイシンなどの立体障害アミノ酸、またはそのアミノ酸残基が挙げられる。
【００２０】
各エステルまたはチオエステルの酵素的調製は、下文においてそれぞれエステル化またはチオエステル化と称されてもよい。この用語は、（チオ）エステルの調製が、Ｎ末端保護アミノ酸またはペプチドＣ末端エステルと（チオ）アルコールとの反応を伴う場合を含む。もっと正確に言えばこのような反応は、（チオ）エステル転移反応として知られている。
【００２１】
一実施態様では、カップリングに参与するプロリンおよび非タンパク新生アミノ酸、またはプロリンまたは非タンパク新生末端アミノ酸残基を含有するペプチドをはじめとする、カップリング反応に参与する末端アミノ酸残基が異なる様々なアミノ酸または様々なペプチドのカップリングのために本発明の方法を使用する可能性を提供するという点において、本発明の方法は有利である。
【００２２】
一実施態様では、活性化（チオ）エステルが、環境に優しいやり方で、すなわち理論量の廃棄化合物を生じることなく、ラセミ化またはその他の副反応なしに高収率で合成されるという点において、本発明の方法は有利である。
【００２３】
一実施態様では、方法で使用される１つまたは複数の酵素に高い安定性および／または活性を提供するという点において、本発明の方法は有利である。
【００２４】
一実施態様では、（（チオ）エステルの調製とカップリングを達成するのに典型的な時間枠内で）酵素的に調製されたエステルの加水分解の程度が低いという点において、本発明の方法は有利であり、少なくともいくつかの実施態様では検出可能なエステルの加水分解は観察されていない。
【００２５】
一実施態様では、酵素的に調製されたペプチドの加水分解の程度が低いという点において、本発明の方法は有利であり、少なくともいくつかの実施態様では、検出可能な酵素的に調製されたペプチドの加水分解は観察されていない。
【００２６】
一実施態様では、高い全体的反応速度、すなわちＮ−保護アミノ酸またはペプチド開始化合物から合成ペプチドへの高い転換速度を提供するという点において、本発明の方法は有利であり、特定収率が比較的短い反応時間で達成される。
【００２７】
特に本発明の方法は、大幅に過剰なカップリングパートナーの１つを必要とせずに、アミノ酸またはペプチドを別のアミノ酸またはペプチドにカップリングして、比較的短時間で他方のカップリングパートナーをベースとする合成ペプチドを許容可能な収率で得られるようにする。（活性化）（チオ）エステルがそれから調製される、Ｎ末端保護アミノ酸、Ｎ末端保護アミノ酸Ｃ末端エステル、Ｎ末端保護ペプチド、またはＮ末端保護ペプチドＣ末端エステルと、場合によりＣ末端保護されていてもよいアミノ酸またはペプチドとのモル比は、通常２：１〜１：３の範囲、特に１：１〜１：２の範囲、好ましくは１：１〜１：１．５の範囲で選択される。特に好ましい方法では、前記モル比は１：１〜１：１．１の範囲である。
【００２８】
本発明の方法は、化学酵素的ペプチド合成の一環として、Ｎ末端保護アミノ酸またはＮ末端保護ペプチドの活性化Ｃ末端エステルまたはチオエステル、特にＮ末端保護アミノ酸またはＮ末端保護ペプチドのＣ末端カルバモイルメチル（Ｃａｍ）エステルまたはＣ末端２，２，２−トリフルオロエチル（Ｔｆｅ）エステルを酵素的に調製できることが判明したという点において、特に有利である。特にプロテアーゼまたはリパーゼを使用してＣａｍおよびＴｆｅエステルを高収率で酵素的に調製し得ること、さらに良いことには、カップリングされるアミノ酸またはペプチドの等モル量を使用した場合でさえ、すなわち過剰なアミノ酸またはペプチドが求核剤として作用する必要なしに、プロテアーゼを使用してペプチド結合形成工程と同時に、プロテアーゼまたはリパーゼによる活性化工程を実施して、顕著な副反応なしに９０％を超える収率で縮合物（合成されるペプチド）を生じ得ることが意外にも分かった。
【００２９】
さらにプロリン、または例えばＤ−アミノ酸のような非タンパク新生アミノ酸などの「困難な」アミノ酸が、アセンブルされるペプチド結合の片側または両側に存在する場合でも、顕著なラセミ化なしにペプチドを合成できることが分かった。
【００３０】
本発明に従った方法は、特にいわゆる「ワンポット」法で（チオ）エステル化を実施できることから、比較的単純な方法を提供する。ワンポット法では、（チオ）エステル化およびカップリングの間で（調製されるエステルまたはチオエステルの）単離工程を実施することなく、反応が実施される。反応のはじめから全物質（カップリングするアミノ酸またはそのエステルおよび／またはペプチドまたはそのエステル、アルコール／チオール、溶剤および酵素など）を含めることで本発明に従った方法を実施することさえでき、それは合成されるペプチドを比較的短時間内に高収率で得ることに関して特に有益かもしれない。したがって本発明の特に適切なワンポット法では、調製されたエステルまたはチオエステルがそれにカップリングされる、場合によりＣ−末端保護されていてもよいアミノ酸または場合によりＣ−末端保護されていてもよいペプチドの存在下で、エステルまたはチオエステルの調製を実施する。
【００３１】
本発明のさらに別のワンポット法では、（チオ）エステル化およびカップリングが逐次実施され、すなわちエステルまたはチオエステルを調製した後に、場合によりＣ−末端保護されていてもよいアミノ酸または場合によりＣ−末端保護されていてもよいペプチドを添加する。
【００３２】
本発明のさらに別のワンポット法では、最初にリパーゼまたはエステラーゼを使用した（チオ）エステルの調製を実施して、その後カップリング反応を触媒するために酵素（通常プロテアーゼ）を添加する。このようなアプローチは、例えばカップリングを触媒する酵素が（チオ）エステルの調製を触媒する酵素の活性または安定性に悪影響を及ぼす場合など、（チオ）エステルの調製に有害である場合に特に採用される。
【００３３】
最初は本発明の方法で使用される物質の１つ以上の一部のみを含めて残部を後から添加するような、これらのワンポット法の中間型もまた使用できる。特に調製されたエステルまたはチオエステルがそれにカップリングされる、場合によりＣ−末端保護されていてもよいアミノ酸または場合によりＣ−末端保護されていてもよいペプチドの一部を徐々にまたは段階的に添加してもよい。
【００３４】
原則として、（チオ）エステル化を触媒する酵素およびカップリングを触媒する酵素は同一であってもよく、特に同一リパーゼ、エステラーゼ、またはプロテアーゼであってもよい。例えばサブチリシンカールスバーグまたはカンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢをこのような実施態様で使用してもよい。
【００３５】
比較的短時間内に合成ペプチドを得ることに関して、少なくとも２つの酵素、すなわちリパーゼおよびエステラーゼの群から選択される少なくとも１つの酵素と、少なくとも１つのプロテアーゼとの使用が特に有利であることが分かった。発明のワンポット法では、リパーゼまたはエステラーゼが（主として）（チオ）エステル化を触媒し、およびプロテアーゼが（主として）カップリング反応を触媒することが考察される。
【００３６】
（チオ）エステル化されるＮ末端保護アミノ酸またはＮ末端保護ペプチドは、原則としてあらゆるタンパク新生または非タンパク新生アミノ酸、またはタンパク新生および／または非タンパク新生アミノ酸をベースとするあらゆるペプチドであってもよい。
【００３７】
好ましい実施態様では、本発明は、エステルまたはチオエステルの酵素的調製のために、（ｉ）Ｎ末端保護アミノ酸またはＮ末端保護ペプチドと、（ｉｉ）それぞれ式ＨＯ−ＣＸ２−Ｚで表されるアルコール、式ＨＳ−ＣＸ２−Ｚで表されるチオールとを反応させる、本発明に従った方法に関する。
【００３８】
特にＮ末端保護アミノ酸またはペプチドは、式Ｉの化合物によって表される。
【化１】
【００３９】
式中、ＰはＮ末端保護基を表す。適切なＮ末端保護基は、（オリゴ）ペプチド合成のために使用し得るＮ保護基である。このような基は当業者に知られている。適切なＮ保護基の例としては、例えば「Ｃｂｚ」（すなわちベンジルオキシカルボニル）、「Ｂｏｃ」（すなわちｔ−ブチルオキシカルボニル）、「Ｆｏｒ」（すなわちホルミル）、Ｆｍｏｃ（すなわち９−フルオレニルメトキシカルボニル）、および「ＰｈＡｃ」（すなわちフェナセチル）などのカルボニルタイプの保護基が挙げられる。ＦｏｒまたはＰｈＡｃ基は、それぞれ酵素ペプチドデホルミラーゼまたはＰｅｎＧアシラーゼを使用して、酵素的に導入し切断してもよい。化学的切断法は、一般に当該技術分野で知られている。
【００４０】
式中は、ｎは少なくとも１の整数である。ｎは特に少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも９または少なくとも１０であってもよい。ｎは特に１００以下、７５以下、５０以下、２５以下、２０以下１５以下または１０以下、例えば５以下であってもよい。
【００４１】
各ＲＡおよび各ＲＢは、独立してＨ、または有機部分、好ましくはアミノ酸側鎖を表す。したがってｎ個のアミノ酸単位の全てでＲＡが同一である必要はない。同様にｎ個のアミノ酸単位の全てでＲＢが同一である必要もない。
【００４２】
本発明の文脈で「アミノ酸側鎖」とは、あらゆるタンパク新生または非タンパク新生アミノ酸側鎖を意味する。アミノ酸側鎖中の反応性基は、アミノ酸側鎖保護基によって保護されていても、または保護されていなくてもよい。アミノ酸側鎖のための適切な保護基は当業者に知られている。特に所望ならば、アミノ酸またはペプチドの溶解性を改善するために、酸性またはアルカリ性側鎖基の全てまたは一部に保護基が備わっていてもよい。
【００４３】
タンパク新生アミノ酸は、遺伝コードによってコードされるアミノ酸である。タンパク新生アミノ酸としては、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、メチオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、トリプトファン、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アルギニン、プロリン、およびフェニルアラニンが挙げられる。
【００４４】
非タンパク新生アミノ酸は、特にＤ−アミノ酸、フェニルグリシン、ＤＯＰＡ（３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン）、β−アミノ酸、４−フルオロ−フェニルアラニン、またはα−アルキル化アミノ酸から選択されてもよい。
【００４５】
特定の実施態様では、カップリング反応に参与するエステルまたはチオエステルの調製に使用されるＮ末端保護アミノ酸またはペプチドは、例えば一般にペプチドを合成するための酵素的カップリング反応において実質的な活性を示さない、または少なくとも活性が調製された（チオ）エステルよりも低いようなｔ−アルキルエステルまたは別のエステルなど、調製される（チオ）エステルとは異なるＣ末端エステルである。このような場合、（チオ）エステルの調製は（チオ）エステル転移と称されてもよい。
【００４６】
調製されるアルコールまたはチオールと反応させる化合物がエステルである実施態様では、それは典型的に上述のようにアミノ酸またはペプチドのエステルである。
【００４７】
したがってエステルは、式ＩＩによって表される。
【化２】
このエステルは、典型的にカップリング反応において、本発明の方法で酵素的に調製されたエステルまたはチオエステルよりも反応性が低い。一般にこれは、Ｒｃ基が電子求引性基でなく、またはエステルまたはチオエステルの調製で使用されるアルコールまたはチオールのＣＸ２−Ｚ基よりも電子求引性が低いことを意味する。Ｒｃは、通常は炭化水素基であり、またはエステルに対してγ位の、またはエステル部分からより離れた位置の炭素に置換基を含んでなる炭化水素基である。特にＲｃは、アルキル基、特にＣ１〜Ｃ６アルキル基、とりわけメチル基、エチル基、一級プロピル基、二級プロピル基、一級ブチル基、二級ブチル基、または三級ブチル基であってもよい。
【００４８】
Ｐ、ＲＡ、ＲＢ、およびｎは、上で同定された通りである。
【００４９】
（チオ）エステルの調製で使用されるアルコールＨＯ−Ｘ２−ＺまたはチオールＨＳ−Ｘ２−Ｚは、一般に活性化アルコールまたはチオールである。活性化アルコールまたはチオールは、（チオ）エステル化後に活性化Ｃ末端カルボキシ（チオ）エステル基、すなわちカップリング反応に参与し得るカルボキシ（チオ）エステル基を提供するアルコールまたはチオールである。上述の通り、アルコールは式ＨＯ−ＣＸ２−Ｚで表され、またはチオールは式ＨＳ−ＣＸ２−Ｚで表される。
【００５０】
式中、各Ｘは独立して、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）または水素原子を表す。Ｘがハロゲン原子である場合、それは好ましくはＦである。Ｘの双方が水素である本発明の方法で、良好な結果が得られている。
【００５１】
通常Ｚは電子求引性基を表す。理論により拘束されることなく、これはカップリング反応速度に関して有利であると考えられる。
【００５２】
Ｚは、ヘテロ原子を含んでなる１つ以上の置換基を含んでなるｓｐ２またはｓｐ３混成炭素原子を表す。Ｎ末端保護アミノ酸またはＮ末端保護ペプチドのＣ末端（チオ）エステル、およびこのようなアルコールまたはチオールを化学的に調製することは一般に困難であり、または少なくとも骨が折れる。したがって本発明はこのようなエステルを調製する比較的単純な方法を提供するという点において、さらに特に有利である。
【００５３】
特定の実施態様では、Ｚはヘテロ原子を含んでなる１つの置換基を含んでなるｓｐ３−混成炭素の群から選択され、そのヘテロ原子はｓｐ３−混成炭素に直接結合する。
【００５４】
好ましい実施態様では、Ｚは、ヘテロ原子を含んでなる２または３個の置換基、特に２または３個のハロゲン置換基、好ましくはＦおよびＣｌの群から選択される２または３個のハロゲン置換基を含んでなるｓｐ３−混成炭素の群から選択され、各置換基の前記ヘテロ原子はｓｐ３−混成炭素に直接結合し、例えばＺはトリフルオロメチル基またはトリクロロメチル基を表してもよい。例えば２，２，２−トリフルオレチルアルコール（Ｘ＝Ｈ、Ｚ＝ＣＦ３）を用いて、特にリパーゼおよびプロテアーゼの双方を利用する方法で、良好な結果が達成された。Ｎ末端保護アミノ酸トリフルオロエチルエステルまたはＮ末端保護ペプチドＣ末端２，２，２−トリフルオロエチルエステルをＮ末端保護アミノ酸またはペプチドから酵素的に調製し、引き続いて酵素的カップリング法で使用し得ること、さらにはワンポット法において良好な収率でこれを達成できることは、特に驚くべきことである。
【００５５】
さらなる好ましい実施態様では、Ｚはヘテロ原子を含んでなる少なくとも１つの置換基を含んでなるｓｐ２−混成炭素の群から選択され、そのヘテロ原子はｓｐ２−混成炭素に直接結合する。特にこのようなＺは、−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１または−（Ｃ＝Ｓ）Ｒ１であってもよい。Ｒ１は、特に−ＮＨ２、ＮＨＣＨ３またはＮ（ＣＨ３）２、（場合により）Ｃ末端保護されていてもよいα−アミノ酸または（場合により）Ｃ末端保護されていてもよいペプチド、好ましくは−ＮＨ２などのアミン基；−ＯＨまたはアルカリまたはアンモニウム塩などのその塩；アルキルまたはアリール基；置換されたアルキルまたはアリール基、特に１つ以上のハロゲン置換基を含んでなる置換されたアルキルまたはアリール基；−ＯＲ２；−ＳＲ２の群から選択されてもよい。Ｒ２基は、通常、炭化水素または置換炭化水素、特にアルキル、（１つ以上のハロゲン置換基を含んでなるアルキルなどの）置換アルキル、非置換アリール基または（１つ以上のハロゲン置換基を含んでなるアリールなどの）置換アリール基である。Ｒ１またはＲ２中のアルキルまたは置換されたアルキルは、特に１〜６個の炭素原子を含んでなってもよく；非置換または置換アリール基は、特に１つまたは複数の環中の５〜１８個、とりわけ６〜１２個の炭素原子を含んでなってもよい。
【００５６】
例えばカルバモイルメチルアルコール（Ｚ＝−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ２、カルバモイル）を用いて、特にリパーゼおよびプロテアーゼの双方を利用する方法で、良好な結果が得られている。Ｎ末端保護アミノ酸Ｃ末端カルバモイルメチルエステルまたはＮ末端保護ペプチドＣ末端カルバモイルメチルエステルをＮ末端保護アミノ酸またはＮ末端保護ペプチドから酵素的に調製して、引き続いて酵素的カップリング方法で使用し得ること、さらにはワンポット法において良好な収率でこれを達成できることは、特に驚くべきことである。
【００５７】
（チオ）エステルとカップリングされる場合によりＣ末端保護されていてもよいアミノ酸または場合によりＣ末端保護されていてもよいペプチドは、原則としてあらゆるタンパク新生または非タンパク新生アミノ酸、またはタンパク新生および／または非タンパク新生アミノ酸をベースとするあらゆるペプチドであってもよい。
【００５８】
特に場合によりＣ末端保護されていてもよいアミノ酸またはペプチドは、式ＩＩＩの化合物によって表されてもよい。
【化３】
【００５９】
式中、ｎ、各ＲＡおよび各ＲＢは上で定義されるとおりである。
【００６０】
式中、Ｑはアミド基またはＯＲ部分を表す（下記参照）。
【００６１】
Ｑがアミド基を表す場合、アミド基は、式ＮＲ１Ｒ２によって表されてもよく、式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ個々にあらゆる（置換）アルキルまたは（置換）アリール基を表してもよい。特にＲ１およびＲ２の片方はＨ原子であり、もう一方は（置換された）アルキル基である。好ましくはＲ１およびＲ２はどちらもＨである。
【００６２】
ＱがＯＲ部分を表す場合、Ｒは、Ｃ末端保護基、または例えば三置換または四置換アンモニウムイオンまたはアルカリ性金属カチオンのような一価のカチオンなどのカチオン、またはＨを表わしてもよい。ＲがＣ末端保護基である場合、これは特に場合により置換されていてもよいアルキル基であってもよい。好ましくはこれはｔ−アルキル基であるが、原則としてそれはまた、当業者に知られているあらゆるその他の保護エステルであってもよい。ｔ−アルキルは、原則としてあらゆる保護三級アルキル基であってもよい。好ましくはｔ−アルキルは、ｔ−ブチル（２−メチル−２−プロピル）、ｔ−ペンチル（２−メチル−２−ブチル）、およびｔ−ヘキシル（２，３−ジメチル−２−ブチル）の群から選択される。良好な結果が特にｔ−ブチルによって得られている。通常、望まれない副反応を避けるために、Ｑがアミド基またはＯＲ部分を表すことが好ましく、式中、Ｒは保護基である。しかし少なくともいくつかの実施態様では、このような副反応は別のやり方で十分に回避される。
【００６３】
上述の通り、本発明の方法ではアミノ酸またはペプチドの（チオ）エステル化が酵素によって触媒され、得られた（チオ）エステルの別のペプチドまたはアミノ酸へのカップリングについても同様である。原則として、これらの反応の片方または双方を触媒できる当該技術分野で知られているあらゆる酵素を使用し得る。特定起源からの酵素に言及する場合、第１の生物が起源であるが、事実上（遺伝子改変された）第２の生物中で生成される組み換え酵素は、明確に第１の生物からの酵素として含めることが意図される。
【００６４】
発明の方法で使用される酵素が由来する生物の例としては、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）などのトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種；リゾプス・オリゼー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）などのクモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）種；バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・アルカロフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）などのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種；コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）またはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）などのアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種；ストレプトミセス・カエスピトーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｅｓｐｉｔｏｓｕｓ）またはストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）などのストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種；カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種；真菌；フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）種；リゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）種；サイトファガ属（Ｃｙｔｏｐｈａｇｉａ）；ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）種；および動物組織、特にブタ膵臓、ウシ膵臓またはヒツジ膵臓などの膵臓からの組織が挙げられる。
【００６５】
本発明に従った方法で、天然（野性型）酵素の変異体もまた利用できることは、平均的当業者には明らかであろう。野生型酵素の変異体は、例えば当業者に知られている変異誘発技術（ランダム変異誘発、部位特異的変異誘発、定方向進化、遺伝子シャフリングなど）を使用して、ＤＮＡが野生型酵素と少なくとも１つのアミノ酸が異なる酵素をコードするように、またはそれが野生型と比較してより短い酵素をコードするように、野生型酵素をコードするＤＮＡを改変することで、そしてこのように改変されたＤＮＡを適切な（宿主）細胞内で発現させることで、作成し得る。酵素の変異体はまた、例えば基質範囲、活性、安定性、有機溶剤抵抗性、温度プロフィール、合成／加水分解比、および副反応プロフィールの１つ以上に関して、特性が改善されていてもよい。
【００６６】
好ましい方法では、リパーゼおよび／またはプロテアーゼを使用して、前記反応の少なくとも１つを触媒する。
【００６７】
適切なリパーゼまたはエステラーゼは、ＥＣ ３．１に分類できる酵素から選択される。特にカルボン酸エステルヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１）またはチオールエステルヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．２）を使用してもよい。好ましい方法では、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）からのリパーゼの群から選択されるリパーゼが使用される。良好な結果が、特に（チオ）エステル化の触媒に関して、カンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼを用いて、特にカンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢを用いて得られている。
【００６８】
適切なプロテアーゼは、ＥＣ ３．４に分類できる酵素から選択される。プロテアーゼは、ペプチド末端近くのみに作用するエキソペプチダーゼと、ペプチド中で内部的に作用するエンドペプチダーゼの２つのサブクラスにさらに分割し得る。
【００６９】
本発明の実施態様では、エステルまたはチオエステルの酵素的調製はリパーゼまたはエステラーゼによって触媒され、酵素的カップリングはプロテアーゼによって触媒される。
【００７０】
ペプチドＮ末端に作用するエキソペプチダーゼは、単一アミノ酸（アミノペプチダーゼＥ．Ｃ．３．４．１１）またはジペプチド（ジペプチダーゼ、Ｅ．Ｃ．３．４．１３）またはジペプチドとトリペプチド（ジペプチジル−ペプチダーゼまたはトリペプチジル−ペプチダーゼ、Ｅ．Ｃ．３．４．１４）の双方を遊離させる。ペプチドＣ末端に作用するペプチダーゼはカルボキシペプチダーゼと称され、単一アミノ酸（カルボキシペプチダーゼ、Ｅ．Ｃ．３．４．１６−１８）またはジペプチド（ペプチジル−ジペプチダーゼ、Ｅ．Ｃ．３．４．１５）を遊離させる。カルボキシペプチダーゼは、例えばセリン型カルボキシペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．１６）、メタロカルボキシペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．１７）、システイン型カルボキシペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．１８）などそれらの触媒機序に従って、または置換され、環化され、またはイソペプチド結合（側鎖が関与するペプチド結合）を有する、切断末端アミノ酸に従って（ω−ペプチダーゼ、Ｅ．Ｃ．３．４．１９）分類される。
【００７１】
特にエンドペプチダーゼ、特にセリンエンドペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２１）、システインエンドペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２２）、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２３）、およびメタロエンドペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２４）の群から選択されるエンドペプチダーゼを使用してもよい。
【００７２】
特に適切なのは、サブチリシンの群から選択されるセリンエンドペプチダーゼである。このような酵素は、特にカップリングを触媒するのに適することが分かっている。
【００７３】
様々なサブチリシンが当該技術分野で知られており、例えば米国特許第５，３１６，９３５号明細書と、その中で引用される参考文献を参照されたい。
【００７４】
サブチリシンＡは、ノボザイムズ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）から市販されるサブチリシンである。
【００７５】
特に好ましいのはサブチリシンカールスバーグであり、それはカンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼなどのリパーゼと組み合わせて使用すると、比較的短時間内に高収率でペプチドを合成するのに特に有利であることが分かっている。
【００７６】
アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）（登録商標）は、サブチリシンカールスバーグの適切な原料である。この製品は、デンマーク国バウスベア（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）のノボザイムズから入手できる。アルカラーゼ（登録商標）は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）によって生成される安価で工業的に入手できるタンパク質分解酵素混合物である（主要酵素構成要素としてサブチリシンカールスバーグを含有する）。
【００７７】
アルカラーゼ（登録商標）などの市販される酵素は、供給元によって液体、特に水性液として提供されてもよい。このような場合、酵素は好ましくは最初に、望まれない副反応を引き起こす望まれない液体、例えば過剰な水、またはアルコールから単離される。これは適切には沈殿と、通常それに続く液体からの固形分分離、および／または乾燥によって達成されてもよい。沈殿は、ｔ−ブタノールなどのアルコール、または本発明の方法で使用されるアルコールまたはチオールを使用して達成してもよい。その他のアルコールまたはチオールを使用する場合、このようなアルコールまたはチオールが（チオ）エステル化反応またはカップリング反応を不利に妨げないように注意しなくてはならない。
【００７８】
好ましい実施態様では、酵素の少なくとも１つが固体担体上に固定化される。少なくともいくつかの実施態様では、これは比較的短い反応時間後に、特に（チオ）エステル化の触媒作用のための酵素と、カップリングの触媒作用のための異なる酵素との双方が使用されるワンポット法で、合成ペプチドの収率増大をもたらすかもしれない。これを考慮すると、特にカンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼなどのリパーゼ、およびサブチリシンカールスバーグなどのプロテアーゼが使用される場合、（チオ）エステル化を触媒する固定化酵素を少なくとも使用することが特に好ましい。アルカラーゼが、グルタルアルデヒドとの縮合によって固定化されているアルカラーゼ架橋酵素凝集体（アルカラーゼ−ＣＬＥＡ）を用いて、特に良好な結果が得られている。
【００７９】
特定の実施態様では少なくとも２種の異なる酵素が使用され、少なくとも片方は（チオ）エステルの調製を触媒し、少なくとももう一方はカップリングを触媒し、異なる酵素が同一担体上に固定化される。
【００８０】
（チオ）エステル化のためのアルコール、そして任意に例えばアセトニトリルなどの不活性有機溶剤、トルエンなどの炭化水素、またはメチル−ｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）などのエーテルを含んでなる混合物中で、反応を実施することが可能である。
【００８１】
エステル化するアミノ酸またはペプチドと比較して、（チオ）エステルの調製のために使用されるチオールまたはアルコールが大幅に過剰でなくてもよいことが、本発明の利点である。例えば前記チオールまたはアルコールと前記アミノ酸またはペプチドとのモル比は、５０：１以下、好ましくは２５：１以下、特に２０：１以下、とりわけ１０：１以下であり得る。通常、比率は少なくとも１：１である。（チオ）エステル化を有利な速度で進行させるために、好ましくは前記モル比は少なくとも３：１、特に少なくとも５：１である。
【００８２】
本発明の方法は、実質的に非水性条件の下で実施される。当業者は理解するであろうように、酵素が所望の触媒作用を適切に果たせるように、酵素によっては少量の水が所望されるかもしれない。良好な触媒活性のためには、例えば液相を基準にして少なくとも０．００５重量％の微量の水の存在が所望されるかもしれない。特に水濃度は、少なくとも０．０１重量％または少なくとも０．０３重量％であってもよい。
【００８３】
所望される水濃度の上限は、特定の酵素、使用されるアルコールまたはチオール、合成されるペプチドの性質（例えばサイズ、ペプチドがそれをベースとするアミノ酸）、所望の最終転換、および所望の反応速度に左右される。
【００８４】
反応媒体は、通常、少なくとも活性化またはエステル化（エステル交換）の開始時に、反応媒体中の液体の重量を基準として２．０重量％未満の水を含有する。反応媒体が第２の液相中に分散していてもよく、または別の液相が反応媒体中に分散していてもよい。二相系または多相系の場合、指定される含水量は、エステル化（エステル交換）または活性化反応が（少なくともその大部分が）起きる相中の液体重量を基準とする。
【００８５】
特に水濃度は、少なくとも（チオ）エステル化の開始時には１．０重量％未満であってもよい。有利には、方法は、所望の酵素活性と、低いまたは検出不能でさえある望まれない加水分解をなおも保ちながら、少なくとも反応開始時には、０．５重量％以下の水、特に０．２重量％以下の水、とりわけ０．１重量％以下の水を含有する媒体中で実施してもよい。実際には、少なくともいくつかの実施態様では、とりわけカンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼおよび／またはサブチリシンカールスバーグを使用した実施態様では、１〜２．５％の水を含んでなる反応媒体中で実施される方法と比較して、非常に低い含水量を有する反応媒体中で、特に０．５重量％未満、または０．１重量％未満の含水量を有する反応媒体中において、改善されたペプチド合成速度が観察されている。
【００８６】
有利な方法では、特に（チオ）エステル化中に形成された水を連続的にまたは断続的に除去してもよい。原則として除去は、当該技術分野で知られている様式で達成してもよい。特に分子ふるいを使用して、良好な結果が達成されている。また除去のためには、真空または蒸留を使用した共沸性除去などの蒸発が非常に適する。
【００８７】
酵素が十分な活性を示すｐＨを選択しさえすれば、原則として、使用されるｐＨは（選択された反応媒体中に存在するｐＨの範囲で）広い制限内で選択してもよい。このようなｐＨは、通常、使用される酵素について知られており、水溶液中におけるその既知の加水分解活性に基づいてもよく、または既知の反応条件下における酵素の既知の基質を利用して慣例的に測定し得る。それは特にほぼ中性であるように選択されてもよい。所望ならば、酵素次第でアルカリ性または酸性条件を使用してもよい。所望ならば、酸および／または塩基を使用してｐＨを調節してもよく、または酸と塩基の適切な組み合わせによって緩衝してもよい。適切な酸および塩基は、特に例えばアンモニアと例えば酢酸およびギ酸などのアルコール可溶性酸との群からの反応媒体に可溶性のものである。
【００８８】
使用される酵素が十分な活性と安定性を示す温度を選択しさえすれば、原則として使用する温度は重要でない。このような温度は、通常、使用される酵素について知られており、既知の反応条件下における酵素の既知の基質を利用して慣例的に測定し得る。一般に温度は、少なくとも０℃、特に少なくとも１５℃または少なくとも２５℃であってもよい。特に好熱性生物に由来する１つ以上の酵素を使用する場合、温度は好ましくは少なくとも４０℃であってもよい。所望の最大温度は、酵素に左右される。一般にこのような最大温度は当該技術分野で知られており、例えば市販される酵素の場合は製品データシートに表示され、または一般常識および本明細書で開示される情報に基づいて慣例的に測定し得る。温度は通常７０℃以下、特に６０℃以下または４５℃以下である。しかし特に好熱性生物からの１つ以上の酵素を使用する場合、例えば９０℃までのより高い温度を選択してもよい。
【００８９】
最適温度条件は、一般常識と本明細書で開示される情報に基づく通例の実験法を通じて、当業者によって特定の酵素について容易に同定され得る。例えばサブチリシン、特にサブチリシンカールスバーグ（例えばアルカラーゼ（登録商標）中の）では、温度は有利には２５〜６０℃の範囲であってもよい。アルカラーゼ（登録商標）とＣａｌ−Ｂの組み合わせを使用する場合、温度は有利には３０〜５５℃の範囲であってもよい。
【００９０】
本発明は、本明細書に記載される本発明に従った方法に従った、異なる実施態様および／または好ましい徴群の全ての可能な組み合わせにさらに関する。
【００９１】
ここで本発明を以下の実施例によって例証する。
【００９２】
［実施例］
特に断りのない限り、化学薬品は商業的供給元から得て、さらに精製することなく使用した。１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ３００ ＭＨｚ ＮＭＲ（３００．１ ＭＨｚ）分光計の上で記録し、化学シフトは特に断りのない限りＣＤＣｌ３（７．２６ｐｐｍ）に対するｐｐｍ（δ）で示す。
【００９３】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）はプレコートされたシリカゲル６０ Ｆ２５４プレート（メルク（Ｍｅｒｃｋ））上で実施し、スポットはＵＶ光またはニンヒドリンを使用して可視化した。
【００９４】
３Å分子ふるい（８〜１２メッシュ、アクロス（Ａｃｒｏｓ））を２００℃、減圧下で活性化し、これらの分子ふるい上でｔ−ブタノール（ｔＢｕＯＨ）を保存した。ｔＢｕＯＨは使用前に予熱して液体（４５℃）にした。
【００９５】
カラムクロマトグラフィーは、シリカゲル（メルク等級９３８５ ６０Å）を使用して実施した。分析的ＨＰＬＣは、４０℃で逆相カラム（イナートシル（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ）ＯＤＳ−３、Ｃ１８、５μｍ、１５０×４．６ｍｍ）を使用して、ＨＰ１０９０液体クロマトグラフ上で実施した。ＵＶ検出は、ＵＶ−ＶＩＳ ２０４線形分光計を使用して２２０ｎｍで実施した。勾配プログラムは次の通りであった。０〜２５分は５％〜９８％の溶出剤Ｂの直線濃度勾配、２５．１〜３０分は５％の溶出剤Ｂ（溶出剤Ａは０．５ｍＬメタンスルホン酸（ＭＳＡ）／Ｌ Ｈ２Ｏ、溶出剤Ｂは０．５ｍＬ ＭＳＡ／Ｌアセトニトリル）。流量は０〜２５．１分で１ｍＬ／分、２５．２〜２９．８分で２ｍＬ／分、次に３０分で停止するまで１ｍＬ／分に戻した。注入量は２０μＬであった。
【００９６】
アルカラーゼ−ＣＬＥＡはＣＬＥＡ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入され、３．５重量％の水を含有し、活性はグラムあたり６５０ ＡＧＥ単位であった（１ ＡＧＥ単位は、４０℃およびｐＨ７．５でＮ−アセチル−グリシンエチルエステルから１μｍｏｌのＮ−アセチル−グリシンの形成を触媒する）。このアルカラーゼ−ＣＬＥＡは、使用前に次のように処理した。１ｇのアルカラーゼ−ＣＬＥＡを２０ｍＬのｔＢｕＯＨに懸濁し、スパチュラで粉砕した。濾過後、２０ｍＬのＭＴＢＥを用いてこの手順を繰り返した。
【００９７】
Ｃａｌ−Ｂ（ノボザイムズ；カンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）からのリパーゼであるノボザイム−４３５；バッチ番号ＬＣ２００２０４）をいかなる前処理もなしに使用した。
【００９８】
ジペプチド基準化合物は、次のように化学的に合成した。３５５μＬジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、２．１ｍｍｏｌ、２．１当量）を含有する１０ｍＬのＣＨＣｌ３と３０ｍＬのＥｔＯＡｃとの混合物に、１．０ｍｍｏｌのアミノ酸アミドＨＣｌ塩またはアミノ酸ｔＢｕ−エステルＨＣｌ塩を溶解した。この溶液を２０ｍＬのＣＨＣｌ３中の１ｍｍｏｌのＮ−Ｃｂｚ−保護アミノ酸（１当量）、２０７ｍｇのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド・ＨＣｌ（ＥＤＣｌ・ＨＣｌ、１．１ｍｍｏｌ、１．１当量）、および１５０ｍｇの７−アザ−Ｎ−ヒドロキシベンザトリアゾール（ＨＯＡｔ、１．２ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液（０℃）に添加した。混合物を周囲温度で１６時間撹拌した。溶液を真空内で濃縮し、残渣を２５ｍＬのＥｔＯＡｃに再溶解して、２０ｍＬの水性ＨＣｌ（ｐＨ３、３×）、２０ｍＬの鹹水、２０ｍＬの飽和水性ＮａＨＣＯ３（３×）、２０ｍＬの鹹水で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、真空内で濃縮した。必要ならばＥｔＯＡｃ／ｎ−ヘプタン混合物を使用した追加的カラムクロマトグラフィーを実施して、純粋なジペプチドを得た。
【００９９】
Ｎ−Ｃｂｚ−保護アミノ酸メチルエステルは、次のように合成した。１００ｍＬのＭｅＯＨをアセトン中のドライアイス浴で−８０℃に冷却し、続いて４ｍＬのＳＯＣｌ２（５．５ｍｍｏｌ、３．７当量）を滴下して添加した。引き続いて１．５ｍｍｏｌのＣｂｚ−保護アミノ酸を添加し、ドライアイス浴から取り出して、混合物を周囲温度で５時間撹拌した。揮発物を真空内で蒸発させ、残渣の残留揮発物をＭｅＯＨ（３×）と共に同時蒸発させた。得られた残渣を真空内、周囲温度で一晩乾燥させ、純粋なＮ−Ｃｂｚ−保護アミノ酸メチルエステルを得た。
【０１００】
Ｎ−Ｃｂｚ−保護アミノ酸カルバモイルメチル（Ｃａｍ）またはトリフルオロエチル（Ｔｆｅ）エステルの化学合成は次のように実施した。３０ｍＬのＥｔＯＡｃと５ｍｍｏｌのカルバモイルメタノール（ＣａｍＯＨ）または２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴｆｅＯＨ）（５当量）との混合物に、１ｍｍｏｌのＮ−Ｃｂｚ−保護アミノ酸を溶解した。引き続いて２０７ｍｇのＥＤＣｌ・ＨＣｌ（１．１ｍｍｏｌ、１．１当量）、１５０ｍｇのＨＯＡｔ（１．２ｍｍｏｌ、１．２当量）、２９２μｌのトリエチルアミン（ＴＥＡ、１．１ｍｍｏｌ、１．１当量）を添加した。反応混合物を周囲温度で２０時間撹拌した。引き続いて２０ｍＬのＥｔＯＡｃを添加し、有機混合物を５０ｍＬの水性ＨＣｌ（ｐＨ３、２×）、５０ｍＬの脱イオン水（２×）、５０ｍＬの鹹水で洗浄し、乾燥させて（Ｎａ２ＳＯ４）、真空内で濃縮し、１０ｍＬのトルエン（２×）と共に同時蒸発させた。必要ならばＥｔＯＡｃ／ｎ−ヘプタン混合物を使用した追加的カラムクロマトグラフィーを実施して、純粋なエステルを得た。
【０１０１】
【表１】
【０１０２】
【表２】
【０１０３】
【表３】
【０１０４】
【表４】
【０１０５】
【表５】
【０１０６】
［実施例１：アルカラーゼ−ＣＬＥＡを使用してＭｅ、Ｃａｍ、およびＴｆｅエステルから出発するジペプチドの酵素的合成］
【化４】
３ｍＬのＭＴＢＥと２００ｍｇの３Å分子ふるいの混合物に、３００ｍｇのアルカラーゼ−ＣＬＥＡを添加した。引き続いて１００ｍｇのＮ−Ｃｂｚ−保護アミノ酸エステルと１．０当量のＣ末端保護アミノ酸を添加した。混合物を５０℃、１５０ｒｐｍで１６時間振盪した。濾過後、固形物を１０ｍＬのＥｔＯＡｃ（３×）で洗浄した。合わせた有機層を２５ｍＬの飽和水性ＮａＨＣＯ３溶液（３×）、２５ｍＬの水性ＨＣｌ溶液（ｐＨ３、３×）、２５ｍＬの鹹水で洗浄し、乾燥させて（Ｎａ２ＳＯ４）、真空内で濃縮し、２０ｍＬのトルエン（２×）および２０ｍＬのＣＨＣｌ３（２×）と共に同時蒸発させた。必要ならばＥｔＯＡｃ／ｎ−ヘプタン混合物を使用した追加的カラムクロマトグラフィーを実施して、純粋なジペプチドを得た。得られた全てのジペプチドのＨＰＬＣ滞留時間および１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、基準化合物と完全に一致した。得られた収率を下の表に示す。
【０１０７】
【表６】
【０１０８】
［実施例２：ＣａｍおよびＴｆｅエステルの酵素的合成］
【化５】
以下に示すプロトコル１、２または３の１つを使用して、数種のＣａｍおよびＴｆｅエステルを合成した。
【０１０９】
［プロトコル１：アルカラーゼ−ＣＬＥＡを使用したＣａｍまたはＴｆｅエステルの合成］
３ｍＬのＭＴＢＥ、２００ｍｇの３Å分子ふるい、２００ｍｇのカルバモイルメタノールまたは２，２，２−トリフルオロエタノール、および５０ｍｇのＮ−Ｃｂｚ−保護アミノ酸の混合物に、３００ｍｇのアルカラーゼ−ＣＬＥＡを添加した。混合物を５０℃、１５０ｒｐｍで７２時間振盪した。濾過後、固形物を１０ｍＬのＥｔＯＡｃ（３×）で洗浄した。合わせた有機層を２５ｍＬの脱イオン水（３×）、２５ｍＬの水性ＨＣｌ溶液（ｐＨ＝３、３×）、２５ｍＬの鹹水で洗浄し、乾燥させて（Ｎａ２ＳＯ４）、真空内で濃縮し、２０ｍＬトルエン（２×）および２ＯｍＬ ＣＨＣｌ３（２×）と共に同時蒸発した。
【０１１０】
［プロトコル２：Ｃａｌ−Ｂを使用したＣａｍまたはＴｆｅエステルの合成］
３ｍＬのアセトニトリル、１００ｍｇの３Å分子ふるい、２００ｍｇのカルバモイルメタノールまたは２，２，２−トリフルオロエタノール、および５０ｍｇのＮ−Ｃｂｚ−保護アミノ酸の混合物に、１００ｍｇのＣａｌ−Ｂを添加した。混合物を５０℃、１５０ｒｐｍで１６時間振盪した。濾過後、固形物を１０ｍＬのＥｔＯＡｃ（３×）で洗浄した。合わせた有機層を２５ｍＬ脱イオン水（３×）、２５ｍＬの水性ＨＣｌ溶液（ｐＨ３、３×）、２５ｍＬの鹹水で洗浄し、乾燥させて（Ｎａ２ＳＯ４）、真空内で濃縮し、２０ｍＬのトルエン（２×）および２０ｍＬのＣＨＣｌ３（２×）と共に同時蒸発させた。必要ならばＥｔＯＡｃ／ｎ−ヘプタン混合物を使用した追加的カラムクロマトグラフィーを実施して、純粋なエステルを得た。
【０１１１】
【表７】
【０１１２】
［プロトコル３：Ｃａｌ−Ｂを使用したＴｆｅエステルの合成］
３ｍＬのＭＢＴＥ、１００ｍｇの３Å分子ふるい、２００ｍｇの２，２，２−トリフルオロエタノール、および５０ｍｇのＮ−Ｃｂｚ−保護アミノ酸の混合物に、１００ｍｇのＣａｌ−Ｂを添加した。混合物を５０℃、１５０ｒｐｍで５４時間振盪した。対応するＴｆｅエステルへの転換は、ＨＰＬＣ分析によって判定した。
【０１１３】
【表８】
【０１１４】
［実施例３：添加剤としてＣａｍまたはＴｆｅアルコールを使用したジペプチドの酵素的合成］
【化６】
以下に示す１〜３のプロトコルの１つを使用して、数種のジペプチドを合成した。
【０１１５】
［プロトコル１：アルカラーゼ−ＣＬＥＡと共に添加剤としてＣａｍまたはＴｆｅアルコールを使用したジペプチドの合成］
３ｍＬのＭＴＢＥ、２００ｍｇの３Å分子ふるい、および２００ｍｇの適切なアルコールの混合物に、３００ｍｇのアルカラーゼ−ＣＬＥＡを添加した。引き続いて、５０ｍｇのＮ−Ｃｂｚ−保護アミノ酸と１当量のアミノ酸アミドを添加した。混合物を５０℃、１５０ｒｐｍで１６時間振盪した。
【０１１６】
［プロトコル２：Ｃａｌ−Ｂと共に添加剤としてＣａｍまたはＴｆｅアルコールを使用したジペプチドの合成］
３ｍＬのアセトニトリル、２００ｍｇの３Å分子ふるい、および２００ｍｇの適切なアルコールの混合物に、１００ｍｇのＣａｌ−Ｂを添加した。引き続いて、５０ｍｇのＮ−Ｃｂｚ−保護アミノ酸と１当量のアミノ酸アミドを添加した。混合物を５０℃、１５０ｒｐｍで１６時間振盪した。
【０１１７】
［プロトコル３：アルカラーゼ−ＣＬＥＡおよびＣａｌ−Ｂと共に添加剤としてＣａｍまたはＴｆｅアルコールを使用したジペプチドの合成］
３ｍＬのアセトニトリル、２００ｍｇの３Å分子ふるい、および２００ｍｇの適切なアルコールの混合物に、３００ｍｇのアルカラーゼ−ＣＬＥＡと１００ｍｇのＣａｌ−Ｂを添加した。引き続いて５０ｍｇのＮ−Ｃｂｚ−保護アミノ酸と１当量のアミノ酸アミドを添加した。混合物を５０℃、１５０ｒｐｍで１６時間振盪した。濾過後、酵素を１０ｍＬのＥｔＯＡｃ（３×）で洗浄した。合わせた有機層を２５ｍＬの脱イオン水（３×）、２５ｍＬの水性ＨＣｌ溶液（ｐＨ３、３×）、２５ｍＬの鹹水で洗浄し、乾燥させて（Ｎａ２ＳＯ４）、真空内で濃縮し、２０ｍＬのトルエン（２×）および２０ｍＬのＣＨＣｌ３（２×）と共に同時蒸発させた。
【０１１８】
［実施例４：Ｃａｌ−Ｂを使用したジ−およびトリペプチドのＴｆｅエステルの酵素的合成］
３ｍＬのメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、１００ｍｇの３Å分子ふるい、２００ｍｇの２，２，２−トリフルオロエタノール、および５０ｍｇのＮ−Ｃｂｚ−保護ジ−またはトリペプチドの混合物に、１００ｍｇのＣａｌ−Ｂを添加した。混合物を５０℃、１５０ｒｐｍで振盪した。対応するＣ末端Ｔｆｅエステルへの転換をＨＰＬＣ分析によってモニターした。いかなる場合でも、出発化合物は対応するＣ末端Ｔｆｅエステルのみに変換された。出発化合物およびＴｆｅエステル生成物（Ｐ）のＨＰＬＣ滞留時間を下の表に示す。
【０１１９】
【表９】
【０１２０】
１および／または２および／または３および／または７日後に、反応混合物からサンプルを取り出した。下の表に示す％Ｔｆｅエステル生成物（％Ｐ）値は、次式によって計算した。
％Ｐ＝Ｔｆｅエステル生成物の面積％／（出発化合物の面積％＋Ｔｆｅエステル生成物の面積％）
【０１２１】
【表１０】
【０１２２】
Ｃｂｚ−Ａｌａ−ＡｌａからＣｂｚ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＴｆｅへのエステル化の反応混合物は、次のように精製した。７日後に得られた反応混合物を濾過し、固形物を１０ｍＬのＥｔＯＡｃ（３×）で洗浄した。合わせた有機層を２５ｍＬの脱イオン水（３×）、２５ｍＬの水性ＨＣｌ溶液（ｐＨ３、３×）、２５ｍＬの鹹水で洗浄し、乾燥させて（Ｎａ２ＳＯ４）、真空内で濃縮した。得られた残渣中の揮発物を２０ｍＬのトルエン（２×）と２０ｍＬのＣＨＣｌ３（２×）との同時蒸発によって除去した。生成物のクロマトグラフィー精製によって、純粋なＣｂｚ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＴｆｅを８５％の収率で得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝１．３２（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３）、１．３７（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３）、４．１３−４．２４（ｍ，１Ｈ，ＣαＨ）、４．２９−４．４０（ｍ，１Ｈ，ＣαＨ）、４．４９−４．６１（ｍ，２Ｈ，ＯＣＨ２ＣＦ３）、５．０５（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２ＯＣＯ）、５．１８（ｂｓ，１Ｈ，ＮＨ）、６．４１（ｂｓ，１Ｈ，ＮＨ）、７．２８（ｍ，５Ｈ，ＣＡｒＨ）；
１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝１６．７、１６．８、４６．９、４９．４、６０．０、６６．１、１１９．８、１２３．５、１２７．１、１２７．３、１２７．６、１３８．３、１７０．２、１７０．９。
【０１２３】
【表１１】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ペプチドを酵素的に合成する方法に関する。
【０００２】
ペプチド、特にオリゴペプチドは、例えば医薬品、食品または飼料成分、農薬または化粧品成分として、多数の用途を有する。
【０００３】
本発明の目的では、ペプチドとは２個以上のアミノ酸のあらゆる鎖を意味する。本発明の目的では、「オリゴペプチド」とは２〜２００個のアミノ酸ベースの、特に２〜１００個のアミノ酸ベースの、より特には２〜５０個のアミノ酸ベースの、好ましくは２〜２００個のアミノ酸、より好ましくは２〜１００個のまたは２〜５０個のアミノ酸のあらゆる直鎖のペプチドを意味する。「ポリペプチド」という用語は、オリゴペプチドについて規定されるよりもさらに多数のアミノ酸をベースとするペプチドに対して使用される。
【０００４】
本発明の目的では、その中で１つ以上のペプチド結合が酵素的カップリング反応によって形成されるペプチド合成と定義される化学酵素的ペプチド合成は、化学ペプチド合成に優るいくつかの利点を有する。例えばアミノ酸側鎖保護の必要性が皆無または限定的であるという事実のために、大規模生産した場合の原価がより低い。また方法は環境により優しい。例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）または１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドメチオジド（ＥＤＣｌ）などのいかなる理論量の有害試薬も不要である。さらにこのような方法は、より少ない有機溶剤を使用して実施してもよい。さらに酵素触媒カップリングにはラセミ化がなく（例えばＳｅｗａｌｄおよびＨ．−Ｄ．Ｊａｋｕｂｋｅ，「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，重版第１刷，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ ２００２年，２５０頁を参照されたい）、より純粋な生成物および／またはより容易な単離がもたらされる。
【０００５】
化学酵素的カップリング法に関して、ペプチド結合を作り出す２つの選択肢がある。いわゆる熱力学的（または平衡状態制御）アプローチでは、カルボキシ構成要素、すなわちそのＣ末端でカップリングされる構成要素が遊離カルボン酸官能基を有するのに対し、動力学的制御アプローチでは、一級ｎ−アルキルエステルなどの反応性カルボキシ構成要素が使用される。
【０００６】
熱力学的アプローチには、３つの主要な不都合がある。ｉ）平衡状態はペプチド結合切断の側に通常あるためカップリング収率が不良であり、ｉｉ）大量の酵素が通常必要とされ、ｉｉｉ）反応速度が通常非常に遅い。動力学的制御アプローチでは、出発原料としてアルキルエステルが必要とされるが、はるかにより少ない酵素が必要とされ、反応時間は顕著により短く、とりわけ最大可能収率が通常大幅により高い。したがって産業上の利用のためには、動力学的アプローチに基づく、すなわち活性化カルボキシ構成要素を使用した、酵素的ペプチド合成構想が最も魅力的である。（例えばＮ．ＳｅｗａｌｄおよびＨ．−Ｄ．Ｊａｋｕｂｋｅ，「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，重版第１刷，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ ２００２年，セクション４．６．２を参照されたい）。
【０００７】
化学酵素的ペプチド合成は、Ｃ→Ｎ末端方向またはＮ→Ｃ末端方向で段階的に実施し得るが、化学合成を使用して、または化学および化学酵素的カップリング工程の組み合わせによって、個々に合成された断片の酵素的カップリングもまた内含し得る。Ｃｈｅｎらは、「低水性」有機溶剤と、有機溶剤中で活性で安定しているプロテアーゼとのカップリングについて記載する。（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９２年，５７，６９６０〜６５頁；Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １９９１年，５０，１８１頁；Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１９９１年，１，４４５頁）。そこで記載される方法の不都合は、これらの出版物に記載される方法では、わずかな酵素のみが低水性条件において活性で安定しており、酵素の基質範囲が限定的なことである。したがって長い反応時間と、多量の過剰なアミノ酸またはペプチド求核剤が通常必要とされる。さらにペプチド中の他の位置でいくらかの加水分解があり、また断片の１つにおいて既存のペプチド結合上でアミノ基転移が起きることが多い（＝既存のペプチド結合の１つの上のアミノ酸またはペプチド求核剤の酵素触媒求核攻撃）。したがって収率が低いことがある。さらに生成物の精製が困難であることが多い。
【０００８】
別のアプローチは、Ｆ．Ｂｏｒｄｕｓａら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２年，３，１５９〜１８０頁でレビューされたいわゆる「基質模倣剤」の使用である。このアプローチでは、Ｃ−活性化アミノ酸またはペプチドが特定アミノ酸と似ているエステル部分を有し、その類似性は、その特定アミノ酸に対して選択的な酵素が、そのエステル部分を有するあらゆるアミノ酸と迅速に反応するほどである。好個の一例はＢｏｒｄｕｓａらによって発見された４−グアニジノフェニル（Ｇｐ）エステルの使用であり、それは、その加水分解特性においてＡｒｇ−Ｘ（Ｘはあらゆるタンパク新生アミノ酸を表す）配列に対して特異的なトリプシンが、ほとんどあらゆるＣ末端（Ｇｐエステルを有する）を様々なアミノ酸およびペプチド求核剤にカップリングし得る程度にまで、Ａｒｇと似ている。例えばＮ−保護Ｄ−Ａｌａ−ＯＧｐは、Ｍ．Ｔｈｏｒｍａｎｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９年，３８，６０５６頁によって実証されたように、様々なアミノ酸およびペプチド求核剤とカップリングし得る。したがってＤ−アミノ酸および非タンパク新生アミノ酸もまた、高効率で酵素的に組み込み得て、さらにカップリング酵素がそれに対して特異的であるペプチド結合がある場合（例えばトリプシンの場合Ａｒｇ−Ｘ結合）を除き、断片中のペプチド結合の加水分解が起きない。基質模倣剤アプローチの不都合は、基質模倣剤（Ｇｐエステルなど）が、規模拡大が困難な、またそれによってアミノ酸のラセミ化が生じることが多い、骨の折れる多段階化学合成を要することである。基質模倣剤はまた不安定でもあり、したがって大規模な取り扱いが困難であり、水溶液に対するそれらの溶解度は低いことがある。
【０００９】
「Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００１年，第３巻，第２６号，４１５７〜４１５９頁」で、ＬｉｕおよびＴａｍは、１〜２．５％の水を含んでなる１，３−プロパンジオールおよび１，４−ブタンジオール中で、特定のＮ末端Ｂｏｃ−保護アミノ酸と非保護ペプチドのＣ末端３−ヒドロキシプロピルまたは４−ヒドロキシブチルエステルの形成を触媒するために、サブチリシンカールスバーグを使用する方法を報告する。さらに反応媒体（その中でエステル形成が起きた媒体とは異なる）中における、アミノ酸（ロイシン）またはペプチドと、得られたエステルとの酵素的カップリングについて記載している。その中でカップリングが起きる反応媒体は、相当量の水を含んでなる。
【００１０】
「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１９９年，第５４巻，第３号，２８７〜２９０頁」でＭｉｔｉｎらは、少なくとも１０重量％の水を含有するグリセロール中において、Ｎ末端ＢｏｃおよびＮ末端Ｃｂｚ保護アミノ酸とペプチドとのＣ末端グリセリルエステル形成を触媒するために、パパインを使用して最大７０％の収率でエステルを得る方法を報告する。１０重量％未満の水を含有する溶液の使用は、パパイン変性のせいではるかにより低いエステル収率をもたらす。
【００１１】
（例えばＴ．Ｍｉｙａｚａｗａら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１，２００２年，３９０〜３９５頁で記載されるような）さらに別のアプローチは、カルバモイルメチル（Ｃａｍ）エステル、または（Ａ．Ｙａｎら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，６１，２００５年，５９３３〜５９４１頁で記載されるような）２，２，２−トリフルオロエチルエステルなどの「活性化」エステルの使用である。これらのエステルは通常、「真正」基質模倣剤に比べてより容易に調製され、より安定しているが、なおも高価で環境に優しくない化学的工程を必要とする。さらにこれらのエステルの調製は、アミノ酸のいくらかのラセミ化をもたらすことが多い。例えばＣａｍエステルは、アシル供与体のＣｓ塩を２−クロロアセトアミドによって処理することで調製し得て、Ｔｆｅエステルはカルボジイミドの化学的性質を使用して調製し得る。ＣａｍおよびＴｆｅエステルは、通常、パパインおよびサブチリシンなどの安価で容易に入手できるプロテアーゼを使用して、アミノ酸またはペプチド求核剤とカップリングされる。したがってＤ−アミノ酸もまた、ペプチドに組み込み得る（Ｐｒｏは未だに組み込まれていない）。
【００１２】
ペプチドを合成するための、および／または一般にペプチド合成に使用し得る中間体化合物を調製するための、代案の方法に対する必要性が残されている。このような方法は、例えばペプチド合成における順応性を増大させる、および／または既知の方法を使用して得られない、または得ることが比較的困難である特定ペプチドの合成を可能にする、追加的方法を提供するかもしれない。例えば許容可能な時間内に、良好な収率で、様々なアミノ酸を酵素的にカップリングすることはなおも難題である。したがってタンパク新生アミノ酸だけでなく、Ｄ−α−アミノ酸、β−アミノ酸、フェニルグリシン、ＤＯＰＡ、α−アルキル化アミノ酸、またはＮ末端アミノ酸残基がこれらのアミノ酸のいずれかの残基であるペプチドなどの非タンパク新生アミノ酸をそれらのＮ末端アミン官能基を通じて別のアミノ酸またはペプチドのＣ末端カルボン酸官能基にカップリングする、改善された方法に対する必要性が依然として存在する。さらにタンパク新生アミノ酸だけでなく、Ｄ−α−アミノ酸、β−アミノ酸、フェニルグリシン、ＤＯＰＡ、α−アルキル化アミノ酸、またはＣ末端アミノ酸残基がこれらのアミノ酸のいずれかの残基であるペプチドなどの非タンパク新生アミノ酸をそれらのＣ末端カルボキシル官能基を通じて別のアミノ酸またはペプチドのＮ末端アミン官能基にカップリングする、改善された技術に対する必要性が依然として存在する。
【００１３】
さらにあらゆるアミノ酸またはペプチドをそのＮ末端アミン官能基を通じて、バリンまたはイソロイシンなどの立体障害アミノ酸のＣ末端カルボン酸官能基に、またはそのＣ末端アミノ酸残基がバリンまたはイソロイシンなどの立体障害ヒンダードアミノ酸であるペプチドに、酵素的にカップリングすることに関する、改善された技術に対する必要性が特に存在する。
【００１４】
さらに比較的環境に優しい、新しい比較的単純な方法に対する必要性が残されている。
【００１５】
アミノ酸またはペプチドの活性化Ｃ末端エステルまたは活性化Ｃ末端チオエステルの酵素的調製を組み合わせ、この活性化エステルまたは活性化チオエステルを別のアミノ酸またはペプチドに特定のやり方で酵素的にカップリングすることによって、このような方法を提供できることが今や分かった。
【００１６】
したがって本発明は、
（ｉ）Ｎ−末端保護アミノ酸、Ｎ−末端保護アミノ酸Ｃ−末端エステル、Ｎ−末端保護ペプチド、またはＮ−末端保護ペプチドＣ−末端エステル、および
（ｉｉ）それぞれ式ＨＯ−ＣＸ２−Ｚで表されるアルコール、式ＨＳ−ＣＸ２−Ｚで表されるチオール
からエステルまたはチオエステルを酵素的に調製するステップであって、
各Ｘが独立してハロゲン原子または水素原子を表し、
Ｚがｓｐ３−混成炭素に直接付着するヘテロ原子を含んでなる少なくとも２個の置換基を含んでなるｓｐ３−混成炭素、およびｓｐ２−混成炭素に直接付着するヘテロ原子を含んでなる１または２個の置換基を含んでなるｓｐ２−混成炭素の群から選択され、
前記エステルまたはチオエステルの調製が、反応媒体中の液体の重量を基準として２重量％以下の水を含んでなる反応媒体中で実施される、ステップと、
前記調製されたエステルまたはチオエステルを、場合によりＣ−末端保護されていてもよいアミノ酸、または場合によりＣ−末端保護されていてもよいペプチドに酵素的にカップリングし、それによって反応媒体総重量を基準にして２重量％以下の水を含んでなる反応媒体中でペプチドを合成するステップと
を含んでなる、ペプチドを酵素的に合成する方法に関する。
【００１７】
「Ｃ末端保護」という用語は、Ｃ末端カルボキシル基に保護基が付与されて、カルボキシル基が別の分子のアミン基とカップリングすることから一般に実質的に保護されることを示すために、本明細書で使用される。特にＣ末端保護基はＣ末端エステルであってもよく、それによって使用されるペプチド合成条件下で、Ｃ末端カルボキシル基がアミンとカップリングすることから少なくとも実質的に保護される。ｔ−アルキル基が、一般に使用される保護基である。
【００１８】
「Ｎ末端保護」という用語は、Ｎ末端アミン基に保護基が付与されて、Ｎ末端アミン基がＣ末端カルボキシル基とＮ末端アミン基とのカップリングに関与することから一般に少なくとも実質的に保護されることを示すために、本明細書で使用される。
【００１９】
本発明の方法で調製されたエステルまたはチオエステルはカップリング反応に関与できるので、このようなエステルはそれぞれ「活性化エステル」または「活性化チオエステル」と称されてもよい。対照的に活性化エステルの調製のために使用してもよい遊離Ｃ末端カルボン酸またはエステルは、カップリングに参与できず、またはカップリング反応において少なくとも実質的により低い反応性を有し、例えば本発明の方法で酵素的に調製された活性化エステルの半分未満の反応性、１０分の１未満の反応性または１００分の１未満の反応性を有する。特にＣ末端アミノ酸残基またはＮ末端アミノ酸残基が従来法ではカップリング困難な（低カップリング速度を有する）アミノ酸では、アミノ酸またはＣ末端アミノ酸残基の活性化のおかげで、本発明の方法によってカップリング速度の大幅な増大を達成し得る。カップリングが困難なアミノ酸またはアミノ酸残基の典型的な例は、Ｄ−アミノ酸またはそのアミノ酸残基、およびその他の非タンパク新生アミノ酸またはそのアミノ酸残基である。さらなる例としては、例えばバリンおよびイソロイシンなどの立体障害アミノ酸、またはそのアミノ酸残基が挙げられる。
【００２０】
各エステルまたはチオエステルの酵素的調製は、下文においてそれぞれエステル化またはチオエステル化と称されてもよい。この用語は、（チオ）エステルの調製が、Ｎ末端保護アミノ酸またはペプチドＣ末端エステルと（チオ）アルコールとの反応を伴う場合を含む。もっと正確に言えばこのような反応は、（チオ）エステル転移反応として知られている。
【００２１】
一実施態様では、カップリングに参与するプロリンおよび非タンパク新生アミノ酸、またはプロリンまたは非タンパク新生末端アミノ酸残基を含有するペプチドをはじめとする、カップリング反応に参与する末端アミノ酸残基が異なる様々なアミノ酸または様々なペプチドのカップリングのために本発明の方法を使用する可能性を提供するという点において、本発明の方法は有利である。
【００２２】
一実施態様では、活性化（チオ）エステルが、環境に優しいやり方で、すなわち理論量の廃棄化合物を生じることなく、ラセミ化またはその他の副反応なしに高収率で合成されるという点において、本発明の方法は有利である。
【００２３】
一実施態様では、方法で使用される１つまたは複数の酵素に高い安定性および／または活性を提供するという点において、本発明の方法は有利である。
【００２４】
一実施態様では、（（チオ）エステルの調製とカップリングを達成するのに典型的な時間枠内で）酵素的に調製されたエステルの加水分解の程度が低いという点において、本発明の方法は有利であり、少なくともいくつかの実施態様では検出可能なエステルの加水分解は観察されていない。
【００２５】
一実施態様では、酵素的に調製されたペプチドの加水分解の程度が低いという点において、本発明の方法は有利であり、少なくともいくつかの実施態様では、検出可能な酵素的に調製されたペプチドの加水分解は観察されていない。
【００２６】
一実施態様では、高い全体的反応速度、すなわちＮ−保護アミノ酸またはペプチド開始化合物から合成ペプチドへの高い転換速度を提供するという点において、本発明の方法は有利であり、特定収率が比較的短い反応時間で達成される。
【００２７】
特に本発明の方法は、大幅に過剰なカップリングパートナーの１つを必要とせずに、アミノ酸またはペプチドを別のアミノ酸またはペプチドにカップリングして、比較的短時間で他方のカップリングパートナーをベースとする合成ペプチドを許容可能な収率で得られるようにする。（活性化）（チオ）エステルがそれから調製される、Ｎ末端保護アミノ酸、Ｎ末端保護アミノ酸Ｃ末端エステル、Ｎ末端保護ペプチド、またはＮ末端保護ペプチドＣ末端エステルと、場合によりＣ末端保護されていてもよいアミノ酸またはペプチドとのモル比は、通常２：１〜１：３の範囲、特に１：１〜１：２の範囲、好ましくは１：１〜１：１．５の範囲で選択される。特に好ましい方法では、前記モル比は１：１〜１：１．１の範囲である。
【００２８】
本発明の方法は、化学酵素的ペプチド合成の一環として、Ｎ末端保護アミノ酸またはＮ末端保護ペプチドの活性化Ｃ末端エステルまたはチオエステル、特にＮ末端保護アミノ酸またはＮ末端保護ペプチドのＣ末端カルバモイルメチル（Ｃａｍ）エステルまたはＣ末端２，２，２−トリフルオロエチル（Ｔｆｅ）エステルを酵素的に調製できることが判明したという点において、特に有利である。特にプロテアーゼまたはリパーゼを使用してＣａｍおよびＴｆｅエステルを高収率で酵素的に調製し得ること、さらに良いことには、カップリングされるアミノ酸またはペプチドの等モル量を使用した場合でさえ、すなわち過剰なアミノ酸またはペプチドが求核剤として作用する必要なしに、プロテアーゼを使用してペプチド結合形成工程と同時に、プロテアーゼまたはリパーゼによる活性化工程を実施して、顕著な副反応なしに９０％を超える収率で縮合物（合成されるペプチド）を生じ得ることが意外にも分かった。
【００２９】
さらにプロリン、または例えばＤ−アミノ酸のような非タンパク新生アミノ酸などの「困難な」アミノ酸が、アセンブルされるペプチド結合の片側または両側に存在する場合でも、顕著なラセミ化なしにペプチドを合成できることが分かった。
【００３０】
本発明に従った方法は、特にいわゆる「ワンポット」法で（チオ）エステル化を実施できることから、比較的単純な方法を提供する。ワンポット法では、（チオ）エステル化およびカップリングの間で（調製されるエステルまたはチオエステルの）単離工程を実施することなく、反応が実施される。反応のはじめから全物質（カップリングするアミノ酸またはそのエステルおよび／またはペプチドまたはそのエステル、アルコール／チオール、溶剤および酵素など）を含めることで本発明に従った方法を実施することさえでき、それは合成されるペプチドを比較的短時間内に高収率で得ることに関して特に有益かもしれない。したがって本発明の特に適切なワンポット法では、調製されたエステルまたはチオエステルがそれにカップリングされる、場合によりＣ−末端保護されていてもよいアミノ酸または場合によりＣ−末端保護されていてもよいペプチドの存在下で、エステルまたはチオエステルの調製を実施する。
【００３１】
本発明のさらに別のワンポット法では、（チオ）エステル化およびカップリングが逐次実施され、すなわちエステルまたはチオエステルを調製した後に、場合によりＣ−末端保護されていてもよいアミノ酸または場合によりＣ−末端保護されていてもよいペプチドを添加する。
【００３２】
本発明のさらに別のワンポット法では、最初にリパーゼまたはエステラーゼを使用した（チオ）エステルの調製を実施して、その後カップリング反応を触媒するために酵素（通常プロテアーゼ）を添加する。このようなアプローチは、例えばカップリングを触媒する酵素が（チオ）エステルの調製を触媒する酵素の活性または安定性に悪影響を及ぼす場合など、（チオ）エステルの調製に有害である場合に特に採用される。
【００３３】
最初は本発明の方法で使用される物質の１つ以上の一部のみを含めて残部を後から添加するような、これらのワンポット法の中間型もまた使用できる。特に調製されたエステルまたはチオエステルがそれにカップリングされる、場合によりＣ−末端保護されていてもよいアミノ酸または場合によりＣ−末端保護されていてもよいペプチドの一部を徐々にまたは段階的に添加してもよい。
【００３４】
原則として、（チオ）エステル化を触媒する酵素およびカップリングを触媒する酵素は同一であってもよく、特に同一リパーゼ、エステラーゼ、またはプロテアーゼであってもよい。例えばサブチリシンカールスバーグまたはカンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢをこのような実施態様で使用してもよい。
【００３５】
比較的短時間内に合成ペプチドを得ることに関して、少なくとも２つの酵素、すなわちリパーゼおよびエステラーゼの群から選択される少なくとも１つの酵素と、少なくとも１つのプロテアーゼとの使用が特に有利であることが分かった。発明のワンポット法では、リパーゼまたはエステラーゼが（主として）（チオ）エステル化を触媒し、およびプロテアーゼが（主として）カップリング反応を触媒することが考察される。
【００３６】
（チオ）エステル化されるＮ末端保護アミノ酸またはＮ末端保護ペプチドは、原則としてあらゆるタンパク新生または非タンパク新生アミノ酸、またはタンパク新生および／または非タンパク新生アミノ酸をベースとするあらゆるペプチドであってもよい。
【００３７】
好ましい実施態様では、本発明は、エステルまたはチオエステルの酵素的調製のために、（ｉ）Ｎ末端保護アミノ酸またはＮ末端保護ペプチドと、（ｉｉ）それぞれ式ＨＯ−ＣＸ２−Ｚで表されるアルコール、式ＨＳ−ＣＸ２−Ｚで表されるチオールとを反応させる、本発明に従った方法に関する。
【００３８】
特にＮ末端保護アミノ酸またはペプチドは、式Ｉの化合物によって表される。
【化１】
【００３９】
式中、ＰはＮ末端保護基を表す。適切なＮ末端保護基は、（オリゴ）ペプチド合成のために使用し得るＮ保護基である。このような基は当業者に知られている。適切なＮ保護基の例としては、例えば「Ｃｂｚ」（すなわちベンジルオキシカルボニル）、「Ｂｏｃ」（すなわちｔ−ブチルオキシカルボニル）、「Ｆｏｒ」（すなわちホルミル）、Ｆｍｏｃ（すなわち９−フルオレニルメトキシカルボニル）、および「ＰｈＡｃ」（すなわちフェナセチル）などのカルボニルタイプの保護基が挙げられる。ＦｏｒまたはＰｈＡｃ基は、それぞれ酵素ペプチドデホルミラーゼまたはＰｅｎＧアシラーゼを使用して、酵素的に導入し切断してもよい。化学的切断法は、一般に当該技術分野で知られている。
【００４０】
式中は、ｎは少なくとも１の整数である。ｎは特に少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも９または少なくとも１０であってもよい。ｎは特に１００以下、７５以下、５０以下、２５以下、２０以下１５以下または１０以下、例えば５以下であってもよい。
【００４１】
各ＲＡおよび各ＲＢは、独立してＨ、または有機部分、好ましくはアミノ酸側鎖を表す。したがってｎ個のアミノ酸単位の全てでＲＡが同一である必要はない。同様にｎ個のアミノ酸単位の全てでＲＢが同一である必要もない。
【００４２】
本発明の文脈で「アミノ酸側鎖」とは、あらゆるタンパク新生または非タンパク新生アミノ酸側鎖を意味する。アミノ酸側鎖中の反応性基は、アミノ酸側鎖保護基によって保護されていても、または保護されていなくてもよい。アミノ酸側鎖のための適切な保護基は当業者に知られている。特に所望ならば、アミノ酸またはペプチドの溶解性を改善するために、酸性またはアルカリ性側鎖基の全てまたは一部に保護基が備わっていてもよい。
【００４３】
タンパク新生アミノ酸は、遺伝コードによってコードされるアミノ酸である。タンパク新生アミノ酸としては、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、メチオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、トリプトファン、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アルギニン、プロリン、およびフェニルアラニンが挙げられる。
【００４４】
非タンパク新生アミノ酸は、特にＤ−アミノ酸、フェニルグリシン、ＤＯＰＡ（３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン）、β−アミノ酸、４−フルオロ−フェニルアラニン、またはα−アルキル化アミノ酸から選択されてもよい。
【００４５】
特定の実施態様では、カップリング反応に参与するエステルまたはチオエステルの調製に使用されるＮ末端保護アミノ酸またはペプチドは、例えば一般にペプチドを合成するための酵素的カップリング反応において実質的な活性を示さない、または少なくとも活性が調製された（チオ）エステルよりも低いようなｔ−アルキルエステルまたは別のエステルなど、調製される（チオ）エステルとは異なるＣ末端エステルである。このような場合、（チオ）エステルの調製は（チオ）エステル転移と称されてもよい。
【００４６】
調製されるアルコールまたはチオールと反応させる化合物がエステルである実施態様では、それは典型的に上述のようにアミノ酸またはペプチドのエステルである。
【００４７】
したがってエステルは、式ＩＩによって表される。
【化２】
このエステルは、典型的にカップリング反応において、本発明の方法で酵素的に調製されたエステルまたはチオエステルよりも反応性が低い。一般にこれは、Ｒｃ基が電子求引性基でなく、またはエステルまたはチオエステルの調製で使用されるアルコールまたはチオールのＣＸ２−Ｚ基よりも電子求引性が低いことを意味する。Ｒｃは、通常は炭化水素基であり、またはエステルに対してγ位の、またはエステル部分からより離れた位置の炭素に置換基を含んでなる炭化水素基である。特にＲｃは、アルキル基、特にＣ１〜Ｃ６アルキル基、とりわけメチル基、エチル基、一級プロピル基、二級プロピル基、一級ブチル基、二級ブチル基、または三級ブチル基であってもよい。
【００４８】
Ｐ、ＲＡ、ＲＢ、およびｎは、上で同定された通りである。
【００４９】
（チオ）エステルの調製で使用されるアルコールＨＯ−Ｘ２−ＺまたはチオールＨＳ−Ｘ２−Ｚは、一般に活性化アルコールまたはチオールである。活性化アルコールまたはチオールは、（チオ）エステル化後に活性化Ｃ末端カルボキシ（チオ）エステル基、すなわちカップリング反応に参与し得るカルボキシ（チオ）エステル基を提供するアルコールまたはチオールである。上述の通り、アルコールは式ＨＯ−ＣＸ２−Ｚで表され、またはチオールは式ＨＳ−ＣＸ２−Ｚで表される。
【００５０】
式中、各Ｘは独立して、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）または水素原子を表す。Ｘがハロゲン原子である場合、それは好ましくはＦである。Ｘの双方が水素である本発明の方法で、良好な結果が得られている。
【００５１】
通常Ｚは電子求引性基を表す。理論により拘束されることなく、これはカップリング反応速度に関して有利であると考えられる。
【００５２】
Ｚは、ヘテロ原子を含んでなる１つ以上の置換基を含んでなるｓｐ２またはｓｐ３混成炭素原子を表す。Ｎ末端保護アミノ酸またはＮ末端保護ペプチドのＣ末端（チオ）エステル、およびこのようなアルコールまたはチオールを化学的に調製することは一般に困難であり、または少なくとも骨が折れる。したがって本発明はこのようなエステルを調製する比較的単純な方法を提供するという点において、さらに特に有利である。
【００５３】
特定の実施態様では、Ｚはヘテロ原子を含んでなる１つの置換基を含んでなるｓｐ３−混成炭素の群から選択され、そのヘテロ原子はｓｐ３−混成炭素に直接結合する。
【００５４】
好ましい実施態様では、Ｚは、ヘテロ原子を含んでなる２または３個の置換基、特に２または３個のハロゲン置換基、好ましくはＦおよびＣｌの群から選択される２または３個のハロゲン置換基を含んでなるｓｐ３−混成炭素の群から選択され、各置換基の前記ヘテロ原子はｓｐ３−混成炭素に直接結合し、例えばＺはトリフルオロメチル基またはトリクロロメチル基を表してもよい。例えば２，２，２−トリフルオレチルアルコール（Ｘ＝Ｈ、Ｚ＝ＣＦ３）を用いて、特にリパーゼおよびプロテアーゼの双方を利用する方法で、良好な結果が達成された。Ｎ末端保護アミノ酸トリフルオロエチルエステルまたはＮ末端保護ペプチドＣ末端２，２，２−トリフルオロエチルエステルをＮ末端保護アミノ酸またはペプチドから酵素的に調製し、引き続いて酵素的カップリング法で使用し得ること、さらにはワンポット法において良好な収率でこれを達成できることは、特に驚くべきことである。
【００５５】
さらなる好ましい実施態様では、Ｚはヘテロ原子を含んでなる少なくとも１つの置換基を含んでなるｓｐ２−混成炭素の群から選択され、そのヘテロ原子はｓｐ２−混成炭素に直接結合する。特にこのようなＺは、−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ１または−（Ｃ＝Ｓ）Ｒ１であってもよい。Ｒ１は、特に−ＮＨ２、ＮＨＣＨ３またはＮ（ＣＨ３）２、（場合により）Ｃ末端保護されていてもよいα−アミノ酸または（場合により）Ｃ末端保護されていてもよいペプチド、好ましくは−ＮＨ２などのアミン基；−ＯＨまたはアルカリまたはアンモニウム塩などのその塩；アルキルまたはアリール基；置換されたアルキルまたはアリール基、特に１つ以上のハロゲン置換基を含んでなる置換されたアルキルまたはアリール基；−ＯＲ２；−ＳＲ２の群から選択されてもよい。Ｒ２基は、通常、炭化水素または置換炭化水素、特にアルキル、（１つ以上のハロゲン置換基を含んでなるアルキルなどの）置換アルキル、非置換アリール基または（１つ以上のハロゲン置換基を含んでなるアリールなどの）置換アリール基である。Ｒ１またはＲ２中のアルキルまたは置換されたアルキルは、特に１〜６個の炭素原子を含んでなってもよく；非置換または置換アリール基は、特に１つまたは複数の環中の５〜１８個、とりわけ６〜１２個の炭素原子を含んでなってもよい。
【００５６】
例えばカルバモイルメチルアルコール（Ｚ＝−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ２、カルバモイル）を用いて、特にリパーゼおよびプロテアーゼの双方を利用する方法で、良好な結果が得られている。Ｎ末端保護アミノ酸Ｃ末端カルバモイルメチルエステルまたはＮ末端保護ペプチドＣ末端カルバモイルメチルエステルをＮ末端保護アミノ酸またはＮ末端保護ペプチドから酵素的に調製して、引き続いて酵素的カップリング方法で使用し得ること、さらにはワンポット法において良好な収率でこれを達成できることは、特に驚くべきことである。
【００５７】
（チオ）エステルとカップリングされる場合によりＣ末端保護されていてもよいアミノ酸または場合によりＣ末端保護されていてもよいペプチドは、原則としてあらゆるタンパク新生または非タンパク新生アミノ酸、またはタンパク新生および／または非タンパク新生アミノ酸をベースとするあらゆるペプチドであってもよい。
【００５８】
特に場合によりＣ末端保護されていてもよいアミノ酸またはペプチドは、式ＩＩＩの化合物によって表されてもよい。
【化３】
【００５９】
式中、ｎ、各ＲＡおよび各ＲＢは上で定義されるとおりである。
【００６０】
式中、Ｑはアミド基またはＯＲ部分を表す（下記参照）。
【００６１】
Ｑがアミド基を表す場合、アミド基は、式ＮＲ１Ｒ２によって表されてもよく、式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ個々にあらゆる（置換）アルキルまたは（置換）アリール基を表してもよい。特にＲ１およびＲ２の片方はＨ原子であり、もう一方は（置換された）アルキル基である。好ましくはＲ１およびＲ２はどちらもＨである。
【００６２】
ＱがＯＲ部分を表す場合、Ｒは、Ｃ末端保護基、または例えば三置換または四置換アンモニウムイオンまたはアルカリ性金属カチオンのような一価のカチオンなどのカチオン、またはＨを表わしてもよい。ＲがＣ末端保護基である場合、これは特に場合により置換されていてもよいアルキル基であってもよい。好ましくはこれはｔ−アルキル基であるが、原則としてそれはまた、当業者に知られているあらゆるその他の保護エステルであってもよい。ｔ−アルキルは、原則としてあらゆる保護三級アルキル基であってもよい。好ましくはｔ−アルキルは、ｔ−ブチル（２−メチル−２−プロピル）、ｔ−ペンチル（２−メチル−２−ブチル）、およびｔ−ヘキシル（２，３−ジメチル−２−ブチル）の群から選択される。良好な結果が特にｔ−ブチルによって得られている。通常、望まれない副反応を避けるために、Ｑがアミド基またはＯＲ部分を表すことが好ましく、式中、Ｒは保護基である。しかし少なくともいくつかの実施態様では、このような副反応は別のやり方で十分に回避される。
【００６３】
上述の通り、本発明の方法ではアミノ酸またはペプチドの（チオ）エステル化が酵素によって触媒され、得られた（チオ）エステルの別のペプチドまたはアミノ酸へのカップリングについても同様である。原則として、これらの反応の片方または双方を触媒できる当該技術分野で知られているあらゆる酵素を使用し得る。特定起源からの酵素に言及する場合、第１の生物が起源であるが、事実上（遺伝子改変された）第２の生物中で生成される組み換え酵素は、明確に第１の生物からの酵素として含めることが意図される。
【００６４】
発明の方法で使用される酵素が由来する生物の例としては、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）などのトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種；リゾプス・オリゼー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）などのクモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）種；バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・アルカロフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）などのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種；コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）またはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）などのアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種；ストレプトミセス・カエスピトーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｅｓｐｉｔｏｓｕｓ）またはストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）などのストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種；カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種；真菌；フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）種；リゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）種；サイトファガ属（Ｃｙｔｏｐｈａｇｉａ）；ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）種；および動物組織、特にブタ膵臓、ウシ膵臓またはヒツジ膵臓などの膵臓からの組織が挙げられる。
【００６５】
本発明に従った方法で、天然（野性型）酵素の変異体もまた利用できることは、平均的当業者には明らかであろう。野生型酵素の変異体は、例えば当業者に知られている変異誘発技術（ランダム変異誘発、部位特異的変異誘発、定方向進化、遺伝子シャフリングなど）を使用して、ＤＮＡが野生型酵素と少なくとも１つのアミノ酸が異なる酵素をコードするように、またはそれが野生型と比較してより短い酵素をコードするように、野生型酵素をコードするＤＮＡを改変することで、そしてこのように改変されたＤＮＡを適切な（宿主）細胞内で発現させることで、作成し得る。酵素の変異体はまた、例えば基質範囲、活性、安定性、有機溶剤抵抗性、温度プロフィール、合成／加水分解比、および副反応プロフィールの１つ以上に関して、特性が改善されていてもよい。
【００６６】
好ましい方法では、リパーゼおよび／またはプロテアーゼを使用して、前記反応の少なくとも１つを触媒する。
【００６７】
適切なリパーゼまたはエステラーゼは、ＥＣ ３．１に分類できる酵素から選択される。特にカルボン酸エステルヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１）またはチオールエステルヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．２）を使用してもよい。好ましい方法では、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）からのリパーゼの群から選択されるリパーゼが使用される。良好な結果が、特に（チオ）エステル化の触媒に関して、カンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼを用いて、特にカンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢを用いて得られている。
【００６８】
適切なプロテアーゼは、ＥＣ ３．４に分類できる酵素から選択される。プロテアーゼは、ペプチド末端近くのみに作用するエキソペプチダーゼと、ペプチド中で内部的に作用するエンドペプチダーゼの２つのサブクラスにさらに分割し得る。
【００６９】
本発明の実施態様では、エステルまたはチオエステルの酵素的調製はリパーゼまたはエステラーゼによって触媒され、酵素的カップリングはプロテアーゼによって触媒される。
【００７０】
ペプチドＮ末端に作用するエキソペプチダーゼは、単一アミノ酸（アミノペプチダーゼＥ．Ｃ．３．４．１１）またはジペプチド（ジペプチダーゼ、Ｅ．Ｃ．３．４．１３）またはジペプチドとトリペプチド（ジペプチジル−ペプチダーゼまたはトリペプチジル−ペプチダーゼ、Ｅ．Ｃ．３．４．１４）の双方を遊離させる。ペプチドＣ末端に作用するペプチダーゼはカルボキシペプチダーゼと称され、単一アミノ酸（カルボキシペプチダーゼ、Ｅ．Ｃ．３．４．１６−１８）またはジペプチド（ペプチジル−ジペプチダーゼ、Ｅ．Ｃ．３．４．１５）を遊離させる。カルボキシペプチダーゼは、例えばセリン型カルボキシペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．１６）、メタロカルボキシペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．１７）、システイン型カルボキシペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．１８）などそれらの触媒機序に従って、または置換され、環化され、またはイソペプチド結合（側鎖が関与するペプチド結合）を有する、切断末端アミノ酸に従って（ω−ペプチダーゼ、Ｅ．Ｃ．３．４．１９）分類される。
【００７１】
特にエンドペプチダーゼ、特にセリンエンドペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２１）、システインエンドペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２２）、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２３）、およびメタロエンドペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２４）の群から選択されるエンドペプチダーゼを使用してもよい。
【００７２】
特に適切なのは、サブチリシンの群から選択されるセリンエンドペプチダーゼである。このような酵素は、特にカップリングを触媒するのに適することが分かっている。
【００７３】
様々なサブチリシンが当該技術分野で知られており、例えば米国特許第５，３１６，９３５号明細書と、その中で引用される参考文献を参照されたい。
【００７４】
サブチリシンＡは、ノボザイムズ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）から市販されるサブチリシンである。
【００７５】
特に好ましいのはサブチリシンカールスバーグであり、それはカンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼなどのリパーゼと組み合わせて使用すると、比較的短時間内に高収率でペプチドを合成するのに特に有利であることが分かっている。
【００７６】
アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）（登録商標）は、サブチリシンカールスバーグの適切な原料である。この製品は、デンマーク国バウスベア（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）のノボザイムズから入手できる。アルカラーゼ（登録商標）は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）によって生成される安価で工業的に入手できるタンパク質分解酵素混合物である（主要酵素構成要素としてサブチリシンカールスバーグを含有する）。
【００７７】
アルカラーゼ（登録商標）などの市販される酵素は、供給元によって液体、特に水性液として提供されてもよい。このような場合、酵素は好ましくは最初に、望まれない副反応を引き起こす望まれない液体、例えば過剰な水、またはアルコールから単離される。これは適切には沈殿と、通常それに続く液体からの固形分分離、および／または乾燥によって達成されてもよい。沈殿は、ｔ−ブタノールなどのアルコール、または本発明の方法で使用されるアルコールまたはチオールを使用して達成してもよい。その他のアルコールまたはチオールを使用する場合、このようなアルコールまたはチオールが（チオ）エステル化反応またはカップリング反応を不利に妨げないように注意しなくてはならない。
【００７８】
好ましい実施態様では、酵素の少なくとも１つが固体担体上に固定化される。少なくともいくつかの実施態様では、これは比較的短い反応時間後に、特に（チオ）エステル化の触媒作用のための酵素と、カップリングの触媒作用のための異なる酵素との双方が使用されるワンポット法で、合成ペプチドの収率増大をもたらすかもしれない。これを考慮すると、特にカンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼなどのリパーゼ、およびサブチリシンカールスバーグなどのプロテアーゼが使用される場合、（チオ）エステル化を触媒する固定化酵素を少なくとも使用することが特に好ましい。アルカラーゼが、グルタルアルデヒドとの縮合によって固定化されているアルカラーゼ架橋酵素凝集体（アルカラーゼ−ＣＬＥＡ）を用いて、特に良好な結果が得られている。
【００７９】
特定の実施態様では少なくとも２種の異なる酵素が使用され、少なくとも片方は（チオ）エステルの調製を触媒し、少なくとももう一方はカップリングを触媒し、異なる酵素が同一担体上に固定化される。
【００８０】
（チオ）エステル化のためのアルコール、そして任意に例えばアセトニトリルなどの不活性有機溶剤、トルエンなどの炭化水素、またはメチル−ｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）などのエーテルを含んでなる混合物中で、反応を実施することが可能である。
【００８１】
エステル化するアミノ酸またはペプチドと比較して、（チオ）エステルの調製のために使用されるチオールまたはアルコールが大幅に過剰でなくてもよいことが、本発明の利点である。例えば前記チオールまたはアルコールと前記アミノ酸またはペプチドとのモル比は、５０：１以下、好ましくは２５：１以下、特に２０：１以下、とりわけ１０：１以下であり得る。通常、比率は少なくとも１：１である。（チオ）エステル化を有利な速度で進行させるために、好ましくは前記モル比は少なくとも３：１、特に少なくとも５：１である。
【００８２】
本発明の方法は、実質的に非水性条件の下で実施される。当業者は理解するであろうように、酵素が所望の触媒作用を適切に果たせるように、酵素によっては少量の水が所望されるかもしれない。良好な触媒活性のためには、例えば液相を基準にして少なくとも０．００５重量％の微量の水の存在が所望されるかもしれない。特に水濃度は、少なくとも０．０１重量％または少なくとも０．０３重量％であってもよい。
【００８３】
所望される水濃度の上限は、特定の酵素、使用されるアルコールまたはチオール、合成されるペプチドの性質（例えばサイズ、ペプチドがそれをベースとするアミノ酸）、所望の最終転換、および所望の反応速度に左右される。
【００８４】
反応媒体は、通常、少なくとも活性化またはエステル化（エステル交換）の開始時に、反応媒体中の液体の重量を基準として２．０重量％未満の水を含有する。反応媒体が第２の液相中に分散していてもよく、または別の液相が反応媒体中に分散していてもよい。二相系または多相系の場合、指定される含水量は、エステル化（エステル交換）または活性化反応が（少なくともその大部分が）起きる相中の液体重量を基準とする。
【００８５】
特に水濃度は、少なくとも（チオ）エステル化の開始時には１．０重量％未満であってもよい。有利には、方法は、所望の酵素活性と、低いまたは検出不能でさえある望まれない加水分解をなおも保ちながら、少なくとも反応開始時には、０．５重量％以下の水、特に０．２重量％以下の水、とりわけ０．１重量％以下の水を含有する媒体中で実施してもよい。実際には、少なくともいくつかの実施態様では、とりわけカンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼおよび／またはサブチリシンカールスバーグを使用した実施態様では、１〜２．５％の水を含んでなる反応媒体中で実施される方法と比較して、非常に低い含水量を有する反応媒体中で、特に０．５重量％未満、または０．１重量％未満の含水量を有する反応媒体中において、改善されたペプチド合成速度が観察されている。
【００８６】
有利な方法では、特に（チオ）エステル化中に形成された水を連続的にまたは断続的に除去してもよい。原則として除去は、当該技術分野で知られている様式で達成してもよい。特に分子ふるいを使用して、良好な結果が達成されている。また除去のためには、真空または蒸留を使用した共沸性除去などの蒸発が非常に適する。
【００８７】
酵素が十分な活性を示すｐＨを選択しさえすれば、原則として、使用されるｐＨは（選択された反応媒体中に存在するｐＨの範囲で）広い制限内で選択してもよい。このようなｐＨは、通常、使用される酵素について知られており、水溶液中におけるその既知の加水分解活性に基づいてもよく、または既知の反応条件下における酵素の既知の基質を利用して慣例的に測定し得る。それは特にほぼ中性であるように選択されてもよい。所望ならば、酵素次第でアルカリ性または酸性条件を使用してもよい。所望ならば、酸および／または塩基を使用してｐＨを調節してもよく、または酸と塩基の適切な組み合わせによって緩衝してもよい。適切な酸および塩基は、特に例えばアンモニアと例えば酢酸およびギ酸などのアルコール可溶性酸との群からの反応媒体に可溶性のものである。
【００８８】
使用される酵素が十分な活性と安定性を示す温度を選択しさえすれば、原則として使用する温度は重要でない。このような温度は、通常、使用される酵素について知られており、既知の反応条件下における酵素の既知の基質を利用して慣例的に測定し得る。一般に温度は、少なくとも０℃、特に少なくとも１５℃または少なくとも２５℃であってもよい。特に好熱性生物に由来する１つ以上の酵素を使用する場合、温度は好ましくは少なくとも４０℃であってもよい。所望の最大温度は、酵素に左右される。一般にこのような最大温度は当該技術分野で知られており、例えば市販される酵素の場合は製品データシートに表示され、または一般常識および本明細書で開示される情報に基づいて慣例的に測定し得る。温度は通常７０℃以下、特に６０℃以下または４５℃以下である。しかし特に好熱性生物からの１つ以上の酵素を使用する場合、例えば９０℃までのより高い温度を選択してもよい。
【００８９】
最適温度条件は、一般常識と本明細書で開示される情報に基づく通例の実験法を通じて、当業者によって特定の酵素について容易に同定され得る。例えばサブチリシン、特にサブチリシンカールスバーグ（例えばアルカラーゼ（登録商標）中の）では、温度は有利には２５〜６０℃の範囲であってもよい。アルカラーゼ（登録商標）とＣａｌ−Ｂの組み合わせを使用する場合、温度は有利には３０〜５５℃の範囲であってもよい。
【００９０】
本発明は、本明細書に記載される本発明に従った方法に従った、異なる実施態様および／または好ましい徴群の全ての可能な組み合わせにさらに関する。
【００９１】
ここで本発明を以下の実施例によって例証する。
【００９２】
［実施例］
特に断りのない限り、化学薬品は商業的供給元から得て、さらに精製することなく使用した。１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ３００ ＭＨｚ ＮＭＲ（３００．１ ＭＨｚ）分光計の上で記録し、化学シフトは特に断りのない限りＣＤＣｌ３（７．２６ｐｐｍ）に対するｐｐｍ（δ）で示す。
【００９３】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）はプレコートされたシリカゲル６０ Ｆ２５４プレート（メルク（Ｍｅｒｃｋ））上で実施し、スポットはＵＶ光またはニンヒドリンを使用して可視化した。
【００９４】
３Å分子ふるい（８〜１２メッシュ、アクロス（Ａｃｒｏｓ））を２００℃、減圧下で活性化し、これらの分子ふるい上でｔ−ブタノール（ｔＢｕＯＨ）を保存した。ｔＢｕＯＨは使用前に予熱して液体（４５℃）にした。
【００９５】
カラムクロマトグラフィーは、シリカゲル（メルク等級９３８５ ６０Å）を使用して実施した。分析的ＨＰＬＣは、４０℃で逆相カラム（イナートシル（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ）ＯＤＳ−３、Ｃ１８、５μｍ、１５０×４．６ｍｍ）を使用して、ＨＰ１０９０液体クロマトグラフ上で実施した。ＵＶ検出は、ＵＶ−ＶＩＳ ２０４線形分光計を使用して２２０ｎｍで実施した。勾配プログラムは次の通りであった。０〜２５分は５％〜９８％の溶出剤Ｂの直線濃度勾配、２５．１〜３０分は５％の溶出剤Ｂ（溶出剤Ａは０．５ｍＬメタンスルホン酸（ＭＳＡ）／Ｌ Ｈ２Ｏ、溶出剤Ｂは０．５ｍＬ ＭＳＡ／Ｌアセトニトリル）。流量は０〜２５．１分で１ｍＬ／分、２５．２〜２９．８分で２ｍＬ／分、次に３０分で停止するまで１ｍＬ／分に戻した。注入量は２０μＬであった。
【００９６】
アルカラーゼ−ＣＬＥＡはＣＬＥＡ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入され、３．５重量％の水を含有し、活性はグラムあたり６５０ ＡＧＥ単位であった（１ ＡＧＥ単位は、４０℃およびｐＨ７．５でＮ−アセチル−グリシンエチルエステルから１μｍｏｌのＮ−アセチル−グリシンの形成を触媒する）。このアルカラーゼ−ＣＬＥＡは、使用前に次のように処理した。１ｇのアルカラーゼ−ＣＬＥＡを２０ｍＬのｔＢｕＯＨに懸濁し、スパチュラで粉砕した。濾過後、２０ｍＬのＭＴＢＥを用いてこの手順を繰り返した。
【００９７】
Ｃａｌ−Ｂ（ノボザイムズ；カンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）からのリパーゼであるノボザイム−４３５；バッチ番号ＬＣ２００２０４）をいかなる前処理もなしに使用した。
【００９８】
ジペプチド基準化合物は、次のように化学的に合成した。３５５μＬジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、２．１ｍｍｏｌ、２．１当量）を含有する１０ｍＬのＣＨＣｌ３と３０ｍＬのＥｔＯＡｃとの混合物に、１．０ｍｍｏｌのアミノ酸アミドＨＣｌ塩またはアミノ酸ｔＢｕ−エステルＨＣｌ塩を溶解した。この溶液を２０ｍＬのＣＨＣｌ３中の１ｍｍｏｌのＮ−Ｃｂｚ−保護アミノ酸（１当量）、２０７ｍｇのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド・ＨＣｌ（ＥＤＣｌ・ＨＣｌ、１．１ｍｍｏｌ、１．１当量）、および１５０ｍｇの７−アザ−Ｎ−ヒドロキシベンザトリアゾール（ＨＯＡｔ、１．２ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液（０℃）に添加した。混合物を周囲温度で１６時間撹拌した。溶液を真空内で濃縮し、残渣を２５ｍＬのＥｔＯＡｃに再溶解して、２０ｍＬの水性ＨＣｌ（ｐＨ３、３×）、２０ｍＬの鹹水、２０ｍＬの飽和水性ＮａＨＣＯ３（３×）、２０ｍＬの鹹水で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、真空内で濃縮した。必要ならばＥｔＯＡｃ／ｎ−ヘプタン混合物を使用した追加的カラムクロマトグラフィーを実施して、純粋なジペプチドを得た。
【００９９】
Ｎ−Ｃｂｚ−保護アミノ酸メチルエステルは、次のように合成した。１００ｍＬのＭｅＯＨをアセトン中のドライアイス浴で−８０℃に冷却し、続いて４ｍＬのＳＯＣｌ２（５．５ｍｍｏｌ、３．７当量）を滴下して添加した。引き続いて１．５ｍｍｏｌのＣｂｚ−保護アミノ酸を添加し、ドライアイス浴から取り出して、混合物を周囲温度で５時間撹拌した。揮発物を真空内で蒸発させ、残渣の残留揮発物をＭｅＯＨ（３×）と共に同時蒸発させた。得られた残渣を真空内、周囲温度で一晩乾燥させ、純粋なＮ−Ｃｂｚ−保護アミノ酸メチルエステルを得た。
【０１００】
Ｎ−Ｃｂｚ−保護アミノ酸カルバモイルメチル（Ｃａｍ）またはトリフルオロエチル（Ｔｆｅ）エステルの化学合成は次のように実施した。３０ｍＬのＥｔＯＡｃと５ｍｍｏｌのカルバモイルメタノール（ＣａｍＯＨ）または２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴｆｅＯＨ）（５当量）との混合物に、１ｍｍｏｌのＮ−Ｃｂｚ−保護アミノ酸を溶解した。引き続いて２０７ｍｇのＥＤＣｌ・ＨＣｌ（１．１ｍｍｏｌ、１．１当量）、１５０ｍｇのＨＯＡｔ（１．２ｍｍｏｌ、１．２当量）、２９２μｌのトリエチルアミン（ＴＥＡ、１．１ｍｍｏｌ、１．１当量）を添加した。反応混合物を周囲温度で２０時間撹拌した。引き続いて２０ｍＬのＥｔＯＡｃを添加し、有機混合物を５０ｍＬの水性ＨＣｌ（ｐＨ３、２×）、５０ｍＬの脱イオン水（２×）、５０ｍＬの鹹水で洗浄し、乾燥させて（Ｎａ２ＳＯ４）、真空内で濃縮し、１０ｍＬのトルエン（２×）と共に同時蒸発させた。必要ならばＥｔＯＡｃ／ｎ−ヘプタン混合物を使用した追加的カラムクロマトグラフィーを実施して、純粋なエステルを得た。
【０１０１】
【表１】
【０１０２】
【表２】
【０１０３】
【表３】
【０１０４】
【表４】
【０１０５】
【表５】
【０１０６】
［実施例１：アルカラーゼ−ＣＬＥＡを使用してＭｅ、Ｃａｍ、およびＴｆｅエステルから出発するジペプチドの酵素的合成］
【化４】
３ｍＬのＭＴＢＥと２００ｍｇの３Å分子ふるいの混合物に、３００ｍｇのアルカラーゼ−ＣＬＥＡを添加した。引き続いて１００ｍｇのＮ−Ｃｂｚ−保護アミノ酸エステルと１．０当量のＣ末端保護アミノ酸を添加した。混合物を５０℃、１５０ｒｐｍで１６時間振盪した。濾過後、固形物を１０ｍＬのＥｔＯＡｃ（３×）で洗浄した。合わせた有機層を２５ｍＬの飽和水性ＮａＨＣＯ３溶液（３×）、２５ｍＬの水性ＨＣｌ溶液（ｐＨ３、３×）、２５ｍＬの鹹水で洗浄し、乾燥させて（Ｎａ２ＳＯ４）、真空内で濃縮し、２０ｍＬのトルエン（２×）および２０ｍＬのＣＨＣｌ３（２×）と共に同時蒸発させた。必要ならばＥｔＯＡｃ／ｎ−ヘプタン混合物を使用した追加的カラムクロマトグラフィーを実施して、純粋なジペプチドを得た。得られた全てのジペプチドのＨＰＬＣ滞留時間および１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、基準化合物と完全に一致した。得られた収率を下の表に示す。
【０１０７】
【表６】
【０１０８】
［実施例２：ＣａｍおよびＴｆｅエステルの酵素的合成］
【化５】
以下に示すプロトコル１、２または３の１つを使用して、数種のＣａｍおよびＴｆｅエステルを合成した。
【０１０９】
［プロトコル１：アルカラーゼ−ＣＬＥＡを使用したＣａｍまたはＴｆｅエステルの合成］
３ｍＬのＭＴＢＥ、２００ｍｇの３Å分子ふるい、２００ｍｇのカルバモイルメタノールまたは２，２，２−トリフルオロエタノール、および５０ｍｇのＮ−Ｃｂｚ−保護アミノ酸の混合物に、３００ｍｇのアルカラーゼ−ＣＬＥＡを添加した。混合物を５０℃、１５０ｒｐｍで７２時間振盪した。濾過後、固形物を１０ｍＬのＥｔＯＡｃ（３×）で洗浄した。合わせた有機層を２５ｍＬの脱イオン水（３×）、２５ｍＬの水性ＨＣｌ溶液（ｐＨ＝３、３×）、２５ｍＬの鹹水で洗浄し、乾燥させて（Ｎａ２ＳＯ４）、真空内で濃縮し、２０ｍＬトルエン（２×）および２ＯｍＬ ＣＨＣｌ３（２×）と共に同時蒸発した。
【０１１０】
［プロトコル２：Ｃａｌ−Ｂを使用したＣａｍまたはＴｆｅエステルの合成］
３ｍＬのアセトニトリル、１００ｍｇの３Å分子ふるい、２００ｍｇのカルバモイルメタノールまたは２，２，２−トリフルオロエタノール、および５０ｍｇのＮ−Ｃｂｚ−保護アミノ酸の混合物に、１００ｍｇのＣａｌ−Ｂを添加した。混合物を５０℃、１５０ｒｐｍで１６時間振盪した。濾過後、固形物を１０ｍＬのＥｔＯＡｃ（３×）で洗浄した。合わせた有機層を２５ｍＬ脱イオン水（３×）、２５ｍＬの水性ＨＣｌ溶液（ｐＨ３、３×）、２５ｍＬの鹹水で洗浄し、乾燥させて（Ｎａ２ＳＯ４）、真空内で濃縮し、２０ｍＬのトルエン（２×）および２０ｍＬのＣＨＣｌ３（２×）と共に同時蒸発させた。必要ならばＥｔＯＡｃ／ｎ−ヘプタン混合物を使用した追加的カラムクロマトグラフィーを実施して、純粋なエステルを得た。
【０１１１】
【表７】
【０１１２】
［プロトコル３：Ｃａｌ−Ｂを使用したＴｆｅエステルの合成］
３ｍＬのＭＢＴＥ、１００ｍｇの３Å分子ふるい、２００ｍｇの２，２，２−トリフルオロエタノール、および５０ｍｇのＮ−Ｃｂｚ−保護アミノ酸の混合物に、１００ｍｇのＣａｌ−Ｂを添加した。混合物を５０℃、１５０ｒｐｍで５４時間振盪した。対応するＴｆｅエステルへの転換は、ＨＰＬＣ分析によって判定した。
【０１１３】
【表８】
【０１１４】
［実施例３：添加剤としてＣａｍまたはＴｆｅアルコールを使用したジペプチドの酵素的合成］
【化６】
以下に示す１〜３のプロトコルの１つを使用して、数種のジペプチドを合成した。
【０１１５】
［プロトコル１：アルカラーゼ−ＣＬＥＡと共に添加剤としてＣａｍまたはＴｆｅアルコールを使用したジペプチドの合成］
３ｍＬのＭＴＢＥ、２００ｍｇの３Å分子ふるい、および２００ｍｇの適切なアルコールの混合物に、３００ｍｇのアルカラーゼ−ＣＬＥＡを添加した。引き続いて、５０ｍｇのＮ−Ｃｂｚ−保護アミノ酸と１当量のアミノ酸アミドを添加した。混合物を５０℃、１５０ｒｐｍで１６時間振盪した。
【０１１６】
［プロトコル２：Ｃａｌ−Ｂと共に添加剤としてＣａｍまたはＴｆｅアルコールを使用したジペプチドの合成］
３ｍＬのアセトニトリル、２００ｍｇの３Å分子ふるい、および２００ｍｇの適切なアルコールの混合物に、１００ｍｇのＣａｌ−Ｂを添加した。引き続いて、５０ｍｇのＮ−Ｃｂｚ−保護アミノ酸と１当量のアミノ酸アミドを添加した。混合物を５０℃、１５０ｒｐｍで１６時間振盪した。
【０１１７】
［プロトコル３：アルカラーゼ−ＣＬＥＡおよびＣａｌ−Ｂと共に添加剤としてＣａｍまたはＴｆｅアルコールを使用したジペプチドの合成］
３ｍＬのアセトニトリル、２００ｍｇの３Å分子ふるい、および２００ｍｇの適切なアルコールの混合物に、３００ｍｇのアルカラーゼ−ＣＬＥＡと１００ｍｇのＣａｌ−Ｂを添加した。引き続いて５０ｍｇのＮ−Ｃｂｚ−保護アミノ酸と１当量のアミノ酸アミドを添加した。混合物を５０℃、１５０ｒｐｍで１６時間振盪した。濾過後、酵素を１０ｍＬのＥｔＯＡｃ（３×）で洗浄した。合わせた有機層を２５ｍＬの脱イオン水（３×）、２５ｍＬの水性ＨＣｌ溶液（ｐＨ３、３×）、２５ｍＬの鹹水で洗浄し、乾燥させて（Ｎａ２ＳＯ４）、真空内で濃縮し、２０ｍＬのトルエン（２×）および２０ｍＬのＣＨＣｌ３（２×）と共に同時蒸発させた。
【０１１８】
［実施例４：Ｃａｌ−Ｂを使用したジ−およびトリペプチドのＴｆｅエステルの酵素的合成］
３ｍＬのメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、１００ｍｇの３Å分子ふるい、２００ｍｇの２，２，２−トリフルオロエタノール、および５０ｍｇのＮ−Ｃｂｚ−保護ジ−またはトリペプチドの混合物に、１００ｍｇのＣａｌ−Ｂを添加した。混合物を５０℃、１５０ｒｐｍで振盪した。対応するＣ末端Ｔｆｅエステルへの転換をＨＰＬＣ分析によってモニターした。いかなる場合でも、出発化合物は対応するＣ末端Ｔｆｅエステルのみに変換された。出発化合物およびＴｆｅエステル生成物（Ｐ）のＨＰＬＣ滞留時間を下の表に示す。
【０１１９】
【表９】
【０１２０】
１および／または２および／または３および／または７日後に、反応混合物からサンプルを取り出した。下の表に示す％Ｔｆｅエステル生成物（％Ｐ）値は、次式によって計算した。
％Ｐ＝Ｔｆｅエステル生成物の面積％／（出発化合物の面積％＋Ｔｆｅエステル生成物の面積％）
【０１２１】
【表１０】
【０１２２】
Ｃｂｚ−Ａｌａ−ＡｌａからＣｂｚ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＴｆｅへのエステル化の反応混合物は、次のように精製した。７日後に得られた反応混合物を濾過し、固形物を１０ｍＬのＥｔＯＡｃ（３×）で洗浄した。合わせた有機層を２５ｍＬの脱イオン水（３×）、２５ｍＬの水性ＨＣｌ溶液（ｐＨ３、３×）、２５ｍＬの鹹水で洗浄し、乾燥させて（Ｎａ２ＳＯ４）、真空内で濃縮した。得られた残渣中の揮発物を２０ｍＬのトルエン（２×）と２０ｍＬのＣＨＣｌ３（２×）との同時蒸発によって除去した。生成物のクロマトグラフィー精製によって、純粋なＣｂｚ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＯＴｆｅを８５％の収率で得た。
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝１．３２（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３）、１．３７（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３）、４．１３−４．２４（ｍ，１Ｈ，ＣαＨ）、４．２９−４．４０（ｍ，１Ｈ，ＣαＨ）、４．４９−４．６１（ｍ，２Ｈ，ＯＣＨ２ＣＦ３）、５．０５（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２ＯＣＯ）、５．１８（ｂｓ，１Ｈ，ＮＨ）、６．４１（ｂｓ，１Ｈ，ＮＨ）、７．２８（ｍ，５Ｈ，ＣＡｒＨ）；
１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝１６．７、１６．８、４６．９、４９．４、６０．０、６６．１、１１９．８、１２３．５、１２７．１、１２７．３、１２７．６、１３８．３、１７０．２、１７０．９。
【０１２３】
【表１１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）Ｎ−末端保護アミノ酸、Ｎ−末端保護アミノ酸Ｃ−末端エステル、Ｎ−末端保護ペプチド、またはＮ−末端保護ペプチドＣ−末端エステル、および
（ｉｉ）それぞれ式ＨＯ−ＣＸ２−Ｚで表されるアルコール、式ＨＳ−ＣＸ２−Ｚで表されるチオール
からエステルまたはチオエステルを酵素的に調製するステップであって、
各Ｘが独立してハロゲン原子または水素原子を表し、
Ｚがｓｐ３−混成炭素に直接付着するヘテロ原子を含んでなる少なくとも２個の置換基を含んでなるｓｐ３−混成炭素、およびｓｐ２−混成炭素に直接付着するヘテロ原子を含んでなる１または２個の置換基を含んでなるｓｐ２−混成炭素の群から選択され、
前記エステルまたはチオエステルの調製が、反応媒体中の液体の重量を基準として２重量％以下の水を含んでなる反応媒体中で実施される、ステップと、
前記調製されたエステルまたはチオエステルを、場合によりＣ−末端保護されていてもよいアミノ酸、または場合によりＣ−末端保護されていてもよいペプチドに酵素的にカップリングし、それによって反応媒体総重量を基準にして２重量％以下の水を含んでなる反応媒体中でペプチドを合成するステップと
を含んでなる、ペプチドを酵素的に合成する方法。
【請求項２】
前記カップリングが、前記エステルまたはチオエステルの調製を触媒するために使用される酵素の存在下で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記各エステルまたはチオエステルの調製前記カップリングがリパーゼ、エステラーゼ、およびプロテアーゼの群から選択される少なくとも１つの酵素によって触媒される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
プロテアーゼと、リパーゼおよびエステラーゼの群から選択される酵素とが使用され、これらの酵素の少なくとも１つが前記エステルまたはチオエステルの調製を触媒し、他方が少なくとも前記カップリングを触媒する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記エステルまたはチオエステルの調製および前記カップリングの双方が、リパーゼ、エステラーゼ、およびプロテアーゼの群から選択される単一酵素によって触媒される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）からの、好ましくはカンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）からのリパーゼ、特にカンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢの群から選択されるリパーゼが使用される、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記プロテアーゼが、セリン型カルボキシペプチダーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、システイン型カルボキシペプチダーゼ、セリンエンドペプチダーゼ、システインエンドペプチダーゼ、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ、およびメタロエンドペプチダーゼの群から選択される、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記プロテアーゼが、サブチリシンの群から選択されるセリンエンドペプチダーゼ、好ましくはサブチリシンカールスバーグである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの固定化酵素が使用される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記エステルの調製および前記カップリングが、１．０重量％以下の水、特に０．５重量％以下の水、とりわけ０．１重量％以下の水を含んでなる反応媒体中で実施される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
Ｚが、カルバモイル基、トリフルオロメチル基またはトリクロロメチル基である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
双方のＸが水素を表す、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記エステルまたはチオエステルの調製が、調製されたエステルまたはチオエステルがそれにカップリングされる前記場合によりＣ−末端保護されていてもよいアミノ酸または前記場合によりＣ−末端保護されていてもよいペプチドの存在下において、かつ、前記カップリング反応触媒酵素の存在下において実施される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記エステルまたはチオエステルが調製された後に、前記場合によりＣ−末端保護されていてもよいアミノ酸または前記場合によりＣ−末端保護されていてもよいペプチドが添加される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
調製されたエステルまたはチオエステルを最初に前記反応媒体から単離することなく、前記カップリングが実施される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
（ｉ）Ｎ−末端保護アミノ酸、Ｎ−末端保護アミノ酸Ｃ−末端エステル、Ｎ−末端保護ペプチド、またはＮ−末端保護ペプチドＣ−末端エステル、および
（ｉｉ）それぞれ式ＨＯ−ＣＸ２−Ｚで表されるアルコール、式ＨＳ−ＣＸ２−Ｚで表されるチオール
からエステルまたはチオエステルを酵素的に調製するステップであって、
各Ｘが独立してハロゲン原子または水素原子を表し、
Ｚがｓｐ３−混成炭素に直接付着するヘテロ原子を含んでなる少なくとも２個の置換基を含んでなるｓｐ３−混成炭素、およびｓｐ２−混成炭素に直接付着するヘテロ原子を含んでなる１または２個の置換基を含んでなるｓｐ２−混成炭素の群から選択され、
前記エステルまたはチオエステルの調製が、反応媒体中の液体の重量を基準として２重量％以下の水を含んでなる反応媒体中で実施される、ステップと、
前記調製されたエステルまたはチオエステルを、場合によりＣ−末端保護されていてもよいアミノ酸、または場合によりＣ−末端保護されていてもよいペプチドに酵素的にカップリングし、それによって反応媒体総重量を基準にして２重量％以下の水を含んでなる反応媒体中でペプチドを合成するステップと
を含んでなる、ペプチドを酵素的に合成する方法。
【請求項２】
前記カップリングが、前記エステルまたはチオエステルの調製を触媒するために使用される酵素の存在下で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記各エステルまたはチオエステルの調製前記カップリングがリパーゼ、エステラーゼ、およびプロテアーゼの群から選択される少なくとも１つの酵素によって触媒される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
プロテアーゼと、リパーゼおよびエステラーゼの群から選択される酵素とが使用され、これらの酵素の少なくとも１つが前記エステルまたはチオエステルの調製を触媒し、他方が少なくとも前記カップリングを触媒する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記エステルまたはチオエステルの調製および前記カップリングの双方が、リパーゼ、エステラーゼ、およびプロテアーゼの群から選択される単一酵素によって触媒される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）からの、好ましくはカンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）からのリパーゼ、特にカンジダ・アンタルクチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＢの群から選択されるリパーゼが使用される、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記プロテアーゼが、セリン型カルボキシペプチダーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、システイン型カルボキシペプチダーゼ、セリンエンドペプチダーゼ、システインエンドペプチダーゼ、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ、およびメタロエンドペプチダーゼの群から選択される、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記プロテアーゼが、サブチリシンの群から選択されるセリンエンドペプチダーゼ、好ましくはサブチリシンカールスバーグである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの固定化酵素が使用される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記エステルの調製および前記カップリングが、１．０重量％以下の水、特に０．５重量％以下の水、とりわけ０．１重量％以下の水を含んでなる反応媒体中で実施される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
Ｚが、カルバモイル基、トリフルオロメチル基またはトリクロロメチル基である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
双方のＸが水素を表す、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記エステルまたはチオエステルの調製が、調製されたエステルまたはチオエステルがそれにカップリングされる前記場合によりＣ−末端保護されていてもよいアミノ酸または前記場合によりＣ−末端保護されていてもよいペプチドの存在下において、かつ、前記カップリング反応触媒酵素の存在下において実施される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記エステルまたはチオエステルが調製された後に、前記場合によりＣ−末端保護されていてもよいアミノ酸または前記場合によりＣ−末端保護されていてもよいペプチドが添加される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
調製されたエステルまたはチオエステルを最初に前記反応媒体から単離することなく、前記カップリングが実施される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【公表番号】特表２０１２−５０９０８９（Ｐ２０１２−５０９０８９Ａ）
【公表日】平成２４年４月１９日（２０１２．４．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４３７７７（Ｐ２０１１−５４３７７７）
【出願日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６５５１２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５７９６１
【国際公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年４月１９日（２０１２．４．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６５５１２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５７９６１
【国際公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
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