酸化ストレスの判定方法
【課題】薬物投与によって組織障害や細胞の壊死を未然に防ぐことができ、各種薬剤の薬物生体反応学（pharmacokinetics）を考察する上でも有力なマーカーとなる、生体が受ける酸化ストレスを簡便かつ迅速に感知することができるバイオマーカーを提供すること。
【解決手段】生体試料中の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の濃度変動に応じて血中で変動する物質であるオフタルミン酸の血中濃度をキャピラリー電気泳動−質量分析計等の分析装置で測定することにより酸化ストレスか否かを判定する。また、抗酸化ストレス候補薬剤を、酸化ストレス状態にある非ヒト動物に投与し、オフタルミン酸の血中濃度を測定し、オフタルミン酸濃度の低下の程度を評価することにより、抗酸化ストレス剤をスクリーニングする。
【解決手段】生体試料中の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の濃度変動に応じて血中で変動する物質であるオフタルミン酸の血中濃度をキャピラリー電気泳動−質量分析計等の分析装置で測定することにより酸化ストレスか否かを判定する。また、抗酸化ストレス候補薬剤を、酸化ストレス状態にある非ヒト動物に投与し、オフタルミン酸の血中濃度を測定し、オフタルミン酸濃度の低下の程度を評価することにより、抗酸化ストレス剤をスクリーニングする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料中の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）濃度が酸化により変化することに応じて血中で変動する物質を測定する酸化ストレスの判定方法や、抗酸化ストレス剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体は外界から常にいろいろなストレスにさらされているが、そのストレスに抵抗するためいろいろな制御システムによって生体の恒常性を維持している。ストレスの中でも生体の内因性および外因性の原因により生じる活性酸素を生体が十分処理できなくなるために生じる酸化ストレスは代表的なものである。これに対して生体はレドックス制御と呼ばれる酸化還元状態を制御することによってストレスに対応し恒常性を維持するシステムを有する。このシステムは多くの外来性の因子、すなわち、薬剤、放射線、紫外線、環境汚染物質、高熱、低温、低酸素状態、感染症、さらにはガン、糖尿病、動脈硬化、高血圧、肥満などの生活習慣病で見られる酸化的ストレスに適応するように機能する。しかし、この制御機構がなんらかの原因によって破綻したり、十分な適応ができなくなると、酸化的ストレスを引き起こす。現在、細胞内のレドックス制御が機能しているかを簡便に捕らえたり、ストレスが起きたことを早期に検出できる分子マーカーが幾つか提唱されている。
【０００３】
例えば、抗体として酸化されたアポリポタンパク質ＡＩの酸化部位に特異的に反応する抗体と、アポリポタンパク質ＡＩに対する抗体との２種類の抗体を使用し、サンドイッチ法により試料中に存在する酸化されたアポリポタンパク質ＡＩを特異的に測定する、動脈硬化、糖尿病合併症（腎症、神経障害など）などの酸化ストレス関連疾患のメカニズムの解析または臨床診断に利用可能である生体内における酸化ストレスを検出する方法（例えば、特許文献１参照）や、生体内で発生する活性酸素及びフリーラジカルによる酸化損傷の大きさを示す酸化損傷項目（尿中における８−ハイドロキシ２’−デオキシグアノシンの体重当りの生成速度、尿中における８−エピプロスタグランジンＦ２αの体重当りの生成速度、血清中におけるコエンザイムＱ１０の酸化率及び血清中における過酸化脂質の含有量）を用いて計算される酸化損傷度を縦軸とし、生体内で発生する活性酸素及びフリーラジカルによる生体構成成分の酸化を抑制し、予防する抗酸化能力を示す抗酸化項目から計算される酸化防御能を横軸とした二次元座標であって、被験者の値を記入することができるようにした酸化ストレス特性の診断分析図等を利用する方法（例えば、特許文献２〜４参照）や、ジヒドロピリジン構造を特異的に認識する、生体内酸化ストレスに相関する物質を認識するモノクローナル抗体（例えば、特許文献５参照）が提案されている。しかし、血液や尿サンプルを用いて測定できる指標がほとんど確立されていないため、生体を酸化ストレスから未然に防ぐことが困難であった。
【０００４】
他方、キャピラリー電気泳動-質量分析装置（CE-MS）による試料中の代謝物質測定法による細胞内の代謝物質の網羅的な測定方法（例えば、非特許文献１参照）は、ヒトまたは動物の身体の状態をモニタリングするために、該ヒトまたは動物の身体由来の液体サンプルの低分子化合物（代謝物質）パターンおよび／またはペプチドパターンを、定性的かつ／または定量的に決定する方法であって、ここで、該液体サンプルの代謝物質およびペプチドは、キャピラリー電気泳動により分離され、次いで直接イオン化され、そしてオンラインでインターフェースを介して、接続された質量分析計で検出される。長期間にわたって該ヒトまたは動物の身体の状態をモニタリングするために、該状態を示す参照値およびサンプル値、ならびに該値から導かれた偏差および対応は、自動的にデータベースに記憶される。キャピラリー電気泳動と質量分析を組合せて陰イオン性化合物を分離分析する場合は、キャピラリーの内表面が予め陽イオン性にコーティングされたコーティングキャピラリーを用いて、電気浸透流を反転することを特徴とする陰イオン性化合物の分離分析方法（例えば、特許文献７参照）が知られている。
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−６９６７２号公報
【特許文献２】特開２００３−３１０６２１号公報
【特許文献３】特開２００３−３０２３９６号公報
【特許文献４】特表２００２−５１７７２４号公報
【特許文献５】特開平１１−８０１９８号公報
【特許文献６】特表２００３−５３２１１５号公報
【特許文献７】特許第３３４１７６５号公報
【非特許文献１】Soga, T.,Ohashi, Y., Ueno, Y., Naraoka, H., Tomita, M., and Nishioka, T., “Quantitative Metabolome Analysis Using Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry”, J. Proteome Res. 2. 488-494, 2003.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
生体のレドックス制御の主役である還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の濃度を血液レベルで測定できれば細胞内のレドックス制御状態を簡便かつ迅速に把握することが可能になる。しかし血中のＧＳＨ濃度は極微量であり、また容易に酸化されるため安定したデータの取得や検出は困難である。そこで、組織（細胞内）のＧＳＨの濃度変化に応じて変動する血中の物質を発見し、このバイオマーカー物質を測定することによってレドックス制御が機能しているか判断することが可能となる。この予兆バイオマーカーを用いることで生体が受ける酸化ストレスを迅速に感知できれば、薬物投与によって組織障害や細胞の壊死を未然に防ぐことが可能になる。また、探索で見出されるバイオマーカーは耐酸化ストレス薬剤の薬効の指標にもなるため、診断のみならず活性酸素消去剤などの創薬開発と効果判定にも威力を発揮する。また細胞内グルタチオンは薬物代謝に伴う抱合体生成と分泌により減少するため、各種薬剤の薬物生体反応学（pharmacokinetics）を考察する上でも有力なマーカーとなると考えられる。本発明の課題は、薬物投与によって組織障害や細胞の壊死を未然に防ぐことができ、各種薬剤の薬物生体反応学（pharmacokinetics）を考察する上でも有力なマーカーとなる、生体が受ける酸化ストレスを簡便かつ迅速に感知することができるバイオマーカーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
酸化ストレスを与える薬剤をマウスに投与し、マウスの肝臓および血液をキャピラリー電気泳動-質量分析計（CE-MS）や高速液体クロマトグラフィー-質量分析計（LC-MS）、ガスクロマトグラフィー-質量分析計（GC-MS）、単体のＣＥ、ＬＣ、ＧＣ、質量分析計(MS)、核磁気共鳴装置（NMR）等の分析計で測定することにより、レドックス制御の主役である肝臓中の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の濃度の摂動に関連して変動する血中のバイオマーカー候補物質を探索する。次にそのバイオマーカー候補物質の成分名を特定し、その物質が酸化ストレスによってＧＳＨと関連して変動するメカニズムを解明して、理論的なメカニズムの裏付けが得られれば酸化ストレスのバイオマーカーと考えることができる。そこで、本発明者らは、細胞内の代謝物質を網羅的に測定することが可能なキャピラリー電気泳動-質量分析計（CE-MS）等の方法を用いて、酸化ストレスを与える薬剤アセトアミノフェンをマウスに投与し、肝臓内のＧＳＨの濃度変動に応じて血中で変動する物質（バイオマーカー）としてオフタルミン酸を見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、（１）生体試料中の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の濃度変動に応じて血中で変動する物質であるオフタルミン酸の血中濃度を測定することを特徴とする酸化ストレスの判定方法や、（２）オフタルミン酸の血中濃度をキャピラリー電気泳動-質量分析計で測定することを特徴とする上記（１）記載の酸化ストレスの判定方法や、（３）酸化ストレスが、ガン、糖尿病、動脈硬化、肥満、肝炎、エイズ、アルツハイマー等に起因する酸化的ストレスであることを特徴とする上記（１）又は（２）記載の酸化ストレスの判定方法に関する。
【０００９】
また本発明は、（４）抗酸化ストレス候補薬剤を、酸化ストレス状態にある非ヒト動物に投与し、投与の前後における生体試料中の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の濃度変動に応じて血中で変動する物質であるオフタルミン酸の血中濃度を測定し、オフタルミン酸濃度の低下の程度を評価することを特徴とする抗酸化ストレス剤のスクリーニング方法や、（５）オフタルミン酸の血中濃度をキャピラリー電気泳動-質量分析計で測定することを特徴とする上記（４）記載の抗酸化ストレス剤のスクリーニング方法や、（６）抗酸化ストレス剤が、ガン、糖尿病、動脈硬化、肥満、肝炎、エイズ、アルツハイマー等に起因する酸化的ストレス関連の疾病の予防・治療薬であることを特徴とする上記（４）又は（５）記載の抗酸化ストレス剤のスクリーニング方法に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明で見い出した血中のオフタルミン酸（ophthalmate）は、薬剤、放射線、紫外線、環境汚染物質、高熱、低温、低酸素状態、感染症等によって引き起こされる酸化ストレスを迅速に感知し急増するため、酸化ストレスの判定・診断に有用であるばかりでなく、これらの酸化ストレスに対する薬剤の薬効マーカーとして使用できる。また、血中のオフタルミン酸はガン、糖尿病、動脈硬化、肥満、肝炎、エイズ、アルツハイマー等で見られる酸化的ストレスを感知できる可能性もあり、これらの疾病の早期発見にも使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の酸化ストレスの判定方法としては、生体試料中の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の濃度変動に応じて血中で変動する物質であるオフタルミン酸の血中濃度を測定する方法であれば特に制限されず、また本発明の抗酸化ストレス剤のスクリーニング方法としては、抗酸化ストレス候補薬剤を、酸化ストレス状態にある非ヒト動物に投与し、投与の前後における生体試料中の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の濃度変動に応じて血中で変動する物質であるオフタルミン酸の血中濃度を測定し、オフタルミン酸濃度の低下の程度を評価する方法であれば特に制限されず、上記非ヒト動物としては、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ等を例示することができる。
【００１２】
生体試料中の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の濃度変動に応じて血中で変動する物質であるオフタルミン酸、γ−Ｇｌｕ−２−アミノ酪酸、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）等の中でもオフタルミン酸の血中濃度、例えば血清中の濃度を測定することにより、感度よく酸化ストレスを判定したり、あるいは感度よく抗酸化ストレス剤をスクリーニングすることができる。
【００１３】
オフタルミン酸の血中濃度を測定する方法としては特に制限されないが、キャピラリー電気泳動-質量分析計（CE-MS）、高速液体クロマトグラフィー-質量分析計（LC-MS）、ガスクロマトグラフィー-質量分析計（GC-MS）、単体のＣＥ、ＬＣ、ＧＣ、質量分析計(MS)、核磁気共鳴装置（NMR）等の分析計で測定する方法を例示することができ、中でもキャピラリー電気泳動-飛行時間型質量分析装置（CE-TOFMS）で測定する方法が好ましい。キャピラリー電気泳動-飛行時間型質量分析装置による血中のオフタルミン酸の測定は、前記の非特許文献１記載の方法に準じて、あるいは後述する実施例記載の方法により行うことができる。
【００１４】
本発明の酸化ストレスの判定方法をより具体的に説明すると、対象被検者から血液を採取し、分離した血清をサンプルとし、ＣＥ-ＴＯＦＭＳ等を用いてサンプル中のオフタルミン酸濃度を測定し、その値が、当該対象被検者の正常時期（酸化ストレスがかかっていなかった時期）の値、あるいは、酸化ストレスのない正常人の値と比較して、有意に高かったときは酸化ストレスがかかっていると判定されることになる。
【００１５】
酸化ストレスがかかっていると判定された場合、酸化的ストレス関連の疾病の疑いがあり、かかる疾病としては、ガン、糖尿病、動脈硬化、肥満、肝炎、エイズ、アルツハイマー病、パーキンソン病、アポトーシス、炎症反応、ぜん息、湿疹、高骨容量症候群（high bone mass syndrome）、大理石骨病、骨粗しょう症−偽性神経膠腫症候群、胃潰瘍、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎等の消化器系疾患、高血圧症、狭心症、心筋梗塞、心筋症、慢性関節リウマチ、片頭痛、緊張性頭痛等の筋骨格系の疾患、気管支喘息、過呼吸症候群等の呼吸器系の疾患、種々の糖尿病合併症、脳神経疾患等を例示することができる。
【００１６】
本発明の抗酸化ストレス剤のスクリーニング方法をより具体的に説明すると、抗酸化ストレス候補薬剤を、酸化ストレス状態にあるマウス等の非ヒト動物に投与し、投与の前後における血清中のオフタルミン酸の濃度を、ＣＥ-ＴＯＦＭＳ等を用いて測定し、投与前と比較して投与後におけるオフタルミン酸の血清中の濃度が有意に減少している場合、前記抗酸化ストレス候補薬剤は、抗酸化ストレス剤として使用しうる可能性がある。このスクリーニングされた抗酸化ストレス候補薬剤を、正常状態にあるマウス等の非ヒト動物に投与し、投与の前後における血清中のオフタルミン酸の濃度が変わらないものをさらに選択することが好ましい。
【００１７】
上記抗酸化ストレス候補薬剤の非ヒト動物への投与方法としては、注射（静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内等）、経口、経皮、吸入などを挙げることができ、これらの投与方法に応じて適宜製剤化することができる。また、選択し得る剤形も特に限定されず、例えば注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等）、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、リポ化剤、軟膏剤、ゲル剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤等から広く選択することができる。また、これらの製剤調製にあたり、慣用の賦形剤、安定化剤、結合剤、滑沢剤、乳化剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、その他着色剤、崩壊剤等、通常医薬に用いられる成分を使用することができる。また、投与量も適宜選択することができる。
【００１８】
マウス等の非ヒト哺乳動物を酸化ストレス状態にする方法としては、アセトアミノフェン等の酸化ストレスを与える薬剤の投与、放射線・紫外線の照射、環境汚染物質による感染症への罹患、高熱・低温・低酸素状態や水浸拘束等の物理的悪環境下への暴露などを例示することができる。
【００１９】
本発明のスクリーニング方法によると、酸化的ストレス関連の疾病、例えば、ガン、糖尿病、動脈硬化、肥満、肝炎、エイズ、アルツハイマー病、パーキンソン病、アポトーシス、炎症反応、ぜん息、湿疹、高骨容量症候群（high bone mass syndrome）、大理石骨病、骨粗しょう症−偽性神経膠腫症候群、胃潰瘍、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎等の消化器系疾患、高血圧症、狭心症、心筋梗塞、心筋症、慢性関節リウマチ、片頭痛、緊張性頭痛等の筋骨格系の疾患、気管支喘息、過呼吸症候群等の呼吸器系の疾患、種々の糖尿病合併症、脳神経疾患等に有効な抗酸化ストレス剤を得ることができる。
【００２０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２１】
（ＡＡＰ投与またはコントロールマウスから試料調整）
一晩絶食させたオスのマウスにペントバルビタルナトリウム（体重１Ｋｇ当たり６０ｍｇ）を腹膜内注射して麻酔後、酸化ストレスを与える薬剤アセトアミノフェン（ＡＡＰ）またはコントロールとして生理食塩水を（体重１Ｋｇ当たり１５０ｍｇ）を注射した。ＡＡＰ投与１，２，４，６，１２，２４時間後のマウスから肝臓（約３００ｍｇ）および血清（２００μｌ）を採取した。
【実施例２】
【００２２】
（肝臓から代謝物質の抽出）
マウスから摘出した肝臓（約３００ｍｇ）は直ちに内部標準物質入りのメタノール１ｍｌに入れ、ホモジナイズし、酵素を失活させ、代謝の亢進を止めた。５００μｌの純水を加えた後、３００μｌの溶液を取り出し、２００μｌのクロロホルムを加え良く攪拌後、さらに４℃で１５分間、１５０００ｒｐｍで遠心した。静置後、分離した水−メタノール相３００μｌを分画分子量５ｋＤａの遠心限外ろ過フィルターを通過し、除タンパクした。ろ液を凍結乾燥後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水５０μｌを加え、それをＣＥ-ＭＳ（CE-TOFMS）測定に供した。
【実施例３】
【００２３】
（血清から代謝物質の抽出）
血清２００μｌを内部標準物質入りのメタノール１．８ｍｌに入れ攪拌後、８００μｌの純水および２ｍｌのクロロホルムを加え、４℃で５分間、５０００ｒｐｍで遠心した。静置後、分離した水−メタノール相８００μｌを分画分子量５ｋＤａの遠心限外ろ過フィルターを通過し、除タンパクした。ろ液を凍結乾燥後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水５０μｌを加え、それをＣＥ-ＭＳ（CE-TOFMS）測定に用いた。
【実施例４】
【００２４】
（キャピラリー電気泳動-飛行時間型質量分析装置（CE-TOFMS）による試料中の代謝物質測定）
ＣＥ-ＴＯＦＭＳを用いて陽イオン測定条件および陰イオン測定条件で質量数１０００以下の代謝物質を網羅的に測定した。
（１）陽イオン性代謝物質測定条件
１）キャピラリー電気泳動（CE）の分析条件
キャピラリーには、フューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、外径３５０μｍ、全長１００ｃｍ）を用いた。緩衝液には、１Ｍギ酸（ｐＨ約１．８）を用いた。印加電圧は、＋３０ｋＶ、キャピラリー温度は２０℃で測定した。試料は、加圧法を用いて５０ｍｂａｒで３秒間注入した。
２）飛行時間型質量分析計（TOFMS）の分析条件
正イオンモードを用い、イオン化電圧は４ｋＶ、フラグメンター電圧は７５Ｖ、スキマー電圧は５０Ｖ、ＯｃｔＲＦＶ電圧は１２５Ｖに設定した。乾燥ガスには窒素を使用し、温度３００℃、圧力１０ｐｓｉｇに設定した。シース液は５０％メタノール溶液を用い、質量較正用にレゼルピン（ｍ/ｚ ６０９．２８０７）を０．５μＭとなるよう混入し１０μ/ｍｉｎで送液した。レゼルピン（ｍ/ｚ ６０９．２８０７）とメタノールのアダクトイオン（ｍ/ｚ８３．０７０３）の質量数を用いて得られた全てのデータを自動較正した。
【００２５】
（２）陰イオン性代謝物質測定条件
１）キャピラリー電気泳動（CE）の分析条件
キャピラリーには、ＳＭＩＬＥ（＋）キャピラリー（内径５０μｍ、外径３５０μｍ、全長１００ｃｍ）を用いた。緩衝液には、５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ８．５）を用いた。印加電圧は、−３０ｋＶ、キャピラリー温度は２０℃で測定した。試料は、加圧法を用いて５０ｍｂａｒで３０秒間注入した。
２）飛行時間型質量分析計（TOFMS）の分析条件
負イオンモードを用い、イオン化電圧は３．５ｋＶ、フラグメンター電圧は１００Ｖ、スキマー電圧は５０Ｖ、ＯｃｔＲＦＶ電圧は２００Ｖに設定した。乾燥ガスには窒素を使用し、温度３００℃、圧力１０ｐｓｉｇに設定した。シース液は５ｍＭ酢酸アンモニウム−５０％メタノール溶液を用い、質量較正用に２０μＭＰＩＰＥＳおよび１μＭレゼルピン（ｍ/ｚ ６０９．２８０７）を加え１０μ/ｍｉｎで送液した。レゼルピン（ｍ/ｚ ６０９．２８０７）とＰＩＰＥＳの１価（ｍ/ｚ３０１．０５３４）と２価（ｍ/ｚ１５０．０２３０）の質量数を用いて得られた全てのデータを自動較正した。
【実施例５】
【００２６】
（酸化ストレス、薬物ストレスのバイオマーカーとしてのオフタルミン酸の発見）
酸化ストレスを与える薬剤ＡＡＰをマウスに過剰投与し、肝臓細胞の壊死を引き起したマウスとコントロールのマウスの肝臓および血液から経時的に代謝物質を抽出し、それをキャピラリー電気泳動-質量分析計（CE-MS）等で網羅的に定量分析した。ＡＡＰ投与２時間後に肝細胞の壊死が観察された。図１にコントロールとＡＡＰ投与２時間マウスの肝臓中で増減した成分を示した。赤で示した点はＡＡＰ投与２時間後のマウスで増加した物質、青は減少した物質を示す。極端に減少した物質はＧＳＨ、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）である。また成分名は未知であるが、ＧＳＨと同じ時間に検出された質量数２９０の物質がＡＡＰ投与によって増加した。この物質はＣＥ-ＴＯＦＭＳで得られた精密質量およびＣＥ-ＭＳ/ＭＳで得られた構造情報より、ＧＳＨ（γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ）の真ん中のＣｙｓが２−アミノ酪酸（２−aminobutyrate）（２ＡＢ）に置き換わったオフタルミン酸（γ−Ｇｌｕ−２ＡＢｓ−Ｇｌｙ）であることが推測された。オフタルミン酸の標品を入手し、未知物質と比較検討した結果、未知物質は予想どおりオフタルミン酸であった。
【００２７】
ＡＡＰ投与による肝細胞の壊死は、図２Ａに示したようにＡＡＰの一部がチトクロム（cytochome）Ｐ４５０によって代謝され、毒性物質ＮＡＰＱＩを生産し、それが多くのタンパク質のＳＨ基に結合（酸化）するためである。通常はＧＳＨがＮＡＰＱＩに結合し、ＮＡＰＱＩを尿中に排泄する。しかしＧＳＨが枯渇すると、ＮＡＰＱＩはタンパク質と結合し、細胞の壊死を引き起こす。ＣＥ-ＴＯＦＭＳによって測定した各代謝物質の濃度変動（図２Ａ）を比較するとコントロールに比べＡＡＰ投与２時間後のマウスの肝臓ではグルタチオン生合成経路の物質が軒並み減少した。一方グルタチオン合成経路にある酵素グルタミルシステインシンテターゼ（ＧＣＳ）とグルタチオンシンテターゼ（ＧＳ）によって生産されるγ−Ｇｌｕ−２−アミノ酪酸（γ−Ｇｌｕ−２ＡＢ）とオフタルミン酸が増加することが確認された。
【００２８】
さらに、本発明者らはＧＣＳを阻害するＢＳＯ（buthionine sulfoximine）とＡＡＰ同様に酸化ストレスを与える薬剤ＤＥＭ（diethylmaleate）をマウスに投与してこの代謝メカニズムを解明した。ＢＳＯはＧＳＨのフィードバック阻害を受けなおかつグルタチオン合成経路の律速酵素であるＧＣＳの活性を阻害する。したがってＧＣＳの下流にある代謝物質γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、ＧＳＨ（図２Ａ）、γ−Ｇｌｕ−２ＡＢ、オフタルミン酸（図２Ｂ）は大幅に減少した。またＤＥＭ投与ではＡＡＰと同様にＧＳＨの枯渇、γ−Ｇｌｕ−２ＡＢ、オフタルミン酸の増加が観察された（図３）。これらの結果より、ＡＡＰ投与によるＧＳＨの枯渇によってＧＣＳが活性化され、２ＡＢを基質にしてγ−Ｇｌｕ−２ＡＢさらにオフタルミン酸が生合成されたことが確認された（図２Ｂ）。ＧＣＳの活性化により、Ｃｙｓを基質にしてＧＳＨも合成されるが、１）ＧＳＨはＮＡＱＰＩと反応し消費される、２）Ｃｙｓが少ないためＧＳＨが合成されない、どちらかの理由でＧＳＨ量は回復しない。しかし、オフタルミン酸はＧＳＨのようにＮＡＰＱＩと反応しないために細胞内に蓄積した。またＧＳＳＧはＧＳＨとほぼ同じ変動傾向を示した。
【００２９】
この結果からＡＡＰやＤＥＭによる酸化ストレスによるＧＳＨの減少に反応して肝臓内のＧＳＳＧ、γ−Ｇｌｕ−２ＡＢ、オフタルミン酸が大きく変動することが判明した。もし血液中のこれらの物質もＧＳＨの減少に反応すればバイオマーカーとして使用することができる。そこで、ＡＡＰをマウスに投与して１，２，４，６，１２，２４時間後の肝臓および血清中のこれらの物質の濃度を測定、比較した（図４）。
【００３０】
肝臓のＧＳＨはＡＡＰ投与後肝細胞の壊死がおきる１時間後、２時間後で急激に減少した。しかし血清からはＧＳＨは検出されなかった。ＧＳＳＧは肝臓、血清中で肝臓中のＧＳＨと似た挙動を示した。オフタルミン酸は肝臓、血清中で肝臓中ＧＳＨと反対の挙動を示した。またオフタルミン酸は肝臓のＧＳＨが急激に減少した１時間後、２時間後で劇的に増加しコントロールのマウスとの統計的有意差も大きかった。以上のことから血中のオフタルミン酸は濃度も高く、肝臓のＧＳＨの減少を感知して急激に増加するため、肝臓内のレドックス制御状態を反映する有効なバイオマーカーであることが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】コントロールとＡＡＰ投与２時間後のマウスの肝臓で変動した代謝物質を示す図である。ＡＡＰ投与後２時間で増加した成分は赤、減少した成分は青で示した。
【図２】コントロールとＡＡＰ投与２時間後のマウスの肝臓中代謝物質の定量値を示す図である。コントロールマウスの代謝の定量値は青、ＡＡＰ投与後２時間は赤で示した。コントロールのマウスとＡＡＰ投与マウスの定量値のＴ検定結果（＊＊＊ｐ＜０．００１，＊＊ｐ＜０．０１，＊ｐ＜０．０５）。Ａ）ＡＡＰ代謝経路の物質。 Ｂ）オフタルミン酸生合成経路の物質。
【図３】コントロールとＢＳＯおよびＤＥＭ投与２時間後のマウスの肝臓中の代謝物質の定量値を示す図である。コントロールのマウスと薬物投与マウスの定量値の統計的有意差検定（Ｔ検定）結果（＊＊＊ｐ＜０．００１，＊＊ｐ＜０．０１，＊ｐ＜０．０５）。
【図４】ＡＡＰ投与後のマウスのＡ）肝臓およびＢ）血清中の代謝物定量値の経時変化を示す図である。コントロールの定量値に対するＴ検定結果（＊＊＊ｐ＜０．００１，＊＊ｐ＜０．０１，＊ｐ＜０．０５）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料中の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）濃度が酸化により変化することに応じて血中で変動する物質を測定する酸化ストレスの判定方法や、抗酸化ストレス剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体は外界から常にいろいろなストレスにさらされているが、そのストレスに抵抗するためいろいろな制御システムによって生体の恒常性を維持している。ストレスの中でも生体の内因性および外因性の原因により生じる活性酸素を生体が十分処理できなくなるために生じる酸化ストレスは代表的なものである。これに対して生体はレドックス制御と呼ばれる酸化還元状態を制御することによってストレスに対応し恒常性を維持するシステムを有する。このシステムは多くの外来性の因子、すなわち、薬剤、放射線、紫外線、環境汚染物質、高熱、低温、低酸素状態、感染症、さらにはガン、糖尿病、動脈硬化、高血圧、肥満などの生活習慣病で見られる酸化的ストレスに適応するように機能する。しかし、この制御機構がなんらかの原因によって破綻したり、十分な適応ができなくなると、酸化的ストレスを引き起こす。現在、細胞内のレドックス制御が機能しているかを簡便に捕らえたり、ストレスが起きたことを早期に検出できる分子マーカーが幾つか提唱されている。
【０００３】
例えば、抗体として酸化されたアポリポタンパク質ＡＩの酸化部位に特異的に反応する抗体と、アポリポタンパク質ＡＩに対する抗体との２種類の抗体を使用し、サンドイッチ法により試料中に存在する酸化されたアポリポタンパク質ＡＩを特異的に測定する、動脈硬化、糖尿病合併症（腎症、神経障害など）などの酸化ストレス関連疾患のメカニズムの解析または臨床診断に利用可能である生体内における酸化ストレスを検出する方法（例えば、特許文献１参照）や、生体内で発生する活性酸素及びフリーラジカルによる酸化損傷の大きさを示す酸化損傷項目（尿中における８−ハイドロキシ２’−デオキシグアノシンの体重当りの生成速度、尿中における８−エピプロスタグランジンＦ２αの体重当りの生成速度、血清中におけるコエンザイムＱ１０の酸化率及び血清中における過酸化脂質の含有量）を用いて計算される酸化損傷度を縦軸とし、生体内で発生する活性酸素及びフリーラジカルによる生体構成成分の酸化を抑制し、予防する抗酸化能力を示す抗酸化項目から計算される酸化防御能を横軸とした二次元座標であって、被験者の値を記入することができるようにした酸化ストレス特性の診断分析図等を利用する方法（例えば、特許文献２〜４参照）や、ジヒドロピリジン構造を特異的に認識する、生体内酸化ストレスに相関する物質を認識するモノクローナル抗体（例えば、特許文献５参照）が提案されている。しかし、血液や尿サンプルを用いて測定できる指標がほとんど確立されていないため、生体を酸化ストレスから未然に防ぐことが困難であった。
【０００４】
他方、キャピラリー電気泳動-質量分析装置（CE-MS）による試料中の代謝物質測定法による細胞内の代謝物質の網羅的な測定方法（例えば、非特許文献１参照）は、ヒトまたは動物の身体の状態をモニタリングするために、該ヒトまたは動物の身体由来の液体サンプルの低分子化合物（代謝物質）パターンおよび／またはペプチドパターンを、定性的かつ／または定量的に決定する方法であって、ここで、該液体サンプルの代謝物質およびペプチドは、キャピラリー電気泳動により分離され、次いで直接イオン化され、そしてオンラインでインターフェースを介して、接続された質量分析計で検出される。長期間にわたって該ヒトまたは動物の身体の状態をモニタリングするために、該状態を示す参照値およびサンプル値、ならびに該値から導かれた偏差および対応は、自動的にデータベースに記憶される。キャピラリー電気泳動と質量分析を組合せて陰イオン性化合物を分離分析する場合は、キャピラリーの内表面が予め陽イオン性にコーティングされたコーティングキャピラリーを用いて、電気浸透流を反転することを特徴とする陰イオン性化合物の分離分析方法（例えば、特許文献７参照）が知られている。
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−６９６７２号公報
【特許文献２】特開２００３−３１０６２１号公報
【特許文献３】特開２００３−３０２３９６号公報
【特許文献４】特表２００２−５１７７２４号公報
【特許文献５】特開平１１−８０１９８号公報
【特許文献６】特表２００３−５３２１１５号公報
【特許文献７】特許第３３４１７６５号公報
【非特許文献１】Soga, T.,Ohashi, Y., Ueno, Y., Naraoka, H., Tomita, M., and Nishioka, T., “Quantitative Metabolome Analysis Using Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry”, J. Proteome Res. 2. 488-494, 2003.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
生体のレドックス制御の主役である還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の濃度を血液レベルで測定できれば細胞内のレドックス制御状態を簡便かつ迅速に把握することが可能になる。しかし血中のＧＳＨ濃度は極微量であり、また容易に酸化されるため安定したデータの取得や検出は困難である。そこで、組織（細胞内）のＧＳＨの濃度変化に応じて変動する血中の物質を発見し、このバイオマーカー物質を測定することによってレドックス制御が機能しているか判断することが可能となる。この予兆バイオマーカーを用いることで生体が受ける酸化ストレスを迅速に感知できれば、薬物投与によって組織障害や細胞の壊死を未然に防ぐことが可能になる。また、探索で見出されるバイオマーカーは耐酸化ストレス薬剤の薬効の指標にもなるため、診断のみならず活性酸素消去剤などの創薬開発と効果判定にも威力を発揮する。また細胞内グルタチオンは薬物代謝に伴う抱合体生成と分泌により減少するため、各種薬剤の薬物生体反応学（pharmacokinetics）を考察する上でも有力なマーカーとなると考えられる。本発明の課題は、薬物投与によって組織障害や細胞の壊死を未然に防ぐことができ、各種薬剤の薬物生体反応学（pharmacokinetics）を考察する上でも有力なマーカーとなる、生体が受ける酸化ストレスを簡便かつ迅速に感知することができるバイオマーカーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
酸化ストレスを与える薬剤をマウスに投与し、マウスの肝臓および血液をキャピラリー電気泳動-質量分析計（CE-MS）や高速液体クロマトグラフィー-質量分析計（LC-MS）、ガスクロマトグラフィー-質量分析計（GC-MS）、単体のＣＥ、ＬＣ、ＧＣ、質量分析計(MS)、核磁気共鳴装置（NMR）等の分析計で測定することにより、レドックス制御の主役である肝臓中の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の濃度の摂動に関連して変動する血中のバイオマーカー候補物質を探索する。次にそのバイオマーカー候補物質の成分名を特定し、その物質が酸化ストレスによってＧＳＨと関連して変動するメカニズムを解明して、理論的なメカニズムの裏付けが得られれば酸化ストレスのバイオマーカーと考えることができる。そこで、本発明者らは、細胞内の代謝物質を網羅的に測定することが可能なキャピラリー電気泳動-質量分析計（CE-MS）等の方法を用いて、酸化ストレスを与える薬剤アセトアミノフェンをマウスに投与し、肝臓内のＧＳＨの濃度変動に応じて血中で変動する物質（バイオマーカー）としてオフタルミン酸を見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、（１）生体試料中の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の濃度変動に応じて血中で変動する物質であるオフタルミン酸の血中濃度を測定することを特徴とする酸化ストレスの判定方法や、（２）オフタルミン酸の血中濃度をキャピラリー電気泳動-質量分析計で測定することを特徴とする上記（１）記載の酸化ストレスの判定方法や、（３）酸化ストレスが、ガン、糖尿病、動脈硬化、肥満、肝炎、エイズ、アルツハイマー等に起因する酸化的ストレスであることを特徴とする上記（１）又は（２）記載の酸化ストレスの判定方法に関する。
【０００９】
また本発明は、（４）抗酸化ストレス候補薬剤を、酸化ストレス状態にある非ヒト動物に投与し、投与の前後における生体試料中の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の濃度変動に応じて血中で変動する物質であるオフタルミン酸の血中濃度を測定し、オフタルミン酸濃度の低下の程度を評価することを特徴とする抗酸化ストレス剤のスクリーニング方法や、（５）オフタルミン酸の血中濃度をキャピラリー電気泳動-質量分析計で測定することを特徴とする上記（４）記載の抗酸化ストレス剤のスクリーニング方法や、（６）抗酸化ストレス剤が、ガン、糖尿病、動脈硬化、肥満、肝炎、エイズ、アルツハイマー等に起因する酸化的ストレス関連の疾病の予防・治療薬であることを特徴とする上記（４）又は（５）記載の抗酸化ストレス剤のスクリーニング方法に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明で見い出した血中のオフタルミン酸（ophthalmate）は、薬剤、放射線、紫外線、環境汚染物質、高熱、低温、低酸素状態、感染症等によって引き起こされる酸化ストレスを迅速に感知し急増するため、酸化ストレスの判定・診断に有用であるばかりでなく、これらの酸化ストレスに対する薬剤の薬効マーカーとして使用できる。また、血中のオフタルミン酸はガン、糖尿病、動脈硬化、肥満、肝炎、エイズ、アルツハイマー等で見られる酸化的ストレスを感知できる可能性もあり、これらの疾病の早期発見にも使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の酸化ストレスの判定方法としては、生体試料中の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の濃度変動に応じて血中で変動する物質であるオフタルミン酸の血中濃度を測定する方法であれば特に制限されず、また本発明の抗酸化ストレス剤のスクリーニング方法としては、抗酸化ストレス候補薬剤を、酸化ストレス状態にある非ヒト動物に投与し、投与の前後における生体試料中の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の濃度変動に応じて血中で変動する物質であるオフタルミン酸の血中濃度を測定し、オフタルミン酸濃度の低下の程度を評価する方法であれば特に制限されず、上記非ヒト動物としては、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ等を例示することができる。
【００１２】
生体試料中の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の濃度変動に応じて血中で変動する物質であるオフタルミン酸、γ−Ｇｌｕ−２−アミノ酪酸、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）等の中でもオフタルミン酸の血中濃度、例えば血清中の濃度を測定することにより、感度よく酸化ストレスを判定したり、あるいは感度よく抗酸化ストレス剤をスクリーニングすることができる。
【００１３】
オフタルミン酸の血中濃度を測定する方法としては特に制限されないが、キャピラリー電気泳動-質量分析計（CE-MS）、高速液体クロマトグラフィー-質量分析計（LC-MS）、ガスクロマトグラフィー-質量分析計（GC-MS）、単体のＣＥ、ＬＣ、ＧＣ、質量分析計(MS)、核磁気共鳴装置（NMR）等の分析計で測定する方法を例示することができ、中でもキャピラリー電気泳動-飛行時間型質量分析装置（CE-TOFMS）で測定する方法が好ましい。キャピラリー電気泳動-飛行時間型質量分析装置による血中のオフタルミン酸の測定は、前記の非特許文献１記載の方法に準じて、あるいは後述する実施例記載の方法により行うことができる。
【００１４】
本発明の酸化ストレスの判定方法をより具体的に説明すると、対象被検者から血液を採取し、分離した血清をサンプルとし、ＣＥ-ＴＯＦＭＳ等を用いてサンプル中のオフタルミン酸濃度を測定し、その値が、当該対象被検者の正常時期（酸化ストレスがかかっていなかった時期）の値、あるいは、酸化ストレスのない正常人の値と比較して、有意に高かったときは酸化ストレスがかかっていると判定されることになる。
【００１５】
酸化ストレスがかかっていると判定された場合、酸化的ストレス関連の疾病の疑いがあり、かかる疾病としては、ガン、糖尿病、動脈硬化、肥満、肝炎、エイズ、アルツハイマー病、パーキンソン病、アポトーシス、炎症反応、ぜん息、湿疹、高骨容量症候群（high bone mass syndrome）、大理石骨病、骨粗しょう症−偽性神経膠腫症候群、胃潰瘍、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎等の消化器系疾患、高血圧症、狭心症、心筋梗塞、心筋症、慢性関節リウマチ、片頭痛、緊張性頭痛等の筋骨格系の疾患、気管支喘息、過呼吸症候群等の呼吸器系の疾患、種々の糖尿病合併症、脳神経疾患等を例示することができる。
【００１６】
本発明の抗酸化ストレス剤のスクリーニング方法をより具体的に説明すると、抗酸化ストレス候補薬剤を、酸化ストレス状態にあるマウス等の非ヒト動物に投与し、投与の前後における血清中のオフタルミン酸の濃度を、ＣＥ-ＴＯＦＭＳ等を用いて測定し、投与前と比較して投与後におけるオフタルミン酸の血清中の濃度が有意に減少している場合、前記抗酸化ストレス候補薬剤は、抗酸化ストレス剤として使用しうる可能性がある。このスクリーニングされた抗酸化ストレス候補薬剤を、正常状態にあるマウス等の非ヒト動物に投与し、投与の前後における血清中のオフタルミン酸の濃度が変わらないものをさらに選択することが好ましい。
【００１７】
上記抗酸化ストレス候補薬剤の非ヒト動物への投与方法としては、注射（静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内等）、経口、経皮、吸入などを挙げることができ、これらの投与方法に応じて適宜製剤化することができる。また、選択し得る剤形も特に限定されず、例えば注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等）、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、リポ化剤、軟膏剤、ゲル剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤等から広く選択することができる。また、これらの製剤調製にあたり、慣用の賦形剤、安定化剤、結合剤、滑沢剤、乳化剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、その他着色剤、崩壊剤等、通常医薬に用いられる成分を使用することができる。また、投与量も適宜選択することができる。
【００１８】
マウス等の非ヒト哺乳動物を酸化ストレス状態にする方法としては、アセトアミノフェン等の酸化ストレスを与える薬剤の投与、放射線・紫外線の照射、環境汚染物質による感染症への罹患、高熱・低温・低酸素状態や水浸拘束等の物理的悪環境下への暴露などを例示することができる。
【００１９】
本発明のスクリーニング方法によると、酸化的ストレス関連の疾病、例えば、ガン、糖尿病、動脈硬化、肥満、肝炎、エイズ、アルツハイマー病、パーキンソン病、アポトーシス、炎症反応、ぜん息、湿疹、高骨容量症候群（high bone mass syndrome）、大理石骨病、骨粗しょう症−偽性神経膠腫症候群、胃潰瘍、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎等の消化器系疾患、高血圧症、狭心症、心筋梗塞、心筋症、慢性関節リウマチ、片頭痛、緊張性頭痛等の筋骨格系の疾患、気管支喘息、過呼吸症候群等の呼吸器系の疾患、種々の糖尿病合併症、脳神経疾患等に有効な抗酸化ストレス剤を得ることができる。
【００２０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２１】
（ＡＡＰ投与またはコントロールマウスから試料調整）
一晩絶食させたオスのマウスにペントバルビタルナトリウム（体重１Ｋｇ当たり６０ｍｇ）を腹膜内注射して麻酔後、酸化ストレスを与える薬剤アセトアミノフェン（ＡＡＰ）またはコントロールとして生理食塩水を（体重１Ｋｇ当たり１５０ｍｇ）を注射した。ＡＡＰ投与１，２，４，６，１２，２４時間後のマウスから肝臓（約３００ｍｇ）および血清（２００μｌ）を採取した。
【実施例２】
【００２２】
（肝臓から代謝物質の抽出）
マウスから摘出した肝臓（約３００ｍｇ）は直ちに内部標準物質入りのメタノール１ｍｌに入れ、ホモジナイズし、酵素を失活させ、代謝の亢進を止めた。５００μｌの純水を加えた後、３００μｌの溶液を取り出し、２００μｌのクロロホルムを加え良く攪拌後、さらに４℃で１５分間、１５０００ｒｐｍで遠心した。静置後、分離した水−メタノール相３００μｌを分画分子量５ｋＤａの遠心限外ろ過フィルターを通過し、除タンパクした。ろ液を凍結乾燥後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水５０μｌを加え、それをＣＥ-ＭＳ（CE-TOFMS）測定に供した。
【実施例３】
【００２３】
（血清から代謝物質の抽出）
血清２００μｌを内部標準物質入りのメタノール１．８ｍｌに入れ攪拌後、８００μｌの純水および２ｍｌのクロロホルムを加え、４℃で５分間、５０００ｒｐｍで遠心した。静置後、分離した水−メタノール相８００μｌを分画分子量５ｋＤａの遠心限外ろ過フィルターを通過し、除タンパクした。ろ液を凍結乾燥後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水５０μｌを加え、それをＣＥ-ＭＳ（CE-TOFMS）測定に用いた。
【実施例４】
【００２４】
（キャピラリー電気泳動-飛行時間型質量分析装置（CE-TOFMS）による試料中の代謝物質測定）
ＣＥ-ＴＯＦＭＳを用いて陽イオン測定条件および陰イオン測定条件で質量数１０００以下の代謝物質を網羅的に測定した。
（１）陽イオン性代謝物質測定条件
１）キャピラリー電気泳動（CE）の分析条件
キャピラリーには、フューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、外径３５０μｍ、全長１００ｃｍ）を用いた。緩衝液には、１Ｍギ酸（ｐＨ約１．８）を用いた。印加電圧は、＋３０ｋＶ、キャピラリー温度は２０℃で測定した。試料は、加圧法を用いて５０ｍｂａｒで３秒間注入した。
２）飛行時間型質量分析計（TOFMS）の分析条件
正イオンモードを用い、イオン化電圧は４ｋＶ、フラグメンター電圧は７５Ｖ、スキマー電圧は５０Ｖ、ＯｃｔＲＦＶ電圧は１２５Ｖに設定した。乾燥ガスには窒素を使用し、温度３００℃、圧力１０ｐｓｉｇに設定した。シース液は５０％メタノール溶液を用い、質量較正用にレゼルピン（ｍ/ｚ ６０９．２８０７）を０．５μＭとなるよう混入し１０μ/ｍｉｎで送液した。レゼルピン（ｍ/ｚ ６０９．２８０７）とメタノールのアダクトイオン（ｍ/ｚ８３．０７０３）の質量数を用いて得られた全てのデータを自動較正した。
【００２５】
（２）陰イオン性代謝物質測定条件
１）キャピラリー電気泳動（CE）の分析条件
キャピラリーには、ＳＭＩＬＥ（＋）キャピラリー（内径５０μｍ、外径３５０μｍ、全長１００ｃｍ）を用いた。緩衝液には、５０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ８．５）を用いた。印加電圧は、−３０ｋＶ、キャピラリー温度は２０℃で測定した。試料は、加圧法を用いて５０ｍｂａｒで３０秒間注入した。
２）飛行時間型質量分析計（TOFMS）の分析条件
負イオンモードを用い、イオン化電圧は３．５ｋＶ、フラグメンター電圧は１００Ｖ、スキマー電圧は５０Ｖ、ＯｃｔＲＦＶ電圧は２００Ｖに設定した。乾燥ガスには窒素を使用し、温度３００℃、圧力１０ｐｓｉｇに設定した。シース液は５ｍＭ酢酸アンモニウム−５０％メタノール溶液を用い、質量較正用に２０μＭＰＩＰＥＳおよび１μＭレゼルピン（ｍ/ｚ ６０９．２８０７）を加え１０μ/ｍｉｎで送液した。レゼルピン（ｍ/ｚ ６０９．２８０７）とＰＩＰＥＳの１価（ｍ/ｚ３０１．０５３４）と２価（ｍ/ｚ１５０．０２３０）の質量数を用いて得られた全てのデータを自動較正した。
【実施例５】
【００２６】
（酸化ストレス、薬物ストレスのバイオマーカーとしてのオフタルミン酸の発見）
酸化ストレスを与える薬剤ＡＡＰをマウスに過剰投与し、肝臓細胞の壊死を引き起したマウスとコントロールのマウスの肝臓および血液から経時的に代謝物質を抽出し、それをキャピラリー電気泳動-質量分析計（CE-MS）等で網羅的に定量分析した。ＡＡＰ投与２時間後に肝細胞の壊死が観察された。図１にコントロールとＡＡＰ投与２時間マウスの肝臓中で増減した成分を示した。赤で示した点はＡＡＰ投与２時間後のマウスで増加した物質、青は減少した物質を示す。極端に減少した物質はＧＳＨ、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）である。また成分名は未知であるが、ＧＳＨと同じ時間に検出された質量数２９０の物質がＡＡＰ投与によって増加した。この物質はＣＥ-ＴＯＦＭＳで得られた精密質量およびＣＥ-ＭＳ/ＭＳで得られた構造情報より、ＧＳＨ（γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ）の真ん中のＣｙｓが２−アミノ酪酸（２−aminobutyrate）（２ＡＢ）に置き換わったオフタルミン酸（γ−Ｇｌｕ−２ＡＢｓ−Ｇｌｙ）であることが推測された。オフタルミン酸の標品を入手し、未知物質と比較検討した結果、未知物質は予想どおりオフタルミン酸であった。
【００２７】
ＡＡＰ投与による肝細胞の壊死は、図２Ａに示したようにＡＡＰの一部がチトクロム（cytochome）Ｐ４５０によって代謝され、毒性物質ＮＡＰＱＩを生産し、それが多くのタンパク質のＳＨ基に結合（酸化）するためである。通常はＧＳＨがＮＡＰＱＩに結合し、ＮＡＰＱＩを尿中に排泄する。しかしＧＳＨが枯渇すると、ＮＡＰＱＩはタンパク質と結合し、細胞の壊死を引き起こす。ＣＥ-ＴＯＦＭＳによって測定した各代謝物質の濃度変動（図２Ａ）を比較するとコントロールに比べＡＡＰ投与２時間後のマウスの肝臓ではグルタチオン生合成経路の物質が軒並み減少した。一方グルタチオン合成経路にある酵素グルタミルシステインシンテターゼ（ＧＣＳ）とグルタチオンシンテターゼ（ＧＳ）によって生産されるγ−Ｇｌｕ−２−アミノ酪酸（γ−Ｇｌｕ−２ＡＢ）とオフタルミン酸が増加することが確認された。
【００２８】
さらに、本発明者らはＧＣＳを阻害するＢＳＯ（buthionine sulfoximine）とＡＡＰ同様に酸化ストレスを与える薬剤ＤＥＭ（diethylmaleate）をマウスに投与してこの代謝メカニズムを解明した。ＢＳＯはＧＳＨのフィードバック阻害を受けなおかつグルタチオン合成経路の律速酵素であるＧＣＳの活性を阻害する。したがってＧＣＳの下流にある代謝物質γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、ＧＳＨ（図２Ａ）、γ−Ｇｌｕ−２ＡＢ、オフタルミン酸（図２Ｂ）は大幅に減少した。またＤＥＭ投与ではＡＡＰと同様にＧＳＨの枯渇、γ−Ｇｌｕ−２ＡＢ、オフタルミン酸の増加が観察された（図３）。これらの結果より、ＡＡＰ投与によるＧＳＨの枯渇によってＧＣＳが活性化され、２ＡＢを基質にしてγ−Ｇｌｕ−２ＡＢさらにオフタルミン酸が生合成されたことが確認された（図２Ｂ）。ＧＣＳの活性化により、Ｃｙｓを基質にしてＧＳＨも合成されるが、１）ＧＳＨはＮＡＱＰＩと反応し消費される、２）Ｃｙｓが少ないためＧＳＨが合成されない、どちらかの理由でＧＳＨ量は回復しない。しかし、オフタルミン酸はＧＳＨのようにＮＡＰＱＩと反応しないために細胞内に蓄積した。またＧＳＳＧはＧＳＨとほぼ同じ変動傾向を示した。
【００２９】
この結果からＡＡＰやＤＥＭによる酸化ストレスによるＧＳＨの減少に反応して肝臓内のＧＳＳＧ、γ−Ｇｌｕ−２ＡＢ、オフタルミン酸が大きく変動することが判明した。もし血液中のこれらの物質もＧＳＨの減少に反応すればバイオマーカーとして使用することができる。そこで、ＡＡＰをマウスに投与して１，２，４，６，１２，２４時間後の肝臓および血清中のこれらの物質の濃度を測定、比較した（図４）。
【００３０】
肝臓のＧＳＨはＡＡＰ投与後肝細胞の壊死がおきる１時間後、２時間後で急激に減少した。しかし血清からはＧＳＨは検出されなかった。ＧＳＳＧは肝臓、血清中で肝臓中のＧＳＨと似た挙動を示した。オフタルミン酸は肝臓、血清中で肝臓中ＧＳＨと反対の挙動を示した。またオフタルミン酸は肝臓のＧＳＨが急激に減少した１時間後、２時間後で劇的に増加しコントロールのマウスとの統計的有意差も大きかった。以上のことから血中のオフタルミン酸は濃度も高く、肝臓のＧＳＨの減少を感知して急激に増加するため、肝臓内のレドックス制御状態を反映する有効なバイオマーカーであることが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】コントロールとＡＡＰ投与２時間後のマウスの肝臓で変動した代謝物質を示す図である。ＡＡＰ投与後２時間で増加した成分は赤、減少した成分は青で示した。
【図２】コントロールとＡＡＰ投与２時間後のマウスの肝臓中代謝物質の定量値を示す図である。コントロールマウスの代謝の定量値は青、ＡＡＰ投与後２時間は赤で示した。コントロールのマウスとＡＡＰ投与マウスの定量値のＴ検定結果（＊＊＊ｐ＜０．００１，＊＊ｐ＜０．０１，＊ｐ＜０．０５）。Ａ）ＡＡＰ代謝経路の物質。 Ｂ）オフタルミン酸生合成経路の物質。
【図３】コントロールとＢＳＯおよびＤＥＭ投与２時間後のマウスの肝臓中の代謝物質の定量値を示す図である。コントロールのマウスと薬物投与マウスの定量値の統計的有意差検定（Ｔ検定）結果（＊＊＊ｐ＜０．００１，＊＊ｐ＜０．０１，＊ｐ＜０．０５）。
【図４】ＡＡＰ投与後のマウスのＡ）肝臓およびＢ）血清中の代謝物定量値の経時変化を示す図である。コントロールの定量値に対するＴ検定結果（＊＊＊ｐ＜０．００１，＊＊ｐ＜０．０１，＊ｐ＜０．０５）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の濃度変動に応じて血中で変動する物質であるオフタルミン酸の血中濃度を測定することを特徴とする酸化ストレスの判定方法。
【請求項２】
オフタルミン酸の血中濃度をキャピラリー電気泳動−質量分析計で測定することを特徴とする請求項１記載の酸化ストレスの判定方法。
【請求項３】
酸化ストレスが、ガン、糖尿病、動脈硬化、肥満、肝炎、エイズ、アルツハイマー等に起因する酸化的ストレスであることを特徴とする請求項１又は２記載の酸化ストレスの判定方法。
【請求項４】
抗酸化ストレス候補薬剤を、酸化ストレス状態にある非ヒト動物に投与し、投与の前後における生体試料中の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の濃度変動に応じて血中で変動する物質であるオフタルミン酸の血中濃度を測定し、オフタルミン酸濃度の低下の程度を評価することを特徴とする抗酸化ストレス剤のスクリーニング方法。
【請求項５】
オフタルミン酸の血中濃度をキャピラリー電気泳動−質量分析計で測定することを特徴とする請求項４記載の抗酸化ストレス剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
抗酸化ストレス剤が、ガン、糖尿病、動脈硬化、肥満、肝炎、エイズ、アルツハイマー等に起因する酸化的ストレス関連の疾病の予防・治療薬であることを特徴とする請求項４又は５記載の抗酸化ストレス剤のスクリーニング方法。
【請求項１】
生体試料中の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の濃度変動に応じて血中で変動する物質であるオフタルミン酸の血中濃度を測定することを特徴とする酸化ストレスの判定方法。
【請求項２】
オフタルミン酸の血中濃度をキャピラリー電気泳動−質量分析計で測定することを特徴とする請求項１記載の酸化ストレスの判定方法。
【請求項３】
酸化ストレスが、ガン、糖尿病、動脈硬化、肥満、肝炎、エイズ、アルツハイマー等に起因する酸化的ストレスであることを特徴とする請求項１又は２記載の酸化ストレスの判定方法。
【請求項４】
抗酸化ストレス候補薬剤を、酸化ストレス状態にある非ヒト動物に投与し、投与の前後における生体試料中の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の濃度変動に応じて血中で変動する物質であるオフタルミン酸の血中濃度を測定し、オフタルミン酸濃度の低下の程度を評価することを特徴とする抗酸化ストレス剤のスクリーニング方法。
【請求項５】
オフタルミン酸の血中濃度をキャピラリー電気泳動−質量分析計で測定することを特徴とする請求項４記載の抗酸化ストレス剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
抗酸化ストレス剤が、ガン、糖尿病、動脈硬化、肥満、肝炎、エイズ、アルツハイマー等に起因する酸化的ストレス関連の疾病の予防・治療薬であることを特徴とする請求項４又は５記載の抗酸化ストレス剤のスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００７−１９２７４６（Ｐ２００７−１９２７４６Ａ）
【公開日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１２９５５（Ｐ２００６−１２９５５）
【出願日】平成１８年１月２０日（２００６．１．２０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１７年度、文部科学省、「網羅的代謝計測技術に基づく細胞機能シミュレーションとその応用並びに支援・基盤領域の研究開発」委託研究、産業再生法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（８９９００００７９）学校法人慶應義塾 (742)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１月２０日（２００６．１．２０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１７年度、文部科学省、「網羅的代謝計測技術に基づく細胞機能シミュレーションとその応用並びに支援・基盤領域の研究開発」委託研究、産業再生法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（８９９００００７９）学校法人慶應義塾 (742)
【Ｆターム（参考）】
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