酸化チタン機能性分子複合体粒子
【課題】 水溶性高分子により水系溶媒中で分散させた酸化チタン複合体粒子に対して、水溶性高分子を変質させることなく機能性分子を酸化チタン表面に結合させた酸化チタン機能性分子複合体粒子の提供。
【解決手段】 本発明では、水溶性高分子により水系溶媒中で分散させた酸化チタン複合体粒子の酸化チタン表面に、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基の群から選択される少なくともひとつの官能基を介して機能性分子を結合させることにより、前記水溶性高分子を変質させることなく、新たな機能性付与を実現できる。この酸化チタン機能性分子複合体粒子は、体内に投与後に体内動態を確認するためのトレーサー実験用材料や、患部に超音波や光を照射することにより行われる診断および治療のための医療用材料として利用できる。
【解決手段】 本発明では、水溶性高分子により水系溶媒中で分散させた酸化チタン複合体粒子の酸化チタン表面に、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基の群から選択される少なくともひとつの官能基を介して機能性分子を結合させることにより、前記水溶性高分子を変質させることなく、新たな機能性付与を実現できる。この酸化チタン機能性分子複合体粒子は、体内に投与後に体内動態を確認するためのトレーサー実験用材料や、患部に超音波や光を照射することにより行われる診断および治療のための医療用材料として利用できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水溶性高分子により水系溶媒中で分散させた酸化チタン複合体粒子に対して、水溶性高分子を変質させることなく機能性分子を酸化チタン表面に結合させた酸化チタン機能性分子複合体粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
酸化チタンはｐＨ６前後に等電点を有すると言われている。このため、酸化チタン粒子は中性付近の水系溶媒中では凝集を生じてしまい、これを均一に分散させることは極めて難しい。そのため、酸化チタン粒子を水系の分散媒に均一に分散させるため、今まで種々の試みがなされてきた。
【０００３】
ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を分散剤として添加して、分散媒中における酸化チタン粒子の分散性を向上させることが知られている（特許文献１（特開平２−３０７５２４号公報）および特許文献２（特開２００２−６０６５１号公報）参照）。
【０００４】
あるいは酸化チタン微粒子に、ポリアクリル酸等の親水性高分子を、カルボキシル基を介して結合させた、表面改質酸化チタン微粒子も知られている（特許文献３（ＷＯ２００４／０８７５７７）参照）。この技術は、ポリアクリル酸等といったアニオン性ポリマーの使用を念頭としたものである。アニオン性ポリマーのもつカルボキシル基等の官能基により表面電荷を与え、それにより生体内環境に近い中性の生理食塩水においても安定した分散性を示し、かつ光触媒活性機能を有するものである。
【０００５】
更に、酸化チタンに機能性を付与する検討がなされている。例えば、前記表面改質酸化チタン微粒子に対して、前記親水性高分子の結合に関与していないカルボキシル残基に、目的分子に対して特異的な結合能を有する分子を固定化した、分子識別能を有する二酸化チタン複合体が提案されている（特許文献４（特許第３８３５７００号）参照）。この技術は、アニオン性ポリマーのもつカルボキシル基等の官能基により、分子が固定化されていても表面電荷を与え、安定した分散性を示すものである。一方で、官能基によって与えられる表面電荷は分散性に直接寄与しており、結合に関与していない残基に分子を固定化することで表面電荷は減少する。このことが固定化される分子の量等に対して制限を与える。
【０００６】
【特許文献１】特開平２−３０７５２４号公報
【特許文献２】特開２００２−６０６５１号公報
【特許文献３】ＷＯ２００４／０８７５７７号パンフレット
【特許文献４】特許第３８３５７００号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、水溶性高分子により水系溶媒中で分散させた酸化チタン複合体粒子において、前記水溶性高分子を変質させることなく高い分散性を保持し、かつ、酸化チタン表面に結合した機能性分子により、酸化チタン表面付近での新たな機能性付与を実現した酸化チタン機能性分子複合体粒子およびその分散体の提供をその目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、今般、水溶性高分子により水系溶媒中で分散させた酸化チタン複合体粒子の酸化チタン表面に、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基の群から選択される少なくともひとつの官能基を介して機能性分子を結合させることにより、前記水溶性高分子を変質させることなく、新たな機能性付与を実現できるとの知見を得た。
【０００９】
すなわち、本発明の酸化チタン機能性分子複合体粒子によれば、水溶性高分子を変質させることなく酸化チタン表面に対し機能性分子を結合させることにより、水溶性高分子による高い分散性を保持できる。このため、機能性分子の結合に際して自由度の高い分子設計が可能である。また、機能性分子を酸化チタン表面に結合することにより、酸化チタン表面付近において超音波や紫外線照射によって発生したラジカル種と機能性分子との反応性が高い。このため、機能性分子および機能性分子と相互作用を有する対象物との反応性を著しく向上することができる。前記対象物が癌細胞の場合にあっては、超音波や紫外線による癌の治療効果を著しく向上することができる。そのため、本発明の酸化チタン機能性分子複合体粒子は、患部に超音波を照射することにより行われる超音波癌治療を促進するための超音波癌治療促進剤としても利用可能である。
【００１０】
そして、本発明の酸化チタン機能性分子複合体粒子は、
酸化チタン粒子と、
該酸化チタン粒子の表面に、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基の群から選択される少なくともひとつの官能基を介して結合されてなる水溶性高分子を含んでなる、酸化チタン複合体粒子と、
該酸化チタン複合体粒子の表面に、さらに結合されてなる機能性分子を含んでなり、
前記機能性分子は、
（１）カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基の群から選択される少なくとも一つの官能基を有し、
（２）ａ）炭素数６〜４０よりなる飽和又は不飽和の鎖状炭化水素基、ｂ）置換基を有するか有しない飽和又は不飽和の５〜６員環複素環式基、又はｃ）置換基を有するか有しない飽和又は不飽和の５〜６員環環状炭化水素水素基を含んでなる化合物であって、
前記官能基を介して前記酸化チタンと結合されてなる、酸化チタン機能性分子複合体粒子であることを特徴とするものである。
【００１１】
また、本発明による分散液は、酸化チタン機能性分子複合体粒子と、該粒子が分散される溶媒とを含んでなるものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、水溶性高分子を変質させることなく高い分散性を保持し、かつ、酸化チタン表面に結合した機能性分子により、酸化チタン表面付近での新たな機能性付与を実現した酸化チタン機能性分子複合体粒子およびその分散体を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明による酸化チタン機能性分子複合体粒子は、酸化チタン粒子と、水溶性高分子と、機能性分子を含む。図１に、酸化チタン機能性分子複合体粒子の一例を示す。図１に示されるように、酸化チタン機能性分子複合体粒子は、酸化チタン粒子１の表面に水溶性高分子２および機能性分子３が結合されたものである。酸化チタン粒子１と、水溶性高分子２および機能性分子３との結合は、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基から選択される少なくとも１種の官能基を介して形成される。
【００１４】
すなわち、これらの官能基は酸化チタンとの間で強固な結合を形成するため、酸化チタン粒子の高い触媒活性に関わらず分散性を保持できる。これらの官能基は酸化チタンとの間で強固な結合を形成するため、酸化チタン粒子の高い触媒活性にかかわらず水溶性高分子および機能性分子の結合を保持することが可能である。なお、本発明における結合形態は、体内における安全性の観点から、体内への投与後２４〜７２時間後に分散性が確保されている程度の結合形態であればよい。生理条件での分散が安定しており、かつ超音波や紫外線照射後も水溶性高分子の遊離が無く、正常細胞へのダメージが少ない点で、共有結合であるのが望ましい。
【００１５】
カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基は、３官能シラノール基のような相互に三次元的に縮合重合して重合物で酸化チタン粒子の表面を覆い尽くしてしまう官能基とは異なり、官能基同士で重合することが無いため、図１に示されるように酸化チタン粒子の表面に剥き出しの部分を確保することができると考えられる。その結果、表面が重合体で覆われることによって起こりうる失活を抑制しつつ、酸化チタン粒子の触媒活性を十分に発揮させることができる。
【００１６】
そして、酸化チタン粒子の表面に結合した水溶性高分子は、電荷あるいは水和の作用によって、酸化チタン粒子の分散が困難とされる中性付近の水系溶媒中であって酸化チタン機能性分子複合体粒子を高度に分散させることができる。機能性分子を、酸化チタン粒子の表面に結合した水溶性高分子に対して導入する方法については公知である。このような場合は、水溶性高分子と機能性分子を化学結合するために、水溶性高分子は反応性の高い極性基を含んでなることが必要である。この水溶性高分子に含まれる極性基は、機能性分子が結合されると失われる。このことにより、水溶性高分子の極性自体に変化が生じる。つまり、酸化チタン粒子の表面に結合した水溶性高分子のもつ電荷あるいは水和の作用によって分散しているバランスが、機能性分子の結合前後において変化すると考えられる。この酸化チタン粒子の表面に結合した水溶性高分子の変質に伴う電荷あるいは水和のバランスをうまくコントロールすることでのみ達成しうる。一方、本発明における酸化チタン粒子の表面に結合した機能性分子については、水溶性高分子を変質させることなく結合させることにより、水溶性高分子による高い分散性を保持できる。このため、水溶性高分子の変質によって生じる分散性の変化を考慮することなく、機能性分子の結合に際して自由度の高い分子設計が可能である。
【００１７】
本発明の酸化チタン機能性分子複合体粒子によれば、前記機能性分子として酸化チタン表面に対し、疎水性や細胞認識性の分子を導入することで、水溶性高分子を変質させることなく高い分散性を保持することができる。さらに、酸化チタン表面付近におけるこれら分子と細胞との高い相互作用を発揮できる。細胞認識性の分子を酸化チタン粒子の表面に結合しているので、酸化チタン表面付近において超音波や紫外線照射によって発生したラジカル種との反応速度を向上させ、殺対象が癌細胞の場合にあっては、超音波や紫外線による癌の治療効果を著しく向上することができる。そのため、本発明の酸化チタン機能性分子複合体粒子は、投与後に選択的に患部に取り込まれ、その後に患部に超音波を照射することにより行われる超音波癌治療を促進するための、細胞認識性を有する超音波癌治療促進剤としても利用可能である。
【００１８】
また、本発明の酸化チタン機能性分子複合体粒子によれば、前記機能性分子として酸化チタン表面に対し、光応答性の分子や放射性物質を導入することで、水溶性高分子を変質させることなく高い分散性を保持することができる。さらに、酸化チタン表面を直接的にこれらの分子を標識することができる。特に、放射性物質に関しては、安全性の観点から取り扱いに注意が必要であるが、水溶性高分子により水系溶媒中で分散させた酸化チタン複合体粒子に対して、酸化チタン表面に放射性物質を結合した後に、未結合の放射性物質を適当な方法で分離除去するだけの、簡易でかつ少ない工程によって粒子の標識ができる。このため、放射性物質が外部に広がる機会が少なく、安全性の面において優れる。また、これを適当な機器により測定することで粒子のイメージングや定量の測定が可能である。そのため、本発明の酸化チタン機能性分子複合体粒子は、体内に投与後に体内動態を確認するためのトレーサー実験用材料や、患部に超音波や光を照射することにより行われる診断および治療のための医療用材料としても利用可能である。
【００１９】
さらに、本発明の酸化チタン機能性分子複合体粒子によれば、前記機能性分子として酸化チタン表面に対し、ラジカル応答性の分子を導入することで、水溶性高分子を変質させることなく高い分散性を保持することができる。さらに、酸化チタン表面付近において超音波や紫外線照射によって発生したラジカル種との反応速度を向上させ、高い反応性を発揮することができる。前記ラジカル応答性の分子が、ラジカル種との反応により蛍光性や発光性を示すものを用いれば、これを適当な機器により測定することで粒子のイメージングやラジカル種発生量の測定が可能である。そのため、本発明の酸化チタン機能性分子複合体粒子は、患部に超音波や光を照射することにより行われる診断および治療のための医療用材料としても利用可能である。
【００２０】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いる水溶性高分子は、酸化チタン粒子の表面に、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基の群から選択される少なくともひとつの官能基を介して結合されてなることが好ましい。これによって、酸化チタン粒子の表面に強固に結合することが可能であり、また、３官能シラノール基のような相互に三次元的に縮合重合して重合物で酸化チタン粒子の表面を覆い尽くしてしまう官能基とは異なり、官能基同士で重合することが無いため、図１に示されるように酸化チタン粒子の表面に剥き出しの部分を多く確保することができると考えられる。その結果、表面が重合体で覆われることによって起こりうる失活を抑制しつつ、酸化チタン粒子の触媒活性を十分に発揮させることができる。
【００２１】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いる水溶性高分子は、酸化チタン機能性分子複合体粒子を水系溶媒中で分散させることができれば特に限定されないが、電荷を有するものとしては、アニオン性またはカチオン性を有する水溶性高分子、また、電荷を有さずに水和によって分散性を与えるものとしてはノニオン性を有する水溶性高分子が挙げられ、これらの少なくとも一種を含んでなる。
【００２２】
本発明の好ましい態様によれば、前記水溶性高分子は重量平均分子量２０００〜１０００００である。水溶性高分子の重量平均分子量はサイズ排除クロマトグラフィーを用いて求めた値である。前記分子量をこの範囲とすることで、水溶性高分子のもつ電荷あるいは水和の作用によって、酸化チタン粒子の分散が困難とされる中性付近の水系溶媒中であって酸化チタン機能性分子複合体粒子を高度に分散させることができる。
より好ましい範囲は５０００〜１０００００であり、さらに好ましくは５０００〜４００００である。
【００２３】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いる水溶性高分子は、アニオン性を有する水溶性高分子として酸化チタン機能性分子複合体粒子を水系溶媒中で分散させることができればいずれも使用可能であるが、複数のカルボキシル基を有するものとしては、例えばカルボキシメチルデンプン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルセルロース、ポリカルボン酸類、およびカルボキシル基単位を有する共重合体（コポリマー）などが挙げられる。具体的には、水溶性高分子の加水分解性および溶解度の観点から、ポリアクリル酸、ポリマレイン酸等のポリカルボン酸類、およびアクリル酸／マレイン酸やアクリル酸／スルフォン酸系モノマーの共重合体（コポリマー）がより好適に使用され、さらに好ましくはポリアクリル酸である。
【００２４】
アニオン性を有する水溶性高分子として、ポリアクリル酸を用いる場合、分散性の観点からポリアクリル酸の重量平均分子量は２０００〜１０００００であるのが好ましく、より好ましくは５０００〜４００００であり、さらに好ましくは５０００〜２００００である。
【００２５】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いる水溶性高分子は、カチオン性を有する水溶性高分子として酸化チタン機能性分子複合体粒子を水系溶媒中で分散させることができればいずれも使用可能であるが、複数のアミノ基を有するものとしては、例えばポリアミノ酸、ポリペプチド、ポリアミン類、およびアミン単位を有する共重合体（コポリマー）などが挙げられる。具体的には、水溶性高分子の加水分解性および溶解度の観点から、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン等のポリアミン類がより好適に使用され、さらに好ましくはポリエチレンイミンである。
【００２６】
カチオン性を有する水溶性高分子として、ポリエチレンイミンを用いる場合、分散性の観点からポリエチレンイミンの重量平均分子量は２０００〜１０００００であるのが好ましく、より好ましくは５０００〜４００００であり、さらに好ましくは５０００〜２００００である。
【００２７】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いる水溶性高分子は、ノニオン性を有する水溶性高分子として酸化チタン機能性分子複合体粒子を水系溶媒中で分散させることができればいずれも使用可能であるが、好ましくは水酸基および／またはポリオキシアルキレン基を有する高分子が挙げられる。そのような水溶性高分子の好ましい例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、デキストランあるいはそれらを含有するコポリマーが挙げられ、より好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデキストランであり、さらに好ましくはポリエチレングリコールである。
【００２８】
ノニオン性を有する水溶性高分子として、ポリエチレングリコールを用いる場合、分散性の観点からポリエチレングリコールの重量平均分子量は２０００〜１０００００であるのが好ましく、より好ましくは５０００〜４００００である
【００２９】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いる機能性分子は、酸化チタン粒子表面に結合してなるが、該機能性分子はカルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基の群から選択される少なくともひとつの官能基を有する。
【００３０】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いる機能性分子は、ａ）炭素数６〜４０よりなる飽和又は不飽和の鎖状炭化水素基、ｂ）置換基を有するか有しない飽和又は不飽和の５〜６員環複素環式基、又はｃ）置換基を有するか有しない飽和又は不飽和の５〜６員環環状炭化水素基を含んでなる化合物である。
【００３１】
上記炭素数よりなる機能性分子は、前記水溶性高分子と比べて分子の大きさが小さい。また、機能性分子は酸化チタン表面に結合してなる。このため、本発明の酸化チタン機能性分子複合体粒子において、外殻に水溶性高分子が位置するのに対し、より内部の位置に機能性分子を有する構造をとる。該外殻は酸化チタン機能性分子複合体粒子の分散性に対する影響が最も大きい。すなわち外殻に位置する水溶性高分子に対して、内部に位置する機能性分子が分散性に与える影響は小さくなり、好適に用いることが出来る。
【００３２】
また、上記炭素数よりなる機能性分子は、機能性分子は酸化チタン粒子表面に結合してなるため、酸化チタン表面付近において超音波や紫外線照射によって発生したラジカル種と機能性分子との反応性が高く、機能性分子および機能性分子と相互作用を有する対象物との反応性を著しく向上することができ、好適に用いることが出来る。
【００３３】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いる機能性分子は、特にその機能は限定されないが、疎水性、細胞認識性、光応答性、放射性、ラジカル応答性、および医薬の他、抗体等の生体分子や他の機能性分子等とのリンカー、などが挙げられる。
【００３４】
前記酸化チタン機能性分子複合体粒子に結合された機能性分子の量は、前記酸化チタン粒子の質量あたり、１．０×１０−１〜１．０×１０−５ 質量部／酸化チタン粒子の質量部であり、好ましくは１．０×１０−２〜１．０×１０−５ 質量部／酸化チタン粒子の質量部であることが好ましい。この範囲であると、酸化チタン機能性分子複合体粒子は生体内環境に近い、１０％タンパク質溶液を溶媒としても分散することができるため、好適に用いることができる。
【００３５】
そのような機能性分子の例としては、芳香族化合物やアルキル構造をもつ分子等が考えられ、より具体的には、ベンゼン環をもつ分子として、カテコール、メチルカテコール、ターシャリーブチルカテコールドーパ、ドーパミン、ジヒドロキシフェニルエタノール、ジヒドロキシフェニルプロピオン酸、ジヒドロキシフェニル酢酸等の、分子内にカテコールの構造を有する、カテコール類などがあげられる。また、他の環状分子として、フェロセン、フェロセンカルボン酸、アスコルビン酸、ジハイドロキシシクロブテンジエン、アリザリン、ビナフタレンジオール等が好適に使用できる。さらに、アルキル構造をもつ分子としては、ヘキシル基、オクチル基、ラウリル基、パルミチル基、ステアリル基などのアルキル基を有する分子があげられる。あるいは、ヘキセニル基、オクテニル基、オレイル基などのアルケニル基、または、シクロアルキル基などの飽和又は不飽和脂肪族炭化水素基をもつものなどがあげられる。
【００３６】
また、機能性分子の他の例としては、細胞認識性においては結合活性部位を含むペプチドやアミノ酸配列であってもよい。より具体的には５−アミノレブリン酸、メチオニン、システイン、グリシン等があげられる。あるいは、糖鎖を含んでもよい。さらに、結合性を有する核酸を含んでいても良い。核酸としては、特に制限はなく、ＤＮＡ、ＲＮＡの他、アプタマー等の核酸塩基、ＰＮＡ等のペプチド核酸を用いることもできる。
【００３７】
また、機能性分子の他の例としては、光応答性においては蛍光性分子を含んでなるものを用いることが出来る。
【００３８】
また、機能性分子の他の例としては、放射性においては同位体元素を含む化合物が挙げられ、例えば１４Ｃを有する１４Ｃ標識カテコールなどが好適に用いられる。
【００３９】
また、機能性分子の他の例としては、ラジカル応答性においてはラジカルと特異的な反応性を示す化学発光性分子や蛍光性分子、またはスピントラップ剤を含んでなることが挙げられる。より具体的には、化学発光性分子や蛍光性分子として、ルミノール、海ホタルルシフェリン類縁体、シュウ酸エステル、アクリジニウム、パラヒドロキシフェニルフルオレセイン、パラアミノフェニルフルオレセイン、ジヒドロローダミン１２３、ジヒドロローダミン６Ｇ、トランス‐１‐（２’‐メトキシビニル）ピレン、ジヒドロキシエチジウム、葉酸、（２’，７’−ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ，ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ（インビトロジェン）、）、５−ｏｒ６−（Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−３’，６’−Ｏ，Ｏ’−ｄｉａｃｅｔｙｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｃｙ色素（アマシャムバイオサイエンス社製）、プテリンなどであり、スピントラップ剤としては、４，６−Ｔｒｉ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｎｉｔｒｏｓｏｂｅｎｚｅｎｅ、２−Ｍｅｔｈｙｌ−２−ｎｉｔｒｏｓｏｐｒｏｐａｎｅ、３，３，５，５−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ Ｎ−Ｏｘｉｄｅ、５，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ Ｎ−Ｏｘｉｄｅ、５−（Ｄｉｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｏ）−５−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ Ｎ−Ｏｘｉｄｅ、Ｎ−ｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌ−ａｌｐｈａ−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ−１−ｏｘｉｄｅ）ｎｉｔｒｏｎｅ、Ｎ−ｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌ−ａｌｐｈａ−ｐｈｅｎｙｌｎｉｔｒｏｎｅ、Ｎｉｔｒｏｓｏｂｅｎｚｅｎｅ、５，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ Ｎ−ｏｘｉｄｅ、４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−２，２，６，６−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌｏｘｙ， ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ、２−（５，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｏｘｏ−２λ５−［１，３，２］ｄｉｏｘａｐｈｏｓｐｈｉｎａｎ−２−ｙｌ）−２−ｍｅｔｈｙｌ−３，４−ｄｉｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｐｙｒｒｏｌｅ １−ｏｘｉｄｅ、５−Ｄｉｅｔｈｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−５−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ−Ｎ−ｏｘｉｄｅなどである。
【００４０】
また、機能性分子の他の例としては、抗がん剤を用いる場合は、フルオロウラシル、ゲムシタビン、メソトレキセート、シクロホスファミド、塩酸ダウノルビシン、アドリアマイシン、塩酸イダルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、アクチノマイシン、ビンクリスチン、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、ネダプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、塩酸イリノテカン等から少なくとも一つが利用できる。また、ペニシリン系、マクロライド系、ニューキノロン系、テトラサイクリン系等の抗菌剤や、ラミブジン、ネルフィナビル、インジナビ、サキナビル、インターフェロン、アマンタジン、アシクロビル等のウイルス治療薬、そして、ニュープロレリン、ブセレリン、ゴセレリン、トリプトレリン、ナファレリン等のホルモン疾患治療薬、イブプロフェン等の鎮痛薬等を含んでなるものが挙げられる。
【００４１】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いる機能性分子は、上記機能を与える分子と酸化チタン表面に結合する官能基がリンカーを介して結合してなる分子であってもなんら問題はない。
【００４２】
本発明の好ましい態様によれば、前記リンカーは、例えば生体分子同士を異なる官能基同士で結合する際に用いられるヘテロバイファンクショナルなクロスリンカーなどが考えられる。リンカーの具体例としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−［α−マレイミドアセトキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−［β−マレイミドプロピルオキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−β−マレイミドプロピオン酸、Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド・ＴＦＡ、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド、Ｎ−ε−マレイミドカプロン酸、Ｎ−［ε−マレイミドカプロン酸］ヒドラジド、Ｎ−［ε−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−κ−マレイミドウンデカン酸、Ｎ−［κ−マレイミドウンデカン酸］ヒドラジド、スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシ−［６−アミドカプロエート］、スクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−［４−Ｎ−マレイミドフェニル］酪酸ヒドラジド・ＨＣｌ、３−［２−ピリジルジチオ］プロピオニルヒドラジド、Ｎ−［ｐ−マレイミドフェニル］イソシアネート、Ｎ−スクシンイミジル［４−アジドフェニル］−１，３’−ジチオプロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル Ｓ−アセチルチオアセテート、Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオプロピオネート、スクシンイミジル ３−［ブロモアセトアミド］プロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル ヨードアセテート、Ｎ−スクシンイミジル［４−イオドアセチル］アミノベンゾエート、スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート、スクシンイミジル６−［（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノネート］、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−α［２−ピリジルジチオ］トルエン、Ｎ−スクシンイミジル３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート、Ｎ−［ε−マレイミドカプロイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル、Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スルホスクシンイミドエステル、Ｎ−［κ−マレイミドウンデカノイルオキシ］−スルホスクシンイミドエステル、スルホスクシンイミジル−６−［α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノネート、スルホスクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルチチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノネート、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホ−スクシンイミドエステル、スルホスクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート、スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スルホスクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート，Ｎ−［ε−トリフルオロアセチルカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル、クロロトリアジン、ジクロロトリアジン、トリクロロトリアジン等が挙げられる。また、リンカーはさらに他のリンカー同士が結合されるような複数種類のリンカーから構成されてもよい。
【００４３】
本発明の好ましい態様によれば、酸化チタン粒子と水溶性高分子およびまたは機能性分子との結合に用いられるジオール基としては、エンジオール基であることが好ましく、より好ましくはα−ジオール基である。これらの官能基を用いることで、優れた酸化チタン粒子への結合を実現することができる。
【００４４】
本発明の好ましい態様によれば、酸化チタン粒子が、アナターゼ型酸化チタンまたはルチル型酸化チタンであるのが好ましい。紫外線や超音波の照射による触媒活性を利用する場合にはアナターゼ型酸化チタンが好ましく、化粧料のように高い屈折率等の性質を利用する場合にはルチル型酸化チタンが好ましい。
【００４５】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いる酸化チタン機能性分子複合体粒子は２０〜２００ｎｍの粒子径を有し、より好ましくは５０〜２００ｎｍであり、さらに好ましくは５０〜１５０ｎｍである。この粒径範囲であると、癌腫瘍への到達を目的として患者の体内に投与されると、ドラッグデリバリーシステムのように、Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ Ｅｆｆｅｃｔ（ＥＰＲ効果）により癌組織に効率的に到達して蓄積される。そして、上述の通り、４００ｋＨｚ〜２０ＭＨｚの超音波や紫外線の照射によりラジカル種の特異的生成が起こる。したがって、超音波や紫外線の照射により高い効率で癌組織を殺傷することができる。
【００４６】
本発明の別の好ましい態様によれば、酸化チタン機能性分子複合体粒子が５０ｎｍ未満（例えば数ｎｍ）の粒子径を有する場合、見かけ上のサイズを大きくしてＥＰＲ効果を得ることもできる。すなわち、５０〜１５０ｎｍの粒子径を有する二次粒子の形態を有するように半導体粒子同士を多官能リンカーで連結する等の方法にて結合されることで、ＥＰＲ効果により高い癌治療効果を実現することができる。本発明のさらに別の好ましい態様によれば、ＥＰＲ効果を利用するため、リポソームのような薬剤封入体の中に、酸化チタン機能性分子複合体粒子を包摂させることもできる。
【００４７】
本発明において半導体粒子の粒子径は、動的光散乱法により測定することができる。具体的には、粒径分布測定装置（ゼータサイザーナノ、マルバーンインスツルメント社製）を用いて、キュミュラント解析で得られる、Ｚ−ａｖｅｒａｇｅ ｓｉｚｅで示される値として得ることができる。
【００４８】
本発明に使用可能な酸化チタン機能性分子複合体粒子は、単一種類の酸化チタン複合体粒子のみならず、複数種類の半導体粒子の混合物あるいは複合物も包含する。具体例としては、酸化チタン粒子と酸化鉄ナノ粒子との複合物、酸化チタン粒子と白金との複合物、およびシリカ被覆された酸化チタン等が挙げられる。
【００４９】
本発明の好ましい態様によれば、酸化チタン機能性分子複合体粒子が、溶媒に分散されて分散液の形態とされてなるのが好ましい。これにより、酸化チタン機能性分子複合体粒子を、点滴、注射、塗布等の種々の方法により、患者の体内に効率的に投与することができる。分散液の液性は限定されず、ｐＨ３〜１０の広範囲にわたって高い分散性を実現可能である。なお、体内投与における安全性の観点から、分散液は、ｐＨ５〜９であるのが好ましく、より好ましくは５〜８、特に中性の液性を有するのが好ましい。また、本発明の好ましい態様によれば、溶媒は水系溶媒であるのが好ましく、さらに好ましくはｐＨ緩衝液または生理食塩水である。水系溶媒の好ましい塩濃度は２Ｍ以下であり、体内投与における安全性の観点から２００ｍＭ以下がより好ましい。酸化チタン機能性分子複合体粒子は分散体に対して、０．００１〜１質量％以下含有されることが好ましく、より好ましくは０．００１〜０．１質量％である。この範囲内であれば、投与後、２４〜７２時間後に患部（腫瘍）に効果的に粒子を蓄積させることが可能となる。すなわち、患部（腫瘍）に粒子濃度が蓄積しやすくなるとともに、血中での粒子の分散性も確保されて凝集隗が形成しにくくなるため、投与後に血管の閉塞などの二次的弊害を招くおそれも無い。
【００５０】
本発明の酸化チタン機能性分子複合体粒子は、点滴、注射、塗布等の種々の方法により、患者の体内に投与することができる。特に静脈または皮下による投与経路で用いられる場合は、粒子の大きさによるＥＰＲ効果と、血中の滞留性を利用して、所謂ＤＤＳ的な治療により、患者の負担を軽減する観点から好ましい。そして、体内に投与された酸化チタン機能性分子複合体粒子は、ドラッグデリバリーシステムのように、癌組織に到達して蓄積される。
【００５１】
本発明の酸化チタン機能性分子複合体粒子は、超音波あるいは紫外線の照射を受け、該照射により細胞毒となることができる。この酸化チタン機能性分子複合体粒子は、体内に投与され、超音波照射を受け、該照射により細胞毒となることで、細胞を殺傷することができるが、体内に限らず、試験管内においても殺対象である細胞を殺傷することができる。本発明において、殺対象は特に限定されないが、癌細胞であるのが好ましい。すなわち、本発明による酸化チタン機能性分子複合体粒子によれば、超音波や紫外線の照射により活性化して癌細胞を殺傷することができる。
【００５２】
本発明の好ましい態様によれば、酸化チタン機能性分子複合体粒子が蓄積された癌組織に超音波処理が行われる。使用する超音波の周波数は、４００ｋＨｚ〜２０ＭＨｚが好ましく、より好ましくは６００ｋＨｚ〜１０ＭＨｚ、さらに好ましくは１ＭＨｚ〜１０ＭＨｚである。超音波の照射時間は治療対象である癌組織の位置および大きさを考慮して適宜決定されるべきであり、特に限定されない。こうして、患者の癌組織を超音波により高い効率で殺傷して、高い癌治療効果を実現することができる。超音波は生体内の深部に外部より到達させることが可能で、本発明の酸化チタン機能性分子複合体粒子と併せて用いることにより、非侵襲の状態で生体内深部に存在するような患部やターゲット部位の治療が実現できる。さらに、患部やターゲット部位に本発明の酸化チタン複合体粒子が集積することにより、周辺の正常細胞に悪影響を及ぼさない程度の微弱な超音波で本発明の酸化チタン複合体粒子を集積させた局所のみに作用させることができる。
【００５３】
ところで、これらの半導体粒子が超音波の照射により活性化して細胞を殺傷する効果は、超音波照射によりラジカル種を生成させることにより得ることができる。すなわち、これらの半導体粒子が与える生物的殺傷効果はラジカル種の質的・量的な増加にあると考えられる。その理由は以下の通り推察されるが、以下の理由はあくまで仮説であって、本発明は何ら下記説明に限定されるものではない。すなわち、超音波照射のみでは系中には過酸化水素とヒドロキシルラジカルが発生するが、本発明者らの知見によれば、酸化チタンなどの半導体粒子の存在下では、過酸化水素及びヒドロキシルラジカルの生成が促進される。また、これら半導体粒子の存在下、特に酸化チタンの存在下では、スーパーオキサイドアニオンと一重項酸素の生成が促進されるように見受けられる。これらラジカル種の特異的生成は、ナノメートルオーダーの微粒子を用いた場合、超音波照射時の周波数が４００ｋＨｚ〜２０ＭＨｚの範囲、好ましくは６００ｋＨｚ〜１０ＭＨｚの範囲、より好ましくは１ＭＨｚ〜１０ＭＨｚの範囲で顕著に観察される現象であると考えられる。
【実施例】
【００５４】
以下に実施例を示す。特に断りのない限り、「％」は質量％を意味する。
【００５５】
例１：ポリエチレングリコール結合酸化チタン微粒子の作製
チタンテトライソプロポキシド３．６ｇとイソプロパノール３．６ｇを混合し、氷冷下で６０ｍｌの超純水に滴下して加水分解を行った。滴下後に室温で３０分間攪拌した。攪拌後、１２Ｎ硝酸１ｍｌを滴下して８０℃で８時間攪拌を行い、ペプチゼーションした。ペプチゼーション終了後０．４５μｍのフィルターで濾過し、さらに脱塩カラムＰＤ−１０（アマシャム・バイオサイエンス社製）を用いて溶液交換して固形成分１％の酸性酸化チタンゾルを調製した。この酸化チタンゾルを１００ｍｌ容のバイアル瓶に入れ、超音波発生器ＭＩＤＳＯＮＩＣ２００（カイジョー社製）を用いて２００ｋＨｚで３０分間超音波処理を行った。超音波処理を行った後の平均分散粒経を動的光散乱法により測定した。この測定は、超音波処理を行った後の酸化チタンゾルを１２Ｎの硝酸で１０００倍に希釈した後、分散液０．１ｍｌを石英測定セルに仕込み、ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス社製）を用いて、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて行った。その結果、分散粒径は２０．２ｎｍであった。蒸発皿を用いて、５０℃下で酸化チタンゾル溶液の濃縮を行い、最終的に固形成分２０％の酸性酸化チタンゾルを調製した。
【００５６】
次に、ポリオキシエチレン−モノアリル−モノメチルエーテルと無水マレイン酸の共重合体（平均分子量；３３６５９−日本油脂製）１ｇに水５ｍｌを添加し加水分解後得られた溶液と１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（同仁化学製）を、超純水を用いてそれぞれ濃度が５０ｍｇ／ｍｌおよび５０ｍＭとなるように混合に調整した。調整した溶液に４−アミノサリチル酸（分子量Ｍｎ＝１５３．１４：ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）を濃度５０ｍＭになるよう混合して４ｍｌの溶液を得た。この溶液を室温にて７２時間振とう撹拌して反応させた。反応後、得られた溶液を透析膜であるスペクトラ／ポア ＣＥ 透析用チューブ（分画分子量＝３５００、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に移して超純水４ｌに対して室温にて２４時間で透析を行った。透析後にすべてナスフラスコに移し替えて一晩凍結乾燥し、得られた粉末に４ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ：和光純薬工業）を添加して混合し、４−アミノサリチル酸結合ポリエチレングリコール溶液とした。
【００５７】
次にＤＭＦを用いて４−アミノサリチル酸結合ポリエチレングリコール溶液が終濃度２０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％、先に得られたアナタ−ゼ型二酸化チタンゾルが終濃度で固形成分０．２５％となるよう調整し、２．５ｍｌの反応溶液とした。この反応溶液を水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学製）に溶液を移し変え、８０℃で６時間加熱反応を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで冷却し、エバポレータでＤＭＦを除去した後に、蒸留水１ｍｌを添加して酸化チタン複合体粒子であるポリエチレングリコール結合二酸化チタン微粒子の分散液とした。さらに、ＨＰＬＣ：ＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、カラム：ＨｉＰｒｅｐ １６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ＨＲ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、移動相：リン酸塩緩衝溶液（ｐＨ７．４）、流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ］に付したところ、素通り画分にＵＶ吸収のピークが確認され、この画分を回収した。この分散液を蒸留水で０．０５（ｗｔ／ｖｏｌ）％水溶液に希釈して７２時間静置後、動的光散乱法による分散粒径およびゼータ電位の確認を、ゼータサイザーナノＺＳを用いて、ゼータ電位測定セルにポリエチレングリコール結合二酸化チタン微粒子の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて測定した。キュミュラント解析の結果、分散粒径は３２．７ｎｍであった。
【００５８】
例２：ポリアクリル酸結合酸化チタン微粒子の作製
チタンテトライソプロポキシド３．６ｇとイソプロパノール３．６ｇを混合し、氷冷下で６０ｍｌの超純水に滴下して加水分解を行った。滴下後に室温で３０分間攪拌した。攪拌後、１２Ｎ硝酸１ｍｌを滴下して８０℃で８時間攪拌を行い、ペプチゼーションした。ペプチゼーション終了後０．４５μｍのフィルターで濾過し、さらに脱塩カラムＰＤ−１０（アマシャム・バイオサイエンス社製）を用いて溶液交換して固形成分１％の酸性酸化チタンゾルを調製した。この酸化チタンゾルを１００ｍｌ容のバイアル瓶に入れ、２００ｋＨｚで３０分間超音波処理を行った。超音波処理を行った後の平均分散粒経を動的光散乱法により測定した。この測定は、超音波処理を行った後の酸化チタンゾルを１２Ｎの硝酸で１０００倍に希釈した後、ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス社製）を用いて、石英測定セルに分散液０．１ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて行った。その結果、分散粒径は２０．２ｎｍであった。蒸発皿を用いて、５０℃下で酸化チタンゾル溶液の濃縮を行い、最終的に固形成分２０％の酸性酸化チタンゾルを調製した。
【００５９】
この酸性酸化チタンゾル０．６ｍｌをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で２０ｍｌとなるよう調整して分散させ、平均分子量５０００のポリアクリル酸（和光純薬社製）０．３ｇを溶解したＤＭＦ１０ｍｌを添加後、攪拌して混合した。水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学社製）に溶液を移し変え、１５０℃で５時間反応を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで反応液を冷却し、反応液に対して２倍量のイソプロパノールを添加した。室温で３０分間静置後、２０００ｇにて１５ｍｉｎ遠心分離により沈殿を回収した。回収した沈殿表面をエタノールで洗浄後、１．５ｍｌの水を加えて酸化チタン複合体粒子であるポリアクリル酸結合酸化チタン微粒子の分散液を得た。この分散液を蒸留水で１００倍に希釈し、分散粒径およびゼータ電位を動的光散乱法により測定した。この測定は、ゼータサイザーナノＺＳを用いて、ゼータ電位測定セルにポリアクリル酸結合酸化チタン微粒子の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて行った。その結果、分散粒径は５３．６ｎｍ、ゼータ電位は−４５．０８ｍＶであった。
【００６０】
例３：ポリエチレンイミン結合酸化チタン微粒子の作製
チタンテトライソプロポキシド３．６ｇとイソプロパノール３．６ｇを混合し、氷冷下で６０ｍｌの超純水に滴下して加水分解を行った。滴下後に室温で３０分間攪拌した。攪拌後、１２Ｎ硝酸１ｍｌを滴下して８０℃で８時間攪拌を行い、ペプチゼーションした。ペプチゼーション終了後０．４５μｍのフィルターで濾過し、さらに脱塩カラムＰＤ−１０（アマシャム・ファルマシア・バイオサイエンス社製）を用いて溶液交換して固形成分１％の酸性酸化チタンゾルを調製した。この酸化チタンゾルを１００ｍｌ容のバイアル瓶に入れ、２００ｋＨｚで３０分間超音波処理を行った。超音波処理を行った後の平均分散粒経を動的光散乱法により測定した。この測定は、１２Ｎの硝酸で１０００倍に希釈した後、ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス社製）を用いて、石英測定セルに分散液０．１ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて行った。その結果、分散粒径は２０．２ｎｍであった。
【００６１】
得られた酸化チタンゾル３ｍｌを２０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に分散させ、平均分子量１００００のポリエチレンイミン（和光純薬社製）４５０ｍｇを溶解したＤＭＦ１０ｍｌを添加後、攪拌して混合した。水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学社製）に溶液を移し変え、１５０℃で５時間反応を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで反応液を冷却し、反応液に対して２倍量のアセトンを添加した。室温で３０分間静置後、２０００ｇにて１５ｍｉｎ遠心分離により沈殿を回収した。回収した沈殿表面をエタノールで洗浄後、１．５ｍｌの水を加えて酸化チタン複合体粒子であるポリエチレンイミン結合酸化チタン微粒子の分散液を得た。この分散液を蒸留水で１００倍に希釈し、分散粒径およびゼータ電位を動的光散乱法により測定した。この測定は、ゼータサイザーナノＺＳを用いて、ゼータ電位測定セルにポリエチレンイミン結合酸化チタン微粒子の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて行った。その結果、分散粒径は５７．５ｎｍ、ゼータ電位は４７．５ｍＶであった。
【００６２】
例４：酸化チタン複合体粒子へのカテコール結合
例１〜３で得られた、それぞれの酸化チタン複合体粒子を超純水にて固形成分１％とした。次に、カテコールを超純水にて、モル濃度で１００ｍＭ、１０ｍＭ、１ｍＭ、０．１ｍＭに調整した。酸化チタン複合体粒子１％溶液に対してそれぞれのカテコール溶液を等量ずつ混合し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）で最終的に酸化チタン複合体粒子とカテコール溶液がそれぞれ終濃度で１０倍希釈になるように調整した。調整した溶液をそれぞれ恒温器に移して４０℃に設定し、３時間結合反応を行った。反応後の溶液について可視光域における波長の吸収スペクトルを紫外−可視光分光光度計により確認したところ、それぞれの溶液について増大が認められたため、カテコールが結合したと考えられた。また、反応前と反応後の溶液をキャピラリ電気泳動にて以下の条件で付したところ、フォトダイオードアレイ検出器によって吸収波長２１４ｎｍのピークを確認することによりカテコールの変化量を求めた。
・装置：Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱ（ベックマンコールター製）
・キャピラリ：フューズドシリカキャピラリ ５０μｍ ｉ．ｄ × ６７ｃｍ（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｌｅｎｇｔｈ ５０ｃｍ）（ベックマンコールター製）
・移動相：５０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ４．８）
・電圧：２５ｋＶ
・温度：２０℃
求めた変化量よりカテコールは酸化チタン粒子の質量あたり５．０×１０−３〜１．０×１０−４ カテコール−ｇ／酸化チタン粒子−ｇであった。
さらに、この溶液２．５ｍｌに対してバッファー交換用自然落下型カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を用いて水３．５ｍｌで回収して未反応のカテコールを除去した。カテコールの除去はキャピラリ電気泳動にて上記と同様に確認し、フリーのカテコールがないことを確認した。これらからカテコール結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の作製を確認した。
【００６３】
例５：酸化チタン複合体粒子への１４Ｃ標識カテコール結合
例４において、カテコールの代わりに１４Ｃ標識カテコール（１４Ｃ標識カテコール終濃度１ｍＭ）を使い、酸化チタン複合体粒子として例１において得られたポリエチレングリコール結合酸化チタン微粒子のみを用いた以外は、まったく同じ手順で酸化チタン複合体粒子への１４Ｃ標識カテコール結合を行った。その結果、１４Ｃ標識カテコールの結合と、フリー１４Ｃ標識カテコールの除去を確認した。また、それぞれの溶液を超純水を用いて、固形成分０．０１％に希釈した後、ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス社製）を用いて、例１と同様に平均分散粒径の測定を行った。その結果、分散粒径は３５．７ｎｍであった。これらから、１４Ｃ標識カテコール結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の作製を確認した。
【００６４】
例６：カテコール結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の分散性
例４において得られたポリエチレングリコール結合酸化チタン微粒子を用いたカテコール結合酸化チタン機能性分子複合体粒子を、それぞれ１０％血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ製）に対して、固形成分０．０１％になるように添加し、９６時間、室温にて静置した。その後、ゼータサイザーナノＺＳにて例１と同様に平均分散粒径の測定を行った。結果を表１に示す。表１より、それぞれのカテコール結合酸化チタン機能性分子複合体粒子は２０〜２００ｎｍの範囲における粒径をもつことが確認された。
【００６５】
【表１】
【００６６】
例７：カテコール結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の疎水性
例１〜例４において得られた酸化チタン複合体粒子およびカテコール結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の分散液を、それぞれよく攪拌して混合した。１分後、各溶液の液面における気泡の状態を目視にて確認したところ、酸化チタン複合体粒子の分散液に比べて、カテコール結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の分散液は気泡の形成が有意に多いことが確認され、このことから、カテコール結合によってカテコール結合酸化チタン機能性分子複合体粒子は疎水性が強まっているものと考えられた。
【００６７】
例８：ポリエチレングリコール結合酸化チタン微粒子の作製
チタンテトライソプロポキシド３．６ｇとイソプロパノール３．６ｇを混合し、氷冷下で６０ｍｌの超純水に滴下して加水分解を行った。滴下後に室温で３０分間攪拌した。攪拌後、１２Ｎ硝酸１ｍｌを滴下して８０℃で８時間攪拌を行い、ペプチゼーションした。ペプチゼーション終了後０．４５μｍのフィルターで濾過し、さらに脱塩カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）を用いて溶液交換して固形成分１％の酸性酸化チタンゾルを調製した。この酸性酸化チタンゾルを１００ｍｌ容のバイアル瓶に入れ、超音波発生器ＭＩＤＳＯＮＩＣ２００（カイジョー社製）を用いて２００ｋＨｚで３０分間超音波処理を行った。超音波処理を行った後の平均分散粒経を動的光散乱法により測定した。この測定は、超音波処理を行った後の酸性酸化チタンゾルを１２Ｎの硝酸で１０００倍に希釈した後、分散液０．１ｍｌを石英測定セルに仕込み、ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス社製）を用いて、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて行った。その結果、分散粒径は３８．４ｎｍであった。蒸発皿を用いて、５０℃下で酸性酸化チタンゾル溶液の濃縮を行い、最終的に固形成分２０％の酸性酸化チタンゾルを調製した。
【００６８】
次に、ポリオキシエチレン−モノアリル−モノメチルエーテルと無水マレイン酸の共重合体（平均分子量１５０００；ＡＭ１５１０Ｋ−日本油脂製）０．５ｇに超純水４．５ｍｌを添加しポリエチレングリコール溶液とした。次に、超純水を用いて１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ；同仁化学製）を濃度４００ｍＭになるよう調製し、ＥＤＣ溶液とした。ポリエチレングリコール溶液１ｍｌに超純水０．２５ｍｌと０．７５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液０．１ｍｌ、およびＥＤＣ溶液０．５ｍｌを混合調製した。調製した溶液にドーパミン塩酸塩（分子量Ｍｎ＝１５３．１７８：和光純薬工業製）を濃度１５ｍＭになるよう混合して２ｍｌの溶液を得た。この溶液を４０℃にて２時間振とう撹拌して反応させた。反応後、得られた溶液を透析膜であるスペクトラ／ポア ＣＥ 透析用チューブ（分画分子量＝３５００、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に移して超純水４ｌに対して室温にて２４時間で透析を行った。透析後にすべてナスフラスコに移し替えて一晩凍結乾燥し、得られた粉末に４ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ：和光純薬工業）を添加して混合し、ドーパミン結合ポリエチレングリコール溶液とした。
【００６９】
次にＤＭＦを用いてドーパミン結合ポリエチレングリコール溶液が終濃度２０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％、先に得られた酸性酸化チタンゾルが終濃度で固形成分０．２５％となるよう調製し、５ｍｌの反応溶液とした。この反応溶液を水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学製）に溶液を移し替え、１５０℃で６時間加熱反応を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで冷却し、エバポレータでＤＭＦを除去した後に、蒸留水１．２５ｍｌを添加してポリエチレングリコール結合酸化チタン微粒子の分散液とした。この分散液を蒸留水で０．０５（ｗｔ／ｖｏｌ）％水溶液に希釈して２４時間静置後、動的光散乱法による分散粒径およびゼータ電位の確認を、ゼータサイザーナノＺＳを用いて、ゼータ電位測定セルにポリエチレングリコール結合酸化チタン微粒子の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて測定した。キュミュラント解析の結果、分散粒径は５７．３ｎｍ、ゼータ電位は３．４１ｍＶであった。
【００７０】
例９：ポリエチレングリコール結合酸化チタン微粒子の作製
チタンテトライソプロポキシド３．６ｇとイソプロパノール３．６ｇを混合し、氷冷下で６０ｍｌの超純水に滴下して加水分解を行った。滴下後に室温で３０分間攪拌した。攪拌後、１２Ｎ硝酸１ｍｌを滴下して８０℃で８時間攪拌を行い、ペプチゼーションした。ペプチゼーション終了後０．４５μｍのフィルターで濾過し、さらに脱塩カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）を用いて溶液交換して固形成分１％の酸性酸化チタンゾルを調製した。この酸性酸化チタンゾルを１００ｍｌ容のバイアル瓶に入れ、超音波発生器ＭＩＤＳＯＮＩＣ２００（カイジョー社製）を用いて２００ｋＨｚで３０分間超音波処理を行った。超音波処理を行った後の平均分散粒経を動的光散乱法により測定した。この測定は、超音波処理を行った後の酸性酸化チタンゾルを１２Ｎの硝酸で１０００倍に希釈した後、分散液０．１ｍｌを石英測定セルに仕込み、ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス社製）を用いて、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて行った。その結果、分散粒径は３８．４ｎｍであった。蒸発皿を用いて、５０℃下で酸性酸化チタンゾル溶液の濃縮を行い、最終的に固形成分２０％の酸性酸化チタンゾルを調製した。
【００７１】
次に、ポリオキシエチレン−モノアリル−モノメチルエーテルと無水マレイン酸の共重合体（平均分子量３００００；ＡＭ２０９０Ｐ−日本油脂製）０．５ｇに超純水４．５ｍｌを添加しポリエチレングリコール溶液とした。次に、超純水を用いて１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ；同仁化学製）を濃度４００ｍＭになるよう調製し、ＥＤＣ溶液とした。ポリエチレングリコール溶液１ｍｌに超純水０．２５ｍｌと０．７５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液０．１ｍｌ、およびＥＤＣ溶液０．５ｍｌを混合調製した。調製した溶液にドーパミン塩酸塩（分子量Ｍｎ＝１５３．１７８：和光純薬工業製）を濃度１５ｍＭになるよう混合して２ｍｌの溶液を得た。この溶液を４０℃にて２時間振とう撹拌して反応させた。反応後、得られた溶液を透析膜であるスペクトラ／ポア ＣＥ 透析用チューブ（分画分子量＝３５００、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に移して超純水４ｌに対して室温にて２４時間で透析を行った。透析後にすべてナスフラスコに移し替えて一晩凍結乾燥し、得られた粉末に４ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ：和光純薬工業）を添加して混合し、ドーパミン結合ポリエチレングリコール溶液とした。
【００７２】
次にＤＭＦを用いてドーパミン結合ポリエチレングリコール溶液が終濃度２０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％、実施例１で得られた酸性酸化チタンゾルが終濃度で固形成分０．２５％となるよう調製し、５ｍｌの反応溶液とした。この反応溶液を水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学製）に溶液を移し替え、１５０℃で６時間加熱反応を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで冷却し、エバポレータでＤＭＦを除去した後に、蒸留水１．２５ｍｌを添加してポリエチレングリコール結合酸化チタン微粒子の分散液とした。この分散液を蒸留水で０．０５（ｗｔ／ｖｏｌ）％水溶液に希釈して２４時間静置後、動的光散乱法による分散粒径およびゼータ電位の確認を、ゼータサイザーナノＺＳを用いて、ゼータ電位測定セルにポリエチレングリコール結合酸化チタン微粒子の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて測定した。キュミュラント解析の結果、分散粒径は６０．３ｎｍ、ゼータ電位は３．０５ｍＶであった。
【００７３】
例１０：ポリエチレングリコール結合酸化チタン微粒子の作製
チタンテトライソプロポキシド３．６ｇとイソプロパノール３．６ｇを混合し、氷冷下で６０ｍｌの超純水に滴下して加水分解を行った。滴下後に室温で３０分間攪拌した。攪拌後、１２Ｎ硝酸１ｍｌを滴下して８０℃で８時間攪拌を行い、ペプチゼーションした。ペプチゼーション終了後０．４５μｍのフィルターで濾過し、さらに脱塩カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）を用いて溶液交換して固形成分１％の酸性酸化チタンゾルを調製した。この酸性酸化チタンゾルを１００ｍｌ容のバイアル瓶に入れ、超音波発生器ＭＩＤＳＯＮＩＣ２００（カイジョー社製）を用いて２００ｋＨｚで３０分間超音波処理を行った。超音波処理を行った後の平均分散粒経を動的光散乱法により測定した。この測定は、超音波処理を行った後の酸性酸化チタンゾルを１２Ｎの硝酸で１０００倍に希釈した後、分散液０．１ｍｌを石英測定セルに仕込み、ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス社製）を用いて、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて行った。その結果、分散粒径は３８．４ｎｍであった。蒸発皿を用いて、５０℃下で酸性酸化チタンゾル溶液の濃縮を行い、最終的に固形成分２０％の酸性酸化チタンゾルを調製した。
【００７４】
次に、２，４−ｂｉｓ（Ｏ−ｍｅｔｈｏｘｙｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）−６−ｃｈｌｏｒｏ−ｓ−ｔｒｉａｚｉｎｅ（平均分子量１００００；ＰＥＧ２−生化学工業製）０．５ｇに超純水４．５ｍｌを添加しポリエチレングリコール溶液とした。ポリエチレングリコール溶液４ｍｌに５０ｍＭの２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２ｍｌとドーパミン塩酸塩（分子量Ｍｎ＝１５３．１７８：和光純薬工業製）を濃度２．５ｍＭになるよう混合して８ｍｌの溶液を得た。この溶液を室温にて２４時間振とう撹拌して反応させた。反応後、得られた溶液を透析膜であるスペクトラ／ポア ＣＥ 透析用チューブ（分画分子量＝３５００、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に移して超純水４ｌに対して室温にて２４時間で透析を行った。透析後にすべてナスフラスコに移し替えて一晩凍結乾燥し、得られた粉末に４ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ：和光純薬工業）を添加して混合し、ドーパミン結合ポリエチレングリコール溶液とした。
【００７５】
次にＤＭＦを用いてドーパミン結合ポリエチレングリコール溶液が終濃度４０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％、実施例１で得られた酸性酸化チタンゾルが終濃度で固形成分０．２５％となるよう調製し、５ｍｌの反応溶液とした。この反応溶液を水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学製）に溶液を移し替え、１５０℃で６時間加熱反応を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで冷却し、エバポレータでＤＭＦを除去した後に、蒸留水１．２５ｍｌを添加してポリエチレングリコール結合酸化チタン微粒子の分散液とした。この分散液を蒸留水で０．０５（ｗｔ／ｖｏｌ）％水溶液に希釈して２４時間静置後、動的光散乱法による分散粒径およびゼータ電位の確認を、ゼータサイザーナノＺＳを用いて、ゼータ電位測定セルにポリエチレングリコール結合酸化チタン微粒子の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて測定した。キュミュラント解析の結果、分散粒径は１２３ｎｍ、ゼータ電位は１３．１ｍＶであった。
【００７６】
例１１：酸化チタン複合体粒子への蛍光分子の結合
例１で得られた、酸化チタン複合体粒子を超純水にて固形成分１％の分散液とした。次に、ドーパミン塩酸塩（分子量Ｍｎ＝１５３．１７８：和光純薬工業製）を２００ｍＭとなるよう調整した。調整した溶液と分散液を１：９で混合して１ｍｌとし、室温で１時間結合反応を行った。反応後の溶液について可視光域における波長の吸収スペクトルを紫外−可視光分光光度計により確認したところ、それぞれの溶液について増大が認められたため、ドーパミンが結合したと考えられた。また、反応前と反応後の溶液をキャピラリ電気泳動にて以下の条件で付したところ、フォトダイオードアレイ検出器によって吸収波長２１４ｎｍのピークを確認することによりドーパミンの変化量を求めた。
・装置：Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱ（ベックマンコールター製）
・キャピラリ：フューズドシリカキャピラリ ５０μｍ ｉ．ｄ×６７ｃｍ（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｌｅｎｇｔｈ ５０ｃｍ）（ベックマンコールター製）
・移動相：５０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ４．８）
・電圧：２５ｋＶ
・温度：２０℃
求めた変化量よりドーパミンは酸化チタン粒子の質量あたり５．２×１０−２ ドーパミン−ｇ／酸化チタン粒子−ｇであった。
さらに、この溶液２．５ｍｌに対してバッファー交換用自然落下型カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス製）を用いて水３．５ｍｌで回収して未反応のドーパミンを除去した。ドーパミンの除去はキャピラリ電気泳動にて上記と同様に確認し、フリーのドーパミンがないことを確認した。これらからドーパミン結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の作製を確認した。
【００７７】
次にこのドーパミン結合酸化チタン機能性分子複合体粒子を終濃度で０．３％、またＮＨＳ−Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ピアース製）を終濃度で１ｍＭとなるように２０ｍＭホウ酸緩衝液中で混合調整した。この溶液を４℃、遮光下で２４時間静置した。この溶液２．５ｍｌに対してバッファー交換用自然落下型カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス製）を用いて水３．５ｍｌで回収して未反応のＮＨＳ−Ｒｈｏｄａｍｉｎｅを除去した。ＮＨＳ−Ｒｈｏｄａｍｉｎｅの除去はキャピラリ電気泳動にて上記と同様に確認し、フリーのＮＨＳ−Ｒｈｏｄａｍｉｎｅがないことを確認した。得られた溶液を蛍光分光光度計にてスペクトル解析を行い、励起波長５５５ｎｍ、蛍光波長５７５ｎｍであることを確認した。これらのことから、酸化チタン複合体粒子へ蛍光分子を結合した、蛍光分子結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の作製を確認した。
【００７８】
例１２：酸化チタン複合体粒子へのドーパミンの結合
例１で得られた、酸化チタン複合体粒子を超純水にて固形成分１％の分散液とした。次に、ドーパミン塩酸塩（分子量Ｍｎ＝１５３．１７８：和光純薬工業製）を２００ｍＭとなるよう調整した。調整した溶液と分散液を１：９で混合して１ｍｌとし、室温で１時間結合反応を行った。反応後の溶液について可視光域における波長の吸収スペクトルを紫外−可視光分光光度計により確認したところ、それぞれの溶液について増大が認められたため、ドーパミンが結合したと考えられた。また、反応前と反応後の溶液をキャピラリ電気泳動にて以下の条件で付したところ、フォトダイオードアレイ検出器によって吸収波長２１４ｎｍのピークを確認することによりドーパミンの変化量を求めた。
・装置：Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱ（ベックマンコールター製）
・キャピラリ：フューズドシリカキャピラリ ５０μｍ ｉ．ｄ×６７ｃｍ（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｌｅｎｇｔｈ ５０ｃｍ）（ベックマンコールター製）
・移動相：５０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ４．８）
・電圧：２５ｋＶ
・温度：２０℃
求めた変化量よりドーパミンは酸化チタン粒子の質量あたり５．２×１０−２ ドーパミン−ｇ／酸化チタン粒子−ｇであった。
さらに、この溶液２．５ｍｌに対してバッファー交換用自然落下型カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス製）を用いて水３．５ｍｌで回収して未反応のドーパミンを除去した。ドーパミンの除去はキャピラリ電気泳動にて上記と同様に確認し、フリーのドーパミンがないことを確認した。これらからドーパミン結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の作製を確認した。
【００７９】
例１３：酸化チタン複合体粒子へのジヒドロキシフェニルプロピオン酸の結合
例１で得られた、酸化チタン複合体粒子を超純水にて固形成分３％とした。次に、ジヒドロキシフェニルプロピオン酸（和光純薬工業製）を超純水にて、モル濃度で５００ｍＭに調整した。酸化チタン複合体粒子３％溶液に対してジヒドロキシフェニルプロピオン酸溶液を１／１０量混合し、全量で１ｍｌ調整した。調整した溶液を室温で２．５時間結合反応を行った。反応後の溶液について可視光域における波長の吸収スペクトルを紫外−可視光分光光度計により確認したところ、吸光度の増大が認められたため、ジヒドロキシフェニルプロピオン酸が結合したと考えられた。また、反応前と反応後の溶液をキャピラリ電気泳動にて以下の条件で、フォトダイオードアレイ検出器の吸収波長２１４ｎｍのピークを確認することによりジヒドロキシフェニルプロピオン酸の変化量を求めた。
・装置：Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱ（ベックマンコールター製）
・キャピラリ：フューズドシリカキャピラリ ５０μｍ ｉ．ｄ × ６７ｃｍ（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｌｅｎｇｔｈ ５０ｃｍ）（ベックマンコールター製）
・移動相：５０ｍＭ ホウ酸緩衝溶液（ｐＨ９．０）
・電圧：２５ｋＶ
・温度：２０℃
求めた変化量より結合したジヒドロキシフェニルプロピオン酸は酸化チタン粒子の質量あたり４．８×１０−２ ジヒドロキシフェニルプロピオン酸−ｇ／酸化チタン−ｇであった。さらに、この溶液２．５ｍｌに対してバッファー交換用自然落下型カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を用いて水３．５ｍｌで回収して未反応のジヒドロキシフェニルプロピオン酸を除去した。ジヒドロキシフェニルプロピオン酸の除去はキャピラリ電気泳動にて上記と同様に確認し、フリーのジヒドロキシフェニルプロピオン酸がないことを確認した。これらからジヒドロキシフェニルプロピオン酸結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の作製を確認した。
【００８０】
例１４：ジヒドロキシフェニルプロピオン酸結合酸化チタン機能性分子複合体粒子へのエタノールアミンの結合
例９で得られた、ジヒドロキシフェニルプロピオン酸結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の溶液と１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（同仁化学製）を、５０ｍＭ ホウ酸緩衝溶液（ｐＨ９．０）を用いてそれぞれ濃度が１５ｍｇ／ｍｌおよび８０ｍＭとなるように混合して調整した。調整した溶液にエタノールアミン（和光純薬工業製）を濃度１０ｍＭになるよう混合して０．２ｍｌの溶液を得た。この溶液を室温にて２４時間振とう撹拌して反応させた。反応した溶液から５０μｌを超純水にて１０００倍希釈に調整し、これを５０ｍＭ ホウ酸緩衝液に対して１／１０量添加して、４４０μｌとした。さらにアセトンに溶解した０．３ｍｇ／ｍｌのフルオレスカミン（東京化成工業社製）を２０μｌ添加して溶液を攪拌後、蛍光光度計（島津製作所製 ：ＲＦ−５３００）により蛍光値を以下の測定条件で測定した。（波長：Ｅｘ＝３９５ｎｍ／Ｅｍ＝４９５ｎｍ、バンド幅：Ｅｘ＝５ｎｍ／Ｅｍ＝１０ｎｍ、感度：Ｈｉｇｈ、レスポンス：Ａｕｔｏ）。事前に作成した検量線を用いて未結合のエタノールアミンを算出して初期濃度からの濃度変化の割合、すなわち結合した割合を算出した。その結果、６３．１６％であった。以上のことから、ジヒドロキシフェニルプロピオン酸結合酸化チタン機能性分子複合体粒子のジヒドロキシフェニルプロピオン酸を介して、エタノールアミンが結合することを確認した。
【００８１】
例１５：ジヒドロキシフェニルプロピオン酸結合酸化チタン機能性分子複合体粒子への抗体の結合
例１３で得られた、ジヒドロキシフェニルプロピオン酸結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の溶液と１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（同仁化学製）を、超純水を用いてそれぞれ濃度が２０ｍｇ／ｍｌおよび８０ｍＭとなるように混合した。混合した溶液を室温にて１０分間反応した。脱塩カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）を用いて２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝溶液（ｐＨ７．４）に溶液交換し、酸化チタン濃度にして２０ｍｇ／ｍｌの粒子の溶液を得た。これと同一の緩衝液で調製した抗ヒト血清アルブミン（抗ＨＳＡ）モノクローナル抗体（マウスＩｇＧ：ＭＳＵ−３０４、コスモバイオ社）を３ｍｇ／ｍｌになるように添加し、全量で１ｍｌの溶液とした。４℃で２４時間反応後、終濃度が０．５Ｍとなるようエタノールアミンを添加して、さらに４℃で１時間反応した。この溶液を酸化チタン濃度にして１ｍｇ／ｍｌに調製し、ＨＰＬＣ：ＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、カラム：ＨｉＰｒｅｐ １６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−５００ＨＲ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、移動相：リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）、流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ］に１ｍｌ付したところ、素通り画分および結合に用いた抗ＨＳＡモノクローナル抗体が単体で確認される画分にＵＶ吸収のピークが確認され、これらの画分を回収した。素通り画分について、蒸留水で０．０５（ｗｔ／ｖｏｌ）％水溶液に希釈して２４時間静置後、動的光散乱法による分散粒径およびゼータ電位の確認を、ゼータサイザーナノＺＳを用いて、ゼータ電位測定セルにポリエチレングリコール結合酸化チタン微粒子の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて測定した。キュミュラント解析の結果、分散粒径は５０．３ｎｍ、ゼータ電位は−３．０ｍＶであった。また、抗ＨＳＡモノクローナル抗体が単体で確認される画分については、ブラッドフォード法でタンパク質濃度を測定した結果、反応前後で抗体濃度の減少が確認された。以上のことから、ジヒドロキシフェニルプロピオン酸結合酸化チタン機能性分子複合体粒子のジヒドロキシフェニルプロピオン酸を介して、抗体分子が結合することを確認した。
【００８２】
例１６：酸化チタン複合体粒子へのアミノレブリン酸およびジヒドロキシフェニルエタノールの結合
３，４−ジヒドロキシフェニルエタノール（和光純薬工業製）３００ｍｇをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；和光純薬工業製）０．５ｍｌに溶解した。この溶液に塩化チオニル（和光純薬工業製）を０．１ｍｌ加えて攪拌後、トルエン（和光純薬工業製）を７ｍｌ混合した。さらに、５−アミノレブリン酸塩酸塩（和光純薬工業製）を２５０ｍｇ加え、攪拌しながら８０℃で１時間反応させた。反応後、二層に分かれた上層部および下層部をそれぞれ回収した。この回収液の一部と３，４−ジヒドロキシフェニルエタノールおよび５−アミノレブリン酸塩酸塩のＤＭＦ溶液を薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）を用いて、アセトン（和光純薬工業製）：メタノール（和光純薬工業製）＝２：３の溶液を用いて展開した後、乾燥したＴＬＣ板にニンヒドリンスプレー（和光純薬工業）を噴霧して加熱後、スポットの観察を行った。その結果、回収液のうち下層部の展開スポットが３，４−ジヒドロキシフェニルエタノールおよび５−アミノレブリン酸塩酸塩とは異なる位置にあり、ニンヒドリン反応によって呈色したことから、３，４−ジヒドロキシフェニルエタノールと５−アミノレブリン酸塩酸塩の複合体が生成したと考えられた。回収液のうち下層部を減圧下で１０倍に濃縮し、反応濃縮溶液とした。例１で得られた、酸化チタン複合体粒子を超純水にて固形成分１％に調整し、そこに反応濃縮溶液を１／１０量混合して、全量で１ｍｌとした。この混合溶液を緩やかに攪拌しながら、室温で１時間反応を行った。反応後、沈殿成分を遠心分離（１５００ｇ、１０ｍｉｎ）して上澄みを回収し、この溶液１ｍｌに対してバッファー交換用自然落下型カラムＮＡＰ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を用いて水１．５ｍｌで回収して未反応の３，４−ジヒドロキシフェニルエタノールと５−アミノレブリン酸塩酸塩の複合体がおよびＤＭＦを除去した。この溶液について可視光域（４００ｎｍ）における波長の吸収スペクトルを紫外−可視光分光光度計（ＵＶ１６００；島津製作所製）により確認したところ増大が認められたため、３，４−ジヒドロキシフェニルエタノールと５−アミノレブリン酸塩酸塩の複合体が結合したと考えられた。これらから３，４−ジヒドロキシフェニルエタノールと５−アミノレブリン酸塩酸塩の複合体結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の作製を確認した。
【００８３】
例１７：酸化チタン複合体粒子への葉酸およびドーパミンの結合
葉酸（和光純薬工業製）および塩酸ドーパミン（和光純薬工業製）を１ｍＭとなるようジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；和光純薬工業製）に溶解した。また、同様にＤＭＦを用いて２００ｍＭ Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ−１−ｙｌ−ｏｘｙ−ｔｒｉｓｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＰｙＢｏｐ；メルク製）、２００ｍＭ １−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨｏＢｔ；同仁化学製）、２０ｍＭ Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ；和光純薬工業製）をそれぞれ調製した。これらのうち、葉酸と塩酸ドーパミンは元濃度の１／４、またその他は元濃度の１／１０となるよう混合してＤＭＦで２０ｍｌに溶液調整した。この混合溶液を緩やかに攪拌しながら、室温で２０時間反応を行った。反応溶液の一部を超純水で１０倍に希釈し、この溶液を逆相クロマトグラフィ（ＨＰＬＣシステム：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所製）、カラム：Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ ＲＰ−１８ｅ １００−３ｍｍ（メルク製）、移動相：Ａ メタノール（和光純薬工業製）Ｂ ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液（和光純薬工業製）、流速：２ｍｌ／ｍｉｎ）を用いて解析した。紫外線検出器で波長２１０ｎｍに設定し、インジェクション（０．０２ｍｌ）後、１〜１０ｍｉｎにおいてメタノールが１００％となるようグラジエント溶出を行った結果、９ｍｉｎ付近に葉酸と塩酸ドーパミンの複合体と考えられるピークを確認した。また、葉酸および塩酸ドーパミンそれぞれ単独のピークは検出限界以下であった。これらのことから、葉酸と塩酸ドーパミンの複合体の生成を確認した。次に、反応溶液の残りを減圧下で１０倍に濃縮し、反応濃縮溶液とした。例１で得られた、酸化チタン複合体粒子を超純水にて固形成分１％に調整し、そこに反応濃縮溶液を１／１０量混合して、全量で１ｍｌとした。この混合溶液を緩やかに攪拌しながら、室温で１時間反応を行った。反応後、沈殿成分を遠心分離（１５００ｇ、１０ｍｉｎ）して上澄みを回収し、この溶液１ｍｌに対してバッファー交換用自然落下型カラムＮＡＰ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を用いて水１．５ｍｌで回収して未反応の葉酸と塩酸ドーパミンの複合体およびＤＭＦを除去した。葉酸と塩酸ドーパミンの複合体およびＤＭＦの除去は逆相クロマトグラフィにて上記と同様に確認し、フリーの葉酸と塩酸ドーパミンの複合体がないことを確認した。これらから葉酸と塩酸ドーパミンの複合体結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の作製を確認した。
【００８４】
例１８：葉酸と塩酸ドーパミンの複合体結合酸化チタン機能性分子複合体粒子への紫外線照射と蛍光の確認
例１７で得られた葉酸と塩酸ドーパミンの複合体結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の溶液を、リン酸緩衝生理食塩水を用いて酸化チタン濃度がそれぞれ０．０５、０．０１、０．００５％となるよう３ｍｌに調製した。これらの溶液を攪拌しながら、波長３５２ｎｍの紫外線ランプ（ＦＬ２０Ｓ・ＢＬＢ−Ａ；東芝ライテック製）を用いて紫外線強度０．９ｍＷ／ｃｍ２で照射し、照射開始後０、３、６、９ｍｉｎにおける溶液の蛍光強度を、蛍光分光光度計（ＲＦ−５３００ＰＣ；島津製作所製）を用いて励起波長３６０ｎｍおよび蛍光波長４５０ｎｍに設定し、それぞれ測定を行った。結果を図２に示す。照射時間および酸化チタン濃度の増加に伴い、蛍光強度が大きくなることが確認された。これは、この溶液への紫外線照射によって生じたラジカルとの反応に伴い、葉酸から遊離したプテリン化合物由来の蛍光であると考えられた。
【００８５】
例１９：ジヒドロキシフェニルプロピオン酸結合酸化チタン機能性分子複合体粒子へのメチオニンの結合
例１３で得られた、ジヒドロキシフェニルプロピオン酸結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の溶液と１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（同仁化学製）を、５０ｍＭ ホウ酸緩衝溶液（ｐＨ９．０）を用いてそれぞれ濃度が１５ｍｇ／ｍｌおよび８０ｍＭとなるように混合に調整した。調整した溶液にメチオニン（和光純薬工業製）を濃度１０ｍＭになるよう混合して０．２ｍｌの溶液を得た。この溶液を室温にて２４時間振とう撹拌して反応させた。反応した溶液から５０μｌを超純水にて１０００倍希釈に調整し、これを５０ｍＭ ホウ酸緩衝液に対して１／１０量添加して、４４０μｌとした。さらにアセトンに溶解した０．３ｍｇ／ｍｌのフルオレスカミン（東京化成工業社製）を２０μｌ添加して溶液を攪拌後、蛍光光度計（島津製作所製 ：ＲＦ−５３００）により蛍光値を以下の測定条件で測定した。（波長：Ｅｘ＝３９５ｎｍ／Ｅｍ＝４９５ｎｍ、バンド幅：Ｅｘ＝５ｎｍ／Ｅｍ＝１０ｎｍ、感度：Ｈｉｇｈ、レスポンス：Ａｕｔｏ）。事前に作成した検量線を用いて未結合のメチオニンを算出して初期濃度からの濃度変化の割合、すなわち結合した割合を算出した。その結果、４０．２％であった。以上のことから、ジヒドロキシフェニルプロピオン酸結合酸化チタン機能性分子複合体粒子のジヒドロキシフェニルプロピオン酸を介して、メチオニンが結合することを確認した。
【００８６】
例２０：ドーパミン結合酸化チタン機能性分子複合体粒子へのラジカル応答性分子の結合
例１２で得られたドーパミン結合酸化チタン機能性分子複合体粒子を終濃度で０．３％、また２，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−６−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏ−１，４−ｐｈｔｈａｌａｚｉｎｅｄｉｏｎｅ（同仁化学製）を終濃度で１ｍＭとなるように２０ｍＭリン酸緩衝液中（ｐＨ７．０）で混合し、３ｍｌに調整した。この溶液を４℃、遮光下で２４時間静置し、結合反応を行った。この溶液２．５ｍｌに対してバッファー交換用自然落下型カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス製）を用いて水３．５ｍｌで回収して未反応物の除去を行った。これらのことから、酸化チタン複合体粒子へラジカル応答性分子である２，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−６−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏ−１，４−ｐｈｔｈａｌａｚｉｎｅｄｉｏｎｅを結合した、ラジカル応答性分子結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の作製を確認した。
【００８７】
例２１：ドーパミン結合酸化チタン機能性分子複合体粒子へのラジカル応答性分子の結合２
例１２で得られたドーパミン結合酸化チタン機能性分子複合体粒子を終濃度で０．３％、また２’，７’−ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ，ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を終濃度で１ｍＭとなるように２０ｍＭリン酸緩衝液中（ｐＨ７．０）で混合し、３ｍｌに調整した。この溶液を４℃、遮光下で２４時間静置し、結合反応を行った。この溶液２．５ｍｌに対してバッファー交換用自然落下型カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス製）を用いて水３．５ｍｌで回収して未反応物を除去した。これらのことから、酸化チタン複合体粒子へラジカル応答性分子である２’，７’−ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ，ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒを結合した、蛍光分子結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の作製を確認した。
【００８８】
例２２：酸化チタン複合体粒子へのフェロセンカルボン酸およびドーパミンの結合
フェロセンカルボン酸（和光純薬工業製）および塩酸ドーパミン（和光純薬工業製）を１ｍＭとなるようジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；和光純薬工業製）に溶解した。また、同様にＤＭＦを用いて２００ｍＭ Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ−１−ｙｌ−ｏｘｙ−ｔｒｉｓｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＰｙＢｏｐ；メルク製）、２００ｍＭ １−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨｏＢｔ；同仁化学製）、２０ｍＭ Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ；和光純薬工業製）をそれぞれ調製した。これらのうち、フェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンは元濃度の１／４、またその他は元濃度の１／１０となるよう混合してＤＭＦで２０ｍｌに溶液調整した。この混合溶液を緩やかに攪拌しながら、室温で２０時間反応を行った。反応溶液の一部を超純水で１０倍に希釈し、この溶液を逆相クロマトグラフィ（ＨＰＬＣシステム：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所製）、カラム：Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ ＲＰ−１８ｅ １００−３ｍｍ（メルク製）、移動相：Ａ メタノール（和光純薬工業製）Ｂ ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液（和光純薬工業製）、流速：２ｍｌ／ｍｉｎ）を用いて解析した。紫外線検出器で波長２１０ｎｍに設定し、インジェクション（０．０２ｍｌ）後、１〜１０ｍｉｎにおいてメタノールが１００％となるようグラジエント溶出を行った結果、フェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンの複合体と考えられるピークを確認した。また、フェロセンカルボン酸および塩酸ドーパミンそれぞれ単独のピークは検出限界以下であった。これらのことから、フェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンの複合体の生成を確認した。
【００８９】
反応溶液の残りを減圧下で１０倍に濃縮し、反応濃縮溶液とした。例１で得られた、酸化チタン複合体粒子を超純水にて固形成分１％に調整し、そこに反応濃縮溶液を１／１０量混合して、全量で１ｍｌとした。この混合溶液を緩やかに攪拌しながら、室温で１時間反応を行った。反応後、沈殿成分を遠心分離（１５００ｇ、１０ｍｉｎ）して上澄みを回収し、この溶液１ｍｌに対してバッファー交換用自然落下型カラムＮＡＰ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を用いて水１．５ｍｌで回収して未反応のフェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンの複合体およびＤＭＦを除去した。この溶液について可視光域（４００ｎｍ）における波長の吸収スペクトルを紫外−可視光分光光度計（ＵＶ１６００；島津製作所製）により確認したところ増大が認められたため、フェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンの複合体が結合したと考えられた。これらからフェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンの複合体結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の作製を確認した。
【００９０】
例２３：ドーパミン結合酸化チタン機能性分子複合体粒子への蛍光分子の結合２
例１２で得られたドーパミン結合酸化チタン機能性分子複合体粒子を終濃度で０．３％、またＣｙ７−ＮＨＳ ｅｓｔｅｒ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス製）を終濃度で１ｍＭとなるように２０ｍＭリン酸緩衝液中（ｐＨ７．０）で混合し、３ｍｌに調整した。この溶液を４℃、遮光下で２４時間静置し、結合反応を行った。この溶液２．５ｍｌに対してバッファー交換用自然落下型カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス製）を用いて水３．５ｍｌで回収して未反応物を除去した。この溶液について蛍光強度を、蛍光分光光度計（ＲＦ−５３００ＰＣ；島津製作所製）を用いて励起波長７４３ｎｍおよび蛍光波長７６７ｎｍに設定して測定を行った結果、蛍光を示すことが確認された。これらのことから、酸化チタン複合体粒子へ蛍光分子であるＣｙ７−ＮＨＳ ｅｓｔｅｒを結合した、蛍光分子結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の作製を確認した。
【００９１】
例２４：酸化チタン複合体粒子へのカテコール結合２
例８〜１０で得られた、それぞれの酸化チタン複合体粒子を超純水にて固形成分１％とした。次に、カテコールを超純水にて、モル濃度で１００ｍＭ、１０ｍＭ、１ｍＭ、０．１ｍＭに調整した。酸化チタン複合体粒子１％溶液に対してそれぞれのカテコール溶液を等量ずつ混合し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）で最終的に酸化チタン複合体粒子とカテコール溶液がそれぞれ終濃度で１０倍希釈になるように調整した。調整した溶液をそれぞれ恒温器に移して４０℃に設定し、３時間結合反応を行った。反応後の溶液について可視光域における波長の吸収スペクトルを紫外−可視光分光光度計により確認したところ、それぞれの溶液について増大が認められたため、カテコールが結合したと考えられた。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】本発明の酸化チタン機能性分子複合体粒子の一例を示す図である。
【図２】例１８において測定された、例１７で得られた酸化チタン機能性分子複合体粒子の紫外線照射時間と、蛍光強度との関係を示す図である。
【符号の説明】
【００９３】
１…酸化チタン粒子
２…水溶性高分子
３…機能性分子
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水溶性高分子により水系溶媒中で分散させた酸化チタン複合体粒子に対して、水溶性高分子を変質させることなく機能性分子を酸化チタン表面に結合させた酸化チタン機能性分子複合体粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
酸化チタンはｐＨ６前後に等電点を有すると言われている。このため、酸化チタン粒子は中性付近の水系溶媒中では凝集を生じてしまい、これを均一に分散させることは極めて難しい。そのため、酸化チタン粒子を水系の分散媒に均一に分散させるため、今まで種々の試みがなされてきた。
【０００３】
ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を分散剤として添加して、分散媒中における酸化チタン粒子の分散性を向上させることが知られている（特許文献１（特開平２−３０７５２４号公報）および特許文献２（特開２００２−６０６５１号公報）参照）。
【０００４】
あるいは酸化チタン微粒子に、ポリアクリル酸等の親水性高分子を、カルボキシル基を介して結合させた、表面改質酸化チタン微粒子も知られている（特許文献３（ＷＯ２００４／０８７５７７）参照）。この技術は、ポリアクリル酸等といったアニオン性ポリマーの使用を念頭としたものである。アニオン性ポリマーのもつカルボキシル基等の官能基により表面電荷を与え、それにより生体内環境に近い中性の生理食塩水においても安定した分散性を示し、かつ光触媒活性機能を有するものである。
【０００５】
更に、酸化チタンに機能性を付与する検討がなされている。例えば、前記表面改質酸化チタン微粒子に対して、前記親水性高分子の結合に関与していないカルボキシル残基に、目的分子に対して特異的な結合能を有する分子を固定化した、分子識別能を有する二酸化チタン複合体が提案されている（特許文献４（特許第３８３５７００号）参照）。この技術は、アニオン性ポリマーのもつカルボキシル基等の官能基により、分子が固定化されていても表面電荷を与え、安定した分散性を示すものである。一方で、官能基によって与えられる表面電荷は分散性に直接寄与しており、結合に関与していない残基に分子を固定化することで表面電荷は減少する。このことが固定化される分子の量等に対して制限を与える。
【０００６】
【特許文献１】特開平２−３０７５２４号公報
【特許文献２】特開２００２−６０６５１号公報
【特許文献３】ＷＯ２００４／０８７５７７号パンフレット
【特許文献４】特許第３８３５７００号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、水溶性高分子により水系溶媒中で分散させた酸化チタン複合体粒子において、前記水溶性高分子を変質させることなく高い分散性を保持し、かつ、酸化チタン表面に結合した機能性分子により、酸化チタン表面付近での新たな機能性付与を実現した酸化チタン機能性分子複合体粒子およびその分散体の提供をその目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、今般、水溶性高分子により水系溶媒中で分散させた酸化チタン複合体粒子の酸化チタン表面に、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基の群から選択される少なくともひとつの官能基を介して機能性分子を結合させることにより、前記水溶性高分子を変質させることなく、新たな機能性付与を実現できるとの知見を得た。
【０００９】
すなわち、本発明の酸化チタン機能性分子複合体粒子によれば、水溶性高分子を変質させることなく酸化チタン表面に対し機能性分子を結合させることにより、水溶性高分子による高い分散性を保持できる。このため、機能性分子の結合に際して自由度の高い分子設計が可能である。また、機能性分子を酸化チタン表面に結合することにより、酸化チタン表面付近において超音波や紫外線照射によって発生したラジカル種と機能性分子との反応性が高い。このため、機能性分子および機能性分子と相互作用を有する対象物との反応性を著しく向上することができる。前記対象物が癌細胞の場合にあっては、超音波や紫外線による癌の治療効果を著しく向上することができる。そのため、本発明の酸化チタン機能性分子複合体粒子は、患部に超音波を照射することにより行われる超音波癌治療を促進するための超音波癌治療促進剤としても利用可能である。
【００１０】
そして、本発明の酸化チタン機能性分子複合体粒子は、
酸化チタン粒子と、
該酸化チタン粒子の表面に、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基の群から選択される少なくともひとつの官能基を介して結合されてなる水溶性高分子を含んでなる、酸化チタン複合体粒子と、
該酸化チタン複合体粒子の表面に、さらに結合されてなる機能性分子を含んでなり、
前記機能性分子は、
（１）カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基の群から選択される少なくとも一つの官能基を有し、
（２）ａ）炭素数６〜４０よりなる飽和又は不飽和の鎖状炭化水素基、ｂ）置換基を有するか有しない飽和又は不飽和の５〜６員環複素環式基、又はｃ）置換基を有するか有しない飽和又は不飽和の５〜６員環環状炭化水素水素基を含んでなる化合物であって、
前記官能基を介して前記酸化チタンと結合されてなる、酸化チタン機能性分子複合体粒子であることを特徴とするものである。
【００１１】
また、本発明による分散液は、酸化チタン機能性分子複合体粒子と、該粒子が分散される溶媒とを含んでなるものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、水溶性高分子を変質させることなく高い分散性を保持し、かつ、酸化チタン表面に結合した機能性分子により、酸化チタン表面付近での新たな機能性付与を実現した酸化チタン機能性分子複合体粒子およびその分散体を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明による酸化チタン機能性分子複合体粒子は、酸化チタン粒子と、水溶性高分子と、機能性分子を含む。図１に、酸化チタン機能性分子複合体粒子の一例を示す。図１に示されるように、酸化チタン機能性分子複合体粒子は、酸化チタン粒子１の表面に水溶性高分子２および機能性分子３が結合されたものである。酸化チタン粒子１と、水溶性高分子２および機能性分子３との結合は、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基から選択される少なくとも１種の官能基を介して形成される。
【００１４】
すなわち、これらの官能基は酸化チタンとの間で強固な結合を形成するため、酸化チタン粒子の高い触媒活性に関わらず分散性を保持できる。これらの官能基は酸化チタンとの間で強固な結合を形成するため、酸化チタン粒子の高い触媒活性にかかわらず水溶性高分子および機能性分子の結合を保持することが可能である。なお、本発明における結合形態は、体内における安全性の観点から、体内への投与後２４〜７２時間後に分散性が確保されている程度の結合形態であればよい。生理条件での分散が安定しており、かつ超音波や紫外線照射後も水溶性高分子の遊離が無く、正常細胞へのダメージが少ない点で、共有結合であるのが望ましい。
【００１５】
カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基は、３官能シラノール基のような相互に三次元的に縮合重合して重合物で酸化チタン粒子の表面を覆い尽くしてしまう官能基とは異なり、官能基同士で重合することが無いため、図１に示されるように酸化チタン粒子の表面に剥き出しの部分を確保することができると考えられる。その結果、表面が重合体で覆われることによって起こりうる失活を抑制しつつ、酸化チタン粒子の触媒活性を十分に発揮させることができる。
【００１６】
そして、酸化チタン粒子の表面に結合した水溶性高分子は、電荷あるいは水和の作用によって、酸化チタン粒子の分散が困難とされる中性付近の水系溶媒中であって酸化チタン機能性分子複合体粒子を高度に分散させることができる。機能性分子を、酸化チタン粒子の表面に結合した水溶性高分子に対して導入する方法については公知である。このような場合は、水溶性高分子と機能性分子を化学結合するために、水溶性高分子は反応性の高い極性基を含んでなることが必要である。この水溶性高分子に含まれる極性基は、機能性分子が結合されると失われる。このことにより、水溶性高分子の極性自体に変化が生じる。つまり、酸化チタン粒子の表面に結合した水溶性高分子のもつ電荷あるいは水和の作用によって分散しているバランスが、機能性分子の結合前後において変化すると考えられる。この酸化チタン粒子の表面に結合した水溶性高分子の変質に伴う電荷あるいは水和のバランスをうまくコントロールすることでのみ達成しうる。一方、本発明における酸化チタン粒子の表面に結合した機能性分子については、水溶性高分子を変質させることなく結合させることにより、水溶性高分子による高い分散性を保持できる。このため、水溶性高分子の変質によって生じる分散性の変化を考慮することなく、機能性分子の結合に際して自由度の高い分子設計が可能である。
【００１７】
本発明の酸化チタン機能性分子複合体粒子によれば、前記機能性分子として酸化チタン表面に対し、疎水性や細胞認識性の分子を導入することで、水溶性高分子を変質させることなく高い分散性を保持することができる。さらに、酸化チタン表面付近におけるこれら分子と細胞との高い相互作用を発揮できる。細胞認識性の分子を酸化チタン粒子の表面に結合しているので、酸化チタン表面付近において超音波や紫外線照射によって発生したラジカル種との反応速度を向上させ、殺対象が癌細胞の場合にあっては、超音波や紫外線による癌の治療効果を著しく向上することができる。そのため、本発明の酸化チタン機能性分子複合体粒子は、投与後に選択的に患部に取り込まれ、その後に患部に超音波を照射することにより行われる超音波癌治療を促進するための、細胞認識性を有する超音波癌治療促進剤としても利用可能である。
【００１８】
また、本発明の酸化チタン機能性分子複合体粒子によれば、前記機能性分子として酸化チタン表面に対し、光応答性の分子や放射性物質を導入することで、水溶性高分子を変質させることなく高い分散性を保持することができる。さらに、酸化チタン表面を直接的にこれらの分子を標識することができる。特に、放射性物質に関しては、安全性の観点から取り扱いに注意が必要であるが、水溶性高分子により水系溶媒中で分散させた酸化チタン複合体粒子に対して、酸化チタン表面に放射性物質を結合した後に、未結合の放射性物質を適当な方法で分離除去するだけの、簡易でかつ少ない工程によって粒子の標識ができる。このため、放射性物質が外部に広がる機会が少なく、安全性の面において優れる。また、これを適当な機器により測定することで粒子のイメージングや定量の測定が可能である。そのため、本発明の酸化チタン機能性分子複合体粒子は、体内に投与後に体内動態を確認するためのトレーサー実験用材料や、患部に超音波や光を照射することにより行われる診断および治療のための医療用材料としても利用可能である。
【００１９】
さらに、本発明の酸化チタン機能性分子複合体粒子によれば、前記機能性分子として酸化チタン表面に対し、ラジカル応答性の分子を導入することで、水溶性高分子を変質させることなく高い分散性を保持することができる。さらに、酸化チタン表面付近において超音波や紫外線照射によって発生したラジカル種との反応速度を向上させ、高い反応性を発揮することができる。前記ラジカル応答性の分子が、ラジカル種との反応により蛍光性や発光性を示すものを用いれば、これを適当な機器により測定することで粒子のイメージングやラジカル種発生量の測定が可能である。そのため、本発明の酸化チタン機能性分子複合体粒子は、患部に超音波や光を照射することにより行われる診断および治療のための医療用材料としても利用可能である。
【００２０】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いる水溶性高分子は、酸化チタン粒子の表面に、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基の群から選択される少なくともひとつの官能基を介して結合されてなることが好ましい。これによって、酸化チタン粒子の表面に強固に結合することが可能であり、また、３官能シラノール基のような相互に三次元的に縮合重合して重合物で酸化チタン粒子の表面を覆い尽くしてしまう官能基とは異なり、官能基同士で重合することが無いため、図１に示されるように酸化チタン粒子の表面に剥き出しの部分を多く確保することができると考えられる。その結果、表面が重合体で覆われることによって起こりうる失活を抑制しつつ、酸化チタン粒子の触媒活性を十分に発揮させることができる。
【００２１】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いる水溶性高分子は、酸化チタン機能性分子複合体粒子を水系溶媒中で分散させることができれば特に限定されないが、電荷を有するものとしては、アニオン性またはカチオン性を有する水溶性高分子、また、電荷を有さずに水和によって分散性を与えるものとしてはノニオン性を有する水溶性高分子が挙げられ、これらの少なくとも一種を含んでなる。
【００２２】
本発明の好ましい態様によれば、前記水溶性高分子は重量平均分子量２０００〜１０００００である。水溶性高分子の重量平均分子量はサイズ排除クロマトグラフィーを用いて求めた値である。前記分子量をこの範囲とすることで、水溶性高分子のもつ電荷あるいは水和の作用によって、酸化チタン粒子の分散が困難とされる中性付近の水系溶媒中であって酸化チタン機能性分子複合体粒子を高度に分散させることができる。
より好ましい範囲は５０００〜１０００００であり、さらに好ましくは５０００〜４００００である。
【００２３】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いる水溶性高分子は、アニオン性を有する水溶性高分子として酸化チタン機能性分子複合体粒子を水系溶媒中で分散させることができればいずれも使用可能であるが、複数のカルボキシル基を有するものとしては、例えばカルボキシメチルデンプン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルセルロース、ポリカルボン酸類、およびカルボキシル基単位を有する共重合体（コポリマー）などが挙げられる。具体的には、水溶性高分子の加水分解性および溶解度の観点から、ポリアクリル酸、ポリマレイン酸等のポリカルボン酸類、およびアクリル酸／マレイン酸やアクリル酸／スルフォン酸系モノマーの共重合体（コポリマー）がより好適に使用され、さらに好ましくはポリアクリル酸である。
【００２４】
アニオン性を有する水溶性高分子として、ポリアクリル酸を用いる場合、分散性の観点からポリアクリル酸の重量平均分子量は２０００〜１０００００であるのが好ましく、より好ましくは５０００〜４００００であり、さらに好ましくは５０００〜２００００である。
【００２５】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いる水溶性高分子は、カチオン性を有する水溶性高分子として酸化チタン機能性分子複合体粒子を水系溶媒中で分散させることができればいずれも使用可能であるが、複数のアミノ基を有するものとしては、例えばポリアミノ酸、ポリペプチド、ポリアミン類、およびアミン単位を有する共重合体（コポリマー）などが挙げられる。具体的には、水溶性高分子の加水分解性および溶解度の観点から、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン等のポリアミン類がより好適に使用され、さらに好ましくはポリエチレンイミンである。
【００２６】
カチオン性を有する水溶性高分子として、ポリエチレンイミンを用いる場合、分散性の観点からポリエチレンイミンの重量平均分子量は２０００〜１０００００であるのが好ましく、より好ましくは５０００〜４００００であり、さらに好ましくは５０００〜２００００である。
【００２７】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いる水溶性高分子は、ノニオン性を有する水溶性高分子として酸化チタン機能性分子複合体粒子を水系溶媒中で分散させることができればいずれも使用可能であるが、好ましくは水酸基および／またはポリオキシアルキレン基を有する高分子が挙げられる。そのような水溶性高分子の好ましい例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、デキストランあるいはそれらを含有するコポリマーが挙げられ、より好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデキストランであり、さらに好ましくはポリエチレングリコールである。
【００２８】
ノニオン性を有する水溶性高分子として、ポリエチレングリコールを用いる場合、分散性の観点からポリエチレングリコールの重量平均分子量は２０００〜１０００００であるのが好ましく、より好ましくは５０００〜４００００である
【００２９】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いる機能性分子は、酸化チタン粒子表面に結合してなるが、該機能性分子はカルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基の群から選択される少なくともひとつの官能基を有する。
【００３０】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いる機能性分子は、ａ）炭素数６〜４０よりなる飽和又は不飽和の鎖状炭化水素基、ｂ）置換基を有するか有しない飽和又は不飽和の５〜６員環複素環式基、又はｃ）置換基を有するか有しない飽和又は不飽和の５〜６員環環状炭化水素基を含んでなる化合物である。
【００３１】
上記炭素数よりなる機能性分子は、前記水溶性高分子と比べて分子の大きさが小さい。また、機能性分子は酸化チタン表面に結合してなる。このため、本発明の酸化チタン機能性分子複合体粒子において、外殻に水溶性高分子が位置するのに対し、より内部の位置に機能性分子を有する構造をとる。該外殻は酸化チタン機能性分子複合体粒子の分散性に対する影響が最も大きい。すなわち外殻に位置する水溶性高分子に対して、内部に位置する機能性分子が分散性に与える影響は小さくなり、好適に用いることが出来る。
【００３２】
また、上記炭素数よりなる機能性分子は、機能性分子は酸化チタン粒子表面に結合してなるため、酸化チタン表面付近において超音波や紫外線照射によって発生したラジカル種と機能性分子との反応性が高く、機能性分子および機能性分子と相互作用を有する対象物との反応性を著しく向上することができ、好適に用いることが出来る。
【００３３】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いる機能性分子は、特にその機能は限定されないが、疎水性、細胞認識性、光応答性、放射性、ラジカル応答性、および医薬の他、抗体等の生体分子や他の機能性分子等とのリンカー、などが挙げられる。
【００３４】
前記酸化チタン機能性分子複合体粒子に結合された機能性分子の量は、前記酸化チタン粒子の質量あたり、１．０×１０−１〜１．０×１０−５ 質量部／酸化チタン粒子の質量部であり、好ましくは１．０×１０−２〜１．０×１０−５ 質量部／酸化チタン粒子の質量部であることが好ましい。この範囲であると、酸化チタン機能性分子複合体粒子は生体内環境に近い、１０％タンパク質溶液を溶媒としても分散することができるため、好適に用いることができる。
【００３５】
そのような機能性分子の例としては、芳香族化合物やアルキル構造をもつ分子等が考えられ、より具体的には、ベンゼン環をもつ分子として、カテコール、メチルカテコール、ターシャリーブチルカテコールドーパ、ドーパミン、ジヒドロキシフェニルエタノール、ジヒドロキシフェニルプロピオン酸、ジヒドロキシフェニル酢酸等の、分子内にカテコールの構造を有する、カテコール類などがあげられる。また、他の環状分子として、フェロセン、フェロセンカルボン酸、アスコルビン酸、ジハイドロキシシクロブテンジエン、アリザリン、ビナフタレンジオール等が好適に使用できる。さらに、アルキル構造をもつ分子としては、ヘキシル基、オクチル基、ラウリル基、パルミチル基、ステアリル基などのアルキル基を有する分子があげられる。あるいは、ヘキセニル基、オクテニル基、オレイル基などのアルケニル基、または、シクロアルキル基などの飽和又は不飽和脂肪族炭化水素基をもつものなどがあげられる。
【００３６】
また、機能性分子の他の例としては、細胞認識性においては結合活性部位を含むペプチドやアミノ酸配列であってもよい。より具体的には５−アミノレブリン酸、メチオニン、システイン、グリシン等があげられる。あるいは、糖鎖を含んでもよい。さらに、結合性を有する核酸を含んでいても良い。核酸としては、特に制限はなく、ＤＮＡ、ＲＮＡの他、アプタマー等の核酸塩基、ＰＮＡ等のペプチド核酸を用いることもできる。
【００３７】
また、機能性分子の他の例としては、光応答性においては蛍光性分子を含んでなるものを用いることが出来る。
【００３８】
また、機能性分子の他の例としては、放射性においては同位体元素を含む化合物が挙げられ、例えば１４Ｃを有する１４Ｃ標識カテコールなどが好適に用いられる。
【００３９】
また、機能性分子の他の例としては、ラジカル応答性においてはラジカルと特異的な反応性を示す化学発光性分子や蛍光性分子、またはスピントラップ剤を含んでなることが挙げられる。より具体的には、化学発光性分子や蛍光性分子として、ルミノール、海ホタルルシフェリン類縁体、シュウ酸エステル、アクリジニウム、パラヒドロキシフェニルフルオレセイン、パラアミノフェニルフルオレセイン、ジヒドロローダミン１２３、ジヒドロローダミン６Ｇ、トランス‐１‐（２’‐メトキシビニル）ピレン、ジヒドロキシエチジウム、葉酸、（２’，７’−ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ，ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ（インビトロジェン）、）、５−ｏｒ６−（Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−３’，６’−Ｏ，Ｏ’−ｄｉａｃｅｔｙｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｃｙ色素（アマシャムバイオサイエンス社製）、プテリンなどであり、スピントラップ剤としては、４，６−Ｔｒｉ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｎｉｔｒｏｓｏｂｅｎｚｅｎｅ、２−Ｍｅｔｈｙｌ−２−ｎｉｔｒｏｓｏｐｒｏｐａｎｅ、３，３，５，５−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ Ｎ−Ｏｘｉｄｅ、５，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ Ｎ−Ｏｘｉｄｅ、５−（Ｄｉｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｏ）−５−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ Ｎ−Ｏｘｉｄｅ、Ｎ−ｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌ−ａｌｐｈａ−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ−１−ｏｘｉｄｅ）ｎｉｔｒｏｎｅ、Ｎ−ｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌ−ａｌｐｈａ−ｐｈｅｎｙｌｎｉｔｒｏｎｅ、Ｎｉｔｒｏｓｏｂｅｎｚｅｎｅ、５，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ Ｎ−ｏｘｉｄｅ、４−Ｈｙｄｒｏｘｙ−２，２，６，６−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌｏｘｙ， ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ、２−（５，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｏｘｏ−２λ５−［１，３，２］ｄｉｏｘａｐｈｏｓｐｈｉｎａｎ−２−ｙｌ）−２−ｍｅｔｈｙｌ−３，４−ｄｉｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｐｙｒｒｏｌｅ １−ｏｘｉｄｅ、５−Ｄｉｅｔｈｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ−５−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ−Ｎ−ｏｘｉｄｅなどである。
【００４０】
また、機能性分子の他の例としては、抗がん剤を用いる場合は、フルオロウラシル、ゲムシタビン、メソトレキセート、シクロホスファミド、塩酸ダウノルビシン、アドリアマイシン、塩酸イダルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、アクチノマイシン、ビンクリスチン、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、ネダプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、塩酸イリノテカン等から少なくとも一つが利用できる。また、ペニシリン系、マクロライド系、ニューキノロン系、テトラサイクリン系等の抗菌剤や、ラミブジン、ネルフィナビル、インジナビ、サキナビル、インターフェロン、アマンタジン、アシクロビル等のウイルス治療薬、そして、ニュープロレリン、ブセレリン、ゴセレリン、トリプトレリン、ナファレリン等のホルモン疾患治療薬、イブプロフェン等の鎮痛薬等を含んでなるものが挙げられる。
【００４１】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いる機能性分子は、上記機能を与える分子と酸化チタン表面に結合する官能基がリンカーを介して結合してなる分子であってもなんら問題はない。
【００４２】
本発明の好ましい態様によれば、前記リンカーは、例えば生体分子同士を異なる官能基同士で結合する際に用いられるヘテロバイファンクショナルなクロスリンカーなどが考えられる。リンカーの具体例としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−［α−マレイミドアセトキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−［β−マレイミドプロピルオキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−β−マレイミドプロピオン酸、Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド・ＴＦＡ、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド、Ｎ−ε−マレイミドカプロン酸、Ｎ−［ε−マレイミドカプロン酸］ヒドラジド、Ｎ−［ε−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−κ−マレイミドウンデカン酸、Ｎ−［κ−マレイミドウンデカン酸］ヒドラジド、スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシ−［６−アミドカプロエート］、スクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−［４−Ｎ−マレイミドフェニル］酪酸ヒドラジド・ＨＣｌ、３−［２−ピリジルジチオ］プロピオニルヒドラジド、Ｎ−［ｐ−マレイミドフェニル］イソシアネート、Ｎ−スクシンイミジル［４−アジドフェニル］−１，３’−ジチオプロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル Ｓ−アセチルチオアセテート、Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオプロピオネート、スクシンイミジル ３−［ブロモアセトアミド］プロピオネート、Ｎ−スクシンイミジル ヨードアセテート、Ｎ−スクシンイミジル［４−イオドアセチル］アミノベンゾエート、スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート、スクシンイミジル６−［（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノネート］、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−α［２−ピリジルジチオ］トルエン、Ｎ−スクシンイミジル３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート、Ｎ−［ε−マレイミドカプロイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル、Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スルホスクシンイミドエステル、Ｎ−［κ−マレイミドウンデカノイルオキシ］−スルホスクシンイミドエステル、スルホスクシンイミジル−６−［α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノネート、スルホスクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルチチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノネート、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホ−スクシンイミドエステル、スルホスクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート、スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スルホスクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート，Ｎ−［ε−トリフルオロアセチルカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル、クロロトリアジン、ジクロロトリアジン、トリクロロトリアジン等が挙げられる。また、リンカーはさらに他のリンカー同士が結合されるような複数種類のリンカーから構成されてもよい。
【００４３】
本発明の好ましい態様によれば、酸化チタン粒子と水溶性高分子およびまたは機能性分子との結合に用いられるジオール基としては、エンジオール基であることが好ましく、より好ましくはα−ジオール基である。これらの官能基を用いることで、優れた酸化チタン粒子への結合を実現することができる。
【００４４】
本発明の好ましい態様によれば、酸化チタン粒子が、アナターゼ型酸化チタンまたはルチル型酸化チタンであるのが好ましい。紫外線や超音波の照射による触媒活性を利用する場合にはアナターゼ型酸化チタンが好ましく、化粧料のように高い屈折率等の性質を利用する場合にはルチル型酸化チタンが好ましい。
【００４５】
本発明の好ましい態様によれば、本発明に用いる酸化チタン機能性分子複合体粒子は２０〜２００ｎｍの粒子径を有し、より好ましくは５０〜２００ｎｍであり、さらに好ましくは５０〜１５０ｎｍである。この粒径範囲であると、癌腫瘍への到達を目的として患者の体内に投与されると、ドラッグデリバリーシステムのように、Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ Ｅｆｆｅｃｔ（ＥＰＲ効果）により癌組織に効率的に到達して蓄積される。そして、上述の通り、４００ｋＨｚ〜２０ＭＨｚの超音波や紫外線の照射によりラジカル種の特異的生成が起こる。したがって、超音波や紫外線の照射により高い効率で癌組織を殺傷することができる。
【００４６】
本発明の別の好ましい態様によれば、酸化チタン機能性分子複合体粒子が５０ｎｍ未満（例えば数ｎｍ）の粒子径を有する場合、見かけ上のサイズを大きくしてＥＰＲ効果を得ることもできる。すなわち、５０〜１５０ｎｍの粒子径を有する二次粒子の形態を有するように半導体粒子同士を多官能リンカーで連結する等の方法にて結合されることで、ＥＰＲ効果により高い癌治療効果を実現することができる。本発明のさらに別の好ましい態様によれば、ＥＰＲ効果を利用するため、リポソームのような薬剤封入体の中に、酸化チタン機能性分子複合体粒子を包摂させることもできる。
【００４７】
本発明において半導体粒子の粒子径は、動的光散乱法により測定することができる。具体的には、粒径分布測定装置（ゼータサイザーナノ、マルバーンインスツルメント社製）を用いて、キュミュラント解析で得られる、Ｚ−ａｖｅｒａｇｅ ｓｉｚｅで示される値として得ることができる。
【００４８】
本発明に使用可能な酸化チタン機能性分子複合体粒子は、単一種類の酸化チタン複合体粒子のみならず、複数種類の半導体粒子の混合物あるいは複合物も包含する。具体例としては、酸化チタン粒子と酸化鉄ナノ粒子との複合物、酸化チタン粒子と白金との複合物、およびシリカ被覆された酸化チタン等が挙げられる。
【００４９】
本発明の好ましい態様によれば、酸化チタン機能性分子複合体粒子が、溶媒に分散されて分散液の形態とされてなるのが好ましい。これにより、酸化チタン機能性分子複合体粒子を、点滴、注射、塗布等の種々の方法により、患者の体内に効率的に投与することができる。分散液の液性は限定されず、ｐＨ３〜１０の広範囲にわたって高い分散性を実現可能である。なお、体内投与における安全性の観点から、分散液は、ｐＨ５〜９であるのが好ましく、より好ましくは５〜８、特に中性の液性を有するのが好ましい。また、本発明の好ましい態様によれば、溶媒は水系溶媒であるのが好ましく、さらに好ましくはｐＨ緩衝液または生理食塩水である。水系溶媒の好ましい塩濃度は２Ｍ以下であり、体内投与における安全性の観点から２００ｍＭ以下がより好ましい。酸化チタン機能性分子複合体粒子は分散体に対して、０．００１〜１質量％以下含有されることが好ましく、より好ましくは０．００１〜０．１質量％である。この範囲内であれば、投与後、２４〜７２時間後に患部（腫瘍）に効果的に粒子を蓄積させることが可能となる。すなわち、患部（腫瘍）に粒子濃度が蓄積しやすくなるとともに、血中での粒子の分散性も確保されて凝集隗が形成しにくくなるため、投与後に血管の閉塞などの二次的弊害を招くおそれも無い。
【００５０】
本発明の酸化チタン機能性分子複合体粒子は、点滴、注射、塗布等の種々の方法により、患者の体内に投与することができる。特に静脈または皮下による投与経路で用いられる場合は、粒子の大きさによるＥＰＲ効果と、血中の滞留性を利用して、所謂ＤＤＳ的な治療により、患者の負担を軽減する観点から好ましい。そして、体内に投与された酸化チタン機能性分子複合体粒子は、ドラッグデリバリーシステムのように、癌組織に到達して蓄積される。
【００５１】
本発明の酸化チタン機能性分子複合体粒子は、超音波あるいは紫外線の照射を受け、該照射により細胞毒となることができる。この酸化チタン機能性分子複合体粒子は、体内に投与され、超音波照射を受け、該照射により細胞毒となることで、細胞を殺傷することができるが、体内に限らず、試験管内においても殺対象である細胞を殺傷することができる。本発明において、殺対象は特に限定されないが、癌細胞であるのが好ましい。すなわち、本発明による酸化チタン機能性分子複合体粒子によれば、超音波や紫外線の照射により活性化して癌細胞を殺傷することができる。
【００５２】
本発明の好ましい態様によれば、酸化チタン機能性分子複合体粒子が蓄積された癌組織に超音波処理が行われる。使用する超音波の周波数は、４００ｋＨｚ〜２０ＭＨｚが好ましく、より好ましくは６００ｋＨｚ〜１０ＭＨｚ、さらに好ましくは１ＭＨｚ〜１０ＭＨｚである。超音波の照射時間は治療対象である癌組織の位置および大きさを考慮して適宜決定されるべきであり、特に限定されない。こうして、患者の癌組織を超音波により高い効率で殺傷して、高い癌治療効果を実現することができる。超音波は生体内の深部に外部より到達させることが可能で、本発明の酸化チタン機能性分子複合体粒子と併せて用いることにより、非侵襲の状態で生体内深部に存在するような患部やターゲット部位の治療が実現できる。さらに、患部やターゲット部位に本発明の酸化チタン複合体粒子が集積することにより、周辺の正常細胞に悪影響を及ぼさない程度の微弱な超音波で本発明の酸化チタン複合体粒子を集積させた局所のみに作用させることができる。
【００５３】
ところで、これらの半導体粒子が超音波の照射により活性化して細胞を殺傷する効果は、超音波照射によりラジカル種を生成させることにより得ることができる。すなわち、これらの半導体粒子が与える生物的殺傷効果はラジカル種の質的・量的な増加にあると考えられる。その理由は以下の通り推察されるが、以下の理由はあくまで仮説であって、本発明は何ら下記説明に限定されるものではない。すなわち、超音波照射のみでは系中には過酸化水素とヒドロキシルラジカルが発生するが、本発明者らの知見によれば、酸化チタンなどの半導体粒子の存在下では、過酸化水素及びヒドロキシルラジカルの生成が促進される。また、これら半導体粒子の存在下、特に酸化チタンの存在下では、スーパーオキサイドアニオンと一重項酸素の生成が促進されるように見受けられる。これらラジカル種の特異的生成は、ナノメートルオーダーの微粒子を用いた場合、超音波照射時の周波数が４００ｋＨｚ〜２０ＭＨｚの範囲、好ましくは６００ｋＨｚ〜１０ＭＨｚの範囲、より好ましくは１ＭＨｚ〜１０ＭＨｚの範囲で顕著に観察される現象であると考えられる。
【実施例】
【００５４】
以下に実施例を示す。特に断りのない限り、「％」は質量％を意味する。
【００５５】
例１：ポリエチレングリコール結合酸化チタン微粒子の作製
チタンテトライソプロポキシド３．６ｇとイソプロパノール３．６ｇを混合し、氷冷下で６０ｍｌの超純水に滴下して加水分解を行った。滴下後に室温で３０分間攪拌した。攪拌後、１２Ｎ硝酸１ｍｌを滴下して８０℃で８時間攪拌を行い、ペプチゼーションした。ペプチゼーション終了後０．４５μｍのフィルターで濾過し、さらに脱塩カラムＰＤ−１０（アマシャム・バイオサイエンス社製）を用いて溶液交換して固形成分１％の酸性酸化チタンゾルを調製した。この酸化チタンゾルを１００ｍｌ容のバイアル瓶に入れ、超音波発生器ＭＩＤＳＯＮＩＣ２００（カイジョー社製）を用いて２００ｋＨｚで３０分間超音波処理を行った。超音波処理を行った後の平均分散粒経を動的光散乱法により測定した。この測定は、超音波処理を行った後の酸化チタンゾルを１２Ｎの硝酸で１０００倍に希釈した後、分散液０．１ｍｌを石英測定セルに仕込み、ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス社製）を用いて、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて行った。その結果、分散粒径は２０．２ｎｍであった。蒸発皿を用いて、５０℃下で酸化チタンゾル溶液の濃縮を行い、最終的に固形成分２０％の酸性酸化チタンゾルを調製した。
【００５６】
次に、ポリオキシエチレン−モノアリル−モノメチルエーテルと無水マレイン酸の共重合体（平均分子量；３３６５９−日本油脂製）１ｇに水５ｍｌを添加し加水分解後得られた溶液と１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（同仁化学製）を、超純水を用いてそれぞれ濃度が５０ｍｇ／ｍｌおよび５０ｍＭとなるように混合に調整した。調整した溶液に４−アミノサリチル酸（分子量Ｍｎ＝１５３．１４：ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）を濃度５０ｍＭになるよう混合して４ｍｌの溶液を得た。この溶液を室温にて７２時間振とう撹拌して反応させた。反応後、得られた溶液を透析膜であるスペクトラ／ポア ＣＥ 透析用チューブ（分画分子量＝３５００、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に移して超純水４ｌに対して室温にて２４時間で透析を行った。透析後にすべてナスフラスコに移し替えて一晩凍結乾燥し、得られた粉末に４ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ：和光純薬工業）を添加して混合し、４−アミノサリチル酸結合ポリエチレングリコール溶液とした。
【００５７】
次にＤＭＦを用いて４−アミノサリチル酸結合ポリエチレングリコール溶液が終濃度２０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％、先に得られたアナタ−ゼ型二酸化チタンゾルが終濃度で固形成分０．２５％となるよう調整し、２．５ｍｌの反応溶液とした。この反応溶液を水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学製）に溶液を移し変え、８０℃で６時間加熱反応を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで冷却し、エバポレータでＤＭＦを除去した後に、蒸留水１ｍｌを添加して酸化チタン複合体粒子であるポリエチレングリコール結合二酸化チタン微粒子の分散液とした。さらに、ＨＰＬＣ：ＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、カラム：ＨｉＰｒｅｐ １６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ＨＲ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、移動相：リン酸塩緩衝溶液（ｐＨ７．４）、流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ］に付したところ、素通り画分にＵＶ吸収のピークが確認され、この画分を回収した。この分散液を蒸留水で０．０５（ｗｔ／ｖｏｌ）％水溶液に希釈して７２時間静置後、動的光散乱法による分散粒径およびゼータ電位の確認を、ゼータサイザーナノＺＳを用いて、ゼータ電位測定セルにポリエチレングリコール結合二酸化チタン微粒子の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて測定した。キュミュラント解析の結果、分散粒径は３２．７ｎｍであった。
【００５８】
例２：ポリアクリル酸結合酸化チタン微粒子の作製
チタンテトライソプロポキシド３．６ｇとイソプロパノール３．６ｇを混合し、氷冷下で６０ｍｌの超純水に滴下して加水分解を行った。滴下後に室温で３０分間攪拌した。攪拌後、１２Ｎ硝酸１ｍｌを滴下して８０℃で８時間攪拌を行い、ペプチゼーションした。ペプチゼーション終了後０．４５μｍのフィルターで濾過し、さらに脱塩カラムＰＤ−１０（アマシャム・バイオサイエンス社製）を用いて溶液交換して固形成分１％の酸性酸化チタンゾルを調製した。この酸化チタンゾルを１００ｍｌ容のバイアル瓶に入れ、２００ｋＨｚで３０分間超音波処理を行った。超音波処理を行った後の平均分散粒経を動的光散乱法により測定した。この測定は、超音波処理を行った後の酸化チタンゾルを１２Ｎの硝酸で１０００倍に希釈した後、ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス社製）を用いて、石英測定セルに分散液０．１ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて行った。その結果、分散粒径は２０．２ｎｍであった。蒸発皿を用いて、５０℃下で酸化チタンゾル溶液の濃縮を行い、最終的に固形成分２０％の酸性酸化チタンゾルを調製した。
【００５９】
この酸性酸化チタンゾル０．６ｍｌをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で２０ｍｌとなるよう調整して分散させ、平均分子量５０００のポリアクリル酸（和光純薬社製）０．３ｇを溶解したＤＭＦ１０ｍｌを添加後、攪拌して混合した。水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学社製）に溶液を移し変え、１５０℃で５時間反応を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで反応液を冷却し、反応液に対して２倍量のイソプロパノールを添加した。室温で３０分間静置後、２０００ｇにて１５ｍｉｎ遠心分離により沈殿を回収した。回収した沈殿表面をエタノールで洗浄後、１．５ｍｌの水を加えて酸化チタン複合体粒子であるポリアクリル酸結合酸化チタン微粒子の分散液を得た。この分散液を蒸留水で１００倍に希釈し、分散粒径およびゼータ電位を動的光散乱法により測定した。この測定は、ゼータサイザーナノＺＳを用いて、ゼータ電位測定セルにポリアクリル酸結合酸化チタン微粒子の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて行った。その結果、分散粒径は５３．６ｎｍ、ゼータ電位は−４５．０８ｍＶであった。
【００６０】
例３：ポリエチレンイミン結合酸化チタン微粒子の作製
チタンテトライソプロポキシド３．６ｇとイソプロパノール３．６ｇを混合し、氷冷下で６０ｍｌの超純水に滴下して加水分解を行った。滴下後に室温で３０分間攪拌した。攪拌後、１２Ｎ硝酸１ｍｌを滴下して８０℃で８時間攪拌を行い、ペプチゼーションした。ペプチゼーション終了後０．４５μｍのフィルターで濾過し、さらに脱塩カラムＰＤ−１０（アマシャム・ファルマシア・バイオサイエンス社製）を用いて溶液交換して固形成分１％の酸性酸化チタンゾルを調製した。この酸化チタンゾルを１００ｍｌ容のバイアル瓶に入れ、２００ｋＨｚで３０分間超音波処理を行った。超音波処理を行った後の平均分散粒経を動的光散乱法により測定した。この測定は、１２Ｎの硝酸で１０００倍に希釈した後、ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス社製）を用いて、石英測定セルに分散液０．１ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて行った。その結果、分散粒径は２０．２ｎｍであった。
【００６１】
得られた酸化チタンゾル３ｍｌを２０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に分散させ、平均分子量１００００のポリエチレンイミン（和光純薬社製）４５０ｍｇを溶解したＤＭＦ１０ｍｌを添加後、攪拌して混合した。水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学社製）に溶液を移し変え、１５０℃で５時間反応を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで反応液を冷却し、反応液に対して２倍量のアセトンを添加した。室温で３０分間静置後、２０００ｇにて１５ｍｉｎ遠心分離により沈殿を回収した。回収した沈殿表面をエタノールで洗浄後、１．５ｍｌの水を加えて酸化チタン複合体粒子であるポリエチレンイミン結合酸化チタン微粒子の分散液を得た。この分散液を蒸留水で１００倍に希釈し、分散粒径およびゼータ電位を動的光散乱法により測定した。この測定は、ゼータサイザーナノＺＳを用いて、ゼータ電位測定セルにポリエチレンイミン結合酸化チタン微粒子の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて行った。その結果、分散粒径は５７．５ｎｍ、ゼータ電位は４７．５ｍＶであった。
【００６２】
例４：酸化チタン複合体粒子へのカテコール結合
例１〜３で得られた、それぞれの酸化チタン複合体粒子を超純水にて固形成分１％とした。次に、カテコールを超純水にて、モル濃度で１００ｍＭ、１０ｍＭ、１ｍＭ、０．１ｍＭに調整した。酸化チタン複合体粒子１％溶液に対してそれぞれのカテコール溶液を等量ずつ混合し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）で最終的に酸化チタン複合体粒子とカテコール溶液がそれぞれ終濃度で１０倍希釈になるように調整した。調整した溶液をそれぞれ恒温器に移して４０℃に設定し、３時間結合反応を行った。反応後の溶液について可視光域における波長の吸収スペクトルを紫外−可視光分光光度計により確認したところ、それぞれの溶液について増大が認められたため、カテコールが結合したと考えられた。また、反応前と反応後の溶液をキャピラリ電気泳動にて以下の条件で付したところ、フォトダイオードアレイ検出器によって吸収波長２１４ｎｍのピークを確認することによりカテコールの変化量を求めた。
・装置：Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱ（ベックマンコールター製）
・キャピラリ：フューズドシリカキャピラリ ５０μｍ ｉ．ｄ × ６７ｃｍ（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｌｅｎｇｔｈ ５０ｃｍ）（ベックマンコールター製）
・移動相：５０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ４．８）
・電圧：２５ｋＶ
・温度：２０℃
求めた変化量よりカテコールは酸化チタン粒子の質量あたり５．０×１０−３〜１．０×１０−４ カテコール−ｇ／酸化チタン粒子−ｇであった。
さらに、この溶液２．５ｍｌに対してバッファー交換用自然落下型カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を用いて水３．５ｍｌで回収して未反応のカテコールを除去した。カテコールの除去はキャピラリ電気泳動にて上記と同様に確認し、フリーのカテコールがないことを確認した。これらからカテコール結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の作製を確認した。
【００６３】
例５：酸化チタン複合体粒子への１４Ｃ標識カテコール結合
例４において、カテコールの代わりに１４Ｃ標識カテコール（１４Ｃ標識カテコール終濃度１ｍＭ）を使い、酸化チタン複合体粒子として例１において得られたポリエチレングリコール結合酸化チタン微粒子のみを用いた以外は、まったく同じ手順で酸化チタン複合体粒子への１４Ｃ標識カテコール結合を行った。その結果、１４Ｃ標識カテコールの結合と、フリー１４Ｃ標識カテコールの除去を確認した。また、それぞれの溶液を超純水を用いて、固形成分０．０１％に希釈した後、ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス社製）を用いて、例１と同様に平均分散粒径の測定を行った。その結果、分散粒径は３５．７ｎｍであった。これらから、１４Ｃ標識カテコール結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の作製を確認した。
【００６４】
例６：カテコール結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の分散性
例４において得られたポリエチレングリコール結合酸化チタン微粒子を用いたカテコール結合酸化チタン機能性分子複合体粒子を、それぞれ１０％血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ製）に対して、固形成分０．０１％になるように添加し、９６時間、室温にて静置した。その後、ゼータサイザーナノＺＳにて例１と同様に平均分散粒径の測定を行った。結果を表１に示す。表１より、それぞれのカテコール結合酸化チタン機能性分子複合体粒子は２０〜２００ｎｍの範囲における粒径をもつことが確認された。
【００６５】
【表１】
【００６６】
例７：カテコール結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の疎水性
例１〜例４において得られた酸化チタン複合体粒子およびカテコール結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の分散液を、それぞれよく攪拌して混合した。１分後、各溶液の液面における気泡の状態を目視にて確認したところ、酸化チタン複合体粒子の分散液に比べて、カテコール結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の分散液は気泡の形成が有意に多いことが確認され、このことから、カテコール結合によってカテコール結合酸化チタン機能性分子複合体粒子は疎水性が強まっているものと考えられた。
【００６７】
例８：ポリエチレングリコール結合酸化チタン微粒子の作製
チタンテトライソプロポキシド３．６ｇとイソプロパノール３．６ｇを混合し、氷冷下で６０ｍｌの超純水に滴下して加水分解を行った。滴下後に室温で３０分間攪拌した。攪拌後、１２Ｎ硝酸１ｍｌを滴下して８０℃で８時間攪拌を行い、ペプチゼーションした。ペプチゼーション終了後０．４５μｍのフィルターで濾過し、さらに脱塩カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）を用いて溶液交換して固形成分１％の酸性酸化チタンゾルを調製した。この酸性酸化チタンゾルを１００ｍｌ容のバイアル瓶に入れ、超音波発生器ＭＩＤＳＯＮＩＣ２００（カイジョー社製）を用いて２００ｋＨｚで３０分間超音波処理を行った。超音波処理を行った後の平均分散粒経を動的光散乱法により測定した。この測定は、超音波処理を行った後の酸性酸化チタンゾルを１２Ｎの硝酸で１０００倍に希釈した後、分散液０．１ｍｌを石英測定セルに仕込み、ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス社製）を用いて、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて行った。その結果、分散粒径は３８．４ｎｍであった。蒸発皿を用いて、５０℃下で酸性酸化チタンゾル溶液の濃縮を行い、最終的に固形成分２０％の酸性酸化チタンゾルを調製した。
【００６８】
次に、ポリオキシエチレン−モノアリル−モノメチルエーテルと無水マレイン酸の共重合体（平均分子量１５０００；ＡＭ１５１０Ｋ−日本油脂製）０．５ｇに超純水４．５ｍｌを添加しポリエチレングリコール溶液とした。次に、超純水を用いて１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ；同仁化学製）を濃度４００ｍＭになるよう調製し、ＥＤＣ溶液とした。ポリエチレングリコール溶液１ｍｌに超純水０．２５ｍｌと０．７５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液０．１ｍｌ、およびＥＤＣ溶液０．５ｍｌを混合調製した。調製した溶液にドーパミン塩酸塩（分子量Ｍｎ＝１５３．１７８：和光純薬工業製）を濃度１５ｍＭになるよう混合して２ｍｌの溶液を得た。この溶液を４０℃にて２時間振とう撹拌して反応させた。反応後、得られた溶液を透析膜であるスペクトラ／ポア ＣＥ 透析用チューブ（分画分子量＝３５００、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に移して超純水４ｌに対して室温にて２４時間で透析を行った。透析後にすべてナスフラスコに移し替えて一晩凍結乾燥し、得られた粉末に４ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ：和光純薬工業）を添加して混合し、ドーパミン結合ポリエチレングリコール溶液とした。
【００６９】
次にＤＭＦを用いてドーパミン結合ポリエチレングリコール溶液が終濃度２０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％、先に得られた酸性酸化チタンゾルが終濃度で固形成分０．２５％となるよう調製し、５ｍｌの反応溶液とした。この反応溶液を水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学製）に溶液を移し替え、１５０℃で６時間加熱反応を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで冷却し、エバポレータでＤＭＦを除去した後に、蒸留水１．２５ｍｌを添加してポリエチレングリコール結合酸化チタン微粒子の分散液とした。この分散液を蒸留水で０．０５（ｗｔ／ｖｏｌ）％水溶液に希釈して２４時間静置後、動的光散乱法による分散粒径およびゼータ電位の確認を、ゼータサイザーナノＺＳを用いて、ゼータ電位測定セルにポリエチレングリコール結合酸化チタン微粒子の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて測定した。キュミュラント解析の結果、分散粒径は５７．３ｎｍ、ゼータ電位は３．４１ｍＶであった。
【００７０】
例９：ポリエチレングリコール結合酸化チタン微粒子の作製
チタンテトライソプロポキシド３．６ｇとイソプロパノール３．６ｇを混合し、氷冷下で６０ｍｌの超純水に滴下して加水分解を行った。滴下後に室温で３０分間攪拌した。攪拌後、１２Ｎ硝酸１ｍｌを滴下して８０℃で８時間攪拌を行い、ペプチゼーションした。ペプチゼーション終了後０．４５μｍのフィルターで濾過し、さらに脱塩カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）を用いて溶液交換して固形成分１％の酸性酸化チタンゾルを調製した。この酸性酸化チタンゾルを１００ｍｌ容のバイアル瓶に入れ、超音波発生器ＭＩＤＳＯＮＩＣ２００（カイジョー社製）を用いて２００ｋＨｚで３０分間超音波処理を行った。超音波処理を行った後の平均分散粒経を動的光散乱法により測定した。この測定は、超音波処理を行った後の酸性酸化チタンゾルを１２Ｎの硝酸で１０００倍に希釈した後、分散液０．１ｍｌを石英測定セルに仕込み、ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス社製）を用いて、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて行った。その結果、分散粒径は３８．４ｎｍであった。蒸発皿を用いて、５０℃下で酸性酸化チタンゾル溶液の濃縮を行い、最終的に固形成分２０％の酸性酸化チタンゾルを調製した。
【００７１】
次に、ポリオキシエチレン−モノアリル−モノメチルエーテルと無水マレイン酸の共重合体（平均分子量３００００；ＡＭ２０９０Ｐ−日本油脂製）０．５ｇに超純水４．５ｍｌを添加しポリエチレングリコール溶液とした。次に、超純水を用いて１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ；同仁化学製）を濃度４００ｍＭになるよう調製し、ＥＤＣ溶液とした。ポリエチレングリコール溶液１ｍｌに超純水０．２５ｍｌと０．７５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液０．１ｍｌ、およびＥＤＣ溶液０．５ｍｌを混合調製した。調製した溶液にドーパミン塩酸塩（分子量Ｍｎ＝１５３．１７８：和光純薬工業製）を濃度１５ｍＭになるよう混合して２ｍｌの溶液を得た。この溶液を４０℃にて２時間振とう撹拌して反応させた。反応後、得られた溶液を透析膜であるスペクトラ／ポア ＣＥ 透析用チューブ（分画分子量＝３５００、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に移して超純水４ｌに対して室温にて２４時間で透析を行った。透析後にすべてナスフラスコに移し替えて一晩凍結乾燥し、得られた粉末に４ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ：和光純薬工業）を添加して混合し、ドーパミン結合ポリエチレングリコール溶液とした。
【００７２】
次にＤＭＦを用いてドーパミン結合ポリエチレングリコール溶液が終濃度２０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％、実施例１で得られた酸性酸化チタンゾルが終濃度で固形成分０．２５％となるよう調製し、５ｍｌの反応溶液とした。この反応溶液を水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学製）に溶液を移し替え、１５０℃で６時間加熱反応を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで冷却し、エバポレータでＤＭＦを除去した後に、蒸留水１．２５ｍｌを添加してポリエチレングリコール結合酸化チタン微粒子の分散液とした。この分散液を蒸留水で０．０５（ｗｔ／ｖｏｌ）％水溶液に希釈して２４時間静置後、動的光散乱法による分散粒径およびゼータ電位の確認を、ゼータサイザーナノＺＳを用いて、ゼータ電位測定セルにポリエチレングリコール結合酸化チタン微粒子の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて測定した。キュミュラント解析の結果、分散粒径は６０．３ｎｍ、ゼータ電位は３．０５ｍＶであった。
【００７３】
例１０：ポリエチレングリコール結合酸化チタン微粒子の作製
チタンテトライソプロポキシド３．６ｇとイソプロパノール３．６ｇを混合し、氷冷下で６０ｍｌの超純水に滴下して加水分解を行った。滴下後に室温で３０分間攪拌した。攪拌後、１２Ｎ硝酸１ｍｌを滴下して８０℃で８時間攪拌を行い、ペプチゼーションした。ペプチゼーション終了後０．４５μｍのフィルターで濾過し、さらに脱塩カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）を用いて溶液交換して固形成分１％の酸性酸化チタンゾルを調製した。この酸性酸化チタンゾルを１００ｍｌ容のバイアル瓶に入れ、超音波発生器ＭＩＤＳＯＮＩＣ２００（カイジョー社製）を用いて２００ｋＨｚで３０分間超音波処理を行った。超音波処理を行った後の平均分散粒経を動的光散乱法により測定した。この測定は、超音波処理を行った後の酸性酸化チタンゾルを１２Ｎの硝酸で１０００倍に希釈した後、分散液０．１ｍｌを石英測定セルに仕込み、ゼータサイザーナノＺＳ（シスメックス社製）を用いて、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて行った。その結果、分散粒径は３８．４ｎｍであった。蒸発皿を用いて、５０℃下で酸性酸化チタンゾル溶液の濃縮を行い、最終的に固形成分２０％の酸性酸化チタンゾルを調製した。
【００７４】
次に、２，４−ｂｉｓ（Ｏ−ｍｅｔｈｏｘｙｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）−６−ｃｈｌｏｒｏ−ｓ−ｔｒｉａｚｉｎｅ（平均分子量１００００；ＰＥＧ２−生化学工業製）０．５ｇに超純水４．５ｍｌを添加しポリエチレングリコール溶液とした。ポリエチレングリコール溶液４ｍｌに５０ｍＭの２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２ｍｌとドーパミン塩酸塩（分子量Ｍｎ＝１５３．１７８：和光純薬工業製）を濃度２．５ｍＭになるよう混合して８ｍｌの溶液を得た。この溶液を室温にて２４時間振とう撹拌して反応させた。反応後、得られた溶液を透析膜であるスペクトラ／ポア ＣＥ 透析用チューブ（分画分子量＝３５００、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に移して超純水４ｌに対して室温にて２４時間で透析を行った。透析後にすべてナスフラスコに移し替えて一晩凍結乾燥し、得られた粉末に４ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ：和光純薬工業）を添加して混合し、ドーパミン結合ポリエチレングリコール溶液とした。
【００７５】
次にＤＭＦを用いてドーパミン結合ポリエチレングリコール溶液が終濃度４０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％、実施例１で得られた酸性酸化チタンゾルが終濃度で固形成分０．２５％となるよう調製し、５ｍｌの反応溶液とした。この反応溶液を水熱反応容器のＨＵ−５０（三愛科学製）に溶液を移し替え、１５０℃で６時間加熱反応を行った。反応終了後、反応容器温度が５０℃以下になるまで冷却し、エバポレータでＤＭＦを除去した後に、蒸留水１．２５ｍｌを添加してポリエチレングリコール結合酸化チタン微粒子の分散液とした。この分散液を蒸留水で０．０５（ｗｔ／ｖｏｌ）％水溶液に希釈して２４時間静置後、動的光散乱法による分散粒径およびゼータ電位の確認を、ゼータサイザーナノＺＳを用いて、ゼータ電位測定セルにポリエチレングリコール結合酸化チタン微粒子の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて測定した。キュミュラント解析の結果、分散粒径は１２３ｎｍ、ゼータ電位は１３．１ｍＶであった。
【００７６】
例１１：酸化チタン複合体粒子への蛍光分子の結合
例１で得られた、酸化チタン複合体粒子を超純水にて固形成分１％の分散液とした。次に、ドーパミン塩酸塩（分子量Ｍｎ＝１５３．１７８：和光純薬工業製）を２００ｍＭとなるよう調整した。調整した溶液と分散液を１：９で混合して１ｍｌとし、室温で１時間結合反応を行った。反応後の溶液について可視光域における波長の吸収スペクトルを紫外−可視光分光光度計により確認したところ、それぞれの溶液について増大が認められたため、ドーパミンが結合したと考えられた。また、反応前と反応後の溶液をキャピラリ電気泳動にて以下の条件で付したところ、フォトダイオードアレイ検出器によって吸収波長２１４ｎｍのピークを確認することによりドーパミンの変化量を求めた。
・装置：Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱ（ベックマンコールター製）
・キャピラリ：フューズドシリカキャピラリ ５０μｍ ｉ．ｄ×６７ｃｍ（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｌｅｎｇｔｈ ５０ｃｍ）（ベックマンコールター製）
・移動相：５０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ４．８）
・電圧：２５ｋＶ
・温度：２０℃
求めた変化量よりドーパミンは酸化チタン粒子の質量あたり５．２×１０−２ ドーパミン−ｇ／酸化チタン粒子−ｇであった。
さらに、この溶液２．５ｍｌに対してバッファー交換用自然落下型カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス製）を用いて水３．５ｍｌで回収して未反応のドーパミンを除去した。ドーパミンの除去はキャピラリ電気泳動にて上記と同様に確認し、フリーのドーパミンがないことを確認した。これらからドーパミン結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の作製を確認した。
【００７７】
次にこのドーパミン結合酸化チタン機能性分子複合体粒子を終濃度で０．３％、またＮＨＳ−Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ピアース製）を終濃度で１ｍＭとなるように２０ｍＭホウ酸緩衝液中で混合調整した。この溶液を４℃、遮光下で２４時間静置した。この溶液２．５ｍｌに対してバッファー交換用自然落下型カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス製）を用いて水３．５ｍｌで回収して未反応のＮＨＳ−Ｒｈｏｄａｍｉｎｅを除去した。ＮＨＳ−Ｒｈｏｄａｍｉｎｅの除去はキャピラリ電気泳動にて上記と同様に確認し、フリーのＮＨＳ−Ｒｈｏｄａｍｉｎｅがないことを確認した。得られた溶液を蛍光分光光度計にてスペクトル解析を行い、励起波長５５５ｎｍ、蛍光波長５７５ｎｍであることを確認した。これらのことから、酸化チタン複合体粒子へ蛍光分子を結合した、蛍光分子結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の作製を確認した。
【００７８】
例１２：酸化チタン複合体粒子へのドーパミンの結合
例１で得られた、酸化チタン複合体粒子を超純水にて固形成分１％の分散液とした。次に、ドーパミン塩酸塩（分子量Ｍｎ＝１５３．１７８：和光純薬工業製）を２００ｍＭとなるよう調整した。調整した溶液と分散液を１：９で混合して１ｍｌとし、室温で１時間結合反応を行った。反応後の溶液について可視光域における波長の吸収スペクトルを紫外−可視光分光光度計により確認したところ、それぞれの溶液について増大が認められたため、ドーパミンが結合したと考えられた。また、反応前と反応後の溶液をキャピラリ電気泳動にて以下の条件で付したところ、フォトダイオードアレイ検出器によって吸収波長２１４ｎｍのピークを確認することによりドーパミンの変化量を求めた。
・装置：Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱ（ベックマンコールター製）
・キャピラリ：フューズドシリカキャピラリ ５０μｍ ｉ．ｄ×６７ｃｍ（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｌｅｎｇｔｈ ５０ｃｍ）（ベックマンコールター製）
・移動相：５０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ４．８）
・電圧：２５ｋＶ
・温度：２０℃
求めた変化量よりドーパミンは酸化チタン粒子の質量あたり５．２×１０−２ ドーパミン−ｇ／酸化チタン粒子−ｇであった。
さらに、この溶液２．５ｍｌに対してバッファー交換用自然落下型カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス製）を用いて水３．５ｍｌで回収して未反応のドーパミンを除去した。ドーパミンの除去はキャピラリ電気泳動にて上記と同様に確認し、フリーのドーパミンがないことを確認した。これらからドーパミン結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の作製を確認した。
【００７９】
例１３：酸化チタン複合体粒子へのジヒドロキシフェニルプロピオン酸の結合
例１で得られた、酸化チタン複合体粒子を超純水にて固形成分３％とした。次に、ジヒドロキシフェニルプロピオン酸（和光純薬工業製）を超純水にて、モル濃度で５００ｍＭに調整した。酸化チタン複合体粒子３％溶液に対してジヒドロキシフェニルプロピオン酸溶液を１／１０量混合し、全量で１ｍｌ調整した。調整した溶液を室温で２．５時間結合反応を行った。反応後の溶液について可視光域における波長の吸収スペクトルを紫外−可視光分光光度計により確認したところ、吸光度の増大が認められたため、ジヒドロキシフェニルプロピオン酸が結合したと考えられた。また、反応前と反応後の溶液をキャピラリ電気泳動にて以下の条件で、フォトダイオードアレイ検出器の吸収波長２１４ｎｍのピークを確認することによりジヒドロキシフェニルプロピオン酸の変化量を求めた。
・装置：Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱ（ベックマンコールター製）
・キャピラリ：フューズドシリカキャピラリ ５０μｍ ｉ．ｄ × ６７ｃｍ（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｌｅｎｇｔｈ ５０ｃｍ）（ベックマンコールター製）
・移動相：５０ｍＭ ホウ酸緩衝溶液（ｐＨ９．０）
・電圧：２５ｋＶ
・温度：２０℃
求めた変化量より結合したジヒドロキシフェニルプロピオン酸は酸化チタン粒子の質量あたり４．８×１０−２ ジヒドロキシフェニルプロピオン酸−ｇ／酸化チタン−ｇであった。さらに、この溶液２．５ｍｌに対してバッファー交換用自然落下型カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を用いて水３．５ｍｌで回収して未反応のジヒドロキシフェニルプロピオン酸を除去した。ジヒドロキシフェニルプロピオン酸の除去はキャピラリ電気泳動にて上記と同様に確認し、フリーのジヒドロキシフェニルプロピオン酸がないことを確認した。これらからジヒドロキシフェニルプロピオン酸結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の作製を確認した。
【００８０】
例１４：ジヒドロキシフェニルプロピオン酸結合酸化チタン機能性分子複合体粒子へのエタノールアミンの結合
例９で得られた、ジヒドロキシフェニルプロピオン酸結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の溶液と１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（同仁化学製）を、５０ｍＭ ホウ酸緩衝溶液（ｐＨ９．０）を用いてそれぞれ濃度が１５ｍｇ／ｍｌおよび８０ｍＭとなるように混合して調整した。調整した溶液にエタノールアミン（和光純薬工業製）を濃度１０ｍＭになるよう混合して０．２ｍｌの溶液を得た。この溶液を室温にて２４時間振とう撹拌して反応させた。反応した溶液から５０μｌを超純水にて１０００倍希釈に調整し、これを５０ｍＭ ホウ酸緩衝液に対して１／１０量添加して、４４０μｌとした。さらにアセトンに溶解した０．３ｍｇ／ｍｌのフルオレスカミン（東京化成工業社製）を２０μｌ添加して溶液を攪拌後、蛍光光度計（島津製作所製 ：ＲＦ−５３００）により蛍光値を以下の測定条件で測定した。（波長：Ｅｘ＝３９５ｎｍ／Ｅｍ＝４９５ｎｍ、バンド幅：Ｅｘ＝５ｎｍ／Ｅｍ＝１０ｎｍ、感度：Ｈｉｇｈ、レスポンス：Ａｕｔｏ）。事前に作成した検量線を用いて未結合のエタノールアミンを算出して初期濃度からの濃度変化の割合、すなわち結合した割合を算出した。その結果、６３．１６％であった。以上のことから、ジヒドロキシフェニルプロピオン酸結合酸化チタン機能性分子複合体粒子のジヒドロキシフェニルプロピオン酸を介して、エタノールアミンが結合することを確認した。
【００８１】
例１５：ジヒドロキシフェニルプロピオン酸結合酸化チタン機能性分子複合体粒子への抗体の結合
例１３で得られた、ジヒドロキシフェニルプロピオン酸結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の溶液と１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（同仁化学製）を、超純水を用いてそれぞれ濃度が２０ｍｇ／ｍｌおよび８０ｍＭとなるように混合した。混合した溶液を室温にて１０分間反応した。脱塩カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）を用いて２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝溶液（ｐＨ７．４）に溶液交換し、酸化チタン濃度にして２０ｍｇ／ｍｌの粒子の溶液を得た。これと同一の緩衝液で調製した抗ヒト血清アルブミン（抗ＨＳＡ）モノクローナル抗体（マウスＩｇＧ：ＭＳＵ−３０４、コスモバイオ社）を３ｍｇ／ｍｌになるように添加し、全量で１ｍｌの溶液とした。４℃で２４時間反応後、終濃度が０．５Ｍとなるようエタノールアミンを添加して、さらに４℃で１時間反応した。この溶液を酸化チタン濃度にして１ｍｇ／ｍｌに調製し、ＨＰＬＣ：ＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、カラム：ＨｉＰｒｅｐ １６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−５００ＨＲ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、移動相：リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）、流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ］に１ｍｌ付したところ、素通り画分および結合に用いた抗ＨＳＡモノクローナル抗体が単体で確認される画分にＵＶ吸収のピークが確認され、これらの画分を回収した。素通り画分について、蒸留水で０．０５（ｗｔ／ｖｏｌ）％水溶液に希釈して２４時間静置後、動的光散乱法による分散粒径およびゼータ電位の確認を、ゼータサイザーナノＺＳを用いて、ゼータ電位測定セルにポリエチレングリコール結合酸化チタン微粒子の分散液０．７５ｍｌを仕込み、溶媒の各種パラメーターを水と同値に設定し、２５℃にて測定した。キュミュラント解析の結果、分散粒径は５０．３ｎｍ、ゼータ電位は−３．０ｍＶであった。また、抗ＨＳＡモノクローナル抗体が単体で確認される画分については、ブラッドフォード法でタンパク質濃度を測定した結果、反応前後で抗体濃度の減少が確認された。以上のことから、ジヒドロキシフェニルプロピオン酸結合酸化チタン機能性分子複合体粒子のジヒドロキシフェニルプロピオン酸を介して、抗体分子が結合することを確認した。
【００８２】
例１６：酸化チタン複合体粒子へのアミノレブリン酸およびジヒドロキシフェニルエタノールの結合
３，４−ジヒドロキシフェニルエタノール（和光純薬工業製）３００ｍｇをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；和光純薬工業製）０．５ｍｌに溶解した。この溶液に塩化チオニル（和光純薬工業製）を０．１ｍｌ加えて攪拌後、トルエン（和光純薬工業製）を７ｍｌ混合した。さらに、５−アミノレブリン酸塩酸塩（和光純薬工業製）を２５０ｍｇ加え、攪拌しながら８０℃で１時間反応させた。反応後、二層に分かれた上層部および下層部をそれぞれ回収した。この回収液の一部と３，４−ジヒドロキシフェニルエタノールおよび５−アミノレブリン酸塩酸塩のＤＭＦ溶液を薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）を用いて、アセトン（和光純薬工業製）：メタノール（和光純薬工業製）＝２：３の溶液を用いて展開した後、乾燥したＴＬＣ板にニンヒドリンスプレー（和光純薬工業）を噴霧して加熱後、スポットの観察を行った。その結果、回収液のうち下層部の展開スポットが３，４−ジヒドロキシフェニルエタノールおよび５−アミノレブリン酸塩酸塩とは異なる位置にあり、ニンヒドリン反応によって呈色したことから、３，４−ジヒドロキシフェニルエタノールと５−アミノレブリン酸塩酸塩の複合体が生成したと考えられた。回収液のうち下層部を減圧下で１０倍に濃縮し、反応濃縮溶液とした。例１で得られた、酸化チタン複合体粒子を超純水にて固形成分１％に調整し、そこに反応濃縮溶液を１／１０量混合して、全量で１ｍｌとした。この混合溶液を緩やかに攪拌しながら、室温で１時間反応を行った。反応後、沈殿成分を遠心分離（１５００ｇ、１０ｍｉｎ）して上澄みを回収し、この溶液１ｍｌに対してバッファー交換用自然落下型カラムＮＡＰ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を用いて水１．５ｍｌで回収して未反応の３，４−ジヒドロキシフェニルエタノールと５−アミノレブリン酸塩酸塩の複合体がおよびＤＭＦを除去した。この溶液について可視光域（４００ｎｍ）における波長の吸収スペクトルを紫外−可視光分光光度計（ＵＶ１６００；島津製作所製）により確認したところ増大が認められたため、３，４−ジヒドロキシフェニルエタノールと５−アミノレブリン酸塩酸塩の複合体が結合したと考えられた。これらから３，４−ジヒドロキシフェニルエタノールと５−アミノレブリン酸塩酸塩の複合体結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の作製を確認した。
【００８３】
例１７：酸化チタン複合体粒子への葉酸およびドーパミンの結合
葉酸（和光純薬工業製）および塩酸ドーパミン（和光純薬工業製）を１ｍＭとなるようジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；和光純薬工業製）に溶解した。また、同様にＤＭＦを用いて２００ｍＭ Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ−１−ｙｌ−ｏｘｙ−ｔｒｉｓｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＰｙＢｏｐ；メルク製）、２００ｍＭ １−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨｏＢｔ；同仁化学製）、２０ｍＭ Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ；和光純薬工業製）をそれぞれ調製した。これらのうち、葉酸と塩酸ドーパミンは元濃度の１／４、またその他は元濃度の１／１０となるよう混合してＤＭＦで２０ｍｌに溶液調整した。この混合溶液を緩やかに攪拌しながら、室温で２０時間反応を行った。反応溶液の一部を超純水で１０倍に希釈し、この溶液を逆相クロマトグラフィ（ＨＰＬＣシステム：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所製）、カラム：Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ ＲＰ−１８ｅ １００−３ｍｍ（メルク製）、移動相：Ａ メタノール（和光純薬工業製）Ｂ ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液（和光純薬工業製）、流速：２ｍｌ／ｍｉｎ）を用いて解析した。紫外線検出器で波長２１０ｎｍに設定し、インジェクション（０．０２ｍｌ）後、１〜１０ｍｉｎにおいてメタノールが１００％となるようグラジエント溶出を行った結果、９ｍｉｎ付近に葉酸と塩酸ドーパミンの複合体と考えられるピークを確認した。また、葉酸および塩酸ドーパミンそれぞれ単独のピークは検出限界以下であった。これらのことから、葉酸と塩酸ドーパミンの複合体の生成を確認した。次に、反応溶液の残りを減圧下で１０倍に濃縮し、反応濃縮溶液とした。例１で得られた、酸化チタン複合体粒子を超純水にて固形成分１％に調整し、そこに反応濃縮溶液を１／１０量混合して、全量で１ｍｌとした。この混合溶液を緩やかに攪拌しながら、室温で１時間反応を行った。反応後、沈殿成分を遠心分離（１５００ｇ、１０ｍｉｎ）して上澄みを回収し、この溶液１ｍｌに対してバッファー交換用自然落下型カラムＮＡＰ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を用いて水１．５ｍｌで回収して未反応の葉酸と塩酸ドーパミンの複合体およびＤＭＦを除去した。葉酸と塩酸ドーパミンの複合体およびＤＭＦの除去は逆相クロマトグラフィにて上記と同様に確認し、フリーの葉酸と塩酸ドーパミンの複合体がないことを確認した。これらから葉酸と塩酸ドーパミンの複合体結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の作製を確認した。
【００８４】
例１８：葉酸と塩酸ドーパミンの複合体結合酸化チタン機能性分子複合体粒子への紫外線照射と蛍光の確認
例１７で得られた葉酸と塩酸ドーパミンの複合体結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の溶液を、リン酸緩衝生理食塩水を用いて酸化チタン濃度がそれぞれ０．０５、０．０１、０．００５％となるよう３ｍｌに調製した。これらの溶液を攪拌しながら、波長３５２ｎｍの紫外線ランプ（ＦＬ２０Ｓ・ＢＬＢ−Ａ；東芝ライテック製）を用いて紫外線強度０．９ｍＷ／ｃｍ２で照射し、照射開始後０、３、６、９ｍｉｎにおける溶液の蛍光強度を、蛍光分光光度計（ＲＦ−５３００ＰＣ；島津製作所製）を用いて励起波長３６０ｎｍおよび蛍光波長４５０ｎｍに設定し、それぞれ測定を行った。結果を図２に示す。照射時間および酸化チタン濃度の増加に伴い、蛍光強度が大きくなることが確認された。これは、この溶液への紫外線照射によって生じたラジカルとの反応に伴い、葉酸から遊離したプテリン化合物由来の蛍光であると考えられた。
【００８５】
例１９：ジヒドロキシフェニルプロピオン酸結合酸化チタン機能性分子複合体粒子へのメチオニンの結合
例１３で得られた、ジヒドロキシフェニルプロピオン酸結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の溶液と１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（同仁化学製）を、５０ｍＭ ホウ酸緩衝溶液（ｐＨ９．０）を用いてそれぞれ濃度が１５ｍｇ／ｍｌおよび８０ｍＭとなるように混合に調整した。調整した溶液にメチオニン（和光純薬工業製）を濃度１０ｍＭになるよう混合して０．２ｍｌの溶液を得た。この溶液を室温にて２４時間振とう撹拌して反応させた。反応した溶液から５０μｌを超純水にて１０００倍希釈に調整し、これを５０ｍＭ ホウ酸緩衝液に対して１／１０量添加して、４４０μｌとした。さらにアセトンに溶解した０．３ｍｇ／ｍｌのフルオレスカミン（東京化成工業社製）を２０μｌ添加して溶液を攪拌後、蛍光光度計（島津製作所製 ：ＲＦ−５３００）により蛍光値を以下の測定条件で測定した。（波長：Ｅｘ＝３９５ｎｍ／Ｅｍ＝４９５ｎｍ、バンド幅：Ｅｘ＝５ｎｍ／Ｅｍ＝１０ｎｍ、感度：Ｈｉｇｈ、レスポンス：Ａｕｔｏ）。事前に作成した検量線を用いて未結合のメチオニンを算出して初期濃度からの濃度変化の割合、すなわち結合した割合を算出した。その結果、４０．２％であった。以上のことから、ジヒドロキシフェニルプロピオン酸結合酸化チタン機能性分子複合体粒子のジヒドロキシフェニルプロピオン酸を介して、メチオニンが結合することを確認した。
【００８６】
例２０：ドーパミン結合酸化チタン機能性分子複合体粒子へのラジカル応答性分子の結合
例１２で得られたドーパミン結合酸化チタン機能性分子複合体粒子を終濃度で０．３％、また２，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−６−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏ−１，４−ｐｈｔｈａｌａｚｉｎｅｄｉｏｎｅ（同仁化学製）を終濃度で１ｍＭとなるように２０ｍＭリン酸緩衝液中（ｐＨ７．０）で混合し、３ｍｌに調整した。この溶液を４℃、遮光下で２４時間静置し、結合反応を行った。この溶液２．５ｍｌに対してバッファー交換用自然落下型カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス製）を用いて水３．５ｍｌで回収して未反応物の除去を行った。これらのことから、酸化チタン複合体粒子へラジカル応答性分子である２，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−６−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏ−１，４−ｐｈｔｈａｌａｚｉｎｅｄｉｏｎｅを結合した、ラジカル応答性分子結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の作製を確認した。
【００８７】
例２１：ドーパミン結合酸化チタン機能性分子複合体粒子へのラジカル応答性分子の結合２
例１２で得られたドーパミン結合酸化チタン機能性分子複合体粒子を終濃度で０．３％、また２’，７’−ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ，ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を終濃度で１ｍＭとなるように２０ｍＭリン酸緩衝液中（ｐＨ７．０）で混合し、３ｍｌに調整した。この溶液を４℃、遮光下で２４時間静置し、結合反応を行った。この溶液２．５ｍｌに対してバッファー交換用自然落下型カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス製）を用いて水３．５ｍｌで回収して未反応物を除去した。これらのことから、酸化チタン複合体粒子へラジカル応答性分子である２’，７’−ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ，ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒを結合した、蛍光分子結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の作製を確認した。
【００８８】
例２２：酸化チタン複合体粒子へのフェロセンカルボン酸およびドーパミンの結合
フェロセンカルボン酸（和光純薬工業製）および塩酸ドーパミン（和光純薬工業製）を１ｍＭとなるようジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；和光純薬工業製）に溶解した。また、同様にＤＭＦを用いて２００ｍＭ Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ−１−ｙｌ−ｏｘｙ−ｔｒｉｓｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＰｙＢｏｐ；メルク製）、２００ｍＭ １−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨｏＢｔ；同仁化学製）、２０ｍＭ Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ；和光純薬工業製）をそれぞれ調製した。これらのうち、フェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンは元濃度の１／４、またその他は元濃度の１／１０となるよう混合してＤＭＦで２０ｍｌに溶液調整した。この混合溶液を緩やかに攪拌しながら、室温で２０時間反応を行った。反応溶液の一部を超純水で１０倍に希釈し、この溶液を逆相クロマトグラフィ（ＨＰＬＣシステム：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所製）、カラム：Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ ＲＰ−１８ｅ １００−３ｍｍ（メルク製）、移動相：Ａ メタノール（和光純薬工業製）Ｂ ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液（和光純薬工業製）、流速：２ｍｌ／ｍｉｎ）を用いて解析した。紫外線検出器で波長２１０ｎｍに設定し、インジェクション（０．０２ｍｌ）後、１〜１０ｍｉｎにおいてメタノールが１００％となるようグラジエント溶出を行った結果、フェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンの複合体と考えられるピークを確認した。また、フェロセンカルボン酸および塩酸ドーパミンそれぞれ単独のピークは検出限界以下であった。これらのことから、フェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンの複合体の生成を確認した。
【００８９】
反応溶液の残りを減圧下で１０倍に濃縮し、反応濃縮溶液とした。例１で得られた、酸化チタン複合体粒子を超純水にて固形成分１％に調整し、そこに反応濃縮溶液を１／１０量混合して、全量で１ｍｌとした。この混合溶液を緩やかに攪拌しながら、室温で１時間反応を行った。反応後、沈殿成分を遠心分離（１５００ｇ、１０ｍｉｎ）して上澄みを回収し、この溶液１ｍｌに対してバッファー交換用自然落下型カラムＮＡＰ−１０（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を用いて水１．５ｍｌで回収して未反応のフェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンの複合体およびＤＭＦを除去した。この溶液について可視光域（４００ｎｍ）における波長の吸収スペクトルを紫外−可視光分光光度計（ＵＶ１６００；島津製作所製）により確認したところ増大が認められたため、フェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンの複合体が結合したと考えられた。これらからフェロセンカルボン酸と塩酸ドーパミンの複合体結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の作製を確認した。
【００９０】
例２３：ドーパミン結合酸化チタン機能性分子複合体粒子への蛍光分子の結合２
例１２で得られたドーパミン結合酸化チタン機能性分子複合体粒子を終濃度で０．３％、またＣｙ７−ＮＨＳ ｅｓｔｅｒ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス製）を終濃度で１ｍＭとなるように２０ｍＭリン酸緩衝液中（ｐＨ７．０）で混合し、３ｍｌに調整した。この溶液を４℃、遮光下で２４時間静置し、結合反応を行った。この溶液２．５ｍｌに対してバッファー交換用自然落下型カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス製）を用いて水３．５ｍｌで回収して未反応物を除去した。この溶液について蛍光強度を、蛍光分光光度計（ＲＦ−５３００ＰＣ；島津製作所製）を用いて励起波長７４３ｎｍおよび蛍光波長７６７ｎｍに設定して測定を行った結果、蛍光を示すことが確認された。これらのことから、酸化チタン複合体粒子へ蛍光分子であるＣｙ７−ＮＨＳ ｅｓｔｅｒを結合した、蛍光分子結合酸化チタン機能性分子複合体粒子の作製を確認した。
【００９１】
例２４：酸化チタン複合体粒子へのカテコール結合２
例８〜１０で得られた、それぞれの酸化チタン複合体粒子を超純水にて固形成分１％とした。次に、カテコールを超純水にて、モル濃度で１００ｍＭ、１０ｍＭ、１ｍＭ、０．１ｍＭに調整した。酸化チタン複合体粒子１％溶液に対してそれぞれのカテコール溶液を等量ずつ混合し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）で最終的に酸化チタン複合体粒子とカテコール溶液がそれぞれ終濃度で１０倍希釈になるように調整した。調整した溶液をそれぞれ恒温器に移して４０℃に設定し、３時間結合反応を行った。反応後の溶液について可視光域における波長の吸収スペクトルを紫外−可視光分光光度計により確認したところ、それぞれの溶液について増大が認められたため、カテコールが結合したと考えられた。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】本発明の酸化チタン機能性分子複合体粒子の一例を示す図である。
【図２】例１８において測定された、例１７で得られた酸化チタン機能性分子複合体粒子の紫外線照射時間と、蛍光強度との関係を示す図である。
【符号の説明】
【００９３】
１…酸化チタン粒子
２…水溶性高分子
３…機能性分子
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化チタン粒子と、
該酸化チタン粒子の表面に、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基の群から選択される少なくとも一つの官能基を介して結合されてなる水溶性高分子を含んでなる、酸化チタン複合体粒子と、
該酸化チタン複合体粒子の表面に、さらに結合されてなる機能性分子を含んでなり、
前記前記機能性分子は、
（１）カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基の群から選択される少なくとも一つの官能基を有し、
（２）ａ）炭素数６〜４０よりなる飽和又は不飽和の鎖状炭化水素基、ｂ）置換基を有するか有しない飽和又は不飽和の５〜６員環複素環式基、又はｃ）置換基を有するか有しない飽和又は不飽和の５〜６員環環状炭化水素基を含んでなる化合物であって、
前記官能基を介して前記酸化チタンと結合されてなる、酸化チタン機能性分子複合体粒子。
【請求項２】
前記機能性分子の結合量は前記酸化チタン粒子の質量あたり、１．０×１０−１〜１．０×１０−５ 質量部／酸化チタン粒子の質量部であることを特徴とする、請求項１に記載の酸化チタン機能性分子複合体粒子。
【請求項３】
前記機能性分子はカテコール類であることを特徴とする、請求項１または２に記載の酸化チタン機能性分子複合体粒子。
【請求項４】
前記機能性分子は、カテコール、ドーパミン、ジヒドロキシフェニルプロピオン酸からなる群から選択される少なくとも一種である、請求項３に記載の酸化チタン機能性分子複合体粒子。
【請求項５】
前記機能性分子は放射性物質であることを特徴とする、請求項１または２に記載の酸化チタン機能性分子複合体粒子。
【請求項６】
前記放射性物質は１４Ｃ標識カテコールであることを特徴とする、請求項５に記載の酸化チタン機能性分子複合体粒子。
【請求項７】
前記機能性分子はラジカル応答性分子を含んでなることを特徴とする、請求項１または２に記載の酸化チタン機能性分子複合体粒子。
【請求項８】
前記機能性分子は蛍光性分子を含んでなることを特徴とする、請求項１または２に記載の酸化チタン機能性分子複合体粒子。
【請求項９】
前記機能性分子はアミノレブリン酸を含んでなることを特徴とする、請求項１または２に記載の酸化チタン機能性分子複合体粒子。
【請求項１０】
前記機能性分子はフェロセンを含んでなることを特徴とする、請求項１または２に記載の酸化チタン機能性分子複合体粒子。
【請求項１１】
前記水溶性高分子は重量平均分子量５０００〜４００００であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の酸化チタン機能性分子複合体粒子。
【請求項１２】
前記水溶性高分子は、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸、ポリエチレンイミンの群から選択される少なくとも一種を含んでなることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の酸化チタン機能性分子複合体粒子。
【請求項１３】
２０〜２００ｎｍの粒子径を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の酸化チタン機能性分子複合体粒子。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の酸化チタン機能性分子複合体粒子と、該粒子が分散される溶媒とを含んでなる、分散液。
【請求項１５】
前記溶媒が、水系溶媒である、請求項１４に記載の分散液。
【請求項１６】
前記溶媒のｐＨが５〜８である、請求項１４または１５に記載の分散液。
【請求項１７】
前記溶媒が、生理食塩水である、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の分散液。
【請求項１８】
前記酸化チタン機能性分子複合体粒子が、０．００１〜１質量％含有される、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の分散液。
【請求項１】
酸化チタン粒子と、
該酸化チタン粒子の表面に、カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基の群から選択される少なくとも一つの官能基を介して結合されてなる水溶性高分子を含んでなる、酸化チタン複合体粒子と、
該酸化チタン複合体粒子の表面に、さらに結合されてなる機能性分子を含んでなり、
前記前記機能性分子は、
（１）カルボキシル基、アミノ基、ジオール基、サリチル酸基、およびリン酸基の群から選択される少なくとも一つの官能基を有し、
（２）ａ）炭素数６〜４０よりなる飽和又は不飽和の鎖状炭化水素基、ｂ）置換基を有するか有しない飽和又は不飽和の５〜６員環複素環式基、又はｃ）置換基を有するか有しない飽和又は不飽和の５〜６員環環状炭化水素基を含んでなる化合物であって、
前記官能基を介して前記酸化チタンと結合されてなる、酸化チタン機能性分子複合体粒子。
【請求項２】
前記機能性分子の結合量は前記酸化チタン粒子の質量あたり、１．０×１０−１〜１．０×１０−５ 質量部／酸化チタン粒子の質量部であることを特徴とする、請求項１に記載の酸化チタン機能性分子複合体粒子。
【請求項３】
前記機能性分子はカテコール類であることを特徴とする、請求項１または２に記載の酸化チタン機能性分子複合体粒子。
【請求項４】
前記機能性分子は、カテコール、ドーパミン、ジヒドロキシフェニルプロピオン酸からなる群から選択される少なくとも一種である、請求項３に記載の酸化チタン機能性分子複合体粒子。
【請求項５】
前記機能性分子は放射性物質であることを特徴とする、請求項１または２に記載の酸化チタン機能性分子複合体粒子。
【請求項６】
前記放射性物質は１４Ｃ標識カテコールであることを特徴とする、請求項５に記載の酸化チタン機能性分子複合体粒子。
【請求項７】
前記機能性分子はラジカル応答性分子を含んでなることを特徴とする、請求項１または２に記載の酸化チタン機能性分子複合体粒子。
【請求項８】
前記機能性分子は蛍光性分子を含んでなることを特徴とする、請求項１または２に記載の酸化チタン機能性分子複合体粒子。
【請求項９】
前記機能性分子はアミノレブリン酸を含んでなることを特徴とする、請求項１または２に記載の酸化チタン機能性分子複合体粒子。
【請求項１０】
前記機能性分子はフェロセンを含んでなることを特徴とする、請求項１または２に記載の酸化チタン機能性分子複合体粒子。
【請求項１１】
前記水溶性高分子は重量平均分子量５０００〜４００００であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の酸化チタン機能性分子複合体粒子。
【請求項１２】
前記水溶性高分子は、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸、ポリエチレンイミンの群から選択される少なくとも一種を含んでなることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の酸化チタン機能性分子複合体粒子。
【請求項１３】
２０〜２００ｎｍの粒子径を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の酸化チタン機能性分子複合体粒子。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の酸化チタン機能性分子複合体粒子と、該粒子が分散される溶媒とを含んでなる、分散液。
【請求項１５】
前記溶媒が、水系溶媒である、請求項１４に記載の分散液。
【請求項１６】
前記溶媒のｐＨが５〜８である、請求項１４または１５に記載の分散液。
【請求項１７】
前記溶媒が、生理食塩水である、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の分散液。
【請求項１８】
前記酸化チタン機能性分子複合体粒子が、０．００１〜１質量％含有される、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の分散液。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００９−９１３４５（Ｐ２００９−９１３４５Ａ）
【公開日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２９４６６（Ｐ２００８−２９４６６）
【出願日】平成２０年２月８日（２００８．２．８）
【出願人】（００００１００８７）ＴＯＴＯ株式会社 (3,889)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月８日（２００８．２．８）
【出願人】（００００１００８７）ＴＯＴＯ株式会社 (3,889)
【Ｆターム（参考）】
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