酸化発色化合物の製造方法
【課題】生体成分測定のための酸化発色化合物の製造方法の提供。
【解決手段】下記化学式１：
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子またはスルホン酸基であり、この際Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の少なくとも一つがスルホン酸基である）で示される化合物またはその塩を、亜硝酸塩を用いてピラゾール環の４位をニトロソ化する工程と；該ニトロソ基を亜鉛を用いてアミノ基に還元する工程と；を含む、酸化発色化合物またはその塩の製造方法。
【解決手段】下記化学式１：
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子またはスルホン酸基であり、この際Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の少なくとも一つがスルホン酸基である）で示される化合物またはその塩を、亜硝酸塩を用いてピラゾール環の４位をニトロソ化する工程と；該ニトロソ基を亜鉛を用いてアミノ基に還元する工程と；を含む、酸化発色化合物またはその塩の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化発色化合物の製造方法ならびに当該方法によって製造された化合物を用いた試薬組成物および試験具に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日、血液や尿をはじめとする体液中の生体成分の測定法の一種として、酵素を用いた比色分析法が広く用いられている。これらの方法は、測定キット、自動分析機、ドライケミストリー試験具等に組み込まれ、日常的な臨床検査に数多く用いられている（例えば、特許文献１を参照）。
【０００３】
このような測定法の一種として、被測定物質に特異的な酸化酵素を作用させて発生する過酸化水素をさらにペルオキシダーゼの作用で活性酸素とし、これで発色試薬を酸化して生成する色素を比色定量する方法がある。
【０００４】
ここで使用される酵素としては、例えばグルコースの測定ではグルコースオキシダーゼ、コレステロールの測定ではコレステロールオキシダーゼ、尿酸の測定にはウリカーゼ、ピルビン酸の測定にはピルベートオキシダーゼ等が用いられる。これらの酵素は検体中の基質のみを特異的に酸化するために、色々な成分を含む検体からそれぞれの測定対象物のみを限定して定量することができる。
【０００５】
また、発色試薬としては、活性酸素で酸化されることによって、その吸収波長特性や吸収強度等が変化する色素もしくは色素の前駆体（色原体）が用いられる。すなわち、活性酸素の量に応じて変化する色を測定することによって、被測定物質の量を定量することができる。これらの色素や色原体には、１分子だけで機能するものや、異なる２分子がカップリングして機能するものがある。
【０００６】
１分子で機能するものには、ロイコ型色素等が挙げられる。具体的な化合物としては、ベンチジン、ｏ−トリジン、ｏ−ジアニシジン、２，２’−アミノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリノン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）、ビス−（４−ジエチルアミノ）−２−スルホフェニルメタン（ＢＳＰＭ）、ビス［３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル］アミン（ＢＣＭＡ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢＺ）、ビス［４−（Ｎ−アルキル−Ｎ−スルホプロピル）−２，６−ジメチルフェニル］メタン（Ｂｉｓ−ＭＡＰＳ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４’，４’’’−トリアミノトリフェニルメタン（ＴＭＰ）などが挙げられる。
【０００７】
２分子で機能する代表的なものには、カプラーとトリンダー試薬を酸化的にカップリングさせたものが挙げられる（例えば、非特許文献１および２を参照）。
【０００８】
カプラーとしては、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）、アミノジフェニルアミンまたはその誘導体などが用いられる。
【０００９】
トリンダー試薬としては、フェノール誘導体、アニリン誘導体が用いられる。フェノール誘導体としては、フェノール、４−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、２，６−ジクロロフェノール、３，５−ジクロロフェノール、２，４−ジブロモフェノール、２，６，４−トリクロロフェノール、２，６，４−トリブロモフェノール、３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホン酸、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨードベンゾイル酸、などが挙げられる。アニリン誘導体としては、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−３−アセチルエチレンジアミン（ＥＭＡＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メチルアニリン（ＣＥＭＢ）、Ｎ，Ｎ−ビス−（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン（ＴＯＤＢ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−サクシニルアミノエチル）−３−メチルアニリン（ＥＳＥＴ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＳＤＡ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）などが挙げられる。
【００１０】
ここで、保存安定性に鑑みると、１分子で機能する色素より２分子で機能する色素の方が良い傾向にある。また、２分子で機能する色素のうち、カプラーとしては、前記のうち最も安定な４−アミノアンチピリン、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾンが多く用いられ、トリンダー試薬としては安定でかつ発色強度や波長の点でより有利なアニリン誘導体が多く用いられている。
【００１１】
このような現状の下、前記の発色原理を用いた製品の価値を上げるためには、測定精度をさらに向上させる、あるいは経時的劣化を低減させる必要があり、また、より微量な成分の検出には、現存のものよりさらに感度のよい検出系が必要となり、それらの目的において、より高性能の発色試薬の開発が望まれている。
【００１２】
このように、従来のカプラーに変わる新規な発色化合物の開発が進められており、例えば、特許文献２には、酵素を阻害しないとされるアミノアンチピリン誘導体が開示されている。
【００１３】
ところで、このようなアミノアンチピリン誘導体のようなアミノ化合物を得るためには、ニトロソ化を行い、さらに還元を行なう方法が一般的に知られており、アミノアンチピリンの製造過程においては、ニトロソ化した後還元し、アミノ化をする手法が開示されている（例えば、特許文献３参照）。なお、特許文献２においても、ニトロソ化、アミノ化を行い、所望の発色化合物を得ている。
【特許文献１】特開２００４−２２３１１５号公報
【特許文献２】特公平６−９９４０３号公報
【特許文献３】米国特許第１，８７７，１６６号明細書
【非特許文献１】Ｔｒｉｎｄｅｒ，Ｐ．，Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６，２４，１９６９
【非特許文献２】Ｂａｒｈａｍ，Ｄ．ａｎｄ Ｔｒｉｎｄｅｒ，Ｐ．，Ａｎａｌｙｓｔ（Ｌｏｎｄｏｎ），９７，１４２，１９７２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上記の通り、より高性能の発色試薬の開発が望まれている一方で、実際に工業化を念頭においた場合、その高性能の発色試薬を、高純度かつ高収率で製造する必要性が生じる。
【００１５】
しかしながら、前記したような技術においては、高純度かつ高収率で製造することができず、このような技術手段の開発が、現実問題として希求されている。
【００１６】
よって、本発明は、上記実情を鑑みてなされたものであり、従来に比して性能が向上した発色化合物を、高純度かつ高収率で製造するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、上記実情に鑑み、鋭意研究を行った。その過程でまず、前記のような技術によっても、従来に比して性能が向上した発色化合物を、高純度かつ高収率で製造することができない理由を、以下の通り詳細に探索した。
【００１８】
まず、所望の発色化合物を得るためには、ニトロソ化、アミノ化を経る必要があるが、高純度かつ高収率で所望の発色化合物を得ることができないのは、ニトロソ化により生じるニトロソ体が非常に不安定で、水溶液中では容易に分解して不純物を生じるのではないかと予測した。
【００１９】
さらには、本発明が提供する酸化発色化合物は、従来のアミノアンチピリンと比較して極めて水溶性が高いことも、従来の方法によっては、高純度かつ高収率で目的物を得ることができない一因ではないかと予測した。
【００２０】
その予測の下、鋭意研究を行った結果、本発明の製造方法によると、驚くべきことに、非常に高い純度および収率で、目的物を得ることができたのである。本発明は、このようにして完成した。
【００２１】
すなわち、本発明は、下記（１）〜（１１）で示される、高い性能を持つ新規酸化発色化合物の製造方法を提供する。
【００２２】
（１）下記化学式１：
【００２３】
【化１】
【００２４】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子またはスルホン酸基であり、この際Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の少なくとも一つがスルホン酸基である、
で示される化合物またはその塩を、亜硝酸塩を用いてニトロソ化する、ニトロソ化工程と；
前記ニトロソ化工程の後、
下記化学式２：
【００２５】
【化２】
【００２６】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である、
で示される化合物またはその塩を単離する、単離工程と；
前記単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩を、亜鉛を用いて還元する、還元工程と；
を含む、
下記化学式３：
【００２７】
【化３】
【００２８】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である、
で示される酸化発色化合物またはその塩の製造方法。
【００２９】
（２）前記ニトロソ化工程において、亜硝酸塩の量が、化学式１で示される化合物またはその塩に対して１．０〜１．５倍モルである、（１）に記載の製造方法。
【００３０】
（３）前記ニトロソ化工程におけるニトロソ化反応を、化学式１で示される化合物またはその塩に対して１．０〜１．５倍モルの酸を用いて行う、（１）または（２）に記載の製造方法。
【００３１】
（４）前記ニトロソ化工程において、酸またはその水溶液と、亜硝酸塩の水溶液と、を同時に化学式１で示される化合物またはその塩の水溶液に滴下して添加する、（３）に記載の製造方法。
【００３２】
（５）前記還元工程において、亜鉛の量が、前記単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩に対して１〜３０倍モルである、（１）〜（４）のいずれか１つに記載の製造方法。
【００３３】
（６）前記還元工程における還元反応を、前記単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩に対して１〜３０倍モルの酸をさらに用いて行う、（１）〜（５）のいずれか１つに記載の製造方法。
【００３４】
（７）前記還元工程を、反応溶媒を用いて行い、該反応溶媒が、アルコールである、（１）〜（６）のいずれか１つに記載の製造方法。
【００３５】
（８）前記還元工程を、反応溶媒を用いて行い、該反応溶媒の量が、前記単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩１ｇに対して２０〜１００ｍＬである、（１）〜（７）のいずれか１つに記載の製造方法。
【００３６】
（９）前記還元工程後、反応混合物中に残留する亜鉛を、水酸化亜鉛として除去する工程をさらに含む、（１）〜（８）のいずれか１つに記載の製造方法。
【００３７】
（１０）前記還元工程後、反応混合物からアルコールを用いて、化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩を抽出精製する、抽出精製工程をさらに含む、（１）〜（９）のいずれか１つに記載の製造方法。
【００３８】
（１１）（１）〜（１０）のいずれか１つに記載の製造方法で得られた、化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩。
【発明の効果】
【００３９】
本発明の製造方法においては、従来の方法と比較して、下記(ア)〜(ウ)で優れている。
【００４０】
（ア）純度の向上
従来法では、５０％程度であった純度が、本願発明の製造方法によると、９５％以上に向上しうる。
【００４１】
（イ）反応収率の向上
従来法では、３０％程度であった収率が、本願発明の製造方法によると、８０％以上の収率が得られうる。
【００４２】
（ウ）吸湿性の改善
従来法で得られるアミノアンチピリン誘導体は、そのアミノ基が、酸（塩酸、酢酸等）との塩を形成しており、非常に吸湿性が高かった。本願発明の製造方法によると、スルホン酸基がアルカリ塩となっているため、吸湿性が有意に低い。さらに、本願発明により製造される発色化合物は、その呈色性能において、下記（エ）〜（キ）の点でこれまでの試薬より優れている。特に担体に保持した試験具として使用する場合、その効果が最も顕著である。
【００４３】
（エ）測定時間の短縮
本願発明の製造方法により製造される発色化合物は、水溶性が有意に高いので、特に担体に保持して使用する場合には、血液などの検体にすばやく溶解して均一化し、迅速に呈色反応が起こる。
【００４４】
（オ）感度が高い
呈色反応によって生成した色素化合物は、検体への溶解性や親和性が有意に高く、担体内での展開性が良くなるので、担体表面での発色が鮮やかで均一性の高いものとなる。それによって感度が高く安定した測定が可能となる。
【００４５】
（カ）精度が高い
本願発明の製造方法により製造される発色化合物は、溶解性が有意に高いので、従来の試薬より高濃度の試薬液が調製可能である。また、担体に担持して使用する場合塗布液濃度を高くしてより多くの試薬を担体に保持させることが可能となる。さらには、塗布液の濃度を高く設定し全体液量を少なくできることで、塗工均一性の高い、グラビア印刷法、ドット印刷法、インクジェット印刷等の精密印刷法が使用できる。塗工液量が少なくなれば、乾燥時間が短縮され乾燥むらを低減させる効果もある。つまり、十分な試薬を高い均一性で塗工できることにより、塗りむらなどに起因するばらつきを低減させることができ、高い精度の試験具を提供することができる。
【００４６】
（キ）経時安定性に優れる
本願発明の製造方法により製造された発色化合物は、親水性が有意に向上して、分子量が有意に大きいため、保管中の昇華による試薬の損失を押さえることができる。また、本願発明の製造方法により製造された発色化合物は、試薬濃度の変化における呈色強度への影響が少ないため、発色化合物が経時的に劣化減少した場合でも測定値への影響が少ない。さらには、本発明の製造方法により製造される発色化合物における親水性官能基は、担体への吸着性を高め、担体内での化合物の安定性を向上させる。つまり、経時劣化を低減させ、有効期間を延ばすことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
以下に本発明をより具体的に説明する。
【００４８】
＜本発明の第一＞
本発明の第一は、
下記化学式１：
【００４９】
【化４】
【００５０】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子またはスルホン酸基であり、この際Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の少なくとも一つがスルホン酸基である、
で示される化合物またはその塩を、亜硝酸塩を用いてニトロソ化する、ニトロソ化工程と；
前記ニトロソ化工程の後、
下記化学式２：
【００５１】
【化５】
【００５２】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である、
で示される化合物またはその塩を単離する、単離工程と；
前記単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩を、亜鉛を用いて還元する、還元工程と；
を含む、
下記化学式３：
【００５３】
【化６】
【００５４】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である、
で示される酸化発色化合物またはその塩の製造方法である。
【００５５】
上記の通り、従来、所望の発色化合物を得ることができないのは、ニトロソ化により生じるニトロソ体が非常に不安定ではないかとの予測の下に鋭意研究を行った。
【００５６】
その結果、中間体であるニトロソ体（化学式２で示される化合物またはその塩）は不安定であり、それが、所望の発色化合物の収率減少や純度低下の一因となっていた。
【００５７】
さらに研究を進めていく過程で、本発明の製造方法により製造される発色化合物は、従来のアミノアンチピリンと比較して極めて水溶性が高いため、従来の方法によっては、高純度かつ高収率で所望の酸化発色化合物を得ることができないとの知見も見出した。
【００５８】
よって、ニトロソ化反応、還元反応の条件および精製法等に、様々な技術的工夫を行うことにより、従来法に比較して、より効率的に高純度の発色化合物を合成する方法を見出し、本発明を完成させたのである。
【００５９】
以下、本発明を詳説する。
【００６０】
［ニトロソ化工程］
ニトロソ化を行う対象化合物は、
下記化学式１：
【００６１】
【化７】
【００６２】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子またはスルホン酸基であり、この際Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の少なくとも一つがスルホン酸基である、で示される化合物またはその塩である。
【００６３】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のうち１つのみが、スルホン酸基である場合、好ましい部位は、呈色性の観点で、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４である。また、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のうちの２つがスルホン酸基である場合、好ましい部位は、呈色性の観点で、Ｒ２、Ｒ４である。
【００６４】
なお、スルホン酸基は、イオン性官能基であるが、これらの官能基は、遊離の状態であっても、または塩を形成していてもよい、すなわち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、スルホン酸基の塩であってもよい。
【００６５】
この際、これらの酸基と塩を形成する対イオンは、無機イオンでもよいし、有機イオンでもよい。例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン等の無機塩基由来の陽イオン；アンモニウムイオン；アルキルアミン類等の有機塩基由来の陽イオン；およびアミノ酸類等の両性化合物由来のイオンなどが挙げられる。なかでも、塩の形態である場合には、好ましくはナトリウム塩、カリウム塩、またはアンモニウム塩であり、より好ましくはナトリウム塩である。
【００６６】
なお、後述する化学式２〜化学式５における「Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５」は、いずれも、上記化学式１において行った「Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５」の定義と同様である。よって、下記ではその説明を割愛する。
【００６７】
なお、ここで、化学式１で示される化合物またはその塩を得る方法について下記に説明する。
【００６８】
本発明の化学式１で示される化合物またはその塩の製造方法は、特に制限されず、公知の製造方法が同様にしてあるいは適宜修飾してあるいは適宜組み合せて適用できる。以下、本発明の化学式１で示される化合物またはその塩の製造方法の好ましい実施形態を説明するが、本発明は下記好ましい実施形態に限定されるものではない。
【００６９】
すなわち、本発明の化学式１で示される化合物またはその塩の製造方法は、下記化学式４：
【００７０】
【化８】
【００７１】
で示される化合物［以下、「化合物４」とも称する］と、下記化学式５：
【００７２】
【化９】
【００７３】
で示される化合物［以下、「化合物５」とも称する］とを、反応させる工程［工程（Ａ）］を有することが好ましい。
【００７４】
化合物４と化合物５とを反応させる上記工程（Ａ）において、化合物４及び５の混合比は、特に制限されない。好ましくは、化合物４及び５をそれぞれ等モル混合する、あるいは化合物４を化合物５に対してやや多めに混合することが好ましい。後者の場合、化合物４は、化合物５を１モルに対して、０．８〜２モル、より好ましくは１〜１．２モル程度の割合で、混合することが好ましい。また、化合物４と化合物５との反応条件は、これらの反応が進行する条件であれば特に制限されないが、例えば、反応温度は、好ましくは２０〜２００℃、より好ましくは、８０〜１５０℃の温度であり、反応時間は、好ましくは０．５〜５時間、より好ましくは１〜１．５時間である。また、化合物４と化合物５との反応は、無溶媒下で行なってもよく、あるいは溶媒中で行なってもよい。後者の場合に使用できる溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール等の、アルコール類；ＴＨＦ、ジエチルエーテル、ジオキサン等の、エーテル類；ピリジン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の溶媒が挙げられる。これらのうち、ＴＨＦが好ましい。化合物４と化合物５との反応後は、反応混合物を適当な溶媒中に加えることによって生成物を固化させることによって、原料化合物と分離回収することができる。
【００７５】
次に、上記工程（Ａ）で得られた反応生成物を、メチル化する［工程（Ｂ）］ことによって、前記化学式１で示される化合物が得られる。
【００７６】
上記工程（Ｂ）において、メチル化は、ヨウ化メチルや硫酸ジメチルなどのメチル化剤を用いて行なうことができる。ここで、メチル化剤としては、上記のものに限定されず、他の公知のメチル化剤も同様にして使用できる。この反応は適当な溶媒や塩基を用いてもよく、室温あるいは加熱下で行なわれる。より具体的には、使用できる溶媒としては、上記工程（Ａ）で列挙したのと同様の溶媒が使用でき、これらのうち、メタノール、ＴＨＦが好ましい。また、塩基としては、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、４−（ジメチルアミノ）ピリジンなどが使用でき、これらのうち、ＴＥＡが好ましい。
【００７７】
上記工程（Ｂ）において、メチル化剤の使用量は、上記工程（Ａ）で得られた反応生成物を十分メチル化できる量であれば特に制限されないが、上記工程（Ａ）で得られた反応生成物１モルに対して、好ましくは０．５〜５モル、より好ましくは１〜２モルである。反応条件もまた特に制限されないが、上記工程（Ａ）で得られた反応生成物のメチル化反応を、好ましくは４０〜２００℃、より好ましくは１００〜１４０℃の温度で、好ましくは１〜２４時間、より好ましくは１０〜２０時間、行なう。
【００７８】
また、化学式１で示される化合物またはその塩を得る他の方法としては、上記工程（Ａ）で得られた反応生成物を、以下の通りメチル化する［工程（Ｃ）］ことによって行う方法が挙げられる。
【００７９】
すなわち、上記工程（Ａ）で得られた反応生成物と、硫酸ジメチルと、を混合し、無溶媒下で加熱反応させる工程を含む、下記化学式１で示される化合物またはその塩：
【００８０】
【化１０】
【００８１】
で示される化合物またはその塩の製造方法である。
【００８２】
工程（Ｃ）の製造方法のように、溶媒を用いずに（無溶媒で）合成できるメリットとしては、反応容量を少量化でき、反応容器容積あたりの仕込み可能量が大きいことがあげられる。すなわち、通常の反応より小型の反応装置でより多くの製造ができるので、大量合成に好都合である。また、塩基を用いずに合成することもできる。
【００８３】
硫酸ジメチルは、市販のものを使用しても合成して使用してもよく、特に制限されることはない。
【００８４】
上記工程（Ａ）で得られた反応生成物に対する前記硫酸ジメチルの量は、１．０〜２．０倍モルであることが好ましく、１．０〜１．５倍モルがより好ましく、１．０〜１．３倍モルが特に好ましい。上記工程（Ａ）で得られた反応生成物に対する硫酸ジメチルの添加量が、１．０倍モル未満だと、反応効率低下の虞れがあり、２．０倍モルを越えると副生成物の増大の虞れがある。
【００８５】
本発明に係る硫酸ジメチルの添加の方法としては、滴下ロート、ピペットなどを用いることができるが、外気中の水分による硫酸ジメチルの加水分解を防ぐために滴下ロートを用いて反応系を密閉して行なうのが好ましい。また、室温、１ａｔｍにおいて上記工程（Ａ）で得られた反応生成物と、硫酸ジメチルとを混合する際には、液体である硫酸ジメチルに完全に溶解させてもまたは溶解させなくてもよく、両者がどのような状態であろうが混合していればよい。
【００８６】
工程（Ｃ）に用いられる反応容器としては、ガラス、ステンレス、ホーロー、テフロン（登録商標）製のフラスコが好ましく、摺合せのガラス製フラスコが特に好ましい。
【００８７】
工程（Ｃ）に用いられる反応容器としては、なす型フラスコ、丸底フラスコ、平底フラスコ、三角フラスコ、セパラブルフラスコ、多口フラスコを用いることができるが、これらは、仕込み量や加熱効率を考慮して選択される。
【００８８】
工程（Ｃ）に用いられる冷却器としては、通常の合成反応に用いられる還流冷却器を用いることができ、リービッヒ冷却器、玉入冷却器（アーリン氏タイプ）、ジムロート冷却器、蛇管冷却器（グラハムタイプ）が好ましく、リービッヒ冷却器、玉入冷却器が特に好ましい。
【００８９】
また、工程（Ｃ）における加熱反応中、外気からの水分の混入を防ぐ為に、塩化カルシウム管、窒素バブラーを取り付けることが好ましい。
【００９０】
工程（Ｃ）における製造方法における加熱反応の加熱方法としては、マントルヒーター、油浴、砂浴（バーナー直火）が好ましく、マントルヒーターが特に好ましい。必要に応じて、センサー付き温度コントローラーを用いることができる。
【００９１】
工程（Ｃ）における加熱反応の温度としては、１９０〜２６０℃が好ましく、２００〜２５０℃が特に好ましく、２２０〜２４０℃がさらに好ましい。
【００９２】
上記加熱反応の温度が１９０℃未満だと、反応効率低下の虞れがあり、２６０℃超だと、副生成物の増大の虞れがある。
【００９３】
工程（Ｃ）における加熱反応の反応時間としては、０．５〜５時間が好ましく、０．５〜３時間が特に好ましく、１〜２時間がさらに好ましい。
【００９４】
上記加熱反応の反応時間が０．５時間未満だと、反応効率低下の虞れがあり、５時間超だと、副生成物の増大の虞れがある。
【００９５】
工程（Ｃ）において、上記工程（Ａ）で得られた反応生成物と、硫酸ジメチルとを混合し、無溶媒下で加熱反応させて得られた反応混合物をアルカリ水溶液に溶解させて反応混合溶液を得る工程と、前記反応混合溶液に酸を加えて固体を単離する工程とを含むことが好ましい。
【００９６】
本発明に係る化学式（１）で示される化合物は、溶媒抽出による回収が困難であるため酸を添加することで強制的に沈殿するいわゆる“酸沈”により回収することが好ましい。これにより、最終目的物を高い純度で得られることができる。
これにより、化学式１で示される化合物またはその塩を高い純度で得られることができる。
【００９７】
本発明に係る製造方法に用いられるアルカリ水溶液のアルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムが好ましく、水酸化ナトリウムが特に好ましい。
【００９８】
本発明に係る製造方法に用いられるアルカリ水溶液の濃度としては、１０〜３０ｗ／ｖ％（重量対体積％）が好ましく、１５〜２５ｗ／ｖ％が特に好ましく、２０〜２５ｗ／ｖ％がさらに好ましい。
【００９９】
また、上記反応混合物をアルカリ水溶液に溶解させて得られる反応混合溶液のｐＨは、７〜１４が好ましい。
【０１００】
本発明に係る製造方法に用いられるアルカリ水溶液中のアルカリの量としては、使用する硫酸ジメチルに対して２〜５倍モルが好ましく、２．５〜４倍モルが特に好ましく、３倍モルがさらに好ましい。
【０１０１】
本発明に係る製造方法に用いられる酸としては、有機酸または無機酸のいずれでもよく、塩酸、硫酸、硝酸、酢酸、クエン酸、コハク酸、ピクリン酸、濃硫酸、濃硝酸などが用いられるが、塩酸、硫酸、硝酸がより好ましく、塩酸がさらに好ましい。
【０１０２】
本発明に係る製造方法において、上記反応物に添加する酸の濃度としては、なるべく水分量を減らすべく濃度が高いものが好ましい。
【０１０３】
上記反応物混合溶液に添加する酸の濃度は、５〜１００ｗ／ｖ％（重量／体積％）が好ましく、１５〜１００ｗ／ｖ％がより好ましく、３０〜１００ｗ／ｖ％が特に好ましい。例えば、添加する酸として塩酸を用いる場合は、１５〜３６ｗ／ｖ％が好ましく、３０〜３６ｗ／ｖ％が特に好ましい。
【０１０４】
上記反応物混合溶液に添加する酸の量は、１〜１０倍モルが好ましく、１〜５倍モルがより好ましく、１．５〜３倍モルが特に好ましい。
【０１０５】
上記反応物に添加する塩酸の量としては、出発物質の使用量に対して、１〜５倍モルが好ましく、１．５〜３倍モルが特に好ましく、１．８〜２．２倍モルがさらに好ましい。
【０１０６】
また、本発明に係る製造方法において酸を加え沈殿を生成させる工程で用いる攪拌装置としては、磁気スターラー、メカニカルスターラーなどを用いることができる。
【０１０７】
本発明に係る製造方法において、前記単離工程で得られた固体を水から再結晶する工程をさらに含むことが好ましい。すなわち、本発明の製造方法は、上記工程（Ａ）で得られた反応生成物と、硫酸ジメチルを混合し、無溶媒下で加熱反応させて得られた反応混合物を得る工程と、アルカリ水溶液に溶解させて反応混合溶液を得た後、さらに前記反応混合溶液に酸を加えて固体（上記化学式１に示される化合物を含むもの）を単離する工程と、単離された前記固体を水から再結晶する工程とを含むことが好ましい。
【０１０８】
本発明に係る製造方法における再結晶で用いる水の量としては、固体１００ｇ当り、５００ｍｌ〜３０００ｍｌが好ましく、１０００ｍｌ〜２０００ｍｌが特に好ましく、１０００ｍｌ〜１５００ｍｌがさらに好ましい。なお、当該単離された固体は、０．５〜２４時間、室温条件下で減圧乾燥したものが使用される。
【０１０９】
上記再結晶工程で固体を水に溶解させる際に、加熱を行なってよい。加熱器具としては、水浴、油浴、マントルヒーター、ホットプレートなどが用いられる。加熱する際の加熱器具の温度設定は、５０〜１５０℃が好ましく、７０〜１３０℃が特に好ましく、９０〜１１０℃がさらに好ましい。
【０１１０】
また上記再結晶のための放置時間は、３０分〜３日が好ましく、１時間〜１日が特に好ましく、１０時間〜１５時間がさらに好ましい。さらに、上記再結晶のための放置時の温度は、０〜４０℃が好ましく、０〜２５℃が特に好ましく、０〜１５℃がさらに好ましい。
【０１１１】
本発明に係る製造方法において使用される水は、特に制限されるものではなく、水道水、イオン交換水、純水、超純水、または工業用水などの水洗水を使用することができ、純水が特に好ましい。
【０１１２】
上記により得られた、前記化学式１で示される化合物またはその塩の純度の測定方法は、後述する。
【０１１３】
（亜硝酸塩）
前記化学式１で示される化合物またはその塩を、亜硝酸塩を用いてニトロソ化する。
【０１１４】
ニトロソ化工程に用いる亜硝酸塩は、特に制限はないが、亜硝酸のカチオン塩が用いられると好ましい。
【０１１５】
カチオン塩としても、特に制限はなく、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などが好適に挙げられる。具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等が好ましい。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。なお、入手のし易さの観点で、ナトリウム塩が特に好ましい。
【０１１６】
ニトロソ化工程に用いる亜硝酸塩の量は、化学式１で示される化合物またはその塩（本明細書中、単に「出発物質」とも称する。）の量に対して、反応効率および副生成物の観点で、１．０〜２．０倍モルが好ましく、１．０〜１．５倍モルがより好ましく、１．０〜１．２倍モルがさらに好ましい。
【０１１７】
（酸）
前記ニトロソ化工程におけるニトロソ化反応は、反応性の観点で、酸の存在下において行うとよい。
【０１１８】
ニトロソ化工程に用いられる酸は、特に制限はないが、反応性の観点で、塩酸、硫酸、硝酸、濃塩酸、濃硫酸、濃硝酸、酢酸、クエン酸、コハク酸、ピクリン酸が好ましい。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。なお、取り扱いの観点で、塩酸が特に好ましい。
【０１１９】
ニトロソ化工程に用いられうる酸の量にも、特に制限はないが、出発物質の量に対して、反応効率および副生成物の生成の観点で、０．５〜２．０倍モルが好ましく、１．０〜１．５倍モルがより好ましく、１．０〜１．２倍モルがさらに好ましい。
【０１２０】
また、添加する酸は、副生成物の生成を抑える観点で、好ましくは０〜１５℃、より好ましくは１〜１０℃、さらに好ましくは１〜５℃にしておくとよい。なお、添加する酸を、後述する溶媒で希釈した場合も同様の温度に制御しておくとよい。
【０１２１】
（溶媒）
ニトロソ化工程において、出発物質と上記亜硝酸塩、酸を混合する場合、それぞれを予め溶媒に含有させておいてもよい。
【０１２２】
つまり、溶媒に、それぞれの原末（出発物質と亜硝酸塩）または原液（酸）を加えていく方法や、出発物質を溶媒に含有させた溶液（本明細書中、「出発物質の溶液」とも称する）に、亜硝酸塩、酸を溶媒に含有させた溶液（それぞれ、「亜硝酸塩の溶液」、「酸の溶液」とも称する。）を添加する方法を用いてもよい。
【０１２３】
好ましくは、反応効率の観点で、出発物質の溶液に、亜硝酸塩の溶液および酸の溶液を添加する方法である。つまり、酸の溶液と、亜硝酸塩の溶液とを、化学式１で示される化合物またはその塩の溶液に滴下して添加する。
【０１２４】
この際、添加する亜硝酸塩の溶液は、副生成物の生成を抑える観点で、好ましくは０〜１５℃、より好ましくは１〜１０℃、さらに好ましくは１〜５℃にしておくとよい。また、添加する亜硝酸塩の溶液の濃度は、反応性の観点で、好ましくは１〜１０ｍｏｌ／ｌ、より好ましくは１〜５ｍｏｌ／ｌ、さらに好ましくは３〜５ｍｏｌ／ｌにしておくとよい。
【０１２５】
また、添加する酸の溶液の濃度は、反応性の観点で、好ましくは１〜１０ｍｏｌ／ｌ、より好ましくは１〜５ｍｏｌ／ｌ、さらに好ましくは３〜５ｍｏｌ／ｌにしておくとよい。
【０１２６】
また、出発物質の溶液の濃度は、反応性の観点で、好ましくは０．１〜１０ｍｏｌ／ｌ、より好ましくは０．１〜５ｍｏｌ／ｌ、さらに好ましくは０．５〜２ｍｏｌ／ｌである。
【０１２７】
また、予め出発物質の溶液を、副生成物を抑える観点で、好ましくは０〜１５℃、より好ましくは０〜５℃、さらに好ましくは０〜３℃にしておくとよい。
【０１２８】
前記溶媒は、特に制限はないが、水、有機溶媒またはこれら混合物（混合溶媒）が用いられうる。なお、本明細書中、溶媒として「水」を主成分（好ましくは、全部）とした溶液の名称を「水溶液」とも称する。なお、本明細書中、「水を主成分とする」とは、全溶液中に水の占める割合が、１０〜１００ｖ／ｖ％であることを意味する。
【０１２９】
有機溶媒としては、特に制限はないが、アルコール、エーテル類、ケトン類、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどが用いられる。
【０１３０】
アルコールとしては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノールなどが好適に用いられうる。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。
【０１３１】
エーテル類としては、ジエチルエーテル、イソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、ジフェニルエーテル、ベンジルエーテル及びｔｅｒｔ−ブチルエーテルなどが好適に用いられうる。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。
【０１３２】
ケトン類としては、アセトン、メチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）及びシクロヘキサノンなどが好適に用いられうる。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。
【０１３３】
これらのうち、反応性の観点で、水単独または水とアルコールとの混合物が好ましく、水単独が特に好ましい。
【０１３４】
水および有機溶媒の混合溶媒を用いる際は、例えば、好ましくは水／有機溶媒（容量比）＝０／１００〜１００／０、より好ましくは水／有機溶媒（容量比）＝１０／９０〜１００／０程度がよい。この際、有機溶媒の含有量が、混合溶媒中、５０容量％を超えると、亜硝酸塩の析出の虞れもある。
【０１３５】
また、上記の通り、出発物質と、亜硝酸塩と酸とを混合させる方法にも特に制限はないが、反応性の観点で、亜硝酸塩の溶液と、酸の溶液とを、攪拌下で、出発物質の溶液に添加する方法が好ましい。さらには、添加する条件は、副生成物を抑える観点で、亜硝酸塩の溶液と酸の溶液を、ほぼ同じ速度で、同時に添加することが好ましい。
【０１３６】
ここで、「同時に添加する」とは、亜硝酸塩の溶液と、酸の溶液とを添加しているある時点が、一瞬でも互いに重複すればよいが、亜硝酸塩の溶液と、酸の溶液との添加を開始する時点と、亜硝酸塩の溶液と、酸の溶液との添加を終了する時点とが、実質的に同じであると好ましい。
【０１３７】
このように、「同じ速度で添加する」および「同時に添加する」ことで、亜硝酸を一定で連続的に発生させる効果を奏しうる。
【０１３８】
なお、この際の、亜硝酸塩の溶液と、酸の溶液の添加の方法にも特に制限はないが、ピペット、シリンジ、滴下ロートなどを用いて行なわれることが好ましい。また、これらの添加に要する時間は、グラムスケールの反応では、生成物の安定性の観点で、１〜１０分が好ましく、３〜７分が特に好ましく、４〜６分がさらに好ましい。
【０１３９】
また、添加は、磁気攪拌子等で、攪拌しながら行うことが、好ましい。
【０１４０】
さらに、亜硝酸塩の溶液と、酸の溶液と、を添加した後、そのまま静置しておいてもよいが、反応が添加後、時間とともに進行するため、好ましくは、上述の磁気攪拌子等で、好ましくは１〜１０分程度、より好ましくは３〜５分程度、激しく攪拌するとよい。この際、「激しく攪拌する」の攪拌速度にも特に制限はないが、好ましくは３００〜１２００ｒｐｍ、より好ましくは６００〜１０００ｒｐｍである。
【０１４１】
（反応時間）
ニトロソ化工程における反応時間にも特に制限はないが、あまりに反応時間が短すぎると、反応が不十分で出発物質の残留が生じる虞れがある。一方で、あまりに反応時間が長過ぎると、生成したニトロソ体の分解が起こる虞れがある。
【０１４２】
反応時間は、亜硝酸塩の溶液と酸の溶液を添加する時間を含めて、グラムスケールの反応では、１〜２０分が好ましく、５〜１５分がより好ましく、７〜１２分がさらに好ましい。
【０１４３】
（反応温度）
ニトロソ化工程において設定される反応温度としては、副生成物の生成を抑える観点で、０〜１５℃が好ましく、１〜１０℃がより好ましく、１〜５℃がさらに好ましい。かような温度条件にするためには、従来公知の知見を適宜参照して制御することができ、例えば、水浴や氷浴等を用いればよい。
【０１４４】
（反応容器）
ニトロソ化工程に用いられる反応容器の素材としても、特に制限はないが、ガラス製、ステンレス製、ホーロー製、テフロン（登録商標）製などが好適に例示でき、ガラス製が特に好ましい。また、反応容器の形状としても、特に制限はないが、なす型フラスコ、丸底フラスコ、平底フラスコ、三角フラスコ、セパラブルフラスコ、多口フラスコなどが挙げられる。
【０１４５】
上記ニトロソ化工程を経ることにより、
下記化学式２：
【０１４６】
【化１１】
【０１４７】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である、で示される化合物またはその塩を得ることができる。
【０１４８】
［単離工程］
本発明においては、上記ニトロソ化工程の後、化学式２で示される化合物またはその塩を単離する、単離工程を経る。つまり、本発明においては、ニトロソ化工程終了後、そのままワンポットで、一気に、後述の還元工程を行わず、単離工程を必須の工程として有する点に特徴の一つを有する。
【０１４９】
上記の通り、従来、所望の発色化合物を、高純度かつ高収率で得ることができないのは、ニトロソ化により生じるニトロソ体が非常に不安定ではないかとの予測の下に鋭意研究を行った。そして、その予測は正しく、中間体であるニトロソ体（化学式２で示される化合物またはその塩）は不安定であり、それが、収率減少や目的物の純度低下の一因となっていることを見出したのである。
【０１５０】
つまりは、中間体であるニトロソ体（化学式２で示される化合物またはその塩）を適切な精製を行わなければ、結局は、最終生成物たる化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩の収率減少や純度低下という結果に直結するのである。
【０１５１】
一方で、ニトロソ化工程終了後、ワンポット（一気に）で、後述の還元工程に移行する条件の下で、化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩の製造を試みると、中間体であるニトロソ体（化学式２で示される化合物またはその塩）の単離をすることが非常に困難なのである。つまりは、中間体であるニトロソ体（化学式２で示される化合物またはその塩）中に存在する副生成物の分離除去を行うことが困難なのである。
【０１５２】
その観点からして、上記ニトロソ化工程においては、中間体であるニトロソ体（化学式２で示される化合物またはその塩）の単離を容易に行わせしめるべく、最適なニトロソ化反応条件を詳細に検討する点も、非常に有用であると言えるのである。具体的には、本発明の製造方法におけるニトロソ化工程によれば、化学式２で示される化合物またはその塩のみが、沈殿分離するため、容易に単離精製することができる。また、上記にて、亜硝酸塩、酸を、それぞれ化学式１で示させる化合物またはその塩に対して、ほぼ等量で添加するのも、副生成物の生成をより抑え、ひいては化学式２で示される化合物またはその塩を容易に単離精製させるために他ならない。
【０１５３】
上記の通り、ニトロソ体（化学式２で示される化合物またはその塩）を固体として単離することによって、不純物が除去され、次の還元工程が効率的に進行するため、最終的に得られるアミノ体（化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩）の純度が高くなり、また還元工程における収率も向上するのである。
【０１５４】
以下、単離工程における、ニトロソ体を単離する方法について詳説する。
【０１５５】
ニトロソ体（化学式２で示される化合物またはその塩）を単離する具体的方法としては、特に制限はないが、ニトロソ化工程終了後に得られた反応混合物を、濾過したり、遠心分離したりすることなどによって行なわれるとよい。なお、かようにして得られたものを、「ニトロソ化物固体」とも称する。
【０１５６】
この際の濾過方法や条件としては、特に制限ないが、ろ紙を用いた吸引ろ過によって行うことができる。
【０１５７】
なお、得られたニトロソ化物固体は、溶媒で洗浄することにより、さらに純度が高くなる。
【０１５８】
この洗浄に用いられうる溶媒は、特に制限はないが、有機溶媒、またはこれらの混合物が用いられる。これらのうち、ニトロソ体の安定性の観点で、有機溶媒は、アルコールが好ましい。アルコールとしても特に制限はなく、上記にて列挙した具体例が同様に妥当であるが、ニトロソ体の安定性・純度の観点で、メタノールが特に好ましい。
【０１５９】
この際、洗浄に用いるアルコールは、ニトロソ体の安定性の観点から、好ましくは−２０℃〜１０℃程度、より好ましくは０〜５℃程度に冷却しておくと良い。
【０１６０】
このように得られたニトロソ体（化学式２で示される化合物またはその塩）の固体は、減圧乾燥などによって乾燥することによって、さらに、保存安定性が向上する。この際の減圧乾燥方法や条件としても、特に制限ないが、真空ライン（好ましくは０〜１０ｍｍＨｇ、より好ましくは１〜２ｍｍＨｇ）に接続して行うことができる。
【０１６１】
かようにして、化学式２で示される化合物またはその塩を単離することができる。
【０１６２】
［還元工程］
本発明における還元工程では、前記単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩を、亜鉛を用いて還元する。
【０１６３】
かような還元工程を経ることにより、
下記化学式３：
【０１６４】
【化１２】
【０１６５】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である、で示される酸化発色化合物またはその塩を製造することができる。
【０１６６】
上記の通り、ニトロソ化工程終了後、ワンポット（一気に）で、後述の還元工程に移行する条件下で、化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩の製造を試みると、生成する無機塩（亜鉛等）の除去が困難である。
【０１６７】
本発明の製造方法によると、無機塩（亜鉛等）を水酸化物として分離除去できるため、精製が非常に容易であり、最終生成物たる化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩の収率が有意に向上する。
【０１６８】
（亜鉛）
還元工程において、亜鉛を必須成分として用いる。ただし、亜鉛以外でも、本発明の効果を奏する範囲であれば、他の還元剤を用いてもよい。他の還元剤としては、ハイドロサルファイド塩、サルファイド塩などが挙げられる。
【０１６９】
還元工程において、亜鉛の量は、前記単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩に対して１〜３０倍モルが好ましく、５〜１０倍モルがより好ましく、７〜８倍モルがさらに好ましい。
【０１７０】
（酸）
還元工程における還元反応は、酸の存在下において行うとよい。
【０１７１】
還元工程に用いられる酸は、特に制限はなく、どのような種の酸でも用いうるが、反応性の観点で、塩酸、硫酸、硝酸、酢酸が好ましい。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。なお、取り扱いやすさの観点で、塩酸が好ましい。
【０１７２】
還元工程に用いられうる酸の量にも、特に制限はないが、前記単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩の量に対して、副生成物を抑える観点で、１〜３０倍モルが好ましく、５〜１５倍モルが特に好ましく、７〜９倍モルがさらに好ましい。
【０１７３】
（溶媒）
化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩の製造のために、前記単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩と、亜鉛と、を用い、上記の通り、還元反応は、酸の存在下で行うとよいが、必要に応じ反応溶媒を用いるとよい。
【０１７４】
反応溶媒としては、特に制限はなく、上記ニトロソ化工程で説明した具体例が、同様に妥当である。
【０１７５】
これら具体例のうち、化学式２で示される化合物の安定性の観点で、アルコール単独が好ましく、中でもメタノール単独が特に好ましい。
【０１７６】
還元工程における溶媒の量は、前記単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩１ｇに対して、反応性の観点で、２０〜１００ｍＬが好ましく、３０〜７０ｍＬがより好ましく、３０〜５０ｍＬがさらに好ましい。
【０１７７】
また、前記単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩と、亜鉛と酸とを混合させる方法にも特に制限はないが、反応性の観点で、亜鉛粉末と、酸の溶液とを、攪拌下で、単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩を溶媒に含有した溶液（本明細書中、「単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩の溶液」とも称する）に添加する方法が好ましい。
【０１７８】
より具体的には、単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩を、予め溶媒（この溶媒は、上記の通り、メタノールが特に好ましい。また、この際、この溶媒を、安定性の観点で、好ましくは−２０〜１０℃、より好ましくは−１０〜５℃に冷却しておくとよい。）に含有させておき、攪拌しながら、酸を添加し、さらに添加すべき亜鉛を一度に添加することが好ましい。「一度に添加する」理由は、ニトロソ体が不安定なため、早く反応を終了させるためである。この際、酸と亜鉛の添加順序にも特に制限はないが、ニトロソ体の安定性の観点で、好ましくは、亜鉛を先に添加する。
【０１７９】
また、添加は、磁気攪拌子等で、攪拌しながら行うことが、好ましい。
【０１８０】
また、亜鉛、酸の溶液を添加した後、副生成物を抑える観点で、好ましくは、上述の磁気攪拌子等で、好ましくは５〜２０分程度、より好ましくは５〜１０分程度、攪拌するとよい。また、攪拌速度にも特に制限はないが、好ましくは１００〜１２００ｒｐｍ、より好ましくは３００〜７００ｒｐｍである。
【０１８１】
（反応温度）
還元工程において設定される反応温度としては、−２０〜３５℃が好ましく、−１５〜２５℃が特に好ましい。かような温度条件にするためには、従来公知の知見を適宜参照して制御することができ、例えば、水浴や氷浴、ドライアイス−メタノール浴等を用いればよい。
【０１８２】
（反応容器）
還元工程に用いられる反応容器の素材としても、特に制限はなく、前記ニトロソ化工程で説明した具体例が同様に妥当である。
【０１８３】
また、反応容器の形状としても、特に制限はなく、前記ニトロソ化工程で説明した具体例が同様に妥当である。
【０１８４】
かような還元工程を経ることにより、前記化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩を製造することができる。
【０１８５】
［亜鉛除去工程］
上記還元工程終了後、亜鉛を除去することが好ましい。
【０１８６】
上記還元工程終了後、亜鉛は、固体状および／または水溶性の亜鉛の形態で残留しうる。
【０１８７】
固体状で残留している亜鉛は、濾過によって除去することが好ましく、さらに反応溶液中に残留する水溶性の亜鉛の除去を行なうとよい（亜鉛除去工程）。かような亜鉛除去工程を経ることにより、より高純度かつ高収率で、化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩を得ることができる。
【０１８８】
このような水溶性の亜鉛を除去する方法も特に制限されないが、例えば、以下の方法が挙げられる。
【０１８９】
すなわち、還元工程終了後の反応混合物を、濾過し、固体状で残留している亜鉛を除去した後、水を添加して洗浄を行う。その後、濾液と洗液をあわせ、濃縮する。そして、もとの化学式２で示される化合物の重量に対し、好ましくは５〜１０００質量部、より好ましくは１０〜１００質量部、さらに好ましくは１０〜５０質量部となる水を添加して、濃縮物の水溶液を準備する。そして、該濃縮物の水溶液に、アルカリ性物質を添加することにより、水酸化亜鉛の形で残留亜鉛を析出させて、濾過によって除去することができる。
【０１９０】
かようにすることで、亜鉛除去工程を経た反応混合物を得ることができる。
【０１９１】
（アルカリ性物質）
水酸化亜鉛を生成させるアルカリ性物質としては、特に制限はないが、水酸化塩が好ましく、より具体的には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムなどが挙げられる。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。なお、中でも水酸化ナトリウムが特に好ましい。
【０１９２】
水酸化亜鉛を生成させるためのアルカリ性物質は、水溶液の形態（アルカリ性物質水溶液）で添加することができる。添加するアルカリ性物質水溶液の濃度は、残留する亜鉛濃度の観点から、１〜１０規定濃度が好ましく、３〜５規定濃度がさらに好ましい。
【０１９３】
なお、添加するアルカリ性物質の量は、残留亜鉛の除去と、化学式３で示される化合物の安定性の観点から、アルカリ性物質を添加した後、ｐＨが、８．０〜１０．０になるよう設定するのが好ましく、８．５〜９．５になるよう設定するのが特に好ましい。
【０１９４】
［抽出精製工程］
上記亜鉛除去工程を経た後、亜鉛除去工程を経て得られた反応混合物から、さらに残留する無機塩を除くため、抽出精製工程を経ることが好ましい。かような抽出精製工程を経ることにより、より高純度かつ高収率で、化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩を得ることができる。
【０１９５】
抽出精製工程は、亜鉛除去工程を経て得られた反応混合物を固体状態とし、溶媒で抽出する方法が用いられうる。抽出精製工程における抽出方法は、反応混合物を粉末状態として溶媒を加えて攪拌する他、一般に用いられる抽出装置を使用して行なってもよい。
【０１９６】
亜鉛除去工程を経て得られた反応混合物を固体状態にする方法にも特に制限はないが、例えば、減圧乾燥方法等により蒸発乾固する方法が挙げられる。
【０１９７】
この際の減圧乾燥方法や条件としても、特に制限ないが、真空ライン（好ましくは０〜３０ｍｍＨｇ、より好ましくは１〜２ｍｍＨｇ）に接続して行うことができる。
【０１９８】
抽出精製工程における溶媒としては、最終目的物（化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩）を溶解できるものであれば特に制限されないが、アルコールが好ましく、より具体的には、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノールなどが好適に使用できる。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。なお、抽出効率の観点で、エタノールが特に好ましい。
【０１９９】
また、本発明の製造方法により得られる化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩は、両性でありうるため、単離をすること自体も困難である。しかしながら、上記の通り、ニトロソ化物の単離（不純物除去）、残留亜鉛の除去、エタノールによる無機塩（ＮａＣｌ）の分離などの工夫を行うため、容易に単離を行うことができる。
【０２００】
本発明の製造方法によると、従来法では５０％程度であった純度が、少なくとも８０％以上、実際には９５％以上に向上する。
【０２０１】
この点においても、本発明は非常に優れていると言える。
【０２０２】
なお、目的物の純度は以下の方法で調べることができる。
【０２０３】
【表１】
【０２０４】
標品と同時に展開を行い、目視で反応進行度合いの確認に用いられる。
【０２０５】
【表２】
【０２０６】
全ピーク面積の和のうち目的物のピーク面積の％を計算し、純度とした。
【０２０７】
＜本発明の第二＞
本実施形態では、本発明の製造方法により製造された酸化発色化合物またはその塩、つまり、化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩（本明細書中、「本発明の酸化発色化合物／塩」とも称する）の特に好ましい用途・使用に関する実施形態を説明する。
【０２０８】
本発明の酸化発色化合物／塩は、血液や尿をはじめとする体液中の生体成分の測定法の一つである、酵素を用いた比色分析法に好適に使用される。特に２分子で機能する酸化型発色試薬のうちのカプラーとして用いられうる。すなわち、本発明の酸化発色化合物／塩は、例えば、前記背景技術の項で記載したトリンダー試薬と共に用いられ、被測定物質の酵素的酸化で生じる過酸化酸素をさらにＰＯＤ酸化して生成した活性酸素によって、２分子が酸化縮合することによって呈色する。
【０２０９】
すなわち、本発明の本発明の第二は、本発明の酸化発色化合物／塩と、トリンダー試薬と、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼと、ペルオキシダーゼと、を含む試薬組成物（本明細書中、「本発明の試薬組成物」とも称する）である。
【０２１０】
つまり、本発明の酸化発色化合物／塩は、カプラーとして使用することが特に好ましく、それ以外については従来公知の知見が適宜参照され、特に限定されるものではない。
【０２１１】
（トリンダー試薬）
トリンダー試薬としては、特に制限はなく、従来公知の化合物がいずれも好ましく用いられうる。ただ、中でも中でもＮ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−３−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ−サクシニルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ビス−（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−サクシニルアミノエチル）−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリンが好ましく、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリンが、発色強度や波長といった観点で、特に好ましい。
【０２１２】
（測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼ）
「測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼ」としては、例えば、測定対象物がグルコースである場合、該オキシダーゼはグルコースオキシダーゼであり、測定対象物がコレステロールである場合、該オキシダーゼはコレステロールオキシダーゼであり、測定対象物が尿酸である場合、該オキシダーゼはウリカーゼであり、測定対象物がピルビン酸である場合、該オキシダーゼはピルベートオキシダーゼである。これらは測定対象物の基質のみを特異的に酸化するために、色々な成分を含む検体からそれぞれの測定対象物のみを限定して定量することができる。
【０２１３】
本発明に係る試薬組成物において、本発明の酸化発色化合物／塩とトリンダー試薬とのモル比は、１：１〜２：１であることが好ましく、１．３：１がより好ましい。本発明の酸化発色化合物／塩とトリンダー試薬とのモル比が１：１未満である場合、また、本発明の酸化発色化合物／塩とトリンダー試薬とのモル比が２：１を超える場合、発色不良を生じることがある。
【０２１４】
本発明に係る試薬組成物中の、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼの含有量は、カプラー１５ｍｍｏｌに対して、４３３ｋ〜２６００ｋＵであることが好ましく、８６６ｋ〜２６００ｋＵであることがより好ましい。測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼの含有量が、カプラー１５ｍｍｏｌに対して４３３ｋＵ未満である場合、発色不良を生じることがある。なお、本発明において、前記測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼの含有量は、４ＡＡ−ＴＯＯＳ法により測定したユニット数を採用するものとする。
【０２１５】
本発明に係る試薬組成物中のペルオキシダーゼの含有量は、カプラー１５ｍｍｏｌに対して１６６．５ｋ〜１６６６ｋＵであることが好ましく、３３３ｋ〜９９９ｋＵであることがより好ましい。ペルオキシダーゼの含有量が、カプラー１５ｍｍｏｌに対して１６６．５ｋＵ未満である場合、発色不良を生じることがある。なお、本発明において、前記ペルオキシダーゼの含有量は、ピロガロール法により測定したユニット数を採用するものとする。
【０２１６】
本発明に係る試薬組成物は、本発明の酸化発色化合物／塩と、トリンダー試薬と、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼと、ペルオキシダーゼと、を含む。すなわち、「本発明の酸化発色化合物／塩と、トリンダー試薬と、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼと、ペルオキシダーゼ」以外の他の成分を、試薬組成物としての機能を害さない程度含んでいてもよい。該成分としては、例えば、ｐＨ緩衝剤、浸透圧調整剤、界面活性剤、可溶化剤、安定化剤、保護剤等が挙げられる。
【０２１７】
なお、これら他の成分の含有量は、試薬組成物としての機能を害さなければ特に制限されないが、本発明の酸化発色化合物／塩と、トリンダー試薬と、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼと、ペルオキシダーゼとの総質量に対して、好ましくは１０〜３０質量％、より好ましくは１３〜２０質量％含まれてもよい。
【０２１８】
本発明に係る酸化発色化合物／塩は、血液や尿をはじめとする体液中の生体成分の測定法の一種である、酵素を用いた比色分析法に好適に使用されるカプラーとして用いられうる。すなわち、本発明に係る酸化発色化合物／塩は、前記トリンダー試薬と共に用いられ、測定対象物の酵素的酸化で生じる過酸化酸素を、さらにペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）酸化して生成した活性酸素によって、本発明に係る酸化発色化合物／塩を含むカプラーと、トリンダー試薬と、が酸化縮合することによって呈色する。そのため本発明の酸化発色化合物／塩は、上記の通り、その化合物自体に特徴を有するものであるが、カプラーとして使用することが特に好ましい。
【０２１９】
上述の通り、本発明の酸化発色化合物／塩は水溶性が高いため、それを含む試薬組成物（本明細書中、「本発明に係る試薬組成物」とも称する）や、該試薬組成物を担体に保持して試験具として使用する場合には、血液などの検体にすばやく溶解して均一化し、迅速に呈色反応が起こる点、非常に優れたものである。また、本発明に係る試薬組成物を用いた呈色反応（比色分析法）において、それによって生じた色素化合物についても、検体への溶解性や親和性が高く、担体内での展開性が良くなるので、担体表面での発色が鮮やかで均一性の高いものとなり、感度が高く安定した測定が可能となる。さらには、本発明に係る酸化発色化合物／塩は、溶解性が高いので、従来の試薬より高濃度の試薬組成物液（試薬液）が調製可能である。すると、該試薬組成物を担体に担持して、試験具として使用する場合、塗布液濃度を高くしてより多くの試薬を担体に保持させることが可能となる。加えて、本発明の酸化発色化合物／塩は親水性が向上し分子量が高くなっている為、保管中の昇華による試薬組成物の損失を抑えることができる。
【０２２０】
また、本発明に係る酸化発色化合物／塩は、試薬濃度の変化における呈色強度への影響が少ない為に、化合物が経時的に劣化減少した場合でも測定値への影響が少ない。さらに、本発明に係る試薬組成物に含まれる本発明の酸化発色化合物／塩の親水性官能基は、担体への吸着性を高め、試験具として使用した場合でも、担体内での化合物の安定性を向上させる。このように本発明に係る試薬組成物を提供することにより、ひいては、経時劣化を低減させ有効期間が延びた試験具を提供することが可能となる。
【０２２１】
＜本発明の第三＞
上記本発明の第二の通り、本発明の酸化発色化合物／塩は、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼと、トリンダー試薬と、を組み合わせて、本発明に係る試薬組成物となる。
【０２２２】
本発明の酸化発色化合物／塩は、前記トリンダー試薬と、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼと、ペルオキシダーゼと、組み合わせて、液体、粉末、錠剤、もしくは担体に保持した状態で分析用組成物として用いられうる。
【０２２３】
これら分析用組成物には、上記に加えて、ｐＨ緩衝剤、浸透圧調整剤、界面活性剤、可溶化剤、安定化剤、保護剤等の成分を含んでいてもよい。
【０２２４】
なお、これら成分の含有量は、試薬組成物としての機能を害さなければ特に制限されないが、本発明に係る酸化発色化合物またはこれらの塩と、トリンダー試薬と、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼと、ペルオキシダーゼとの総重量に対して、好ましくは１０〜３０質量％、より好ましくは１３〜２０質量％含まれてもよい。
【０２２５】
また、液体に保持して用いる場合には、検体と混合して反応させた後、色の変化を目視で判定する他、分光光度計で透過吸光度を測定してもよい。また、本発明に係る試薬組成物は、担体に保持した状態で試験具として用いてもよい。
【０２２６】
このように、本発明に係る試薬組成物は、種々の物に保持して用いることができるが、本発明に係る試薬組成物は、担体に保持した状態で試験具として用いることが好ましい。
【０２２７】
よって、本発明の第三は、本発明に係る試薬組成物が、担体に保持されてなる試験具である。
【０２２８】
かようなドライケミストリーで用いられる試験用具のように、担体に保持した状態で用いる場合には、これらの試薬組成物を含む層の他、これの機能を害さない範囲において、計量層、展開層、濾過層、保持層等を含んでいてもよい。このように担体に保持して用いる場合には、検体を付与した後、色の変化を目視で判定する他、分光光度計で反射吸光度を測定してもよい。測定値は予め作製した検量線を用いて測定対象物の量に換算することができる。
【０２２９】
（担体）
本発明に係る担体の素材としては、紙、布帛、高分子膜等の多孔質物質を用いることができるが、特に、発色性能といった点で、高分子膜が好ましい。
【０２３０】
上記高分子膜とは、高分子よりなる水不溶性の多孔質体である。高分子としては、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、セルロース、セルロースアセテート、硝酸セルロース、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、芳香族ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリ塩化ビニル、ポリビニルアルコールが挙げられる。これらの高分子は一般的に知られている製膜方法を用いて膜を形成することができる。これらの高分子膜の中でもポリスルホンまたはポリエーテルスルホンが、発色性能といった点で、特に好ましい。
【０２３１】
（担体に保持する方法）
本発明に係る試薬組成物を担体に保持する方法にも特に制限はないが、担体に適当な溶剤に溶解させた試薬組成物溶液を担体にコーティングする他、試薬組成物を含むマトリックス前駆体を成型して試験層を形成させる等の公知の方法が用いられうる。
【０２３２】
コーティングは、工業用に使用される一般的なコート法を用いることができるが、担体が多孔質の場合には、しばしば塗工直後の液移動や不均一な乾燥に起因するコートむらが問題となる。担体と塗工液の物性や、塗工乾燥の方法、機器、条件がこれらを支配する重要因子となりうる。このため、精密印刷法が有効な場合もある。
【０２３３】
塗工後の液移動や不均一な乾燥を低減する為には、少量の液を正確に計量して塗工するような精密印刷技術が適するが、この方法では高い試薬濃度の塗工液を作製できることが必須となる。
【０２３４】
例えば、４−アミノアンチピリン等の既存のカプラーは、測定に用いる種々の試薬の中でも最も溶解性が低く、これが高い濃度の塗工液を作製するときの問題点となっていた。しかしながら、本発明の化合物は溶解性が高く、濃度の高い塗工液を作製するに好都合である。
【０２３５】
試薬を担体に保持させた試験具では、検体付与後、検体の液体成分によってまず試薬が溶解し、混合して反応が起こり、色素化合物が生成し、通常試験具の検体付与面の反対側にある読み取り面に移動し、その色調変化を測定する、というステップを経て定量が行なわれる。このため、試薬の溶解性が高いことは、検体による均一な溶解、均一化、迅速な反応に有利であるだけではなく、生成する色素も溶解性に優れるために読み取り面への移動がスムースかつ均一性が高いというメリットもある。これらの特徴は、測定時間の短縮化、測定精度の向上、測定値ばらつきの低減に寄与する。したがって、本発明の酸化発色化合物／塩は高い溶解性を有するため、測定時間の短縮化、測定精度の向上、測定値ばらつきの低減に寄与できることが期待される。
【０２３６】
例えば、従来公知のカプラーである４−アミノアンチピリンを担体に保持させた試験具として使用した場合、経時的に劣化減少し測定値が上昇するという問題が生じる。減少による測定値上昇の原因としては、酵素反応や呈色反応の阻害ではなく化合物の濃度が高いほど他の試薬類の溶解や移動、また生成色素の流動性に何らかの障害を与えるのではないかと考えられている。しかしながら、本発明の化合物は４−アミノアンチピリンと比較して量が増減しても測定値への影響が少なく、４−アミノアンチピリンでみられた問題を改善できた。
４−アミノアンチピリン等の既存のカプラーは、ある担体に保持させた試験具として使用した場合、濃度変化が測定値に影響するという問題点がある。バルク担体にコートする際むらが生じた場合には、それを切り抜いて用いる各試験具間に感度差が生じる、あるいは保存中に劣化分解して量が変化した場合測定値に影響が出るということを示唆している。原因は、酵素反応や呈色反応の阻害ではなく、化合物の濃度が高いほど他の試薬類の溶解や移動、また生成色素の流動性に何らかの障害を与えるのではないかと考えられている。これに対して、本発明の酸化発色化合物／塩は４−アミノアンチピリンと比較して濃度の測定値への影響が少なく、これらの問題を改善できる。
【０２３７】
本発明の製造方法により得られる化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩は、トリンダー試薬と組み合わせて酸化発色させた場合には、４−アミノアンチピリン等の既存のカプラーを用いた場合と比較して吸光度が大きくなり、測定感度が向上することができる。例えば、本発明の４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン、４−アミノ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン等は、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）やＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）と組み合わせて発色させた場合、その検量線の傾きは改善され、測定感度が向上されうる。
【０２３８】
上述の通り、本発明の製造方法により得られる化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩は水溶性が高いため、それを含む試薬組成物を担体に保持しなる試験具（以下、単に、「本発明に係る試験具」とも称する）を使用する場合、本発明に係る試薬組成物は、血液などの検体にすばやく溶解して均一化し、迅速に呈色反応が起こるため、本発明に係る試験具は、非常に優れたものとして使用されうる。
【０２３９】
また、本発明に係る試験具を用いた場合、本発明に係る試薬組成物の呈色反応において生じた色素化合物についても、検体への溶解性や親和性が高く、担体内での展開性が良くなるので、担体表面での発色が鮮やかで均一性の高いものとなる。
【０２４０】
本願発明の製造方法により製造された化合物は、溶解性が有意に高いので、従来の試薬より高濃度の試薬液が調製可能である。また、担体に担持して使用する場合塗布液濃度を高くしてより多くの試薬を担体に保持させることが可能となる。さらには、塗布液の濃度を高く設定し全体液量を少なくできることで、塗工均一性の高い、グラビア印刷法、ドット印刷法、インクジェット印刷等の精密印刷法が使用できる。塗工液量が少なくなれば、乾燥時間が短縮され乾燥むらを低減させる効果もある。以上、十分な試薬を高い均一性で塗工できることにより、塗りむらなどに起因するばらつきを低減させることができ、高い精度の試験具を提供することができる。すなわち、本発明に係る試験具を用いると、感度が高く安定した測定が可能となる。さらには、本発明の酸化発色化合物／塩は、溶解性が高いので、従来の試薬より高濃度の試薬組成物液（試薬液）が調製可能である。すると、該試薬組成物を担体に担持して、試験具として使用する場合、塗布液濃度を高くしてより多くの試薬を担体に保持させることが可能となる。
【０２４１】
加えて、本発明の製造方法により得られる化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩は、親水性が向上し分子量が高くなっている為、保管中の昇華による試薬組成物の損失を抑えることができる。
【０２４２】
また、本発明の酸化発色化合物／塩は、試薬濃度の変化における呈色強度への影響が少ない為に、化合物が経時的に劣化減少した場合でも測定値への影響が少ない。さらに、本発明に係る試薬組成物に含まれる本発明の酸化発色化合物／塩の親水性官能基は、担体への吸着性を高める。すなわち、本発明に係る試験具は、担体内での化合物の安定性を向上されている。
【０２４３】
このように本発明に係る試験具は、従来に比べ、経時劣化を低減させ有効期間が有意に延びたものといえる。
【実施例】
【０２４４】
次に実施例によって本発明を説明する。本発明の化合物は以下の実施例の製法で合成される。
【０２４５】
＜実施例１＞
１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
２００ｇの１−（４−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロンを１Ｌナスフラスコに入れ、８９ｍＬの硫酸ジメチルを滴下ロートから均一にかかるように室温下にて滴下した。硫酸ジメチルの滴下後、ナスフラスコ上部に塩化カルシウム管を接続した玉入冷却器を取り付けた。次いで、温度コントローラーのセンサー部分をマントルヒーター上に置き、ナスフラスコを装着した。設定温度を２３０℃にして加熱を開始した。１−（４−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロンの粉末が完全に融解し内部が茶色透明の均一状態になるまで、約２時間加熱した。ナスフラスコを室温まで放冷後、氷冷下、水酸化ナトリウム水溶液（水酸化ナトリウム：１１３ｇ＋純水：５００ ｍＬ）を徐々に添加した後、発熱、発煙が収まってから、７０〜８０℃の水浴上でガラス棒にて攪拌しながら反応混合物の固形物を溶解した。さらに、溶解後、ｐＨ試験紙で内容液が強アルカリ性（ｐＨ１１以上）であることを確認した。
【０２４６】
次いで、上記反応混合物の固形物をアルカリ水溶液で溶解した反応物をサンプリングし、ＴＬＣでチェックを行なった。ナスフラスコ内容液中の黒色不溶物を吸引濾過し濾別した。氷冷下、得られた濾液に１２０ ｍＬの塩酸を攪拌しながら添加し、ｐＨ試験紙で内容液が強酸性（ｐＨ１以下）であることを確認した。氷冷下、沈殿が生成するまで攪拌を続けた。生成した沈殿を吸引濾過し、ロート上で、純水５００ｍＬ、アセトン５００ｍＬにて順次洗浄した。真空ラインに接続して、減圧乾燥を行ない、粗生成物１７４ｇを得た。粗生成物を２０００ｍＬナスフラスコに入れ、純水から再結晶して、純水、アセトンにて洗浄後、減圧乾燥して目的物１１９ｇを得た（収率：５６％）。純度９５％以上（ＨＰＬＣ）。
【０２４７】
【表３】
【０２４８】
＜実施例２＞
１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成（高圧法）
６．７５ｇの１−（４−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロン（アルドリッチ社製 １３４１６３）、２５０ｍＬの脱水メタノール（ナカライテスク社製 ０４１００−２５）、４．２ｍＬのヨウ化メチル（関東化学社製 Ｉ００６０）を、高圧反応装置〈耐圧硝子社製ＴＰＲ−１型）シリンダー容器内に入れ、１３０℃で１８時間加熱攪拌した。反応後、反応混合液を３００ｍＬのナスフラスコに注ぎロータリーエバポレーターにて４０±３℃の水浴上で乾固するまで減圧濃縮を行なった。真空ラインに接続して室温にて３０分間減圧乾燥を行なった。乾燥後、純水１５ｍＬを加え１００〜１１０℃のオイルバス中で攪拌しながら内容物を完全に溶解させた。すり潰した塩化ナトリウム５．５３ｇを加え、オイルバス上で完全に溶解させた。ナスフラスコをオイルバスから取り出し、室温で１時間攪拌した。茶色の沈殿が生成することを確認し、冷蔵庫に入れ、１５時間以上放置した後、生成した沈殿を吸引濾過し、純水、アセトンで洗浄し、減圧乾燥して粗生成物を得た。粗生成物を純水から再結晶して、純水、アセトンにて洗浄後、減圧乾燥して目的物１．５ｇを得た（収率：２１％）。所要時間３日、純度９５％以上（ＨＰＬＣ）。
【０２４９】
【表４】
【０２５０】
＜実施例３＞
４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
（１）「ニトロソ化工程」
４−ニトロソ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
実施例１または２で合成した１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン３０．０ｇ（０．１１１ｍｏｌ）を乳鉢で細かくすりつぶし、５００ｍＬ三つ口フラスコに秤量し、磁気攪拌子を入れた。三つ口フラスコを磁気スターラー上に置いた氷浴（０〜３℃）中に浸し、氷冷した純水１１１ｍＬを加え、１０分程度攪拌した。
【０２５１】
攪拌下、２〜３℃に冷却した亜硝酸ナトリウム水溶液３１ｍＬ（亜硝酸ナトリウム１３．８ｇ／純水５０ｍＬ）（０．１２４ｍｏｌ）と、２〜３℃に冷却した４Ｎ塩酸３１ｍＬ（０．１２４ｍｏｌ）と、を同時に、５分かけて滴下ロートから滴下した。滴下後、磁気スターラーで３分間激しく攪拌した。生成した沈殿を吸引濾過した。フィルターケーキ上に、２〜３℃に冷却した脱水メタノール約１５０ｍＬをまんべんなくかけて洗浄し、真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して、室温にて、減圧乾燥した。
【０２５２】
その後、目的物（４−ニトロソ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成）２５ｇを得た。
【０２５３】
なお、１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンに対する収率は、７５％であった。
【０２５４】
（２）「還元工程」
４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
上記（１）で得られた４−ニトロソ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン４．０ｇ（０．０１３４ｍｏｌ）を、５００ｍＬナスフラスコに秤量した。ナスフラスコに、磁気攪拌子を入れ、磁気スターラー上に置いた氷浴中に浸しクランプで固定した。
【０２５５】
それに、２〜３℃に冷却したメタノール１５６ｍＬを入れ、３秒間攪拌して分散させた。亜鉛粉末６．６ｇ（０．１００ｍｏｌ）、２〜３℃に冷却した２Ｎ塩酸５４ｍＬ（０．１０８ｍｏｌ）を加えて、５分間攪拌を続けた。反応後、ナスフラスコ中の内容物を吸引濾過して亜鉛残渣を濾別した。亜鉛残渣を、純水を用いてロート上で洗浄して、濾液と洗液をあわせ、ナスフラスコに入れた。ロータリーエバポレーターにて減圧濃縮を行ない、溶媒を留去した。１３０ｍＬの純水を加えて濃縮物を懸濁させ、ビーカーに移して磁気攪拌子を入れ、磁気スターラー上に置いた氷浴中に浸し攪拌を行った。濃縮物のｐＨをｐＨメーターでモニターしながら、ｐＨが９．０±０．５になるまで、攪拌下、４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液をピペットで滴下した。
【０２５６】
生成した水酸化亜鉛の沈殿物を吸引濾過して水酸化亜鉛残渣を濾別した。水酸化亜鉛残渣を、純水を用いてロート上で洗浄して濾液と洗液をあわせ、ナスフラスコに入れた。ロータリーエバポレーターにて減圧濃縮を行ない、溶媒を留去して、真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して、室温にて減圧乾燥した。ナスフラスコ中の生成物にエタノール８００ｍＬを加え、磁気攪拌子を入れ磁気スターラーにて目的物を攪拌抽出した。ナスフラスコ内容物を吸引濾過して塩化ナトリウム残渣を濾別した。塩化ナトリウム残渣を、エタノールを用いてロート上で洗浄して濾液と洗液をあわせ、ナスフラスコに入れた。ロータリーエバポレーターにて減圧濃縮を行ない、溶媒を留去して、真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して、室温にて減圧乾燥した。目的物：３．７ｇを得た。
【０２５７】
なお、４−ニトロソ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン対する収率は、９０％であった。
【０２５８】
２工程（「ニトロソ化工程」および「還元工程」の２工程）の収率は６８％（（１）×（２））であり、純度は、９７％以上（ＨＰＬＣ）であった。
【０２５９】
【表５】
【０２６０】
＜比較例１＞
４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
実施例１または２で得られた１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン ０．５ｇを０．４Ｎ塩酸１０ｍＬに溶解し、氷冷下４０％亜硝酸ナトリウム水溶液０．３５ｍＬを加えて１分間攪拌し、亜鉛末５００ｍｇを加え、さらに室温で１０分攪拌した。反応混合物をろ過後、濾液を濃縮乾固し、目的物０．４１ｇを得た。収率は３６％、純度は５０％（ＨＰＬＣ測定により）であった。
【０２６１】
【表６】
【０２６２】
＜実施例４＞
１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
２００ｇの１−（３−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロンを１０００ｍＬナスフラスコに入れ、８９ｍＬの硫酸ジメチルを滴下ロートから均一にかかるように室温下にて滴下した後、ナスフラスコ上部に塩化カルシウム管を接続した玉入冷却器を取り付けた。温度コントローラーのセンサー部分をマントルヒーター上に置き、ナスフラスコを装着した。設定温度を２３０℃にして加熱を開始した。１−（３−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロンの粉末が完全に融解し内部が茶色透明の均一状態になるまで、約２時間加熱した。ナスフラスコを室温まで放冷後、氷冷下、水酸化ナトリウム水溶液（水酸化ナトリウム：１１３ｇ＋純水：５００ ｍＬ）を徐々に添加した後、発熱、発煙が収まってから、７０〜８０℃の水浴上でガラス棒にて攪拌しながら固形物を溶解した。溶解後、ｐＨ試験紙で内容液が強アルカリ性（ｐＨ１１以上）であることを確認した。
【０２６３】
反応物をサンプリングし、ＴＬＣでチェックを行なった。ナスフラスコ内容液中の黒色不溶物を吸引濾過を行ない濾別した。氷冷下、得られた濾液に１２０ ｍＬの塩酸を攪拌しながら添加し、ｐＨ試験紙で内容液が強酸性（ｐＨ１以下）であることを確認した。氷冷下、沈殿が生成するまで攪拌を続けた。生成した沈殿を吸引濾過し、ロート上で、純水５００ｍＬ、アセトン５００ｍＬにて順次洗浄した。真空ラインに接続して、減圧乾燥を行ない、粗生成物１８０ｇを得た。粗生成物を２０００ｍＬナスフラスコに入れ、純水から再結晶して、純水、アセトンにて洗浄後、減圧乾燥して目的物１２５ｇを得た（収率：６０％）。所要時間２日、純度９５％以上（ＨＰＬＣ測定により）。
【０２６４】
【表７】
【０２６５】
以上のことから、比較例に比べて本発明の製造方法で製造された実施例１または実施例４では、同規模の反応装置ではるかに仕込み量が大きく出来ることにより効率化された。また、所要時間は１日、収率は３８％程度向上している。
【０２６６】
＜実施例５＞
１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
６．７５ｇの１−（３−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロン（アルドリッチ社製 ５５６８９０）、２５０ｍＬの脱水メタノール（ナカライテスク社製 ０４１００−２５）、４．２ｍＬのヨウ化メチル（関東化学社製 Ｉ００６０）を、高圧反応装置〈耐圧硝子社製ＴＰＲ−１型）シリンダー容器内に入れ、１３０℃で１８時間加熱攪拌した。
【０２６７】
反応後、反応混合液を３００ｍＬのナスフラスコに注ぎロータリーエバポレーターにて４０±３℃の水浴上で、乾固するまで減圧濃縮を行なった。さらに、真空ラインに接続して、室温にて３０分間減圧乾燥を行なった。乾燥後、純水１５ｍＬを加え、１００〜１１０℃のオイルバス中で攪拌しながら内容物を完全に溶解させた。これに、すり潰した塩化ナトリウム５．５３ｇを加え、オイルバス上で完全に溶解させた。ナスフラスコをオイルバスから取り出し、室温で１時間攪拌した。ここで、茶色の沈殿が生成したことを確認し、冷蔵庫に入れ、１５時間以上（一昼夜）放置した。
【０２６８】
放置後、生成した沈殿を吸引濾過し、純水、アセトンで洗浄し、減圧乾燥して粗生成物を得た。粗生成物を純水から再結晶して、純水、アセトンにて洗浄後、減圧乾燥して目的物１．４ｇを得た（収率：２０％）。なお、純度は９５％以上（ＨＰＬＣ）であった。
【０２６９】
【表８】
【０２７０】
＜実施例６＞
４−アミノ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
（１）「ニトロソ化工程」
４−ニトロソ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
実施例４または５で合成した１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン３０．０ｇ（０．１１１ｍｏｌ）を、乳鉢で細かくすりつぶし、５００ｍＬ三つ口フラスコに秤量し、磁気攪拌子を入れた。三つ口フラスコを磁気スターラー上に置いた氷浴（０〜３℃）中に浸し、氷冷した純水１１０ｍＬを加え、１０分攪拌した。
【０２７１】
攪拌下、２〜３℃に冷却した亜硝酸ナトリウム水溶液３１ｍＬ（亜硝酸ナトリウム１３．８ｇ／純水５０ｍＬ）（０．１２４ｍｏｌ）と、２〜３℃に冷却した４Ｎ塩酸３１ｍＬ（０．１２４ｍｏｌ）と、を同時に、５分かけて滴下ロートから滴下する。滴下後、磁気スターラーで３分間激しく攪拌した。生成した沈殿を吸引濾過した。フィルターケーキ上に、２〜３℃に冷却した脱水メタノール約１５０ｍＬをまんべんなくかけて洗浄し、真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して、室温にて、減圧乾燥した。目的物２５ｇを得た。
【０２７２】
なお、１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン対しての収率は、７５％であった。
【０２７３】
（２）「還元工程」
４−アミノ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
上記（１）で得られた４−ニトロソ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン４．０ｇ（０．０１ｍｏｌ）を、５００ｍＬナスフラスコに秤量した。ナスフラスコに、磁気攪拌子を入れ、磁気スターラー上に置いた氷浴中に浸しクランプで固定した。
【０２７４】
それに、２〜３℃に冷却したメタノール１６０ｍＬを入れ、３秒間攪拌して分散させた。亜鉛粉末６．６ｇ（０．１ｍｏｌ）、２〜３℃に冷却した２Ｎ塩酸５４ｍＬ（０．１ｍｏｌ）を加えて、５分間攪拌を続ける。反応後、ナスフラスコ中の内容物を吸引濾過して亜鉛残渣を濾別した。亜鉛残渣を、純水を用いてロート上で洗浄して、濾液と洗液をあわせ、ナスフラスコに入れた。ロータリーエバポレーターにて減圧濃縮を行ない、溶媒を留去した。１３０ｍＬの純水を加えて濃縮物を懸濁させ、ビーカーに移して磁気攪拌子を入れ、磁気スターラー上に置いた氷浴中に浸し攪拌を行なった。濃縮物のｐＨをｐＨメーターでモニターしながら、ｐＨが９．０±０．５になるまで、攪拌下、４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液をピペットで滴下した。
【０２７５】
生成した水酸化亜鉛の沈殿物を吸引濾過して水酸化亜鉛残渣を濾別した。
【０２７６】
水酸化亜鉛残渣を、純水を用いてロート上で洗浄して濾液と洗液をあわせ、ナスフラスコに入れた。ロータリーエバポレーターにて減圧濃縮を行ない、溶媒を留去して、真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して、室温にて減圧乾燥した。
【０２７７】
ナスフラスコ中の生成物にエタノール８００ｍＬを加え、磁気攪拌子を入れ磁気スターラーにて目的物を攪拌抽出した。
【０２７８】
ナスフラスコ内容物を吸引濾過して塩化ナトリウム残渣を濾別した。
【０２７９】
塩化ナトリウム残渣を、エタノールを用いてロート上で洗浄して濾液と洗液をあわせ、ナスフラスコに入れた。ロータリーエバポレーターにて減圧濃縮を行ない、溶媒を留去して、真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して、室温にて減圧乾燥した。目的物：３．６ｇを得た（収率８７％）。
【０２８０】
２工程（「ニトロソ化工程」および「還元工程」の２工程）の収率は６５％であり、純度は、９７％以上（ＨＰＬＣ）であった。
【０２８１】
【表９】
【０２８２】
比較例に比べて本発明の製造方法で製造された実施例では、純度は４７％以上、収率は３２％および２９％向上している。また性状は、比較例で得られた化合物は吸湿性が高い粉末であり扱いにくいのに対し、実施例３および実施例６で得られた化合物は吸湿性が低い粉末で取扱いがしやすい。
【０２８３】
＜実施例７＞
試験片による性能評価
０．１３Ｍコハク酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝５．０）１００ｍＬ中に、実施例３で合成した４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン ０．４６ｇ 、 Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン ０．９５ｇ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ３．０ｇ、グルコースオキシダーゼ １５０Ｋ ｕｎｉｔ、ペルオキシダーゼ ２５０Ｋ ｕｎｉｔを溶解して塗工液を作成した。ポリエーテルスルホン膜（テルモ株式会社製、膜厚１３０μｍ）に塗工液を塗布し、３５℃で１８時間乾燥を行なった。膜を１ｃｍ角の正方形に打ち抜き、試験片を得た。試験片を反射分光光度計検出部に固定した後、１μＬの検体を試験膜上部より滴下し、１０秒後の反射吸光度を測定した。ヘマトクリット値４０、種々のグルコース濃度の血液で測定した値から検量線を作成し、定量感度を観察した。（図１）反射吸光度値はそれぞれの試験片に対して最高となる時間の値を用いた。図１中、ｘ軸に反射吸光度、ｙ軸に血糖値をとっているため、傾きがなだらかなほど感度が高いことを意味する。
図２から示されるように、本発明の製造方法により合成した中間体を用いて合成された４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンを用いた試験片の検量線の傾きは、従来から広く使用されている４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）を用いた場合より改善され、測定感度を有意に向上させることが示される。
【図面の簡単な説明】
【０２８４】
【図１】実施例３における、本発明の酸化発色化合物／塩および４−アミノアンチピリンの反射吸光度値の時間変化を表した図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化発色化合物の製造方法ならびに当該方法によって製造された化合物を用いた試薬組成物および試験具に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日、血液や尿をはじめとする体液中の生体成分の測定法の一種として、酵素を用いた比色分析法が広く用いられている。これらの方法は、測定キット、自動分析機、ドライケミストリー試験具等に組み込まれ、日常的な臨床検査に数多く用いられている（例えば、特許文献１を参照）。
【０００３】
このような測定法の一種として、被測定物質に特異的な酸化酵素を作用させて発生する過酸化水素をさらにペルオキシダーゼの作用で活性酸素とし、これで発色試薬を酸化して生成する色素を比色定量する方法がある。
【０００４】
ここで使用される酵素としては、例えばグルコースの測定ではグルコースオキシダーゼ、コレステロールの測定ではコレステロールオキシダーゼ、尿酸の測定にはウリカーゼ、ピルビン酸の測定にはピルベートオキシダーゼ等が用いられる。これらの酵素は検体中の基質のみを特異的に酸化するために、色々な成分を含む検体からそれぞれの測定対象物のみを限定して定量することができる。
【０００５】
また、発色試薬としては、活性酸素で酸化されることによって、その吸収波長特性や吸収強度等が変化する色素もしくは色素の前駆体（色原体）が用いられる。すなわち、活性酸素の量に応じて変化する色を測定することによって、被測定物質の量を定量することができる。これらの色素や色原体には、１分子だけで機能するものや、異なる２分子がカップリングして機能するものがある。
【０００６】
１分子で機能するものには、ロイコ型色素等が挙げられる。具体的な化合物としては、ベンチジン、ｏ−トリジン、ｏ−ジアニシジン、２，２’−アミノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリノン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）、ビス−（４−ジエチルアミノ）−２−スルホフェニルメタン（ＢＳＰＭ）、ビス［３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル］アミン（ＢＣＭＡ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢＺ）、ビス［４−（Ｎ−アルキル−Ｎ−スルホプロピル）−２，６−ジメチルフェニル］メタン（Ｂｉｓ−ＭＡＰＳ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４’，４’’’−トリアミノトリフェニルメタン（ＴＭＰ）などが挙げられる。
【０００７】
２分子で機能する代表的なものには、カプラーとトリンダー試薬を酸化的にカップリングさせたものが挙げられる（例えば、非特許文献１および２を参照）。
【０００８】
カプラーとしては、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）、アミノジフェニルアミンまたはその誘導体などが用いられる。
【０００９】
トリンダー試薬としては、フェノール誘導体、アニリン誘導体が用いられる。フェノール誘導体としては、フェノール、４−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、２，６−ジクロロフェノール、３，５−ジクロロフェノール、２，４−ジブロモフェノール、２，６，４−トリクロロフェノール、２，６，４−トリブロモフェノール、３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホン酸、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨードベンゾイル酸、などが挙げられる。アニリン誘導体としては、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−３−アセチルエチレンジアミン（ＥＭＡＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メチルアニリン（ＣＥＭＢ）、Ｎ，Ｎ−ビス−（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン（ＴＯＤＢ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−サクシニルアミノエチル）−３−メチルアニリン（ＥＳＥＴ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＳＤＡ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）などが挙げられる。
【００１０】
ここで、保存安定性に鑑みると、１分子で機能する色素より２分子で機能する色素の方が良い傾向にある。また、２分子で機能する色素のうち、カプラーとしては、前記のうち最も安定な４−アミノアンチピリン、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾンが多く用いられ、トリンダー試薬としては安定でかつ発色強度や波長の点でより有利なアニリン誘導体が多く用いられている。
【００１１】
このような現状の下、前記の発色原理を用いた製品の価値を上げるためには、測定精度をさらに向上させる、あるいは経時的劣化を低減させる必要があり、また、より微量な成分の検出には、現存のものよりさらに感度のよい検出系が必要となり、それらの目的において、より高性能の発色試薬の開発が望まれている。
【００１２】
このように、従来のカプラーに変わる新規な発色化合物の開発が進められており、例えば、特許文献２には、酵素を阻害しないとされるアミノアンチピリン誘導体が開示されている。
【００１３】
ところで、このようなアミノアンチピリン誘導体のようなアミノ化合物を得るためには、ニトロソ化を行い、さらに還元を行なう方法が一般的に知られており、アミノアンチピリンの製造過程においては、ニトロソ化した後還元し、アミノ化をする手法が開示されている（例えば、特許文献３参照）。なお、特許文献２においても、ニトロソ化、アミノ化を行い、所望の発色化合物を得ている。
【特許文献１】特開２００４−２２３１１５号公報
【特許文献２】特公平６−９９４０３号公報
【特許文献３】米国特許第１，８７７，１６６号明細書
【非特許文献１】Ｔｒｉｎｄｅｒ，Ｐ．，Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６，２４，１９６９
【非特許文献２】Ｂａｒｈａｍ，Ｄ．ａｎｄ Ｔｒｉｎｄｅｒ，Ｐ．，Ａｎａｌｙｓｔ（Ｌｏｎｄｏｎ），９７，１４２，１９７２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上記の通り、より高性能の発色試薬の開発が望まれている一方で、実際に工業化を念頭においた場合、その高性能の発色試薬を、高純度かつ高収率で製造する必要性が生じる。
【００１５】
しかしながら、前記したような技術においては、高純度かつ高収率で製造することができず、このような技術手段の開発が、現実問題として希求されている。
【００１６】
よって、本発明は、上記実情を鑑みてなされたものであり、従来に比して性能が向上した発色化合物を、高純度かつ高収率で製造するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、上記実情に鑑み、鋭意研究を行った。その過程でまず、前記のような技術によっても、従来に比して性能が向上した発色化合物を、高純度かつ高収率で製造することができない理由を、以下の通り詳細に探索した。
【００１８】
まず、所望の発色化合物を得るためには、ニトロソ化、アミノ化を経る必要があるが、高純度かつ高収率で所望の発色化合物を得ることができないのは、ニトロソ化により生じるニトロソ体が非常に不安定で、水溶液中では容易に分解して不純物を生じるのではないかと予測した。
【００１９】
さらには、本発明が提供する酸化発色化合物は、従来のアミノアンチピリンと比較して極めて水溶性が高いことも、従来の方法によっては、高純度かつ高収率で目的物を得ることができない一因ではないかと予測した。
【００２０】
その予測の下、鋭意研究を行った結果、本発明の製造方法によると、驚くべきことに、非常に高い純度および収率で、目的物を得ることができたのである。本発明は、このようにして完成した。
【００２１】
すなわち、本発明は、下記（１）〜（１１）で示される、高い性能を持つ新規酸化発色化合物の製造方法を提供する。
【００２２】
（１）下記化学式１：
【００２３】
【化１】
【００２４】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子またはスルホン酸基であり、この際Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の少なくとも一つがスルホン酸基である、
で示される化合物またはその塩を、亜硝酸塩を用いてニトロソ化する、ニトロソ化工程と；
前記ニトロソ化工程の後、
下記化学式２：
【００２５】
【化２】
【００２６】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である、
で示される化合物またはその塩を単離する、単離工程と；
前記単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩を、亜鉛を用いて還元する、還元工程と；
を含む、
下記化学式３：
【００２７】
【化３】
【００２８】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である、
で示される酸化発色化合物またはその塩の製造方法。
【００２９】
（２）前記ニトロソ化工程において、亜硝酸塩の量が、化学式１で示される化合物またはその塩に対して１．０〜１．５倍モルである、（１）に記載の製造方法。
【００３０】
（３）前記ニトロソ化工程におけるニトロソ化反応を、化学式１で示される化合物またはその塩に対して１．０〜１．５倍モルの酸を用いて行う、（１）または（２）に記載の製造方法。
【００３１】
（４）前記ニトロソ化工程において、酸またはその水溶液と、亜硝酸塩の水溶液と、を同時に化学式１で示される化合物またはその塩の水溶液に滴下して添加する、（３）に記載の製造方法。
【００３２】
（５）前記還元工程において、亜鉛の量が、前記単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩に対して１〜３０倍モルである、（１）〜（４）のいずれか１つに記載の製造方法。
【００３３】
（６）前記還元工程における還元反応を、前記単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩に対して１〜３０倍モルの酸をさらに用いて行う、（１）〜（５）のいずれか１つに記載の製造方法。
【００３４】
（７）前記還元工程を、反応溶媒を用いて行い、該反応溶媒が、アルコールである、（１）〜（６）のいずれか１つに記載の製造方法。
【００３５】
（８）前記還元工程を、反応溶媒を用いて行い、該反応溶媒の量が、前記単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩１ｇに対して２０〜１００ｍＬである、（１）〜（７）のいずれか１つに記載の製造方法。
【００３６】
（９）前記還元工程後、反応混合物中に残留する亜鉛を、水酸化亜鉛として除去する工程をさらに含む、（１）〜（８）のいずれか１つに記載の製造方法。
【００３７】
（１０）前記還元工程後、反応混合物からアルコールを用いて、化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩を抽出精製する、抽出精製工程をさらに含む、（１）〜（９）のいずれか１つに記載の製造方法。
【００３８】
（１１）（１）〜（１０）のいずれか１つに記載の製造方法で得られた、化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩。
【発明の効果】
【００３９】
本発明の製造方法においては、従来の方法と比較して、下記(ア)〜(ウ)で優れている。
【００４０】
（ア）純度の向上
従来法では、５０％程度であった純度が、本願発明の製造方法によると、９５％以上に向上しうる。
【００４１】
（イ）反応収率の向上
従来法では、３０％程度であった収率が、本願発明の製造方法によると、８０％以上の収率が得られうる。
【００４２】
（ウ）吸湿性の改善
従来法で得られるアミノアンチピリン誘導体は、そのアミノ基が、酸（塩酸、酢酸等）との塩を形成しており、非常に吸湿性が高かった。本願発明の製造方法によると、スルホン酸基がアルカリ塩となっているため、吸湿性が有意に低い。さらに、本願発明により製造される発色化合物は、その呈色性能において、下記（エ）〜（キ）の点でこれまでの試薬より優れている。特に担体に保持した試験具として使用する場合、その効果が最も顕著である。
【００４３】
（エ）測定時間の短縮
本願発明の製造方法により製造される発色化合物は、水溶性が有意に高いので、特に担体に保持して使用する場合には、血液などの検体にすばやく溶解して均一化し、迅速に呈色反応が起こる。
【００４４】
（オ）感度が高い
呈色反応によって生成した色素化合物は、検体への溶解性や親和性が有意に高く、担体内での展開性が良くなるので、担体表面での発色が鮮やかで均一性の高いものとなる。それによって感度が高く安定した測定が可能となる。
【００４５】
（カ）精度が高い
本願発明の製造方法により製造される発色化合物は、溶解性が有意に高いので、従来の試薬より高濃度の試薬液が調製可能である。また、担体に担持して使用する場合塗布液濃度を高くしてより多くの試薬を担体に保持させることが可能となる。さらには、塗布液の濃度を高く設定し全体液量を少なくできることで、塗工均一性の高い、グラビア印刷法、ドット印刷法、インクジェット印刷等の精密印刷法が使用できる。塗工液量が少なくなれば、乾燥時間が短縮され乾燥むらを低減させる効果もある。つまり、十分な試薬を高い均一性で塗工できることにより、塗りむらなどに起因するばらつきを低減させることができ、高い精度の試験具を提供することができる。
【００４６】
（キ）経時安定性に優れる
本願発明の製造方法により製造された発色化合物は、親水性が有意に向上して、分子量が有意に大きいため、保管中の昇華による試薬の損失を押さえることができる。また、本願発明の製造方法により製造された発色化合物は、試薬濃度の変化における呈色強度への影響が少ないため、発色化合物が経時的に劣化減少した場合でも測定値への影響が少ない。さらには、本発明の製造方法により製造される発色化合物における親水性官能基は、担体への吸着性を高め、担体内での化合物の安定性を向上させる。つまり、経時劣化を低減させ、有効期間を延ばすことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
以下に本発明をより具体的に説明する。
【００４８】
＜本発明の第一＞
本発明の第一は、
下記化学式１：
【００４９】
【化４】
【００５０】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子またはスルホン酸基であり、この際Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の少なくとも一つがスルホン酸基である、
で示される化合物またはその塩を、亜硝酸塩を用いてニトロソ化する、ニトロソ化工程と；
前記ニトロソ化工程の後、
下記化学式２：
【００５１】
【化５】
【００５２】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である、
で示される化合物またはその塩を単離する、単離工程と；
前記単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩を、亜鉛を用いて還元する、還元工程と；
を含む、
下記化学式３：
【００５３】
【化６】
【００５４】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である、
で示される酸化発色化合物またはその塩の製造方法である。
【００５５】
上記の通り、従来、所望の発色化合物を得ることができないのは、ニトロソ化により生じるニトロソ体が非常に不安定ではないかとの予測の下に鋭意研究を行った。
【００５６】
その結果、中間体であるニトロソ体（化学式２で示される化合物またはその塩）は不安定であり、それが、所望の発色化合物の収率減少や純度低下の一因となっていた。
【００５７】
さらに研究を進めていく過程で、本発明の製造方法により製造される発色化合物は、従来のアミノアンチピリンと比較して極めて水溶性が高いため、従来の方法によっては、高純度かつ高収率で所望の酸化発色化合物を得ることができないとの知見も見出した。
【００５８】
よって、ニトロソ化反応、還元反応の条件および精製法等に、様々な技術的工夫を行うことにより、従来法に比較して、より効率的に高純度の発色化合物を合成する方法を見出し、本発明を完成させたのである。
【００５９】
以下、本発明を詳説する。
【００６０】
［ニトロソ化工程］
ニトロソ化を行う対象化合物は、
下記化学式１：
【００６１】
【化７】
【００６２】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子またはスルホン酸基であり、この際Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の少なくとも一つがスルホン酸基である、で示される化合物またはその塩である。
【００６３】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のうち１つのみが、スルホン酸基である場合、好ましい部位は、呈色性の観点で、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４である。また、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のうちの２つがスルホン酸基である場合、好ましい部位は、呈色性の観点で、Ｒ２、Ｒ４である。
【００６４】
なお、スルホン酸基は、イオン性官能基であるが、これらの官能基は、遊離の状態であっても、または塩を形成していてもよい、すなわち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、スルホン酸基の塩であってもよい。
【００６５】
この際、これらの酸基と塩を形成する対イオンは、無機イオンでもよいし、有機イオンでもよい。例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン等の無機塩基由来の陽イオン；アンモニウムイオン；アルキルアミン類等の有機塩基由来の陽イオン；およびアミノ酸類等の両性化合物由来のイオンなどが挙げられる。なかでも、塩の形態である場合には、好ましくはナトリウム塩、カリウム塩、またはアンモニウム塩であり、より好ましくはナトリウム塩である。
【００６６】
なお、後述する化学式２〜化学式５における「Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５」は、いずれも、上記化学式１において行った「Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５」の定義と同様である。よって、下記ではその説明を割愛する。
【００６７】
なお、ここで、化学式１で示される化合物またはその塩を得る方法について下記に説明する。
【００６８】
本発明の化学式１で示される化合物またはその塩の製造方法は、特に制限されず、公知の製造方法が同様にしてあるいは適宜修飾してあるいは適宜組み合せて適用できる。以下、本発明の化学式１で示される化合物またはその塩の製造方法の好ましい実施形態を説明するが、本発明は下記好ましい実施形態に限定されるものではない。
【００６９】
すなわち、本発明の化学式１で示される化合物またはその塩の製造方法は、下記化学式４：
【００７０】
【化８】
【００７１】
で示される化合物［以下、「化合物４」とも称する］と、下記化学式５：
【００７２】
【化９】
【００７３】
で示される化合物［以下、「化合物５」とも称する］とを、反応させる工程［工程（Ａ）］を有することが好ましい。
【００７４】
化合物４と化合物５とを反応させる上記工程（Ａ）において、化合物４及び５の混合比は、特に制限されない。好ましくは、化合物４及び５をそれぞれ等モル混合する、あるいは化合物４を化合物５に対してやや多めに混合することが好ましい。後者の場合、化合物４は、化合物５を１モルに対して、０．８〜２モル、より好ましくは１〜１．２モル程度の割合で、混合することが好ましい。また、化合物４と化合物５との反応条件は、これらの反応が進行する条件であれば特に制限されないが、例えば、反応温度は、好ましくは２０〜２００℃、より好ましくは、８０〜１５０℃の温度であり、反応時間は、好ましくは０．５〜５時間、より好ましくは１〜１．５時間である。また、化合物４と化合物５との反応は、無溶媒下で行なってもよく、あるいは溶媒中で行なってもよい。後者の場合に使用できる溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール等の、アルコール類；ＴＨＦ、ジエチルエーテル、ジオキサン等の、エーテル類；ピリジン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の溶媒が挙げられる。これらのうち、ＴＨＦが好ましい。化合物４と化合物５との反応後は、反応混合物を適当な溶媒中に加えることによって生成物を固化させることによって、原料化合物と分離回収することができる。
【００７５】
次に、上記工程（Ａ）で得られた反応生成物を、メチル化する［工程（Ｂ）］ことによって、前記化学式１で示される化合物が得られる。
【００７６】
上記工程（Ｂ）において、メチル化は、ヨウ化メチルや硫酸ジメチルなどのメチル化剤を用いて行なうことができる。ここで、メチル化剤としては、上記のものに限定されず、他の公知のメチル化剤も同様にして使用できる。この反応は適当な溶媒や塩基を用いてもよく、室温あるいは加熱下で行なわれる。より具体的には、使用できる溶媒としては、上記工程（Ａ）で列挙したのと同様の溶媒が使用でき、これらのうち、メタノール、ＴＨＦが好ましい。また、塩基としては、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、４−（ジメチルアミノ）ピリジンなどが使用でき、これらのうち、ＴＥＡが好ましい。
【００７７】
上記工程（Ｂ）において、メチル化剤の使用量は、上記工程（Ａ）で得られた反応生成物を十分メチル化できる量であれば特に制限されないが、上記工程（Ａ）で得られた反応生成物１モルに対して、好ましくは０．５〜５モル、より好ましくは１〜２モルである。反応条件もまた特に制限されないが、上記工程（Ａ）で得られた反応生成物のメチル化反応を、好ましくは４０〜２００℃、より好ましくは１００〜１４０℃の温度で、好ましくは１〜２４時間、より好ましくは１０〜２０時間、行なう。
【００７８】
また、化学式１で示される化合物またはその塩を得る他の方法としては、上記工程（Ａ）で得られた反応生成物を、以下の通りメチル化する［工程（Ｃ）］ことによって行う方法が挙げられる。
【００７９】
すなわち、上記工程（Ａ）で得られた反応生成物と、硫酸ジメチルと、を混合し、無溶媒下で加熱反応させる工程を含む、下記化学式１で示される化合物またはその塩：
【００８０】
【化１０】
【００８１】
で示される化合物またはその塩の製造方法である。
【００８２】
工程（Ｃ）の製造方法のように、溶媒を用いずに（無溶媒で）合成できるメリットとしては、反応容量を少量化でき、反応容器容積あたりの仕込み可能量が大きいことがあげられる。すなわち、通常の反応より小型の反応装置でより多くの製造ができるので、大量合成に好都合である。また、塩基を用いずに合成することもできる。
【００８３】
硫酸ジメチルは、市販のものを使用しても合成して使用してもよく、特に制限されることはない。
【００８４】
上記工程（Ａ）で得られた反応生成物に対する前記硫酸ジメチルの量は、１．０〜２．０倍モルであることが好ましく、１．０〜１．５倍モルがより好ましく、１．０〜１．３倍モルが特に好ましい。上記工程（Ａ）で得られた反応生成物に対する硫酸ジメチルの添加量が、１．０倍モル未満だと、反応効率低下の虞れがあり、２．０倍モルを越えると副生成物の増大の虞れがある。
【００８５】
本発明に係る硫酸ジメチルの添加の方法としては、滴下ロート、ピペットなどを用いることができるが、外気中の水分による硫酸ジメチルの加水分解を防ぐために滴下ロートを用いて反応系を密閉して行なうのが好ましい。また、室温、１ａｔｍにおいて上記工程（Ａ）で得られた反応生成物と、硫酸ジメチルとを混合する際には、液体である硫酸ジメチルに完全に溶解させてもまたは溶解させなくてもよく、両者がどのような状態であろうが混合していればよい。
【００８６】
工程（Ｃ）に用いられる反応容器としては、ガラス、ステンレス、ホーロー、テフロン（登録商標）製のフラスコが好ましく、摺合せのガラス製フラスコが特に好ましい。
【００８７】
工程（Ｃ）に用いられる反応容器としては、なす型フラスコ、丸底フラスコ、平底フラスコ、三角フラスコ、セパラブルフラスコ、多口フラスコを用いることができるが、これらは、仕込み量や加熱効率を考慮して選択される。
【００８８】
工程（Ｃ）に用いられる冷却器としては、通常の合成反応に用いられる還流冷却器を用いることができ、リービッヒ冷却器、玉入冷却器（アーリン氏タイプ）、ジムロート冷却器、蛇管冷却器（グラハムタイプ）が好ましく、リービッヒ冷却器、玉入冷却器が特に好ましい。
【００８９】
また、工程（Ｃ）における加熱反応中、外気からの水分の混入を防ぐ為に、塩化カルシウム管、窒素バブラーを取り付けることが好ましい。
【００９０】
工程（Ｃ）における製造方法における加熱反応の加熱方法としては、マントルヒーター、油浴、砂浴（バーナー直火）が好ましく、マントルヒーターが特に好ましい。必要に応じて、センサー付き温度コントローラーを用いることができる。
【００９１】
工程（Ｃ）における加熱反応の温度としては、１９０〜２６０℃が好ましく、２００〜２５０℃が特に好ましく、２２０〜２４０℃がさらに好ましい。
【００９２】
上記加熱反応の温度が１９０℃未満だと、反応効率低下の虞れがあり、２６０℃超だと、副生成物の増大の虞れがある。
【００９３】
工程（Ｃ）における加熱反応の反応時間としては、０．５〜５時間が好ましく、０．５〜３時間が特に好ましく、１〜２時間がさらに好ましい。
【００９４】
上記加熱反応の反応時間が０．５時間未満だと、反応効率低下の虞れがあり、５時間超だと、副生成物の増大の虞れがある。
【００９５】
工程（Ｃ）において、上記工程（Ａ）で得られた反応生成物と、硫酸ジメチルとを混合し、無溶媒下で加熱反応させて得られた反応混合物をアルカリ水溶液に溶解させて反応混合溶液を得る工程と、前記反応混合溶液に酸を加えて固体を単離する工程とを含むことが好ましい。
【００９６】
本発明に係る化学式（１）で示される化合物は、溶媒抽出による回収が困難であるため酸を添加することで強制的に沈殿するいわゆる“酸沈”により回収することが好ましい。これにより、最終目的物を高い純度で得られることができる。
これにより、化学式１で示される化合物またはその塩を高い純度で得られることができる。
【００９７】
本発明に係る製造方法に用いられるアルカリ水溶液のアルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムが好ましく、水酸化ナトリウムが特に好ましい。
【００９８】
本発明に係る製造方法に用いられるアルカリ水溶液の濃度としては、１０〜３０ｗ／ｖ％（重量対体積％）が好ましく、１５〜２５ｗ／ｖ％が特に好ましく、２０〜２５ｗ／ｖ％がさらに好ましい。
【００９９】
また、上記反応混合物をアルカリ水溶液に溶解させて得られる反応混合溶液のｐＨは、７〜１４が好ましい。
【０１００】
本発明に係る製造方法に用いられるアルカリ水溶液中のアルカリの量としては、使用する硫酸ジメチルに対して２〜５倍モルが好ましく、２．５〜４倍モルが特に好ましく、３倍モルがさらに好ましい。
【０１０１】
本発明に係る製造方法に用いられる酸としては、有機酸または無機酸のいずれでもよく、塩酸、硫酸、硝酸、酢酸、クエン酸、コハク酸、ピクリン酸、濃硫酸、濃硝酸などが用いられるが、塩酸、硫酸、硝酸がより好ましく、塩酸がさらに好ましい。
【０１０２】
本発明に係る製造方法において、上記反応物に添加する酸の濃度としては、なるべく水分量を減らすべく濃度が高いものが好ましい。
【０１０３】
上記反応物混合溶液に添加する酸の濃度は、５〜１００ｗ／ｖ％（重量／体積％）が好ましく、１５〜１００ｗ／ｖ％がより好ましく、３０〜１００ｗ／ｖ％が特に好ましい。例えば、添加する酸として塩酸を用いる場合は、１５〜３６ｗ／ｖ％が好ましく、３０〜３６ｗ／ｖ％が特に好ましい。
【０１０４】
上記反応物混合溶液に添加する酸の量は、１〜１０倍モルが好ましく、１〜５倍モルがより好ましく、１．５〜３倍モルが特に好ましい。
【０１０５】
上記反応物に添加する塩酸の量としては、出発物質の使用量に対して、１〜５倍モルが好ましく、１．５〜３倍モルが特に好ましく、１．８〜２．２倍モルがさらに好ましい。
【０１０６】
また、本発明に係る製造方法において酸を加え沈殿を生成させる工程で用いる攪拌装置としては、磁気スターラー、メカニカルスターラーなどを用いることができる。
【０１０７】
本発明に係る製造方法において、前記単離工程で得られた固体を水から再結晶する工程をさらに含むことが好ましい。すなわち、本発明の製造方法は、上記工程（Ａ）で得られた反応生成物と、硫酸ジメチルを混合し、無溶媒下で加熱反応させて得られた反応混合物を得る工程と、アルカリ水溶液に溶解させて反応混合溶液を得た後、さらに前記反応混合溶液に酸を加えて固体（上記化学式１に示される化合物を含むもの）を単離する工程と、単離された前記固体を水から再結晶する工程とを含むことが好ましい。
【０１０８】
本発明に係る製造方法における再結晶で用いる水の量としては、固体１００ｇ当り、５００ｍｌ〜３０００ｍｌが好ましく、１０００ｍｌ〜２０００ｍｌが特に好ましく、１０００ｍｌ〜１５００ｍｌがさらに好ましい。なお、当該単離された固体は、０．５〜２４時間、室温条件下で減圧乾燥したものが使用される。
【０１０９】
上記再結晶工程で固体を水に溶解させる際に、加熱を行なってよい。加熱器具としては、水浴、油浴、マントルヒーター、ホットプレートなどが用いられる。加熱する際の加熱器具の温度設定は、５０〜１５０℃が好ましく、７０〜１３０℃が特に好ましく、９０〜１１０℃がさらに好ましい。
【０１１０】
また上記再結晶のための放置時間は、３０分〜３日が好ましく、１時間〜１日が特に好ましく、１０時間〜１５時間がさらに好ましい。さらに、上記再結晶のための放置時の温度は、０〜４０℃が好ましく、０〜２５℃が特に好ましく、０〜１５℃がさらに好ましい。
【０１１１】
本発明に係る製造方法において使用される水は、特に制限されるものではなく、水道水、イオン交換水、純水、超純水、または工業用水などの水洗水を使用することができ、純水が特に好ましい。
【０１１２】
上記により得られた、前記化学式１で示される化合物またはその塩の純度の測定方法は、後述する。
【０１１３】
（亜硝酸塩）
前記化学式１で示される化合物またはその塩を、亜硝酸塩を用いてニトロソ化する。
【０１１４】
ニトロソ化工程に用いる亜硝酸塩は、特に制限はないが、亜硝酸のカチオン塩が用いられると好ましい。
【０１１５】
カチオン塩としても、特に制限はなく、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などが好適に挙げられる。具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等が好ましい。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。なお、入手のし易さの観点で、ナトリウム塩が特に好ましい。
【０１１６】
ニトロソ化工程に用いる亜硝酸塩の量は、化学式１で示される化合物またはその塩（本明細書中、単に「出発物質」とも称する。）の量に対して、反応効率および副生成物の観点で、１．０〜２．０倍モルが好ましく、１．０〜１．５倍モルがより好ましく、１．０〜１．２倍モルがさらに好ましい。
【０１１７】
（酸）
前記ニトロソ化工程におけるニトロソ化反応は、反応性の観点で、酸の存在下において行うとよい。
【０１１８】
ニトロソ化工程に用いられる酸は、特に制限はないが、反応性の観点で、塩酸、硫酸、硝酸、濃塩酸、濃硫酸、濃硝酸、酢酸、クエン酸、コハク酸、ピクリン酸が好ましい。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。なお、取り扱いの観点で、塩酸が特に好ましい。
【０１１９】
ニトロソ化工程に用いられうる酸の量にも、特に制限はないが、出発物質の量に対して、反応効率および副生成物の生成の観点で、０．５〜２．０倍モルが好ましく、１．０〜１．５倍モルがより好ましく、１．０〜１．２倍モルがさらに好ましい。
【０１２０】
また、添加する酸は、副生成物の生成を抑える観点で、好ましくは０〜１５℃、より好ましくは１〜１０℃、さらに好ましくは１〜５℃にしておくとよい。なお、添加する酸を、後述する溶媒で希釈した場合も同様の温度に制御しておくとよい。
【０１２１】
（溶媒）
ニトロソ化工程において、出発物質と上記亜硝酸塩、酸を混合する場合、それぞれを予め溶媒に含有させておいてもよい。
【０１２２】
つまり、溶媒に、それぞれの原末（出発物質と亜硝酸塩）または原液（酸）を加えていく方法や、出発物質を溶媒に含有させた溶液（本明細書中、「出発物質の溶液」とも称する）に、亜硝酸塩、酸を溶媒に含有させた溶液（それぞれ、「亜硝酸塩の溶液」、「酸の溶液」とも称する。）を添加する方法を用いてもよい。
【０１２３】
好ましくは、反応効率の観点で、出発物質の溶液に、亜硝酸塩の溶液および酸の溶液を添加する方法である。つまり、酸の溶液と、亜硝酸塩の溶液とを、化学式１で示される化合物またはその塩の溶液に滴下して添加する。
【０１２４】
この際、添加する亜硝酸塩の溶液は、副生成物の生成を抑える観点で、好ましくは０〜１５℃、より好ましくは１〜１０℃、さらに好ましくは１〜５℃にしておくとよい。また、添加する亜硝酸塩の溶液の濃度は、反応性の観点で、好ましくは１〜１０ｍｏｌ／ｌ、より好ましくは１〜５ｍｏｌ／ｌ、さらに好ましくは３〜５ｍｏｌ／ｌにしておくとよい。
【０１２５】
また、添加する酸の溶液の濃度は、反応性の観点で、好ましくは１〜１０ｍｏｌ／ｌ、より好ましくは１〜５ｍｏｌ／ｌ、さらに好ましくは３〜５ｍｏｌ／ｌにしておくとよい。
【０１２６】
また、出発物質の溶液の濃度は、反応性の観点で、好ましくは０．１〜１０ｍｏｌ／ｌ、より好ましくは０．１〜５ｍｏｌ／ｌ、さらに好ましくは０．５〜２ｍｏｌ／ｌである。
【０１２７】
また、予め出発物質の溶液を、副生成物を抑える観点で、好ましくは０〜１５℃、より好ましくは０〜５℃、さらに好ましくは０〜３℃にしておくとよい。
【０１２８】
前記溶媒は、特に制限はないが、水、有機溶媒またはこれら混合物（混合溶媒）が用いられうる。なお、本明細書中、溶媒として「水」を主成分（好ましくは、全部）とした溶液の名称を「水溶液」とも称する。なお、本明細書中、「水を主成分とする」とは、全溶液中に水の占める割合が、１０〜１００ｖ／ｖ％であることを意味する。
【０１２９】
有機溶媒としては、特に制限はないが、アルコール、エーテル類、ケトン類、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどが用いられる。
【０１３０】
アルコールとしては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノールなどが好適に用いられうる。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。
【０１３１】
エーテル類としては、ジエチルエーテル、イソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、ジフェニルエーテル、ベンジルエーテル及びｔｅｒｔ−ブチルエーテルなどが好適に用いられうる。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。
【０１３２】
ケトン類としては、アセトン、メチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）及びシクロヘキサノンなどが好適に用いられうる。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。
【０１３３】
これらのうち、反応性の観点で、水単独または水とアルコールとの混合物が好ましく、水単独が特に好ましい。
【０１３４】
水および有機溶媒の混合溶媒を用いる際は、例えば、好ましくは水／有機溶媒（容量比）＝０／１００〜１００／０、より好ましくは水／有機溶媒（容量比）＝１０／９０〜１００／０程度がよい。この際、有機溶媒の含有量が、混合溶媒中、５０容量％を超えると、亜硝酸塩の析出の虞れもある。
【０１３５】
また、上記の通り、出発物質と、亜硝酸塩と酸とを混合させる方法にも特に制限はないが、反応性の観点で、亜硝酸塩の溶液と、酸の溶液とを、攪拌下で、出発物質の溶液に添加する方法が好ましい。さらには、添加する条件は、副生成物を抑える観点で、亜硝酸塩の溶液と酸の溶液を、ほぼ同じ速度で、同時に添加することが好ましい。
【０１３６】
ここで、「同時に添加する」とは、亜硝酸塩の溶液と、酸の溶液とを添加しているある時点が、一瞬でも互いに重複すればよいが、亜硝酸塩の溶液と、酸の溶液との添加を開始する時点と、亜硝酸塩の溶液と、酸の溶液との添加を終了する時点とが、実質的に同じであると好ましい。
【０１３７】
このように、「同じ速度で添加する」および「同時に添加する」ことで、亜硝酸を一定で連続的に発生させる効果を奏しうる。
【０１３８】
なお、この際の、亜硝酸塩の溶液と、酸の溶液の添加の方法にも特に制限はないが、ピペット、シリンジ、滴下ロートなどを用いて行なわれることが好ましい。また、これらの添加に要する時間は、グラムスケールの反応では、生成物の安定性の観点で、１〜１０分が好ましく、３〜７分が特に好ましく、４〜６分がさらに好ましい。
【０１３９】
また、添加は、磁気攪拌子等で、攪拌しながら行うことが、好ましい。
【０１４０】
さらに、亜硝酸塩の溶液と、酸の溶液と、を添加した後、そのまま静置しておいてもよいが、反応が添加後、時間とともに進行するため、好ましくは、上述の磁気攪拌子等で、好ましくは１〜１０分程度、より好ましくは３〜５分程度、激しく攪拌するとよい。この際、「激しく攪拌する」の攪拌速度にも特に制限はないが、好ましくは３００〜１２００ｒｐｍ、より好ましくは６００〜１０００ｒｐｍである。
【０１４１】
（反応時間）
ニトロソ化工程における反応時間にも特に制限はないが、あまりに反応時間が短すぎると、反応が不十分で出発物質の残留が生じる虞れがある。一方で、あまりに反応時間が長過ぎると、生成したニトロソ体の分解が起こる虞れがある。
【０１４２】
反応時間は、亜硝酸塩の溶液と酸の溶液を添加する時間を含めて、グラムスケールの反応では、１〜２０分が好ましく、５〜１５分がより好ましく、７〜１２分がさらに好ましい。
【０１４３】
（反応温度）
ニトロソ化工程において設定される反応温度としては、副生成物の生成を抑える観点で、０〜１５℃が好ましく、１〜１０℃がより好ましく、１〜５℃がさらに好ましい。かような温度条件にするためには、従来公知の知見を適宜参照して制御することができ、例えば、水浴や氷浴等を用いればよい。
【０１４４】
（反応容器）
ニトロソ化工程に用いられる反応容器の素材としても、特に制限はないが、ガラス製、ステンレス製、ホーロー製、テフロン（登録商標）製などが好適に例示でき、ガラス製が特に好ましい。また、反応容器の形状としても、特に制限はないが、なす型フラスコ、丸底フラスコ、平底フラスコ、三角フラスコ、セパラブルフラスコ、多口フラスコなどが挙げられる。
【０１４５】
上記ニトロソ化工程を経ることにより、
下記化学式２：
【０１４６】
【化１１】
【０１４７】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である、で示される化合物またはその塩を得ることができる。
【０１４８】
［単離工程］
本発明においては、上記ニトロソ化工程の後、化学式２で示される化合物またはその塩を単離する、単離工程を経る。つまり、本発明においては、ニトロソ化工程終了後、そのままワンポットで、一気に、後述の還元工程を行わず、単離工程を必須の工程として有する点に特徴の一つを有する。
【０１４９】
上記の通り、従来、所望の発色化合物を、高純度かつ高収率で得ることができないのは、ニトロソ化により生じるニトロソ体が非常に不安定ではないかとの予測の下に鋭意研究を行った。そして、その予測は正しく、中間体であるニトロソ体（化学式２で示される化合物またはその塩）は不安定であり、それが、収率減少や目的物の純度低下の一因となっていることを見出したのである。
【０１５０】
つまりは、中間体であるニトロソ体（化学式２で示される化合物またはその塩）を適切な精製を行わなければ、結局は、最終生成物たる化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩の収率減少や純度低下という結果に直結するのである。
【０１５１】
一方で、ニトロソ化工程終了後、ワンポット（一気に）で、後述の還元工程に移行する条件の下で、化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩の製造を試みると、中間体であるニトロソ体（化学式２で示される化合物またはその塩）の単離をすることが非常に困難なのである。つまりは、中間体であるニトロソ体（化学式２で示される化合物またはその塩）中に存在する副生成物の分離除去を行うことが困難なのである。
【０１５２】
その観点からして、上記ニトロソ化工程においては、中間体であるニトロソ体（化学式２で示される化合物またはその塩）の単離を容易に行わせしめるべく、最適なニトロソ化反応条件を詳細に検討する点も、非常に有用であると言えるのである。具体的には、本発明の製造方法におけるニトロソ化工程によれば、化学式２で示される化合物またはその塩のみが、沈殿分離するため、容易に単離精製することができる。また、上記にて、亜硝酸塩、酸を、それぞれ化学式１で示させる化合物またはその塩に対して、ほぼ等量で添加するのも、副生成物の生成をより抑え、ひいては化学式２で示される化合物またはその塩を容易に単離精製させるために他ならない。
【０１５３】
上記の通り、ニトロソ体（化学式２で示される化合物またはその塩）を固体として単離することによって、不純物が除去され、次の還元工程が効率的に進行するため、最終的に得られるアミノ体（化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩）の純度が高くなり、また還元工程における収率も向上するのである。
【０１５４】
以下、単離工程における、ニトロソ体を単離する方法について詳説する。
【０１５５】
ニトロソ体（化学式２で示される化合物またはその塩）を単離する具体的方法としては、特に制限はないが、ニトロソ化工程終了後に得られた反応混合物を、濾過したり、遠心分離したりすることなどによって行なわれるとよい。なお、かようにして得られたものを、「ニトロソ化物固体」とも称する。
【０１５６】
この際の濾過方法や条件としては、特に制限ないが、ろ紙を用いた吸引ろ過によって行うことができる。
【０１５７】
なお、得られたニトロソ化物固体は、溶媒で洗浄することにより、さらに純度が高くなる。
【０１５８】
この洗浄に用いられうる溶媒は、特に制限はないが、有機溶媒、またはこれらの混合物が用いられる。これらのうち、ニトロソ体の安定性の観点で、有機溶媒は、アルコールが好ましい。アルコールとしても特に制限はなく、上記にて列挙した具体例が同様に妥当であるが、ニトロソ体の安定性・純度の観点で、メタノールが特に好ましい。
【０１５９】
この際、洗浄に用いるアルコールは、ニトロソ体の安定性の観点から、好ましくは−２０℃〜１０℃程度、より好ましくは０〜５℃程度に冷却しておくと良い。
【０１６０】
このように得られたニトロソ体（化学式２で示される化合物またはその塩）の固体は、減圧乾燥などによって乾燥することによって、さらに、保存安定性が向上する。この際の減圧乾燥方法や条件としても、特に制限ないが、真空ライン（好ましくは０〜１０ｍｍＨｇ、より好ましくは１〜２ｍｍＨｇ）に接続して行うことができる。
【０１６１】
かようにして、化学式２で示される化合物またはその塩を単離することができる。
【０１６２】
［還元工程］
本発明における還元工程では、前記単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩を、亜鉛を用いて還元する。
【０１６３】
かような還元工程を経ることにより、
下記化学式３：
【０１６４】
【化１２】
【０１６５】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である、で示される酸化発色化合物またはその塩を製造することができる。
【０１６６】
上記の通り、ニトロソ化工程終了後、ワンポット（一気に）で、後述の還元工程に移行する条件下で、化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩の製造を試みると、生成する無機塩（亜鉛等）の除去が困難である。
【０１６７】
本発明の製造方法によると、無機塩（亜鉛等）を水酸化物として分離除去できるため、精製が非常に容易であり、最終生成物たる化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩の収率が有意に向上する。
【０１６８】
（亜鉛）
還元工程において、亜鉛を必須成分として用いる。ただし、亜鉛以外でも、本発明の効果を奏する範囲であれば、他の還元剤を用いてもよい。他の還元剤としては、ハイドロサルファイド塩、サルファイド塩などが挙げられる。
【０１６９】
還元工程において、亜鉛の量は、前記単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩に対して１〜３０倍モルが好ましく、５〜１０倍モルがより好ましく、７〜８倍モルがさらに好ましい。
【０１７０】
（酸）
還元工程における還元反応は、酸の存在下において行うとよい。
【０１７１】
還元工程に用いられる酸は、特に制限はなく、どのような種の酸でも用いうるが、反応性の観点で、塩酸、硫酸、硝酸、酢酸が好ましい。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。なお、取り扱いやすさの観点で、塩酸が好ましい。
【０１７２】
還元工程に用いられうる酸の量にも、特に制限はないが、前記単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩の量に対して、副生成物を抑える観点で、１〜３０倍モルが好ましく、５〜１５倍モルが特に好ましく、７〜９倍モルがさらに好ましい。
【０１７３】
（溶媒）
化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩の製造のために、前記単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩と、亜鉛と、を用い、上記の通り、還元反応は、酸の存在下で行うとよいが、必要に応じ反応溶媒を用いるとよい。
【０１７４】
反応溶媒としては、特に制限はなく、上記ニトロソ化工程で説明した具体例が、同様に妥当である。
【０１７５】
これら具体例のうち、化学式２で示される化合物の安定性の観点で、アルコール単独が好ましく、中でもメタノール単独が特に好ましい。
【０１７６】
還元工程における溶媒の量は、前記単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩１ｇに対して、反応性の観点で、２０〜１００ｍＬが好ましく、３０〜７０ｍＬがより好ましく、３０〜５０ｍＬがさらに好ましい。
【０１７７】
また、前記単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩と、亜鉛と酸とを混合させる方法にも特に制限はないが、反応性の観点で、亜鉛粉末と、酸の溶液とを、攪拌下で、単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩を溶媒に含有した溶液（本明細書中、「単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩の溶液」とも称する）に添加する方法が好ましい。
【０１７８】
より具体的には、単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩を、予め溶媒（この溶媒は、上記の通り、メタノールが特に好ましい。また、この際、この溶媒を、安定性の観点で、好ましくは−２０〜１０℃、より好ましくは−１０〜５℃に冷却しておくとよい。）に含有させておき、攪拌しながら、酸を添加し、さらに添加すべき亜鉛を一度に添加することが好ましい。「一度に添加する」理由は、ニトロソ体が不安定なため、早く反応を終了させるためである。この際、酸と亜鉛の添加順序にも特に制限はないが、ニトロソ体の安定性の観点で、好ましくは、亜鉛を先に添加する。
【０１７９】
また、添加は、磁気攪拌子等で、攪拌しながら行うことが、好ましい。
【０１８０】
また、亜鉛、酸の溶液を添加した後、副生成物を抑える観点で、好ましくは、上述の磁気攪拌子等で、好ましくは５〜２０分程度、より好ましくは５〜１０分程度、攪拌するとよい。また、攪拌速度にも特に制限はないが、好ましくは１００〜１２００ｒｐｍ、より好ましくは３００〜７００ｒｐｍである。
【０１８１】
（反応温度）
還元工程において設定される反応温度としては、−２０〜３５℃が好ましく、−１５〜２５℃が特に好ましい。かような温度条件にするためには、従来公知の知見を適宜参照して制御することができ、例えば、水浴や氷浴、ドライアイス−メタノール浴等を用いればよい。
【０１８２】
（反応容器）
還元工程に用いられる反応容器の素材としても、特に制限はなく、前記ニトロソ化工程で説明した具体例が同様に妥当である。
【０１８３】
また、反応容器の形状としても、特に制限はなく、前記ニトロソ化工程で説明した具体例が同様に妥当である。
【０１８４】
かような還元工程を経ることにより、前記化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩を製造することができる。
【０１８５】
［亜鉛除去工程］
上記還元工程終了後、亜鉛を除去することが好ましい。
【０１８６】
上記還元工程終了後、亜鉛は、固体状および／または水溶性の亜鉛の形態で残留しうる。
【０１８７】
固体状で残留している亜鉛は、濾過によって除去することが好ましく、さらに反応溶液中に残留する水溶性の亜鉛の除去を行なうとよい（亜鉛除去工程）。かような亜鉛除去工程を経ることにより、より高純度かつ高収率で、化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩を得ることができる。
【０１８８】
このような水溶性の亜鉛を除去する方法も特に制限されないが、例えば、以下の方法が挙げられる。
【０１８９】
すなわち、還元工程終了後の反応混合物を、濾過し、固体状で残留している亜鉛を除去した後、水を添加して洗浄を行う。その後、濾液と洗液をあわせ、濃縮する。そして、もとの化学式２で示される化合物の重量に対し、好ましくは５〜１０００質量部、より好ましくは１０〜１００質量部、さらに好ましくは１０〜５０質量部となる水を添加して、濃縮物の水溶液を準備する。そして、該濃縮物の水溶液に、アルカリ性物質を添加することにより、水酸化亜鉛の形で残留亜鉛を析出させて、濾過によって除去することができる。
【０１９０】
かようにすることで、亜鉛除去工程を経た反応混合物を得ることができる。
【０１９１】
（アルカリ性物質）
水酸化亜鉛を生成させるアルカリ性物質としては、特に制限はないが、水酸化塩が好ましく、より具体的には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムなどが挙げられる。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。なお、中でも水酸化ナトリウムが特に好ましい。
【０１９２】
水酸化亜鉛を生成させるためのアルカリ性物質は、水溶液の形態（アルカリ性物質水溶液）で添加することができる。添加するアルカリ性物質水溶液の濃度は、残留する亜鉛濃度の観点から、１〜１０規定濃度が好ましく、３〜５規定濃度がさらに好ましい。
【０１９３】
なお、添加するアルカリ性物質の量は、残留亜鉛の除去と、化学式３で示される化合物の安定性の観点から、アルカリ性物質を添加した後、ｐＨが、８．０〜１０．０になるよう設定するのが好ましく、８．５〜９．５になるよう設定するのが特に好ましい。
【０１９４】
［抽出精製工程］
上記亜鉛除去工程を経た後、亜鉛除去工程を経て得られた反応混合物から、さらに残留する無機塩を除くため、抽出精製工程を経ることが好ましい。かような抽出精製工程を経ることにより、より高純度かつ高収率で、化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩を得ることができる。
【０１９５】
抽出精製工程は、亜鉛除去工程を経て得られた反応混合物を固体状態とし、溶媒で抽出する方法が用いられうる。抽出精製工程における抽出方法は、反応混合物を粉末状態として溶媒を加えて攪拌する他、一般に用いられる抽出装置を使用して行なってもよい。
【０１９６】
亜鉛除去工程を経て得られた反応混合物を固体状態にする方法にも特に制限はないが、例えば、減圧乾燥方法等により蒸発乾固する方法が挙げられる。
【０１９７】
この際の減圧乾燥方法や条件としても、特に制限ないが、真空ライン（好ましくは０〜３０ｍｍＨｇ、より好ましくは１〜２ｍｍＨｇ）に接続して行うことができる。
【０１９８】
抽出精製工程における溶媒としては、最終目的物（化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩）を溶解できるものであれば特に制限されないが、アルコールが好ましく、より具体的には、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノールなどが好適に使用できる。これらは、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。なお、抽出効率の観点で、エタノールが特に好ましい。
【０１９９】
また、本発明の製造方法により得られる化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩は、両性でありうるため、単離をすること自体も困難である。しかしながら、上記の通り、ニトロソ化物の単離（不純物除去）、残留亜鉛の除去、エタノールによる無機塩（ＮａＣｌ）の分離などの工夫を行うため、容易に単離を行うことができる。
【０２００】
本発明の製造方法によると、従来法では５０％程度であった純度が、少なくとも８０％以上、実際には９５％以上に向上する。
【０２０１】
この点においても、本発明は非常に優れていると言える。
【０２０２】
なお、目的物の純度は以下の方法で調べることができる。
【０２０３】
【表１】
【０２０４】
標品と同時に展開を行い、目視で反応進行度合いの確認に用いられる。
【０２０５】
【表２】
【０２０６】
全ピーク面積の和のうち目的物のピーク面積の％を計算し、純度とした。
【０２０７】
＜本発明の第二＞
本実施形態では、本発明の製造方法により製造された酸化発色化合物またはその塩、つまり、化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩（本明細書中、「本発明の酸化発色化合物／塩」とも称する）の特に好ましい用途・使用に関する実施形態を説明する。
【０２０８】
本発明の酸化発色化合物／塩は、血液や尿をはじめとする体液中の生体成分の測定法の一つである、酵素を用いた比色分析法に好適に使用される。特に２分子で機能する酸化型発色試薬のうちのカプラーとして用いられうる。すなわち、本発明の酸化発色化合物／塩は、例えば、前記背景技術の項で記載したトリンダー試薬と共に用いられ、被測定物質の酵素的酸化で生じる過酸化酸素をさらにＰＯＤ酸化して生成した活性酸素によって、２分子が酸化縮合することによって呈色する。
【０２０９】
すなわち、本発明の本発明の第二は、本発明の酸化発色化合物／塩と、トリンダー試薬と、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼと、ペルオキシダーゼと、を含む試薬組成物（本明細書中、「本発明の試薬組成物」とも称する）である。
【０２１０】
つまり、本発明の酸化発色化合物／塩は、カプラーとして使用することが特に好ましく、それ以外については従来公知の知見が適宜参照され、特に限定されるものではない。
【０２１１】
（トリンダー試薬）
トリンダー試薬としては、特に制限はなく、従来公知の化合物がいずれも好ましく用いられうる。ただ、中でも中でもＮ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−３−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ−サクシニルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ビス−（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−サクシニルアミノエチル）−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリンが好ましく、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリンが、発色強度や波長といった観点で、特に好ましい。
【０２１２】
（測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼ）
「測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼ」としては、例えば、測定対象物がグルコースである場合、該オキシダーゼはグルコースオキシダーゼであり、測定対象物がコレステロールである場合、該オキシダーゼはコレステロールオキシダーゼであり、測定対象物が尿酸である場合、該オキシダーゼはウリカーゼであり、測定対象物がピルビン酸である場合、該オキシダーゼはピルベートオキシダーゼである。これらは測定対象物の基質のみを特異的に酸化するために、色々な成分を含む検体からそれぞれの測定対象物のみを限定して定量することができる。
【０２１３】
本発明に係る試薬組成物において、本発明の酸化発色化合物／塩とトリンダー試薬とのモル比は、１：１〜２：１であることが好ましく、１．３：１がより好ましい。本発明の酸化発色化合物／塩とトリンダー試薬とのモル比が１：１未満である場合、また、本発明の酸化発色化合物／塩とトリンダー試薬とのモル比が２：１を超える場合、発色不良を生じることがある。
【０２１４】
本発明に係る試薬組成物中の、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼの含有量は、カプラー１５ｍｍｏｌに対して、４３３ｋ〜２６００ｋＵであることが好ましく、８６６ｋ〜２６００ｋＵであることがより好ましい。測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼの含有量が、カプラー１５ｍｍｏｌに対して４３３ｋＵ未満である場合、発色不良を生じることがある。なお、本発明において、前記測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼの含有量は、４ＡＡ−ＴＯＯＳ法により測定したユニット数を採用するものとする。
【０２１５】
本発明に係る試薬組成物中のペルオキシダーゼの含有量は、カプラー１５ｍｍｏｌに対して１６６．５ｋ〜１６６６ｋＵであることが好ましく、３３３ｋ〜９９９ｋＵであることがより好ましい。ペルオキシダーゼの含有量が、カプラー１５ｍｍｏｌに対して１６６．５ｋＵ未満である場合、発色不良を生じることがある。なお、本発明において、前記ペルオキシダーゼの含有量は、ピロガロール法により測定したユニット数を採用するものとする。
【０２１６】
本発明に係る試薬組成物は、本発明の酸化発色化合物／塩と、トリンダー試薬と、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼと、ペルオキシダーゼと、を含む。すなわち、「本発明の酸化発色化合物／塩と、トリンダー試薬と、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼと、ペルオキシダーゼ」以外の他の成分を、試薬組成物としての機能を害さない程度含んでいてもよい。該成分としては、例えば、ｐＨ緩衝剤、浸透圧調整剤、界面活性剤、可溶化剤、安定化剤、保護剤等が挙げられる。
【０２１７】
なお、これら他の成分の含有量は、試薬組成物としての機能を害さなければ特に制限されないが、本発明の酸化発色化合物／塩と、トリンダー試薬と、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼと、ペルオキシダーゼとの総質量に対して、好ましくは１０〜３０質量％、より好ましくは１３〜２０質量％含まれてもよい。
【０２１８】
本発明に係る酸化発色化合物／塩は、血液や尿をはじめとする体液中の生体成分の測定法の一種である、酵素を用いた比色分析法に好適に使用されるカプラーとして用いられうる。すなわち、本発明に係る酸化発色化合物／塩は、前記トリンダー試薬と共に用いられ、測定対象物の酵素的酸化で生じる過酸化酸素を、さらにペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）酸化して生成した活性酸素によって、本発明に係る酸化発色化合物／塩を含むカプラーと、トリンダー試薬と、が酸化縮合することによって呈色する。そのため本発明の酸化発色化合物／塩は、上記の通り、その化合物自体に特徴を有するものであるが、カプラーとして使用することが特に好ましい。
【０２１９】
上述の通り、本発明の酸化発色化合物／塩は水溶性が高いため、それを含む試薬組成物（本明細書中、「本発明に係る試薬組成物」とも称する）や、該試薬組成物を担体に保持して試験具として使用する場合には、血液などの検体にすばやく溶解して均一化し、迅速に呈色反応が起こる点、非常に優れたものである。また、本発明に係る試薬組成物を用いた呈色反応（比色分析法）において、それによって生じた色素化合物についても、検体への溶解性や親和性が高く、担体内での展開性が良くなるので、担体表面での発色が鮮やかで均一性の高いものとなり、感度が高く安定した測定が可能となる。さらには、本発明に係る酸化発色化合物／塩は、溶解性が高いので、従来の試薬より高濃度の試薬組成物液（試薬液）が調製可能である。すると、該試薬組成物を担体に担持して、試験具として使用する場合、塗布液濃度を高くしてより多くの試薬を担体に保持させることが可能となる。加えて、本発明の酸化発色化合物／塩は親水性が向上し分子量が高くなっている為、保管中の昇華による試薬組成物の損失を抑えることができる。
【０２２０】
また、本発明に係る酸化発色化合物／塩は、試薬濃度の変化における呈色強度への影響が少ない為に、化合物が経時的に劣化減少した場合でも測定値への影響が少ない。さらに、本発明に係る試薬組成物に含まれる本発明の酸化発色化合物／塩の親水性官能基は、担体への吸着性を高め、試験具として使用した場合でも、担体内での化合物の安定性を向上させる。このように本発明に係る試薬組成物を提供することにより、ひいては、経時劣化を低減させ有効期間が延びた試験具を提供することが可能となる。
【０２２１】
＜本発明の第三＞
上記本発明の第二の通り、本発明の酸化発色化合物／塩は、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼと、トリンダー試薬と、を組み合わせて、本発明に係る試薬組成物となる。
【０２２２】
本発明の酸化発色化合物／塩は、前記トリンダー試薬と、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼと、ペルオキシダーゼと、組み合わせて、液体、粉末、錠剤、もしくは担体に保持した状態で分析用組成物として用いられうる。
【０２２３】
これら分析用組成物には、上記に加えて、ｐＨ緩衝剤、浸透圧調整剤、界面活性剤、可溶化剤、安定化剤、保護剤等の成分を含んでいてもよい。
【０２２４】
なお、これら成分の含有量は、試薬組成物としての機能を害さなければ特に制限されないが、本発明に係る酸化発色化合物またはこれらの塩と、トリンダー試薬と、測定対象物に対して選択的に作用するオキシダーゼと、ペルオキシダーゼとの総重量に対して、好ましくは１０〜３０質量％、より好ましくは１３〜２０質量％含まれてもよい。
【０２２５】
また、液体に保持して用いる場合には、検体と混合して反応させた後、色の変化を目視で判定する他、分光光度計で透過吸光度を測定してもよい。また、本発明に係る試薬組成物は、担体に保持した状態で試験具として用いてもよい。
【０２２６】
このように、本発明に係る試薬組成物は、種々の物に保持して用いることができるが、本発明に係る試薬組成物は、担体に保持した状態で試験具として用いることが好ましい。
【０２２７】
よって、本発明の第三は、本発明に係る試薬組成物が、担体に保持されてなる試験具である。
【０２２８】
かようなドライケミストリーで用いられる試験用具のように、担体に保持した状態で用いる場合には、これらの試薬組成物を含む層の他、これの機能を害さない範囲において、計量層、展開層、濾過層、保持層等を含んでいてもよい。このように担体に保持して用いる場合には、検体を付与した後、色の変化を目視で判定する他、分光光度計で反射吸光度を測定してもよい。測定値は予め作製した検量線を用いて測定対象物の量に換算することができる。
【０２２９】
（担体）
本発明に係る担体の素材としては、紙、布帛、高分子膜等の多孔質物質を用いることができるが、特に、発色性能といった点で、高分子膜が好ましい。
【０２３０】
上記高分子膜とは、高分子よりなる水不溶性の多孔質体である。高分子としては、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、セルロース、セルロースアセテート、硝酸セルロース、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、芳香族ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリ塩化ビニル、ポリビニルアルコールが挙げられる。これらの高分子は一般的に知られている製膜方法を用いて膜を形成することができる。これらの高分子膜の中でもポリスルホンまたはポリエーテルスルホンが、発色性能といった点で、特に好ましい。
【０２３１】
（担体に保持する方法）
本発明に係る試薬組成物を担体に保持する方法にも特に制限はないが、担体に適当な溶剤に溶解させた試薬組成物溶液を担体にコーティングする他、試薬組成物を含むマトリックス前駆体を成型して試験層を形成させる等の公知の方法が用いられうる。
【０２３２】
コーティングは、工業用に使用される一般的なコート法を用いることができるが、担体が多孔質の場合には、しばしば塗工直後の液移動や不均一な乾燥に起因するコートむらが問題となる。担体と塗工液の物性や、塗工乾燥の方法、機器、条件がこれらを支配する重要因子となりうる。このため、精密印刷法が有効な場合もある。
【０２３３】
塗工後の液移動や不均一な乾燥を低減する為には、少量の液を正確に計量して塗工するような精密印刷技術が適するが、この方法では高い試薬濃度の塗工液を作製できることが必須となる。
【０２３４】
例えば、４−アミノアンチピリン等の既存のカプラーは、測定に用いる種々の試薬の中でも最も溶解性が低く、これが高い濃度の塗工液を作製するときの問題点となっていた。しかしながら、本発明の化合物は溶解性が高く、濃度の高い塗工液を作製するに好都合である。
【０２３５】
試薬を担体に保持させた試験具では、検体付与後、検体の液体成分によってまず試薬が溶解し、混合して反応が起こり、色素化合物が生成し、通常試験具の検体付与面の反対側にある読み取り面に移動し、その色調変化を測定する、というステップを経て定量が行なわれる。このため、試薬の溶解性が高いことは、検体による均一な溶解、均一化、迅速な反応に有利であるだけではなく、生成する色素も溶解性に優れるために読み取り面への移動がスムースかつ均一性が高いというメリットもある。これらの特徴は、測定時間の短縮化、測定精度の向上、測定値ばらつきの低減に寄与する。したがって、本発明の酸化発色化合物／塩は高い溶解性を有するため、測定時間の短縮化、測定精度の向上、測定値ばらつきの低減に寄与できることが期待される。
【０２３６】
例えば、従来公知のカプラーである４−アミノアンチピリンを担体に保持させた試験具として使用した場合、経時的に劣化減少し測定値が上昇するという問題が生じる。減少による測定値上昇の原因としては、酵素反応や呈色反応の阻害ではなく化合物の濃度が高いほど他の試薬類の溶解や移動、また生成色素の流動性に何らかの障害を与えるのではないかと考えられている。しかしながら、本発明の化合物は４−アミノアンチピリンと比較して量が増減しても測定値への影響が少なく、４−アミノアンチピリンでみられた問題を改善できた。
４−アミノアンチピリン等の既存のカプラーは、ある担体に保持させた試験具として使用した場合、濃度変化が測定値に影響するという問題点がある。バルク担体にコートする際むらが生じた場合には、それを切り抜いて用いる各試験具間に感度差が生じる、あるいは保存中に劣化分解して量が変化した場合測定値に影響が出るということを示唆している。原因は、酵素反応や呈色反応の阻害ではなく、化合物の濃度が高いほど他の試薬類の溶解や移動、また生成色素の流動性に何らかの障害を与えるのではないかと考えられている。これに対して、本発明の酸化発色化合物／塩は４−アミノアンチピリンと比較して濃度の測定値への影響が少なく、これらの問題を改善できる。
【０２３７】
本発明の製造方法により得られる化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩は、トリンダー試薬と組み合わせて酸化発色させた場合には、４−アミノアンチピリン等の既存のカプラーを用いた場合と比較して吸光度が大きくなり、測定感度が向上することができる。例えば、本発明の４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン、４−アミノ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン等は、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）やＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）と組み合わせて発色させた場合、その検量線の傾きは改善され、測定感度が向上されうる。
【０２３８】
上述の通り、本発明の製造方法により得られる化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩は水溶性が高いため、それを含む試薬組成物を担体に保持しなる試験具（以下、単に、「本発明に係る試験具」とも称する）を使用する場合、本発明に係る試薬組成物は、血液などの検体にすばやく溶解して均一化し、迅速に呈色反応が起こるため、本発明に係る試験具は、非常に優れたものとして使用されうる。
【０２３９】
また、本発明に係る試験具を用いた場合、本発明に係る試薬組成物の呈色反応において生じた色素化合物についても、検体への溶解性や親和性が高く、担体内での展開性が良くなるので、担体表面での発色が鮮やかで均一性の高いものとなる。
【０２４０】
本願発明の製造方法により製造された化合物は、溶解性が有意に高いので、従来の試薬より高濃度の試薬液が調製可能である。また、担体に担持して使用する場合塗布液濃度を高くしてより多くの試薬を担体に保持させることが可能となる。さらには、塗布液の濃度を高く設定し全体液量を少なくできることで、塗工均一性の高い、グラビア印刷法、ドット印刷法、インクジェット印刷等の精密印刷法が使用できる。塗工液量が少なくなれば、乾燥時間が短縮され乾燥むらを低減させる効果もある。以上、十分な試薬を高い均一性で塗工できることにより、塗りむらなどに起因するばらつきを低減させることができ、高い精度の試験具を提供することができる。すなわち、本発明に係る試験具を用いると、感度が高く安定した測定が可能となる。さらには、本発明の酸化発色化合物／塩は、溶解性が高いので、従来の試薬より高濃度の試薬組成物液（試薬液）が調製可能である。すると、該試薬組成物を担体に担持して、試験具として使用する場合、塗布液濃度を高くしてより多くの試薬を担体に保持させることが可能となる。
【０２４１】
加えて、本発明の製造方法により得られる化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩は、親水性が向上し分子量が高くなっている為、保管中の昇華による試薬組成物の損失を抑えることができる。
【０２４２】
また、本発明の酸化発色化合物／塩は、試薬濃度の変化における呈色強度への影響が少ない為に、化合物が経時的に劣化減少した場合でも測定値への影響が少ない。さらに、本発明に係る試薬組成物に含まれる本発明の酸化発色化合物／塩の親水性官能基は、担体への吸着性を高める。すなわち、本発明に係る試験具は、担体内での化合物の安定性を向上されている。
【０２４３】
このように本発明に係る試験具は、従来に比べ、経時劣化を低減させ有効期間が有意に延びたものといえる。
【実施例】
【０２４４】
次に実施例によって本発明を説明する。本発明の化合物は以下の実施例の製法で合成される。
【０２４５】
＜実施例１＞
１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
２００ｇの１−（４−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロンを１Ｌナスフラスコに入れ、８９ｍＬの硫酸ジメチルを滴下ロートから均一にかかるように室温下にて滴下した。硫酸ジメチルの滴下後、ナスフラスコ上部に塩化カルシウム管を接続した玉入冷却器を取り付けた。次いで、温度コントローラーのセンサー部分をマントルヒーター上に置き、ナスフラスコを装着した。設定温度を２３０℃にして加熱を開始した。１−（４−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロンの粉末が完全に融解し内部が茶色透明の均一状態になるまで、約２時間加熱した。ナスフラスコを室温まで放冷後、氷冷下、水酸化ナトリウム水溶液（水酸化ナトリウム：１１３ｇ＋純水：５００ ｍＬ）を徐々に添加した後、発熱、発煙が収まってから、７０〜８０℃の水浴上でガラス棒にて攪拌しながら反応混合物の固形物を溶解した。さらに、溶解後、ｐＨ試験紙で内容液が強アルカリ性（ｐＨ１１以上）であることを確認した。
【０２４６】
次いで、上記反応混合物の固形物をアルカリ水溶液で溶解した反応物をサンプリングし、ＴＬＣでチェックを行なった。ナスフラスコ内容液中の黒色不溶物を吸引濾過し濾別した。氷冷下、得られた濾液に１２０ ｍＬの塩酸を攪拌しながら添加し、ｐＨ試験紙で内容液が強酸性（ｐＨ１以下）であることを確認した。氷冷下、沈殿が生成するまで攪拌を続けた。生成した沈殿を吸引濾過し、ロート上で、純水５００ｍＬ、アセトン５００ｍＬにて順次洗浄した。真空ラインに接続して、減圧乾燥を行ない、粗生成物１７４ｇを得た。粗生成物を２０００ｍＬナスフラスコに入れ、純水から再結晶して、純水、アセトンにて洗浄後、減圧乾燥して目的物１１９ｇを得た（収率：５６％）。純度９５％以上（ＨＰＬＣ）。
【０２４７】
【表３】
【０２４８】
＜実施例２＞
１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成（高圧法）
６．７５ｇの１−（４−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロン（アルドリッチ社製 １３４１６３）、２５０ｍＬの脱水メタノール（ナカライテスク社製 ０４１００−２５）、４．２ｍＬのヨウ化メチル（関東化学社製 Ｉ００６０）を、高圧反応装置〈耐圧硝子社製ＴＰＲ−１型）シリンダー容器内に入れ、１３０℃で１８時間加熱攪拌した。反応後、反応混合液を３００ｍＬのナスフラスコに注ぎロータリーエバポレーターにて４０±３℃の水浴上で乾固するまで減圧濃縮を行なった。真空ラインに接続して室温にて３０分間減圧乾燥を行なった。乾燥後、純水１５ｍＬを加え１００〜１１０℃のオイルバス中で攪拌しながら内容物を完全に溶解させた。すり潰した塩化ナトリウム５．５３ｇを加え、オイルバス上で完全に溶解させた。ナスフラスコをオイルバスから取り出し、室温で１時間攪拌した。茶色の沈殿が生成することを確認し、冷蔵庫に入れ、１５時間以上放置した後、生成した沈殿を吸引濾過し、純水、アセトンで洗浄し、減圧乾燥して粗生成物を得た。粗生成物を純水から再結晶して、純水、アセトンにて洗浄後、減圧乾燥して目的物１．５ｇを得た（収率：２１％）。所要時間３日、純度９５％以上（ＨＰＬＣ）。
【０２４９】
【表４】
【０２５０】
＜実施例３＞
４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
（１）「ニトロソ化工程」
４−ニトロソ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
実施例１または２で合成した１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン３０．０ｇ（０．１１１ｍｏｌ）を乳鉢で細かくすりつぶし、５００ｍＬ三つ口フラスコに秤量し、磁気攪拌子を入れた。三つ口フラスコを磁気スターラー上に置いた氷浴（０〜３℃）中に浸し、氷冷した純水１１１ｍＬを加え、１０分程度攪拌した。
【０２５１】
攪拌下、２〜３℃に冷却した亜硝酸ナトリウム水溶液３１ｍＬ（亜硝酸ナトリウム１３．８ｇ／純水５０ｍＬ）（０．１２４ｍｏｌ）と、２〜３℃に冷却した４Ｎ塩酸３１ｍＬ（０．１２４ｍｏｌ）と、を同時に、５分かけて滴下ロートから滴下した。滴下後、磁気スターラーで３分間激しく攪拌した。生成した沈殿を吸引濾過した。フィルターケーキ上に、２〜３℃に冷却した脱水メタノール約１５０ｍＬをまんべんなくかけて洗浄し、真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して、室温にて、減圧乾燥した。
【０２５２】
その後、目的物（４−ニトロソ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成）２５ｇを得た。
【０２５３】
なお、１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンに対する収率は、７５％であった。
【０２５４】
（２）「還元工程」
４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
上記（１）で得られた４−ニトロソ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン４．０ｇ（０．０１３４ｍｏｌ）を、５００ｍＬナスフラスコに秤量した。ナスフラスコに、磁気攪拌子を入れ、磁気スターラー上に置いた氷浴中に浸しクランプで固定した。
【０２５５】
それに、２〜３℃に冷却したメタノール１５６ｍＬを入れ、３秒間攪拌して分散させた。亜鉛粉末６．６ｇ（０．１００ｍｏｌ）、２〜３℃に冷却した２Ｎ塩酸５４ｍＬ（０．１０８ｍｏｌ）を加えて、５分間攪拌を続けた。反応後、ナスフラスコ中の内容物を吸引濾過して亜鉛残渣を濾別した。亜鉛残渣を、純水を用いてロート上で洗浄して、濾液と洗液をあわせ、ナスフラスコに入れた。ロータリーエバポレーターにて減圧濃縮を行ない、溶媒を留去した。１３０ｍＬの純水を加えて濃縮物を懸濁させ、ビーカーに移して磁気攪拌子を入れ、磁気スターラー上に置いた氷浴中に浸し攪拌を行った。濃縮物のｐＨをｐＨメーターでモニターしながら、ｐＨが９．０±０．５になるまで、攪拌下、４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液をピペットで滴下した。
【０２５６】
生成した水酸化亜鉛の沈殿物を吸引濾過して水酸化亜鉛残渣を濾別した。水酸化亜鉛残渣を、純水を用いてロート上で洗浄して濾液と洗液をあわせ、ナスフラスコに入れた。ロータリーエバポレーターにて減圧濃縮を行ない、溶媒を留去して、真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して、室温にて減圧乾燥した。ナスフラスコ中の生成物にエタノール８００ｍＬを加え、磁気攪拌子を入れ磁気スターラーにて目的物を攪拌抽出した。ナスフラスコ内容物を吸引濾過して塩化ナトリウム残渣を濾別した。塩化ナトリウム残渣を、エタノールを用いてロート上で洗浄して濾液と洗液をあわせ、ナスフラスコに入れた。ロータリーエバポレーターにて減圧濃縮を行ない、溶媒を留去して、真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して、室温にて減圧乾燥した。目的物：３．７ｇを得た。
【０２５７】
なお、４−ニトロソ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン対する収率は、９０％であった。
【０２５８】
２工程（「ニトロソ化工程」および「還元工程」の２工程）の収率は６８％（（１）×（２））であり、純度は、９７％以上（ＨＰＬＣ）であった。
【０２５９】
【表５】
【０２６０】
＜比較例１＞
４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
実施例１または２で得られた１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン ０．５ｇを０．４Ｎ塩酸１０ｍＬに溶解し、氷冷下４０％亜硝酸ナトリウム水溶液０．３５ｍＬを加えて１分間攪拌し、亜鉛末５００ｍｇを加え、さらに室温で１０分攪拌した。反応混合物をろ過後、濾液を濃縮乾固し、目的物０．４１ｇを得た。収率は３６％、純度は５０％（ＨＰＬＣ測定により）であった。
【０２６１】
【表６】
【０２６２】
＜実施例４＞
１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
２００ｇの１−（３−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロンを１０００ｍＬナスフラスコに入れ、８９ｍＬの硫酸ジメチルを滴下ロートから均一にかかるように室温下にて滴下した後、ナスフラスコ上部に塩化カルシウム管を接続した玉入冷却器を取り付けた。温度コントローラーのセンサー部分をマントルヒーター上に置き、ナスフラスコを装着した。設定温度を２３０℃にして加熱を開始した。１−（３−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロンの粉末が完全に融解し内部が茶色透明の均一状態になるまで、約２時間加熱した。ナスフラスコを室温まで放冷後、氷冷下、水酸化ナトリウム水溶液（水酸化ナトリウム：１１３ｇ＋純水：５００ ｍＬ）を徐々に添加した後、発熱、発煙が収まってから、７０〜８０℃の水浴上でガラス棒にて攪拌しながら固形物を溶解した。溶解後、ｐＨ試験紙で内容液が強アルカリ性（ｐＨ１１以上）であることを確認した。
【０２６３】
反応物をサンプリングし、ＴＬＣでチェックを行なった。ナスフラスコ内容液中の黒色不溶物を吸引濾過を行ない濾別した。氷冷下、得られた濾液に１２０ ｍＬの塩酸を攪拌しながら添加し、ｐＨ試験紙で内容液が強酸性（ｐＨ１以下）であることを確認した。氷冷下、沈殿が生成するまで攪拌を続けた。生成した沈殿を吸引濾過し、ロート上で、純水５００ｍＬ、アセトン５００ｍＬにて順次洗浄した。真空ラインに接続して、減圧乾燥を行ない、粗生成物１８０ｇを得た。粗生成物を２０００ｍＬナスフラスコに入れ、純水から再結晶して、純水、アセトンにて洗浄後、減圧乾燥して目的物１２５ｇを得た（収率：６０％）。所要時間２日、純度９５％以上（ＨＰＬＣ測定により）。
【０２６４】
【表７】
【０２６５】
以上のことから、比較例に比べて本発明の製造方法で製造された実施例１または実施例４では、同規模の反応装置ではるかに仕込み量が大きく出来ることにより効率化された。また、所要時間は１日、収率は３８％程度向上している。
【０２６６】
＜実施例５＞
１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
６．７５ｇの１−（３−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロン（アルドリッチ社製 ５５６８９０）、２５０ｍＬの脱水メタノール（ナカライテスク社製 ０４１００−２５）、４．２ｍＬのヨウ化メチル（関東化学社製 Ｉ００６０）を、高圧反応装置〈耐圧硝子社製ＴＰＲ−１型）シリンダー容器内に入れ、１３０℃で１８時間加熱攪拌した。
【０２６７】
反応後、反応混合液を３００ｍＬのナスフラスコに注ぎロータリーエバポレーターにて４０±３℃の水浴上で、乾固するまで減圧濃縮を行なった。さらに、真空ラインに接続して、室温にて３０分間減圧乾燥を行なった。乾燥後、純水１５ｍＬを加え、１００〜１１０℃のオイルバス中で攪拌しながら内容物を完全に溶解させた。これに、すり潰した塩化ナトリウム５．５３ｇを加え、オイルバス上で完全に溶解させた。ナスフラスコをオイルバスから取り出し、室温で１時間攪拌した。ここで、茶色の沈殿が生成したことを確認し、冷蔵庫に入れ、１５時間以上（一昼夜）放置した。
【０２６８】
放置後、生成した沈殿を吸引濾過し、純水、アセトンで洗浄し、減圧乾燥して粗生成物を得た。粗生成物を純水から再結晶して、純水、アセトンにて洗浄後、減圧乾燥して目的物１．４ｇを得た（収率：２０％）。なお、純度は９５％以上（ＨＰＬＣ）であった。
【０２６９】
【表８】
【０２７０】
＜実施例６＞
４−アミノ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
（１）「ニトロソ化工程」
４−ニトロソ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
実施例４または５で合成した１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン３０．０ｇ（０．１１１ｍｏｌ）を、乳鉢で細かくすりつぶし、５００ｍＬ三つ口フラスコに秤量し、磁気攪拌子を入れた。三つ口フラスコを磁気スターラー上に置いた氷浴（０〜３℃）中に浸し、氷冷した純水１１０ｍＬを加え、１０分攪拌した。
【０２７１】
攪拌下、２〜３℃に冷却した亜硝酸ナトリウム水溶液３１ｍＬ（亜硝酸ナトリウム１３．８ｇ／純水５０ｍＬ）（０．１２４ｍｏｌ）と、２〜３℃に冷却した４Ｎ塩酸３１ｍＬ（０．１２４ｍｏｌ）と、を同時に、５分かけて滴下ロートから滴下する。滴下後、磁気スターラーで３分間激しく攪拌した。生成した沈殿を吸引濾過した。フィルターケーキ上に、２〜３℃に冷却した脱水メタノール約１５０ｍＬをまんべんなくかけて洗浄し、真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して、室温にて、減圧乾燥した。目的物２５ｇを得た。
【０２７２】
なお、１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン対しての収率は、７５％であった。
【０２７３】
（２）「還元工程」
４−アミノ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
上記（１）で得られた４−ニトロソ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン４．０ｇ（０．０１ｍｏｌ）を、５００ｍＬナスフラスコに秤量した。ナスフラスコに、磁気攪拌子を入れ、磁気スターラー上に置いた氷浴中に浸しクランプで固定した。
【０２７４】
それに、２〜３℃に冷却したメタノール１６０ｍＬを入れ、３秒間攪拌して分散させた。亜鉛粉末６．６ｇ（０．１ｍｏｌ）、２〜３℃に冷却した２Ｎ塩酸５４ｍＬ（０．１ｍｏｌ）を加えて、５分間攪拌を続ける。反応後、ナスフラスコ中の内容物を吸引濾過して亜鉛残渣を濾別した。亜鉛残渣を、純水を用いてロート上で洗浄して、濾液と洗液をあわせ、ナスフラスコに入れた。ロータリーエバポレーターにて減圧濃縮を行ない、溶媒を留去した。１３０ｍＬの純水を加えて濃縮物を懸濁させ、ビーカーに移して磁気攪拌子を入れ、磁気スターラー上に置いた氷浴中に浸し攪拌を行なった。濃縮物のｐＨをｐＨメーターでモニターしながら、ｐＨが９．０±０．５になるまで、攪拌下、４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液をピペットで滴下した。
【０２７５】
生成した水酸化亜鉛の沈殿物を吸引濾過して水酸化亜鉛残渣を濾別した。
【０２７６】
水酸化亜鉛残渣を、純水を用いてロート上で洗浄して濾液と洗液をあわせ、ナスフラスコに入れた。ロータリーエバポレーターにて減圧濃縮を行ない、溶媒を留去して、真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して、室温にて減圧乾燥した。
【０２７７】
ナスフラスコ中の生成物にエタノール８００ｍＬを加え、磁気攪拌子を入れ磁気スターラーにて目的物を攪拌抽出した。
【０２７８】
ナスフラスコ内容物を吸引濾過して塩化ナトリウム残渣を濾別した。
【０２７９】
塩化ナトリウム残渣を、エタノールを用いてロート上で洗浄して濾液と洗液をあわせ、ナスフラスコに入れた。ロータリーエバポレーターにて減圧濃縮を行ない、溶媒を留去して、真空ライン（＜２ｍｍＨｇ）に接続して、室温にて減圧乾燥した。目的物：３．６ｇを得た（収率８７％）。
【０２８０】
２工程（「ニトロソ化工程」および「還元工程」の２工程）の収率は６５％であり、純度は、９７％以上（ＨＰＬＣ）であった。
【０２８１】
【表９】
【０２８２】
比較例に比べて本発明の製造方法で製造された実施例では、純度は４７％以上、収率は３２％および２９％向上している。また性状は、比較例で得られた化合物は吸湿性が高い粉末であり扱いにくいのに対し、実施例３および実施例６で得られた化合物は吸湿性が低い粉末で取扱いがしやすい。
【０２８３】
＜実施例７＞
試験片による性能評価
０．１３Ｍコハク酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝５．０）１００ｍＬ中に、実施例３で合成した４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン ０．４６ｇ 、 Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン ０．９５ｇ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ３．０ｇ、グルコースオキシダーゼ １５０Ｋ ｕｎｉｔ、ペルオキシダーゼ ２５０Ｋ ｕｎｉｔを溶解して塗工液を作成した。ポリエーテルスルホン膜（テルモ株式会社製、膜厚１３０μｍ）に塗工液を塗布し、３５℃で１８時間乾燥を行なった。膜を１ｃｍ角の正方形に打ち抜き、試験片を得た。試験片を反射分光光度計検出部に固定した後、１μＬの検体を試験膜上部より滴下し、１０秒後の反射吸光度を測定した。ヘマトクリット値４０、種々のグルコース濃度の血液で測定した値から検量線を作成し、定量感度を観察した。（図１）反射吸光度値はそれぞれの試験片に対して最高となる時間の値を用いた。図１中、ｘ軸に反射吸光度、ｙ軸に血糖値をとっているため、傾きがなだらかなほど感度が高いことを意味する。
図２から示されるように、本発明の製造方法により合成した中間体を用いて合成された４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンを用いた試験片の検量線の傾きは、従来から広く使用されている４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）を用いた場合より改善され、測定感度を有意に向上させることが示される。
【図面の簡単な説明】
【０２８４】
【図１】実施例３における、本発明の酸化発色化合物／塩および４−アミノアンチピリンの反射吸光度値の時間変化を表した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１：
【化１】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子またはスルホン酸基であり、この際Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の少なくとも一つがスルホン酸基である、
で示される化合物またはその塩を、亜硝酸塩を用いてニトロソ化する、ニトロソ化工程と；
前記ニトロソ化工程の後、
下記化学式２：
【化２】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である、
で示される化合物またはその塩を単離する、単離工程と；
前記単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩を、亜鉛を用いて還元する、還元工程と；
を含む、
下記化学式３：
【化３】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である、
で示される酸化発色化合物またはその塩の製造方法。
【請求項２】
前記ニトロソ化工程において、亜硝酸塩の量が、化学式１で示される化合物またはその塩に対して１．０〜１．５倍モルである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記ニトロソ化工程におけるニトロソ化反応を、化学式１で示される化合物またはその塩に対して１．０〜１．５倍モルの酸を用いて行う、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記ニトロソ化工程において、酸またはその水溶液と、亜硝酸塩の水溶液と、を同時に化学式１で示される化合物またはその塩の水溶液に滴下して添加する、請求項３に製造方法。
【請求項５】
前記還元工程において、亜鉛の量が、前記単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩に対して１〜３０倍モルである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記還元工程における還元反応を、前記単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩に対して１〜３０倍モルの酸を用いて行う、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記還元工程を、反応溶媒を用いて行い、該反応溶媒が、アルコールである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記還元工程を、反応溶媒を用いて行い、該反応溶媒の量が、前記単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩１ｇに対して２０〜１００ｍＬである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
前記還元工程後、反応混合物中に残留する水溶性の亜鉛を、水酸化亜鉛として除去する、亜鉛除去工程をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記還元工程後、反応混合物からアルコールを用いて、化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩を抽出精製する、抽出精製工程をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に製造方法で得られる、化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩。
【請求項１】
下記化学式１：
【化１】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子またはスルホン酸基であり、この際Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の少なくとも一つがスルホン酸基である、
で示される化合物またはその塩を、亜硝酸塩を用いてニトロソ化する、ニトロソ化工程と；
前記ニトロソ化工程の後、
下記化学式２：
【化２】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である、
で示される化合物またはその塩を単離する、単離工程と；
前記単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩を、亜鉛を用いて還元する、還元工程と；
を含む、
下記化学式３：
【化３】
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、化学式１の定義と同様である、
で示される酸化発色化合物またはその塩の製造方法。
【請求項２】
前記ニトロソ化工程において、亜硝酸塩の量が、化学式１で示される化合物またはその塩に対して１．０〜１．５倍モルである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記ニトロソ化工程におけるニトロソ化反応を、化学式１で示される化合物またはその塩に対して１．０〜１．５倍モルの酸を用いて行う、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記ニトロソ化工程において、酸またはその水溶液と、亜硝酸塩の水溶液と、を同時に化学式１で示される化合物またはその塩の水溶液に滴下して添加する、請求項３に製造方法。
【請求項５】
前記還元工程において、亜鉛の量が、前記単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩に対して１〜３０倍モルである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記還元工程における還元反応を、前記単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩に対して１〜３０倍モルの酸を用いて行う、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記還元工程を、反応溶媒を用いて行い、該反応溶媒が、アルコールである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記還元工程を、反応溶媒を用いて行い、該反応溶媒の量が、前記単離工程により得られた化学式２で示される化合物またはその塩１ｇに対して２０〜１００ｍＬである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
前記還元工程後、反応混合物中に残留する水溶性の亜鉛を、水酸化亜鉛として除去する、亜鉛除去工程をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記還元工程後、反応混合物からアルコールを用いて、化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩を抽出精製する、抽出精製工程をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に製造方法で得られる、化学式３で示される酸化発色化合物またはその塩。
【図１】
【公開番号】特開２００９−２４２２４６（Ｐ２００９−２４２２４６Ａ）
【公開日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−８７１９７（Ｐ２００８−８７１９７）
【出願日】平成２０年３月２８日（２００８．３．２８）
【出願人】（０００１０９５４３）テルモ株式会社 (2,232)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２８日（２００８．３．２８）
【出願人】（０００１０９５４３）テルモ株式会社 (2,232)
【Ｆターム（参考）】
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