酸化還元反応による血漿タンパク質の結合特異性の改変方法
液体培地中に懸濁または溶解した少なくとも１つの血漿タンパク質の結合特異性は、結合特異性の改変を引き起こすのに十分な酸化剤、または電位に暴露することにより改変される。自己抗体のようなマスクされたタンパク質は、結合特異性を改変するためにタンパク質を酸化することにより、血液または血液産物または抽出物より回復されうる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００３年６月９日に出願された、米国特許仮出願明細書番号第６０／４７６，６０７号の出願日の優先権を主張する。仮出願明細書は、これを参照することによって本明細書中に組み込まれている。
【０００２】
本発明は、酸化還元反応により改変されうる結合特異性を持つ血漿タンパク質の結合特異性を改変する方法に関する。本発明はさらに、正常な被験者の血液、血清または血漿中に生来存在する自己抗体を非マスク化することにより、自己抗体を得る方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
「自己免疫疾患（autoimmune disease）」という語句は、免疫システムが誤って自分自身の体の細胞、組織および器官を攻撃する疾患の一群を指す。一般的に、自己免疫疾患は、一般的なタンパク質および脂質のような、体自身の成分に結合する抗体が関与する。自己化合物（またはより一般的には、あまりに共通しているので全ての生物でみられる化合物）に対して結合する抗体が、自己抗体と呼ばれる。例として、リン脂質および／またはリン脂質結合性血漿タンパク質に結合する自己抗体が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、深部静脈血栓症および反回動脈血栓症、肺塞栓、再発性流産、血小板減少症、舞踏病、てんかん、青色皮斑、特発性肺高血圧、リウマチ状態および多くの膠原病のような疾患に関連する。自己抗体に関連した他の疾患には、多発性硬化症、クローン病、円板状エリテマトーデス、橋本甲状腺炎、乾癬、糖尿病およびリウマチ関節が含まれる。約８０の異なる自己免疫疾患があり、集団的に、これらの疾患は、数百万人が罹患している。
【０００４】
自己免疫疾患の病因に関する従来の理論は、これらの疾患は、疾患個体（individual）中の自己抗体の過剰産出によって引き起こされ、恐らく、自己抗体等をコードしている遺伝子の過剰発現による、というものである。この理論によると、罹患している個体の血液は、疾患を引き起こす特定の自己抗体が高いレベルを有し、一方で、正常の個体からの血液には、自己抗体が全く含まれないか、または非常に少ない量である。この理論は、自己免疫疾患を罹患している被験者からの血液または血液産物中に多量の自己抗体が見かけ上、検出可能であり、一方、自己免疫疾患を持たない被験者からの血液または血液産物中では、まったく検出されない、または最小の量の自己抗体しか検出されないという従来のアッセイによって支持される。
【０００５】
本発明は、正常の個体からの血液には、事実、広い範囲の種類と特異性において著しい数の自己抗体が含まれるという、本明細書で報告された、驚くべき発見に基づいている。血液または血液産物を酸化によって、本明細書に記述した方法に従い、たとえば、酸化剤または電流により処理すれば、正常の個体の血液または血液産物から、これらの自己抗体を検出し、単離することが可能である。正常な血液中の著しい量の自己抗体の発見は、いままでに報告されておらず、本発明者の知る限りでは、そのような自己抗体が、正常な血液中に著しい量で存在することは、本発明以前には、完全に未知であった。
【０００６】
どんな特定の理論にも固執することなく、自己免疫疾患の症状を持たない個体から得た正常の血液を操作することで、自己抗体を得ることが可能であるならば、正常者の免疫系が、これらの自己抗体を日常的に作製し、循環させているのに違いないが、何らかの方法でこれらはその中へマスクされるか、ブロックされるか、または任意の有害な効果をもつことを防止していることは明らかである。
【０００７】
正常個体中での、著しい量の自己抗体の発見によって、自己抗体が、（典型的には、その対応する抗原に対する抗体の結合に基づく）標準のアッセイでなぜ検出されないのか、およびなぜ自己抗体が、正常個体における疾患症状を引き起こさないのか、という疑問がわいてくる。
【０００８】
本明細書にて記述した以前の実験に基づいて、自己抗体が、通常のスクリーニング手順で、そのような抗体が検出されることなく、そしてそのような抗体が疾患を引き起こすこともなく、正常の血液に含まれるのか、という初期の仮説の解釈は、正常個体中に自己抗体が産生された後に、何らかの形で、それらが隔離された、というものである。隔離は、たとえば、自己抗体を封鎖し、血流の他の成分から分離した状態を保つ能力を持つ低密度または高密度リポタンパク質（ＬＤＬ、ＨＤＬ）のような巨大分子、または他の型の微粒子、小胞またはミセルの形態であり得る。このような理論では、自己免疫疾患は、自己抗体それ自体の産出によってではなく、自己抗体を隔離している巨大分子（macromolecules）、微粒子（microparticles）、小胞またはミセルの破壊、崩壊または形成不全によって、ひきおこされうる。この理論は、自己抗体が、振とうおよび加熱を含む試料のきわめて過烈な操作の後に、血液または血清試料から得ることができた、以前の実験によって支持されるようである。
【０００９】
しかしながら、本明細書で記述するように、その後の実験において、血液または血液産物を、酸化剤またはＤＣ電流に暴露するような、本発明のより単純な方法で、正常血液から自己抗体を得るのに十分であり得ること、およびこの工程が可逆的であることが示された。さらに、自己抗体が、任意のタイプの存在物（entity）を隔離している巨大分子を含まない、市販されているＩｖＩｇ産物を処理することによって得ることができることが発見された。これらの実験に基づいて、そのような抗体が通常のスクリーニング手順で検出されることなく、そしてそのような抗体が疾患を引き起こすことなく、どのようにして正常血液が自己抗体を有するのかに関しては、よりあり得る理論は自己抗体が他の抗体とともに自由に循環しているが、自己抗体の抗原結合部位が正常個体において、どうにかしてブロックされるか不活性化される、というものである。このような理論では、自己免疫疾患は、酸化によって自己抗体の抗原結合部位を取り去る（unblock）ことで引き起こされうる。さらに、この理論は、特定の血漿タンパク質の結合特異性が改変されうるという、より一般的な機構を示唆している。
【００１０】
本発明の基礎を形成している発見の即時的な実用は、得られる自己抗体のほとんど制限のない供給を与え、自己抗体が、自己免疫および他のａＰＬ関連疾患の実験室診断用の診断キットで、標品として使用可能である。以前は、自己免疫疾患または標準的なアッセイで、自己抗体が陽性である個体から、自己抗体は得られると考えられているために、商業的利用の大量の自己抗体を集めることは、困難であった。個々の患者の静脈切開術から得ることが出来る、または自己抗体に関して試験陽性と判明している、患者の群からの血液をプールすることによって得ることが出来る、そのような血液の量は限られている。米国特許第５，８８５，７９３号で記述したような、ファージライブラリーをスクリーニングすることのような、自己抗体を得る他の方法も、難しく、多大な時間がかかりうる。
【００１１】
マスクされた抗体の存在または存在しないことに関して、血液試料を試験することは、特定の個体における酸化ストレスに続いて、どんな抗体が現れるかを予兆、または予期しうるので、重要な診断的価値がある。
【発明の開示】
【００１２】
酸化還元状態の変化によって改変可能な結合特異性を持つ、血漿タンパク質の結合特異性を変更する方法を提供することが、本発明の目的である。
【００１３】
正常の個体由来の血液、血清または血漿から自己抗体を得る方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００１４】
前記被験者における自己抗体を不活性化するのに十分な抗酸化剤を、被験者に、投与することによって、自己免疫疾患を持つ被験者を処置する方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００１５】
自己免疫疾患を持つ被験者を、前記被験者の自己抗体を体外で不活性化することによって、処置する方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００１６】
結合特異性を改変するのに十分な酸化剤またはＤＣ電流を暴露した、少なくとも１つのタンパク質が含まれる生体液、または生体液のタンパク質含有抽出物からなる産物を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００１７】
ルーチン臨床アッセイにおいて、自己抗体の存在に関してテスト陰性である１人またはそれ以上の個人由来の、血液、血漿または血清が、自己抗体の存在を示すように処置された当該血液、血漿または血清試料を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００１８】
循環タンパク質の結合特異性の改変をもたらす酸化剤や直流電流（ＤＣ）を生体液または生体液の抽出物中のタンパク質に暴露させて、タンパク質の酸化還元状態の変化おこすことで改変されうる結合特異性の結合部位を持ち、生体液またはタンパク質を含む生体液の抽出物中に少なくとも一つの循環タンパク質の結合特異性を改変する方法によって、これらと他の目的を達成される。
【００１９】
目的はさらに、液体培地中に懸濁または溶解した、少なくとも１つの血漿タンパク質を含む組成物を与える方法であって、前記血漿タンパク質の結合特異性に改変を起こし得るのに十分な、酸化剤またはＤＣ電流に暴露することで、酸化還元状態の変化し、改変されうる結合特異性をもつ血漿タンパク質からなる方法により、達成される。
【００２０】
他の実施形態において、本発明は、生体液または生体液の抽出物由来の自己抗体または他のマスクされた循環タンパク質、前記自己抗体または他のマスクされた循環タンパク質が、抗原またはリガンドに結合可能になるように、前記自己抗体または他のマスクされた循環タンパク質の結合特異性を改変するのに十分な酸化剤またはＤＣ電流に暴露すること、それによって、生体液または生体液の抽出物から検出可能および回収可能になること、および自己抗体または他のマスクされた循環タンパク質を、生体液から回収することによって、生体液から、または生体液の抽出物から、自己抗体または他のマスクされた循環タンパク質を得る方法に関する。
【００２１】
他の実施形態において、本発明は、自己免疫疾患を持っている被験者に、被験者中の自己抗体を不活性化するのに十分な量の抗酸化剤を投与することによって、自己免疫疾患を処置する方法に関する。自己免疫疾患を患っている個体の処置には、非マスク化タンパク質を減少させ、マスクされたタンパク質として置換するために、血液の体外処理が含まれうる。
【００２２】
他の実施形態において、本発明は、正常者の生体液または抽出物に、どの自己抗体がマスクされているかのスクリーニング方法に関し、つまり酸化および起電力により、暴露される、または非マスク化された場合、個体の自己免疫疾患を引き起こす自己抗体の、可能性のある抗体プロファイルを構築することに関する。
【００２３】
特定の非限定例として、血液、血漿または血清、または抽出物から自己抗体が検出と回復可能なように、血液、血漿または血清、または免疫グロブリン混合物のような血液抽出物を、前記血液、血漿、血清または抽出物中に含まれる少なくとも１つの自己抗体の結合特異性の改変を引き起こす酸化剤またはＤＣ電流に暴露しうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、生体液または生体液の抽出物中の、少なくとも１つの血漿タンパク質または循環タンパク質の結合特異性を改変する方法に関する。
【００２５】
本明細書で使用するところの語句「循環タンパク質（circulating protein）」および「血漿タンパク質（plasma protein）」は、動物の循環系にて天然に存在するタンパク質を意味する。循環タンパク質の例には、抗体および他の血漿タンパク質が含まれる。本発明の方法は、全ての血漿タンパク質または循環タンパク質に普遍的に利用されるということを意味しないが、該タンパク質の酸化還元状態の変化によって改変可能である結合特異性がある特性が任意の血漿タンパク質または循環タンパク質に利用されるということが理解されるべきである。この特性を持つ自己抗体のような循環タンパク質が存在するという、本発明者らの発見は、本発明の基礎を形成する。酸化還元状態での変化によって、変更可能である結合特異性を持つと発見された非抗体タンパク質の例には、キニノゲン（kininogen）およびプロトロンビン（prothrombin）および／またはベータ２糖タンパク質（beta2 glycoprotein）が含まれる。
【００２６】
語句「マスクされた循環タンパク質（masked circulating protein）」は、正常の個体中で血液に存在するが、その結合部位が、正常の個体内または正常の個体から取られた試料中では、マスクされているか、またはブロックされているか、あるいは抗原の結合から保護されているので、レセプター−リガンド結合にもとづく従来の結合アッセイによって検出不可能であり、そして、マスクされた循環タンパク質を含む試料を、本発明の方法にしたがった酸化剤または電流に暴露することなどによって、その酸化還元状態を変化させることによって処理する場合に抗原に結合可能になり、それによって試料中で検出可能になる「循環タンパク質」を命名し、説明するために、本発明に新たに造語した。マスクされた循環タンパク質の例は、自己抗体である。本発明者らによって発見されたように、正常の血液中に、著しい量の自己抗体が循環しているが、これらは、抗体−抗原結合に基づく典型的なアッセイで検出されない。本明細書で議論したように、自己抗体の結合特異性を変更するのに十分な酸化−還元条件下に自己抗体を供した場合に、自己抗体は、検出可能および回復可能になる。酸化によって非マスク化される自己抗体には、抗リン脂質、抗核小体（強皮症関連（scleroderma associated））、抗ラミン（核孔で非常に明るい（very bright at nuclear pores））、抗ミトコンドリア（細胞質性（cytoplasmic））、および抗中心小体抗体が含まれる。さらに、最初にＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス（hepatitis C virus））については陰性とされ、本発明にしたがった処置の後に、ＨＣＶについて陽性であるとされる、血液、血清またはＩｖＩｇ試料が存在することがわかり、このことは、正常な個体が、その循環内に、マスクされた抗ＨＣＶ抗体を持つことを示唆している。
【００２７】
語句、タンパク質の「結合特異性を改変（altering the binding specificity）」は、酸化または還元などによって、タンパク質が改変または変化し、先には特異的に結合不能であった抗原またはリガンドの特異的な結合が可能になる、または先には特異的に結合可能であった抗原またはリガンドの結合が不可能になる過程を意味する。語句「非マスク化（unmasking）」は、マスクされた循環タンパク質の結合特異性が改変され、前記タンパク質が、改変された結合特異性の為に、結合アッセイによって検出可能になる過程を意味する。
【００２８】
語句「自己抗体（autoantibody）」は、動物の免疫系によって産出される、そして、自己−抗原、すなわち、動物それ自身によって産出された化合物または抗原に結合する、任意の天然に存在する抗体を意味する。
【００２９】
語句「生体液（biological fluid）」には、血漿、血清および全血、唾液、尿、乳および他の分泌物を含む、循環タンパク質を含む任意の体液が含まれる。語句「生体液のタンパク質含有抽出物（protein-containing extract of any biological fluid）」は、免疫グロブリンフラクションのような、生体液から回収または分離された任意の調製物を意味する。本発明で使用しうる血液、血清または血漿は、個体から新鮮に入手でき、または血液銀行または他の血液収集機関から得たプールした血液または血漿調製物のような供給源から得てよい。本発明の目的のために、血液、血清または血漿はまた、期限切れ、または血液銀行または血液収集機関によって標準以下であると分かったコレクションであっても良い。この記述は、ヒト血液、血漿および血清に焦点をあてているが、本発明の同一の工程を動物血液に応用可能であり、獣医学に関する目的に、類似の動物抗体を得ることになる。好ましくは、前記血液、血漿または血清中に含まれうる抗酸化剤の効果を減少させるために、本発明の方法にて使用した血液または血清は、希釈する。
【００３０】
本発明の方法において、生体液中の少なくとも１つの循環タンパク質または血漿タンパク質の結合特異性は、前記タンパク質を酸化剤または電流に暴露することによって改変される。たとえば、蛋白質が非マスク化されるために、つまり本方法が実施される前に、蛋白質が結合不能であった抗原に、結合可能になるために、マスク化した循環タンパク質の結合特異性が変わり得る。その結合特異性が改変されたタンパク質は、ついで、特異的結合に基づいた任意の分離方法によって単離、および回収（recover）しうる。
【００３１】
酸化剤を使用して本発明を実施する場合、酸化剤は、生物学的分子の酸化還元状態を変化可能である任意の化合物でありうる。より特異的には、酸化剤は、電子供与体として働く他の分子に対して、電子受容体として働くことによって還元される能力のある分子である。酸化剤の例には、限定はしないが、ヘミン（hemin）、クロロフィル、または強酸化金属（strong oxidizing metal）を含む他の環状化合物、および過マンガン酸カリウム（ＫＭｎＯ4）が含まれる。典型的には、酸化剤を使用する際、生体液または抽出物と酸化剤の混合物とを、一定時間、典型的には、約１日〜一晩インキュベートしなければならない。酸化剤は、改変可能な結合特異性を持つタンパク質の結合特異性を改変するのに十分な濃度で、しかし、タンパク質を破壊しない濃度で使用すべきである。自己抗体の場合、異なる種類の自己抗体が、異なる抗酸化剤と、異なって相互作用しうる。たとえば、ａＰＣ自己抗体の非マスク化に関では、ヘミンは良い結果ではないが、ＫＭｎＯ4は非常に良い結果である。
【００３２】
ＤＣ電流を使用して、本発明を実施する場合、本方法は、処置すべき試料を含む導電性溶液中に、陽極および陰極電極を浸すような、任意の電流を伝達する方法によって実施しうる。典型的には、生体液を含む溶液を、改変可能な結合特異性を持つタンパク質の結合特異性を改変するのに、十分な大きさ（magnitude）、および十分な期間の電位に暴露しうる。陽性の結果が、溶液を、数秒間〜数分間、６〜２４ボルトの電位に暴露することによってえられうることがわかった。実施例で議論するように、電流への長期の暴露で、結合特異性の改変は可逆的となる。
【００３３】
ＡＣ電流を用いて、陽性の結果を得る試みは失敗に終わった。
【００３４】
特定の理論に関与することなく、自己抗体の場合、この自己抗体のＦａｂ部位中の抗原結合部位を酸化するのに十分な量、または時間で、酸化剤または電流に自己抗体を暴露することが好ましい。
【００３５】
対象の特定のタンパク質が、酸化還元状態での変化で改変しうる結合特異性をもつタンパク質か、そうでないか、および対象の特定のタンパク質の結合特異性を変更するための任意の組の条件の効果は、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または他のリガンド−レセプターアッセイによって簡単に決定しうる。酸化還元状態がタンパク質の結合特異性を変えうるか、そうでないかを見るために、タンパク質を酸化還元状態に供した前および後において、そのようなアッセイを実施した。たとえば、特異的自己抗体を回復するのに最適な酸化剤は、単純な実験によって、簡単に決定可能である。
【００３６】
本発明のさらなる観点は、自己免疫疾患を罹患している被験者に、被験者中の自己抗体を不活性化するために十分な量の抗酸化剤を投与すること、または前記被験者より血液試料を採取し、前記血液試料を、前記血液試料中の自己抗体を不活性化するのに十分な抗酸化剤または電流に暴露すること、および血液試料を対象に戻すことのいずれかによって、処置する可能性である。
【００３７】
本発明のさらなる観点は、自己抗体がマスクされているかどうか、個体において自己免疫疾患を惹起する自己抗体の可能性がある抗体のプロファイルを構築できるか、を決定するために、各個体の生体液または抽出物をスクリーニングする方法である。概括的にいうと、被験者由来の血液、血漿、血清試料を、試料中に検出可能であった自己抗体の量、および／または型を決定するために、アッセイし得る。したがって、被験者由来の血液、血漿、血清は、酸化剤またはＤＣ電流に暴露することで処理され得る、そして前記処理された試料において検出可能な自己抗体の量および／または型を決定するために、前記処理された被験者ゆらいの血漿または血清はアッセイされ得る。したがって、治療工程の前に試料中に検出可能な自己抗体の量および／または型を、治療工程後の試料中の検出可能な自己抗体の量および／または型と比較可能である。
【００３８】
未処理の血液、血漿、血清またはＩｖＩｇ試料、および本発明の方法にしたがって処理した血液、血漿または血清またはＩｖＩｇ試料を凍結乾燥および輸送または保存が可能であることがわかった。試料を再構成するときに、各個の活性を保持する。
【実施例】
【００３９】
本発明を記述するにあたって、以下の実施例が、本発明を実施するために現在知られている最良の態様を含む、本発明の特定の利用を例示するために与えられる。実施例は、ほぼ年代順で示しており、本発明の効果を達成するために必要な成分および手順の理解の進展を示している。これらの特定の実施例は、本明細書に記述した本発明の範囲を限定するものではない。
【００４０】
他に言及しない限り、本明細書で記述した実施例１〜１７のそれぞれに関して、以下の手順が一般的に使用された。正常ａＰＬ陰性被験者由来の、１０ｍｌの全血試料、または５ｍｌの血清または血漿、および４〜５ｍｌのパック（packed）された哺乳類赤血球細胞を、３０ｍｌのビオメリュー（Biomerieux）ブランドの細菌培養増殖培地（少なくとも以下の成分を含む：蒸留水、ダイズ−カセイン消化ブロス、酵母抽出物、デキストロース、スクロース、ヘミン、メナジオン（ビタミンＫ３）、ピリドキサールＨＣｌ（ビタミンＢ６）、およびポリアンエトレスルホネートナトリウム（ＳＰＳ）および活性炭（charcoal））を含むバイアルに加えた。ついで、この混合物を、３７℃、１８〜２２時間で振とう（rocking）ないし振動（shaking）しながらインキュベートした。インキュベーションおよび遠心分離（centrifugation）に続き、インキュベートした血液または血清／ＲＢＣを、２４の別個のａＰＬ試験結果を与える包括的イン−ハウスＥＬＩＳＡ（Comprehensive in-house ELISA）ａＰＬフォーマットを用いて、抗リン脂質抗体（ａＰＬ）の存在を試験した。試験手順は、以下の文献に、より詳しく記述され、その文献は本明細書に、組み込まれている。Wagenknecht DR他、「抗リン脂質抗体アッセイの進化、評価および解釈（Evolution, Evaluation and Interpretation of Antiphospholipid Antibody Assays）」Clinical Immunology Newsletter, Vol.15, No.2／3（1995）pp.28-38、およびMcIntyre JA他、「ボランティア血液ドナー中の抗リン脂質抗体（ａＰＬ）の頻度および特異性（Frequency and Specificities of Antiphospholipid Antibodies（aPL）in Volunteer Blood Donors）」、Immunobiology 207（1）:59-63,2003。
【００４１】
図１は、包括的イン−ハウスＥＬＩＳＡ（Comprehensive in-house ELISA）ａＰＬフォーマットを用いて試験した２４の別個のａＰＬ特異性を示している。４つの特異性 １）ａＰＳ＝抗ホスファチジルセリン、２）ａＣＬ＝抗カルジオリピン、３）ａＰＥ＝抗ホスファチジルエタノールアミン、および４）ａＰＣ＝抗ホスファチジルコリン、が評価された。これらのａＰＬ特性のそれぞれに関し、３つの免疫グロブリンアイソタイプ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭを探索した。各特異性および各アイソタイプを、それぞれ緩衝液に希釈したサプリメント（supplement）、１０％成体ウシ血漿（ＡＢＰ）（リン脂質結合血漿タンパク質を含む）、または１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、リン脂質結合血漿タンパク質を欠く）の存在下（依存性）および非存在下（非依存性）で評価した。被験者の血液試料の最終希釈は、１／５０〜１／１００の間であった。
【００４２】
本明細書で記述された種々の実験より得た２４種のａＰＬ特異性の結果を以下の図で与えた。陽性／陰性の発見を、上記McIntyre JA、Immunobiologyにて記述されたように、７７５人の正常血液の供給者由来の試験血漿試料に基づいた多重平均（ＭｏＭ）で表している。＋＋＋の存在は、強力な抗体活性を示している。＋および＋＋の表示は、それぞれ低いおよび中程度の抗体活性を示している。図はまた、各ａＰＬ特異性およびアイソタイプ組み合わせにおける、正常範囲値を与えている。
【００４３】
ＰＬ結合タンパク質「依存的」と示された縦列中の陽性結果は、抗リン脂質抗体（ａＰＬ）が、示した特定のリン脂質に初期に結合した血漿タンパク質に、実際、結合していることを示している。一般的に、ＰＳおよびＣＬによって結合可能である血漿タンパク質には以下のものがを内包される：ベータ2−糖タンパク質Ｉ、プロトロンビン、プロテインＣ、プロテインＳ、アネキシンＶ、および補体成分因子ＨおよびＣ４（例えば、McIntyre, J.A.、Wagenknecht,D.R. およびFaulk,W.P.「抗リン脂質抗体：発見、定義、検出および疾患（Antiphospholipid antibodies: Discovery, definition, detection and disease）」Prog. Lipid Res.42（3）:176-237、182ページを参照のこと）。血漿タンパク質結合の生理学的特性は、すべてのリン脂質に関して、以前は知られてはいないが、このような結合は、血漿タンパク質構造の立体構造変化を誘導すると考えられ、それによって、個体の自己抗体によって標的とされる新規なまたはあいまいな（cryptic）エピトープを曝すと考えられる。一般的に、リン脂質ＰＥによって結合可能である血漿タンパク質には、以下のものが含まれる：高分子量および低分子量キニノゲン、第ＸＩ因子、プレカリクレインが含まれる。後者２つのタンパク質は、高分子量キニノゲンへの結合の際に、それらの忠実性（Fidelity）に基づき検出可能である。ＰＣに結合する血漿タンパク質はいまだに決定されていない。ある実験において、血漿−タンパク質非依存的なａＰＬが観察されている（図３を参照のこと）。この活性の可能な解釈は、元来血液試料中に存在する、残余のリン脂質結合血漿タンパク質の存在を表しているということである。
【００４４】
実施例１
正常の被験者由来の血液試料を、上記の手順にしたがい、インキュベートし、試験した。ａＰＬ ＥＬＩＳＡの結果を、図２に示している。図２で示すように、インキュベートした血液試料は、正常者範囲の縦列中で示した正常、未処理血液と比較して、自己抗体の活性の著しい存在を示した。とりわけ、強力な自己抗体活性は、ａＰＳ（ＩｇＧ）、ａＣＬ（全てのアイソタイプ）、およびａＰＥ（ＩｇＧ）のタンパク質依存の部類で示されている。低いＩｇＧ ａＰＣ自己抗体の活性、または活性が無いことは、早期実施例およびヘミンを酸化剤として使用した手順において、特徴的な発見であった。この結果は、ＰＣに対する自己抗体、特にＩｇＧアイソタイプである自己抗体は、異なっており、恐らく他に行うのと同様の方法では活性化しないことを示している。後半の実験で、ａＰＣの著しいレベルが、ＫＭｎＯ4で処置した試料中で検出可能であることがわかった（データは示していない）。
【００４５】
実施例２
７人の健康な被験者から得た血液試料を、上記の手順にしたがってインキュベートおよび試験をした。とりわけ、全ての７人の患者の血液を、２０分間以内に得て、同一条件下で２０時間インキュベートした。図３は、これらの７つの試料のａＰＬセロコンバージョン（aPL seroconversion）の範囲を示している複合表である。これらの結果は、異なる個体間に、検出されたａＰＬレベルならびに存在するアイソタイプにおいて、ばらつきがあることを示している。それにもかかわらず、本発明によって示されたように、各個体が、インキュベーション後に検出できるａＰＬ抗体を持つ。
【００４６】
実施例３
最初の実験において、正常被験者由来の血清試料を、上記の基本的な手順にしたがい、インキュベートおよび試験した。インキュベーション混合物では、ウマ赤血球細胞（ＲＢＣ）を、ヒトＲＢＣの代わりに使用した。ａＰＬ ＥＬＩＳＡの結果を図４に示している。図４で示したように、著しいａＰＬ活性が、特にａＰＳ（ＩｇＧおよびＩｇＭ）およびａＣＬ（ＩｇＡおよびＩｇＭ）に関して得られた。
【００４７】
第二の実験において、ヒト血清の代わりに、ウマ血清を、ヒトＲＢＣと共にインキュベートし、上記の基本的な手順にしたがって試験した。ａＰＬ ＥＬＩＳＡの結果を、図５に示している。図５で示したように、ａＰＬ活性は得られなかった。（本実験で使用したＥＬＩＳＡアッセイは、ａＰＬを検出するために、ヒト抗体特異的アルカリホスファターゼ標識の抗体プローブを使用したので、インキュベートした試料がウマａＰＬを含んだかどうかは未知である）。
【００４８】
図４および５で要約して示した結果は、すべてのａＰＬが、第一の実験ではウマＲＢＣを用いているので、ヒトＲＢＣから放出されたのではなく、ヒト血漿由来の本発明のセロコンバージョン過程中に得られ、ヒトＲＢＣのかわりに、ヒト抗体を欠くウマＲＢＣを使用し、陽性の結果を示していること、一方、第二の実験は、ヒトＲＢＣの存在下でウマ血清を使用して、陰性の結果を示していることを明白に示している。
【００４９】
実施例４
正常被験者由来の血液試料を、インキュベーションを高い温度（elevated temperature）でのかわりに室温（２２℃）で実施したことを除き、上記の基本的な手順にしたがってインキュベートおよび試験した。図６は、試料が、室温でインキュベートした際には、セロコンバージョンを受けなかったことを示している。これらの結果は、セロコンバージョンの工程が、温度感受性でありうることを示唆している。
【００５０】
実施例５
正常被験者由来の血液試料を、活性炭（charcoal）の代わりにインキュベーション混合物中の粒子固体として、０．７ｍｍ デガラン（Degalan）（プラスチック）ビーズを使用することを特徴とし、上記の基本的な手順にしたがってインキュベートおよび試験した。セロコンバージョンを示している初期実験で活性炭を使用したので、活性炭がセロコンバージョン中に特定の役割を果たすかどうかを決めるために、この実験を実施した。図７は、活性炭の代わりにプラスチックビーズを使用した場合にさえ、試料がセロコンバージョンを示したことを示している。これらの結果は、活性炭の役割が、実際は化学的にではなく機械的であり、プラスチック、樹脂またはガラスビーズのような、任意の粒子固体を使用可能であることを示している。任意の特定の説に限定することなしに、粒子成分が、ＲＢＣ膜上で研磨剤として働き、おそらくこれが、ＲＢＣ ＡＥ１／Ｂａｎｄ３タンパク質との、またはＳＮＯヘモグロビン遷移分子との、または両方との相互作用によって、ＲＢＣからのＮＯイオンの放出を引き起こすと理論を立てることができる。機械的な研磨の可能性は、実施例６での観察によって支持され、そこでは、ネガティブアッセイ（negative assay）の結果は、振とう（rocking）ないし振動（shaking）されていないインキュベーション混合物でも示されている。粒子固体は自己抗体放出を支援する物理的機能もはたしうる。
【００５１】
実施例６
正常被験者由来の血液試料を、インキュベーション混合物を振とうないし振動せずに、静止させたことを除いて、上記の基本的な手順にしたがってインキュベートし、試験した。図８は、試料を静止させたままである時、セロコンバージョンを受けなかったことを示している。これらの結果は、この運動が固体粒子とＲＢＣ間の相互作用を促進しうることを示唆している。試料のインキュベーターへの移動によって産出されるようなわずかな量の運動が、少量のａＰＬ放出を産出しうるが、静止インキュベーション（stationary incubation）条件は、ａＰＬ放出を促進しなかった。
【００５２】
実施例７
正常被験者由来の血液試料を、遠心によるＲＢＣおよび活性炭のインキュベーションおよび除去の後に、インキュベーション混合物を５６℃にて３０分間加熱したという追加した特徴で、上記の基本的な手順にしたがってインキュベートおよび試験した。図９は、検出したａＰＬの量が、本手順により著しく増加したことを示している。
【００５３】
実施例８
Biomerieuxからの細菌培養増殖培地の代わりに、異なる供給業者（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）、スパークス（Sparks）、MD）からの細菌培養増殖培地を使用した特徴で、正常被験者由来の血液試料を、上記の基本的な手順にしたがってインキュベートおよび試験した。図１０は、試料が、ベクトンディッキンソン培地中でセロコンバージョンを表したことを示しており、そして、これは本発明の方法が、特定の供給源からの細菌培養増殖培地に依存しないことを示唆している。
【００５４】
実施例９
正常被験者由来の血液試料を、インキュベーションを好気性条件下（酸素およびＣＯ2の存在下）のかわりに、嫌気性条件下（窒素下）で実施したという特徴で、上記の基本的な手順にしたがってインキュベートおよび試験した。図１１は、試料が、嫌気性条件下でもセロコンバージョンを示したこと、および本発明の方法が、嫌気性環境に依存しないことを示している。
【００５５】
実施例１０
正常被験者由来の血液試料を、Ｋ５６２細胞（ヒト造血腫瘍細胞株）を、赤血球細胞の代わりに使用した特徴で、上記の基本的な手順にしたがってインキュベートおよび試験した。さらに、本発明の方法において典型的に使用したパック（pack）ＲＢＣの３〜４ｍｌと比較して、１１３０万個のＫ５６２細胞だけが、培養培地中に存在した。図１２は、試料が、セロコンバージョンを示したことを示している。
【００５６】
他の実験によって、他の単離された細胞種、リンパ球、単球および好中球とインキュベートした試料が、ａＰＬセロコンバージョンを典型的に示していないことが示された。特に、リンパおよび脊髄系の白血球は、ａＰＬ放出を促進せず、Ｌ１４と命名されたブタＢリンパ球の細胞株も促進しなかった（データは示していない）。これらの結果は、Ｋ５６２細胞およびＲＢＣがヘモグロビンを含み、リンパ球、単球および好中球はヘモグロビンを含まないので、ヘモグロビンがインキュベーション混合物中で、鍵となる成分であり得ることを示唆している。
【００５７】
実施例１１
正常被験者由来の血液試料を、細菌培養増殖培地をヒト細胞を増殖させるために使用される細胞培養培地：ＲＰＭＩと置換したことを除いて、上記の基本的な手順にしたがってインキュベートおよび試験した。図１３は、セロコンバージョンがおこらなかったことを示している。この実験は、本発明の目的のためには、細菌培養培地中のいくつかの成分の重要性を示している。ＲＰＭＩが、ヒト細胞のために設計された培養培地である一方で、バイアルブロス（viral broth）に置換したときにａＰＬ放出を促進しない。２つの異なる微生物学バイアルブロスのリストと、ＲＰＭＩとの成分の比較が、ＲＰＭＩが、ヘミンおよびビタミンＫ３と呼ばれるメナジオン（人工プロビタミンＫ）を欠くことを示す。ヘミンが、ＲＢＣ由来のイオンのポルフィリンキレーター（Ｆｅ＋＋＋）であり、メナジオンは、脂溶性ビタミンである。このことは、酸化還元反応が、自己抗体の放出において、役割を果たしうることを示唆している。
【００５８】
実施例１２
臍帯血試料を、上記の手順にしたがってインキュベートおよび試験した。臍帯血液を新生児の誕生後に取り、また、誕生前に胎盤を子宮壁から分離した。母親血液または新生児臍帯血いずれもが、従来の実験室アッセイにおいて、ａＰＬの存在を示さなかった。本明細書で記述した本発明にしたがって処理した場合、強力なａＰＬ抗体が、図１４で示したように、臍帯血試料中での存在を示した。抗体は、ＩｇＧのみであり、母由来の抗体と適合可能である知見である。誕生の前に、母親がＩｇＧを胎児へ伝達するので、この実験は、胎児血液中で胎児によってマスクされたままであるトロホブラスト（trophoblast）上の特殊化したＦｃγレセプター（ＦｃγＲｎ）によって、マスクされた母由来の自己抗体が、胎児に輸送されることを示したようにみられる。本発明の方法によるセロコンバージョンの前に、母親の血液および臍帯血は、ａＰＬ陰性であることを示し、そして検出されたＩｇＭまたはＩｇＡ免疫グロブリンがなかったので、これらの発見は、セロコンバージョンの後で、臍帯血にて観察されるＩｇＧ ａＰＬは、起源は母であるという論点を支持している。ＦｃγＲｎを発現するトロホブラストは、ＨＬＡ抗原を発現しないことも興味深い。
【００５９】
実施例１３
正常被験者由来の血漿試料を、上記の基本的な手順にしたがって、インキュベーション混合物中のＲＢＣに代わってニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ、２００マイクロモーラー）を用いたという特徴で、インキュベートおよび試験した。図１５は、試料がセロコンバージョンを提示したことを示している。
【００６０】
ＳＮＰは、強力な酸化窒素（ＮＯ）ドナー（donor）であるので、これらの結果はＮＯラジカルが、自己抗体の放出に関与するという支持証拠が提供され、ＲＢＣからＮＯ-供与体を与える役割を、ＲＢＣおよび固体粒子が果たすという説をさらに支持する。ニトロプルシドナトリウムは別として、他のフリーラジカル介在反応も自己抗体の放出を引き起こしうる。
【００６１】
実施例１４
正常被験者由来の血液試料を、上記の基本的な手順にしたがってインキュベートし、ループス性抗凝固因子活性に関して試験した。ループス性抗凝固因子または阻害剤は、ａＰＬの他の型であり、典型的に、機能的な実験室アッセイ（functional laboratory assay）によってのみ検出可能である。図１６中の結果は、ループス阻害剤陰性個体から採取し、本発明の方法により処理したセロコンバートされた血液中に、強力なループス性抗凝固因子（ＬＡ）を示している。ｄＲＶＶＴアッセイ中のセロコンバートしたブロスに、正常な血漿を添加することで、最初に補正（initially corrected）した一方で、結果として１〜２時間のインキュベーションにより、阻害剤が再現された。この時間枠は、混合の研究によって導入された、ＬＡまたは非マスク化抗体が関与するリン脂質結合血漿タンパク質に結合するのにかかる時間として提示される。１：１混合が、因子を欠いた試料中で、凝固時間を補正する十分なレベルの凝固因子を与えるので、凝固因子不足の可能性も除外する。希釈プロトロンビン時間（ｄＰＴ）は、正常血漿の存在下では補正しなかった。そして凝固時間の延長の増加は、正常血漿とのインキュベーションの後に観察され、これは強力なループス阻害剤を示す。
【００６２】
実施例１５
五人の正常被験者由来の血液試料を、上記の基本的な手順にしたがってインキュベートし、他の型の自己抗体の存在を蛍光顕微鏡によって試験した。これらの五人の個体からの血清および血漿試料は、本発明の指導にしたがった処理以前において、陰性であった。図１７は、Ｈｅｐ−２細胞株を用いて同定された、追加の自己抗体の特異性を列挙している。抗核小体（強皮症関連）、抗ラミン（核孔で非常に明るい）、抗ミトコンドリア（細胞質性）、および抗中心小体が同定された。この結果は、本発明の方法によって放出された自己抗体は、ＥＬＩＳＡに基づく試験以外の、異なる検出法である蛍光顕微鏡によっても検出可能であることを示している。この結果により、ａＰＬ以外の多くの型の自己抗体が、その血清および血漿が、ルーチンな実験室解析（routine laboratory analysis）において、これらの抗体に関して陰性であると試験された個体の血液中で、マスクされていることが確認される。
【００６３】
これらの結果から、より多くの自己抗体特異性が、本発明により処理された血液を試験することにより、発見されることが期待される。
【００６４】
実施例１６
正常被験者由来の血液試料を、上記の基本的な手順にしたがってインキュベートし、フローサイトメトリーおよび蛍光共役型抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて、単球との反応性に関して試験した。比較試験を、未処理プール正常ヒト血清（ＮＨＳ）、本発明で使用した同一の正常被験者由来の血清、および陽性対照ヒト血清で実施した。（処理した血液は、リンパ球および好中球との自己反応性は示さなかった。データは示していない。）図１８は、フローサイトメトリーによって定義したように、細胞の正常被験者の単球ポピュレーション（population）の、前方散乱（大きさ）および側方散乱（粒度）プロファイルを描写している。この細胞の単球ポピュレーションは、ＣＤ１４モノクローナル抗体との反応性を示すことによって確認した。図１９Ａは、ＮＨＳとの抗単球応答性を示している。示された中央値応答性（median reactivity）は、直線スケール上で、７４３．５０である。図１９Ｂは、正常被験者由来の血清の自己抗単球活性を示しており、この被験者は、自己単球に対する抗体活性を持たない。示された反応性の中央値は、７３７．００である。図１９Ｃは、本発明にしたがって処理した後、図１９Ｂで示した被験者由来の血液試料の自己抗単球活性を示している。示された中央値は、８６４．００であり、強力な自己抗単球活性を示している。本発明の教示にしたがって処理した血漿が、１／８の希釈で使用されたという事実にもかかわらず、原液のポジティブコントロールの血清でよりも、単球に対してより大きい反応性を示した。したがって、本実施例は、本発明の方法にしたがって処理した血液または血清試料が、単球を特異的に標的とする自己抗体を放出することを示している。同様の結果が、本発明の教示にしたがって処理した場合に、他の個体からの４つのさらなる試料に関して、文献となっている。
【００６５】
実施例１７
ＲＥＬＩＳＡ（登録商標）スクリーニングアッセイを用いた、抗核抗体（ＡＮＡ）の存在に関する比較試験を、未処理臍帯血；振とうせずに、本発明の方法にしたがってインキュベートした臍帯血；振とうした本発明にしたがい、処理した臍帯血；ＡＮＡ陰性の健康的なドナー（ＡＣＳとして同定された）由来の未処理血清、および本発明の方法にしたがってインキュベートした、同一のＡＮＡ陰性、および本発明の方法によって処理された健康的なドナー由来血清について実行した。図２０で示したように、顕著な量のＡＮＡが、本発明の方法によって処理した臍帯血および血清中で同定された。図１６および１７での結果から、より多くの自己抗体特異性が、本発明によって処理された血液を試験することによって、発見されるのが待たれる。
【００６６】
実施例１８
自己抗体の放出の現象における赤血球細胞の役割を理解するために、赤血球細胞を、赤血球細胞の活性を模倣しうるより単純な成分で、置き換えた実験を設計した。本実験において、赤血球細胞と活性炭を、ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）と塩化第二鉄で置き換えた。ニトロプルシドナトリウムが、強力な酸化窒素産出物（nitric oxide powder）であり、ＲＢＣがＮＯ-のキャリヤーであると知られているので、この置換を実施した。塩化第二鉄（ＦｅＣｌ3ストック溶液、２５μＭ）を、ヘモグロビン中の鉄との置換物として加えた。
【００６７】
細菌培養増殖培地と、５ｍｌのヒト血漿または血清、種々の濃度のニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ、２００μｍ）、および外因性（exogenous）の塩化第二鉄（４．１μｍ最終濃度）を含む培養ボトルを、赤血球細胞および活性炭の代わりに使用し、３７℃にてインキュベートし、ついで５６℃にて３０分間加熱した。試料は、ａＰＬのセロコンバージョンを示したが、ＩｇＧしか示さなかった（データは示していない）。
【００６８】
この結果によって、ＮＯ-が、抗体非マスク化に関与していることが示唆され、また、培養ボトル中の固相物質（solid phase material ）の機械的な作用が、赤血球細胞を分解させ、ＮＯ-を放出することが示唆された。あるいは、ＮＯの放出または修飾によって、ヘモグロビン分子を、酸化還元反応に参加できるようにしうる。
【００６９】
実施例１９
非マスク化した自己抗体の効果が、血清または血液中の、自己抗体含む巨大分子構造の分解によるのかどうか、あるいは抗体自身の結合特異性の直接的な変化によるのかどうかを決定する目的で、市販されている静脈内免疫グロブリン（ＩｖＩｇ）を、ヒト血漿または血清と置き換えた一連の実験で実施した。市販されているＩｖＩｇは、多数のドナー、一般的には１，０００〜１０，０００ドナーからの、プールした血漿のアルコール沈殿フラクションである。一般的には、ＩｖＩｇは、主にＩｇＧを含み、ＩｇＡ、ＩｇＭおよび他の血漿タンパク質は含まない。未処理ＩｖＩｇを、ＥＬＩＳＡ試験によって、自己抗体の存在について試験したときに、試験の結果は陰性である。その調製の方式のために、ＩｖＩｇはまたリポタンパク質ミセル、小胞または他の巨大分子構造を含まない。したがって、ＩｖＩｇが、インキュベーション処置の後に、自己抗体の存在に関して陽性であった場合に、自己抗体がＩｖＩｇ調製物中に、すでに存在するＩｇＧ抗体の改変によって得られたものであり、自己抗体を遮蔽する構造または小胞の破壊によるのではないと考えるべきである。
【００７０】
以下の実施例において、使用したＩｖＩｇの市販されている調製物は、凍結乾燥ＩｖＩｇ（イムノグロブリンイントラベノウス（ヒト）ガンマ−PI.V.、（Immune Globulin Introvenous （Human） Gammar-PI.V.）、アベンティスベーリング（Aventis Behring）、Kankakee、Illinois）であった。
【００７１】
５グラムの凍結乾燥ＩｖＩｇの市販されている調製物を、無菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、１００ｍｇ／ｍｌ）中に再構築した。１．７ｍｌの再構築したＩｖＩｇ溶液を細菌培養増殖培地を含む培養ボトル（赤血球細胞または活性炭なし）に加え、３７℃にて２０時間インキュベートした。インキュベートした混合物は、セロコンバージョンと、ａＰＬ ＩｇＧの存在を示した（データは示していない）。（予想したように、ＩｇＧのみが検出され、ＩｇＡまたはＩｇＭは検出されなかった。）
【００７２】
同様の実験で、自己抗体が、室温、振動バイアル中でインキュベートした混合物中で検出されたが、３７℃ほど良い結果ではなかった（結果は示していない）。
【００７３】
約３７℃でのＩｖＩｇ細菌増殖培地混合物の加熱によって、さらなる自己抗体の増加はなかった。
【００７４】
対照として、ボトルからだしたそのままのＩｖＩｇを、ａＰＬおよび他の自己抗体に関して試験したが、結果は陰性であった。
【００７５】
実施例２０
実施例１９において、自己抗体が、細菌増殖培地中の市販されているＩｖＩｇ調製物をインキュベートすることによって得られることが示された。次の段階は、細菌培養増殖培地中のどの成分が、検出可能な自己抗体を産出する役割を果たしているかを決定することを試みることである。
【００７６】
まず、２％トリプシン処理大豆ブロス（ＴＳＢ）（それぞれ大豆のカゼインの膵臓消化対パパイヤ消化の比、１７：３で、ペプトン類を含む）（残余物は水である（the remainder being water））中のＩｖＩｇを、振とうしながら、３７℃にて２０時間インキュベートした。インキュベートした混合物を、ａＰＬの存在について試験し、結果は陰性であった。
【００７７】
次に、ＩｖＩｇを、大豆ブロス、ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）およびヘミン（鉄（第二鉄）含有プロトポルフィリン）中の試験管内で、３７℃にて２０時間、振とうしながらインキュベートした。使用した量は、合計１ｍｌの大豆ブロス中、６０マイクロリットルのＩｖＩｇ、５マイクロリットルのＳＮＰ、および５マイクロリットルのヘミンであった。インキュベートした混合物は、ａＰＬ、特にａＰＳ（１５ＭｏＭ）およびａＰＥ（４１ＭｏＭ）の存在に関して陽性であると試験された（データは示していない）。
【００７８】
実施例２１
一連の実験を実施して、ヘミンのみとのインキュベーションが、ＩｖＩｇ中、血漿または血清中での自己抗体の出現を引き起こすのに十分でありうるかを決定した。
【００７９】
再構築した凍結乾燥ＩｖＩｇ（１００ｍｇ／ｍｌの濃度）を、ヘミンを含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液中に加え、３７℃にて２０時間インキュベートした。使用した量は、総量１ｍｌ中３００μｌのＩｖＩｇ溶液と５μｌのヘミン溶液（７５μｇ）であった。
【００８０】
図２１で示したように、インキュベートした混合物は、著しい量のａＰＳおよびａＰＥ ＩｇＧを示しており、それほどにはないにせよ、ａＣＬ ＩｇＧを示した。
【００８１】
血清または血漿を、同様の条件下でヘミンとインキュベートした場合、自己抗体は検出されなかった。
【００８２】
実施例２２
ＩｖＩｇをヘミンとともにインキュベートしたとき、自己抗体の存在のために、陽性の結果が得られたが、血清または血漿はヘミンとインキュベートした場合に得られた陰性の結果は、血清または血漿は自己抗体の処理を阻害または干渉する物質を含みうるということを示唆している。
【００８３】
一連の実験において、ヒト血清を漸増していった量（本発明者のもの）を、インキュベーションの前にバッチ（batch）に加えたという追加特徴で、実施例２１の工程と同様に、ＩｖＩｇをヘミンとともにＴｒｉｓ緩衝液中で、３７℃にて２０時間、インキュベートした。各分離バッチ（separate batch）を、ａＰＳ、ａＣＬ、ａＰＥおよびａＰＣ自己抗体の存在について試験し、結果を図２２に示している。図２２で示した結果は、血清の漸増していった量が、自己リン脂質抗体の放出において、阻害効果を持ったことを示している。同様の結果が、血清を血漿に置換した場合にも見られた（データは示していない）。これらの結果に対する可能な解釈は、第二鉄状態の鉄分子を含み活性酸化剤として知られているヘミンが、結合部位の改変が自己抗原への結合をできるように、特定の免疫グロブリン分子の結合部位を酸化させるために働きうるということである。この工程は、血液中の基質（substance）、おそらく抗酸化剤によって阻害されうる。
【００８４】
実施例２３
ヒト血清（本発明者のもの）を、Ｔｒｉｓ緩衝液中１／１０に希釈した。一連の実験において、１ｍｌバッチ中のこの希釈した血清を、特に、０μｌ、１０μｌ、２５μｌおよび５０μｌとともにヘミンの量を増加させ、インキュベートした。（以前に、ＩｖＩｇからのそのような放出を引き起こすのに十分であったけれども、ヘミンそれ自身は、血液または血清から、自己抗体の放出を引き起こすのに十分ではなかったことがわかった。したがって、血清を希釈する目的は、抗酸化物質のような血液中にみられ、干渉する任意の基質の効果を希釈するためである。）バッチをａＰＳ、ａＣＬ、ａＰＥおよびａＰＣ自己抗体の存在について試験し、結果を図２３に示す。図２３に示した結果は、０または１０μｌのヘミンを加えた場合には、希釈血清中で自己抗体の量が検出されず、２５μｌのヘミンで著しい量が検出されたことを示している。理由はわからないが、検出された自己抗体の量は、５０μｌのヘミンでは、少なかった。
【００８５】
実施例２４
次の一連の実験を、血液中に存在するビタミンＣのような抗酸化剤が、自己抗体の放出を阻害しうるかどうかを決定するために設計した。一連の実験において、アスコルビン酸（ビタミンＣ）の増加量を、ヘミン含有緩衝液に加え、ＩｖＩｇを添加する前および、インキュベーション前に、３０分間混合した追加特徴で、ＩｖＩｇをヘミンを含むＴｒｉｓ緩衝液中でインキュベートした。図２４に示したように、１ｍｇのビタミンＣで、ヘミン誘導によるａＰＥ放出の約７８％阻害があり、この量はビタミンＣの生理的な濃度を表している。ａＰＳ放出での二相性曲線が存在し、低濃度でのビタミンＣは酸化剤として働きえるが、高濃度では抗酸化剤（還元剤）となるという可能性が提起される。
【００８６】
実施例２５
次の一連の実験は、得られた結果において、ヘミンを溶解した賦形剤（vehicle）が得られた結果に影響を及ぼすかどうか、およびヘミン中の鉄原子が必要かどうかを決定するために設計された。一連の実験で、ＩｖＩｇを、ヘミン、または他の添加物とともに、Ｔｒｉｓ緩衝液中でインキュベートした。特に、１例として、ヘミンをＮａＯＨで可溶化した。もう１つの例としては、ＤＭＳＯにて可溶化した。他の例では、ヘミンと同様の分子であるが、鉄（Ｆｅ＋＋＋）を含まないヘマトポルフィンＩＸ（ｈｐＩＸ）を、ヘミンの代わりに使用し、ＮａＯＨまたはＤＭＳＯで可溶化した。他の例において、ＮａＯＨおよびＤＭＳＯを、対照として（ヘミンまたはｈｐＩＸなしで）試験した。図２５において示したように、ＮａＯＨ可溶化ヘミンの使用によって、自己抗体の存在について陽性の結果が得られ、一方でヘミン＋ＤＭＳＯ、ｈｐＩＸ＋ＮａＯＨ、ｈｐＩＸ＋ＤＭＳＯ、ＮａＯＨのみ、およびＤＭＳＯのみでは、陽性の結果が得られなかった。
【００８７】
実施例２６
ヘミンが、抗体の酸化を引き起こしていることをさらに確立するために、当モル量のヘモペキシン（Ｈｐｘ）を、ＩｖＩｇ ＰＢＳヘミン混合物に加えた。Ｈｐｘは、ヘム鉄に対して、並はずれて高い結合親和性を持つ抗酸化剤分子である。SciPac（Kent、England）から購入した凍結乾燥Ｈｐｘを、１０ｍｇ／ｍｌで、ＰＢＳ中に再構築した。図２６で示したものは、ＩｖＩｇＧに対するヘミンの増加の濃度と、ＩｖＩｇＧに対し、ヘミンおよびヘミンと当モル濃度のＨｐｘの増加の濃度によって計数した結果である、ａＰＳ酸化還元データである。ヘミンとＨｐｘ間の１：１結合相互作用が存在するので、Ｈｐｘが、ヘミン中に存在する第二鉄イオンの酸化還元能力を打ち消すことができた。
【００８８】
実施例２７
ＩｖＩｇの酸化処理によって得ることができる自己抗体の広い範囲および活性を例示するために、一連のウエスタンブロットを、ヘミン処理ＩｖＩｇまたは未処理ＩｖＩｇを一次抗体として使用し、抗ヒトＨＲＰタグ化共役物を対照として使用して、３つの異なる細胞株からの細胞溶解物を用いて設定した（ＨＲＰ＝ホースラディッシュペルオキシダーゼ）。ブロットを図２７に示す。「Ｂ」溶解物は、リンパ腫の患者からのRajaと呼ばれるリンパ球細胞株である。「Ｔ」溶解物は、白血病患者からの、Jurkatと呼ばれる、Ｔリンパ球由来細胞株である。Ｕ８７ＭＧ溶解物は、膠芽細胞腫細胞株（脳腫瘍）である。還元溶解物を、５０ｍｇ／ｍｌの濃度で、ゲル内に供した。ヘミン処理ＩｖＩｇ調製物を得るために、７５μｇのヘミンを、６ｍｇのＩｖＩｇＧを含む１ｍｌのＰＢＳと混和した。インキュベーションを、２０時間３７℃で実施した。図２７において、ヘミン処置ＩｖＩｇを一次抗体として用いたブロットを、「試験ＩｇＧ（Ｔｅｓｔ ＩｇＧ）」と標識し、未処理ＩｖＩｇを、一次抗体として用いたブロットを、「コントロール（Control）」と標識し、一次抗体なしで、抗ヒトＨＲＰタグ化共役物を適用したブロットを、「二次（Secondary）」と標識した。ヘミン処理および未処理ＩｇＧ調製物を、それぞれ、１／１０００で希釈した。抗ヒトＨＲＰタグ化共役物を、１／５０００の希釈で使用した。
【００８９】
これらのデータは、ヘミン処理ＩｖＩｇが、活性を持たない未処理ＩｖＩｇＧおよび共役物対照と比較して、ヒト細胞成分に対して、十分な活性をもつことを明らかに示している。
【００９０】
実施例２８
次の実験を、ヘミン以外の酸化剤、特に、鉄を含まない酸化剤が非マスク自己抗体に対して効果的でありうるかどうかを決定するために実施した。総容量１ｍｌのリン酸緩衝食塩水中の、１００μＭの濃度の２５μｇの過マンガン酸カリウム（ＫＭｎＯ4）と２ｍｇのＩｖＩｇの混合物を、３７℃にて一晩インキュベートした。インキュベート混合物中、ａＰＣおよびａＰＳが検出可能であった。ａＣＬが通常では検出されたが、ａＰＥはされなかった（データは示していない）。後に、ａＰＥが検出されなかった理由が、ＫＭｎＯ4が、ＥＬＩＳＡ試験で使用したＰＥリン脂質抗原を変更させるからであることがわかった。
【００９１】
実施例２９
自己抗体が、酸化反応によって非マスク化可能であることが示された後、次の疑問は、電源からの電動力のような電気化学的方法が同様の効果を達成可能であるかどうかであった。
【００９２】
ＩｖＩｇを、リン酸緩衝食塩水溶液中に溶解し、別個の実験で、亜鉛メッキ鋼、銅またはステンレス鋼電極を、９ボルト電池の陽極および陰極に接続し、１〜２分間溶液中に浸した。この期間、泡立ちが溶液中で確認され、ＰＢＳ溶液の色が変化した（銅ワイヤを使用した場合青色、ステンレス鋼ワイヤを使用した場合褐色、亜鉛メッキ鋼ワイヤを使用した場合緑色）。図２８Ａおよび２８Ｂで示したように、処理した溶液が、ａＰＬ依存試験にてａＰＳ、ａＣＬ、ａＰＥおよびａＰＣ自己抗体の存在下で陽性であるとわかり、また、ａＰＬ非依存試験でａＰＳ、ａＰＥおよびａＰＣ自己抗体の存在に関して陽性であった。
【００９３】
実施例３０
溶液との金属の相互作用をさけ、それによって、電流の効果のみを決定するために、黒鉛電極を、金属電極の代わりに使用した。黒鉛は不活性であるが、反応に参加することなしに、導電性溶液中に、電子を通過させることができる。
【００９４】
ＩｖＩｇを、リン酸緩衝食塩水溶液中に溶解し、６ボルト電池の陽極および陰極に接続した黒鉛電極を、６０秒間この溶液中に浸した。図２９で示したように、処理した溶液が、ａＰＳ、ａＰＥおよびａＰＣ自己抗体の存在に関して陽性であるとわかった。
【００９５】
実施例３１
リン酸緩衝食塩水中のＩｖＩｇの溶液に、電流を流すことを含む実験において、ｐＨの著しい増加が観察され、これはおそらくＮａＯＨの形成によるものである。反応を生理学的ｐＨレベルに維持するために、細胞培養培地、ＲＭＰＩを、リン酸緩衝食塩水と置換した。
【００９６】
次の一連の実験を、自己抗体の非マスク化における、電流への暴露の時間の効果を決定するために使用した。ＩｖＩｇをＲＭＰＩ中に溶解し、細胞培養培地、および６ボルト電池の陽極および陰極に接続した黒鉛電極を、時間間隔を変えて溶液中に浸した。図３０で示したように、依存ａＰＬの最大放出を、電流への暴露の６０秒後に得た。不思議なことに、２分間と４分間のあいだで、ａＰＬの量が減少したか、あるいは無くなった。
【００９７】
実施例３２
先の実験によって、ａＰＬ抗体を電流への暴露の後に、ＩｖＩｇから得ることが出来るが、ａＰＬ抗体がさらなる電流への暴露の後に消えたことが示されたので、次なる疑問は、自己抗体の非マスク化が、電流によって逆転可能であったかどうかである。すなわち、ポジティブコントロールの血清を、自己抗体がもはや検出可能ではないように処理可能であるか、どうかである。
【００９８】
別の実験において、１：４００の希釈でのａＣＬ陽性対照血清、１：７５の希釈でのａＰＥポジティブコントロールの血清、および１：４００の希釈でのａＰＳを、６ボルト電池の陽極および陰極に接続した黒鉛電極を２４０秒間まで浸すことによって電流に暴露した。図３１Ａ〜３１Ｃで示したように、それぞれのコントロールの血清は、そのそれぞれの特異性に対し陰性となった。
【００９９】
実施例３３
実施例３２での結果に基づいて、次の求められる疑問は、自己免疫疾患を患う患者の自己抗体が、患者血清を電流に暴露したときに、再マスク化されるかどうかである。ａＰＳおよびａＣＬのレベルが増加した患者からの血清を、リン酸緩衝食塩水で１／４００に希釈し（ＰＢＳ中での希釈は、１０〜１５分で、１，０００のＯＤ値を達成する量である）、６ボルト電池の陽極および陰極に接続した黒煙電極を、時間間隔を変えてこの溶液中に沈めた。図３２で示したように、自己免疫患者の血清中で検出可能なａＣＬおよびａＰＳの量は、３０秒後に著しくに減少し、２分後にはもはや観察されなかった。これらの実験を、他の患者の抗体で繰り返し、同様の結果が得られた（データは示していない）。
【０１００】
実施例３４
初期の実験で、非常に特異的で高いタイターのＩｇＡ ａＰＥを持つ患者からの血液試料を、日常的に用いられる微生物学培養ボトル中で、ヘミンに暴露した。ヘミンへの暴露の後、そのＩｇＡ ａＰＥが消えたことが観察され、ＩｇＧ ａＰＳ、ａＣＬ、およびもっとも飛躍的にＩｇＧ ａＰＥの出現が、ａＰＬ ＥＬＩＳＡで検出された。この時点で、この現象に対する説明は明らかではなかった。
【０１０１】
電流を用いるより速い非マスク化工程の開発に伴って、高いａＰＥを持つ他の患者の、より早く結果を確認することが可能になった。この実験において、高いａＰＥを持つ患者からの血清を１／７５までＰＢＳ中で希釈し、６ボルト電池の陽極および陰極に接続した黒鉛電極を、時間間隔を変えてこの溶液に浸した。図３３で示したように、ａＰＥは、６ボルトＤＣ電流適用で３０秒以内に検出されなくなり（マスク化され）、同時にａＰＳおよびａＣＬ ＩｇＧの非マスク化と検出された。新規に非マスク化されたａＰＬは、３０秒付近でピークとなり、暴露の２〜４分後に再びマスク化となった。
【０１０２】
以上の実験によって取り組んだ重要な技術的観点は、ａＰＥ患者を、アッセイで使用した血漿タンパク質希釈液から離して処理したことであり、この場合は、１０％成体ウシ血漿（ＡＢＰ）であった。示してはいない他の実験にて、希釈した患者の血清を、ＥＬＩＳＡ希釈液にて使用した血漿タンパク質を加える前に、６ボルトＥＭＦ状態に暴露した。これらの実験の重要な観点は、ＥＭＦ効果が、患者の抗体に適用されており、希釈液中で使用した血漿タンパク質中のＥＭＦ変化には適用していないことを示すことである。
【０１０３】
これらの実験データは、酸化還元反応が、異なる抗体特異性の出現および消失を決定しているという所見を支持する。これらの実験からまた学んだことは、酸化還元効果が、抗体結合部位（群）、抗体分子のＦａｂ部位に限定されるように見えることである。このことは、ＥＬＩＳＡで使用した異種抗ヒト抗体標識共役物（heterologoous antihuman antibody-labeled conjugates）が、抗体分子の異なる抗体重鎖標的（Ｆｃ部位）を認識し続けている共役物として影響されなかったからである。したがって、ヒト抗体が、酸化還元によって消費されず、破壊されないので、最も説得力のある説明としては、抗体分子のＦａｂ部位中の抗体結合部位が、酸化／還元過程において参加可能な接近可能な電子（accessible electrons that can participate in the oxidation/reduction process）を含む、というものである。
【０１０４】
実施例３５
次の実験は、自己抗体以外の血漿タンパク質が、酸化−還元によって改変した結合特異性を持ちうるかどうかを見るために実施された。これらの実験において、１０％成体ウシ血漿（ＡＢＰ）溶液、タンパク質依存性のａＰＬ結合を決定するために使用したリン脂質結合タンパク質を含む同様の溶液を、時間間隔を変えて、６ボルト電池からの電流に暴露した。ＥＬＩＳＡに用いた処理したＡＢＰ試料を、ついで、ＡＢＰの処置がＥＬＩＳＡの結果に影響を与えるかを見るために、ａＰＳ、ａＣＬおよびａＰＥ陽性患者の血清で、アッセイした。図３４で示したように、時間ゼロ（未処理ＡＢＰ）で、陽性患者の血清は、いつもＡＢＰ中でａＰＬ応答性を示す。１０％ＡＢＰを、長期間、酸化−還元に暴露（ＥＭＦ）した場合、検出されたａＰＬの量は減少し、２分後では、ａＰＥ陽性血清はもはや陽性ではない。これらの結果は、患者のａＰＬ応答性に反応する血漿タンパク質が、電流への暴露によって改変されることを示唆している。たとえば、キニノゲンは、ａＰＥ依存的な反応で陽性ＥＬＩＳＡシグナルを与えるのに関与している血漿蛋白質であるが（キニノゲンはＰＥに結合し、ついで抗体がキニノゲンに結合する。しかしながら、ａＰＥは、ＰＥまたはキニノゲンに、非依存的には結合しない）、このことは、ＡＢＰ試料中のキニノゲンが、酸化還元暴露によって変更されていることを示している。ａＣＬはまた、２４０秒間暴露にて陰性であり、この患者の血清が、ａＰＬ ＥＬＩＳＡにて陽性シグナルを産出するために、プロトロンビンおよび／またはベータ２糖タンパク質（または両方が関与しうる）いずれかを要求するので、これらの２つのタンパク質は、酸化還元反応によって変更されたに違いない。同様の２つの血漿タンパク質が、ａＰＳ試料中に含まれる。
【０１０５】
明らかに、本発明の多くの改変および変化は、上記教示に関して可能である。したがって、付随する請求項の範囲内で、本発明は、特に記述された以外にも実施しうることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】下記記述の多くの実施例にて使用した、イン−ハウス（in-house）酵素免疫測定アッセイ（ELISA）によってアッセイした、特定の抗リン脂質抗体（ａＰＬ）を列記している表である。
【図２】実施例の最初の項目で記述した方法にしたがって、インキュベートした、正常なａＰＬ陰性被験者由来の血液試料に関する、ａＰＬアッセイ結果を要約している表である。
【図３】実施例の最初の項目で記述した方法にしたがって、インキュベートした、７人の正常ａＰＬ陰性個体由来の血液試料のａＰＬアッセイ結果を要約している構成表である。
【図４】手順中ヒトＲＢＣをウマ赤血球細胞（ＲＢＣ）で置換したことを特徴とし、実施例の最初の項目で記述した方法にしたがってインキュベートした正常ａＰＬ陰性被験者からの血清試料についての、ａＰＬアッセイ結果を要約している表である。
【図５】ウマ血清をヒト血清の代わりに使用したことをのぞいて、実施例の最初の項目で記述した方法にしたがって、実施した血清試料のインキュベーションのａＰＬアッセイ結果を要約している表である。
【図６】インキュベーションを、室温（２２℃）にて実施したことをのぞいて、実施例の最初の項目で記述した方法にしたがって、インキュベートした正常ａＰＬ陰性被験者由来の血液試料についてのａＰＬアッセイ結果を要約している表である。
【図７】０．７ｍｍ Degalan（プラスチック）ビーズを、インキュベーション混合物中、粒子個体として使用した特徴で、実施例の最初の項目で記述した方法にしたがってインキュベートした、正常ａＰＬ陰性被験者からの血液試料に関する、ａＰＬアッセイ結果を要約している表である。
【図８】インキュベーション混合物を、振とうまたは振動するかわりに、静止させたままにした以外は、実施例の最初の項目で記述した方法にしたがってインキュベートした正常ａＰＬ陰性被験者由来の血液試料についてのａＰＬアッセイ結果を要約している表である。
【図９】インキュベーション混合物を、５６℃まで３０分間加熱した特徴で、実施例の最初の項目で記述した方法にしたがってインキュベートした、正常ａＰＬ陰性被験者由来の血液試料についてのａＰＬアッセイ結果を要約している表である。
【図１０】異なる供給業者（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）、Sparks、Md）からの細菌培養増殖培地を、Biomerieuxからの細菌培養増殖培地の代わりに使用したことを特徴とし、実施例の最初の項目で記述した方法にしたがってインキュベートした、正常ａＰＬ陰性被験者由来の血液試料についてのａＰＬアッセイ結果を要約している表である。
【図１１】インキュベーションを、嫌気性条件下で実施したことを特徴とし、実施例の最初の項目で記述した方法にしたがってインキュベートした、正常ａＰＬ陰性被験者由来の血液試料について、ａＰＬアッセイ結果を要約している表である。
【図１２】Ｋ５６２細胞（ヒト腫瘍細胞株）をＲＢＣの代わりに用いたことを特徴とし、実施例の最初の項目で記述した方法にしたがってインキュベートした正常ａＰＬ陰性被験者由来の血清試料についてａＰＬアッセイ結果を要約している表である。
【図１３】細菌培養増殖培地からヒト細胞を増殖するために用いた細胞培養培地で置き換えたことを除いて、正常ａＰＬ陰性被験者由来の血液試料についてのａＰＬアッセイ結果を要約している表である。
【図１４】正常のａＰＬ陰性母親および幼児からの臍帯血試料についてのａＰＬアッセイを要約している表である。
【図１５】ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）を、インキュベーション混合物中でＲＢＣの代わりに用いたことを特徴とし、実施例の最初の項目で記述した方法にしたがってインキュベートした正常ａＰＬ陰性被験者由来の血液試料についてのａＰＬアッセイ結果を要約している表である。
【図１６】実施例の最初の項目で記述した方法にしたがってインキュベートした、血液試料に関する、ループス抗凝固活性の結果を要約している表である。血液試料は、その血液が、本発明の工程によるセロコンバージョンの前に、ループス抗凝固は陰性である対象から得た。
【図１７】実施例の最初の項目で記述した方法にしたがってインキュベートする、血液試料中で同定された、他の型の自己抗体を列記している表である。列記した抗体は、免疫蛍光顕微鏡によって同定した。
【図１８】フローサイトメトリーによって、密度勾配分離したヒト白血球細胞に関して定義した、細胞の単球集団の、前方散乱（大きさ）および側方散乱（粒度）プロファイルを示しているグラフである。
【図１９Ａ】プールした正常ヒト血清（ＮＨＳ）の単球応答性を示しているフローサイトメトリーヒストグラムである。ヒストグラム中に、存在するならば、抗体活性を、水平軸にそって中央チャネル値（ログスケール）でのシフトによって測定した。
【図１９Ｂ】単一な正常被験者由来の血清の単球応答性を示しているフローサイトメトリーヒストグラムである。ヒストグラム中に、存在するならば、抗体活性を、水平軸にそって中央チャネル値（ログスケール）でのシフトによって測定した。
【図１９Ｃ】実施例の最初の項目で記述した方法にしたがって処理した図１９Ｂで示した被験者由来の血液試料の、単球応答性を示しているフローサイトメトリーヒストグラムである。ヒストグラム中に、存在するならば、抗体活性を、水平軸にそって中央チャネル値（ログスケール）でのシフトによって測定した。
【図１９Ｄ】陽性対照血清の単球活性を示しているフローサイトメトリーヒストグラムである。ヒストグラム中に、存在するならば、抗体活性を、水平軸にそって中央チャネル値（ログスケール）でのシフトによって測定した。
【図２０】ＲＥＬＩＳＡ（登録商標）スクリーニングアッセイを用いて、種々の試料の、抗核抗体（ＡＮＡ）試験の結果を要約している表である。
【図２１】トリス緩衝液中で、ヘミンとともにインキュベートした、ＩｖＩｇの試料に関する、ａＰＬアッセイ結果を要約している表である。
【図２２】調製物に加えた、ヒト血清（μｌ）の量に応じて、ヘミンとともにインキュベートした、連続ＩｖＩｇ調製物中で検出された、（光学密度、ＯＤによって測定されたような）ａＰＳ、ａＣＬ、ａＰＥおよびａＰＣの量を示しているグラフである。
【図２３】ヘミン（μｌ）の量に応じて、ヘミンとともにインキュベートした調製物に加えた一連のヒト血清調製物中で検出された（光学密度、ＯＤによって測定されたような）ａＰＳ、ａＣＬ、ａＰＥおよびａＰＣの量を示しているグラフである。
【図２４】調製物に加えたビタミンＣ（μｌ）の量に応じて、ヘミンとビタミンＣとともにインキュベートした、連続ＩｖＩｇ調製物中で検出された、（多重平均、ＭｏＭｓによって測定されたような）ａＰＳ、ａＣＬ、ａＰＥおよびａＰＣの量を示しているグラフである。
【図２５】ＮａＯＨ可溶化ヘミン、ＤＭＳＯ可溶化ヘマトポルフィリンＩＸ（ｈｐＩＸ）、ＮａＯＨ可溶性ｈｐＩＸ、ＮａＯＨのみ、ＤＭＳＯのみ、およびＤＭＳＯ可溶性ヘミンとともにインキュベートした、連続ＩｖＩｇ調製物中で検出された、（多重平均、ＭｏＭｓによって測定されたような）ａＰＳ、ａＣＬ、ａＰＥおよびａＰＣの量を示しているグラフである。
【図２６】増加ヘミン量、および増加ヘミンおよびヘモペキシン（ｈｐｘ）とともにインキュベートした一連のＩｖＩｇ調製物中で検出された、（光学密度、ＯＤによって測定されたような）ａＰＳの量を示しているグラフである。
【図２７】抗ヒトＨＲＰタグ化共役物を対照として使用したブロットとともに、一次抗体として使用したヘミン処理ＩｖＩｇおよび未処理ＩｖＩｇで、３つの細胞溶解物を得たウエスタンブロットを示している。
【図２８】図２８Ａおよび２８Ｂは、９ボルト電池に接続した電極を、ＩｖＩｇを含むリン酸緩衝食塩水溶液中に２分間浸した、一連のＩｖＩｇ調製物中で検出した（多重平均、ＭｏＭｓによって測定されたような）ａＰＬ非依存性およびａＰＬ依存性ａＰＳ、ａＣＬ、ａＰＥおよびａＰＣの量を示しているグラフである。
【図２９】６ボルト電池に接続した電極をＩｖＩｇを含むリン酸緩衝食塩水溶液中に６０秒間浸した、一連のＩｖＩｇ調製物中で検出した、（多重平均、ＭｏＭｓによって測定されたような）ａＰＳ、ａＣＬ、ａＰＥおよびａＰＣの量を示しているグラフである。
【図３０】浸す時間に応じて、６ボルト電池に接続した電極を、ＩｖＩｇを含むリン酸緩衝食塩水溶液中に浸した、一連のＩｖＩｇ調製物中で検出した（多重平均、ＭｏＭｓによって測定されたような）ａＰＳ、ａＣＬ、ａＰＥおよびａＰＣの量を示しているグラフである。
【図３１Ａ】６ボルト電池に接続した電極へ、２４０秒間の暴露前後で、対照溶液中で検出された、それぞれ（多重平均、ＭｏＭｓによって測定されたような）ａＣＬの量を示しているグラフである。
【図３１Ｂ】６ボルト電池に接続した電極へ、２４０秒間の暴露前後で、対照溶液中で検出された、それぞれ（多重平均、ＭｏＭｓによって測定されたような）ａＰＳの量を示しているグラフである。
【図３１Ｃ】６ボルト電池に接続した電極へ、２４０秒間の暴露前後で、対照溶液中で検出された、それぞれ（多重平均、ＭｏＭｓによって測定されたような）ａＰＥの量を示しているグラフである。
【図３２】ａＰＳおよびａＣＬ陽性患者のＰＢＳ希釈血清中で検出した、（多重平均、ＭｏＭｓによって測定されたような）それぞれ、ａＰＳおよびａＣＬの量を示しているグラフである。この実験で、６ボルトの電池に接続した黒鉛電極を、様々な時間量で希釈血清中に浸した。
【図３３】ａＰＥ陽性患者のＰＢＳ希釈血清中で検出された、それぞれ、（多重平均、ＭｏＭｓによって測定されたような）ａＰＳ、ａＣＬ、ａＰＥおよびａＰＣの量を示しているグラフである。この実験で、６ボルトの電池に接続した黒鉛電極を、様々な時間量で希釈血清中に浸した。
【図３４】ａＰＥ陽性患者のＰＢＳ希釈血清中で検出された、それぞれ、（光学密度、ＯＤによって測定されたような）ａＰＳ、ａＣＬ、およびａＰＥの量を示しているグラフである。この実験で、タンパク質依存ａＰＬ結合の決定において使用した１０％成体ウシ血漿（ＡＢＰ）を、様々な時間量で、ＡＢＰ中に、６ボルト電池に接続した黒鉛電極を浸すことによって処置した。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００３年６月９日に出願された、米国特許仮出願明細書番号第６０／４７６，６０７号の出願日の優先権を主張する。仮出願明細書は、これを参照することによって本明細書中に組み込まれている。
【０００２】
本発明は、酸化還元反応により改変されうる結合特異性を持つ血漿タンパク質の結合特異性を改変する方法に関する。本発明はさらに、正常な被験者の血液、血清または血漿中に生来存在する自己抗体を非マスク化することにより、自己抗体を得る方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
「自己免疫疾患（autoimmune disease）」という語句は、免疫システムが誤って自分自身の体の細胞、組織および器官を攻撃する疾患の一群を指す。一般的に、自己免疫疾患は、一般的なタンパク質および脂質のような、体自身の成分に結合する抗体が関与する。自己化合物（またはより一般的には、あまりに共通しているので全ての生物でみられる化合物）に対して結合する抗体が、自己抗体と呼ばれる。例として、リン脂質および／またはリン脂質結合性血漿タンパク質に結合する自己抗体が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、深部静脈血栓症および反回動脈血栓症、肺塞栓、再発性流産、血小板減少症、舞踏病、てんかん、青色皮斑、特発性肺高血圧、リウマチ状態および多くの膠原病のような疾患に関連する。自己抗体に関連した他の疾患には、多発性硬化症、クローン病、円板状エリテマトーデス、橋本甲状腺炎、乾癬、糖尿病およびリウマチ関節が含まれる。約８０の異なる自己免疫疾患があり、集団的に、これらの疾患は、数百万人が罹患している。
【０００４】
自己免疫疾患の病因に関する従来の理論は、これらの疾患は、疾患個体（individual）中の自己抗体の過剰産出によって引き起こされ、恐らく、自己抗体等をコードしている遺伝子の過剰発現による、というものである。この理論によると、罹患している個体の血液は、疾患を引き起こす特定の自己抗体が高いレベルを有し、一方で、正常の個体からの血液には、自己抗体が全く含まれないか、または非常に少ない量である。この理論は、自己免疫疾患を罹患している被験者からの血液または血液産物中に多量の自己抗体が見かけ上、検出可能であり、一方、自己免疫疾患を持たない被験者からの血液または血液産物中では、まったく検出されない、または最小の量の自己抗体しか検出されないという従来のアッセイによって支持される。
【０００５】
本発明は、正常の個体からの血液には、事実、広い範囲の種類と特異性において著しい数の自己抗体が含まれるという、本明細書で報告された、驚くべき発見に基づいている。血液または血液産物を酸化によって、本明細書に記述した方法に従い、たとえば、酸化剤または電流により処理すれば、正常の個体の血液または血液産物から、これらの自己抗体を検出し、単離することが可能である。正常な血液中の著しい量の自己抗体の発見は、いままでに報告されておらず、本発明者の知る限りでは、そのような自己抗体が、正常な血液中に著しい量で存在することは、本発明以前には、完全に未知であった。
【０００６】
どんな特定の理論にも固執することなく、自己免疫疾患の症状を持たない個体から得た正常の血液を操作することで、自己抗体を得ることが可能であるならば、正常者の免疫系が、これらの自己抗体を日常的に作製し、循環させているのに違いないが、何らかの方法でこれらはその中へマスクされるか、ブロックされるか、または任意の有害な効果をもつことを防止していることは明らかである。
【０００７】
正常個体中での、著しい量の自己抗体の発見によって、自己抗体が、（典型的には、その対応する抗原に対する抗体の結合に基づく）標準のアッセイでなぜ検出されないのか、およびなぜ自己抗体が、正常個体における疾患症状を引き起こさないのか、という疑問がわいてくる。
【０００８】
本明細書にて記述した以前の実験に基づいて、自己抗体が、通常のスクリーニング手順で、そのような抗体が検出されることなく、そしてそのような抗体が疾患を引き起こすこともなく、正常の血液に含まれるのか、という初期の仮説の解釈は、正常個体中に自己抗体が産生された後に、何らかの形で、それらが隔離された、というものである。隔離は、たとえば、自己抗体を封鎖し、血流の他の成分から分離した状態を保つ能力を持つ低密度または高密度リポタンパク質（ＬＤＬ、ＨＤＬ）のような巨大分子、または他の型の微粒子、小胞またはミセルの形態であり得る。このような理論では、自己免疫疾患は、自己抗体それ自体の産出によってではなく、自己抗体を隔離している巨大分子（macromolecules）、微粒子（microparticles）、小胞またはミセルの破壊、崩壊または形成不全によって、ひきおこされうる。この理論は、自己抗体が、振とうおよび加熱を含む試料のきわめて過烈な操作の後に、血液または血清試料から得ることができた、以前の実験によって支持されるようである。
【０００９】
しかしながら、本明細書で記述するように、その後の実験において、血液または血液産物を、酸化剤またはＤＣ電流に暴露するような、本発明のより単純な方法で、正常血液から自己抗体を得るのに十分であり得ること、およびこの工程が可逆的であることが示された。さらに、自己抗体が、任意のタイプの存在物（entity）を隔離している巨大分子を含まない、市販されているＩｖＩｇ産物を処理することによって得ることができることが発見された。これらの実験に基づいて、そのような抗体が通常のスクリーニング手順で検出されることなく、そしてそのような抗体が疾患を引き起こすことなく、どのようにして正常血液が自己抗体を有するのかに関しては、よりあり得る理論は自己抗体が他の抗体とともに自由に循環しているが、自己抗体の抗原結合部位が正常個体において、どうにかしてブロックされるか不活性化される、というものである。このような理論では、自己免疫疾患は、酸化によって自己抗体の抗原結合部位を取り去る（unblock）ことで引き起こされうる。さらに、この理論は、特定の血漿タンパク質の結合特異性が改変されうるという、より一般的な機構を示唆している。
【００１０】
本発明の基礎を形成している発見の即時的な実用は、得られる自己抗体のほとんど制限のない供給を与え、自己抗体が、自己免疫および他のａＰＬ関連疾患の実験室診断用の診断キットで、標品として使用可能である。以前は、自己免疫疾患または標準的なアッセイで、自己抗体が陽性である個体から、自己抗体は得られると考えられているために、商業的利用の大量の自己抗体を集めることは、困難であった。個々の患者の静脈切開術から得ることが出来る、または自己抗体に関して試験陽性と判明している、患者の群からの血液をプールすることによって得ることが出来る、そのような血液の量は限られている。米国特許第５，８８５，７９３号で記述したような、ファージライブラリーをスクリーニングすることのような、自己抗体を得る他の方法も、難しく、多大な時間がかかりうる。
【００１１】
マスクされた抗体の存在または存在しないことに関して、血液試料を試験することは、特定の個体における酸化ストレスに続いて、どんな抗体が現れるかを予兆、または予期しうるので、重要な診断的価値がある。
【発明の開示】
【００１２】
酸化還元状態の変化によって改変可能な結合特異性を持つ、血漿タンパク質の結合特異性を変更する方法を提供することが、本発明の目的である。
【００１３】
正常の個体由来の血液、血清または血漿から自己抗体を得る方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００１４】
前記被験者における自己抗体を不活性化するのに十分な抗酸化剤を、被験者に、投与することによって、自己免疫疾患を持つ被験者を処置する方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００１５】
自己免疫疾患を持つ被験者を、前記被験者の自己抗体を体外で不活性化することによって、処置する方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００１６】
結合特異性を改変するのに十分な酸化剤またはＤＣ電流を暴露した、少なくとも１つのタンパク質が含まれる生体液、または生体液のタンパク質含有抽出物からなる産物を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００１７】
ルーチン臨床アッセイにおいて、自己抗体の存在に関してテスト陰性である１人またはそれ以上の個人由来の、血液、血漿または血清が、自己抗体の存在を示すように処置された当該血液、血漿または血清試料を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００１８】
循環タンパク質の結合特異性の改変をもたらす酸化剤や直流電流（ＤＣ）を生体液または生体液の抽出物中のタンパク質に暴露させて、タンパク質の酸化還元状態の変化おこすことで改変されうる結合特異性の結合部位を持ち、生体液またはタンパク質を含む生体液の抽出物中に少なくとも一つの循環タンパク質の結合特異性を改変する方法によって、これらと他の目的を達成される。
【００１９】
目的はさらに、液体培地中に懸濁または溶解した、少なくとも１つの血漿タンパク質を含む組成物を与える方法であって、前記血漿タンパク質の結合特異性に改変を起こし得るのに十分な、酸化剤またはＤＣ電流に暴露することで、酸化還元状態の変化し、改変されうる結合特異性をもつ血漿タンパク質からなる方法により、達成される。
【００２０】
他の実施形態において、本発明は、生体液または生体液の抽出物由来の自己抗体または他のマスクされた循環タンパク質、前記自己抗体または他のマスクされた循環タンパク質が、抗原またはリガンドに結合可能になるように、前記自己抗体または他のマスクされた循環タンパク質の結合特異性を改変するのに十分な酸化剤またはＤＣ電流に暴露すること、それによって、生体液または生体液の抽出物から検出可能および回収可能になること、および自己抗体または他のマスクされた循環タンパク質を、生体液から回収することによって、生体液から、または生体液の抽出物から、自己抗体または他のマスクされた循環タンパク質を得る方法に関する。
【００２１】
他の実施形態において、本発明は、自己免疫疾患を持っている被験者に、被験者中の自己抗体を不活性化するのに十分な量の抗酸化剤を投与することによって、自己免疫疾患を処置する方法に関する。自己免疫疾患を患っている個体の処置には、非マスク化タンパク質を減少させ、マスクされたタンパク質として置換するために、血液の体外処理が含まれうる。
【００２２】
他の実施形態において、本発明は、正常者の生体液または抽出物に、どの自己抗体がマスクされているかのスクリーニング方法に関し、つまり酸化および起電力により、暴露される、または非マスク化された場合、個体の自己免疫疾患を引き起こす自己抗体の、可能性のある抗体プロファイルを構築することに関する。
【００２３】
特定の非限定例として、血液、血漿または血清、または抽出物から自己抗体が検出と回復可能なように、血液、血漿または血清、または免疫グロブリン混合物のような血液抽出物を、前記血液、血漿、血清または抽出物中に含まれる少なくとも１つの自己抗体の結合特異性の改変を引き起こす酸化剤またはＤＣ電流に暴露しうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、生体液または生体液の抽出物中の、少なくとも１つの血漿タンパク質または循環タンパク質の結合特異性を改変する方法に関する。
【００２５】
本明細書で使用するところの語句「循環タンパク質（circulating protein）」および「血漿タンパク質（plasma protein）」は、動物の循環系にて天然に存在するタンパク質を意味する。循環タンパク質の例には、抗体および他の血漿タンパク質が含まれる。本発明の方法は、全ての血漿タンパク質または循環タンパク質に普遍的に利用されるということを意味しないが、該タンパク質の酸化還元状態の変化によって改変可能である結合特異性がある特性が任意の血漿タンパク質または循環タンパク質に利用されるということが理解されるべきである。この特性を持つ自己抗体のような循環タンパク質が存在するという、本発明者らの発見は、本発明の基礎を形成する。酸化還元状態での変化によって、変更可能である結合特異性を持つと発見された非抗体タンパク質の例には、キニノゲン（kininogen）およびプロトロンビン（prothrombin）および／またはベータ２糖タンパク質（beta2 glycoprotein）が含まれる。
【００２６】
語句「マスクされた循環タンパク質（masked circulating protein）」は、正常の個体中で血液に存在するが、その結合部位が、正常の個体内または正常の個体から取られた試料中では、マスクされているか、またはブロックされているか、あるいは抗原の結合から保護されているので、レセプター−リガンド結合にもとづく従来の結合アッセイによって検出不可能であり、そして、マスクされた循環タンパク質を含む試料を、本発明の方法にしたがった酸化剤または電流に暴露することなどによって、その酸化還元状態を変化させることによって処理する場合に抗原に結合可能になり、それによって試料中で検出可能になる「循環タンパク質」を命名し、説明するために、本発明に新たに造語した。マスクされた循環タンパク質の例は、自己抗体である。本発明者らによって発見されたように、正常の血液中に、著しい量の自己抗体が循環しているが、これらは、抗体−抗原結合に基づく典型的なアッセイで検出されない。本明細書で議論したように、自己抗体の結合特異性を変更するのに十分な酸化−還元条件下に自己抗体を供した場合に、自己抗体は、検出可能および回復可能になる。酸化によって非マスク化される自己抗体には、抗リン脂質、抗核小体（強皮症関連（scleroderma associated））、抗ラミン（核孔で非常に明るい（very bright at nuclear pores））、抗ミトコンドリア（細胞質性（cytoplasmic））、および抗中心小体抗体が含まれる。さらに、最初にＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス（hepatitis C virus））については陰性とされ、本発明にしたがった処置の後に、ＨＣＶについて陽性であるとされる、血液、血清またはＩｖＩｇ試料が存在することがわかり、このことは、正常な個体が、その循環内に、マスクされた抗ＨＣＶ抗体を持つことを示唆している。
【００２７】
語句、タンパク質の「結合特異性を改変（altering the binding specificity）」は、酸化または還元などによって、タンパク質が改変または変化し、先には特異的に結合不能であった抗原またはリガンドの特異的な結合が可能になる、または先には特異的に結合可能であった抗原またはリガンドの結合が不可能になる過程を意味する。語句「非マスク化（unmasking）」は、マスクされた循環タンパク質の結合特異性が改変され、前記タンパク質が、改変された結合特異性の為に、結合アッセイによって検出可能になる過程を意味する。
【００２８】
語句「自己抗体（autoantibody）」は、動物の免疫系によって産出される、そして、自己−抗原、すなわち、動物それ自身によって産出された化合物または抗原に結合する、任意の天然に存在する抗体を意味する。
【００２９】
語句「生体液（biological fluid）」には、血漿、血清および全血、唾液、尿、乳および他の分泌物を含む、循環タンパク質を含む任意の体液が含まれる。語句「生体液のタンパク質含有抽出物（protein-containing extract of any biological fluid）」は、免疫グロブリンフラクションのような、生体液から回収または分離された任意の調製物を意味する。本発明で使用しうる血液、血清または血漿は、個体から新鮮に入手でき、または血液銀行または他の血液収集機関から得たプールした血液または血漿調製物のような供給源から得てよい。本発明の目的のために、血液、血清または血漿はまた、期限切れ、または血液銀行または血液収集機関によって標準以下であると分かったコレクションであっても良い。この記述は、ヒト血液、血漿および血清に焦点をあてているが、本発明の同一の工程を動物血液に応用可能であり、獣医学に関する目的に、類似の動物抗体を得ることになる。好ましくは、前記血液、血漿または血清中に含まれうる抗酸化剤の効果を減少させるために、本発明の方法にて使用した血液または血清は、希釈する。
【００３０】
本発明の方法において、生体液中の少なくとも１つの循環タンパク質または血漿タンパク質の結合特異性は、前記タンパク質を酸化剤または電流に暴露することによって改変される。たとえば、蛋白質が非マスク化されるために、つまり本方法が実施される前に、蛋白質が結合不能であった抗原に、結合可能になるために、マスク化した循環タンパク質の結合特異性が変わり得る。その結合特異性が改変されたタンパク質は、ついで、特異的結合に基づいた任意の分離方法によって単離、および回収（recover）しうる。
【００３１】
酸化剤を使用して本発明を実施する場合、酸化剤は、生物学的分子の酸化還元状態を変化可能である任意の化合物でありうる。より特異的には、酸化剤は、電子供与体として働く他の分子に対して、電子受容体として働くことによって還元される能力のある分子である。酸化剤の例には、限定はしないが、ヘミン（hemin）、クロロフィル、または強酸化金属（strong oxidizing metal）を含む他の環状化合物、および過マンガン酸カリウム（ＫＭｎＯ4）が含まれる。典型的には、酸化剤を使用する際、生体液または抽出物と酸化剤の混合物とを、一定時間、典型的には、約１日〜一晩インキュベートしなければならない。酸化剤は、改変可能な結合特異性を持つタンパク質の結合特異性を改変するのに十分な濃度で、しかし、タンパク質を破壊しない濃度で使用すべきである。自己抗体の場合、異なる種類の自己抗体が、異なる抗酸化剤と、異なって相互作用しうる。たとえば、ａＰＣ自己抗体の非マスク化に関では、ヘミンは良い結果ではないが、ＫＭｎＯ4は非常に良い結果である。
【００３２】
ＤＣ電流を使用して、本発明を実施する場合、本方法は、処置すべき試料を含む導電性溶液中に、陽極および陰極電極を浸すような、任意の電流を伝達する方法によって実施しうる。典型的には、生体液を含む溶液を、改変可能な結合特異性を持つタンパク質の結合特異性を改変するのに、十分な大きさ（magnitude）、および十分な期間の電位に暴露しうる。陽性の結果が、溶液を、数秒間〜数分間、６〜２４ボルトの電位に暴露することによってえられうることがわかった。実施例で議論するように、電流への長期の暴露で、結合特異性の改変は可逆的となる。
【００３３】
ＡＣ電流を用いて、陽性の結果を得る試みは失敗に終わった。
【００３４】
特定の理論に関与することなく、自己抗体の場合、この自己抗体のＦａｂ部位中の抗原結合部位を酸化するのに十分な量、または時間で、酸化剤または電流に自己抗体を暴露することが好ましい。
【００３５】
対象の特定のタンパク質が、酸化還元状態での変化で改変しうる結合特異性をもつタンパク質か、そうでないか、および対象の特定のタンパク質の結合特異性を変更するための任意の組の条件の効果は、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または他のリガンド−レセプターアッセイによって簡単に決定しうる。酸化還元状態がタンパク質の結合特異性を変えうるか、そうでないかを見るために、タンパク質を酸化還元状態に供した前および後において、そのようなアッセイを実施した。たとえば、特異的自己抗体を回復するのに最適な酸化剤は、単純な実験によって、簡単に決定可能である。
【００３６】
本発明のさらなる観点は、自己免疫疾患を罹患している被験者に、被験者中の自己抗体を不活性化するために十分な量の抗酸化剤を投与すること、または前記被験者より血液試料を採取し、前記血液試料を、前記血液試料中の自己抗体を不活性化するのに十分な抗酸化剤または電流に暴露すること、および血液試料を対象に戻すことのいずれかによって、処置する可能性である。
【００３７】
本発明のさらなる観点は、自己抗体がマスクされているかどうか、個体において自己免疫疾患を惹起する自己抗体の可能性がある抗体のプロファイルを構築できるか、を決定するために、各個体の生体液または抽出物をスクリーニングする方法である。概括的にいうと、被験者由来の血液、血漿、血清試料を、試料中に検出可能であった自己抗体の量、および／または型を決定するために、アッセイし得る。したがって、被験者由来の血液、血漿、血清は、酸化剤またはＤＣ電流に暴露することで処理され得る、そして前記処理された試料において検出可能な自己抗体の量および／または型を決定するために、前記処理された被験者ゆらいの血漿または血清はアッセイされ得る。したがって、治療工程の前に試料中に検出可能な自己抗体の量および／または型を、治療工程後の試料中の検出可能な自己抗体の量および／または型と比較可能である。
【００３８】
未処理の血液、血漿、血清またはＩｖＩｇ試料、および本発明の方法にしたがって処理した血液、血漿または血清またはＩｖＩｇ試料を凍結乾燥および輸送または保存が可能であることがわかった。試料を再構成するときに、各個の活性を保持する。
【実施例】
【００３９】
本発明を記述するにあたって、以下の実施例が、本発明を実施するために現在知られている最良の態様を含む、本発明の特定の利用を例示するために与えられる。実施例は、ほぼ年代順で示しており、本発明の効果を達成するために必要な成分および手順の理解の進展を示している。これらの特定の実施例は、本明細書に記述した本発明の範囲を限定するものではない。
【００４０】
他に言及しない限り、本明細書で記述した実施例１〜１７のそれぞれに関して、以下の手順が一般的に使用された。正常ａＰＬ陰性被験者由来の、１０ｍｌの全血試料、または５ｍｌの血清または血漿、および４〜５ｍｌのパック（packed）された哺乳類赤血球細胞を、３０ｍｌのビオメリュー（Biomerieux）ブランドの細菌培養増殖培地（少なくとも以下の成分を含む：蒸留水、ダイズ−カセイン消化ブロス、酵母抽出物、デキストロース、スクロース、ヘミン、メナジオン（ビタミンＫ３）、ピリドキサールＨＣｌ（ビタミンＢ６）、およびポリアンエトレスルホネートナトリウム（ＳＰＳ）および活性炭（charcoal））を含むバイアルに加えた。ついで、この混合物を、３７℃、１８〜２２時間で振とう（rocking）ないし振動（shaking）しながらインキュベートした。インキュベーションおよび遠心分離（centrifugation）に続き、インキュベートした血液または血清／ＲＢＣを、２４の別個のａＰＬ試験結果を与える包括的イン−ハウスＥＬＩＳＡ（Comprehensive in-house ELISA）ａＰＬフォーマットを用いて、抗リン脂質抗体（ａＰＬ）の存在を試験した。試験手順は、以下の文献に、より詳しく記述され、その文献は本明細書に、組み込まれている。Wagenknecht DR他、「抗リン脂質抗体アッセイの進化、評価および解釈（Evolution, Evaluation and Interpretation of Antiphospholipid Antibody Assays）」Clinical Immunology Newsletter, Vol.15, No.2／3（1995）pp.28-38、およびMcIntyre JA他、「ボランティア血液ドナー中の抗リン脂質抗体（ａＰＬ）の頻度および特異性（Frequency and Specificities of Antiphospholipid Antibodies（aPL）in Volunteer Blood Donors）」、Immunobiology 207（1）:59-63,2003。
【００４１】
図１は、包括的イン−ハウスＥＬＩＳＡ（Comprehensive in-house ELISA）ａＰＬフォーマットを用いて試験した２４の別個のａＰＬ特異性を示している。４つの特異性 １）ａＰＳ＝抗ホスファチジルセリン、２）ａＣＬ＝抗カルジオリピン、３）ａＰＥ＝抗ホスファチジルエタノールアミン、および４）ａＰＣ＝抗ホスファチジルコリン、が評価された。これらのａＰＬ特性のそれぞれに関し、３つの免疫グロブリンアイソタイプ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭを探索した。各特異性および各アイソタイプを、それぞれ緩衝液に希釈したサプリメント（supplement）、１０％成体ウシ血漿（ＡＢＰ）（リン脂質結合血漿タンパク質を含む）、または１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、リン脂質結合血漿タンパク質を欠く）の存在下（依存性）および非存在下（非依存性）で評価した。被験者の血液試料の最終希釈は、１／５０〜１／１００の間であった。
【００４２】
本明細書で記述された種々の実験より得た２４種のａＰＬ特異性の結果を以下の図で与えた。陽性／陰性の発見を、上記McIntyre JA、Immunobiologyにて記述されたように、７７５人の正常血液の供給者由来の試験血漿試料に基づいた多重平均（ＭｏＭ）で表している。＋＋＋の存在は、強力な抗体活性を示している。＋および＋＋の表示は、それぞれ低いおよび中程度の抗体活性を示している。図はまた、各ａＰＬ特異性およびアイソタイプ組み合わせにおける、正常範囲値を与えている。
【００４３】
ＰＬ結合タンパク質「依存的」と示された縦列中の陽性結果は、抗リン脂質抗体（ａＰＬ）が、示した特定のリン脂質に初期に結合した血漿タンパク質に、実際、結合していることを示している。一般的に、ＰＳおよびＣＬによって結合可能である血漿タンパク質には以下のものがを内包される：ベータ2−糖タンパク質Ｉ、プロトロンビン、プロテインＣ、プロテインＳ、アネキシンＶ、および補体成分因子ＨおよびＣ４（例えば、McIntyre, J.A.、Wagenknecht,D.R. およびFaulk,W.P.「抗リン脂質抗体：発見、定義、検出および疾患（Antiphospholipid antibodies: Discovery, definition, detection and disease）」Prog. Lipid Res.42（3）:176-237、182ページを参照のこと）。血漿タンパク質結合の生理学的特性は、すべてのリン脂質に関して、以前は知られてはいないが、このような結合は、血漿タンパク質構造の立体構造変化を誘導すると考えられ、それによって、個体の自己抗体によって標的とされる新規なまたはあいまいな（cryptic）エピトープを曝すと考えられる。一般的に、リン脂質ＰＥによって結合可能である血漿タンパク質には、以下のものが含まれる：高分子量および低分子量キニノゲン、第ＸＩ因子、プレカリクレインが含まれる。後者２つのタンパク質は、高分子量キニノゲンへの結合の際に、それらの忠実性（Fidelity）に基づき検出可能である。ＰＣに結合する血漿タンパク質はいまだに決定されていない。ある実験において、血漿−タンパク質非依存的なａＰＬが観察されている（図３を参照のこと）。この活性の可能な解釈は、元来血液試料中に存在する、残余のリン脂質結合血漿タンパク質の存在を表しているということである。
【００４４】
実施例１
正常の被験者由来の血液試料を、上記の手順にしたがい、インキュベートし、試験した。ａＰＬ ＥＬＩＳＡの結果を、図２に示している。図２で示すように、インキュベートした血液試料は、正常者範囲の縦列中で示した正常、未処理血液と比較して、自己抗体の活性の著しい存在を示した。とりわけ、強力な自己抗体活性は、ａＰＳ（ＩｇＧ）、ａＣＬ（全てのアイソタイプ）、およびａＰＥ（ＩｇＧ）のタンパク質依存の部類で示されている。低いＩｇＧ ａＰＣ自己抗体の活性、または活性が無いことは、早期実施例およびヘミンを酸化剤として使用した手順において、特徴的な発見であった。この結果は、ＰＣに対する自己抗体、特にＩｇＧアイソタイプである自己抗体は、異なっており、恐らく他に行うのと同様の方法では活性化しないことを示している。後半の実験で、ａＰＣの著しいレベルが、ＫＭｎＯ4で処置した試料中で検出可能であることがわかった（データは示していない）。
【００４５】
実施例２
７人の健康な被験者から得た血液試料を、上記の手順にしたがってインキュベートおよび試験をした。とりわけ、全ての７人の患者の血液を、２０分間以内に得て、同一条件下で２０時間インキュベートした。図３は、これらの７つの試料のａＰＬセロコンバージョン（aPL seroconversion）の範囲を示している複合表である。これらの結果は、異なる個体間に、検出されたａＰＬレベルならびに存在するアイソタイプにおいて、ばらつきがあることを示している。それにもかかわらず、本発明によって示されたように、各個体が、インキュベーション後に検出できるａＰＬ抗体を持つ。
【００４６】
実施例３
最初の実験において、正常被験者由来の血清試料を、上記の基本的な手順にしたがい、インキュベートおよび試験した。インキュベーション混合物では、ウマ赤血球細胞（ＲＢＣ）を、ヒトＲＢＣの代わりに使用した。ａＰＬ ＥＬＩＳＡの結果を図４に示している。図４で示したように、著しいａＰＬ活性が、特にａＰＳ（ＩｇＧおよびＩｇＭ）およびａＣＬ（ＩｇＡおよびＩｇＭ）に関して得られた。
【００４７】
第二の実験において、ヒト血清の代わりに、ウマ血清を、ヒトＲＢＣと共にインキュベートし、上記の基本的な手順にしたがって試験した。ａＰＬ ＥＬＩＳＡの結果を、図５に示している。図５で示したように、ａＰＬ活性は得られなかった。（本実験で使用したＥＬＩＳＡアッセイは、ａＰＬを検出するために、ヒト抗体特異的アルカリホスファターゼ標識の抗体プローブを使用したので、インキュベートした試料がウマａＰＬを含んだかどうかは未知である）。
【００４８】
図４および５で要約して示した結果は、すべてのａＰＬが、第一の実験ではウマＲＢＣを用いているので、ヒトＲＢＣから放出されたのではなく、ヒト血漿由来の本発明のセロコンバージョン過程中に得られ、ヒトＲＢＣのかわりに、ヒト抗体を欠くウマＲＢＣを使用し、陽性の結果を示していること、一方、第二の実験は、ヒトＲＢＣの存在下でウマ血清を使用して、陰性の結果を示していることを明白に示している。
【００４９】
実施例４
正常被験者由来の血液試料を、インキュベーションを高い温度（elevated temperature）でのかわりに室温（２２℃）で実施したことを除き、上記の基本的な手順にしたがってインキュベートおよび試験した。図６は、試料が、室温でインキュベートした際には、セロコンバージョンを受けなかったことを示している。これらの結果は、セロコンバージョンの工程が、温度感受性でありうることを示唆している。
【００５０】
実施例５
正常被験者由来の血液試料を、活性炭（charcoal）の代わりにインキュベーション混合物中の粒子固体として、０．７ｍｍ デガラン（Degalan）（プラスチック）ビーズを使用することを特徴とし、上記の基本的な手順にしたがってインキュベートおよび試験した。セロコンバージョンを示している初期実験で活性炭を使用したので、活性炭がセロコンバージョン中に特定の役割を果たすかどうかを決めるために、この実験を実施した。図７は、活性炭の代わりにプラスチックビーズを使用した場合にさえ、試料がセロコンバージョンを示したことを示している。これらの結果は、活性炭の役割が、実際は化学的にではなく機械的であり、プラスチック、樹脂またはガラスビーズのような、任意の粒子固体を使用可能であることを示している。任意の特定の説に限定することなしに、粒子成分が、ＲＢＣ膜上で研磨剤として働き、おそらくこれが、ＲＢＣ ＡＥ１／Ｂａｎｄ３タンパク質との、またはＳＮＯヘモグロビン遷移分子との、または両方との相互作用によって、ＲＢＣからのＮＯイオンの放出を引き起こすと理論を立てることができる。機械的な研磨の可能性は、実施例６での観察によって支持され、そこでは、ネガティブアッセイ（negative assay）の結果は、振とう（rocking）ないし振動（shaking）されていないインキュベーション混合物でも示されている。粒子固体は自己抗体放出を支援する物理的機能もはたしうる。
【００５１】
実施例６
正常被験者由来の血液試料を、インキュベーション混合物を振とうないし振動せずに、静止させたことを除いて、上記の基本的な手順にしたがってインキュベートし、試験した。図８は、試料を静止させたままである時、セロコンバージョンを受けなかったことを示している。これらの結果は、この運動が固体粒子とＲＢＣ間の相互作用を促進しうることを示唆している。試料のインキュベーターへの移動によって産出されるようなわずかな量の運動が、少量のａＰＬ放出を産出しうるが、静止インキュベーション（stationary incubation）条件は、ａＰＬ放出を促進しなかった。
【００５２】
実施例７
正常被験者由来の血液試料を、遠心によるＲＢＣおよび活性炭のインキュベーションおよび除去の後に、インキュベーション混合物を５６℃にて３０分間加熱したという追加した特徴で、上記の基本的な手順にしたがってインキュベートおよび試験した。図９は、検出したａＰＬの量が、本手順により著しく増加したことを示している。
【００５３】
実施例８
Biomerieuxからの細菌培養増殖培地の代わりに、異なる供給業者（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）、スパークス（Sparks）、MD）からの細菌培養増殖培地を使用した特徴で、正常被験者由来の血液試料を、上記の基本的な手順にしたがってインキュベートおよび試験した。図１０は、試料が、ベクトンディッキンソン培地中でセロコンバージョンを表したことを示しており、そして、これは本発明の方法が、特定の供給源からの細菌培養増殖培地に依存しないことを示唆している。
【００５４】
実施例９
正常被験者由来の血液試料を、インキュベーションを好気性条件下（酸素およびＣＯ2の存在下）のかわりに、嫌気性条件下（窒素下）で実施したという特徴で、上記の基本的な手順にしたがってインキュベートおよび試験した。図１１は、試料が、嫌気性条件下でもセロコンバージョンを示したこと、および本発明の方法が、嫌気性環境に依存しないことを示している。
【００５５】
実施例１０
正常被験者由来の血液試料を、Ｋ５６２細胞（ヒト造血腫瘍細胞株）を、赤血球細胞の代わりに使用した特徴で、上記の基本的な手順にしたがってインキュベートおよび試験した。さらに、本発明の方法において典型的に使用したパック（pack）ＲＢＣの３〜４ｍｌと比較して、１１３０万個のＫ５６２細胞だけが、培養培地中に存在した。図１２は、試料が、セロコンバージョンを示したことを示している。
【００５６】
他の実験によって、他の単離された細胞種、リンパ球、単球および好中球とインキュベートした試料が、ａＰＬセロコンバージョンを典型的に示していないことが示された。特に、リンパおよび脊髄系の白血球は、ａＰＬ放出を促進せず、Ｌ１４と命名されたブタＢリンパ球の細胞株も促進しなかった（データは示していない）。これらの結果は、Ｋ５６２細胞およびＲＢＣがヘモグロビンを含み、リンパ球、単球および好中球はヘモグロビンを含まないので、ヘモグロビンがインキュベーション混合物中で、鍵となる成分であり得ることを示唆している。
【００５７】
実施例１１
正常被験者由来の血液試料を、細菌培養増殖培地をヒト細胞を増殖させるために使用される細胞培養培地：ＲＰＭＩと置換したことを除いて、上記の基本的な手順にしたがってインキュベートおよび試験した。図１３は、セロコンバージョンがおこらなかったことを示している。この実験は、本発明の目的のためには、細菌培養培地中のいくつかの成分の重要性を示している。ＲＰＭＩが、ヒト細胞のために設計された培養培地である一方で、バイアルブロス（viral broth）に置換したときにａＰＬ放出を促進しない。２つの異なる微生物学バイアルブロスのリストと、ＲＰＭＩとの成分の比較が、ＲＰＭＩが、ヘミンおよびビタミンＫ３と呼ばれるメナジオン（人工プロビタミンＫ）を欠くことを示す。ヘミンが、ＲＢＣ由来のイオンのポルフィリンキレーター（Ｆｅ＋＋＋）であり、メナジオンは、脂溶性ビタミンである。このことは、酸化還元反応が、自己抗体の放出において、役割を果たしうることを示唆している。
【００５８】
実施例１２
臍帯血試料を、上記の手順にしたがってインキュベートおよび試験した。臍帯血液を新生児の誕生後に取り、また、誕生前に胎盤を子宮壁から分離した。母親血液または新生児臍帯血いずれもが、従来の実験室アッセイにおいて、ａＰＬの存在を示さなかった。本明細書で記述した本発明にしたがって処理した場合、強力なａＰＬ抗体が、図１４で示したように、臍帯血試料中での存在を示した。抗体は、ＩｇＧのみであり、母由来の抗体と適合可能である知見である。誕生の前に、母親がＩｇＧを胎児へ伝達するので、この実験は、胎児血液中で胎児によってマスクされたままであるトロホブラスト（trophoblast）上の特殊化したＦｃγレセプター（ＦｃγＲｎ）によって、マスクされた母由来の自己抗体が、胎児に輸送されることを示したようにみられる。本発明の方法によるセロコンバージョンの前に、母親の血液および臍帯血は、ａＰＬ陰性であることを示し、そして検出されたＩｇＭまたはＩｇＡ免疫グロブリンがなかったので、これらの発見は、セロコンバージョンの後で、臍帯血にて観察されるＩｇＧ ａＰＬは、起源は母であるという論点を支持している。ＦｃγＲｎを発現するトロホブラストは、ＨＬＡ抗原を発現しないことも興味深い。
【００５９】
実施例１３
正常被験者由来の血漿試料を、上記の基本的な手順にしたがって、インキュベーション混合物中のＲＢＣに代わってニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ、２００マイクロモーラー）を用いたという特徴で、インキュベートおよび試験した。図１５は、試料がセロコンバージョンを提示したことを示している。
【００６０】
ＳＮＰは、強力な酸化窒素（ＮＯ）ドナー（donor）であるので、これらの結果はＮＯラジカルが、自己抗体の放出に関与するという支持証拠が提供され、ＲＢＣからＮＯ-供与体を与える役割を、ＲＢＣおよび固体粒子が果たすという説をさらに支持する。ニトロプルシドナトリウムは別として、他のフリーラジカル介在反応も自己抗体の放出を引き起こしうる。
【００６１】
実施例１４
正常被験者由来の血液試料を、上記の基本的な手順にしたがってインキュベートし、ループス性抗凝固因子活性に関して試験した。ループス性抗凝固因子または阻害剤は、ａＰＬの他の型であり、典型的に、機能的な実験室アッセイ（functional laboratory assay）によってのみ検出可能である。図１６中の結果は、ループス阻害剤陰性個体から採取し、本発明の方法により処理したセロコンバートされた血液中に、強力なループス性抗凝固因子（ＬＡ）を示している。ｄＲＶＶＴアッセイ中のセロコンバートしたブロスに、正常な血漿を添加することで、最初に補正（initially corrected）した一方で、結果として１〜２時間のインキュベーションにより、阻害剤が再現された。この時間枠は、混合の研究によって導入された、ＬＡまたは非マスク化抗体が関与するリン脂質結合血漿タンパク質に結合するのにかかる時間として提示される。１：１混合が、因子を欠いた試料中で、凝固時間を補正する十分なレベルの凝固因子を与えるので、凝固因子不足の可能性も除外する。希釈プロトロンビン時間（ｄＰＴ）は、正常血漿の存在下では補正しなかった。そして凝固時間の延長の増加は、正常血漿とのインキュベーションの後に観察され、これは強力なループス阻害剤を示す。
【００６２】
実施例１５
五人の正常被験者由来の血液試料を、上記の基本的な手順にしたがってインキュベートし、他の型の自己抗体の存在を蛍光顕微鏡によって試験した。これらの五人の個体からの血清および血漿試料は、本発明の指導にしたがった処理以前において、陰性であった。図１７は、Ｈｅｐ−２細胞株を用いて同定された、追加の自己抗体の特異性を列挙している。抗核小体（強皮症関連）、抗ラミン（核孔で非常に明るい）、抗ミトコンドリア（細胞質性）、および抗中心小体が同定された。この結果は、本発明の方法によって放出された自己抗体は、ＥＬＩＳＡに基づく試験以外の、異なる検出法である蛍光顕微鏡によっても検出可能であることを示している。この結果により、ａＰＬ以外の多くの型の自己抗体が、その血清および血漿が、ルーチンな実験室解析（routine laboratory analysis）において、これらの抗体に関して陰性であると試験された個体の血液中で、マスクされていることが確認される。
【００６３】
これらの結果から、より多くの自己抗体特異性が、本発明により処理された血液を試験することにより、発見されることが期待される。
【００６４】
実施例１６
正常被験者由来の血液試料を、上記の基本的な手順にしたがってインキュベートし、フローサイトメトリーおよび蛍光共役型抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて、単球との反応性に関して試験した。比較試験を、未処理プール正常ヒト血清（ＮＨＳ）、本発明で使用した同一の正常被験者由来の血清、および陽性対照ヒト血清で実施した。（処理した血液は、リンパ球および好中球との自己反応性は示さなかった。データは示していない。）図１８は、フローサイトメトリーによって定義したように、細胞の正常被験者の単球ポピュレーション（population）の、前方散乱（大きさ）および側方散乱（粒度）プロファイルを描写している。この細胞の単球ポピュレーションは、ＣＤ１４モノクローナル抗体との反応性を示すことによって確認した。図１９Ａは、ＮＨＳとの抗単球応答性を示している。示された中央値応答性（median reactivity）は、直線スケール上で、７４３．５０である。図１９Ｂは、正常被験者由来の血清の自己抗単球活性を示しており、この被験者は、自己単球に対する抗体活性を持たない。示された反応性の中央値は、７３７．００である。図１９Ｃは、本発明にしたがって処理した後、図１９Ｂで示した被験者由来の血液試料の自己抗単球活性を示している。示された中央値は、８６４．００であり、強力な自己抗単球活性を示している。本発明の教示にしたがって処理した血漿が、１／８の希釈で使用されたという事実にもかかわらず、原液のポジティブコントロールの血清でよりも、単球に対してより大きい反応性を示した。したがって、本実施例は、本発明の方法にしたがって処理した血液または血清試料が、単球を特異的に標的とする自己抗体を放出することを示している。同様の結果が、本発明の教示にしたがって処理した場合に、他の個体からの４つのさらなる試料に関して、文献となっている。
【００６５】
実施例１７
ＲＥＬＩＳＡ（登録商標）スクリーニングアッセイを用いた、抗核抗体（ＡＮＡ）の存在に関する比較試験を、未処理臍帯血；振とうせずに、本発明の方法にしたがってインキュベートした臍帯血；振とうした本発明にしたがい、処理した臍帯血；ＡＮＡ陰性の健康的なドナー（ＡＣＳとして同定された）由来の未処理血清、および本発明の方法にしたがってインキュベートした、同一のＡＮＡ陰性、および本発明の方法によって処理された健康的なドナー由来血清について実行した。図２０で示したように、顕著な量のＡＮＡが、本発明の方法によって処理した臍帯血および血清中で同定された。図１６および１７での結果から、より多くの自己抗体特異性が、本発明によって処理された血液を試験することによって、発見されるのが待たれる。
【００６６】
実施例１８
自己抗体の放出の現象における赤血球細胞の役割を理解するために、赤血球細胞を、赤血球細胞の活性を模倣しうるより単純な成分で、置き換えた実験を設計した。本実験において、赤血球細胞と活性炭を、ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）と塩化第二鉄で置き換えた。ニトロプルシドナトリウムが、強力な酸化窒素産出物（nitric oxide powder）であり、ＲＢＣがＮＯ-のキャリヤーであると知られているので、この置換を実施した。塩化第二鉄（ＦｅＣｌ3ストック溶液、２５μＭ）を、ヘモグロビン中の鉄との置換物として加えた。
【００６７】
細菌培養増殖培地と、５ｍｌのヒト血漿または血清、種々の濃度のニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ、２００μｍ）、および外因性（exogenous）の塩化第二鉄（４．１μｍ最終濃度）を含む培養ボトルを、赤血球細胞および活性炭の代わりに使用し、３７℃にてインキュベートし、ついで５６℃にて３０分間加熱した。試料は、ａＰＬのセロコンバージョンを示したが、ＩｇＧしか示さなかった（データは示していない）。
【００６８】
この結果によって、ＮＯ-が、抗体非マスク化に関与していることが示唆され、また、培養ボトル中の固相物質（solid phase material ）の機械的な作用が、赤血球細胞を分解させ、ＮＯ-を放出することが示唆された。あるいは、ＮＯの放出または修飾によって、ヘモグロビン分子を、酸化還元反応に参加できるようにしうる。
【００６９】
実施例１９
非マスク化した自己抗体の効果が、血清または血液中の、自己抗体含む巨大分子構造の分解によるのかどうか、あるいは抗体自身の結合特異性の直接的な変化によるのかどうかを決定する目的で、市販されている静脈内免疫グロブリン（ＩｖＩｇ）を、ヒト血漿または血清と置き換えた一連の実験で実施した。市販されているＩｖＩｇは、多数のドナー、一般的には１，０００〜１０，０００ドナーからの、プールした血漿のアルコール沈殿フラクションである。一般的には、ＩｖＩｇは、主にＩｇＧを含み、ＩｇＡ、ＩｇＭおよび他の血漿タンパク質は含まない。未処理ＩｖＩｇを、ＥＬＩＳＡ試験によって、自己抗体の存在について試験したときに、試験の結果は陰性である。その調製の方式のために、ＩｖＩｇはまたリポタンパク質ミセル、小胞または他の巨大分子構造を含まない。したがって、ＩｖＩｇが、インキュベーション処置の後に、自己抗体の存在に関して陽性であった場合に、自己抗体がＩｖＩｇ調製物中に、すでに存在するＩｇＧ抗体の改変によって得られたものであり、自己抗体を遮蔽する構造または小胞の破壊によるのではないと考えるべきである。
【００７０】
以下の実施例において、使用したＩｖＩｇの市販されている調製物は、凍結乾燥ＩｖＩｇ（イムノグロブリンイントラベノウス（ヒト）ガンマ−PI.V.、（Immune Globulin Introvenous （Human） Gammar-PI.V.）、アベンティスベーリング（Aventis Behring）、Kankakee、Illinois）であった。
【００７１】
５グラムの凍結乾燥ＩｖＩｇの市販されている調製物を、無菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、１００ｍｇ／ｍｌ）中に再構築した。１．７ｍｌの再構築したＩｖＩｇ溶液を細菌培養増殖培地を含む培養ボトル（赤血球細胞または活性炭なし）に加え、３７℃にて２０時間インキュベートした。インキュベートした混合物は、セロコンバージョンと、ａＰＬ ＩｇＧの存在を示した（データは示していない）。（予想したように、ＩｇＧのみが検出され、ＩｇＡまたはＩｇＭは検出されなかった。）
【００７２】
同様の実験で、自己抗体が、室温、振動バイアル中でインキュベートした混合物中で検出されたが、３７℃ほど良い結果ではなかった（結果は示していない）。
【００７３】
約３７℃でのＩｖＩｇ細菌増殖培地混合物の加熱によって、さらなる自己抗体の増加はなかった。
【００７４】
対照として、ボトルからだしたそのままのＩｖＩｇを、ａＰＬおよび他の自己抗体に関して試験したが、結果は陰性であった。
【００７５】
実施例２０
実施例１９において、自己抗体が、細菌増殖培地中の市販されているＩｖＩｇ調製物をインキュベートすることによって得られることが示された。次の段階は、細菌培養増殖培地中のどの成分が、検出可能な自己抗体を産出する役割を果たしているかを決定することを試みることである。
【００７６】
まず、２％トリプシン処理大豆ブロス（ＴＳＢ）（それぞれ大豆のカゼインの膵臓消化対パパイヤ消化の比、１７：３で、ペプトン類を含む）（残余物は水である（the remainder being water））中のＩｖＩｇを、振とうしながら、３７℃にて２０時間インキュベートした。インキュベートした混合物を、ａＰＬの存在について試験し、結果は陰性であった。
【００７７】
次に、ＩｖＩｇを、大豆ブロス、ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）およびヘミン（鉄（第二鉄）含有プロトポルフィリン）中の試験管内で、３７℃にて２０時間、振とうしながらインキュベートした。使用した量は、合計１ｍｌの大豆ブロス中、６０マイクロリットルのＩｖＩｇ、５マイクロリットルのＳＮＰ、および５マイクロリットルのヘミンであった。インキュベートした混合物は、ａＰＬ、特にａＰＳ（１５ＭｏＭ）およびａＰＥ（４１ＭｏＭ）の存在に関して陽性であると試験された（データは示していない）。
【００７８】
実施例２１
一連の実験を実施して、ヘミンのみとのインキュベーションが、ＩｖＩｇ中、血漿または血清中での自己抗体の出現を引き起こすのに十分でありうるかを決定した。
【００７９】
再構築した凍結乾燥ＩｖＩｇ（１００ｍｇ／ｍｌの濃度）を、ヘミンを含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液中に加え、３７℃にて２０時間インキュベートした。使用した量は、総量１ｍｌ中３００μｌのＩｖＩｇ溶液と５μｌのヘミン溶液（７５μｇ）であった。
【００８０】
図２１で示したように、インキュベートした混合物は、著しい量のａＰＳおよびａＰＥ ＩｇＧを示しており、それほどにはないにせよ、ａＣＬ ＩｇＧを示した。
【００８１】
血清または血漿を、同様の条件下でヘミンとインキュベートした場合、自己抗体は検出されなかった。
【００８２】
実施例２２
ＩｖＩｇをヘミンとともにインキュベートしたとき、自己抗体の存在のために、陽性の結果が得られたが、血清または血漿はヘミンとインキュベートした場合に得られた陰性の結果は、血清または血漿は自己抗体の処理を阻害または干渉する物質を含みうるということを示唆している。
【００８３】
一連の実験において、ヒト血清を漸増していった量（本発明者のもの）を、インキュベーションの前にバッチ（batch）に加えたという追加特徴で、実施例２１の工程と同様に、ＩｖＩｇをヘミンとともにＴｒｉｓ緩衝液中で、３７℃にて２０時間、インキュベートした。各分離バッチ（separate batch）を、ａＰＳ、ａＣＬ、ａＰＥおよびａＰＣ自己抗体の存在について試験し、結果を図２２に示している。図２２で示した結果は、血清の漸増していった量が、自己リン脂質抗体の放出において、阻害効果を持ったことを示している。同様の結果が、血清を血漿に置換した場合にも見られた（データは示していない）。これらの結果に対する可能な解釈は、第二鉄状態の鉄分子を含み活性酸化剤として知られているヘミンが、結合部位の改変が自己抗原への結合をできるように、特定の免疫グロブリン分子の結合部位を酸化させるために働きうるということである。この工程は、血液中の基質（substance）、おそらく抗酸化剤によって阻害されうる。
【００８４】
実施例２３
ヒト血清（本発明者のもの）を、Ｔｒｉｓ緩衝液中１／１０に希釈した。一連の実験において、１ｍｌバッチ中のこの希釈した血清を、特に、０μｌ、１０μｌ、２５μｌおよび５０μｌとともにヘミンの量を増加させ、インキュベートした。（以前に、ＩｖＩｇからのそのような放出を引き起こすのに十分であったけれども、ヘミンそれ自身は、血液または血清から、自己抗体の放出を引き起こすのに十分ではなかったことがわかった。したがって、血清を希釈する目的は、抗酸化物質のような血液中にみられ、干渉する任意の基質の効果を希釈するためである。）バッチをａＰＳ、ａＣＬ、ａＰＥおよびａＰＣ自己抗体の存在について試験し、結果を図２３に示す。図２３に示した結果は、０または１０μｌのヘミンを加えた場合には、希釈血清中で自己抗体の量が検出されず、２５μｌのヘミンで著しい量が検出されたことを示している。理由はわからないが、検出された自己抗体の量は、５０μｌのヘミンでは、少なかった。
【００８５】
実施例２４
次の一連の実験を、血液中に存在するビタミンＣのような抗酸化剤が、自己抗体の放出を阻害しうるかどうかを決定するために設計した。一連の実験において、アスコルビン酸（ビタミンＣ）の増加量を、ヘミン含有緩衝液に加え、ＩｖＩｇを添加する前および、インキュベーション前に、３０分間混合した追加特徴で、ＩｖＩｇをヘミンを含むＴｒｉｓ緩衝液中でインキュベートした。図２４に示したように、１ｍｇのビタミンＣで、ヘミン誘導によるａＰＥ放出の約７８％阻害があり、この量はビタミンＣの生理的な濃度を表している。ａＰＳ放出での二相性曲線が存在し、低濃度でのビタミンＣは酸化剤として働きえるが、高濃度では抗酸化剤（還元剤）となるという可能性が提起される。
【００８６】
実施例２５
次の一連の実験は、得られた結果において、ヘミンを溶解した賦形剤（vehicle）が得られた結果に影響を及ぼすかどうか、およびヘミン中の鉄原子が必要かどうかを決定するために設計された。一連の実験で、ＩｖＩｇを、ヘミン、または他の添加物とともに、Ｔｒｉｓ緩衝液中でインキュベートした。特に、１例として、ヘミンをＮａＯＨで可溶化した。もう１つの例としては、ＤＭＳＯにて可溶化した。他の例では、ヘミンと同様の分子であるが、鉄（Ｆｅ＋＋＋）を含まないヘマトポルフィンＩＸ（ｈｐＩＸ）を、ヘミンの代わりに使用し、ＮａＯＨまたはＤＭＳＯで可溶化した。他の例において、ＮａＯＨおよびＤＭＳＯを、対照として（ヘミンまたはｈｐＩＸなしで）試験した。図２５において示したように、ＮａＯＨ可溶化ヘミンの使用によって、自己抗体の存在について陽性の結果が得られ、一方でヘミン＋ＤＭＳＯ、ｈｐＩＸ＋ＮａＯＨ、ｈｐＩＸ＋ＤＭＳＯ、ＮａＯＨのみ、およびＤＭＳＯのみでは、陽性の結果が得られなかった。
【００８７】
実施例２６
ヘミンが、抗体の酸化を引き起こしていることをさらに確立するために、当モル量のヘモペキシン（Ｈｐｘ）を、ＩｖＩｇ ＰＢＳヘミン混合物に加えた。Ｈｐｘは、ヘム鉄に対して、並はずれて高い結合親和性を持つ抗酸化剤分子である。SciPac（Kent、England）から購入した凍結乾燥Ｈｐｘを、１０ｍｇ／ｍｌで、ＰＢＳ中に再構築した。図２６で示したものは、ＩｖＩｇＧに対するヘミンの増加の濃度と、ＩｖＩｇＧに対し、ヘミンおよびヘミンと当モル濃度のＨｐｘの増加の濃度によって計数した結果である、ａＰＳ酸化還元データである。ヘミンとＨｐｘ間の１：１結合相互作用が存在するので、Ｈｐｘが、ヘミン中に存在する第二鉄イオンの酸化還元能力を打ち消すことができた。
【００８８】
実施例２７
ＩｖＩｇの酸化処理によって得ることができる自己抗体の広い範囲および活性を例示するために、一連のウエスタンブロットを、ヘミン処理ＩｖＩｇまたは未処理ＩｖＩｇを一次抗体として使用し、抗ヒトＨＲＰタグ化共役物を対照として使用して、３つの異なる細胞株からの細胞溶解物を用いて設定した（ＨＲＰ＝ホースラディッシュペルオキシダーゼ）。ブロットを図２７に示す。「Ｂ」溶解物は、リンパ腫の患者からのRajaと呼ばれるリンパ球細胞株である。「Ｔ」溶解物は、白血病患者からの、Jurkatと呼ばれる、Ｔリンパ球由来細胞株である。Ｕ８７ＭＧ溶解物は、膠芽細胞腫細胞株（脳腫瘍）である。還元溶解物を、５０ｍｇ／ｍｌの濃度で、ゲル内に供した。ヘミン処理ＩｖＩｇ調製物を得るために、７５μｇのヘミンを、６ｍｇのＩｖＩｇＧを含む１ｍｌのＰＢＳと混和した。インキュベーションを、２０時間３７℃で実施した。図２７において、ヘミン処置ＩｖＩｇを一次抗体として用いたブロットを、「試験ＩｇＧ（Ｔｅｓｔ ＩｇＧ）」と標識し、未処理ＩｖＩｇを、一次抗体として用いたブロットを、「コントロール（Control）」と標識し、一次抗体なしで、抗ヒトＨＲＰタグ化共役物を適用したブロットを、「二次（Secondary）」と標識した。ヘミン処理および未処理ＩｇＧ調製物を、それぞれ、１／１０００で希釈した。抗ヒトＨＲＰタグ化共役物を、１／５０００の希釈で使用した。
【００８９】
これらのデータは、ヘミン処理ＩｖＩｇが、活性を持たない未処理ＩｖＩｇＧおよび共役物対照と比較して、ヒト細胞成分に対して、十分な活性をもつことを明らかに示している。
【００９０】
実施例２８
次の実験を、ヘミン以外の酸化剤、特に、鉄を含まない酸化剤が非マスク自己抗体に対して効果的でありうるかどうかを決定するために実施した。総容量１ｍｌのリン酸緩衝食塩水中の、１００μＭの濃度の２５μｇの過マンガン酸カリウム（ＫＭｎＯ4）と２ｍｇのＩｖＩｇの混合物を、３７℃にて一晩インキュベートした。インキュベート混合物中、ａＰＣおよびａＰＳが検出可能であった。ａＣＬが通常では検出されたが、ａＰＥはされなかった（データは示していない）。後に、ａＰＥが検出されなかった理由が、ＫＭｎＯ4が、ＥＬＩＳＡ試験で使用したＰＥリン脂質抗原を変更させるからであることがわかった。
【００９１】
実施例２９
自己抗体が、酸化反応によって非マスク化可能であることが示された後、次の疑問は、電源からの電動力のような電気化学的方法が同様の効果を達成可能であるかどうかであった。
【００９２】
ＩｖＩｇを、リン酸緩衝食塩水溶液中に溶解し、別個の実験で、亜鉛メッキ鋼、銅またはステンレス鋼電極を、９ボルト電池の陽極および陰極に接続し、１〜２分間溶液中に浸した。この期間、泡立ちが溶液中で確認され、ＰＢＳ溶液の色が変化した（銅ワイヤを使用した場合青色、ステンレス鋼ワイヤを使用した場合褐色、亜鉛メッキ鋼ワイヤを使用した場合緑色）。図２８Ａおよび２８Ｂで示したように、処理した溶液が、ａＰＬ依存試験にてａＰＳ、ａＣＬ、ａＰＥおよびａＰＣ自己抗体の存在下で陽性であるとわかり、また、ａＰＬ非依存試験でａＰＳ、ａＰＥおよびａＰＣ自己抗体の存在に関して陽性であった。
【００９３】
実施例３０
溶液との金属の相互作用をさけ、それによって、電流の効果のみを決定するために、黒鉛電極を、金属電極の代わりに使用した。黒鉛は不活性であるが、反応に参加することなしに、導電性溶液中に、電子を通過させることができる。
【００９４】
ＩｖＩｇを、リン酸緩衝食塩水溶液中に溶解し、６ボルト電池の陽極および陰極に接続した黒鉛電極を、６０秒間この溶液中に浸した。図２９で示したように、処理した溶液が、ａＰＳ、ａＰＥおよびａＰＣ自己抗体の存在に関して陽性であるとわかった。
【００９５】
実施例３１
リン酸緩衝食塩水中のＩｖＩｇの溶液に、電流を流すことを含む実験において、ｐＨの著しい増加が観察され、これはおそらくＮａＯＨの形成によるものである。反応を生理学的ｐＨレベルに維持するために、細胞培養培地、ＲＭＰＩを、リン酸緩衝食塩水と置換した。
【００９６】
次の一連の実験を、自己抗体の非マスク化における、電流への暴露の時間の効果を決定するために使用した。ＩｖＩｇをＲＭＰＩ中に溶解し、細胞培養培地、および６ボルト電池の陽極および陰極に接続した黒鉛電極を、時間間隔を変えて溶液中に浸した。図３０で示したように、依存ａＰＬの最大放出を、電流への暴露の６０秒後に得た。不思議なことに、２分間と４分間のあいだで、ａＰＬの量が減少したか、あるいは無くなった。
【００９７】
実施例３２
先の実験によって、ａＰＬ抗体を電流への暴露の後に、ＩｖＩｇから得ることが出来るが、ａＰＬ抗体がさらなる電流への暴露の後に消えたことが示されたので、次なる疑問は、自己抗体の非マスク化が、電流によって逆転可能であったかどうかである。すなわち、ポジティブコントロールの血清を、自己抗体がもはや検出可能ではないように処理可能であるか、どうかである。
【００９８】
別の実験において、１：４００の希釈でのａＣＬ陽性対照血清、１：７５の希釈でのａＰＥポジティブコントロールの血清、および１：４００の希釈でのａＰＳを、６ボルト電池の陽極および陰極に接続した黒鉛電極を２４０秒間まで浸すことによって電流に暴露した。図３１Ａ〜３１Ｃで示したように、それぞれのコントロールの血清は、そのそれぞれの特異性に対し陰性となった。
【００９９】
実施例３３
実施例３２での結果に基づいて、次の求められる疑問は、自己免疫疾患を患う患者の自己抗体が、患者血清を電流に暴露したときに、再マスク化されるかどうかである。ａＰＳおよびａＣＬのレベルが増加した患者からの血清を、リン酸緩衝食塩水で１／４００に希釈し（ＰＢＳ中での希釈は、１０〜１５分で、１，０００のＯＤ値を達成する量である）、６ボルト電池の陽極および陰極に接続した黒煙電極を、時間間隔を変えてこの溶液中に沈めた。図３２で示したように、自己免疫患者の血清中で検出可能なａＣＬおよびａＰＳの量は、３０秒後に著しくに減少し、２分後にはもはや観察されなかった。これらの実験を、他の患者の抗体で繰り返し、同様の結果が得られた（データは示していない）。
【０１００】
実施例３４
初期の実験で、非常に特異的で高いタイターのＩｇＡ ａＰＥを持つ患者からの血液試料を、日常的に用いられる微生物学培養ボトル中で、ヘミンに暴露した。ヘミンへの暴露の後、そのＩｇＡ ａＰＥが消えたことが観察され、ＩｇＧ ａＰＳ、ａＣＬ、およびもっとも飛躍的にＩｇＧ ａＰＥの出現が、ａＰＬ ＥＬＩＳＡで検出された。この時点で、この現象に対する説明は明らかではなかった。
【０１０１】
電流を用いるより速い非マスク化工程の開発に伴って、高いａＰＥを持つ他の患者の、より早く結果を確認することが可能になった。この実験において、高いａＰＥを持つ患者からの血清を１／７５までＰＢＳ中で希釈し、６ボルト電池の陽極および陰極に接続した黒鉛電極を、時間間隔を変えてこの溶液に浸した。図３３で示したように、ａＰＥは、６ボルトＤＣ電流適用で３０秒以内に検出されなくなり（マスク化され）、同時にａＰＳおよびａＣＬ ＩｇＧの非マスク化と検出された。新規に非マスク化されたａＰＬは、３０秒付近でピークとなり、暴露の２〜４分後に再びマスク化となった。
【０１０２】
以上の実験によって取り組んだ重要な技術的観点は、ａＰＥ患者を、アッセイで使用した血漿タンパク質希釈液から離して処理したことであり、この場合は、１０％成体ウシ血漿（ＡＢＰ）であった。示してはいない他の実験にて、希釈した患者の血清を、ＥＬＩＳＡ希釈液にて使用した血漿タンパク質を加える前に、６ボルトＥＭＦ状態に暴露した。これらの実験の重要な観点は、ＥＭＦ効果が、患者の抗体に適用されており、希釈液中で使用した血漿タンパク質中のＥＭＦ変化には適用していないことを示すことである。
【０１０３】
これらの実験データは、酸化還元反応が、異なる抗体特異性の出現および消失を決定しているという所見を支持する。これらの実験からまた学んだことは、酸化還元効果が、抗体結合部位（群）、抗体分子のＦａｂ部位に限定されるように見えることである。このことは、ＥＬＩＳＡで使用した異種抗ヒト抗体標識共役物（heterologoous antihuman antibody-labeled conjugates）が、抗体分子の異なる抗体重鎖標的（Ｆｃ部位）を認識し続けている共役物として影響されなかったからである。したがって、ヒト抗体が、酸化還元によって消費されず、破壊されないので、最も説得力のある説明としては、抗体分子のＦａｂ部位中の抗体結合部位が、酸化／還元過程において参加可能な接近可能な電子（accessible electrons that can participate in the oxidation/reduction process）を含む、というものである。
【０１０４】
実施例３５
次の実験は、自己抗体以外の血漿タンパク質が、酸化−還元によって改変した結合特異性を持ちうるかどうかを見るために実施された。これらの実験において、１０％成体ウシ血漿（ＡＢＰ）溶液、タンパク質依存性のａＰＬ結合を決定するために使用したリン脂質結合タンパク質を含む同様の溶液を、時間間隔を変えて、６ボルト電池からの電流に暴露した。ＥＬＩＳＡに用いた処理したＡＢＰ試料を、ついで、ＡＢＰの処置がＥＬＩＳＡの結果に影響を与えるかを見るために、ａＰＳ、ａＣＬおよびａＰＥ陽性患者の血清で、アッセイした。図３４で示したように、時間ゼロ（未処理ＡＢＰ）で、陽性患者の血清は、いつもＡＢＰ中でａＰＬ応答性を示す。１０％ＡＢＰを、長期間、酸化−還元に暴露（ＥＭＦ）した場合、検出されたａＰＬの量は減少し、２分後では、ａＰＥ陽性血清はもはや陽性ではない。これらの結果は、患者のａＰＬ応答性に反応する血漿タンパク質が、電流への暴露によって改変されることを示唆している。たとえば、キニノゲンは、ａＰＥ依存的な反応で陽性ＥＬＩＳＡシグナルを与えるのに関与している血漿蛋白質であるが（キニノゲンはＰＥに結合し、ついで抗体がキニノゲンに結合する。しかしながら、ａＰＥは、ＰＥまたはキニノゲンに、非依存的には結合しない）、このことは、ＡＢＰ試料中のキニノゲンが、酸化還元暴露によって変更されていることを示している。ａＣＬはまた、２４０秒間暴露にて陰性であり、この患者の血清が、ａＰＬ ＥＬＩＳＡにて陽性シグナルを産出するために、プロトロンビンおよび／またはベータ２糖タンパク質（または両方が関与しうる）いずれかを要求するので、これらの２つのタンパク質は、酸化還元反応によって変更されたに違いない。同様の２つの血漿タンパク質が、ａＰＳ試料中に含まれる。
【０１０５】
明らかに、本発明の多くの改変および変化は、上記教示に関して可能である。したがって、付随する請求項の範囲内で、本発明は、特に記述された以外にも実施しうることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】下記記述の多くの実施例にて使用した、イン−ハウス（in-house）酵素免疫測定アッセイ（ELISA）によってアッセイした、特定の抗リン脂質抗体（ａＰＬ）を列記している表である。
【図２】実施例の最初の項目で記述した方法にしたがって、インキュベートした、正常なａＰＬ陰性被験者由来の血液試料に関する、ａＰＬアッセイ結果を要約している表である。
【図３】実施例の最初の項目で記述した方法にしたがって、インキュベートした、７人の正常ａＰＬ陰性個体由来の血液試料のａＰＬアッセイ結果を要約している構成表である。
【図４】手順中ヒトＲＢＣをウマ赤血球細胞（ＲＢＣ）で置換したことを特徴とし、実施例の最初の項目で記述した方法にしたがってインキュベートした正常ａＰＬ陰性被験者からの血清試料についての、ａＰＬアッセイ結果を要約している表である。
【図５】ウマ血清をヒト血清の代わりに使用したことをのぞいて、実施例の最初の項目で記述した方法にしたがって、実施した血清試料のインキュベーションのａＰＬアッセイ結果を要約している表である。
【図６】インキュベーションを、室温（２２℃）にて実施したことをのぞいて、実施例の最初の項目で記述した方法にしたがって、インキュベートした正常ａＰＬ陰性被験者由来の血液試料についてのａＰＬアッセイ結果を要約している表である。
【図７】０．７ｍｍ Degalan（プラスチック）ビーズを、インキュベーション混合物中、粒子個体として使用した特徴で、実施例の最初の項目で記述した方法にしたがってインキュベートした、正常ａＰＬ陰性被験者からの血液試料に関する、ａＰＬアッセイ結果を要約している表である。
【図８】インキュベーション混合物を、振とうまたは振動するかわりに、静止させたままにした以外は、実施例の最初の項目で記述した方法にしたがってインキュベートした正常ａＰＬ陰性被験者由来の血液試料についてのａＰＬアッセイ結果を要約している表である。
【図９】インキュベーション混合物を、５６℃まで３０分間加熱した特徴で、実施例の最初の項目で記述した方法にしたがってインキュベートした、正常ａＰＬ陰性被験者由来の血液試料についてのａＰＬアッセイ結果を要約している表である。
【図１０】異なる供給業者（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）、Sparks、Md）からの細菌培養増殖培地を、Biomerieuxからの細菌培養増殖培地の代わりに使用したことを特徴とし、実施例の最初の項目で記述した方法にしたがってインキュベートした、正常ａＰＬ陰性被験者由来の血液試料についてのａＰＬアッセイ結果を要約している表である。
【図１１】インキュベーションを、嫌気性条件下で実施したことを特徴とし、実施例の最初の項目で記述した方法にしたがってインキュベートした、正常ａＰＬ陰性被験者由来の血液試料について、ａＰＬアッセイ結果を要約している表である。
【図１２】Ｋ５６２細胞（ヒト腫瘍細胞株）をＲＢＣの代わりに用いたことを特徴とし、実施例の最初の項目で記述した方法にしたがってインキュベートした正常ａＰＬ陰性被験者由来の血清試料についてａＰＬアッセイ結果を要約している表である。
【図１３】細菌培養増殖培地からヒト細胞を増殖するために用いた細胞培養培地で置き換えたことを除いて、正常ａＰＬ陰性被験者由来の血液試料についてのａＰＬアッセイ結果を要約している表である。
【図１４】正常のａＰＬ陰性母親および幼児からの臍帯血試料についてのａＰＬアッセイを要約している表である。
【図１５】ニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）を、インキュベーション混合物中でＲＢＣの代わりに用いたことを特徴とし、実施例の最初の項目で記述した方法にしたがってインキュベートした正常ａＰＬ陰性被験者由来の血液試料についてのａＰＬアッセイ結果を要約している表である。
【図１６】実施例の最初の項目で記述した方法にしたがってインキュベートした、血液試料に関する、ループス抗凝固活性の結果を要約している表である。血液試料は、その血液が、本発明の工程によるセロコンバージョンの前に、ループス抗凝固は陰性である対象から得た。
【図１７】実施例の最初の項目で記述した方法にしたがってインキュベートする、血液試料中で同定された、他の型の自己抗体を列記している表である。列記した抗体は、免疫蛍光顕微鏡によって同定した。
【図１８】フローサイトメトリーによって、密度勾配分離したヒト白血球細胞に関して定義した、細胞の単球集団の、前方散乱（大きさ）および側方散乱（粒度）プロファイルを示しているグラフである。
【図１９Ａ】プールした正常ヒト血清（ＮＨＳ）の単球応答性を示しているフローサイトメトリーヒストグラムである。ヒストグラム中に、存在するならば、抗体活性を、水平軸にそって中央チャネル値（ログスケール）でのシフトによって測定した。
【図１９Ｂ】単一な正常被験者由来の血清の単球応答性を示しているフローサイトメトリーヒストグラムである。ヒストグラム中に、存在するならば、抗体活性を、水平軸にそって中央チャネル値（ログスケール）でのシフトによって測定した。
【図１９Ｃ】実施例の最初の項目で記述した方法にしたがって処理した図１９Ｂで示した被験者由来の血液試料の、単球応答性を示しているフローサイトメトリーヒストグラムである。ヒストグラム中に、存在するならば、抗体活性を、水平軸にそって中央チャネル値（ログスケール）でのシフトによって測定した。
【図１９Ｄ】陽性対照血清の単球活性を示しているフローサイトメトリーヒストグラムである。ヒストグラム中に、存在するならば、抗体活性を、水平軸にそって中央チャネル値（ログスケール）でのシフトによって測定した。
【図２０】ＲＥＬＩＳＡ（登録商標）スクリーニングアッセイを用いて、種々の試料の、抗核抗体（ＡＮＡ）試験の結果を要約している表である。
【図２１】トリス緩衝液中で、ヘミンとともにインキュベートした、ＩｖＩｇの試料に関する、ａＰＬアッセイ結果を要約している表である。
【図２２】調製物に加えた、ヒト血清（μｌ）の量に応じて、ヘミンとともにインキュベートした、連続ＩｖＩｇ調製物中で検出された、（光学密度、ＯＤによって測定されたような）ａＰＳ、ａＣＬ、ａＰＥおよびａＰＣの量を示しているグラフである。
【図２３】ヘミン（μｌ）の量に応じて、ヘミンとともにインキュベートした調製物に加えた一連のヒト血清調製物中で検出された（光学密度、ＯＤによって測定されたような）ａＰＳ、ａＣＬ、ａＰＥおよびａＰＣの量を示しているグラフである。
【図２４】調製物に加えたビタミンＣ（μｌ）の量に応じて、ヘミンとビタミンＣとともにインキュベートした、連続ＩｖＩｇ調製物中で検出された、（多重平均、ＭｏＭｓによって測定されたような）ａＰＳ、ａＣＬ、ａＰＥおよびａＰＣの量を示しているグラフである。
【図２５】ＮａＯＨ可溶化ヘミン、ＤＭＳＯ可溶化ヘマトポルフィリンＩＸ（ｈｐＩＸ）、ＮａＯＨ可溶性ｈｐＩＸ、ＮａＯＨのみ、ＤＭＳＯのみ、およびＤＭＳＯ可溶性ヘミンとともにインキュベートした、連続ＩｖＩｇ調製物中で検出された、（多重平均、ＭｏＭｓによって測定されたような）ａＰＳ、ａＣＬ、ａＰＥおよびａＰＣの量を示しているグラフである。
【図２６】増加ヘミン量、および増加ヘミンおよびヘモペキシン（ｈｐｘ）とともにインキュベートした一連のＩｖＩｇ調製物中で検出された、（光学密度、ＯＤによって測定されたような）ａＰＳの量を示しているグラフである。
【図２７】抗ヒトＨＲＰタグ化共役物を対照として使用したブロットとともに、一次抗体として使用したヘミン処理ＩｖＩｇおよび未処理ＩｖＩｇで、３つの細胞溶解物を得たウエスタンブロットを示している。
【図２８】図２８Ａおよび２８Ｂは、９ボルト電池に接続した電極を、ＩｖＩｇを含むリン酸緩衝食塩水溶液中に２分間浸した、一連のＩｖＩｇ調製物中で検出した（多重平均、ＭｏＭｓによって測定されたような）ａＰＬ非依存性およびａＰＬ依存性ａＰＳ、ａＣＬ、ａＰＥおよびａＰＣの量を示しているグラフである。
【図２９】６ボルト電池に接続した電極をＩｖＩｇを含むリン酸緩衝食塩水溶液中に６０秒間浸した、一連のＩｖＩｇ調製物中で検出した、（多重平均、ＭｏＭｓによって測定されたような）ａＰＳ、ａＣＬ、ａＰＥおよびａＰＣの量を示しているグラフである。
【図３０】浸す時間に応じて、６ボルト電池に接続した電極を、ＩｖＩｇを含むリン酸緩衝食塩水溶液中に浸した、一連のＩｖＩｇ調製物中で検出した（多重平均、ＭｏＭｓによって測定されたような）ａＰＳ、ａＣＬ、ａＰＥおよびａＰＣの量を示しているグラフである。
【図３１Ａ】６ボルト電池に接続した電極へ、２４０秒間の暴露前後で、対照溶液中で検出された、それぞれ（多重平均、ＭｏＭｓによって測定されたような）ａＣＬの量を示しているグラフである。
【図３１Ｂ】６ボルト電池に接続した電極へ、２４０秒間の暴露前後で、対照溶液中で検出された、それぞれ（多重平均、ＭｏＭｓによって測定されたような）ａＰＳの量を示しているグラフである。
【図３１Ｃ】６ボルト電池に接続した電極へ、２４０秒間の暴露前後で、対照溶液中で検出された、それぞれ（多重平均、ＭｏＭｓによって測定されたような）ａＰＥの量を示しているグラフである。
【図３２】ａＰＳおよびａＣＬ陽性患者のＰＢＳ希釈血清中で検出した、（多重平均、ＭｏＭｓによって測定されたような）それぞれ、ａＰＳおよびａＣＬの量を示しているグラフである。この実験で、６ボルトの電池に接続した黒鉛電極を、様々な時間量で希釈血清中に浸した。
【図３３】ａＰＥ陽性患者のＰＢＳ希釈血清中で検出された、それぞれ、（多重平均、ＭｏＭｓによって測定されたような）ａＰＳ、ａＣＬ、ａＰＥおよびａＰＣの量を示しているグラフである。この実験で、６ボルトの電池に接続した黒鉛電極を、様々な時間量で希釈血清中に浸した。
【図３４】ａＰＥ陽性患者のＰＢＳ希釈血清中で検出された、それぞれ、（光学密度、ＯＤによって測定されたような）ａＰＳ、ａＣＬ、およびａＰＥの量を示しているグラフである。この実験で、タンパク質依存ａＰＬ結合の決定において使用した１０％成体ウシ血漿（ＡＢＰ）を、様々な時間量で、ＡＢＰ中に、６ボルト電池に接続した黒鉛電極を浸すことによって処置した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体培地中に懸濁または溶解した、少なくとも１つの血漿タンパク質からなる組成物を提供する工程であって、前記血漿タンパク質がその酸化還元状態の変化によって、可逆的に改変可能である結合特異性を有する工程、および
前記組成物を前記血漿タンパク質の結合特異性の可逆的な改変を引き起こすのに十分な酸化剤、または電位に暴露する工程からなる方法。
【請求項２】
前記液体培地が、希釈または未希釈の全血、血清または血漿である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記組成物が、液体培地中に懸濁または溶解した静脈内免疫グロブリン（ＩｖＩｇ）からなる請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記血漿タンパク質が、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭアイソタイプの抗体である請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記血漿タンパク質が、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭアイソタイプの自己抗体である請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記血漿タンパク質が、抗体以外の血漿タンパク質である請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記酸化剤が、ヘミンである請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記酸化剤が、ＫＭｎＯ4である請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記酸化剤が、クロロフィルである請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記酸化剤が、電子供与体として働く他の分子に対する電子受容体として働くことによって還元される能力を有する分子である請求項１記載の方法。
【請求項１１】
生体液または生体液の抽出物からなる組成物を提供する工程であって、前記生体液またはその抽出物が、酸化還元状態での変化によって改変可能な結合特異性を有する結合部位を持つ少なくとも１つのマスクされた循環タンパク質からなる工程、
前記組成物を、前記マスクされた循環タンパク質の結合特異性の改変を引き起こすのに十分な酸化剤または電位に暴露し、それによって、循環タンパク質を非マスク化する工程、および
前記組成物中の非マスク化循環タンパク質を検出し、または前記組成物から非マスク化循環タンパク質を回収する工程からなる方法。
【請求項１２】
前記生体液が、希釈または未希釈全血、血清、血漿または胎盤の臍帯血である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
抗体含有生体液、または生体液の抗体含有抽出物から、自己抗体を得て単離する方法であって、前記生体液またはその抽出物が、本方法を実施する前に、自己抗原への結合が不可能であり、したがって、レセプター−リガンド結合に基づくアッセイによって検出不可能である自己抗体を含むものであり、前記方法が、
前記生体液またはその抽出物を、自己抗体の結合特異性を改変し、前記自己抗体が、抗原に結合可能になり、それによって、レセプター−リガンド結合分離法によって、前記生体液またはその抽出物から検出可能および回収可能になるのに十分な、酸化剤、またはＤＣ電流へ暴露する工程、および
前記生体液から、自己抗体を回収する工程からなる方法。
【請求項１４】
前記生体液が、希釈または未希釈全血、血清または血漿である請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
生体液の前記抗体含有抽出物が、静脈免疫グロブリン（ＩｖＩｇ）である請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前記酸化剤が、ヘミンまたはクロロフィルである請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
前記酸化剤が、ＫＭｎＯ4である請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
自己抗体の抗原結合部位を非マスク化する自己抗体の酸化により引き起こされる自己免疫疾患を処置する方法であって、前記方法が、自己免疫疾患を有する被験者に、前記被験者における自己抗体を不活性化させるのに十分な量の抗酸化剤を投与する工程からなる方法。
【請求項１９】
自己抗体の抗原結合部位を非マスク化する自己抗体の酸化により引き起こされる自己免疫疾患を処置する方法であって、前記方法が、
自己免疫疾患を有する被験者から、血液試料を得る工程、
前記血液試料を、前記血液試料中の非マスク化自己抗体を不活性化するのに十分な抗酸化剤またはＤＣ電流に暴露する工程、および
血液試料を被験者に戻す工程からなる方法。
【請求項２０】
試料中で検出可能な自己抗体の量および／または種類を決定するために、被験者からの血液、血清または血漿試料をアッセイする工程、
酸化剤またはＤＣ電流に暴露することによって、被験者からの血液、血清または血漿試料を処置する工程、
処置した試料中で検出可能な自己抗体の量および／または種類を決定するために、被験者からの処置した血液、血清または血漿試料をアッセイする工程、および
未処置の試料中で検出可能な自己抗体の量および／または種類を、処置した試料中で検出可能な自己抗体の量および／または種類と比較する工程からなる方法。
【請求項２１】
含有された少なくとも１つのタンパク質の結合特異性を改変するのに十分な酸化剤またはＤＣ電流に暴露した、生体液、または生体液のタンパク質含有抽出物を含む製品であって、前記結合特異性が特異的な抗体またはリガンドに関する結合能力を有さないタンパク質から、特異的な抗体またはリガンドに関する結合能力を有するタンパク質に改変された製品。
【請求項２２】
前記生体液が、全血、血清または血漿である請求項２１記載の製品。
【請求項２３】
前記生体液のタンパク質含有抽出物が、静脈免疫グロブリン（ＩｖＩｇ）である請求項２１記載の製品。
【請求項２４】
前記少なくとも１つのタンパク質が、抗体である請求項２１記載の製品。
【請求項２５】
前記少なくとも１つのタンパク質が、自己抗体である請求項２１記載の製品。
【請求項２６】
前記酸化剤が、ヘミンまたはクロロフィルである請求項２１記載の製品。
【請求項２７】
前記酸化剤がＫＭｎＯ4である請求項２１記載の製品。
【請求項２８】
液体培地中に懸濁または溶解した、少なくとも１つの血漿タンパク質からなる組成物を提供する工程であって、前記血漿タンパク質がその酸化還元状態の変化によって、改変可能である結合特異性を有する工程、および
前記組成物を前記血漿タンパク質の結合特異性の改変を引き起こすのに十分な酸化剤、または電位に暴露する工程であって、前記結合特異性が特異的な抗体またはリガンドに関する結合能力を有さない前記血漿タンパク質から、特異的な抗体またはリガンドに関する結合能力を有する血前記漿タンパク質に、改変された工程からなる方法。
【請求項２９】
液体培地中に懸濁または溶解した、少なくとも１つの血漿タンパク質を含む組成物を提供する工程であって、前記血漿タンパク質がその酸化還元状態の変化によって、改変可能である結合特異性を有する工程、および
前記組成物を前記血漿タンパク質の結合特異性の改変を引き起こすのに十分な酸化剤、または電位に暴露する工程、および
改変された結合特異性を有する前記血漿タンパク質を検出する工程からなる方法。
【請求項１】
液体培地中に懸濁または溶解した、少なくとも１つの血漿タンパク質からなる組成物を提供する工程であって、前記血漿タンパク質がその酸化還元状態の変化によって、可逆的に改変可能である結合特異性を有する工程、および
前記組成物を前記血漿タンパク質の結合特異性の可逆的な改変を引き起こすのに十分な酸化剤、または電位に暴露する工程からなる方法。
【請求項２】
前記液体培地が、希釈または未希釈の全血、血清または血漿である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記組成物が、液体培地中に懸濁または溶解した静脈内免疫グロブリン（ＩｖＩｇ）からなる請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記血漿タンパク質が、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭアイソタイプの抗体である請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記血漿タンパク質が、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭアイソタイプの自己抗体である請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記血漿タンパク質が、抗体以外の血漿タンパク質である請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記酸化剤が、ヘミンである請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記酸化剤が、ＫＭｎＯ4である請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記酸化剤が、クロロフィルである請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記酸化剤が、電子供与体として働く他の分子に対する電子受容体として働くことによって還元される能力を有する分子である請求項１記載の方法。
【請求項１１】
生体液または生体液の抽出物からなる組成物を提供する工程であって、前記生体液またはその抽出物が、酸化還元状態での変化によって改変可能な結合特異性を有する結合部位を持つ少なくとも１つのマスクされた循環タンパク質からなる工程、
前記組成物を、前記マスクされた循環タンパク質の結合特異性の改変を引き起こすのに十分な酸化剤または電位に暴露し、それによって、循環タンパク質を非マスク化する工程、および
前記組成物中の非マスク化循環タンパク質を検出し、または前記組成物から非マスク化循環タンパク質を回収する工程からなる方法。
【請求項１２】
前記生体液が、希釈または未希釈全血、血清、血漿または胎盤の臍帯血である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
抗体含有生体液、または生体液の抗体含有抽出物から、自己抗体を得て単離する方法であって、前記生体液またはその抽出物が、本方法を実施する前に、自己抗原への結合が不可能であり、したがって、レセプター−リガンド結合に基づくアッセイによって検出不可能である自己抗体を含むものであり、前記方法が、
前記生体液またはその抽出物を、自己抗体の結合特異性を改変し、前記自己抗体が、抗原に結合可能になり、それによって、レセプター−リガンド結合分離法によって、前記生体液またはその抽出物から検出可能および回収可能になるのに十分な、酸化剤、またはＤＣ電流へ暴露する工程、および
前記生体液から、自己抗体を回収する工程からなる方法。
【請求項１４】
前記生体液が、希釈または未希釈全血、血清または血漿である請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
生体液の前記抗体含有抽出物が、静脈免疫グロブリン（ＩｖＩｇ）である請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前記酸化剤が、ヘミンまたはクロロフィルである請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
前記酸化剤が、ＫＭｎＯ4である請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
自己抗体の抗原結合部位を非マスク化する自己抗体の酸化により引き起こされる自己免疫疾患を処置する方法であって、前記方法が、自己免疫疾患を有する被験者に、前記被験者における自己抗体を不活性化させるのに十分な量の抗酸化剤を投与する工程からなる方法。
【請求項１９】
自己抗体の抗原結合部位を非マスク化する自己抗体の酸化により引き起こされる自己免疫疾患を処置する方法であって、前記方法が、
自己免疫疾患を有する被験者から、血液試料を得る工程、
前記血液試料を、前記血液試料中の非マスク化自己抗体を不活性化するのに十分な抗酸化剤またはＤＣ電流に暴露する工程、および
血液試料を被験者に戻す工程からなる方法。
【請求項２０】
試料中で検出可能な自己抗体の量および／または種類を決定するために、被験者からの血液、血清または血漿試料をアッセイする工程、
酸化剤またはＤＣ電流に暴露することによって、被験者からの血液、血清または血漿試料を処置する工程、
処置した試料中で検出可能な自己抗体の量および／または種類を決定するために、被験者からの処置した血液、血清または血漿試料をアッセイする工程、および
未処置の試料中で検出可能な自己抗体の量および／または種類を、処置した試料中で検出可能な自己抗体の量および／または種類と比較する工程からなる方法。
【請求項２１】
含有された少なくとも１つのタンパク質の結合特異性を改変するのに十分な酸化剤またはＤＣ電流に暴露した、生体液、または生体液のタンパク質含有抽出物を含む製品であって、前記結合特異性が特異的な抗体またはリガンドに関する結合能力を有さないタンパク質から、特異的な抗体またはリガンドに関する結合能力を有するタンパク質に改変された製品。
【請求項２２】
前記生体液が、全血、血清または血漿である請求項２１記載の製品。
【請求項２３】
前記生体液のタンパク質含有抽出物が、静脈免疫グロブリン（ＩｖＩｇ）である請求項２１記載の製品。
【請求項２４】
前記少なくとも１つのタンパク質が、抗体である請求項２１記載の製品。
【請求項２５】
前記少なくとも１つのタンパク質が、自己抗体である請求項２１記載の製品。
【請求項２６】
前記酸化剤が、ヘミンまたはクロロフィルである請求項２１記載の製品。
【請求項２７】
前記酸化剤がＫＭｎＯ4である請求項２１記載の製品。
【請求項２８】
液体培地中に懸濁または溶解した、少なくとも１つの血漿タンパク質からなる組成物を提供する工程であって、前記血漿タンパク質がその酸化還元状態の変化によって、改変可能である結合特異性を有する工程、および
前記組成物を前記血漿タンパク質の結合特異性の改変を引き起こすのに十分な酸化剤、または電位に暴露する工程であって、前記結合特異性が特異的な抗体またはリガンドに関する結合能力を有さない前記血漿タンパク質から、特異的な抗体またはリガンドに関する結合能力を有する血前記漿タンパク質に、改変された工程からなる方法。
【請求項２９】
液体培地中に懸濁または溶解した、少なくとも１つの血漿タンパク質を含む組成物を提供する工程であって、前記血漿タンパク質がその酸化還元状態の変化によって、改変可能である結合特異性を有する工程、および
前記組成物を前記血漿タンパク質の結合特異性の改変を引き起こすのに十分な酸化剤、または電位に暴露する工程、および
改変された結合特異性を有する前記血漿タンパク質を検出する工程からなる方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図１９Ｃ】
【図１９Ｄ】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１Ａ】
【図３１Ｂ】
【図３１Ｃ】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図１９Ｃ】
【図１９Ｄ】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１Ａ】
【図３１Ｂ】
【図３１Ｃ】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【公表番号】特表２００６−５２６０２７（Ｐ２００６−５２６０２７Ａ）
【公表日】平成１８年１１月１６日（２００６．１１．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１５２２９（Ｐ２００６−５１５２２９）
【出願日】平成１６年６月９日（２００４．６．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１７８８９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１１１６０８
【国際公開日】平成１６年１２月２３日（２００４．１２．２３）
【出願人】（５０５４３０４８１）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１１月１６日（２００６．１１．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月９日（２００４．６．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１７８８９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１１１６０８
【国際公開日】平成１６年１２月２３日（２００４．１２．２３）
【出願人】（５０５４３０４８１）
【Ｆターム（参考）】
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