酸化酵素の活性向上方法
【課題】本発明の目的は、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼの酵素活性を高め、これらの酸化酵素反応の効率を向上させる技術、とりわけ、バイオ燃料電池の出力増加をもたらし得る酵素反応技術を提供することである。
【解決手段】グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼを用いた酵素反応において、特定構造のベタイン誘導体を添加することによって、酵素反応効率を著しく向上させることが可能になる。
【解決手段】グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼを用いた酵素反応において、特定構造のベタイン誘導体を添加することによって、酵素反応効率を著しく向上させることが可能になる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼの酵素活性を高め、これらの酸化酵素反応の効率を向上させることができる技術、とりわけバイオ燃料電池における負極で電子を放出させる酵素反応系に好適に適用される技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、負極又は正極の少なくとも一方の電極上に触媒として酸化還元酵素を固定したバイオ燃料電池が注目されている。このバイオ燃料電池は、グルコース等の燃料を酵素により分解してプロトン（Ｈ+）と電子とに分離することにより、燃料の持つ化学エネルギーを電気エネルギーに直接変換することが可能になっている。現在では、バイオ燃料電池は、大規模発電、自動車の駆動用電源、パソコンやモバイル機器等のポータブル電源等への幅広い応用が試みられている。
【０００３】
グルコースを燃料として用いるバイオ燃料電池は、負極でグルコースの酸化反応が進行し、正極で大気中の酸素の還元反応が進行するように構成されている。当該バイオ燃料電池の代表的なものは、負極においては、グルコース、グルコースデヒドロゲナーゼ、補酵素、ジアホラーゼ、電子メディエーター、電極の順で、電子が受け渡されるように設計されている。
【０００４】
一方、一般に、酵素反応は、生成物やエフェクター分子との結合によって反応過程で反応速度が頭打ちになる場合が多い。このような酵素反応が頭打ちとなる現象は、酵素反応を利用する技術分野で問題となっており、バイオ燃料電池の場合もその例外ではない。即ち、バイオ燃料電池の実用化への障壁の一つとして、電極における酵素反応が頭打ちになり、負極から正極に受け渡される電子量が少なく、他の燃料電池に比して出力が小さいという問題が挙げられる。そのため、バイオ燃料電池において、酸化酵素（特に、グルコースデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼ）の反応効率を向上させ得る技術を開発できれば、バイオ燃料電池の実用化に多大なる貢献をもたらすと考えられる。
【０００５】
従来、酵素反応において、酵素活性を高める技術は報告されている。例えば、非特許文献１には、アルコールを酵素反応溶液に添加することにより酵素活性を向上させる方法が開示されている。非特許文献２には、ポリエチレングリコールを酵素反応溶液に添加することによって、酵素活性を向上できることが開示されている。非特許文献３には、グリシンが酵素活性を向上させることも開示されている。特許文献１には、特定構造のベタイン誘導体が酵素活性を向上させることも開示されている。しかしながら、酵素の種類は多種多様であり、酵素活性を高める技術は、使用する酵素の種類に応じて検討しなければならず、非特許文献１〜３及び特許文献１に開示されている技術も、あらゆる酵素の活性向上に適用できる訳ではない。実際に、非特許文献１〜３及び特許文献１に開示されている技術を適用しても、酵素活性の向上が認められない酵素も多数存在することが確認されている。更に、非特許文献１〜３及び特許文献１には、酸化酵素の活性を向上させる技術的手段については一切開示されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】S. N. Timasheff, Adv. Protein Chem., 51, 355 (1998)
【非特許文献２】K. Hayashi, et al., Nucleic Acids Res., 14, 7817 (1986)
【非特許文献３】V. Vathipadiekal, et al., Biol. Chem., 388, 61 (2007)
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2010-220607号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来、酸化酵素の酵素活性を高めて、反応効率を向上させるための具体的解決策は提言されていない。特に、バイオ燃料電池の出力増加をもたらし得る酸化酵素の活性を向上させる手法については、何ら知られていない。
そこで、本発明は、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼの酵素活性を高め、これらの酸化酵素反応の効率を向上させる技術、とりわけ、バイオ燃料電池の出力増加をもたらし得る酵素反応技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、上記課題を解決すべき鋭意検討を行ったところ、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼを用いた酵素反応において、特定構造のベタイン誘導体を添加することによって、酵素反応効率を著しく向上させることが可能になることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。
【００１０】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１． 下記一般式(1)に示すベタイン誘導体の存在下で、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼを用いた酵素反応を行うことを特徴とする、酵素反応方法。
【化１】
[一般式(1)中、R1〜R3は、同一又は異なって、炭素数１〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、R4は、ＣＯＯ−又はＳＯ３−、ｎは、１〜５の整数を示す。]
項２． グルコースデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼを組み合わせて同一反応系で酵素反応を行う、項１に記載の酵素反応方法。
項３． グルコースデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼの少なくとも１つ及び下記一般式(1)に示すベタイン誘導体を含む負極を有する、バイオ燃料電池。
【化２】
[一般式(1)中、R1〜R3は、同一又は異なって、炭素数１〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、R4は、ＣＯＯ−又はＳＯ３−、ｎは、１〜５の整数を示す。]
項４． 下記一般式(1)に示すベタイン誘導体からなる、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼの酵素反応効率の向上剤。
【化３】
[一般式(1)中、R1〜R3は、同一又は異なって、炭素数１〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、R4は、ＣＯＯ−又はＳＯ３−、ｎは、１〜５の整数を示す。]
項５． 項１又は２に記載の酵素反応方法を行うためのキットであって、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼ、並びに一般式(1)に示すベタイン誘導体を含有する、前記キット。
【化４】
[一般式(1)中、R1〜R3は、同一又は異なって、炭素数１〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、R4は、ＣＯＯ−又はＳＯ３−、ｎは、１〜５の整数を示す。]
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼを用いた酵素反応において、酵素反応効率を向上させることにより、グルコースからプロトンと電子の遊離、又は酸化型補酵素（ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋等）とプロトンによる還元型補酵素（ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ等）の生成を効率的に進行させることができる。特に、本発明は、グルコースを燃料として用いたバイオ燃料電池における電極反応系に好適に適用することができ、バイオ燃料電池の出力増加に寄与し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１において、グルコースデヒドロゲナーゼを用いた酵素反応において、ベタイン誘導体の添加による酵素反応効率を評価した結果を示す図である。
【図２】実施例２において、ジアホラーゼを用いた酵素反応において、ベタイン誘導体の添加による酵素反応効率を評価した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．酵素反応方法
本発明の酵素反応方法は、一般式(1)に示すベタイン誘導体の存在下で、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼを用いた酵素反応を行うことを特徴とする。
【００１４】
本発明で使用するベタイン誘導体は、以下の一般式(1)に示す構造である。
【化５】
【００１５】
一般式(1)中、R1〜R3は、同一又は異なって、炭素数１〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、好ましくは炭素数１〜４の直鎖又は分岐状のアルキル基、更に好ましくは炭素数１〜４の直鎖状のアルキル基を示す。
また、一般式(1)中、R4は、ＣＯＯ−又はＳＯ３−を示す。
また、一般式(1)中、ｎは、１〜５、好ましくは１〜３、更に好ましくは１又は３の整数を示す。
【００１６】
グルコースデヒドロゲナーゼの酵素反応に使用する場合には、一般式(1)に示すベタイン誘導体の中でも、好ましくは、一般式(1)中、R1〜R3が、炭素数２〜４の直鎖状のアルキル基、更に好ましくは炭素数２又は４の直鎖状のアルキル基、R4が、ＣＯＯ−、且つｎが１〜３の整数、更に好ましくは１であるもの；或いはR1〜R3が、炭素数１〜３の直鎖状のアルキル基、更に好ましくは炭素数２の直鎖状のアルキル基、R4が、ＳＯ３−、且つｎが２〜４の整数、更に好ましくは３であるものが例示される。
【００１７】
また、ジアホラーゼの酵素反応に使用する場合には、一般式(1)に示すベタイン誘導体の中でも、好ましくは、一般式(1)中、R1〜R3が、炭素数１〜４の直鎖状のアルキル基、更に好ましくは炭素数１〜３の直鎖状のアルキル基、R4が、ＣＯＯ−、且つｎが１〜３の整数、更に好ましくは１であるもの；或いはR1〜R3が、炭素数１〜３の直鎖状のアルキル基、更に好ましくは炭素数１の直鎖状のアルキル基、R4が、ＳＯ３−、且つｎが２〜４の整数、更に好ましくは３であるものが例示される。
【００１８】
更に、グルコースデヒドロゲナーゼとジアホラーゼの双方を用いて同一の反応系内で双方の酸化酵素による酵素反応を行う場合には、一般式(1)に示すベタイン誘導体の中でも、好ましくは、一般式(1)中、R1〜R3が、炭素数２〜３の直鎖状のアルキル基、R4が、ＣＯＯ−、且つｎが１〜３の整数、更に好ましくは１であるもの；或いはR1〜R3が、炭素数２〜３の直鎖状のアルキル基、更に好ましくは炭素数２の直鎖状のアルキル基、R4が、ＳＯ３−、且つｎが２〜４の整数、更に好ましくは３であるものが例示される。とりわけ、一般式(1)中、R1〜R3が、炭素数２のアルキル基、R4が、ＣＯＯ−、且つｎが１〜３の整数、特に１であるものが、双方の酸化酵素の活性を顕著に向上させ得るので好適である。
【００１９】
一般式(1)に示すベタイン誘導体の製造方法については、例えば、特開2009-96766号公報等で公知であり、更に公知の有機合成法から導き出されるものである。
【００２０】
本発明の酵素反応方法では、酸化酵素として、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼを使用する。
【００２１】
グルコースデヒドロゲナーゼは、酸化型補酵素（ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋等）の存在下でグルコースを脱水素してグルコノ−δ−ラクトンとプロトンを生成させる。当該反応によって、酸化型補酵素は、還元型補酵素（ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ等）に変換される。
本発明に使用されるグルコースデヒドロゲナーゼは、上記反応を行うことができる限り、その種類については、特に制限されないが、ＮＡＤ＋依存型のグルコースデヒドロゲナーゼが好ましい。また、本発明では、酵素反応効率を一層向上させるために、耐熱性のグルコースデヒドロゲナーゼを使用してもよい。
また、本発明に使用されるグルコースデヒドロゲナーゼは、微生物から単離したもの、その変異体、遺伝子組換技術により製造したもの等であってもよい。
【００２２】
また、ジアホラーゼは、電子受容体の存在下で、還元型補酵素（ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ）を酸化して、酸化型補酵素（ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋等）とプロトンと電子を生成させる。当該反応によって、還元型補酵素１分子あたり、酸化型補酵素１分子と、プロトン１個と、電子２個が生成する。生成した電子は電子受容体の還元に使用され、電子受容体は電子供与体に変換される。
本発明に使用されるジアホラーゼは、上記反応を行うことができる限り、その種類については、特に制限されないが、ＮＡＤＨを還元できるものが好ましい。また、本発明では、酵素反応効率を一層向上させるために、耐熱性のジアホラーゼを使用してもよい。
また、本発明に使用されるジアホラーゼは、微生物から単離したもの、その変異体、遺伝子組換技術により製造したもの等であってもよい。
【００２３】
また、ジアホラーゼによる酵素反応で使用される電子受容体としては、バイオ燃料電池の電子メディエーターとして使用し得る物質、即ち酸化と還元を可逆的に行う物質であることが好ましく、このような電子受容体としては、２，３−ジメトキシ−５−メチル−１，４−ベンゾキノン（Ｑ０）や、ナフトキノン骨格を有する化合物、例えば、２−アミノ−１，４−ナフトキノン（ＡＮＱ）、２−アミノ−３−メチル−１，４−ナフトキノン（ＡＭＮＱ）、２−メチル−１，４−ナフトキノン（ＶＫ３）、２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン（ＡＣＮＱ）、ビタミンＫ１等のナフトキノン誘導体；フェロセンメタノール等のフェロセン誘導体；フェリシアン化カリウム；オスミウム錯体；ルテニウム錯体；フェノチアジン誘導体；フェナジンメトサルフェート誘導体；ｐ−アミノフェノール；メルドーラブルー；２，６−ジクロロフェノールインドフェノール等が挙げられる。これらの電子受容体は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００２４】
本発明の酵素反応では、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼを使用する従来の酵素反応系に、上記一般式(1)に示すベタイン誘導体を添加することにより行われる。
【００２５】
本発明の酵素反応において、酵素、一般式(1)に示すベタイン誘導体、補酵素、基質等の濃度については、特に制限されず、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼが使用される酵素反応での一般的な濃度範囲であればよい。
【００２６】
例えば、酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼを使用する場合、反応開始時に、適量のグルコースデヒドロゲナーゼの存在下で、グルコース１モル当たり、酸化型補酵素を0.0001〜0.5モル、一般式(1)に示すベタイン誘導体を0.01〜3モルの比率で共存させればよい。
【００２７】
また、例えば、酵素としてジアホラーゼを使用する場合、反応開始時に、適量のジアホラーゼの存在下で、還元型補酵素を１モル当たり、電子受容体を0.0001〜0.5モル、一般式(1)に示すベタイン誘導体を0.01〜12.5モルの比率で共存させればよい。
【００２８】
更に、例えば、酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼを組み合わせて同一反応系で行う場合、反応開始時に、適量のグルコースデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼの存在下で、グルコース１モル当たり、補酵素（酸化型補酵素と還元型補酵素の総量）を0.0001〜0.5モル、電子受容体を0.0001〜0.5モル、一般式(1)に示すベタイン誘導体を0.01〜12.5モルの比率で共存させればよい。
【００２９】
本発明の酵素反応における反応温度は、使用する酸化酵素の特性に応じて、適宜設定すればよく、使用する酸化酵素の至適温度であることが望ましいが、使用する酸化酵素が作用可能であることを限り、温度調整を行わず、酵素反応が行われる環境の温度であってもよい。
【００３０】
本発明の酵素反応は、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼの酵素反応を行うのに適した溶媒（例えば、緩衝液）中で行われる。
【００３１】
２．バイオ燃料電池
本発明は、上記酵素反応を利用するバイオ燃料電池を提供する。
【００３２】
本発明のバイオ燃料電池では、負極において、グルコースデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼの少なくとも１つ及び一般式(1)に示すベタイン誘導体を含むように構成される。
【００３３】
例えば、バイオ燃料電池の負極において、酸化酵素として、グルコースデヒドロゲナーゼと、ジアホラーゼ以外の酸化酵素を使用する場合（実施態様１）、グルコースデヒドロゲナーゼ以外の酸化酵素と、ジアホラーゼを使用する場合（実施態様２）、グルコースデヒドロゲナーゼとジアホラーゼを使用する場合（実施態様３）が包含される。
【００３４】
実施態様１では、グルコースデヒドロゲナーゼと、ジアホラーゼ以外の酸化酵素とが負極に固定化される。当該実施態様１に使用されるジアホラーゼ以外の酸化酵素としては、グルコースデヒドロゲナーゼの酵素反応により生成する還元型補酵素（ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ等）を酸化して、酸化型補酵素（ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋等）に変換できるものが使用される。当該実施態様１では、燃料化合物として使用されるグルコースが適当な溶媒（溶媒（例えば、リン酸緩衝液やトリス緩衝液等の緩衝液）に溶解されて、燃料溶液として使用される。また、当該実施態様１において、一般式(1)に示すベタイン誘導体、補酵素及び電子メディエーターは、燃料溶液に含ませてもよいが、負極に固定化することが望ましい。当該実施態様１では、グルコースデヒドロゲナーゼによってグルコースが酸化されると共に還元型補酵素が生成し、ジアホラーゼ以外の酸化酵素により還元型補酵素が酸化型補酵素に戻されて、電子を生じさせる。当該実施態様１では、グルコース１分子あたり、２個の電子がと２個のプロトンが生成される。
【００３５】
実施態様２では、グルコースデヒドロゲナーゼ以外の酸化酵素と、ジアホラーゼが負極に固定化される。当該実施態様２に使用されるグルコースデヒドロゲナーゼ以外の酸化酵素としては、クエン酸回路に関与する各種の有機酸や、ペントースリン酸回路および解糖系に関与する糖又は有機酸を燃料化合物として、これらを酸化型補酵素の存在下で酸化し、酸化型補酵素を還元型補酵素に変換できるものが使用される。当該実施態様２では、燃料化合物として使用される有機酸や糖が適当な溶媒（溶媒（例えば、リン酸緩衝液やトリス緩衝液等の緩衝液）に溶解されて、燃料溶液として使用される。また、当該実施態様２において、一般式(1)に示すベタイン誘導体、補酵素及び電子メディエーターは、燃料溶液に含ませてもよいが、負極に固定化することが望ましい。当該実施態様２では、グルコースデヒドロゲナーゼ以外の酸化酵素によって燃料化合物が酸化されると共に還元型補酵素が生成し、ジアホラーゼにより還元型補酵素が酸化型補酵素に戻されて、電子を生じさせる。当該実施態様１では、燃料化合物から電子とプロトンが生成される。
【００３６】
実施態様３では、グルコースデヒドロゲナーゼと、ジアホラーゼが負極に固定化される。当該実施態様３では、燃料として使用されるグルコースが適当な溶媒（溶媒（例えば、リン酸緩衝液やトリス緩衝液等の緩衝液）に溶解されて、燃料溶液として使用される。また、当該実施態様３において、一般式(1)に示すベタイン誘導体、補酵素及び電子メディエーターは、燃料溶液に含ませてもよいが、負極に固定化することが望ましい。当該実施態様３では、グルコースデヒドロゲナーゼによってグルコースが酸化されると共に還元型補酵素が生成し、ジアホラーにより還元型補酵素が酸化型補酵素に戻されて、電子を生じさせる。当該実施態様３では、グルコース１分子あたり、２個の電子がと２個のプロトンが生成される。
【００３７】
負極に使用される上記電子メディエーターとしては、補酵素に受け渡された電子を負極に移動させ得るものである限り、特に制限されないが、好適には、上記「１．酵素反応方法」の欄に記載した電子受容体が例示される。電子メディエーターを負極に固定化する場合、平均値で０．６４×１０-6ｍｏｌ／ｍｍ2 以上となるように固定化することが望ましい。
【００３８】
上記負極において、燃料化合物、酸化酵素、補酵素の使用量については、上記「１．酵素反応方法」の欄に記載の比率を目安にして適宜設定すればよい。
【００３９】
本発明のバイオ燃料電池は、負極で発生したプロトンがプロトン伝導体を通って正極まで移動するように構成される。また、負極で発生した電子は、外部回路を通って正極に送られる。正極では、負極から移動してきたプロトンと、外部から供給された酸素と、外部回路を通って正極に送られた電子とが反応して、水（Ｈ２Ｏ）が生じるように構成される。
【００４０】
上記プロトン電素導体としては、電子伝導性を持たず、プロトンを伝導する性質を備えるものである限り、特に制限されず、通常の燃料電池にも使用されるものを用いることができる。
【００４１】
正極は、プロトンと、酸素と、電子とが反応して、水が生じるように構成される限り、特に制限されないが、好ましくは、酸素還元酵素を利用するように構成されていることが望ましい。正極に使用される酸素還元酵素としては、例えば、ビリルビンオキシダーゼ、ラッカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。当該酸素還元酵素は、正極に固定化されて使用される。正極おける酸素還元酵素の使用量については、一般的なバイオ燃料電池の正極の場合と同様の範囲に設定すればよい。
【００４２】
また、正極には、電子メディエーターが固定化されていることが好ましく、当該電子メディエーターとしては、例えば、オクタシアノタングステン酸カリウム、ヘキサシアノ鉄酸カリウム、フェリシアン化カリウム等が挙げられる。電子メディエーターを正極に固定化する場合、平均値で０．６４×１０-6ｍｏｌ／ｍｍ2 以上となるように固定化することが望ましい。
【００４３】
正極及び負極の電極における酵素、補酵素、一般式(1)に示すベタイン誘導体、電子メディエーター等の固定化は、当該技術分野で公知の方法で行うことができる。
正極及び負極の電極の材料としては、例えば、多孔質カーボン、カーボンペレット、カーボンフェルト、カーボンペーパー等のカーボン系材料を使用することができる。
【００４４】
本発明のバイオ燃料電池は、コイン型、ボタン型等の各種形状にすることができる。
【００４５】
本発明のバイオ燃料電池は、例えば、電子機器、移動体（自動車、二輪車、航空機、ロケット、宇宙船等）、動力装置等に用いることができる。
【００４６】
３．グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼの酵素反応効率の向上剤
また、本発明は、一般式(1)に示すベタイン誘導体からなる、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼの酵素反応効率の向上剤を提供する。
当該剤は、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼを使用する酵素反応系で、反応効率を向上させるために使用されるものであり、その使用態様は、前記「１．酵素反応方法」の欄に記載の通りである。
【００４７】
４．キット
更に、本発明は、上記酵素反応方法を行うためのキットをも提供する。
本発明のキットは、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼ、並びに一般式(1)に示すベタイン誘導体を含む。
本発明のキットは、必要に応じて、酵素反応に使用する補酵素を含んでいてもよく、また、ジアホラーゼの酵素反応方法を行うためのキットの場合には、電子受容体を含んでいてもよい。
また、本発明のキットは、前述する酵素反応についてのプロトコールを示した実験手順書が含まれていてもよい。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例を挙げて、本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４９】
試験例１：グルコースデヒドロゲナーゼの反応効率の評価
グルコースデヒドロゲナーゼの酵素活性について、ベタイン誘導体の添加効果を評価した。基質としてはグルコース、酸化型補酵素としてＮＡＤ＋、ベタイン誘導体としては、下記のベタイン１〜５を用いた。
【００５０】
【化６】
【００５１】
酵素反応は、以下の条件で行った。先ず、２Ｍのイミダゾール緩衝溶液（ｐＨ７．０）、グルコースデヒドロゲナーゼ0.875μｇ、0.015〜0.5Ｍのベタイン誘導体、0.4Ｍのグルコース、1.5 mＭのＮＡＤ＋を含む酵素反応液を調製し、２５℃で３分間インキュベートし酵素反応を行った。また、コントロールとして、ベタイン誘導体を添加しないこと以外は上記と同条件で、酵素反応を行った。
酵素反応によって生成するNADHの生成量を340 nmにおける吸光度を測定することにより、１分間に酸化されるグルコース量を測定した。NADHの分子吸光係数は6.22/mM/cmを用いた。コントロールにおける反応生成物の生成量を１００％として、各ベタイン誘導体を添加した場合の反応生成物の生成量を相対活性（％）として算出した。
【００５２】
この結果を図１に示す。この結果から、ベタイン１〜５を添加した場合に、それらの添加濃度によってその挙動が異なるものの、コントロールに比して、グルコースデヒドロゲナーゼ活性の向上が認められた。とりわけ、ベタイン１、３、及び５を添加した場合に、顕著なグルコースデヒドロゲナーゼ活性の向上が認められた。
以上の結果から、本発明で規定する一般式(1)に示すベタイン誘導体を選択し、これをグルコースデヒドロゲナーゼによる酵素反応系に添加することによって、グルコースデヒドロゲナーゼの酵素反応効率を高め得ることが明らかとなった。
【００５３】
試験例２：発色基質の発色効率の評価−２
ジアホラーゼの酵素活性について、ベタイン誘導体の添加効果を評価した。還元型補酵素としてはＮＡＤＨ、電子受容体としてＡＮＱ（2-amino-1,4-naphthoquinone）、ベタイン誘導体としては、実施例１で使用したベタイン１〜５を用いた。
【００５４】
酵素反応は、以下の条件で行った。先ず、２Ｍのイミダゾール緩衝溶液（ｐＨ７．０）、ジアホラーゼ０．１８μg、0.03〜0.5Ｍのベタイン誘導体、40mＭのＮＡＤＨ、0.3ｍＭのＡＮＱを含む酵素反応液を調製し、２５℃で３分間インキュベートし酵素反応を行った。また、コントロールとして、ベタイン誘導体を添加しないこと以外は上記と同条件で、酵素反応を行った。
【００５５】
ANQの還元に伴って減少する４６５ｎｍにおける吸光度変化を測定することにより、酵素活性を測定した。ANQの分子吸光係数は12/mM/cmを用いた。コントロールにおける反応生成物の生成量を１００％として、各ベタイン誘導体を添加した場合の反応生成物の生成量を相対活性（％）として算出した。
【００５６】
この結果を図２に示す。この結果から、ベタイン１〜５を添加した場合に、それらの添加濃度によってその挙動が異なるものの、コントロールに比して、ジアホラーゼ活性の向上が認められた。とりわけ、ベタイン１、２、４、及び５、特にベタイン1を添加した場合に、顕著なジアホラーゼ活性の向上が認められた。
以上の結果から、本発明で規定する一般式(1)に示すベタイン誘導体を選択し、これをジアホラーゼによる酵素反応系に添加することによって、ジアホラーゼの酵素反応効率を高め得ることが明らかとなった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼの酵素活性を高め、これらの酸化酵素反応の効率を向上させることができる技術、とりわけバイオ燃料電池における負極で電子を放出させる酵素反応系に好適に適用される技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、負極又は正極の少なくとも一方の電極上に触媒として酸化還元酵素を固定したバイオ燃料電池が注目されている。このバイオ燃料電池は、グルコース等の燃料を酵素により分解してプロトン（Ｈ+）と電子とに分離することにより、燃料の持つ化学エネルギーを電気エネルギーに直接変換することが可能になっている。現在では、バイオ燃料電池は、大規模発電、自動車の駆動用電源、パソコンやモバイル機器等のポータブル電源等への幅広い応用が試みられている。
【０００３】
グルコースを燃料として用いるバイオ燃料電池は、負極でグルコースの酸化反応が進行し、正極で大気中の酸素の還元反応が進行するように構成されている。当該バイオ燃料電池の代表的なものは、負極においては、グルコース、グルコースデヒドロゲナーゼ、補酵素、ジアホラーゼ、電子メディエーター、電極の順で、電子が受け渡されるように設計されている。
【０００４】
一方、一般に、酵素反応は、生成物やエフェクター分子との結合によって反応過程で反応速度が頭打ちになる場合が多い。このような酵素反応が頭打ちとなる現象は、酵素反応を利用する技術分野で問題となっており、バイオ燃料電池の場合もその例外ではない。即ち、バイオ燃料電池の実用化への障壁の一つとして、電極における酵素反応が頭打ちになり、負極から正極に受け渡される電子量が少なく、他の燃料電池に比して出力が小さいという問題が挙げられる。そのため、バイオ燃料電池において、酸化酵素（特に、グルコースデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼ）の反応効率を向上させ得る技術を開発できれば、バイオ燃料電池の実用化に多大なる貢献をもたらすと考えられる。
【０００５】
従来、酵素反応において、酵素活性を高める技術は報告されている。例えば、非特許文献１には、アルコールを酵素反応溶液に添加することにより酵素活性を向上させる方法が開示されている。非特許文献２には、ポリエチレングリコールを酵素反応溶液に添加することによって、酵素活性を向上できることが開示されている。非特許文献３には、グリシンが酵素活性を向上させることも開示されている。特許文献１には、特定構造のベタイン誘導体が酵素活性を向上させることも開示されている。しかしながら、酵素の種類は多種多様であり、酵素活性を高める技術は、使用する酵素の種類に応じて検討しなければならず、非特許文献１〜３及び特許文献１に開示されている技術も、あらゆる酵素の活性向上に適用できる訳ではない。実際に、非特許文献１〜３及び特許文献１に開示されている技術を適用しても、酵素活性の向上が認められない酵素も多数存在することが確認されている。更に、非特許文献１〜３及び特許文献１には、酸化酵素の活性を向上させる技術的手段については一切開示されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】S. N. Timasheff, Adv. Protein Chem., 51, 355 (1998)
【非特許文献２】K. Hayashi, et al., Nucleic Acids Res., 14, 7817 (1986)
【非特許文献３】V. Vathipadiekal, et al., Biol. Chem., 388, 61 (2007)
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2010-220607号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来、酸化酵素の酵素活性を高めて、反応効率を向上させるための具体的解決策は提言されていない。特に、バイオ燃料電池の出力増加をもたらし得る酸化酵素の活性を向上させる手法については、何ら知られていない。
そこで、本発明は、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼの酵素活性を高め、これらの酸化酵素反応の効率を向上させる技術、とりわけ、バイオ燃料電池の出力増加をもたらし得る酵素反応技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、上記課題を解決すべき鋭意検討を行ったところ、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼを用いた酵素反応において、特定構造のベタイン誘導体を添加することによって、酵素反応効率を著しく向上させることが可能になることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。
【００１０】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１． 下記一般式(1)に示すベタイン誘導体の存在下で、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼを用いた酵素反応を行うことを特徴とする、酵素反応方法。
【化１】
[一般式(1)中、R1〜R3は、同一又は異なって、炭素数１〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、R4は、ＣＯＯ−又はＳＯ３−、ｎは、１〜５の整数を示す。]
項２． グルコースデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼを組み合わせて同一反応系で酵素反応を行う、項１に記載の酵素反応方法。
項３． グルコースデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼの少なくとも１つ及び下記一般式(1)に示すベタイン誘導体を含む負極を有する、バイオ燃料電池。
【化２】
[一般式(1)中、R1〜R3は、同一又は異なって、炭素数１〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、R4は、ＣＯＯ−又はＳＯ３−、ｎは、１〜５の整数を示す。]
項４． 下記一般式(1)に示すベタイン誘導体からなる、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼの酵素反応効率の向上剤。
【化３】
[一般式(1)中、R1〜R3は、同一又は異なって、炭素数１〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、R4は、ＣＯＯ−又はＳＯ３−、ｎは、１〜５の整数を示す。]
項５． 項１又は２に記載の酵素反応方法を行うためのキットであって、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼ、並びに一般式(1)に示すベタイン誘導体を含有する、前記キット。
【化４】
[一般式(1)中、R1〜R3は、同一又は異なって、炭素数１〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、R4は、ＣＯＯ−又はＳＯ３−、ｎは、１〜５の整数を示す。]
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼを用いた酵素反応において、酵素反応効率を向上させることにより、グルコースからプロトンと電子の遊離、又は酸化型補酵素（ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋等）とプロトンによる還元型補酵素（ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ等）の生成を効率的に進行させることができる。特に、本発明は、グルコースを燃料として用いたバイオ燃料電池における電極反応系に好適に適用することができ、バイオ燃料電池の出力増加に寄与し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１において、グルコースデヒドロゲナーゼを用いた酵素反応において、ベタイン誘導体の添加による酵素反応効率を評価した結果を示す図である。
【図２】実施例２において、ジアホラーゼを用いた酵素反応において、ベタイン誘導体の添加による酵素反応効率を評価した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．酵素反応方法
本発明の酵素反応方法は、一般式(1)に示すベタイン誘導体の存在下で、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼを用いた酵素反応を行うことを特徴とする。
【００１４】
本発明で使用するベタイン誘導体は、以下の一般式(1)に示す構造である。
【化５】
【００１５】
一般式(1)中、R1〜R3は、同一又は異なって、炭素数１〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、好ましくは炭素数１〜４の直鎖又は分岐状のアルキル基、更に好ましくは炭素数１〜４の直鎖状のアルキル基を示す。
また、一般式(1)中、R4は、ＣＯＯ−又はＳＯ３−を示す。
また、一般式(1)中、ｎは、１〜５、好ましくは１〜３、更に好ましくは１又は３の整数を示す。
【００１６】
グルコースデヒドロゲナーゼの酵素反応に使用する場合には、一般式(1)に示すベタイン誘導体の中でも、好ましくは、一般式(1)中、R1〜R3が、炭素数２〜４の直鎖状のアルキル基、更に好ましくは炭素数２又は４の直鎖状のアルキル基、R4が、ＣＯＯ−、且つｎが１〜３の整数、更に好ましくは１であるもの；或いはR1〜R3が、炭素数１〜３の直鎖状のアルキル基、更に好ましくは炭素数２の直鎖状のアルキル基、R4が、ＳＯ３−、且つｎが２〜４の整数、更に好ましくは３であるものが例示される。
【００１７】
また、ジアホラーゼの酵素反応に使用する場合には、一般式(1)に示すベタイン誘導体の中でも、好ましくは、一般式(1)中、R1〜R3が、炭素数１〜４の直鎖状のアルキル基、更に好ましくは炭素数１〜３の直鎖状のアルキル基、R4が、ＣＯＯ−、且つｎが１〜３の整数、更に好ましくは１であるもの；或いはR1〜R3が、炭素数１〜３の直鎖状のアルキル基、更に好ましくは炭素数１の直鎖状のアルキル基、R4が、ＳＯ３−、且つｎが２〜４の整数、更に好ましくは３であるものが例示される。
【００１８】
更に、グルコースデヒドロゲナーゼとジアホラーゼの双方を用いて同一の反応系内で双方の酸化酵素による酵素反応を行う場合には、一般式(1)に示すベタイン誘導体の中でも、好ましくは、一般式(1)中、R1〜R3が、炭素数２〜３の直鎖状のアルキル基、R4が、ＣＯＯ−、且つｎが１〜３の整数、更に好ましくは１であるもの；或いはR1〜R3が、炭素数２〜３の直鎖状のアルキル基、更に好ましくは炭素数２の直鎖状のアルキル基、R4が、ＳＯ３−、且つｎが２〜４の整数、更に好ましくは３であるものが例示される。とりわけ、一般式(1)中、R1〜R3が、炭素数２のアルキル基、R4が、ＣＯＯ−、且つｎが１〜３の整数、特に１であるものが、双方の酸化酵素の活性を顕著に向上させ得るので好適である。
【００１９】
一般式(1)に示すベタイン誘導体の製造方法については、例えば、特開2009-96766号公報等で公知であり、更に公知の有機合成法から導き出されるものである。
【００２０】
本発明の酵素反応方法では、酸化酵素として、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼを使用する。
【００２１】
グルコースデヒドロゲナーゼは、酸化型補酵素（ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋等）の存在下でグルコースを脱水素してグルコノ−δ−ラクトンとプロトンを生成させる。当該反応によって、酸化型補酵素は、還元型補酵素（ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ等）に変換される。
本発明に使用されるグルコースデヒドロゲナーゼは、上記反応を行うことができる限り、その種類については、特に制限されないが、ＮＡＤ＋依存型のグルコースデヒドロゲナーゼが好ましい。また、本発明では、酵素反応効率を一層向上させるために、耐熱性のグルコースデヒドロゲナーゼを使用してもよい。
また、本発明に使用されるグルコースデヒドロゲナーゼは、微生物から単離したもの、その変異体、遺伝子組換技術により製造したもの等であってもよい。
【００２２】
また、ジアホラーゼは、電子受容体の存在下で、還元型補酵素（ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ）を酸化して、酸化型補酵素（ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋等）とプロトンと電子を生成させる。当該反応によって、還元型補酵素１分子あたり、酸化型補酵素１分子と、プロトン１個と、電子２個が生成する。生成した電子は電子受容体の還元に使用され、電子受容体は電子供与体に変換される。
本発明に使用されるジアホラーゼは、上記反応を行うことができる限り、その種類については、特に制限されないが、ＮＡＤＨを還元できるものが好ましい。また、本発明では、酵素反応効率を一層向上させるために、耐熱性のジアホラーゼを使用してもよい。
また、本発明に使用されるジアホラーゼは、微生物から単離したもの、その変異体、遺伝子組換技術により製造したもの等であってもよい。
【００２３】
また、ジアホラーゼによる酵素反応で使用される電子受容体としては、バイオ燃料電池の電子メディエーターとして使用し得る物質、即ち酸化と還元を可逆的に行う物質であることが好ましく、このような電子受容体としては、２，３−ジメトキシ−５−メチル−１，４−ベンゾキノン（Ｑ０）や、ナフトキノン骨格を有する化合物、例えば、２−アミノ−１，４−ナフトキノン（ＡＮＱ）、２−アミノ−３−メチル−１，４−ナフトキノン（ＡＭＮＱ）、２−メチル−１，４−ナフトキノン（ＶＫ３）、２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン（ＡＣＮＱ）、ビタミンＫ１等のナフトキノン誘導体；フェロセンメタノール等のフェロセン誘導体；フェリシアン化カリウム；オスミウム錯体；ルテニウム錯体；フェノチアジン誘導体；フェナジンメトサルフェート誘導体；ｐ−アミノフェノール；メルドーラブルー；２，６−ジクロロフェノールインドフェノール等が挙げられる。これらの電子受容体は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００２４】
本発明の酵素反応では、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼを使用する従来の酵素反応系に、上記一般式(1)に示すベタイン誘導体を添加することにより行われる。
【００２５】
本発明の酵素反応において、酵素、一般式(1)に示すベタイン誘導体、補酵素、基質等の濃度については、特に制限されず、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼが使用される酵素反応での一般的な濃度範囲であればよい。
【００２６】
例えば、酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼを使用する場合、反応開始時に、適量のグルコースデヒドロゲナーゼの存在下で、グルコース１モル当たり、酸化型補酵素を0.0001〜0.5モル、一般式(1)に示すベタイン誘導体を0.01〜3モルの比率で共存させればよい。
【００２７】
また、例えば、酵素としてジアホラーゼを使用する場合、反応開始時に、適量のジアホラーゼの存在下で、還元型補酵素を１モル当たり、電子受容体を0.0001〜0.5モル、一般式(1)に示すベタイン誘導体を0.01〜12.5モルの比率で共存させればよい。
【００２８】
更に、例えば、酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼを組み合わせて同一反応系で行う場合、反応開始時に、適量のグルコースデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼの存在下で、グルコース１モル当たり、補酵素（酸化型補酵素と還元型補酵素の総量）を0.0001〜0.5モル、電子受容体を0.0001〜0.5モル、一般式(1)に示すベタイン誘導体を0.01〜12.5モルの比率で共存させればよい。
【００２９】
本発明の酵素反応における反応温度は、使用する酸化酵素の特性に応じて、適宜設定すればよく、使用する酸化酵素の至適温度であることが望ましいが、使用する酸化酵素が作用可能であることを限り、温度調整を行わず、酵素反応が行われる環境の温度であってもよい。
【００３０】
本発明の酵素反応は、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼの酵素反応を行うのに適した溶媒（例えば、緩衝液）中で行われる。
【００３１】
２．バイオ燃料電池
本発明は、上記酵素反応を利用するバイオ燃料電池を提供する。
【００３２】
本発明のバイオ燃料電池では、負極において、グルコースデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼの少なくとも１つ及び一般式(1)に示すベタイン誘導体を含むように構成される。
【００３３】
例えば、バイオ燃料電池の負極において、酸化酵素として、グルコースデヒドロゲナーゼと、ジアホラーゼ以外の酸化酵素を使用する場合（実施態様１）、グルコースデヒドロゲナーゼ以外の酸化酵素と、ジアホラーゼを使用する場合（実施態様２）、グルコースデヒドロゲナーゼとジアホラーゼを使用する場合（実施態様３）が包含される。
【００３４】
実施態様１では、グルコースデヒドロゲナーゼと、ジアホラーゼ以外の酸化酵素とが負極に固定化される。当該実施態様１に使用されるジアホラーゼ以外の酸化酵素としては、グルコースデヒドロゲナーゼの酵素反応により生成する還元型補酵素（ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ等）を酸化して、酸化型補酵素（ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋等）に変換できるものが使用される。当該実施態様１では、燃料化合物として使用されるグルコースが適当な溶媒（溶媒（例えば、リン酸緩衝液やトリス緩衝液等の緩衝液）に溶解されて、燃料溶液として使用される。また、当該実施態様１において、一般式(1)に示すベタイン誘導体、補酵素及び電子メディエーターは、燃料溶液に含ませてもよいが、負極に固定化することが望ましい。当該実施態様１では、グルコースデヒドロゲナーゼによってグルコースが酸化されると共に還元型補酵素が生成し、ジアホラーゼ以外の酸化酵素により還元型補酵素が酸化型補酵素に戻されて、電子を生じさせる。当該実施態様１では、グルコース１分子あたり、２個の電子がと２個のプロトンが生成される。
【００３５】
実施態様２では、グルコースデヒドロゲナーゼ以外の酸化酵素と、ジアホラーゼが負極に固定化される。当該実施態様２に使用されるグルコースデヒドロゲナーゼ以外の酸化酵素としては、クエン酸回路に関与する各種の有機酸や、ペントースリン酸回路および解糖系に関与する糖又は有機酸を燃料化合物として、これらを酸化型補酵素の存在下で酸化し、酸化型補酵素を還元型補酵素に変換できるものが使用される。当該実施態様２では、燃料化合物として使用される有機酸や糖が適当な溶媒（溶媒（例えば、リン酸緩衝液やトリス緩衝液等の緩衝液）に溶解されて、燃料溶液として使用される。また、当該実施態様２において、一般式(1)に示すベタイン誘導体、補酵素及び電子メディエーターは、燃料溶液に含ませてもよいが、負極に固定化することが望ましい。当該実施態様２では、グルコースデヒドロゲナーゼ以外の酸化酵素によって燃料化合物が酸化されると共に還元型補酵素が生成し、ジアホラーゼにより還元型補酵素が酸化型補酵素に戻されて、電子を生じさせる。当該実施態様１では、燃料化合物から電子とプロトンが生成される。
【００３６】
実施態様３では、グルコースデヒドロゲナーゼと、ジアホラーゼが負極に固定化される。当該実施態様３では、燃料として使用されるグルコースが適当な溶媒（溶媒（例えば、リン酸緩衝液やトリス緩衝液等の緩衝液）に溶解されて、燃料溶液として使用される。また、当該実施態様３において、一般式(1)に示すベタイン誘導体、補酵素及び電子メディエーターは、燃料溶液に含ませてもよいが、負極に固定化することが望ましい。当該実施態様３では、グルコースデヒドロゲナーゼによってグルコースが酸化されると共に還元型補酵素が生成し、ジアホラーにより還元型補酵素が酸化型補酵素に戻されて、電子を生じさせる。当該実施態様３では、グルコース１分子あたり、２個の電子がと２個のプロトンが生成される。
【００３７】
負極に使用される上記電子メディエーターとしては、補酵素に受け渡された電子を負極に移動させ得るものである限り、特に制限されないが、好適には、上記「１．酵素反応方法」の欄に記載した電子受容体が例示される。電子メディエーターを負極に固定化する場合、平均値で０．６４×１０-6ｍｏｌ／ｍｍ2 以上となるように固定化することが望ましい。
【００３８】
上記負極において、燃料化合物、酸化酵素、補酵素の使用量については、上記「１．酵素反応方法」の欄に記載の比率を目安にして適宜設定すればよい。
【００３９】
本発明のバイオ燃料電池は、負極で発生したプロトンがプロトン伝導体を通って正極まで移動するように構成される。また、負極で発生した電子は、外部回路を通って正極に送られる。正極では、負極から移動してきたプロトンと、外部から供給された酸素と、外部回路を通って正極に送られた電子とが反応して、水（Ｈ２Ｏ）が生じるように構成される。
【００４０】
上記プロトン電素導体としては、電子伝導性を持たず、プロトンを伝導する性質を備えるものである限り、特に制限されず、通常の燃料電池にも使用されるものを用いることができる。
【００４１】
正極は、プロトンと、酸素と、電子とが反応して、水が生じるように構成される限り、特に制限されないが、好ましくは、酸素還元酵素を利用するように構成されていることが望ましい。正極に使用される酸素還元酵素としては、例えば、ビリルビンオキシダーゼ、ラッカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。当該酸素還元酵素は、正極に固定化されて使用される。正極おける酸素還元酵素の使用量については、一般的なバイオ燃料電池の正極の場合と同様の範囲に設定すればよい。
【００４２】
また、正極には、電子メディエーターが固定化されていることが好ましく、当該電子メディエーターとしては、例えば、オクタシアノタングステン酸カリウム、ヘキサシアノ鉄酸カリウム、フェリシアン化カリウム等が挙げられる。電子メディエーターを正極に固定化する場合、平均値で０．６４×１０-6ｍｏｌ／ｍｍ2 以上となるように固定化することが望ましい。
【００４３】
正極及び負極の電極における酵素、補酵素、一般式(1)に示すベタイン誘導体、電子メディエーター等の固定化は、当該技術分野で公知の方法で行うことができる。
正極及び負極の電極の材料としては、例えば、多孔質カーボン、カーボンペレット、カーボンフェルト、カーボンペーパー等のカーボン系材料を使用することができる。
【００４４】
本発明のバイオ燃料電池は、コイン型、ボタン型等の各種形状にすることができる。
【００４５】
本発明のバイオ燃料電池は、例えば、電子機器、移動体（自動車、二輪車、航空機、ロケット、宇宙船等）、動力装置等に用いることができる。
【００４６】
３．グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼの酵素反応効率の向上剤
また、本発明は、一般式(1)に示すベタイン誘導体からなる、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼの酵素反応効率の向上剤を提供する。
当該剤は、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼを使用する酵素反応系で、反応効率を向上させるために使用されるものであり、その使用態様は、前記「１．酵素反応方法」の欄に記載の通りである。
【００４７】
４．キット
更に、本発明は、上記酵素反応方法を行うためのキットをも提供する。
本発明のキットは、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼ、並びに一般式(1)に示すベタイン誘導体を含む。
本発明のキットは、必要に応じて、酵素反応に使用する補酵素を含んでいてもよく、また、ジアホラーゼの酵素反応方法を行うためのキットの場合には、電子受容体を含んでいてもよい。
また、本発明のキットは、前述する酵素反応についてのプロトコールを示した実験手順書が含まれていてもよい。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例を挙げて、本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４９】
試験例１：グルコースデヒドロゲナーゼの反応効率の評価
グルコースデヒドロゲナーゼの酵素活性について、ベタイン誘導体の添加効果を評価した。基質としてはグルコース、酸化型補酵素としてＮＡＤ＋、ベタイン誘導体としては、下記のベタイン１〜５を用いた。
【００５０】
【化６】
【００５１】
酵素反応は、以下の条件で行った。先ず、２Ｍのイミダゾール緩衝溶液（ｐＨ７．０）、グルコースデヒドロゲナーゼ0.875μｇ、0.015〜0.5Ｍのベタイン誘導体、0.4Ｍのグルコース、1.5 mＭのＮＡＤ＋を含む酵素反応液を調製し、２５℃で３分間インキュベートし酵素反応を行った。また、コントロールとして、ベタイン誘導体を添加しないこと以外は上記と同条件で、酵素反応を行った。
酵素反応によって生成するNADHの生成量を340 nmにおける吸光度を測定することにより、１分間に酸化されるグルコース量を測定した。NADHの分子吸光係数は6.22/mM/cmを用いた。コントロールにおける反応生成物の生成量を１００％として、各ベタイン誘導体を添加した場合の反応生成物の生成量を相対活性（％）として算出した。
【００５２】
この結果を図１に示す。この結果から、ベタイン１〜５を添加した場合に、それらの添加濃度によってその挙動が異なるものの、コントロールに比して、グルコースデヒドロゲナーゼ活性の向上が認められた。とりわけ、ベタイン１、３、及び５を添加した場合に、顕著なグルコースデヒドロゲナーゼ活性の向上が認められた。
以上の結果から、本発明で規定する一般式(1)に示すベタイン誘導体を選択し、これをグルコースデヒドロゲナーゼによる酵素反応系に添加することによって、グルコースデヒドロゲナーゼの酵素反応効率を高め得ることが明らかとなった。
【００５３】
試験例２：発色基質の発色効率の評価−２
ジアホラーゼの酵素活性について、ベタイン誘導体の添加効果を評価した。還元型補酵素としてはＮＡＤＨ、電子受容体としてＡＮＱ（2-amino-1,4-naphthoquinone）、ベタイン誘導体としては、実施例１で使用したベタイン１〜５を用いた。
【００５４】
酵素反応は、以下の条件で行った。先ず、２Ｍのイミダゾール緩衝溶液（ｐＨ７．０）、ジアホラーゼ０．１８μg、0.03〜0.5Ｍのベタイン誘導体、40mＭのＮＡＤＨ、0.3ｍＭのＡＮＱを含む酵素反応液を調製し、２５℃で３分間インキュベートし酵素反応を行った。また、コントロールとして、ベタイン誘導体を添加しないこと以外は上記と同条件で、酵素反応を行った。
【００５５】
ANQの還元に伴って減少する４６５ｎｍにおける吸光度変化を測定することにより、酵素活性を測定した。ANQの分子吸光係数は12/mM/cmを用いた。コントロールにおける反応生成物の生成量を１００％として、各ベタイン誘導体を添加した場合の反応生成物の生成量を相対活性（％）として算出した。
【００５６】
この結果を図２に示す。この結果から、ベタイン１〜５を添加した場合に、それらの添加濃度によってその挙動が異なるものの、コントロールに比して、ジアホラーゼ活性の向上が認められた。とりわけ、ベタイン１、２、４、及び５、特にベタイン1を添加した場合に、顕著なジアホラーゼ活性の向上が認められた。
以上の結果から、本発明で規定する一般式(1)に示すベタイン誘導体を選択し、これをジアホラーゼによる酵素反応系に添加することによって、ジアホラーゼの酵素反応効率を高め得ることが明らかとなった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式(1)に示すベタイン誘導体の存在下で、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼを用いた酵素反応を行うことを特徴とする、酵素反応方法。
【化１】
[一般式(1)中、R1〜R3は、同一又は異なって、炭素数１〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、R4は、ＣＯＯ−又はＳＯ３−、ｎは、１〜５の整数を示す。]
【請求項２】
グルコースデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼを組み合わせて同一反応系で酵素反応を行う、請求項１に記載の酵素反応方法。
【請求項３】
グルコースデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼの少なくとも１つの酸化酵素及び下記一般式(1)に示すベタイン誘導体を含む負極を有する、バイオ燃料電池。
【化２】
[一般式(1)中、R1〜R3は、同一又は異なって、炭素数１〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、R4は、ＣＯＯ−又はＳＯ３−、ｎは、１〜５の整数を示す。]
【請求項４】
下記一般式(1)に示すベタイン誘導体からなる、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼの酵素反応効率の向上剤。
【化３】
[一般式(1)中、R1〜R3は、同一又は異なって、炭素数１〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、R4は、ＣＯＯ−又はＳＯ３−、ｎは、１〜５の整数を示す。]
【請求項５】
請求項１又は２に記載の酵素反応方法を行うためのキットであって、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼ、並びに下記一般式(1)に示すベタイン誘導体を含有する、前記キット。
【化４】
[一般式(1)中、R1〜R3は、同一又は異なって、炭素数１〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、R4は、ＣＯＯ−又はＳＯ３−、ｎは、１〜５の整数を示す。]
【請求項１】
下記一般式(1)に示すベタイン誘導体の存在下で、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼを用いた酵素反応を行うことを特徴とする、酵素反応方法。
【化１】
[一般式(1)中、R1〜R3は、同一又は異なって、炭素数１〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、R4は、ＣＯＯ−又はＳＯ３−、ｎは、１〜５の整数を示す。]
【請求項２】
グルコースデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼを組み合わせて同一反応系で酵素反応を行う、請求項１に記載の酵素反応方法。
【請求項３】
グルコースデヒドロゲナーゼ及びジアホラーゼの少なくとも１つの酸化酵素及び下記一般式(1)に示すベタイン誘導体を含む負極を有する、バイオ燃料電池。
【化２】
[一般式(1)中、R1〜R3は、同一又は異なって、炭素数１〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、R4は、ＣＯＯ−又はＳＯ３−、ｎは、１〜５の整数を示す。]
【請求項４】
下記一般式(1)に示すベタイン誘導体からなる、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼの酵素反応効率の向上剤。
【化３】
[一般式(1)中、R1〜R3は、同一又は異なって、炭素数１〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、R4は、ＣＯＯ−又はＳＯ３−、ｎは、１〜５の整数を示す。]
【請求項５】
請求項１又は２に記載の酵素反応方法を行うためのキットであって、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はジアホラーゼ、並びに下記一般式(1)に示すベタイン誘導体を含有する、前記キット。
【化４】
[一般式(1)中、R1〜R3は、同一又は異なって、炭素数１〜６の直鎖又は分岐状のアルキル基、R4は、ＣＯＯ−又はＳＯ３−、ｎは、１〜５の整数を示す。]
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１２−１７８９９７（Ｐ２０１２−１７８９９７Ａ）
【公開日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−４３３６５（Ｐ２０１１−４３３６５）
【出願日】平成２３年２月２８日（２０１１．２．２８）
【出願人】（３９７０２２９１１）学校法人甲南学園 (18)
【出願人】（５０５０５７７３８）株式会社耐熱性酵素研究所 (10)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月２８日（２０１１．２．２８）
【出願人】（３９７０２２９１１）学校法人甲南学園 (18)
【出願人】（５０５０５７７３８）株式会社耐熱性酵素研究所 (10)
【Ｆターム（参考）】
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