酸性およびシステインに富む分泌（ＳＰＡＲＣ）タンパク質ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ
本開示は、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）質量分析、または多重反応モニタリング（ＭＲＭ）質量分析とも名付けられてもいる方法により、ホルマリン中で固定された生物検体中で直接的にＳＰＡＲＣタンパク質を定量するための特に好都合な、酸性およびシステインに富む分泌（ＳＰＡＲＣ）タンパク質由来の特異的ペプチド、および生成されるペプチドのイオン化特性を提供する。このような生物検体は、化学的に保存および固定され、前記生物検体は、ホルマリン固定組織／細胞、ホルマリン固定／パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織／細胞、ＦＦＰＥ組織ブロックおよびこれらのブロック由来の細胞、ならびにホルマリン固定および／またはパラフィン包埋されている組織培養細胞を含む試薬／固定液を含むホルムアルデヒドで処理した組織および細胞から選択される。タンパク質検体は、前記生物検体からＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）試薬およびプロトコルを使って調製され、ＳＰＡＲＣタンパク質が、ＳＲＭ／ＭＲＭ質量分析法を使って、Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）検体中でタンパク質検体中の少なくとも１つ以上の記載ペプチドを定量することにより定量化される。これらのペプチドが修飾または非修飾型で存在する場合は、定量化可能である。ＳＰＡＲＣペプチドの修飾型の一例は、ペプチド配列内のチロシン、トレオニン、セリン、および／または他のアミノ酸残基のリン酸化である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００９年１２月２２日出願の「酸性およびシステインに富む分泌（ＳＰＡＲＣ）タンパク質ＳＲＭアッセイ」の名称の米国特許仮出願第６１／２８９，３８３号（発明者ＤａｖｉｄＢ．Ｋｒｉｚｍａｎ）の利益を主張し、その全内容が参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
緒言
酸性およびシステインに富む分泌タンパク質（ＳＰＡＲＣ、また基底膜４０タンパク質やオステオネクチンとも呼ばれる）のサブシーケンス由来の特異的ペプチドが提供される。各ペプチドに対するペプチド配列およびフラグメント／遷移イオンは、質量分析ベース選択反応モニタリング（ＳＲＭ）（多重反応モニタリング（ＭＲＭ）とも呼ばれる）アッセイでは特に有用で、この分析は、ＳＲＭ／ＭＲＭと呼ばれる。ＳＰＡＲＣタンパク質のＳＲＭ／ＭＲＭ定量分析用として、この内の１つのペプチドの使用について記載する。
【０００３】
このＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを使って、ＳＰＡＲＣタンパク質由来の１つ以上の特異的ペプチドの相対的または絶対的定量値を測定することができ、従って、生物検体から得た所与のタンパク質調製物中のＳＰＡＲＣタンパク質の量を質量分析により測定する手段を提供することができる。
【０００４】
さらに具体的には、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイで、患者組織検体、例えば、ホルマリン固定癌患者組織、から得た細胞より調製した複合タンパク質ライセート検体中のこれらのペプチドを直接測定可能である。ホルマリン固定組織からタンパク質検体を調製する方法は、米国特許第７，４７３，５３２号に記載されている。この特許の内容は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。米国特許第７，４７３，５３２号に記載の方法は、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手可能であるＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）試薬およびプロトコルを使って都合よく行うことができる。
【０００５】
最も広範にまた便利に入手できる癌患者組織由来の組織の形は、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織である。外科的採取組織のホルムアルデヒド／ホルマリン固定は、世界中でこれまで最もよく行われている癌組織検体保存方法であり、標準的病理学実践のための認められた方法である。ホルムアルデヒドの水溶液は、ホルマリンと呼ばれる。「１００％」ホルマリンは、ホルムアルデヒドの飽和水溶液（約４０容量％または３７重量％に相当）から構成され、酸化および重合の度合いを制限するための少量の安定剤、通常はメタノール、を含む。組織を保存する最もよく用いられ方法は、水性のホルムアルデヒド（通常、１０％中性緩衝ホルマリンと命名されている）中に全組織を長時間（８時間〜４８時間）浸漬し、続いて、室温での長期貯蔵のために、固定全組織をパラフィンワックス中に包埋することである。従って、ホルマリン固定癌組織を分析する分子分析方法が、最も受け入れられ、また、頻繁に使用されている癌患者組織の分析方法であると思われる。
【０００６】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの結果は、組織（生物検体）を採取し保存した患者または被験者の特定の組織検体（例えば、癌組織検体）内のＳＰＡＲＣタンパク質の正確で精密な定量値を関連付けるために使用可能である。これは、癌に関する診断情報を提供するだけでなく、医師または他の医療従事者の患者に対する治療の適切な判断を可能とする。患部組織または他の患者の検体中のタンパク質発現レベルに関する、診断上また治療上で重要な情報を提供するこのアッセイは、コンパニオン診断アッセイと名付けられている。例えば、このようなアッセイは、癌の病期または程度を診断するように設計可能であり、患者が最も反応しそうな治療薬を決定できる。
【発明の概要】
【０００７】
要約
本明細書記載のアッセイは、ＳＰＡＲＣタンパク質由来の特定の非修飾ペプチドの相対的または絶対的量を測定し、また、ＳＰＡＲＣタンパク質由来の特定の修飾ペプチドの絶対的または相対的量も測定できる。修飾の例には、ペプチド上に存在するリン酸化アミノ酸残基およびグリコシル化アミノ酸残基が含まれる。
【０００８】
ＳＰＡＲＣタンパク質の相対的定量レベルは、ＳＲＭ／ＭＲＭ法、例えば、異なる検体中の個別のＳＰＡＲＣペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャ（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）ピーク面積（例えば、シグネチャピーク面積または積分フラグメントイオン強度）を比較することにより、測定できる。あるいは、それ自体の特異的ＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピークをそれぞれ有する、複数のＳＰＡＲＣシグネチャペプチドの複数のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積を比較し、１つ以上の追加のまたは異なる生物検体中にＳＰＡＲＣタンパク質含量を有する１つの生物検体中の相対的ＳＰＡＲＣタンパク質含量を測定できる。この方法では、ＳＰＡＲＣタンパク質由来の特定の１つ以上のペプチドの量、従って、ＳＰＡＲＣタンパク質の量が、同じ実験条件下の２つ以上の生物検体の間における同じ１つ以上のＳＰＡＲＣペプチドと比較して、測定される。さらに、ＳＲＭ／ＭＲＭ法によるそのペプチドのシグネチャピーク面積を、生物検体由来の同じタンパク質調製物内の異なる１つ以上のタンパク質由来の別の異なる１つ以上のペプチドと比較することにより、単一の検体中の所与の１つ以上のＳＰＡＲＣタンパク質由来のペプチドを相対定量することができる。この方法では、ＳＰＡＲＣタンパク質由来の特定のペプチドの量、従って、ＳＰＡＲＣタンパク質量を、同じ検体内で相対的に測定できる。これらの手法では、生物検体由来のタンパク質調製物中のＳＰＡＲＣペプチドの容量に対する絶対重量または重量に対する絶対重量のいずれであっても、ピーク面積により求めた量が相互に相対的である検体間および検体内の間の別の１つ以上のペプチドの量に対する、ＳＰＡＲＣタンパク質由来の個別の１つ以上のペプチドの定量化が行える。異なる検体間の個別のシグネチャピーク面積に関する相対的定量データは、検体毎に分析したタンパク質の量に正規化される。複数のタンパク質由来の多くのペプチドおよびＳＰＡＲＣタンパク質について、単一の検体中、および／または多くの検体間で同時に相対的定量化を行い、相対的タンパク質の量、他のペプチド／タンパク質と比較して１つのペプチド／タンパク質に対する洞察を得ることができる。
【０００９】
ＳＰＡＲＣタンパク質の絶対的定量レベルは、例えば、ＳＲＭ／ＭＲＭ法により測定でき、この方法では、１つの生物検体内の個別のＳＰＡＲＣタンパク質由来のペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積が、添加内部標準のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積と比較される。一実施形態では、内部標準は、１つ以上の重同位元素で標識した１つ以上のアミノ酸残基を含む、合成バージョンの正確に同じＳＰＡＲＣペプチドである。このような同位体標識内部標準を合成し、それにより、質量分析で分析した場合、これは、元のＳＰＡＲＣペプチドシグネチャピークとは異なる、区別可能で、予測可能かつ一貫したＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピークを生成し、比較ピークとして使用可能である。従って、生物検体由来のタンパク質調製物中に既知の量の内部標準が添加され、質量分析で分析された場合、元のペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積が内部標準ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積と比較され、この数値比較は、元の生物検体由来のタンパク質調製物中に存在する元のペプチドの絶対的モル濃度および／または絶対的重量を示す。フラグメントペプチドに対する絶対的データは、検体毎に分析されるタンパク質の量に従って、表示される。単一の検体中、および／または多くの検体間で同時に多くのペプチド、従って、タンパク質に関し、絶対的定量化を行い、個別生物検体および個別検体の全体コホート中の絶対的タンパク質量に対する洞察を得ることができる。
【００１０】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ法は、例えば、直接的に、ホルマリン固定組織等の患者由来の組織を使って、癌の病期の診断を支援し、また、どの治療薬が患者の治療に対する使用に最も都合が良いかどうかという決定を支援するのに使用できる。手術、例えば、部分または全体腫瘍の治療的除去により、または疑わしい疾患が存在するか否かを判断するために行う生検法により患者から取り出した癌組織を分析し、その患者組織中に１つ以上の特異的タンパク質があるのかどうか、およびどの型のタンパク質なのかを判断する。さらに、１つ以上のタンパク質の発現レベルが測定でき、健康な組織中で見つかった「正常な」または参照レベルと比較できる。健康な組織中で見つかったタンパク質の正常なまたは参照レベルは、例えば、癌を有さない１つ以上の個体の関連する組織由来であってもよい。あるいは、正常なまたは参照レベルは、癌の個体に対し、癌に罹患していない関連する組織の分析から得てもよい。タンパク質レベルのアッセイ（例えば、ＳＰＡＲＣレベル）は、ＳＰＡＲＣレベルを採用することにより癌と診断された患者または被験者の癌の病期の診断にも使用可能である。タンパク質またはペプチドのレベルまたは量は、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイにより測定されたタンパク質またはペプチドのモル、質量または重量により表現される量として定義できる。レベルまたは量は、分析ライセート中の全体タンパク質または他の成分のレベルまたは量に対し正規化できる（例えば、タンパク質のマイクロモル／マイクログラムまたはタンパク質のマイクログラム／マイクログラムとして表現）。さらに、タンパク質またはペプチドのレベルまたは量は、容量ベース、例えば、マイクロモルまたはナノグラム／マイクロリットルによる表現に基づいて測定してもよい。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイにより測定されたタンパク質またはペプチドのレベルまたは量は、また、分析した細胞の数で正規化可能である。ＳＰＡＲＣに関する情報は、従って、ＳＰＡＲＣタンパク質（またはＳＰＡＲＣタンパク質フラグメントペプチド）のレベルを正常組織で観察されるレベルと相互に関連付けることにより癌の病期またはグレードを決定するのを支援するために使用できる。癌の病期および／またはグレード、および／またはＳＰＡＲＣタンパク質の発現特性が解るとすぐに、その情報は、例えば、アッセイされる１つ以上のタンパク質（例えば、ＳＰＡＲＣ）の異常な発現を特徴とする癌組織を特異的に治療するように開発された治療薬（化学および生物学的）のリストと照合することができる。例えば、ＳＰＡＲＣタンパク質またはタンパク質を発現している細胞／組織を特異的に標的にする治療薬のリストを照合するＳＰＡＲＣタンパク質アッセイからの情報は、疾患を治療するための、いわゆるオーダーメイド医療手法を規定する。本明細書記載のアッセイ方法は、患者自信の組織由来のタンパク質の分析を診断と治療決定のソースとして使って、オーダーメイド医療手法の基盤を形成する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】パートＡ〜Ｃは、Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセートを使って三連四重極質量分析計により行ったＳＰＡＲＣペプチドの定量化によるＳＰＡＲＣタンパク質由来の単一ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
詳細な説明
原理的には、例えば、既知の特異性のプロテアーゼ（例えば、トリプシン）で消化されることにより調製されるＳＰＡＲＣタンパク質由来のいずれの予測されるペプチドも、質量分析ベースＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを使って検体中のＳＰＡＲＣタンパク質の存在量を測定するための代用レポーターとして使用可能である。同様に、ＳＰＡＲＣタンパク質中で潜在的に修飾されることが解っている部位のアミノ酸残基を含むいずれの予測されるペプチド配列も、また、検体中のＳＰＡＲＣタンパク質の修飾の度合いのアッセイに使用できる可能性がある。
【００１３】
ＳＰＡＲＣフラグメントペプチドは、米国特許第７，４７３，５３２号で提供されるＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）プロトコルの使用を含む種々の手段で生成可能である。Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）プロトコルおよび試薬を使って、組織／生物検体中のタンパク質のタンパク分解性消化により、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から質量分光分析に適したペプチド検体を作ることができる。Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）プロトコルでは、組織／生物検体は、長期間の緩衝液中で加熱され（例えば、約８０℃〜約１００℃で、約１０分〜約４時間）、タンパク質架橋の逆転または解放が起こる。採用される緩衝液は、中性の緩衝液（例えば、トリスベース緩衝液、または洗剤含有緩衝液）である。熱処理後、組織／生物検体は、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、およびエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃを含む（これに限定されない）１つ以上のプロテアーゼを使って、前記生物検体の組織と細胞構造を破壊し、前記検体を液化するのに充分な時間（例えば、温度３７℃〜６５℃で３０分〜２４時間）処理される。加熱および蛋白質分解の生成物は、可溶性で希釈可能な液体生体分子ライセートである。
【００１４】
驚くべきことに、ＳＰＡＲＣタンパク質由来の多くの可能性のあるペプチド配列が、質量分析ベースＳＲＭ／ＭＲＭアッセイでの使用に対し不適切であるか、または効果がないことが明らかになったが、理由はすぐには明らかになっていない。ＭＲＭ／ＳＲＭアッセイに対し最も適したペプチドの予測が可能ではないので、ＳＰＡＲＣタンパク質用の信頼できる正確なＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するために、実際のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセート中で、修飾および非修飾ペプチドを実験的に特定することが必要であった。いかなる理論にも拘泥する意図はないが、うまくイオン化せず、または他のタンパク質とは異なるフラグメントを生成しない、また、ペプチドが分離工程中（例えば、液体クロマトグラフィー）で、うまく分解できない、またはガラスまたはプラスチック器具に付着する可能性があるために、一部のペプチドは、例えば、質量分析によって検出することが困難である可能性があると考えられている。
【００１５】
本開示の種々の実施形態（例えば、表１および２）のＳＰＡＲＣペプチドは、ホルマリン固定癌組織から得た細胞から調製した複合Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセート中の全タンパク質のプロテアーゼ消化によるＳＰＡＲＣタンパク質由来であった。別段の指定がなければ、それぞれの例で、プロテアーゼはトリプシンであった。Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセートは、次に、質量分析で分析され、質量分析により検出され分析されるＳＰＡＲＣタンパク質由来のペプチドが測定される。質量分析用に好ましい特異的サブセットのペプチドの特定は、次の項目に基づいている；１）タンパク質由来の１つ以上のどのペプチドがＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセートの質量分析中にイオン化するかの実験的決定、および２）Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセートを調製するのに使用されるプロトコルおよび実験条件に対し生き残るためのペプチドの能力。この後者の特性は、ペプチドのアミノ酸配列のみならず、ペプチド内の修飾アミノ酸残基の修飾された形態で検体調製の間、生き残る能力までも及ぶものである。
【表１】
【表２】
【００１６】
ホルマリン（ホルムアルデヒド）固定組織から直接得た細胞由来のタンパク質ライセートをＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）試薬およびプロトコルを使って調製した。この方法は、組織のマイクロダイセクションにより検体チューブ中に細胞を集めた後、細胞をＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）緩衝液中で長期間加熱することを伴う。ホルマリン誘導架橋がマイナスの影響を受けるとすぐに、組織／細胞は、例えば、プロテアーゼトリプシン（これに限定されない）等のプロテアーゼを使って予想通りの方式で、完全に消化される。各タンパク質ライセートは、インタクトポリペプチドのプロテアーゼを使った消化により一群のペプチドへと変化する。各Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセートを分析し（例えば、イオントラップ質量分析）、複数のペプチドの包括的プロテオミック調査を行った。この場合、各タンパク質ライセート中に存在する全細胞性タンパク質から質量分析により可能な限り多くのペプチドが特定されるように、データを提示した。単一複合タンパク質／ペプチドライセートからできる限り多くのペプチドの特定のための包括的プロファイリングを行うことが可能なイオントラップ質量分析計または別の形式の質量分析計が採用される。しかし、イオントラップ質量分析計は、ペプチドの包括的プロファイリングを行うための質量分析計として最適のタイプであろう。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの開発および実行を、ＭＡＬＤＩ、イオントラップ、または三連四重極を含む任意のタイプの質量分析計で行うことができるが、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ用の最も都合のよい装置プラットフォームは、三連四重極装置プラットフォームであると考えられることが多い。
【００１７】
採用された条件下で、単一ライセートの単一ＭＳ分析により可能な限り多くのペプチドが特定されるとすぐに、そのペプチドリストは、照合され、ライセートで検出されたタンパク質を測定するために使われる。このプロセスは、複数のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセートに対し繰り返され、ペプチドの非常に長いリストが単一のデータセットにまとめられる。そのタイプのデータセットは、分析された（プロテアーゼ消化後に）生物検体のタイプ中で、具体的には、生物検体のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセート中で検出可能な、従って、特定のタンパク質、例えば、ＳＰＡＲＣタンパク質に対するペプチドを含む、ペプチドを表していると考えることができる。
【００１８】
一実施形態では、ＳＰＡＲＣ受容体の絶対的または相対的量の測定で有用であると特定されたＳＰＡＲＣトリプシン消化ペプチドには、１つ以上の、２つ以上の、３つ以上の、４つ以上の、５つ以上の、６つ以上の、８つ以上の、または１０以上の、次の配列番号のペプチドが含まれる：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号９これらのそれぞれは表１に挙げられている。これらのペプチドのそれぞれは、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織から調製したＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセートの質量分析により検出される。従って、表１のペプチドまたはこれらのペプチドのいずれかの組み合わせのそれぞれ（例えば、１つ以上の、２つ以上の、３つ以上の、４つ以上の、５つ以上の、６つ以上の、８つ以上の、または１０以上の、表１で列挙したこれらのペプチド、および表２にある1つ以上のペプチドとの具体的な組み合わせ）は、ホルマリン固定した患者組織を含むヒト生物検体中のＳＰＡＲＣタンパク質に対する定量的ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイでの使用のための候補である。
【００１９】
表１に挙げたＳＰＡＲＣトリプシン消化ペプチドは、前立腺、結腸、および乳房を含む異なるヒト器官の複数の異なるホルマリン固定組織の複数のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセートから検出されたものを含む。これらのペプチドのそれぞれは、ホルマリン固定組織中のＳＰＡＲＣタンパク質の定量的ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイのために有用であると考えられる。これらの実験のさらなるデータ分析では、いずれの特定の器官部位由来のいずれの特定のペプチドに対しても、選択性は観察されなかった。従って、それぞれのこれらのペプチドは、任意の生物検体または身体の任意の器官部位に由来する任意のホルマリン固定組織のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセート中のＳＰＡＲＣタンパク質のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを行うために適すると考えられる。
【００２０】
一実施形態では、表１のペプチドまたはこれらのペプチドの任意の組み合わせ（例えば、１つ以上の、２つ以上の、３つ以上の、４つ以上の、５つ以上の、６つ以上の、８つ以上の、または９以上の、表１で列挙したこれらのペプチド、および、また、表２に挙げられたペプチドとの具体的な組み合わせ）が、免疫学的な方法（例えば、ウェスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡ）（これに限定されない）を含む質量分析に依存しない方法、によりアッセイされる。ペプチド（絶対的または相対的）の量に対するどのような情報が得られるかに関わらず、その情報は、本明細書記載のいずれかの方法に採用することができ、被験者の癌の存在を示し（診断）、癌の病期／グレード／状態を決定し、予後を示し、または被検者／患者に対する治療薬または治療法を決定することが含まれる。
【００２１】
本開示の実施形態では、１つ以上の、２つ以上の、３つ以上の、４つ以上の、５つ以上の、６つ以上の、または８つ以上の、表１のペプチドを含む組成物が含まれる。一部の実施形態では、組成物は、１つ以上の、２つ以上の、または３つ以上の、表２のペプチドを含む。ペプチドを含む組成物は、１つ以上の、２つ以上の、３つ以上の、４つ以上の、５つ以上の、６つ以上の、７つ以上の、または８以上の同位体で標識したペプチドを含んでもよい。それぞれのペプチドは、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈまたはこれらの組み合わせからなる群から独立に選択される１つ以上の同位体で標識してもよい。同位体標識していても、していなくても、ＳＰＡＲＣタンパク質由来のペプチド含有組成物は、そのタンパク質由来の全てのペプチド（例えば、トリプシン消化ペプチドの完全のセット）を含む必要はない。一部の実施形態では、組成物は、１つ以上の、２つ以上の、３つ以上の、４つ以上の、５つ以上の、６つ以上の、８つ以上の、または１０以上の、ＳＰＡＲＣ由来のペプチド、および表１または表２に具体的に挙げられているペプチドを含まない。ペプチド含有組成物は、乾燥または凍結乾燥物質、液体（例えば、水性の）溶液または懸濁液、配列、またはブロットの形であってもよい。
【００２２】
表１に挙げたＳＰＡＲＣトリプシン消化ペプチドは、前立腺、結腸、および乳房を含む異なるヒト器官の複数の異なるホルマリン固定組織の複数のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセートから検出されたものを含む。これらのペプチドのそれぞれは、ホルマリン固定組織中のＳＰＡＲＣタンパク質の定量的ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイのために有用であると考えられる。これらの実験のさらなるデータ分析では、いずれの特定の器官部位由来のいずれの特定のペプチドに対しても、選択性は観察されなかった。従って、それぞれのこれらのペプチドは、任意の生物検体または身体の任意の器官部位に由来する任意のホルマリン固定組織のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセート中のＳＰＡＲＣタンパク質のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを行うために適すると考えられる。
【００２３】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを行う上での重要な考慮すべきことは、ペプチドの分析に使用する装置のタイプである。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、開発および実行をＭＡＬＤＩ、イオントラップ、または三連四重極を含む任意のタイプの質量分析計を使って行うことができるが、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ用の最も都合のよい装置プラットフォームは、三連四重極装置プラットフォームであると考えられることが多い。そのタイプの質量分析計が、細胞内に含まれる全タンパク質由来の１０００億の個別ペプチドを含むこともありうる極めて複雑化した単一のタンパク質ライセート内の単離標的ペプチドを分析するための最適の装置であると考えることができる。
【００２４】
各ＳＰＡＲＣタンパク質由来のペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを最も効率よく実施するためには、分析におけるペプチド配列に加えて追加の情報を利用することが望ましい。その追加の情報は、質量分析計（例えば、三連四重極質量分析計を）を操作するために使用して、正しく、的を絞った特異的標的化ペプチドの分析を行うことができ、それにより、アッセイを効率的に行うことが可能となる。
【００２５】
通常の標的ペプチドに関する、および特定のＳＰＡＲＣペプチドに関する追加の情報としては、ペプチドの１つ以上のモノアイソトピック質量、その前駆物質電荷状態、前駆物質ｍ／ｚ値、ｍ／ｚ遷移イオン、および各遷移イオンのイオンタイプを含んでもよい。ＳＰＡＲＣタンパク質用のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するために使用可能な追加のペプチド情報は、表１の一覧中の４つのＳＰＡＲＣペプチドに対する例により示され、これを表２に示す。表２の例で示されるこの４つのＳＰＡＲＣペプチドに対し記載されている類似の追加の情報が、作成され、取得され、さらに表１に含まれる他のペプチドの分析に適用可能である。
【００２６】
以下に記載する方法は、１）ＳＰＡＲＣタンパク質の質量分析ベースＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ用に使用可能なＳＰＡＲＣタンパク質由来の候補ペプチドを特定する、２）相互に関連付けるために、ＳＰＡＲＣタンパク質由来の標的ペプチドのための１つ以上の個別ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発する、および３）定量アッセイを癌診断および／または最適治療の選択に適用する、ために使用される。
【００２７】
アッセイ方法
１．ＳＰＡＲＣタンパク質のためのＳＲＭ／ＭＲＭ候補フラグメントペプチドの特定
ａ．１つ以上のプロテアーゼ（これには、トリプシンを含んでも含まなくてもよい）を使ってタンパク質を消化して、ホルマリン固定生物検体からＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）タンパク質ライセートを調製する。
ｂ．イオントラップタンデム質量分析計を用いて、Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセート中の全タンパク質フラグメントを分析し、ＳＰＡＲＣタンパク質由来の全フラグメントペプチドを特定する。この場合、個別フラグメントペプチドは、どのペプチド修飾、例えば、リン酸化またはグリコシル化、も含まない。
ｃ．イオントラップタンデム質量分析計を用いて、Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセート中の全タンパク質フラグメントを分析し、ペプチド修飾、例えば、リン酸化またはグリコシル化残基を有するＳＰＡＲＣタンパク質由来の全フラグメントペプチドを特定する。
ｄ．完全長ＳＰＡＲＣ完全タンパク質から特異的消化方法により生成された全ペプチドを測定することは可能ではあるが、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの開発に使用される好ましいペプチドは、ホルマリン固定生物検体から調製される複合Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）タンパク質ライセートで直接質量分析により特定されるものである。
ｅ．ホルマリン固定生物検体由来のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセートの分析を行う場合、患者組織中で特異的に修飾され（リン酸化された、グリコシル化された、等）、質量分析計中でイオン化され、検出されるペプチドは、ＳＰＡＲＣタンパク質のペプチド修飾をアッセイするための候補ペプチドとして特定される。
２．ＳＰＡＲＣタンパク質由来のフラグメントペプチドの質量分析アッセイ
ａ．Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセート中で特定された個別フラグメントペプチドのための三連四重極質量分析計を使ったＳＲＭ／ＭＲＭアッセイがＳＰＡＲＣタンパク質由来のペプチドに適用される。
ｉ．最適クロマトグラフィー条件のためのフラグメントペプチドに対する最適保持時間の決定。使用されるクロマトグラフィーには、これに限定されないが、ゲル電気泳動法、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動法、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または逆相高速液体クロマトグラフィー、が含まれる。
ｉｉ．各ペプチドに対するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するために、ペプチドのモノアイソトピック質量、各ペプチドに対する前駆物質電荷状態、各ペプチドに対する前駆物質ｍ／ｚ値、各ペプチドに対するｍ／ｚ遷移イオン、および各フラグメントペプチドに対する各遷移イオンのイオンタイプの測定を行う。
ｉｉｉ．次に、（ｉ）および（ｉｉ）からの情報を使って、三連四重極質量分析計によりＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを行うことができる。この場合、各ペプチドは、三連四重極質量分析計で行われる独特のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを明確に規定する特徴的かつ固有のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピークを有する。
ｂ．ＳＲＭ／ＭＲＭ質量分析における固有のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積の関数として、検出されるＳＰＡＲＣタンパク質のフラグメントペプチドの量が、特定のタンパク質ライセート中の相対的および絶対的量のタンパク質を表すことができるように、ＳＲＭ／ＭＲＭ分析を行う。
ｉ．相対的定量は、下記により行うことができる：
１．１つのホルマリン固定生物検体由来のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセート中で検出された所与のＳＰＡＲＣペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積を、少なくとも第２、第３、第４、またはそれを超えるのホルマリン固定生物検体由来の少なくとも第２、第３、第４、またはそれを超えるのＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセート中の同じＳＰＡＲＣフラグメントペプチドの同じＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積と比較することにより、ＳＰＡＲＣタンパク質の増加または減少を測定する。
２．１つのホルマリン固定生物検体由来のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセート中で検出された所与のＳＰＡＲＣペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積を、異なる、別の生物学的ソース由来の他の検体中の他のタンパク質由来のフラグメントペプチドから生成したＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積と比較することにより、ＳＰＡＲＣタンパク質の増加または減少を測定する。この場合、２検体間のペプチドフラグメントに対するＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積比較は、各検体で分析されたタンパク質の量に正規化されている。
３．ＳＰＡＲＣタンパク質のレベルの変化を、種々の細胞性条件下でそれらの発現レベルを変化させない他のタンパク質のレベルに正規化するために、所与のＳＰＡＲＣペプチドに対するＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積を、ホルマリン固定生物検体由来の同じＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセート内の異なるタンパク質由来の他のフラグメントペプチドからのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積と比較することにより、ＳＰＡＲＣタンパク質の増加または減少を測定する。
４．これらのアッセイは、ＳＰＡＲＣタンパク質の非修飾フラグメントペプチドおよび修飾フラグメントペプチドの両方に対し適用可能である。この場合、修飾には、これに限定されないが、リン酸化および／またはグリコシル化が含まれ、また、修飾ペプチドの相対的レベルは、非修飾ペプチドの相対的量測定と同じ方法で測定される。
ｉｉ．所与のペプチドの絶対的定量は、個別の生物検体中の所与のフラグメントＳＰＡＲＣタンパク質由来のペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積を、生物検体由来のタンパク質ライセート中に添加された内部フラグメントペプチド標準のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積と比較することにより行うことができる。
１．内部標準は、標識した合成バージョンのフラグメントＳＰＡＲＣタンパク質由来の参照されるペプチドである。この標準は、既知量で検体中に添加され、ＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積が、生物検体中の内部フラグメントペプチド標準および元のフラグメントペプチドの両方に対し、別々に測定され、その後、両ピーク面積が比較される。
２．これは、非修飾フラグメントペプチドおよび修飾フラグメントペプチドに適用でき、この場合、修飾には、これに限定されないが、リン酸化および／またはグリコシル化が含まれ、また、絶対的レベルの修飾ペプチドは、絶対的レベルの非修飾ペプチドの測定と同じ方法で測定可能である。
３．フラグメントペプチド定量化の癌診断および治療への適用
ａ．ＳＰＡＲＣタンパク質のフラグメントペプチドレベルの相対的および／または絶対的定量化を行い、癌の分野で十分理解されている、ＳＰＡＲＣタンパク質発現と患者腫瘍組織中の癌の病期／グレード／状態の間の、以前測定されている関連性が確認されることを証明する。
ｂ．ＳＰＡＲＣタンパク質のフラグメントペプチドレベルの相対的および／または絶対的定量化を行い、異なる治療戦略から来る臨床的転帰との相関を証明する。この場合、この相関は、この分野ですでに証明されているか、または患者およびこれらの患者由来の組織のコホート全体の相関調査により将来証明可能である。以前確立された相関関係または将来得られる相関関係がこのアッセイにより確認されるとすぐに、本アッセイ方法は、最適治療戦略の決定に使用可能である。
【００２８】
図１は、ホルマリン固定癌組織由来のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセートで行った単一ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの例を示す。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、三連四重極質量分析計によるＳＰＡＲＣタンパク質の定量化のために単一ペプチドに対し開発された。このＳＰＡＲＣペプチド(配列ＮＶＬＶＴＬＹＥＲ)に関して）の特異的および固有の特性は、イオントラップおよび三連四重極質量分析計の両方を使って、全ＳＰＡＲＣペプチドの分析により開発され、図１に示されている。その情報には、ペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆物質電荷状態、前駆物質ｍ／ｚ値、前駆物質の遷移ｍ／ｚ値、および特定された各遷移のイオンタイプが含まれる。その情報は、各および全候補ＳＲＭ／ＭＲＭペプチドに対し、ホルマリン固定組織由来のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセート中で直接的に実験により測定されなければならない；理由は、興味深いことに、本明細書記載のＳＲＭ／ＭＲＭを使って、必ずしも全てのＳＰＡＲＣタンパク質由来のペプチドが、このようなライセート中に検出されるとは限らないからであり、検出されなかったＳＰＡＲＣペプチドが、ホルマリン固定組織由来Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセート中で直接にペプチド／タンパク質を定量するのに使用するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するための候補ペプチドと考えられることはあり得ないことを示している。
【００２９】
図１Ｂに示すように、この特殊ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、三連四重極質量分析計を使って実行された。大量のペプチドが存在することが解っている対照タンパク質ライセートを分析したが、理由は、このライセートがヒト由来癌細胞株のヌードマウスへの注入により生じたマウス異種移植腫瘍から調製されたためである。従って、この異種移植腫瘍は陽性対照であった。この実験の実験検体は、標準ホルマリン固定、パラフィン包埋ヒト乳癌組織から調製されたＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）タンパク質ライセートであった。アッセイデータは、対照検体（上段クロマトグラフ）および実験検体（下段クロマトグラフ）の両方中で、このＳＰＡＲＣペプチドに対し固有のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピークの存在を示す。これら２検体間のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積の比較により、２つの異なる生物検体間のＳＰＡＲＣタンパク質に対する相対的定量測定値が得られる。
【００３０】
図１Ｃは、癌由来患者検体のコホート全体のＳＰＡＲＣタンパク質の絶対的定量を行うための内部標準を使った、３０つのホルマリン固定癌組織の上述ペプチドの定量測定を示す。これらのデータは、分析したタンパク質ライセートのマイクログラム当たりのペプチドのモル量の関数として、このＳＰＡＲＣペプチドの絶対的量を示している。ホルマリン固定患者由来の組織の分析に基づく組織中のＳＰＡＲＣタンパク質レベルの評価は、特定の各患者に関する診断、予後、および治療関連情報を提供できる。一実施形態では、本開示は、生物検体中のＳＰＡＲＣタンパク質のレベルの測定方法が記載され、これには、質量分析を使って前記生物検体から調製されたタンパク質消化物中の１つ以上の修飾または非修飾ＳＰＡＲＣフラグメントペプチドの量の検出および／または定量；および前記検体中の修飾または非修飾ＳＰＡＲＣタンパク質のレベルの計算が含まれ；ここで前記レベルは、相対的レベルまたは絶対的レベルである。関連実施形態では、１つ以上のＳＰＡＲＣフラグメントペプチドの定量化には、既知量の添加内部標準ペプチドと比較することによる、生物検体中の各ＳＰＡＲＣフラグメントペプチドの量の測定が含まれ、ここで、生物検体中の各ＳＰＡＲＣフラグメントペプチドが同じアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較される。一部の実施形態では、内部標準は、同位体標識した内部標準ペプチドで、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈまたはこれらの組み合わせから選択される１つ以上の安定重同位体を含む。
【００３１】
本明細書記載の生物検体（またはその代替物としてのフラグメントペプチド）中のＳＰＡＲＣタンパク質のレベルを測定する方法は、患者または被験者の癌の診断指標として使用可能である。一実施形態では、ＳＰＡＲＣタンパク質のレベルの測定結果は、組織中に認められるＳＰＡＲＣ受容体のレベルと正常および／または癌性または前癌性組織で認められるタンパク質のレベルを関連付ける（例えば、比較する）ことにより診断上の癌の病期／グレード／状態を判定するために採用可能である。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００９年１２月２２日出願の「酸性およびシステインに富む分泌（ＳＰＡＲＣ）タンパク質ＳＲＭアッセイ」の名称の米国特許仮出願第６１／２８９，３８３号（発明者ＤａｖｉｄＢ．Ｋｒｉｚｍａｎ）の利益を主張し、その全内容が参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
緒言
酸性およびシステインに富む分泌タンパク質（ＳＰＡＲＣ、また基底膜４０タンパク質やオステオネクチンとも呼ばれる）のサブシーケンス由来の特異的ペプチドが提供される。各ペプチドに対するペプチド配列およびフラグメント／遷移イオンは、質量分析ベース選択反応モニタリング（ＳＲＭ）（多重反応モニタリング（ＭＲＭ）とも呼ばれる）アッセイでは特に有用で、この分析は、ＳＲＭ／ＭＲＭと呼ばれる。ＳＰＡＲＣタンパク質のＳＲＭ／ＭＲＭ定量分析用として、この内の１つのペプチドの使用について記載する。
【０００３】
このＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを使って、ＳＰＡＲＣタンパク質由来の１つ以上の特異的ペプチドの相対的または絶対的定量値を測定することができ、従って、生物検体から得た所与のタンパク質調製物中のＳＰＡＲＣタンパク質の量を質量分析により測定する手段を提供することができる。
【０００４】
さらに具体的には、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイで、患者組織検体、例えば、ホルマリン固定癌患者組織、から得た細胞より調製した複合タンパク質ライセート検体中のこれらのペプチドを直接測定可能である。ホルマリン固定組織からタンパク質検体を調製する方法は、米国特許第７，４７３，５３２号に記載されている。この特許の内容は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。米国特許第７，４７３，５３２号に記載の方法は、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手可能であるＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）試薬およびプロトコルを使って都合よく行うことができる。
【０００５】
最も広範にまた便利に入手できる癌患者組織由来の組織の形は、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織である。外科的採取組織のホルムアルデヒド／ホルマリン固定は、世界中でこれまで最もよく行われている癌組織検体保存方法であり、標準的病理学実践のための認められた方法である。ホルムアルデヒドの水溶液は、ホルマリンと呼ばれる。「１００％」ホルマリンは、ホルムアルデヒドの飽和水溶液（約４０容量％または３７重量％に相当）から構成され、酸化および重合の度合いを制限するための少量の安定剤、通常はメタノール、を含む。組織を保存する最もよく用いられ方法は、水性のホルムアルデヒド（通常、１０％中性緩衝ホルマリンと命名されている）中に全組織を長時間（８時間〜４８時間）浸漬し、続いて、室温での長期貯蔵のために、固定全組織をパラフィンワックス中に包埋することである。従って、ホルマリン固定癌組織を分析する分子分析方法が、最も受け入れられ、また、頻繁に使用されている癌患者組織の分析方法であると思われる。
【０００６】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの結果は、組織（生物検体）を採取し保存した患者または被験者の特定の組織検体（例えば、癌組織検体）内のＳＰＡＲＣタンパク質の正確で精密な定量値を関連付けるために使用可能である。これは、癌に関する診断情報を提供するだけでなく、医師または他の医療従事者の患者に対する治療の適切な判断を可能とする。患部組織または他の患者の検体中のタンパク質発現レベルに関する、診断上また治療上で重要な情報を提供するこのアッセイは、コンパニオン診断アッセイと名付けられている。例えば、このようなアッセイは、癌の病期または程度を診断するように設計可能であり、患者が最も反応しそうな治療薬を決定できる。
【発明の概要】
【０００７】
要約
本明細書記載のアッセイは、ＳＰＡＲＣタンパク質由来の特定の非修飾ペプチドの相対的または絶対的量を測定し、また、ＳＰＡＲＣタンパク質由来の特定の修飾ペプチドの絶対的または相対的量も測定できる。修飾の例には、ペプチド上に存在するリン酸化アミノ酸残基およびグリコシル化アミノ酸残基が含まれる。
【０００８】
ＳＰＡＲＣタンパク質の相対的定量レベルは、ＳＲＭ／ＭＲＭ法、例えば、異なる検体中の個別のＳＰＡＲＣペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャ（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）ピーク面積（例えば、シグネチャピーク面積または積分フラグメントイオン強度）を比較することにより、測定できる。あるいは、それ自体の特異的ＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピークをそれぞれ有する、複数のＳＰＡＲＣシグネチャペプチドの複数のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積を比較し、１つ以上の追加のまたは異なる生物検体中にＳＰＡＲＣタンパク質含量を有する１つの生物検体中の相対的ＳＰＡＲＣタンパク質含量を測定できる。この方法では、ＳＰＡＲＣタンパク質由来の特定の１つ以上のペプチドの量、従って、ＳＰＡＲＣタンパク質の量が、同じ実験条件下の２つ以上の生物検体の間における同じ１つ以上のＳＰＡＲＣペプチドと比較して、測定される。さらに、ＳＲＭ／ＭＲＭ法によるそのペプチドのシグネチャピーク面積を、生物検体由来の同じタンパク質調製物内の異なる１つ以上のタンパク質由来の別の異なる１つ以上のペプチドと比較することにより、単一の検体中の所与の１つ以上のＳＰＡＲＣタンパク質由来のペプチドを相対定量することができる。この方法では、ＳＰＡＲＣタンパク質由来の特定のペプチドの量、従って、ＳＰＡＲＣタンパク質量を、同じ検体内で相対的に測定できる。これらの手法では、生物検体由来のタンパク質調製物中のＳＰＡＲＣペプチドの容量に対する絶対重量または重量に対する絶対重量のいずれであっても、ピーク面積により求めた量が相互に相対的である検体間および検体内の間の別の１つ以上のペプチドの量に対する、ＳＰＡＲＣタンパク質由来の個別の１つ以上のペプチドの定量化が行える。異なる検体間の個別のシグネチャピーク面積に関する相対的定量データは、検体毎に分析したタンパク質の量に正規化される。複数のタンパク質由来の多くのペプチドおよびＳＰＡＲＣタンパク質について、単一の検体中、および／または多くの検体間で同時に相対的定量化を行い、相対的タンパク質の量、他のペプチド／タンパク質と比較して１つのペプチド／タンパク質に対する洞察を得ることができる。
【０００９】
ＳＰＡＲＣタンパク質の絶対的定量レベルは、例えば、ＳＲＭ／ＭＲＭ法により測定でき、この方法では、１つの生物検体内の個別のＳＰＡＲＣタンパク質由来のペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積が、添加内部標準のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積と比較される。一実施形態では、内部標準は、１つ以上の重同位元素で標識した１つ以上のアミノ酸残基を含む、合成バージョンの正確に同じＳＰＡＲＣペプチドである。このような同位体標識内部標準を合成し、それにより、質量分析で分析した場合、これは、元のＳＰＡＲＣペプチドシグネチャピークとは異なる、区別可能で、予測可能かつ一貫したＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピークを生成し、比較ピークとして使用可能である。従って、生物検体由来のタンパク質調製物中に既知の量の内部標準が添加され、質量分析で分析された場合、元のペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積が内部標準ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積と比較され、この数値比較は、元の生物検体由来のタンパク質調製物中に存在する元のペプチドの絶対的モル濃度および／または絶対的重量を示す。フラグメントペプチドに対する絶対的データは、検体毎に分析されるタンパク質の量に従って、表示される。単一の検体中、および／または多くの検体間で同時に多くのペプチド、従って、タンパク質に関し、絶対的定量化を行い、個別生物検体および個別検体の全体コホート中の絶対的タンパク質量に対する洞察を得ることができる。
【００１０】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ法は、例えば、直接的に、ホルマリン固定組織等の患者由来の組織を使って、癌の病期の診断を支援し、また、どの治療薬が患者の治療に対する使用に最も都合が良いかどうかという決定を支援するのに使用できる。手術、例えば、部分または全体腫瘍の治療的除去により、または疑わしい疾患が存在するか否かを判断するために行う生検法により患者から取り出した癌組織を分析し、その患者組織中に１つ以上の特異的タンパク質があるのかどうか、およびどの型のタンパク質なのかを判断する。さらに、１つ以上のタンパク質の発現レベルが測定でき、健康な組織中で見つかった「正常な」または参照レベルと比較できる。健康な組織中で見つかったタンパク質の正常なまたは参照レベルは、例えば、癌を有さない１つ以上の個体の関連する組織由来であってもよい。あるいは、正常なまたは参照レベルは、癌の個体に対し、癌に罹患していない関連する組織の分析から得てもよい。タンパク質レベルのアッセイ（例えば、ＳＰＡＲＣレベル）は、ＳＰＡＲＣレベルを採用することにより癌と診断された患者または被験者の癌の病期の診断にも使用可能である。タンパク質またはペプチドのレベルまたは量は、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイにより測定されたタンパク質またはペプチドのモル、質量または重量により表現される量として定義できる。レベルまたは量は、分析ライセート中の全体タンパク質または他の成分のレベルまたは量に対し正規化できる（例えば、タンパク質のマイクロモル／マイクログラムまたはタンパク質のマイクログラム／マイクログラムとして表現）。さらに、タンパク質またはペプチドのレベルまたは量は、容量ベース、例えば、マイクロモルまたはナノグラム／マイクロリットルによる表現に基づいて測定してもよい。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイにより測定されたタンパク質またはペプチドのレベルまたは量は、また、分析した細胞の数で正規化可能である。ＳＰＡＲＣに関する情報は、従って、ＳＰＡＲＣタンパク質（またはＳＰＡＲＣタンパク質フラグメントペプチド）のレベルを正常組織で観察されるレベルと相互に関連付けることにより癌の病期またはグレードを決定するのを支援するために使用できる。癌の病期および／またはグレード、および／またはＳＰＡＲＣタンパク質の発現特性が解るとすぐに、その情報は、例えば、アッセイされる１つ以上のタンパク質（例えば、ＳＰＡＲＣ）の異常な発現を特徴とする癌組織を特異的に治療するように開発された治療薬（化学および生物学的）のリストと照合することができる。例えば、ＳＰＡＲＣタンパク質またはタンパク質を発現している細胞／組織を特異的に標的にする治療薬のリストを照合するＳＰＡＲＣタンパク質アッセイからの情報は、疾患を治療するための、いわゆるオーダーメイド医療手法を規定する。本明細書記載のアッセイ方法は、患者自信の組織由来のタンパク質の分析を診断と治療決定のソースとして使って、オーダーメイド医療手法の基盤を形成する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】パートＡ〜Ｃは、Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセートを使って三連四重極質量分析計により行ったＳＰＡＲＣペプチドの定量化によるＳＰＡＲＣタンパク質由来の単一ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
詳細な説明
原理的には、例えば、既知の特異性のプロテアーゼ（例えば、トリプシン）で消化されることにより調製されるＳＰＡＲＣタンパク質由来のいずれの予測されるペプチドも、質量分析ベースＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを使って検体中のＳＰＡＲＣタンパク質の存在量を測定するための代用レポーターとして使用可能である。同様に、ＳＰＡＲＣタンパク質中で潜在的に修飾されることが解っている部位のアミノ酸残基を含むいずれの予測されるペプチド配列も、また、検体中のＳＰＡＲＣタンパク質の修飾の度合いのアッセイに使用できる可能性がある。
【００１３】
ＳＰＡＲＣフラグメントペプチドは、米国特許第７，４７３，５３２号で提供されるＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）プロトコルの使用を含む種々の手段で生成可能である。Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）プロトコルおよび試薬を使って、組織／生物検体中のタンパク質のタンパク分解性消化により、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から質量分光分析に適したペプチド検体を作ることができる。Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）プロトコルでは、組織／生物検体は、長期間の緩衝液中で加熱され（例えば、約８０℃〜約１００℃で、約１０分〜約４時間）、タンパク質架橋の逆転または解放が起こる。採用される緩衝液は、中性の緩衝液（例えば、トリスベース緩衝液、または洗剤含有緩衝液）である。熱処理後、組織／生物検体は、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、およびエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃを含む（これに限定されない）１つ以上のプロテアーゼを使って、前記生物検体の組織と細胞構造を破壊し、前記検体を液化するのに充分な時間（例えば、温度３７℃〜６５℃で３０分〜２４時間）処理される。加熱および蛋白質分解の生成物は、可溶性で希釈可能な液体生体分子ライセートである。
【００１４】
驚くべきことに、ＳＰＡＲＣタンパク質由来の多くの可能性のあるペプチド配列が、質量分析ベースＳＲＭ／ＭＲＭアッセイでの使用に対し不適切であるか、または効果がないことが明らかになったが、理由はすぐには明らかになっていない。ＭＲＭ／ＳＲＭアッセイに対し最も適したペプチドの予測が可能ではないので、ＳＰＡＲＣタンパク質用の信頼できる正確なＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するために、実際のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセート中で、修飾および非修飾ペプチドを実験的に特定することが必要であった。いかなる理論にも拘泥する意図はないが、うまくイオン化せず、または他のタンパク質とは異なるフラグメントを生成しない、また、ペプチドが分離工程中（例えば、液体クロマトグラフィー）で、うまく分解できない、またはガラスまたはプラスチック器具に付着する可能性があるために、一部のペプチドは、例えば、質量分析によって検出することが困難である可能性があると考えられている。
【００１５】
本開示の種々の実施形態（例えば、表１および２）のＳＰＡＲＣペプチドは、ホルマリン固定癌組織から得た細胞から調製した複合Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセート中の全タンパク質のプロテアーゼ消化によるＳＰＡＲＣタンパク質由来であった。別段の指定がなければ、それぞれの例で、プロテアーゼはトリプシンであった。Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセートは、次に、質量分析で分析され、質量分析により検出され分析されるＳＰＡＲＣタンパク質由来のペプチドが測定される。質量分析用に好ましい特異的サブセットのペプチドの特定は、次の項目に基づいている；１）タンパク質由来の１つ以上のどのペプチドがＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセートの質量分析中にイオン化するかの実験的決定、および２）Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセートを調製するのに使用されるプロトコルおよび実験条件に対し生き残るためのペプチドの能力。この後者の特性は、ペプチドのアミノ酸配列のみならず、ペプチド内の修飾アミノ酸残基の修飾された形態で検体調製の間、生き残る能力までも及ぶものである。
【表１】
【表２】
【００１６】
ホルマリン（ホルムアルデヒド）固定組織から直接得た細胞由来のタンパク質ライセートをＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）試薬およびプロトコルを使って調製した。この方法は、組織のマイクロダイセクションにより検体チューブ中に細胞を集めた後、細胞をＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）緩衝液中で長期間加熱することを伴う。ホルマリン誘導架橋がマイナスの影響を受けるとすぐに、組織／細胞は、例えば、プロテアーゼトリプシン（これに限定されない）等のプロテアーゼを使って予想通りの方式で、完全に消化される。各タンパク質ライセートは、インタクトポリペプチドのプロテアーゼを使った消化により一群のペプチドへと変化する。各Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセートを分析し（例えば、イオントラップ質量分析）、複数のペプチドの包括的プロテオミック調査を行った。この場合、各タンパク質ライセート中に存在する全細胞性タンパク質から質量分析により可能な限り多くのペプチドが特定されるように、データを提示した。単一複合タンパク質／ペプチドライセートからできる限り多くのペプチドの特定のための包括的プロファイリングを行うことが可能なイオントラップ質量分析計または別の形式の質量分析計が採用される。しかし、イオントラップ質量分析計は、ペプチドの包括的プロファイリングを行うための質量分析計として最適のタイプであろう。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの開発および実行を、ＭＡＬＤＩ、イオントラップ、または三連四重極を含む任意のタイプの質量分析計で行うことができるが、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ用の最も都合のよい装置プラットフォームは、三連四重極装置プラットフォームであると考えられることが多い。
【００１７】
採用された条件下で、単一ライセートの単一ＭＳ分析により可能な限り多くのペプチドが特定されるとすぐに、そのペプチドリストは、照合され、ライセートで検出されたタンパク質を測定するために使われる。このプロセスは、複数のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセートに対し繰り返され、ペプチドの非常に長いリストが単一のデータセットにまとめられる。そのタイプのデータセットは、分析された（プロテアーゼ消化後に）生物検体のタイプ中で、具体的には、生物検体のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセート中で検出可能な、従って、特定のタンパク質、例えば、ＳＰＡＲＣタンパク質に対するペプチドを含む、ペプチドを表していると考えることができる。
【００１８】
一実施形態では、ＳＰＡＲＣ受容体の絶対的または相対的量の測定で有用であると特定されたＳＰＡＲＣトリプシン消化ペプチドには、１つ以上の、２つ以上の、３つ以上の、４つ以上の、５つ以上の、６つ以上の、８つ以上の、または１０以上の、次の配列番号のペプチドが含まれる：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号９これらのそれぞれは表１に挙げられている。これらのペプチドのそれぞれは、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織から調製したＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセートの質量分析により検出される。従って、表１のペプチドまたはこれらのペプチドのいずれかの組み合わせのそれぞれ（例えば、１つ以上の、２つ以上の、３つ以上の、４つ以上の、５つ以上の、６つ以上の、８つ以上の、または１０以上の、表１で列挙したこれらのペプチド、および表２にある1つ以上のペプチドとの具体的な組み合わせ）は、ホルマリン固定した患者組織を含むヒト生物検体中のＳＰＡＲＣタンパク質に対する定量的ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイでの使用のための候補である。
【００１９】
表１に挙げたＳＰＡＲＣトリプシン消化ペプチドは、前立腺、結腸、および乳房を含む異なるヒト器官の複数の異なるホルマリン固定組織の複数のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセートから検出されたものを含む。これらのペプチドのそれぞれは、ホルマリン固定組織中のＳＰＡＲＣタンパク質の定量的ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイのために有用であると考えられる。これらの実験のさらなるデータ分析では、いずれの特定の器官部位由来のいずれの特定のペプチドに対しても、選択性は観察されなかった。従って、それぞれのこれらのペプチドは、任意の生物検体または身体の任意の器官部位に由来する任意のホルマリン固定組織のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセート中のＳＰＡＲＣタンパク質のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを行うために適すると考えられる。
【００２０】
一実施形態では、表１のペプチドまたはこれらのペプチドの任意の組み合わせ（例えば、１つ以上の、２つ以上の、３つ以上の、４つ以上の、５つ以上の、６つ以上の、８つ以上の、または９以上の、表１で列挙したこれらのペプチド、および、また、表２に挙げられたペプチドとの具体的な組み合わせ）が、免疫学的な方法（例えば、ウェスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡ）（これに限定されない）を含む質量分析に依存しない方法、によりアッセイされる。ペプチド（絶対的または相対的）の量に対するどのような情報が得られるかに関わらず、その情報は、本明細書記載のいずれかの方法に採用することができ、被験者の癌の存在を示し（診断）、癌の病期／グレード／状態を決定し、予後を示し、または被検者／患者に対する治療薬または治療法を決定することが含まれる。
【００２１】
本開示の実施形態では、１つ以上の、２つ以上の、３つ以上の、４つ以上の、５つ以上の、６つ以上の、または８つ以上の、表１のペプチドを含む組成物が含まれる。一部の実施形態では、組成物は、１つ以上の、２つ以上の、または３つ以上の、表２のペプチドを含む。ペプチドを含む組成物は、１つ以上の、２つ以上の、３つ以上の、４つ以上の、５つ以上の、６つ以上の、７つ以上の、または８以上の同位体で標識したペプチドを含んでもよい。それぞれのペプチドは、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈまたはこれらの組み合わせからなる群から独立に選択される１つ以上の同位体で標識してもよい。同位体標識していても、していなくても、ＳＰＡＲＣタンパク質由来のペプチド含有組成物は、そのタンパク質由来の全てのペプチド（例えば、トリプシン消化ペプチドの完全のセット）を含む必要はない。一部の実施形態では、組成物は、１つ以上の、２つ以上の、３つ以上の、４つ以上の、５つ以上の、６つ以上の、８つ以上の、または１０以上の、ＳＰＡＲＣ由来のペプチド、および表１または表２に具体的に挙げられているペプチドを含まない。ペプチド含有組成物は、乾燥または凍結乾燥物質、液体（例えば、水性の）溶液または懸濁液、配列、またはブロットの形であってもよい。
【００２２】
表１に挙げたＳＰＡＲＣトリプシン消化ペプチドは、前立腺、結腸、および乳房を含む異なるヒト器官の複数の異なるホルマリン固定組織の複数のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセートから検出されたものを含む。これらのペプチドのそれぞれは、ホルマリン固定組織中のＳＰＡＲＣタンパク質の定量的ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイのために有用であると考えられる。これらの実験のさらなるデータ分析では、いずれの特定の器官部位由来のいずれの特定のペプチドに対しても、選択性は観察されなかった。従って、それぞれのこれらのペプチドは、任意の生物検体または身体の任意の器官部位に由来する任意のホルマリン固定組織のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセート中のＳＰＡＲＣタンパク質のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを行うために適すると考えられる。
【００２３】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを行う上での重要な考慮すべきことは、ペプチドの分析に使用する装置のタイプである。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、開発および実行をＭＡＬＤＩ、イオントラップ、または三連四重極を含む任意のタイプの質量分析計を使って行うことができるが、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ用の最も都合のよい装置プラットフォームは、三連四重極装置プラットフォームであると考えられることが多い。そのタイプの質量分析計が、細胞内に含まれる全タンパク質由来の１０００億の個別ペプチドを含むこともありうる極めて複雑化した単一のタンパク質ライセート内の単離標的ペプチドを分析するための最適の装置であると考えることができる。
【００２４】
各ＳＰＡＲＣタンパク質由来のペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを最も効率よく実施するためには、分析におけるペプチド配列に加えて追加の情報を利用することが望ましい。その追加の情報は、質量分析計（例えば、三連四重極質量分析計を）を操作するために使用して、正しく、的を絞った特異的標的化ペプチドの分析を行うことができ、それにより、アッセイを効率的に行うことが可能となる。
【００２５】
通常の標的ペプチドに関する、および特定のＳＰＡＲＣペプチドに関する追加の情報としては、ペプチドの１つ以上のモノアイソトピック質量、その前駆物質電荷状態、前駆物質ｍ／ｚ値、ｍ／ｚ遷移イオン、および各遷移イオンのイオンタイプを含んでもよい。ＳＰＡＲＣタンパク質用のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するために使用可能な追加のペプチド情報は、表１の一覧中の４つのＳＰＡＲＣペプチドに対する例により示され、これを表２に示す。表２の例で示されるこの４つのＳＰＡＲＣペプチドに対し記載されている類似の追加の情報が、作成され、取得され、さらに表１に含まれる他のペプチドの分析に適用可能である。
【００２６】
以下に記載する方法は、１）ＳＰＡＲＣタンパク質の質量分析ベースＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ用に使用可能なＳＰＡＲＣタンパク質由来の候補ペプチドを特定する、２）相互に関連付けるために、ＳＰＡＲＣタンパク質由来の標的ペプチドのための１つ以上の個別ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発する、および３）定量アッセイを癌診断および／または最適治療の選択に適用する、ために使用される。
【００２７】
アッセイ方法
１．ＳＰＡＲＣタンパク質のためのＳＲＭ／ＭＲＭ候補フラグメントペプチドの特定
ａ．１つ以上のプロテアーゼ（これには、トリプシンを含んでも含まなくてもよい）を使ってタンパク質を消化して、ホルマリン固定生物検体からＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）タンパク質ライセートを調製する。
ｂ．イオントラップタンデム質量分析計を用いて、Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセート中の全タンパク質フラグメントを分析し、ＳＰＡＲＣタンパク質由来の全フラグメントペプチドを特定する。この場合、個別フラグメントペプチドは、どのペプチド修飾、例えば、リン酸化またはグリコシル化、も含まない。
ｃ．イオントラップタンデム質量分析計を用いて、Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセート中の全タンパク質フラグメントを分析し、ペプチド修飾、例えば、リン酸化またはグリコシル化残基を有するＳＰＡＲＣタンパク質由来の全フラグメントペプチドを特定する。
ｄ．完全長ＳＰＡＲＣ完全タンパク質から特異的消化方法により生成された全ペプチドを測定することは可能ではあるが、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの開発に使用される好ましいペプチドは、ホルマリン固定生物検体から調製される複合Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）タンパク質ライセートで直接質量分析により特定されるものである。
ｅ．ホルマリン固定生物検体由来のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセートの分析を行う場合、患者組織中で特異的に修飾され（リン酸化された、グリコシル化された、等）、質量分析計中でイオン化され、検出されるペプチドは、ＳＰＡＲＣタンパク質のペプチド修飾をアッセイするための候補ペプチドとして特定される。
２．ＳＰＡＲＣタンパク質由来のフラグメントペプチドの質量分析アッセイ
ａ．Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセート中で特定された個別フラグメントペプチドのための三連四重極質量分析計を使ったＳＲＭ／ＭＲＭアッセイがＳＰＡＲＣタンパク質由来のペプチドに適用される。
ｉ．最適クロマトグラフィー条件のためのフラグメントペプチドに対する最適保持時間の決定。使用されるクロマトグラフィーには、これに限定されないが、ゲル電気泳動法、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動法、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または逆相高速液体クロマトグラフィー、が含まれる。
ｉｉ．各ペプチドに対するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するために、ペプチドのモノアイソトピック質量、各ペプチドに対する前駆物質電荷状態、各ペプチドに対する前駆物質ｍ／ｚ値、各ペプチドに対するｍ／ｚ遷移イオン、および各フラグメントペプチドに対する各遷移イオンのイオンタイプの測定を行う。
ｉｉｉ．次に、（ｉ）および（ｉｉ）からの情報を使って、三連四重極質量分析計によりＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを行うことができる。この場合、各ペプチドは、三連四重極質量分析計で行われる独特のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを明確に規定する特徴的かつ固有のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピークを有する。
ｂ．ＳＲＭ／ＭＲＭ質量分析における固有のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積の関数として、検出されるＳＰＡＲＣタンパク質のフラグメントペプチドの量が、特定のタンパク質ライセート中の相対的および絶対的量のタンパク質を表すことができるように、ＳＲＭ／ＭＲＭ分析を行う。
ｉ．相対的定量は、下記により行うことができる：
１．１つのホルマリン固定生物検体由来のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセート中で検出された所与のＳＰＡＲＣペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積を、少なくとも第２、第３、第４、またはそれを超えるのホルマリン固定生物検体由来の少なくとも第２、第３、第４、またはそれを超えるのＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセート中の同じＳＰＡＲＣフラグメントペプチドの同じＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積と比較することにより、ＳＰＡＲＣタンパク質の増加または減少を測定する。
２．１つのホルマリン固定生物検体由来のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセート中で検出された所与のＳＰＡＲＣペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積を、異なる、別の生物学的ソース由来の他の検体中の他のタンパク質由来のフラグメントペプチドから生成したＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積と比較することにより、ＳＰＡＲＣタンパク質の増加または減少を測定する。この場合、２検体間のペプチドフラグメントに対するＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積比較は、各検体で分析されたタンパク質の量に正規化されている。
３．ＳＰＡＲＣタンパク質のレベルの変化を、種々の細胞性条件下でそれらの発現レベルを変化させない他のタンパク質のレベルに正規化するために、所与のＳＰＡＲＣペプチドに対するＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積を、ホルマリン固定生物検体由来の同じＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセート内の異なるタンパク質由来の他のフラグメントペプチドからのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積と比較することにより、ＳＰＡＲＣタンパク質の増加または減少を測定する。
４．これらのアッセイは、ＳＰＡＲＣタンパク質の非修飾フラグメントペプチドおよび修飾フラグメントペプチドの両方に対し適用可能である。この場合、修飾には、これに限定されないが、リン酸化および／またはグリコシル化が含まれ、また、修飾ペプチドの相対的レベルは、非修飾ペプチドの相対的量測定と同じ方法で測定される。
ｉｉ．所与のペプチドの絶対的定量は、個別の生物検体中の所与のフラグメントＳＰＡＲＣタンパク質由来のペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積を、生物検体由来のタンパク質ライセート中に添加された内部フラグメントペプチド標準のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積と比較することにより行うことができる。
１．内部標準は、標識した合成バージョンのフラグメントＳＰＡＲＣタンパク質由来の参照されるペプチドである。この標準は、既知量で検体中に添加され、ＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積が、生物検体中の内部フラグメントペプチド標準および元のフラグメントペプチドの両方に対し、別々に測定され、その後、両ピーク面積が比較される。
２．これは、非修飾フラグメントペプチドおよび修飾フラグメントペプチドに適用でき、この場合、修飾には、これに限定されないが、リン酸化および／またはグリコシル化が含まれ、また、絶対的レベルの修飾ペプチドは、絶対的レベルの非修飾ペプチドの測定と同じ方法で測定可能である。
３．フラグメントペプチド定量化の癌診断および治療への適用
ａ．ＳＰＡＲＣタンパク質のフラグメントペプチドレベルの相対的および／または絶対的定量化を行い、癌の分野で十分理解されている、ＳＰＡＲＣタンパク質発現と患者腫瘍組織中の癌の病期／グレード／状態の間の、以前測定されている関連性が確認されることを証明する。
ｂ．ＳＰＡＲＣタンパク質のフラグメントペプチドレベルの相対的および／または絶対的定量化を行い、異なる治療戦略から来る臨床的転帰との相関を証明する。この場合、この相関は、この分野ですでに証明されているか、または患者およびこれらの患者由来の組織のコホート全体の相関調査により将来証明可能である。以前確立された相関関係または将来得られる相関関係がこのアッセイにより確認されるとすぐに、本アッセイ方法は、最適治療戦略の決定に使用可能である。
【００２８】
図１は、ホルマリン固定癌組織由来のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセートで行った単一ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの例を示す。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、三連四重極質量分析計によるＳＰＡＲＣタンパク質の定量化のために単一ペプチドに対し開発された。このＳＰＡＲＣペプチド(配列ＮＶＬＶＴＬＹＥＲ)に関して）の特異的および固有の特性は、イオントラップおよび三連四重極質量分析計の両方を使って、全ＳＰＡＲＣペプチドの分析により開発され、図１に示されている。その情報には、ペプチドのモノアイソトピック質量、その前駆物質電荷状態、前駆物質ｍ／ｚ値、前駆物質の遷移ｍ／ｚ値、および特定された各遷移のイオンタイプが含まれる。その情報は、各および全候補ＳＲＭ／ＭＲＭペプチドに対し、ホルマリン固定組織由来のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセート中で直接的に実験により測定されなければならない；理由は、興味深いことに、本明細書記載のＳＲＭ／ＭＲＭを使って、必ずしも全てのＳＰＡＲＣタンパク質由来のペプチドが、このようなライセート中に検出されるとは限らないからであり、検出されなかったＳＰＡＲＣペプチドが、ホルマリン固定組織由来Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）ライセート中で直接にペプチド／タンパク質を定量するのに使用するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するための候補ペプチドと考えられることはあり得ないことを示している。
【００２９】
図１Ｂに示すように、この特殊ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、三連四重極質量分析計を使って実行された。大量のペプチドが存在することが解っている対照タンパク質ライセートを分析したが、理由は、このライセートがヒト由来癌細胞株のヌードマウスへの注入により生じたマウス異種移植腫瘍から調製されたためである。従って、この異種移植腫瘍は陽性対照であった。この実験の実験検体は、標準ホルマリン固定、パラフィン包埋ヒト乳癌組織から調製されたＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）タンパク質ライセートであった。アッセイデータは、対照検体（上段クロマトグラフ）および実験検体（下段クロマトグラフ）の両方中で、このＳＰＡＲＣペプチドに対し固有のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピークの存在を示す。これら２検体間のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャピーク面積の比較により、２つの異なる生物検体間のＳＰＡＲＣタンパク質に対する相対的定量測定値が得られる。
【００３０】
図１Ｃは、癌由来患者検体のコホート全体のＳＰＡＲＣタンパク質の絶対的定量を行うための内部標準を使った、３０つのホルマリン固定癌組織の上述ペプチドの定量測定を示す。これらのデータは、分析したタンパク質ライセートのマイクログラム当たりのペプチドのモル量の関数として、このＳＰＡＲＣペプチドの絶対的量を示している。ホルマリン固定患者由来の組織の分析に基づく組織中のＳＰＡＲＣタンパク質レベルの評価は、特定の各患者に関する診断、予後、および治療関連情報を提供できる。一実施形態では、本開示は、生物検体中のＳＰＡＲＣタンパク質のレベルの測定方法が記載され、これには、質量分析を使って前記生物検体から調製されたタンパク質消化物中の１つ以上の修飾または非修飾ＳＰＡＲＣフラグメントペプチドの量の検出および／または定量；および前記検体中の修飾または非修飾ＳＰＡＲＣタンパク質のレベルの計算が含まれ；ここで前記レベルは、相対的レベルまたは絶対的レベルである。関連実施形態では、１つ以上のＳＰＡＲＣフラグメントペプチドの定量化には、既知量の添加内部標準ペプチドと比較することによる、生物検体中の各ＳＰＡＲＣフラグメントペプチドの量の測定が含まれ、ここで、生物検体中の各ＳＰＡＲＣフラグメントペプチドが同じアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較される。一部の実施形態では、内部標準は、同位体標識した内部標準ペプチドで、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈまたはこれらの組み合わせから選択される１つ以上の安定重同位体を含む。
【００３１】
本明細書記載の生物検体（またはその代替物としてのフラグメントペプチド）中のＳＰＡＲＣタンパク質のレベルを測定する方法は、患者または被験者の癌の診断指標として使用可能である。一実施形態では、ＳＰＡＲＣタンパク質のレベルの測定結果は、組織中に認められるＳＰＡＲＣ受容体のレベルと正常および／または癌性または前癌性組織で認められるタンパク質のレベルを関連付ける（例えば、比較する）ことにより診断上の癌の病期／グレード／状態を判定するために採用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物検体中の酸性およびシステインに富む分泌（ＳＰＡＲＣ）タンパク質のレベルの測定方法であって、前記生物検体から調製したタンパク質消化物中の１つ以上の修飾または非修飾ＳＰＡＲＣフラグメントペプチドの量の質量分析による検出および／または定量；ならびに前記検体中の修飾または非修飾ＳＰＡＲＣタンパク質のレベルの計算を含み；さらに前記レベルが相対的レベルまたは絶対的レベルである、方法。
【請求項２】
１つ以上の修飾または非修飾ＳＰＡＲＣフラグメントペプチドの量の検出および／または定量の前に、前記タンパク質消化物を分画するステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分画ステップが、ゲル電気泳動法、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動法、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または逆相高速液体クロマトグラフィー、からなる群より選択される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記生物検体の前記タンパク質消化物が、Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）プロトコルにより調製される請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質消化物がプロテアーゼ消化物を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質消化物がトリプシン消化物を含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記質量分析が、タンデム型質量分析、イオントラップ質量分析、三連四重極質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、ＭＡＬＤＩ質量分析、および／または飛行時間型質量分析を含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
使用される質量分析のモードが、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、および／または複数の選択反応モニタリング（ｍＳＲＭ）である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＳＰＡＲＣフラグメントペプチドが、下記に設定されるアミノ酸配列を含む請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号９。
【請求項１０】
前記生物検体が血液サンプル、尿検体、血清検体、腹水検体、痰検体、リンパ体液、唾液検体、細胞、または固形組織である請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記組織がホルマリン固定組織である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記組織がパラフィン包埋組織である請求項１０または１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記組織が腫瘍から入手される請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記腫瘍が原発性腫瘍である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記腫瘍が２次腫瘍である請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記修飾または非修飾ＳＰＡＲＣフラグメントペプチドを定量することをさらに含む請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
１つの生物検体中の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、または配列番号９で示されるＳＰＡＲＣの約８〜約４５アミノ酸残基のアミノ酸配列を含む１つ以上のＳＰＡＲＣフラグメントペプチドの量を、異なる、別の生物検体中の同じＳＰＡＲＣフラグメントペプチドの量と比較することを含むＳＰＡＲＣフラグメントペプチドを定量する請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
１つ以上のＳＰＡＲＣフラグメントペプチドの定量が、既知量の添加内部標準ペプチドに対する比較により、生物検体中の各ＳＰＡＲＣフラグメントペプチドの量を測定することを含み、ここで生物検体中の各ＳＰＡＲＣフラグメントペプチドが同じアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドに対し比較される請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記内部標準ペプチドが同位体で標識したペプチドである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記同位体で標識した内部標準ペプチドが、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈまたはこれらの組み合わせから選択される１つ以上の安定重同位体を含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
タンパク質消化物中の１つ以上の修飾または非修飾ＳＰＡＲＣフラグメントペプチドの量の検出および／または定量により、修飾または非修飾ＳＰＡＲＣタンパク質の存在および被験者の癌との関連性が示される請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
１つ以上の修飾または非修飾ＳＰＡＲＣフラグメントペプチドの量、または前記ＳＰＡＲＣタンパク質のレベルの前記検出および／または定量結果と、診断上の癌の病期／グレード／状態とを関連付けることをさらに含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
１つ以上の修飾または非修飾ＳＰＡＲＣフラグメントペプチドの量、または前記ＳＰＡＲＣタンパク質のレベルの前記検出および／または定量結果の、診断上の癌の病期／グレード／状態に対する関連付けが、他のタンパク質由来の他のタンパク質またはペプチドの量の検出および／または定量と組み合わされて、多項目同時測定により、診断上の癌の病期／グレード／状態に関する追加の情報を提供する請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記生物検体が採取された被験者に対し、１つ以上のＳＰＡＲＣフラグメントペプチドの存在、非存在、もしくは量またはＳＰＡＲＣタンパク質のレベルに基づいて治療を選択することをさらに含む請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記生物検体が採取された患者に対し、治療有効量の治療薬を投与することをさらに含み、投与される治療薬および／または治療薬の量が、１つ以上の修飾または非修飾ＳＰＡＲＣフラグメントペプチドの量またはＳＰＡＲＣタンパク質のレベルに基づいている請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
治療薬がＳＰＡＲＣタンパク質を発現する癌細胞を示す請求項２４および２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記生物検体が、Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）プロトコルおよび試薬を使って、１つ以上の修飾または非修飾ＳＰＡＲＣフラグメントペプチドの量を定量するための処理を受けているホルマリン固定腫瘍組織である請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
１つ以上の修飾または非修飾ＳＰＡＲＣフラグメントペプチドが、２つ以上、３つ以上、４以上、５以上、６以上、８以上、または１０以上の表１のペプチドである請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
1つ以上、２つ以上、または３つ以上の表２のペプチドの量の定量化を含む請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
１つ以上、２つ以上、３つ以上、４以上、５以上、６以上、８以上、または１０以上の表１のペプチドまたはそれらに対する抗体を含む組成物。
【請求項３１】
1つ以上、２つ以上、または３つ以上の表２のペプチドまたはそれらに対する抗体を含む請求項３０に記載の組成物。
【請求項１】
生物検体中の酸性およびシステインに富む分泌（ＳＰＡＲＣ）タンパク質のレベルの測定方法であって、前記生物検体から調製したタンパク質消化物中の１つ以上の修飾または非修飾ＳＰＡＲＣフラグメントペプチドの量の質量分析による検出および／または定量；ならびに前記検体中の修飾または非修飾ＳＰＡＲＣタンパク質のレベルの計算を含み；さらに前記レベルが相対的レベルまたは絶対的レベルである、方法。
【請求項２】
１つ以上の修飾または非修飾ＳＰＡＲＣフラグメントペプチドの量の検出および／または定量の前に、前記タンパク質消化物を分画するステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分画ステップが、ゲル電気泳動法、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動法、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または逆相高速液体クロマトグラフィー、からなる群より選択される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記生物検体の前記タンパク質消化物が、Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）プロトコルにより調製される請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質消化物がプロテアーゼ消化物を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質消化物がトリプシン消化物を含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記質量分析が、タンデム型質量分析、イオントラップ質量分析、三連四重極質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、ＭＡＬＤＩ質量分析、および／または飛行時間型質量分析を含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
使用される質量分析のモードが、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、および／または複数の選択反応モニタリング（ｍＳＲＭ）である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＳＰＡＲＣフラグメントペプチドが、下記に設定されるアミノ酸配列を含む請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号９。
【請求項１０】
前記生物検体が血液サンプル、尿検体、血清検体、腹水検体、痰検体、リンパ体液、唾液検体、細胞、または固形組織である請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記組織がホルマリン固定組織である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記組織がパラフィン包埋組織である請求項１０または１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記組織が腫瘍から入手される請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記腫瘍が原発性腫瘍である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記腫瘍が２次腫瘍である請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記修飾または非修飾ＳＰＡＲＣフラグメントペプチドを定量することをさらに含む請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
１つの生物検体中の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、または配列番号９で示されるＳＰＡＲＣの約８〜約４５アミノ酸残基のアミノ酸配列を含む１つ以上のＳＰＡＲＣフラグメントペプチドの量を、異なる、別の生物検体中の同じＳＰＡＲＣフラグメントペプチドの量と比較することを含むＳＰＡＲＣフラグメントペプチドを定量する請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
１つ以上のＳＰＡＲＣフラグメントペプチドの定量が、既知量の添加内部標準ペプチドに対する比較により、生物検体中の各ＳＰＡＲＣフラグメントペプチドの量を測定することを含み、ここで生物検体中の各ＳＰＡＲＣフラグメントペプチドが同じアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドに対し比較される請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記内部標準ペプチドが同位体で標識したペプチドである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記同位体で標識した内部標準ペプチドが、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈまたはこれらの組み合わせから選択される１つ以上の安定重同位体を含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
タンパク質消化物中の１つ以上の修飾または非修飾ＳＰＡＲＣフラグメントペプチドの量の検出および／または定量により、修飾または非修飾ＳＰＡＲＣタンパク質の存在および被験者の癌との関連性が示される請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
１つ以上の修飾または非修飾ＳＰＡＲＣフラグメントペプチドの量、または前記ＳＰＡＲＣタンパク質のレベルの前記検出および／または定量結果と、診断上の癌の病期／グレード／状態とを関連付けることをさらに含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
１つ以上の修飾または非修飾ＳＰＡＲＣフラグメントペプチドの量、または前記ＳＰＡＲＣタンパク質のレベルの前記検出および／または定量結果の、診断上の癌の病期／グレード／状態に対する関連付けが、他のタンパク質由来の他のタンパク質またはペプチドの量の検出および／または定量と組み合わされて、多項目同時測定により、診断上の癌の病期／グレード／状態に関する追加の情報を提供する請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記生物検体が採取された被験者に対し、１つ以上のＳＰＡＲＣフラグメントペプチドの存在、非存在、もしくは量またはＳＰＡＲＣタンパク質のレベルに基づいて治療を選択することをさらに含む請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記生物検体が採取された患者に対し、治療有効量の治療薬を投与することをさらに含み、投与される治療薬および／または治療薬の量が、１つ以上の修飾または非修飾ＳＰＡＲＣフラグメントペプチドの量またはＳＰＡＲＣタンパク質のレベルに基づいている請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
治療薬がＳＰＡＲＣタンパク質を発現する癌細胞を示す請求項２４および２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記生物検体が、Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（登録商標）プロトコルおよび試薬を使って、１つ以上の修飾または非修飾ＳＰＡＲＣフラグメントペプチドの量を定量するための処理を受けているホルマリン固定腫瘍組織である請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
１つ以上の修飾または非修飾ＳＰＡＲＣフラグメントペプチドが、２つ以上、３つ以上、４以上、５以上、６以上、８以上、または１０以上の表１のペプチドである請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
1つ以上、２つ以上、または３つ以上の表２のペプチドの量の定量化を含む請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
１つ以上、２つ以上、３つ以上、４以上、５以上、６以上、８以上、または１０以上の表１のペプチドまたはそれらに対する抗体を含む組成物。
【請求項３１】
1つ以上、２つ以上、または３つ以上の表２のペプチドまたはそれらに対する抗体を含む請求項３０に記載の組成物。
【図１】
【公表番号】特表２０１３−５１５２７４（Ｐ２０１３−５１５２７４Ａ）
【公表日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４６２１８（Ｐ２０１２−５４６２１８）
【出願日】平成２２年１２月２２日（２０１０．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６１９２５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８７８６９
【国際公開日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【出願人】（５０５３４３７４５）エクスプレッション、パソロジー、インコーポレイテッド (7)
【氏名又は名称原語表記】ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＰＡＴＨＯＬＯＧＹ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月２２日（２０１０．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６１９２５
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８７８６９
【国際公開日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【出願人】（５０５３４３７４５）エクスプレッション、パソロジー、インコーポレイテッド (7)
【氏名又は名称原語表記】ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＰＡＴＨＯＬＯＧＹ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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