量子ドット複合体、量子ドット複合体含有ベシクル及びこれらの製造方法
【課題】蛍光イメージングによる位置特定と、生体組織に対する高効率な薬剤放出機構とを備え、かつ煩雑な合成プロセスを伴うことなく得られる量子ドット複合体、量子ドット複合体含有ベシクルを提供する。
【解決手段】半導体ナノ粒子からなるコア部１２と該コア部１２の表面にポリマーが結合してなるシェル部１４とを備え、かつ表面に反応活性基を備える量子ドット１０と、該量子ドット１０の表面の反応活性基に結合された生体関連分子２０とを備える量子ドット複合体１よりなる。さらに、リン脂質二重層で構成されるベシクルの層内及び表面の双方またはいずれかに量子ドット複合体１を含有することよりなる。
【解決手段】半導体ナノ粒子からなるコア部１２と該コア部１２の表面にポリマーが結合してなるシェル部１４とを備え、かつ表面に反応活性基を備える量子ドット１０と、該量子ドット１０の表面の反応活性基に結合された生体関連分子２０とを備える量子ドット複合体１よりなる。さらに、リン脂質二重層で構成されるベシクルの層内及び表面の双方またはいずれかに量子ドット複合体１を含有することよりなる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、量子ドット複合体、量子ドット複合体含有ベシクル及びこれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
半導体ナノ結晶からなる量子ドットは、電子・光デバイスやライフサイエンスをはじめとする様々な技術分野で注目を集める材料である。量子ドットは、非常に高いモル吸光係数と蛍光量子収率を有し、吸収スペクトルと蛍光スペクトルは、量子ドットの粒子サイズに依存して、容易にチューニングでき、蛍光スペクトルでは、紫外域から赤外域にわたってシャープなスペクトル特性を示す。さらに、量子ドットは優れた光退色耐性と光／化学分解耐性を示す等、既知の蛍光材料にはない特徴を有している。
【０００３】
これまで、バイオイメージングにおいては、一般に有機蛍光色素が利用され、その光退色が長時間観測を妨げる要因となっていた。量子ドットを用いれば、この問題を克服でき、さらに、量子ドットは粒子サイズに依存して異なる波長の蛍光を発することから、生体組織内に異なるサイズの量子ドットを導入することで、単一励起波長において同時に生体分子の多色観察を行うことができる。
【０００４】
量子ドットを構成する材料として、セレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）、硫化カドミウム（ＣｄＳ）、テルル化カドミウム（ＣｄＴｅ）、硫化亜鉛（ＺｎＳ）等が使用されており、これらは生体系への有害性が懸念されてきた。加えて、量子ドットは、優れた蛍光特性を示すものの、そのままではタンパク質、糖質、核酸等の生体分子と融合させることができない。
【０００５】
そこで、量子ドットの表面を種々の親水性の有機分子やポリマーで被覆し、無害化処理した生体適合型の量子ドットが提案されている（非特許文献１、２）。このような量子ドットの表面には、カルボキシル基、アミノ基、システイン基等が導入されており、これらの官能基を利用することで、タンパク質（酵素、ホルモン、受容体、成長因子、抗体）、核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）、糖質、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド等の生体分子と化学結合できる。
【０００６】
一方、リン脂質分子は、自己組織化によって脂質二重層（リン脂質二重層）を形成し、細胞膜の主要な構成要素となる他、細胞膜内外の物質移動に用いられる小さな脂質ベシクル（リポソーム）を形成する。ベシクルは、微小な水相をリン脂質二重層が包み込んだカプセル状の構造体であり、その内孔には、抗がん剤等の種々の化学物質を内包することができる。このため医薬、食品、化粧品産業における有効な技術ツールとして、また、次世代のナノ・マイクロスケールのドラックデリバリーシステムやバイオチップの構成要素としての応用が期待されている。近年では、基板上にベシクルを高密度に固定化したマイクロアレイを作製し、アトリットル（１ａＬ＝１０−１８Ｌ）スケールの分子を、ハイスループットで検査するライブラリ基板用の作製ツールが提案されている（非特許文献３）。
【０００７】
これらのバイオシステムにおいて、ベシクルは薬物を内包するベッセル、もしくは薬物を運搬するキャリアの役割を担うが、その際、ベシクルの位置を特定するために、ベシクルを蛍光標識化する必要がある。通常、その手段として、蛍光色素でラベル化されたリン脂質分子を、ベシクルに挿入する手法が用いられる（非特許文献４、５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｚ．Ｚｈｅｌｅｖら、「アナリティカル・ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、第７８巻、２００６年、第３２１−３３０頁
【非特許文献２】Ｋ．Ｓｕｓｕｍｕら、「ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）」、第１２９巻、２００７年、第１３９８７−１３９９６頁
【非特許文献３】Ｄ．Ｓｔａｍｏｕら、「アンゲヴァンテ・ ケミィ・インターナショナル・エディション（Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ）」、第４２巻、２００３年、第５５８０−５５８３頁
【非特許文献４】Ｊ．Ｗ．Ｎｉｃｈｏｌｓ、「バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、第２４巻、１９８５年、第６３９０−６３９８頁
【非特許文献５】Ｙ．Ｌｉら、「ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）」、第１３０巻、２００８年、第１２２５２−２２５３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、有機蛍光色素等の既存の蛍光色素化合物は、光退色に問題があり、ベシクルの動的・静的な挙動を長時間にわたって観測する系には適していない。蛍光色素ラベル化リン脂質分子は、強い光照射により、光／化学分解を生じる欠点があり、ベシクルは、この光／化学分解に伴い、不安定化して、その構造が崩壊してしまう可能性がある。特にドラックデリバリーシステムでは、ベシクルが崩壊すると、内包する化学物質が目的外の位置で放出されてしまうため、その用途には利用できない。
加えて、蛍光色素化合物に代えて量子ドットで蛍光ラベル化しようとしても、ベシクルのリン脂質二重層に量子ドットを取り込むのが困難であった。
さらに、ベシクルをドラックデリバリーやバイオチップシステムに利用する場合には、内包する薬剤を生体分子に対して、高効率に作用させる機構が要求される。
【００１０】
本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、蛍光イメージングによる位置特定と、生体組織に対する高効率な薬剤放出機構とを備え、かつ煩雑な合成プロセスを伴うことなく得られる量子ドット複合体、量子ドット複合体含有ベシクル及びこれらの製造方法を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の量子ドット複合体は、半導体ナノ粒子からなるコア部と該コア部の表面にポリマーが結合してなるシェル部とを備え、かつ表面に反応活性基を備える量子ドットと、該量子ドットの表面の反応活性基に結合された生体関連分子とを備えることを特徴とする。
前記生体関連分子は、リン脂質であることが好ましい。
【００１２】
本発明の量子ドット複合体の製造方法は、前記の本発明の量子ドット複合体の製造方法であって、前記量子ドットの表面の反応活性基に、前記生体関連分子の反応活性基を結合することを特徴とする。
【００１３】
本発明の量子ドット複合体含有ベシクルは、リン脂質からなる脂質二重層がカプセル状に形成され、前記の本発明の量子ドット複合体が、前記脂質二重層の層内及び表面の双方又はいずれか一方に含有されてなることを特徴とする。
前記のカプセル状に形成された脂質二重層で化学物質が内包されていてもよく、前記脂質二重層は、その表面にポリエーテル鎖を備えることが好ましく、前記ポリエーテル鎖は、末端に生体分子と結合可能な官能基を備えることがより好ましい。
【００１４】
本発明の量子ドット複合体含有ベシクルの製造方法は、半導体ナノ粒子からなるコア部と該コア部の表面にポリマーが結合してなるシェル部とを備え、かつ表面に反応活性基を備える量子ドットと、生体関連分子とを、前記量子ドットの表面の反応活性基と前記生体関連分子の反応活性基との化学結合により結合させ量子ドット複合体を得る第一の工程と、得られた量子ドット複合体とリン脂質とを分散媒に分散させ、前記分散媒を除去して量子ドット複合体を含むリン脂質を薄膜化した後、水溶液中でリン脂質をカプセル化する第二の工程とを有することを特徴とする。
前記第二の工程は、さらに化学物質を添加してもよく、前記第二の工程は、さらに末端に生体分子と結合可能な官能基を備えるポリエーテル鎖が導入されたリン脂質を添加して分散液とすることが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の量子ドット複合体、量子ドット複合体含有ベシクルによれば、煩雑な合成プロセスを伴うことなく、蛍光イメージングによる位置特定ができ、生体組織に対する薬剤放出機構の高効率化が図れる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の一実施形態にかかる量子ドット複合体の断面図である。
【図２】（ａ）本発明の一実施形態にかかる量子ドット複合体含有ベシクルの断面図である。（ｂ）（ａ）の部分拡大図である。
【図３】本発明の一実施形態にかかる量子ドット複合体含有ベシクルの断面図である。
【図４】本発明の一実施形態にかかる量子ドット複合体含有ベシクルの断面図である。
【図５】本発明の一実施形態にかかる量子ドット複合体含有ベシクルの断面図である。
【図６】実施例１、２の量子ドット複合体における吸収スペクトル測定の結果を示すグラフである。
【図７】実施例１、２の量子ドット複合体における蛍光スペクトルの測定結果を示すグラフである。
【図８】（ａ）実施例１の量子ドット複合体における動的光散乱の測定結果を示すグラフである。（ｂ）参考品である量子ドット５２５における動的光散乱の測定結果を示すグラフである。
【図９】（ａ）実施例１の量子ドット複合体の原子間力顕微鏡での観察結果を示す写真である。（ｂ）（ａ）で観察された粒子の粒径の測定結果を示すグラフである。（ｃ）（ａ）で観察された粒子の粒径の測定結果を示すグラフである。
【図１０】（ａ）参考品である量子ドット５２５の原子間力顕微鏡での観察結果を示す写真である。（ｂ）（ａ）で観察された粒子の粒径の測定結果を示すグラフである。（ｃ）（ａ）で観察された粒子の粒径の測定結果を示すグラフである。
【図１１】実施例５の量子ドット複合体含有ベシクルの共焦点レーザー蛍光顕微鏡の観察結果を示す写真である。
【図１２】（ａ）実施例５の量子ドット複合体含有ベシクルの原子間力顕微鏡での観察結果を示す写真である。（ｂ）ベシクルの膜厚の測定結果を示すグラフである。（ｃ）（ａ）で観察されたドット構造の粒径の測定結果を示すグラフである。
【図１３】（ａ）実施例５の量子ドット複合体含有ベシクルの原子間力顕微鏡での観察結果を示す写真である。（ｂ）（ａ）で観察されたドット構造の粒径の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（量子ドット複合体）
本発明の量子ドット複合体の一例について、以下に図面を参照しながら説明する。図１に示すように、量子ドット複合体１は、量子ドット１０と、量子ドット１０の表面に結合された生体関連分子２０とを備えるものである。
【００１８】
＜量子ドット＞
量子ドット１０は、半導体ナノ粒子からなるコア部１２と、該コア部１２の表面にポリマーが結合してなるシェル部１４とを備え、かつ表面に反応活性基を備えるものである。
コア部１２である半導体ナノ粒子は、半導体のナノメートルサイズの微粒子であり、量子閉じ込め効果を有する発光材料である。半導体ナノ粒子としては、金属元素と、非金属元素又は遷移金属元素を組み合わせたものが挙げられ、例えば、セレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）、硫化カドミウム（ＣｄＳ）、テルル化カドミウム（ＣｄＴｅ）、硫化亜鉛（ＺｎＳ）等のＩＩＢ−ＶＩＢ族のもの、インジウムリン（ＩｎＰ）、ガリウムリン（ＧａＰ）等のＩＩＩＢ−ＶＢ族のもの等が挙げられる。
【００１９】
シェル部１４を構成するポリマーとしては、後述する生体関連分子２０の反応活性基と結合する反応活性基を備えるものであればよく、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート等の生体適合型ポリマーに、カルボキシル基やアミノ基を反応活性基として備えるポリマーが挙げられる。中でも、生体関連分子２０としてリン脂質を用いる場合には、カルボキシル基を反応活性基として備えるポリマーが好ましく、カルボキシル基を反応活性基として備えるＰＥＧがより好ましい。
コア部１２の半導体ナノ粒子は、溶液中で凝集しやすく取り扱いが困難であると共に、人体への健康被害や環境に対する毒性が懸念されるものである。量子ドット１０は、生体親和性の高いポリマーで構成されるシェル部１４を備えることで、無害化され、医療、バイオテクノロジー分野等で汎用的に用いることができる。
加えて、量子ドット１０は、シェル部１４の表面に、カルボキシル基等の反応活性基が導入されていることで、生体関連分子２０を量子ドット１０表面に直接化学結合させた、量子ドット複合体１を作製することができる。
【００２０】
量子ドット１０は、コア部１２の半導体ナノ粒子のサイズによって、発光波長が著しく変化する。通常、バイオイメージングでは、可視域の波長を利用するため、コア部１２のサイズとしては、可視域に発光を示す１〜２０ｎｍ程度のものが好ましい。また、シェル部１４の厚みは特に限定されないが、１〜３０ｎｍ程度のものが好ましい。
【００２１】
＜生体関連分子＞
生体関連分子２０は、生体中に存在する分子及びその誘導体である。生体関連分子２０としては、例えば、リン脂質、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸、ポリペプチド、オリゴペプチド、糖等が挙げられ、中でも、リン脂質が好ましい。
【００２２】
リン脂質は、その疎水部のアシル鎖長、アシル鎖内の二重結合の有無、さらにその二重結合の部位と数は特に限定されない。ただし、リン脂質の親水頭部は、量子ドット１０表面にあるカルボキシル基等の活性反応基と化学結合が可能な、ホスファエタノールアミン（ＰＥ）を備える構造が好ましい。このようなリン脂質としては、下記（Ｉ）式で表される１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、下記（ＩＩ）式で表される１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、下記（ＩＩＩ）式で表される１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファエタノールアミン（ＤＳＰＥ）等が挙げられる。
【００２３】
【化１】
【００２４】
【化２】
【００２５】
【化３】
【００２６】
＜量子ドット複合体の製造方法＞
本発明の量子ドット複合体の製造方法は、量子ドットの表面、即ちシェル部の反応活性基に、生体関連分子の反応活性基を結合するものであり、公知の脱水縮合反応による結合方法が挙げられる。例えば、生体関連分子としてリン脂質を用い、量子ドット複合体を得る場合には、量子ドットと、リン脂質とを１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）触媒下で脱水縮合する製造方法が挙げられる。この際。量子ドット／リン脂質で表される質量比は、特に限定されず、量子ドット又はリン脂質の種類等を勘案して決定できる。
【００２７】
（量子ドット複合体含有ベシクル）
本発明の量子ドット複合体含有ベシクルは、リン脂質二重層がカプセル状に形成されたベシクルと本発明の量子ドット複合体とを備え、量子ドット複合体が、リン脂質二重層の層内及び表面の双方又はいずれか一方に含有されてなるものである。
本発明の量子ドット複合体含有ベシクルについて、以下に図面を参照しながら説明する。図２（ａ）は、本発明の量子ドット複合体含有ベシクルの一実施形態にかかる断面図であり、図２（ｂ）は、符号Ｘの領域の拡大図である。
図２（ａ）に示すとおり、量子ドット複合体含有ベシクル１００は、内孔１２０を有するカプセル状のベシクル１１０と、量子ドット複合体１とを備え、前記内孔１２０内には液体が保持されている。図２（ｂ）に示すように、ベシクル１１０は、リン脂質１１２の二分子層であるリン脂質二重層からなり、量子ドット複合体１は、リン脂質二重層の層内及び表面の双方又はいずれか一方に含有されている。
【００２８】
＜ベシクル＞
ベシクル１１０を構成するリン脂質１１２は、その疎水部のアシル鎖長、アシル鎖内の二重結合の有無、さらにその二重結合の部位と数は特に限定されない。ベシクル１１０を構成するリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールホスフェイト（ＰＩＰ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、スフィンゴ脂質等が挙げられる。これらリン脂質は、１種類のみを使用してもよく、２種類以上を併用してもよい。
【００２９】
ベシクル１１０は、そのサイズにより、外径５０ｎｍ未満のスモールベシクルと、外径５０ｎｍ以上のラージベシクルとに分類され、特に、外径１０μｍ超のベシクル１１０は、巨大ベシクルと呼ばれている。ベシクル１１０の外径（ベシクルサイズ）は、合成方法やサイズ分離精製によって制御することができる。本発明に用いるベシクル１１０は、その大きさが特に限定されないが、巨大ベシクルであることが好ましい。一般に、小さなベシクルサイズでは、ベシクル１１０の膜厚が４〜５ｎｍであり、仮にベシクルサイズが５０〜１００ｎｍであると、球状構造の曲率が高くなるため、膜面に欠陥が生じやすく、構造が不安定である。このため本発明においては、ベシクル１１０の取り扱い操作の簡便性、ベシクル構造の安定性、内孔１２０内への化学物質の取り込みの制御性、という観点から巨大ベシクルを用いることがより好ましい。ベシクル１１０を巨大ベシクルとすることで、化学物質を幅広い濃度で内孔１２０に内包できる。
【００３０】
内孔１２０内の液体の種類は、特に限定されず、量子ドット複合体含有ベシクル１００の製造過程で用いられる溶媒等が挙げられる。内孔１２０内に液体が保持されていることで、量子ドット複合体含有ベシクル１００の形態が維持される。
【００３１】
＜化学物質＞
内孔１２０内には、化学物質が内包されていてもよい。
図３は、量子ドット複合体含有ベシクル２００の断面図であり、ベシクル１１０の内孔１２０には、化学物質２１０が内包されている。
化学物質２１０は、対象とする生体物質と、化学結合の形成、吸着等の何らかの相互作用を生じる特異結合物質が存在するもの、即ち、例えば、ある種のタンパク質を特異的に認識したり、タンパク質を活性化したりする生理活性物質等が挙げられ、具体的には、各種アミノ酸、ＡＴＰ、イオン、糖類、タンパク質、ペプチド、低分子有機化合物等が挙げられる。
【００３２】
＜ポリエーテル鎖＞
本発明の量子ドット複合体含有ベシクルは、さらにその表面にポリエーテル鎖を備えることができる。ベシクルは、柔軟で、流体のような特性をもつため、長時間放置するとベシクル同士の融合が生じる可能性がある。この問題を克服するため、ベシクル表面へポリエーテル鎖を導入し、ベシクル融合を防止することが好ましい。ポリエーテル鎖を備えることで、ベシクル表面にあるポリエーテル鎖の排除体積効果（立体障害）により、溶液中でベシクルを単体に保ち、ベシクル構造を長時間安定化させることができる。
ポリエーテル鎖としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖、ポリプロピレングリコール鎖等が挙げられ、中でも、ポリエチレングリコール鎖が好ましい。
【００３３】
ポリエーテル鎖は、その末端に、タンパク質等の生体分子と化学結合する官能基を備えることが好ましい。かかる官能基を備えることで、量子ドット複合体含有ベシクルは、その表面がさらに機能化され、目的物質と特異的に結合できる。生体分子と化学結合する官能基としては、ビオチン、マレイミド等の機能性分子を用いることができる。
このような官能基を備えるポリエーテル（機能性ポリエーテル）としては、例えば、下記（ＩＶ）式で表される１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファエタノールアミン−Ｎ−［ビオチニル（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｂｉｏｔｉｎ）等のビオチン−ＰＥＧ化リン脂質分子、下記（Ｖ）式で表される１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファエタノールアミン−Ｎ−［マレイミド（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）等のマレイミド−ＰＥＧ化リン脂質分子等が挙げられる。
【００３４】
【化４】
【００３５】
【化５】
【００３６】
ポリエーテル鎖の鎖長は、得られる量子ドット複合体含有ベシクルの製造時における収率や、ベシクル構造の安定性の観点から、質量平均分子量５００〜１００００のものが好ましい。
【００３７】
機能性ポリエーテル鎖を備える量子ドット複合体含有ベシクルの一例を図４に示す。図４に示すとおり、量子ドット複合体含有ベシクル３００は、ベシクル１１０の表面に、ビオチン−ＰＥＧ化リン脂質分子３１０を備えるものである。本実施形態においては、ベシクル１１０の表面にポリエチレングリコール鎖（ＰＥＧ鎖）３１４が結合され、ＰＥＧ鎖３１４の末端にビオチン３１２が備えられていることで、量子ドット複合体含有ベシクル３００の最外部にビオチン３１２が位置するものとされている。量子ドット複合体含有ベシクル３００は、ビオチン−ＰＥＧ化リン脂質分子３１０を備えることで、ストレプトアビジンと特異的かつ容易に結合することができる。
【００３８】
また、図５に示すように、ポリエーテル鎖を備える量子ドット複合体含有ベシクルとしては、ベシクル１１０の表面に、マレイミド−ＰＥＧ化リン脂質分子４１０を備える量子ドット複合体含有ベシクル４００が挙げられる。本実施形態においては、ベシクル１１０の表面にＰＥＧ鎖３１４が結合され、ＰＥＧ鎖３１４の末端にマレイミド４１２が備えられていることで、量子ドット複合体含有ベシクル４００の最外部にマレイミド４１２が位置するものとされている。量子ドット複合体含有ベシクル４００は、マレイミド−ＰＥＧ化リン脂質分子４１０を備えることで、マレイミド４１２が、抗原、抗体、酵素、膜タンパク質、受容体型タンパク質、蛍光タンパク質、細胞骨格、モータータンパク質等のタンパク質の末端アミノ基と反応して、前記タンパク質と容易に結合できる。
【００３９】
＜量子ドット複合体含有ベシクルの製造方法＞
本発明の量子ドット複合体含有ベシクルの製造方法は、量子ドットの表面に、生体関連分子を結合して量子ドット複合体を得る第一の工程と、得られた量子ドット複合体とリン脂質とを分散媒に分散した後、分散液中で前記リン脂質をカプセル化する第二の工程とを有するものである。
【００４０】
第一の工程は、前述の「＜量子ドット複合体の製造方法＞」と同じである。
【００４１】
第二の工程は、第一の工程で得られた量子ドット複合体と、ベシクルを構成するリン脂質（ベシクル用リン脂質）とを分散媒に分散し（分散操作）、次いで、分散媒を除去・乾燥した後、水や緩衝液中でベシクル用リン脂質をカプセル状に形成し（カプセル化操作）ベシクルとする工程である。
【００４２】
≪分散操作≫
分散操作は、分散媒に量子ドット複合体及びベシクル用リン脂質を分散するものである。
分散媒は、クロロホルム等の有機溶剤が挙げられる。
分散液中の、量子ドット複合体の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．００１〜１ｇ／Ｌが好ましい。
また、分散液中のベシクル用リン脂質濃度は、特に限定されないが、例えば、０．１〜１０ｇ／Ｌが好ましい。
【００４３】
分散液には、必要に応じて、ポリエーテル又はビオチン−ＰＥＧ化リン脂質分子、マレイミド−ＰＥＧ化リン脂質分子等の機能性ポリエーテルを添加することができる。分散液にポリエーテル又は機能性ポリエーテルを添加することで、ベシクルの表面にポリエーテル鎖又は機能性ポリエーテル鎖を導入できる。分散液中のポリエーテル又は機能性ポリエーテルの含有量は、ベシクル用リン脂質に対し０．１〜１質量％が好ましい。
【００４４】
≪カプセル化操作≫
カプセル化操作は、分散媒である有機溶剤を除去・乾燥して、ベシクル用リン脂質からなるリン脂質二重層を形成し、このリン脂質二重層を水や緩衝液中でカプセル状に形成させベシクルを作製するものである。ベシクルの作製の手法としては、静置水和法やエレクトロスウェリング法（電界形成法）等が挙げられ、中でも巨大ベシクルが作製しやすく、また反応時間や反応プロセスの簡易性から、電界形成法を採用することが好ましい。電界形成法は、例えば、Ｐ．Ｇｉｒａｒｄら、「バイオフィジカルジャーナル（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ）」、第８７巻、２００４年、第４１９−４２９頁に記載の公知の電解形成法が挙げられる。電界形成法は、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）等の電極上に分散液を塗布し、分散媒を除去・乾燥してリン脂質を薄膜化した後、この薄膜にベシクル化水溶液を添加し、交流電場をかけて水溶液中に巨大ベシクルを膨潤させる手法である。分散媒の除去方法は、特に限定されず、例えば、減圧乾燥等が挙げられる。ベシクル化水溶液としては、水又はリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等の緩衝液が用いられる。サイズのそろったベシクルを得るためには、ＩＴＯ基板上に厚さ１０ｎｍ〜１００μｍの均一なリン脂質の薄膜を形成することが好ましい。また、印加する交流電場は、周波数が１０Ｈｚ程度、振幅が１００ｍＶ〜２Ｖ程度の条件が好ましい。より低い振幅では、ベシクルの収量が低く、より高い振幅では、ベシクルの構造破壊や水の電気分解が生じ、ベシクルが製造できない可能性がある。
【００４５】
このカプセル化操作は、ベシクル化水溶液中でリン脂質からなるベシクルを形成する操作である。ベシクル化水溶液には、必要に応じて化学物質を添加することができる。ベシクル化水溶液に化学物質を添加することで、化学物質を内包する量子ドット複合体含有ベシクルを製造できる。
以上の工程により、量子ドット複合体含有ベシクルが分散したベシクル分散液を得られる。
【００４６】
本発明の量子ドット複合体によれば、量子ドットが、ポリマーからなるシェル部を備え、かつこの量子ドットの表面に生体関連分子を備えるため、高い生体適合性を有すると共に、量子ドット特有の優れた蛍光特性を発揮できる。
加えて、量子ドットの表面に生体関連分子を結合するという簡便な方法により、本発明の量子ドット複合体を得ることができる。
【００４７】
従来、生理活性を検査するバイオチップ等では、添加する化学物質の大部分が溶液中に拡散し、生体分子に対する化学物質の作用が低効率となる問題があった。本発明の量子ドット複合体含有ベシクルは、１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等の水溶液等を添加することにより、容易にベシクルが破壊されるものである。本発明の量子ドット複合体含有ベシクルによれば、量子ドット複合体含有ベシクルを、生体分子に直接結合させた後に、塩類を含む水溶液を添加することで、内包する化学物質を生体分子に対して近距離で放出し、化学物質を高効率で作用させることができる。加えて、ベシクルが量子ドットで蛍光標識されているため、生体組織内でターゲットとする生体分子の位置情報を容易に把握することができる。
【００４８】
本発明の量子ドット複合体含有ベシクルは、その表面にポリエーテル鎖を備えることで、量子ドット複合体含有ベシクル同士の融合を防止できる。加えて、ポリエーテル鎖を機能性ポリエーテル鎖とすることで、目的物質又は候補目的物質に応じて、本発明の量子ドット複合体含有ベシクルに高い選択性を付与することができる。
【００４９】
本発明の量子ドット複合体含有ベシクルの製造方法によれば、ベシクルのリン脂質二重層の層内及び表面の双方又はいずれかに量子ドット複合体を保有する量子ドット複合体含有ベシクルを容易に製造できる。加えて、第二の工程で、分散液に化学物質を添加することで、ベシクルの内孔に化学物質を内包できる。さらに、第二の工程で、ポリエーテル又は機能性ポリエーテルを添加することで、ベシクルの表面を機能化した量子ドット複合体含有ベシクルを作製することができる。
【実施例】
【００５０】
本発明について実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００５１】
（実施例１）
カルボキシル基修飾量子ドット５２５（量子ドット５２５（発光波長５２５ｎｍ）、Ｑｄｏｔ▲Ｒ▼ＩＴＫＴＭ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ，Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）８μｍｏｌを含む水溶液、ならびにＤＯＰＥを２．５ｍｇ／ｍＬ含むクロロホルム分散液、ならびに１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を２０ｍｇ／ｍＬ含む水溶液、ならびにホウ酸バッファー溶液（１０ｍｍｏｌ Ｈ３ＢＯ３、ｐＨ７．４）をそれぞれ調製した。反応容器のガラス瓶内に、クロロホルム１．１ｍＬを加え、続いてＤＯＰＥクロロホルム分散液２８６μＬ（９６０ｎｍｏｌ）を添加した。撹拌子で緩やかに撹拌しながら、ホウ酸バッファー溶液７００μＬ、量子ドット５２５水溶液１００μＬ（０．８ｎｍｏｌ）、ＥＤＣ水溶液２７６μＬ（２８．８μｍｏｌ）を添加し、反応溶液を均一系にするためにメタノール２．５ｍＬを滴下した。この反応溶液を室温で終夜撹拌すると、ガラス容器壁面に沈着する黄色の生成物を得た。反応溶液を完全に除去した後、クロロホルムを添加すると、生成物はクロロホルムに均一に分散した。このクロロホルム分散液に純水を加え、遠心分離（１０，０００回転／分、１０分、１０℃）、上澄み水相除去の操作を繰り返し行い、生成物が溶解するクロロホルム相のみを抽出することで、未反応の量子ドット５２５及び過剰なＥＤＣを除去した。その後、クロロホルムを完全に除去し、目的とする量子ドット複合体を得た。この生成物は、量子ドットの表面が、リン脂質分子で化学修飾されているため、クロロホルムに再分散可能であった。
【００５２】
（実施例２）
カルボキシル基修飾量子ドット５２５の表面に化学修飾するリン脂質を、ＤＯＰＥに換えてＤＰＰＥとした以外は、実施例１と同様にして量子ドット複合体を作製した。
【００５３】
＜吸収スペクトル測定＞
実施例１又は２で得られた量子ドット複合体を、それぞれ５０μｇ／ｍＬとなるようにクロロホルムに分散して、量子ドット複合体のクロロホルム分散液（複合体−クロロホルム分散液）を調製した。この複合体―クロロホルム分散液の吸収スペクトル（波長３００−７００ｎｍ）を測定した。また、参考として、出発物質である量子ドット５２５の水分散液についても同様の測定を行った。
【００５４】
図６において、凡例（ａ１）は参考として測定した量子ドット５２５の測定結果を示し、凡例（ａ２）は実施例１、凡例（ａ３）は実施例２で得られた量子ドット複合体の測定結果である。凡例（ａ２）、（ａ３）の示すとおり、実施例１〜２で得られた量子ドット複合体は、いずれも５０８ｎｍに極大をもつ吸収ピークが観測され、３００ｎｍ〜４８０ｎｍ付近においては短波長になるにつれ、吸収強度が増加する吸収特性を示した。出発物質である量子ドット５２５の吸収特性も同様な傾向を示した。このように実施例１〜２の量子ドット複合体の吸収スペクトルの形状と、量子ドット５２５の吸収スペクトルの形状とは一致する。即ち、量子ドット表面へのリン脂質分子の化学修飾後も、量子ドットの光学的性質は保持されていることが示唆された。
なお、図６のグラフに示す吸光度は、各溶液について測定された吸光度を５０８ｎｍのピークトップで規格化した値である。
【００５５】
＜蛍光スペクトル測定＞
実施例１又は２で得られた量子ドット複合体を、それぞれ５０μｇ／ｍＬとなるようにクロロホルムに分散して、複合体−クロロホルム分散液を調製した。この複合体−クロロホルム分散液の蛍光スペクトル（励起波長４００ｎｍ、測定波長４１０−７００ｎｍ）を測定した。また、参考として、出発物質である量子ドット５２５の水分散液についても同様の測定を行った。結果を図７に示す。
【００５６】
図７において、凡例（ｂ１）は参考として測定した量子ドット５２５の測定結果を示し、凡例（ｂ２）は実施例１、凡例（ｂ３）は実施例２で得られた量子ドット複合体の測定結果である。凡例（ｂ２）、（ｂ３）の示すとおり、実施例１〜２で得られた量子ドット複合体は、いずれも５２５ｎｍに極大をもつ蛍光ピークが観測された。出発物質である量子ドット５２５の蛍光特性も同様な蛍光ピークを示した。このように実施例１〜２の量子ドット複合体の蛍光スペクトルの形状と、量子ドット５２５の蛍光スペクトルの形状とは一致する。即ち、量子ドット表面へのリン脂質分子の化学修飾後も、量子ドットの光学的性質は保持されていることが示唆された。
なお、図７のグラフに示す蛍光強度は、各溶液について測定された蛍光強度を、５２５ｎｍのピークトップで規格化した値である。
【００５７】
＜動的光散乱測定＞
実施例１で得られた量子ドット複合体を、５０μｇ／ｍＬとなるようにクロロホルムに分散して、複合体−クロロホルム分散液を調製した。この複合体−クロロホルム分散液の動的光散乱測定を行い、量子ドット複合体の粒径分布を観測した。また、参考として、出発物質である量子ドット５２５の水分散液についても同様の測定を行った。結果を図８に示す。
【００５８】
図８（ａ）は、実施例１の測定結果であり、図８（ｂ）は量子ドット５２５の測定結果である。
図８（ａ）に示すように、実施例１の量子ドット複合体では、平均粒径が１６．７ｎｍの及び７１．８ｎｍを示す２つのピークが観測された。このピーク強度比から、実施例１の量子ドット複合体には、粒径７１．８ｎｍの粒子が、粒径１６．７ｎｍの粒子の３．５倍量存在することが示唆された。一方、図８（ｂ）に示すように、出発物質である量子ドット５２５の水分散液においても、平均粒径が１６．３ｎｍ及び１４３ｎｍを示す２つのピークが観測された。このピーク強度比から、量子ドット５２５には、粒径１６．３ｎｍの粒子が、粒径１４３ｎｍの粒子の６．８倍量存在することが示唆された。これらの結果から、量子ドット５２５の粒径は、約１６〜１７ｎｍ程度であることが推定された。一般に、ナノ粒子は溶液中で凝集しやすい性質があるが、実施例１の量子ドット複合体において巨大粒子の存在比が多い理由として、リン脂質分子の化学修飾過程、又は生成物の精製過程において、量子ドット粒子同士が凝集した可能性が考えられる。
【００５９】
＜原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）測定＞
実施例１で得られた量子ドット複合体を、１００μｇ／ｍＬとなるようにクロロホルムに分散して、複合体−クロロホルム分散液を調製した。この複合体−クロロホルム分散液を、へき開したマイカ基板上に１０μＬ滴下した後、大気中で乾燥した試料について、室温、大気中でＡＦＭ測定を行った。また、参考として、出発物質である量子ドット５２５の水分散液を、マイカ基板上に滴下して、乾燥した試料についても同様の測定を行った。結果を図９〜１０に示す。
【００６０】
図９（ａ）は、実施例１の量子ドット複合体のＡＦＭによる写真であり、図９（ｂ）は、図９（ａ）で観測された粒子Ａの粒径の測定結果であり、図９（ｃ）は、図９（ａ）で観測された粒子Ｂの粒径の測定結果である。図１０（ａ）は、量子ドット５２５のＡＦＭによる写真であり、図１０（ｂ）は、図１０（ａ）で観測された粒子Ｃの粒径の測定結果であり、図１０（ｃ）は、図１０（ａ）で観測された粒子Ｄの粒径の測定結果である。
図９（ａ）に示すように、実施例１では、複数の粒子Ａ、Ｂが観測された。図９（ｂ）、（ｃ）に示すように、粒子Ａ及び粒子Ｂの粒径測定の結果から、図９（ａ）で観測された粒子は、高さ２０〜４０ｎｍであった。しかしながら、いずれもＸＹ平面方向の距離が１００ｎｍ以上に及ぶことから、これらは量子ドット複合体の単体ではなく、測定用試料の乾燥過程において、量子ドット複合体同士が２次元的、３次元的に凝集したものと推定される。
図１０（ａ）に示すように、出発物質である量子ドット５２５についても、複数の粒子Ｃ、Ｄが観測された。図１０（ｂ）、（ｃ）に示すように、粒子Ｃ及び粒子Ｄの粒径測定の結果から、図１０（ａ）で観測された粒子は、高さ２０〜６０ｎｍにわたり、ＸＹ平面方向の距離が１００ｎｍ以上に及んでいた。このことから、水分散液中では、量子ドット５２５同士が凝集している可能性が示唆された。また、図１０（ａ）では、粒子表面にポリマー層に由来するひも状の構造体Ｆが観測された。試料乾燥後、ポリマー鎖は粒子間を架橋して複雑に絡み合い、相互にネットワーク構造を形成している様子が観測された。
【００６１】
（実施例３）
量子ドット５２５に換えて、カルボキシル基修飾量子ドット６２５（量子ドット６２５（発光波長６２５ｎｍ）、Ｑｄｏｔ▲Ｒ▼ＩＴＫＴＭ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ，Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）とした以外は、実施例１と同様にして量子ドット複合体を作製した。
得られた量子ドット複合体について、実施例１と同様にして、吸収スペクトル及び蛍光スペクトルを測定したところ、量子ドット６２５の水分散液と同等の吸光スペクトルと蛍光スペクトルを示した。
【００６２】
（実施例４）
量子ドット６２５の表面に化学修飾するリン脂質分子を、ＤＯＰＥに換えて、ＤＰＰＥとした以外は、実施例３と同様にして量子ドット複合体を作製した。
得られた量子ドット複合体について、実施例１と同様にして、吸収スペクトル及び蛍光スペクトルを測定したところ、量子ドット６２５の水分散液と同等の吸光スペクトルと蛍光スペクトルを示した。
【００６３】
（実施例５）
卵黄由来フォスファチジルコリン（Ｌ−α−ＰＣ）０．２ｍｇ、ならびに実施例１で得られた量子ドット５２５の量子ドット複合体を１０．５μｇ（５質量％）含む複合体−クロロホルム分散液２００μＬを調製した。続いて、ＩＴＯ基板（ＳｉＯ２上に膜厚１００ｎｍのＩＴＯが薄膜化された基板、サイズ４０×４０ｎｍ、５０〜１００Ω・ｃｍ）上に、Ｌ−α−ＰＣと複合体−クロロホルム分散液を均一に塗布した。この基板を、室温で２時間、減圧乾燥して、クロロホルム分散液を完全に除去することで、均一なリン脂質薄膜をＩＴＯ基板上に形成した。このリン脂質薄膜上に、窓部を有するシリコーンゴム（外寸３０×３０ｍｍ、厚さ１ｍｍのシリコーンゴムを２０×２０ｍｍのサイズでくり貫いた窓部を有する）を密着して配置し、窓部に２００ｍｍｏｌのスクロース水溶液４００μＬを滴下した。さらに、その上部にＩＴＯ基板を配置し、シリコーンゴム窓部にある溶液をＩＴＯ基板で挟み込んで密閉した。続いて、ＩＴＯ基板にクリップ電極を接合し、６０℃のホットプレート上で、交流電場（正弦波、１Ｖ、１０Ｈｚ）を２時間印加することで、電界形成法により、量子ドット複合体含有ベシクルがスクロース水溶液に分散したベシクル−スクロース分散液を得た。このベシクルの内孔には、化学物質としてスクロース水溶液を含む。
【００６４】
＜共焦点レーザー蛍光顕微鏡測定＞
シリコーンコートされた撥水性のスライドガラス表面に、２００ｍｍｏｌのグルコース溶液を３００μＬ滴下し、液滴を形成させた。その液滴中に、実施例５で得られたベシクル−スクロース分散液１０μＬを添加した。ベシクル内部にあるスクロース溶液と、ベシクル外液のグルコース溶液の比重の差を利用し、ベシクルをスライドガラス表面近傍に沈降させるため、５分間静置した。その後、この試料を共焦点レーザー蛍光顕微鏡（励起：４８８ｎｍアルゴンレーザー、観測：５０５〜５２５ｎｍ領域観測用の蛍光フィルター、４０倍対物レンズ）を用いて観察した。その結果を図１１に示す。
【００６５】
図１１（ａ）は、倍率４０倍で観測した写真であり、図１１（ｂ）は、（ａ）の一部を拡大したものである。図１１（ａ）、（ｂ）に示すように、共焦点レーザー蛍光顕微鏡写真から、リング状の蛍光像が多数観測された。このリング形状は、ベシクルの断面を反映した像である。リング状に蛍光成分が観測される結果は、ベシクル構造のリン脂質二重層内、又はベシクル表面に量子ドット複合体が導入されていることを示唆する。ベシクルの内孔には蛍光成分が観測されず、量子ドット複合体はベシクル内液中にはほぼ含まれていないことが推量される。
【００６６】
＜ＡＦＭ測定＞
へき開したマイカ基板上に、実施例５で得られたベシクル−スクロース分散液３μＬと、２００ｍｍｏｌのグルコース溶液５０μＬとを滴下した後、１５分間静置した。静置後、量子ドット複合体含有ベシクルをマイカ基板上に沈降させた後、５ｍｍｏｌの塩化カルシウム水溶液２０μＬを液滴に添加し、さらに１５分間静置した。この処理により、量子ドット複合体含有ベシクルを破壊し、マイカ上に膜化させた。この試料に関し、室温、溶液中でＡＭＦ測定を行った。その結果を図１２に示す。
【００６７】
図１２（ａ）は、ベシクルを崩壊させた実施例５の量子ドット複合体含有ベシクルのＡＦＭによる写真であり、図１２（ｂ）は、図１２（ａ）における仮想線Ｇにおける断面の膜厚測定結果であり、図１２（ｃ）は、図１２（ａ）で観測された粒子Ｈの粒径の測定結果である。図１３（ａ）は、ベシクルを崩壊させた実施例５の量子ドット複合体含有ベシクルのＡＦＭによる写真であり、図１３（ｂ）は、図１３（ａ）における粒子Ｌの粒径の測定結果である。
図１２（ａ）、図１３（ａ）において符号Ｊは、ベシクルを崩壊させて生じた膜を示す。図１２（ａ）に示すように、膜Ｊには、複数のドット構造Ｉ、ドット構造Ｈが観察された。加えて、図１２（ｂ）に示すように、膜Ｊは、ベシクルのリン脂質二重層に由来するもので、仮想線Ｇにおける断面の膜厚５ｎｍであった。さらに図１２（ｃ）に示すように、膜Ｊの内部に存在するドット構造Ｈは、量子ドット複合体に由来する、高さ９ｎｍのものであった。量子ドットが膜Ｊ中に埋包されている可能性を考慮すると、量子ドット複合体の粒径は１４ｎｍ程度（膜内５ｎｍと膜外９ｎｍの高さの和を加味した粒径）であると推定され、ドット構造Ｈの高さは、動的光散乱測定で観測された実施例１の量子ドット複合体の粒径とほぼ一致する。
加えて、図１３（ａ）に示すように膜Ｊには、複数のドット構造Ｋ、ドット構造Ｌが確認された。図１３（ｂ）に示すように、膜Ｊの内部に存在するドット構造Ｌは、量子ドット複合体に由来する高さ９ｎｍのものであった。量子ドットが膜Ｊ中に埋包されている可能性を考慮すると、量子ドット複合体の粒径は１４ｎｍ程度であると推定され、ドット構造Ｌの高さは、動的光散乱測定で観測された実施例１の量子ドット複合体の粒径とほぼ一致する。
以上の結果から、量子ドット複合体がベシクルに導入された、量子ドット複合体含有ベシクルが作製されていることを確認した。
【００６８】
（実施例６）
ベシクル内に導入する量子ドット複合体を、実施例２で得られた量子ドット複合体とした以外は、実施例５と同様にして量子ドット複合体含有ベシクルを作製した。
得られた量子ドット複合体含有ベシクルについて、実施例５と同様にして、共焦点レーザー蛍光顕微鏡測定及びＡＦＭ測定を行ったところ、量子ドット複合体がベシクルに導入された量子ドット複合体含有ベシクルが作製されていることが確認できた。
【００６９】
（実施例７）
ベシクル内に導入する量子ドット複合体を、実施例３で得られた量子ドット複合体とした以外は、実施例５と同様にして量子ドット複合体含有ベシクルを作製した。
得られた量子ドット複合体含有ベシクルについて、実施例５と同様にして、共焦点レーザー蛍光顕微鏡測定及びＡＦＭ測定を行ったところ、量子ドット複合体がベシクルに導入された量子ドット複合体含有ベシクルが作製されていることが確認できた。
【００７０】
（実施例８）
ベシクル内に導入する量子ドット複合体を、実施例４で得られた量子ドット複合体とした以外は、実施例５と同様にして量子ドット複合体含有ベシクルを作製した。
得られた量子ドット複合体含有ベシクルについて、実施例５と同様にして、共焦点レーザー蛍光顕微鏡測定及びＡＦＭ測定を行ったところ、量子ドット複合体がベシクルに導入された量子ドット複合体含有ベシクルが作製されていることが確認できた。
【００７１】
（実施例９）
卵黄由来フォスファチジルコリン（Ｌ−α―ＰＣ）０．２ｍｇ、ならびに実施例１で得られた量子ドット複合体１０．５μｇ（５質量％）、ならびにＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）−Ｂｉｏｔｉｎ０．６μｇ（０．３質量％）を含むクロロホルム分散液２００μＬを調製した。以下、実施例５に記載した手法と同様にして、ＩＴＯ基板上での電界形成法により、ベシクル表面がビオチン−ＰＥＧ分子で修飾され、ベシクルのリン脂質二重層の層内及び表面の双方又はいずれかに量子ドット複合体が導入され、ベシクル内孔にスクロース溶液を含む量子ドット複合体含有ベシクルを作製した。
得られた量子ドット複合体含有ベシクルについて、実施例５と同様にして、共焦点レーザー蛍光顕微鏡測定及びＡＦＭ測定を行ったところ、量子ドット複合体がベシクルに導入された量子ドット複合体含有ベシクルが作製されていることが確認できた。
【００７２】
（実施例１０）
ベシクル表面を機能化する分子として、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）−Ｂｉｏｔｉｎに換えてＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅを用いた以外は、実施例９と同様にして量子ドット複合体含有ベシクルを作製した。
得られた量子ドット複合体含有ベシクルについて、実施例５と同様にして、共焦点レーザー蛍光顕微鏡測定及びＡＦＭ測定を行ったところ、量子ドット複合体がベシクルに導入された量子ドット複合体含有ベシクルが作製されていることが確認できた。
【符号の説明】
【００７３】
１ 量子ドット複合体
１０ 量子ドット
１２ コア部
１４ シェル部
２０ 生体関連分子
１００、２００、３００、４００ 量子ドット複合体含有ベシクル
１１０ ベシクル
１１２ リン脂質
１２０ 内孔
２１０ 化学物質
３１４ ポリエチレングリコール鎖
３１２ ビオチン
４１２ マレイミド
【技術分野】
【０００１】
本発明は、量子ドット複合体、量子ドット複合体含有ベシクル及びこれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
半導体ナノ結晶からなる量子ドットは、電子・光デバイスやライフサイエンスをはじめとする様々な技術分野で注目を集める材料である。量子ドットは、非常に高いモル吸光係数と蛍光量子収率を有し、吸収スペクトルと蛍光スペクトルは、量子ドットの粒子サイズに依存して、容易にチューニングでき、蛍光スペクトルでは、紫外域から赤外域にわたってシャープなスペクトル特性を示す。さらに、量子ドットは優れた光退色耐性と光／化学分解耐性を示す等、既知の蛍光材料にはない特徴を有している。
【０００３】
これまで、バイオイメージングにおいては、一般に有機蛍光色素が利用され、その光退色が長時間観測を妨げる要因となっていた。量子ドットを用いれば、この問題を克服でき、さらに、量子ドットは粒子サイズに依存して異なる波長の蛍光を発することから、生体組織内に異なるサイズの量子ドットを導入することで、単一励起波長において同時に生体分子の多色観察を行うことができる。
【０００４】
量子ドットを構成する材料として、セレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）、硫化カドミウム（ＣｄＳ）、テルル化カドミウム（ＣｄＴｅ）、硫化亜鉛（ＺｎＳ）等が使用されており、これらは生体系への有害性が懸念されてきた。加えて、量子ドットは、優れた蛍光特性を示すものの、そのままではタンパク質、糖質、核酸等の生体分子と融合させることができない。
【０００５】
そこで、量子ドットの表面を種々の親水性の有機分子やポリマーで被覆し、無害化処理した生体適合型の量子ドットが提案されている（非特許文献１、２）。このような量子ドットの表面には、カルボキシル基、アミノ基、システイン基等が導入されており、これらの官能基を利用することで、タンパク質（酵素、ホルモン、受容体、成長因子、抗体）、核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）、糖質、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド等の生体分子と化学結合できる。
【０００６】
一方、リン脂質分子は、自己組織化によって脂質二重層（リン脂質二重層）を形成し、細胞膜の主要な構成要素となる他、細胞膜内外の物質移動に用いられる小さな脂質ベシクル（リポソーム）を形成する。ベシクルは、微小な水相をリン脂質二重層が包み込んだカプセル状の構造体であり、その内孔には、抗がん剤等の種々の化学物質を内包することができる。このため医薬、食品、化粧品産業における有効な技術ツールとして、また、次世代のナノ・マイクロスケールのドラックデリバリーシステムやバイオチップの構成要素としての応用が期待されている。近年では、基板上にベシクルを高密度に固定化したマイクロアレイを作製し、アトリットル（１ａＬ＝１０−１８Ｌ）スケールの分子を、ハイスループットで検査するライブラリ基板用の作製ツールが提案されている（非特許文献３）。
【０００７】
これらのバイオシステムにおいて、ベシクルは薬物を内包するベッセル、もしくは薬物を運搬するキャリアの役割を担うが、その際、ベシクルの位置を特定するために、ベシクルを蛍光標識化する必要がある。通常、その手段として、蛍光色素でラベル化されたリン脂質分子を、ベシクルに挿入する手法が用いられる（非特許文献４、５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｚ．Ｚｈｅｌｅｖら、「アナリティカル・ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、第７８巻、２００６年、第３２１−３３０頁
【非特許文献２】Ｋ．Ｓｕｓｕｍｕら、「ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）」、第１２９巻、２００７年、第１３９８７−１３９９６頁
【非特許文献３】Ｄ．Ｓｔａｍｏｕら、「アンゲヴァンテ・ ケミィ・インターナショナル・エディション（Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ）」、第４２巻、２００３年、第５５８０−５５８３頁
【非特許文献４】Ｊ．Ｗ．Ｎｉｃｈｏｌｓ、「バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、第２４巻、１９８５年、第６３９０−６３９８頁
【非特許文献５】Ｙ．Ｌｉら、「ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）」、第１３０巻、２００８年、第１２２５２−２２５３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、有機蛍光色素等の既存の蛍光色素化合物は、光退色に問題があり、ベシクルの動的・静的な挙動を長時間にわたって観測する系には適していない。蛍光色素ラベル化リン脂質分子は、強い光照射により、光／化学分解を生じる欠点があり、ベシクルは、この光／化学分解に伴い、不安定化して、その構造が崩壊してしまう可能性がある。特にドラックデリバリーシステムでは、ベシクルが崩壊すると、内包する化学物質が目的外の位置で放出されてしまうため、その用途には利用できない。
加えて、蛍光色素化合物に代えて量子ドットで蛍光ラベル化しようとしても、ベシクルのリン脂質二重層に量子ドットを取り込むのが困難であった。
さらに、ベシクルをドラックデリバリーやバイオチップシステムに利用する場合には、内包する薬剤を生体分子に対して、高効率に作用させる機構が要求される。
【００１０】
本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、蛍光イメージングによる位置特定と、生体組織に対する高効率な薬剤放出機構とを備え、かつ煩雑な合成プロセスを伴うことなく得られる量子ドット複合体、量子ドット複合体含有ベシクル及びこれらの製造方法を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の量子ドット複合体は、半導体ナノ粒子からなるコア部と該コア部の表面にポリマーが結合してなるシェル部とを備え、かつ表面に反応活性基を備える量子ドットと、該量子ドットの表面の反応活性基に結合された生体関連分子とを備えることを特徴とする。
前記生体関連分子は、リン脂質であることが好ましい。
【００１２】
本発明の量子ドット複合体の製造方法は、前記の本発明の量子ドット複合体の製造方法であって、前記量子ドットの表面の反応活性基に、前記生体関連分子の反応活性基を結合することを特徴とする。
【００１３】
本発明の量子ドット複合体含有ベシクルは、リン脂質からなる脂質二重層がカプセル状に形成され、前記の本発明の量子ドット複合体が、前記脂質二重層の層内及び表面の双方又はいずれか一方に含有されてなることを特徴とする。
前記のカプセル状に形成された脂質二重層で化学物質が内包されていてもよく、前記脂質二重層は、その表面にポリエーテル鎖を備えることが好ましく、前記ポリエーテル鎖は、末端に生体分子と結合可能な官能基を備えることがより好ましい。
【００１４】
本発明の量子ドット複合体含有ベシクルの製造方法は、半導体ナノ粒子からなるコア部と該コア部の表面にポリマーが結合してなるシェル部とを備え、かつ表面に反応活性基を備える量子ドットと、生体関連分子とを、前記量子ドットの表面の反応活性基と前記生体関連分子の反応活性基との化学結合により結合させ量子ドット複合体を得る第一の工程と、得られた量子ドット複合体とリン脂質とを分散媒に分散させ、前記分散媒を除去して量子ドット複合体を含むリン脂質を薄膜化した後、水溶液中でリン脂質をカプセル化する第二の工程とを有することを特徴とする。
前記第二の工程は、さらに化学物質を添加してもよく、前記第二の工程は、さらに末端に生体分子と結合可能な官能基を備えるポリエーテル鎖が導入されたリン脂質を添加して分散液とすることが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の量子ドット複合体、量子ドット複合体含有ベシクルによれば、煩雑な合成プロセスを伴うことなく、蛍光イメージングによる位置特定ができ、生体組織に対する薬剤放出機構の高効率化が図れる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の一実施形態にかかる量子ドット複合体の断面図である。
【図２】（ａ）本発明の一実施形態にかかる量子ドット複合体含有ベシクルの断面図である。（ｂ）（ａ）の部分拡大図である。
【図３】本発明の一実施形態にかかる量子ドット複合体含有ベシクルの断面図である。
【図４】本発明の一実施形態にかかる量子ドット複合体含有ベシクルの断面図である。
【図５】本発明の一実施形態にかかる量子ドット複合体含有ベシクルの断面図である。
【図６】実施例１、２の量子ドット複合体における吸収スペクトル測定の結果を示すグラフである。
【図７】実施例１、２の量子ドット複合体における蛍光スペクトルの測定結果を示すグラフである。
【図８】（ａ）実施例１の量子ドット複合体における動的光散乱の測定結果を示すグラフである。（ｂ）参考品である量子ドット５２５における動的光散乱の測定結果を示すグラフである。
【図９】（ａ）実施例１の量子ドット複合体の原子間力顕微鏡での観察結果を示す写真である。（ｂ）（ａ）で観察された粒子の粒径の測定結果を示すグラフである。（ｃ）（ａ）で観察された粒子の粒径の測定結果を示すグラフである。
【図１０】（ａ）参考品である量子ドット５２５の原子間力顕微鏡での観察結果を示す写真である。（ｂ）（ａ）で観察された粒子の粒径の測定結果を示すグラフである。（ｃ）（ａ）で観察された粒子の粒径の測定結果を示すグラフである。
【図１１】実施例５の量子ドット複合体含有ベシクルの共焦点レーザー蛍光顕微鏡の観察結果を示す写真である。
【図１２】（ａ）実施例５の量子ドット複合体含有ベシクルの原子間力顕微鏡での観察結果を示す写真である。（ｂ）ベシクルの膜厚の測定結果を示すグラフである。（ｃ）（ａ）で観察されたドット構造の粒径の測定結果を示すグラフである。
【図１３】（ａ）実施例５の量子ドット複合体含有ベシクルの原子間力顕微鏡での観察結果を示す写真である。（ｂ）（ａ）で観察されたドット構造の粒径の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（量子ドット複合体）
本発明の量子ドット複合体の一例について、以下に図面を参照しながら説明する。図１に示すように、量子ドット複合体１は、量子ドット１０と、量子ドット１０の表面に結合された生体関連分子２０とを備えるものである。
【００１８】
＜量子ドット＞
量子ドット１０は、半導体ナノ粒子からなるコア部１２と、該コア部１２の表面にポリマーが結合してなるシェル部１４とを備え、かつ表面に反応活性基を備えるものである。
コア部１２である半導体ナノ粒子は、半導体のナノメートルサイズの微粒子であり、量子閉じ込め効果を有する発光材料である。半導体ナノ粒子としては、金属元素と、非金属元素又は遷移金属元素を組み合わせたものが挙げられ、例えば、セレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）、硫化カドミウム（ＣｄＳ）、テルル化カドミウム（ＣｄＴｅ）、硫化亜鉛（ＺｎＳ）等のＩＩＢ−ＶＩＢ族のもの、インジウムリン（ＩｎＰ）、ガリウムリン（ＧａＰ）等のＩＩＩＢ−ＶＢ族のもの等が挙げられる。
【００１９】
シェル部１４を構成するポリマーとしては、後述する生体関連分子２０の反応活性基と結合する反応活性基を備えるものであればよく、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート等の生体適合型ポリマーに、カルボキシル基やアミノ基を反応活性基として備えるポリマーが挙げられる。中でも、生体関連分子２０としてリン脂質を用いる場合には、カルボキシル基を反応活性基として備えるポリマーが好ましく、カルボキシル基を反応活性基として備えるＰＥＧがより好ましい。
コア部１２の半導体ナノ粒子は、溶液中で凝集しやすく取り扱いが困難であると共に、人体への健康被害や環境に対する毒性が懸念されるものである。量子ドット１０は、生体親和性の高いポリマーで構成されるシェル部１４を備えることで、無害化され、医療、バイオテクノロジー分野等で汎用的に用いることができる。
加えて、量子ドット１０は、シェル部１４の表面に、カルボキシル基等の反応活性基が導入されていることで、生体関連分子２０を量子ドット１０表面に直接化学結合させた、量子ドット複合体１を作製することができる。
【００２０】
量子ドット１０は、コア部１２の半導体ナノ粒子のサイズによって、発光波長が著しく変化する。通常、バイオイメージングでは、可視域の波長を利用するため、コア部１２のサイズとしては、可視域に発光を示す１〜２０ｎｍ程度のものが好ましい。また、シェル部１４の厚みは特に限定されないが、１〜３０ｎｍ程度のものが好ましい。
【００２１】
＜生体関連分子＞
生体関連分子２０は、生体中に存在する分子及びその誘導体である。生体関連分子２０としては、例えば、リン脂質、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸、ポリペプチド、オリゴペプチド、糖等が挙げられ、中でも、リン脂質が好ましい。
【００２２】
リン脂質は、その疎水部のアシル鎖長、アシル鎖内の二重結合の有無、さらにその二重結合の部位と数は特に限定されない。ただし、リン脂質の親水頭部は、量子ドット１０表面にあるカルボキシル基等の活性反応基と化学結合が可能な、ホスファエタノールアミン（ＰＥ）を備える構造が好ましい。このようなリン脂質としては、下記（Ｉ）式で表される１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、下記（ＩＩ）式で表される１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、下記（ＩＩＩ）式で表される１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファエタノールアミン（ＤＳＰＥ）等が挙げられる。
【００２３】
【化１】
【００２４】
【化２】
【００２５】
【化３】
【００２６】
＜量子ドット複合体の製造方法＞
本発明の量子ドット複合体の製造方法は、量子ドットの表面、即ちシェル部の反応活性基に、生体関連分子の反応活性基を結合するものであり、公知の脱水縮合反応による結合方法が挙げられる。例えば、生体関連分子としてリン脂質を用い、量子ドット複合体を得る場合には、量子ドットと、リン脂質とを１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）触媒下で脱水縮合する製造方法が挙げられる。この際。量子ドット／リン脂質で表される質量比は、特に限定されず、量子ドット又はリン脂質の種類等を勘案して決定できる。
【００２７】
（量子ドット複合体含有ベシクル）
本発明の量子ドット複合体含有ベシクルは、リン脂質二重層がカプセル状に形成されたベシクルと本発明の量子ドット複合体とを備え、量子ドット複合体が、リン脂質二重層の層内及び表面の双方又はいずれか一方に含有されてなるものである。
本発明の量子ドット複合体含有ベシクルについて、以下に図面を参照しながら説明する。図２（ａ）は、本発明の量子ドット複合体含有ベシクルの一実施形態にかかる断面図であり、図２（ｂ）は、符号Ｘの領域の拡大図である。
図２（ａ）に示すとおり、量子ドット複合体含有ベシクル１００は、内孔１２０を有するカプセル状のベシクル１１０と、量子ドット複合体１とを備え、前記内孔１２０内には液体が保持されている。図２（ｂ）に示すように、ベシクル１１０は、リン脂質１１２の二分子層であるリン脂質二重層からなり、量子ドット複合体１は、リン脂質二重層の層内及び表面の双方又はいずれか一方に含有されている。
【００２８】
＜ベシクル＞
ベシクル１１０を構成するリン脂質１１２は、その疎水部のアシル鎖長、アシル鎖内の二重結合の有無、さらにその二重結合の部位と数は特に限定されない。ベシクル１１０を構成するリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールホスフェイト（ＰＩＰ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、スフィンゴ脂質等が挙げられる。これらリン脂質は、１種類のみを使用してもよく、２種類以上を併用してもよい。
【００２９】
ベシクル１１０は、そのサイズにより、外径５０ｎｍ未満のスモールベシクルと、外径５０ｎｍ以上のラージベシクルとに分類され、特に、外径１０μｍ超のベシクル１１０は、巨大ベシクルと呼ばれている。ベシクル１１０の外径（ベシクルサイズ）は、合成方法やサイズ分離精製によって制御することができる。本発明に用いるベシクル１１０は、その大きさが特に限定されないが、巨大ベシクルであることが好ましい。一般に、小さなベシクルサイズでは、ベシクル１１０の膜厚が４〜５ｎｍであり、仮にベシクルサイズが５０〜１００ｎｍであると、球状構造の曲率が高くなるため、膜面に欠陥が生じやすく、構造が不安定である。このため本発明においては、ベシクル１１０の取り扱い操作の簡便性、ベシクル構造の安定性、内孔１２０内への化学物質の取り込みの制御性、という観点から巨大ベシクルを用いることがより好ましい。ベシクル１１０を巨大ベシクルとすることで、化学物質を幅広い濃度で内孔１２０に内包できる。
【００３０】
内孔１２０内の液体の種類は、特に限定されず、量子ドット複合体含有ベシクル１００の製造過程で用いられる溶媒等が挙げられる。内孔１２０内に液体が保持されていることで、量子ドット複合体含有ベシクル１００の形態が維持される。
【００３１】
＜化学物質＞
内孔１２０内には、化学物質が内包されていてもよい。
図３は、量子ドット複合体含有ベシクル２００の断面図であり、ベシクル１１０の内孔１２０には、化学物質２１０が内包されている。
化学物質２１０は、対象とする生体物質と、化学結合の形成、吸着等の何らかの相互作用を生じる特異結合物質が存在するもの、即ち、例えば、ある種のタンパク質を特異的に認識したり、タンパク質を活性化したりする生理活性物質等が挙げられ、具体的には、各種アミノ酸、ＡＴＰ、イオン、糖類、タンパク質、ペプチド、低分子有機化合物等が挙げられる。
【００３２】
＜ポリエーテル鎖＞
本発明の量子ドット複合体含有ベシクルは、さらにその表面にポリエーテル鎖を備えることができる。ベシクルは、柔軟で、流体のような特性をもつため、長時間放置するとベシクル同士の融合が生じる可能性がある。この問題を克服するため、ベシクル表面へポリエーテル鎖を導入し、ベシクル融合を防止することが好ましい。ポリエーテル鎖を備えることで、ベシクル表面にあるポリエーテル鎖の排除体積効果（立体障害）により、溶液中でベシクルを単体に保ち、ベシクル構造を長時間安定化させることができる。
ポリエーテル鎖としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖、ポリプロピレングリコール鎖等が挙げられ、中でも、ポリエチレングリコール鎖が好ましい。
【００３３】
ポリエーテル鎖は、その末端に、タンパク質等の生体分子と化学結合する官能基を備えることが好ましい。かかる官能基を備えることで、量子ドット複合体含有ベシクルは、その表面がさらに機能化され、目的物質と特異的に結合できる。生体分子と化学結合する官能基としては、ビオチン、マレイミド等の機能性分子を用いることができる。
このような官能基を備えるポリエーテル（機能性ポリエーテル）としては、例えば、下記（ＩＶ）式で表される１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファエタノールアミン−Ｎ−［ビオチニル（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｂｉｏｔｉｎ）等のビオチン−ＰＥＧ化リン脂質分子、下記（Ｖ）式で表される１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファエタノールアミン−Ｎ−［マレイミド（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）等のマレイミド−ＰＥＧ化リン脂質分子等が挙げられる。
【００３４】
【化４】
【００３５】
【化５】
【００３６】
ポリエーテル鎖の鎖長は、得られる量子ドット複合体含有ベシクルの製造時における収率や、ベシクル構造の安定性の観点から、質量平均分子量５００〜１００００のものが好ましい。
【００３７】
機能性ポリエーテル鎖を備える量子ドット複合体含有ベシクルの一例を図４に示す。図４に示すとおり、量子ドット複合体含有ベシクル３００は、ベシクル１１０の表面に、ビオチン−ＰＥＧ化リン脂質分子３１０を備えるものである。本実施形態においては、ベシクル１１０の表面にポリエチレングリコール鎖（ＰＥＧ鎖）３１４が結合され、ＰＥＧ鎖３１４の末端にビオチン３１２が備えられていることで、量子ドット複合体含有ベシクル３００の最外部にビオチン３１２が位置するものとされている。量子ドット複合体含有ベシクル３００は、ビオチン−ＰＥＧ化リン脂質分子３１０を備えることで、ストレプトアビジンと特異的かつ容易に結合することができる。
【００３８】
また、図５に示すように、ポリエーテル鎖を備える量子ドット複合体含有ベシクルとしては、ベシクル１１０の表面に、マレイミド−ＰＥＧ化リン脂質分子４１０を備える量子ドット複合体含有ベシクル４００が挙げられる。本実施形態においては、ベシクル１１０の表面にＰＥＧ鎖３１４が結合され、ＰＥＧ鎖３１４の末端にマレイミド４１２が備えられていることで、量子ドット複合体含有ベシクル４００の最外部にマレイミド４１２が位置するものとされている。量子ドット複合体含有ベシクル４００は、マレイミド−ＰＥＧ化リン脂質分子４１０を備えることで、マレイミド４１２が、抗原、抗体、酵素、膜タンパク質、受容体型タンパク質、蛍光タンパク質、細胞骨格、モータータンパク質等のタンパク質の末端アミノ基と反応して、前記タンパク質と容易に結合できる。
【００３９】
＜量子ドット複合体含有ベシクルの製造方法＞
本発明の量子ドット複合体含有ベシクルの製造方法は、量子ドットの表面に、生体関連分子を結合して量子ドット複合体を得る第一の工程と、得られた量子ドット複合体とリン脂質とを分散媒に分散した後、分散液中で前記リン脂質をカプセル化する第二の工程とを有するものである。
【００４０】
第一の工程は、前述の「＜量子ドット複合体の製造方法＞」と同じである。
【００４１】
第二の工程は、第一の工程で得られた量子ドット複合体と、ベシクルを構成するリン脂質（ベシクル用リン脂質）とを分散媒に分散し（分散操作）、次いで、分散媒を除去・乾燥した後、水や緩衝液中でベシクル用リン脂質をカプセル状に形成し（カプセル化操作）ベシクルとする工程である。
【００４２】
≪分散操作≫
分散操作は、分散媒に量子ドット複合体及びベシクル用リン脂質を分散するものである。
分散媒は、クロロホルム等の有機溶剤が挙げられる。
分散液中の、量子ドット複合体の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．００１〜１ｇ／Ｌが好ましい。
また、分散液中のベシクル用リン脂質濃度は、特に限定されないが、例えば、０．１〜１０ｇ／Ｌが好ましい。
【００４３】
分散液には、必要に応じて、ポリエーテル又はビオチン−ＰＥＧ化リン脂質分子、マレイミド−ＰＥＧ化リン脂質分子等の機能性ポリエーテルを添加することができる。分散液にポリエーテル又は機能性ポリエーテルを添加することで、ベシクルの表面にポリエーテル鎖又は機能性ポリエーテル鎖を導入できる。分散液中のポリエーテル又は機能性ポリエーテルの含有量は、ベシクル用リン脂質に対し０．１〜１質量％が好ましい。
【００４４】
≪カプセル化操作≫
カプセル化操作は、分散媒である有機溶剤を除去・乾燥して、ベシクル用リン脂質からなるリン脂質二重層を形成し、このリン脂質二重層を水や緩衝液中でカプセル状に形成させベシクルを作製するものである。ベシクルの作製の手法としては、静置水和法やエレクトロスウェリング法（電界形成法）等が挙げられ、中でも巨大ベシクルが作製しやすく、また反応時間や反応プロセスの簡易性から、電界形成法を採用することが好ましい。電界形成法は、例えば、Ｐ．Ｇｉｒａｒｄら、「バイオフィジカルジャーナル（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ）」、第８７巻、２００４年、第４１９−４２９頁に記載の公知の電解形成法が挙げられる。電界形成法は、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）等の電極上に分散液を塗布し、分散媒を除去・乾燥してリン脂質を薄膜化した後、この薄膜にベシクル化水溶液を添加し、交流電場をかけて水溶液中に巨大ベシクルを膨潤させる手法である。分散媒の除去方法は、特に限定されず、例えば、減圧乾燥等が挙げられる。ベシクル化水溶液としては、水又はリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等の緩衝液が用いられる。サイズのそろったベシクルを得るためには、ＩＴＯ基板上に厚さ１０ｎｍ〜１００μｍの均一なリン脂質の薄膜を形成することが好ましい。また、印加する交流電場は、周波数が１０Ｈｚ程度、振幅が１００ｍＶ〜２Ｖ程度の条件が好ましい。より低い振幅では、ベシクルの収量が低く、より高い振幅では、ベシクルの構造破壊や水の電気分解が生じ、ベシクルが製造できない可能性がある。
【００４５】
このカプセル化操作は、ベシクル化水溶液中でリン脂質からなるベシクルを形成する操作である。ベシクル化水溶液には、必要に応じて化学物質を添加することができる。ベシクル化水溶液に化学物質を添加することで、化学物質を内包する量子ドット複合体含有ベシクルを製造できる。
以上の工程により、量子ドット複合体含有ベシクルが分散したベシクル分散液を得られる。
【００４６】
本発明の量子ドット複合体によれば、量子ドットが、ポリマーからなるシェル部を備え、かつこの量子ドットの表面に生体関連分子を備えるため、高い生体適合性を有すると共に、量子ドット特有の優れた蛍光特性を発揮できる。
加えて、量子ドットの表面に生体関連分子を結合するという簡便な方法により、本発明の量子ドット複合体を得ることができる。
【００４７】
従来、生理活性を検査するバイオチップ等では、添加する化学物質の大部分が溶液中に拡散し、生体分子に対する化学物質の作用が低効率となる問題があった。本発明の量子ドット複合体含有ベシクルは、１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等の水溶液等を添加することにより、容易にベシクルが破壊されるものである。本発明の量子ドット複合体含有ベシクルによれば、量子ドット複合体含有ベシクルを、生体分子に直接結合させた後に、塩類を含む水溶液を添加することで、内包する化学物質を生体分子に対して近距離で放出し、化学物質を高効率で作用させることができる。加えて、ベシクルが量子ドットで蛍光標識されているため、生体組織内でターゲットとする生体分子の位置情報を容易に把握することができる。
【００４８】
本発明の量子ドット複合体含有ベシクルは、その表面にポリエーテル鎖を備えることで、量子ドット複合体含有ベシクル同士の融合を防止できる。加えて、ポリエーテル鎖を機能性ポリエーテル鎖とすることで、目的物質又は候補目的物質に応じて、本発明の量子ドット複合体含有ベシクルに高い選択性を付与することができる。
【００４９】
本発明の量子ドット複合体含有ベシクルの製造方法によれば、ベシクルのリン脂質二重層の層内及び表面の双方又はいずれかに量子ドット複合体を保有する量子ドット複合体含有ベシクルを容易に製造できる。加えて、第二の工程で、分散液に化学物質を添加することで、ベシクルの内孔に化学物質を内包できる。さらに、第二の工程で、ポリエーテル又は機能性ポリエーテルを添加することで、ベシクルの表面を機能化した量子ドット複合体含有ベシクルを作製することができる。
【実施例】
【００５０】
本発明について実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００５１】
（実施例１）
カルボキシル基修飾量子ドット５２５（量子ドット５２５（発光波長５２５ｎｍ）、Ｑｄｏｔ▲Ｒ▼ＩＴＫＴＭ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ，Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）８μｍｏｌを含む水溶液、ならびにＤＯＰＥを２．５ｍｇ／ｍＬ含むクロロホルム分散液、ならびに１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を２０ｍｇ／ｍＬ含む水溶液、ならびにホウ酸バッファー溶液（１０ｍｍｏｌ Ｈ３ＢＯ３、ｐＨ７．４）をそれぞれ調製した。反応容器のガラス瓶内に、クロロホルム１．１ｍＬを加え、続いてＤＯＰＥクロロホルム分散液２８６μＬ（９６０ｎｍｏｌ）を添加した。撹拌子で緩やかに撹拌しながら、ホウ酸バッファー溶液７００μＬ、量子ドット５２５水溶液１００μＬ（０．８ｎｍｏｌ）、ＥＤＣ水溶液２７６μＬ（２８．８μｍｏｌ）を添加し、反応溶液を均一系にするためにメタノール２．５ｍＬを滴下した。この反応溶液を室温で終夜撹拌すると、ガラス容器壁面に沈着する黄色の生成物を得た。反応溶液を完全に除去した後、クロロホルムを添加すると、生成物はクロロホルムに均一に分散した。このクロロホルム分散液に純水を加え、遠心分離（１０，０００回転／分、１０分、１０℃）、上澄み水相除去の操作を繰り返し行い、生成物が溶解するクロロホルム相のみを抽出することで、未反応の量子ドット５２５及び過剰なＥＤＣを除去した。その後、クロロホルムを完全に除去し、目的とする量子ドット複合体を得た。この生成物は、量子ドットの表面が、リン脂質分子で化学修飾されているため、クロロホルムに再分散可能であった。
【００５２】
（実施例２）
カルボキシル基修飾量子ドット５２５の表面に化学修飾するリン脂質を、ＤＯＰＥに換えてＤＰＰＥとした以外は、実施例１と同様にして量子ドット複合体を作製した。
【００５３】
＜吸収スペクトル測定＞
実施例１又は２で得られた量子ドット複合体を、それぞれ５０μｇ／ｍＬとなるようにクロロホルムに分散して、量子ドット複合体のクロロホルム分散液（複合体−クロロホルム分散液）を調製した。この複合体―クロロホルム分散液の吸収スペクトル（波長３００−７００ｎｍ）を測定した。また、参考として、出発物質である量子ドット５２５の水分散液についても同様の測定を行った。
【００５４】
図６において、凡例（ａ１）は参考として測定した量子ドット５２５の測定結果を示し、凡例（ａ２）は実施例１、凡例（ａ３）は実施例２で得られた量子ドット複合体の測定結果である。凡例（ａ２）、（ａ３）の示すとおり、実施例１〜２で得られた量子ドット複合体は、いずれも５０８ｎｍに極大をもつ吸収ピークが観測され、３００ｎｍ〜４８０ｎｍ付近においては短波長になるにつれ、吸収強度が増加する吸収特性を示した。出発物質である量子ドット５２５の吸収特性も同様な傾向を示した。このように実施例１〜２の量子ドット複合体の吸収スペクトルの形状と、量子ドット５２５の吸収スペクトルの形状とは一致する。即ち、量子ドット表面へのリン脂質分子の化学修飾後も、量子ドットの光学的性質は保持されていることが示唆された。
なお、図６のグラフに示す吸光度は、各溶液について測定された吸光度を５０８ｎｍのピークトップで規格化した値である。
【００５５】
＜蛍光スペクトル測定＞
実施例１又は２で得られた量子ドット複合体を、それぞれ５０μｇ／ｍＬとなるようにクロロホルムに分散して、複合体−クロロホルム分散液を調製した。この複合体−クロロホルム分散液の蛍光スペクトル（励起波長４００ｎｍ、測定波長４１０−７００ｎｍ）を測定した。また、参考として、出発物質である量子ドット５２５の水分散液についても同様の測定を行った。結果を図７に示す。
【００５６】
図７において、凡例（ｂ１）は参考として測定した量子ドット５２５の測定結果を示し、凡例（ｂ２）は実施例１、凡例（ｂ３）は実施例２で得られた量子ドット複合体の測定結果である。凡例（ｂ２）、（ｂ３）の示すとおり、実施例１〜２で得られた量子ドット複合体は、いずれも５２５ｎｍに極大をもつ蛍光ピークが観測された。出発物質である量子ドット５２５の蛍光特性も同様な蛍光ピークを示した。このように実施例１〜２の量子ドット複合体の蛍光スペクトルの形状と、量子ドット５２５の蛍光スペクトルの形状とは一致する。即ち、量子ドット表面へのリン脂質分子の化学修飾後も、量子ドットの光学的性質は保持されていることが示唆された。
なお、図７のグラフに示す蛍光強度は、各溶液について測定された蛍光強度を、５２５ｎｍのピークトップで規格化した値である。
【００５７】
＜動的光散乱測定＞
実施例１で得られた量子ドット複合体を、５０μｇ／ｍＬとなるようにクロロホルムに分散して、複合体−クロロホルム分散液を調製した。この複合体−クロロホルム分散液の動的光散乱測定を行い、量子ドット複合体の粒径分布を観測した。また、参考として、出発物質である量子ドット５２５の水分散液についても同様の測定を行った。結果を図８に示す。
【００５８】
図８（ａ）は、実施例１の測定結果であり、図８（ｂ）は量子ドット５２５の測定結果である。
図８（ａ）に示すように、実施例１の量子ドット複合体では、平均粒径が１６．７ｎｍの及び７１．８ｎｍを示す２つのピークが観測された。このピーク強度比から、実施例１の量子ドット複合体には、粒径７１．８ｎｍの粒子が、粒径１６．７ｎｍの粒子の３．５倍量存在することが示唆された。一方、図８（ｂ）に示すように、出発物質である量子ドット５２５の水分散液においても、平均粒径が１６．３ｎｍ及び１４３ｎｍを示す２つのピークが観測された。このピーク強度比から、量子ドット５２５には、粒径１６．３ｎｍの粒子が、粒径１４３ｎｍの粒子の６．８倍量存在することが示唆された。これらの結果から、量子ドット５２５の粒径は、約１６〜１７ｎｍ程度であることが推定された。一般に、ナノ粒子は溶液中で凝集しやすい性質があるが、実施例１の量子ドット複合体において巨大粒子の存在比が多い理由として、リン脂質分子の化学修飾過程、又は生成物の精製過程において、量子ドット粒子同士が凝集した可能性が考えられる。
【００５９】
＜原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）測定＞
実施例１で得られた量子ドット複合体を、１００μｇ／ｍＬとなるようにクロロホルムに分散して、複合体−クロロホルム分散液を調製した。この複合体−クロロホルム分散液を、へき開したマイカ基板上に１０μＬ滴下した後、大気中で乾燥した試料について、室温、大気中でＡＦＭ測定を行った。また、参考として、出発物質である量子ドット５２５の水分散液を、マイカ基板上に滴下して、乾燥した試料についても同様の測定を行った。結果を図９〜１０に示す。
【００６０】
図９（ａ）は、実施例１の量子ドット複合体のＡＦＭによる写真であり、図９（ｂ）は、図９（ａ）で観測された粒子Ａの粒径の測定結果であり、図９（ｃ）は、図９（ａ）で観測された粒子Ｂの粒径の測定結果である。図１０（ａ）は、量子ドット５２５のＡＦＭによる写真であり、図１０（ｂ）は、図１０（ａ）で観測された粒子Ｃの粒径の測定結果であり、図１０（ｃ）は、図１０（ａ）で観測された粒子Ｄの粒径の測定結果である。
図９（ａ）に示すように、実施例１では、複数の粒子Ａ、Ｂが観測された。図９（ｂ）、（ｃ）に示すように、粒子Ａ及び粒子Ｂの粒径測定の結果から、図９（ａ）で観測された粒子は、高さ２０〜４０ｎｍであった。しかしながら、いずれもＸＹ平面方向の距離が１００ｎｍ以上に及ぶことから、これらは量子ドット複合体の単体ではなく、測定用試料の乾燥過程において、量子ドット複合体同士が２次元的、３次元的に凝集したものと推定される。
図１０（ａ）に示すように、出発物質である量子ドット５２５についても、複数の粒子Ｃ、Ｄが観測された。図１０（ｂ）、（ｃ）に示すように、粒子Ｃ及び粒子Ｄの粒径測定の結果から、図１０（ａ）で観測された粒子は、高さ２０〜６０ｎｍにわたり、ＸＹ平面方向の距離が１００ｎｍ以上に及んでいた。このことから、水分散液中では、量子ドット５２５同士が凝集している可能性が示唆された。また、図１０（ａ）では、粒子表面にポリマー層に由来するひも状の構造体Ｆが観測された。試料乾燥後、ポリマー鎖は粒子間を架橋して複雑に絡み合い、相互にネットワーク構造を形成している様子が観測された。
【００６１】
（実施例３）
量子ドット５２５に換えて、カルボキシル基修飾量子ドット６２５（量子ドット６２５（発光波長６２５ｎｍ）、Ｑｄｏｔ▲Ｒ▼ＩＴＫＴＭ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ，Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）とした以外は、実施例１と同様にして量子ドット複合体を作製した。
得られた量子ドット複合体について、実施例１と同様にして、吸収スペクトル及び蛍光スペクトルを測定したところ、量子ドット６２５の水分散液と同等の吸光スペクトルと蛍光スペクトルを示した。
【００６２】
（実施例４）
量子ドット６２５の表面に化学修飾するリン脂質分子を、ＤＯＰＥに換えて、ＤＰＰＥとした以外は、実施例３と同様にして量子ドット複合体を作製した。
得られた量子ドット複合体について、実施例１と同様にして、吸収スペクトル及び蛍光スペクトルを測定したところ、量子ドット６２５の水分散液と同等の吸光スペクトルと蛍光スペクトルを示した。
【００６３】
（実施例５）
卵黄由来フォスファチジルコリン（Ｌ−α−ＰＣ）０．２ｍｇ、ならびに実施例１で得られた量子ドット５２５の量子ドット複合体を１０．５μｇ（５質量％）含む複合体−クロロホルム分散液２００μＬを調製した。続いて、ＩＴＯ基板（ＳｉＯ２上に膜厚１００ｎｍのＩＴＯが薄膜化された基板、サイズ４０×４０ｎｍ、５０〜１００Ω・ｃｍ）上に、Ｌ−α−ＰＣと複合体−クロロホルム分散液を均一に塗布した。この基板を、室温で２時間、減圧乾燥して、クロロホルム分散液を完全に除去することで、均一なリン脂質薄膜をＩＴＯ基板上に形成した。このリン脂質薄膜上に、窓部を有するシリコーンゴム（外寸３０×３０ｍｍ、厚さ１ｍｍのシリコーンゴムを２０×２０ｍｍのサイズでくり貫いた窓部を有する）を密着して配置し、窓部に２００ｍｍｏｌのスクロース水溶液４００μＬを滴下した。さらに、その上部にＩＴＯ基板を配置し、シリコーンゴム窓部にある溶液をＩＴＯ基板で挟み込んで密閉した。続いて、ＩＴＯ基板にクリップ電極を接合し、６０℃のホットプレート上で、交流電場（正弦波、１Ｖ、１０Ｈｚ）を２時間印加することで、電界形成法により、量子ドット複合体含有ベシクルがスクロース水溶液に分散したベシクル−スクロース分散液を得た。このベシクルの内孔には、化学物質としてスクロース水溶液を含む。
【００６４】
＜共焦点レーザー蛍光顕微鏡測定＞
シリコーンコートされた撥水性のスライドガラス表面に、２００ｍｍｏｌのグルコース溶液を３００μＬ滴下し、液滴を形成させた。その液滴中に、実施例５で得られたベシクル−スクロース分散液１０μＬを添加した。ベシクル内部にあるスクロース溶液と、ベシクル外液のグルコース溶液の比重の差を利用し、ベシクルをスライドガラス表面近傍に沈降させるため、５分間静置した。その後、この試料を共焦点レーザー蛍光顕微鏡（励起：４８８ｎｍアルゴンレーザー、観測：５０５〜５２５ｎｍ領域観測用の蛍光フィルター、４０倍対物レンズ）を用いて観察した。その結果を図１１に示す。
【００６５】
図１１（ａ）は、倍率４０倍で観測した写真であり、図１１（ｂ）は、（ａ）の一部を拡大したものである。図１１（ａ）、（ｂ）に示すように、共焦点レーザー蛍光顕微鏡写真から、リング状の蛍光像が多数観測された。このリング形状は、ベシクルの断面を反映した像である。リング状に蛍光成分が観測される結果は、ベシクル構造のリン脂質二重層内、又はベシクル表面に量子ドット複合体が導入されていることを示唆する。ベシクルの内孔には蛍光成分が観測されず、量子ドット複合体はベシクル内液中にはほぼ含まれていないことが推量される。
【００６６】
＜ＡＦＭ測定＞
へき開したマイカ基板上に、実施例５で得られたベシクル−スクロース分散液３μＬと、２００ｍｍｏｌのグルコース溶液５０μＬとを滴下した後、１５分間静置した。静置後、量子ドット複合体含有ベシクルをマイカ基板上に沈降させた後、５ｍｍｏｌの塩化カルシウム水溶液２０μＬを液滴に添加し、さらに１５分間静置した。この処理により、量子ドット複合体含有ベシクルを破壊し、マイカ上に膜化させた。この試料に関し、室温、溶液中でＡＭＦ測定を行った。その結果を図１２に示す。
【００６７】
図１２（ａ）は、ベシクルを崩壊させた実施例５の量子ドット複合体含有ベシクルのＡＦＭによる写真であり、図１２（ｂ）は、図１２（ａ）における仮想線Ｇにおける断面の膜厚測定結果であり、図１２（ｃ）は、図１２（ａ）で観測された粒子Ｈの粒径の測定結果である。図１３（ａ）は、ベシクルを崩壊させた実施例５の量子ドット複合体含有ベシクルのＡＦＭによる写真であり、図１３（ｂ）は、図１３（ａ）における粒子Ｌの粒径の測定結果である。
図１２（ａ）、図１３（ａ）において符号Ｊは、ベシクルを崩壊させて生じた膜を示す。図１２（ａ）に示すように、膜Ｊには、複数のドット構造Ｉ、ドット構造Ｈが観察された。加えて、図１２（ｂ）に示すように、膜Ｊは、ベシクルのリン脂質二重層に由来するもので、仮想線Ｇにおける断面の膜厚５ｎｍであった。さらに図１２（ｃ）に示すように、膜Ｊの内部に存在するドット構造Ｈは、量子ドット複合体に由来する、高さ９ｎｍのものであった。量子ドットが膜Ｊ中に埋包されている可能性を考慮すると、量子ドット複合体の粒径は１４ｎｍ程度（膜内５ｎｍと膜外９ｎｍの高さの和を加味した粒径）であると推定され、ドット構造Ｈの高さは、動的光散乱測定で観測された実施例１の量子ドット複合体の粒径とほぼ一致する。
加えて、図１３（ａ）に示すように膜Ｊには、複数のドット構造Ｋ、ドット構造Ｌが確認された。図１３（ｂ）に示すように、膜Ｊの内部に存在するドット構造Ｌは、量子ドット複合体に由来する高さ９ｎｍのものであった。量子ドットが膜Ｊ中に埋包されている可能性を考慮すると、量子ドット複合体の粒径は１４ｎｍ程度であると推定され、ドット構造Ｌの高さは、動的光散乱測定で観測された実施例１の量子ドット複合体の粒径とほぼ一致する。
以上の結果から、量子ドット複合体がベシクルに導入された、量子ドット複合体含有ベシクルが作製されていることを確認した。
【００６８】
（実施例６）
ベシクル内に導入する量子ドット複合体を、実施例２で得られた量子ドット複合体とした以外は、実施例５と同様にして量子ドット複合体含有ベシクルを作製した。
得られた量子ドット複合体含有ベシクルについて、実施例５と同様にして、共焦点レーザー蛍光顕微鏡測定及びＡＦＭ測定を行ったところ、量子ドット複合体がベシクルに導入された量子ドット複合体含有ベシクルが作製されていることが確認できた。
【００６９】
（実施例７）
ベシクル内に導入する量子ドット複合体を、実施例３で得られた量子ドット複合体とした以外は、実施例５と同様にして量子ドット複合体含有ベシクルを作製した。
得られた量子ドット複合体含有ベシクルについて、実施例５と同様にして、共焦点レーザー蛍光顕微鏡測定及びＡＦＭ測定を行ったところ、量子ドット複合体がベシクルに導入された量子ドット複合体含有ベシクルが作製されていることが確認できた。
【００７０】
（実施例８）
ベシクル内に導入する量子ドット複合体を、実施例４で得られた量子ドット複合体とした以外は、実施例５と同様にして量子ドット複合体含有ベシクルを作製した。
得られた量子ドット複合体含有ベシクルについて、実施例５と同様にして、共焦点レーザー蛍光顕微鏡測定及びＡＦＭ測定を行ったところ、量子ドット複合体がベシクルに導入された量子ドット複合体含有ベシクルが作製されていることが確認できた。
【００７１】
（実施例９）
卵黄由来フォスファチジルコリン（Ｌ−α―ＰＣ）０．２ｍｇ、ならびに実施例１で得られた量子ドット複合体１０．５μｇ（５質量％）、ならびにＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）−Ｂｉｏｔｉｎ０．６μｇ（０．３質量％）を含むクロロホルム分散液２００μＬを調製した。以下、実施例５に記載した手法と同様にして、ＩＴＯ基板上での電界形成法により、ベシクル表面がビオチン−ＰＥＧ分子で修飾され、ベシクルのリン脂質二重層の層内及び表面の双方又はいずれかに量子ドット複合体が導入され、ベシクル内孔にスクロース溶液を含む量子ドット複合体含有ベシクルを作製した。
得られた量子ドット複合体含有ベシクルについて、実施例５と同様にして、共焦点レーザー蛍光顕微鏡測定及びＡＦＭ測定を行ったところ、量子ドット複合体がベシクルに導入された量子ドット複合体含有ベシクルが作製されていることが確認できた。
【００７２】
（実施例１０）
ベシクル表面を機能化する分子として、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）−Ｂｉｏｔｉｎに換えてＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅを用いた以外は、実施例９と同様にして量子ドット複合体含有ベシクルを作製した。
得られた量子ドット複合体含有ベシクルについて、実施例５と同様にして、共焦点レーザー蛍光顕微鏡測定及びＡＦＭ測定を行ったところ、量子ドット複合体がベシクルに導入された量子ドット複合体含有ベシクルが作製されていることが確認できた。
【符号の説明】
【００７３】
１ 量子ドット複合体
１０ 量子ドット
１２ コア部
１４ シェル部
２０ 生体関連分子
１００、２００、３００、４００ 量子ドット複合体含有ベシクル
１１０ ベシクル
１１２ リン脂質
１２０ 内孔
２１０ 化学物質
３１４ ポリエチレングリコール鎖
３１２ ビオチン
４１２ マレイミド
【特許請求の範囲】
【請求項１】
半導体ナノ粒子からなるコア部と該コア部の表面にポリマーが結合してなるシェル部とを備え、かつ表面に反応活性基を備える量子ドットと、
該量子ドットの表面の反応活性基に結合された生体関連分子とを備える量子ドット複合体。
【請求項２】
前記生体関連分子は、リン脂質である、請求項１に記載の量子ドット複合体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の量子ドット複合体の製造方法であって、
前記量子ドットの表面の反応活性基に、前記生体関連分子の反応活性基を結合する量子ドット複合体の製造方法。
【請求項４】
リン脂質からなる脂質二重層がカプセル状に形成され、
請求項１又は２に記載の量子ドット複合体が、前記脂質二重層の層内及び表面の双方又はいずれか一方に含有されてなる量子ドット複合体含有ベシクル。
【請求項５】
前記のカプセル状に形成された脂質二重層で化学物質が内包されてなる、請求項４に記載の量子ドット複合体含有ベシクル。
【請求項６】
前記脂質二重層は、その表面にポリエーテル鎖を備える、請求項４又は５に記載の量子ドット複合体含有ベシクル。
【請求項７】
前記ポリエーテル鎖は、末端に生体分子と結合可能な官能基を備える、請求項６に記載の量子ドット複合体含有ベシクル。
【請求項８】
半導体ナノ粒子からなるコア部と該コア部の表面にポリマーが結合してなるシェル部とを備え、かつ表面に反応活性基を備える量子ドットと、生体関連分子とを、前記量子ドットの表面の反応活性基と前記生体関連分子の反応活性基との化学結合により結合させ量子ドット複合体を得る第一の工程と、
得られた量子ドット複合体とリン脂質とを分散媒に分散させ、前記分散媒を除去して量子ドット複合体を含むリン脂質を薄膜化した後、水溶液中でリン脂質をカプセル化する第二の工程とを有する量子ドット複合体含有ベシクルの製造方法。
【請求項９】
前記第二の工程は、さらに化学物質を添加する、請求項８に記載の量子ドット複合体含有ベシクルの製造方法。
【請求項１０】
前記第二の工程は、さらに末端に生体分子と結合可能な官能基を備えるポリエーテル鎖が導入されたリン脂質を添加して分散液とする、請求項８又は９に記載の量子ドット複合体含有ベシクルの製造方法。
【請求項１】
半導体ナノ粒子からなるコア部と該コア部の表面にポリマーが結合してなるシェル部とを備え、かつ表面に反応活性基を備える量子ドットと、
該量子ドットの表面の反応活性基に結合された生体関連分子とを備える量子ドット複合体。
【請求項２】
前記生体関連分子は、リン脂質である、請求項１に記載の量子ドット複合体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の量子ドット複合体の製造方法であって、
前記量子ドットの表面の反応活性基に、前記生体関連分子の反応活性基を結合する量子ドット複合体の製造方法。
【請求項４】
リン脂質からなる脂質二重層がカプセル状に形成され、
請求項１又は２に記載の量子ドット複合体が、前記脂質二重層の層内及び表面の双方又はいずれか一方に含有されてなる量子ドット複合体含有ベシクル。
【請求項５】
前記のカプセル状に形成された脂質二重層で化学物質が内包されてなる、請求項４に記載の量子ドット複合体含有ベシクル。
【請求項６】
前記脂質二重層は、その表面にポリエーテル鎖を備える、請求項４又は５に記載の量子ドット複合体含有ベシクル。
【請求項７】
前記ポリエーテル鎖は、末端に生体分子と結合可能な官能基を備える、請求項６に記載の量子ドット複合体含有ベシクル。
【請求項８】
半導体ナノ粒子からなるコア部と該コア部の表面にポリマーが結合してなるシェル部とを備え、かつ表面に反応活性基を備える量子ドットと、生体関連分子とを、前記量子ドットの表面の反応活性基と前記生体関連分子の反応活性基との化学結合により結合させ量子ドット複合体を得る第一の工程と、
得られた量子ドット複合体とリン脂質とを分散媒に分散させ、前記分散媒を除去して量子ドット複合体を含むリン脂質を薄膜化した後、水溶液中でリン脂質をカプセル化する第二の工程とを有する量子ドット複合体含有ベシクルの製造方法。
【請求項９】
前記第二の工程は、さらに化学物質を添加する、請求項８に記載の量子ドット複合体含有ベシクルの製造方法。
【請求項１０】
前記第二の工程は、さらに末端に生体分子と結合可能な官能基を備えるポリエーテル鎖が導入されたリン脂質を添加して分散液とする、請求項８又は９に記載の量子ドット複合体含有ベシクルの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２０１１−１８４４０６（Ｐ２０１１−１８４４０６Ａ）
【公開日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３６８４（Ｐ２０１０−５３６８４）
【出願日】平成２２年３月１０日（２０１０．３．１０）
【出願人】（０００００４２２６）日本電信電話株式会社 (13,992)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月１０日（２０１０．３．１０）
【出願人】（０００００４２２６）日本電信電話株式会社 (13,992)
【Ｆターム（参考）】
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