金ナノ粒子を形成する微生物及びこれを用いた金ナノ粒子の形成方法
【課題】金ナノ粒子を形成する新規な微生物及びこれを用いた金ナノ粒子の形成方法を提供すること。
【解決手段】金の還元能力を有する、コリモナス（Collimonas）属に属し、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１１０４の微生物と、当該微生物またはその無細胞抽出液に金化合物を接触させ、前記金化合物から金酸イオンを還元することを特徴とする金粒子の形成方法。
【解決手段】金の還元能力を有する、コリモナス（Collimonas）属に属し、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１１０４の微生物と、当該微生物またはその無細胞抽出液に金化合物を接触させ、前記金化合物から金酸イオンを還元することを特徴とする金粒子の形成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、金化合物を生体反応により金ナノ粒子に変換・濃縮する微生物及びこれを用いた金ナノ粒子の形成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有価金属の産出のため、鉱石の採掘が世界各地で進められている。一方で、採鉱に伴って排出される低品位の鉱石や鉱山廃水、製錬廃水などの管理処分には多大な費用を要するため、大規模かつ良質の鉱山が発見され難くなっている昨今、有価金属の採掘コストは一層高騰してきている。
【０００３】
低品位鉱石や鉱山廃水にも有価金属は含まれるが、含有量が低く、従来の製錬等の技術ではコストに見合う回収が困難であることから、現状では未利用のまま廃棄されることがほとんどである。従って、これらの管理処分に要する費用負担を軽減するため、未利用の有価金属を低コストで回収するか、又は回収された金属をより付加価値の高い金属材料として資源化することが求められている。
【０００４】
そこで有価金属のうち、金の還元による金ナノ粒子の形成について、微生物を用いた種々の提案がされている。
【０００５】
例えば、引用文献５及び６には、γ-Proteobacteria綱に属する微生物Pseudomonas aeruginosa及びStenotrophomonas maltophiliaの三価金[Au(III)]還元によるナノ粒子形成について開示されている。また、引用文献７には、β-Proteobacteria綱に属する微生物Cupriavidus metalliduransによる金粒子生成について開示されている。その他、種々の細菌、真菌がAu(III)還元を行い、金ナノ粒子を形成する提案がなされている（非特許文献２、３及び４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】N. Miyata, Y. Tani, K Iwahori, and M. Soma: Enzymatic formation of manganese oxides by an Acremonium-like hyphomycete fungus, strain KR21-2. FEMS Microbiol. Ecol., 47, 101-109(2004).
【非特許文献２】D. Mandal, M. E. Bolander, D. Mukhopadhyay, G. Sarkar, and P. Mukherjee: The use of microorganisms for the formation of metal nanoparticles and their application. Appl. Microbiol. Biotechnol., 69, 485-492(2006).
【非特許文献３】P. Mohanpuria, N. K. Rana, and S. K. Yadav: Biosynthesis of nanoparticles: thechnological concepts and future applications. J. Nanopart. Res., 10, 507-517(2008).
【非特許文献４】F. Reith, M. F. Lengke, D. Falconer, D. Craw, and G. Southam: The geomicrobiology of gold. ISMEJ., 1, 567-584(2007).
【非特許文献５】M. I. Husseiny, M. A. El-Aziz, Y. Badr, and M. A. Mahmoud: Biosynthesis of gold nanoparticles using Pseudomonas aeruginosa. Spectrochim. Acta A: Mol. Biomol. Spectrosc., 67, 1003-1006(2007).
【非特許文献６】Y. Nangia, N. Wangoo, S. Sharma, J.-S. Wu, V. Dravid, G. S. Shekahawat, and C. R. Suri: Facile biosynthesis of phosphate capped gold nanoparticles by a bacterial isolate Stenotrophomonas maltophilia. Appl. Physics Lett., 94, 233901(2009).
【非特許文献７】F. Reith et al.: Mechanisms of gold biomineralization in the bacterium Cupriavidus metallidurans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 17757-17762(2009).
【非特許文献８】S. A. Kumar, Y.-A. Peter, and J. L. Nadeau: Facile biosynthesis, separation and conjugation of nanoparticles to doxorubicin. Nanotechnology, 19, 495101(10pp)(2008).
【非特許文献９】S. He, Z. Guo, Y. Zhang, S. Zhang, J. Wang, and N. Gu: Biosynthesis of gold nanoparticles using the bacteria Rhodopseudmonas capsulate. Mater. Lett., 61-3984-3987(2007).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の分類群に属する微生物がAu(III)還元によってナノ粒子を形成する報告がなされているが、この他の微生物についても、金鉱山の浸出液や廃水中の金化合物（塩化金酸など）を生体反応により金ナノ粒子に変換・濃縮し得るか否か検討する余地がある。また従来の微生物では、好気または嫌気（無酸素）のどちらか一つの条件で金ナノ粒子の生成が報告されているが、両条件で生成できる微生物の報告はなされていない。
【０００８】
そこで、本発明は、金ナノ粒子を形成する新規な微生物及びこれを用いた金ナノ粒子の形成方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明者らは、秋田県内で採取した休廃止鉱山周辺土壌やコンポスト（堆肥）等の環境試料から、金酸イオンを還元して金ナノ粒子を形成することができる数種の菌株を分離することに成功した。
【００１０】
これらの菌株は、その菌学的性質から上記文献に記載されているいずれの菌種とも一致せず、金酸イオンを還元して金ナノ粒子を形成することができる新規な微生物であることが確認されたので、本発明に至った。
【００１１】
即ち、請求項１の発明は、
金の還元能力を有する、コリモナス（Collimonas）属に属し、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１１０４の微生物である。
【００１２】
請求項２の発明は、
金の還元能力を有する、ディアドバクター（Dyadobacter）属に属し、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１２４６の微生物である。
【００１３】
請求項３の発明は、
金の還元能力を有する、ペドバクター（Pedobacter）属に属し、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１２４７、ＮＩＴＥ Ｐ−１２４８、ＮＩＴＥ Ｐ−１２４９から選択される微生物である。
【００１４】
請求項４の発明は、
請求項１乃至３いずれか一項記載の微生物に金化合物を接触させ、前記微生物が前記金化合物から金酸イオンを還元することを特徴とする金粒子の形成方法である。
【００１５】
請求項５の発明は、
前記金化合物における金の価数が３であることを特徴とする請求項４記載の金粒子の形成方法である。
【００１６】
請求項６の発明は、
前記金酸イオンの還元が好気条件又は嫌気条件下で行われることを特徴とする請求項４又は５記載の金粒子の形成方法である。
【００１７】
請求項７の発明は、
請求項１乃至３いずれか一項記載の微生物から無細胞抽出液を調製し、前記抽出液と金化合物及び補酵素ＮＡＤＨを混合して前記金化合物から金酸イオンを還元することを特徴とする金粒子の形成方法である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、金ナノ粒子を形成する新規な微生物及びこれを用いた金ナノ粒子の形成方法を提供することができる効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】金を還元する微生物探索のアプローチを示す概念図。
【図２】４８穴マイクロプレートを用いたＡｕ（III）還元菌のスクリーニングの結果を示す図。
【図３】４８穴マイクロプレートを用いた細菌分離株のＡｕ（III）還元活性の評価を表す図であって、（ａ）各ウェルに0.2または0.4 mM Ａｕ（III）を添加して１日経過した状態を表す図、（ｂ）同じく４日経過した状態を表す図、（ｃ）同じく５日経過した状態を表す図、（ｄ）同じく８日経過した状態を表す図。
【図４】Ａｕ（III）還元細菌Ｄ−２５株の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づく分子系統分類。
【図５】Ａｕ（III）還元細菌Ｄ−２２株、Ｅ−２９株、Ｋ−２２株及びＭ１−１株の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づく分子系統分類。
【図６】（ａ）Ｄ−２５株のコロニー像、（ｂ）Ｄ−２５株のグラム染色像。
【図７】（ａ）Ｄ−２２株のコロニー像、（ｂ）Ｄ−２２株のグラム染色像。
【図８】（ａ）Ｅ−２９株のコロニー像、（ｂ）Ｅ−２９株のグラム染色像。
【図９】（ａ）Ｋ−２２株のコロニー像、（ｂ）Ｋ−２２株のグラム染色像。
【図１０】（ａ）Ｍ１−１株のコロニー像、（ｂ）Ｍ１−１株のグラム染色像。
【図１１】透過型電子顕微鏡により観察されたＤ−２５株及びＭ１−１株それぞれの培養液上清中に産生された金ナノ粒子の形態であって、（ａ）Ｄ−２５株における球形形態の金ナノ粒子、（ｂ）同じく他の形態の金ナノ粒子、（ｃ）Ｍ１−１株における金ナノ粒子の形態、（ｄ）同じく他の形態の金ナノ粒子、（ｅ）同じく他の形態の金ナノ粒子。図中のスケールバーはすべて20nmを示す。
【図１２】Ｄ−２５株による好気および嫌気条件下でのＡｕ還元活性を示す図であって、（ａ）ＫＡｕＣｌ４添加直後（コントロール）、（ｂ）好気条件下２日後、（ｃ）嫌気条件下２日後。
【図１３】Ｄ−２５株の無細胞抽出液によるＮＡＤＨ依存性のＡｕ還元活性を示す図であって、図中左はコントロール（酵素抽出液と0.1 mM ＫＡｕＣｌ４を混合）、図中右は反応液（酵素抽出液、0.1 mM ＫＡｕＣｌ４および0.5 mM ＮＡＤＨを混合）。反応条件は２８℃で３０分。
【図１４】９６穴マイクロプレートを用いたＮＡＤＨ依存性のＡｕ（III）還元酵素活性の検出を表す図。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明に係る微生物は、秋田県内の休廃鉱山周辺の土壌試料から分離したものである。
【００２１】
次に、本発明に係る微生物のスクリーニング培地とその組成は表１の通りである。
【表１】
【００２２】
培地に添加するＡｕ化合物には、以下のテトラクロロ金酸カリウムを用いた。前記Ａｕ化合物は、水溶液をフィルター減菌（孔径０．２μｍ）したものを所定の濃度となるように培地に添加した。
【００２３】
・テトラクロロ金酸カリウム（和光純薬工業株式会社、ＫＡｕＣｌ４）
Ａｕ価数：Ａｕ３＋（Ａｕ（III））、テトラクロロ金酸（ＡｕＣｌ４−）として溶存
金を還元する微生物（以下「Ａｕ還元菌」という）のスクリーニングのアプローチを図１に示す。
【００２４】
図１における集積培養によるアプローチにおいて、予備的に、土壌試料の懸濁液を１ｍＭ ＫＡｕＣｌ４を含む１／１０ＴＳＢ培地（ＴＳＢ培地を１０倍希釈したもの）に接種し、室温（約２５℃）で振盪培養を開始したところ、即座に培地が紫色に変色し始めた。ここで、非特許文献２によれば、Ａｕ還元によりＡｕ（０）（元素態Ａｕ）のナノ粒子が生成すると培養液が赤紫〜青紫色を呈するとされていることから、この培地成分による化学的なＡｕ（III）還元（Ａｕナノ粒子の形成）が起こることが判明した。よって、このような培地では微生物によるＡｕ還元活性を評価することは困難となるため、
・培地成分自体による非生物的なＡｕ還元が起こらないこと
・微生物が増殖してＡｕ還元活性が評価できること
の２点を満たす培地を選定する必要がある。
【００２５】
そのような培地として、本実施形態ではｍＧＹ培地を作製して使用した。ｍＧＹ培地では、培地成分によるＡｕ還元は、目視では観察されなかった。
【００２６】
ｍＧＹ培地はｐＨ７．２を示し、ｐＨ緩衝作用はほとんど無い。しかし、リン酸緩衝液（１．２ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４及び０．８ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４；ｐＨ７．０）を添加したｍＧＹ培地では、ＫＡｕＣｌ４は水和物を形成し不溶化してしまったため、緩衝剤は添加せずに用いることにした。
【００２７】
Ａｕ還元菌のスクリーニング時のもう一つの問題として、ＫＡｕＣｌ４の毒性が挙げられる。予備的な検討として、０．５または１ｍＭ ＫＡｕＣｌ４を含むｍＧＹ培地に土壌試料を添加し、Ａｕ還元菌の集積培養を試みたが、ＫＡｕＣｌ４により微生物増殖が大きく抑制されたため、短期間でのＫＡｕＣｌ４含有培地によるＡｕ還元菌の集積は困難であると判断された。
【００２８】
そこで、本実施形態では、図１の「マイクロプレートの利用」に準じた以下の手法を採用した。
・Ｒ２Ａ寒天培地を用いた希釈平板法により、微生物コロニーを収集する。
・それぞれの微生物をマイクロプレートの各ウェルでｍＧＹ培地を用いて生育させる。
・微生物を生育させた後、各培養液にＫＡｕＣｌ４を添加し、Ａｕ（III）還元活性の有無を判別する。
【００２９】
土壌試料の少量を減菌水道水に懸濁した後、１０１〜１０４倍に段階希釈し、その５０μＬをＲ２Ａ平板培地に播種して２５℃で５日間インキュベートした。この間に生じた細菌及び真菌のコロニーをランダムに釣菌し、新しいＲ２Ａ寒天培地に移した。
【００３０】
これらの微生物のＡｕ（III）還元活性は、４８穴マイクロプレート（減菌済み）を用いて評価した。すなわち、マイクロプレートの各ウェルにｍＧＹ培地１ｍＬを分注し、分離した微生物株を植種して２５℃で２〜３日間インキュベートした。そして、各々の培養液にフィルター減菌したＫＡｕＣｌ４を０．２ｍＭとなるように添加し、さらに２５℃でインキュベートした。
【００３１】
上述のとおり、Ａｕ還元によりＡｕ（０）（元素態Ａｕ）のナノ粒子が生成すると培養液が赤紫〜青紫色を呈するとされているので（非特許文献２）、前記各ウェルの培養液において、前記色調を示す菌株をＡｕ還元菌とみなした。図２は、Ａｕ還元活性を示した陽性ウェルの様子を示したものである。分離した菌株は４℃で保存した。
【００３２】
（Ａｕ還元菌の分離）
前記Ｒ２Ａ寒天培地を用いた希釈平板法により、種々の環境試料から微生物（細菌、真菌）を合計２０１株分離し、ｍＧＹ培地を分注したマイクロプレートでＡｕ還元活性の有無を評価した。
【００３３】
図３は、４８穴マイクロプレートを用いた細菌分離株のＡｕ（III）還元活性の評価を表す図であって、培養２日後に、Ａｕ（III）を０．２ｍＭまたは０．４ｍＭとなるように各ウェルに添加して試験を開始した。
【００３４】
前記２０１株の微生物のうち、細菌１２株で明瞭なＡｕ（III）還元活性が認められ、これらの菌株をＡｕ（III）還元菌として保存した（表２）。
【表２】
【００３５】
表２の結果から、Ｄ−２５、Ｄ−２２、Ｅ−２９、Ｋ−２２およびＭ１−１と称した細菌が相対的にＡｕ（III）還元能力の高い菌株であると推察された。
【００３６】
（分離株の菌学的性質）
（１）分離株の分子系統解析
得られた分離株について、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づいた分子系統解析により分類同定を試みた。
【００３７】
Ｒ２Ａ培地上で生育させた菌体（細菌）からのＤＮＡの抽出は、ISOIL for Beads Beating（株式会社ニッポンジーン製）を用いて行った。培養菌体を専用の２ｍＬ容プラスチックチューブに採取し、９５０μＬのLysis Solution BBと５０μＬのLysis Solution 20Sを添加した。その後チューブを、ビードビーターを用いて激しく撹拌してから遠心分離した（１２，０００×ｇ、１分間、室温）。遠心分離後、上清６００μＬを新しいチューブに移し、４００μＬのPurifiction Solutionを添加し、十分に混合した。次に、６００μＬのクロロホルムを添加混合し、遠心分離した（１２，０００×ｇ、１５分間、室温）。遠心分離後、水槽８００μＬを新しいチューブに移し、８００μＬのPrecipitation Solutionを添加し十分に混合した後、遠心分離した（２０，０００×ｇ、１５分間、４℃）。上清を捨て、１ｍＬの７０％エタノールを添加し十分に混合した後、遠心分離した（２０，０００×ｇ、５分間、４℃）。その後上清を捨て、風乾した後、沈澱を５０μＬのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した。
【００３８】
抽出したゲノムＤＮＡをユニバーサルプライマー２７ｆと１４９２ｒ（細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域を標的とする）を用いてＰＣＲ増幅した（表３）。ＰＣＲは反応容量２０μＬにて、Thermal Cycler 2720 (Applied Biosystems 社)を用いて行った。ＰＣＲ酵素TaKaRa Ex Taq (TaKaRa)とそれに付属していたＰＣＲ試薬により反応溶液を調整した。反応液２０μＬあたりの組成は、減菌水１４．７μＬ，緩衝液２μＬ、ゲノムＤＮＡ１μＬ（＜１ｎｇ）、１０ｐｍｏｌ／Ｌの各プライマー０．８μＬずつ、ｄＮＴＰ溶液１．６μＬ、Ex Taq ０．１μＬ（０．０２５Ｕ）とした。なお、大腸菌ゲノムを鋳型ＤＮＡとした反応液を陽性コントロール、鋳型ＤＮＡ溶液を添加しなかった反応液を陰性コントロールとした。温度サイクリングは、９４℃−１分の初期変性後、熱変性９４℃−３０秒、アニーリング５５℃−３０秒、伸長反応７２℃−９０秒を１サイクルとして３０サイクル行った。ＰＣＲ後、反応液を５μＬ採取し、１．５％アガロースゲル電気永動で分析した。検出はアガロースゲルをエチジウムブロミドで染色し、ＵＶイルミネーター（ＵＶＰ）で行った。
【００３９】
得られたＰＣＲ断片（約１，５００ｂｐ）のシーケンシング解析を行った。シーケンシング反応にはプライマー２７ｆ、５１９ｆ、１０９９ｆ、５２０ｒ、１４９２ｒを用い（表３）、ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)で塩基配列を決定した。塩基配列結果はGenBankにてBLASTによる相同性検索を行った。相同性が示された配列とともにCLUSTAL Wを用いてマルチプルアラインメントを行い、MEGA4.0を用いて近隣結合法により分子系統樹を作成した。
【表３】
【００４０】
各分離株について塩基配列をもとに分類を行ったところ、Ｄ−２５株は、これまでにＡｕ還元活性が報告されていないコリモナス（Collimonas）属細菌の塩基配列と相同性が高いことが明らかになった。表４にＤ−２５株の相同性検索の結果を、図４に分子系統樹を示す。なお、Ｄ−２５株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列（部分配列）を配列表に示した。
【表４】
【００４１】
また、Ａｕ(III)還元活性が高かったＤ−２２株も、これまでにＡｕ還元活性が報告されていないディアドバクター（Dyadobacter）属細菌の塩基配列と相同性が高いことが明らかになった。
【００４２】
さらに、Ａｕ(III)還元活性が高かったＥ−２９株、Ｋ−２２株及びＭ１−１株についても、これまでにＡｕ還元活性が報告されていないペドバクター（Pedobacter）属細菌の塩基配列と相同性が高いことが明らかになった。
【００４３】
表５にＤ−２２株、Ｅ−２９株、Ｋ−２２株及びＭ１−１株の相同性検索の結果を、図５に分子系統樹を示す。また、Ｄ−２２株、Ｅ−２９株、Ｋ−２２株及びＭ１−１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列（部分配列）を配列表に示した。
【表５】
【００４４】
（２）Ｄ−２５株の形態観察及び生理・生化学試験
前記分離株のうち、Ｄ−２５株について形態観察及び生理・生化学試験を行った。その結果を図６、表６、表７及び表８に示す。
【表６】
【表７】
【表８】
【００４５】
（考察）
Ｄ−２５株はコリモナス（Collimonas）属細菌と１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列が９９％以上一致していたこと、分子系統樹においてコリモナス（Collimonas）属の系統枝に含まれていたことから、Ｄ−２５株は本属に帰属するものと推察される。
【００４６】
次に、形態観察の結果、Ｄ−２５株は運動性を有さないグラム陰性桿菌で、Ｒ２Ａ寒天培地上で粘稠性のコロニーを形成し、嫌気条件下で生育せず、グルコースを酸化せず、カタラーゼ反応及びオキシターゼ反応はともに陽性を示した（表６）。
【００４７】
また、生理・生化学試験の結果、Ｄ−２５株は硝酸塩を還元せず、インドールを産生せず、アルギニンジヒドロラーゼ活性を示さず、グルコース、L-アルビノース及びD-マンニトールなどを資化し、n-カプリン酸および酢酸フェニルなどは資化しなかった（表７）。
【００４８】
また、酵素反応の試験結果、Ｄ−２５株はアルカリホスタファーゼ、エステラーゼ（C4）及びエステラーゼ リパーゼ（C8）などの活性を示し、バリン アリルアミターゼやα-ガラクトシダーゼなどの活性は示さなかった（表８）。
【００４９】
これらの性状は１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づく系統解析の結果から帰属が推察されたコリモナス（Collimonas）属の既知種に類似点が多く認められた。ただし、運動性を示さず（表６）、バリンアリルアミダーゼ活性を示さない点は（表８）、コリモナス（Collimonas）属の既知種の性状とは異なっていた。
【００５０】
上記菌学的性質から、Ｄ−２５株をコリモナス（Collimonas）属分類群に帰属するものと推定した。この菌株は、平成２３年６月９日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１１０４として寄託されている。
【００５１】
コリモナス（Collimonas）属細菌ではＡｕ（III）還元活性は報告されていないため、Ｄ−２５株は新規のＡｕ（III）還元菌であるといえる。
【００５２】
そして、上述したように本菌株はＡｕ（III）還元活性を示す微生物であるので、この微生物により、金鉱山の浸出液や廃水中に含まれる金化合物を金ナノ粒子に変換・濃縮し、効率よく金を回収・資源化することができる。
【００５３】
（３）Ｄ−２２株の形態観察及び生理・生化学試験
前記分離株のうち、Ｄ−２２株について形態観察及び生理・生化学試験を行った。その結果を図７、表9、表１０に示す。
【表９】
【表１０】
【００５４】
（考察）
Ｄ−２２株はディアドバクター（Dyadobacter）属細菌と１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列が９７％以上一致していたこと、分子系統樹においてディアドバクター（Dyadobacter）属の系統枝に含まれていたことから、Ｄ−２２株は本属に帰属すると推察される。
【００５５】
形態観察の結果、Ｄ−２２株は運動性を有さないグラム陰性桿菌で、Ｒ2Ａ寒天培地上で粘稠性のある黄色コロニーを形成し、グルコースを酸化せず、カタラーゼ反応およびオキシダーゼ反応はともに陽性を示した（表９）。
【００５６】
また、生理・生化学試験の結果、Ｄ−２２株は硝酸塩を還元せず、インドールを産生せず、アルギニンジヒドロラーゼやウレアーゼなどの活性を示さず、エスクリンを加水分解し、グルコース、Ｌ−アラビノースおよびＤ−マンノースなどを資化し、グルコン酸カリウムやｎ−カプリン酸を資化しなかった（表１０）。本株は嫌気条件で生育した。
【００５７】
これらの性状は１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列解析の結果において帰属が示唆されたディアドバクダー（Dyadobacter）属の性状に類似すると考えられ、塩基配列解析の結果と併せて、Ｄ−２２株をディアドバクダー（Dyadobacter）属分類群に帰属するものと推定した。この菌株は、平成２４年２月２１日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１２４６として寄託されている。
【００５８】
これまでに、ディアドバクダー（Dyadobacter）属細菌ではＡｕ（III）還元活性は報告されていないため、Ｄ−２２株は新規のＡｕ（III）還元菌であるといえる。
【００５９】
そして、上述したように本菌株はＡｕ（III）還元活性を示す微生物であるので、この微生物により、金鉱山の浸出液や廃水中に含まれる金化合物を金ナノ粒子に変換・濃縮し、効率よく金を回収・資源化することができる。
【００６０】
（４）Ｅ−２９株の形態観察及び生理・生化学試験
前記分離株のうち、Ｅ−２９株について形態観察及び生理・生化学試験を行った。その結果を図８、表１１、表１２に示す。
【表１１】
【表１２】
【００６１】
（考察）
Ｅ−２９株は一部のペドバクター（Pedobacter）属細菌（P. cryoconitis）と１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列が９９％以上一致していたこと、分子系統樹においてPedobacter属の系統枝に含まれていたことから、Ｅ−２９株は本属に帰属すると推察される。
【００６２】
形態観察の結果、Ｅ−２９株は運動性を有さないグラム陰性桿菌で、Ｒ2Ａ寒天培地上で粘稠性のあるクリーム色コロニーを形成し、グルコースを酸化し、カタラーゼ反応およびオキシダーゼ反応はともに陽性を示した（表１１）。
【００６３】
また、生理・生化学試験の結果、Ｅ−２９株は硝酸塩を還元せず、アルギニンジヒドロラーゼ活性を示さず、ゼラチンを加水分解し、β−ガラクトシダーゼ活性を示し、グルコース、Ｄ−マンノースおよびＤ−マンニトールなどを資化し、Ｌ−アラビノースやＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンなどを資化しなかった（表１２）。本株は嫌気条件では生育しなかった。
【００６４】
これらの性状は１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列解析の結果において帰属が示唆されたペドバクター（Pedobacter）属の性状に類似すると考えられ、塩基配列解析の結果と併せて、Ｅ−２９株をペドバクター（Pedobacter）属分類群に帰属するものと推定した。この菌株は、平成２４年２月２１日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受領番号ＮＩＴＥ Ｐ−１２４７として寄託されている。
【００６５】
これまでに、ペドバクター（Pedobacter）属細菌ではＡｕ（III）還元活性は報告されていないため、Ｅ−２９株は新規のＡｕ（III）還元菌であるといえる。
【００６６】
そして、上述したように本菌株はＡｕ（III）還元活性を示す微生物であるので、この微生物により、金鉱山の浸出液や廃水中に含まれる金化合物を金ナノ粒子に変換・濃縮し、効率よく金を回収・資源化することができる。
【００６７】
（５）Ｋ−２２株の形態観察及び生理・生化学試験
前記分離株のうち、Ｋ−２２株について形態観察及び生理・生化学試験を行った。その結果を図９、表１３、表１４に示す。
【表１３】
【表１４】
【００６８】
（考察）
Ｋ−２２株は一部のペドバクター（Pedobacter）属細菌（P. nyackensis）と１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列が９８％以上一致していたこと、分子系統樹においてペドバクター（Pedobacter）属の系統枝に含まれていたことから、Ｋ−２２株は本属に帰属すると推察される。
【００６９】
形態観察の結果、Ｋ−２２株は運動性を有さないグラム陰性桿菌で、Ｒ2Ａ寒天培地上でのコロニー色は黄色を呈し、グルコースを酸化せず、カタラーゼ反応およびオキシダーゼ反応はともに陽性を示した（表１３）。
【００７０】
また、生理・生化学試験の結果、Ｋ−２２株は硝酸塩を還元せず、エスクリンを加水分解し、ゼラチンを加水分解せず、β−ガラクトシダーゼ活性を示し、グルコース、Ｌ−アラビノースおよびＤ−マンノースを資化し、Ｄ−マンニトール、グルコン酸カリウムおよびｎ−カプリン酸などを資化しなかった（表１４）。本株は嫌気条件では生育しなかった。
【００７１】
これらの性状は１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列解析の結果において帰属が示唆されたペドバクター（Pedobacter）属の性状に類似すると考えられ、塩基配列解析の結果と併せて、Ｋ−２２株をペドバクター（Pedobacter）属分類群に帰属するものと推定した。この菌株は、平成２４年２月２１日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受領番号ＮＩＴＥ Ｐ−１２４８として寄託されている。
【００７２】
これまでに、ペドバクター（Pedobacter）属細菌ではＡｕ（III）還元活性は報告されていないため、Ｋ−２２株は新規のＡｕ（III）還元菌であるといえる。
【００７３】
そして、上述したように本菌株はＡｕ（III）還元活性を示す微生物であるので、この微生物により、金鉱山の浸出液や廃水中に含まれる金化合物を金ナノ粒子に変換・濃縮し、効率よく金を回収・資源化することができる。
【００７４】
（６）Ｍ１−１株の形態観察及び生理・生化学試験
前記分離株のうち、Ｍ１−１株について形態観察及び生理・生化学試験を行った。その結果を図１０、表１５、表１６に示す。
【表１５】
【表１６】
【００７５】
（考察）
Ｍ１−１株は一部のペドバクター（Pedobacter）属細菌（P. panaciterrae）と１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列が９８％以上一致していたこと、分子系統樹においてペドバクター（Pedobacter）属の系統枝に含まれていたことから、Ｍ１−１株は本属に帰属すると推察される。
【００７６】
形態観察の結果、Ｍ１−１株は運動性を有さないグラム陰性桿菌で、Ｒ2Ａ寒天培地上で粘稠性のあるクリーム色のコロニーを形成し、グルコースを酸化し、カタラーゼ反応およびオキシダーゼ反応はともに陽性を示した（表１５）。
【００７７】
また、生理・生化学試験の結果、Ｍ１−１株は硝酸塩を還元せず、エスクリンを加水分解し、ゼラチンを加水分解せず、β−ガラクトシダーゼ活性を示し、グルコース、Ｌ−アラビノースおよびＤ−マンノースを資化し、Ｄ−マンニトール、グルコン酸カリウムおよびｎ−カプリン酸などを資化しなかった（表１６）。本株は嫌気条件では生育しなかった。
【００７８】
これらの性状は１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列解析の結果において帰属が示唆されたペドバクター（Pedobacter）属の性状に類似すると考えられ、塩基配列解析の結果と併せて、Ｍ１−１株をペドバクター（Pedobacter）属分類群に帰属するものと推定した。この菌株は、平成２４年２月２１日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受領番号ＮＩＴＥ Ｐ−１２４９として寄託されている。
【００７９】
これまでに、ペドバクター（Pedobacter）属細菌ではＡｕ（III）還元活性は報告されていないため、Ｍ１−１株は新規のＡｕ（III）還元菌であるといえる。
【００８０】
そして、上述したように本菌株はＡｕ（III）還元活性を示す微生物であるので、この微生物により、金鉱山の浸出液や廃水中に含まれる金化合物を金ナノ粒子に変換・濃縮し、効率よく金を回収・資源化することができる。
【００８１】
（分離株の培養液で生成したＡｕナノ粒子の形態）
上記分離株のうち、Ｄ−２５株とＭ１−１株をそれぞれＴＳＢ培地で２日間振盪培養した後、遠心分離により集菌し、減菌水で洗浄してから再び減菌水に懸濁した。この懸濁液に０．５ｍＭ ＫＡｕＣｌ４を添加し、暗所、室温で５日間静置してＡｕ（III）を還元させた。金粒子を含む培養液上清を、孔径０．２μｍのメンブランフィルターで濾過してから減圧遠心機により濃縮して透過型電子顕微鏡観察を行った。
【００８２】
分離株の培養液に金化合物を添加すると紫色を呈することから、Ａｕはナノ粒子として存在しているものと考えられる。このことは、培養液を孔径０．２μｍのメンブランフィルターで濾過したとき、濾液が紫色を呈したことからも支持される。
【００８３】
電子顕微鏡観察の結果、図１１に示されるように、Ｄ−２５株及びＭ１−１株共にＡｕナノ粒子が形成されていることが確認された。粒子のサイズはおよそ５〜４０ｎｍ、形態は球形、三角形、五角形、六角形のものが観察され、粒子としては不均一であることがわかった。
【００８４】
前記粒子の形態は、非特許文献８に記載されている真菌Helminthosporum solaniの培養液で形成されたものと類似しているが、粒子サイズはＤ−２５株と比較して大きい（〜５０μｍ）。
【００８５】
また、非特許文献９によれば、細菌Rhodopseudomas capsulataにおいて、ｐＨ７の培養液でＡｕ還元させた場合は１０〜２０ｎｍのナノ粒子が形成されるが、ｐＨ４の条件では６０％以上が三角形のナノプレート（５０〜４００ｎｍ）として存在することが報告されている。
【００８６】
従って、Ｄ−２５株やＭ１−１株で観察されたＡｕナノ粒子についても、培養条件によってそれらの形態は大きく変化する可能性がある。
【００８７】
なお、培養液を遠心分離して集めた菌体画分も紫色を呈したので、多量のＡｕ粒子が含まれると推察される。
【実施例１】
【００８８】
前記実施形態では、細菌分離株が好気条件でＡｕ（III）還元することを説明したが、本実施例では、上記菌株が嫌気条件でもＡｕ（III）還元を示すか否かを検討したので説明する。
【００８９】
（Ｄ−２５株）
Ｄ−２５株をｍＧＹ培地で振盪培養した後、その１０ｍＬを減菌した２０ｍＬバイアル瓶に移し、ＫＡｕＣｌ４を０．２ｍＭとなるように添加した。このバイアル瓶に窒素ガスを１０分間通気して酸素を置換した後、ブチルゴム栓とアルミキャップで密栓して嫌気条件とした。バイアル瓶は２５℃で静置した。
【００９０】
この結果を図１２に示す。Ａｕ添加後２日間で、培養液は紫青色を示し（図１２（ｃ））、Ａｕ（III）還元活性が認められた。非特許文献４、７、９によれば、微生物は、嫌気条件において金化合物を電子受容体として利用して還元するか、好気条件で還元するか、どちらか一つの条件下での活性が報告されてきたが、Ｄ−２５株では好気及び嫌気条件下でＡｕ還元活性が発現することが明らかになった。本株を用いることにより、好気および嫌気の両条件で金ナノ粒子を製造できることから、排水の性状や設備の状況に合わせて最適な製造プロセスを構築することができる。
【００９１】
（Ｄ−２２株、Ｅ−２９株、Ｋ−２２株、Ｍ１−１株）
Ｄ−２５株と同様に、Ｄ−２２株、Ｅ−２９株、Ｋ−２２株、Ｍ１−１株は好気条件（静置条件）でＡｕ（III）還元活性をもつ細菌として分離されたものである。これらの菌株がＤ−２５株のように、嫌気条件下においてもＡｕ還元するか否か調査した。
【００９２】
Ｄ−２２株、Ｅ−２９株、Ｋ−２２株、Ｍ１−１株の各々をｍＧＹ培地で振盪培養した後、その１０ｍＬを滅菌した２０ｍＬバイアル瓶に移し、ＫＡｕＣｌ４を０．２ｍＭとなるように添加した。このバイアル瓶に窒素ガスを１０分間通気して酸素を置換した後、ブチルゴム栓とアルミキャップで密栓して嫌気条件とした。バイアル瓶は２５℃で静置した。
【００９３】
その結果、培養開始後４８時間までに培養液は青紫色または赤紫色を呈し、菌体のＡｕ（III）還元による金ナノ粒子の形成が確認された。したがって、これらの分離株もＤ−２５株と同様に、好気および嫌気の両条件においてＡｕ（III）還元活性をもつことが示された。これらの菌株を用いることにより、好気および嫌気の両条件で金ナノ粒子を製造できることから、排水の性状や設備の状況に合わせて最適な製造プロセスを構築することができる。
【実施例２】
【００９４】
前記実施形態では、好気または嫌気条件下で、Ｄ−２５株の菌体に金酸イオンを接触させて金ナノ粒子を形成させた。本実施例では、菌体からの酵素抽出液でもＡｕ（III）還元を示すか否かを検討したので説明する。
【００９５】
（Ｄ−２５株）
Ｄ−２５株を好気条件で２日間振盪培養したあと、０．０５ ｍＭ ＫＡｕＣｌ４を添加し、１２時間嫌気条件に設置した。この菌体を氷中で冷却しながら超音波処理で破砕し、４℃、１２０００ ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により、無細胞抽出液を調製した。この抽出液に０．１ ｍＭ ＫＡｕＣｌ４を添加し２８℃で３０分静置してもＡｕ還元は認められなかったが、この溶液に０．５ ｍＭ ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を添加すると、溶液は青紫色を示し、金ナノ粒子が生成した（図１３）。このことから、Ｄ−２５株はＮＡＤＨ依存性Ａｕ(III)還元酵素活性を保有し、この酵素を利用すれば金酸イオンを菌体に接触させることなく金ナノ粒子を形成できることがわかった。菌体を利用する場合には、金ナノ粒子の形成時に菌体成分が混入するが、菌体から抽出した酵素を利用することにより、有機物の混入を最大限に抑えた金ナノ粒子の標品を得ることができる。
【００９６】
なお、非特許文献７によれば、細菌であるStenotrophomonas maltophiliaにおいて、好気条件で増殖した菌体の無細胞抽出液で同様の酵素活性が既に示されているが、Stenotrophomonas maltophiliaが嫌気条件でも酵素活性を発現するか否かは明らかにされていない。
【００９７】
（Ｄ−２２株、Ｅ−２９株、Ｋ−２２株、Ｍ１−１株）
次に、分離した４菌株がＤ−２５株と同様にＡｕ（III）還元酵素を産生し、無細胞抽出液でも金ナノ粒子を形成するか否かを調査した。各々の菌株を、ｍＧＹ培地を用いて２５℃で２日間振盪培養した。この後、０．０５ｍＭ ＫＡｕＣｌ４を添加して８〜１５時間嫌気条件で静置した。各々の菌体から、前述したように超音波処理により菌体破砕を行い、無細胞抽出液を調製した。
【００９８】
無細胞抽出液中のＡｕ（III）還元酵素活性は９６穴マイクロプレートを用いて測定した。反応溶液の全量を２５０μＬとして、この溶液中に無細胞抽出液（５０〜２００μＬ）、０．５ｍＭ ＮＡＤＨ、０．１ｍＭ ＫＡｕＣｌ４を含むようにした。なおＫＡｕＣｌ４を最後に添加し、添加後直ちにマイクロプレートリーダー（TECAN社）を用いて、５分ごとに波長４９５ｎｍにおける吸光度を計測した。単位時間当たりの吸光度の変化量を求めて、Ａｕ（III）還元速度を算出した。
【００９９】
この試験と並行して、無細胞抽出液を添加しない反応液についても同様にＡｕ（III）還元速度を算出し、酵素添加時の速度から差し引くことで、ＮＡＤＨによる非酵素的な還元量を除外した。
【０１００】
無細胞抽出液のタンパク質濃度は測定キット（同仁化学製、ＣＢＢ染料を用いたBradford法による）を用いて測定した。タンパク質標準溶液には所定の濃度のウシ血清アルブミンを使用した。
【０１０１】
試験の結果、全ての菌株の無細胞抽出液において、ＮＡＤＨを添加しない場合はＡｕ（III）還元酵素活性は検出されなかった（図１４）。また、無細胞抽出液を加えない場合、ＮＡＤＨによる非酵素的なＡｕ（III）還元は殆ど認められなかったが（Ａｕ還元速度（ΔＡ４９５ｎｍ／分）：０．００１以下）、無細胞抽出液とＮＡＤＨの両方を添加すると反応液は直ちに赤紫色を呈し、明確なＡｕ（III）還元活性が検出された（図１４、表１７）。
【表１７】
【０１０２】
これらの結果から、Ｄ−２２株、Ｅ−２９株、Ｋ−２２株およびＭ１−１株は、Ｄ−２５株と同様に、ＮＡＤＨ依存性のＡｕ（III）還元酵素活性を保有し、酵素反応により金ナノ粒子を形成できることが示された。これらの菌体を利用する場合には、金ナノ粒子の形成時に菌体成分が混入するが、それぞれの菌体から抽出した酵素を利用することにより、有機物の混入を最大限に抑えた金ナノ粒子の標品を得ることができる。
【０１０３】
以上、添付図面等を参照して本発明の好ましい実施形態、実施例を説明したが、本発明はかかる実施形態、実施例に限定されること無く、特許請求の範囲の記載から把握される技術的範囲において種々に変更可能である。
【技術分野】
【０００１】
この発明は、金化合物を生体反応により金ナノ粒子に変換・濃縮する微生物及びこれを用いた金ナノ粒子の形成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有価金属の産出のため、鉱石の採掘が世界各地で進められている。一方で、採鉱に伴って排出される低品位の鉱石や鉱山廃水、製錬廃水などの管理処分には多大な費用を要するため、大規模かつ良質の鉱山が発見され難くなっている昨今、有価金属の採掘コストは一層高騰してきている。
【０００３】
低品位鉱石や鉱山廃水にも有価金属は含まれるが、含有量が低く、従来の製錬等の技術ではコストに見合う回収が困難であることから、現状では未利用のまま廃棄されることがほとんどである。従って、これらの管理処分に要する費用負担を軽減するため、未利用の有価金属を低コストで回収するか、又は回収された金属をより付加価値の高い金属材料として資源化することが求められている。
【０００４】
そこで有価金属のうち、金の還元による金ナノ粒子の形成について、微生物を用いた種々の提案がされている。
【０００５】
例えば、引用文献５及び６には、γ-Proteobacteria綱に属する微生物Pseudomonas aeruginosa及びStenotrophomonas maltophiliaの三価金[Au(III)]還元によるナノ粒子形成について開示されている。また、引用文献７には、β-Proteobacteria綱に属する微生物Cupriavidus metalliduransによる金粒子生成について開示されている。その他、種々の細菌、真菌がAu(III)還元を行い、金ナノ粒子を形成する提案がなされている（非特許文献２、３及び４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】N. Miyata, Y. Tani, K Iwahori, and M. Soma: Enzymatic formation of manganese oxides by an Acremonium-like hyphomycete fungus, strain KR21-2. FEMS Microbiol. Ecol., 47, 101-109(2004).
【非特許文献２】D. Mandal, M. E. Bolander, D. Mukhopadhyay, G. Sarkar, and P. Mukherjee: The use of microorganisms for the formation of metal nanoparticles and their application. Appl. Microbiol. Biotechnol., 69, 485-492(2006).
【非特許文献３】P. Mohanpuria, N. K. Rana, and S. K. Yadav: Biosynthesis of nanoparticles: thechnological concepts and future applications. J. Nanopart. Res., 10, 507-517(2008).
【非特許文献４】F. Reith, M. F. Lengke, D. Falconer, D. Craw, and G. Southam: The geomicrobiology of gold. ISMEJ., 1, 567-584(2007).
【非特許文献５】M. I. Husseiny, M. A. El-Aziz, Y. Badr, and M. A. Mahmoud: Biosynthesis of gold nanoparticles using Pseudomonas aeruginosa. Spectrochim. Acta A: Mol. Biomol. Spectrosc., 67, 1003-1006(2007).
【非特許文献６】Y. Nangia, N. Wangoo, S. Sharma, J.-S. Wu, V. Dravid, G. S. Shekahawat, and C. R. Suri: Facile biosynthesis of phosphate capped gold nanoparticles by a bacterial isolate Stenotrophomonas maltophilia. Appl. Physics Lett., 94, 233901(2009).
【非特許文献７】F. Reith et al.: Mechanisms of gold biomineralization in the bacterium Cupriavidus metallidurans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 17757-17762(2009).
【非特許文献８】S. A. Kumar, Y.-A. Peter, and J. L. Nadeau: Facile biosynthesis, separation and conjugation of nanoparticles to doxorubicin. Nanotechnology, 19, 495101(10pp)(2008).
【非特許文献９】S. He, Z. Guo, Y. Zhang, S. Zhang, J. Wang, and N. Gu: Biosynthesis of gold nanoparticles using the bacteria Rhodopseudmonas capsulate. Mater. Lett., 61-3984-3987(2007).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の分類群に属する微生物がAu(III)還元によってナノ粒子を形成する報告がなされているが、この他の微生物についても、金鉱山の浸出液や廃水中の金化合物（塩化金酸など）を生体反応により金ナノ粒子に変換・濃縮し得るか否か検討する余地がある。また従来の微生物では、好気または嫌気（無酸素）のどちらか一つの条件で金ナノ粒子の生成が報告されているが、両条件で生成できる微生物の報告はなされていない。
【０００８】
そこで、本発明は、金ナノ粒子を形成する新規な微生物及びこれを用いた金ナノ粒子の形成方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明者らは、秋田県内で採取した休廃止鉱山周辺土壌やコンポスト（堆肥）等の環境試料から、金酸イオンを還元して金ナノ粒子を形成することができる数種の菌株を分離することに成功した。
【００１０】
これらの菌株は、その菌学的性質から上記文献に記載されているいずれの菌種とも一致せず、金酸イオンを還元して金ナノ粒子を形成することができる新規な微生物であることが確認されたので、本発明に至った。
【００１１】
即ち、請求項１の発明は、
金の還元能力を有する、コリモナス（Collimonas）属に属し、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１１０４の微生物である。
【００１２】
請求項２の発明は、
金の還元能力を有する、ディアドバクター（Dyadobacter）属に属し、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１２４６の微生物である。
【００１３】
請求項３の発明は、
金の還元能力を有する、ペドバクター（Pedobacter）属に属し、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１２４７、ＮＩＴＥ Ｐ−１２４８、ＮＩＴＥ Ｐ−１２４９から選択される微生物である。
【００１４】
請求項４の発明は、
請求項１乃至３いずれか一項記載の微生物に金化合物を接触させ、前記微生物が前記金化合物から金酸イオンを還元することを特徴とする金粒子の形成方法である。
【００１５】
請求項５の発明は、
前記金化合物における金の価数が３であることを特徴とする請求項４記載の金粒子の形成方法である。
【００１６】
請求項６の発明は、
前記金酸イオンの還元が好気条件又は嫌気条件下で行われることを特徴とする請求項４又は５記載の金粒子の形成方法である。
【００１７】
請求項７の発明は、
請求項１乃至３いずれか一項記載の微生物から無細胞抽出液を調製し、前記抽出液と金化合物及び補酵素ＮＡＤＨを混合して前記金化合物から金酸イオンを還元することを特徴とする金粒子の形成方法である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、金ナノ粒子を形成する新規な微生物及びこれを用いた金ナノ粒子の形成方法を提供することができる効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】金を還元する微生物探索のアプローチを示す概念図。
【図２】４８穴マイクロプレートを用いたＡｕ（III）還元菌のスクリーニングの結果を示す図。
【図３】４８穴マイクロプレートを用いた細菌分離株のＡｕ（III）還元活性の評価を表す図であって、（ａ）各ウェルに0.2または0.4 mM Ａｕ（III）を添加して１日経過した状態を表す図、（ｂ）同じく４日経過した状態を表す図、（ｃ）同じく５日経過した状態を表す図、（ｄ）同じく８日経過した状態を表す図。
【図４】Ａｕ（III）還元細菌Ｄ−２５株の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づく分子系統分類。
【図５】Ａｕ（III）還元細菌Ｄ−２２株、Ｅ−２９株、Ｋ−２２株及びＭ１−１株の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づく分子系統分類。
【図６】（ａ）Ｄ−２５株のコロニー像、（ｂ）Ｄ−２５株のグラム染色像。
【図７】（ａ）Ｄ−２２株のコロニー像、（ｂ）Ｄ−２２株のグラム染色像。
【図８】（ａ）Ｅ−２９株のコロニー像、（ｂ）Ｅ−２９株のグラム染色像。
【図９】（ａ）Ｋ−２２株のコロニー像、（ｂ）Ｋ−２２株のグラム染色像。
【図１０】（ａ）Ｍ１−１株のコロニー像、（ｂ）Ｍ１−１株のグラム染色像。
【図１１】透過型電子顕微鏡により観察されたＤ−２５株及びＭ１−１株それぞれの培養液上清中に産生された金ナノ粒子の形態であって、（ａ）Ｄ−２５株における球形形態の金ナノ粒子、（ｂ）同じく他の形態の金ナノ粒子、（ｃ）Ｍ１−１株における金ナノ粒子の形態、（ｄ）同じく他の形態の金ナノ粒子、（ｅ）同じく他の形態の金ナノ粒子。図中のスケールバーはすべて20nmを示す。
【図１２】Ｄ−２５株による好気および嫌気条件下でのＡｕ還元活性を示す図であって、（ａ）ＫＡｕＣｌ４添加直後（コントロール）、（ｂ）好気条件下２日後、（ｃ）嫌気条件下２日後。
【図１３】Ｄ−２５株の無細胞抽出液によるＮＡＤＨ依存性のＡｕ還元活性を示す図であって、図中左はコントロール（酵素抽出液と0.1 mM ＫＡｕＣｌ４を混合）、図中右は反応液（酵素抽出液、0.1 mM ＫＡｕＣｌ４および0.5 mM ＮＡＤＨを混合）。反応条件は２８℃で３０分。
【図１４】９６穴マイクロプレートを用いたＮＡＤＨ依存性のＡｕ（III）還元酵素活性の検出を表す図。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明に係る微生物は、秋田県内の休廃鉱山周辺の土壌試料から分離したものである。
【００２１】
次に、本発明に係る微生物のスクリーニング培地とその組成は表１の通りである。
【表１】
【００２２】
培地に添加するＡｕ化合物には、以下のテトラクロロ金酸カリウムを用いた。前記Ａｕ化合物は、水溶液をフィルター減菌（孔径０．２μｍ）したものを所定の濃度となるように培地に添加した。
【００２３】
・テトラクロロ金酸カリウム（和光純薬工業株式会社、ＫＡｕＣｌ４）
Ａｕ価数：Ａｕ３＋（Ａｕ（III））、テトラクロロ金酸（ＡｕＣｌ４−）として溶存
金を還元する微生物（以下「Ａｕ還元菌」という）のスクリーニングのアプローチを図１に示す。
【００２４】
図１における集積培養によるアプローチにおいて、予備的に、土壌試料の懸濁液を１ｍＭ ＫＡｕＣｌ４を含む１／１０ＴＳＢ培地（ＴＳＢ培地を１０倍希釈したもの）に接種し、室温（約２５℃）で振盪培養を開始したところ、即座に培地が紫色に変色し始めた。ここで、非特許文献２によれば、Ａｕ還元によりＡｕ（０）（元素態Ａｕ）のナノ粒子が生成すると培養液が赤紫〜青紫色を呈するとされていることから、この培地成分による化学的なＡｕ（III）還元（Ａｕナノ粒子の形成）が起こることが判明した。よって、このような培地では微生物によるＡｕ還元活性を評価することは困難となるため、
・培地成分自体による非生物的なＡｕ還元が起こらないこと
・微生物が増殖してＡｕ還元活性が評価できること
の２点を満たす培地を選定する必要がある。
【００２５】
そのような培地として、本実施形態ではｍＧＹ培地を作製して使用した。ｍＧＹ培地では、培地成分によるＡｕ還元は、目視では観察されなかった。
【００２６】
ｍＧＹ培地はｐＨ７．２を示し、ｐＨ緩衝作用はほとんど無い。しかし、リン酸緩衝液（１．２ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４及び０．８ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４；ｐＨ７．０）を添加したｍＧＹ培地では、ＫＡｕＣｌ４は水和物を形成し不溶化してしまったため、緩衝剤は添加せずに用いることにした。
【００２７】
Ａｕ還元菌のスクリーニング時のもう一つの問題として、ＫＡｕＣｌ４の毒性が挙げられる。予備的な検討として、０．５または１ｍＭ ＫＡｕＣｌ４を含むｍＧＹ培地に土壌試料を添加し、Ａｕ還元菌の集積培養を試みたが、ＫＡｕＣｌ４により微生物増殖が大きく抑制されたため、短期間でのＫＡｕＣｌ４含有培地によるＡｕ還元菌の集積は困難であると判断された。
【００２８】
そこで、本実施形態では、図１の「マイクロプレートの利用」に準じた以下の手法を採用した。
・Ｒ２Ａ寒天培地を用いた希釈平板法により、微生物コロニーを収集する。
・それぞれの微生物をマイクロプレートの各ウェルでｍＧＹ培地を用いて生育させる。
・微生物を生育させた後、各培養液にＫＡｕＣｌ４を添加し、Ａｕ（III）還元活性の有無を判別する。
【００２９】
土壌試料の少量を減菌水道水に懸濁した後、１０１〜１０４倍に段階希釈し、その５０μＬをＲ２Ａ平板培地に播種して２５℃で５日間インキュベートした。この間に生じた細菌及び真菌のコロニーをランダムに釣菌し、新しいＲ２Ａ寒天培地に移した。
【００３０】
これらの微生物のＡｕ（III）還元活性は、４８穴マイクロプレート（減菌済み）を用いて評価した。すなわち、マイクロプレートの各ウェルにｍＧＹ培地１ｍＬを分注し、分離した微生物株を植種して２５℃で２〜３日間インキュベートした。そして、各々の培養液にフィルター減菌したＫＡｕＣｌ４を０．２ｍＭとなるように添加し、さらに２５℃でインキュベートした。
【００３１】
上述のとおり、Ａｕ還元によりＡｕ（０）（元素態Ａｕ）のナノ粒子が生成すると培養液が赤紫〜青紫色を呈するとされているので（非特許文献２）、前記各ウェルの培養液において、前記色調を示す菌株をＡｕ還元菌とみなした。図２は、Ａｕ還元活性を示した陽性ウェルの様子を示したものである。分離した菌株は４℃で保存した。
【００３２】
（Ａｕ還元菌の分離）
前記Ｒ２Ａ寒天培地を用いた希釈平板法により、種々の環境試料から微生物（細菌、真菌）を合計２０１株分離し、ｍＧＹ培地を分注したマイクロプレートでＡｕ還元活性の有無を評価した。
【００３３】
図３は、４８穴マイクロプレートを用いた細菌分離株のＡｕ（III）還元活性の評価を表す図であって、培養２日後に、Ａｕ（III）を０．２ｍＭまたは０．４ｍＭとなるように各ウェルに添加して試験を開始した。
【００３４】
前記２０１株の微生物のうち、細菌１２株で明瞭なＡｕ（III）還元活性が認められ、これらの菌株をＡｕ（III）還元菌として保存した（表２）。
【表２】
【００３５】
表２の結果から、Ｄ−２５、Ｄ−２２、Ｅ−２９、Ｋ−２２およびＭ１−１と称した細菌が相対的にＡｕ（III）還元能力の高い菌株であると推察された。
【００３６】
（分離株の菌学的性質）
（１）分離株の分子系統解析
得られた分離株について、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づいた分子系統解析により分類同定を試みた。
【００３７】
Ｒ２Ａ培地上で生育させた菌体（細菌）からのＤＮＡの抽出は、ISOIL for Beads Beating（株式会社ニッポンジーン製）を用いて行った。培養菌体を専用の２ｍＬ容プラスチックチューブに採取し、９５０μＬのLysis Solution BBと５０μＬのLysis Solution 20Sを添加した。その後チューブを、ビードビーターを用いて激しく撹拌してから遠心分離した（１２，０００×ｇ、１分間、室温）。遠心分離後、上清６００μＬを新しいチューブに移し、４００μＬのPurifiction Solutionを添加し、十分に混合した。次に、６００μＬのクロロホルムを添加混合し、遠心分離した（１２，０００×ｇ、１５分間、室温）。遠心分離後、水槽８００μＬを新しいチューブに移し、８００μＬのPrecipitation Solutionを添加し十分に混合した後、遠心分離した（２０，０００×ｇ、１５分間、４℃）。上清を捨て、１ｍＬの７０％エタノールを添加し十分に混合した後、遠心分離した（２０，０００×ｇ、５分間、４℃）。その後上清を捨て、風乾した後、沈澱を５０μＬのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した。
【００３８】
抽出したゲノムＤＮＡをユニバーサルプライマー２７ｆと１４９２ｒ（細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域を標的とする）を用いてＰＣＲ増幅した（表３）。ＰＣＲは反応容量２０μＬにて、Thermal Cycler 2720 (Applied Biosystems 社)を用いて行った。ＰＣＲ酵素TaKaRa Ex Taq (TaKaRa)とそれに付属していたＰＣＲ試薬により反応溶液を調整した。反応液２０μＬあたりの組成は、減菌水１４．７μＬ，緩衝液２μＬ、ゲノムＤＮＡ１μＬ（＜１ｎｇ）、１０ｐｍｏｌ／Ｌの各プライマー０．８μＬずつ、ｄＮＴＰ溶液１．６μＬ、Ex Taq ０．１μＬ（０．０２５Ｕ）とした。なお、大腸菌ゲノムを鋳型ＤＮＡとした反応液を陽性コントロール、鋳型ＤＮＡ溶液を添加しなかった反応液を陰性コントロールとした。温度サイクリングは、９４℃−１分の初期変性後、熱変性９４℃−３０秒、アニーリング５５℃−３０秒、伸長反応７２℃−９０秒を１サイクルとして３０サイクル行った。ＰＣＲ後、反応液を５μＬ採取し、１．５％アガロースゲル電気永動で分析した。検出はアガロースゲルをエチジウムブロミドで染色し、ＵＶイルミネーター（ＵＶＰ）で行った。
【００３９】
得られたＰＣＲ断片（約１，５００ｂｐ）のシーケンシング解析を行った。シーケンシング反応にはプライマー２７ｆ、５１９ｆ、１０９９ｆ、５２０ｒ、１４９２ｒを用い（表３）、ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)で塩基配列を決定した。塩基配列結果はGenBankにてBLASTによる相同性検索を行った。相同性が示された配列とともにCLUSTAL Wを用いてマルチプルアラインメントを行い、MEGA4.0を用いて近隣結合法により分子系統樹を作成した。
【表３】
【００４０】
各分離株について塩基配列をもとに分類を行ったところ、Ｄ−２５株は、これまでにＡｕ還元活性が報告されていないコリモナス（Collimonas）属細菌の塩基配列と相同性が高いことが明らかになった。表４にＤ−２５株の相同性検索の結果を、図４に分子系統樹を示す。なお、Ｄ−２５株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列（部分配列）を配列表に示した。
【表４】
【００４１】
また、Ａｕ(III)還元活性が高かったＤ−２２株も、これまでにＡｕ還元活性が報告されていないディアドバクター（Dyadobacter）属細菌の塩基配列と相同性が高いことが明らかになった。
【００４２】
さらに、Ａｕ(III)還元活性が高かったＥ−２９株、Ｋ−２２株及びＭ１−１株についても、これまでにＡｕ還元活性が報告されていないペドバクター（Pedobacter）属細菌の塩基配列と相同性が高いことが明らかになった。
【００４３】
表５にＤ−２２株、Ｅ−２９株、Ｋ−２２株及びＭ１−１株の相同性検索の結果を、図５に分子系統樹を示す。また、Ｄ−２２株、Ｅ−２９株、Ｋ−２２株及びＭ１−１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列（部分配列）を配列表に示した。
【表５】
【００４４】
（２）Ｄ−２５株の形態観察及び生理・生化学試験
前記分離株のうち、Ｄ−２５株について形態観察及び生理・生化学試験を行った。その結果を図６、表６、表７及び表８に示す。
【表６】
【表７】
【表８】
【００４５】
（考察）
Ｄ−２５株はコリモナス（Collimonas）属細菌と１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列が９９％以上一致していたこと、分子系統樹においてコリモナス（Collimonas）属の系統枝に含まれていたことから、Ｄ−２５株は本属に帰属するものと推察される。
【００４６】
次に、形態観察の結果、Ｄ−２５株は運動性を有さないグラム陰性桿菌で、Ｒ２Ａ寒天培地上で粘稠性のコロニーを形成し、嫌気条件下で生育せず、グルコースを酸化せず、カタラーゼ反応及びオキシターゼ反応はともに陽性を示した（表６）。
【００４７】
また、生理・生化学試験の結果、Ｄ−２５株は硝酸塩を還元せず、インドールを産生せず、アルギニンジヒドロラーゼ活性を示さず、グルコース、L-アルビノース及びD-マンニトールなどを資化し、n-カプリン酸および酢酸フェニルなどは資化しなかった（表７）。
【００４８】
また、酵素反応の試験結果、Ｄ−２５株はアルカリホスタファーゼ、エステラーゼ（C4）及びエステラーゼ リパーゼ（C8）などの活性を示し、バリン アリルアミターゼやα-ガラクトシダーゼなどの活性は示さなかった（表８）。
【００４９】
これらの性状は１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づく系統解析の結果から帰属が推察されたコリモナス（Collimonas）属の既知種に類似点が多く認められた。ただし、運動性を示さず（表６）、バリンアリルアミダーゼ活性を示さない点は（表８）、コリモナス（Collimonas）属の既知種の性状とは異なっていた。
【００５０】
上記菌学的性質から、Ｄ−２５株をコリモナス（Collimonas）属分類群に帰属するものと推定した。この菌株は、平成２３年６月９日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１１０４として寄託されている。
【００５１】
コリモナス（Collimonas）属細菌ではＡｕ（III）還元活性は報告されていないため、Ｄ−２５株は新規のＡｕ（III）還元菌であるといえる。
【００５２】
そして、上述したように本菌株はＡｕ（III）還元活性を示す微生物であるので、この微生物により、金鉱山の浸出液や廃水中に含まれる金化合物を金ナノ粒子に変換・濃縮し、効率よく金を回収・資源化することができる。
【００５３】
（３）Ｄ−２２株の形態観察及び生理・生化学試験
前記分離株のうち、Ｄ−２２株について形態観察及び生理・生化学試験を行った。その結果を図７、表9、表１０に示す。
【表９】
【表１０】
【００５４】
（考察）
Ｄ−２２株はディアドバクター（Dyadobacter）属細菌と１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列が９７％以上一致していたこと、分子系統樹においてディアドバクター（Dyadobacter）属の系統枝に含まれていたことから、Ｄ−２２株は本属に帰属すると推察される。
【００５５】
形態観察の結果、Ｄ−２２株は運動性を有さないグラム陰性桿菌で、Ｒ2Ａ寒天培地上で粘稠性のある黄色コロニーを形成し、グルコースを酸化せず、カタラーゼ反応およびオキシダーゼ反応はともに陽性を示した（表９）。
【００５６】
また、生理・生化学試験の結果、Ｄ−２２株は硝酸塩を還元せず、インドールを産生せず、アルギニンジヒドロラーゼやウレアーゼなどの活性を示さず、エスクリンを加水分解し、グルコース、Ｌ−アラビノースおよびＤ−マンノースなどを資化し、グルコン酸カリウムやｎ−カプリン酸を資化しなかった（表１０）。本株は嫌気条件で生育した。
【００５７】
これらの性状は１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列解析の結果において帰属が示唆されたディアドバクダー（Dyadobacter）属の性状に類似すると考えられ、塩基配列解析の結果と併せて、Ｄ−２２株をディアドバクダー（Dyadobacter）属分類群に帰属するものと推定した。この菌株は、平成２４年２月２１日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１２４６として寄託されている。
【００５８】
これまでに、ディアドバクダー（Dyadobacter）属細菌ではＡｕ（III）還元活性は報告されていないため、Ｄ−２２株は新規のＡｕ（III）還元菌であるといえる。
【００５９】
そして、上述したように本菌株はＡｕ（III）還元活性を示す微生物であるので、この微生物により、金鉱山の浸出液や廃水中に含まれる金化合物を金ナノ粒子に変換・濃縮し、効率よく金を回収・資源化することができる。
【００６０】
（４）Ｅ−２９株の形態観察及び生理・生化学試験
前記分離株のうち、Ｅ−２９株について形態観察及び生理・生化学試験を行った。その結果を図８、表１１、表１２に示す。
【表１１】
【表１２】
【００６１】
（考察）
Ｅ−２９株は一部のペドバクター（Pedobacter）属細菌（P. cryoconitis）と１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列が９９％以上一致していたこと、分子系統樹においてPedobacter属の系統枝に含まれていたことから、Ｅ−２９株は本属に帰属すると推察される。
【００６２】
形態観察の結果、Ｅ−２９株は運動性を有さないグラム陰性桿菌で、Ｒ2Ａ寒天培地上で粘稠性のあるクリーム色コロニーを形成し、グルコースを酸化し、カタラーゼ反応およびオキシダーゼ反応はともに陽性を示した（表１１）。
【００６３】
また、生理・生化学試験の結果、Ｅ−２９株は硝酸塩を還元せず、アルギニンジヒドロラーゼ活性を示さず、ゼラチンを加水分解し、β−ガラクトシダーゼ活性を示し、グルコース、Ｄ−マンノースおよびＤ−マンニトールなどを資化し、Ｌ−アラビノースやＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンなどを資化しなかった（表１２）。本株は嫌気条件では生育しなかった。
【００６４】
これらの性状は１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列解析の結果において帰属が示唆されたペドバクター（Pedobacter）属の性状に類似すると考えられ、塩基配列解析の結果と併せて、Ｅ−２９株をペドバクター（Pedobacter）属分類群に帰属するものと推定した。この菌株は、平成２４年２月２１日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受領番号ＮＩＴＥ Ｐ−１２４７として寄託されている。
【００６５】
これまでに、ペドバクター（Pedobacter）属細菌ではＡｕ（III）還元活性は報告されていないため、Ｅ−２９株は新規のＡｕ（III）還元菌であるといえる。
【００６６】
そして、上述したように本菌株はＡｕ（III）還元活性を示す微生物であるので、この微生物により、金鉱山の浸出液や廃水中に含まれる金化合物を金ナノ粒子に変換・濃縮し、効率よく金を回収・資源化することができる。
【００６７】
（５）Ｋ−２２株の形態観察及び生理・生化学試験
前記分離株のうち、Ｋ−２２株について形態観察及び生理・生化学試験を行った。その結果を図９、表１３、表１４に示す。
【表１３】
【表１４】
【００６８】
（考察）
Ｋ−２２株は一部のペドバクター（Pedobacter）属細菌（P. nyackensis）と１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列が９８％以上一致していたこと、分子系統樹においてペドバクター（Pedobacter）属の系統枝に含まれていたことから、Ｋ−２２株は本属に帰属すると推察される。
【００６９】
形態観察の結果、Ｋ−２２株は運動性を有さないグラム陰性桿菌で、Ｒ2Ａ寒天培地上でのコロニー色は黄色を呈し、グルコースを酸化せず、カタラーゼ反応およびオキシダーゼ反応はともに陽性を示した（表１３）。
【００７０】
また、生理・生化学試験の結果、Ｋ−２２株は硝酸塩を還元せず、エスクリンを加水分解し、ゼラチンを加水分解せず、β−ガラクトシダーゼ活性を示し、グルコース、Ｌ−アラビノースおよびＤ−マンノースを資化し、Ｄ−マンニトール、グルコン酸カリウムおよびｎ−カプリン酸などを資化しなかった（表１４）。本株は嫌気条件では生育しなかった。
【００７１】
これらの性状は１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列解析の結果において帰属が示唆されたペドバクター（Pedobacter）属の性状に類似すると考えられ、塩基配列解析の結果と併せて、Ｋ−２２株をペドバクター（Pedobacter）属分類群に帰属するものと推定した。この菌株は、平成２４年２月２１日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受領番号ＮＩＴＥ Ｐ−１２４８として寄託されている。
【００７２】
これまでに、ペドバクター（Pedobacter）属細菌ではＡｕ（III）還元活性は報告されていないため、Ｋ−２２株は新規のＡｕ（III）還元菌であるといえる。
【００７３】
そして、上述したように本菌株はＡｕ（III）還元活性を示す微生物であるので、この微生物により、金鉱山の浸出液や廃水中に含まれる金化合物を金ナノ粒子に変換・濃縮し、効率よく金を回収・資源化することができる。
【００７４】
（６）Ｍ１−１株の形態観察及び生理・生化学試験
前記分離株のうち、Ｍ１−１株について形態観察及び生理・生化学試験を行った。その結果を図１０、表１５、表１６に示す。
【表１５】
【表１６】
【００７５】
（考察）
Ｍ１−１株は一部のペドバクター（Pedobacter）属細菌（P. panaciterrae）と１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列が９８％以上一致していたこと、分子系統樹においてペドバクター（Pedobacter）属の系統枝に含まれていたことから、Ｍ１−１株は本属に帰属すると推察される。
【００７６】
形態観察の結果、Ｍ１−１株は運動性を有さないグラム陰性桿菌で、Ｒ2Ａ寒天培地上で粘稠性のあるクリーム色のコロニーを形成し、グルコースを酸化し、カタラーゼ反応およびオキシダーゼ反応はともに陽性を示した（表１５）。
【００７７】
また、生理・生化学試験の結果、Ｍ１−１株は硝酸塩を還元せず、エスクリンを加水分解し、ゼラチンを加水分解せず、β−ガラクトシダーゼ活性を示し、グルコース、Ｌ−アラビノースおよびＤ−マンノースを資化し、Ｄ−マンニトール、グルコン酸カリウムおよびｎ−カプリン酸などを資化しなかった（表１６）。本株は嫌気条件では生育しなかった。
【００７８】
これらの性状は１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列解析の結果において帰属が示唆されたペドバクター（Pedobacter）属の性状に類似すると考えられ、塩基配列解析の結果と併せて、Ｍ１−１株をペドバクター（Pedobacter）属分類群に帰属するものと推定した。この菌株は、平成２４年２月２１日付けで独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受領番号ＮＩＴＥ Ｐ−１２４９として寄託されている。
【００７９】
これまでに、ペドバクター（Pedobacter）属細菌ではＡｕ（III）還元活性は報告されていないため、Ｍ１−１株は新規のＡｕ（III）還元菌であるといえる。
【００８０】
そして、上述したように本菌株はＡｕ（III）還元活性を示す微生物であるので、この微生物により、金鉱山の浸出液や廃水中に含まれる金化合物を金ナノ粒子に変換・濃縮し、効率よく金を回収・資源化することができる。
【００８１】
（分離株の培養液で生成したＡｕナノ粒子の形態）
上記分離株のうち、Ｄ−２５株とＭ１−１株をそれぞれＴＳＢ培地で２日間振盪培養した後、遠心分離により集菌し、減菌水で洗浄してから再び減菌水に懸濁した。この懸濁液に０．５ｍＭ ＫＡｕＣｌ４を添加し、暗所、室温で５日間静置してＡｕ（III）を還元させた。金粒子を含む培養液上清を、孔径０．２μｍのメンブランフィルターで濾過してから減圧遠心機により濃縮して透過型電子顕微鏡観察を行った。
【００８２】
分離株の培養液に金化合物を添加すると紫色を呈することから、Ａｕはナノ粒子として存在しているものと考えられる。このことは、培養液を孔径０．２μｍのメンブランフィルターで濾過したとき、濾液が紫色を呈したことからも支持される。
【００８３】
電子顕微鏡観察の結果、図１１に示されるように、Ｄ−２５株及びＭ１−１株共にＡｕナノ粒子が形成されていることが確認された。粒子のサイズはおよそ５〜４０ｎｍ、形態は球形、三角形、五角形、六角形のものが観察され、粒子としては不均一であることがわかった。
【００８４】
前記粒子の形態は、非特許文献８に記載されている真菌Helminthosporum solaniの培養液で形成されたものと類似しているが、粒子サイズはＤ−２５株と比較して大きい（〜５０μｍ）。
【００８５】
また、非特許文献９によれば、細菌Rhodopseudomas capsulataにおいて、ｐＨ７の培養液でＡｕ還元させた場合は１０〜２０ｎｍのナノ粒子が形成されるが、ｐＨ４の条件では６０％以上が三角形のナノプレート（５０〜４００ｎｍ）として存在することが報告されている。
【００８６】
従って、Ｄ−２５株やＭ１−１株で観察されたＡｕナノ粒子についても、培養条件によってそれらの形態は大きく変化する可能性がある。
【００８７】
なお、培養液を遠心分離して集めた菌体画分も紫色を呈したので、多量のＡｕ粒子が含まれると推察される。
【実施例１】
【００８８】
前記実施形態では、細菌分離株が好気条件でＡｕ（III）還元することを説明したが、本実施例では、上記菌株が嫌気条件でもＡｕ（III）還元を示すか否かを検討したので説明する。
【００８９】
（Ｄ−２５株）
Ｄ−２５株をｍＧＹ培地で振盪培養した後、その１０ｍＬを減菌した２０ｍＬバイアル瓶に移し、ＫＡｕＣｌ４を０．２ｍＭとなるように添加した。このバイアル瓶に窒素ガスを１０分間通気して酸素を置換した後、ブチルゴム栓とアルミキャップで密栓して嫌気条件とした。バイアル瓶は２５℃で静置した。
【００９０】
この結果を図１２に示す。Ａｕ添加後２日間で、培養液は紫青色を示し（図１２（ｃ））、Ａｕ（III）還元活性が認められた。非特許文献４、７、９によれば、微生物は、嫌気条件において金化合物を電子受容体として利用して還元するか、好気条件で還元するか、どちらか一つの条件下での活性が報告されてきたが、Ｄ−２５株では好気及び嫌気条件下でＡｕ還元活性が発現することが明らかになった。本株を用いることにより、好気および嫌気の両条件で金ナノ粒子を製造できることから、排水の性状や設備の状況に合わせて最適な製造プロセスを構築することができる。
【００９１】
（Ｄ−２２株、Ｅ−２９株、Ｋ−２２株、Ｍ１−１株）
Ｄ−２５株と同様に、Ｄ−２２株、Ｅ−２９株、Ｋ−２２株、Ｍ１−１株は好気条件（静置条件）でＡｕ（III）還元活性をもつ細菌として分離されたものである。これらの菌株がＤ−２５株のように、嫌気条件下においてもＡｕ還元するか否か調査した。
【００９２】
Ｄ−２２株、Ｅ−２９株、Ｋ−２２株、Ｍ１−１株の各々をｍＧＹ培地で振盪培養した後、その１０ｍＬを滅菌した２０ｍＬバイアル瓶に移し、ＫＡｕＣｌ４を０．２ｍＭとなるように添加した。このバイアル瓶に窒素ガスを１０分間通気して酸素を置換した後、ブチルゴム栓とアルミキャップで密栓して嫌気条件とした。バイアル瓶は２５℃で静置した。
【００９３】
その結果、培養開始後４８時間までに培養液は青紫色または赤紫色を呈し、菌体のＡｕ（III）還元による金ナノ粒子の形成が確認された。したがって、これらの分離株もＤ−２５株と同様に、好気および嫌気の両条件においてＡｕ（III）還元活性をもつことが示された。これらの菌株を用いることにより、好気および嫌気の両条件で金ナノ粒子を製造できることから、排水の性状や設備の状況に合わせて最適な製造プロセスを構築することができる。
【実施例２】
【００９４】
前記実施形態では、好気または嫌気条件下で、Ｄ−２５株の菌体に金酸イオンを接触させて金ナノ粒子を形成させた。本実施例では、菌体からの酵素抽出液でもＡｕ（III）還元を示すか否かを検討したので説明する。
【００９５】
（Ｄ−２５株）
Ｄ−２５株を好気条件で２日間振盪培養したあと、０．０５ ｍＭ ＫＡｕＣｌ４を添加し、１２時間嫌気条件に設置した。この菌体を氷中で冷却しながら超音波処理で破砕し、４℃、１２０００ ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により、無細胞抽出液を調製した。この抽出液に０．１ ｍＭ ＫＡｕＣｌ４を添加し２８℃で３０分静置してもＡｕ還元は認められなかったが、この溶液に０．５ ｍＭ ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を添加すると、溶液は青紫色を示し、金ナノ粒子が生成した（図１３）。このことから、Ｄ−２５株はＮＡＤＨ依存性Ａｕ(III)還元酵素活性を保有し、この酵素を利用すれば金酸イオンを菌体に接触させることなく金ナノ粒子を形成できることがわかった。菌体を利用する場合には、金ナノ粒子の形成時に菌体成分が混入するが、菌体から抽出した酵素を利用することにより、有機物の混入を最大限に抑えた金ナノ粒子の標品を得ることができる。
【００９６】
なお、非特許文献７によれば、細菌であるStenotrophomonas maltophiliaにおいて、好気条件で増殖した菌体の無細胞抽出液で同様の酵素活性が既に示されているが、Stenotrophomonas maltophiliaが嫌気条件でも酵素活性を発現するか否かは明らかにされていない。
【００９７】
（Ｄ−２２株、Ｅ−２９株、Ｋ−２２株、Ｍ１−１株）
次に、分離した４菌株がＤ−２５株と同様にＡｕ（III）還元酵素を産生し、無細胞抽出液でも金ナノ粒子を形成するか否かを調査した。各々の菌株を、ｍＧＹ培地を用いて２５℃で２日間振盪培養した。この後、０．０５ｍＭ ＫＡｕＣｌ４を添加して８〜１５時間嫌気条件で静置した。各々の菌体から、前述したように超音波処理により菌体破砕を行い、無細胞抽出液を調製した。
【００９８】
無細胞抽出液中のＡｕ（III）還元酵素活性は９６穴マイクロプレートを用いて測定した。反応溶液の全量を２５０μＬとして、この溶液中に無細胞抽出液（５０〜２００μＬ）、０．５ｍＭ ＮＡＤＨ、０．１ｍＭ ＫＡｕＣｌ４を含むようにした。なおＫＡｕＣｌ４を最後に添加し、添加後直ちにマイクロプレートリーダー（TECAN社）を用いて、５分ごとに波長４９５ｎｍにおける吸光度を計測した。単位時間当たりの吸光度の変化量を求めて、Ａｕ（III）還元速度を算出した。
【００９９】
この試験と並行して、無細胞抽出液を添加しない反応液についても同様にＡｕ（III）還元速度を算出し、酵素添加時の速度から差し引くことで、ＮＡＤＨによる非酵素的な還元量を除外した。
【０１００】
無細胞抽出液のタンパク質濃度は測定キット（同仁化学製、ＣＢＢ染料を用いたBradford法による）を用いて測定した。タンパク質標準溶液には所定の濃度のウシ血清アルブミンを使用した。
【０１０１】
試験の結果、全ての菌株の無細胞抽出液において、ＮＡＤＨを添加しない場合はＡｕ（III）還元酵素活性は検出されなかった（図１４）。また、無細胞抽出液を加えない場合、ＮＡＤＨによる非酵素的なＡｕ（III）還元は殆ど認められなかったが（Ａｕ還元速度（ΔＡ４９５ｎｍ／分）：０．００１以下）、無細胞抽出液とＮＡＤＨの両方を添加すると反応液は直ちに赤紫色を呈し、明確なＡｕ（III）還元活性が検出された（図１４、表１７）。
【表１７】
【０１０２】
これらの結果から、Ｄ−２２株、Ｅ−２９株、Ｋ−２２株およびＭ１−１株は、Ｄ−２５株と同様に、ＮＡＤＨ依存性のＡｕ（III）還元酵素活性を保有し、酵素反応により金ナノ粒子を形成できることが示された。これらの菌体を利用する場合には、金ナノ粒子の形成時に菌体成分が混入するが、それぞれの菌体から抽出した酵素を利用することにより、有機物の混入を最大限に抑えた金ナノ粒子の標品を得ることができる。
【０１０３】
以上、添付図面等を参照して本発明の好ましい実施形態、実施例を説明したが、本発明はかかる実施形態、実施例に限定されること無く、特許請求の範囲の記載から把握される技術的範囲において種々に変更可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
金の還元能力を有する、コリモナス（Collimonas）属に属し、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１１０４の微生物。
【請求項２】
金の還元能力を有する、ディアドバクター（Dyadobacter）属に属し、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１２４６の微生物。
【請求項３】
金の還元能力を有する、ペドバクター（Pedobacter）属に属し、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１２４７、ＮＩＴＥ Ｐ−１２４８、ＮＩＴＥ Ｐ−１２４９から選択される微生物。
【請求項４】
請求項１乃至３いずれか一項記載の微生物に金化合物を接触させ、前記微生物が前記金化合物から金酸イオンを還元することを特徴とする金粒子の形成方法。
【請求項５】
前記金化合物における金の価数が３であることを特徴とする請求項４記載の金粒子の形成方法。
【請求項６】
前記金酸イオンの還元が好気条件又は嫌気条件下で行われることを特徴とする請求項４又は５記載の金粒子の形成方法。
【請求項７】
請求項１乃至３いずれか一項記載の微生物から無細胞抽出液を調製し、前記抽出液と金化合物及び補酵素ＮＡＤＨを混合して前記金化合物から金酸イオンを還元することを特徴とする金粒子の形成方法。
【請求項１】
金の還元能力を有する、コリモナス（Collimonas）属に属し、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１１０４の微生物。
【請求項２】
金の還元能力を有する、ディアドバクター（Dyadobacter）属に属し、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１２４６の微生物。
【請求項３】
金の還元能力を有する、ペドバクター（Pedobacter）属に属し、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１２４７、ＮＩＴＥ Ｐ−１２４８、ＮＩＴＥ Ｐ−１２４９から選択される微生物。
【請求項４】
請求項１乃至３いずれか一項記載の微生物に金化合物を接触させ、前記微生物が前記金化合物から金酸イオンを還元することを特徴とする金粒子の形成方法。
【請求項５】
前記金化合物における金の価数が３であることを特徴とする請求項４記載の金粒子の形成方法。
【請求項６】
前記金酸イオンの還元が好気条件又は嫌気条件下で行われることを特徴とする請求項４又は５記載の金粒子の形成方法。
【請求項７】
請求項１乃至３いずれか一項記載の微生物から無細胞抽出液を調製し、前記抽出液と金化合物及び補酵素ＮＡＤＨを混合して前記金化合物から金酸イオンを還元することを特徴とする金粒子の形成方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２０１３−１３４０３（Ｐ２０１３−１３４０３Ａ）
【公開日】平成２５年１月２４日（２０１３．１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１１７１３２（Ｐ２０１２−１１７１３２）
【出願日】平成２４年５月２３日（２０１２．５．２３）
【出願人】（３９８０２４８８２）株式会社ジパング (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年１月２４日（２０１３．１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年５月２３日（２０１２．５．２３）
【出願人】（３９８０２４８８２）株式会社ジパング (1)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]