金ナノ複合体
【課題】ドラッグデリバリーシステムや蛍光センサー等に用いられる新規な金ナノ複合体を提供する。
【解決手段】表面に薬剤を吸着した金ナノ粒子と、該金ナノ粒子を被覆してなる熱応答性高分子とを有することを特徴とする金ナノ粒子複合体によって、上記課題を解決する。この金ナノ複合体は、グルタチオン等チオール化合物の共存下においてのみ、熱刺激により薬剤を放出することから、ねらった部位で薬物を的確に放出できるドラッグデリバリーシステムを構築することができる。
【解決手段】表面に薬剤を吸着した金ナノ粒子と、該金ナノ粒子を被覆してなる熱応答性高分子とを有することを特徴とする金ナノ粒子複合体によって、上記課題を解決する。この金ナノ複合体は、グルタチオン等チオール化合物の共存下においてのみ、熱刺激により薬剤を放出することから、ねらった部位で薬物を的確に放出できるドラッグデリバリーシステムを構築することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドラッグデリバリーシステムや蛍光センサー等に用いられる金ナノ複合体に関する。更に詳しくは、所定の条件下においてのみ、熱刺激により、包摂していた有機分子を放出する、金ナノ複合体及びこれを用いたドラッグデリバリーシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
ドラッグデリバリーシステムは、理想的な薬物投与システムとして、また、種々の種類の担体等を対象として、盛んに研究されている。粒子径が１００ｎｍ以下のナノ粒子材料は、その粒径が薬物運搬体のサイズに適しているのに加え、相互作用に利用できる単位質量あたりの表面積が大きいという特性を有する。そのため、機能性物質の内包や分析感度の向上等、その実用性への展望からバイオ分離や各種アッセイ、診断やドラッグデリバリーシステム等の幅広い領域での活用が期待されている。
【０００３】
中でも、温度やｐＨ等の外部刺激に応答して機能や物理的性質が不連続かつ可逆的に変化する刺激応答性高分子は、感知・判断・運動といった高度機能を兼ね備えた高機能材料として数多く研究されている。
【０００４】
刺激応答性高分子とは、外部環境の様々な物理・化学情報（温度・熱、溶媒・組成、ｐＨ、電場、光等）を感知して応答する高分子であり，特に熱に感応するものが熱応答性高分子とばれる。現在、４種の基本的な相互作用（水素結合性、疎水性、ファンデルワールス力、静電的相互作用）と高分子の相転移が示されている。
【０００５】
この相転移は、ゲル内の分子間相互作用（高分子鎖と溶媒分子間、高分子鎖と高分子鎖間)によって誘発されていることから、ゲルの相転移を構成高分子の物性変化と捉えることができる。従来からよく知られる熱応答性高分子には、ポリＮ−イソピルアクリルアミド等のポリ（アクリルアミンド）類縁体が挙げられる。
【０００６】
このように、架橋型熱応答性高分子は、外部の熱刺激に応じて高分子鎖のコンフォメーションを変化させることができる。そのため、体温に近い温度で相転移する架橋型熱応答性高分子を利用して、体内の必要な部分に確実に薬を投与し、最適な温度で薬の投与のｏｎ‐ｏｆｆを制御することのできるドラッグデリバリー用の担体として研究されている。
【０００７】
しかしながら、このような架橋型熱応答性高分子を用いたドラッグデリバリーシステムにおいては、当該高分子の熱による相転移によって、内包させた薬剤の放出が生じる（すなわち熱刺激によって薬剤の放出が起動されてしまう）ため、環境温度変化による当該高分子からの薬剤の遊離等による安定性の問題、また薬剤の自己拡散による漏出等の克服すべき課題が残されている。
【０００８】
一方、金ナノ粒子は、バルクでは見られなかった新しい物性と構造を持っている古くから研究されているナノ粒子であり、ステンドグラスや陶器の無鉛赤色絵具や無機塗料顔料として利用されてきた。例えば、鮮やかなワインレッドの色は、液相で金ナノ粒子を調製して得ることができる。金ナノ粒子の発色は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって生じるため、形状や粒径によって様々な色調を与える。粒径が十数ｎｍ程度で分散状態にある溶液は、５２０ｎｍ付近で極大吸収波長を示し、赤色を呈する。この粒子が凝集状態になると、ブルーシフトを起こして長波長側に新たな吸収帯が生じ、溶液は青色になる。金ナノ粒子は、一度凝集状態になると容易には分散状態に戻らない。
【０００９】
このようなあざやかな色調の変化を利用して、近年では、バイオセンサや光スイッチ等の次世代のセンシング材料やフォトニクス材料として注目され、多くの研究が行われている。
【００１０】
例えば、本発明者による特許文献１においては、グルタチオン又はシステイニルグリシン等のチオール基含有化合物を簡便、迅速、正確に計測することができる色彩色差計測方法として、金ナノ粒子に、特定の熱応答性高分子を複合化してなる金ナノ粒子複合体を用いる方法を提案している。この方法によれば、金ナノ粒子と特定の熱応答性高分子を複合化した金ナノ粒子複合体は溶液中で凝集状態となって青色を呈するが、金ナノ粒子複合体はポリマーが金ナノ粒子に化学吸着することにより溶液中で沈降しない。そして、この複合体溶液にグルタチオンやシステイニルグリシン等の特定のチオール基含有化合物を混合することにより、ポリマーが離脱する代わりにグルタチオンやシステイニルグリシン等が金ナノ粒子に吸着し、さらにそのグルタチオンやシステイニルグリシン等が有するカルボキシル基の作用により分散状態になって赤色に変化するというものである。
【００１１】
また、同じく本発明者による特許文献２においては、粒径が１〜５μｍの金ナノクラスターと熱応答性高分子（カルボキシル基等のアニオン基を含む熱応答性高分子を除く。）とを含む混合溶液を準備する工程と、混合溶液を加熱し、冷却する工程とを有することを特徴とする金ナノ粒子の製造方法が開示されている。この方法によれば、金(III)イオンを還元して粒径が５０ｎｍを超える金ナノ粒子やロッド状の金ナノ粒子を製造するのではなく、粒径１〜５μｍの金ナノクラスターと熱応答性高分子との混合溶液を加熱、冷却するという簡単な操作で、粒径が５０〜１００ｎｍの範囲の金ナノ粒子を得るという新しい方法を提案している。また、特許文献２においては、チオール化合物が、凝集体を構成する金ナノクラスターに吸着することで、金ナノクラスター同士の接触・融合が阻まれ、その結果、金ナノ粒子の製造が阻害され、吸光度での５５０ｎｍの吸収ピークが小さくなり、赤みが弱くなるため、金ナノ粒子の製造用溶液を、チオール化合物の選択的な検出溶液として応用できることが提案されている。
【００１２】
非特許文献１では、ナイルレッドを非共有的に吸着させた金ナノ粒子の水溶液をチオール類の検出に用いることが開示されている。これは、システアミンやホモシステイン等のようなチオール類の添加によって、当該ナイルレッドを非共有的に吸着させた金ナノ粒子の水溶液の蛍光が増加するというものであり、このような蛍光の増加は、アミン類、酸類、アルコール類、ウシ血清アルブミン、ヘモグロビン等の添加によっては生じないことが報告されている。
【００１３】
非特許文献２においては、狭い多分散性を有する熱応答性ブロック共重合体を被覆した金ナノ粒子が、可逆性の熱応答性を示すことが開示されている。
【００１４】
非特許文献３においては、１，１０−フェナントロリンリガンドを有する４ｎｍの金ナノ粒子が、選択的にリチウムイオンに結合し、２：１のリガンド−金属複合体を形成することで、当該リガンドがリチウムイオンに結合し、金ナノ粒子が凝集することを引き起こすことが示されており、この金ナノ粒子の凝集が、色変化を伴う励起スペクトルにおけるシフトを引き起こし、水溶液中のリチウムイオンの有用な光学的検出方法となることが開示されている。
【００１５】
金ナノ粒子は、前記したようなナノ粒子材料の一種であり、ドラッグデリバリー用の担体としても研究されているが、薬剤は金ナノ粒子に吸着した状態で運ばれ、かつ一般的にその結合力が強いため、外部から薬剤の放出を制御することが困難であった。
【００１６】
また、蛍光分子を金ナノ粒子に物理吸着させたナノ複合体が、ナノ粒子蛍光センサーとして研究されている。ナノ粒子蛍光センサー溶液に分析対象物質を添加すると、ナノ複合体に吸着していた蛍光分子が遊離するため、ナノ複合体による蛍光共鳴エネルギー移動（以下ＦＲＥＴ）が解消し、蛍光強度が回復する。しかし、このナノ粒子蛍光センサーでは、分析対象物質の添加により凝集が生じることがあり、再現性低下の原因となっていた。
【００１７】
このように、従来、金ナノ粒子、架橋型熱応答性高分子はともにドラッグデリバリー用の担体として研究されている。しかしながら、これまで熱応答性高分子を被覆した金ナノ粒子をドラッグデリバリー担体として実用化されているものはない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】特開２００９−２２９１４７号公報
【特許文献２】特願２０１０−４４７９２号明細書
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Analytical Chemistry, 76, 3727-3734(2004).
【非特許文献２】Colloids and Surfaces, A, 317, 764-767(2008).
【非特許文献２】Langmuir, 26, 6818-6825(2010).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
効果的なドラッグデリバリーシステムを構築するためには、ねらった部位で薬物を的確に放出できる担体の開発する必要がある。上述したように、架橋型熱応答性高分子を用いる場合には、外部からの熱刺激により内包している薬物の放出を制御することが可能ではある。しかしながら、薬物の自己拡散による漏出等が従来克服すべき課題であった。一方、金ナノ粒子を担体として用いる場合、薬剤は金ナノ粒子に吸着した状態で運ばれるが、この場合には、外部から薬剤の放出を制御することはできないという問題があった。
【００２１】
本発明の目的は、ドラッグデリバリーシステムや蛍光センサー等に用いられる新規な金ナノ複合体を提供することにある。特に、本発明は、ねらった部位で薬物を的確に放出できる金ナノ複合体、及びこれを用いたドラッグデリバリーシステムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究及び検討を重ねた結果、金ナノ粒子に対しチオール類が強い吸着性を示すことに着目し、金ナノ粒子表面に薬剤（有機物）を吸着させ、熱応答性高分子を被覆してなる金ナノ複合体を調製した。この金ナノ複合体を、グルタチオン等チオール化合物と接触させると、チオール化合物により、金ナノ粒子表面で吸着分子の置換が起こるものの、薬剤は熱応答性高分子に覆われている金ナノ複合体の中に留まる。この状態で熱刺激を加えると熱応答性高分子の収縮により、薬剤は複合体から放出される。これによって、当該金ナノ複合体は、グルタチオン等チオール化合物の共存下においてのみ、熱刺激により薬剤を放出し、ねらった部位で薬物を的確に放出できるドラッグデリバリーシステムが確立されること、また、薬剤として蛍光物質を用いた場合に、再現性の良好な蛍光センサーとなることを見出し、本発明に到達した。
【００２３】
すなわち、上記課題を解決するための本発明に係る金ナノ粒子複合体は、表面に薬剤を吸着した金ナノ粒子と、該金ナノ粒子を被覆してなる熱応答性高分子とを有することを特徴とする。
【００２４】
この発明によれば、表面に薬剤を吸着した金ナノ粒子と、該金ナノ粒子を被覆してなる熱応答性高分子とを有するので、グルタチオン等のチオール化合物の共存下において、熱刺激により薬剤を効率的に放出することができる。こうした金ナノ複合体は、その核である金ナノ粒子の表面が薬剤を吸着していることから、自己拡散のおそれがない。なお、薬剤の放散のメカニズムは以下のステップで行われると考えられる。すなわち、チオール化合物により、金ナノ粒子の表面で吸着分子の置換が起こるものの、薬剤は熱応答性高分子に覆われている金ナノ複合体の中に留まる。この状態で熱刺激を加えると、熱応答性高分子の収縮により、薬剤が複合体から放出される。このように、金ナノ粒子に熱応答性高分子を被覆することで、これらが単独で用いられていたときには克服できなかった問題を克服するドラッグデリバリー担体やナノ粒子蛍光センサーを構築することができる。
【００２５】
本発明に係る金ナノ複合体において、前記熱応答性高分子としては、下記化学式２で表されるポリマーが好ましい。式中、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立にアルキル基を表す。Ｒ３とＲ４はそれぞれ独立に水素又はメチル基を表す。また、ｘ／ｙは９５／５〜７０／３０であり、ｎは１〜４である。
【００２６】
【化１】
【００２７】
このうち特に、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルジエチレントリアミン）［ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＤＥＴＡ））］及びポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルトリエチレンテトラミン）［ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＴＥＴＡ））が好ましい。
【００２８】
本発明に係る金ナノ複合体において、前記薬剤としては、蛍光物質、生理活性物質又は医薬化合物を用いることができる。
【００２９】
上記課題を解決するための本発明に係る金ナノ複合体の製造方法は、金ナノ粒子のコロイド溶液に対し、薬剤水溶液、熱応答性高分子溶液の順に添加し、金ナノ粒子に対して先に薬剤を吸着させてから、熱応答性高分子を被覆することを特徴とする。
【００３０】
上記課題を解決するための本発明に係るドラッグデリバリーシステム薬剤は、上記した本発明に係る金ナノ複合体を、チオール類又はシスチンの存在下で加熱して使用することを特徴とする。
【発明の効果】
【００３１】
本発明に係る金ナノ複合体によれば、表面に薬剤を吸着した金ナノ粒子と、該金ナノ粒子を被覆してなる熱応答性高分子とを有するので、グルタチオン等のチオール化合物の共存下において、熱刺激により薬剤を効率的に放出することができる。こうした金ナノ複合体は、その核である金ナノ粒子表面に薬剤が吸着していることから、自己拡散のおそれがない。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】金ナノ複合体からの薬剤放出のメカニズムを示す模式図である。
【図２】蛍光物質Nile Redの励起及び蛍光スペクトルを示す図面である。
【図３】金ナノ複合体において用いられた熱応答性高分子の相違による薬剤放出特性の影響を示す蛍光スペクトル強度を示す図面である。
【図４】金ナノ粒子を被覆する熱応答性高分子（ＮＩＰ−ＤＥＴＡ）の濃度による蛍光スペクトル強度の影響を示す図である。
【図５】金ナノ粒子を被覆する熱応答性高分子（ＮＩＰ−ＴＥＴＡ）の濃度による蛍光スペクトル強度の影響を示す図である。
【図６】ｐＨ環境変化による金ナノ複合体の薬剤放出特性の影響を示す蛍光スペクトル強度を示す図面である。
【図７】加熱温度の変化による金ナノ複合体の薬剤放出特性の影響を示す蛍光スペクトル強度を示す図面である。
【図８】実施例において使用した分子スイッチ化合物の構造式を示す図面である。
【図９】添加した分子スイッチ化合物の相違による金ナノ複合体の薬剤放出特性の影響を示す蛍光スペクトル強度を示す図面である。
【図１０】分子スイッチ化合物の添加濃度変化による金ナノ複合体の薬剤放出特性の影響を示す蛍光スペクトル強度を示す図面である。
【図１１】分子スイッチ化合物の添加濃度変化による金ナノ複合体の薬剤放出特性の影響を示す蛍光スペクトル強度を示す図面である。
【図１２】分子スイッチ化合物の添加時における共存物質の存在による金ナノ複合体の薬剤放出特性の影響を示す蛍光スペクトル強度を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、本発明に係る金ナノ粒子複合体について、図面を参照しつつ説明する。
【００３４】
［金ナノ粒子複合体］
本発明に係る金ナノ粒子複合体は、表面に薬剤を吸着した金ナノ粒子と、該金ナノ粒子を被覆してなる熱応答性高分子とを有することを特徴とする。先ず、本発明に係る金ナノ複合体を説明するに先立ち、本発明の重要な構成要素につき、個々に説明する。
【００３５】
（金ナノ粒子）
金ナノ粒子としては、種々の形状のものを用いることが可能であるが、粒形状又は球形状であることが望ましい。なお、金ナノ粒子の粒径は、その調製方法に依存し、各種の粒径のものを得ることができる。本発明に使用可能な金ナノ粒子の粒径の範囲は特に限定されないが、粒径が小さすぎるものは作製が難しく、一方、粒径が大きすぎるものは沈降してしまう場合があるので、それらを考慮して選択する。一般的には、粒径１０〜１００ｎｍ程度のもの、特に１０〜５０ｎｍ程度のものが多く用いられる。なお、金ナノ粒子の粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）での観察結果から求めることができる。
【００３６】
金ナノ粒子は、金ナノ粒子溶液として調製することができる。この金ナノ粒子溶液の調製は、クエン酸ナトリウム還元により行うことができ、具体的には、所定量のテトラクロロ金酸水溶液に、クエン酸三ナトリウム水溶液を添加して調製する例を挙げることができる。また、市販の所定の大きさからなる金ナノ粒子溶液を用いてもよい。
【００３７】
金ナノ粒子を含む金ナノ粒子複合体は、特許文献１に記載されるように、粒径１〜５μｍの金ナノクラスターと熱応答性高分子との混合溶液を加熱、冷却するという製造方法を応用して、調製することも可能である。この調製方法については下記に詳述する。
【００３８】
ここで、金ナノクラスターは、透過型電子顕微鏡像（ＴＥＭ像）で測定した粒径が１〜５μｍの金粒子のことである。金ナノクラスターの形状は、粒形状又は球形状であることが望ましい。金ナノクラスターは各種の方法で製造でき、例えば、テトラヒドロホウ酸ナトリウム溶液を用いる方法等で製造することができる。具体的には、塩化金酸溶液にポリオキシエチレン溶液を添加した後に水を加え、ｐＨ調整した後にＮａＢＨ４（テトラヒドロホウ酸ナトリウム）溶液を添加し、その後反応させて合成することができる。なお、ポリオキシエチレン溶液としては、テトラエチレングリコール等を挙げることができる。こうした合成方法によって、粒径が１〜５μｍの金ナノクラスターを得ることができる。
【００３９】
（熱応答性高分子）
熱応答性高分子としては、少なくともＮ−イソプロピルアクリルアミド類を構成単位として含むポリマー、ポリ（メチルビニルエーテル）、又はヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。
【００４０】
熱応答性高分子のうち、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド類を構成単位として含むポリマーの例としては、下記一般式１〜６に記載のものを例示することができる。
【００４１】
【化２】
【００４２】
上記化学式１のポリマーは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）類である。化学式１において、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立にアルキル基、好ましくは炭素数１〜４程度の直鎖状のアルキル基、より好ましくはメチル基を表す。Ｒ３はそれぞれ独立に水素又はメチル基、好ましくは水素を表す。ｎは１０００〜１０００００の整数である。Ｒ１とＲ２をメチル基とし、Ｒ３を水素としたポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）は「Ｐ−ＮＩＰ」で表す。
【００４３】
【化３】
【００４４】
上記化学式２のポリマーは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイル−アミン）類である。化学式２において、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立にアルキル基、好ましくは炭素数１〜４程度の直鎖状のアルキル基、より好ましくはメチル基を表す。Ｒ３とＲ４はそれぞれ独立に水素又はメチル基、好ましくは水素を表す。また、ｘ／ｙは９５／５〜７０／３０であり、好ましくは９０／１０〜８５／１５の範囲である。ｎは１〜４である。Ｒ１とＲ２をメチル基とし、Ｒ３とＲ４を水素としたポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイル−アミン）は「ｐＮＩＰ−ＡＣ」で表す。
【００４５】
化学式２のポリマーの右側の側鎖は、エチレンイミン鎖の繰り返し単位を含むアクリロイルアミン（以下、ＡＣという。）である。より具体的には、右側の側鎖のエチレンイミン鎖の繰り返し単位であるｎ＝０の場合には、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルエチレンジアミン）［以下、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＥＤＡ））という。］となり、ｎ＝１の場合には、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルジエチレントリアミン）［以下、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＤＥＴＡ））という。］となり、ｎ＝２の場合には、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルトリエチレンテトラミン）［以下、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＴＥＴＡ））という。］となり、ｎ＝３の場合には、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルテトラエチレンペンタミン）［以下、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＴＥＰＡ））という。］、ｎ＝４の場合には、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルペンタエチレンヘキサミン）［以下、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＰＥＨＡ））という。］となる。
【００４６】
【化４】
【００４７】
上記化学式３のポリマーは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイル−シスタミン）類である。化学式３において、Ｒ１とＲ２及びＲ７とＲ８はそれぞれ独立にアルキル基、好ましくは炭素数１〜４程度の直鎖状のアルキル基、より好ましくはメチル基を表す。Ｒ３とＲ４及びＲ５とＲ６はそれぞれ独立に水素又はメチル基、好ましくは水素を表す。また、ｘ／ｙ／ｚは９５／２．５／２．５〜８０／１０／１０である。Ｒ１とＲ２及びＲ７とＲ８をメチル基とし、Ｒ３とＲ４及びＲ５とＲ６を水素としたポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイル−アミン）は「ｐＮＩＰ−Ｃｙｓ」で表す。
【００４８】
【化５】
【００４９】
上記化学式４のポリマーは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイル−アラニン）類である。化学式４において、Ｒ１とＲ２及びＲ５はそれぞれ独立にアルキル基、好ましくは炭素数１〜４程度の直鎖状のアルキル基、より好ましくはメチル基を表す。Ｒ３とＲ４はそれぞれ独立に水素又はメチル基、好ましくは水素を表す。また、ｘ／ｙは９０／１０〜８０／２０である。Ｒ１とＲ２及びＲ５をメチル基とし、Ｒ３とＲ４を水素としたポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイル−アミン）は「ｐＮＩＰ−ＡＣ」で表す。
【００５０】
【化６】
【００５１】
上記化学式５のポリマーは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−グリシジルメタクリル酸−乳酸）類である。化学式５において、Ｒ１とＲ２及びＲ５はそれぞれ独立にアルキル基、好ましくは炭素数１〜４程度の直鎖状のアルキル基、より好ましくはメチル基を表す。Ｒ３とＲ４はそれぞれ独立に水素又はメチル基、好ましくは水素を表す。また、ｘ／ｙは９５／５〜８０／２０である。Ｒ１とＲ２及びＲ５をメチル基とし、Ｒ３とＲ４を水素としたポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイル−アミン）は「ｐＮＩＰ−ＧＭＡ−乳酸」で表す。
【００５２】
【化７】
【００５３】
上記化学式６のポリマーは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−（メタ）アクリル酸）類である。化学式６において、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立にアルキル基、好ましくは炭素数１〜４程度の直鎖状のアルキル基、より好ましくはメチル基を表す。Ｒ４は水素又はメチル基を表す。また、ｘ／ｙは９５／５〜７０／３０であり、好ましくは９０／１０〜８５／１５の範囲である。Ｒ１とＲ２をメチル基とし、Ｒ４をメチル基としたポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−メタクリル酸）は「ｐＮＩＰ−ＭＡ」で表す。
【００５４】
なお、この化学式６で表されるポリマーのように、カルボキシル基等のアニオン基を含む熱応答性高分子は、前述の特許文献１に記載の金ナノクラスターと熱応答性高分子との混合溶液から金ナノ粒子を調製するという製法には用いることができない。
【００５５】
また、熱応答性高分子ではないポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やポリアクリルアミドは、金ナノ粒子を製造できない。
【００５６】
上記化学式１〜６のポリマーの分子量は、重量平均分子量で８０００以上１０００００以下のものを用いることができ、１００００以上２００００以下のものが好ましい。また、各ポリマーは、通常それぞれ単独で用いられるが、２以上を併せて用いてもよい。また、本発明の趣旨の範囲内であれば、上記化学式１〜６のポリマーと同様の効果を奏する他の熱応答性高分子、例えば、ポリ（メチルビニルエーテル）、ヒドロキシプロピルセルロース等を用いてもよい。
【００５７】
上記化学式１〜６のポリマーは、後述する実験例に示す方法で合成することができる。例えば、化学式１のポリマーは、モノマー成分であるＮ−イソプロピルアクリルアミド類を水に溶解し、重合開始剤と重合促進剤を加えて重合し、生成物を精製し、その後凍結乾燥して得ることができる。また、化学式２〜６のポリマーも、重合させるモノマー成分を溶媒に溶解し、重合開始剤と重合促進剤を加えて重合し、生成物を精製し、その後凍結乾燥して各ポリマーを得ることができる。
【００５８】
特に限定されるものではないが、上記化学式１〜６のポリマーうち、化学式２のｐＮＩＰ−ＡＣ、好ましくは、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＤＥＴＡ）、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＴＥＴＡ））、特に好ましくは、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＤＥＴＡ）である。ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＤＥＴＡ）は、チオール類存在下における熱刺激による、金ナノ粒子に吸着していた薬剤の放出特性に優れ、チオール類不在下における熱刺激の状態又はチオール存在下の熱刺激のない状態においては、安定に薬剤を保持している特性を発揮することから、特に好ましいものである。
【００５９】
なお、熱応答性高分子が、上記化学式２で表されるポリマーのうち、右側の側鎖のエチレンイミン鎖の繰り返し単位の数が大きいもの、具体的には、ｎ＝３のｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＴＥＴＡ）よりもエチレンイミンユニットが多いものである場合には、ＮＨ基やＮＨ２基が多く、熱刺激によって熱応答性高分子が熱収縮した際、そうした基が金ナノ粒子に吸着し、金ナノ粒子に吸着していた薬剤分子と置き換わることが生じると考えられるため、チオール類の不在下によっても、熱刺激によりある程度の薬剤が放出されるが、チオール類の存在下における熱刺激の場合と比較すると、放出の程度は有意に異なり、かつその放出の程度は後述する実施例において示すように、実験に用いた熱応答性高分子のうち最も高いものであったことから、好ましい熱応答性高分子として例示できるものである。
【００６０】
（薬剤）
金ナノ粒子が吸着する薬剤としては、チオール類存在下における熱刺激によって、金ナノ複合体より良好に放出される一方、チオール類不在下における熱刺激の状態又はチオール存在下の熱刺激のない状態においては、安定に金ナノ複合体に保持され得るものであれば、特に制限なく各種のものを用いることができる。
【００６１】
薬剤としては、担持又は付着されない状態において、特有の機能、例えば生理活性、薬物活性、触媒活性や光学分割性、抗酸化活性、界面活性、香料、又は、光学活性等の機能を有するものとして考慮される。中でも、生理活性物質又は医薬化合物が代表的なものとして例示される。
【００６２】
生理活性物質又は医薬化合物としては、例えば、Goodman and Gilman’s “The Pharmacological of Basis of Therapeutics”の最新版、又はThe Merck Indexの最新版等に示された各種の薬剤類が挙げられる。例えば、中枢神経系に作用する薬剤；末梢シナプスに作用する薬剤；炎症応答に影響を及ぼす薬剤；体液の組成に影響を及ぼす薬剤；腎臓機能及び電解質代謝に影響を及ぼす薬剤；心臓血管剤、胃腸管機能に影響を及ぼす薬剤；子宮運動性に影響を及ぼす薬剤；寄生中感染症のための化学療法剤、微生物病のための化学療法剤；抗腫瘍性ないし抗癌剤；免疫抑制剤、血液及び血液形成器官に影響を及ぼす薬剤；ホルモン及びホルモンアンタゴニスト；皮膚剤；重金属アンタゴニスト、ビタミン及び栄養素、ワクチン、オリゴヌクレオチド及び遺伝子治療薬等が挙げられる。また、アミン系の薬剤、例えば塩酸アミトリプチリン、塩酸イミプラミン、塩酸クロミプラミン、マレイン酸トリミプラミン、塩酸ノルトリプチリン、アモキサピン、塩酸ドスレピン、塩酸ロフェプラミン）等を挙げることもできる。また、シスプラチン等の錯体系の薬剤であってもよい。
【００６３】
また、光学特性の機能を有する薬剤として代表的な、蛍光物質としては、ナイルレッド等が好ましく例示できる。
【００６４】
本発明に係る金ナノ複合体において、金ナノ粒子が吸着する薬剤は、後述するようなチオール類の存在下において、金ナノ粒子に対しチオール類が強い吸着性を示すために置換され、金ナノ粒子から遊離するものと考えられる。金ナノ粒子に対して、チオール化合物よりも強い吸着性を有する薬剤であると、チオール類存在下における熱刺激によっても、金ナノ複合体より放出されにくいものとなる。このため、使用するチオール類の種類によっても左右されるが、概して、金ナノ粒子に対してある程度の吸着性を示す一方で、チオール類の吸着性よりも低い吸着性を発揮する化合物が用いられる。こうした化合物としては、特にチオール化合物の有するチオール基よりも、金ナノ粒子表面に対し弱い相互作用を示す官能基ないし骨格構造を有する、例えばエチル基やメチル基のようなアルキル基、フェニル基、水酸基、カルボキシル基、アミノ基等を適度に有する化合物等が用いられる。
【００６５】
また、金ナノ粒子に対して、いわゆる保護コロイドを形成するような高分子化合物、つまり１分子が多数の点で金ナノ粒子表面に吸着（多点吸着）する高分子化合物等は、チオール類の添加によっても脱着が生じにくいと考えられる。そのため、本発明に係るナノ複合体に使用する薬剤としては、概して適当ではないものが多い。
【００６６】
［金ナノ複合体の製造方法１］
本発明に係る金ナノ複合体は、基本的には、金ナノ粒子のコロイド溶液に対し、薬剤水溶液、熱応答性高分子溶液の順に添加し、金ナノ粒子に対して先に薬剤を吸着させてから、熱応答性高分子を被覆することによって製造することができる。
【００６７】
なお、上記とは異なり、金ナノ粒子のコロイド溶液に対し、先に熱応答性高分子溶液を添加した後、薬剤水溶液を添加する順序で金ナノ複合体を調製すると、金ナノ粒子に先に熱応答性高分子を被覆されてしまう。このことから、得られる金ナノ複合体において、薬剤分子は金ナノ粒子にはあまり直接吸着せず、金ナノ粒子を被覆している熱応答性高分子に取り込まれている状態になっていることが推測される。本発明者が確認したところによれば、この場合、後述するようなチオール類等の分子スイッチの添加有無ないしは添加する有機化合物分子のチオール基含有の有無にかかわらず、熱刺激によって薬剤分子の放出が見られる。このことから、本発明に係る金ナノ複合体の製造方法としては、上記したように、金ナノ粒子のコロイド溶液に対し、先に薬剤水溶液を接触させることが肝要であると考えられる。
【００６８】
使用する熱応答性高分子は、通常、１種の熱応答性高分子であるが、金ナノ複合体を製造することが可能であれば２種以上の熱応答性高分子であってもよい。また、金ナノ複合体を製造する際の、混合溶液のｐＨは含有させる薬剤及び熱応答性高分子の種類にもよるが、通常、２．９〜１０．０の範囲であることが好ましい。
【００６９】
混合溶液には、金ナノ粒子が０．００１８〜０．００９０質量％の範囲で含まれることが好ましく、熱応答性高分子は、使用する熱応答性高分子の種類によっても左右されるが０．２５〜２．０質量％の範囲で含まれることが好ましい。また、薬剤の濃度としては、使用する薬剤の種類によっても左右されるが、例えば、金１ｇに対し、０．２〜２０×１０-５Ｍ程度の濃度とすることができる。この程度の薬剤濃度であれば、添加した薬剤を効率よく金ナノ粒子に吸着させることができ、かつ後述するようなチオール類存在下における熱刺激による薬剤放出の作用機序に薬剤の濃度依存性による影響を及ぼすこともない。
【００７０】
［金ナノ複合体の製造方法２］
本発明に係る金ナノ複合体の製造方法としては、特許文献１に記載の製造方法を応用したものを例示することが可能である。
【００７１】
すなわち、金ナノ複合体は、上記した金ナノクラスターの溶液に、薬剤水溶液、熱応答性高分子（カルボキシル基等のアニオン基を含む熱応答性高分子を除く。）溶液を順に添加し、調製された混合溶液を加熱し、冷却することによって、金ナノ複合体が製造される。
【００７２】
混合溶液には、金ナノクラスターが０．００１８〜０．００９０質量％の範囲で含まれることが好ましく、熱応答性高分子が０．２５〜２．０質量％の範囲で含まれることが好ましい。また、金ナノクラスターと熱応答性高分子を質量比で表すと、金ナノクラスター／熱応答性高分子の質量比が９／１００００〜３６／１０００の範囲であることが好ましい。また、薬剤の濃度としては、使用する薬剤の種類によっても左右されるが、例えば、金１ｇに対し、０．２〜２０×１０-５Ｍ程度の濃度とすることができる。この程度の薬剤濃度であれば、添加した薬剤を効率よく金ナノ粒子に吸着させることができ、かつ後述するようなチオール類存在下における熱刺激による薬剤放出の作用機序に薬剤の濃度依存性による影響を及ぼすこともない。
【００７３】
混合溶液に含有させる熱応答性高分子は、通常、１種の熱応答性高分子であるが、金ナノ粒子を製造することが可能であれば２種以上の熱応答性高分子であってもよい。また、混合溶液のｐＨは含有させる熱応答性高分子の種類にもよるが、通常、２．９〜１０．０の範囲であることが好ましい。
【００７４】
金ナノ複合体は、調製された金ナノ複合体の製造用溶液（混合溶液）を加熱し、冷却することによって製造される。加熱は、熱応答性高分子に相転移を起こさせ、金ナノクラスターを融合させる操作である。加熱温度は、４０〜９５℃、好ましくは７０〜９５℃である。温度が高いほど大きな粒径の金ナノ粒子を得ることができる。加熱時間は、３０分〜２時間が好ましい。なお、加熱時間が長くなると大きな粒子の個数が増えて平均粒径が見かけ上大きくなる。しかし、粒子が成長して大きい粒子になるわけではない。また、吸光度の変化は、３０分以上ではあまり変わらない。
【００７５】
冷却は、加熱されて熱応答性高分子が析出し濁った溶液を、再度透明にする操作である。冷却温度は、０〜３０℃、好ましくは４〜１０℃である。冷却温度が低くなるほど早く溶液は透明となる。冷却時間は、３０分以上で十分であり、上限は特に限定されない（１時間又は２時間程度）。
【００７６】
こうした加熱冷却手段により、混合溶液から金ナノ複合体を製造することができる。製造された金ナノ粒子は、ＴＥＭ像から計測できる粒径が５０〜１００ｎｍの範囲であり、動的光散乱法での測定で粒径１００〜５００ｎｍにピークを示す。なお、ＴＥＭ像からの計測は、ＴＥＭ写真を撮影し、その写真から計測したものである。一方、動的光散乱法による粒径の測定は、動的光散乱測定装置で測定されたものである。
【００７７】
［金ナノ複合体からの薬剤放出］
本発明に係る金ナノ複合体からの吸着薬剤分子の放出は、後述するようなグルタチオン等チオール類又はシスチンを添加し、熱刺激（加熱→冷却）を行うことによってなされる。
【００７８】
図１は、金ナノ複合体からの薬剤放出のメカニズムを示す模式図である。すなわち、図１に示すように、金ナノ粒子表面に薬剤分子を吸着させ、熱応答性高分子を被覆してなる金ナノ複合体に対して、チオール類等の分子スイッチとなる有機化合物を添加すると、当該有機化合物分子により、金ナノ粒子表面で吸着分子の置換が起こるものの、薬剤は熱応答性高分子に覆われている金ナノ複合体の中に留まる。この状態で熱刺激（加熱→冷却）を加えると熱応答性高分子が相移転を起こし一旦収縮することで、金ナノ複合体から遊離し放出されというものである。
【００７９】
（チオール類）
次に、上記したような本発明に係る金ナノ複合体からの薬剤放出のために用いられるチオール類について説明する。
【００８０】
金ナノ複合体へのチオール類の吸着によって、金ナノ粒子に吸着した薬剤分子が金ナノ粒子から脱離する。すなわち、凝集状態の金ナノ粒子複合体にチオール基を有するチオール類を加えると、金ナノ粒子の表面で、薬剤分子の官能基等と交換して、金ナノ粒子表面に対し強い結合性を有するチオール基が配位しチオール類が吸着する。
【００８１】
チオール類の添加により、上記のような薬剤分子の脱離を効果的に生じさせるチオール類としては、（１）チオール基の存在、（２）分子サイズ及び構造、（３）カルボキシル基やアミノ基間の水素結合の存在といった要素が必要であると考えられる。
【００８２】
（１）のチオール基は、金ナノ粒子の表面に吸着し、薬剤分子の官能基等との交換反応を起こすと考えられる。酸化型グルタチオンのようなジスルフィド結合を有する化合物、メチオニンのようなスルフィド結合を有する化合物では、チオール基を有する化合物とは異なり、薬剤分子の官能基等との交換反応は生じないように思われる。但し、本発明者の行った実験によれば、ジスルフィド結合を有する化合物であっても、シスチン（システインの２量体）の場合、当該化合物添加後に熱刺激を与えると、薬剤分子の高い放出効果が発揮されることが観察でき、例外的にシスチンは、本発明に係る金ナノ複合体に対し効果的に作用する化合物であるといえる。
【００８３】
（２）の分子サイズ及び構造については、チオール類の金ナノ粒子表面への吸着による薬剤分子との置き換え反応が、概してチオール類が低分子量となる程速く生じるものと思われる。例えば、グルタチオンのように分子サイズが大きいと金ナノ粒子の保護効果が大きいものの、金ナノ複合体の表面に吸着した薬剤分子や熱応答性高分子との置換が遅い。Ｌ−システイン（Ｌ−Ｃｙｓ）、ホモシステイン（Ｈｃｙｓ）等の低分子量のカルボキシル基を有するチオール基含有化合物では金ナノ粒子の保護効果はほとんどなく、反応は速い。グルタチオンとＬ−システインの中間のサイズにあるシステイニルグリシン、グルタミルシステイン等は、金ナノ粒子の保護効果を有し、薬剤分子や熱応答性高分子との置換の反応速度も比較的速いと考えられる。
【００８４】
このため、Ｌ−システイン、Ｈｃｙｓ等の低分子量チオール基含有化合物を用いた場合、当該化合物を添加したのみで、金ナノ複合体からかなりの量の薬剤が放出され、熱刺激によって薬剤を放出するという本発明に係る金ナノ複合体の起動作用が有効に働かないおそれが高い。このような化合物は分子サイズが小さいので、これを添加すると、熱刺激（加熱→冷却）による金ナノ粒子の再分散を阻害する為に薬剤分子の遊離が十分ではなくなり、熱刺激後において遊離薬剤分子量が低下するものと思われる。
【００８５】
システイニルグリシン、グルタミルシステイン等の場合においても、このような傾向はある程度見られるものの、熱刺激を受けた後において金ナノ粒子の再分散が促進され、薬剤放出は、熱刺激を与える前よりも高い割合で生じるため、好ましい化合物といえる。グルタチオンの場合には、当該化合物を添加したのみでは、最も薬剤放出の程度が低く、かつ熱刺激を受けた後における薬剤放出の割合が極めて高いものとなるために、特に好ましい化合物といえる。
【００８６】
（３）カルボキシル基の静電反発については、チオール基含有化合物の酸解離したカルボキシル基の静電反発が大きく関与すると考えられる。グルタチオンの二つのカルボキシル基のｐＫａはｐＫａ１＝２．１６及びｐＫａ２＝３．５５であり、主に検討している熱応答性高分子濃度０．２質量％における複合体溶液のｐＨが約８であるため、カルボキシル基はＣＯＯ−となっている。その一方、ＮＨ基、ＮＨ２基は一部水素イオンが付加して正に帯電している。はじめに金ナノ粒子はクエン酸によりアニオン性の状態であり、静電反発により分散している。この状態にＮＨ基、ＮＨ２基を有するポリマーを添加することにより、金ナノ粒子表面の電荷が部分的に打ち消されるとともに、ＮＨ基、ＮＨ２基が金に吸着して、金ナノ粒子が凝集する。このとき、金ナノ粒子は、ポリマーで被覆され、凝集した粒子間にポリマーが入りこんだ状態になっている。この状態の金ナノ粒子にチオール基含有化合物であるグルタチオン等を添加すると、チオール基とＮＨ基、ＮＨ２基とが交換し、チオール基含有化合物が金ナノ粒子の表面に結合する。このとき、金ナノ粒子の表面では官能基が非常に込み合っている状態となっているが、チオール基含有化合物や熱応答性高分子の極性基（官能基）がランダムな状態で存在することはエネルギー的に不利になる。極性基（官能基）が水素結合により配列することで、エネルギー的に不利な状態が解消される。結果として、金ナノ粒子間の距離を広がることになるものと考えられる。
【００８７】
以上のチオール基の存在、分子サイズや構造、チオール基含有化合物のカルボキシル基の存在、ＮＨ基、ＮＨ２基を有するポリマーによる非共有結合的な保護効果が金ナノ粒子の再分散に影響するほかに、チオール基含有化合物の他の官能基の電荷や溶液中に存在する化合物の構造や各官能基の電荷等が、全体として金ナノ粒子の再分散に影響していると考えられる。
【００８８】
以上の点から、本発明に係る金ナノ複合体による薬剤放出の分子スイッチとして用いられるチオール類としては、特に限定されるものではないが、グルタチオン（ＧＳＨ）、システイニルグリシン（Ｃｙｓ−Ｇｌｙ）、グルタミン酸システイン（Ｇｌｕ−Ｃｙｓ）等が好ましいものとして例示でき、このうち特に好ましくは、グルタチオンである。また、前記したように薬剤放出の分子スイッチとしてシスチンも好ましい化合物として例示できる。
【００８９】
また、このような薬剤放出の分子スイッチとして用いられるチオール類の添加濃度としては、一般的にチオール類の添加濃度が高い程、熱刺激を与えた後に放出される薬剤量が多くなる傾向があるが、一方で添加濃度が高くなる程、熱刺激を与えない状態において放出される薬剤量も多くなる傾向がある。また、ある程度以上の添加濃度とならないと、熱刺激前後における放出薬剤量の有意差が生じない。このため使用するチオール類の種類によっても左右されるため、一概には規定できないが、例えば、グルタチオンを使用する場合には、その濃度が４〜１０×１０−６Ｍ程度とすることが望ましい。
【００９０】
なお、グルタチオン等の好ましいチオール類を薬剤放出の分子スイッチとして用いる場合、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｈｃｙｓ、グリシン、グルタミン酸等の共存物質が存在していても、当該グルタチオン（分子スイッチ）の添加後、熱刺激によって薬剤を放出するという本発明に係る金ナノ複合体の起動作用が有効に機能する。このことは、生体内においては、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｈｃｙｓ、グリシン、グルタミン酸等のアミノ酸、ペプチド等の存在が当然に想定されることから、本発明に係る金ナノ複合体を用いたドラッグデリバリーシステムが生体内において有効に機能するものであると思われる。
【００９１】
（熱刺激）
本発明に係る金ナノ複合体に対し、分子スイッチであるチオール類の添加後、加熱し、冷却することによって、金ナノ複合体よりの薬剤放出が行われる。加熱は、熱応答性高分子に相転移を起こさせる操作である。加熱温度は、４０〜９５℃、好ましくは７０〜９５℃である。加熱時間は、３０分〜２時間が好ましい。蛍光強度から見積もった薬物放出量の変化は、３０分以上ではあまり変わらない。
【００９２】
冷却は、加熱されて相転移を起こし収縮した熱応答性高分子を、再度分散させ金ナノ複合体からの薬剤の放出を行わせる操作である。冷却温度は、０〜３０℃、好ましくは４〜１０℃である。冷却時間は、３０分以上で十分であり、上限は特に限定されない（１時間又は２時間程度）。
【００９３】
金ナノ複合体が分子スイッチ添加及び熱刺激により吸着薬剤分子を放出する現象は、一般的なｐＨ環境であるｐＨ５〜９の範囲内においては、ｐＨ値にあまり依存することなく、ほぼ均一に生じ、熱刺激前において吸着薬剤分子は実質的に放出されないか又はごく微量の放出に留まり、熱刺激後において大きな放出が生じる。より望ましくは、ｐＨ５〜７．５程度の弱酸性ないし中性領域での使用が、熱刺激前の吸着薬剤分子の放出量を抑制しかつ熱刺激後において大きな放出を生じさせる上で好ましい。
【００９４】
（ドラッグデリバリーシステム）
本発明に係る金ナノ複合体に対して、上記したようにチオール類又はシスチンの存在下で熱刺激を与えることで、吸着していた薬剤を放出することができることから、ねらった部位で薬物を的確に放出できるドラッグデリバリーシステムにおいて好適に用いられる。
【００９５】
金ナノ複合体の生体内投与経路としては、特に限定されるものではなく、担持させる薬剤の種類及び薬剤を投与しようとする生体部位ないし組織に応じて、経口、経鼻、経膣、静脈内、皮下、腹腔内等の適当な投与経路を通して生体内に導入することが可能である。
【００９６】
生体内においては、金ナノ複合体の分子スイッチであるチオール類、例えば、分子スイッチとして好適なグルタチオン、システイニルグリシン、グルタミン酸システイン等が本来存在しており、このようなグルタチオン等の濃度が高い生体部位ないし組織をターゲットとする薬剤投与の場合には、系外より別途チオール類を投与せずとも、熱刺激を与えることによって、本発明に係る金ナノ複合体を用いたドラッグデリバリーシステム薬剤を、ターゲット部位において的確に発動させることができる。もちろん、必要に応じて、このような分子スイッチとしてチオール類は、外部より生体内のターゲット部位ないし組織に導入することが可能である。
【００９７】
生体に対し熱刺激（加熱）を行う手段としては、特に限定されるものではなく各種の手法を用いることが可能であるが、例えば、二方向（代表的には直交方向）からの遠赤外レーザー加熱を行えば、ターゲット部位を局所的に加熱することが可能である。
【００９８】
（蛍光センサー）
本発明に係る金ナノ複合体に担持させる薬剤として、蛍光物質、例えば、上記したようなナイルレッド等を用いた場合、再現性の良いナノ蛍光センサーとして用いることがきる。
【００９９】
ナノ粒子蛍光センサー溶液に、チオール化合物であるグルタチオン等の分析対象物質を添加し、熱刺激を加えると、熱応答性高分子の相転移に伴って蛍光物質が金ナノ複合体から遊離する。この結果、金ナノ複合体による蛍光共鳴エネルギー移動(以下FRET)が解消し、蛍光強度が回復する。回復した蛍光強度は添加する分析対象物質の濃度に比例するので、分析対象物質を定量できる。熱刺激を加えないと、蛍光物質が金ナノ複合体から遊離が実質的生じないため、分析対象物質の添加により遊離した蛍光物質が凝集することがなく、再現性良く定量分析が可能である。
【実施例】
【０１００】
以下の実験によって、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例によって何ら限定されるものではない。特に、以下の実施例においては、吸着薬剤の放出の程度の確認を容易とするために、蛍光物質であるナイルレッドを吸着薬剤として使用した例を中心として記載するが、吸着薬剤としては何らこのような蛍光物質に限定されるものではなく、上述したような各種の薬剤が使用可能であることと、このような各種の薬剤においても以下の実施例に示す蛍光物質の場合と同様の有効な薬剤放出現象が生じることは、当業者であれば容易に理解できるものであると思われる。
【０１０１】
［装置及び試薬］
まず、本実施例において用いられた装置及び試薬としては、以下の通りであった。吸収スペクトルの測定には、光路長１ｃｍプラスチックセルを装備した日本分光製Ｖ−５６０型 紫外可視分光光度計を使用した。蛍光スペクトル測定には、光路長１ｃｍ石英セルを装備した日本分光製ＦＰ−６３００型分光蛍光光度計を使用した。
【０１０２】
合成した熱応答性高分子の限外濾過には、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製の限外濾過膜を（排除限界分子量：５０００）を装備したアドバンテック製のプラスチック製ウルトラフィルター用限外濾過器ＭＯＤＥＬ−ＵＨＰ−Ｋを使用した。合成した熱応答性高分子の凍結乾燥には、アルバック機工製のＯＭＴ−０５０Ａ型オイルミストトラップを備え付けたアルバック機工製の直結型油回転真空ポンプ、東京理科器械製のＵＴ−１０００型ユニトラップ、及び東京理科器械製のＣＭＷ−１型水分トラップを装備した東京理科器械製のＦＤ−５Ｎ型凍結乾燥機を使用した。ｐＨの測定には、ＨＯＲＩＢＡ製ｐＨ−ＭＥＴＥＲ Ｆ−１３を使用した。
【０１０３】
α,α’‐アゾビスイソブチロニトリル(AIBN、Fw：164.21)、水酸化カリウム(Fw：56.11)、水酸化ナトリウム(Fw：40.00)、ジエチルエーテル(Fw：74.12)、1,4‐ジオキサン(Fw：88.1)、ペルオキソ二硫酸カリウム(Fw：270.32)、ジエチレントリアミン(DETA、Fw：103.17)は関東化学製特級のものを使用した。ピロガロール(Fw：126.11)は関東化学製1級のものを使用した。メタクリル酸(MA、Fw：86.09)は関東化学製1級のものを凍結法により重合禁止剤を除去してから使用した。トリエチレンテトラミン(TETA、Fw：146.24)は関東化学製ものを使用した。N‐イソプロピルアクリルアミド(NIPAAm、Fw：113.16)は和光純薬製特級を関東化学製特級のヘキサン(Fw：86.18)を用いて再結晶してから使用した。N,N,N’,N’−テトラメチルエチレンジアミン(TEMED、Fw：116.21)は和光純薬特級を使用した。塩化アクリロイル(AC、Fw：90.51)は和光純薬1級を用いた。テトラクロロ金酸四水和物(Fw：411.85)、クエン酸三ナトリウム二水和物(Fw：294.1)、アセトン(Fw：58.08)は関東化学製特級のものを使用した。Nile Red(NR、Fw：318.57)は東京化成製1級のものを使用した。グリシン(Gly、Fw：75.07)、グルタミン酸(Fw：147.03)、L‐システイン(L-Cys、Fw：121.16)、1-ブタンチオール(Fw：90.19)、1-オクタンチオール(Fw：146.29)、2-メルカプトエタノール(Fw：78.13)、2,3-ジメルカプト-1-プロパノール (Fw：124.23)は関東化学製特級のものを、還元型グルタチオン(GSH、Fw：307.32)、3-メルカプト-1,2-プロパンジオール(Fw：108.16)は関東化学製1級のものを使用した。3-メルカプトプロピオン酸 (3-MPA、Fw：106.14)、1,2-エタンジチオール(Fw：94.2)は東京化成製特級のものを、酸化型グルタチオン(GSSG、Fw：612.63)、n-ドデシルメルカプタン(Fw：202.4)、3-メルカプトプロピオン酸エチル (Fw：134.2)は東京化成製1級のものをシスタミン硫酸塩(Fw：250.36)、Ｈｃｙｓ(Fw：135.19)は東京化成製のものを使用した。グルタミルシステイン(Glu-Cys、Fw：250.27)、システイニルグリシン(Cys-Gly、Fw：178.2)、ＤＬ−ペニシラミン(Fw：149.2)はSigma製ものを使用した。
【０１０４】
実験における水は、蒸留、イオン交換した後、Ｍｉｌｌｐｏｒｅ製のＭｉｌｌｉ−Ｑ超純水製造システムで製造したものを使用した。メタノール（Ｆｗ：３２．０４）は関東化学製特級のものを蒸留してから使用した。
【０１０５】
［合成例１（金ナノ粒子の調製）］
金ナノ粒子溶液の調製は、クエン酸ナトリウム還元法により行った。使用した器具は、全て王水に３０分間浸漬後、超純水で洗浄し、乾燥させたものを用いた。調製手順を以下に示す。５００ｍＬ丸底フラスコに１ｍＭテトラクロロ金酸塩水溶液、２５０ｍＬを入れ、激しく攪拌しながら、沸騰直前まで加熱した。沸騰させたまま３８．８ｍＭクエン酸三ナトリウム水溶液、２５ｍＬを添加し、溶液の色が淡黄色から深赤色へと変化することを確認した。さらに攪拌しながら１０分間加熱させた後、室温において１５分間攪拌し続けた。溶液を孔径１μｍメンブランフィルターを用いて吸引ろ過を行い、金ナノ粒子溶液をガラス試薬瓶に移し、冷暗所（４℃）に保管した（０．１８ｇ−Ａｕ／Ｌ金コロイド溶液）。
【０１０６】
［合成例２（化学式１／Ｐ−ＮＩＰの合成）］
５００ｍＬ三つ口セパラブルフラスコにＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）３０ｇを採り、水１００ｍＬで溶解した。氷浴を用いてフラスコを０℃に保ち、攪拌しながら、重合開始剤としてペルオキソ二硫酸カリウム１．０ｇ及び重合促進剤としてＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）１．５ｍＬを添加し、４時間重合した。合成したＰ−ＮＩＰの構造式は、上記化学式１のＲ１とＲ２をメチル基としＲ３を水素原子としたものである。重合終了後、メタノール１００ｍＬを加えて沈殿したポリマーを取り出し、メタノール１００ｍＬに溶解した。この溶液に、水１００ｍＬを加え、沈殿したポリマー取り出して水１００ｍＬに溶解した。この操作を二回繰り返し行い、精製したＰ−ＮＩＰを水に溶解し、凍結乾燥を行った。さらに、得られたポリマーを水に溶解して凍結乾燥を行い、冷暗所に保存した。この熱応答性高分子の下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）は３４．１℃であった。
【０１０７】
［合成例３（化学式２／ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルトリエチレンテトラミン）の合成）］
トリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ）をモノマーとして用いる場合、あらかじめビニル基を導入する必要がある。そこでまずＴＥＴＡと塩化アクリロイル（ＡＣ）よりアクリロイルトリエチレンテトラミン［以下、ＡＣ−ＴＥＴＡ］の合成を行った。ＴＥＴＡ２９．７３ｍＬ（０．２ｍｏｌ）と１，４−ジオキサン２００ｍＬの混合溶液に、ＡＣ１．６２５ｍＬ（０．０２ｍｏｌ）と１，４−ジオキサン５０ｍＬの混合溶液を冷却、攪拌しながら一滴ずつ滴下して反応させた。滴下終了後、白色の沈殿を濾別し少量のメタノールに溶解した。これに水酸化カリウム−メタノール溶液（水酸化カリウム １．１８ｇ（０．０２ｍｏｌ））を含む１００ｍＬを加えて攪拌、濾別し得られた濾液をＮＩＰＡＡｍとの共重合に用いた。
【０１０８】
５００ｍＬ三つ口セパラブルフラスコにモノマーの供給比（ＮＩＰＡＡｍの物質量：ＴＥＴＡの物質量）がモル比で９０：１０（ｍｏｌ％）となるようにＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）２０．３７ｇ（０．１８ｍｏｌ）とＡＣ−ＴＥＴＡを含むメタノール溶液を加えた。オイルバスを用いてフラスコを６０℃に加温、攪拌しながら、重合促進剤として３−メルカプトプロピオン酸（３−ＭＰＡ）（メタノール２０ｍＬに対して０．１ｍＬ）及び重合開始剤としてα，α’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）０．８２１１ｇ（０．００５ｍｏｌ）を添加して、５ｗ／ｖ％ ピロガロール−１０ｗ／ｖ％アルカリ溶液（アルカリ：ＮａＯＨ）１００ｍＬを用いた脱酸素ラインに通気した窒素雰囲気下で４時間重合を行った。
【０１０９】
得られたポリマーは以下の手順で精製した。まず、得られた重合反応物をエバポレーターにてポリマーの溶解液に含まれるメタノールを除去した後に、冷ジエチルエーテル１．０Ｌに注いだ。この上澄み液をデカンテーションして取り除き、メタノールで再度溶解した。この工程を２回繰り返した後、デカンテーション後に得られた沈殿物に水を加えて３００ｍＬとした。この溶液を分子量５０００の限外濾過膜を用いて透析を６回行い、未反応モノマーを除去した。その後、得られたポリマー溶液に凍結乾燥を行い冷暗所で保存した。合成したポリ(Ｎ−イソプロピルアクリルアミド-co-アクリロイルトリエチレンテトラミン)［以下、ＮＩＰ−ＴＥＴＡ］の構造式は、上記化学式２のＲ１とＲ２をメチル基としＲ３とＲ４を水素原子、ｎを２としたものである。得られたＮＩＰ−ＴＥＴＡの下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）は３８．３℃であった。
【０１１０】
［合成例４（化学式２／ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルジトリエチレンテトラミン）の合成）］
ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）をモノマーとして用いる場合、ＤＥＴＡにビニル基を導入する必要がある。そこで、まずＤＥＴＡと塩化アクリロイル（ＡＣ）よりアクリロイルジエチレントリアミン［以下、ＡＣ−ＤＥＴＡ］の合成を以下の手順で行った。ＤＥＴＡを含む１，４−ジオキサンの混合溶液（２０．６３ｇ／２００ｍＬ）に、ＡＣと１，４−ジオキサンの混合溶液（１．６２５ｍＬ／５０ｍＬ）を冷却、攪拌しながら一滴ずつ滴下して反応させた（ＤＥＴＡの物質量：ＡＣの物質量＝１０：１）。滴下終了後、白色の沈殿を濾別し、少量のメタノールに溶解した。これにＫＯＨ−メタノール溶液を加えて攪拌、濾別し、得られた濾液をＮＩＰＡＡｍとの共重合に用いた。
【０１１１】
５００ｍＬ三つ口セパラブルフラスコにモノマーの供給比（ＮＩＰＡＡｍの物質量：ＤＥＴＡの物質量）がモル比で９０：１０（ｍｏｌ％）となるようにＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）とＡＣ−ＤＥＴＡを含むメタノール溶液を加えた。重合促進剤として３−メルカプトプロピオン酸（３−ＭＰＡ）（メタノール２０ｍＬに対して０．１ｍＬ）を、重合開始剤としてα，α’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）０．３２８４ｇ（０．００５ｍｏｌ）を添加した。油浴中においてフラスコ内の溶液を攪拌しながら脱酸素ライン（５ｗ／ｖ％ピロガロール−１０ｗ／ｖ％ＮａＯＨ溶液１００ｍＬ）に通気した窒素をフラスコ内に通気し、窒素雰囲気下で３０分間脱酸素を行った。その後、窒素を通気しながら、６０℃に加温し、窒素雰囲気下で４時間重合を行った。得られたポリマーは以下の手順で精製した。まず、得られた重合反応物をエバポレーターにてポリマーの溶解液に含まれるメタノールを可能な限り除去した後に、冷ジエチルエーテル１．０Ｌに注いだ。この上澄み液をデカンテーションして取り除き、メタノールで再度溶解した。この工程を２回繰り返した後、デカンテーション後に得られた沈殿物に水を加えて３００ｍＬとした。この溶液を分子量５０００の限外濾過膜を用いて透析を６回行い、未反応ポリマーを除去した。その後、得られたポリマー溶液に凍結乾燥を行い冷暗所で保存した。合成したポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルジトリエチレンテトラミン）［以下、ＮＩＰ−ＤＥＴＡ］の構造式は、上記化学式２のＲ１とＲ２をメチル基としＲ３とＲ４を水素原子、ｎを１としたものである。得られたＮＩＰ−ＤＥＴＡの下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）は３８．４℃であった。
【０１１２】
［合成例５（化学式６／ｐＮＩＰ−ＭＡの合成）］
５００ｍＬ三つ口セパラブルフラスコに、モノマーの供給比（ＮＩＰＡＡｍの物質量：ＭＡの物質量）をモル比で（９０：１０）（ｍｏｌ％）となるようにＮＩＰＡＡｍ２０．３７ｇ（０．１８ｍｏｌ）とメタクリル酸（ＭＡ）１．７２ｇ（０．０２ｍｏｌ）を入れた。ＮＩＰＡＡｍとＭＡの含量が両者の和として３０質量％となるようにメタノール６５．２ｍＬを添加してモノマーを溶解した。オイルバスを用いてフラスコを６０℃に加温し、攪拌しながら、重合促進剤として３−ＭＰＡ（メタノール２０ｍＬに対して０．１ｍＬ）を、重合開始剤としてＡＩＢＮ０．８２１１ｇ（０．００５ｍｏｌ）を添加して、脱酸素ライン（５ｗ／ｖ％ピロガロール−１０ｗ／ｖ％水酸化ナトリウム溶液１００ｍＬ）に通気した窒素をフラスコ内に通気し、窒素雰囲気下で４時間重合を行った。重合終了後、生成物を含むメタノール溶液を室温まで冷却する。メタノール１００ｍＬに対して２Ｌの冷ジエチルエーテルを用い、生成物を含むメタノール溶液を冷ジエチルエーテルに１滴ずつゆっくり滴下し、攪拌する。これにより析出したガム状の生成物を回収し、再びメタノール約５０ｍＬに溶解する。この精製を２回行った後、得られたポリマーを水に溶解し、溶液を凍結させた。溶液が完全に凍結した後、凍結乾燥を行い、冷暗所に保存した。合成したｐＮＩＰ−ＭＡの構造式は上記化学式６のＲ１とＲ２をメチル基としＲ３とＲ４を水素原子としたものである。得られたｐＮＩＰ−ＭＡの下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）は３５．７℃であった。
【０１１３】
［参考例１（蛍光物質の特性）］
本発明に係る金ナノ複合体の薬剤放出特性を評価するための吸着薬剤として、蛍光物質Nile Redを使用した。そこでまず、Nile Redの蛍光スペクトル測定を行った。Nile Redを０．０１５９ｇ（５．０×１０−５ｍｏｌ）採り、少量のアセトンで溶解したのち、アセトンで２０ｍＬに定容した（２．５×１０−３Ｍ）。この溶液０．０４ｍＬを１０ｍＬメスフラスコに採り、水で定容した（１．０×１０−５Ｍ）。このNile Red水溶液を１０ｍＬメスフラスコに０〜０．１００ｍＬに採り、水で１０ｍＬに定要した（０〜１．０×１０−７Ｍ）。これらの溶液の蛍光スペクトルを励起波長を５８０ｎｍ、蛍光波長を６５２ｎｍに固定して測定した。その結果、Nile Redの濃度に応じて蛍光強度の増加が確認できた。
【０１１４】
Nile Redを熱応答性高分子及び、金ナノ粒子に混合することから、以下の実験では、Nile Redの最終濃度を、１．０×１０−７Ｍとした。後に詳述するが、この濃度のNile Redは、再分散には全く影響を及ぼさない。なお、図２に、１．０×１０−７Ｍの濃度におけるNile Redの励起及び蛍光スペクトルを示す。
【０１１５】
［実施例１〜４及び比較例１］
（金ナノ複合体の調製及び熱応答性高分子の相違による薬剤放出評価）
１０ｍＬメスフラスコに０．１８ｇ−Ａｕ／Ｌ金ナノ粒子溶液３．０ｍＬを添加し、１．０×１０−５Ｍ Nile Red溶液０．１００ｍＬを添加し、上記合成例２〜５で調製した各熱応答性高分子の２．０質量％溶液３．７５ｍＬを添加し、水で１０ｍＬに定容とした。
【０１１６】
調製した金ナノ複合体（実施例１〜４）からの薬剤放出を評価するため、励起波長を５８０ｎｍ、蛍光波長を６５２ｎｍに固定して、蛍光スペクトル測定を行った。その後、９０℃で３０分間、加熱を行い、４℃で１時間冷却を行い、同様の条件で蛍光スペクトル測定を行った。
【０１１７】
また、調製した各金ナノ複合体溶液に、チオール類として、１．０×１０−３Ｍグルタチオン（ＧＳＨ）溶液２５０μＬを添加した後、上記と同様の条件にて、蛍光スペクトル測定を行った。その後、９０℃で３０分間、加熱を行い、４℃で１時間冷却を行い、同様の条件で蛍光スペクトル測定を行った。
【０１１８】
また、比較のために、１０ｍＬメスフラスコに０．１８ｇ−Ａｕ／Ｌ金ナノ粒子溶液０〜５．０ｍＬを添加し、１．０×１０−５Ｍ Nile Red溶液０．１００ｍＬを添加して水で１０ｍＬに定容した。
【０１１９】
得られた比較用金ナノ複合体（比較例１）に対し、実施例１〜４と同様に、ＧＳＨ無添加の状態での加熱前後の蛍光スペクトル測定、ＧＳＨ添加状態での加熱前後の蛍光スペクトル測定を行った。
【０１２０】
得られた結果を、図３に示す。図３中、Ａｕ＋ＮＲは、金ナノ粒子にNile Redを吸着させた比較例１の比較用金ナノ複合体を、「Ｐ−ＮＩＰ」は、金ナノ粒子にNile Redを吸着させ合成例２のＰ−ＮＩＰを被覆した実施例１の金ナノ複合体を、「ＴＥＴＡ」は、金ナノ粒子にNile Redを吸着させ合成例３のＮＩＰ−ＴＥＴＡを被覆した実施例２の金ナノ複合体を、「ＤＥＴＡ」は、金ナノ粒子にNile Redを吸着させ合成例４のＮＩＰ−ＤＥＴＡを被覆した実施例３の金ナノ複合体を、「ＭＡ」は、金ナノ粒子にNile Redを吸着させ合成例５のｐＮＩＰ−ＭＡを被覆した実施例４の金ナノ複合体を、それぞれ示すものである。
【０１２１】
図３に示すように、実施例１〜４の金ナノ複合体はいずれもＧＳＨを添加しない系に比較して、ＧＳＨを添加した系において、加熱後において高い蛍光強度を示し、ＧＳＨを添加し熱刺激を与えることによって、金ナノ複合体からNile Redが効果的に遊離することが明らかとなった。また、比較例１のものと比べて、ＧＳＨを添加した系における加熱後の蛍光強度は、いずれも大きな値であり、本発明に係る金ナノ複合体によるチオール類共存下における熱刺激による薬剤放出効果が優れたものであることが示された。
【０１２２】
なお、図３に示すように、ＮＩＰ−ＴＥＴＡを被覆した際（実施例２）は、ＧＳＨを添加しない系においても、Nile Redが一部遊離していることが分かった。これは、ＴＥＴＡ基が金ナノ粒子表面に吸着した際に、Nile Redを交換したために生じると思われる。これに対して、その他の熱応答性高分子を加えた場合にはＮｉｌｅ Ｒｅｄの遊離は観測されなかった。
【０１２３】
一方、ＧＳＨを添加した系においては、ＧＳＨはチオール基を有することから金ナノ粒子と特異的に反応しかつ、加熱・冷却なしでも再分散を促進する効果があることが観察できる。このことから、熱刺激によって再分散を起こすＮＩＰ−ＴＥＴＡ（実施例２）とＮＩＰ−ＤＥＴＡ（実施例３）は、ＧＳＨ添加によりNile Redが効果的に遊離するために蛍光強度が大幅に回復したと考えられる。再分散を起こさないＮＩＰ−ＭＡ（実施例４）とＰ−ＮＩＰ（実施例１）においても、添加したＧＳＨによってNile Redの遊離がある程度生じたものと思われ、熱刺激後において比較的高い蛍光強度を示したものと考えられる。
【０１２４】
［実施例５］
（金ナノ複合体の調製及び熱応答性高分子の濃度による薬剤放出評価）
１０ｍＬメスフラスコに０．１８ｇ−Ａｕ／Ｌ金ナノ粒子溶液を添加し、１．０×１０−５Ｍ Nile Red溶液０．１００ｍＬを添加し、熱応答性高分子の最終濃度が０〜１．０質量％の時は、２．０質量％熱応答性高分子溶液を０〜５ｍＬ加え、ポリマーの最終濃度が１．２５及び１．５０質量％の時は５．０質量％熱応答性高分子溶液を２．５ｍＬ及び３ｍＬ加えて、水で最終体積が１０ｍＬとして、熱応答性高分子濃度の異なる金ナノ複合体を調製した。なお、使用した熱応答性高分子としては、合成例４のＮＩＰ−ＤＥＴＡを用いた。
【０１２５】
これらの各溶液について、実施例１〜４と同様の条件下に、ＧＳＨ無添加の状態で測定を行った。得られた結果を、図４に示す。図４に示すように、ＧＳＨを添加しない系においては、被覆したＮＩＰ−ＤＥＴＡの量にかかわらす、熱刺激を加えてもNile Redの遊離はほどんど起こっておらず、一方ＧＳＨを添加している系においては、熱刺激後に大きなNile Redの遊離が起こることが示された。ＮＩＰ−ＤＥＴＡの添加濃度が０．２５質量％以上となると、ＮＩＰ−ＤＥＴＡを添加しない場合と比較して、その熱刺激後のNile Redの遊離量に有意な差が見られ、特に、添加濃度約０．５〜約１．０質量％の範囲内において、大きな効果が得られた。
【０１２６】
［実施例６］
（金ナノ複合体の調製及び熱応答性高分子の濃度による薬剤放出評価）
使用する熱応答性高分子として、合成例４のＮＩＰ−ＤＥＴＡに代えて、合成例３のＮＩＰ−ＴＥＴＡを用いた以外は、実施例５と同様にして、熱応答性高分子濃度の異なる金ナノ複合体を調製し、これらの各溶液について、ＧＳＨ添加状態での加熱前後の蛍光スペクトル測定を実施例５と同様にして行った。
【０１２７】
得られた結果を、図５に示す。図５に示すようにＧＳＨを添加している系において、熱刺激後に大きなNile Redの遊離が起こることが示された。ＮＩＰ−ＴＥＴＡの添加濃度が比較的低いところでも、ＮＩＰ−ＴＥＴＡを添加しない場合と比較して、その熱刺激後のNile Redの遊離量に有意な差が見られたが、ＮＩＰ−ＴＥＴＡの添加濃度が約１．０質量％を超えると、ＮＩＰ−ＴＥＴＡを添加しない場合と比べて熱刺激前におけるNile Redの遊離量が大きくなってしまう傾向が見られた。熱刺激前後における蛍光強度差からみると、添加濃度としては、約０．２５〜約１．２５質量％、特に約０．２５質量％前後の範囲内において、大きな効果が得られた。
【０１２８】
［実施例７］
（金ナノ複合体の調製及び環境ｐＨ条件の変動による薬剤放出評価）
１０ｍＬメスフラスコに０．１８ｇ−Ａｕ／Ｌ金ナノ粒子溶液を添加し、１．０×１０−５Ｍ Nile Red溶液０．１００ｍＬを添加し、２質量％ＮＩＰ−ＤＥＴＡ溶液 ３．７３ｍＬを加えて、水で最終体積が１０ｍＬとした。この溶液に１．０Ｍ ＮａＯＨ水溶液及び、１Ｍ ＨＣｌ水溶液を少量加えることによりｐＨを５．０〜９．０の間で調整した。各溶液に対し、１．０×１０−３Ｍグルタチオン（ＧＳＨ）溶液２５０μｍμＬを添加した後、実施例１〜４におけるものと同様の条件にて、蛍光スペクトル測定を行った。その後、９０℃で３０分間、加熱を行い、４℃で１時間冷却を行い、同様の条件で蛍光スペクトル測定を行った。
【０１２９】
得られた結果を図６に示す。図６に示すように、ＧＳＨ添加系において熱刺激により吸着薬剤分子を放出する現象は、測定したｐＨ５〜９の範囲内においては、ｐＨ値にあまり依存することなく、ほぼ均一に生じ、熱刺激前において吸着薬剤分子はごく微量の放出に留まり、熱刺激後において大きな放出が生じることが示された。特にｐＨ５．５〜ｐＨ７．５の範囲において良好な結果が得られた。
【０１３０】
［実施例８］
（熱刺激温度の変動による薬剤放出評価）
１０ｍＬメスフラスコに０．１８ｇ−Ａｕ／Ｌ金ナノ粒子溶液を添加し、１．０×１０−５Ｍ Nile Red溶液０．１００ｍＬを添加し、２質量％ＮＩＰ−ＤＥＴＡ溶液 ３．７３ｍＬを加えて、水で最終体積が１０ｍＬとした。
【０１３１】
得られた金ナノ複合体溶液に対し、１．０×１０−３Ｍグルタチオン（ＧＳＨ）溶液２５０μＬを添加した後、実施例１〜４におけるものと同様の条件にて、蛍光スペクトル測定を行った。その後、加熱温度を３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０℃に設定して３０分間、加熱を行った後、４℃で１時間冷却を行い、同様の条件で蛍光スペクトル測定を行った。
【０１３２】
得られた結果を図７に示す。図７に示すように、加熱温度が約４０℃以上、特に約７０℃となると熱刺激による良好なNile Redの遊離が生じた。
【０１３３】
［実施例９〜１２及び参考例２〜７］
（分子スイッチの評価）
１０ｍＬメスフラスコに０．１８ｇ−Ａｕ／Ｌ金ナノ粒子溶液を添加し、１．０×１０−５Ｍ Nile Red溶液０．１００ｍＬを添加し、２質量％ＮＩＰ−ＤＥＴＡ溶液 ３．７３ｍＬを加えて、水で最終体積が１０ｍＬとした。
【０１３４】
得られた金ナノ複合体溶液に対し、１．０×１０−３Ｍの各化合物溶液を２５０μＬを添加した後、実施例１〜４におけるものと同様の条件にて、蛍光スペクトル測定を行った。その後、加熱温度を９０℃で３０分間、加熱を行った後、４℃で１時間冷却を行い、同様の条件で蛍光スペクトル測定を行った。
【０１３５】
なお、添加した化合物は、グルタチオン（ＧＳＨ）（実施例９）、システイニルグリシン（Ｃｙｓ−Ｇｌｙ）（実施例１０）、シスチン（実施例１０）、グルタミン酸システイン（Ｇｌｕ−Ｃｙｓ）（実施例１１）、グリシン（Ｇｌｙ）（参考例２）、グルタミン酸（参考例３）、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）（参考例４）、Ｌ−システイン（Ｌ−Ｃｙｓ）（参考例５）、Ｈｃｙｓ（参考例６）、メチオニン（参考例７）であった。使用した化合物の構造式を図８に示す。
【０１３６】
得られた結果を図９に示す。図９に示すように、ＧＳＨ、Ｃｌｙ−Ｃｙｓ、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｈｃｙｓのチオール化合物を用いた場合は、いずれもＮｉｌｅ Ｒｅｄが遊離していることが確認できた。その中でも、ＧＳＨ、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ、が非常に大きな蛍光強度の回復が確認できた。ＧＳＨ、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、Ｃｙｓ−Ｇｌｙは分子サイズが大きいことから再分散を促進し、熱刺激を与えることで十分な再分散を行うことができ、これによって蛍光強度の回復が起こるものと考えられる。Ｌ−Ｃｙｓ、Ｈｃｙｓでは分子サイズが小さいので、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｈｃｙｓを添加すると再分散を阻害する為にＮｉｌｅ Ｒｅｄの遊離が十分ではなくなり、結果として加熱・冷却しても蛍光強度が十分には回復しなかったものと考えられる。
【０１３７】
Ｇｌｙ、グルタミン酸は、チオール基を含まない化合物であるため、金ナノ粒子と反応せず、加熱後においてもＮｉｌｅ Ｒｅｄが遊離しておらず、分子スイッチとして不適であることが示された。また、ジスルフィド結合を有するＧＳＳＧ、スルフィド結合を有するメチオニンに関しても、加熱後においてもＮｉｌｅ Ｒｅｄが遊離していなかったが、ジスルフィド結合を有するシスチンに関しては、加熱・冷却後に蛍光強度が大きく回復しており、分子スイッチとして適用可能であることが示された。
【０１３８】
［実施例１３〜１６及び参考例８〜９］
（分子スイッチの評価）
実施例９〜１２及び参考例２〜７における結果から、分子スイッチとして好適であると思われるＧＳＨ、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ、シスチンに関し、その濃度の検討を行った。比較のために、併せてＬ−Ｃｙｓ、Ｈｃｙｓに関しても同様の検討を行った。
【０１３９】
実験は、実施例９〜１２及び参考例２〜７におけるものと同様にして得られた金ナノ複合体溶液に対し、１．０×１０−３Ｍの各化合物溶液を０〜２５０μＬの範囲で添加量を変えてを添加した後、実施例１〜４におけるものと同様の条件にて、蛍光スペクトル測定を行った。その後、加熱温度を９０℃で３０分間、加熱を行った後、４℃で１時間冷却を行い、同様の条件で蛍光スペクトル測定を行った。
【０１４０】
得られた結果を図１０に示す。図１０に示すように、ＧＳＨ、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ、シスチンは測定した０．５〜２．５×１０−５Ｍの濃度範囲において、分子スイッチとして有効に機能していることが確認できた。
【０１４１】
なお、ＧＳＨにおいては、比較的添加濃度が低いところにおいても有意な効果が見られたため、濃度０〜１×１０−６Ｍの範囲内においてより細かな濃度変化を与え、濃度変動による効果の違いを調べた。得られた結果を図１１に示す。図１１に示すように、濃度が約４×１０−６Ｍ以上となると、加熱・冷却後に蛍光強度が大きく回復していることが判った。
【０１４２】
［実施例１７］
（共存物質の影響の検討）
実施例１３〜１６及び参考例８〜９の結果から、分子スイッチとしてＧＳＨが適当なものの１つであることが判ったため、このＧＳＨの分子スイッチの機能が、共存物質により影響を受けるかどうかについて検討を行った。
【０１４３】
１０ｍＬメスフラスコに０．１８ｇ−Ａｕ／Ｌ金ナノ粒子溶液を添加し、１．０×１０−５Ｍ Nile Red溶液０．１００ｍＬを添加し、２質量％ＮＩＰ−ＤＥＴＡ溶液 ３．７３ｍＬを加えて、水で最終体積を１０ｍＬとした。
【０１４４】
得られた金ナノ複合体溶液に対し、１．０×１０−３ＭのＧＳＨ溶液を５０μＬ、共存物質としてＬ−Ｃｙｓ、Ｈｃｙｓ、Ｇｌｙ、グルタミン酸のそれぞれ１．０×１０−３Ｍ溶液を５０μＬ添加した後、実施例１〜４におけるものと同様の条件にて、蛍光スペクトル測定を行った。その後、加熱温度を９０℃で３０分間、加熱を行った後、４℃で１時間冷却を行い、同様の条件で蛍光スペクトル測定を行った。なお比較対照として、共存物質を添加せず１．０×１０−３ＭのＧＳＨ溶液を５０μＬのみ添加した系も別途調製し、同様の測定を行った。
【０１４５】
得られた結果を図１２に示す。図１２に示すように、共存物質の存在下においても、ＧＳＨは分子スイッチとして有効に機能することが確認できた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドラッグデリバリーシステムや蛍光センサー等に用いられる金ナノ複合体に関する。更に詳しくは、所定の条件下においてのみ、熱刺激により、包摂していた有機分子を放出する、金ナノ複合体及びこれを用いたドラッグデリバリーシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
ドラッグデリバリーシステムは、理想的な薬物投与システムとして、また、種々の種類の担体等を対象として、盛んに研究されている。粒子径が１００ｎｍ以下のナノ粒子材料は、その粒径が薬物運搬体のサイズに適しているのに加え、相互作用に利用できる単位質量あたりの表面積が大きいという特性を有する。そのため、機能性物質の内包や分析感度の向上等、その実用性への展望からバイオ分離や各種アッセイ、診断やドラッグデリバリーシステム等の幅広い領域での活用が期待されている。
【０００３】
中でも、温度やｐＨ等の外部刺激に応答して機能や物理的性質が不連続かつ可逆的に変化する刺激応答性高分子は、感知・判断・運動といった高度機能を兼ね備えた高機能材料として数多く研究されている。
【０００４】
刺激応答性高分子とは、外部環境の様々な物理・化学情報（温度・熱、溶媒・組成、ｐＨ、電場、光等）を感知して応答する高分子であり，特に熱に感応するものが熱応答性高分子とばれる。現在、４種の基本的な相互作用（水素結合性、疎水性、ファンデルワールス力、静電的相互作用）と高分子の相転移が示されている。
【０００５】
この相転移は、ゲル内の分子間相互作用（高分子鎖と溶媒分子間、高分子鎖と高分子鎖間)によって誘発されていることから、ゲルの相転移を構成高分子の物性変化と捉えることができる。従来からよく知られる熱応答性高分子には、ポリＮ−イソピルアクリルアミド等のポリ（アクリルアミンド）類縁体が挙げられる。
【０００６】
このように、架橋型熱応答性高分子は、外部の熱刺激に応じて高分子鎖のコンフォメーションを変化させることができる。そのため、体温に近い温度で相転移する架橋型熱応答性高分子を利用して、体内の必要な部分に確実に薬を投与し、最適な温度で薬の投与のｏｎ‐ｏｆｆを制御することのできるドラッグデリバリー用の担体として研究されている。
【０００７】
しかしながら、このような架橋型熱応答性高分子を用いたドラッグデリバリーシステムにおいては、当該高分子の熱による相転移によって、内包させた薬剤の放出が生じる（すなわち熱刺激によって薬剤の放出が起動されてしまう）ため、環境温度変化による当該高分子からの薬剤の遊離等による安定性の問題、また薬剤の自己拡散による漏出等の克服すべき課題が残されている。
【０００８】
一方、金ナノ粒子は、バルクでは見られなかった新しい物性と構造を持っている古くから研究されているナノ粒子であり、ステンドグラスや陶器の無鉛赤色絵具や無機塗料顔料として利用されてきた。例えば、鮮やかなワインレッドの色は、液相で金ナノ粒子を調製して得ることができる。金ナノ粒子の発色は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって生じるため、形状や粒径によって様々な色調を与える。粒径が十数ｎｍ程度で分散状態にある溶液は、５２０ｎｍ付近で極大吸収波長を示し、赤色を呈する。この粒子が凝集状態になると、ブルーシフトを起こして長波長側に新たな吸収帯が生じ、溶液は青色になる。金ナノ粒子は、一度凝集状態になると容易には分散状態に戻らない。
【０００９】
このようなあざやかな色調の変化を利用して、近年では、バイオセンサや光スイッチ等の次世代のセンシング材料やフォトニクス材料として注目され、多くの研究が行われている。
【００１０】
例えば、本発明者による特許文献１においては、グルタチオン又はシステイニルグリシン等のチオール基含有化合物を簡便、迅速、正確に計測することができる色彩色差計測方法として、金ナノ粒子に、特定の熱応答性高分子を複合化してなる金ナノ粒子複合体を用いる方法を提案している。この方法によれば、金ナノ粒子と特定の熱応答性高分子を複合化した金ナノ粒子複合体は溶液中で凝集状態となって青色を呈するが、金ナノ粒子複合体はポリマーが金ナノ粒子に化学吸着することにより溶液中で沈降しない。そして、この複合体溶液にグルタチオンやシステイニルグリシン等の特定のチオール基含有化合物を混合することにより、ポリマーが離脱する代わりにグルタチオンやシステイニルグリシン等が金ナノ粒子に吸着し、さらにそのグルタチオンやシステイニルグリシン等が有するカルボキシル基の作用により分散状態になって赤色に変化するというものである。
【００１１】
また、同じく本発明者による特許文献２においては、粒径が１〜５μｍの金ナノクラスターと熱応答性高分子（カルボキシル基等のアニオン基を含む熱応答性高分子を除く。）とを含む混合溶液を準備する工程と、混合溶液を加熱し、冷却する工程とを有することを特徴とする金ナノ粒子の製造方法が開示されている。この方法によれば、金(III)イオンを還元して粒径が５０ｎｍを超える金ナノ粒子やロッド状の金ナノ粒子を製造するのではなく、粒径１〜５μｍの金ナノクラスターと熱応答性高分子との混合溶液を加熱、冷却するという簡単な操作で、粒径が５０〜１００ｎｍの範囲の金ナノ粒子を得るという新しい方法を提案している。また、特許文献２においては、チオール化合物が、凝集体を構成する金ナノクラスターに吸着することで、金ナノクラスター同士の接触・融合が阻まれ、その結果、金ナノ粒子の製造が阻害され、吸光度での５５０ｎｍの吸収ピークが小さくなり、赤みが弱くなるため、金ナノ粒子の製造用溶液を、チオール化合物の選択的な検出溶液として応用できることが提案されている。
【００１２】
非特許文献１では、ナイルレッドを非共有的に吸着させた金ナノ粒子の水溶液をチオール類の検出に用いることが開示されている。これは、システアミンやホモシステイン等のようなチオール類の添加によって、当該ナイルレッドを非共有的に吸着させた金ナノ粒子の水溶液の蛍光が増加するというものであり、このような蛍光の増加は、アミン類、酸類、アルコール類、ウシ血清アルブミン、ヘモグロビン等の添加によっては生じないことが報告されている。
【００１３】
非特許文献２においては、狭い多分散性を有する熱応答性ブロック共重合体を被覆した金ナノ粒子が、可逆性の熱応答性を示すことが開示されている。
【００１４】
非特許文献３においては、１，１０−フェナントロリンリガンドを有する４ｎｍの金ナノ粒子が、選択的にリチウムイオンに結合し、２：１のリガンド−金属複合体を形成することで、当該リガンドがリチウムイオンに結合し、金ナノ粒子が凝集することを引き起こすことが示されており、この金ナノ粒子の凝集が、色変化を伴う励起スペクトルにおけるシフトを引き起こし、水溶液中のリチウムイオンの有用な光学的検出方法となることが開示されている。
【００１５】
金ナノ粒子は、前記したようなナノ粒子材料の一種であり、ドラッグデリバリー用の担体としても研究されているが、薬剤は金ナノ粒子に吸着した状態で運ばれ、かつ一般的にその結合力が強いため、外部から薬剤の放出を制御することが困難であった。
【００１６】
また、蛍光分子を金ナノ粒子に物理吸着させたナノ複合体が、ナノ粒子蛍光センサーとして研究されている。ナノ粒子蛍光センサー溶液に分析対象物質を添加すると、ナノ複合体に吸着していた蛍光分子が遊離するため、ナノ複合体による蛍光共鳴エネルギー移動（以下ＦＲＥＴ）が解消し、蛍光強度が回復する。しかし、このナノ粒子蛍光センサーでは、分析対象物質の添加により凝集が生じることがあり、再現性低下の原因となっていた。
【００１７】
このように、従来、金ナノ粒子、架橋型熱応答性高分子はともにドラッグデリバリー用の担体として研究されている。しかしながら、これまで熱応答性高分子を被覆した金ナノ粒子をドラッグデリバリー担体として実用化されているものはない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】特開２００９−２２９１４７号公報
【特許文献２】特願２０１０−４４７９２号明細書
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Analytical Chemistry, 76, 3727-3734(2004).
【非特許文献２】Colloids and Surfaces, A, 317, 764-767(2008).
【非特許文献２】Langmuir, 26, 6818-6825(2010).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
効果的なドラッグデリバリーシステムを構築するためには、ねらった部位で薬物を的確に放出できる担体の開発する必要がある。上述したように、架橋型熱応答性高分子を用いる場合には、外部からの熱刺激により内包している薬物の放出を制御することが可能ではある。しかしながら、薬物の自己拡散による漏出等が従来克服すべき課題であった。一方、金ナノ粒子を担体として用いる場合、薬剤は金ナノ粒子に吸着した状態で運ばれるが、この場合には、外部から薬剤の放出を制御することはできないという問題があった。
【００２１】
本発明の目的は、ドラッグデリバリーシステムや蛍光センサー等に用いられる新規な金ナノ複合体を提供することにある。特に、本発明は、ねらった部位で薬物を的確に放出できる金ナノ複合体、及びこれを用いたドラッグデリバリーシステムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究及び検討を重ねた結果、金ナノ粒子に対しチオール類が強い吸着性を示すことに着目し、金ナノ粒子表面に薬剤（有機物）を吸着させ、熱応答性高分子を被覆してなる金ナノ複合体を調製した。この金ナノ複合体を、グルタチオン等チオール化合物と接触させると、チオール化合物により、金ナノ粒子表面で吸着分子の置換が起こるものの、薬剤は熱応答性高分子に覆われている金ナノ複合体の中に留まる。この状態で熱刺激を加えると熱応答性高分子の収縮により、薬剤は複合体から放出される。これによって、当該金ナノ複合体は、グルタチオン等チオール化合物の共存下においてのみ、熱刺激により薬剤を放出し、ねらった部位で薬物を的確に放出できるドラッグデリバリーシステムが確立されること、また、薬剤として蛍光物質を用いた場合に、再現性の良好な蛍光センサーとなることを見出し、本発明に到達した。
【００２３】
すなわち、上記課題を解決するための本発明に係る金ナノ粒子複合体は、表面に薬剤を吸着した金ナノ粒子と、該金ナノ粒子を被覆してなる熱応答性高分子とを有することを特徴とする。
【００２４】
この発明によれば、表面に薬剤を吸着した金ナノ粒子と、該金ナノ粒子を被覆してなる熱応答性高分子とを有するので、グルタチオン等のチオール化合物の共存下において、熱刺激により薬剤を効率的に放出することができる。こうした金ナノ複合体は、その核である金ナノ粒子の表面が薬剤を吸着していることから、自己拡散のおそれがない。なお、薬剤の放散のメカニズムは以下のステップで行われると考えられる。すなわち、チオール化合物により、金ナノ粒子の表面で吸着分子の置換が起こるものの、薬剤は熱応答性高分子に覆われている金ナノ複合体の中に留まる。この状態で熱刺激を加えると、熱応答性高分子の収縮により、薬剤が複合体から放出される。このように、金ナノ粒子に熱応答性高分子を被覆することで、これらが単独で用いられていたときには克服できなかった問題を克服するドラッグデリバリー担体やナノ粒子蛍光センサーを構築することができる。
【００２５】
本発明に係る金ナノ複合体において、前記熱応答性高分子としては、下記化学式２で表されるポリマーが好ましい。式中、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立にアルキル基を表す。Ｒ３とＲ４はそれぞれ独立に水素又はメチル基を表す。また、ｘ／ｙは９５／５〜７０／３０であり、ｎは１〜４である。
【００２６】
【化１】
【００２７】
このうち特に、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルジエチレントリアミン）［ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＤＥＴＡ））］及びポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルトリエチレンテトラミン）［ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＴＥＴＡ））が好ましい。
【００２８】
本発明に係る金ナノ複合体において、前記薬剤としては、蛍光物質、生理活性物質又は医薬化合物を用いることができる。
【００２９】
上記課題を解決するための本発明に係る金ナノ複合体の製造方法は、金ナノ粒子のコロイド溶液に対し、薬剤水溶液、熱応答性高分子溶液の順に添加し、金ナノ粒子に対して先に薬剤を吸着させてから、熱応答性高分子を被覆することを特徴とする。
【００３０】
上記課題を解決するための本発明に係るドラッグデリバリーシステム薬剤は、上記した本発明に係る金ナノ複合体を、チオール類又はシスチンの存在下で加熱して使用することを特徴とする。
【発明の効果】
【００３１】
本発明に係る金ナノ複合体によれば、表面に薬剤を吸着した金ナノ粒子と、該金ナノ粒子を被覆してなる熱応答性高分子とを有するので、グルタチオン等のチオール化合物の共存下において、熱刺激により薬剤を効率的に放出することができる。こうした金ナノ複合体は、その核である金ナノ粒子表面に薬剤が吸着していることから、自己拡散のおそれがない。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】金ナノ複合体からの薬剤放出のメカニズムを示す模式図である。
【図２】蛍光物質Nile Redの励起及び蛍光スペクトルを示す図面である。
【図３】金ナノ複合体において用いられた熱応答性高分子の相違による薬剤放出特性の影響を示す蛍光スペクトル強度を示す図面である。
【図４】金ナノ粒子を被覆する熱応答性高分子（ＮＩＰ−ＤＥＴＡ）の濃度による蛍光スペクトル強度の影響を示す図である。
【図５】金ナノ粒子を被覆する熱応答性高分子（ＮＩＰ−ＴＥＴＡ）の濃度による蛍光スペクトル強度の影響を示す図である。
【図６】ｐＨ環境変化による金ナノ複合体の薬剤放出特性の影響を示す蛍光スペクトル強度を示す図面である。
【図７】加熱温度の変化による金ナノ複合体の薬剤放出特性の影響を示す蛍光スペクトル強度を示す図面である。
【図８】実施例において使用した分子スイッチ化合物の構造式を示す図面である。
【図９】添加した分子スイッチ化合物の相違による金ナノ複合体の薬剤放出特性の影響を示す蛍光スペクトル強度を示す図面である。
【図１０】分子スイッチ化合物の添加濃度変化による金ナノ複合体の薬剤放出特性の影響を示す蛍光スペクトル強度を示す図面である。
【図１１】分子スイッチ化合物の添加濃度変化による金ナノ複合体の薬剤放出特性の影響を示す蛍光スペクトル強度を示す図面である。
【図１２】分子スイッチ化合物の添加時における共存物質の存在による金ナノ複合体の薬剤放出特性の影響を示す蛍光スペクトル強度を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、本発明に係る金ナノ粒子複合体について、図面を参照しつつ説明する。
【００３４】
［金ナノ粒子複合体］
本発明に係る金ナノ粒子複合体は、表面に薬剤を吸着した金ナノ粒子と、該金ナノ粒子を被覆してなる熱応答性高分子とを有することを特徴とする。先ず、本発明に係る金ナノ複合体を説明するに先立ち、本発明の重要な構成要素につき、個々に説明する。
【００３５】
（金ナノ粒子）
金ナノ粒子としては、種々の形状のものを用いることが可能であるが、粒形状又は球形状であることが望ましい。なお、金ナノ粒子の粒径は、その調製方法に依存し、各種の粒径のものを得ることができる。本発明に使用可能な金ナノ粒子の粒径の範囲は特に限定されないが、粒径が小さすぎるものは作製が難しく、一方、粒径が大きすぎるものは沈降してしまう場合があるので、それらを考慮して選択する。一般的には、粒径１０〜１００ｎｍ程度のもの、特に１０〜５０ｎｍ程度のものが多く用いられる。なお、金ナノ粒子の粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）での観察結果から求めることができる。
【００３６】
金ナノ粒子は、金ナノ粒子溶液として調製することができる。この金ナノ粒子溶液の調製は、クエン酸ナトリウム還元により行うことができ、具体的には、所定量のテトラクロロ金酸水溶液に、クエン酸三ナトリウム水溶液を添加して調製する例を挙げることができる。また、市販の所定の大きさからなる金ナノ粒子溶液を用いてもよい。
【００３７】
金ナノ粒子を含む金ナノ粒子複合体は、特許文献１に記載されるように、粒径１〜５μｍの金ナノクラスターと熱応答性高分子との混合溶液を加熱、冷却するという製造方法を応用して、調製することも可能である。この調製方法については下記に詳述する。
【００３８】
ここで、金ナノクラスターは、透過型電子顕微鏡像（ＴＥＭ像）で測定した粒径が１〜５μｍの金粒子のことである。金ナノクラスターの形状は、粒形状又は球形状であることが望ましい。金ナノクラスターは各種の方法で製造でき、例えば、テトラヒドロホウ酸ナトリウム溶液を用いる方法等で製造することができる。具体的には、塩化金酸溶液にポリオキシエチレン溶液を添加した後に水を加え、ｐＨ調整した後にＮａＢＨ４（テトラヒドロホウ酸ナトリウム）溶液を添加し、その後反応させて合成することができる。なお、ポリオキシエチレン溶液としては、テトラエチレングリコール等を挙げることができる。こうした合成方法によって、粒径が１〜５μｍの金ナノクラスターを得ることができる。
【００３９】
（熱応答性高分子）
熱応答性高分子としては、少なくともＮ−イソプロピルアクリルアミド類を構成単位として含むポリマー、ポリ（メチルビニルエーテル）、又はヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。
【００４０】
熱応答性高分子のうち、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド類を構成単位として含むポリマーの例としては、下記一般式１〜６に記載のものを例示することができる。
【００４１】
【化２】
【００４２】
上記化学式１のポリマーは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）類である。化学式１において、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立にアルキル基、好ましくは炭素数１〜４程度の直鎖状のアルキル基、より好ましくはメチル基を表す。Ｒ３はそれぞれ独立に水素又はメチル基、好ましくは水素を表す。ｎは１０００〜１０００００の整数である。Ｒ１とＲ２をメチル基とし、Ｒ３を水素としたポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）は「Ｐ−ＮＩＰ」で表す。
【００４３】
【化３】
【００４４】
上記化学式２のポリマーは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイル−アミン）類である。化学式２において、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立にアルキル基、好ましくは炭素数１〜４程度の直鎖状のアルキル基、より好ましくはメチル基を表す。Ｒ３とＲ４はそれぞれ独立に水素又はメチル基、好ましくは水素を表す。また、ｘ／ｙは９５／５〜７０／３０であり、好ましくは９０／１０〜８５／１５の範囲である。ｎは１〜４である。Ｒ１とＲ２をメチル基とし、Ｒ３とＲ４を水素としたポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイル−アミン）は「ｐＮＩＰ−ＡＣ」で表す。
【００４５】
化学式２のポリマーの右側の側鎖は、エチレンイミン鎖の繰り返し単位を含むアクリロイルアミン（以下、ＡＣという。）である。より具体的には、右側の側鎖のエチレンイミン鎖の繰り返し単位であるｎ＝０の場合には、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルエチレンジアミン）［以下、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＥＤＡ））という。］となり、ｎ＝１の場合には、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルジエチレントリアミン）［以下、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＤＥＴＡ））という。］となり、ｎ＝２の場合には、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルトリエチレンテトラミン）［以下、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＴＥＴＡ））という。］となり、ｎ＝３の場合には、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルテトラエチレンペンタミン）［以下、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＴＥＰＡ））という。］、ｎ＝４の場合には、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルペンタエチレンヘキサミン）［以下、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＰＥＨＡ））という。］となる。
【００４６】
【化４】
【００４７】
上記化学式３のポリマーは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイル−シスタミン）類である。化学式３において、Ｒ１とＲ２及びＲ７とＲ８はそれぞれ独立にアルキル基、好ましくは炭素数１〜４程度の直鎖状のアルキル基、より好ましくはメチル基を表す。Ｒ３とＲ４及びＲ５とＲ６はそれぞれ独立に水素又はメチル基、好ましくは水素を表す。また、ｘ／ｙ／ｚは９５／２．５／２．５〜８０／１０／１０である。Ｒ１とＲ２及びＲ７とＲ８をメチル基とし、Ｒ３とＲ４及びＲ５とＲ６を水素としたポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイル−アミン）は「ｐＮＩＰ−Ｃｙｓ」で表す。
【００４８】
【化５】
【００４９】
上記化学式４のポリマーは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイル−アラニン）類である。化学式４において、Ｒ１とＲ２及びＲ５はそれぞれ独立にアルキル基、好ましくは炭素数１〜４程度の直鎖状のアルキル基、より好ましくはメチル基を表す。Ｒ３とＲ４はそれぞれ独立に水素又はメチル基、好ましくは水素を表す。また、ｘ／ｙは９０／１０〜８０／２０である。Ｒ１とＲ２及びＲ５をメチル基とし、Ｒ３とＲ４を水素としたポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイル−アミン）は「ｐＮＩＰ−ＡＣ」で表す。
【００５０】
【化６】
【００５１】
上記化学式５のポリマーは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−グリシジルメタクリル酸−乳酸）類である。化学式５において、Ｒ１とＲ２及びＲ５はそれぞれ独立にアルキル基、好ましくは炭素数１〜４程度の直鎖状のアルキル基、より好ましくはメチル基を表す。Ｒ３とＲ４はそれぞれ独立に水素又はメチル基、好ましくは水素を表す。また、ｘ／ｙは９５／５〜８０／２０である。Ｒ１とＲ２及びＲ５をメチル基とし、Ｒ３とＲ４を水素としたポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイル−アミン）は「ｐＮＩＰ−ＧＭＡ−乳酸」で表す。
【００５２】
【化７】
【００５３】
上記化学式６のポリマーは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−（メタ）アクリル酸）類である。化学式６において、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立にアルキル基、好ましくは炭素数１〜４程度の直鎖状のアルキル基、より好ましくはメチル基を表す。Ｒ４は水素又はメチル基を表す。また、ｘ／ｙは９５／５〜７０／３０であり、好ましくは９０／１０〜８５／１５の範囲である。Ｒ１とＲ２をメチル基とし、Ｒ４をメチル基としたポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−メタクリル酸）は「ｐＮＩＰ−ＭＡ」で表す。
【００５４】
なお、この化学式６で表されるポリマーのように、カルボキシル基等のアニオン基を含む熱応答性高分子は、前述の特許文献１に記載の金ナノクラスターと熱応答性高分子との混合溶液から金ナノ粒子を調製するという製法には用いることができない。
【００５５】
また、熱応答性高分子ではないポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やポリアクリルアミドは、金ナノ粒子を製造できない。
【００５６】
上記化学式１〜６のポリマーの分子量は、重量平均分子量で８０００以上１０００００以下のものを用いることができ、１００００以上２００００以下のものが好ましい。また、各ポリマーは、通常それぞれ単独で用いられるが、２以上を併せて用いてもよい。また、本発明の趣旨の範囲内であれば、上記化学式１〜６のポリマーと同様の効果を奏する他の熱応答性高分子、例えば、ポリ（メチルビニルエーテル）、ヒドロキシプロピルセルロース等を用いてもよい。
【００５７】
上記化学式１〜６のポリマーは、後述する実験例に示す方法で合成することができる。例えば、化学式１のポリマーは、モノマー成分であるＮ−イソプロピルアクリルアミド類を水に溶解し、重合開始剤と重合促進剤を加えて重合し、生成物を精製し、その後凍結乾燥して得ることができる。また、化学式２〜６のポリマーも、重合させるモノマー成分を溶媒に溶解し、重合開始剤と重合促進剤を加えて重合し、生成物を精製し、その後凍結乾燥して各ポリマーを得ることができる。
【００５８】
特に限定されるものではないが、上記化学式１〜６のポリマーうち、化学式２のｐＮＩＰ−ＡＣ、好ましくは、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＤＥＴＡ）、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＴＥＴＡ））、特に好ましくは、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＤＥＴＡ）である。ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＤＥＴＡ）は、チオール類存在下における熱刺激による、金ナノ粒子に吸着していた薬剤の放出特性に優れ、チオール類不在下における熱刺激の状態又はチオール存在下の熱刺激のない状態においては、安定に薬剤を保持している特性を発揮することから、特に好ましいものである。
【００５９】
なお、熱応答性高分子が、上記化学式２で表されるポリマーのうち、右側の側鎖のエチレンイミン鎖の繰り返し単位の数が大きいもの、具体的には、ｎ＝３のｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＴＥＴＡ）よりもエチレンイミンユニットが多いものである場合には、ＮＨ基やＮＨ２基が多く、熱刺激によって熱応答性高分子が熱収縮した際、そうした基が金ナノ粒子に吸着し、金ナノ粒子に吸着していた薬剤分子と置き換わることが生じると考えられるため、チオール類の不在下によっても、熱刺激によりある程度の薬剤が放出されるが、チオール類の存在下における熱刺激の場合と比較すると、放出の程度は有意に異なり、かつその放出の程度は後述する実施例において示すように、実験に用いた熱応答性高分子のうち最も高いものであったことから、好ましい熱応答性高分子として例示できるものである。
【００６０】
（薬剤）
金ナノ粒子が吸着する薬剤としては、チオール類存在下における熱刺激によって、金ナノ複合体より良好に放出される一方、チオール類不在下における熱刺激の状態又はチオール存在下の熱刺激のない状態においては、安定に金ナノ複合体に保持され得るものであれば、特に制限なく各種のものを用いることができる。
【００６１】
薬剤としては、担持又は付着されない状態において、特有の機能、例えば生理活性、薬物活性、触媒活性や光学分割性、抗酸化活性、界面活性、香料、又は、光学活性等の機能を有するものとして考慮される。中でも、生理活性物質又は医薬化合物が代表的なものとして例示される。
【００６２】
生理活性物質又は医薬化合物としては、例えば、Goodman and Gilman’s “The Pharmacological of Basis of Therapeutics”の最新版、又はThe Merck Indexの最新版等に示された各種の薬剤類が挙げられる。例えば、中枢神経系に作用する薬剤；末梢シナプスに作用する薬剤；炎症応答に影響を及ぼす薬剤；体液の組成に影響を及ぼす薬剤；腎臓機能及び電解質代謝に影響を及ぼす薬剤；心臓血管剤、胃腸管機能に影響を及ぼす薬剤；子宮運動性に影響を及ぼす薬剤；寄生中感染症のための化学療法剤、微生物病のための化学療法剤；抗腫瘍性ないし抗癌剤；免疫抑制剤、血液及び血液形成器官に影響を及ぼす薬剤；ホルモン及びホルモンアンタゴニスト；皮膚剤；重金属アンタゴニスト、ビタミン及び栄養素、ワクチン、オリゴヌクレオチド及び遺伝子治療薬等が挙げられる。また、アミン系の薬剤、例えば塩酸アミトリプチリン、塩酸イミプラミン、塩酸クロミプラミン、マレイン酸トリミプラミン、塩酸ノルトリプチリン、アモキサピン、塩酸ドスレピン、塩酸ロフェプラミン）等を挙げることもできる。また、シスプラチン等の錯体系の薬剤であってもよい。
【００６３】
また、光学特性の機能を有する薬剤として代表的な、蛍光物質としては、ナイルレッド等が好ましく例示できる。
【００６４】
本発明に係る金ナノ複合体において、金ナノ粒子が吸着する薬剤は、後述するようなチオール類の存在下において、金ナノ粒子に対しチオール類が強い吸着性を示すために置換され、金ナノ粒子から遊離するものと考えられる。金ナノ粒子に対して、チオール化合物よりも強い吸着性を有する薬剤であると、チオール類存在下における熱刺激によっても、金ナノ複合体より放出されにくいものとなる。このため、使用するチオール類の種類によっても左右されるが、概して、金ナノ粒子に対してある程度の吸着性を示す一方で、チオール類の吸着性よりも低い吸着性を発揮する化合物が用いられる。こうした化合物としては、特にチオール化合物の有するチオール基よりも、金ナノ粒子表面に対し弱い相互作用を示す官能基ないし骨格構造を有する、例えばエチル基やメチル基のようなアルキル基、フェニル基、水酸基、カルボキシル基、アミノ基等を適度に有する化合物等が用いられる。
【００６５】
また、金ナノ粒子に対して、いわゆる保護コロイドを形成するような高分子化合物、つまり１分子が多数の点で金ナノ粒子表面に吸着（多点吸着）する高分子化合物等は、チオール類の添加によっても脱着が生じにくいと考えられる。そのため、本発明に係るナノ複合体に使用する薬剤としては、概して適当ではないものが多い。
【００６６】
［金ナノ複合体の製造方法１］
本発明に係る金ナノ複合体は、基本的には、金ナノ粒子のコロイド溶液に対し、薬剤水溶液、熱応答性高分子溶液の順に添加し、金ナノ粒子に対して先に薬剤を吸着させてから、熱応答性高分子を被覆することによって製造することができる。
【００６７】
なお、上記とは異なり、金ナノ粒子のコロイド溶液に対し、先に熱応答性高分子溶液を添加した後、薬剤水溶液を添加する順序で金ナノ複合体を調製すると、金ナノ粒子に先に熱応答性高分子を被覆されてしまう。このことから、得られる金ナノ複合体において、薬剤分子は金ナノ粒子にはあまり直接吸着せず、金ナノ粒子を被覆している熱応答性高分子に取り込まれている状態になっていることが推測される。本発明者が確認したところによれば、この場合、後述するようなチオール類等の分子スイッチの添加有無ないしは添加する有機化合物分子のチオール基含有の有無にかかわらず、熱刺激によって薬剤分子の放出が見られる。このことから、本発明に係る金ナノ複合体の製造方法としては、上記したように、金ナノ粒子のコロイド溶液に対し、先に薬剤水溶液を接触させることが肝要であると考えられる。
【００６８】
使用する熱応答性高分子は、通常、１種の熱応答性高分子であるが、金ナノ複合体を製造することが可能であれば２種以上の熱応答性高分子であってもよい。また、金ナノ複合体を製造する際の、混合溶液のｐＨは含有させる薬剤及び熱応答性高分子の種類にもよるが、通常、２．９〜１０．０の範囲であることが好ましい。
【００６９】
混合溶液には、金ナノ粒子が０．００１８〜０．００９０質量％の範囲で含まれることが好ましく、熱応答性高分子は、使用する熱応答性高分子の種類によっても左右されるが０．２５〜２．０質量％の範囲で含まれることが好ましい。また、薬剤の濃度としては、使用する薬剤の種類によっても左右されるが、例えば、金１ｇに対し、０．２〜２０×１０-５Ｍ程度の濃度とすることができる。この程度の薬剤濃度であれば、添加した薬剤を効率よく金ナノ粒子に吸着させることができ、かつ後述するようなチオール類存在下における熱刺激による薬剤放出の作用機序に薬剤の濃度依存性による影響を及ぼすこともない。
【００７０】
［金ナノ複合体の製造方法２］
本発明に係る金ナノ複合体の製造方法としては、特許文献１に記載の製造方法を応用したものを例示することが可能である。
【００７１】
すなわち、金ナノ複合体は、上記した金ナノクラスターの溶液に、薬剤水溶液、熱応答性高分子（カルボキシル基等のアニオン基を含む熱応答性高分子を除く。）溶液を順に添加し、調製された混合溶液を加熱し、冷却することによって、金ナノ複合体が製造される。
【００７２】
混合溶液には、金ナノクラスターが０．００１８〜０．００９０質量％の範囲で含まれることが好ましく、熱応答性高分子が０．２５〜２．０質量％の範囲で含まれることが好ましい。また、金ナノクラスターと熱応答性高分子を質量比で表すと、金ナノクラスター／熱応答性高分子の質量比が９／１００００〜３６／１０００の範囲であることが好ましい。また、薬剤の濃度としては、使用する薬剤の種類によっても左右されるが、例えば、金１ｇに対し、０．２〜２０×１０-５Ｍ程度の濃度とすることができる。この程度の薬剤濃度であれば、添加した薬剤を効率よく金ナノ粒子に吸着させることができ、かつ後述するようなチオール類存在下における熱刺激による薬剤放出の作用機序に薬剤の濃度依存性による影響を及ぼすこともない。
【００７３】
混合溶液に含有させる熱応答性高分子は、通常、１種の熱応答性高分子であるが、金ナノ粒子を製造することが可能であれば２種以上の熱応答性高分子であってもよい。また、混合溶液のｐＨは含有させる熱応答性高分子の種類にもよるが、通常、２．９〜１０．０の範囲であることが好ましい。
【００７４】
金ナノ複合体は、調製された金ナノ複合体の製造用溶液（混合溶液）を加熱し、冷却することによって製造される。加熱は、熱応答性高分子に相転移を起こさせ、金ナノクラスターを融合させる操作である。加熱温度は、４０〜９５℃、好ましくは７０〜９５℃である。温度が高いほど大きな粒径の金ナノ粒子を得ることができる。加熱時間は、３０分〜２時間が好ましい。なお、加熱時間が長くなると大きな粒子の個数が増えて平均粒径が見かけ上大きくなる。しかし、粒子が成長して大きい粒子になるわけではない。また、吸光度の変化は、３０分以上ではあまり変わらない。
【００７５】
冷却は、加熱されて熱応答性高分子が析出し濁った溶液を、再度透明にする操作である。冷却温度は、０〜３０℃、好ましくは４〜１０℃である。冷却温度が低くなるほど早く溶液は透明となる。冷却時間は、３０分以上で十分であり、上限は特に限定されない（１時間又は２時間程度）。
【００７６】
こうした加熱冷却手段により、混合溶液から金ナノ複合体を製造することができる。製造された金ナノ粒子は、ＴＥＭ像から計測できる粒径が５０〜１００ｎｍの範囲であり、動的光散乱法での測定で粒径１００〜５００ｎｍにピークを示す。なお、ＴＥＭ像からの計測は、ＴＥＭ写真を撮影し、その写真から計測したものである。一方、動的光散乱法による粒径の測定は、動的光散乱測定装置で測定されたものである。
【００７７】
［金ナノ複合体からの薬剤放出］
本発明に係る金ナノ複合体からの吸着薬剤分子の放出は、後述するようなグルタチオン等チオール類又はシスチンを添加し、熱刺激（加熱→冷却）を行うことによってなされる。
【００７８】
図１は、金ナノ複合体からの薬剤放出のメカニズムを示す模式図である。すなわち、図１に示すように、金ナノ粒子表面に薬剤分子を吸着させ、熱応答性高分子を被覆してなる金ナノ複合体に対して、チオール類等の分子スイッチとなる有機化合物を添加すると、当該有機化合物分子により、金ナノ粒子表面で吸着分子の置換が起こるものの、薬剤は熱応答性高分子に覆われている金ナノ複合体の中に留まる。この状態で熱刺激（加熱→冷却）を加えると熱応答性高分子が相移転を起こし一旦収縮することで、金ナノ複合体から遊離し放出されというものである。
【００７９】
（チオール類）
次に、上記したような本発明に係る金ナノ複合体からの薬剤放出のために用いられるチオール類について説明する。
【００８０】
金ナノ複合体へのチオール類の吸着によって、金ナノ粒子に吸着した薬剤分子が金ナノ粒子から脱離する。すなわち、凝集状態の金ナノ粒子複合体にチオール基を有するチオール類を加えると、金ナノ粒子の表面で、薬剤分子の官能基等と交換して、金ナノ粒子表面に対し強い結合性を有するチオール基が配位しチオール類が吸着する。
【００８１】
チオール類の添加により、上記のような薬剤分子の脱離を効果的に生じさせるチオール類としては、（１）チオール基の存在、（２）分子サイズ及び構造、（３）カルボキシル基やアミノ基間の水素結合の存在といった要素が必要であると考えられる。
【００８２】
（１）のチオール基は、金ナノ粒子の表面に吸着し、薬剤分子の官能基等との交換反応を起こすと考えられる。酸化型グルタチオンのようなジスルフィド結合を有する化合物、メチオニンのようなスルフィド結合を有する化合物では、チオール基を有する化合物とは異なり、薬剤分子の官能基等との交換反応は生じないように思われる。但し、本発明者の行った実験によれば、ジスルフィド結合を有する化合物であっても、シスチン（システインの２量体）の場合、当該化合物添加後に熱刺激を与えると、薬剤分子の高い放出効果が発揮されることが観察でき、例外的にシスチンは、本発明に係る金ナノ複合体に対し効果的に作用する化合物であるといえる。
【００８３】
（２）の分子サイズ及び構造については、チオール類の金ナノ粒子表面への吸着による薬剤分子との置き換え反応が、概してチオール類が低分子量となる程速く生じるものと思われる。例えば、グルタチオンのように分子サイズが大きいと金ナノ粒子の保護効果が大きいものの、金ナノ複合体の表面に吸着した薬剤分子や熱応答性高分子との置換が遅い。Ｌ−システイン（Ｌ−Ｃｙｓ）、ホモシステイン（Ｈｃｙｓ）等の低分子量のカルボキシル基を有するチオール基含有化合物では金ナノ粒子の保護効果はほとんどなく、反応は速い。グルタチオンとＬ−システインの中間のサイズにあるシステイニルグリシン、グルタミルシステイン等は、金ナノ粒子の保護効果を有し、薬剤分子や熱応答性高分子との置換の反応速度も比較的速いと考えられる。
【００８４】
このため、Ｌ−システイン、Ｈｃｙｓ等の低分子量チオール基含有化合物を用いた場合、当該化合物を添加したのみで、金ナノ複合体からかなりの量の薬剤が放出され、熱刺激によって薬剤を放出するという本発明に係る金ナノ複合体の起動作用が有効に働かないおそれが高い。このような化合物は分子サイズが小さいので、これを添加すると、熱刺激（加熱→冷却）による金ナノ粒子の再分散を阻害する為に薬剤分子の遊離が十分ではなくなり、熱刺激後において遊離薬剤分子量が低下するものと思われる。
【００８５】
システイニルグリシン、グルタミルシステイン等の場合においても、このような傾向はある程度見られるものの、熱刺激を受けた後において金ナノ粒子の再分散が促進され、薬剤放出は、熱刺激を与える前よりも高い割合で生じるため、好ましい化合物といえる。グルタチオンの場合には、当該化合物を添加したのみでは、最も薬剤放出の程度が低く、かつ熱刺激を受けた後における薬剤放出の割合が極めて高いものとなるために、特に好ましい化合物といえる。
【００８６】
（３）カルボキシル基の静電反発については、チオール基含有化合物の酸解離したカルボキシル基の静電反発が大きく関与すると考えられる。グルタチオンの二つのカルボキシル基のｐＫａはｐＫａ１＝２．１６及びｐＫａ２＝３．５５であり、主に検討している熱応答性高分子濃度０．２質量％における複合体溶液のｐＨが約８であるため、カルボキシル基はＣＯＯ−となっている。その一方、ＮＨ基、ＮＨ２基は一部水素イオンが付加して正に帯電している。はじめに金ナノ粒子はクエン酸によりアニオン性の状態であり、静電反発により分散している。この状態にＮＨ基、ＮＨ２基を有するポリマーを添加することにより、金ナノ粒子表面の電荷が部分的に打ち消されるとともに、ＮＨ基、ＮＨ２基が金に吸着して、金ナノ粒子が凝集する。このとき、金ナノ粒子は、ポリマーで被覆され、凝集した粒子間にポリマーが入りこんだ状態になっている。この状態の金ナノ粒子にチオール基含有化合物であるグルタチオン等を添加すると、チオール基とＮＨ基、ＮＨ２基とが交換し、チオール基含有化合物が金ナノ粒子の表面に結合する。このとき、金ナノ粒子の表面では官能基が非常に込み合っている状態となっているが、チオール基含有化合物や熱応答性高分子の極性基（官能基）がランダムな状態で存在することはエネルギー的に不利になる。極性基（官能基）が水素結合により配列することで、エネルギー的に不利な状態が解消される。結果として、金ナノ粒子間の距離を広がることになるものと考えられる。
【００８７】
以上のチオール基の存在、分子サイズや構造、チオール基含有化合物のカルボキシル基の存在、ＮＨ基、ＮＨ２基を有するポリマーによる非共有結合的な保護効果が金ナノ粒子の再分散に影響するほかに、チオール基含有化合物の他の官能基の電荷や溶液中に存在する化合物の構造や各官能基の電荷等が、全体として金ナノ粒子の再分散に影響していると考えられる。
【００８８】
以上の点から、本発明に係る金ナノ複合体による薬剤放出の分子スイッチとして用いられるチオール類としては、特に限定されるものではないが、グルタチオン（ＧＳＨ）、システイニルグリシン（Ｃｙｓ−Ｇｌｙ）、グルタミン酸システイン（Ｇｌｕ−Ｃｙｓ）等が好ましいものとして例示でき、このうち特に好ましくは、グルタチオンである。また、前記したように薬剤放出の分子スイッチとしてシスチンも好ましい化合物として例示できる。
【００８９】
また、このような薬剤放出の分子スイッチとして用いられるチオール類の添加濃度としては、一般的にチオール類の添加濃度が高い程、熱刺激を与えた後に放出される薬剤量が多くなる傾向があるが、一方で添加濃度が高くなる程、熱刺激を与えない状態において放出される薬剤量も多くなる傾向がある。また、ある程度以上の添加濃度とならないと、熱刺激前後における放出薬剤量の有意差が生じない。このため使用するチオール類の種類によっても左右されるため、一概には規定できないが、例えば、グルタチオンを使用する場合には、その濃度が４〜１０×１０−６Ｍ程度とすることが望ましい。
【００９０】
なお、グルタチオン等の好ましいチオール類を薬剤放出の分子スイッチとして用いる場合、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｈｃｙｓ、グリシン、グルタミン酸等の共存物質が存在していても、当該グルタチオン（分子スイッチ）の添加後、熱刺激によって薬剤を放出するという本発明に係る金ナノ複合体の起動作用が有効に機能する。このことは、生体内においては、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｈｃｙｓ、グリシン、グルタミン酸等のアミノ酸、ペプチド等の存在が当然に想定されることから、本発明に係る金ナノ複合体を用いたドラッグデリバリーシステムが生体内において有効に機能するものであると思われる。
【００９１】
（熱刺激）
本発明に係る金ナノ複合体に対し、分子スイッチであるチオール類の添加後、加熱し、冷却することによって、金ナノ複合体よりの薬剤放出が行われる。加熱は、熱応答性高分子に相転移を起こさせる操作である。加熱温度は、４０〜９５℃、好ましくは７０〜９５℃である。加熱時間は、３０分〜２時間が好ましい。蛍光強度から見積もった薬物放出量の変化は、３０分以上ではあまり変わらない。
【００９２】
冷却は、加熱されて相転移を起こし収縮した熱応答性高分子を、再度分散させ金ナノ複合体からの薬剤の放出を行わせる操作である。冷却温度は、０〜３０℃、好ましくは４〜１０℃である。冷却時間は、３０分以上で十分であり、上限は特に限定されない（１時間又は２時間程度）。
【００９３】
金ナノ複合体が分子スイッチ添加及び熱刺激により吸着薬剤分子を放出する現象は、一般的なｐＨ環境であるｐＨ５〜９の範囲内においては、ｐＨ値にあまり依存することなく、ほぼ均一に生じ、熱刺激前において吸着薬剤分子は実質的に放出されないか又はごく微量の放出に留まり、熱刺激後において大きな放出が生じる。より望ましくは、ｐＨ５〜７．５程度の弱酸性ないし中性領域での使用が、熱刺激前の吸着薬剤分子の放出量を抑制しかつ熱刺激後において大きな放出を生じさせる上で好ましい。
【００９４】
（ドラッグデリバリーシステム）
本発明に係る金ナノ複合体に対して、上記したようにチオール類又はシスチンの存在下で熱刺激を与えることで、吸着していた薬剤を放出することができることから、ねらった部位で薬物を的確に放出できるドラッグデリバリーシステムにおいて好適に用いられる。
【００９５】
金ナノ複合体の生体内投与経路としては、特に限定されるものではなく、担持させる薬剤の種類及び薬剤を投与しようとする生体部位ないし組織に応じて、経口、経鼻、経膣、静脈内、皮下、腹腔内等の適当な投与経路を通して生体内に導入することが可能である。
【００９６】
生体内においては、金ナノ複合体の分子スイッチであるチオール類、例えば、分子スイッチとして好適なグルタチオン、システイニルグリシン、グルタミン酸システイン等が本来存在しており、このようなグルタチオン等の濃度が高い生体部位ないし組織をターゲットとする薬剤投与の場合には、系外より別途チオール類を投与せずとも、熱刺激を与えることによって、本発明に係る金ナノ複合体を用いたドラッグデリバリーシステム薬剤を、ターゲット部位において的確に発動させることができる。もちろん、必要に応じて、このような分子スイッチとしてチオール類は、外部より生体内のターゲット部位ないし組織に導入することが可能である。
【００９７】
生体に対し熱刺激（加熱）を行う手段としては、特に限定されるものではなく各種の手法を用いることが可能であるが、例えば、二方向（代表的には直交方向）からの遠赤外レーザー加熱を行えば、ターゲット部位を局所的に加熱することが可能である。
【００９８】
（蛍光センサー）
本発明に係る金ナノ複合体に担持させる薬剤として、蛍光物質、例えば、上記したようなナイルレッド等を用いた場合、再現性の良いナノ蛍光センサーとして用いることがきる。
【００９９】
ナノ粒子蛍光センサー溶液に、チオール化合物であるグルタチオン等の分析対象物質を添加し、熱刺激を加えると、熱応答性高分子の相転移に伴って蛍光物質が金ナノ複合体から遊離する。この結果、金ナノ複合体による蛍光共鳴エネルギー移動(以下FRET)が解消し、蛍光強度が回復する。回復した蛍光強度は添加する分析対象物質の濃度に比例するので、分析対象物質を定量できる。熱刺激を加えないと、蛍光物質が金ナノ複合体から遊離が実質的生じないため、分析対象物質の添加により遊離した蛍光物質が凝集することがなく、再現性良く定量分析が可能である。
【実施例】
【０１００】
以下の実験によって、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例によって何ら限定されるものではない。特に、以下の実施例においては、吸着薬剤の放出の程度の確認を容易とするために、蛍光物質であるナイルレッドを吸着薬剤として使用した例を中心として記載するが、吸着薬剤としては何らこのような蛍光物質に限定されるものではなく、上述したような各種の薬剤が使用可能であることと、このような各種の薬剤においても以下の実施例に示す蛍光物質の場合と同様の有効な薬剤放出現象が生じることは、当業者であれば容易に理解できるものであると思われる。
【０１０１】
［装置及び試薬］
まず、本実施例において用いられた装置及び試薬としては、以下の通りであった。吸収スペクトルの測定には、光路長１ｃｍプラスチックセルを装備した日本分光製Ｖ−５６０型 紫外可視分光光度計を使用した。蛍光スペクトル測定には、光路長１ｃｍ石英セルを装備した日本分光製ＦＰ−６３００型分光蛍光光度計を使用した。
【０１０２】
合成した熱応答性高分子の限外濾過には、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製の限外濾過膜を（排除限界分子量：５０００）を装備したアドバンテック製のプラスチック製ウルトラフィルター用限外濾過器ＭＯＤＥＬ−ＵＨＰ−Ｋを使用した。合成した熱応答性高分子の凍結乾燥には、アルバック機工製のＯＭＴ−０５０Ａ型オイルミストトラップを備え付けたアルバック機工製の直結型油回転真空ポンプ、東京理科器械製のＵＴ−１０００型ユニトラップ、及び東京理科器械製のＣＭＷ−１型水分トラップを装備した東京理科器械製のＦＤ−５Ｎ型凍結乾燥機を使用した。ｐＨの測定には、ＨＯＲＩＢＡ製ｐＨ−ＭＥＴＥＲ Ｆ−１３を使用した。
【０１０３】
α,α’‐アゾビスイソブチロニトリル(AIBN、Fw：164.21)、水酸化カリウム(Fw：56.11)、水酸化ナトリウム(Fw：40.00)、ジエチルエーテル(Fw：74.12)、1,4‐ジオキサン(Fw：88.1)、ペルオキソ二硫酸カリウム(Fw：270.32)、ジエチレントリアミン(DETA、Fw：103.17)は関東化学製特級のものを使用した。ピロガロール(Fw：126.11)は関東化学製1級のものを使用した。メタクリル酸(MA、Fw：86.09)は関東化学製1級のものを凍結法により重合禁止剤を除去してから使用した。トリエチレンテトラミン(TETA、Fw：146.24)は関東化学製ものを使用した。N‐イソプロピルアクリルアミド(NIPAAm、Fw：113.16)は和光純薬製特級を関東化学製特級のヘキサン(Fw：86.18)を用いて再結晶してから使用した。N,N,N’,N’−テトラメチルエチレンジアミン(TEMED、Fw：116.21)は和光純薬特級を使用した。塩化アクリロイル(AC、Fw：90.51)は和光純薬1級を用いた。テトラクロロ金酸四水和物(Fw：411.85)、クエン酸三ナトリウム二水和物(Fw：294.1)、アセトン(Fw：58.08)は関東化学製特級のものを使用した。Nile Red(NR、Fw：318.57)は東京化成製1級のものを使用した。グリシン(Gly、Fw：75.07)、グルタミン酸(Fw：147.03)、L‐システイン(L-Cys、Fw：121.16)、1-ブタンチオール(Fw：90.19)、1-オクタンチオール(Fw：146.29)、2-メルカプトエタノール(Fw：78.13)、2,3-ジメルカプト-1-プロパノール (Fw：124.23)は関東化学製特級のものを、還元型グルタチオン(GSH、Fw：307.32)、3-メルカプト-1,2-プロパンジオール(Fw：108.16)は関東化学製1級のものを使用した。3-メルカプトプロピオン酸 (3-MPA、Fw：106.14)、1,2-エタンジチオール(Fw：94.2)は東京化成製特級のものを、酸化型グルタチオン(GSSG、Fw：612.63)、n-ドデシルメルカプタン(Fw：202.4)、3-メルカプトプロピオン酸エチル (Fw：134.2)は東京化成製1級のものをシスタミン硫酸塩(Fw：250.36)、Ｈｃｙｓ(Fw：135.19)は東京化成製のものを使用した。グルタミルシステイン(Glu-Cys、Fw：250.27)、システイニルグリシン(Cys-Gly、Fw：178.2)、ＤＬ−ペニシラミン(Fw：149.2)はSigma製ものを使用した。
【０１０４】
実験における水は、蒸留、イオン交換した後、Ｍｉｌｌｐｏｒｅ製のＭｉｌｌｉ−Ｑ超純水製造システムで製造したものを使用した。メタノール（Ｆｗ：３２．０４）は関東化学製特級のものを蒸留してから使用した。
【０１０５】
［合成例１（金ナノ粒子の調製）］
金ナノ粒子溶液の調製は、クエン酸ナトリウム還元法により行った。使用した器具は、全て王水に３０分間浸漬後、超純水で洗浄し、乾燥させたものを用いた。調製手順を以下に示す。５００ｍＬ丸底フラスコに１ｍＭテトラクロロ金酸塩水溶液、２５０ｍＬを入れ、激しく攪拌しながら、沸騰直前まで加熱した。沸騰させたまま３８．８ｍＭクエン酸三ナトリウム水溶液、２５ｍＬを添加し、溶液の色が淡黄色から深赤色へと変化することを確認した。さらに攪拌しながら１０分間加熱させた後、室温において１５分間攪拌し続けた。溶液を孔径１μｍメンブランフィルターを用いて吸引ろ過を行い、金ナノ粒子溶液をガラス試薬瓶に移し、冷暗所（４℃）に保管した（０．１８ｇ−Ａｕ／Ｌ金コロイド溶液）。
【０１０６】
［合成例２（化学式１／Ｐ−ＮＩＰの合成）］
５００ｍＬ三つ口セパラブルフラスコにＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）３０ｇを採り、水１００ｍＬで溶解した。氷浴を用いてフラスコを０℃に保ち、攪拌しながら、重合開始剤としてペルオキソ二硫酸カリウム１．０ｇ及び重合促進剤としてＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）１．５ｍＬを添加し、４時間重合した。合成したＰ−ＮＩＰの構造式は、上記化学式１のＲ１とＲ２をメチル基としＲ３を水素原子としたものである。重合終了後、メタノール１００ｍＬを加えて沈殿したポリマーを取り出し、メタノール１００ｍＬに溶解した。この溶液に、水１００ｍＬを加え、沈殿したポリマー取り出して水１００ｍＬに溶解した。この操作を二回繰り返し行い、精製したＰ−ＮＩＰを水に溶解し、凍結乾燥を行った。さらに、得られたポリマーを水に溶解して凍結乾燥を行い、冷暗所に保存した。この熱応答性高分子の下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）は３４．１℃であった。
【０１０７】
［合成例３（化学式２／ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルトリエチレンテトラミン）の合成）］
トリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ）をモノマーとして用いる場合、あらかじめビニル基を導入する必要がある。そこでまずＴＥＴＡと塩化アクリロイル（ＡＣ）よりアクリロイルトリエチレンテトラミン［以下、ＡＣ−ＴＥＴＡ］の合成を行った。ＴＥＴＡ２９．７３ｍＬ（０．２ｍｏｌ）と１，４−ジオキサン２００ｍＬの混合溶液に、ＡＣ１．６２５ｍＬ（０．０２ｍｏｌ）と１，４−ジオキサン５０ｍＬの混合溶液を冷却、攪拌しながら一滴ずつ滴下して反応させた。滴下終了後、白色の沈殿を濾別し少量のメタノールに溶解した。これに水酸化カリウム−メタノール溶液（水酸化カリウム １．１８ｇ（０．０２ｍｏｌ））を含む１００ｍＬを加えて攪拌、濾別し得られた濾液をＮＩＰＡＡｍとの共重合に用いた。
【０１０８】
５００ｍＬ三つ口セパラブルフラスコにモノマーの供給比（ＮＩＰＡＡｍの物質量：ＴＥＴＡの物質量）がモル比で９０：１０（ｍｏｌ％）となるようにＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）２０．３７ｇ（０．１８ｍｏｌ）とＡＣ−ＴＥＴＡを含むメタノール溶液を加えた。オイルバスを用いてフラスコを６０℃に加温、攪拌しながら、重合促進剤として３−メルカプトプロピオン酸（３−ＭＰＡ）（メタノール２０ｍＬに対して０．１ｍＬ）及び重合開始剤としてα，α’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）０．８２１１ｇ（０．００５ｍｏｌ）を添加して、５ｗ／ｖ％ ピロガロール−１０ｗ／ｖ％アルカリ溶液（アルカリ：ＮａＯＨ）１００ｍＬを用いた脱酸素ラインに通気した窒素雰囲気下で４時間重合を行った。
【０１０９】
得られたポリマーは以下の手順で精製した。まず、得られた重合反応物をエバポレーターにてポリマーの溶解液に含まれるメタノールを除去した後に、冷ジエチルエーテル１．０Ｌに注いだ。この上澄み液をデカンテーションして取り除き、メタノールで再度溶解した。この工程を２回繰り返した後、デカンテーション後に得られた沈殿物に水を加えて３００ｍＬとした。この溶液を分子量５０００の限外濾過膜を用いて透析を６回行い、未反応モノマーを除去した。その後、得られたポリマー溶液に凍結乾燥を行い冷暗所で保存した。合成したポリ(Ｎ−イソプロピルアクリルアミド-co-アクリロイルトリエチレンテトラミン)［以下、ＮＩＰ−ＴＥＴＡ］の構造式は、上記化学式２のＲ１とＲ２をメチル基としＲ３とＲ４を水素原子、ｎを２としたものである。得られたＮＩＰ−ＴＥＴＡの下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）は３８．３℃であった。
【０１１０】
［合成例４（化学式２／ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルジトリエチレンテトラミン）の合成）］
ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）をモノマーとして用いる場合、ＤＥＴＡにビニル基を導入する必要がある。そこで、まずＤＥＴＡと塩化アクリロイル（ＡＣ）よりアクリロイルジエチレントリアミン［以下、ＡＣ−ＤＥＴＡ］の合成を以下の手順で行った。ＤＥＴＡを含む１，４−ジオキサンの混合溶液（２０．６３ｇ／２００ｍＬ）に、ＡＣと１，４−ジオキサンの混合溶液（１．６２５ｍＬ／５０ｍＬ）を冷却、攪拌しながら一滴ずつ滴下して反応させた（ＤＥＴＡの物質量：ＡＣの物質量＝１０：１）。滴下終了後、白色の沈殿を濾別し、少量のメタノールに溶解した。これにＫＯＨ−メタノール溶液を加えて攪拌、濾別し、得られた濾液をＮＩＰＡＡｍとの共重合に用いた。
【０１１１】
５００ｍＬ三つ口セパラブルフラスコにモノマーの供給比（ＮＩＰＡＡｍの物質量：ＤＥＴＡの物質量）がモル比で９０：１０（ｍｏｌ％）となるようにＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）とＡＣ−ＤＥＴＡを含むメタノール溶液を加えた。重合促進剤として３−メルカプトプロピオン酸（３−ＭＰＡ）（メタノール２０ｍＬに対して０．１ｍＬ）を、重合開始剤としてα，α’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）０．３２８４ｇ（０．００５ｍｏｌ）を添加した。油浴中においてフラスコ内の溶液を攪拌しながら脱酸素ライン（５ｗ／ｖ％ピロガロール−１０ｗ／ｖ％ＮａＯＨ溶液１００ｍＬ）に通気した窒素をフラスコ内に通気し、窒素雰囲気下で３０分間脱酸素を行った。その後、窒素を通気しながら、６０℃に加温し、窒素雰囲気下で４時間重合を行った。得られたポリマーは以下の手順で精製した。まず、得られた重合反応物をエバポレーターにてポリマーの溶解液に含まれるメタノールを可能な限り除去した後に、冷ジエチルエーテル１．０Ｌに注いだ。この上澄み液をデカンテーションして取り除き、メタノールで再度溶解した。この工程を２回繰り返した後、デカンテーション後に得られた沈殿物に水を加えて３００ｍＬとした。この溶液を分子量５０００の限外濾過膜を用いて透析を６回行い、未反応ポリマーを除去した。その後、得られたポリマー溶液に凍結乾燥を行い冷暗所で保存した。合成したポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルジトリエチレンテトラミン）［以下、ＮＩＰ−ＤＥＴＡ］の構造式は、上記化学式２のＲ１とＲ２をメチル基としＲ３とＲ４を水素原子、ｎを１としたものである。得られたＮＩＰ−ＤＥＴＡの下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）は３８．４℃であった。
【０１１２】
［合成例５（化学式６／ｐＮＩＰ−ＭＡの合成）］
５００ｍＬ三つ口セパラブルフラスコに、モノマーの供給比（ＮＩＰＡＡｍの物質量：ＭＡの物質量）をモル比で（９０：１０）（ｍｏｌ％）となるようにＮＩＰＡＡｍ２０．３７ｇ（０．１８ｍｏｌ）とメタクリル酸（ＭＡ）１．７２ｇ（０．０２ｍｏｌ）を入れた。ＮＩＰＡＡｍとＭＡの含量が両者の和として３０質量％となるようにメタノール６５．２ｍＬを添加してモノマーを溶解した。オイルバスを用いてフラスコを６０℃に加温し、攪拌しながら、重合促進剤として３−ＭＰＡ（メタノール２０ｍＬに対して０．１ｍＬ）を、重合開始剤としてＡＩＢＮ０．８２１１ｇ（０．００５ｍｏｌ）を添加して、脱酸素ライン（５ｗ／ｖ％ピロガロール−１０ｗ／ｖ％水酸化ナトリウム溶液１００ｍＬ）に通気した窒素をフラスコ内に通気し、窒素雰囲気下で４時間重合を行った。重合終了後、生成物を含むメタノール溶液を室温まで冷却する。メタノール１００ｍＬに対して２Ｌの冷ジエチルエーテルを用い、生成物を含むメタノール溶液を冷ジエチルエーテルに１滴ずつゆっくり滴下し、攪拌する。これにより析出したガム状の生成物を回収し、再びメタノール約５０ｍＬに溶解する。この精製を２回行った後、得られたポリマーを水に溶解し、溶液を凍結させた。溶液が完全に凍結した後、凍結乾燥を行い、冷暗所に保存した。合成したｐＮＩＰ−ＭＡの構造式は上記化学式６のＲ１とＲ２をメチル基としＲ３とＲ４を水素原子としたものである。得られたｐＮＩＰ−ＭＡの下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）は３５．７℃であった。
【０１１３】
［参考例１（蛍光物質の特性）］
本発明に係る金ナノ複合体の薬剤放出特性を評価するための吸着薬剤として、蛍光物質Nile Redを使用した。そこでまず、Nile Redの蛍光スペクトル測定を行った。Nile Redを０．０１５９ｇ（５．０×１０−５ｍｏｌ）採り、少量のアセトンで溶解したのち、アセトンで２０ｍＬに定容した（２．５×１０−３Ｍ）。この溶液０．０４ｍＬを１０ｍＬメスフラスコに採り、水で定容した（１．０×１０−５Ｍ）。このNile Red水溶液を１０ｍＬメスフラスコに０〜０．１００ｍＬに採り、水で１０ｍＬに定要した（０〜１．０×１０−７Ｍ）。これらの溶液の蛍光スペクトルを励起波長を５８０ｎｍ、蛍光波長を６５２ｎｍに固定して測定した。その結果、Nile Redの濃度に応じて蛍光強度の増加が確認できた。
【０１１４】
Nile Redを熱応答性高分子及び、金ナノ粒子に混合することから、以下の実験では、Nile Redの最終濃度を、１．０×１０−７Ｍとした。後に詳述するが、この濃度のNile Redは、再分散には全く影響を及ぼさない。なお、図２に、１．０×１０−７Ｍの濃度におけるNile Redの励起及び蛍光スペクトルを示す。
【０１１５】
［実施例１〜４及び比較例１］
（金ナノ複合体の調製及び熱応答性高分子の相違による薬剤放出評価）
１０ｍＬメスフラスコに０．１８ｇ−Ａｕ／Ｌ金ナノ粒子溶液３．０ｍＬを添加し、１．０×１０−５Ｍ Nile Red溶液０．１００ｍＬを添加し、上記合成例２〜５で調製した各熱応答性高分子の２．０質量％溶液３．７５ｍＬを添加し、水で１０ｍＬに定容とした。
【０１１６】
調製した金ナノ複合体（実施例１〜４）からの薬剤放出を評価するため、励起波長を５８０ｎｍ、蛍光波長を６５２ｎｍに固定して、蛍光スペクトル測定を行った。その後、９０℃で３０分間、加熱を行い、４℃で１時間冷却を行い、同様の条件で蛍光スペクトル測定を行った。
【０１１７】
また、調製した各金ナノ複合体溶液に、チオール類として、１．０×１０−３Ｍグルタチオン（ＧＳＨ）溶液２５０μＬを添加した後、上記と同様の条件にて、蛍光スペクトル測定を行った。その後、９０℃で３０分間、加熱を行い、４℃で１時間冷却を行い、同様の条件で蛍光スペクトル測定を行った。
【０１１８】
また、比較のために、１０ｍＬメスフラスコに０．１８ｇ−Ａｕ／Ｌ金ナノ粒子溶液０〜５．０ｍＬを添加し、１．０×１０−５Ｍ Nile Red溶液０．１００ｍＬを添加して水で１０ｍＬに定容した。
【０１１９】
得られた比較用金ナノ複合体（比較例１）に対し、実施例１〜４と同様に、ＧＳＨ無添加の状態での加熱前後の蛍光スペクトル測定、ＧＳＨ添加状態での加熱前後の蛍光スペクトル測定を行った。
【０１２０】
得られた結果を、図３に示す。図３中、Ａｕ＋ＮＲは、金ナノ粒子にNile Redを吸着させた比較例１の比較用金ナノ複合体を、「Ｐ−ＮＩＰ」は、金ナノ粒子にNile Redを吸着させ合成例２のＰ−ＮＩＰを被覆した実施例１の金ナノ複合体を、「ＴＥＴＡ」は、金ナノ粒子にNile Redを吸着させ合成例３のＮＩＰ−ＴＥＴＡを被覆した実施例２の金ナノ複合体を、「ＤＥＴＡ」は、金ナノ粒子にNile Redを吸着させ合成例４のＮＩＰ−ＤＥＴＡを被覆した実施例３の金ナノ複合体を、「ＭＡ」は、金ナノ粒子にNile Redを吸着させ合成例５のｐＮＩＰ−ＭＡを被覆した実施例４の金ナノ複合体を、それぞれ示すものである。
【０１２１】
図３に示すように、実施例１〜４の金ナノ複合体はいずれもＧＳＨを添加しない系に比較して、ＧＳＨを添加した系において、加熱後において高い蛍光強度を示し、ＧＳＨを添加し熱刺激を与えることによって、金ナノ複合体からNile Redが効果的に遊離することが明らかとなった。また、比較例１のものと比べて、ＧＳＨを添加した系における加熱後の蛍光強度は、いずれも大きな値であり、本発明に係る金ナノ複合体によるチオール類共存下における熱刺激による薬剤放出効果が優れたものであることが示された。
【０１２２】
なお、図３に示すように、ＮＩＰ−ＴＥＴＡを被覆した際（実施例２）は、ＧＳＨを添加しない系においても、Nile Redが一部遊離していることが分かった。これは、ＴＥＴＡ基が金ナノ粒子表面に吸着した際に、Nile Redを交換したために生じると思われる。これに対して、その他の熱応答性高分子を加えた場合にはＮｉｌｅ Ｒｅｄの遊離は観測されなかった。
【０１２３】
一方、ＧＳＨを添加した系においては、ＧＳＨはチオール基を有することから金ナノ粒子と特異的に反応しかつ、加熱・冷却なしでも再分散を促進する効果があることが観察できる。このことから、熱刺激によって再分散を起こすＮＩＰ−ＴＥＴＡ（実施例２）とＮＩＰ−ＤＥＴＡ（実施例３）は、ＧＳＨ添加によりNile Redが効果的に遊離するために蛍光強度が大幅に回復したと考えられる。再分散を起こさないＮＩＰ−ＭＡ（実施例４）とＰ−ＮＩＰ（実施例１）においても、添加したＧＳＨによってNile Redの遊離がある程度生じたものと思われ、熱刺激後において比較的高い蛍光強度を示したものと考えられる。
【０１２４】
［実施例５］
（金ナノ複合体の調製及び熱応答性高分子の濃度による薬剤放出評価）
１０ｍＬメスフラスコに０．１８ｇ−Ａｕ／Ｌ金ナノ粒子溶液を添加し、１．０×１０−５Ｍ Nile Red溶液０．１００ｍＬを添加し、熱応答性高分子の最終濃度が０〜１．０質量％の時は、２．０質量％熱応答性高分子溶液を０〜５ｍＬ加え、ポリマーの最終濃度が１．２５及び１．５０質量％の時は５．０質量％熱応答性高分子溶液を２．５ｍＬ及び３ｍＬ加えて、水で最終体積が１０ｍＬとして、熱応答性高分子濃度の異なる金ナノ複合体を調製した。なお、使用した熱応答性高分子としては、合成例４のＮＩＰ−ＤＥＴＡを用いた。
【０１２５】
これらの各溶液について、実施例１〜４と同様の条件下に、ＧＳＨ無添加の状態で測定を行った。得られた結果を、図４に示す。図４に示すように、ＧＳＨを添加しない系においては、被覆したＮＩＰ−ＤＥＴＡの量にかかわらす、熱刺激を加えてもNile Redの遊離はほどんど起こっておらず、一方ＧＳＨを添加している系においては、熱刺激後に大きなNile Redの遊離が起こることが示された。ＮＩＰ−ＤＥＴＡの添加濃度が０．２５質量％以上となると、ＮＩＰ−ＤＥＴＡを添加しない場合と比較して、その熱刺激後のNile Redの遊離量に有意な差が見られ、特に、添加濃度約０．５〜約１．０質量％の範囲内において、大きな効果が得られた。
【０１２６】
［実施例６］
（金ナノ複合体の調製及び熱応答性高分子の濃度による薬剤放出評価）
使用する熱応答性高分子として、合成例４のＮＩＰ−ＤＥＴＡに代えて、合成例３のＮＩＰ−ＴＥＴＡを用いた以外は、実施例５と同様にして、熱応答性高分子濃度の異なる金ナノ複合体を調製し、これらの各溶液について、ＧＳＨ添加状態での加熱前後の蛍光スペクトル測定を実施例５と同様にして行った。
【０１２７】
得られた結果を、図５に示す。図５に示すようにＧＳＨを添加している系において、熱刺激後に大きなNile Redの遊離が起こることが示された。ＮＩＰ−ＴＥＴＡの添加濃度が比較的低いところでも、ＮＩＰ−ＴＥＴＡを添加しない場合と比較して、その熱刺激後のNile Redの遊離量に有意な差が見られたが、ＮＩＰ−ＴＥＴＡの添加濃度が約１．０質量％を超えると、ＮＩＰ−ＴＥＴＡを添加しない場合と比べて熱刺激前におけるNile Redの遊離量が大きくなってしまう傾向が見られた。熱刺激前後における蛍光強度差からみると、添加濃度としては、約０．２５〜約１．２５質量％、特に約０．２５質量％前後の範囲内において、大きな効果が得られた。
【０１２８】
［実施例７］
（金ナノ複合体の調製及び環境ｐＨ条件の変動による薬剤放出評価）
１０ｍＬメスフラスコに０．１８ｇ−Ａｕ／Ｌ金ナノ粒子溶液を添加し、１．０×１０−５Ｍ Nile Red溶液０．１００ｍＬを添加し、２質量％ＮＩＰ−ＤＥＴＡ溶液 ３．７３ｍＬを加えて、水で最終体積が１０ｍＬとした。この溶液に１．０Ｍ ＮａＯＨ水溶液及び、１Ｍ ＨＣｌ水溶液を少量加えることによりｐＨを５．０〜９．０の間で調整した。各溶液に対し、１．０×１０−３Ｍグルタチオン（ＧＳＨ）溶液２５０μｍμＬを添加した後、実施例１〜４におけるものと同様の条件にて、蛍光スペクトル測定を行った。その後、９０℃で３０分間、加熱を行い、４℃で１時間冷却を行い、同様の条件で蛍光スペクトル測定を行った。
【０１２９】
得られた結果を図６に示す。図６に示すように、ＧＳＨ添加系において熱刺激により吸着薬剤分子を放出する現象は、測定したｐＨ５〜９の範囲内においては、ｐＨ値にあまり依存することなく、ほぼ均一に生じ、熱刺激前において吸着薬剤分子はごく微量の放出に留まり、熱刺激後において大きな放出が生じることが示された。特にｐＨ５．５〜ｐＨ７．５の範囲において良好な結果が得られた。
【０１３０】
［実施例８］
（熱刺激温度の変動による薬剤放出評価）
１０ｍＬメスフラスコに０．１８ｇ−Ａｕ／Ｌ金ナノ粒子溶液を添加し、１．０×１０−５Ｍ Nile Red溶液０．１００ｍＬを添加し、２質量％ＮＩＰ−ＤＥＴＡ溶液 ３．７３ｍＬを加えて、水で最終体積が１０ｍＬとした。
【０１３１】
得られた金ナノ複合体溶液に対し、１．０×１０−３Ｍグルタチオン（ＧＳＨ）溶液２５０μＬを添加した後、実施例１〜４におけるものと同様の条件にて、蛍光スペクトル測定を行った。その後、加熱温度を３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０℃に設定して３０分間、加熱を行った後、４℃で１時間冷却を行い、同様の条件で蛍光スペクトル測定を行った。
【０１３２】
得られた結果を図７に示す。図７に示すように、加熱温度が約４０℃以上、特に約７０℃となると熱刺激による良好なNile Redの遊離が生じた。
【０１３３】
［実施例９〜１２及び参考例２〜７］
（分子スイッチの評価）
１０ｍＬメスフラスコに０．１８ｇ−Ａｕ／Ｌ金ナノ粒子溶液を添加し、１．０×１０−５Ｍ Nile Red溶液０．１００ｍＬを添加し、２質量％ＮＩＰ−ＤＥＴＡ溶液 ３．７３ｍＬを加えて、水で最終体積が１０ｍＬとした。
【０１３４】
得られた金ナノ複合体溶液に対し、１．０×１０−３Ｍの各化合物溶液を２５０μＬを添加した後、実施例１〜４におけるものと同様の条件にて、蛍光スペクトル測定を行った。その後、加熱温度を９０℃で３０分間、加熱を行った後、４℃で１時間冷却を行い、同様の条件で蛍光スペクトル測定を行った。
【０１３５】
なお、添加した化合物は、グルタチオン（ＧＳＨ）（実施例９）、システイニルグリシン（Ｃｙｓ−Ｇｌｙ）（実施例１０）、シスチン（実施例１０）、グルタミン酸システイン（Ｇｌｕ−Ｃｙｓ）（実施例１１）、グリシン（Ｇｌｙ）（参考例２）、グルタミン酸（参考例３）、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）（参考例４）、Ｌ−システイン（Ｌ−Ｃｙｓ）（参考例５）、Ｈｃｙｓ（参考例６）、メチオニン（参考例７）であった。使用した化合物の構造式を図８に示す。
【０１３６】
得られた結果を図９に示す。図９に示すように、ＧＳＨ、Ｃｌｙ−Ｃｙｓ、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｈｃｙｓのチオール化合物を用いた場合は、いずれもＮｉｌｅ Ｒｅｄが遊離していることが確認できた。その中でも、ＧＳＨ、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ、が非常に大きな蛍光強度の回復が確認できた。ＧＳＨ、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、Ｃｙｓ−Ｇｌｙは分子サイズが大きいことから再分散を促進し、熱刺激を与えることで十分な再分散を行うことができ、これによって蛍光強度の回復が起こるものと考えられる。Ｌ−Ｃｙｓ、Ｈｃｙｓでは分子サイズが小さいので、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｈｃｙｓを添加すると再分散を阻害する為にＮｉｌｅ Ｒｅｄの遊離が十分ではなくなり、結果として加熱・冷却しても蛍光強度が十分には回復しなかったものと考えられる。
【０１３７】
Ｇｌｙ、グルタミン酸は、チオール基を含まない化合物であるため、金ナノ粒子と反応せず、加熱後においてもＮｉｌｅ Ｒｅｄが遊離しておらず、分子スイッチとして不適であることが示された。また、ジスルフィド結合を有するＧＳＳＧ、スルフィド結合を有するメチオニンに関しても、加熱後においてもＮｉｌｅ Ｒｅｄが遊離していなかったが、ジスルフィド結合を有するシスチンに関しては、加熱・冷却後に蛍光強度が大きく回復しており、分子スイッチとして適用可能であることが示された。
【０１３８】
［実施例１３〜１６及び参考例８〜９］
（分子スイッチの評価）
実施例９〜１２及び参考例２〜７における結果から、分子スイッチとして好適であると思われるＧＳＨ、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ、シスチンに関し、その濃度の検討を行った。比較のために、併せてＬ−Ｃｙｓ、Ｈｃｙｓに関しても同様の検討を行った。
【０１３９】
実験は、実施例９〜１２及び参考例２〜７におけるものと同様にして得られた金ナノ複合体溶液に対し、１．０×１０−３Ｍの各化合物溶液を０〜２５０μＬの範囲で添加量を変えてを添加した後、実施例１〜４におけるものと同様の条件にて、蛍光スペクトル測定を行った。その後、加熱温度を９０℃で３０分間、加熱を行った後、４℃で１時間冷却を行い、同様の条件で蛍光スペクトル測定を行った。
【０１４０】
得られた結果を図１０に示す。図１０に示すように、ＧＳＨ、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ、シスチンは測定した０．５〜２．５×１０−５Ｍの濃度範囲において、分子スイッチとして有効に機能していることが確認できた。
【０１４１】
なお、ＧＳＨにおいては、比較的添加濃度が低いところにおいても有意な効果が見られたため、濃度０〜１×１０−６Ｍの範囲内においてより細かな濃度変化を与え、濃度変動による効果の違いを調べた。得られた結果を図１１に示す。図１１に示すように、濃度が約４×１０−６Ｍ以上となると、加熱・冷却後に蛍光強度が大きく回復していることが判った。
【０１４２】
［実施例１７］
（共存物質の影響の検討）
実施例１３〜１６及び参考例８〜９の結果から、分子スイッチとしてＧＳＨが適当なものの１つであることが判ったため、このＧＳＨの分子スイッチの機能が、共存物質により影響を受けるかどうかについて検討を行った。
【０１４３】
１０ｍＬメスフラスコに０．１８ｇ−Ａｕ／Ｌ金ナノ粒子溶液を添加し、１．０×１０−５Ｍ Nile Red溶液０．１００ｍＬを添加し、２質量％ＮＩＰ−ＤＥＴＡ溶液 ３．７３ｍＬを加えて、水で最終体積を１０ｍＬとした。
【０１４４】
得られた金ナノ複合体溶液に対し、１．０×１０−３ＭのＧＳＨ溶液を５０μＬ、共存物質としてＬ−Ｃｙｓ、Ｈｃｙｓ、Ｇｌｙ、グルタミン酸のそれぞれ１．０×１０−３Ｍ溶液を５０μＬ添加した後、実施例１〜４におけるものと同様の条件にて、蛍光スペクトル測定を行った。その後、加熱温度を９０℃で３０分間、加熱を行った後、４℃で１時間冷却を行い、同様の条件で蛍光スペクトル測定を行った。なお比較対照として、共存物質を添加せず１．０×１０−３ＭのＧＳＨ溶液を５０μＬのみ添加した系も別途調製し、同様の測定を行った。
【０１４５】
得られた結果を図１２に示す。図１２に示すように、共存物質の存在下においても、ＧＳＨは分子スイッチとして有効に機能することが確認できた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に薬剤を吸着した金ナノ粒子と、該金ナノ粒子を被覆してなる熱応答性高分子とを有することを特徴とする金ナノ複合体。
【請求項２】
前記熱応答性高分子が、下記化学式２で表されるポリマーであることを特徴とする請求項１に記載の金ナノ複合体（式中、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立にアルキル基を表す。Ｒ３とＲ４はそれぞれ独立に水素又はメチル基を表す。また、ｘ／ｙは９５／５〜７０／３０であり、ｎは１〜４である。）。
【化１】
【請求項３】
前記薬剤が、蛍光物質、生理活性物質又は医薬化合物である、請求項１又は２に記載の金ナノ複合体。
【請求項４】
金ナノ粒子のコロイド溶液に対し、薬剤水溶液、熱応答性高分子溶液の順に添加し、金ナノ粒子に対して先に薬剤を吸着させてから、熱応答性高分子を被覆することを特徴とする金ナノ複合体の製造方法。
【請求項５】
上記請求項１〜３に記載の金ナノ複合体を、チオール類又はシスチンの存在下加熱して使用することを特徴とするドラッグデリバリーシステム薬剤。
【請求項１】
表面に薬剤を吸着した金ナノ粒子と、該金ナノ粒子を被覆してなる熱応答性高分子とを有することを特徴とする金ナノ複合体。
【請求項２】
前記熱応答性高分子が、下記化学式２で表されるポリマーであることを特徴とする請求項１に記載の金ナノ複合体（式中、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立にアルキル基を表す。Ｒ３とＲ４はそれぞれ独立に水素又はメチル基を表す。また、ｘ／ｙは９５／５〜７０／３０であり、ｎは１〜４である。）。
【化１】
【請求項３】
前記薬剤が、蛍光物質、生理活性物質又は医薬化合物である、請求項１又は２に記載の金ナノ複合体。
【請求項４】
金ナノ粒子のコロイド溶液に対し、薬剤水溶液、熱応答性高分子溶液の順に添加し、金ナノ粒子に対して先に薬剤を吸着させてから、熱応答性高分子を被覆することを特徴とする金ナノ複合体の製造方法。
【請求項５】
上記請求項１〜３に記載の金ナノ複合体を、チオール類又はシスチンの存在下加熱して使用することを特徴とするドラッグデリバリーシステム薬剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２０１２−１８０３０１（Ｐ２０１２−１８０３０１Ａ）
【公開日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−４３３４６（Ｐ２０１１−４３３４６）
【出願日】平成２３年２月２８日（２０１１．２．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 刊行物１ ・刊行物名 ：東京コンファレンス２０１０ 講演要旨集 ・巻号頁等 ：２９４頁 ・発行年月日：２０１０年（平成２２年）８月３１日 ・発行者名 ：社団法人 日本分析化学会 刊行物２ ・刊行物名 ：日本分析化学会第５９年会 講演要旨集 ・巻号頁等 ：３６９頁 ・発行年月日：２０１０年（平成２２年）９月１日 ・発行者名 ：社団法人 日本分析化学会
【出願人】（３０４０３６７４３）国立大学法人宇都宮大学 (209)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月２８日（２０１１．２．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 刊行物１ ・刊行物名 ：東京コンファレンス２０１０ 講演要旨集 ・巻号頁等 ：２９４頁 ・発行年月日：２０１０年（平成２２年）８月３１日 ・発行者名 ：社団法人 日本分析化学会 刊行物２ ・刊行物名 ：日本分析化学会第５９年会 講演要旨集 ・巻号頁等 ：３６９頁 ・発行年月日：２０１０年（平成２２年）９月１日 ・発行者名 ：社団法人 日本分析化学会
【出願人】（３０４０３６７４３）国立大学法人宇都宮大学 (209)
【Ｆターム（参考）】
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