金属複合体の製造方法
【課題】金属微粒子と標的化合物とを反応させてなる、金属と標的化合物とを含む金属複合体を簡易に得るための、金属複合体の製造方法を提供する。
【解決手段】金属微粒子と標的化合物とを反応させてなる、金属と標的化合物とを含む金属複合体の製造方法であって、金属微粒子と、標的化合物と、を含む反応液に、レーザを照射することにより、金属複合体を製造する金属複合体の製造方法である。
【解決手段】金属微粒子と標的化合物とを反応させてなる、金属と標的化合物とを含む金属複合体の製造方法であって、金属微粒子と、標的化合物と、を含む反応液に、レーザを照射することにより、金属複合体を製造する金属複合体の製造方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属微粒子と標的化合物とを反応させてなる、金属と標的化合物とを含む金属複合体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
金属の配位化合物、例えば、金あるいは白金のｄ８配位化合物は、抗癌剤などの薬剤として注目されている。この金あるいは白金のｄ８配位化合物が抗癌作用を発現する理由は、金または白金の配位化合物がＤＮＡの塩基部分と配位複合体を形成することにより、ＤＮＡ依存性酵素の活性を抑制するためであると考えられている。すなわち、金あるいは白金等の金属イオンがＤＮＡの塩基部分と結合すると、ＤＮＡの化学構造の他にＤＮＡの２次構造や３次構造を変化させ、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、エステラーゼ、カイネース、その他のヌクレオチドまたはポリヌクレオチド依存性酵素の活性に影響する。この結果、金属の配位化合物は、抗癌剤や、その他にも細胞毒性、抗リューマチ剤等として利用することができる。
【０００３】
金属の配位化合物を抗癌剤等として機能させるためには、例えば、予め金塩化物または白金塩化物のアミン誘導体などを有機化学的に合成し、これを細胞に供与する。するとこの誘導体がＤＮＡと反応して、その塩基部分と金属塩化物との複合体が生じる。その結果として上記の酵素活性に影響する。
【０００４】
そのような金属複合体を得る方法として、例えば、特許文献１には、核酸特異的な金属配位化合物を核酸と反応させて金属配位化合物と核酸との金属複合体を作製し、核酸と複合体を形成していない金属配位化合物及び／又は副生成物を除去し、金属配位化合物と核酸との金属複合体に還元剤を作用させて金属微粒子と核酸との金属複合体を作製する核酸金属化方法が記載されている。
【０００５】
その他にも、金属複合体を得る方法として、例えば、特許文献２には、荷電粒子を利用し、水中で塩溶液と接触させて、オリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子を製造する方法が記載されている。この方法では、金属粒子をクエン酸で還元して金コロイドを調整し、その後オリゴヌクレオチドを付着させる。
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−３７１０９４号公報
【特許文献２】特表２００４−５０１３４０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、従来のように金属配位化合物を抗癌剤等として使用するためには、上記金塩化物または白金塩化物のアミン誘導体などを有機化学的に合成する必要があり、手間がかかった。また、生体内へこの誘導体を投与する必要があり、反応の時間空間の制御が困難であった。
【０００８】
特許文献１及び２の方法でも、金属複合体を得るために複数の工程を経ており、例えば、生体内で金属複合体の生成を行うことは困難である。したがって、簡易に金属複合体を製造する方法の開発が望まれている。
【０００９】
本発明は、金属微粒子と標的化合物とを反応させてなる、金属と標的化合物とを含む金属複合体を簡易に得るための、金属複合体の製造方法である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、金属微粒子と標的化合物とを反応させてなる、金属と標的化合物とを含む金属複合体の製造方法であって、前記金属微粒子と、前記標的化合物と、を含む反応液に、レーザを照射することにより、前記金属複合体を製造する。
【００１１】
また、前記金属複合体の製造方法において、前記反応液は、さらに、アミン化合物と、反応促進剤とを含むことが好ましい。
【００１２】
また、前記金属複合体の製造方法において、前記標的化合物は、生体高分子であることが好ましい。
【００１３】
また、前記金属複合体の製造方法において、前記生体高分子は、核酸であることが好ましい。
【００１４】
また、前記金属複合体の製造方法において、前記生体高分子は、タンパク質であることが好ましい。
【００１５】
また、前記金属複合体の製造方法において、前記金属微粒子は、Ａｕ、Ａｇ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ｃｕ、Ｈｇ、Ｒｅ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｍｏ、Ｗ、Ｔａ及びＮｂから選択される少なくとも１つの金属を含むことが好ましい。
【００１６】
また、前記金属複合体の製造方法において、前記アミン化合物は、Ａｕ、Ａｇ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ｃｕ、Ｈｇ、Ｒｅ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｍｏ、Ｗ、Ｔａ及びＮｂから選択される少なくとも１つの金属と配位結合を形成しやすいアミン化合物を含むことが好ましい。
【００１７】
また、前記金属複合体の製造方法において、前記アミン化合物は、プロリン、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）、ヒスチジン、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、酢酸トリエチルアミン、尿素、アスパラギン、アルギニン、トリプトファン及びスペルミジンから選択される少なくとも１つのアミン化合物を含むことが好ましい。
【００１８】
また、前記金属複合体の製造方法において、前記反応促進剤は、陽イオンであることが好ましい。
【００１９】
また、前記金属複合体の製造方法において、前記陽イオンは、２価以上の多価陽イオンであることが好ましい。
【００２０】
また、前記金属複合体の製造方法において、前記金属複合体は、金属の配位化合物であることが好ましい。
【００２１】
また、前記金属複合体の製造方法において、前記レーザは、パルスレーザであることが好ましい。
【００２２】
また、前記金属複合体の製造方法において、前記レーザの波長は、前記金属微粒子の表面プラズモン共鳴波長付近の波長であることが好ましい。
【００２３】
また、前記金属複合体の製造方法において、前記レーザの波長は、前記金属微粒子が大きな吸収係数を有する波長であることが好ましい。
【００２４】
また、前記金属複合体の製造方法において、前記レーザの波長は、前記金属微粒子のバンド間遷移付近の波長であることが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明の実施形態について説明する。
【００２６】
本発明の実施形態に係る金属複合体の製造方法において、金属微粒子と、標的化合物とを含む反応液に、好ましくは、金属微粒子と、標的化合物と、アミン化合物と、反応促進剤とを含む反応液に、レーザを照射することにより、金属と標的化合物とを含む金属複合体を製造する。金属複合体は、例えば、金属と標的化合物との配位化合物である。
【００２７】
本実施形態に係る金属複合体の製造方法は、例えば、図１に示す金属複合体製造装置を使用して行われる。金属複合体製造装置１は、レーザ発生装置１０、レンズ１２等の集光手段、セル１４、撹拌子１６等の撹拌手段等を含んで構成される。本実施形態に係る金属複合体の製造方法は、具体的には、以下の手順で行われる。
【００２８】
まず、金属微粒子と、標的化合物と、アミン化合物と、反応促進剤と、を含む反応液を準備する。このとき、金属微粒子は、溶液に分散した状態であるが、標的化合物、アミン化合物及び反応促進剤は反応液中に溶解されている状態であることが、反応効率の向上を図れる等の点から好ましい。
【００２９】
本実施形態において使用される金属微粒子の金属としては、典型金属、遷移金属であれば特に制限はないが、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｈｇ、Ｒｅ、Ｙ、Ｚｒ、Ｎｂ、Ｍｏ、Ｗ、Ｔａ、Ｎｂ、Ｒｕ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ａｕ、Ａｇ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ等の遷移金属であることが好ましい。遷移金属の中では、Ａｕ、Ａｇ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ｃｕ、Ｈｇ、Ｒｅ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｍｏ、Ｗ、Ｔａ及びＮｂであることがより好ましく、Ａｕ、Ａｇ及び白金族（Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ）等の貴金属であることが酸化されにくいこと等の点からさらに好ましく、Ａｕ，Ｐｔが特に好ましい。
【００３０】
金属微粒子の粒径としては、金属の溶液中での高い分散性が望ましい等の点から、１μｍ以下であることが好ましく、１ｎｍ〜１００ｎｍの範囲であることがより好ましく、５ｎｍ〜２０ｎｍであることがさらに好ましい。金属微粒子の粒径が１ｎｍより小さいと、照射レーザの波長が短波長になる傾向があり、操作が煩雑になる可能性がある。
【００３１】
金属微粒子の製造方法としては、水等の液体中で金属プレート表面をレーザ照射またはマイクロ波照射によりアブレーションするＳＦ−ＬＡＳ法（Surfactant-free laser ablation in solution）、界面活性剤を添加した水等の液体中で金属プレート表面をレーザ照射またはマイクロ波照射によりアブレーションするＳＣ−ＬＡＳ法（Surfactant-controlled laser ablation in solution）、化学的に還元する方法、溶液中で放電する方法等が挙げられ、特に制限はない。金属微粒子に界面活性剤を添加することにより、金属微粒子を安定化させることができ、製造において操作が容易となる等のため、好ましい。
【００３２】
界面活性剤としては、アニオン系、カチオン系、ノニオン系、両性の界面活性剤を使用することができる。通常は、界面活性剤の溶解度、溶媒中の金属微粒子の安定化力等の点からドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が使用される。
【００３３】
本実施形態において金属微粒子と金属複合体を形成する標的化合物としては、上記金属微粒子と金属複合体を形成する化合物であれば特に制限はないが、生体高分子；電荷移動性を有する高分子等の機能性高分子；等が挙げられ、この中でも金属と配位しやすい等の点から生体高分子であることが好ましい。ここで、生体高分子とは、生体内で合成される高分子化合物であり、例えば、タンパク質；ＤＮＡ，ＲＮＡ等の核酸；多糖等である。このうち、タンパク質または核酸であることが好ましく、ＤＮＡ，ＲＮＡ等の核酸であることが、窒素含有化合物であり、非常に金属と配位しやすい等の点からより好ましい。また、ＤＮＡ、ＲＮＡとしては、１本鎖であっても２本鎖であってもよい。
【００３４】
本実施形態において、金属と標的化合物とを含む金属複合体が形成されるためには、アミン化合物の存在が必要である。アミン化合物としては、１級アミン、２級アミン、３級アミン、４級アミンを含む化合物、例えば、脂肪族アミン類、芳香族アミン類であれば特に制限はないが、例えば、プロリン（Ｐｒｏｌｉｎｅ）、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）、ＨＥＰＥＳ、酢酸トリエチルアミン、尿素、アスパラギン（Ａｓｐａｒｇｉｎｅ）、アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）、トリプトファン（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）、スペルミジン（Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）等が挙げられる。アミン化合物としては、金属イオン、例えば、Ａｕ、Ａｇ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ｃｕ、Ｈｇ、Ｒｅ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｍｏ、Ｗ、Ｔａ及びＮｂから選択される少なくとも１つの金属、と配位結合を形成しやすい化合物であることが好ましい。このような化合物としては、例えば、イオン化エネルギが低い化合物が挙げられる。これは、イオン化エネルギが低い方が電子を金属イオンに受け渡し易く、金属がアミン化合物に配位し易いためと考えられる。傾向としては、イオン化エネルギは８ｅＶ以下であることが好ましい。
【００３５】
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
【化９】
【化１０】
【００３６】
本実施形態において、金属と標的化合物とを含む金属複合体が形成されるためには、アミン化合物の他に反応促進剤が必要である。ここで、反応促進剤としては、例えば、陽イオン、ポリアミン化合物等が挙げられる。陽イオンとしては、特に制限はないが、例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋、等の周期律表１Ａ族の金属イオン；Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋等の周期律表２Ａ族の金属イオン；その他Ｍｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｏ３＋、Ａｌ３＋、Ｓｎ４＋、等の周期律表３Ａ族〜７Ａ族、８族、１Ｂ族〜４Ｂ族の金属イオン；等が挙げられる。これらの中でも、金属と標的化合物とを含む金属複合体を形成する反応効率を高めるためには、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋等の２価以上の多価金属イオンであることが好ましく、価数が多いほどより好ましい。これらの陽イオンを発生する塩としては、特に制限はなく、例えば、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン塩；硫酸塩；炭酸塩；硝酸塩；アンモニウム塩；等を通常用いることができる。
【００３７】
ポリアミン化合物としては、例えば、プトレッシン、スペルミジン、スペルミン等が挙げられる。
【００３８】
反応液に使用される溶媒としては、水や一般的な有機溶媒を使用することができる。水としては、特に制限はなく、例えば、水道水、地下水、イオン交換水、純水、超純水等が挙げられるが、反応効率を向上させるためには不純物が少ない方がよく、通常はイオン交換水、純水、超純水が用いられる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等のアルコール系溶媒；ベンゼン、トルエン等の芳香族系溶媒；塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン系溶媒；ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン等の直鎖飽和炭化水素系溶媒；シクロヘキサン等の環状飽和炭化水素系溶媒；アセトニトリル等を用いることができる。この中で、適用範囲が広いことから水、アルコール系溶媒が好ましく、水がより好ましい。
【００３９】
反応液中の金属微粒子の濃度は、金属微粒子を懸濁できる程度の濃度であれば特に制限はないが、通常、０．１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬの範囲である。反応液中の標的化合物の量は、通常、金属微粒子の量に対して、１０４モル％〜１０８モル％の範囲である。また、反応液中のアミン化合物の濃度は、通常、０．００１Ｍ〜５Ｍの範囲である。反応液中の反応促進剤の濃度としては、０．００１Ｍ〜１０Ｍの範囲であることが好ましい。陽イオンの濃度が０．１Ｍより少ないと、金属複合物の生成が十分に進行しない場合があり、陽イオン濃度が１０Ｍを超えると金属複合物の生成が飽和状態になる場合があるので必要以上に添加する必要はない。
【００４０】
この金属微粒子と、標的化合物と、アミン化合物と、反応促進剤と、を含む反応液は、セル１４に入れられる。セル１４は、通常、石英、ガラス等の材質のものが使用される。
【００４１】
セル１４に入れられた反応液に、レーザ発生装置１０から発せられるレーザが照射される。レーザが所定の強度、所定の時間、反応液に照射されると、金属微粒子から生成する金属原子または金属イオンあるいは金属クラスターまたは金属クラスターイオンと、標的化合物との反応が起こり、金属複合体が得られる。反応液にレーザを照射するときに、レーザはレンズ１２等の集光手段により、反応液中で集光させることが好ましい。反応液中でのレーザの集光領域は、（１μｍ）３〜（１ｍｍ）３の範囲であることが好ましい。装置上の制約から集光領域は（１μｍ）３より小さく絞ることは困難であり、集光領域が（１ｍｍ）３より大きい範囲であると、反応効率が低下する場合がある。また、レーザはパルスレーザであることが好ましい。
【００４２】
反応液に照射されるレーザの強度は、金属微粒子が効率よくアブレーションされる強度であれば特に制限はないが、１００μＪ／パルス〜１００ｍＪ／パルスの範囲であることが好ましく、５ｍＪ／パルス〜２０ｍＪ／パルスの範囲であることがより好ましい。レーザの照射強度が１００μＪ／パルスより低いと、反応が進行しない場合があり、１００ｍＪ／パルスより大きいと、標的化合物や反応生成物が分解してしまう場合がある。
【００４３】
反応液にレーザを照射する時間は、使用する金属微粒子と標的化合物との反応性等に応じて決めればよく、特に制限はないが、通常１分〜１時間の範囲、好ましくは、５分〜１０分の範囲である。
【００４４】
反応液に照射されるレーザの波長としては、金属微粒子が効率よくアブレーションされる波長を選択すればよく、特に制限はないが、金属微粒子の表面プラズモン共鳴波長付近の波長であること、または、金属微粒子が大きな吸収係数を有する波長であること、または、金属微粒子のバンド間遷移付近の波長であることが好ましい。ここで、大きな吸収係数とは、１００Ｍ−１ｃｍ−１以上の強度の吸収であることが好ましい。例えば、金微粒子の場合はその表面プラズモン共鳴波長付近の５３２ｎｍの波長を用いることが好ましい。白金微粒子の場合のように、可視領域に特に強い吸収を有さない場合は、どの波長のレーザを用いてもよい。
【００４５】
使用されるレーザの種類としては、照射するレーザの波長に応じて選択すればよく特に制限はないが、例えば、半導体レーザ、固体レーザ、気体レーザ、色素レーザ、エキシマレーザ等を使用することができる。
【００４６】
なお、反応液に照射されるレーザは、セル１４の開放部を通して照射されることが好ましい。セル１４を通して照射されると、レーザの強度によっては、セル１４自体がレーザによりスパッタされ損傷を受けてしまう可能性がある。また、このため、セル１４は透明な材質であることが好ましい。レーザの照射は、例えば図１に示すように、セル１４の上面開口部から照射される。
【００４７】
反応液の温度は、使用する生体高分子等の標的化合物が分解されない温度であれば特に制限はないが、０℃〜１００℃の範囲、通常は１０℃〜３０℃の室温である。
【００４８】
セル１４に入れられた反応液は、撹拌子１６や撹拌羽根等の撹拌手段により撹拌されることが好ましい。撹拌することによりレーザを反応液全体に均一に照射することができる。撹拌子１６等の撹拌手段を使用しない場合には、レーザを反応液全体に照射するようにスキャンしてもよい。
【００４９】
金属微粒子と標的化合物との反応による金属複合体の生成は、例えば、レーザ照射後の反応液を吸収スペクトル測定用のセルに移し、紫外可視分光器を用いて紫外可視吸収スペクトルを測定することにより確認される。ＳＦ−ＬＡＳ法により作製した金微粒子と、λＤＮＡと、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）と、Ｃａ２＋（塩化カルシウム）とを水に分散、溶解させた反応液をガラスセル中で、Ｎｄ：ＹＡＧレーザの２倍波５３２ｎｍを、溶液を撹拌子ながら照射した反応液についての紫外可視吸収スペクトルの測定結果を図２に示す（詳細な実験条件は実施例１を参照）。図２において、点線は金微粒子分散溶液の吸収スペクトルを、太い実線は金微粒子、λＤＮＡ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）、ＣａＣｌ２を添加後、レーザ照射した反応液の吸収スペクトルを示す。また、３６０ｎｍ付近のピーク強度は３６０ｎｍピークの斜線部分の積分値とする。金微粒子由来の５１７ｎｍの吸収ピークとＤＮＡ塩基由来の２６０ｎｍの吸収ピークの強度は、レーザ照射前と比較して減少しており、新たに３６０ｎｍの吸収ピークが観測された。この３６０ｎｍのピークはＤＮＡの塩基部分と金イオンとの化学結合によって生じた新しい化合物の吸収ピークであると考えられる。
【００５０】
この３６０ｎｍの吸収ピークはＤＮＡの塩基部分、またはアミンの窒素原子上の孤立電子から金イオンのｄ軌道へ電子が移動することによる電荷移動吸収によるものと考えられる。（金または白金にアミン類が４つ配位した化合物では３６０ｎｍ付近に電荷移動吸収帯をもつものが多い。）
【００５１】
また、溶液中で生成した金イオンはアミンと複合体を形成し安定化すると同時に、ＤＮＡの塩基部分とも複合体を形成すると考えられる。
【００５２】
以上のことから図３に示すように反応機構を推定した。まず、金微粒子がレーザ照射によりアブレーションされると、金イオンが放出される。このイオンは添加したアミン化合物の窒素原子と反応し、反応性分子中間体が生成されると考えられる。さらにこの中間体によりＤＮＡ塩基部分の窒素の部分と金−アミンとの複合体が生成されると考えられる。可視紫外吸収スペクトル中の３６０ｎｍのピークは、この化合物の電荷移動吸収帯に由来すると考えられる。さらに金イオンと同時に金微粒子から放出された溶媒和電子が配位複合体中の金イオンと再結合して金原子に還元され、金微粒子に取り込まれると考えられる。
【００５３】
本実施形態において、金属微粒子と、生体高分子等の標的化合物と、アミン化合物と、反応促進剤とを含む反応液に、レーザを照射することにより、反応液中の金属微粒子を標的化合物と反応させて、金属と標的化合物とを含む金属複合体を簡易に得ることができる。本実施形態に係る金属複合体の製造方法の特徴としては、例えば、
（ａ）レーザによる反応の時間、空間、反応量の制御
（ｂ）核酸結合因子の立体障害による核酸−金または核酸−白金塩化物複合体形成反応の阻害効果の利用
等を挙げることができる。これらの特徴を利用した、本実施形態に係る金属複合体の製造方法の応用例として以下の例を挙げることができる。
【００５４】
（１）抗癌剤（ＤＮＡ反応物の失活を利用）
金属イオンが塩基部分と結合するとＤＮＡの２次構造や３次構造を変化させ、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、エステラーゼ、カイネース、その他のヌクレオチドまたはポリヌクレオチド依存性酵素の活性に影響する。この結果、細胞毒性、抗がん剤、抗リューマチ剤等として利用することができる。従来は、予め金塩化物または白金塩化物のアミン誘導体などを有機化学的に合成し、これを細胞に供与すると、この誘導体がＤＮＡと反応して、その塩基部分と金属塩化物の複合体が生じる。その結果として上記の酵素活性に影響し、細胞毒性の作用を発揮する。本実施形態に係る金属複合体の製造方法では、誘導体を合成する必要はなく、反応必須因子の存在下でレーザを照射するだけでよい。また、レーザを照射した部位にだけ反応が惹起されるので、反応の時間空間の制御が誘導体投与の場合よりはるかに優れている。
【００５５】
具体的には、従来法においては、例えば、ＡｕＣｌ３（Ｈｐｍ）、ＡｕＣｌ２（ｐｍ）、ＡｕＣｌ（Ｐｈ）、Ｅｔ３ＡｓＡｕＣｌ、Ｐｈ（ＰｈＣｈ２）２ＰＡｕＣｌ、等の金の複合体（錯体）や、ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、ｃｉｓ−ＥＥ等の白金の錯体等を予め有機化学的に合成し、皮下膜下で２０日ほど培養した癌細胞に対し腹膜注射する。その１０日後、腹膜を開裂し、癌細胞の重さを測定する。このような方法でこれらの物質の抗癌剤としての機能が調べられた。
【００５６】
【化１１】
【化１２】
【化１３】
【化１４】
【化１５】
【００５７】
抗癌剤としてこれらの物質が作用する要因は、これらの錯体化合物がＤＮＡと反応し、ＤＮＡの塩基部分と金または白金の複合体を形成し、ＤＮＡ上で働く種々の酵素の活性が抑制され、細胞が死滅するためと考えられている。
【００５８】
しかし、従来法においては、これらの化合物を癌細胞に的確に供与し、その他の健康な細胞に作用が及ばないようにすることには種々の困難があり、ドラッグデリバリの問題があった。また抗癌剤としてもっとも適した時間、空間での作用制御は難しかった。しかし、本実施形態に係る金属複合体の製造方法では、レーザ照射した部分だけＤＮＡと金または白金が複合体を形成するため、レーザ照射による時間、空間の制御が容易であるという利点を有する。
【００５９】
（２）生化学的分析法
核酸結合因子の立体障害による核酸−金または白金塩化物複合体形成反応の阻害効果、すなわち、核酸と核酸結合因子が相互作用している場合、レーザ照射された金属微粒子から生成した金属化合物が核酸に接近できないため核酸の塩基部分での反応が起こらない。この後、核酸−金塩化物複合体形成反応の起こらなかった部位を同定するため、例えば、ＤＮａｓｅ Ｉフットプリント法におけるＤＮａｓｅ Ｉ部分消化法を用いる。複合体形成反応が起こった箇所ではＤＮａｓｅ Ｉの活性阻害が起こり、起こらなかった箇所では、ＤＮａｓｅ Ｉによる部分消化が起こる。電気泳動などの分析手段を用いてＤＮａｓｅ Ｉの活性阻害が起こった部位を特定すると、核酸と核酸結合因子が相互作用したＤＮＡ部分を同定することができる。
【００６０】
従来法においては、ＤＮａｓｅ Ｉフットプリント法が使用されていた（従来法１とする）。ＤＮａｓｅ Ｉフットプリント法は、特異的塩基配列を認識し結合する因子の同定およびその特異塩基配列の領域を決定するために行う。片側末端のみを標識したＤＮＡ断片と、ＤＮＡ結合性因子とを反応させた後、ＤＮａｓｅ ＩでＤＮＡ分子あたり約１箇所切断する条件でＤＮＡ断片を部分消化する。このＤＮＡ断片を塩基配列決定用の尿素ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、オートラジオグラフィを行う。得られるバンドは、１塩基ごとのはしご状になるが、ＤＮＡ結合因子の結合していた領域はＤＮａｓｅ Ｉの消化から保護されるため、対応するバンドは薄くなる。そのため結合領域の決定が可能となる。
【００６１】
従来法１においては、時間、空間を制御した測定が行われていた。ＤＮＡ結合因子が複合体の場合の複合体形成の過程や、ＤＮＡ結合因子がＤＮＡ特異的結合配列を探索する過程を時間分解して追跡するような場合、時間分解してＤＮａｓｅ Ｉフットプリント法を行う必要がある。しかし従来法１では、ＤＮａｓｅ Ｉの消化時間が時間分解能の上限を決定してしまう。ＤＮａｓｅ Ｉの場合、数分である。
【００６２】
本実施形態に係る金属複合体の製造方法では、レーザ照射時間が反応時間であるため、数マイクロ秒の時間分解能を有するという利点を有する。
【００６３】
さらに、従来法２として、メチル化干渉法が知られていた。部分的にグアニンヌクレオチドをメチル化したＤＮＡ断片をＤＮＡ結合性因子と反応させた場合、メチル化は因子のＤＮＡ結合能を阻害する。その結果、結合グアニンヌクレオチドが同定される。具体的には部分的にグアニンヌクレオチドをメチル化したＤＮＡプローブとＤＮＡ結合因子を反応させゲルシフト法を行い、そのゲルより結合および非結合ＤＮＡプローブを抽出する。塩基配列決定用ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、結合グアニンヌクレオチドの同定を行う。
【００６４】
しかし、従来法２においては、時間分解能の上限は、ゲルシフト法により結合および非結合ＤＮＡプローブを抽出する時間の数十分以上である。また、結合/非結合を決定する塩基がグアニンヌクレオチドに限定されるという問題点があった。
【００６５】
本実施形態に係る金属複合体の製造方法では、レーザ照射時間が反応時間であるため、数マイクロ秒の時間分解能を有する。また、本実施形態に係る金属複合体の製造方法で示した反応は塩基の種類によらないという利点を有する。
【００６６】
（３）結合活性（結合解離定数の迅速な測定）
これも上記と同様に核酸結合因子の立体障害による核酸−金属塩化物複合体形成反応の阻害効果を利用する。具体的には、核酸と核酸結合因子を混合し、これに反応に必要な因子を混合してレーザを１０分間程度照射し、可視紫外スペクトルを測定するだけで結合活性が測定可能である。
【００６７】
従来法では、ＤＮＡ結合因子の量を変えながら、ＤＮＡとＤＮＡ結合因子の結合量をゲルシフト法やメンブレン固定化法などを用いて測定する。
【００６８】
しかし、従来法においては、ゲルシフト法やメンブレン固定化などの操作が煩雑であるという問題点があった。
【００６９】
本実施形態に係る金属複合体の製造方法では、可視紫外スペクトルを測定するだけで結合活性が測定可能であり、非常に簡便であるという利点がある。
【００７０】
（４）核酸の高次構造、１本鎖と２本鎖の反応性の相違
上記の原理と同様に核酸の高次構造または核酸が１本鎖か２本鎖かによって、レーザ照射された金属微粒子から生成した反応性分子中間体の核酸への接近の容易さによって核酸の塩基部分での反応に差が生じる。この差を可視紫外スペクトルの吸収強度により検出し、核酸の形態に関する知見を得ることができる。
【００７１】
従来法として、核酸が高次構造の検出には多くの方法がある。例えば、光散乱や電気泳動によるＤＮＡの形態検出である。また、核酸が１本鎖か２本鎖かの検出には塩基の紫外吸収断面積の差を利用する方法などがある。
【００７２】
しかし、従来法においては、ＤＮＡの構造の時間分解測定が困難であるという問題点があった。
【００７３】
本実施形態に係る金属複合体の製造方法を用いると、レーザ照射時の数マイクロ秒の時間分解能をもったＤＮＡ高次構造測定が可能である。すなわちレーザ照射時のＤＮＡの構造を固定化することができるという利点を有する。
【００７４】
このように、本実施形態に係る金属複合体の製造方法は、上記特徴を有することにより、抗癌剤としての利用、生化学的分析としての利用等において従来法に比べて有利な点を有し、様々な応用が可能である。
【実施例】
【００７５】
以下、実施例を挙げ、本発明をより具体的に詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００７６】
＜金微粒子とλＤＮＡとの金属複合体の形成＞
（実施例１）
界面活性剤の入っていない金微粒子をＳＦ−ＬＡＳ（surfactant-free laser ablation in solution）法（例えば、特開２００３−２８６５０９号公報、及び、F. Mafune, J. Kohno, Y. Takeda, T. Kondow and H. Sawabe：J.Phys.Chem.B, 105, (2001), 5114-5120等を参照）により作製した。３ｍＭの濃度のλＤＮＡ（TOYOBO製）水溶液１００ｍＬと、０．５Ｍの濃度の塩化カルシウム水溶液１００ｍＬと、上記界面活性剤の入っていない金微粒子１．２ｍｇを分散させた溶液１００ｍＬとを混合し、反応液を作製した。この反応液のうち０．３ｍＬを、底面が１ｃｍ×１ｃｍのガラスセルに入れた。本実施例では、λＤＮＡは１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と１ｍＭのＥＤＴＡが添加されているものをそのまま用いた。これにＮｄ：ＹＡＧレーザの２倍波５３２ｎｍ、１７ｍＪ／パルスのパルスレーザをセルの開口部から１０分間照射した。レーザ光はレンズを用いて、（０．１ｍｍ）３程度になるように反応液中に集光した。この間、セルの底に長さ１０ｍｍ、幅１ｍｍの攪拌子を入れて、マグネティックスターラにより溶液を攪拌した。その後、溶液を吸収スペクトル測定用の石英セルに移し、紫外可視分光器（株式会社島津製作所製、ＵＶ−１２００ ＳＰＥＣＴＲＯＰＨＯＴＯＭＥＴＥＲ）を用いて紫外可視吸収スペクトルを測定した。その結果を図２に示す。図２において、点線は金微粒子分散溶液の吸収スペクトルを、太い実線は金微粒子、λＤＮＡ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）、ＣａＣｌ２を添加後、レーザ照射した反応液の吸収スペクトルを示す。金微粒子由来の５１７ｎｍの吸収ピークとＤＮＡ塩基由来の２６０ｎｍの吸収ピークの強度はレーザ照射前と比較して減少しており、新たに３６０ｎｍの吸収ピークが観測された。この３６０ｎｍのピークはＤＮＡの塩基部分と金塩化物との化学結合によって生じた新しい化合物の吸収ピークであることがわかった。なお、３６０ｎｍ付近のピーク強度は、図２において３６０ｎｍピークの斜線部分の積分を示す。
【００７７】
次に、金微粒子へのレーザ照射による標的化合物と金の複合体形成に必要な因子を探索した。
【００７８】
＜複合体形成に必要な因子の探索＞
（比較例１）
実施例１の反応液を使用して、レーザ照射をせずに反応液を１０分間混合した。１０分間撹拌後、反応液の紫外可視吸収スペクトルを測定したが、３６０ｎｍ付近の吸収ピークは観測されず、反応はほとんど起こらなかった。これより、３６０ｎｍの吸収ピーク出現には、５３２ｎｍのレーザ照射が必要であることを確認した。
【００７９】
（比較例２）
実施例１において、反応液にλＤＮＡを添加しない以外は実施例１と同様にしてレーザ照射を行い、可視紫外吸収スペクトルを測定した。３６０ｎｍ付近の吸収ピークは観測されず、反応はほとんど起こらなかった。これより、３６０ｎｍの吸収ピーク出現には、ＤＮＡが必要であることを確認した。
【００８０】
（比較例３）
実施例１において、反応液に金微粒子を添加しない以外は実施例１と同様にしてレーザ照射を行い、可視紫外吸収スペクトルを測定した。３６０ｎｍ付近の吸収ピークは観測されず、反応はほとんど起こらなかった。これにより、３６０ｎｍの吸収ピーク出現には、金微粒子が必要であることを確認した。
【００８１】
（比較例４）
実施例１において、反応液に多価陽イオン（Ｃａ２＋）を添加しない以外は実施例１と同様にしてレーザ照射を行い、可視紫外吸収スペクトルを測定した。３６０ｎｍ付近の吸収ピークは観測されず、反応はほとんど起こらなかった。これにより、３６０ｎｍの吸収ピーク出現には、陽イオンが必要であることを確認した。
【００８２】
（比較例５）
実施例１において、金微粒子の代わりに金（Ａｕ）プレート（大きさ１０ｍｍ×１０ｍｍ×厚さ３ｍｍ）を反応液の底部に設置し、Ｎｄ：ＹＡＧレーザの基本波１０６４ｎｍ、及び２倍波５３２ｎｍの１００ｍＪ／パルスのパルスレーザを金プレートの表面に焦点を合わせてそれぞれ１０分間照射した以外は実施例１と同様にしてレーザ照射を行い、可視紫外吸収スペクトルを測定した。３６０ｎｍ付近の吸収ピークは観測されず、反応はほとんど起こらなかった。これにより、３６０ｎｍの吸収ピーク出現には、溶液内に金微粒子が分散していることが必要であることを確認した。
【００８３】
（比較例６）
実施例１において、λＤＮＡは添加せずに、金微粒子と、陽イオンとを混合して反応液とし、実施例１と同様にしてＮｄ：ＹＡＧレーザの２倍波５３２ｎｍ、１７ｍＪ／パルスのパルスレーザを１０分間照射した。その直後に、λＤＮＡ（TOYOBO製）を透析してバッファを除去したものを添加し、可視紫外吸収スペクトルを測定したところ、３６０ｎｍ付近の吸収ピークは観測されなかった。これより、レーザ照射時に金微粒子と陽イオンとアミン化合物とＤＮＡとが同時に共存して反応が進行することを示している。
【００８４】
（比較例７）
実施例１においてλＤＮＡとして、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と１ｍＭのＥＤＴＡが添加されているλＤＮＡ（TOYOBO製）をそのまま用いたが、本比較例では、反応液に、λＤＮＡ（TOYOBO製）の代わりに、λＤＮＡ（TOYOBO製）を透析してバッファを除去したものを使用した以外は実施例１と同様にしてレーザ照射を行い、可視紫外吸収スペクトルを測定した。３６０ｎｍ付近の吸収ピークは観測されず、反応はほとんど起こらなかった。これにより、３６０ｎｍの吸収ピーク出現には、ＤＮＡ、金微粒子、多価陽イオンの他に反応必須因子のあることが判明した。
【００８５】
＜反応必須因子の探索＞
（実施例２）
反応必須因子を明らかにするために、比較例６において、λＤＮＡ（TOYOBO製）を透析してバッファを除去したものに、さらに、プロリン（Ｐｒｏｌｉｎｅ）、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid：ＨＥＰＥＳ）、酢酸トリエチルアミン、尿素、アスパラギン（Ａｓｐａｒｇｉｎｅ）、アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）、トリプトファン（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）、スペルミジン（Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）、エチレンジアミン、ホルムアミド、ヒドラジン、アニリン、ニコチン酸、リゾチーム（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル、ＥＤＴＡ、グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、リシン（Ｌｙｓｉｎｅ）、硝酸アンモニウム、ｄＡＴＰ、ｄＡＭＰ、アデニン（Ａｄｅｎｉｎｅ）、チミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ）、グアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）、シトシン（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ）を１Ｍの濃度でそれぞれ添加して、比較例５と同様にしてレーザ照射を行い、可視紫外吸収スペクトルを測定した。プロリン、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）、ヒスチジン、ＨＥＰＥＳ、酢酸トリエチルアミン、尿素、アスパラギン、アルギニン、トリプトファン、スペルミジン、をそれぞれ添加した溶液では３６０ｎｍ付近の吸収ピークは観測された。一方、エチレンジアミン、ホルムアミド、ヒドラジン、アニリン、ニコチン酸、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、ＤＭＳＯ、アセトニトリル、ＥＤＴＡ、グリシン、リシン、硝酸アンモニウム、ｄＡＴＰ、ｄＡＭＰ、アデニン、チミン、グアニン、シトシンをそれぞれ添加した溶液では３６０ｎｍ付近の吸収ピークはわずかしか観測されなかった。これらの結果より、反応にはある種のアミン化合物類が必要であることが判明した。
【００８６】
【化１６】
【化１７】
【化１８】
【化１９】
【化２０】
【化２１】
【化２２】
【化２３】
【化２４】
【化２５】
【化２６】
【化２７】
【化２８】
【化２９】
【化３０】
【化３１】
【００８７】
＜レーザ波長の影響＞
（実施例３）
実施例１において、Ｎｄ：ＹＡＧレーザの２倍波５３２ｎｍ、１７ｍＪ／パルスのパルスレーザの代わりに、Ｎｄ：ＹＡＧレーザの基本波１０６４ｎｍの１７ｍＪ／パルスのパルスレーザを１０分間照射した以外は実施例１と同様にしてレーザ照射を行い、可視紫外吸収スペクトルを測定した。３６０ｎｍ付近の吸収ピークはわずかしか観測されなかった。これにより、３６０ｎｍの吸収ピーク出現には、金微粒子の表面プラズモン共鳴の波長を照射することが効果的であることを確認した。
【００８８】
＜陽イオン濃度依存性＞
（実施例４）
実施例１において、添加する塩化カルシウム（Ｃａ２＋イオン）の濃度を変化させた以外は、実施例１と同様にして、レーザ照射を行い、可視紫外吸収スペクトルを測定した。濃度３６０ｎｍの吸収ピーク強度のＣａ２＋イオン濃度依存性を図４に示す。横軸にＣａ２＋の濃度を、縦軸に３６０ｎｍ付近の吸収の強度を示す。Ｃａ２＋イオン濃度が０．００１Ｍより低いところでは反応がほとんど起こらず、０．１Ｍより高いところでは反応量は一定の値に飽和している。さらにＣａ２＋イオン濃度が０．００５Ｍ付近で急激な反応量の増加がみられる。Ｃａ２＋イオンをはじめとする陽イオンはＤＮＡ分子のリン酸部分と結合して、ＤＮＡの負電荷を中和し溶液中のＤＮＡを中和する働きを持っている。中和されたＤＮＡは金微粒子の表面に吸着し、レーザ照射により生成した金イオンとの反応確率が高まると考えられる。図４よりＤＮＡ分子とＣａ２＋イオン結合反応において、平衡定数７．６×１０−３Ｍをもった平衡反応であることを示している。ここで求められた平衡定数７．６×１０−３Ｍは、ＤＮＡ分子とＣａ２＋イオンの解離定数３．３×１０−５Ｍや溶液中のＤＮＡリン酸基濃度４．０×１０−４Ｍのいずれよりも大きい。巨大な負電荷が高密度に存在するλＤＮＡを中性化するためにより高濃度のＣａ２＋イオンが必要であると考えられる。
【００８９】
＜金微粒子とポリヌクレオチドとの金属複合体の形成＞
（実施例５）
以上の実施例及び比較例で用いたλＤＮＡは４８５０２塩基対をもつ２本鎖ＤＮＡである。そこで、塩基対数の少ないＤＮＡや一本鎖ＤＮＡについて、実施例１と同様に反応を行った。実施したＤＮＡの長さは２ｍｅｒ（一本鎖ＤＮＡを以下ｓｓＤＮＡと記す）、４ｍｅｒ（ｓｓＤＮＡ）、５６ｍｅｒ（ｓｓＤＮＡ）、１８ｍｅｒ（ｓｓＤＮＡ）のいずれも３６０ｎｍ付近のピークを生じ、反応が起こったことが確認された。さらに、モノマｄＡＴＰ、ｄＡＭＰ、アデニン、チミン、グアニン、シトシンについて同様な反応をおこなったが、反応は起こらなかった。以上より２ｍｅｒ以上のポリヌクレオチドで反応が起こることから、金イオンは二つの塩基部分にまたがって反応していると考えられる。
【００９０】
（実施例６）
＜生成物の加水分解＞
金属複合体生成後に、生成物が時間経過とともに分解を起こすかどうかを確認した。レーザ照射後、一定時間をおいて可視紫外吸収スペクトルを測定した。分解の主な原因は溶液中に金イオンと同時に金微粒子から放出された溶媒和電子が配位複合体中の金イオンと再結合し、金原子に還元するためと考えられる。実際、レーザ照射により現れた３６０ｎｍ付近のピークはレーザ照射後に時間とともに減衰した。半減期は２５℃で３６分であった。図５に結果を示す。測定値を指数関数で当てはめた結果を実線で示した。
【００９１】
（実施例７）
＜ＤＮＡとＤＮＡ結合因子の相互作用の検出＞
ＤＮＡ結合因子の立体障害によるＤＮＡへの複合体形成反応の阻害効果について検討した。すなわち、ＤＮＡとＤＮＡ結合因子が相互作用している場合、レーザ照射された金微粒子から生成した反応性分子中間体がＤＮＡに接近できないためＤＮＡの塩基部分での反応が起こらないと考えられる。具体的には、ｓｓＤＮＡ（Seq：ggatcctaatgaccaagg）とＴ４ ｐｈａｇｅ ３２ ｐｒｏｔｅｉｎ（以下ｐ３２タンパク質と記す）との相互作用を検出した。ｐ３２タンパク質はＴ４ファージにコードされているタンパク質でＤＮＡの複製時に配列非特異的にｓｓＤＮＡに結合して、ｓｓＤＮＡの安定化に寄与するタンパク質である。反応は、１．０μＭの濃度のsｓＤＮＡ水溶液と、１０ｍＭの濃度のＴｒｉｓ水溶液と１Ｍの濃度のＣａＣｌ２水溶液と、Ａ：０Ｍ，Ｂ：０．３×１０−６Ｍ，Ｃ：１．０×１０−６Ｍの３種の濃度のｐ３２タンパク質水溶液を含む反応液に対して、５３２ｎｍのレーザ光を実施例１と同様に照射した。その後、可視紫外吸収スペクトルを測定し、３６０ｎｍの吸収ピーク強度を測定した。ｐ３２タンパク質の濃度が高いときは３６０ｎｍの吸収ピーク面積は減少した。ｐ３２タンパク質の濃度と３６０ｎｍの吸収ピークの関係を図６に示す。矢印は３６０ｎｍのピークの位置を示す。これよりｐ３２タンパク質の解離定数は１０−６以下であることが分かる。文献値によると、ｐ３２タンパク質のｓｓＤＮＡに対する解離定数は１０−８Ｍである。
【００９２】
＜ＳＣ−ＬＡＳ法で作製した金微粒子とλＤＮＡとの金属複合体の形成＞
（実施例８）
ＳＣ−ＬＡＳ（surfactant-controlled laser ablation in solution）法（ＳＤＳを添加した液体中で金微粒子を作製する方法。ＳＤＳの濃度を変えることにより生成する金微粒子の大きさを制御することが可能。例えば、特開２００３−２８６５０９号公報、及び、F.Mafune, J.Kohno, Y.Takeda, T.Kondow and H.Sawabe：J.Phys.Chem.B, 105, (2001), 5114-5120等を参照）により作製した金微粒子を用いて、実施例１と同様にして反応を行った。これはＳＣ−ＬＡＳ法で作製した金微粒子の方がＳＦ−ＬＡＳ（surfactant-free laser ablation in solution）法で作製した金微粒子より溶液中で安定なので、実験の操作が容易となる利点がある。ＳＤＳが０．０１Ｍ以上含まれると沈殿物が生じてしまい、吸収スペクトルの測定が困難であった。しかし０．００１以下のＳＤＳでは吸収スペクトルの測定が可能であり、３６０ｎｍのピークが生成し、反応がＳＤＳ存在下でも反応が進行することを確認した。
【００９３】
（実施例９）
界面活性剤の入っていない白金微粒子をＳＦ−ＬＡＳ法で作製した。これに実施例１と同様にして、λＤＮＡ（TOYOBO製）と塩化カルシウムと界面活性剤の入っていない白金微粒子とを分散、溶解させた反応液を底面が１ｃｍ×１ｃｍのガラスセルに入れた。これにＮｄ：ＹＡＧレーザの２倍波５３２ｎｍ、１７ｍＪ／パルスのパルスレーザをセルの開口部から１０分間照射し、紫外可視吸収スペクトルを測定した。その結果を図７に示す。ＤＮＡ塩基由来の２６０ｎｍ吸収ピークの他に、新たに３６０ｎｍの吸収ピークが観測された。この３６０ｎｍのピークはＤＮＡの塩基部分と白金化合物との反応によって生じた新しい化合物の吸収ピークである。また塩化カルシウムとトリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）が反応に必要であること、またモノマのＡＴＰでは反応が起こらないこと、またｓｓＤＮＡでも反応が起こることなどは金微粒子の場合と同じ傾向を示した。なお、図７において、Ａ：白金微粒子分散液にλＤＮＡと塩化カルシウムを添加して反応した時の紫外可視吸収スペクトル，Ｂ：Ａから塩化カルシウムを除いた反応液を使用して反応した時の紫外可視吸収スペクトル，Ｃ：ＡのλＤＮＡをＡＴＰに換え、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）を加えた反応液を使用して反応した時の紫外可視吸収スペクトル，Ｄ：ＡのλＤＮＡを４ｍｅｒのＤＮＡに換え、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）を加えた反応液を使用して反応した時の紫外可視吸収スペクトル，Ｅ：Ｄのトリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）を除いた反応液を使用して反応した時の紫外可視吸収スペクトル，を示す。矢印は３６０ｎｍのピークの位置を示す。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】本発明の実施形態に係る金属複合体製造装置の構成の一例を示す図である。
【図２】本発明の実施形態に係る金属複合体の製造方法において、反応前後の反応液の可視吸収スペクトルの測定結果を示す図である。
【図３】本発明の実施形態に係る金属複合体の製造方法において推定される、金属複合体が生成する反応機構を示す図である。
【図４】本発明の実施形態に係る金属複合体の製造方法において、反応後の反応液における濃度３６０ｎｍの吸収ピーク強度のＣａ２＋イオン濃度依存性を示す図である。
【図５】本発明の実施形態に係る金属複合体の製造方法において、レーザ照射直後の反応液の３６０ｎｍの吸収ピーク強度の時間経過に伴う変化を示す図である。
【図６】本発明の実施形態に係る金属複合体の製造方法において、ｐ３２タンパク質の濃度と３６０ｎｍの吸収ピークの関係を示す図である。
【図７】本発明の実施形態に係る金属複合体の製造方法において、白金微粒子を使用して反応させたときの、反応後の反応液の可視吸収スペクトルの測定結果を示す図である。
【符号の説明】
【００９５】
１ 金属複合体製造装置、１０ レーザ発生装置、１２ レンズ、１４ セル、１６ 撹拌子。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属微粒子と標的化合物とを反応させてなる、金属と標的化合物とを含む金属複合体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
金属の配位化合物、例えば、金あるいは白金のｄ８配位化合物は、抗癌剤などの薬剤として注目されている。この金あるいは白金のｄ８配位化合物が抗癌作用を発現する理由は、金または白金の配位化合物がＤＮＡの塩基部分と配位複合体を形成することにより、ＤＮＡ依存性酵素の活性を抑制するためであると考えられている。すなわち、金あるいは白金等の金属イオンがＤＮＡの塩基部分と結合すると、ＤＮＡの化学構造の他にＤＮＡの２次構造や３次構造を変化させ、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、エステラーゼ、カイネース、その他のヌクレオチドまたはポリヌクレオチド依存性酵素の活性に影響する。この結果、金属の配位化合物は、抗癌剤や、その他にも細胞毒性、抗リューマチ剤等として利用することができる。
【０００３】
金属の配位化合物を抗癌剤等として機能させるためには、例えば、予め金塩化物または白金塩化物のアミン誘導体などを有機化学的に合成し、これを細胞に供与する。するとこの誘導体がＤＮＡと反応して、その塩基部分と金属塩化物との複合体が生じる。その結果として上記の酵素活性に影響する。
【０００４】
そのような金属複合体を得る方法として、例えば、特許文献１には、核酸特異的な金属配位化合物を核酸と反応させて金属配位化合物と核酸との金属複合体を作製し、核酸と複合体を形成していない金属配位化合物及び／又は副生成物を除去し、金属配位化合物と核酸との金属複合体に還元剤を作用させて金属微粒子と核酸との金属複合体を作製する核酸金属化方法が記載されている。
【０００５】
その他にも、金属複合体を得る方法として、例えば、特許文献２には、荷電粒子を利用し、水中で塩溶液と接触させて、オリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子を製造する方法が記載されている。この方法では、金属粒子をクエン酸で還元して金コロイドを調整し、その後オリゴヌクレオチドを付着させる。
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−３７１０９４号公報
【特許文献２】特表２００４−５０１３４０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、従来のように金属配位化合物を抗癌剤等として使用するためには、上記金塩化物または白金塩化物のアミン誘導体などを有機化学的に合成する必要があり、手間がかかった。また、生体内へこの誘導体を投与する必要があり、反応の時間空間の制御が困難であった。
【０００８】
特許文献１及び２の方法でも、金属複合体を得るために複数の工程を経ており、例えば、生体内で金属複合体の生成を行うことは困難である。したがって、簡易に金属複合体を製造する方法の開発が望まれている。
【０００９】
本発明は、金属微粒子と標的化合物とを反応させてなる、金属と標的化合物とを含む金属複合体を簡易に得るための、金属複合体の製造方法である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、金属微粒子と標的化合物とを反応させてなる、金属と標的化合物とを含む金属複合体の製造方法であって、前記金属微粒子と、前記標的化合物と、を含む反応液に、レーザを照射することにより、前記金属複合体を製造する。
【００１１】
また、前記金属複合体の製造方法において、前記反応液は、さらに、アミン化合物と、反応促進剤とを含むことが好ましい。
【００１２】
また、前記金属複合体の製造方法において、前記標的化合物は、生体高分子であることが好ましい。
【００１３】
また、前記金属複合体の製造方法において、前記生体高分子は、核酸であることが好ましい。
【００１４】
また、前記金属複合体の製造方法において、前記生体高分子は、タンパク質であることが好ましい。
【００１５】
また、前記金属複合体の製造方法において、前記金属微粒子は、Ａｕ、Ａｇ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ｃｕ、Ｈｇ、Ｒｅ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｍｏ、Ｗ、Ｔａ及びＮｂから選択される少なくとも１つの金属を含むことが好ましい。
【００１６】
また、前記金属複合体の製造方法において、前記アミン化合物は、Ａｕ、Ａｇ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ｃｕ、Ｈｇ、Ｒｅ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｍｏ、Ｗ、Ｔａ及びＮｂから選択される少なくとも１つの金属と配位結合を形成しやすいアミン化合物を含むことが好ましい。
【００１７】
また、前記金属複合体の製造方法において、前記アミン化合物は、プロリン、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）、ヒスチジン、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、酢酸トリエチルアミン、尿素、アスパラギン、アルギニン、トリプトファン及びスペルミジンから選択される少なくとも１つのアミン化合物を含むことが好ましい。
【００１８】
また、前記金属複合体の製造方法において、前記反応促進剤は、陽イオンであることが好ましい。
【００１９】
また、前記金属複合体の製造方法において、前記陽イオンは、２価以上の多価陽イオンであることが好ましい。
【００２０】
また、前記金属複合体の製造方法において、前記金属複合体は、金属の配位化合物であることが好ましい。
【００２１】
また、前記金属複合体の製造方法において、前記レーザは、パルスレーザであることが好ましい。
【００２２】
また、前記金属複合体の製造方法において、前記レーザの波長は、前記金属微粒子の表面プラズモン共鳴波長付近の波長であることが好ましい。
【００２３】
また、前記金属複合体の製造方法において、前記レーザの波長は、前記金属微粒子が大きな吸収係数を有する波長であることが好ましい。
【００２４】
また、前記金属複合体の製造方法において、前記レーザの波長は、前記金属微粒子のバンド間遷移付近の波長であることが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明の実施形態について説明する。
【００２６】
本発明の実施形態に係る金属複合体の製造方法において、金属微粒子と、標的化合物とを含む反応液に、好ましくは、金属微粒子と、標的化合物と、アミン化合物と、反応促進剤とを含む反応液に、レーザを照射することにより、金属と標的化合物とを含む金属複合体を製造する。金属複合体は、例えば、金属と標的化合物との配位化合物である。
【００２７】
本実施形態に係る金属複合体の製造方法は、例えば、図１に示す金属複合体製造装置を使用して行われる。金属複合体製造装置１は、レーザ発生装置１０、レンズ１２等の集光手段、セル１４、撹拌子１６等の撹拌手段等を含んで構成される。本実施形態に係る金属複合体の製造方法は、具体的には、以下の手順で行われる。
【００２８】
まず、金属微粒子と、標的化合物と、アミン化合物と、反応促進剤と、を含む反応液を準備する。このとき、金属微粒子は、溶液に分散した状態であるが、標的化合物、アミン化合物及び反応促進剤は反応液中に溶解されている状態であることが、反応効率の向上を図れる等の点から好ましい。
【００２９】
本実施形態において使用される金属微粒子の金属としては、典型金属、遷移金属であれば特に制限はないが、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｈｇ、Ｒｅ、Ｙ、Ｚｒ、Ｎｂ、Ｍｏ、Ｗ、Ｔａ、Ｎｂ、Ｒｕ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ａｕ、Ａｇ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ等の遷移金属であることが好ましい。遷移金属の中では、Ａｕ、Ａｇ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ｃｕ、Ｈｇ、Ｒｅ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｍｏ、Ｗ、Ｔａ及びＮｂであることがより好ましく、Ａｕ、Ａｇ及び白金族（Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ）等の貴金属であることが酸化されにくいこと等の点からさらに好ましく、Ａｕ，Ｐｔが特に好ましい。
【００３０】
金属微粒子の粒径としては、金属の溶液中での高い分散性が望ましい等の点から、１μｍ以下であることが好ましく、１ｎｍ〜１００ｎｍの範囲であることがより好ましく、５ｎｍ〜２０ｎｍであることがさらに好ましい。金属微粒子の粒径が１ｎｍより小さいと、照射レーザの波長が短波長になる傾向があり、操作が煩雑になる可能性がある。
【００３１】
金属微粒子の製造方法としては、水等の液体中で金属プレート表面をレーザ照射またはマイクロ波照射によりアブレーションするＳＦ−ＬＡＳ法（Surfactant-free laser ablation in solution）、界面活性剤を添加した水等の液体中で金属プレート表面をレーザ照射またはマイクロ波照射によりアブレーションするＳＣ−ＬＡＳ法（Surfactant-controlled laser ablation in solution）、化学的に還元する方法、溶液中で放電する方法等が挙げられ、特に制限はない。金属微粒子に界面活性剤を添加することにより、金属微粒子を安定化させることができ、製造において操作が容易となる等のため、好ましい。
【００３２】
界面活性剤としては、アニオン系、カチオン系、ノニオン系、両性の界面活性剤を使用することができる。通常は、界面活性剤の溶解度、溶媒中の金属微粒子の安定化力等の点からドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が使用される。
【００３３】
本実施形態において金属微粒子と金属複合体を形成する標的化合物としては、上記金属微粒子と金属複合体を形成する化合物であれば特に制限はないが、生体高分子；電荷移動性を有する高分子等の機能性高分子；等が挙げられ、この中でも金属と配位しやすい等の点から生体高分子であることが好ましい。ここで、生体高分子とは、生体内で合成される高分子化合物であり、例えば、タンパク質；ＤＮＡ，ＲＮＡ等の核酸；多糖等である。このうち、タンパク質または核酸であることが好ましく、ＤＮＡ，ＲＮＡ等の核酸であることが、窒素含有化合物であり、非常に金属と配位しやすい等の点からより好ましい。また、ＤＮＡ、ＲＮＡとしては、１本鎖であっても２本鎖であってもよい。
【００３４】
本実施形態において、金属と標的化合物とを含む金属複合体が形成されるためには、アミン化合物の存在が必要である。アミン化合物としては、１級アミン、２級アミン、３級アミン、４級アミンを含む化合物、例えば、脂肪族アミン類、芳香族アミン類であれば特に制限はないが、例えば、プロリン（Ｐｒｏｌｉｎｅ）、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）、ＨＥＰＥＳ、酢酸トリエチルアミン、尿素、アスパラギン（Ａｓｐａｒｇｉｎｅ）、アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）、トリプトファン（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）、スペルミジン（Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）等が挙げられる。アミン化合物としては、金属イオン、例えば、Ａｕ、Ａｇ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ｃｕ、Ｈｇ、Ｒｅ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｍｏ、Ｗ、Ｔａ及びＮｂから選択される少なくとも１つの金属、と配位結合を形成しやすい化合物であることが好ましい。このような化合物としては、例えば、イオン化エネルギが低い化合物が挙げられる。これは、イオン化エネルギが低い方が電子を金属イオンに受け渡し易く、金属がアミン化合物に配位し易いためと考えられる。傾向としては、イオン化エネルギは８ｅＶ以下であることが好ましい。
【００３５】
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
【化９】
【化１０】
【００３６】
本実施形態において、金属と標的化合物とを含む金属複合体が形成されるためには、アミン化合物の他に反応促進剤が必要である。ここで、反応促進剤としては、例えば、陽イオン、ポリアミン化合物等が挙げられる。陽イオンとしては、特に制限はないが、例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋、等の周期律表１Ａ族の金属イオン；Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋等の周期律表２Ａ族の金属イオン；その他Ｍｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｏ３＋、Ａｌ３＋、Ｓｎ４＋、等の周期律表３Ａ族〜７Ａ族、８族、１Ｂ族〜４Ｂ族の金属イオン；等が挙げられる。これらの中でも、金属と標的化合物とを含む金属複合体を形成する反応効率を高めるためには、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋等の２価以上の多価金属イオンであることが好ましく、価数が多いほどより好ましい。これらの陽イオンを発生する塩としては、特に制限はなく、例えば、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン塩；硫酸塩；炭酸塩；硝酸塩；アンモニウム塩；等を通常用いることができる。
【００３７】
ポリアミン化合物としては、例えば、プトレッシン、スペルミジン、スペルミン等が挙げられる。
【００３８】
反応液に使用される溶媒としては、水や一般的な有機溶媒を使用することができる。水としては、特に制限はなく、例えば、水道水、地下水、イオン交換水、純水、超純水等が挙げられるが、反応効率を向上させるためには不純物が少ない方がよく、通常はイオン交換水、純水、超純水が用いられる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等のアルコール系溶媒；ベンゼン、トルエン等の芳香族系溶媒；塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン系溶媒；ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン等の直鎖飽和炭化水素系溶媒；シクロヘキサン等の環状飽和炭化水素系溶媒；アセトニトリル等を用いることができる。この中で、適用範囲が広いことから水、アルコール系溶媒が好ましく、水がより好ましい。
【００３９】
反応液中の金属微粒子の濃度は、金属微粒子を懸濁できる程度の濃度であれば特に制限はないが、通常、０．１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬの範囲である。反応液中の標的化合物の量は、通常、金属微粒子の量に対して、１０４モル％〜１０８モル％の範囲である。また、反応液中のアミン化合物の濃度は、通常、０．００１Ｍ〜５Ｍの範囲である。反応液中の反応促進剤の濃度としては、０．００１Ｍ〜１０Ｍの範囲であることが好ましい。陽イオンの濃度が０．１Ｍより少ないと、金属複合物の生成が十分に進行しない場合があり、陽イオン濃度が１０Ｍを超えると金属複合物の生成が飽和状態になる場合があるので必要以上に添加する必要はない。
【００４０】
この金属微粒子と、標的化合物と、アミン化合物と、反応促進剤と、を含む反応液は、セル１４に入れられる。セル１４は、通常、石英、ガラス等の材質のものが使用される。
【００４１】
セル１４に入れられた反応液に、レーザ発生装置１０から発せられるレーザが照射される。レーザが所定の強度、所定の時間、反応液に照射されると、金属微粒子から生成する金属原子または金属イオンあるいは金属クラスターまたは金属クラスターイオンと、標的化合物との反応が起こり、金属複合体が得られる。反応液にレーザを照射するときに、レーザはレンズ１２等の集光手段により、反応液中で集光させることが好ましい。反応液中でのレーザの集光領域は、（１μｍ）３〜（１ｍｍ）３の範囲であることが好ましい。装置上の制約から集光領域は（１μｍ）３より小さく絞ることは困難であり、集光領域が（１ｍｍ）３より大きい範囲であると、反応効率が低下する場合がある。また、レーザはパルスレーザであることが好ましい。
【００４２】
反応液に照射されるレーザの強度は、金属微粒子が効率よくアブレーションされる強度であれば特に制限はないが、１００μＪ／パルス〜１００ｍＪ／パルスの範囲であることが好ましく、５ｍＪ／パルス〜２０ｍＪ／パルスの範囲であることがより好ましい。レーザの照射強度が１００μＪ／パルスより低いと、反応が進行しない場合があり、１００ｍＪ／パルスより大きいと、標的化合物や反応生成物が分解してしまう場合がある。
【００４３】
反応液にレーザを照射する時間は、使用する金属微粒子と標的化合物との反応性等に応じて決めればよく、特に制限はないが、通常１分〜１時間の範囲、好ましくは、５分〜１０分の範囲である。
【００４４】
反応液に照射されるレーザの波長としては、金属微粒子が効率よくアブレーションされる波長を選択すればよく、特に制限はないが、金属微粒子の表面プラズモン共鳴波長付近の波長であること、または、金属微粒子が大きな吸収係数を有する波長であること、または、金属微粒子のバンド間遷移付近の波長であることが好ましい。ここで、大きな吸収係数とは、１００Ｍ−１ｃｍ−１以上の強度の吸収であることが好ましい。例えば、金微粒子の場合はその表面プラズモン共鳴波長付近の５３２ｎｍの波長を用いることが好ましい。白金微粒子の場合のように、可視領域に特に強い吸収を有さない場合は、どの波長のレーザを用いてもよい。
【００４５】
使用されるレーザの種類としては、照射するレーザの波長に応じて選択すればよく特に制限はないが、例えば、半導体レーザ、固体レーザ、気体レーザ、色素レーザ、エキシマレーザ等を使用することができる。
【００４６】
なお、反応液に照射されるレーザは、セル１４の開放部を通して照射されることが好ましい。セル１４を通して照射されると、レーザの強度によっては、セル１４自体がレーザによりスパッタされ損傷を受けてしまう可能性がある。また、このため、セル１４は透明な材質であることが好ましい。レーザの照射は、例えば図１に示すように、セル１４の上面開口部から照射される。
【００４７】
反応液の温度は、使用する生体高分子等の標的化合物が分解されない温度であれば特に制限はないが、０℃〜１００℃の範囲、通常は１０℃〜３０℃の室温である。
【００４８】
セル１４に入れられた反応液は、撹拌子１６や撹拌羽根等の撹拌手段により撹拌されることが好ましい。撹拌することによりレーザを反応液全体に均一に照射することができる。撹拌子１６等の撹拌手段を使用しない場合には、レーザを反応液全体に照射するようにスキャンしてもよい。
【００４９】
金属微粒子と標的化合物との反応による金属複合体の生成は、例えば、レーザ照射後の反応液を吸収スペクトル測定用のセルに移し、紫外可視分光器を用いて紫外可視吸収スペクトルを測定することにより確認される。ＳＦ−ＬＡＳ法により作製した金微粒子と、λＤＮＡと、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）と、Ｃａ２＋（塩化カルシウム）とを水に分散、溶解させた反応液をガラスセル中で、Ｎｄ：ＹＡＧレーザの２倍波５３２ｎｍを、溶液を撹拌子ながら照射した反応液についての紫外可視吸収スペクトルの測定結果を図２に示す（詳細な実験条件は実施例１を参照）。図２において、点線は金微粒子分散溶液の吸収スペクトルを、太い実線は金微粒子、λＤＮＡ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）、ＣａＣｌ２を添加後、レーザ照射した反応液の吸収スペクトルを示す。また、３６０ｎｍ付近のピーク強度は３６０ｎｍピークの斜線部分の積分値とする。金微粒子由来の５１７ｎｍの吸収ピークとＤＮＡ塩基由来の２６０ｎｍの吸収ピークの強度は、レーザ照射前と比較して減少しており、新たに３６０ｎｍの吸収ピークが観測された。この３６０ｎｍのピークはＤＮＡの塩基部分と金イオンとの化学結合によって生じた新しい化合物の吸収ピークであると考えられる。
【００５０】
この３６０ｎｍの吸収ピークはＤＮＡの塩基部分、またはアミンの窒素原子上の孤立電子から金イオンのｄ軌道へ電子が移動することによる電荷移動吸収によるものと考えられる。（金または白金にアミン類が４つ配位した化合物では３６０ｎｍ付近に電荷移動吸収帯をもつものが多い。）
【００５１】
また、溶液中で生成した金イオンはアミンと複合体を形成し安定化すると同時に、ＤＮＡの塩基部分とも複合体を形成すると考えられる。
【００５２】
以上のことから図３に示すように反応機構を推定した。まず、金微粒子がレーザ照射によりアブレーションされると、金イオンが放出される。このイオンは添加したアミン化合物の窒素原子と反応し、反応性分子中間体が生成されると考えられる。さらにこの中間体によりＤＮＡ塩基部分の窒素の部分と金−アミンとの複合体が生成されると考えられる。可視紫外吸収スペクトル中の３６０ｎｍのピークは、この化合物の電荷移動吸収帯に由来すると考えられる。さらに金イオンと同時に金微粒子から放出された溶媒和電子が配位複合体中の金イオンと再結合して金原子に還元され、金微粒子に取り込まれると考えられる。
【００５３】
本実施形態において、金属微粒子と、生体高分子等の標的化合物と、アミン化合物と、反応促進剤とを含む反応液に、レーザを照射することにより、反応液中の金属微粒子を標的化合物と反応させて、金属と標的化合物とを含む金属複合体を簡易に得ることができる。本実施形態に係る金属複合体の製造方法の特徴としては、例えば、
（ａ）レーザによる反応の時間、空間、反応量の制御
（ｂ）核酸結合因子の立体障害による核酸−金または核酸−白金塩化物複合体形成反応の阻害効果の利用
等を挙げることができる。これらの特徴を利用した、本実施形態に係る金属複合体の製造方法の応用例として以下の例を挙げることができる。
【００５４】
（１）抗癌剤（ＤＮＡ反応物の失活を利用）
金属イオンが塩基部分と結合するとＤＮＡの２次構造や３次構造を変化させ、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、エステラーゼ、カイネース、その他のヌクレオチドまたはポリヌクレオチド依存性酵素の活性に影響する。この結果、細胞毒性、抗がん剤、抗リューマチ剤等として利用することができる。従来は、予め金塩化物または白金塩化物のアミン誘導体などを有機化学的に合成し、これを細胞に供与すると、この誘導体がＤＮＡと反応して、その塩基部分と金属塩化物の複合体が生じる。その結果として上記の酵素活性に影響し、細胞毒性の作用を発揮する。本実施形態に係る金属複合体の製造方法では、誘導体を合成する必要はなく、反応必須因子の存在下でレーザを照射するだけでよい。また、レーザを照射した部位にだけ反応が惹起されるので、反応の時間空間の制御が誘導体投与の場合よりはるかに優れている。
【００５５】
具体的には、従来法においては、例えば、ＡｕＣｌ３（Ｈｐｍ）、ＡｕＣｌ２（ｐｍ）、ＡｕＣｌ（Ｐｈ）、Ｅｔ３ＡｓＡｕＣｌ、Ｐｈ（ＰｈＣｈ２）２ＰＡｕＣｌ、等の金の複合体（錯体）や、ｃｉｓｐｌａｔｉｎ、ｃｉｓ−ＥＥ等の白金の錯体等を予め有機化学的に合成し、皮下膜下で２０日ほど培養した癌細胞に対し腹膜注射する。その１０日後、腹膜を開裂し、癌細胞の重さを測定する。このような方法でこれらの物質の抗癌剤としての機能が調べられた。
【００５６】
【化１１】
【化１２】
【化１３】
【化１４】
【化１５】
【００５７】
抗癌剤としてこれらの物質が作用する要因は、これらの錯体化合物がＤＮＡと反応し、ＤＮＡの塩基部分と金または白金の複合体を形成し、ＤＮＡ上で働く種々の酵素の活性が抑制され、細胞が死滅するためと考えられている。
【００５８】
しかし、従来法においては、これらの化合物を癌細胞に的確に供与し、その他の健康な細胞に作用が及ばないようにすることには種々の困難があり、ドラッグデリバリの問題があった。また抗癌剤としてもっとも適した時間、空間での作用制御は難しかった。しかし、本実施形態に係る金属複合体の製造方法では、レーザ照射した部分だけＤＮＡと金または白金が複合体を形成するため、レーザ照射による時間、空間の制御が容易であるという利点を有する。
【００５９】
（２）生化学的分析法
核酸結合因子の立体障害による核酸−金または白金塩化物複合体形成反応の阻害効果、すなわち、核酸と核酸結合因子が相互作用している場合、レーザ照射された金属微粒子から生成した金属化合物が核酸に接近できないため核酸の塩基部分での反応が起こらない。この後、核酸−金塩化物複合体形成反応の起こらなかった部位を同定するため、例えば、ＤＮａｓｅ Ｉフットプリント法におけるＤＮａｓｅ Ｉ部分消化法を用いる。複合体形成反応が起こった箇所ではＤＮａｓｅ Ｉの活性阻害が起こり、起こらなかった箇所では、ＤＮａｓｅ Ｉによる部分消化が起こる。電気泳動などの分析手段を用いてＤＮａｓｅ Ｉの活性阻害が起こった部位を特定すると、核酸と核酸結合因子が相互作用したＤＮＡ部分を同定することができる。
【００６０】
従来法においては、ＤＮａｓｅ Ｉフットプリント法が使用されていた（従来法１とする）。ＤＮａｓｅ Ｉフットプリント法は、特異的塩基配列を認識し結合する因子の同定およびその特異塩基配列の領域を決定するために行う。片側末端のみを標識したＤＮＡ断片と、ＤＮＡ結合性因子とを反応させた後、ＤＮａｓｅ ＩでＤＮＡ分子あたり約１箇所切断する条件でＤＮＡ断片を部分消化する。このＤＮＡ断片を塩基配列決定用の尿素ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、オートラジオグラフィを行う。得られるバンドは、１塩基ごとのはしご状になるが、ＤＮＡ結合因子の結合していた領域はＤＮａｓｅ Ｉの消化から保護されるため、対応するバンドは薄くなる。そのため結合領域の決定が可能となる。
【００６１】
従来法１においては、時間、空間を制御した測定が行われていた。ＤＮＡ結合因子が複合体の場合の複合体形成の過程や、ＤＮＡ結合因子がＤＮＡ特異的結合配列を探索する過程を時間分解して追跡するような場合、時間分解してＤＮａｓｅ Ｉフットプリント法を行う必要がある。しかし従来法１では、ＤＮａｓｅ Ｉの消化時間が時間分解能の上限を決定してしまう。ＤＮａｓｅ Ｉの場合、数分である。
【００６２】
本実施形態に係る金属複合体の製造方法では、レーザ照射時間が反応時間であるため、数マイクロ秒の時間分解能を有するという利点を有する。
【００６３】
さらに、従来法２として、メチル化干渉法が知られていた。部分的にグアニンヌクレオチドをメチル化したＤＮＡ断片をＤＮＡ結合性因子と反応させた場合、メチル化は因子のＤＮＡ結合能を阻害する。その結果、結合グアニンヌクレオチドが同定される。具体的には部分的にグアニンヌクレオチドをメチル化したＤＮＡプローブとＤＮＡ結合因子を反応させゲルシフト法を行い、そのゲルより結合および非結合ＤＮＡプローブを抽出する。塩基配列決定用ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、結合グアニンヌクレオチドの同定を行う。
【００６４】
しかし、従来法２においては、時間分解能の上限は、ゲルシフト法により結合および非結合ＤＮＡプローブを抽出する時間の数十分以上である。また、結合/非結合を決定する塩基がグアニンヌクレオチドに限定されるという問題点があった。
【００６５】
本実施形態に係る金属複合体の製造方法では、レーザ照射時間が反応時間であるため、数マイクロ秒の時間分解能を有する。また、本実施形態に係る金属複合体の製造方法で示した反応は塩基の種類によらないという利点を有する。
【００６６】
（３）結合活性（結合解離定数の迅速な測定）
これも上記と同様に核酸結合因子の立体障害による核酸−金属塩化物複合体形成反応の阻害効果を利用する。具体的には、核酸と核酸結合因子を混合し、これに反応に必要な因子を混合してレーザを１０分間程度照射し、可視紫外スペクトルを測定するだけで結合活性が測定可能である。
【００６７】
従来法では、ＤＮＡ結合因子の量を変えながら、ＤＮＡとＤＮＡ結合因子の結合量をゲルシフト法やメンブレン固定化法などを用いて測定する。
【００６８】
しかし、従来法においては、ゲルシフト法やメンブレン固定化などの操作が煩雑であるという問題点があった。
【００６９】
本実施形態に係る金属複合体の製造方法では、可視紫外スペクトルを測定するだけで結合活性が測定可能であり、非常に簡便であるという利点がある。
【００７０】
（４）核酸の高次構造、１本鎖と２本鎖の反応性の相違
上記の原理と同様に核酸の高次構造または核酸が１本鎖か２本鎖かによって、レーザ照射された金属微粒子から生成した反応性分子中間体の核酸への接近の容易さによって核酸の塩基部分での反応に差が生じる。この差を可視紫外スペクトルの吸収強度により検出し、核酸の形態に関する知見を得ることができる。
【００７１】
従来法として、核酸が高次構造の検出には多くの方法がある。例えば、光散乱や電気泳動によるＤＮＡの形態検出である。また、核酸が１本鎖か２本鎖かの検出には塩基の紫外吸収断面積の差を利用する方法などがある。
【００７２】
しかし、従来法においては、ＤＮＡの構造の時間分解測定が困難であるという問題点があった。
【００７３】
本実施形態に係る金属複合体の製造方法を用いると、レーザ照射時の数マイクロ秒の時間分解能をもったＤＮＡ高次構造測定が可能である。すなわちレーザ照射時のＤＮＡの構造を固定化することができるという利点を有する。
【００７４】
このように、本実施形態に係る金属複合体の製造方法は、上記特徴を有することにより、抗癌剤としての利用、生化学的分析としての利用等において従来法に比べて有利な点を有し、様々な応用が可能である。
【実施例】
【００７５】
以下、実施例を挙げ、本発明をより具体的に詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００７６】
＜金微粒子とλＤＮＡとの金属複合体の形成＞
（実施例１）
界面活性剤の入っていない金微粒子をＳＦ−ＬＡＳ（surfactant-free laser ablation in solution）法（例えば、特開２００３−２８６５０９号公報、及び、F. Mafune, J. Kohno, Y. Takeda, T. Kondow and H. Sawabe：J.Phys.Chem.B, 105, (2001), 5114-5120等を参照）により作製した。３ｍＭの濃度のλＤＮＡ（TOYOBO製）水溶液１００ｍＬと、０．５Ｍの濃度の塩化カルシウム水溶液１００ｍＬと、上記界面活性剤の入っていない金微粒子１．２ｍｇを分散させた溶液１００ｍＬとを混合し、反応液を作製した。この反応液のうち０．３ｍＬを、底面が１ｃｍ×１ｃｍのガラスセルに入れた。本実施例では、λＤＮＡは１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と１ｍＭのＥＤＴＡが添加されているものをそのまま用いた。これにＮｄ：ＹＡＧレーザの２倍波５３２ｎｍ、１７ｍＪ／パルスのパルスレーザをセルの開口部から１０分間照射した。レーザ光はレンズを用いて、（０．１ｍｍ）３程度になるように反応液中に集光した。この間、セルの底に長さ１０ｍｍ、幅１ｍｍの攪拌子を入れて、マグネティックスターラにより溶液を攪拌した。その後、溶液を吸収スペクトル測定用の石英セルに移し、紫外可視分光器（株式会社島津製作所製、ＵＶ−１２００ ＳＰＥＣＴＲＯＰＨＯＴＯＭＥＴＥＲ）を用いて紫外可視吸収スペクトルを測定した。その結果を図２に示す。図２において、点線は金微粒子分散溶液の吸収スペクトルを、太い実線は金微粒子、λＤＮＡ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）、ＣａＣｌ２を添加後、レーザ照射した反応液の吸収スペクトルを示す。金微粒子由来の５１７ｎｍの吸収ピークとＤＮＡ塩基由来の２６０ｎｍの吸収ピークの強度はレーザ照射前と比較して減少しており、新たに３６０ｎｍの吸収ピークが観測された。この３６０ｎｍのピークはＤＮＡの塩基部分と金塩化物との化学結合によって生じた新しい化合物の吸収ピークであることがわかった。なお、３６０ｎｍ付近のピーク強度は、図２において３６０ｎｍピークの斜線部分の積分を示す。
【００７７】
次に、金微粒子へのレーザ照射による標的化合物と金の複合体形成に必要な因子を探索した。
【００７８】
＜複合体形成に必要な因子の探索＞
（比較例１）
実施例１の反応液を使用して、レーザ照射をせずに反応液を１０分間混合した。１０分間撹拌後、反応液の紫外可視吸収スペクトルを測定したが、３６０ｎｍ付近の吸収ピークは観測されず、反応はほとんど起こらなかった。これより、３６０ｎｍの吸収ピーク出現には、５３２ｎｍのレーザ照射が必要であることを確認した。
【００７９】
（比較例２）
実施例１において、反応液にλＤＮＡを添加しない以外は実施例１と同様にしてレーザ照射を行い、可視紫外吸収スペクトルを測定した。３６０ｎｍ付近の吸収ピークは観測されず、反応はほとんど起こらなかった。これより、３６０ｎｍの吸収ピーク出現には、ＤＮＡが必要であることを確認した。
【００８０】
（比較例３）
実施例１において、反応液に金微粒子を添加しない以外は実施例１と同様にしてレーザ照射を行い、可視紫外吸収スペクトルを測定した。３６０ｎｍ付近の吸収ピークは観測されず、反応はほとんど起こらなかった。これにより、３６０ｎｍの吸収ピーク出現には、金微粒子が必要であることを確認した。
【００８１】
（比較例４）
実施例１において、反応液に多価陽イオン（Ｃａ２＋）を添加しない以外は実施例１と同様にしてレーザ照射を行い、可視紫外吸収スペクトルを測定した。３６０ｎｍ付近の吸収ピークは観測されず、反応はほとんど起こらなかった。これにより、３６０ｎｍの吸収ピーク出現には、陽イオンが必要であることを確認した。
【００８２】
（比較例５）
実施例１において、金微粒子の代わりに金（Ａｕ）プレート（大きさ１０ｍｍ×１０ｍｍ×厚さ３ｍｍ）を反応液の底部に設置し、Ｎｄ：ＹＡＧレーザの基本波１０６４ｎｍ、及び２倍波５３２ｎｍの１００ｍＪ／パルスのパルスレーザを金プレートの表面に焦点を合わせてそれぞれ１０分間照射した以外は実施例１と同様にしてレーザ照射を行い、可視紫外吸収スペクトルを測定した。３６０ｎｍ付近の吸収ピークは観測されず、反応はほとんど起こらなかった。これにより、３６０ｎｍの吸収ピーク出現には、溶液内に金微粒子が分散していることが必要であることを確認した。
【００８３】
（比較例６）
実施例１において、λＤＮＡは添加せずに、金微粒子と、陽イオンとを混合して反応液とし、実施例１と同様にしてＮｄ：ＹＡＧレーザの２倍波５３２ｎｍ、１７ｍＪ／パルスのパルスレーザを１０分間照射した。その直後に、λＤＮＡ（TOYOBO製）を透析してバッファを除去したものを添加し、可視紫外吸収スペクトルを測定したところ、３６０ｎｍ付近の吸収ピークは観測されなかった。これより、レーザ照射時に金微粒子と陽イオンとアミン化合物とＤＮＡとが同時に共存して反応が進行することを示している。
【００８４】
（比較例７）
実施例１においてλＤＮＡとして、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と１ｍＭのＥＤＴＡが添加されているλＤＮＡ（TOYOBO製）をそのまま用いたが、本比較例では、反応液に、λＤＮＡ（TOYOBO製）の代わりに、λＤＮＡ（TOYOBO製）を透析してバッファを除去したものを使用した以外は実施例１と同様にしてレーザ照射を行い、可視紫外吸収スペクトルを測定した。３６０ｎｍ付近の吸収ピークは観測されず、反応はほとんど起こらなかった。これにより、３６０ｎｍの吸収ピーク出現には、ＤＮＡ、金微粒子、多価陽イオンの他に反応必須因子のあることが判明した。
【００８５】
＜反応必須因子の探索＞
（実施例２）
反応必須因子を明らかにするために、比較例６において、λＤＮＡ（TOYOBO製）を透析してバッファを除去したものに、さらに、プロリン（Ｐｒｏｌｉｎｅ）、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid：ＨＥＰＥＳ）、酢酸トリエチルアミン、尿素、アスパラギン（Ａｓｐａｒｇｉｎｅ）、アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）、トリプトファン（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）、スペルミジン（Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）、エチレンジアミン、ホルムアミド、ヒドラジン、アニリン、ニコチン酸、リゾチーム（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル、ＥＤＴＡ、グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、リシン（Ｌｙｓｉｎｅ）、硝酸アンモニウム、ｄＡＴＰ、ｄＡＭＰ、アデニン（Ａｄｅｎｉｎｅ）、チミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ）、グアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）、シトシン（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ）を１Ｍの濃度でそれぞれ添加して、比較例５と同様にしてレーザ照射を行い、可視紫外吸収スペクトルを測定した。プロリン、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）、ヒスチジン、ＨＥＰＥＳ、酢酸トリエチルアミン、尿素、アスパラギン、アルギニン、トリプトファン、スペルミジン、をそれぞれ添加した溶液では３６０ｎｍ付近の吸収ピークは観測された。一方、エチレンジアミン、ホルムアミド、ヒドラジン、アニリン、ニコチン酸、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、ＤＭＳＯ、アセトニトリル、ＥＤＴＡ、グリシン、リシン、硝酸アンモニウム、ｄＡＴＰ、ｄＡＭＰ、アデニン、チミン、グアニン、シトシンをそれぞれ添加した溶液では３６０ｎｍ付近の吸収ピークはわずかしか観測されなかった。これらの結果より、反応にはある種のアミン化合物類が必要であることが判明した。
【００８６】
【化１６】
【化１７】
【化１８】
【化１９】
【化２０】
【化２１】
【化２２】
【化２３】
【化２４】
【化２５】
【化２６】
【化２７】
【化２８】
【化２９】
【化３０】
【化３１】
【００８７】
＜レーザ波長の影響＞
（実施例３）
実施例１において、Ｎｄ：ＹＡＧレーザの２倍波５３２ｎｍ、１７ｍＪ／パルスのパルスレーザの代わりに、Ｎｄ：ＹＡＧレーザの基本波１０６４ｎｍの１７ｍＪ／パルスのパルスレーザを１０分間照射した以外は実施例１と同様にしてレーザ照射を行い、可視紫外吸収スペクトルを測定した。３６０ｎｍ付近の吸収ピークはわずかしか観測されなかった。これにより、３６０ｎｍの吸収ピーク出現には、金微粒子の表面プラズモン共鳴の波長を照射することが効果的であることを確認した。
【００８８】
＜陽イオン濃度依存性＞
（実施例４）
実施例１において、添加する塩化カルシウム（Ｃａ２＋イオン）の濃度を変化させた以外は、実施例１と同様にして、レーザ照射を行い、可視紫外吸収スペクトルを測定した。濃度３６０ｎｍの吸収ピーク強度のＣａ２＋イオン濃度依存性を図４に示す。横軸にＣａ２＋の濃度を、縦軸に３６０ｎｍ付近の吸収の強度を示す。Ｃａ２＋イオン濃度が０．００１Ｍより低いところでは反応がほとんど起こらず、０．１Ｍより高いところでは反応量は一定の値に飽和している。さらにＣａ２＋イオン濃度が０．００５Ｍ付近で急激な反応量の増加がみられる。Ｃａ２＋イオンをはじめとする陽イオンはＤＮＡ分子のリン酸部分と結合して、ＤＮＡの負電荷を中和し溶液中のＤＮＡを中和する働きを持っている。中和されたＤＮＡは金微粒子の表面に吸着し、レーザ照射により生成した金イオンとの反応確率が高まると考えられる。図４よりＤＮＡ分子とＣａ２＋イオン結合反応において、平衡定数７．６×１０−３Ｍをもった平衡反応であることを示している。ここで求められた平衡定数７．６×１０−３Ｍは、ＤＮＡ分子とＣａ２＋イオンの解離定数３．３×１０−５Ｍや溶液中のＤＮＡリン酸基濃度４．０×１０−４Ｍのいずれよりも大きい。巨大な負電荷が高密度に存在するλＤＮＡを中性化するためにより高濃度のＣａ２＋イオンが必要であると考えられる。
【００８９】
＜金微粒子とポリヌクレオチドとの金属複合体の形成＞
（実施例５）
以上の実施例及び比較例で用いたλＤＮＡは４８５０２塩基対をもつ２本鎖ＤＮＡである。そこで、塩基対数の少ないＤＮＡや一本鎖ＤＮＡについて、実施例１と同様に反応を行った。実施したＤＮＡの長さは２ｍｅｒ（一本鎖ＤＮＡを以下ｓｓＤＮＡと記す）、４ｍｅｒ（ｓｓＤＮＡ）、５６ｍｅｒ（ｓｓＤＮＡ）、１８ｍｅｒ（ｓｓＤＮＡ）のいずれも３６０ｎｍ付近のピークを生じ、反応が起こったことが確認された。さらに、モノマｄＡＴＰ、ｄＡＭＰ、アデニン、チミン、グアニン、シトシンについて同様な反応をおこなったが、反応は起こらなかった。以上より２ｍｅｒ以上のポリヌクレオチドで反応が起こることから、金イオンは二つの塩基部分にまたがって反応していると考えられる。
【００９０】
（実施例６）
＜生成物の加水分解＞
金属複合体生成後に、生成物が時間経過とともに分解を起こすかどうかを確認した。レーザ照射後、一定時間をおいて可視紫外吸収スペクトルを測定した。分解の主な原因は溶液中に金イオンと同時に金微粒子から放出された溶媒和電子が配位複合体中の金イオンと再結合し、金原子に還元するためと考えられる。実際、レーザ照射により現れた３６０ｎｍ付近のピークはレーザ照射後に時間とともに減衰した。半減期は２５℃で３６分であった。図５に結果を示す。測定値を指数関数で当てはめた結果を実線で示した。
【００９１】
（実施例７）
＜ＤＮＡとＤＮＡ結合因子の相互作用の検出＞
ＤＮＡ結合因子の立体障害によるＤＮＡへの複合体形成反応の阻害効果について検討した。すなわち、ＤＮＡとＤＮＡ結合因子が相互作用している場合、レーザ照射された金微粒子から生成した反応性分子中間体がＤＮＡに接近できないためＤＮＡの塩基部分での反応が起こらないと考えられる。具体的には、ｓｓＤＮＡ（Seq：ggatcctaatgaccaagg）とＴ４ ｐｈａｇｅ ３２ ｐｒｏｔｅｉｎ（以下ｐ３２タンパク質と記す）との相互作用を検出した。ｐ３２タンパク質はＴ４ファージにコードされているタンパク質でＤＮＡの複製時に配列非特異的にｓｓＤＮＡに結合して、ｓｓＤＮＡの安定化に寄与するタンパク質である。反応は、１．０μＭの濃度のsｓＤＮＡ水溶液と、１０ｍＭの濃度のＴｒｉｓ水溶液と１Ｍの濃度のＣａＣｌ２水溶液と、Ａ：０Ｍ，Ｂ：０．３×１０−６Ｍ，Ｃ：１．０×１０−６Ｍの３種の濃度のｐ３２タンパク質水溶液を含む反応液に対して、５３２ｎｍのレーザ光を実施例１と同様に照射した。その後、可視紫外吸収スペクトルを測定し、３６０ｎｍの吸収ピーク強度を測定した。ｐ３２タンパク質の濃度が高いときは３６０ｎｍの吸収ピーク面積は減少した。ｐ３２タンパク質の濃度と３６０ｎｍの吸収ピークの関係を図６に示す。矢印は３６０ｎｍのピークの位置を示す。これよりｐ３２タンパク質の解離定数は１０−６以下であることが分かる。文献値によると、ｐ３２タンパク質のｓｓＤＮＡに対する解離定数は１０−８Ｍである。
【００９２】
＜ＳＣ−ＬＡＳ法で作製した金微粒子とλＤＮＡとの金属複合体の形成＞
（実施例８）
ＳＣ−ＬＡＳ（surfactant-controlled laser ablation in solution）法（ＳＤＳを添加した液体中で金微粒子を作製する方法。ＳＤＳの濃度を変えることにより生成する金微粒子の大きさを制御することが可能。例えば、特開２００３−２８６５０９号公報、及び、F.Mafune, J.Kohno, Y.Takeda, T.Kondow and H.Sawabe：J.Phys.Chem.B, 105, (2001), 5114-5120等を参照）により作製した金微粒子を用いて、実施例１と同様にして反応を行った。これはＳＣ−ＬＡＳ法で作製した金微粒子の方がＳＦ−ＬＡＳ（surfactant-free laser ablation in solution）法で作製した金微粒子より溶液中で安定なので、実験の操作が容易となる利点がある。ＳＤＳが０．０１Ｍ以上含まれると沈殿物が生じてしまい、吸収スペクトルの測定が困難であった。しかし０．００１以下のＳＤＳでは吸収スペクトルの測定が可能であり、３６０ｎｍのピークが生成し、反応がＳＤＳ存在下でも反応が進行することを確認した。
【００９３】
（実施例９）
界面活性剤の入っていない白金微粒子をＳＦ−ＬＡＳ法で作製した。これに実施例１と同様にして、λＤＮＡ（TOYOBO製）と塩化カルシウムと界面活性剤の入っていない白金微粒子とを分散、溶解させた反応液を底面が１ｃｍ×１ｃｍのガラスセルに入れた。これにＮｄ：ＹＡＧレーザの２倍波５３２ｎｍ、１７ｍＪ／パルスのパルスレーザをセルの開口部から１０分間照射し、紫外可視吸収スペクトルを測定した。その結果を図７に示す。ＤＮＡ塩基由来の２６０ｎｍ吸収ピークの他に、新たに３６０ｎｍの吸収ピークが観測された。この３６０ｎｍのピークはＤＮＡの塩基部分と白金化合物との反応によって生じた新しい化合物の吸収ピークである。また塩化カルシウムとトリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）が反応に必要であること、またモノマのＡＴＰでは反応が起こらないこと、またｓｓＤＮＡでも反応が起こることなどは金微粒子の場合と同じ傾向を示した。なお、図７において、Ａ：白金微粒子分散液にλＤＮＡと塩化カルシウムを添加して反応した時の紫外可視吸収スペクトル，Ｂ：Ａから塩化カルシウムを除いた反応液を使用して反応した時の紫外可視吸収スペクトル，Ｃ：ＡのλＤＮＡをＡＴＰに換え、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）を加えた反応液を使用して反応した時の紫外可視吸収スペクトル，Ｄ：ＡのλＤＮＡを４ｍｅｒのＤＮＡに換え、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）を加えた反応液を使用して反応した時の紫外可視吸収スペクトル，Ｅ：Ｄのトリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）を除いた反応液を使用して反応した時の紫外可視吸収スペクトル，を示す。矢印は３６０ｎｍのピークの位置を示す。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】本発明の実施形態に係る金属複合体製造装置の構成の一例を示す図である。
【図２】本発明の実施形態に係る金属複合体の製造方法において、反応前後の反応液の可視吸収スペクトルの測定結果を示す図である。
【図３】本発明の実施形態に係る金属複合体の製造方法において推定される、金属複合体が生成する反応機構を示す図である。
【図４】本発明の実施形態に係る金属複合体の製造方法において、反応後の反応液における濃度３６０ｎｍの吸収ピーク強度のＣａ２＋イオン濃度依存性を示す図である。
【図５】本発明の実施形態に係る金属複合体の製造方法において、レーザ照射直後の反応液の３６０ｎｍの吸収ピーク強度の時間経過に伴う変化を示す図である。
【図６】本発明の実施形態に係る金属複合体の製造方法において、ｐ３２タンパク質の濃度と３６０ｎｍの吸収ピークの関係を示す図である。
【図７】本発明の実施形態に係る金属複合体の製造方法において、白金微粒子を使用して反応させたときの、反応後の反応液の可視吸収スペクトルの測定結果を示す図である。
【符号の説明】
【００９５】
１ 金属複合体製造装置、１０ レーザ発生装置、１２ レンズ、１４ セル、１６ 撹拌子。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属微粒子と標的化合物とを反応させてなる、金属と標的化合物とを含む金属複合体の製造方法であって、
前記金属微粒子と、前記標的化合物と、を含む反応液に、レーザを照射することにより、前記金属複合体を製造することを特徴とする金属複合体の製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記反応液は、さらに、アミン化合物と、反応促進剤とを含むことを特徴とする金属複合体の製造方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記標的化合物は、生体高分子であることを特徴とする金属複合体の製造方法。
【請求項４】
請求項３に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記生体高分子は、核酸であることを特徴とする金属複合体の製造方法。
【請求項５】
請求項３に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記生体高分子は、タンパク質であることを特徴とする金属複合体の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記金属微粒子は、Ａｕ、Ａｇ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ｃｕ、Ｈｇ、Ｒｅ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｍｏ、Ｗ、Ｔａ及びＮｂから選択される少なくとも１つの金属を含むことを特徴とする金属複合体の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記アミン化合物は、Ａｕ、Ａｇ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ｃｕ、Ｈｇ、Ｒｅ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｍｏ、Ｗ、Ｔａ及びＮｂから選択される少なくとも１つの金属と配位結合を形成しやすいアミン化合物を含むことを特徴とする金属複合体の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記アミン化合物は、プロリン、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）、ヒスチジン、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、酢酸トリエチルアミン、尿素、アスパラギン、アルギニン、トリプトファン及びスペルミジンから選択される少なくとも１つのアミン化合物を含むことを特徴とする金属複合体の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記反応促進剤は、陽イオンであることを特徴とする金属複合体の製造方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記陽イオンは、２価以上の多価陽イオンであることを特徴とする金属複合体の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記金属複合体は、金属の配位化合物であることを特徴とする金属複合体の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記レーザは、パルスレーザであることを特徴とする金属複合体の製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記レーザの波長は、前記金属微粒子の表面プラズモン共鳴波長付近の波長であることを特徴とする金属複合体の製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記レーザの波長は、前記金属微粒子が大きな吸収係数を有する波長であることを特徴とする金属複合体の製造方法。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記レーザの波長は、前記金属微粒子のバンド間遷移付近の波長であることを特徴とする金属複合体の製造方法。
【請求項１】
金属微粒子と標的化合物とを反応させてなる、金属と標的化合物とを含む金属複合体の製造方法であって、
前記金属微粒子と、前記標的化合物と、を含む反応液に、レーザを照射することにより、前記金属複合体を製造することを特徴とする金属複合体の製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記反応液は、さらに、アミン化合物と、反応促進剤とを含むことを特徴とする金属複合体の製造方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記標的化合物は、生体高分子であることを特徴とする金属複合体の製造方法。
【請求項４】
請求項３に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記生体高分子は、核酸であることを特徴とする金属複合体の製造方法。
【請求項５】
請求項３に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記生体高分子は、タンパク質であることを特徴とする金属複合体の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記金属微粒子は、Ａｕ、Ａｇ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ｃｕ、Ｈｇ、Ｒｅ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｍｏ、Ｗ、Ｔａ及びＮｂから選択される少なくとも１つの金属を含むことを特徴とする金属複合体の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記アミン化合物は、Ａｕ、Ａｇ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ｃｕ、Ｈｇ、Ｒｅ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｍｏ、Ｗ、Ｔａ及びＮｂから選択される少なくとも１つの金属と配位結合を形成しやすいアミン化合物を含むことを特徴とする金属複合体の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記アミン化合物は、プロリン、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）、ヒスチジン、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、酢酸トリエチルアミン、尿素、アスパラギン、アルギニン、トリプトファン及びスペルミジンから選択される少なくとも１つのアミン化合物を含むことを特徴とする金属複合体の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記反応促進剤は、陽イオンであることを特徴とする金属複合体の製造方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記陽イオンは、２価以上の多価陽イオンであることを特徴とする金属複合体の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記金属複合体は、金属の配位化合物であることを特徴とする金属複合体の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記レーザは、パルスレーザであることを特徴とする金属複合体の製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記レーザの波長は、前記金属微粒子の表面プラズモン共鳴波長付近の波長であることを特徴とする金属複合体の製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記レーザの波長は、前記金属微粒子が大きな吸収係数を有する波長であることを特徴とする金属複合体の製造方法。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の金属複合体の製造方法であって、
前記レーザの波長は、前記金属微粒子のバンド間遷移付近の波長であることを特徴とする金属複合体の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００６−６９９７６（Ｐ２００６−６９９７６Ａ）
【公開日】平成１８年３月１６日（２００６．３．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２５６５５０（Ｐ２００４−２５６５５０）
【出願日】平成１６年９月３日（２００４．９．３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 分子構造総合討論会、「分子構造総合討論会２００４講演要旨集」、２００４年９月１日発行
【出願人】（０００００３２０７）トヨタ自動車株式会社 (59,920)
【出願人】（５９８０１４８１４）株式会社コンポン研究所 (24)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月１６日（２００６．３．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月３日（２００４．９．３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 分子構造総合討論会、「分子構造総合討論会２００４講演要旨集」、２００４年９月１日発行
【出願人】（０００００３２０７）トヨタ自動車株式会社 (59,920)
【出願人】（５９８０１４８１４）株式会社コンポン研究所 (24)
【Ｆターム（参考）】
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