長さ多型を有する準種において変異を検出するための方法および材料
本発明は，病原体の核酸において興味の対象である変異の存在または非存在を検出する方法に関し，ここで，興味の対象である変異は，病原体の複数の準種を規定する長さ多型に隣接して位置する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は，米国特許仮出願６０／６０３，１９５（２００４年８月２０日出願）および米国特許仮出願６０／６０３，３３７（２００４年８月２０日出願）に基づく優先権を主張する。
【０００２】
本発明は一般に，病原体における興味の対象である変異の存在または非存在を検出するための方法および物質に関する。本発明はまた，１人の患者からのサンプル中に存在する複数のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）準種の間の変異の存在または非存在を検出するための特定の方法およびプライマーに関する。
【背景技術】
【０００３】
病原体の核酸配列はしばしば高い確率で変異し，多様な多型変種を生ずる。例えば，レトロウイルスのレンチウイルス群のメンバーであり，後天性免疫不全症候群（Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＡＩＤＳ），あるいはＡＩＤＳ関連複合体（ＡＲＣ）の主要な病原因子であるヒト免疫不全ウイルスは，典型的には高頻度の変異を生ずる。ＨＩＶ−１のＲＮＡゲノムは，ＨＩＶ−１の複製に必要な蛋白質をコードする種々の遺伝子を含む。これは，他のすべてのレトロウイルスと同様にＲＮＡゲノムを有しており，これはウイルスリバーストランスクリプターゼ（ＲＴ）酵素により複製される。ＲＴ酵素は，一本鎖ウイルスＲＮＡゲノムをコピーして二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドとし，その結果ＤＮＡプロウイルスが宿主細胞ゲノム中に組み込まれる。ＲＴ酵素は，通常はポリメラーゼ酵素の"プルーフリーディング"機能を助けてエラーを修復する３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失している。したがって，ＲＴ酵素は１０，０００塩基がコピーされる転写ごとに少なくとも１つの誤りを生じ，その結果，ＨＩＶ−１の高い変異率の原因である誤りが生ずる。
【０００４】
ＨＩＶ−１のＲＮＡゲノムはまた，２つの主要なサブユニット，すなわち，ｇｐｌ２０表面糖蛋白質およびｇｐ４１貫膜糖蛋白質からなるエンベロープ糖蛋白質（ｅｎｖ）をコードする遺伝子を含む。ｇｐ４１サブユニットは，ＨＩＶ−１ウイルスがＣＤ４細胞の細胞外膜に融合することを容易にする貫膜蛋白質をコードする。ＨＩＶ−１ ｅｎｖ蛋白質は，ＣＤ４細胞への初期感染に重要な役割を果たすため，ＨＩＶ−１の細胞への融合を担う蛋白質の相互作用を阻害し，このことによりＨＩＶの感染を阻害することができる薬剤の探索における第１の標的であった。ＨＩＶ−１ ｅｎｖ蛋白質のｇｐ４１サブユニットの１つの特定の標的は，７回反復１（ＨＲ１）および７回反復２（ＨＲ２）ドメインであり，これらはウイルスと細胞膜との融合に必要なコンフォメーション変化を容易にするうえで鍵となる役割を果たすことが見いだされている。多くの抗レトロウイルス薬剤は，ＨＩＶ−１の細胞への侵入を阻害するために，ＨＩＶ−１ ｅｎｖ蛋白質を標的とするため，ＨＩＶ−１の薬剤耐性の原因となる多くの変異はこの領域中で生ずる。
【０００５】
ＨＩＶを治療するために現在利用可能な種々の薬剤は，３つの異なる種類に分類される：ヌクレオシドリバーストランスクリプターゼ阻害剤（ＮＲＴＩ），非ヌクレオシドリバーストランスクリプターゼ阻害剤（ＮＮＲＴＩ），およびプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）。ＡＩＤＳを治療するために用いられている現在利用可能な抗レトロウイルス化合物はいくつかの欠点を有しており，これには，一過性のＣＤ４細胞数効果，ウイルス複製の不完全な阻害，処方される投与量における毒性，および耐性型のウイルスの出現が含まれる。組み合わせ療法が登場しているが，多くの患者は，抗レトロウイルス化合物を用いても，完全なウイルス抑制を達成できないか維持できないままである。不完全なウイルス抑制の結果として，ＨＩＶウイルスの非常に高い突然変異率（ウイルスＲＴ酵素が誤りを起こしやすい性質のため）およびウイルスの遺伝的可変性と相まって，薬剤に対する感受性が低下した多くのＨｌＶ変種が生ずる。例えば，ＨＩＶと宿主細胞との融合を阻害する新しい種類の抗ＨＩＶ剤の最初のものであるエンフビルチド（Ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ；Ｅｎｆ，以前はＴ−２０と称されていた）を使用すると，ｇｐ４１（ＨＲ１）の第１の７回反復ドメイン中に耐性変異が出現し，これがＴ−２０治療の失敗につながっている。
【０００６】
治療的介入の前に，特定の抗レトロウイルス剤に対するＨＩＶ−１薬剤耐性に関連した変異を同定することによって，ウイルスが最も高い感受性をもつ薬剤を選択して投与することにより，治療的介入の特定の経過を最適化することができる。変異は，種々の手法によって検出することができる。その最も直接的かつ信頼性のある手法は，ウイルスＤＮＡの配列決定（ジェノタイピング）である。ジェノタイピングの結果に基づいて治療的介入に関連した重要かつ救命的な決定がなされる臨床的ジェノタイピングの場合には，ＤＮＡの相補鎖の配列を比較することにより配列決定結果を確認することがさらに重要である。しかし，単一の患者サンプル中に複数の種の病原性ベクターが存在する場合には，ジェノタイピングの有効性を高め，配列結果の双方向確認を得ることが困難である。混合された種の病原性ベクターを含む患者サンプルは複数の変種のＤＮＡ配列を含むため，配列決定は，特定の位置に複数の塩基を示し，挿入または欠失変異の場合には，読み枠のシフトのためＤＮＡの領域全体にわたって各位置で複数の塩基を示すであろう。したがって，結果が混乱し，配列の相補鎖の確認およびその配列における臨床的に意義ある変異の同定が妨げられるであろう。したがって，患者サンプル中に複数の種の形で存在する病原性ベクターは，臨床的なジェノタイピングの努力をますます困難性なものとし，臨床的に重要な変異，例えば，特定の治療薬剤に対して耐性のウイルスを生じさせる変異を検出するための診断アッセイを構築することをますます困難なものとする。
【０００７】
したがって，臨床の状況における相補鎖確認に適しており，かつ患者のサンプル中に複数の準種の形で存在する病原性ベクター中の，臨床的に重要な変異を検出し同定することができる，より正確かつ信頼性のあるジェノタイピング法を開発することが求められている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本発明は，複数の準種の病原体を含む患者サンプル中に存在するＨＩＶ等の病原体を臨床でジェノタイピングするための改良された方法および材料を提供する。
【０００９】
特定の観点においては，本発明は，混合された長さ多型を有する病原体の複数の準種を含むサンプル中に存在する病原体において，興味の対象である変異の存在または非存在を検出する方法および材料に関し，ここで，興味の対象である変異は，長さ多型に隣接して位置する。
【００１０】
特定の観点においては，本発明は，混合された準種の病原体を含む患者サンプルにおいて興味の対象である変異の存在または非存在を検出する方法および材料に関し，ここで，興味の対象である変異は，異なる核酸配列長さの準種をもたらす挿入変異または欠失変異などの所定の長さ多型に隣接して位置する。特定の観点においては，本発明は，混合された準種を含む患者サンプル中に存在しうる長さ多型を有するＨＩＶ−１ウイルスのジェノタイピングにおける正確性を改良するための方法およびプライマーを提供する。本発明の改良された方法および材料は，感染性疾患，例えばＡＩＤＳの治療的介入および治療を改良することができる。
【００１１】
本発明の方法およびプライマーは，全ＨＩＶ−１ ｅｎｖ遺伝子の増幅および配列決定からは，治療的介入にはその同定が必須である重要な薬剤耐性を伴う変異の存在を同定し確認するのに必要な信頼性のある相補鎖確認データが得られないという最初の発見の結果として開発された。ＨＩＶ−１ ｅｎｖ遺伝子のｇｐ４１領域は，第１の７回反復ドメイン（ＨＲ１）および第２の７回反復ドメイン（ＨＲ２）を含む。第１の７回反復ドメイン（ＨＲ１）のまわりの領域は，高頻度で挿入または欠失変異を受けやすく，その結果ＨＲ１ドメイン中に薬剤耐性変異を有し，さらに長さ多型を有する複数の準種を含む，混合されたＨＩＶ−１集団が生ずる。単一の患者サンプル中に準種の間で混合された長さ多型が存在することにより，より広い領域をカバーするプライマーを用いて相補鎖の確認配列を得ようとする努力が妨げられる。これは，外側プライマーの１つと目的とする変異との間に生ずる混合長さ多型変異のために，プライマー間の領域に異なる長さの配列を有する相補プライマー伸長産物が生じ，このために重複した読み枠外の配列シグナルが生ずるためである。本発明の方法は，長さ多型を含む領域を含まない，興味の対象である変異の領域を配列決定することにより，ジェノタイピングの信頼性を改良する。プライマーセットは，単独で用いてもよく，または可変の領域を含む二次的プライマーセットと組み合わせて用いて，他の配列決定プライマーを用いては容易に特性決定することができないサンプルについてジェノタイプを確認することができる。
【００１２】
本発明の方法は，最初はＨＩＶ−１遺伝子に関連して開発されたが，かかる方法は，複数の準種の間で長さ多型を有するあらゆる病原体に適用可能である。したがって，本発明は，ＨＩＶ−１等の病原体の核酸において，興味の対象である変異の存在または非存在を検出する方法に関し，ここで，興味の対象である変異は，病原体の複数の準種を規定する長さ多型に隣接して位置しており，該方法は，
ａ）患者サンプルから興味の対象である変異を包含する二本鎖ＤＮＡテンプレートを取得し；
ｂ）ＤＮＡテンプレートの，興味の対象である変異を含み長さ多型を含まない領域の第１の鎖を配列決定し；
ｃ）ＤＮＡテンプレートの，興味の対象である変異を含み長さ多型を含まない領域の第２の鎖を配列決定し；そして
ｄ）第１の鎖の配列を第２の鎖の配列と比較して，興味の対象である変異の配列の相補鎖確認を得る，ことを含む。
【００１３】
別の観点においては，本発明は，ＨＩＶ−１等の病原体の核酸において興味の対象である変異の存在または非存在を検出する方法に関し，ここで，興味の対象である変異は，病原体の複数の準種を規定する長さ多型に隣接して位置しており，該方法は，
ａ）患者サンプルから興味の対象である変異を包含する二本鎖ＤＮＡテンプレートを取得し；
ｂ）ＤＮＡテンプレートの，興味の対象である変異および長さ多型の両方を含む第１の領域を増幅し；
ｃ）ＤＮＡテンプレートの，興味の対象である変異を含み長さ多型を含まない領域の第１の鎖を配列決定し；
ｄ）ＤＮＡテンプレートの，興味の対象である変異を含み長さ多型を含まない領域の第２の鎖を配列決定し；そして
ｅ）第１の鎖の配列を第２の鎖の配列と比較して，興味の対象である変異の配列の相補鎖確認を得ることを含む。
【００１４】
さらに別の観点においては，本発明は，ＨＩＶ−１等の病原体の核酸において興味の対象である変異の存在または非存在を検出する方法に関し，ここで，興味の対象である変異は病原体の複数の準種を規定する長さ多型に隣接して位置しており，該方法は，
ａ）患者サンプルから興味の対象である変異を包含する二本鎖ＤＮＡテンプレートを取得し；
ｂ）ＤＮＡテンプレートの，興味の対象である変異を含み長さ多型を含まない第１の遺伝子領域を増幅し；
ｃ）ＤＮＡテンプレートの，興味の対象である変異を含みさ多型を含まない領域の第１の鎖を配列決定し；
ｄ）ＤＮＡテンプレートの，興味の対象である変異を含みさ多型を含まない領域の第２の鎖を配列決定し；そして
ｅ）第１の鎖の配列を第２の鎖の配列と比較して，興味の対象である変異の配列の相補鎖確認を得ることを含む。
【００１５】
本発明の１つの観点においては，興味の対象である変異は，ＨＩＶのｇｐ４１およびｇｐｌ２０からなる群より選択される領域に位置する。本発明の別の観点においては，興味の対象である変異は，ＨＩＶ−１エンベロープ糖蛋白質ｇｐ４１中に存在する。本発明のさらに別の観点においては，興味の対象である変異は，ｇｐ４１の３６−４５位に存在する。
【００１６】
別の観点においては，本発明は，本質的に配列番号１のヌクレオチド７３２９−７６１４，配列番号１の７３８８−７５４９または配列番号１の７４９２−７５２２，それらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる領域に対応するプライマー伸長産物を生成することができるオリゴヌクレオチドプライマーに関する。
【００１７】
別の観点においては，本発明は，配列番号３１，配列番号３２，配列番号３３，配列番号３４，配列番号３５，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択される，フォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせに関する。
【００１８】
１つの観点においては，本発明は，ＨＩＶ−１ ｅｎｖ蛋白質のｇｐ４１サブユニットをジェノタイピングするための方法およびプライマーに関し，該方法は，ＨＩＶ−１ ｅｎｖ蛋白質のｇｐ４１サブユニットのＨＲ１およびＨＲ２ドメインの両方を包含する領域の配列を決定することを含む。
【００１９】
別の観点においては，本発明は，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９，配列番号３０，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントの１またはそれ以上からなる群より選択されるプライマーを含む。
【００２０】
別の観点においては，本発明は，ＨＩＶ−１のＨＲ１およびＨＲ２ドメインを包含する領域を囲む双方向配列決定プライマーのセットを含むプライマーの組み合わせに関し，ここで，プライマーの組み合わせは，
（ａ）配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントの１またはそれ以上からなる群より選択されるフォワードプライマー；および
（ｂ）配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９，配列番号３０，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントの１またはそれ以上からなる群より選択されるリバースプライマー
を含む。
【００２１】
各群から選択された１またはそれ以上のプライマーを逆転写，増幅および配列決定プライマーとして用いることができる。
【００２２】
プライマーは，適当なジェノタイピングキット中に包装することができる。そのようなキットは，プライマーに加えて，ＲＮａｓｅ阻害剤，リバーストランスクリプターゼ，ポリメラーゼ，および／またはＤＮＴＰおよびｄｄＮＴＰ原料等の試薬を含んでいてもよい。好ましい観点においては，本発明は，病原体の核酸において興味の対象である変異の存在または非存在を検出するためのキットに関し，ここで，興味の対象である変異は，病原体の複数の準種を規定する長さ多型に隣接して位置しており，該キットは，ＤＮＡテンプレートの興味の対象である変異を含む領域の第１の鎖を配列決定するための第１のプライマー，およびＤＮＡテンプレートの興味の対象である変異を含む領域の第２の鎖を配列決定するための第２のプライマーを含み，ここで，第１のプライマーおよび第２のプライマーにより規定される領域は長さ多型を含まない。
【００２３】
プライマーは，本発明の方法において適宜用いられる。この方法にしたがって，ＨＩＶ−１ウイルスを含むと疑われるサンプルを処理してウイルスＲＮＡを回収する。回収されたウイルスＲＮＡを逆転写してＤＮＡとし，これを本発明のプライマーを用いて配列決定する。得られた配列情報を用いて，試験したウイルスのジェノタイプを確立する，すなわち，サンプル中のウイルスがいずれのサブタイプ，種または準種に属するかを判定するか，または興味の対象である変異の存在または非存在を判定することができる。本発明の方法は，多数のウイルス種を評価するよう設計されたジェノタイピング法と平行して行うことができる。あるいは，これまでに感染性病原体をジェノタイピングする目的で信頼性のある配列情報を得ようとする試みが失敗している対象物を有するサンプルについて，本発明の方法を実施することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
発明の詳細な説明
本明細書において用いられる用語は当該技術分野において標準的なものであるが，明確性を確実にするために，ある種の用語について以下に定義を記載する。
【００２５】
単位，識別番号，および記号は，ＳＩに許容された形を示す。特に記載しない限り，核酸は左から右に５’から３’方向に記載される。本明細書に記載される数値範囲は，その範囲を規定する数値を含み，規定される範囲内の各整数を含みかつ支持する。アミノ酸は，その一般的に知られる３文字記号で表してもよく，ｔｈｅ ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＭＢ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号で表してもよい。同様に，ヌクレオチドは，その一般的に許容される１文字コードで表すことができる。特に記載しない限り，"ａ"または"ａｎ"との用語は，"・・・の少なくとも１つ"を意味すると解釈すべきである。本明細書において用いられる節の見出しは，整理の目的のためのみであり，記載される主題を制限するものと解釈してはならない。本明細書において引用されるすべての文献または文献の一部，例えば，限定されないが，特許，特許出願，論説，書籍，および論文は，すべての目的のために，明示的に本明細書の一部としてここに引用する。本出願中でアミノ酸または核酸配列の不一致がある場合には，図面にしたがう。
【００２６】
本明細書において用いる場合，"病原体"との用語は，宿主生物の外に由来するかまたは外で最初に生成されるが，宿主生物中に存在する感染因子または外来ベクターを意味し，例えば，ウイルス，細菌，真菌またはプロトゾア生物が含まれる。本発明の方法および試薬は，宿主生物中に複数の準種の形で存在する病原体のジェノタイピングに有利に用いられ，ここで，準種は，準種の間で長さ多型を生じさせる，長さ多型の１またはそれ以上のアレルを有することを特徴とする。
【００２７】
本明細書において用いる場合，"準種（ｑｕａｓｉｓｐｅｃｉｅｓ）"との用語は，代替のまたは追加の遺伝子配列の取り込みまたは欠失の結果として，異なる遺伝子配列を含む自己複製型生物の種を意味し，正しい場合も誤りである場合も含まれる。準種は，例えば，既に存在する他の遺伝子配列の遺伝子のコピーのプロセスの結果として生じうる。準種は，典型的には，生物，例えば，細菌およびウイルスなどの感染性病原体のＲＮＡまたはＤＮＡなどの自己複製型高分子の進化プロセスの状況中で生ずる。本明細書において用いる場合，"準種"との用語は，変種（ｖａｒｉａｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ）および変種が由来する野生型種の両方を含む。
【００２８】
本明細書において用いる場合，"長さ多型"との用語は，遺伝子配列中の，異なる長さの核酸配列を有する準種を生ずる任意の変異を意味する。長さ多型としては，例えば，限定されないが，異なる核酸配列長さを生ずる挿入変異，欠失変異および，置換変異が挙げられる。複数の準種を含むサンプルの自動化配列決定においては，配列決定の軌跡は，２つの異なる配列（すなわち，参照配列および長さ多型を含む配列）からのデータを含むこととなり，所与のヌクレオチド塩基位置において複数のピークが重ね合わされる。本発明の文脈において，"病原体の複数の準種を規定する長さ多型"との語句は，その遺伝子座に関して病原体の複数の準種を生ずる長さ多型が存在する遺伝視座を意味する。長さ多型とは，異なる準種を生ずる病原体の種々のアレルまたは種を表し，その種に関して長さ多型が規定される"野生型"または"参照"種を含む。
【００２９】
本明細書において用いる場合，"隣接する"との用語は，興味の対象である変異の，長さ多型に対する位置について用いられる。興味の対象である変異は，その位置が，標準的な増幅および／または配列決定プライマーが興味の対象である変異と長さ多型との両方を囲むのに十分に近接している場合，長さ多型に"隣接"していると考えられる。興味の対象である変異と長さ多型との間の正確な距離は重要ではないが，外側プライマーの一方と目的とする変異との間に混合長さ多型変異が生ずる場合には，重なり合ったフレーム外の配列が生成するために，配列の質の低下を引き起こす。本発明の方法および物質は，そのような重なり合ったフレーム外配列を生成する任意のまたはすべての長さ多型を含まないようにすることができるプライマーを用いる場合に，有利に利用することができる。
【００３０】
本明細書において用いる場合，"サンプル"との用語は，複数の準種を有する病原体からの核酸被検物質を含むかもしれない，患者または患者の群から得られる生物学的サンプルを表す。患者サンプルには，個人または複数の個人から単離された組織または液体のサンプル，例えば，限定されないが，皮膚，血漿，血清，脊髄液，リンパ液，滑液，尿，涙，血液細胞，臓器，腫瘍，およびインビトロ細胞培養構成物のサンプル（例えば，限定されないが，細胞培養培地における細胞の成長から得られるコンディションド培地，組換え細胞および細胞成分）が含まれる。
【００３１】
本明細書において用いる場合，"増幅"との用語は，反応混合物中で，１またはそれ以上の特定の遺伝子または遺伝子フラグメントの量を他の遺伝子に対して増加させるプロセスを意味する。多くの増幅方法が当業者に利用可能であり知られている。そのような方法は，典型的には，ポリメラーゼ連鎖反応（またはＰＣＲ）の技術または他の何らかのプライマー伸長に基づく方法論を利用する。ＰＣＲ法は，例えば，米国特許４，６８３，１９４，４，６８３，１９５および４，６８３，２０２，および４，８００，１５９（本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。この方法はまた，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；１９９５）），Ｋ．Ｍｕｌｌｉｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５１：２６３−２７３（１９８６）；およびＣ．Ｒ．Ｎｅｗｔｏｎ＆Ａ．Ｇｒａｈａｍ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：ＰＣＲ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：１９９７）（その内容を本明細書の一部としてここに引用する）などの教科書にも説明されている。ＰＣＲは，デュープレックスＤＮＡ（ここで，コーディング鎖は"センス鎖"と称され，その相補鎖は"アンチセンス鎖"と称される）の各相補鎖に対して１つずつのプライマーの対を使用することを含み，これらは遺伝子中の目的とする領域の両側に位置する部位でハイブリダイズする。次に反復サイクルにおいて鎖伸長重合を行って，目的とする領域のコピー数を指数関数的に増加させる。簡単にまとめると，ＰＣＲ反応の第１の工程においては，二本鎖分子を変性させるために，サンプルの核酸分子を一時的に加熱し，次に冷却する。フォワードおよびリバースプライマーは，増幅反応混合物中に，サンプル標的と比較して過剰の濃度で存在する。サンプルをハイブリダイゼーションおよび重合が生ずる条件下でインキュベーションすると，プライマーは，増幅することが望まれる配列の領域の３’側の位置で，その増幅が望まれる配列の相補体である核酸分子の相補鎖にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後，プライマーの３’末端がポリメラーゼにより伸長される。プライマーの伸長により，所望の核酸サンプル標的の相補体の正確な配列を有するＤＮＡ分子が合成される。ＰＣＲ反応は，所望の核酸配列を指数関数的に増幅することができ，各サイクルで所望の配列を有する分子の数がほぼ２倍になる。すなわち，ハイブリダイゼーション，重合，および変性のサイクルを進めることにより，所望の核酸分子の濃度の指数関数的な増加を達成することができる。増幅されたポリヌクレオチドは，配列決定反応のテンプレートとして用いることができる。Ｇｅｌｆａｎｄらは，この増幅プロセスで有用な，生物Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓに由来する熱安定性酵素，"Ｔａｑポリメラーゼ"を記載する（米国特許４，８８９，８１８；５，３５２，６００；および５，０７９，３５２（本明細書の一部としてここに引用する））。別の増幅手法，例えば，ＮＡＳＢＡ，３ＳＲ，Ｑｂレプリカーゼ，および分枝鎖増幅が当業者に知られており利用可能である。"ＲＴ−ＰＣＲ"との用語は，一般に増幅を表し，例えば，ＲＮＡ配列の増幅を進める逆転写工程を含む。
【００３２】
本明細書において用いる場合，"配列決定"との用語は，遺伝子の少なくとも一部におけるヌクレオチドの順番を決定することを意味する。よく知られる配列決定の方法は"チェーンターミネーション"法であり，これはＳａｎｇｅｒら（ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）７４（１２）：５４６３−５４６７（１９７７））により最初に記載され，Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）２．０の製品説明（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ）に詳細に説明されており，最近では欧州特許ＥＰ−Ｂ１−６５５５０６（この内容をすべて本明細書の一部としてここに引用する）に詳細に述べられている。この方法においては，配列決定すべきＤＮＡを単離し，１本鎖とし，４つの容器に入れる。各容器には，ＤＮＡ鎖の複製に必要な成分が入っており，これは，プライマーと配列決定すべきＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションおよびハイブリダイズしたプライマーの鎖伸長を促すバッファ中に，テンプレート依存的ＤＮＡポリメラーゼ，配列決定すべきＤＮＡの配列決定の開始部位に相補的な短いプライマー分子，および塩基Ａ，Ｃ，ＧおよびＴのそれぞれのデオキシリボヌクレオチド三リン酸を含む。さらに，各容器は，あるタイプのジデオキシヌクレオチド三リン酸，例えば，ジデオキシアデノシン三リン酸（"ｄｄＡ"），ジデオキシグアノシン三リン酸（"ｄｄＧ"），ジデオキシシトシン三リン酸（"ｄｄＣ"），ジデオキシチミジン三リン酸（"ｄｄＴ"）を少量含む。それぞれの容器において，単離されたＤＮＡの一部がそれぞれプライマーとハイブリダイズする。次に，プライマーを，１回に１塩基ずつ伸長して，テンプレートＤＮＡに相補的な新たな核酸ポリマーが形成される。伸長しつつあるポリマー中にジデオキシヌクレオチドが取り込まれると，ポリマーはさらなる伸長が妨げられる。したがって，各容器において，特定の長さの伸長されたポリマーの組が形成され，これはその容器内のジデオキシヌクレオチドに対応するヌクレオチドの位置を示す。次にこれらのポリマーの組をゲル電気泳動を用いて評価して，配列を決定する。
【００３３】
ポリヌクレオチドの配列決定は，一本鎖ＤＮＡを用いて行っても二本鎖ＤＮＡを用いて行ってもよい。プライマー伸長のためにポリメラーゼを使用する場合には，一本鎖ＤＮＡテンプレートが必要である。好ましい態様においては，本発明の方法は，配列決定結果の確証的な反対鎖確認を得るために，二本鎖ＤＮＡを用いる。二本鎖ＤＮＡテンプレートは，アルカリ変性または熱変性を用いて２つの相補ＤＮＡテンプレートを分離して一本鎖として，配列決定することができる。重合の間に，ＤＮＡテンプレートの各分子は，相補的プライマーにより伸長された鎖として１回コピーされる。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば，Ｔａｇ，Ｂｓｔ，ＴｔｈまたはＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ）を使用することにより，配列決定反応において，熱変性，プライマーアニーリング，伸長およびジデオキシターミネーションの交互周期を通して，二本鎖ＤＮＡテンプレートを反復循環させることができる。この循環プロセスは，少量の入力ＤＮＡテンプレートを効率的に増幅して，配列決定のために十分なテンプレートを生成する。
【００３４】
配列決定はまた，ＰＣＲ増幅反応生成物に対して直接行うことができる。増幅されたＤＮＡのクローニングは比較的簡単であるが，ＰＣＲ産物の直接配列決定は，配列情報の取得を容易にし迅速にする。ＰＣＲ反応が別々の増幅産物を生ずるかぎり，これを直接配列決定に適用することができる。ＰＣＲ産物をクローニングして，単一クローンを配列決定する方法と比較して，ＰＣＲ産物の配列を直接分析するアプローチは一般に，ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの比較的高い誤差率に影響されない。誤差は分子の全体にわたって確率的に分布していると考えられる。すなわち，圧倒的多数の増幅産物は，正しい配列から構成されるであろう。ＰＣＲ産物の直接配列決定は，クローニングしたＰＣＲ産物の配列決定と比較して，以下の利点を有する：（１）これは生きた細胞の使用に依存しない簡単な酵素プロセスであるため，容易に標準化することができる；および（２）各サンプルについて一方の配列を決定するだけでよい。
【００３５】
本明細書において用いる場合，"核酸"，"ポリヌクレオチド"，および"オリゴヌクレオチド"との用語は，プライマー，プローブ，検出すべきオリゴマーフラグメント，オリゴマー対照および未標識ブロッキングオリゴマーを表し，ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む），ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む），およびプリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドである他の任意のタイプのポリヌクレオチド，または修飾されたプリンまたはピリミジン塩基の総称である。"核酸"，"ポリヌクレオチド"および"オリゴヌクレオチド"との用語の間では，長さ上の区別を意図するものではなく，これらの用語は，特に明示しないかぎり，同等であり代替可能である。これらの用語は，分子の一次構造のみを表す。すなわち，これらの用語は，二本鎖および一本鎖ＤＮＡ，ならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡを含む。オリゴヌクレオチドは，指定されたヌクレオチド配列の領域に対応した，少なくとも約６ヌクレオチド，好ましくは少なくとも約１０−１２ヌクレオチド，より好ましくは少なくとも約１５−２５ヌクレオチドの配列から構成される。核酸はまた，標準的なヌクレオチド塩基をヌクレオチドアイソフォーム類似体で置き換えてもよく，これには，例えば，限定されないが，標準的な塩基とおおよそ許容範囲内でハイブリダイズすることができ，相補的アイソフォーム類似体塩基と優先的にハイブリダイズするであろうイソＣおよびイソＧ塩基が含まれる。多くのそのようなアイソフォーム塩基が例えば，ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ．に記載されている。本明細書において参照ヌクレオチド配列に対して核酸配列を規定するために用いる場合，"対応する"との用語は，参照配列のすべてまたは一部とマッチするヌクレオチド配列，および参照配列のすべてまたは一部の相補体であるヌクレオチド配列を意味する。
【００３６】
オリゴヌクレオチドは，任意の現存する配列または天然の配列から必ずしも物理学的に分離されていなくてもよいが，化学合成，ＤＮＡ複製，逆転写またはこれらの組み合わせなどの任意の方法により生成することができる。"オリゴヌクレオチド"または"核酸"との用語は，その起源または操作の理由により，以下のゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ，ｃＤＮＡ，半合成の，または合成の起源のポリヌクレオチドを意図する：（１）それが天然に関連しているポリヌクレオチドのすべてまたは一部と関連しておらず；および／または（２）それが天然に連結しているポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチドに連結しており；および（３）天然に見いだされない。
【００３７】
モノヌクレオチドを，１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸がその隣の３’酸素にホスホジエステル結合により１つの方向で結合するように反応させてオリゴヌクレオチドを作成するため，オリゴヌクレオチドの末端は，その５’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に結合していない場合には"５’末端"と称され，その３’酸素が次のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸に結合していない場合には，"３’末端"と称される。本明細書において用いる場合，核酸配列は，より長いオリゴヌクレオチドの内部にある場合であっても，５’および３’末端を有する場合がある。
【００３８】
２つの異なる重複しないオリゴヌクレオチドが同じ直鎖状の相補的核酸配列の異なる領域にアニーリングし，一方のオリゴヌクレオチドの３’末端が他方の５’末端の方向を向く場合，前者を"上流の"オリゴヌクレオチドと称し，後者を"下流の"オリゴヌクレオチドと称する。
【００３９】
本明細書において用いる場合"ＨＲ１"との用語は，ＨＩＶ−１ ｅｎｖ蛋白質のｇｐ４１サブユニットの７回反復１（ＨＲ１）領域を表し，配列番号１のヌクレオチド７３８８−７５４９で表される。
【００４０】
本明細書において用いる場合，特定のヌクレオチド配列に関して，"本質的に〜からなる"との用語は，特定の配列，および所定の長さ多型を含まない任意の追加の配列を意味する。例えば，本質的にＨＩＶ−１ ｅｎｖ ｇｐ４１領域のＨＲ１ドメインからなる領域は，ＨＲ１（配列番号１のヌクレオチド７３８８−７５４９）のすべてまたは一部，および隣接する５’および３’領域の任意の追加のヌクレオチド配列を含み，予想患者集団の間で十分に高い頻度で生じて配列決定結果の信頼性に不利に影響するかもしれない，ＨＲ１ドメインの外側に位置する長さ多型を含まない。そのような長さ多型は，例えば，おおよそｇｐ４１ドメインの最初の２５ヌクレオチドまたは最後の６０ヌクレオチド中に存在しうる。本明細書において用いる場合，本質的にＨＲ１ドメインからなる領域は，好ましくは，配列番号１のヌクレオチド７３２９−７６１４の領域，またはその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントに対応する。より好ましくは，本質的にＨＲ１ドメインからなる領域は，配列番号１のヌクレオチド７３８８−７５４９の領域またはその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントに対応する。本質的にＨＲ１ドメインからなる領域はまた，配列番号１のヌクレオチド７４９２−７５２２の領域またはその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントに対応してもよい。"本質的に・・・からなる"との用語は，所定の長さ多型を含まない特定の配列を規定するために用いられるため，本発明は，知られているかまたは知られていない他の長さ多型を含有する配列を含んでいてもよいことが理解されるであろう。本発明の有用性は，主として，長さ多型が病原性ベクターの新たな準種を引き起こし，準種が患者集団中に臨床的失敗率が許容できないほど十分に高い頻度で生ずる状況において生ずる。すなわち，本発明は，配列決定された興味の対象である変異を含む領域が，"所定の長さ多型を含まない"がなお他の長さ多型，例えば，未知であるか，または患者集団の中で臨床的な失敗の確率が許容できないほど高いと判定されないような頻度で生じない長さ多型を含んでいてもよいことを企図する。本発明の目的のためには，所定の長さ多型により規定されるベクターの準種からの配列の相補鎖確認を可能とするため，配列決定される領域からただ１つの所定の長さ多型が除かれていてもよい。
【００４１】
本明細書において，参照位置に対するプライマーの位置に関して用いる場合，"包含する"または"囲む"との用語は，ＰＣＲ伸長プライマーが特定のヌクレオチドまたはヌクレオチドの領域を含むプライマー伸長産物を生成するように配置されることを意味する。プライマーは，参照される位置のすべてまたは一部に対応するかまたはこれに相補的なヌクレオチド配列を含むことができる。あるいは，プライマーは，参照される位置の３’側の領域に相補的であってもよい。
【００４２】
"プライマー"との用語は，２以上のプライマーを表してもよく，精製した制限酵素消化産物におけるように天然に生じるオリゴヌクレオチドや，または合成により製造されるオリゴヌクレオチドを表してもよい。これは，核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が触媒される条件下におかれたとき，相補鎖に沿った合成の開始点として作用することができる。そのような条件としては，適当なバッファ（"バッファ"には，補因子であるもの，またはｐＨ，イオン強度等を変更する代替物が含まれる）中の，適当な温度における，４つの異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸および重合を誘導する試薬，例えばＤＮＡポリメラーゼまたはリバーストランスクリプターゼの存在が含まれる。
【００４３】
プライマーは，増幅の効率を最大にするためには，好ましくは１本鎖であるが，あるいは二本鎖であってもよい。二本鎖の場合，伸長産物を調製するためにプライマーを用いる前に，まずこれを処理してその鎖を分離する。好ましくは，プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは，重合用試薬の存在下で伸長産物の合成をプライミングするのに十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは，多くの因子，例えば，温度およびプライマーの起源および使用方法によって異なるであろう。例えば，標的配列の複雑性に依存して，オリゴヌクレオチドプライマーは，典型的には１０−５０，好ましくは１５−２５ヌクレオチドを含むが，より多いかまたは少ないヌクレオチドを含んでいてもよい。短いプライマー分子は一般に，テンプレートと十分に安定なハイブリッド複合体を形成するために，低い温度を必要とする。
【００４４】
本明細書において用いる場合，"伸長プライマー"との用語は，テンプレート配列に相補的であり，配列にハイブリダイズして，ポリメラーゼ連鎖反応条件下で配列を伸長してプライマー伸長産物を生成することができるポリヌクレオチド配列を意味する。
【００４５】
２つの核酸配列に関して用いる場合，"相補体"およびその関連する形容詞形である"相補的な"との用語は，２つの核酸配列を逆平行の関係で並列させたときに（一方の配列の５’末端が他方の配列の３’末端と対になる），配列の対応するＧヌクレオチド塩基とＣヌクレオチド塩基とが対となり，対応するＡヌクレオチド塩基とＴヌクレオチド塩基とが対になることを意味する。一般には天然の核酸中に見いだされないある種の塩基を本発明の核酸中に含めてもよく，これには，例えば，イノシンおよび７−デアザグアニンがある。
【００４６】
本明細書において用いる場合，"アレル"との用語は，多型の遺伝子座におけるヌクレオチド配列の特定のバージョンを意味する。
【００４７】
本明細書において用いる場合，"多型部位"との用語は，ある集団中で変動する遺伝子座中の所与のヌクレオチド位置を意味する。
【００４８】
本明細書において用いる場合，"遺伝子座"との用語は，ＤＮＡ配列における，または転写されたＤＮＡ配列に由来しウイルス粒子中にパッケージングされた対応するＲＮＡ鎖における，ヌクレオチドまたはヌクレオチドの領域の特定の位置または配置を意味する。
【００４９】
アデノシン，シトシン，グアニンおよびチミンのヌクレオチドは，それぞれ１文字表記Ａ，Ｃ，Ｇ，およびＴにより表される。縮重プライマーを表記する場合には，記号ＲはＧまたはＡのいずれかを表し，記号ＹはＴ／ＵまたはＣのいずれかを表し，記号ＭはＡまたはＣのいずれかを表し，記号ＫはＧまたはＴ／Ｕのいずれかを表し，記号ＳはＧまたはＣのいずれかを表し，記号ＷはＡまたはＴ／Ｕのいずれかを表し，記号Ｂは"Ａ以外"，記号Ｄは"Ｃ以外"，記号Ｈは"Ｇ以外"，記号Ｖは"Ｔ／Ｕ以外"を表し，記号Ｎは任意のヌクレオチドを表す。本出願の明細書および特許請求の範囲においては，縮重プライマーとは，塩基の選択のすべての組み合わせを表し，ＤＮＡまたは対応するＲＮＡ配列（すなわち，ＴがＵで置き換えられている）のいずれをも表す。すなわち，縮重プライマーは，単一の種，またはその選択の範囲内の２つの種の混合物，またはその選択の範囲内の３つの種の混合物，および同様にしてすべての可能な組み合わせを含む混合物を表すことができる。アイソフォームヌクレオチド塩基は，当業者に一般に許容されている命名法を用いて表す。
【００５０】
本明細書において用いる場合，"オリゴヌクレオチドプライマー"との用語は，４以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドから構成される分子を意味する。その正確な長さは，オリゴヌクレオチドプライマーの究極的な機能および用途に関連する多くの因子，例えば，アニーリング反応の温度，プライマーの起源および組成によって異なるであろう。増幅プライマーは，重合用の試薬の存在下で伸長産物の合成をプライミングするのに十分な長さでなければならない。オリゴヌクレオチドプライマーは，核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成を誘導する条件下におかれたときに，合成の開始点として作用することができる。この条件としては，適当な温度およびｐＨにおける，ＤＮＡポリメラーゼ等の誘導試薬およびヌクレオチドの存在が挙げられる。好ましい態様においては，プライマーは，誘導試薬の存在下で特定の配列から伸長産物の合成をプライミングするのに十分な長さの一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。本発明の１つの観点においては，オリゴヌクレオチドプライマーは，約１０−約５０ヌクレオチドの長さ，好ましくは約１５−約３０ヌクレオチドの長さであるが，プライマーはより多くのまたは少ないヌクレオチドを含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドプライマーは，一般に，少なくとも１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，または２５ヌクレオチドの長さである。より好ましくは，プライマーは約２０−２５ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドプライマーの感度および特異度は，プライマーの長さおよびテンプレート核酸の所与のサンプル中における配列のユニークさにより決定される。短すぎるプライマーは，例えば，広範な種類の配列に対する非特異的結合を示すかもしれない。
【００５１】
本発明において用いられるオリゴヌクレオチドプライマーはまた，ユニバーサルプライマーを含んでいてもよい。ユニバーサルプライマーは，ユニバーサルプライマーに相補的な配列を含む標準的なベクター中に挿入されたポリヌクレオチド配列を増幅し配列決定するために便利に用いられる。ユニバーサル配列決定プライマーは当業者にはよく知られており，例えば，Ｔ７，ＳＰ６，Ｍ１３（−４０），Ｍ１３（−２０），およびＭ１３／ｐＵＣと称されるプライマーが挙げられる。増幅プライマーは，増幅産物（アンプリコン）がユニバーサルプライマー部位を取り込むように，ユニバーサルプライマーの相補体を含むよう設計することができ，このことにより，次に相補的ユニバーサル配列決定プライマーを用いて配列決定することが容易になる。
【００５２】
本発明のプライマーはまた，プライマー配列と興味の対象である配列との間にランダムな追加の配列を含ませて，より正確な配列決定を容易にしてもよい。典型的には配列の最初の１０−５０塩基対は読めないため，１０−５０塩基対のランダム配列を付加することにより，重要な配列を最初の読めない配列の下流にシフトさせて，目的とする配列を配列の正確な読みが得られる領域に配置することができる。
【００５３】
"逆転写"との用語は，ＲＮＡ分子に相補的なＤＮＡを生成するプロセスを意味し，一般に，リバーストランスクリプターゼ酵素を用いて行う。プライマーを用いて重合を開始することができ，このプライマーは，後にＰＣＲ増幅に用いるプライマー対の１つであってもよい。次に，ＲＮＡ分子をコピーされたＤＮＡ（"ｃＤＮＡ"）から分離するか，または酵素のＲＮＡｓｅＨ活性により分解して，テンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼによってｃＤＮＡの第２の鎖が生成されるようにする。この方法は，"Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ"，Ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；１９９５）（その内容を本明細書の一部としてここに引用する）のユニット３．７および１５．４に開示されている。
【００５４】
本発明の実施においては，特に記載しないかぎり，当業者の技術の範囲内である分子生物学，微生物学，組換えＤＮＡ手法，オリゴヌクレオチド合成の慣用の手法を利用することができる。そのような手法は，文献にすべて説明されている。酵素反応および精製手法は，製造元の仕様書にしたがって，または当該技術分野に一般に確立されているように，または本明細書に記載されるようにして，行うことができる。上述の手法および手順は，一般に，当該技術分野においてよく知られる慣用の方法にしたがって，および本明細書の全体に引用されるか説明される種々の一般的および特定の文献にしたがって実施する。例えば，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８４）；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，１９８４）；およびＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙのシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照（これらのすべての内容を本明細書の一部としてここに引用する）。
【００５５】
本発明の方法
本発明は，異なる所定の長さ多型に隣接する興味の対象である変異の存在または非存在を検出する方法に関する。本発明の方法および試薬は，長さ多型について複数の準種のベクターを含むかもしれない患者サンプルにおいて，感染性病原体等の外来ベクターのポリヌクレオチド配列を得るために最も有利に用いることができる。単一の患者サンプル中に混合された準種の長さ多型が存在すると，配列決定された領域が長さ多型を包含する場合に，ベクターの相補的な反対鎖ＤＮＡから配列決定結果を確認することが妨げられる。一般に，本発明の方法は，興味の対象である変異に関連するが隣接する所定の長さ多型を含まない領域の両方の相補鎖を選択的に配列決定し，そして相補鎖の配列を比較して，各鎖の配列がすべてのヌクレオチド塩基において他方の鎖と相補的であることを確認することを含む。
【００５６】
本発明の方法は最初にＨＩＶ−１遺伝子に関して開発されたが，かかる方法は，複数の準種の間で長さ多型を有するあらゆる病原体にもやはり適用することができる。したがって，本発明は，ＨＩＶ−１等の病原体の核酸における，興味の対象である変異の存在または非存在を検出する方法に関し，ここで，興味の対象である変異は，病原体の複数の準種を規定する長さ多型に隣接して位置する。この方法は，
ａ）患者サンプルから興味の対象である変異を包含する二本鎖ＤＮＡテンプレートを取得し；
ｂ）ＤＮＡテンプレートの，興味の対象である変異を含み長さ多型を含まない領域の第１の鎖を配列決定し；
ｃ）ＤＮＡテンプレートの，興味の対象である変異を含み長さ多型を含まない領域の第２の鎖を配列決定し；そして
ｄ）第１の鎖の配列を第２の鎖の配列と比較して，興味の対象である変異の配列の相補鎖確認を得ることを含む。工程（ｂ）および（ｃ）の配列決定は，外来ベクターの特定の領域の遺伝子配列情報を与えることができる任意の適当なＤＮＡテンプレートを用いて行うことができる。
【００５７】
別の観点においては，本発明は，ＨＩＶ−１等の病原体の核酸において，興味の対象である変異の存在または非存在を検出する方法に関し，ここで，興味の対象である変異は，病原体の複数の準種を規定する長さ多型に隣接して位置する。この方法は，
ａ）患者サンプルから興味の対象である変異を包含する二本鎖ＤＮＡテンプレートを取得し；
ｂ）ＤＮＡテンプレートの，興味の対象である変異および長さ多型の両方を含む第１の領域を増幅させ；
ｃ）ＤＮＡテンプレートの，興味の対象である変異を含み長さ多型を含まない領域の第１の鎖を配列決定し；
ｄ）ＤＮＡテンプレートの，興味の対象である変異を含み長さ多型を含まない領域の第２の鎖を配列決定し；そして
ｅ）第１の鎖の配列を第２の鎖の配列と比較して，興味の対象である変異の配列の相補鎖確認を得る，ことを含む。この方法においては，増幅工程は興味の対象である変異および長さ多型を含み，長さ多型が排除されるのは配列決定工程（ｃ）および（ｄ）中である。
【００５８】
さらに別の観点においては，本発明は，ＨＩＶ−１等の病原体の核酸において興味の対象である変異の存在または非存在を検出する方法に関し，ここで，興味の対象である変異は，病原体の複数の準種を規定する長さ多型に隣接して位置する。この方法は，
ａ）患者サンプルから興味の対象である変異を包含する二本鎖ＤＮＡテンプレートを取得し；
ｂ）ＤＮＡテンプレートの，興味の対象である変異を含み長さ多型を含まない第１の遺伝領域を増幅し；
ｃ）ＤＮＡテンプレートの，興味の対象である変異を含み長さ多型を含まない領域の第１の鎖を配列決定し；
ｄ）ＤＮＡテンプレートの，興味の対象である変異を含み長さ多型を含まない領域の第２の鎖を配列決定し；そして
ｅ）第１の鎖の配列を第２の鎖の配列と比較して，興味の対象である変異の配列の相補鎖確認を得る，ことを含む。この態様においては，長さ多型が排除されるのは増幅工程においてであり，増幅された領域または増幅された領域の一部を配列決定する次の行程も長さ多型を含まない。
【００５９】
本発明の１つの観点においては，興味の対象である変異は，ＨＩＶのｇｐ４１およびｇｐｌ２０からなる群より選択される領域中に位置する。本発明の別の観点においては，興味の対象である変異は，ＨＩＶ−１エンベロープ糖蛋白質ｇｐ４１中に位置する。本発明のさらに別の観点においては，興味の対象である変異は，ｇｐ４１の３６−４５位に位置する。
【００６０】
上述の態様により例示されるように，本発明の種々の態様の共通の特徴は，配列決定されるＤＮＡの領域中に長さ多型が含まれないようにして，次に，第１の鎖配列と第２の鎖配列とを比較して，異なる核酸長さを有する複数の長さ多型準種の存在の結果として得られる混乱した結果なしに，興味の対象である変異の配列の相補鎖確認を可能とすることにある。当業者には，配列決定工程の前に種々の方法を利用して，長さ多型を含まない配列データを与えることができるＤＮＡテンプレートを用意しうることが理解されるであろう。
【００６１】
ＤＮＡの起源
本発明の１つの観点においては，この方法は，まず，患者サンプルから興味の対象である変異を包含する二本鎖ポリヌクレオチドテンプレートを取得することを含む。二本鎖ポリヌクレオチドテンプレートは，最初はゲノムＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのフラグメントを含むであろう。このテンプレートは，興味の対象である変異のみならず，複数の準種を生ずる長さ多型を含む領域も包含するであろう。
【００６２】
二本鎖ポリヌクレオチドテンプレートは，典型的には，ＤＮＡを含む患者サンプルを，サンプル中のすべてまたは一部のＤＮＡをオリゴヌクレオチドプライマーとのハイブリダイゼーションについてアクセス可能とするように処理することにより，患者サンプルから調製される。例えば，溶解し，遠心分離により細胞破片を除き，蛋白質分解性の分解によりＤＮＡを曝露する。したがって，ＤＮＡテンプレートは，核ＤＮＡのみ，ミトコンドリアＤＮＡのみ，または組織サンプルから単離することにより得られる核またはミトコンドリアＤＮＡのある一部を含んでいてもよい。ＤＮＡテンプレートはまた，変換により，例えば総ｍＲＮＡ調製物またはＲＮＡウイルスのゲノムをｃＤＮＡに逆転写することにより調製したものであってもよく，プレート上で成長した個々の細菌コロニーから，または濃縮した細菌培養物から単離されたＤＮＡであってもよく，実質的にすべてのウイルスゲノムが単離されているウイルスＤＮＡ調製物であってもよい。
【００６３】
ＤＮＡは，液体サンプル，例えば，血液または尿または組織サンプルから，例えば，溶解し，遠心分離して細胞破片を除去し，蛋白質分解性消化によりＤＮＡを曝露させ，塩沈または標準的なＳＤＳ−プロテアーゼＫ−フェノール抽出を行う，などの多数の手法のいずれかにより調製することができる。サンプルはまた，ｔｈｅ Ｐｕｒｅ Ｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ）などのキットを用いて調製してもよい。
【００６４】
核酸の増幅
本発明の好ましい態様は，ＤＮＡを増幅して，続く配列決定のための大量のＤＮＡの供給源を提供する工程を含む。１つの観点においては，本発明の方法は，任意に，ＤＮＡテンプレートの興味の対象である変異および長さ多型の両方を含む第１の領域を増幅することを含んでいてもよい。次に，所定の長さ多型を含む増幅産物を，長さ多型を除くプライマーを用いて配列決定する。
【００６５】
あるいは，別の観点においては，本発明の方法は，興味の対象である変異を含み長さ多型を含まない領域を含むＤＮＡテンプレートの第１の遺伝子領域を選択的に増幅することを含んでいてもよい。所定の長さ多型を含まない増幅産物は，増幅プライマーに対応する同じプライマーを用いて，増幅されたフラグメントの異なる領域に相補的なプライマーを用いて，またはＰＣＲの間に増幅産物中に取り込まれた（ユニバーサルプライマーを含むプライマーを用いて）ユニバーサルプライマーテンプレートに相補的なユニバーサルプライマーを用いて，直接配列決定することができる。
【００６６】
典型的には，配列決定の前に，まず配列決定すべき標的領域を包含するＤＮＡの領域を増幅することにより，配列決定テンプレートを調製する。増幅すべき配列が最初に純粋な形で存在することは必要ではない。これは，複雑な混合物のより少ない部分であってもよく，核酸配列の一部であってもよい。出発核酸は，２以上の所望の特定の核酸配列を含んでいてもよく，これらは同じであっても異なっていてもよい。したがって，本発明の方法は，大量の１つの特定の核酸配列を製造するためのみならず，配列中に２以上の塩基対変種が存在する場合には同じまたは異なる核酸分子中に存在する２以上の異なる特定の核酸配列を同時に増幅するためにも有用である。
【００６７】
１つの観点においては，本発明は，ＨＩＶ−１ ｅｎｖをジェノタイピングする方法において用いられる，増幅および配列決定プライマーに関する。この方法は，ポリメラーゼ連鎖反応（またはＰＣＲ）の手法または他の何らかのプライマー伸長系方法論を用いる，特定の核酸配列を増幅するためのよく知られる方法を利用する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は当該技術分野において非常によく知られている。例えば，米国特許４，６８３，１９５，４，６８３，２０２，および４，８００，１５９；Ｋ．Ｍｕｌｌｉｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５１：２６３−２７３（１９８６）；およびＣ．Ｒ．Ｎｅｗｔｏｎ＆Ａ．Ｇｒａｈａｍ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：ＰＣＲ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：１９９７）（これらの開示を本明細書の一部としてここに引用する）は，サンプル標的にハイブリダイズするＰＣＲ増幅伸長プライマーを用いて核酸サンプル標的を増幅する手順を記載する。ＤＮＡポリメラーゼ（好ましくは熱安定性）を用いてＰＣＲ増幅プライマーが伸長されるにつれて，より多くのサンプル標的が作成され，したがって，より多くのプライマーを用いてこの手順を反復し，このことによりサンプル標的配列を増幅することができる。典型的には，反応条件は，ハイブリダイゼーションおよび核酸重合を助ける条件と，デュープレックス分子の変性をもたらす条件との間でサイクリングさせる。
【００６８】
簡単には，反応の第１の工程においては，二本鎖分子を変性させるために，サンプルの核酸分子を一時的に加熱し，次に冷却する。フォワードプライマーおよびリバースプライマーは，増幅反応混合物中にサンプル標的と比較して過剰濃度で存在する。サンプルをハイブリダイゼーションおよび重合を行う条件下でインキュベートすると，プライマーは，その増幅が望まれる配列の相補体である核酸分子の相補鎖の，増幅することが望まれる領域の配列の３’側の位置にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションが生じた後，プライマーの３’末端がポリメラーゼにより伸長される。プライマーの伸長により，所望の核酸サンプル標的の相補体の正確な配列を有するＤＮＡ分子が合成される。ＰＣＲ反応は，所望の核酸配列を指数関数的に増幅することができ，各サイクルで所望の配列を有する分子の数をほぼ２倍にする。すなわち，ハイブリダイゼーション，重合，および変性のサイクルを進めることにより，所望の核酸分子の濃度の指数関数的増加が達成される。
【００６９】
核酸増幅テンプレートの調製
本発明は，病原体，例えばＨＩＶ−１ ｅｎｖおよびその変種形を増幅し配列決定する方法に関する。本発明の方法は，例えば，ＤＮＡまたはＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡを含む）を用いることができ，このＤＮＡまたはＲＮＡは１本鎖であっても二本鎖であってもよい。さらに，それぞれの１本鎖を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを用いてもよい。これらの核酸のいずれかの混合物も用いることができ，同じまたは異なるプライマーを用いて先の増幅反応から産生された核酸も同じように用いることができる。増幅すべき特定の核酸配列は，より大きな分子の一部のみであってもよく，最初は別々の分子として存在して，特定の配列が核酸全体を構成するようにしてもよい。
【００７０】
増幅すべき配列が最初に純粋な形で存在することは必要ではない。これは複雑な混合物中の少ない割合であってもよく，核酸配列の一部であってもよい。出発核酸は２以上の所望の特定の核酸配列を含んでいてもよく，これらは同じであっても異なっていてもよい。したがって，本発明の方法は，１つの特定の核酸配列を大量に製造するためのみならず，配列中に２以上の塩基対変種が存在する場合には，同じまたは異なる核酸分子上に位置する２以上の異なる特定の核酸配列を同時に増幅するのにも有用である。
【００７１】
核酸テンプレートは，任意の起源から，例えば，ｐＢＲ３２２等のプラスミドから，クローニングされたＤＮＡまたはＲＮＡから，または任意の起源，例えば，患者から得られたＨＩＶ感染血漿または血清の天然のＤＮＡまたはＲＮＡから，得ることができる。ＤＮＡまたはＲＮＡは，血液，組織材料または羊膜細胞から，Ｍａｎｉａｔｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２），２８０−２８１）などに記載されている種々の手法により抽出することができる。
【００７２】
細胞は，核酸を精製することなく直接用いてもよく，この場合，細胞を低張バッファに懸濁し，細胞が溶解して細胞内成分の分散が生ずるまで，一般には約９０℃−１００℃で約１−１５分間加熱する。加熱工程の後，溶解した細胞に増幅試薬を直接加えることができる。この直接細胞検出法は，末梢血液リンパ球および羊膜細胞について用いることができる。
【００７３】
サンプル中に含まれる標的核酸は，最初はＲＮＡの形であろうが，好ましくは逆転写してｃＤＮＡとし，次に，任意の適当な変性法，例えば，当業者に知られる物理学的，化学的または酵素的手段を用いて変性する。鎖分離のための好ましい物理学的手段は，完全に（＞９９％）変性するまで核酸を加熱することを含む。典型的な熱変性は，約８０℃から約１０５℃の温度範囲で数秒間から数分間を含む。変性の代わりに，標的核酸は，一本鎖の形で，例えば，一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスの形でサンプル中に存在してもよい。
【００７４】
次に，変性した核酸鎖を，予め選択されたオリゴヌクレオチドプライマー，および，任意に，増幅された配列を検出する目的で標識されたオリゴヌクレオチド（本明細書において"プローブ"と称する））とともに，プライマーおよびプローブが一本鎖核酸に結合しうる条件下でインキュベートする。当該技術分野において知られるように，プライマーは，デュープレックス配列に沿ったその相対的位置が，伸長産物をそのテンプレート（相補体）から分離したときに，１つのプライマーから合成される伸長産物が他のプライマーの伸長のテンプレートとして働いて，規定された長さの複製物を与えるように選択される。
【００７５】
核酸の配列決定
上述したＤＮＡの増幅により，配列決定のための大量のＤＮＡ起源が生成する。上述のように調製したポリヌクレオチドテンプレートを，ヌクレオチドの配列決定用に当業者に利用可能であり知られている多くの方法のいずれかを用いて配列決定する。
【００７６】
本発明の好ましい観点においては，配列決定に用いられるＤＮＡテンプレートは二本鎖である。二本鎖ＤＮＡは相補鎖の同時配列決定を可能とし，このことにより，各鎖から得られた正確に相補的であるはずの配列を比較することにより，正しい配列決定の結果を確認することができる。
【００７７】
本発明において用いられる増幅方法は，配列決定と組み合わせて同時に用いてもよい。同時増幅および配列決定の方法は，当該技術分野において広く知られており，例えば，カップリングした増幅および配列（ＣＡＳ）（Ｒｕａｎｏ ａｎｄ Ｋｉｄｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８（７）：２８１５−２８１９（１９９１），および米国特許５，４２７，９１１（本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている），およびＣＬＩＰ増幅および配列決定（米国特許６，００７，９８３，およびＪ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ４１（４）；１５８６−１５９３（Ａｐｒｉｌ ２００３）（本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている）が挙げられる。ＣＬＩＰ配列決定は，先に生成されたＰＣＲ増幅フラグメントを同時ＰＣＲ増幅および直接配列決定に供する。ＣＡＳ配列決定においては，サンプルを第１の反応工程で２つのプライマーで処理し，多数のサイクルで増幅して１０，０００から１００，０００倍の増幅を得る。次に，増幅反応の対数期の間にｄｄＮＴＰを加え，さらなるサーマルサイクルで反応を進行させて，連鎖停止された配列決定フラグメントを生成する。ＣＡＳプロセスは，途中で試薬（ｄｄＮＴＰ試薬）を加えることを必要とし，これは誤りまたは夾雑物混入の機会を持ち込み，自動化に用いる装置の複雑性を増加させる。したがって，ＣＡＳ方法論は，好ましくは，先に生成したＰＣＲ増幅フラグメントを同時ＰＣＲ増幅および直接配列決定に供するＣＬＩＰ配列決定と組み合わせる。ＣＬＩＰ（登録商標）方法を用いる同時増幅および配列決定は，例えば，市販のキット，例えばＴＲＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＩＶジェノタイピングキット（Ｂａｙｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ ＬＬＣ）に記述され与えられている試薬および条件を用いて行うことができる。
【００７８】
特定の観点においては，本発明は，細菌またはウイルスなどの感染性病原体，例えば，Ｂ型肝炎ウイルス，Ｃ型肝炎ウイルス，およびヒト免疫不全ウイルス，特にＨＩＶ−１ ｅｎｖ，およびこれらの変種型の配列決定に関する。本発明の方法において用いられる二本鎖ＤＮＡテンプレートは，例えば，ＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡ等のＲＮＡに由来するものであってもよく，１本鎖であっても二本鎖であってもよい。さらに，ＤＮＡテンプレートは，１つの鎖がＤＮＡであり１つの鎖がＲＮＡであるＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの形であってもよい。これらの核酸の任意のものの混合物も用いることができ，または，先に行った同じまたは異なるプライマーを用いる本発明の増幅反応により生成した核酸を利用してもよい。増幅すべき特定の核酸配列は，より大きい分子の一部であってもよく，または特定の配列が全核酸を構成するように別々の分子として最初に存在するものであってもよい。
【００７９】
ＨＩＶ−１ ｇｐ４１のＨＲ１および／またはＨＲ２ドメインの配列決定
本発明は，ＨＩＶ−１ウイルスを含むと疑われるサンプルにおいてＨＩＶ−１貫膜糖蛋白質（ｇｐ４１）をジェノタイピングするための新規な方法および試薬を含む。
【００８０】
本発明は，ｇｐ４１のＨＲ１およびＨＲ２ドメインの全てまたは一部，またはｇｐ４１のＨＲ１ドメインの全てまたは一部を包含するプライマーを提供することにより，上述の問題点を解決する。
【００８１】
本発明の配列決定プライマーは，ＨＩＶ−１に特異的なオリゴヌクレオチドからなり，これを用いてｇｐ４１ＤＮＡの一部を増幅し配列決定することができる。当業者に知られる方法にしたがって，ＨＩＶ−１ウイルスに感染していると疑われる個人から得られたサンプルを用いて，ウイルスＲＮＡをＲＮＡまたはＤＮＡの形で回収する。サンプルから得られたウイルスＨＩＶ−１ ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡとする。次に，ｃＤＮＡテンプレートを，ポリメラーゼ連鎖反応または他の何らかのプライマー伸長系方法を用いて増幅する。次に，得られた増幅されたフラグメントを，ｇｐ４１サブユニットを囲むか，ＨＲ１およびＨＲ２ドメインを囲むか，あるいは，ＨＲ１ドメインを囲むプライマーのセットを用いて，サイクルシークエンシング法またはＣＬＩＰ（商標）双方向シークエンシングを用いて最初に配列決定する。
【００８２】
本発明の１つの特定の観点は，ＨＩＶ−１ウイルスを含むと疑われるサンプル中のＨＩＶ−１ ｅｎｖ遺伝子のｇｐ４１サブユニットを増幅しジェノタイピングする方法である。この方法は，（１）ＨＩＶ−１ ｅｎｖ領域を増幅し，（２）ｇｐ４１のＨＲ１およびＨＲ２ドメインの両方を包含する領域の配列を決定することを含む。
【００８３】
本発明は，一般に，ＨＩＶ−１ウイルスを含むと疑われるサンプル中において，ＨＩＶ−１貫膜糖蛋白質（ｇｐ４１）のＨＲ１ドメインを配列決定およびジェノタイピングするための新規な方法および試薬に関する。ｇｐ４１領域の最初の７回反復ドメイン（ＨＲ１）の周囲の高い複雑性は，ＨＲ１ドメインの近くで挿入または欠失変異が生ずる頻度が比較的高いためであることが見いだされている。ＨＲ１ドメイン中の変異は，例えば，ＨＩＶ−１エンベロープ糖蛋白質ｇｐ４１の３６−３８位で生ずることが知られている。特定の変異としては，Ｇ３６Ｖ／Ｄ／Ｓ，Ｉ３７Ｖ，Ｖ３８Ａ／Ｍ／Ｅ，Ｑ３９Ｒ，Ｑ４０Ｈ，Ｎ４２Ｔ，Ｎ４３Ｈ／Ｅ／Ｄ／Ｓ，Ｌ４４Ｍ，Ｌ４５Ｍが挙げられる。長さ多型を有するＨＩＶ−１ウイルス集団の混合物が血漿中に生じて，一致しないＨＲ１ヌクレオチド配列データおよび矛盾する双方向配列データをもたらすことが見いだされている。この問題は，これまでに認識されておらず，これはおそらく，配列決定の前にＲＴ−ＰＣＲ産物をクローニングすることに依存した方法であったこと，または確認用双方向データなしで１方向データが許容されていたためであろう。本発明は，本質的にＨＩＶ−１ ｅｎｖのＨＲ１ドメインからなり長さ多型の原因であるより可変性の高い領域を除く領域を配列決定するための方法およびプライマーを提供することにより，上述の問題点を解決する。したがって，本発明のプライマーは，ＨＲ１ドメインに到達する前に長さ多型を含む領域を通して配列決定するための配列決定プライマーを用いては正確に特徴決定することができないサンプルについて，配列を確認するのに有用である。
【００８４】
ｇｐ４１のための配列決定プライマー
本発明の配列決定プライマーは，フォワードプライマーおよびリバースプライマーの両方を含み，これらは，検出可能な標識で標識してもよい。最も一般的な配列決定装置用には，蛍光標識が望ましいが，他のタイプの標識，例えば，呈色，発色，蛍光（化学発光を含む）および放射性標識を用いてもよい。プライマーの組み合わせは，逆転写，増幅または配列決定に適当な他の試薬を含んでいてもよく，もちろん，分析用のＨＩＶ−１の遺伝的材料を含んでいてもよい。
【００８５】
１つの観点においては，本発明は，ｇｐ４１のＨＲ１およびＨＲ２ドメインの配列を決定するための方法およびプライマーを含む。特定の態様においては，本発明は，ｇｐ４１のＨＲ１およびＨＲ２ドメインを包含する領域の両方のＤＮＡ鎖（双方向）の配列を決定するための方法およびプライマーを含む。
【００８６】
別の観点においては，本発明はまた，本質的にＨＩＶ−１糖蛋白質ｇｐ４１のＨＲ１ドメインからなる領域を配列決定するための方法およびプライマーを含む。本発明の配列決定プライマーは，本質的にＨＩＶ−１のＨＲ１ドメインからなる領域を配列決定するのに望ましい特異性を有する任意の適当な配列決定プライマーでありうる。当業者に知られる方法にしたがって，ＨＩＶ−１ウイルスに感染していることがわかっているかその疑いのある個人から得たサンプルを用いて，ウイルスＲＮＡをＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの形で回収する。サンプルから得たウイルスＨＩＶ−１ ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡとする。次に，ｃＤＮＡテンプレートを，ポリメラーゼ連鎖反応またはプライマー伸長に基づく他の方法を用いて増幅する。好ましい態様においては，増幅される領域は，ＨＩＶ−１ ｅｎｖ蛋白質をコードする領域を包含するが，より広いかまたは狭い領域もまた，ＨＩＶ ｅｎｖドメインの特定の領域を配列決定するためのテンプレートとして用いるのに適している。次に，本質的にＨＲ１ドメインからなる領域の配列を与えるが，ＨＲ１領域それ自体を配列決定する前にＨＲ１ドメイン近傍の挿入および／または欠失変異により引き起こされた長さ多型の領域については配列決定しないプライマーのセットを用いて，あるいは１方向配列決定の場合には単一のプライマーを用いて，得られた増幅されたフラグメントを配列決定する（例えば，サイクルシークエンシングまたはＣＬＩＰ（登録商標）双方向配列決定により）。したがって，本発明のプライマーは，挿入および／または欠失変異により引き起こされた長さ多型の領域とＨＲ１ドメインそれ自体との間に存在する領域に相補的であり，したがって，プライマーの伸長は，長さ多型から離れる方向に，ＨＲ１ドメインに向かって進行する。特定の態様においては，本発明は，ＨＩＶ−１ウイルスを含むと疑われるサンプルにおいて，ＨＩＶ−１ ｅｎｖ遺伝子のｇｐ４１サブユニットのＨＲ１ドメインを配列決定する方法を提供し，この方法は，本質的にｇｐ４１のＨＲ１ドメインからなるが，長さ多型に伴う変異を含むＨＲ１ドメインに隣接する領域を含まない領域のヌクレオチド配列を決定することを含む。
【００８７】
本発明のプライマーは，ＨＩＶ−１の亜集団が混合された血漿の間の長さ多型の結果として他のプライマーでは解読が困難な配列データが得られるような臨床の状況において，ＨＲ１の配列を決定することを可能とする。これらのプライマーは，ＨＲ１変異を確認するために利用することができるが，また，ＨＲ１のみをカバーする代替の配列決定プライマーセットとして用いてもよい。
【００８８】
本発明のプライマーは，ＤＮＡの１本の鎖の配列を決定するのに用いるための単一のプライマーであってもよい。あるいは，本発明の好ましい態様においては，プライマーは，ｇｐ４１のＨＲ１ドメインを囲む領域の両方のＤＮＡ鎖（双方向配列）の配列を決定するためのプライマーの組み合わせである。したがって，本発明の配列決定プライマーは，フォワードプライマー，リバースプライマー，またはフォワードプライマーとリバースプライマーの両方を含んでいてもよい。臨床目的で患者サンプルからのＨＩＶ−１のジェノタイプの決定に用いる場合には，ＤＮＡのフォワードおよびリバースの両方の鎖の配列を取得し，このことにより，配列決定の結果を確認することが望ましい。しかし，フォワード鎖およびリバース鎖の一方または他方の配列を得るだけの場合にも本発明の配列決定プライマーを用いることができることが理解されるであろう。
【００８９】
本発明のプライマーはＨＲ１中の薬剤耐性関連変異とＨＩＶの亜集団が混合された血漿中に見いだされる長さ多型との間の領域に特異的である。機能的な意味では，そのようなプライマーは，ＨＩＶ亜集団の混合血漿の間に見いだされる長さ多型に関連した挿入または欠失変異を含まない配列決定反応生成物を生成することができるプライマーとして定義することができる。目的は，ＨＲ１領域（特に，ＨＲ１中に位置する薬剤耐性変異）について矛盾のない配列データを得ることであるため，プライマーは最初にＨＲ１領域の配列データを与え（伸長の反対側の方向に存在する長さ多型から離れる方向），次にＨＲ１の他方の側にある長さ多型を含むかもしれない配列を決定する方向に伸長を開始することが企図される。まずＨＲ１領域を通る配列を生成することにより（長さ多型の領域を通る配列を生成する前に），ＨＲ１領域について矛盾のないヌクレオチド配列データが得られる。したがって，ＨＲ１領域の後の長さ多型から生ずる混乱した配列の存在は，ＨＲ１領域それ自体の配列決定の結果に悪影響を与えない。したがって，プライマーは，長さ多型の領域を通って配列決定するであろうが，ただし，そのような配列はＨＲ１の配列が最初に生成された後に生成されることが理解されるであろう。
【００９０】
許容しうる配列決定プライマーの例は下記に開示される。本発明の配列決定プライマーは，好ましくは以下に記載される配列と同じ配列を有するプライマーの中から選択されるが，本発明は，主要なＨＩＶ−１サブタイプに対する特異性を有するが，あまり一般的ではないサブタイプに対しても特異性を有するかもしれない縮重配列を含むことが企図される。そのような縮重配列の設計および構築は当業者によく知られている。
【００９１】
一般に，ＤＮＡ配列決定プライマーは，１５またはそれ以上のヌクレオチド塩基，好ましくは１８−３０ヌクレオチド塩基からなる。配列決定プライマーはまた，上述のプライマーの１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，または２５ヌクレオチドを有するフラグメントを含んでいてもよい。プライマーは，特にテンプレートがＧＣリッチである場合には，二次的プライミングのアルチファクトやノイズ配列につながりうるため，５２℃−６５℃の範囲の溶融温度（Ｔｍ）を有することが好ましい。さらに，好ましいプライマーは，二量体や著しいヘアピンを形成せず，二次的なプライミング部位をもたない。また，プライマーは，３’末端における結合の特異性が低いであろう（すなわち，ミスプライミングを回避するために，より低い，好ましくは４０−６０％のＧＣ含量を有する）。これらの特性を有するプライマーを設計するコンピュータソフトウエアが利用可能であり，これには例えば，ＬａｓｅｒＧｅｎｅ（ＤＮＡ Ｓｔａｒ），Ｏｌｉｇｏ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．），ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（Ｋｏｄａｋ／ＩＢＩ）およびｔｈｅ ＧＣＧ ｓｕｉｔｅがある。さらに，プライマーは，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｏｂｒａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ／ｐｒｉｍｅｒ３．ｃｇｉから入手可能）を用いて，上述の基準を満たすように設計することができる。さらなる設計基準は当業者に知られておりかつ利用可能である。
【００９２】
配列決定プライマーは，増幅プライマーとは異なり，３’塩基について同じ位置を有しない限り一緒に混合することができないため，特定の縮重塩基位置が以下に示されるが，３’および５’位置は改変することができることが理解されるべきである。５’ヌクレオチド位置は，より配列保存性の高い領域を含むかまたは溶融温度および結合のストリンジェンシーを改変するよう変更してもよい。成功率が所望のＨＩＶ−１サブタイプについての配列を得るのに十分であれば，非縮重プライマーセットが好ましい。また，反応条件を調節して動作を最適化することができる。配列決定プライマーの可能な修飾の例は以下に開示される。
【００９３】
特定の態様においては，以下から選択される配列決定プライマーを用いて，ｇｐ４１のＨＲ１およびＨＲ２ドメインの両方を包含する領域を配列決定する。
配列番号２ ５’−ＧＣＡＣＣＸＡＣＳＡＲＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＭＧＡＧＹＧＧ−３’
配列番号３ ５’−ＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＧＧ−３’
配列番号４ ５’−ＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＧＧ−３’
配列番号５ ５’−ＧＣＡＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＧＧ−３’
配列番号６ ５’−ＧＣＡＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＹＧＧ−３’
配列番号７ ５’−ＧＣＡＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＭＧＡＧＹＧＧ−３’
配列番号８ ５’−ＧＣＡＣＣＣＡＣＣＡＧＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＭＧＡＧＹＧＧ−３’
配列番号９ ５’−ＧＣＡＣＣＣＡＣＧＡＧＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＭＧＡＧＹＧＧ−３’
配列番号１０ ５’−ＧＣＡＣＣＮＡＣＧＡＧＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＭＧＡＧＹＧＧ−３’
配列番号１１ ５’−ＡＣＧＡＧＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＭＧＡＧＹＧＧ−３’
配列番号１２ ５’−ＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＧ−３’
配列番号１３ ５’−ＣＧＡＧＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＭＧＡＧＹＧ−３’
配列番号１４ ５’−ＧＣＡＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＧＧ−３’
配列番号１５ ５’−ＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＧＧ−３’
配列番号１６ ５’−ｔａｒｔａｇｇａｇｇｎｔｔｒａｔａｇｇｎｔｔａａｇａａｔａ−３’
配列番号１７ ３’−ｇｔａｇｇａｇｇｃｔｔｇａｔａｇｇｔｔｔａａｇ−５’
配列番号１８ ３’−ｔａｇｔａｇｇａｇｇｃｔｔｇａｔａｇｇｔｔｔａａｇ−５’
配列番号１９ ３’−ｔａｒｔａｇｇａｇｇｃｔｔｇａｔａｇｇｔｔｔａａｇ−５’
配列番号２０ ３’−ｔａｒｔａｇｇａｇｇｎｔｔｇａｔａｇｇｔｔｔａａｇ−５’
配列番号２１ ３’−ｔａｒｔａｇｇａｇｇｎｔｔｒａｔａｇｇｔｔｔａａｇ−５’
配列番号２２ ３’−ｔａｒｔａｇｇａｇｇｎｔｔｒａｔａｇｇｎｔｔａａｇ−５，
配列番号２３ ３’−ｔａｒｔａｇｇａｇｇｎｔｔｒａｔａｇｇｎｔｔａａｇａａｔａ−５’
配列番号２４ ３’−ｇｇａｇｇｎｔｔｒａｔａｇｇｎｔｔａａｇａａｔａ−５’
配列番号２５ ３’−ｇｇｖｇｇｎｔｔｒａｔａｇｇｎｔｔａａｇａａｔａ−５’
配列番号２６ ３’−ｔａｇｇａｇｇｎｔｔｒａｔａｇｇｎｔｔａａｇ−５’
配列番号２７ ３’−ｇｇａｇｇｃｔｔｇｇｔａｇｇｔｔｔａａｇａ−５’
配列番号２８ ３’−ｇｇｖｇｇｎｔｔｒａｔａｇｇｎｔｔａａｇａ−５’
配列番号２９ ３’−ｔａｇｔａｇｇａｇｇｃｔｔｇａｔａｇｇｔｔｔａａｇａａｔａ−５’
配列番号３０ ３’−ｇｔａｇｇａｇｇｃｔｔｇａｔａｇｇｔｔｔａａｇ−５’
【００９４】
配列決定プライマーは，例えば，以下からなる群より選択される少なくとも１つのフォワード配列決定プライマーを含むことができる：
配列番号２ ５’−ＧＣＡＣＣＸＡＣＳＡＲＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＭＧＡＧＹＧＧ−３’
配列番号３ ５’−ＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＧＧ−３’
配列番号４ ５’−ＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＧＧ−３’
配列番号５ ５’−ＧＣＡＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＧＧ−３’
配列番号６ ５’−ＧＣＡＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＹＧＧ−３’
配列番号７ ５’−ＧＣＡＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＭＧＡＧＹＧＧ−３’
配列番号８ ５’−ＧＣＡＣＣＣＡＣＣＡＧＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＭＧＡＧＹＧＧ−３’
配列番号９ ５’−ＧＣＡＣＣＣＡＣＧＡＧＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＭＧＡＧＹＧＧ−３’
配列番号１０ ５’−ＧＣＡＣＣＮＡＣＧＡＧＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＭＧＡＧＹＧＧ−３’
配列番号１１ ５’−ＡＣＧＡＧＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＭＧＡＧＹＧＧ−３’
配列番号１２ ５’−ＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＧ−３’
配列番号１３ ５’−ＣＧＡＧＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＭＧＡＧＹＧ−３’
配列番号１４ ５’−ＧＣＡＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＧＧ−３’
【００９５】
本発明の１つの態様においては，双方向一次配列決定プライマーのセットは，配列番号２，およびその３’末端を含む１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントのヌクレオチド配列を含む第１のプライマーを含む。配列番号２は，フォワードプライマーとして用いることができる縮重プライマーのセットを記述し，ここで，Ｘは，５−ニトロインドールまたはＣであり，ＳはＧまたはＣを表し，ＲはＧまたはＡを表し，ＭはＡまたはＣを表し，ＹはＴまたはＣを表す。Ｙ（Ｔ／Ｃ）におけるプライマー縮重は，ＨＩＶのＢおよびＡサブタイプの両方の単離物を検出するために設計されたものである。同様に，Ｍ（Ａ／Ｃ）におけるプライマー縮重は，Ｆ−タイプのＨＩＶ組換え体を検出するために設計されたものである。上述の配列の他の変種を用いて，他のＨＩＶ変種を検出することができる。
【００９６】
別の態様においては，本発明は，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，配列番号１２，および配列番号１３，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択される第１のプライマーを含む，双方向一次配列決定プライマーのセットを含む。
【００９７】
さらに別の態様においては，本発明は，配列番号１４，およびその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントの配列を含む第１のプライマーを含む双方向一次配列決定プライマーのセットを含む。
【００９８】
さらに別の態様においては，本発明は，配列番号３の配列を含む第１のプライマーを含む双方向一次配列決定プライマーのセットを含む。
【００９９】
一次配列決定プライマーはまた，以下からなる群より選択される少なくとも１つのリバース配列決定プライマーを含んでいてもよい：
配列番号１５ ５’−ＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＧＧ−３’
配列番号１６ ５’−ｔａｒｔａｇｇａｇｇｎｔｔｒａｔａｇｇｎｔｔａａｇａａｔａ−３’
配列番号１７ ３’−ｇｔａｇｇａｇｇｃｔｔｇａｔａｇｇｔｔｔａａｇ−５’
配列番号１８ ３’−ｔａｇｔａｇｇａｇｇｃｔｔｇａｔａｇｇｔｔｔａａｇ−５’
配列番号１９ ３’−ｔａｒｔａｇｇａｇｇｃｔｔｇａｔａｇｇｔｔｔａａｇ−５’
配列番号２０ ３’−ｔａｒｔａｇｇａｇｇｎｔｔｇａｔａｇｇｔｔｔａａｇ−５’
配列番号２１ ３’−ｔａｒｔａｇｇａｇｇｎｔｔｒａｔａｇｇｔｔｔａａｇ−５’
配列番号２２ ３’−ｔａｒｔａｇｇａｇｇｎｔｔｒａｔａｇｇｎｔｔａａｇ−５，
配列番号２３ ３’−ｔａｒｔａｇｇａｇｇｎｔｔｒａｔａｇｇｎｔｔａａｇａａｔａ−５’
配列番号２４ ３’−ｇｇａｇｇｎｔｔｒａｔａｇｇｎｔｔａａｇａａｔａ−５’
配列番号２５ ３’−ｇｇｖｇｇｎｔｔｒａｔａｇｇｎｔｔａａｇａａｔａ−５’
配列番号２６ ３’−ｔａｇｇａｇｇｎｔｔｒａｔａｇｇｎｔｔａａｇ−５’
配列番号２７ ３’−ｇｇａｇｇｃｔｔｇｇｔａｇｇｔｔｔａａｇａ−５’
配列番号２８ ３’−ｇｇｖｇｇｎｔｔｒａｔａｇｇｎｔｔａａｇａ−５’
配列番号２９ ３’−ｔａｇｔａｇｇａｇｇｃｔｔｇａｔａｇｇｔｔｔａａｇａａｔａ−５’
配列番号３０ ３’−ｇｔａｇｇａｇｇｃｔｔｇａｔａｇｇｔｔｔａａｇ−５’
【０１００】
本発明の１つの態様においては，双方向一次配列決定プライマーのセットは，配列番号１６，および３’末端を含むその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントのヌクレオチド配列を含む第２のプライマーを含む。配列番号１６は，フォワードプライマーとして用いることができる縮重プライマーのセットを記述し，ここで，ＲはＧまたはＡを表し，Ｘは５−ニトロインドールまたはＣを表し，Ｚは５−ニトロインドールまたはＴを表し，ＶはＡまたはＧまたはＣであってＴではないことを表す。上述の配列の他の変種を利用すれば，他のＨＩＶ変種を検出することができる。
【０１０１】
別の態様においては，本発明は，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，および配列番号２８からなる群より選択される第２のプライマーを含む双方向一次配列決定プライマーのセットを含む。
【０１０２】
さらに別の態様においては，本発明は，配列番号２９，およびその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントの配列を含む第２のプライマーを含む双方向一次配列決定プライマーのセットを含む。
【０１０３】
さらに別の態様においては，本発明は，配列番号３０の配列を含む第２のプライマーを含む双方向一次配列決定プライマーのセットを含む。
【０１０４】
本発明のさらに別の観点においては，ＨＩＶ−１のＨＲ１ドメインを配列決定するための用いられるプライマーは，配列番号３１，配列番号３２，配列番号３３，配列番号３４，配列番号３５，および配列番号３６（以下に記載）またはそれらの少なくとも１５またはそれ以上のヌクレオチドののフラグメントの１またはそれ以上からなる群より選択される配列を有するであろう。
配列番号３１ ５’−ＴＴＧＧＧＴＴＣＴＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＡＧ−３’
配列番号３２ ５’−ＴＴＧＧＧＴＴＣＴＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧ−３’
配列番号３３ ５’−ＡＧＴＲＧＴＧＣＡＲＡＴＧＡＫＴＴＴＴＣＣＡＧＡＧ−３’
配列番号３４ ５’−ＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＧＴＴＴＴＣＣＡＧＡＧ−３’
配列番号３５ ５’−ＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＧＴＴＴＴＣＣＡＧＡＧＣ−３’
【０１０５】
配列番号３１，配列番号３２，配列番号３３は，ＨＲ１の５’側の領域中の代替フォワードプライマー配列を表す。配列番号３１のプライマー配列は，配列番号１のヌクレオチド７３２９−７３５３の配列に対応する。配列番号３２のプライマー配列は，配列番号１のヌクレオチド７３２９−７３５０の配列に対応する。配列番号３３のプライマー配列は，配列番号１のヌクレオチド７３３７−７３６１の配列に対応する。
【０１０６】
配列番号３４，配列番号３５，配列番号３６は，ＨＲ１の３’側（ＨＲ１ドメインとＨＲ２ドメインの間）の領域中の代替リバースプライマー配列を表す。配列番号３４のプライマー配列は，配列番号１のヌクレオチド７５６３−７５８７（ｃｔｃｔｇｇａａａａｍｔｃａｔｙｔｇｃａｃｙａｃｔ）のリバース相補体に対応する。配列番号３５のプライマー配列は，配列番号１のヌクレオチド７５６４−７５８７（ｃｔｃｔｇｇａａａａｃｔｃａｔｃｔｇｃａｃｃａｃ）のリバース相補体に対応する。配列番号３６のプライマー配列は，配列番号１のヌクレオチド７５６３−７５８８（ｃｔｃｔｇｇａａａａｃｔｃａｔｃｔｇｃａｃｃａｃｇ）のリバース相補体に対応する。
【０１０７】
本発明の１つの態様においては，プライマーは，配列番号１およびその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントのヌクレオチド配列を含む。
【０１０８】
本発明の別の態様においては，プライマーは，配列番号３１およびその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントのヌクレオチド配列を含む。
【０１０９】
本発明の別の態様においては，プライマーは，配列番号３２およびその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントのヌクレオチド配列を含む。
【０１１０】
本発明の別の態様においては，プライマーは，配列番号３３およびその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントのヌクレオチド配列を含む。
【０１１１】
本発明の別の態様においては，プライマーは，配列番号３４およびその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントのヌクレオチド配列を含む。
【０１１２】
本発明の別の態様においては，プライマーは，配列番号３５およびその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントのヌクレオチド配列を含む。
【０１１３】
本発明の別の態様においては，プライマーは，双方向配列決定プライマーのセットを含み，ここで，フォワードプライマーは，配列番号１，配列番号３１，および配列番号３２，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択され，リバースプライマーは，配列番号３３，配列番号３４，および配列番号３５，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択される。
【０１１４】
配列番号１，配列番号３１，および配列番号３２で示されるフォワードプライマー部位は，３’末端は好ましくは−Ｇヌクレオチド塩基であり，より好ましくは−ＧＧである。このことにより，プライマーの３’末端で特に強いハイブリダイゼーションが得られ，おそらくは，異なる位置で終わるプライマーに対してより改良された配列決定結果が得られる。プライマーの３’末端はさらに３’方向に伸長することができる。プライマーのすぐ後の配列は一般に質が低いため，フォワードプライマーの３’末端は，好ましくは，ＨＲ１配列の始まりが明確であるよう，ＨＲ１領域から十分な距離に位置する。フォワードプライマーの３’末端は，好ましくは配列番号１の３’末端の−ＡＡＧよりさらに延長されないが，ＨＲ１領域のための適当な配列を得ることができれば，この点を超えて伸長するプライマーも企図される。
【０１１５】
このプライマーの５’末端はわずかに短くしてもよいが，これはプライマーのアニーリング特性も変化させるであろう。特に，５’末端−ＧＧは短くして−Ｇとしてもよい。より短いタイプのもの（ＴＧＧ−，ＧＧ−，Ｇ−）を３’末端の伸長と組み合わせて，アニーリング（または融点，Ｔｍ）温度を他の可能なリバースプライマーとマッチさせるようにさらに最適化することができる。
【０１１６】
フォワードプライマーは，用いられる配列決定化学に対する適当な修飾とともに，上述した位置を越えてさらに修飾してもよい。例えば，ネステッドＰＣＲプライマーにユニバーサル配列決定プライマーテールを用いて，ユニバーサル配列決定プライマーを重要な領域に近づけすぎることなく，プライマーをやや内側に移動させることができる。このためには，ＷＰプライマーがＰＣＲプライマーとしてユニバーサル配列決定テールを含むことが必要である。
【０１１７】
配列番号３３，配列番号３４，および配列番号３５を例とするリバースプライマーはまた，本発明にしたがって修飾することができる。好ましい態様においては，リバースプライマーの５’末端は，ヌクレオチド７５６４（Ｇ）または７５６３（Ａ）であることができる。好ましい態様においては，リバースプライマーの３’末端はヌクレオチド７５８５（Ｇ），７５８６（Ａ），７５８７（Ｇ）または７５８８（Ｃ）であることができる。プライマーは，好ましくはＨＲ１領域からそれ以上離れていないものであり，さもなくば，配列があまり保存されていないＨｌＶ配列位置に配置されて，あまり強固でない配列決定プライマーセットを与える。プライマーは好ましくはＨＲ１領域にそれ以上近くないものであり，さもなくばプライマーのすぐ後の十分な初期配列を与えることができず，ＨＲ１位置に到達する前に配列データを解析することができない。
【０１１８】
上述のプライマーの組み合わせは，本発明にしたがう方法において，ＨＩＶ−１ウイルスを含むと疑われるサンプルについて，ウイルスのサブタイプおよびジェノタイプを評価するために用いることができる。
【０１１９】
この方法は，サンプルを処理してウイルスＲＮＡを回収し；回収したウイルスＲＮＡを逆転写し；逆転写産物を配列決定し；そして，配列決定工程の結果を用いて試験したウイルスのジェノタイプを確立する，の各工程を含む。この方法においては，逆転写工程および配列決定工程のいずれかまたは両方を，上述のプライマーの組み合わせを用いて実施することができる。本発明の方法は，ＨＩＶのｇｐ４１領域における多型変種を評価するために，そして特にｇｐ４１のＨＲ１ドメインにおける多型変種を評価するために設計されたパラレルジェノタイピング法を実施する工程を含むことができる。あるいは，この方法は，先にｇｐ４１に特異的なジェノタイピング手順を用いてジェノタイピングを試みたが失敗したサンプルを用いて行うことができる。
【０１２０】
キット
本発明はまた，上述の方法を実施するのに必要でありかつ十分な試薬を含むキットを含む。１つの観点においては，本発明は，混合された長さ多型を有する病原体の複数の準種を含むサンプル中において病原体における興味の対象である変異の存在または非存在を検出するためのキットに関し，ここで，興味の対象である変異は，長さ多型に隣接して位置する。このキットは，興味の対象である変異を含むＤＮＡテンプレートの領域の第１の鎖を配列決定するための第１のプライマー，および興味の対象である変異を含むＤＮＡテンプレートの領域の第２の鎖を配列決定するための第２のプライマーを含み，ここで，第１のプライマーおよび第２のプライマーにより規定される（すなわち，これらを含みこれらの間の）領域には長さ多型が含まれない。
【０１２１】
別の観点においては，本発明は，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９，配列番号３０，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択される１またはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを含むキットに関する。
【０１２２】
さらに別の観点においては，本発明は，
（ａ）配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントの１またはそれ以上からなる群より選択されるフォワードプライマー；および
（ｂ）配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９，配列番号３０，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントの１またはそれ以上からなる群より選択されるリバースプライマー，
を含むキットに関する。
【０１２３】
さらに別の態様においては，本発明は，本質的に配列番号１のヌクレオチド７３２９−７６１４またはその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる領域に対応するプライマー伸長産物を生成することができるオリゴヌクレオチドプライマーを含むキットに関する。
【０１２４】
さらに別の態様においては，本発明は，オリゴヌクレオチドプライマーを含むキットに関し，ここで，プライマーは，本質的に配列番号１のヌクレオチド７３８８−７５４９またはその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる領域に対応するプライマー伸長産物を生成することができる。
【０１２５】
さらに別の態様においては，本発明は，オリゴヌクレオチドプライマーを含むキットに関し，ここで，プライマーは，本質的に配列番号１のヌクレオチド７４９２−７５２２またはその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる領域に対応するプライマー伸長産物を生成することができる。
【０１２６】
さらに別の態様においては，本発明は，オリゴヌクレオチドプライマーを含むキットに関し，ここで，プライマーは，配列番号３１，配列番号３２，配列番号３３，配列番号３４，配列番号３５，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択される。
【０１２７】
さらに別の態様においては，本発明は，本質的に配列番号１のヌクレオチド７３２９−７６１４またはその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる領域を囲む双方向配列決定プライマーのセットを含むプライマーの組み合わせを含むキットに関する。
【０１２８】
さらに別の態様においては，本発明は，プライマーの組み合わせを含むキットに関し，ここで，双方向配列決定プライマーのセットは，本質的に配列番号１のヌクレオチド７３８８−７５４９またはその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる領域を囲む。
【０１２９】
さらに別の態様においては，本発明は，プライマーの組み合わせを含むキットに関し，ここで，双方向配列決定プライマーのセットは，本質的に配列番号１のヌクレオチド７４９２−７５２２またはその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる領域を囲む。
【０１３０】
さらに別の態様においては，本発明は，プライマーの組み合わせを含むキットに関し，ここで，双方向一次配列決定プライマーのセットは，配列番号３１，配列番号３２，配列番号３３，配列番号３４，配列番号３５，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択される２またはそれ以上のプライマーを含む。
【０１３１】
さらに別の態様においては，本発明は，プライマーの組み合わせを含むキットに関し，ここで，双方向配列決定プライマーのセットは，
（ａ）配列番号３１および配列番号３２，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つのフォワードプライマー，および
（ｂ）配列番号３３，配列番号３４，配列番号３５，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つのリバースプライマー
を含む。
【０１３２】
以下の実施例は，本発明の特定の態様を例示する。
【実施例】
【０１３３】
実施例１
以下の実施例は，ｇｐ４１のＨＲ１領域中の一次配列決定プライマーセット（ＥＣ７７１９Ｆ，ＥＣ８３１ＩＲ）および二次配列決定プライマーセット（ＷＰ８７４６Ｆ，ＷＰ８９６０ＲＢおよび／またはＷＰ８７４６ＲＣ）を用いた，長さ多型を含む混合集団を示す臨床血漿サンプルからの双方向（二重鎖）配列決定を示す。フォワード鎖一次配列決定プライマーのみを用いて得られた，長さ多型を有するかまたは有しないほぼ等量の混合物の複雑な配列痕跡は，決定的な結果を示さなかった。得られた重ね合わせピークは，日常的な分析によっては解析ができない。下記に示されるように，二次プライマーセットを使用することにより，ただちに使用可能な双方向結果が得られた。
【０１３４】
ＲＴ−ＰＣＲおよびＣＬＩＰ配列決定条件を組み合わせた代表的なセットを用いて，以下のプライマーを用いて，質の高い配列データが得られた：
ＥＭＦ１（５’−ＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧＧＣ−３’），および
ＥＭＲ１（５’−ＣＣＴＴＧＴＡＡＧＴＣＡＴＴＧＧＴＣＴＴＡＡＡＧＧＴＡＣＣ−３’）（ＲＴ−ＰＣＲプライマー）；
ＥＣ７７１９Ｆ（５’−ＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＧＧ−３’），および
ＥＣ８３１１Ｒ（３’−ｇｔａｇｇａｇｇｃｔｔｇａｔａｇｇｔｔｔａａｇ−５’）（ＣＬＩＰプライマー）；および
ＷＰ８７４６Ｆ（５’−ＴＴＧＧＧＴＴＣＴＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧ−３’），
ＷＰ８９６０ＲＢ（５’−ＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＧＴＴＴＴＣＣＡＧＡＧ−３’）および／または
ＷＰ８７４６ＲＣ（５’−ＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＧＴＴＴＴＣＣＡＧＡＧＣ−３’）（ＣＬＩＰプライマー）
【０１３５】
以下の材料を用いた：
ＲＴ−ＰＣＲ試薬：ＴＲＵＧＥＮＥ ＨＩＶキット
ＣＬＩＰ試薬：ＶＧ３０００１コア配列決定キット
ＲＴ−ＰＣＲプライマー：
ＥＭＦｌ（未標識）３０μＭ
ＥＭＲｌ（未標識）３０μＭ
ＣＬＩＰプライマー：
ＥＣ７７１９Ｆ（Ｃｙ５．５）３μＭ
ＥＣ８３１１Ｒ（Ｃｙ５．０）３μＭ
ＥＣ８３１ＩＲ（未標識）３μＭ
【０１３６】
ウイルスＲＮＡ用ＴＲＵＰＲＥＰ抽出キットの包装中の指針にしたがって，患者血漿サンプルからＲＮＡを抽出した。
【０１３７】
ｇｐ４１領域のＲＴ−ＰＣＲ増幅のためには，以下の試薬を用いた：
【表１】
【０１３８】
マスターミックスＩおよびＩＩは使用まで氷上に保持した。１６μＬのマスターミックスＩを各ＰＣＲチューブの底に小分けした。マスターミックスＩを有するＰＣＲプレートに各１０μＬの抽出ＲＮＡサンプルをピペットで入れた。次にチューブをサーモサイクラーに入れた。５０℃サイクル１回の５分後，サーモサイクラーを休止し，１４μＬのマスターミックスＩＩを各ウエルに加えた。次に，以下のプロトコルにしたがって，サーモサイクラープログラムを再開する：
１ｘ ９０℃，２分間，
５０℃，２０分間
注：上述の５０℃の工程後に５分間の休止をおいて，マスターミックスＩＩを加える。
９４℃で２分間，
３７ｘ ９４℃で３０秒間，
６０℃で３０秒間，
６８℃で２分間），
１ｘ ６８℃で７分間
４０℃で次の作業まで保持する。
【０１３９】
次に，得られたＰＣＲ増幅産物を以下のようにしてＣＬＩＰ配列決定法を用いて配列決定した。まず，７．００μＬのＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ酵素を６３μＬの酵素希釈バッファで１０倍に希釈して，総容量を７０．００μＬとした。次に，１１．５０μＬの標識ＥＣ８３１１Ｒ（３μＬ）リバースプライマーを１１．５０μＬの未標識ＥＣ８３１１Ｒ（３μＬ）リバースプライマーで５０％に希釈して，総容量を２３．００μＬとした。次に，以下のようにしてｇｐ４１ＣＬＩＰマスターミックスを調製した。
【０１４０】
【表２】
【０１４１】
１７μＬのＣＬＩＰマスターミックスを配列決定すべき増幅産物各５μＬに加えた。次に３μＬのターミネーションミックスＡ，Ｃ，Ｇ，Ｔを各配列決定チューブにピペットで加えた。
【０１４２】
５μＬのマスターミックス／増幅産物をターミネーションミックスを含む各配列決定チューブにピペットで加えた。次に，以下のＣＬＩＰ配列決定熱サイクルプログラムを用いてミックスを配列決定した：
１ｘ ９４℃，５分間，
（３０）ｘ ９４℃，２０秒間，
６０℃，２０秒間，
７０℃，１．５分間，
１ｘ ７０℃，５分間，
４℃で保持。
【０１４３】
配列決定が完了したら，６μＬのストップローディング染料を各チューブに加えた。サンプルを９４℃で２分間加熱し，氷上で急冷し，穏やかにボルテックスすることによりよく混合した。２μＬをＭｉｃｒｏｃｅｌ（登録商標）カセットの各ウエルに負荷した。次に，製造元により供給されたＬＲ Ｔｏｗｅｒ設定および負荷のＴＲＵＧＥＮＥプロトコルにしたがって，Ｍｉｃｒｏｃｅｌ５００および６％のＳｕｒｅｆｉｌｌを用いて，２０００Ｖ，５０％レーザー出力，実行時間７０分間で自動ＤＮＡ配列決定を行った。
【０１４４】
以下の表１および表２は，合わせたＨＲ１およびＨＲ２領域（表１）の配列決定およびＨＲ１領域のみ（表２）の配列決定の結果の分析を示す。表１に示されるように，"不明瞭マッチ"のカラムは，ＦＡＳＴＡファイルのそれぞれにおける位置において不明瞭なベースコールを有する少なくとも１つの塩基またはコードと一致する。
【０１４５】
【表３】
【０１４６】
上述のデータは，ＨＩＶ−１のＨＲ１およびＨＲ２領域を囲むプライマーが，広範囲のＨＩＶ変種について配列データを取得することができることを示す。
【０１４７】
表２は，プライマーがＨＲ１領域のみを囲む本発明の好ましい観点においては，ＨＲ１領域中の不明瞭なマッチが少ないために，編集工程が少なくなり，全体的な整合性が高くなることを示す。
【０１４８】
【表４】
【０１４９】
特定の患者サンプルに関しては，ＥＣプライマーセットおよびＷＰプライマーセットの両方を用いてサンプル２８９４２からの配列トレースを生成した。ＥＣプライマーセットのみを用いて生成した配列データから，読み取り可能でありかつ確認できる配列データが得られた。これは，一方の方向からでは読み取ることができず，その結果，確認することができない不明確な結果が得られた。しかし，サンプル２８９４２をＷＰプライマーセットで分析したところ，不明確なデータはアンチセンス鎖配列を用いて確認することができた。
【０１５０】
上述のデータは，本質的にＨＲ１ドメインからなる領域を本発明のプライマーを用いて配列決定することにより，有意に少ない不明瞭性およびミスマッチ，および改良された正確性および一致度をもつ配列決定結果が得られたことを示す。例えば，エンフビルチド（ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ）（ＦＵＺＥＯＮ（商標）またはＴ−２０）治療に伴う耐性変異（ＨＲ１）について特に興味深い領域において生成したＨＩＶ−１ ｇｐ４１配列決定データの以下の例は，標準的設計のプライマー（ＥＣ）および新規プライマー（ＷＰ）を用いたデータを含む。一般に，外側プライマーの１つと興味の対象である変異との間で生ずる任意の混合された長さの多型変異は，重複および読み枠外配列が生成するために，配列の質の低下を引き起こす。本発明のプライマーは，この問題点を回避し，興味の対象である領域中で質の高い双方向配列データを与え，ＨＲ１中で生ずる任意の変異のアンチセンス鎖の確認を可能とする。
【技術分野】
【０００１】
本出願は，米国特許仮出願６０／６０３，１９５（２００４年８月２０日出願）および米国特許仮出願６０／６０３，３３７（２００４年８月２０日出願）に基づく優先権を主張する。
【０００２】
本発明は一般に，病原体における興味の対象である変異の存在または非存在を検出するための方法および物質に関する。本発明はまた，１人の患者からのサンプル中に存在する複数のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）準種の間の変異の存在または非存在を検出するための特定の方法およびプライマーに関する。
【背景技術】
【０００３】
病原体の核酸配列はしばしば高い確率で変異し，多様な多型変種を生ずる。例えば，レトロウイルスのレンチウイルス群のメンバーであり，後天性免疫不全症候群（Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＡＩＤＳ），あるいはＡＩＤＳ関連複合体（ＡＲＣ）の主要な病原因子であるヒト免疫不全ウイルスは，典型的には高頻度の変異を生ずる。ＨＩＶ−１のＲＮＡゲノムは，ＨＩＶ−１の複製に必要な蛋白質をコードする種々の遺伝子を含む。これは，他のすべてのレトロウイルスと同様にＲＮＡゲノムを有しており，これはウイルスリバーストランスクリプターゼ（ＲＴ）酵素により複製される。ＲＴ酵素は，一本鎖ウイルスＲＮＡゲノムをコピーして二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドとし，その結果ＤＮＡプロウイルスが宿主細胞ゲノム中に組み込まれる。ＲＴ酵素は，通常はポリメラーゼ酵素の"プルーフリーディング"機能を助けてエラーを修復する３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失している。したがって，ＲＴ酵素は１０，０００塩基がコピーされる転写ごとに少なくとも１つの誤りを生じ，その結果，ＨＩＶ−１の高い変異率の原因である誤りが生ずる。
【０００４】
ＨＩＶ−１のＲＮＡゲノムはまた，２つの主要なサブユニット，すなわち，ｇｐｌ２０表面糖蛋白質およびｇｐ４１貫膜糖蛋白質からなるエンベロープ糖蛋白質（ｅｎｖ）をコードする遺伝子を含む。ｇｐ４１サブユニットは，ＨＩＶ−１ウイルスがＣＤ４細胞の細胞外膜に融合することを容易にする貫膜蛋白質をコードする。ＨＩＶ−１ ｅｎｖ蛋白質は，ＣＤ４細胞への初期感染に重要な役割を果たすため，ＨＩＶ−１の細胞への融合を担う蛋白質の相互作用を阻害し，このことによりＨＩＶの感染を阻害することができる薬剤の探索における第１の標的であった。ＨＩＶ−１ ｅｎｖ蛋白質のｇｐ４１サブユニットの１つの特定の標的は，７回反復１（ＨＲ１）および７回反復２（ＨＲ２）ドメインであり，これらはウイルスと細胞膜との融合に必要なコンフォメーション変化を容易にするうえで鍵となる役割を果たすことが見いだされている。多くの抗レトロウイルス薬剤は，ＨＩＶ−１の細胞への侵入を阻害するために，ＨＩＶ−１ ｅｎｖ蛋白質を標的とするため，ＨＩＶ−１の薬剤耐性の原因となる多くの変異はこの領域中で生ずる。
【０００５】
ＨＩＶを治療するために現在利用可能な種々の薬剤は，３つの異なる種類に分類される：ヌクレオシドリバーストランスクリプターゼ阻害剤（ＮＲＴＩ），非ヌクレオシドリバーストランスクリプターゼ阻害剤（ＮＮＲＴＩ），およびプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）。ＡＩＤＳを治療するために用いられている現在利用可能な抗レトロウイルス化合物はいくつかの欠点を有しており，これには，一過性のＣＤ４細胞数効果，ウイルス複製の不完全な阻害，処方される投与量における毒性，および耐性型のウイルスの出現が含まれる。組み合わせ療法が登場しているが，多くの患者は，抗レトロウイルス化合物を用いても，完全なウイルス抑制を達成できないか維持できないままである。不完全なウイルス抑制の結果として，ＨＩＶウイルスの非常に高い突然変異率（ウイルスＲＴ酵素が誤りを起こしやすい性質のため）およびウイルスの遺伝的可変性と相まって，薬剤に対する感受性が低下した多くのＨｌＶ変種が生ずる。例えば，ＨＩＶと宿主細胞との融合を阻害する新しい種類の抗ＨＩＶ剤の最初のものであるエンフビルチド（Ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ；Ｅｎｆ，以前はＴ−２０と称されていた）を使用すると，ｇｐ４１（ＨＲ１）の第１の７回反復ドメイン中に耐性変異が出現し，これがＴ−２０治療の失敗につながっている。
【０００６】
治療的介入の前に，特定の抗レトロウイルス剤に対するＨＩＶ−１薬剤耐性に関連した変異を同定することによって，ウイルスが最も高い感受性をもつ薬剤を選択して投与することにより，治療的介入の特定の経過を最適化することができる。変異は，種々の手法によって検出することができる。その最も直接的かつ信頼性のある手法は，ウイルスＤＮＡの配列決定（ジェノタイピング）である。ジェノタイピングの結果に基づいて治療的介入に関連した重要かつ救命的な決定がなされる臨床的ジェノタイピングの場合には，ＤＮＡの相補鎖の配列を比較することにより配列決定結果を確認することがさらに重要である。しかし，単一の患者サンプル中に複数の種の病原性ベクターが存在する場合には，ジェノタイピングの有効性を高め，配列結果の双方向確認を得ることが困難である。混合された種の病原性ベクターを含む患者サンプルは複数の変種のＤＮＡ配列を含むため，配列決定は，特定の位置に複数の塩基を示し，挿入または欠失変異の場合には，読み枠のシフトのためＤＮＡの領域全体にわたって各位置で複数の塩基を示すであろう。したがって，結果が混乱し，配列の相補鎖の確認およびその配列における臨床的に意義ある変異の同定が妨げられるであろう。したがって，患者サンプル中に複数の種の形で存在する病原性ベクターは，臨床的なジェノタイピングの努力をますます困難性なものとし，臨床的に重要な変異，例えば，特定の治療薬剤に対して耐性のウイルスを生じさせる変異を検出するための診断アッセイを構築することをますます困難なものとする。
【０００７】
したがって，臨床の状況における相補鎖確認に適しており，かつ患者のサンプル中に複数の準種の形で存在する病原性ベクター中の，臨床的に重要な変異を検出し同定することができる，より正確かつ信頼性のあるジェノタイピング法を開発することが求められている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本発明は，複数の準種の病原体を含む患者サンプル中に存在するＨＩＶ等の病原体を臨床でジェノタイピングするための改良された方法および材料を提供する。
【０００９】
特定の観点においては，本発明は，混合された長さ多型を有する病原体の複数の準種を含むサンプル中に存在する病原体において，興味の対象である変異の存在または非存在を検出する方法および材料に関し，ここで，興味の対象である変異は，長さ多型に隣接して位置する。
【００１０】
特定の観点においては，本発明は，混合された準種の病原体を含む患者サンプルにおいて興味の対象である変異の存在または非存在を検出する方法および材料に関し，ここで，興味の対象である変異は，異なる核酸配列長さの準種をもたらす挿入変異または欠失変異などの所定の長さ多型に隣接して位置する。特定の観点においては，本発明は，混合された準種を含む患者サンプル中に存在しうる長さ多型を有するＨＩＶ−１ウイルスのジェノタイピングにおける正確性を改良するための方法およびプライマーを提供する。本発明の改良された方法および材料は，感染性疾患，例えばＡＩＤＳの治療的介入および治療を改良することができる。
【００１１】
本発明の方法およびプライマーは，全ＨＩＶ−１ ｅｎｖ遺伝子の増幅および配列決定からは，治療的介入にはその同定が必須である重要な薬剤耐性を伴う変異の存在を同定し確認するのに必要な信頼性のある相補鎖確認データが得られないという最初の発見の結果として開発された。ＨＩＶ−１ ｅｎｖ遺伝子のｇｐ４１領域は，第１の７回反復ドメイン（ＨＲ１）および第２の７回反復ドメイン（ＨＲ２）を含む。第１の７回反復ドメイン（ＨＲ１）のまわりの領域は，高頻度で挿入または欠失変異を受けやすく，その結果ＨＲ１ドメイン中に薬剤耐性変異を有し，さらに長さ多型を有する複数の準種を含む，混合されたＨＩＶ−１集団が生ずる。単一の患者サンプル中に準種の間で混合された長さ多型が存在することにより，より広い領域をカバーするプライマーを用いて相補鎖の確認配列を得ようとする努力が妨げられる。これは，外側プライマーの１つと目的とする変異との間に生ずる混合長さ多型変異のために，プライマー間の領域に異なる長さの配列を有する相補プライマー伸長産物が生じ，このために重複した読み枠外の配列シグナルが生ずるためである。本発明の方法は，長さ多型を含む領域を含まない，興味の対象である変異の領域を配列決定することにより，ジェノタイピングの信頼性を改良する。プライマーセットは，単独で用いてもよく，または可変の領域を含む二次的プライマーセットと組み合わせて用いて，他の配列決定プライマーを用いては容易に特性決定することができないサンプルについてジェノタイプを確認することができる。
【００１２】
本発明の方法は，最初はＨＩＶ−１遺伝子に関連して開発されたが，かかる方法は，複数の準種の間で長さ多型を有するあらゆる病原体に適用可能である。したがって，本発明は，ＨＩＶ−１等の病原体の核酸において，興味の対象である変異の存在または非存在を検出する方法に関し，ここで，興味の対象である変異は，病原体の複数の準種を規定する長さ多型に隣接して位置しており，該方法は，
ａ）患者サンプルから興味の対象である変異を包含する二本鎖ＤＮＡテンプレートを取得し；
ｂ）ＤＮＡテンプレートの，興味の対象である変異を含み長さ多型を含まない領域の第１の鎖を配列決定し；
ｃ）ＤＮＡテンプレートの，興味の対象である変異を含み長さ多型を含まない領域の第２の鎖を配列決定し；そして
ｄ）第１の鎖の配列を第２の鎖の配列と比較して，興味の対象である変異の配列の相補鎖確認を得る，ことを含む。
【００１３】
別の観点においては，本発明は，ＨＩＶ−１等の病原体の核酸において興味の対象である変異の存在または非存在を検出する方法に関し，ここで，興味の対象である変異は，病原体の複数の準種を規定する長さ多型に隣接して位置しており，該方法は，
ａ）患者サンプルから興味の対象である変異を包含する二本鎖ＤＮＡテンプレートを取得し；
ｂ）ＤＮＡテンプレートの，興味の対象である変異および長さ多型の両方を含む第１の領域を増幅し；
ｃ）ＤＮＡテンプレートの，興味の対象である変異を含み長さ多型を含まない領域の第１の鎖を配列決定し；
ｄ）ＤＮＡテンプレートの，興味の対象である変異を含み長さ多型を含まない領域の第２の鎖を配列決定し；そして
ｅ）第１の鎖の配列を第２の鎖の配列と比較して，興味の対象である変異の配列の相補鎖確認を得ることを含む。
【００１４】
さらに別の観点においては，本発明は，ＨＩＶ−１等の病原体の核酸において興味の対象である変異の存在または非存在を検出する方法に関し，ここで，興味の対象である変異は病原体の複数の準種を規定する長さ多型に隣接して位置しており，該方法は，
ａ）患者サンプルから興味の対象である変異を包含する二本鎖ＤＮＡテンプレートを取得し；
ｂ）ＤＮＡテンプレートの，興味の対象である変異を含み長さ多型を含まない第１の遺伝子領域を増幅し；
ｃ）ＤＮＡテンプレートの，興味の対象である変異を含みさ多型を含まない領域の第１の鎖を配列決定し；
ｄ）ＤＮＡテンプレートの，興味の対象である変異を含みさ多型を含まない領域の第２の鎖を配列決定し；そして
ｅ）第１の鎖の配列を第２の鎖の配列と比較して，興味の対象である変異の配列の相補鎖確認を得ることを含む。
【００１５】
本発明の１つの観点においては，興味の対象である変異は，ＨＩＶのｇｐ４１およびｇｐｌ２０からなる群より選択される領域に位置する。本発明の別の観点においては，興味の対象である変異は，ＨＩＶ−１エンベロープ糖蛋白質ｇｐ４１中に存在する。本発明のさらに別の観点においては，興味の対象である変異は，ｇｐ４１の３６−４５位に存在する。
【００１６】
別の観点においては，本発明は，本質的に配列番号１のヌクレオチド７３２９−７６１４，配列番号１の７３８８−７５４９または配列番号１の７４９２−７５２２，それらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる領域に対応するプライマー伸長産物を生成することができるオリゴヌクレオチドプライマーに関する。
【００１７】
別の観点においては，本発明は，配列番号３１，配列番号３２，配列番号３３，配列番号３４，配列番号３５，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択される，フォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせに関する。
【００１８】
１つの観点においては，本発明は，ＨＩＶ−１ ｅｎｖ蛋白質のｇｐ４１サブユニットをジェノタイピングするための方法およびプライマーに関し，該方法は，ＨＩＶ−１ ｅｎｖ蛋白質のｇｐ４１サブユニットのＨＲ１およびＨＲ２ドメインの両方を包含する領域の配列を決定することを含む。
【００１９】
別の観点においては，本発明は，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９，配列番号３０，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントの１またはそれ以上からなる群より選択されるプライマーを含む。
【００２０】
別の観点においては，本発明は，ＨＩＶ−１のＨＲ１およびＨＲ２ドメインを包含する領域を囲む双方向配列決定プライマーのセットを含むプライマーの組み合わせに関し，ここで，プライマーの組み合わせは，
（ａ）配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントの１またはそれ以上からなる群より選択されるフォワードプライマー；および
（ｂ）配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９，配列番号３０，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントの１またはそれ以上からなる群より選択されるリバースプライマー
を含む。
【００２１】
各群から選択された１またはそれ以上のプライマーを逆転写，増幅および配列決定プライマーとして用いることができる。
【００２２】
プライマーは，適当なジェノタイピングキット中に包装することができる。そのようなキットは，プライマーに加えて，ＲＮａｓｅ阻害剤，リバーストランスクリプターゼ，ポリメラーゼ，および／またはＤＮＴＰおよびｄｄＮＴＰ原料等の試薬を含んでいてもよい。好ましい観点においては，本発明は，病原体の核酸において興味の対象である変異の存在または非存在を検出するためのキットに関し，ここで，興味の対象である変異は，病原体の複数の準種を規定する長さ多型に隣接して位置しており，該キットは，ＤＮＡテンプレートの興味の対象である変異を含む領域の第１の鎖を配列決定するための第１のプライマー，およびＤＮＡテンプレートの興味の対象である変異を含む領域の第２の鎖を配列決定するための第２のプライマーを含み，ここで，第１のプライマーおよび第２のプライマーにより規定される領域は長さ多型を含まない。
【００２３】
プライマーは，本発明の方法において適宜用いられる。この方法にしたがって，ＨＩＶ−１ウイルスを含むと疑われるサンプルを処理してウイルスＲＮＡを回収する。回収されたウイルスＲＮＡを逆転写してＤＮＡとし，これを本発明のプライマーを用いて配列決定する。得られた配列情報を用いて，試験したウイルスのジェノタイプを確立する，すなわち，サンプル中のウイルスがいずれのサブタイプ，種または準種に属するかを判定するか，または興味の対象である変異の存在または非存在を判定することができる。本発明の方法は，多数のウイルス種を評価するよう設計されたジェノタイピング法と平行して行うことができる。あるいは，これまでに感染性病原体をジェノタイピングする目的で信頼性のある配列情報を得ようとする試みが失敗している対象物を有するサンプルについて，本発明の方法を実施することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
発明の詳細な説明
本明細書において用いられる用語は当該技術分野において標準的なものであるが，明確性を確実にするために，ある種の用語について以下に定義を記載する。
【００２５】
単位，識別番号，および記号は，ＳＩに許容された形を示す。特に記載しない限り，核酸は左から右に５’から３’方向に記載される。本明細書に記載される数値範囲は，その範囲を規定する数値を含み，規定される範囲内の各整数を含みかつ支持する。アミノ酸は，その一般的に知られる３文字記号で表してもよく，ｔｈｅ ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＭＢ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号で表してもよい。同様に，ヌクレオチドは，その一般的に許容される１文字コードで表すことができる。特に記載しない限り，"ａ"または"ａｎ"との用語は，"・・・の少なくとも１つ"を意味すると解釈すべきである。本明細書において用いられる節の見出しは，整理の目的のためのみであり，記載される主題を制限するものと解釈してはならない。本明細書において引用されるすべての文献または文献の一部，例えば，限定されないが，特許，特許出願，論説，書籍，および論文は，すべての目的のために，明示的に本明細書の一部としてここに引用する。本出願中でアミノ酸または核酸配列の不一致がある場合には，図面にしたがう。
【００２６】
本明細書において用いる場合，"病原体"との用語は，宿主生物の外に由来するかまたは外で最初に生成されるが，宿主生物中に存在する感染因子または外来ベクターを意味し，例えば，ウイルス，細菌，真菌またはプロトゾア生物が含まれる。本発明の方法および試薬は，宿主生物中に複数の準種の形で存在する病原体のジェノタイピングに有利に用いられ，ここで，準種は，準種の間で長さ多型を生じさせる，長さ多型の１またはそれ以上のアレルを有することを特徴とする。
【００２７】
本明細書において用いる場合，"準種（ｑｕａｓｉｓｐｅｃｉｅｓ）"との用語は，代替のまたは追加の遺伝子配列の取り込みまたは欠失の結果として，異なる遺伝子配列を含む自己複製型生物の種を意味し，正しい場合も誤りである場合も含まれる。準種は，例えば，既に存在する他の遺伝子配列の遺伝子のコピーのプロセスの結果として生じうる。準種は，典型的には，生物，例えば，細菌およびウイルスなどの感染性病原体のＲＮＡまたはＤＮＡなどの自己複製型高分子の進化プロセスの状況中で生ずる。本明細書において用いる場合，"準種"との用語は，変種（ｖａｒｉａｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ）および変種が由来する野生型種の両方を含む。
【００２８】
本明細書において用いる場合，"長さ多型"との用語は，遺伝子配列中の，異なる長さの核酸配列を有する準種を生ずる任意の変異を意味する。長さ多型としては，例えば，限定されないが，異なる核酸配列長さを生ずる挿入変異，欠失変異および，置換変異が挙げられる。複数の準種を含むサンプルの自動化配列決定においては，配列決定の軌跡は，２つの異なる配列（すなわち，参照配列および長さ多型を含む配列）からのデータを含むこととなり，所与のヌクレオチド塩基位置において複数のピークが重ね合わされる。本発明の文脈において，"病原体の複数の準種を規定する長さ多型"との語句は，その遺伝子座に関して病原体の複数の準種を生ずる長さ多型が存在する遺伝視座を意味する。長さ多型とは，異なる準種を生ずる病原体の種々のアレルまたは種を表し，その種に関して長さ多型が規定される"野生型"または"参照"種を含む。
【００２９】
本明細書において用いる場合，"隣接する"との用語は，興味の対象である変異の，長さ多型に対する位置について用いられる。興味の対象である変異は，その位置が，標準的な増幅および／または配列決定プライマーが興味の対象である変異と長さ多型との両方を囲むのに十分に近接している場合，長さ多型に"隣接"していると考えられる。興味の対象である変異と長さ多型との間の正確な距離は重要ではないが，外側プライマーの一方と目的とする変異との間に混合長さ多型変異が生ずる場合には，重なり合ったフレーム外の配列が生成するために，配列の質の低下を引き起こす。本発明の方法および物質は，そのような重なり合ったフレーム外配列を生成する任意のまたはすべての長さ多型を含まないようにすることができるプライマーを用いる場合に，有利に利用することができる。
【００３０】
本明細書において用いる場合，"サンプル"との用語は，複数の準種を有する病原体からの核酸被検物質を含むかもしれない，患者または患者の群から得られる生物学的サンプルを表す。患者サンプルには，個人または複数の個人から単離された組織または液体のサンプル，例えば，限定されないが，皮膚，血漿，血清，脊髄液，リンパ液，滑液，尿，涙，血液細胞，臓器，腫瘍，およびインビトロ細胞培養構成物のサンプル（例えば，限定されないが，細胞培養培地における細胞の成長から得られるコンディションド培地，組換え細胞および細胞成分）が含まれる。
【００３１】
本明細書において用いる場合，"増幅"との用語は，反応混合物中で，１またはそれ以上の特定の遺伝子または遺伝子フラグメントの量を他の遺伝子に対して増加させるプロセスを意味する。多くの増幅方法が当業者に利用可能であり知られている。そのような方法は，典型的には，ポリメラーゼ連鎖反応（またはＰＣＲ）の技術または他の何らかのプライマー伸長に基づく方法論を利用する。ＰＣＲ法は，例えば，米国特許４，６８３，１９４，４，６８３，１９５および４，６８３，２０２，および４，８００，１５９（本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている。この方法はまた，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；１９９５）），Ｋ．Ｍｕｌｌｉｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５１：２６３−２７３（１９８６）；およびＣ．Ｒ．Ｎｅｗｔｏｎ＆Ａ．Ｇｒａｈａｍ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：ＰＣＲ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：１９９７）（その内容を本明細書の一部としてここに引用する）などの教科書にも説明されている。ＰＣＲは，デュープレックスＤＮＡ（ここで，コーディング鎖は"センス鎖"と称され，その相補鎖は"アンチセンス鎖"と称される）の各相補鎖に対して１つずつのプライマーの対を使用することを含み，これらは遺伝子中の目的とする領域の両側に位置する部位でハイブリダイズする。次に反復サイクルにおいて鎖伸長重合を行って，目的とする領域のコピー数を指数関数的に増加させる。簡単にまとめると，ＰＣＲ反応の第１の工程においては，二本鎖分子を変性させるために，サンプルの核酸分子を一時的に加熱し，次に冷却する。フォワードおよびリバースプライマーは，増幅反応混合物中に，サンプル標的と比較して過剰の濃度で存在する。サンプルをハイブリダイゼーションおよび重合が生ずる条件下でインキュベーションすると，プライマーは，増幅することが望まれる配列の領域の３’側の位置で，その増幅が望まれる配列の相補体である核酸分子の相補鎖にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後，プライマーの３’末端がポリメラーゼにより伸長される。プライマーの伸長により，所望の核酸サンプル標的の相補体の正確な配列を有するＤＮＡ分子が合成される。ＰＣＲ反応は，所望の核酸配列を指数関数的に増幅することができ，各サイクルで所望の配列を有する分子の数がほぼ２倍になる。すなわち，ハイブリダイゼーション，重合，および変性のサイクルを進めることにより，所望の核酸分子の濃度の指数関数的な増加を達成することができる。増幅されたポリヌクレオチドは，配列決定反応のテンプレートとして用いることができる。Ｇｅｌｆａｎｄらは，この増幅プロセスで有用な，生物Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓに由来する熱安定性酵素，"Ｔａｑポリメラーゼ"を記載する（米国特許４，８８９，８１８；５，３５２，６００；および５，０７９，３５２（本明細書の一部としてここに引用する））。別の増幅手法，例えば，ＮＡＳＢＡ，３ＳＲ，Ｑｂレプリカーゼ，および分枝鎖増幅が当業者に知られており利用可能である。"ＲＴ−ＰＣＲ"との用語は，一般に増幅を表し，例えば，ＲＮＡ配列の増幅を進める逆転写工程を含む。
【００３２】
本明細書において用いる場合，"配列決定"との用語は，遺伝子の少なくとも一部におけるヌクレオチドの順番を決定することを意味する。よく知られる配列決定の方法は"チェーンターミネーション"法であり，これはＳａｎｇｅｒら（ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）７４（１２）：５４６３−５４６７（１９７７））により最初に記載され，Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）２．０の製品説明（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ）に詳細に説明されており，最近では欧州特許ＥＰ−Ｂ１−６５５５０６（この内容をすべて本明細書の一部としてここに引用する）に詳細に述べられている。この方法においては，配列決定すべきＤＮＡを単離し，１本鎖とし，４つの容器に入れる。各容器には，ＤＮＡ鎖の複製に必要な成分が入っており，これは，プライマーと配列決定すべきＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションおよびハイブリダイズしたプライマーの鎖伸長を促すバッファ中に，テンプレート依存的ＤＮＡポリメラーゼ，配列決定すべきＤＮＡの配列決定の開始部位に相補的な短いプライマー分子，および塩基Ａ，Ｃ，ＧおよびＴのそれぞれのデオキシリボヌクレオチド三リン酸を含む。さらに，各容器は，あるタイプのジデオキシヌクレオチド三リン酸，例えば，ジデオキシアデノシン三リン酸（"ｄｄＡ"），ジデオキシグアノシン三リン酸（"ｄｄＧ"），ジデオキシシトシン三リン酸（"ｄｄＣ"），ジデオキシチミジン三リン酸（"ｄｄＴ"）を少量含む。それぞれの容器において，単離されたＤＮＡの一部がそれぞれプライマーとハイブリダイズする。次に，プライマーを，１回に１塩基ずつ伸長して，テンプレートＤＮＡに相補的な新たな核酸ポリマーが形成される。伸長しつつあるポリマー中にジデオキシヌクレオチドが取り込まれると，ポリマーはさらなる伸長が妨げられる。したがって，各容器において，特定の長さの伸長されたポリマーの組が形成され，これはその容器内のジデオキシヌクレオチドに対応するヌクレオチドの位置を示す。次にこれらのポリマーの組をゲル電気泳動を用いて評価して，配列を決定する。
【００３３】
ポリヌクレオチドの配列決定は，一本鎖ＤＮＡを用いて行っても二本鎖ＤＮＡを用いて行ってもよい。プライマー伸長のためにポリメラーゼを使用する場合には，一本鎖ＤＮＡテンプレートが必要である。好ましい態様においては，本発明の方法は，配列決定結果の確証的な反対鎖確認を得るために，二本鎖ＤＮＡを用いる。二本鎖ＤＮＡテンプレートは，アルカリ変性または熱変性を用いて２つの相補ＤＮＡテンプレートを分離して一本鎖として，配列決定することができる。重合の間に，ＤＮＡテンプレートの各分子は，相補的プライマーにより伸長された鎖として１回コピーされる。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば，Ｔａｇ，Ｂｓｔ，ＴｔｈまたはＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ）を使用することにより，配列決定反応において，熱変性，プライマーアニーリング，伸長およびジデオキシターミネーションの交互周期を通して，二本鎖ＤＮＡテンプレートを反復循環させることができる。この循環プロセスは，少量の入力ＤＮＡテンプレートを効率的に増幅して，配列決定のために十分なテンプレートを生成する。
【００３４】
配列決定はまた，ＰＣＲ増幅反応生成物に対して直接行うことができる。増幅されたＤＮＡのクローニングは比較的簡単であるが，ＰＣＲ産物の直接配列決定は，配列情報の取得を容易にし迅速にする。ＰＣＲ反応が別々の増幅産物を生ずるかぎり，これを直接配列決定に適用することができる。ＰＣＲ産物をクローニングして，単一クローンを配列決定する方法と比較して，ＰＣＲ産物の配列を直接分析するアプローチは一般に，ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの比較的高い誤差率に影響されない。誤差は分子の全体にわたって確率的に分布していると考えられる。すなわち，圧倒的多数の増幅産物は，正しい配列から構成されるであろう。ＰＣＲ産物の直接配列決定は，クローニングしたＰＣＲ産物の配列決定と比較して，以下の利点を有する：（１）これは生きた細胞の使用に依存しない簡単な酵素プロセスであるため，容易に標準化することができる；および（２）各サンプルについて一方の配列を決定するだけでよい。
【００３５】
本明細書において用いる場合，"核酸"，"ポリヌクレオチド"，および"オリゴヌクレオチド"との用語は，プライマー，プローブ，検出すべきオリゴマーフラグメント，オリゴマー対照および未標識ブロッキングオリゴマーを表し，ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む），ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む），およびプリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドである他の任意のタイプのポリヌクレオチド，または修飾されたプリンまたはピリミジン塩基の総称である。"核酸"，"ポリヌクレオチド"および"オリゴヌクレオチド"との用語の間では，長さ上の区別を意図するものではなく，これらの用語は，特に明示しないかぎり，同等であり代替可能である。これらの用語は，分子の一次構造のみを表す。すなわち，これらの用語は，二本鎖および一本鎖ＤＮＡ，ならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡを含む。オリゴヌクレオチドは，指定されたヌクレオチド配列の領域に対応した，少なくとも約６ヌクレオチド，好ましくは少なくとも約１０−１２ヌクレオチド，より好ましくは少なくとも約１５−２５ヌクレオチドの配列から構成される。核酸はまた，標準的なヌクレオチド塩基をヌクレオチドアイソフォーム類似体で置き換えてもよく，これには，例えば，限定されないが，標準的な塩基とおおよそ許容範囲内でハイブリダイズすることができ，相補的アイソフォーム類似体塩基と優先的にハイブリダイズするであろうイソＣおよびイソＧ塩基が含まれる。多くのそのようなアイソフォーム塩基が例えば，ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ．に記載されている。本明細書において参照ヌクレオチド配列に対して核酸配列を規定するために用いる場合，"対応する"との用語は，参照配列のすべてまたは一部とマッチするヌクレオチド配列，および参照配列のすべてまたは一部の相補体であるヌクレオチド配列を意味する。
【００３６】
オリゴヌクレオチドは，任意の現存する配列または天然の配列から必ずしも物理学的に分離されていなくてもよいが，化学合成，ＤＮＡ複製，逆転写またはこれらの組み合わせなどの任意の方法により生成することができる。"オリゴヌクレオチド"または"核酸"との用語は，その起源または操作の理由により，以下のゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ，ｃＤＮＡ，半合成の，または合成の起源のポリヌクレオチドを意図する：（１）それが天然に関連しているポリヌクレオチドのすべてまたは一部と関連しておらず；および／または（２）それが天然に連結しているポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチドに連結しており；および（３）天然に見いだされない。
【００３７】
モノヌクレオチドを，１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸がその隣の３’酸素にホスホジエステル結合により１つの方向で結合するように反応させてオリゴヌクレオチドを作成するため，オリゴヌクレオチドの末端は，その５’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に結合していない場合には"５’末端"と称され，その３’酸素が次のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸に結合していない場合には，"３’末端"と称される。本明細書において用いる場合，核酸配列は，より長いオリゴヌクレオチドの内部にある場合であっても，５’および３’末端を有する場合がある。
【００３８】
２つの異なる重複しないオリゴヌクレオチドが同じ直鎖状の相補的核酸配列の異なる領域にアニーリングし，一方のオリゴヌクレオチドの３’末端が他方の５’末端の方向を向く場合，前者を"上流の"オリゴヌクレオチドと称し，後者を"下流の"オリゴヌクレオチドと称する。
【００３９】
本明細書において用いる場合"ＨＲ１"との用語は，ＨＩＶ−１ ｅｎｖ蛋白質のｇｐ４１サブユニットの７回反復１（ＨＲ１）領域を表し，配列番号１のヌクレオチド７３８８−７５４９で表される。
【００４０】
本明細書において用いる場合，特定のヌクレオチド配列に関して，"本質的に〜からなる"との用語は，特定の配列，および所定の長さ多型を含まない任意の追加の配列を意味する。例えば，本質的にＨＩＶ−１ ｅｎｖ ｇｐ４１領域のＨＲ１ドメインからなる領域は，ＨＲ１（配列番号１のヌクレオチド７３８８−７５４９）のすべてまたは一部，および隣接する５’および３’領域の任意の追加のヌクレオチド配列を含み，予想患者集団の間で十分に高い頻度で生じて配列決定結果の信頼性に不利に影響するかもしれない，ＨＲ１ドメインの外側に位置する長さ多型を含まない。そのような長さ多型は，例えば，おおよそｇｐ４１ドメインの最初の２５ヌクレオチドまたは最後の６０ヌクレオチド中に存在しうる。本明細書において用いる場合，本質的にＨＲ１ドメインからなる領域は，好ましくは，配列番号１のヌクレオチド７３２９−７６１４の領域，またはその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントに対応する。より好ましくは，本質的にＨＲ１ドメインからなる領域は，配列番号１のヌクレオチド７３８８−７５４９の領域またはその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントに対応する。本質的にＨＲ１ドメインからなる領域はまた，配列番号１のヌクレオチド７４９２−７５２２の領域またはその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントに対応してもよい。"本質的に・・・からなる"との用語は，所定の長さ多型を含まない特定の配列を規定するために用いられるため，本発明は，知られているかまたは知られていない他の長さ多型を含有する配列を含んでいてもよいことが理解されるであろう。本発明の有用性は，主として，長さ多型が病原性ベクターの新たな準種を引き起こし，準種が患者集団中に臨床的失敗率が許容できないほど十分に高い頻度で生ずる状況において生ずる。すなわち，本発明は，配列決定された興味の対象である変異を含む領域が，"所定の長さ多型を含まない"がなお他の長さ多型，例えば，未知であるか，または患者集団の中で臨床的な失敗の確率が許容できないほど高いと判定されないような頻度で生じない長さ多型を含んでいてもよいことを企図する。本発明の目的のためには，所定の長さ多型により規定されるベクターの準種からの配列の相補鎖確認を可能とするため，配列決定される領域からただ１つの所定の長さ多型が除かれていてもよい。
【００４１】
本明細書において，参照位置に対するプライマーの位置に関して用いる場合，"包含する"または"囲む"との用語は，ＰＣＲ伸長プライマーが特定のヌクレオチドまたはヌクレオチドの領域を含むプライマー伸長産物を生成するように配置されることを意味する。プライマーは，参照される位置のすべてまたは一部に対応するかまたはこれに相補的なヌクレオチド配列を含むことができる。あるいは，プライマーは，参照される位置の３’側の領域に相補的であってもよい。
【００４２】
"プライマー"との用語は，２以上のプライマーを表してもよく，精製した制限酵素消化産物におけるように天然に生じるオリゴヌクレオチドや，または合成により製造されるオリゴヌクレオチドを表してもよい。これは，核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が触媒される条件下におかれたとき，相補鎖に沿った合成の開始点として作用することができる。そのような条件としては，適当なバッファ（"バッファ"には，補因子であるもの，またはｐＨ，イオン強度等を変更する代替物が含まれる）中の，適当な温度における，４つの異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸および重合を誘導する試薬，例えばＤＮＡポリメラーゼまたはリバーストランスクリプターゼの存在が含まれる。
【００４３】
プライマーは，増幅の効率を最大にするためには，好ましくは１本鎖であるが，あるいは二本鎖であってもよい。二本鎖の場合，伸長産物を調製するためにプライマーを用いる前に，まずこれを処理してその鎖を分離する。好ましくは，プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは，重合用試薬の存在下で伸長産物の合成をプライミングするのに十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは，多くの因子，例えば，温度およびプライマーの起源および使用方法によって異なるであろう。例えば，標的配列の複雑性に依存して，オリゴヌクレオチドプライマーは，典型的には１０−５０，好ましくは１５−２５ヌクレオチドを含むが，より多いかまたは少ないヌクレオチドを含んでいてもよい。短いプライマー分子は一般に，テンプレートと十分に安定なハイブリッド複合体を形成するために，低い温度を必要とする。
【００４４】
本明細書において用いる場合，"伸長プライマー"との用語は，テンプレート配列に相補的であり，配列にハイブリダイズして，ポリメラーゼ連鎖反応条件下で配列を伸長してプライマー伸長産物を生成することができるポリヌクレオチド配列を意味する。
【００４５】
２つの核酸配列に関して用いる場合，"相補体"およびその関連する形容詞形である"相補的な"との用語は，２つの核酸配列を逆平行の関係で並列させたときに（一方の配列の５’末端が他方の配列の３’末端と対になる），配列の対応するＧヌクレオチド塩基とＣヌクレオチド塩基とが対となり，対応するＡヌクレオチド塩基とＴヌクレオチド塩基とが対になることを意味する。一般には天然の核酸中に見いだされないある種の塩基を本発明の核酸中に含めてもよく，これには，例えば，イノシンおよび７−デアザグアニンがある。
【００４６】
本明細書において用いる場合，"アレル"との用語は，多型の遺伝子座におけるヌクレオチド配列の特定のバージョンを意味する。
【００４７】
本明細書において用いる場合，"多型部位"との用語は，ある集団中で変動する遺伝子座中の所与のヌクレオチド位置を意味する。
【００４８】
本明細書において用いる場合，"遺伝子座"との用語は，ＤＮＡ配列における，または転写されたＤＮＡ配列に由来しウイルス粒子中にパッケージングされた対応するＲＮＡ鎖における，ヌクレオチドまたはヌクレオチドの領域の特定の位置または配置を意味する。
【００４９】
アデノシン，シトシン，グアニンおよびチミンのヌクレオチドは，それぞれ１文字表記Ａ，Ｃ，Ｇ，およびＴにより表される。縮重プライマーを表記する場合には，記号ＲはＧまたはＡのいずれかを表し，記号ＹはＴ／ＵまたはＣのいずれかを表し，記号ＭはＡまたはＣのいずれかを表し，記号ＫはＧまたはＴ／Ｕのいずれかを表し，記号ＳはＧまたはＣのいずれかを表し，記号ＷはＡまたはＴ／Ｕのいずれかを表し，記号Ｂは"Ａ以外"，記号Ｄは"Ｃ以外"，記号Ｈは"Ｇ以外"，記号Ｖは"Ｔ／Ｕ以外"を表し，記号Ｎは任意のヌクレオチドを表す。本出願の明細書および特許請求の範囲においては，縮重プライマーとは，塩基の選択のすべての組み合わせを表し，ＤＮＡまたは対応するＲＮＡ配列（すなわち，ＴがＵで置き換えられている）のいずれをも表す。すなわち，縮重プライマーは，単一の種，またはその選択の範囲内の２つの種の混合物，またはその選択の範囲内の３つの種の混合物，および同様にしてすべての可能な組み合わせを含む混合物を表すことができる。アイソフォームヌクレオチド塩基は，当業者に一般に許容されている命名法を用いて表す。
【００５０】
本明細書において用いる場合，"オリゴヌクレオチドプライマー"との用語は，４以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドから構成される分子を意味する。その正確な長さは，オリゴヌクレオチドプライマーの究極的な機能および用途に関連する多くの因子，例えば，アニーリング反応の温度，プライマーの起源および組成によって異なるであろう。増幅プライマーは，重合用の試薬の存在下で伸長産物の合成をプライミングするのに十分な長さでなければならない。オリゴヌクレオチドプライマーは，核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成を誘導する条件下におかれたときに，合成の開始点として作用することができる。この条件としては，適当な温度およびｐＨにおける，ＤＮＡポリメラーゼ等の誘導試薬およびヌクレオチドの存在が挙げられる。好ましい態様においては，プライマーは，誘導試薬の存在下で特定の配列から伸長産物の合成をプライミングするのに十分な長さの一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。本発明の１つの観点においては，オリゴヌクレオチドプライマーは，約１０−約５０ヌクレオチドの長さ，好ましくは約１５−約３０ヌクレオチドの長さであるが，プライマーはより多くのまたは少ないヌクレオチドを含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドプライマーは，一般に，少なくとも１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，または２５ヌクレオチドの長さである。より好ましくは，プライマーは約２０−２５ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドプライマーの感度および特異度は，プライマーの長さおよびテンプレート核酸の所与のサンプル中における配列のユニークさにより決定される。短すぎるプライマーは，例えば，広範な種類の配列に対する非特異的結合を示すかもしれない。
【００５１】
本発明において用いられるオリゴヌクレオチドプライマーはまた，ユニバーサルプライマーを含んでいてもよい。ユニバーサルプライマーは，ユニバーサルプライマーに相補的な配列を含む標準的なベクター中に挿入されたポリヌクレオチド配列を増幅し配列決定するために便利に用いられる。ユニバーサル配列決定プライマーは当業者にはよく知られており，例えば，Ｔ７，ＳＰ６，Ｍ１３（−４０），Ｍ１３（−２０），およびＭ１３／ｐＵＣと称されるプライマーが挙げられる。増幅プライマーは，増幅産物（アンプリコン）がユニバーサルプライマー部位を取り込むように，ユニバーサルプライマーの相補体を含むよう設計することができ，このことにより，次に相補的ユニバーサル配列決定プライマーを用いて配列決定することが容易になる。
【００５２】
本発明のプライマーはまた，プライマー配列と興味の対象である配列との間にランダムな追加の配列を含ませて，より正確な配列決定を容易にしてもよい。典型的には配列の最初の１０−５０塩基対は読めないため，１０−５０塩基対のランダム配列を付加することにより，重要な配列を最初の読めない配列の下流にシフトさせて，目的とする配列を配列の正確な読みが得られる領域に配置することができる。
【００５３】
"逆転写"との用語は，ＲＮＡ分子に相補的なＤＮＡを生成するプロセスを意味し，一般に，リバーストランスクリプターゼ酵素を用いて行う。プライマーを用いて重合を開始することができ，このプライマーは，後にＰＣＲ増幅に用いるプライマー対の１つであってもよい。次に，ＲＮＡ分子をコピーされたＤＮＡ（"ｃＤＮＡ"）から分離するか，または酵素のＲＮＡｓｅＨ活性により分解して，テンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼによってｃＤＮＡの第２の鎖が生成されるようにする。この方法は，"Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ"，Ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；１９９５）（その内容を本明細書の一部としてここに引用する）のユニット３．７および１５．４に開示されている。
【００５４】
本発明の実施においては，特に記載しないかぎり，当業者の技術の範囲内である分子生物学，微生物学，組換えＤＮＡ手法，オリゴヌクレオチド合成の慣用の手法を利用することができる。そのような手法は，文献にすべて説明されている。酵素反応および精製手法は，製造元の仕様書にしたがって，または当該技術分野に一般に確立されているように，または本明細書に記載されるようにして，行うことができる。上述の手法および手順は，一般に，当該技術分野においてよく知られる慣用の方法にしたがって，および本明細書の全体に引用されるか説明される種々の一般的および特定の文献にしたがって実施する。例えば，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８４）；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，１９８４）；およびＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙのシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照（これらのすべての内容を本明細書の一部としてここに引用する）。
【００５５】
本発明の方法
本発明は，異なる所定の長さ多型に隣接する興味の対象である変異の存在または非存在を検出する方法に関する。本発明の方法および試薬は，長さ多型について複数の準種のベクターを含むかもしれない患者サンプルにおいて，感染性病原体等の外来ベクターのポリヌクレオチド配列を得るために最も有利に用いることができる。単一の患者サンプル中に混合された準種の長さ多型が存在すると，配列決定された領域が長さ多型を包含する場合に，ベクターの相補的な反対鎖ＤＮＡから配列決定結果を確認することが妨げられる。一般に，本発明の方法は，興味の対象である変異に関連するが隣接する所定の長さ多型を含まない領域の両方の相補鎖を選択的に配列決定し，そして相補鎖の配列を比較して，各鎖の配列がすべてのヌクレオチド塩基において他方の鎖と相補的であることを確認することを含む。
【００５６】
本発明の方法は最初にＨＩＶ−１遺伝子に関して開発されたが，かかる方法は，複数の準種の間で長さ多型を有するあらゆる病原体にもやはり適用することができる。したがって，本発明は，ＨＩＶ−１等の病原体の核酸における，興味の対象である変異の存在または非存在を検出する方法に関し，ここで，興味の対象である変異は，病原体の複数の準種を規定する長さ多型に隣接して位置する。この方法は，
ａ）患者サンプルから興味の対象である変異を包含する二本鎖ＤＮＡテンプレートを取得し；
ｂ）ＤＮＡテンプレートの，興味の対象である変異を含み長さ多型を含まない領域の第１の鎖を配列決定し；
ｃ）ＤＮＡテンプレートの，興味の対象である変異を含み長さ多型を含まない領域の第２の鎖を配列決定し；そして
ｄ）第１の鎖の配列を第２の鎖の配列と比較して，興味の対象である変異の配列の相補鎖確認を得ることを含む。工程（ｂ）および（ｃ）の配列決定は，外来ベクターの特定の領域の遺伝子配列情報を与えることができる任意の適当なＤＮＡテンプレートを用いて行うことができる。
【００５７】
別の観点においては，本発明は，ＨＩＶ−１等の病原体の核酸において，興味の対象である変異の存在または非存在を検出する方法に関し，ここで，興味の対象である変異は，病原体の複数の準種を規定する長さ多型に隣接して位置する。この方法は，
ａ）患者サンプルから興味の対象である変異を包含する二本鎖ＤＮＡテンプレートを取得し；
ｂ）ＤＮＡテンプレートの，興味の対象である変異および長さ多型の両方を含む第１の領域を増幅させ；
ｃ）ＤＮＡテンプレートの，興味の対象である変異を含み長さ多型を含まない領域の第１の鎖を配列決定し；
ｄ）ＤＮＡテンプレートの，興味の対象である変異を含み長さ多型を含まない領域の第２の鎖を配列決定し；そして
ｅ）第１の鎖の配列を第２の鎖の配列と比較して，興味の対象である変異の配列の相補鎖確認を得る，ことを含む。この方法においては，増幅工程は興味の対象である変異および長さ多型を含み，長さ多型が排除されるのは配列決定工程（ｃ）および（ｄ）中である。
【００５８】
さらに別の観点においては，本発明は，ＨＩＶ−１等の病原体の核酸において興味の対象である変異の存在または非存在を検出する方法に関し，ここで，興味の対象である変異は，病原体の複数の準種を規定する長さ多型に隣接して位置する。この方法は，
ａ）患者サンプルから興味の対象である変異を包含する二本鎖ＤＮＡテンプレートを取得し；
ｂ）ＤＮＡテンプレートの，興味の対象である変異を含み長さ多型を含まない第１の遺伝領域を増幅し；
ｃ）ＤＮＡテンプレートの，興味の対象である変異を含み長さ多型を含まない領域の第１の鎖を配列決定し；
ｄ）ＤＮＡテンプレートの，興味の対象である変異を含み長さ多型を含まない領域の第２の鎖を配列決定し；そして
ｅ）第１の鎖の配列を第２の鎖の配列と比較して，興味の対象である変異の配列の相補鎖確認を得る，ことを含む。この態様においては，長さ多型が排除されるのは増幅工程においてであり，増幅された領域または増幅された領域の一部を配列決定する次の行程も長さ多型を含まない。
【００５９】
本発明の１つの観点においては，興味の対象である変異は，ＨＩＶのｇｐ４１およびｇｐｌ２０からなる群より選択される領域中に位置する。本発明の別の観点においては，興味の対象である変異は，ＨＩＶ−１エンベロープ糖蛋白質ｇｐ４１中に位置する。本発明のさらに別の観点においては，興味の対象である変異は，ｇｐ４１の３６−４５位に位置する。
【００６０】
上述の態様により例示されるように，本発明の種々の態様の共通の特徴は，配列決定されるＤＮＡの領域中に長さ多型が含まれないようにして，次に，第１の鎖配列と第２の鎖配列とを比較して，異なる核酸長さを有する複数の長さ多型準種の存在の結果として得られる混乱した結果なしに，興味の対象である変異の配列の相補鎖確認を可能とすることにある。当業者には，配列決定工程の前に種々の方法を利用して，長さ多型を含まない配列データを与えることができるＤＮＡテンプレートを用意しうることが理解されるであろう。
【００６１】
ＤＮＡの起源
本発明の１つの観点においては，この方法は，まず，患者サンプルから興味の対象である変異を包含する二本鎖ポリヌクレオチドテンプレートを取得することを含む。二本鎖ポリヌクレオチドテンプレートは，最初はゲノムＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのフラグメントを含むであろう。このテンプレートは，興味の対象である変異のみならず，複数の準種を生ずる長さ多型を含む領域も包含するであろう。
【００６２】
二本鎖ポリヌクレオチドテンプレートは，典型的には，ＤＮＡを含む患者サンプルを，サンプル中のすべてまたは一部のＤＮＡをオリゴヌクレオチドプライマーとのハイブリダイゼーションについてアクセス可能とするように処理することにより，患者サンプルから調製される。例えば，溶解し，遠心分離により細胞破片を除き，蛋白質分解性の分解によりＤＮＡを曝露する。したがって，ＤＮＡテンプレートは，核ＤＮＡのみ，ミトコンドリアＤＮＡのみ，または組織サンプルから単離することにより得られる核またはミトコンドリアＤＮＡのある一部を含んでいてもよい。ＤＮＡテンプレートはまた，変換により，例えば総ｍＲＮＡ調製物またはＲＮＡウイルスのゲノムをｃＤＮＡに逆転写することにより調製したものであってもよく，プレート上で成長した個々の細菌コロニーから，または濃縮した細菌培養物から単離されたＤＮＡであってもよく，実質的にすべてのウイルスゲノムが単離されているウイルスＤＮＡ調製物であってもよい。
【００６３】
ＤＮＡは，液体サンプル，例えば，血液または尿または組織サンプルから，例えば，溶解し，遠心分離して細胞破片を除去し，蛋白質分解性消化によりＤＮＡを曝露させ，塩沈または標準的なＳＤＳ−プロテアーゼＫ−フェノール抽出を行う，などの多数の手法のいずれかにより調製することができる。サンプルはまた，ｔｈｅ Ｐｕｒｅ Ｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ）などのキットを用いて調製してもよい。
【００６４】
核酸の増幅
本発明の好ましい態様は，ＤＮＡを増幅して，続く配列決定のための大量のＤＮＡの供給源を提供する工程を含む。１つの観点においては，本発明の方法は，任意に，ＤＮＡテンプレートの興味の対象である変異および長さ多型の両方を含む第１の領域を増幅することを含んでいてもよい。次に，所定の長さ多型を含む増幅産物を，長さ多型を除くプライマーを用いて配列決定する。
【００６５】
あるいは，別の観点においては，本発明の方法は，興味の対象である変異を含み長さ多型を含まない領域を含むＤＮＡテンプレートの第１の遺伝子領域を選択的に増幅することを含んでいてもよい。所定の長さ多型を含まない増幅産物は，増幅プライマーに対応する同じプライマーを用いて，増幅されたフラグメントの異なる領域に相補的なプライマーを用いて，またはＰＣＲの間に増幅産物中に取り込まれた（ユニバーサルプライマーを含むプライマーを用いて）ユニバーサルプライマーテンプレートに相補的なユニバーサルプライマーを用いて，直接配列決定することができる。
【００６６】
典型的には，配列決定の前に，まず配列決定すべき標的領域を包含するＤＮＡの領域を増幅することにより，配列決定テンプレートを調製する。増幅すべき配列が最初に純粋な形で存在することは必要ではない。これは，複雑な混合物のより少ない部分であってもよく，核酸配列の一部であってもよい。出発核酸は，２以上の所望の特定の核酸配列を含んでいてもよく，これらは同じであっても異なっていてもよい。したがって，本発明の方法は，大量の１つの特定の核酸配列を製造するためのみならず，配列中に２以上の塩基対変種が存在する場合には同じまたは異なる核酸分子中に存在する２以上の異なる特定の核酸配列を同時に増幅するためにも有用である。
【００６７】
１つの観点においては，本発明は，ＨＩＶ−１ ｅｎｖをジェノタイピングする方法において用いられる，増幅および配列決定プライマーに関する。この方法は，ポリメラーゼ連鎖反応（またはＰＣＲ）の手法または他の何らかのプライマー伸長系方法論を用いる，特定の核酸配列を増幅するためのよく知られる方法を利用する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は当該技術分野において非常によく知られている。例えば，米国特許４，６８３，１９５，４，６８３，２０２，および４，８００，１５９；Ｋ．Ｍｕｌｌｉｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５１：２６３−２７３（１９８６）；およびＣ．Ｒ．Ｎｅｗｔｏｎ＆Ａ．Ｇｒａｈａｍ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：ＰＣＲ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：１９９７）（これらの開示を本明細書の一部としてここに引用する）は，サンプル標的にハイブリダイズするＰＣＲ増幅伸長プライマーを用いて核酸サンプル標的を増幅する手順を記載する。ＤＮＡポリメラーゼ（好ましくは熱安定性）を用いてＰＣＲ増幅プライマーが伸長されるにつれて，より多くのサンプル標的が作成され，したがって，より多くのプライマーを用いてこの手順を反復し，このことによりサンプル標的配列を増幅することができる。典型的には，反応条件は，ハイブリダイゼーションおよび核酸重合を助ける条件と，デュープレックス分子の変性をもたらす条件との間でサイクリングさせる。
【００６８】
簡単には，反応の第１の工程においては，二本鎖分子を変性させるために，サンプルの核酸分子を一時的に加熱し，次に冷却する。フォワードプライマーおよびリバースプライマーは，増幅反応混合物中にサンプル標的と比較して過剰濃度で存在する。サンプルをハイブリダイゼーションおよび重合を行う条件下でインキュベートすると，プライマーは，その増幅が望まれる配列の相補体である核酸分子の相補鎖の，増幅することが望まれる領域の配列の３’側の位置にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションが生じた後，プライマーの３’末端がポリメラーゼにより伸長される。プライマーの伸長により，所望の核酸サンプル標的の相補体の正確な配列を有するＤＮＡ分子が合成される。ＰＣＲ反応は，所望の核酸配列を指数関数的に増幅することができ，各サイクルで所望の配列を有する分子の数をほぼ２倍にする。すなわち，ハイブリダイゼーション，重合，および変性のサイクルを進めることにより，所望の核酸分子の濃度の指数関数的増加が達成される。
【００６９】
核酸増幅テンプレートの調製
本発明は，病原体，例えばＨＩＶ−１ ｅｎｖおよびその変種形を増幅し配列決定する方法に関する。本発明の方法は，例えば，ＤＮＡまたはＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡを含む）を用いることができ，このＤＮＡまたはＲＮＡは１本鎖であっても二本鎖であってもよい。さらに，それぞれの１本鎖を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを用いてもよい。これらの核酸のいずれかの混合物も用いることができ，同じまたは異なるプライマーを用いて先の増幅反応から産生された核酸も同じように用いることができる。増幅すべき特定の核酸配列は，より大きな分子の一部のみであってもよく，最初は別々の分子として存在して，特定の配列が核酸全体を構成するようにしてもよい。
【００７０】
増幅すべき配列が最初に純粋な形で存在することは必要ではない。これは複雑な混合物中の少ない割合であってもよく，核酸配列の一部であってもよい。出発核酸は２以上の所望の特定の核酸配列を含んでいてもよく，これらは同じであっても異なっていてもよい。したがって，本発明の方法は，１つの特定の核酸配列を大量に製造するためのみならず，配列中に２以上の塩基対変種が存在する場合には，同じまたは異なる核酸分子上に位置する２以上の異なる特定の核酸配列を同時に増幅するのにも有用である。
【００７１】
核酸テンプレートは，任意の起源から，例えば，ｐＢＲ３２２等のプラスミドから，クローニングされたＤＮＡまたはＲＮＡから，または任意の起源，例えば，患者から得られたＨＩＶ感染血漿または血清の天然のＤＮＡまたはＲＮＡから，得ることができる。ＤＮＡまたはＲＮＡは，血液，組織材料または羊膜細胞から，Ｍａｎｉａｔｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２），２８０−２８１）などに記載されている種々の手法により抽出することができる。
【００７２】
細胞は，核酸を精製することなく直接用いてもよく，この場合，細胞を低張バッファに懸濁し，細胞が溶解して細胞内成分の分散が生ずるまで，一般には約９０℃−１００℃で約１−１５分間加熱する。加熱工程の後，溶解した細胞に増幅試薬を直接加えることができる。この直接細胞検出法は，末梢血液リンパ球および羊膜細胞について用いることができる。
【００７３】
サンプル中に含まれる標的核酸は，最初はＲＮＡの形であろうが，好ましくは逆転写してｃＤＮＡとし，次に，任意の適当な変性法，例えば，当業者に知られる物理学的，化学的または酵素的手段を用いて変性する。鎖分離のための好ましい物理学的手段は，完全に（＞９９％）変性するまで核酸を加熱することを含む。典型的な熱変性は，約８０℃から約１０５℃の温度範囲で数秒間から数分間を含む。変性の代わりに，標的核酸は，一本鎖の形で，例えば，一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスの形でサンプル中に存在してもよい。
【００７４】
次に，変性した核酸鎖を，予め選択されたオリゴヌクレオチドプライマー，および，任意に，増幅された配列を検出する目的で標識されたオリゴヌクレオチド（本明細書において"プローブ"と称する））とともに，プライマーおよびプローブが一本鎖核酸に結合しうる条件下でインキュベートする。当該技術分野において知られるように，プライマーは，デュープレックス配列に沿ったその相対的位置が，伸長産物をそのテンプレート（相補体）から分離したときに，１つのプライマーから合成される伸長産物が他のプライマーの伸長のテンプレートとして働いて，規定された長さの複製物を与えるように選択される。
【００７５】
核酸の配列決定
上述したＤＮＡの増幅により，配列決定のための大量のＤＮＡ起源が生成する。上述のように調製したポリヌクレオチドテンプレートを，ヌクレオチドの配列決定用に当業者に利用可能であり知られている多くの方法のいずれかを用いて配列決定する。
【００７６】
本発明の好ましい観点においては，配列決定に用いられるＤＮＡテンプレートは二本鎖である。二本鎖ＤＮＡは相補鎖の同時配列決定を可能とし，このことにより，各鎖から得られた正確に相補的であるはずの配列を比較することにより，正しい配列決定の結果を確認することができる。
【００７７】
本発明において用いられる増幅方法は，配列決定と組み合わせて同時に用いてもよい。同時増幅および配列決定の方法は，当該技術分野において広く知られており，例えば，カップリングした増幅および配列（ＣＡＳ）（Ｒｕａｎｏ ａｎｄ Ｋｉｄｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８（７）：２８１５−２８１９（１９９１），および米国特許５，４２７，９１１（本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている），およびＣＬＩＰ増幅および配列決定（米国特許６，００７，９８３，およびＪ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ４１（４）；１５８６−１５９３（Ａｐｒｉｌ ２００３）（本明細書の一部としてここに引用する）に記載されている）が挙げられる。ＣＬＩＰ配列決定は，先に生成されたＰＣＲ増幅フラグメントを同時ＰＣＲ増幅および直接配列決定に供する。ＣＡＳ配列決定においては，サンプルを第１の反応工程で２つのプライマーで処理し，多数のサイクルで増幅して１０，０００から１００，０００倍の増幅を得る。次に，増幅反応の対数期の間にｄｄＮＴＰを加え，さらなるサーマルサイクルで反応を進行させて，連鎖停止された配列決定フラグメントを生成する。ＣＡＳプロセスは，途中で試薬（ｄｄＮＴＰ試薬）を加えることを必要とし，これは誤りまたは夾雑物混入の機会を持ち込み，自動化に用いる装置の複雑性を増加させる。したがって，ＣＡＳ方法論は，好ましくは，先に生成したＰＣＲ増幅フラグメントを同時ＰＣＲ増幅および直接配列決定に供するＣＬＩＰ配列決定と組み合わせる。ＣＬＩＰ（登録商標）方法を用いる同時増幅および配列決定は，例えば，市販のキット，例えばＴＲＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＩＶジェノタイピングキット（Ｂａｙｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ ＬＬＣ）に記述され与えられている試薬および条件を用いて行うことができる。
【００７８】
特定の観点においては，本発明は，細菌またはウイルスなどの感染性病原体，例えば，Ｂ型肝炎ウイルス，Ｃ型肝炎ウイルス，およびヒト免疫不全ウイルス，特にＨＩＶ−１ ｅｎｖ，およびこれらの変種型の配列決定に関する。本発明の方法において用いられる二本鎖ＤＮＡテンプレートは，例えば，ＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡ等のＲＮＡに由来するものであってもよく，１本鎖であっても二本鎖であってもよい。さらに，ＤＮＡテンプレートは，１つの鎖がＤＮＡであり１つの鎖がＲＮＡであるＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドの形であってもよい。これらの核酸の任意のものの混合物も用いることができ，または，先に行った同じまたは異なるプライマーを用いる本発明の増幅反応により生成した核酸を利用してもよい。増幅すべき特定の核酸配列は，より大きい分子の一部であってもよく，または特定の配列が全核酸を構成するように別々の分子として最初に存在するものであってもよい。
【００７９】
ＨＩＶ−１ ｇｐ４１のＨＲ１および／またはＨＲ２ドメインの配列決定
本発明は，ＨＩＶ−１ウイルスを含むと疑われるサンプルにおいてＨＩＶ−１貫膜糖蛋白質（ｇｐ４１）をジェノタイピングするための新規な方法および試薬を含む。
【００８０】
本発明は，ｇｐ４１のＨＲ１およびＨＲ２ドメインの全てまたは一部，またはｇｐ４１のＨＲ１ドメインの全てまたは一部を包含するプライマーを提供することにより，上述の問題点を解決する。
【００８１】
本発明の配列決定プライマーは，ＨＩＶ−１に特異的なオリゴヌクレオチドからなり，これを用いてｇｐ４１ＤＮＡの一部を増幅し配列決定することができる。当業者に知られる方法にしたがって，ＨＩＶ−１ウイルスに感染していると疑われる個人から得られたサンプルを用いて，ウイルスＲＮＡをＲＮＡまたはＤＮＡの形で回収する。サンプルから得られたウイルスＨＩＶ−１ ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡとする。次に，ｃＤＮＡテンプレートを，ポリメラーゼ連鎖反応または他の何らかのプライマー伸長系方法を用いて増幅する。次に，得られた増幅されたフラグメントを，ｇｐ４１サブユニットを囲むか，ＨＲ１およびＨＲ２ドメインを囲むか，あるいは，ＨＲ１ドメインを囲むプライマーのセットを用いて，サイクルシークエンシング法またはＣＬＩＰ（商標）双方向シークエンシングを用いて最初に配列決定する。
【００８２】
本発明の１つの特定の観点は，ＨＩＶ−１ウイルスを含むと疑われるサンプル中のＨＩＶ−１ ｅｎｖ遺伝子のｇｐ４１サブユニットを増幅しジェノタイピングする方法である。この方法は，（１）ＨＩＶ−１ ｅｎｖ領域を増幅し，（２）ｇｐ４１のＨＲ１およびＨＲ２ドメインの両方を包含する領域の配列を決定することを含む。
【００８３】
本発明は，一般に，ＨＩＶ−１ウイルスを含むと疑われるサンプル中において，ＨＩＶ−１貫膜糖蛋白質（ｇｐ４１）のＨＲ１ドメインを配列決定およびジェノタイピングするための新規な方法および試薬に関する。ｇｐ４１領域の最初の７回反復ドメイン（ＨＲ１）の周囲の高い複雑性は，ＨＲ１ドメインの近くで挿入または欠失変異が生ずる頻度が比較的高いためであることが見いだされている。ＨＲ１ドメイン中の変異は，例えば，ＨＩＶ−１エンベロープ糖蛋白質ｇｐ４１の３６−３８位で生ずることが知られている。特定の変異としては，Ｇ３６Ｖ／Ｄ／Ｓ，Ｉ３７Ｖ，Ｖ３８Ａ／Ｍ／Ｅ，Ｑ３９Ｒ，Ｑ４０Ｈ，Ｎ４２Ｔ，Ｎ４３Ｈ／Ｅ／Ｄ／Ｓ，Ｌ４４Ｍ，Ｌ４５Ｍが挙げられる。長さ多型を有するＨＩＶ−１ウイルス集団の混合物が血漿中に生じて，一致しないＨＲ１ヌクレオチド配列データおよび矛盾する双方向配列データをもたらすことが見いだされている。この問題は，これまでに認識されておらず，これはおそらく，配列決定の前にＲＴ−ＰＣＲ産物をクローニングすることに依存した方法であったこと，または確認用双方向データなしで１方向データが許容されていたためであろう。本発明は，本質的にＨＩＶ−１ ｅｎｖのＨＲ１ドメインからなり長さ多型の原因であるより可変性の高い領域を除く領域を配列決定するための方法およびプライマーを提供することにより，上述の問題点を解決する。したがって，本発明のプライマーは，ＨＲ１ドメインに到達する前に長さ多型を含む領域を通して配列決定するための配列決定プライマーを用いては正確に特徴決定することができないサンプルについて，配列を確認するのに有用である。
【００８４】
ｇｐ４１のための配列決定プライマー
本発明の配列決定プライマーは，フォワードプライマーおよびリバースプライマーの両方を含み，これらは，検出可能な標識で標識してもよい。最も一般的な配列決定装置用には，蛍光標識が望ましいが，他のタイプの標識，例えば，呈色，発色，蛍光（化学発光を含む）および放射性標識を用いてもよい。プライマーの組み合わせは，逆転写，増幅または配列決定に適当な他の試薬を含んでいてもよく，もちろん，分析用のＨＩＶ−１の遺伝的材料を含んでいてもよい。
【００８５】
１つの観点においては，本発明は，ｇｐ４１のＨＲ１およびＨＲ２ドメインの配列を決定するための方法およびプライマーを含む。特定の態様においては，本発明は，ｇｐ４１のＨＲ１およびＨＲ２ドメインを包含する領域の両方のＤＮＡ鎖（双方向）の配列を決定するための方法およびプライマーを含む。
【００８６】
別の観点においては，本発明はまた，本質的にＨＩＶ−１糖蛋白質ｇｐ４１のＨＲ１ドメインからなる領域を配列決定するための方法およびプライマーを含む。本発明の配列決定プライマーは，本質的にＨＩＶ−１のＨＲ１ドメインからなる領域を配列決定するのに望ましい特異性を有する任意の適当な配列決定プライマーでありうる。当業者に知られる方法にしたがって，ＨＩＶ−１ウイルスに感染していることがわかっているかその疑いのある個人から得たサンプルを用いて，ウイルスＲＮＡをＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの形で回収する。サンプルから得たウイルスＨＩＶ−１ ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡとする。次に，ｃＤＮＡテンプレートを，ポリメラーゼ連鎖反応またはプライマー伸長に基づく他の方法を用いて増幅する。好ましい態様においては，増幅される領域は，ＨＩＶ−１ ｅｎｖ蛋白質をコードする領域を包含するが，より広いかまたは狭い領域もまた，ＨＩＶ ｅｎｖドメインの特定の領域を配列決定するためのテンプレートとして用いるのに適している。次に，本質的にＨＲ１ドメインからなる領域の配列を与えるが，ＨＲ１領域それ自体を配列決定する前にＨＲ１ドメイン近傍の挿入および／または欠失変異により引き起こされた長さ多型の領域については配列決定しないプライマーのセットを用いて，あるいは１方向配列決定の場合には単一のプライマーを用いて，得られた増幅されたフラグメントを配列決定する（例えば，サイクルシークエンシングまたはＣＬＩＰ（登録商標）双方向配列決定により）。したがって，本発明のプライマーは，挿入および／または欠失変異により引き起こされた長さ多型の領域とＨＲ１ドメインそれ自体との間に存在する領域に相補的であり，したがって，プライマーの伸長は，長さ多型から離れる方向に，ＨＲ１ドメインに向かって進行する。特定の態様においては，本発明は，ＨＩＶ−１ウイルスを含むと疑われるサンプルにおいて，ＨＩＶ−１ ｅｎｖ遺伝子のｇｐ４１サブユニットのＨＲ１ドメインを配列決定する方法を提供し，この方法は，本質的にｇｐ４１のＨＲ１ドメインからなるが，長さ多型に伴う変異を含むＨＲ１ドメインに隣接する領域を含まない領域のヌクレオチド配列を決定することを含む。
【００８７】
本発明のプライマーは，ＨＩＶ−１の亜集団が混合された血漿の間の長さ多型の結果として他のプライマーでは解読が困難な配列データが得られるような臨床の状況において，ＨＲ１の配列を決定することを可能とする。これらのプライマーは，ＨＲ１変異を確認するために利用することができるが，また，ＨＲ１のみをカバーする代替の配列決定プライマーセットとして用いてもよい。
【００８８】
本発明のプライマーは，ＤＮＡの１本の鎖の配列を決定するのに用いるための単一のプライマーであってもよい。あるいは，本発明の好ましい態様においては，プライマーは，ｇｐ４１のＨＲ１ドメインを囲む領域の両方のＤＮＡ鎖（双方向配列）の配列を決定するためのプライマーの組み合わせである。したがって，本発明の配列決定プライマーは，フォワードプライマー，リバースプライマー，またはフォワードプライマーとリバースプライマーの両方を含んでいてもよい。臨床目的で患者サンプルからのＨＩＶ−１のジェノタイプの決定に用いる場合には，ＤＮＡのフォワードおよびリバースの両方の鎖の配列を取得し，このことにより，配列決定の結果を確認することが望ましい。しかし，フォワード鎖およびリバース鎖の一方または他方の配列を得るだけの場合にも本発明の配列決定プライマーを用いることができることが理解されるであろう。
【００８９】
本発明のプライマーはＨＲ１中の薬剤耐性関連変異とＨＩＶの亜集団が混合された血漿中に見いだされる長さ多型との間の領域に特異的である。機能的な意味では，そのようなプライマーは，ＨＩＶ亜集団の混合血漿の間に見いだされる長さ多型に関連した挿入または欠失変異を含まない配列決定反応生成物を生成することができるプライマーとして定義することができる。目的は，ＨＲ１領域（特に，ＨＲ１中に位置する薬剤耐性変異）について矛盾のない配列データを得ることであるため，プライマーは最初にＨＲ１領域の配列データを与え（伸長の反対側の方向に存在する長さ多型から離れる方向），次にＨＲ１の他方の側にある長さ多型を含むかもしれない配列を決定する方向に伸長を開始することが企図される。まずＨＲ１領域を通る配列を生成することにより（長さ多型の領域を通る配列を生成する前に），ＨＲ１領域について矛盾のないヌクレオチド配列データが得られる。したがって，ＨＲ１領域の後の長さ多型から生ずる混乱した配列の存在は，ＨＲ１領域それ自体の配列決定の結果に悪影響を与えない。したがって，プライマーは，長さ多型の領域を通って配列決定するであろうが，ただし，そのような配列はＨＲ１の配列が最初に生成された後に生成されることが理解されるであろう。
【００９０】
許容しうる配列決定プライマーの例は下記に開示される。本発明の配列決定プライマーは，好ましくは以下に記載される配列と同じ配列を有するプライマーの中から選択されるが，本発明は，主要なＨＩＶ−１サブタイプに対する特異性を有するが，あまり一般的ではないサブタイプに対しても特異性を有するかもしれない縮重配列を含むことが企図される。そのような縮重配列の設計および構築は当業者によく知られている。
【００９１】
一般に，ＤＮＡ配列決定プライマーは，１５またはそれ以上のヌクレオチド塩基，好ましくは１８−３０ヌクレオチド塩基からなる。配列決定プライマーはまた，上述のプライマーの１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，または２５ヌクレオチドを有するフラグメントを含んでいてもよい。プライマーは，特にテンプレートがＧＣリッチである場合には，二次的プライミングのアルチファクトやノイズ配列につながりうるため，５２℃−６５℃の範囲の溶融温度（Ｔｍ）を有することが好ましい。さらに，好ましいプライマーは，二量体や著しいヘアピンを形成せず，二次的なプライミング部位をもたない。また，プライマーは，３’末端における結合の特異性が低いであろう（すなわち，ミスプライミングを回避するために，より低い，好ましくは４０−６０％のＧＣ含量を有する）。これらの特性を有するプライマーを設計するコンピュータソフトウエアが利用可能であり，これには例えば，ＬａｓｅｒＧｅｎｅ（ＤＮＡ Ｓｔａｒ），Ｏｌｉｇｏ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．），ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（Ｋｏｄａｋ／ＩＢＩ）およびｔｈｅ ＧＣＧ ｓｕｉｔｅがある。さらに，プライマーは，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｏｂｒａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ／ｐｒｉｍｅｒ３．ｃｇｉから入手可能）を用いて，上述の基準を満たすように設計することができる。さらなる設計基準は当業者に知られておりかつ利用可能である。
【００９２】
配列決定プライマーは，増幅プライマーとは異なり，３’塩基について同じ位置を有しない限り一緒に混合することができないため，特定の縮重塩基位置が以下に示されるが，３’および５’位置は改変することができることが理解されるべきである。５’ヌクレオチド位置は，より配列保存性の高い領域を含むかまたは溶融温度および結合のストリンジェンシーを改変するよう変更してもよい。成功率が所望のＨＩＶ−１サブタイプについての配列を得るのに十分であれば，非縮重プライマーセットが好ましい。また，反応条件を調節して動作を最適化することができる。配列決定プライマーの可能な修飾の例は以下に開示される。
【００９３】
特定の態様においては，以下から選択される配列決定プライマーを用いて，ｇｐ４１のＨＲ１およびＨＲ２ドメインの両方を包含する領域を配列決定する。
配列番号２ ５’−ＧＣＡＣＣＸＡＣＳＡＲＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＭＧＡＧＹＧＧ−３’
配列番号３ ５’−ＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＧＧ−３’
配列番号４ ５’−ＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＧＧ−３’
配列番号５ ５’−ＧＣＡＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＧＧ−３’
配列番号６ ５’−ＧＣＡＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＹＧＧ−３’
配列番号７ ５’−ＧＣＡＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＭＧＡＧＹＧＧ−３’
配列番号８ ５’−ＧＣＡＣＣＣＡＣＣＡＧＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＭＧＡＧＹＧＧ−３’
配列番号９ ５’−ＧＣＡＣＣＣＡＣＧＡＧＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＭＧＡＧＹＧＧ−３’
配列番号１０ ５’−ＧＣＡＣＣＮＡＣＧＡＧＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＭＧＡＧＹＧＧ−３’
配列番号１１ ５’−ＡＣＧＡＧＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＭＧＡＧＹＧＧ−３’
配列番号１２ ５’−ＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＧ−３’
配列番号１３ ５’−ＣＧＡＧＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＭＧＡＧＹＧ−３’
配列番号１４ ５’−ＧＣＡＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＧＧ−３’
配列番号１５ ５’−ＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＧＧ−３’
配列番号１６ ５’−ｔａｒｔａｇｇａｇｇｎｔｔｒａｔａｇｇｎｔｔａａｇａａｔａ−３’
配列番号１７ ３’−ｇｔａｇｇａｇｇｃｔｔｇａｔａｇｇｔｔｔａａｇ−５’
配列番号１８ ３’−ｔａｇｔａｇｇａｇｇｃｔｔｇａｔａｇｇｔｔｔａａｇ−５’
配列番号１９ ３’−ｔａｒｔａｇｇａｇｇｃｔｔｇａｔａｇｇｔｔｔａａｇ−５’
配列番号２０ ３’−ｔａｒｔａｇｇａｇｇｎｔｔｇａｔａｇｇｔｔｔａａｇ−５’
配列番号２１ ３’−ｔａｒｔａｇｇａｇｇｎｔｔｒａｔａｇｇｔｔｔａａｇ−５’
配列番号２２ ３’−ｔａｒｔａｇｇａｇｇｎｔｔｒａｔａｇｇｎｔｔａａｇ−５，
配列番号２３ ３’−ｔａｒｔａｇｇａｇｇｎｔｔｒａｔａｇｇｎｔｔａａｇａａｔａ−５’
配列番号２４ ３’−ｇｇａｇｇｎｔｔｒａｔａｇｇｎｔｔａａｇａａｔａ−５’
配列番号２５ ３’−ｇｇｖｇｇｎｔｔｒａｔａｇｇｎｔｔａａｇａａｔａ−５’
配列番号２６ ３’−ｔａｇｇａｇｇｎｔｔｒａｔａｇｇｎｔｔａａｇ−５’
配列番号２７ ３’−ｇｇａｇｇｃｔｔｇｇｔａｇｇｔｔｔａａｇａ−５’
配列番号２８ ３’−ｇｇｖｇｇｎｔｔｒａｔａｇｇｎｔｔａａｇａ−５’
配列番号２９ ３’−ｔａｇｔａｇｇａｇｇｃｔｔｇａｔａｇｇｔｔｔａａｇａａｔａ−５’
配列番号３０ ３’−ｇｔａｇｇａｇｇｃｔｔｇａｔａｇｇｔｔｔａａｇ−５’
【００９４】
配列決定プライマーは，例えば，以下からなる群より選択される少なくとも１つのフォワード配列決定プライマーを含むことができる：
配列番号２ ５’−ＧＣＡＣＣＸＡＣＳＡＲＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＭＧＡＧＹＧＧ−３’
配列番号３ ５’−ＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＧＧ−３’
配列番号４ ５’−ＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＧＧ−３’
配列番号５ ５’−ＧＣＡＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＧＧ−３’
配列番号６ ５’−ＧＣＡＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＹＧＧ−３’
配列番号７ ５’−ＧＣＡＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＭＧＡＧＹＧＧ−３’
配列番号８ ５’−ＧＣＡＣＣＣＡＣＣＡＧＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＭＧＡＧＹＧＧ−３’
配列番号９ ５’−ＧＣＡＣＣＣＡＣＧＡＧＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＭＧＡＧＹＧＧ−３’
配列番号１０ ５’−ＧＣＡＣＣＮＡＣＧＡＧＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＭＧＡＧＹＧＧ−３’
配列番号１１ ５’−ＡＣＧＡＧＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＭＧＡＧＹＧＧ−３’
配列番号１２ ５’−ＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＧ−３’
配列番号１３ ５’−ＣＧＡＧＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＭＧＡＧＹＧ−３’
配列番号１４ ５’−ＧＣＡＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＧＧ−３’
【００９５】
本発明の１つの態様においては，双方向一次配列決定プライマーのセットは，配列番号２，およびその３’末端を含む１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントのヌクレオチド配列を含む第１のプライマーを含む。配列番号２は，フォワードプライマーとして用いることができる縮重プライマーのセットを記述し，ここで，Ｘは，５−ニトロインドールまたはＣであり，ＳはＧまたはＣを表し，ＲはＧまたはＡを表し，ＭはＡまたはＣを表し，ＹはＴまたはＣを表す。Ｙ（Ｔ／Ｃ）におけるプライマー縮重は，ＨＩＶのＢおよびＡサブタイプの両方の単離物を検出するために設計されたものである。同様に，Ｍ（Ａ／Ｃ）におけるプライマー縮重は，Ｆ−タイプのＨＩＶ組換え体を検出するために設計されたものである。上述の配列の他の変種を用いて，他のＨＩＶ変種を検出することができる。
【００９６】
別の態様においては，本発明は，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，配列番号１２，および配列番号１３，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択される第１のプライマーを含む，双方向一次配列決定プライマーのセットを含む。
【００９７】
さらに別の態様においては，本発明は，配列番号１４，およびその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントの配列を含む第１のプライマーを含む双方向一次配列決定プライマーのセットを含む。
【００９８】
さらに別の態様においては，本発明は，配列番号３の配列を含む第１のプライマーを含む双方向一次配列決定プライマーのセットを含む。
【００９９】
一次配列決定プライマーはまた，以下からなる群より選択される少なくとも１つのリバース配列決定プライマーを含んでいてもよい：
配列番号１５ ５’−ＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＧＧ−３’
配列番号１６ ５’−ｔａｒｔａｇｇａｇｇｎｔｔｒａｔａｇｇｎｔｔａａｇａａｔａ−３’
配列番号１７ ３’−ｇｔａｇｇａｇｇｃｔｔｇａｔａｇｇｔｔｔａａｇ−５’
配列番号１８ ３’−ｔａｇｔａｇｇａｇｇｃｔｔｇａｔａｇｇｔｔｔａａｇ−５’
配列番号１９ ３’−ｔａｒｔａｇｇａｇｇｃｔｔｇａｔａｇｇｔｔｔａａｇ−５’
配列番号２０ ３’−ｔａｒｔａｇｇａｇｇｎｔｔｇａｔａｇｇｔｔｔａａｇ−５’
配列番号２１ ３’−ｔａｒｔａｇｇａｇｇｎｔｔｒａｔａｇｇｔｔｔａａｇ−５’
配列番号２２ ３’−ｔａｒｔａｇｇａｇｇｎｔｔｒａｔａｇｇｎｔｔａａｇ−５，
配列番号２３ ３’−ｔａｒｔａｇｇａｇｇｎｔｔｒａｔａｇｇｎｔｔａａｇａａｔａ−５’
配列番号２４ ３’−ｇｇａｇｇｎｔｔｒａｔａｇｇｎｔｔａａｇａａｔａ−５’
配列番号２５ ３’−ｇｇｖｇｇｎｔｔｒａｔａｇｇｎｔｔａａｇａａｔａ−５’
配列番号２６ ３’−ｔａｇｇａｇｇｎｔｔｒａｔａｇｇｎｔｔａａｇ−５’
配列番号２７ ３’−ｇｇａｇｇｃｔｔｇｇｔａｇｇｔｔｔａａｇａ−５’
配列番号２８ ３’−ｇｇｖｇｇｎｔｔｒａｔａｇｇｎｔｔａａｇａ−５’
配列番号２９ ３’−ｔａｇｔａｇｇａｇｇｃｔｔｇａｔａｇｇｔｔｔａａｇａａｔａ−５’
配列番号３０ ３’−ｇｔａｇｇａｇｇｃｔｔｇａｔａｇｇｔｔｔａａｇ−５’
【０１００】
本発明の１つの態様においては，双方向一次配列決定プライマーのセットは，配列番号１６，および３’末端を含むその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントのヌクレオチド配列を含む第２のプライマーを含む。配列番号１６は，フォワードプライマーとして用いることができる縮重プライマーのセットを記述し，ここで，ＲはＧまたはＡを表し，Ｘは５−ニトロインドールまたはＣを表し，Ｚは５−ニトロインドールまたはＴを表し，ＶはＡまたはＧまたはＣであってＴではないことを表す。上述の配列の他の変種を利用すれば，他のＨＩＶ変種を検出することができる。
【０１０１】
別の態様においては，本発明は，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，および配列番号２８からなる群より選択される第２のプライマーを含む双方向一次配列決定プライマーのセットを含む。
【０１０２】
さらに別の態様においては，本発明は，配列番号２９，およびその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントの配列を含む第２のプライマーを含む双方向一次配列決定プライマーのセットを含む。
【０１０３】
さらに別の態様においては，本発明は，配列番号３０の配列を含む第２のプライマーを含む双方向一次配列決定プライマーのセットを含む。
【０１０４】
本発明のさらに別の観点においては，ＨＩＶ−１のＨＲ１ドメインを配列決定するための用いられるプライマーは，配列番号３１，配列番号３２，配列番号３３，配列番号３４，配列番号３５，および配列番号３６（以下に記載）またはそれらの少なくとも１５またはそれ以上のヌクレオチドののフラグメントの１またはそれ以上からなる群より選択される配列を有するであろう。
配列番号３１ ５’−ＴＴＧＧＧＴＴＣＴＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＡＧ−３’
配列番号３２ ５’−ＴＴＧＧＧＴＴＣＴＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧ−３’
配列番号３３ ５’−ＡＧＴＲＧＴＧＣＡＲＡＴＧＡＫＴＴＴＴＣＣＡＧＡＧ−３’
配列番号３４ ５’−ＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＧＴＴＴＴＣＣＡＧＡＧ−３’
配列番号３５ ５’−ＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＧＴＴＴＴＣＣＡＧＡＧＣ−３’
【０１０５】
配列番号３１，配列番号３２，配列番号３３は，ＨＲ１の５’側の領域中の代替フォワードプライマー配列を表す。配列番号３１のプライマー配列は，配列番号１のヌクレオチド７３２９−７３５３の配列に対応する。配列番号３２のプライマー配列は，配列番号１のヌクレオチド７３２９−７３５０の配列に対応する。配列番号３３のプライマー配列は，配列番号１のヌクレオチド７３３７−７３６１の配列に対応する。
【０１０６】
配列番号３４，配列番号３５，配列番号３６は，ＨＲ１の３’側（ＨＲ１ドメインとＨＲ２ドメインの間）の領域中の代替リバースプライマー配列を表す。配列番号３４のプライマー配列は，配列番号１のヌクレオチド７５６３−７５８７（ｃｔｃｔｇｇａａａａｍｔｃａｔｙｔｇｃａｃｙａｃｔ）のリバース相補体に対応する。配列番号３５のプライマー配列は，配列番号１のヌクレオチド７５６４−７５８７（ｃｔｃｔｇｇａａａａｃｔｃａｔｃｔｇｃａｃｃａｃ）のリバース相補体に対応する。配列番号３６のプライマー配列は，配列番号１のヌクレオチド７５６３−７５８８（ｃｔｃｔｇｇａａａａｃｔｃａｔｃｔｇｃａｃｃａｃｇ）のリバース相補体に対応する。
【０１０７】
本発明の１つの態様においては，プライマーは，配列番号１およびその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントのヌクレオチド配列を含む。
【０１０８】
本発明の別の態様においては，プライマーは，配列番号３１およびその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントのヌクレオチド配列を含む。
【０１０９】
本発明の別の態様においては，プライマーは，配列番号３２およびその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントのヌクレオチド配列を含む。
【０１１０】
本発明の別の態様においては，プライマーは，配列番号３３およびその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントのヌクレオチド配列を含む。
【０１１１】
本発明の別の態様においては，プライマーは，配列番号３４およびその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントのヌクレオチド配列を含む。
【０１１２】
本発明の別の態様においては，プライマーは，配列番号３５およびその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントのヌクレオチド配列を含む。
【０１１３】
本発明の別の態様においては，プライマーは，双方向配列決定プライマーのセットを含み，ここで，フォワードプライマーは，配列番号１，配列番号３１，および配列番号３２，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択され，リバースプライマーは，配列番号３３，配列番号３４，および配列番号３５，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択される。
【０１１４】
配列番号１，配列番号３１，および配列番号３２で示されるフォワードプライマー部位は，３’末端は好ましくは−Ｇヌクレオチド塩基であり，より好ましくは−ＧＧである。このことにより，プライマーの３’末端で特に強いハイブリダイゼーションが得られ，おそらくは，異なる位置で終わるプライマーに対してより改良された配列決定結果が得られる。プライマーの３’末端はさらに３’方向に伸長することができる。プライマーのすぐ後の配列は一般に質が低いため，フォワードプライマーの３’末端は，好ましくは，ＨＲ１配列の始まりが明確であるよう，ＨＲ１領域から十分な距離に位置する。フォワードプライマーの３’末端は，好ましくは配列番号１の３’末端の−ＡＡＧよりさらに延長されないが，ＨＲ１領域のための適当な配列を得ることができれば，この点を超えて伸長するプライマーも企図される。
【０１１５】
このプライマーの５’末端はわずかに短くしてもよいが，これはプライマーのアニーリング特性も変化させるであろう。特に，５’末端−ＧＧは短くして−Ｇとしてもよい。より短いタイプのもの（ＴＧＧ−，ＧＧ−，Ｇ−）を３’末端の伸長と組み合わせて，アニーリング（または融点，Ｔｍ）温度を他の可能なリバースプライマーとマッチさせるようにさらに最適化することができる。
【０１１６】
フォワードプライマーは，用いられる配列決定化学に対する適当な修飾とともに，上述した位置を越えてさらに修飾してもよい。例えば，ネステッドＰＣＲプライマーにユニバーサル配列決定プライマーテールを用いて，ユニバーサル配列決定プライマーを重要な領域に近づけすぎることなく，プライマーをやや内側に移動させることができる。このためには，ＷＰプライマーがＰＣＲプライマーとしてユニバーサル配列決定テールを含むことが必要である。
【０１１７】
配列番号３３，配列番号３４，および配列番号３５を例とするリバースプライマーはまた，本発明にしたがって修飾することができる。好ましい態様においては，リバースプライマーの５’末端は，ヌクレオチド７５６４（Ｇ）または７５６３（Ａ）であることができる。好ましい態様においては，リバースプライマーの３’末端はヌクレオチド７５８５（Ｇ），７５８６（Ａ），７５８７（Ｇ）または７５８８（Ｃ）であることができる。プライマーは，好ましくはＨＲ１領域からそれ以上離れていないものであり，さもなくば，配列があまり保存されていないＨｌＶ配列位置に配置されて，あまり強固でない配列決定プライマーセットを与える。プライマーは好ましくはＨＲ１領域にそれ以上近くないものであり，さもなくばプライマーのすぐ後の十分な初期配列を与えることができず，ＨＲ１位置に到達する前に配列データを解析することができない。
【０１１８】
上述のプライマーの組み合わせは，本発明にしたがう方法において，ＨＩＶ−１ウイルスを含むと疑われるサンプルについて，ウイルスのサブタイプおよびジェノタイプを評価するために用いることができる。
【０１１９】
この方法は，サンプルを処理してウイルスＲＮＡを回収し；回収したウイルスＲＮＡを逆転写し；逆転写産物を配列決定し；そして，配列決定工程の結果を用いて試験したウイルスのジェノタイプを確立する，の各工程を含む。この方法においては，逆転写工程および配列決定工程のいずれかまたは両方を，上述のプライマーの組み合わせを用いて実施することができる。本発明の方法は，ＨＩＶのｇｐ４１領域における多型変種を評価するために，そして特にｇｐ４１のＨＲ１ドメインにおける多型変種を評価するために設計されたパラレルジェノタイピング法を実施する工程を含むことができる。あるいは，この方法は，先にｇｐ４１に特異的なジェノタイピング手順を用いてジェノタイピングを試みたが失敗したサンプルを用いて行うことができる。
【０１２０】
キット
本発明はまた，上述の方法を実施するのに必要でありかつ十分な試薬を含むキットを含む。１つの観点においては，本発明は，混合された長さ多型を有する病原体の複数の準種を含むサンプル中において病原体における興味の対象である変異の存在または非存在を検出するためのキットに関し，ここで，興味の対象である変異は，長さ多型に隣接して位置する。このキットは，興味の対象である変異を含むＤＮＡテンプレートの領域の第１の鎖を配列決定するための第１のプライマー，および興味の対象である変異を含むＤＮＡテンプレートの領域の第２の鎖を配列決定するための第２のプライマーを含み，ここで，第１のプライマーおよび第２のプライマーにより規定される（すなわち，これらを含みこれらの間の）領域には長さ多型が含まれない。
【０１２１】
別の観点においては，本発明は，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９，配列番号３０，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択される１またはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを含むキットに関する。
【０１２２】
さらに別の観点においては，本発明は，
（ａ）配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントの１またはそれ以上からなる群より選択されるフォワードプライマー；および
（ｂ）配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９，配列番号３０，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントの１またはそれ以上からなる群より選択されるリバースプライマー，
を含むキットに関する。
【０１２３】
さらに別の態様においては，本発明は，本質的に配列番号１のヌクレオチド７３２９−７６１４またはその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる領域に対応するプライマー伸長産物を生成することができるオリゴヌクレオチドプライマーを含むキットに関する。
【０１２４】
さらに別の態様においては，本発明は，オリゴヌクレオチドプライマーを含むキットに関し，ここで，プライマーは，本質的に配列番号１のヌクレオチド７３８８−７５４９またはその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる領域に対応するプライマー伸長産物を生成することができる。
【０１２５】
さらに別の態様においては，本発明は，オリゴヌクレオチドプライマーを含むキットに関し，ここで，プライマーは，本質的に配列番号１のヌクレオチド７４９２−７５２２またはその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる領域に対応するプライマー伸長産物を生成することができる。
【０１２６】
さらに別の態様においては，本発明は，オリゴヌクレオチドプライマーを含むキットに関し，ここで，プライマーは，配列番号３１，配列番号３２，配列番号３３，配列番号３４，配列番号３５，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択される。
【０１２７】
さらに別の態様においては，本発明は，本質的に配列番号１のヌクレオチド７３２９−７６１４またはその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる領域を囲む双方向配列決定プライマーのセットを含むプライマーの組み合わせを含むキットに関する。
【０１２８】
さらに別の態様においては，本発明は，プライマーの組み合わせを含むキットに関し，ここで，双方向配列決定プライマーのセットは，本質的に配列番号１のヌクレオチド７３８８−７５４９またはその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる領域を囲む。
【０１２９】
さらに別の態様においては，本発明は，プライマーの組み合わせを含むキットに関し，ここで，双方向配列決定プライマーのセットは，本質的に配列番号１のヌクレオチド７４９２−７５２２またはその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる領域を囲む。
【０１３０】
さらに別の態様においては，本発明は，プライマーの組み合わせを含むキットに関し，ここで，双方向一次配列決定プライマーのセットは，配列番号３１，配列番号３２，配列番号３３，配列番号３４，配列番号３５，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択される２またはそれ以上のプライマーを含む。
【０１３１】
さらに別の態様においては，本発明は，プライマーの組み合わせを含むキットに関し，ここで，双方向配列決定プライマーのセットは，
（ａ）配列番号３１および配列番号３２，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つのフォワードプライマー，および
（ｂ）配列番号３３，配列番号３４，配列番号３５，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つのリバースプライマー
を含む。
【０１３２】
以下の実施例は，本発明の特定の態様を例示する。
【実施例】
【０１３３】
実施例１
以下の実施例は，ｇｐ４１のＨＲ１領域中の一次配列決定プライマーセット（ＥＣ７７１９Ｆ，ＥＣ８３１ＩＲ）および二次配列決定プライマーセット（ＷＰ８７４６Ｆ，ＷＰ８９６０ＲＢおよび／またはＷＰ８７４６ＲＣ）を用いた，長さ多型を含む混合集団を示す臨床血漿サンプルからの双方向（二重鎖）配列決定を示す。フォワード鎖一次配列決定プライマーのみを用いて得られた，長さ多型を有するかまたは有しないほぼ等量の混合物の複雑な配列痕跡は，決定的な結果を示さなかった。得られた重ね合わせピークは，日常的な分析によっては解析ができない。下記に示されるように，二次プライマーセットを使用することにより，ただちに使用可能な双方向結果が得られた。
【０１３４】
ＲＴ−ＰＣＲおよびＣＬＩＰ配列決定条件を組み合わせた代表的なセットを用いて，以下のプライマーを用いて，質の高い配列データが得られた：
ＥＭＦ１（５’−ＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧＧＣ−３’），および
ＥＭＲ１（５’−ＣＣＴＴＧＴＡＡＧＴＣＡＴＴＧＧＴＣＴＴＡＡＡＧＧＴＡＣＣ−３’）（ＲＴ−ＰＣＲプライマー）；
ＥＣ７７１９Ｆ（５’−ＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＧＧ−３’），および
ＥＣ８３１１Ｒ（３’−ｇｔａｇｇａｇｇｃｔｔｇａｔａｇｇｔｔｔａａｇ−５’）（ＣＬＩＰプライマー）；および
ＷＰ８７４６Ｆ（５’−ＴＴＧＧＧＴＴＣＴＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧ−３’），
ＷＰ８９６０ＲＢ（５’−ＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＧＴＴＴＴＣＣＡＧＡＧ−３’）および／または
ＷＰ８７４６ＲＣ（５’−ＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＧＴＴＴＴＣＣＡＧＡＧＣ−３’）（ＣＬＩＰプライマー）
【０１３５】
以下の材料を用いた：
ＲＴ−ＰＣＲ試薬：ＴＲＵＧＥＮＥ ＨＩＶキット
ＣＬＩＰ試薬：ＶＧ３０００１コア配列決定キット
ＲＴ−ＰＣＲプライマー：
ＥＭＦｌ（未標識）３０μＭ
ＥＭＲｌ（未標識）３０μＭ
ＣＬＩＰプライマー：
ＥＣ７７１９Ｆ（Ｃｙ５．５）３μＭ
ＥＣ８３１１Ｒ（Ｃｙ５．０）３μＭ
ＥＣ８３１ＩＲ（未標識）３μＭ
【０１３６】
ウイルスＲＮＡ用ＴＲＵＰＲＥＰ抽出キットの包装中の指針にしたがって，患者血漿サンプルからＲＮＡを抽出した。
【０１３７】
ｇｐ４１領域のＲＴ−ＰＣＲ増幅のためには，以下の試薬を用いた：
【表１】
【０１３８】
マスターミックスＩおよびＩＩは使用まで氷上に保持した。１６μＬのマスターミックスＩを各ＰＣＲチューブの底に小分けした。マスターミックスＩを有するＰＣＲプレートに各１０μＬの抽出ＲＮＡサンプルをピペットで入れた。次にチューブをサーモサイクラーに入れた。５０℃サイクル１回の５分後，サーモサイクラーを休止し，１４μＬのマスターミックスＩＩを各ウエルに加えた。次に，以下のプロトコルにしたがって，サーモサイクラープログラムを再開する：
１ｘ ９０℃，２分間，
５０℃，２０分間
注：上述の５０℃の工程後に５分間の休止をおいて，マスターミックスＩＩを加える。
９４℃で２分間，
３７ｘ ９４℃で３０秒間，
６０℃で３０秒間，
６８℃で２分間），
１ｘ ６８℃で７分間
４０℃で次の作業まで保持する。
【０１３９】
次に，得られたＰＣＲ増幅産物を以下のようにしてＣＬＩＰ配列決定法を用いて配列決定した。まず，７．００μＬのＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ酵素を６３μＬの酵素希釈バッファで１０倍に希釈して，総容量を７０．００μＬとした。次に，１１．５０μＬの標識ＥＣ８３１１Ｒ（３μＬ）リバースプライマーを１１．５０μＬの未標識ＥＣ８３１１Ｒ（３μＬ）リバースプライマーで５０％に希釈して，総容量を２３．００μＬとした。次に，以下のようにしてｇｐ４１ＣＬＩＰマスターミックスを調製した。
【０１４０】
【表２】
【０１４１】
１７μＬのＣＬＩＰマスターミックスを配列決定すべき増幅産物各５μＬに加えた。次に３μＬのターミネーションミックスＡ，Ｃ，Ｇ，Ｔを各配列決定チューブにピペットで加えた。
【０１４２】
５μＬのマスターミックス／増幅産物をターミネーションミックスを含む各配列決定チューブにピペットで加えた。次に，以下のＣＬＩＰ配列決定熱サイクルプログラムを用いてミックスを配列決定した：
１ｘ ９４℃，５分間，
（３０）ｘ ９４℃，２０秒間，
６０℃，２０秒間，
７０℃，１．５分間，
１ｘ ７０℃，５分間，
４℃で保持。
【０１４３】
配列決定が完了したら，６μＬのストップローディング染料を各チューブに加えた。サンプルを９４℃で２分間加熱し，氷上で急冷し，穏やかにボルテックスすることによりよく混合した。２μＬをＭｉｃｒｏｃｅｌ（登録商標）カセットの各ウエルに負荷した。次に，製造元により供給されたＬＲ Ｔｏｗｅｒ設定および負荷のＴＲＵＧＥＮＥプロトコルにしたがって，Ｍｉｃｒｏｃｅｌ５００および６％のＳｕｒｅｆｉｌｌを用いて，２０００Ｖ，５０％レーザー出力，実行時間７０分間で自動ＤＮＡ配列決定を行った。
【０１４４】
以下の表１および表２は，合わせたＨＲ１およびＨＲ２領域（表１）の配列決定およびＨＲ１領域のみ（表２）の配列決定の結果の分析を示す。表１に示されるように，"不明瞭マッチ"のカラムは，ＦＡＳＴＡファイルのそれぞれにおける位置において不明瞭なベースコールを有する少なくとも１つの塩基またはコードと一致する。
【０１４５】
【表３】
【０１４６】
上述のデータは，ＨＩＶ−１のＨＲ１およびＨＲ２領域を囲むプライマーが，広範囲のＨＩＶ変種について配列データを取得することができることを示す。
【０１４７】
表２は，プライマーがＨＲ１領域のみを囲む本発明の好ましい観点においては，ＨＲ１領域中の不明瞭なマッチが少ないために，編集工程が少なくなり，全体的な整合性が高くなることを示す。
【０１４８】
【表４】
【０１４９】
特定の患者サンプルに関しては，ＥＣプライマーセットおよびＷＰプライマーセットの両方を用いてサンプル２８９４２からの配列トレースを生成した。ＥＣプライマーセットのみを用いて生成した配列データから，読み取り可能でありかつ確認できる配列データが得られた。これは，一方の方向からでは読み取ることができず，その結果，確認することができない不明確な結果が得られた。しかし，サンプル２８９４２をＷＰプライマーセットで分析したところ，不明確なデータはアンチセンス鎖配列を用いて確認することができた。
【０１５０】
上述のデータは，本質的にＨＲ１ドメインからなる領域を本発明のプライマーを用いて配列決定することにより，有意に少ない不明瞭性およびミスマッチ，および改良された正確性および一致度をもつ配列決定結果が得られたことを示す。例えば，エンフビルチド（ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ）（ＦＵＺＥＯＮ（商標）またはＴ−２０）治療に伴う耐性変異（ＨＲ１）について特に興味深い領域において生成したＨＩＶ−１ ｇｐ４１配列決定データの以下の例は，標準的設計のプライマー（ＥＣ）および新規プライマー（ＷＰ）を用いたデータを含む。一般に，外側プライマーの１つと興味の対象である変異との間で生ずる任意の混合された長さの多型変異は，重複および読み枠外配列が生成するために，配列の質の低下を引き起こす。本発明のプライマーは，この問題点を回避し，興味の対象である領域中で質の高い双方向配列データを与え，ＨＲ１中で生ずる任意の変異のアンチセンス鎖の確認を可能とする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ−１のＨＲ１およびＨＲ２ドメインを含む領域を囲む双方向配列決定プライマーのセットを含むプライマーの組み合わせであって，
プライマーの組み合わせは，
（ａ）配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントの１またはそれ以上からなる群より選択されるフォワードプライマー；および
（ｂ）配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９，配列番号３０，および１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントの１またはそれ以上からなる群より選択されるリバースプライマー，
を含むプライマーの組み合わせ。
【請求項２】
プライマーの組み合わせは，本質的に配列番号１のヌクレオチド７３２９−７６１４またはその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる領域を囲む双方向配列決定プライマーのセットを含む，請求項１記載のプライマーの組み合わせ。
【請求項３】
双方向配列決定プライマーのセットが，本質的に配列番号１のヌクレオチド７３８８−７５４９またはその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる領域を囲む，請求項２記載のプライマーの組み合わせ。
【請求項４】
双方向配列決定プライマーのセットが，本質的に配列番号１のヌクレオチド７４９２−７５２２またはその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる領域を囲む，請求項３記載のプライマーの組み合わせ。
【請求項５】
双方向一次配列決定プライマーのセットが，配列番号３１，配列番号３２，配列番号３３，配列番号３４，配列番号３５，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択される２またはそれ以上のプライマーを含む，請求項４記載のプライマーの組み合わせ。
【請求項６】
双方向配列決定プライマーのセットが，
（ａ）配列番号３１および配列番号３２，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つのフォワードプライマー，および
（ｂ）配列番号３３，配列番号３４，配列番号３５，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つのリバースプライマー，
を含む，請求項５記載のプライマーの組み合わせ。
【請求項７】
病原体の核酸中で興味の対象である変異の存在または非存在を検出する方法であって，ここで，興味の対象である変異は，病原体の複数の準種を規定する長さ多型に隣接して位置しており，該方法は，
ａ）患者サンプルから興味の対象である変異を包含する二本鎖ＤＮＡテンプレートを取得し；
ｂ）ＤＮＡテンプレートの興味の対象である変異を含む領域の第１の鎖を配列決定し；
ｃ）ＤＮＡテンプレートの興味の対象である変異を含む領域の第２の鎖を配列決定し，ここで，ＤＮＡテンプレートの配列決定された領域の第１の鎖および第２の鎖に共通する領域は長さ多型を含まず；そして
ｄ）第１の鎖の配列を第２の鎖の配列と比較して，興味の対象である変異の配列の相補鎖確認を得る，ことを含む方法。
【請求項８】
病原体がＨＩＶ−１である，請求項７記載の方法。
【請求項９】
興味の対象である変異が，ＨＩＶ−１エンベロープ糖蛋白質ｇｐ４１中に存在する，請求項８記載の方法。
【請求項１０】
興味の対象である変異が，ｇｐ４１の３６位−４５位の間に存在する，請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ＤＮＡテンプレートの配列決定された第１の鎖および第２の鎖に共通する領域が，本質的に配列番号１のヌクレオチド７３２９−７６１４またはその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる長さ多型を含まない，請求項７記載の方法。
【請求項１２】
ＤＮＡテンプレートの配列決定された第１の鎖および第２の鎖に共通する領域が，本質的に配列番号１のヌクレオチド７３８８−７５４９またはその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる長さ多型を含まない，請求項７記載の方法。
【請求項１３】
ＤＮＡテンプレートの配列決定された第１の鎖および第２の鎖に共通する領域が，本質的に配列番号１のヌクレオチド７４９２−７５２２またはその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる長さ多型を含まない，請求項７記載の方法。
【請求項１４】
配列が，配列番号３１，配列番号３２，配列番号３３，配列番号３４，配列番号３５，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択される１またはそれ以上のプライマーからなる群より選択されるプライマーを用いて決定される，請求項７記載の方法。
【請求項１５】
配列が，配列番号３１，配列番号３２，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択される１またはそれ以上のプライマーを含むフォワードプライマー，および配列番号３３，配列番号３４，配列番号３５，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択される１またはそれ以上のプライマーを含むリバースプライマーを用いて決定される，請求項７記載の方法。
【請求項１６】
配列が，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０５配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９，配列番号３０，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択されるプライマーを用いて決定される，請求項７記載の方法。
【請求項１７】
配列が，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントの１またはそれ以上からなる群より選択されるフォワードプライマーを用いて決定される，請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
プライマーが，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９，配列番号３０，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントの１またはそれ以上からなる群より選択されるリバースプライマーである，請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
ＨＩＶ−１のＨＲ１およびＨＲ２ドメインを包含する領域を囲む双方向配列決定プライマーのセットを含むプライマーの組み合わせを含み，ここで，プライマーの組み合わせは，
（ａ）配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントの１またはそれ以上からなる群より選択されるフォワードプライマー；および
（ｂ）配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９，配列番号３０，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントの１またはそれ以上からなる群より選択されるリバースプライマー
を含む，請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
混合された長さ多型を有する病原体の複数の準種を含むサンプルにおいて，病原体中の興味の対象である変異の存在または非存在を検出するためのキットであって，ここで，興味の対象である変異は長さ多型に隣接して位置しており，該キットは，ＤＮＡテンプレートの興味の対象である変異を含む領域の第１の鎖を配列決定するための第１のプライマー，およびＤＮＡテンプレートの興味の対象である変異を含む領域の第２の鎖を配列決定するための第２のプライマーを含み，ここで，第１のプライマーおよび第２のプライマーにより規定される領域は長さ多型を含まない，ことを特徴とするキット。
【請求項２１】
キットが，配列番号３１，配列番号３２，配列番号３３，配列番号３４，配列番号３５，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択される１またはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを含む，請求項２０記載のキット。
【請求項２２】
キットが，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９，配列番号３０，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択される１またはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを含む，請求項２１記載のキット。
【請求項１】
ＨＩＶ−１のＨＲ１およびＨＲ２ドメインを含む領域を囲む双方向配列決定プライマーのセットを含むプライマーの組み合わせであって，
プライマーの組み合わせは，
（ａ）配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントの１またはそれ以上からなる群より選択されるフォワードプライマー；および
（ｂ）配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９，配列番号３０，および１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントの１またはそれ以上からなる群より選択されるリバースプライマー，
を含むプライマーの組み合わせ。
【請求項２】
プライマーの組み合わせは，本質的に配列番号１のヌクレオチド７３２９−７６１４またはその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる領域を囲む双方向配列決定プライマーのセットを含む，請求項１記載のプライマーの組み合わせ。
【請求項３】
双方向配列決定プライマーのセットが，本質的に配列番号１のヌクレオチド７３８８−７５４９またはその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる領域を囲む，請求項２記載のプライマーの組み合わせ。
【請求項４】
双方向配列決定プライマーのセットが，本質的に配列番号１のヌクレオチド７４９２−７５２２またはその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる領域を囲む，請求項３記載のプライマーの組み合わせ。
【請求項５】
双方向一次配列決定プライマーのセットが，配列番号３１，配列番号３２，配列番号３３，配列番号３４，配列番号３５，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択される２またはそれ以上のプライマーを含む，請求項４記載のプライマーの組み合わせ。
【請求項６】
双方向配列決定プライマーのセットが，
（ａ）配列番号３１および配列番号３２，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つのフォワードプライマー，および
（ｂ）配列番号３３，配列番号３４，配列番号３５，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択される少なくとも１つのリバースプライマー，
を含む，請求項５記載のプライマーの組み合わせ。
【請求項７】
病原体の核酸中で興味の対象である変異の存在または非存在を検出する方法であって，ここで，興味の対象である変異は，病原体の複数の準種を規定する長さ多型に隣接して位置しており，該方法は，
ａ）患者サンプルから興味の対象である変異を包含する二本鎖ＤＮＡテンプレートを取得し；
ｂ）ＤＮＡテンプレートの興味の対象である変異を含む領域の第１の鎖を配列決定し；
ｃ）ＤＮＡテンプレートの興味の対象である変異を含む領域の第２の鎖を配列決定し，ここで，ＤＮＡテンプレートの配列決定された領域の第１の鎖および第２の鎖に共通する領域は長さ多型を含まず；そして
ｄ）第１の鎖の配列を第２の鎖の配列と比較して，興味の対象である変異の配列の相補鎖確認を得る，ことを含む方法。
【請求項８】
病原体がＨＩＶ−１である，請求項７記載の方法。
【請求項９】
興味の対象である変異が，ＨＩＶ−１エンベロープ糖蛋白質ｇｐ４１中に存在する，請求項８記載の方法。
【請求項１０】
興味の対象である変異が，ｇｐ４１の３６位−４５位の間に存在する，請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ＤＮＡテンプレートの配列決定された第１の鎖および第２の鎖に共通する領域が，本質的に配列番号１のヌクレオチド７３２９−７６１４またはその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる長さ多型を含まない，請求項７記載の方法。
【請求項１２】
ＤＮＡテンプレートの配列決定された第１の鎖および第２の鎖に共通する領域が，本質的に配列番号１のヌクレオチド７３８８−７５４９またはその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる長さ多型を含まない，請求項７記載の方法。
【請求項１３】
ＤＮＡテンプレートの配列決定された第１の鎖および第２の鎖に共通する領域が，本質的に配列番号１のヌクレオチド７４９２−７５２２またはその１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる長さ多型を含まない，請求項７記載の方法。
【請求項１４】
配列が，配列番号３１，配列番号３２，配列番号３３，配列番号３４，配列番号３５，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択される１またはそれ以上のプライマーからなる群より選択されるプライマーを用いて決定される，請求項７記載の方法。
【請求項１５】
配列が，配列番号３１，配列番号３２，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択される１またはそれ以上のプライマーを含むフォワードプライマー，および配列番号３３，配列番号３４，配列番号３５，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択される１またはそれ以上のプライマーを含むリバースプライマーを用いて決定される，請求項７記載の方法。
【請求項１６】
配列が，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０５配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９，配列番号３０，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択されるプライマーを用いて決定される，請求項７記載の方法。
【請求項１７】
配列が，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントの１またはそれ以上からなる群より選択されるフォワードプライマーを用いて決定される，請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
プライマーが，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９，配列番号３０，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントの１またはそれ以上からなる群より選択されるリバースプライマーである，請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
ＨＩＶ−１のＨＲ１およびＨＲ２ドメインを包含する領域を囲む双方向配列決定プライマーのセットを含むプライマーの組み合わせを含み，ここで，プライマーの組み合わせは，
（ａ）配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントの１またはそれ以上からなる群より選択されるフォワードプライマー；および
（ｂ）配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９，配列番号３０，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントの１またはそれ以上からなる群より選択されるリバースプライマー
を含む，請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
混合された長さ多型を有する病原体の複数の準種を含むサンプルにおいて，病原体中の興味の対象である変異の存在または非存在を検出するためのキットであって，ここで，興味の対象である変異は長さ多型に隣接して位置しており，該キットは，ＤＮＡテンプレートの興味の対象である変異を含む領域の第１の鎖を配列決定するための第１のプライマー，およびＤＮＡテンプレートの興味の対象である変異を含む領域の第２の鎖を配列決定するための第２のプライマーを含み，ここで，第１のプライマーおよび第２のプライマーにより規定される領域は長さ多型を含まない，ことを特徴とするキット。
【請求項２１】
キットが，配列番号３１，配列番号３２，配列番号３３，配列番号３４，配列番号３５，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択される１またはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを含む，請求項２０記載のキット。
【請求項２２】
キットが，配列番号２，配列番号３，配列番号４，配列番号５，配列番号６，配列番号７，配列番号８，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４，配列番号１５，配列番号１６，配列番号１７，配列番号１８，配列番号１９，配列番号２０，配列番号２１，配列番号２２，配列番号２３，配列番号２４，配列番号２５，配列番号２６，配列番号２７，配列番号２８，配列番号２９，配列番号３０，およびそれらの１５またはそれ以上のヌクレオチドのフラグメントからなる群より選択される１またはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを含む，請求項２１記載のキット。
【公表番号】特表２００８−５１０４６７（Ｐ２００８−５１０４６７Ａ）
【公表日】平成２０年４月１０日（２００８．４．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２８０５５（Ｐ２００７−５２８０５５）
【出願日】平成１７年８月１９日（２００５．８．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２９６１８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２３７６８
【国際公開日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【出願人】（５０３１０６１１１）バイエル・ヘルスケア・エルエルシー (154)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年４月１０日（２００８．４．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月１９日（２００５．８．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２９６１８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２３７６８
【国際公開日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【出願人】（５０３１０６１１１）バイエル・ヘルスケア・エルエルシー (154)
【Ｆターム（参考）】
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