関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法、並びにその利用
【課題】本発明は、新たな関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法、並びにその利用を提供する。
【解決手段】本発明において、体内時計遺伝子の発現量の異常は、関節リウマチを発症させる原因となるc-fos遺伝子およびWee1キナーゼの発現に影響を与え、その結果、関節リウマチを発症させることを明らかにした。この知見を基づき、生体から分離した試料を用いて、体内時計遺伝子の発現を評価し、その体内時計遺伝子の発現を指標として関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性を判定する方法を確立した。本発明によれば、関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性を、簡便かつ客観的に判定することができる。
【解決手段】本発明において、体内時計遺伝子の発現量の異常は、関節リウマチを発症させる原因となるc-fos遺伝子およびWee1キナーゼの発現に影響を与え、その結果、関節リウマチを発症させることを明らかにした。この知見を基づき、生体から分離した試料を用いて、体内時計遺伝子の発現を評価し、その体内時計遺伝子の発現を指標として関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性を判定する方法を確立した。本発明によれば、関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性を、簡便かつ客観的に判定することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法、並びにその利用に関するものであって、特に、関節リウマチの発症に関連する遺伝子の発現量を測定することにより関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性を判定する方法、並びにその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（rheumatoid arthritis、以下「ＲＡ」ともいう）は、多発するびらん性関節炎を主な特徴とするが、同時に多臓器を障害する原因不明の全身性炎症疾患である。ＲＡは寛解と増悪とを繰り返しながら慢性に進行し、無治療で放置すると関節の破壊や変形を来し、やがて運動器の機能障害を呈してくる。
【０００３】
ＲＡの原因である関節炎と関節破壊の様相、特にそれらの病理過程は、種々の研究を通じて次第に明らかになりつつあるが、ＲＡは生活環境を含めた多数の原因因子が重なり合ってはじめて疾患へと発展・増悪する疾患である。そのため、疾患の正しい解明と適切な診断や治療とを行うには、多因子相互作用の本体そのものが明らかにされなければならない。
【０００４】
このような状況下において、近年、本発明者らは、ＲＡの発症病因・病態を研究する中で、ＲＡの病態の主軸にc-fos遺伝子の過剰活性化による関節滑膜細胞やＴリンパ球の過剰活性化があることを明らかにした。具体的には、ＲＡでは、c-fos遺伝子の発現が過剰であるため、p21waf1/cip1が低下して細胞は強く増殖することを明らかにした（非特許文献１を参照）。
【０００５】
これとは別に、本発明者らは、c-fos遺伝子発現細胞を長い間培養していると、次第に４倍体の核をもつ細胞が増加し、その原因は、Wee1キナーゼの亢進であることを明らかにしている。
【０００６】
一般に、細胞分裂開始の引き金は、mitosis promoting factor（以下、「ＭＰＦ」ともいう）分子によって引かれる。ＭＰＦはサイクリンＢとcdc2分子とからなる複合体である。ＭＰＦは、cdc2分子の１５番目のチロシンがリン酸化されると不活性型となり、脱リン酸化されると活性型となって細胞分裂が始まる。上記Wee1キナーゼは、cdc2分子の１５番目のチロシンをリン酸化するものである。
【０００７】
また、上記c-fos遺伝子については、リンパ球などの増殖性細胞において、G1前期にimmediate early geneとしてごく短時間だけ一過的に転写されることが以前から知られている。しかし、なぜc-fos遺伝子がこの時期にだけ一過的に増減するのか、その生理学的な意義については不明であった。
【０００８】
近年、本発明者らは、細胞分裂のG1前期にc-Fosタンパク質がwee1遺伝子のプロモーターに作用してWee1キナーゼの発現量を一過的に増加させる直接の転写シグナル経路が存在することを明らかにした（非特許文献２を参照）。これにより、c-fos遺伝子は、細胞を増殖に向かわせると同時に、Wee1キナーゼの発現量を増加させて細胞分裂を一過的に阻止することを明らかとなった。つまり、生体では、このようなメカニズムを有することにより、細胞がＧ１前期からＳ期にあって盛んにＤＮＡを合成している時に、誤って細胞が分裂を起こさないように制御されているのである。
【０００９】
しかし、ＲＡではその病態として、上述したようにc-fos遺伝子が持続的に過剰発現している。したがって、c-fos遺伝子の発現の亢進に連動してwee-lキナーゼの発現も亢進することとなる。この結果、c-fos遺伝子の過剰発現の効果で細胞が過剰増殖するのに対して、Wee1キナーゼの発現活性化の効果によって細胞分裂が阻止されるという矛盾した、いわば腫瘍様の病態がＲＡにおいて見られることを本発明者はこれまでに独自に導き出しているのである。
【００１０】
また、ＲＡの病態には、ホルモン分泌異常が関与していることが知られている。その１つとして、視床下部−下垂体−副腎軸異常が挙げられる。これに関連して、本発明者らは、ＲＡ関節滑膜において、Urocortin（非特許文献３を参照）やＡＣＴＨ（非特許文献４を参照）が過剰発現されることを報告している。こういった事実は、ＲＡの増悪因子として体内ホルモンバランスの異常が作用する可能性を示すものである。しかし、体内ホルモンバランスの異常のみがＲＡに特有の滑膜増殖や骨軟骨破壊を導くものではない。
【００１１】
例えば、ＲＡの滑膜病変の進行には関節滑膜の慢性炎症が必須であるが、その際、c-fos遺伝子やc-myc遺伝子といった癌原遺伝子が活性化され、炎症の遷延化に関与することが知られている。（非特許文献５を参照）。
【００１２】
さらに、本発明者らは、c-fos遺伝子を過剰発現させたH2-c-fos遺伝子導入マウスにおいて実験的関節炎が重症化し、滑膜間葉系細胞にのみによる関節破壊が誘導されることを見出している（非特許文献６および７を参照）。
【００１３】
また、本発明者らは、ＲＡ滑膜細胞においてc-fos遺伝子が転写因子activator protein-1(AP-1)として機能した結果、細胞因子調節因子であるWee1キナーゼの発現を直接制御することを明らかにしている（非特許文献８）。
【００１４】
ところで、上述のWee1キナーゼは、体内時計遺伝子であるCry1遺伝子およびcry2遺伝子をノックアウトしたマウス（Cry1/2遺伝子ノックアウトマウス、以下「Cry1/2KOマウス」ともいう）では、過剰に発現していることが知られている（非特許文献９および１０を参照）。
【００１５】
上記体内時計遺伝子とは、体内時計を制御する遺伝子の総称である。体内時計は生物が地球の自転により起こる昼夜変化に適応するために獲得した基本形質であり、ヒトを含む哺乳類において特に発達している。体内時計のセンターは視床下部の小神経核である視交叉上核であるが、一方で皮膚をはじめ肝、腸管、腎などの臓器が個々に時計遺伝子を発現し、24時間周期の機能的変動を行う。
【００１６】
生体リズムの研究は近年、時計遺伝子が相次いで報告されたため急速に進展している。上記Cry1遺伝子およびcry2遺伝子は、転写抑制因子として働く時計遺伝子である。Cry1遺伝子およびcry2遺伝子以外の時計遺伝子としては、現在までにClock遺伝子、BMAL1遺伝子、Per1遺伝子、Per2遺伝子、Per3遺伝子、およびカゼインキナーゼ遺伝子が報告されている。これらの遺伝子群は、互いにその発現を調節しながら作用して体内ホルモンの分泌や代謝に日内リズムをもたらす。
【００１７】
上記Cry1/2KOマウスでは、さらに、暗環境（暗闇）においても活動と睡眠とを細切れに繰り返し、睡眠障害に基づく機能異常を表現する。視交叉上核からの時間シグナルは、神経系の特性を生かして視床下部の内分泌・自律神経系の諸核に出力される。また、脳からのびる交感神経・副交感神経は、直接また間接的に副腎を介して諸臓器に分布する細胞の時間シグナルを調節する。
【非特許文献１】Hikasa M, Yamamoto E, Kawasaki H, Komai K, Shiozawa K, Hashiramoto A, Miura Y, Shiozawa S. p21 is down-regulated in conjunction with up-regulation of c-Fos in the lymphocytes of rheumatoid arthritis patients. Biochem Biophys Res Commun 304:143-147, 2003.
【非特許文献２】Kawasaki H, Komai K, Ouyang Z, Murata M, Hikasa M, Ohgiri M, Shiozawa S. c-Fos/activator protein-1 transactivates wee 1 kinase at G1/S to inhibit premature mitosis in antigen-specific Th1 cells. EMBO J 20:4618-4627, 2001.
【非特許文献３】Kohno M, Kawahito Y, Tsubouchi Y, Hashiramoto A, 他８名Urocortin expression in synovium of patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis: relation to inflammatory activity. J Clin Endocrinol Metab. 2001 Sep;86(9):4344-52.
【非特許文献４】Miyazaki S, Yoshikawa T, Hashiramoto A, 他６名ACTH expression in synovium of patients with rheumatoid arthritis and Lewis rat with adjuvant arthritis. Mod Rheumatol 2002;12: 202-212.
【非特許文献５】Hashiramoto A, Sano H, 他８名C-myc antisense oligodeoxynucleotides can induce apoptosis and down-regulate Fas expression in rheumatoid synoviocytes. Arthritis Rheum. 1999 May;42(5):954-62.
【非特許文献６】Shiozawa S,他３名. Studies on the contribution of c-fos/AP-1 to arthritic joint destruction. J Clin Invest. 1997 Mar 15;99(6):1210-6.
【非特許文献７】Shiozawa S, Tanaka Y, Fujita T, Tokuhisa T. Destructive arthritis without lymphocyte infiltration in H2-c-fos transgenic mice. J Immunol 148:3100-3104, 1992.
【非特許文献８】Kawasaki H, Komai K, Nakamura M, Yamamoto E, Ouyang Z, Nakashima T, Morisawa T, Hashiramoto A, 他４名. Human wee1 kinase is directly transactivated by and increased in association with c-Fos/AP-1: rheumatoid synovial cells overexpressing these genes go into aberrant mitosis. Oncogene. 2003 Oct9;22(44):6839-44.
【非特許文献９】Okamura H, 他７名 Photic induction of mPer1 and mPer2 in cry-deficient mice lacking a biological clock.Science. 1999 Dec 24;286(5449):2531-4.
【非特許文献１０】Matsuo T et al. Control mechanism of the circadian clock for timing of cell division in vivo. Science 302:255-259, 2003.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
ＲＡにおいて、その本体が不明な症状として、古くから、ＲＡ患者に特有の性格が知られている。この特有の性格については、これまで多くの心理学的・精神医学的分析が多くなされてきたが、その本体は未だ解明されていない。上記「ＲＡ患者に特有の性格」とは、疑り深く頑固で容易に妥協しないといった類のものである。
【００１９】
ところで、上述したように、ＲＡでは、Wee1キナーゼの過剰発現が見られる。このWee1キナーゼの過剰発現は、上述したようにＲＡにおける腫瘍様の病態を呈するのに寄与するが、ＲＡ患者に対して、その他どのような影響を及ぼすものであるかについては、全く知られていない。
【００２０】
一方、上記Cry1/2KOマウスは、上述した特徴をもつことから、視交叉上核という神経核レベルの異常を起点に、睡眠障害と全身性に伝播される行動・ホルモン異常、さらに細胞周期調節因子（Wee1キナーゼ）異常を具現するモデルマウスと捉えることができる。
【００２１】
本発明者らは、上記２つの知見、すなわち、（１）ＲＡにおけるWee1キナーゼの過剰発現と、（２）睡眠障害をもつCry1/2KOマウスにおけるWee1キナーゼの過剰発現とから、ＲＡにおいて、Wee1キナーゼが過剰発現することにより、睡眠異常という病態が現れることに起因して、上記のＲＡ患者に特有の性格が形成される可能性があることを独自に考え出した。しかしながら、これまで、ＲＡ患者における不眠は、疼痛によるものと考えられており、ＲＡと睡眠異常との関係を分子生物学的手法を用いて、生化学的に解析した研究例は全くない。
【００２２】
本発明は、上記問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、ＲＡと睡眠異常との関係を生化学的に明らかにし、その知見を基づいて、新たな関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法、並びにその利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、Cry1/2KOマウスは滑膜増殖を起こしやすい表現型を示し、重度の関節炎を発症するとともに、睡眠異常を引き起こすWee1キナーゼの活性上昇が見られることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、産業上有用な以下の発明を包含する。
【００２４】
（１）生体から分離した試料を用いて、体内時計遺伝子の発現を評価する工程を含むことを特徴とする関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法。
【００２５】
（２）体内時計遺伝子が、Cry1遺伝子、Cry2遺伝子、Clock遺伝子、BMAL1遺伝子、Per1遺伝子、Per2遺伝子、Per3遺伝子、およびカゼインキナーゼ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子であることを特徴とする（１）に記載の関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法。
【００２６】
（３）Wee1キナーゼの発現量を測定する工程をさらに含むことを特徴とする（１）または（２）に記載の関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法。
【００２７】
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載の関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法を実施するために用いるキットであって、体内時計遺伝子の発現量を測定するために用いるプライマー、プローブ、および抗体のうち、少なくとも１つを含有することを特徴とする関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定キット。
【００２８】
（５）さらに、Wee1キナーゼの発現量を測定するために用いるプライマー、プローブ、および抗体のうち、少なくとも１つを含有することを特徴とする（４）に記載の関節リウマチの発症またはその可能性の判定キット。
【００２９】
（６）体内時計遺伝子に異常が見られ、Wee1キナーゼの発現量が過剰に上昇していることを特徴とする関節リウマチ発症モデル動物。
【００３０】
（７）上記体内時計遺伝子の異常が、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子の破壊であることを特徴とする（６）に記載の関節リウマチ発症モデル動物。
【００３１】
（８）Wee1キナーゼの発現量が過剰に上昇するように体内時計遺伝子を操作する工程を含むことを特徴とする関節リウマチ発症モデル動物の製造方法。
【００３２】
（９）上記体内時計遺伝子の操作が、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子の破壊であることを特徴とする（８）に記載の関節リウマチ発症モデル動物の製造方法。
【００３３】
（１０）（６）または（７）に記載の関節リウマチ発症モデル動物に、被験化合物を投与する工程と、当該被験化合物を投与された関節リウマチ発症モデル動物における関節リウマチのマーカーを測定する工程とを含むことを特徴とする関節リウマチの治療薬剤のスクリーニング方法。
【００３４】
（１１）上記被験化合物が、Wee1キナーゼの発現を阻害することが期待される化合物またはWee1キナーゼの活性を阻害することが期待される化合物であることを特徴とする（１０）に記載の関節リウマチの治療薬剤のスクリーニング方法。
【００３５】
（１２）睡眠障害を改善する物質を含有することを特徴とする関節リウマチの治療薬剤。
【００３６】
（１３）Wee1キナーゼの発現量を抑制することを特徴とする（１２）に記載の関節リウマチの治療薬剤。
【発明の効果】
【００３７】
本発明にかかる関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法は、以上のように、体内時計遺伝子の発現量を指標とするものである。それゆえ、簡便に、かつ客観的に関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性を判定できるという効果を奏する。
【００３８】
また、本発明にかかる関節リウマチ発症モデル動物は、体内時計遺伝子が操作されることにより、Wee1キナーゼの発現量およびc-fos遺伝子の発現量が上昇しているため、関節リウマチを発症している。それゆえ、新たな関節リウマチの治療薬剤や、治療方法の開発に好適に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本発明者らは、関節リウマチ（rheumatoid arthritis、以下「ＲＡ」ともいう）患者に見られる不眠症状は、疼痛によるものだけではなく、体内時計の異常により引き起こされることを独自に見出した。具体的には、本発明者らは、これまでに、ＲＡ患者では、c-fos遺伝子の過剰活性化により、Wee1キナーゼの発現が上昇することにより、関節滑膜細胞やＴリンパ球が過剰活性化されることを見出していた。しかし、このWee1キナーゼの過剰発現が、ＲＡ患者において、そのほかにどのような症状を引き起こしているかについては全く知られていなかった。
【００４０】
そこで、c-fos遺伝子の過剰活性化以外の方法で、Wee1キナーゼの過剰発現を誘導した実験動物を用いて、ＲＡを発症するかを検証した。c-fos遺伝子の過剰活性化以外の方法として、本発明者らは、体内時計遺伝子であるCry1遺伝子およびCry2遺伝子を破壊する方法を用いた。
【００４１】
マウスにおいて、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子を破壊すると、Wee1キナーゼが過剰発現し、睡眠障害を引き起こすことは知られていたが、ＲＡを発症するか否かについては全く検討もなされていなかった。
【００４２】
上記の検証の結果、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子を破壊したマウスにおいて、ＲＡが発症されることが分かった。こうして、本発明者らは、これまで全く予測もされていなかった体内時計異常とＲＡ発症との相関を明らかにし、本発明を完成させるに至った。
【００４３】
以下、本発明の実施形態について、説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４４】
＜１．ＲＡの発症またはその可能性の判定方法＞
本発明にかかるＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法は、生体から分離した試料を用いて、体内時計遺伝子の発現を評価する工程を含んでいればよく、その他の具体的な工程や、使用する器具および装置は特に限定されるものではない。
【００４５】
本明細書において、上記体内時計遺伝子とは、体内時計を制御する遺伝子を意味する。また、上記「体内時計」とは、生物が地球の自転により起こる昼夜変化に適応するために獲得した基本形質を意味する。体内時計のセンターは視床下部の小神経核である視交叉上核である。一方で、皮膚をはじめ肝、腸管、腎などの臓器では個々に体内時計遺伝子が発現し、それら遺伝子が互いにその発現を調節しながら作用して体内ホルモンの分泌や代謝に日内リズムをもたらす。その結果として、生体内では、24時間周期の機能的変動が起こる。このような体内時計が正常でなくなると、睡眠障害等の症状が現れる。逆に言えば、睡眠障害がある場合、当該生物では、体内時計に異常がある可能性があると判断することができる。
【００４６】
本発明において、上記体内時計遺伝子は特に限定されるものではなく、Cry1遺伝子、Cry2遺伝子、Clock遺伝子、BMAL1遺伝子、Per1遺伝子、Per2遺伝子、Per3遺伝子、およびカゼインキナーゼ遺伝子等を挙げることができる。本発明にかかるＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法においては、上記例示したような体内時計遺伝子から、少なくとも１つ以上の遺伝子の発現量を測定すればよい。
【００４７】
上記Cry1遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０３１７９７やＮＰ＿００４０６６に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００７７７１に登録されている塩基配列の５８４番目から２４０４番目までの塩基配列をオープンリーディングフレーム（以下、「ＯＲＦ」ともいう）として有する遺伝子や、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００４０７５に登録されている塩基配列の５８７番目から２３４７番目までの塩基配列をＯＲＦとして有する遺伝子を例示することができる。
【００４８】
また、上記Cry2遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０３４０９３やＮＰ＿０６６９４０に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００９９６３に登録されている塩基配列の６番目から１７８４番目までの塩基配列をＯＲＦとして有する遺伝子や、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０２１１１７に登録されている塩基配列の１４番目から１７９５番目までの塩基配列をＯＲＦとして有する遺伝子を例示することができる。
【００４９】
上記Clock遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０３１７４１やＮＰ＿００４８８９に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００７７１５に登録されている塩基配列の３８９番目から２９５６番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子や、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００４８９８に登録されている塩基配列の３３９番目から２８７９番目までの塩基配列をＯＲＦとして有する遺伝子を例示することができる。
【００５０】
上記BMAL1遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＡ１９９３５に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＢ０００８１２に登録されている塩基配列の４１番目から１９２１番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子を例示することができる。
【００５１】
上記Per1遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０３５１９５やＮＰ＿００２６０７に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１１０６５に登録されている塩基配列の２２６番目から４１０１番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子や、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００２６１６に登録されている塩基配列の１８８番目から４０６０番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子を例示することができる。
【００５２】
上記Per2遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０３５１９６やＮＰ＿０７３７２８に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１１０６６に登録されている塩基配列の１４５番目から３９１８番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子や、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０２２８１７に登録されている塩基配列の１２３番目から３８９０番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子を例示することができる。
【００５３】
上記Per3遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０３５１９７やＮＰ＿０５８５１５に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１１０６７に登録されている塩基配列の３５８番目から３６９９番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子や、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１６８３１に登録されている塩基配列の１７６番目から３７８１番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子を例示することができる。
【００５４】
上記カゼインキナーゼ遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿００１３１０に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１３１９に登録されている塩基配列の５４番目から１３０１番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子を例示することができる。
【００５５】
本発明にかかる体内時計遺伝子は、上記例示したものに限定されるものではなく、上記例示した遺伝子とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズし、かつ、上記例示した遺伝子の翻訳産物と同様の機能を有する翻訳産物を生じる遺伝子であってもよい。
【００５６】
上記「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の具体的な例として、例えば、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。また、上記ハイブリダイゼーションは、J.Sambrook et al. Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory（1989）に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができ、特に限定されるものではない。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（ハイブリダイズし難くなる）。
【００５７】
上記のような条件でハイブリダイズする遺伝子としては、一般的には、少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在する遺伝子が挙げられる。
【００５８】
本発明にかかるＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法においては、上記のような体内時計遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子の発現を評価する工程を含んでいればよい。
【００５９】
本明細書において、「Ｘ遺伝子の発現を評価する」とは、以下の（ｉ）〜（ｖ）の全てを含む意味である。
（ｉ）Ｘ遺伝子の発現量を測定する。
（ｉｉ）Ｘ遺伝子の翻訳産物であるタンパク質の発現量を測定する。
（ｉｉｉ）Ｘ遺伝子の翻訳産物であるタンパク質に由来する活性量を測定する。
（ｉｖ）Ｘ遺伝子の変異の有無を調べる。
（ｖ）Ｘ遺伝子の有無を調べる。
【００６０】
以下、本発明にかかるＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法について、より詳細に説明するが、本明細書において、「遺伝子の発現量」とは、当該遺伝子の転写量、すなわち、ｍＲＮＡ量を意味するだけではなく、当該遺伝子の翻訳産物であるタンパク質量をも含む意味で用いている。逆に、「タンパク質の発現量」についても、当該タンパク質の発現量に加えて、当該タンパク質をコードする遺伝子の発現量、すなわち、ｍＲＮＡ量をも含む意味で用いている。
【００６１】
体内時計遺伝子の発現を評価する方法として、体内時計遺伝子の発現量を測定する方法を用いる場合、上記体内時計遺伝子の発現量の測定方法は、特に限定されるものではない。具体的には、上記体内時計遺伝子の発現量の測定方法は、ｍＲＮＡレベルで当該体内時計遺伝子の発現量を測定する方法であっても、また、タンパク質レベルで上記体内時計遺伝子の発現量の測定する方法であっても、さらにその両方を測定する方法であってもよい。より具体的には、（Ａ）体内時計遺伝子のｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を定量することにより、当該体内時計遺伝子の発現量を測定する方法、（Ｂ）体内時計遺伝子の翻訳産物であるタンパク質を定量することにより、当該体内時計遺伝子の発現量を測定する方法のいずれをも用いることができる。また、上記（Ａ）および（Ｂ）の両方の方法で上記体内時計遺伝子の発現量を測定してもよい。そうすることにより、上記体内時計遺伝子の発現量をより正確に測定することができる。以下、上記（Ａ）および（Ｂ）の方法について説明する。
【００６２】
（Ａ）ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いる方法
ｍＲＮＡを利用する場合、例えば、被験者から採取した試料より抽出したｍＲＮＡまたは全ＲＮＡを用いて、ノザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイを用いた方法などにより当該体内時計遺伝子のｍＲＮＡを定量することができる。さらには、ＲＴ−ＰＣＲ法等の遺伝子増幅技術を利用することができる。ＲＴ−ＰＣＲ法においては、遺伝子の増幅過程においてＰＣＲ増幅モニター法を用いることにより、本発明の遺伝子の発現について、より定量的な解析を行うことが可能である。
【００６３】
上記ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法においては、両端に互いの蛍光を打ち消し合うことができる異なる蛍光色素で標識したプライマーを用い、検出対象（ＤＮＡもしくはＲＮＡの逆転写産物）にハイブリダイズさせる。ＰＣＲが進んでＴａｑポリメラーゼの５'−３'エクソヌクレアーゼ（exonuclease）活性により上記プライマーが分解されると二つの蛍光色素が離れ、蛍光が検出されるようになる。この蛍光の検出をリアルタイムに行う。上記検出対象についてコピー数の明らかな標準試料についても同時に測定することにより、ＰＣＲ増幅の直線性のあるサイクル数で目的試料中の検出対象のコピー数を決定する（Holland,P.M.et al.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7276-7280;Livak,K.J.et al.,1995,PCR Methods and Applications 4(6):357-362;Heid,C.A.et al.,Genome Research 6:986-994;Gibson,E.M.U.et al.,1996,Genome Research 6:995-1001を参照）。これにより、検出対象を定量することができる。ＰＣＲ増幅モニター法においては、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００（ＰＥバイオシステムズ社）を用いることができる。
【００６４】
上記プライマーは、特に限定されるものではなく、当該体内時計遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を利用して、従来公知の方法で設計すればよい。
【００６５】
上記試料からｍＲＮＡまたは全ＲＮＡを抽出する方法は、特に限定されるものではなく、上記体内時計遺伝子を発現する生物学的試料（例えば、細胞、組織、生物個体等）などから、従来公知の方法を用いてｍＲＮＡまたは全ＲＮＡを抽出することができる。上記生物学的試料としては、具体的には、胸腺、肝、脾、および四肢関節周囲軟部組織を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００６６】
また、上記ＲＴ−ＰＣＲに用いるプライマーや、ノザンハイブリダイゼーション法やドットブロット法に用いるプローブを蛍光色素などにより標識する場合、その標識方法は特に限定されるものではない。例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩを用いるニックトランスレーション法、ポリヌクレオチドキナーゼを用いる末端標識法、クレノーフラグメントによるフィルイン末端標識法（Berger SL,Kimmel AR.(1987)Guide to Molecular Cloning Techniques,Method in Enzymology,Academic Press;Hames BD,Higgins SJ(1985)Genes Probes:A Practical Approach.IRL Press;Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.(1989)Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2nd Edn.Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照）、ＲＮＡポリメラーゼを用いる転写による標識法（Melton DA,Krieg,PA,Rebagkiati MR,Maniatis T,Zinn K,Green MR.(1984)Nucleic Acid Res.,12,7035−7056を参照）、放射性同位体を用いない修飾ヌクレオチドをＤＮＡに取り込ませる方法（Krick a LJ.(1992)Nonisotopic DNA Probing Techniques.Academic Pressを参照）などを用いることができる。
【００６７】
（Ｂ）タンパク質を用いる方法
被験者から採取した試料より抽出したタンパク質を用いる場合、分析対象となる体内時計遺伝子の翻訳産物であるタンパク質に特異的に結合する抗体を用いて、ウェスタンブロット法やＥＬＩＳＡ法などの従来公知の免疫化学的手法により当該タンパク質を定量することができる。また、分析対象となるタンパク質の活性を測定することにより、当該タンパク質を定量することができる。さらに、本発明はこれに限定されず、従来公知のあらゆる手法を用いて、当該タンパク質を定量することができる。このように、体内時計遺伝子の翻訳産物であるタンパク質を定量することで、上記体内時計遺伝子の発現量を測定することができる。
【００６８】
また、試料からタンパク質を抽出する方法は、特に限定されるものではなく、上記タンパク質を含有する生物学的試料（例えば、細胞、組織、生物個体等）などから、当該タンパク質が分解されない条件下で、従来公知の緩衝液および装置、キット等を用いてタンパク質を抽出することができる。上記生物学的試料としては、具体的には、胸腺、肝、脾、四肢関節周囲軟部組織、末梢血リンパ球、および胸腺もしくは脾より採取したリンパ球を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００６９】
上記抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。また、上記抗体の取得方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。例えば、ポリクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物 の血液を取り出し、この血液から公知の方法により血清を分離することにより取得することができる。また、ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用することができる。さらに、必要に応じてこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離してもよい。
【００７０】
また、モノクローナル抗体は、例えば、抗原を感作した哺乳動物から免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞などと細胞融合させて得られたハイブリドーマをクローニングして、その培養物から抗体を回収することにより取得することができる。
【００７１】
本発明にかかるＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法においては、上記（Ａ）および／または（Ｂ）に例示したような方法で、被験者における体内時計遺伝子の発現量を測定する。その後、その発現量を、同様の方法で測定した健常者の発現量と比較する。両者の間で有意な相違が見られた場合、当該被験者は、体内時計に異常がある可能性があると判定する。上述したように、体内時計の異常は、睡眠障害を引き起こし、ＲＡを発症する可能性を示唆するものである。
【００７２】
より具体的にいえば、上記体内時計遺伝子がCry1遺伝子またはCry2遺伝子である場合、これら遺伝子の発現量が健常者と比較して低下していれば、ＲＡを発症している、もしくは将来発症する可能性が高いと判定することができる。また、上記体内時計遺伝子がPer1遺伝子、Per2遺伝子、またはPer3遺伝子である場合、これら遺伝子の発現量が健常者と比較して低下していれば、ＲＡを発症している、もしくは将来発症する可能性が高いと判定することができる。さらに上記体内時計遺伝子がClock遺伝子またはBMAL1遺伝子である場合、これら遺伝子の発現量が健常者と比較して上昇していれば、ＲＡを発症している、もしくは将来発症する可能性が高いと判定することができる。
【００７３】
すなわち、本発明によれば、ＲＡおよびＲＡの睡眠障害を現在発症しているか、もしくは将来的にＲＡおよびＲＡの睡眠障害を発症する可能性があると判定することができる。
【００７４】
また、本発明では、体内時計遺伝子の発現を評価する方法として、体内時計遺伝子の変異の有無を調べる方法を用いることもできる。この場合の体内時計遺伝子の変異は、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）、または翻訳産物であるタンパク質を用いて、従来公知の方法により調べることができる。
【００７５】
具体的には、ゲノムＤＮＡを用いる場合、例えば、アリル特異的オリゴヌクレオチドプローブ法、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（Oligonucleotide Ligation Assay）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＣＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＨＰＦＡ法、インベーダー法、ＲＣＡ（Rolling Circle Amplification）法、プライマーオリゴベースエクステンション（Primer Oligo Base Extension）法、タイリング・アレイ法、および変性勾配ゲル電気泳動法などを用いて変異の有無を調べることができる。上記ゲノムＤＮＡは、常法により人体の全ての細胞より得ることが可能であるが、例えば、毛髪、各臓器、末梢リンパ球、滑膜細胞などから得ることができる。また、得られた細胞を培養し、増殖したものから得ることもできる。さらに、末梢血から得ることも可能である。
【００７６】
得られたゲノムは、そのまま用いてもよいし、例えば、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence based amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-mediated amplification）法およびＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅して用いてもよい。
【００７７】
また、ｍＲＮＡを用いる場合、例えば、被験者の細胞より抽出したｍＲＮＡから逆転写反応によってｃＤＮＡを作製し、上記遺伝子の領域を増幅後、増幅断片の塩基配列を直接シークエンスすることにより、またはＤＮＡチップを用いることにより、あるいはＲＦＬＰ（Restriction Fragment Length Polymorphism）法を用いることにより、体内時計遺伝子の変異の有無を決定することができる。
【００７８】
また、被験者の細胞より調製したタンパク質を用いる場合、通常のタンパク質のシークエンス方法に準ずればよく、例えば、正常型もしくは変異型の体内時計タンパク質のみを認識する抗体を作製し、ＥＬＩＳＡ法で検出する方法、タンパク質を単離し、直接または必要に応じ、酵素等で切断し、プロテインシークエンサーを利用して変異を検出する方法、アミノ酸の等電点の変異を検出する方法および質量分析により質量の差を検出する方法が挙げられる。
【００７９】
このように、体内時計遺伝子の発現を評価する方法として、体内時計遺伝子の変異の有無を調べる方法を用いる場合、体内時計遺伝子における変異が検出されれば、ＲＡおよびＲＡの睡眠障害を現在発症しているか、もしくは将来的にＲＡおよびＲＡの睡眠障害を発症する可能性があると判定することができる。この場合、さらに、翻訳産物であるタンパク質の定量や活性を評価することにより、健常者と比較して、体内時計遺伝子の発現に異常がないか調べることが好ましい。これにより、判定精度をより高めることができる。
【００８０】
例えば、Cry1遺伝子、Cry2遺伝子、Per1遺伝子、Per2遺伝子、またはPer3遺伝子に変異が検出され、その結果、これら遺伝子の発現量が健常者と比較して低下していれば、ＲＡを発症している、もしくは将来発症する可能性が高いと判定することができる。また、Clock遺伝子またはBMAL1遺伝子に変異があり、その結果、これら遺伝子の発現量が健常者と比較して上昇していれば、ＲＡを発症している、もしくは将来発症する可能性が高いと判定することができる。
【００８１】
また、本発明では、体内時計遺伝子の発現を評価する方法として、体内時計遺伝子の有無を調べる方法を用いることもできる。具体的には、被験者のゲノムＤＮＡ上に、体内時計遺伝子が存在するかを従来公知の方法により調べることで、体内時計遺伝子の有無を調べることができる。体内時計遺伝子の欠損は、睡眠障害を引き起こし、ＲＡを発症する可能性を示唆するものである。
【００８２】
より具体的にいえば、Cry1遺伝子、Cry2遺伝子、Per1遺伝子、Per2遺伝子、またはPer3遺伝子が欠損している場合、ＲＡおよびＲＡの睡眠障害を発症している、もしくは将来発症する可能性が高いと判定することができる。
【００８３】
本発明にかかるＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法は、さらに、Wee1キナーゼの発現量を測定する工程を含むことが好ましい。これにより、より精度よく、ＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性を判定することができる。より具体的には、被験者において測定したWee1キナーゼの発現量を、同様の方法で測定した健常者におけるWee1キナーゼの発現量と比較する。その結果、両者の間で有意な相違が見られた場合、具体的には、被験者においてWee1キナーゼの発現量の上昇が見られた場合、当該被験者は、ＲＡおよびＲＡの睡眠障害を現在発症しているか、もしくは将来的にＲＡおよびＲＡの睡眠障害を発症する可能性があると判定することができる。
【００８４】
上記「Wee1キナーゼの発現量」には、Wee1キナーゼをコードするwee1遺伝子の転写レベルでの発現量、すなわちwee1遺伝子のｍＲＮＡ量、およびWee1キナーゼのタンパク質レベルでの発現量、すなわちWee1キナーゼのタンパク質量の両方の意味が含まれる。つまり、上記「Wee1キナーゼの発現量を測定する」とは、Wee1キナーゼの転写レベルでの発現量およびタンパク質レベルでの発現量のいずれを測定するものであってもよい。また、転写レベルでの発現量およびタンパク質レベルの両方の発現量を測定するものであってもよい。これにより、Wee1キナーゼの発現量をより精度よく測定することができる。
【００８５】
Wee1キナーゼの発現量を測定する方法は、特に限定されるものではなく、上述した体内時計遺伝子の発現量を測定する方法と同様の方法を用いることができる。
【００８６】
また、上記wee1遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０３３５４２やＮＰ＿００３３８１に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００９５１６に登録されている塩基配列の３１１番目から２２５１番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子や、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００３３９０に登録されている塩基配列の１１４２番目から３０８２番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子を例示することができる。
【００８７】
さらに、本発明にかかるＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法は、c-fos遺伝子の発現量を測定する工程を含むことが好ましい。これにより、さらに高精度にＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性を判定することができる。より具体的には、被験者において測定したc-fos遺伝子の発現量を、同様の方法で測定した健常者におけるc-fos遺伝子の発現量と比較する。その結果、両者の間で有意な相違が見られた場合、具体的には、被験者においてc-fos遺伝子の発現量の上昇が見られた場合、当該被験者は、ＲＡおよびＲＡの睡眠障害を現在発症しているか、もしくは将来的にＲＡおよびＲＡの睡眠障害を発症する可能性があると判定することができる。
【００８８】
上記「c-fos遺伝子の発現量」には、c-fos遺伝子の転写レベルでの発現量、すなわちc-fos遺伝子のｍＲＮＡ量、およびc-fos遺伝子の翻訳産物であるタンパク質の発現量、すなわちc-fos遺伝子タンパク質の量の両方の意味が含まれる。つまり、上記「c-fos遺伝子の発現量を測定する」とは、c-fos遺伝子の転写レベルでの発現量およびタンパク質レベルでの発現量のいずれを測定するものであってもよい。また、転写レベルでの発現量およびタンパク質レベルの両方の発現量を測定するものであってもよい。これにより、c-fos遺伝子の発現量をより精度よく測定することができる。
【００８９】
c-fos遺伝子の発現量を測定する方法は、特に限定されるものではなく、上述した体内時計遺伝子の発現量を測定する方法と同様の方法を用いることができる。
【００９０】
また、上記c-fos遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセション番号ＣＡＡ２４７５６に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
【００９１】
本発明において、上記被験者は、特に限定されるものではないが、自覚症状として、睡眠障害、例えば、不眠を訴えている者や、関節炎を疑わせる症状を有する者であることが好ましい。さらに、本発明にかかるＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法が適用される試料は、人体等の生体から分離された試料であればよく、上記例示されたものに限定されるものではない。
【００９２】
＜２．ＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定キット＞
本発明にかかるＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定キット（換言すれば、ＲＡの診断キット）は、上記体内時計遺伝子の発現量を測定するための試薬を少なくとも含んでいればよく、その他の構成は特に限定されるものではない。上記体内時計遺伝子の発現量を測定するための試薬としては、例えば、プライマー、プローブ、および抗体などを挙げることができる。これらの試薬は、単独で含まれてもよく、また、複数の組み合わせで含まれていてもよい。さらに、上記判定キットは、上記例示する試薬に加えて、その他の試薬を組み合わせることによっても得ることができる。
【００９３】
具体的には、ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）または全ＲＮＡを用いて上記体内時計遺伝子の発現量を測定するキットとしては、上記体内時計遺伝子のｃＤＮＡの一部の領域を増幅できるように設計されたプライマーおよび／または上記体内時計遺伝子のｍＲＮＡに結合できるように設計されたプローブを含み、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法やノザンブロット法に用いられる試薬など、体内時計遺伝子の発現量を測定するために必要な試薬を１つ以上組み合わせたキットが挙げられる。なお、かかる試薬は、採用される検出方法に応じて適宜選択採用されるが、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ＤＮＡ合成酵素等を挙げることができる。さらに、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法やノザンブロット法に用いることが可能な適当な緩衝液および洗浄液等が含まれていてもよい。
【００９４】
上記プライマーやプローブは、特に限定されるものではない。具体的には、上記プライマーは、上記体内時計遺伝子のｃＤＮＡの一部の領域を増幅できるものであればよい。また、上記プローブは、上記体内時計遺伝子のｍＲＮＡに結合できるように設計されたものであればよい。
【００９５】
さらに、タンパク質レベルで上記体内時計遺伝子の発現量を測定するキットとしては、例えば体内時計遺伝子の翻訳産物であるタンパク質を認識する抗体を含むキットなどが挙げられる。
【００９６】
また、上記判定キットには、Wee1キナーゼおよび／またはc-fos遺伝子の発現量を測定するために用いるプライマーや、プローブ、抗体が含まれることが好ましい。上記構成によれば、より精度よく、ＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性を判定することができる。
【００９７】
上述した判定キットを使用することにより、上記＜１．ＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法＞の項で述べたように、ＲＡの診断（発症または発症可能性の判定）を客観的かつ簡便に行うことができる
また、本発明にかかるＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定キットが適用される被験者は、特に限定されるものではないが、自覚症状として、睡眠障害、例えば、不眠を訴えている者や、関節炎を疑わせる症状を有する者であることが好ましい。
【００９８】
＜３．ＲＡ発症モデル動物およびその製造方法＞
本発明にかかるＲＡ発症モデル動物は、体内時計遺伝子に異常が見られ、Wee1キナーゼの発現量が過剰に上昇し、ＲＡを発症しているモデル動物である。
【００９９】
本明細書において、「モデル動物」とは、ヒトの疾患に対する予防法または治療法を開発するために用いられる実験動物をいい、具体的には、マウス、ラット、ウサギ、サル、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、イヌなどの非ヒト哺乳動物、およびその他の脊椎動物が挙げられる。
【０１００】
上記体内時計遺伝子の異常とは、当該体内時計遺伝子の発現量の異常をもたらす体内時計遺伝子の異常であって、その原因は特に限定されるものではない。具体的には、体内時計遺伝子が破壊されることにより、体内時計遺伝子の発現量に異常が見られるモデル動物、いわゆる体内時計遺伝子のノックアウトモデル動物や、体内時計遺伝子に変異が導入された結果、体内時計遺伝子の発現量に異常が見られるモデル動物の変異体などが挙げられる。上記変異は、体内時計遺伝子の発現量を低下させる変異であっても、上昇させる変異であってもよい。
【０１０１】
上記変異とは、遺伝子の置換、欠失、挿入、あるいは付加を示すものである。本発明においては、当該体内時計遺伝子の翻訳産物であるタンパク質のアミノ酸配列に変異を導入するものであることが好ましい。また、別の形態としては、当該体内時計遺伝子の転写調節領域を変異させることにより、当該体内時計遺伝子の発現そのものを調節するものであってもよい。
【０１０２】
本発明にかかるＲＡ発症モデル動物では、さらに、c-fos遺伝子の発現量が過剰に上昇していることが好ましい。このようなモデル動物では、Wee1キナーゼの過剰発現により細胞分裂が抑制され、かつc-fos遺伝子の発現量が過剰に上昇することにより細胞増殖が活性化されるので、モデル動物にＲＡを発症させることができる。
【０１０３】
上記体内時計遺伝子は特に限定されるものではなく、具体的には、上記＜１．ＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法＞の項で例示したものを同様に挙げることができる。その中でも、上記体内時計遺伝子は、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子であって、上記体内時計遺伝子の異常は、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子の破壊であることが好ましい。すなわち、本発明にかかるＲＡ発症モデル動物は、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子がともに破壊されたノックアウトモデル動物（以下、「cry1/2KOモデル動物」ともいう）であることが好ましい。
【０１０４】
後述の実施例においても実証しているように、cry1/2KOモデル動物では、c-fos遺伝子およびwee1遺伝子の発現が上昇する。つまり、c-fos遺伝子の発現の上昇により細胞増殖が活性化され、wee1遺伝子の発現の上昇により細胞分裂が抑制されるので、ＲＡが発症する。
【０１０５】
上記体内時計遺伝子が、Per1遺伝子、Per2遺伝子、またはPer3遺伝子である場合、当該体内時計遺伝子の異常は、Per1遺伝子、Per2遺伝子、またはPer3遺伝子の発現を低下させる異常であることが好ましい。
【０１０６】
これによれば、wee1遺伝子の発現の上昇させることができ、その結果、当該モデル動物において、ＲＡを発症させることができる。
【０１０７】
上記体内時計遺伝子がClock遺伝子またはBMAL1遺伝子である場合、上記体内時計遺伝子の異常は、Clock遺伝子またはBMAL1遺伝子が過剰発現する異常であることが好ましい。
【０１０８】
Clock遺伝子またはBMAL1遺伝子の過剰発現は、上記wee1遺伝子を活性化し、発現量を増加させることができる。これにより、当該モデル動物において、ＲＡを発症させることができる。
【０１０９】
このようなＲＡ発症モデル動物は、体内時計の異常に伴い、睡眠障害を起こしている。したがって、上記ＲＡ発症モデル動物を用いることにより、ＲＡ患者に対する睡眠改善治療がＲＡの病態に及ぼす影響を評価することができ、新たなＲＡの治療方法の開発に用いることができる。
【０１１０】
本発明にかかるＲＡ発症モデル動物の製造方法は、Wee1キナーゼの発現量が過剰に上昇するようにモデル動物の体内時計遺伝子を操作する工程を含んでいればよく、その他の具体的な工程、材料、条件、使用装置、および使用機器等については、特に限定されるものではない。
【０１１１】
本明細書において、「モデル動物の遺伝子を操作する」とは、従来公知の遺伝子操作技術を用いて、モデル動物の遺伝子を操作するものであって、特に限定されるものではない。具体的には、モデル動物の遺伝子の遺伝子を破壊したり、当該遺伝子に変異を導入したり、さらには、当該モデル動物に外来遺伝子を導入したり、モデル動物を交雑したりすることをすべて包含する意味である。
【０１１２】
本発明において、モデル動物に特定の遺伝子を導入する方法としては、例えば、遺伝子と卵を混合してリン酸カルシウムで処理する方法；位相差顕微鏡下で前核期卵の核に、微小ピペットで遺伝子を直接導入する方法（マイクロインジェクション法、米国特許第４８７３１９１号）；胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を使用する方法；レトロウィルスベクターに遺伝子を挿入し、卵に感染させる方法；精子を介して遺伝子を卵に導入する精子ベクター法等を挙げることができる。上記精子ベクター法とは、精子に外来遺伝子を付着またはエレクトロポレーション等の方法で精子細胞内に取り込ませた後に、卵子に受精させることにより、外来遺伝子を導入する遺伝子組換え法である（M.LavitranoetらCell,57,717,1989を参照）。
【０１１３】
また、本発明にかかるＲＡ発症モデル動物の製造方法において、モデル動物の体内時計遺伝子を破壊する場合の方法としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞ともいう）を用いて相同組換えを行い、一方の対立遺伝子を改変・破壊した胚性幹細胞を選別することにより、ノックアウト動物を製造する方法を用いることができる。より具体的には、受精卵に遺伝子を操作した胚性幹細胞を注入して、胚性幹細胞由来の細胞と胚由来の細胞が混ざったキメラ動物を得る。このキメラ動物と正常マウスとを交配することにより、一方の対立遺伝子の全てが改変・破壊されたヘテロ接合体を得ることができる。さらに、ヘテロ接合体同士を交配することにより、ホモ接合体を得ることができる。本発明にかかるＲＡ発症モデル動物は、これらヘテロ接合体と、ホモ接合体とのいずれをも含むものである。
【０１１４】
上記用語「キメラ」とは、２個以上の受精卵に基づいた体細胞で形成される単一個体をいう。また、用語「相同組換え」とは、遺伝子組換え機構で塩基配列が同じ、または非常に類似している２つの遺伝子間で起こる組換えのことをいう。相同組換えを起こした細胞の選別は、従来公知の方法およびそれらの変法を用いて容易に行うことができる。例えば、挿入遺伝子の一部、および挿入が期待される領域の一部の配列をもとに設計したプライマーを用いて、ＰＣＲを行い、増幅産物が生じた場合には、その細胞で相同組換えを起こしていると判定することができる。また、胚性幹細胞で発現している遺伝子に相同組み換えを起こさせる場合には、導入遺伝子にネオマイシン耐性遺伝子などのマーカー遺伝子を結合させておき、そのマーカー遺伝子を用いて相同組換えが起こった細胞を選択することができる。
【０１１５】
以上のように、本発明にかかるＲＡ発症モデル動物の製造方法によれば、Wee1キナーゼの発現量が上昇するように、モデル動物の体内時計遺伝子を操作することにより、ＲＡを発症したモデル動物を製造することができる。
【０１１６】
このようにして得られるＲＡ発症モデル動物は、ＲＡの治療薬剤のスクリーニングやＲＡの研究に利用することができる。したがって、抗ＲＡ薬の候補物質をスクリーニングするスクリーニング方法であって、ＲＡのモデル動物に被験化合物を与える過程と、上記＜１．ＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法＞の項に記載の判定方法により、上記モデル動物のＲＡが治癒または改善されたか否かを診断する過程と、上記モデル動物のＲＡが治癒または改善していることを指標として、上記被験化合物が抗ＲＡ薬の候補化合物であると判定する過程と、を備えるスクリーニング方法も本発明に含まれる。
【０１１７】
＜４．ＲＡの治療薬剤のスクリーニング方法＞
本発明にかかるＲＡの治療薬剤のスクリーニング方法について、以下より詳細に説明する。
【０１１８】
本発明にかかるＲＡの治療薬剤のスクリーニング方法は、本発明にかかるＲＡ発症モデル動物に被験化合物を投与する工程と、当該被験化合物を投与されたＲＡ発症モデル動物におけるＲＡのマーカーを測定する工程とを含んでいればよい。つまり、上記ＲＡの治療薬剤のスクリーニング方法によれば、ＲＡ発症モデル動物に被験化合物を投与し、当該被験化合物を投与されたＲＡ発症モデル動物において、ＲＡが治癒または改善していることを指標として、上記被験物質が抗ＲＡ薬の候補化合物であると判定することができる。
【０１１９】
上記被験化合物は、特に限定されるものではないが、Wee1キナーゼの発現を阻害することが期待される化合物またはWee1キナーゼの活性を阻害することが期待される化合物であることが好ましい。また、上記被験化合物は、睡眠を誘導する薬剤などのように、睡眠障害の治療に用いることができる薬剤であってもよい。
【０１２０】
このような被験化合物を本発明にかかるＲＡ発症モデル動物に投与する方法は、特に限定されるものではなく、その被験化合物の物性等に応じて、それに適した方法を従来公知のものから選択して用いればよい。
【０１２１】
また、上記ＲＡのマーカーとは、ＲＡの診断や治療において、ＲＡの発症や進行を判定するために用いられるマーカーを意味する。本発明において、上記ＲＡのマーカーは、特に限定されるものではないが、例えば、上述した体内時計遺伝子、wee1遺伝子、またはc-fos遺伝子を挙げることができる。また、本発明においては、ＩＬ−１、ＩＬ−６、またはＴＮＦ−αのような炎症性サイトカインや、リウマトイド因子（以下、「ＲＦ」という）、抗ガラクトース欠損ＩｇＧ抗体などをＲＡのマーカーとして用いることができる。
【０１２２】
上記ＲＡのマーカーの測定方法は、特に限定されるものではなく、測定するＲＡのマーカーに種類に応じて、適宜従来公知の方法から選択することが好ましい。例えば、上述した体内時計遺伝子、wee1遺伝子、またはc-fos遺伝子をＲＡのマーカーとする場合、それら遺伝子の発現量は、＜１．ＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法＞の項で述べた方法を用いて測定することができる。
【０１２３】
＜５．ＲＡの治療薬剤および治療方法＞
本発明にかかるＲＡの治療薬剤は、睡眠障害を改善する物質を含有するものであればよく、その他の具体的な構成は特に限定されるものではない。特に、Wee1キナーゼの発現量を抑制するものであることが好ましい。上記構成によれば、ＲＡ患者において、c-fos遺伝子の過剰発現により細胞が過剰増殖した場合であっても、細胞分裂が阻止されることがなく、ＲＡにおける腫瘍様の病態の進行を抑制することができる。
【０１２４】
上記睡眠障害を改善する物質としては、睡眠導入薬を挙げることができる。より具体的には、ジアゼパム剤や、メラトニンとビタミンＢ１２とを含む配合剤などを挙げることができる。
【０１２５】
また、本発明にかかるＲＡの治療薬剤は、＜４．ＲＡの治療薬剤のスクリーニング方法＞の項で述べた方法を用いることにより、候補化合物から選抜することにより取得することができる。
【０１２６】
ところで、臨床適用のための治療薬剤の投与条件は、本明細書に記載したＲＡのモデル動物系を用いて決定することができる。すなわち、上記モデル動物を用いて投与量、投与間隔、投与ルートを含む投与条件を検討し、適切な予防または治療効果を得られる条件を決定することができる。このような治療薬剤は、ＲＡに対する予防または治療のための医薬となる。
【０１２７】
また、治療薬剤は、薬学的に許容できる所望の担体と組み合わせて組成物とすることができる。担体としては、例えば、滅菌水、生理食塩水、緩衝剤、植物油、乳化剤、懸濁剤、塩、安定剤、保存剤、界面活性剤、徐放剤、他のタンパク質（ＢＳＡなど）、トランスフェクション試薬（リポフェクション試薬、リポソーム等を含む）等が挙げられる。さらに、使用可能な担体としては、グルコース、ラクトース、アラビアゴム、ゼラチン、マンニトール、デンプンのり、マグネシウムトリシリケート、タルク、コーンスターチ、ケラチン、コロイドシリカ、ばれいしょデンプン、尿素などが挙げられる。
【０１２８】
製剤化する場合の剤型は制限されず、たとえば溶液（注射剤）、粉体、マイクロカプセル、錠剤などであってよい。投与は全身または局所的に行い得るが、全身投与による副作用や効果の低下がある場合には、局所投与することが好ましい。例えば本治療薬剤を徐放剤と組み合わせ、ＲＡを呈する疾患部位を標的とするドラッグデリバリーにより効果的に治療を行うことが可能と考えられる。
【０１２９】
また、患者への投与は、特に限定されるものではなく、有効成分の性質に応じて、経口的に、または非経口的に行うことができる。経口的に投与する剤型としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、または懸濁剤等を選択することができる。非経口的な投与としては、例えば、経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、関節内、皮下、脊髄腔内、もしくは脳室内への投与が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、非経口的に投与する剤型としては、例えば、注射剤、座薬、塗り薬等を挙げることができる。上記注射剤としては、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を挙げることができる。投与は全身的または局所的にされ得るが、全身投与による副作用が問題となる場合には病変部位への局所投与が好ましい。投与量、投与方法は、治療薬剤の有効成分の組織移行性、治療目的、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
【０１３０】
また、本発明の治療薬剤は一般的に、総組成物の重量で０．１〜９０％の治療薬物を含む。非経口投与では、１日当たり体重１ｋｇ当たり、０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜３００ｍｇ、より好ましくは０．０１ｍｇ〜１００ｍｇである。しかし、疾患状態、体重、及び治療に対する患者の個々反応、治療薬剤が投与される組成物の種類、および投与形態、病気の経過の段階または投与の間隔に依存して、これら投与速度は適宜調整する。したがって、上述した最小投与量より少なく使うことがときには適量であり、一方、他の場合には治療効果を得るために上限を越える必要がある。投与は１回〜数回に分けて行うことができ、１日あたり１〜５回投与することができる。
【０１３１】
対象となる個体は、例えばヒト、およびマウス、ラット、ウサギ、サルなどの非ヒト哺乳動物、およびその他の脊椎動物が挙げられる。非ヒト哺乳動物への適用は、ヒトＲＡに対する予防法または治療法を開発するためのモデルとする上でも有用である。これにより、例えばＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症を予防する新たな治療プロトコルを開発することができる。したがって、本発明には、本発明にかかる治療薬剤を、ＲＡ患者に睡眠障害を緩和する薬剤を投与することにより、Wee1キナーゼの発現を抑制することにより、ＲＡを予防または治療するＲＡおよびＲＡの睡眠障害の予防または治療の方法が含まれる。
【０１３２】
なお本発明は、以上例示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術範囲に含まれる。
【実施例】
【０１３３】
本発明について、実施例および図１〜３に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。
【０１３４】
〔実施例１：体内時計の破壊による関節炎の発症〕
７〜８週齢のマウス（野生型マウス、並びに、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子を破壊したマウス（以下、「Cry-/-マウス」ともいう））の腹腔内に関節炎惹起モノクローナル抗体カクテル（Chondrex社、商品コードNo.62200）を５ｍｇ投与し、四肢関節の腫脹を１〜４点のスコア化することにより関節炎の発症を評価した。観察は、関節炎カクテル投与後、４〜５週間後まで行った。
【０１３５】
野生型マウス、およびCry-/-マウスにおいて、関節炎の発症を比較したところ、Cry-/-マウスにやや強い関節炎誘導の傾向が見られた。すなわち、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子を破壊したマウスでは、関節炎を発症することが分かった。
【０１３６】
〔実施例２：関節炎におけるc-Fosタンパク質およびWee1キナーゼタンパク質の発現の上昇〕
関節炎発症後のマウスを屠殺し、肝臓より抽出したタンパク質におけるc-Fosタンパク質およびWee1キナーゼの発現量を、各タンパク質に対して特異的な抗体を用いて、ウェスタンブロット法により評価した。その結果、Cry-/-マウスにおいては、c-Fosタンパク質およびWee1キナーゼの発現が有意に強く誘導された。すなわち、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子を破壊したマウスでは、ＲＡに見られるのと同様の現象が起こることが分かった。
【０１３７】
〔実施例３：体内時計の破壊による炎症性サイトカインの上昇〕
関節炎発症後のマウスを屠殺し、単離した脾細胞を抗ＣＤ３抗体（２μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ２８抗体（５μｇ／ｍｌ）を用いて２４時間刺激培養した。その後、培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法により培養上清中のＴＮＦ−αを測定した。
【０１３８】
その結果、免疫の有無に関わらず、Cry-/-マウスの血清ＴＮＦ−α値が有意に高かった。ＲＡでは、ＴＮＦ−αが上昇することから、本実施例の結果からも、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子を破壊したマウスでは、ＲＡに見られるのと同様の現象が起こることが分かった。
【０１３９】
なお、本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１４０】
以上のように、本発明では、体内時計遺伝子の発現量を指標として、ＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性を判定することができる。それゆえ、ＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法や判定キットに代表される診断医療の分野だけでなく、保健医学分野に広く利用することができる。さらに、本発明では、上記体内時計遺伝子を用いてＲＡ発症モデル動物を製造することができる。このようなＲＡ発症モデル動物は、ＲＡの治療薬剤や治療方法の開発に用いることができる。それゆえ、本発明は、製薬分野をはじめ、生命科学分野の産業に広く利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】本発明の実施形態にかかるＲＡ発症モデル動物における関節炎の発症を調べた結果を示す図である。
【図２】本発明の実施形態にかかるＲＡ発症モデル動物におけるc-Fosタンパク質およびWee1キナーゼタンパク質の発現を調べた結果を示す図である。
【図３】本発明の実施形態にかかるＲＡ発症モデル動物における炎症性サイトカインを測定した結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法、並びにその利用に関するものであって、特に、関節リウマチの発症に関連する遺伝子の発現量を測定することにより関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性を判定する方法、並びにその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（rheumatoid arthritis、以下「ＲＡ」ともいう）は、多発するびらん性関節炎を主な特徴とするが、同時に多臓器を障害する原因不明の全身性炎症疾患である。ＲＡは寛解と増悪とを繰り返しながら慢性に進行し、無治療で放置すると関節の破壊や変形を来し、やがて運動器の機能障害を呈してくる。
【０００３】
ＲＡの原因である関節炎と関節破壊の様相、特にそれらの病理過程は、種々の研究を通じて次第に明らかになりつつあるが、ＲＡは生活環境を含めた多数の原因因子が重なり合ってはじめて疾患へと発展・増悪する疾患である。そのため、疾患の正しい解明と適切な診断や治療とを行うには、多因子相互作用の本体そのものが明らかにされなければならない。
【０００４】
このような状況下において、近年、本発明者らは、ＲＡの発症病因・病態を研究する中で、ＲＡの病態の主軸にc-fos遺伝子の過剰活性化による関節滑膜細胞やＴリンパ球の過剰活性化があることを明らかにした。具体的には、ＲＡでは、c-fos遺伝子の発現が過剰であるため、p21waf1/cip1が低下して細胞は強く増殖することを明らかにした（非特許文献１を参照）。
【０００５】
これとは別に、本発明者らは、c-fos遺伝子発現細胞を長い間培養していると、次第に４倍体の核をもつ細胞が増加し、その原因は、Wee1キナーゼの亢進であることを明らかにしている。
【０００６】
一般に、細胞分裂開始の引き金は、mitosis promoting factor（以下、「ＭＰＦ」ともいう）分子によって引かれる。ＭＰＦはサイクリンＢとcdc2分子とからなる複合体である。ＭＰＦは、cdc2分子の１５番目のチロシンがリン酸化されると不活性型となり、脱リン酸化されると活性型となって細胞分裂が始まる。上記Wee1キナーゼは、cdc2分子の１５番目のチロシンをリン酸化するものである。
【０００７】
また、上記c-fos遺伝子については、リンパ球などの増殖性細胞において、G1前期にimmediate early geneとしてごく短時間だけ一過的に転写されることが以前から知られている。しかし、なぜc-fos遺伝子がこの時期にだけ一過的に増減するのか、その生理学的な意義については不明であった。
【０００８】
近年、本発明者らは、細胞分裂のG1前期にc-Fosタンパク質がwee1遺伝子のプロモーターに作用してWee1キナーゼの発現量を一過的に増加させる直接の転写シグナル経路が存在することを明らかにした（非特許文献２を参照）。これにより、c-fos遺伝子は、細胞を増殖に向かわせると同時に、Wee1キナーゼの発現量を増加させて細胞分裂を一過的に阻止することを明らかとなった。つまり、生体では、このようなメカニズムを有することにより、細胞がＧ１前期からＳ期にあって盛んにＤＮＡを合成している時に、誤って細胞が分裂を起こさないように制御されているのである。
【０００９】
しかし、ＲＡではその病態として、上述したようにc-fos遺伝子が持続的に過剰発現している。したがって、c-fos遺伝子の発現の亢進に連動してwee-lキナーゼの発現も亢進することとなる。この結果、c-fos遺伝子の過剰発現の効果で細胞が過剰増殖するのに対して、Wee1キナーゼの発現活性化の効果によって細胞分裂が阻止されるという矛盾した、いわば腫瘍様の病態がＲＡにおいて見られることを本発明者はこれまでに独自に導き出しているのである。
【００１０】
また、ＲＡの病態には、ホルモン分泌異常が関与していることが知られている。その１つとして、視床下部−下垂体−副腎軸異常が挙げられる。これに関連して、本発明者らは、ＲＡ関節滑膜において、Urocortin（非特許文献３を参照）やＡＣＴＨ（非特許文献４を参照）が過剰発現されることを報告している。こういった事実は、ＲＡの増悪因子として体内ホルモンバランスの異常が作用する可能性を示すものである。しかし、体内ホルモンバランスの異常のみがＲＡに特有の滑膜増殖や骨軟骨破壊を導くものではない。
【００１１】
例えば、ＲＡの滑膜病変の進行には関節滑膜の慢性炎症が必須であるが、その際、c-fos遺伝子やc-myc遺伝子といった癌原遺伝子が活性化され、炎症の遷延化に関与することが知られている。（非特許文献５を参照）。
【００１２】
さらに、本発明者らは、c-fos遺伝子を過剰発現させたH2-c-fos遺伝子導入マウスにおいて実験的関節炎が重症化し、滑膜間葉系細胞にのみによる関節破壊が誘導されることを見出している（非特許文献６および７を参照）。
【００１３】
また、本発明者らは、ＲＡ滑膜細胞においてc-fos遺伝子が転写因子activator protein-1(AP-1)として機能した結果、細胞因子調節因子であるWee1キナーゼの発現を直接制御することを明らかにしている（非特許文献８）。
【００１４】
ところで、上述のWee1キナーゼは、体内時計遺伝子であるCry1遺伝子およびcry2遺伝子をノックアウトしたマウス（Cry1/2遺伝子ノックアウトマウス、以下「Cry1/2KOマウス」ともいう）では、過剰に発現していることが知られている（非特許文献９および１０を参照）。
【００１５】
上記体内時計遺伝子とは、体内時計を制御する遺伝子の総称である。体内時計は生物が地球の自転により起こる昼夜変化に適応するために獲得した基本形質であり、ヒトを含む哺乳類において特に発達している。体内時計のセンターは視床下部の小神経核である視交叉上核であるが、一方で皮膚をはじめ肝、腸管、腎などの臓器が個々に時計遺伝子を発現し、24時間周期の機能的変動を行う。
【００１６】
生体リズムの研究は近年、時計遺伝子が相次いで報告されたため急速に進展している。上記Cry1遺伝子およびcry2遺伝子は、転写抑制因子として働く時計遺伝子である。Cry1遺伝子およびcry2遺伝子以外の時計遺伝子としては、現在までにClock遺伝子、BMAL1遺伝子、Per1遺伝子、Per2遺伝子、Per3遺伝子、およびカゼインキナーゼ遺伝子が報告されている。これらの遺伝子群は、互いにその発現を調節しながら作用して体内ホルモンの分泌や代謝に日内リズムをもたらす。
【００１７】
上記Cry1/2KOマウスでは、さらに、暗環境（暗闇）においても活動と睡眠とを細切れに繰り返し、睡眠障害に基づく機能異常を表現する。視交叉上核からの時間シグナルは、神経系の特性を生かして視床下部の内分泌・自律神経系の諸核に出力される。また、脳からのびる交感神経・副交感神経は、直接また間接的に副腎を介して諸臓器に分布する細胞の時間シグナルを調節する。
【非特許文献１】Hikasa M, Yamamoto E, Kawasaki H, Komai K, Shiozawa K, Hashiramoto A, Miura Y, Shiozawa S. p21 is down-regulated in conjunction with up-regulation of c-Fos in the lymphocytes of rheumatoid arthritis patients. Biochem Biophys Res Commun 304:143-147, 2003.
【非特許文献２】Kawasaki H, Komai K, Ouyang Z, Murata M, Hikasa M, Ohgiri M, Shiozawa S. c-Fos/activator protein-1 transactivates wee 1 kinase at G1/S to inhibit premature mitosis in antigen-specific Th1 cells. EMBO J 20:4618-4627, 2001.
【非特許文献３】Kohno M, Kawahito Y, Tsubouchi Y, Hashiramoto A, 他８名Urocortin expression in synovium of patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis: relation to inflammatory activity. J Clin Endocrinol Metab. 2001 Sep;86(9):4344-52.
【非特許文献４】Miyazaki S, Yoshikawa T, Hashiramoto A, 他６名ACTH expression in synovium of patients with rheumatoid arthritis and Lewis rat with adjuvant arthritis. Mod Rheumatol 2002;12: 202-212.
【非特許文献５】Hashiramoto A, Sano H, 他８名C-myc antisense oligodeoxynucleotides can induce apoptosis and down-regulate Fas expression in rheumatoid synoviocytes. Arthritis Rheum. 1999 May;42(5):954-62.
【非特許文献６】Shiozawa S,他３名. Studies on the contribution of c-fos/AP-1 to arthritic joint destruction. J Clin Invest. 1997 Mar 15;99(6):1210-6.
【非特許文献７】Shiozawa S, Tanaka Y, Fujita T, Tokuhisa T. Destructive arthritis without lymphocyte infiltration in H2-c-fos transgenic mice. J Immunol 148:3100-3104, 1992.
【非特許文献８】Kawasaki H, Komai K, Nakamura M, Yamamoto E, Ouyang Z, Nakashima T, Morisawa T, Hashiramoto A, 他４名. Human wee1 kinase is directly transactivated by and increased in association with c-Fos/AP-1: rheumatoid synovial cells overexpressing these genes go into aberrant mitosis. Oncogene. 2003 Oct9;22(44):6839-44.
【非特許文献９】Okamura H, 他７名 Photic induction of mPer1 and mPer2 in cry-deficient mice lacking a biological clock.Science. 1999 Dec 24;286(5449):2531-4.
【非特許文献１０】Matsuo T et al. Control mechanism of the circadian clock for timing of cell division in vivo. Science 302:255-259, 2003.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
ＲＡにおいて、その本体が不明な症状として、古くから、ＲＡ患者に特有の性格が知られている。この特有の性格については、これまで多くの心理学的・精神医学的分析が多くなされてきたが、その本体は未だ解明されていない。上記「ＲＡ患者に特有の性格」とは、疑り深く頑固で容易に妥協しないといった類のものである。
【００１９】
ところで、上述したように、ＲＡでは、Wee1キナーゼの過剰発現が見られる。このWee1キナーゼの過剰発現は、上述したようにＲＡにおける腫瘍様の病態を呈するのに寄与するが、ＲＡ患者に対して、その他どのような影響を及ぼすものであるかについては、全く知られていない。
【００２０】
一方、上記Cry1/2KOマウスは、上述した特徴をもつことから、視交叉上核という神経核レベルの異常を起点に、睡眠障害と全身性に伝播される行動・ホルモン異常、さらに細胞周期調節因子（Wee1キナーゼ）異常を具現するモデルマウスと捉えることができる。
【００２１】
本発明者らは、上記２つの知見、すなわち、（１）ＲＡにおけるWee1キナーゼの過剰発現と、（２）睡眠障害をもつCry1/2KOマウスにおけるWee1キナーゼの過剰発現とから、ＲＡにおいて、Wee1キナーゼが過剰発現することにより、睡眠異常という病態が現れることに起因して、上記のＲＡ患者に特有の性格が形成される可能性があることを独自に考え出した。しかしながら、これまで、ＲＡ患者における不眠は、疼痛によるものと考えられており、ＲＡと睡眠異常との関係を分子生物学的手法を用いて、生化学的に解析した研究例は全くない。
【００２２】
本発明は、上記問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、ＲＡと睡眠異常との関係を生化学的に明らかにし、その知見を基づいて、新たな関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法、並びにその利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、Cry1/2KOマウスは滑膜増殖を起こしやすい表現型を示し、重度の関節炎を発症するとともに、睡眠異常を引き起こすWee1キナーゼの活性上昇が見られることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、産業上有用な以下の発明を包含する。
【００２４】
（１）生体から分離した試料を用いて、体内時計遺伝子の発現を評価する工程を含むことを特徴とする関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法。
【００２５】
（２）体内時計遺伝子が、Cry1遺伝子、Cry2遺伝子、Clock遺伝子、BMAL1遺伝子、Per1遺伝子、Per2遺伝子、Per3遺伝子、およびカゼインキナーゼ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子であることを特徴とする（１）に記載の関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法。
【００２６】
（３）Wee1キナーゼの発現量を測定する工程をさらに含むことを特徴とする（１）または（２）に記載の関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法。
【００２７】
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載の関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法を実施するために用いるキットであって、体内時計遺伝子の発現量を測定するために用いるプライマー、プローブ、および抗体のうち、少なくとも１つを含有することを特徴とする関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定キット。
【００２８】
（５）さらに、Wee1キナーゼの発現量を測定するために用いるプライマー、プローブ、および抗体のうち、少なくとも１つを含有することを特徴とする（４）に記載の関節リウマチの発症またはその可能性の判定キット。
【００２９】
（６）体内時計遺伝子に異常が見られ、Wee1キナーゼの発現量が過剰に上昇していることを特徴とする関節リウマチ発症モデル動物。
【００３０】
（７）上記体内時計遺伝子の異常が、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子の破壊であることを特徴とする（６）に記載の関節リウマチ発症モデル動物。
【００３１】
（８）Wee1キナーゼの発現量が過剰に上昇するように体内時計遺伝子を操作する工程を含むことを特徴とする関節リウマチ発症モデル動物の製造方法。
【００３２】
（９）上記体内時計遺伝子の操作が、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子の破壊であることを特徴とする（８）に記載の関節リウマチ発症モデル動物の製造方法。
【００３３】
（１０）（６）または（７）に記載の関節リウマチ発症モデル動物に、被験化合物を投与する工程と、当該被験化合物を投与された関節リウマチ発症モデル動物における関節リウマチのマーカーを測定する工程とを含むことを特徴とする関節リウマチの治療薬剤のスクリーニング方法。
【００３４】
（１１）上記被験化合物が、Wee1キナーゼの発現を阻害することが期待される化合物またはWee1キナーゼの活性を阻害することが期待される化合物であることを特徴とする（１０）に記載の関節リウマチの治療薬剤のスクリーニング方法。
【００３５】
（１２）睡眠障害を改善する物質を含有することを特徴とする関節リウマチの治療薬剤。
【００３６】
（１３）Wee1キナーゼの発現量を抑制することを特徴とする（１２）に記載の関節リウマチの治療薬剤。
【発明の効果】
【００３７】
本発明にかかる関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法は、以上のように、体内時計遺伝子の発現量を指標とするものである。それゆえ、簡便に、かつ客観的に関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性を判定できるという効果を奏する。
【００３８】
また、本発明にかかる関節リウマチ発症モデル動物は、体内時計遺伝子が操作されることにより、Wee1キナーゼの発現量およびc-fos遺伝子の発現量が上昇しているため、関節リウマチを発症している。それゆえ、新たな関節リウマチの治療薬剤や、治療方法の開発に好適に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本発明者らは、関節リウマチ（rheumatoid arthritis、以下「ＲＡ」ともいう）患者に見られる不眠症状は、疼痛によるものだけではなく、体内時計の異常により引き起こされることを独自に見出した。具体的には、本発明者らは、これまでに、ＲＡ患者では、c-fos遺伝子の過剰活性化により、Wee1キナーゼの発現が上昇することにより、関節滑膜細胞やＴリンパ球が過剰活性化されることを見出していた。しかし、このWee1キナーゼの過剰発現が、ＲＡ患者において、そのほかにどのような症状を引き起こしているかについては全く知られていなかった。
【００４０】
そこで、c-fos遺伝子の過剰活性化以外の方法で、Wee1キナーゼの過剰発現を誘導した実験動物を用いて、ＲＡを発症するかを検証した。c-fos遺伝子の過剰活性化以外の方法として、本発明者らは、体内時計遺伝子であるCry1遺伝子およびCry2遺伝子を破壊する方法を用いた。
【００４１】
マウスにおいて、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子を破壊すると、Wee1キナーゼが過剰発現し、睡眠障害を引き起こすことは知られていたが、ＲＡを発症するか否かについては全く検討もなされていなかった。
【００４２】
上記の検証の結果、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子を破壊したマウスにおいて、ＲＡが発症されることが分かった。こうして、本発明者らは、これまで全く予測もされていなかった体内時計異常とＲＡ発症との相関を明らかにし、本発明を完成させるに至った。
【００４３】
以下、本発明の実施形態について、説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４４】
＜１．ＲＡの発症またはその可能性の判定方法＞
本発明にかかるＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法は、生体から分離した試料を用いて、体内時計遺伝子の発現を評価する工程を含んでいればよく、その他の具体的な工程や、使用する器具および装置は特に限定されるものではない。
【００４５】
本明細書において、上記体内時計遺伝子とは、体内時計を制御する遺伝子を意味する。また、上記「体内時計」とは、生物が地球の自転により起こる昼夜変化に適応するために獲得した基本形質を意味する。体内時計のセンターは視床下部の小神経核である視交叉上核である。一方で、皮膚をはじめ肝、腸管、腎などの臓器では個々に体内時計遺伝子が発現し、それら遺伝子が互いにその発現を調節しながら作用して体内ホルモンの分泌や代謝に日内リズムをもたらす。その結果として、生体内では、24時間周期の機能的変動が起こる。このような体内時計が正常でなくなると、睡眠障害等の症状が現れる。逆に言えば、睡眠障害がある場合、当該生物では、体内時計に異常がある可能性があると判断することができる。
【００４６】
本発明において、上記体内時計遺伝子は特に限定されるものではなく、Cry1遺伝子、Cry2遺伝子、Clock遺伝子、BMAL1遺伝子、Per1遺伝子、Per2遺伝子、Per3遺伝子、およびカゼインキナーゼ遺伝子等を挙げることができる。本発明にかかるＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法においては、上記例示したような体内時計遺伝子から、少なくとも１つ以上の遺伝子の発現量を測定すればよい。
【００４７】
上記Cry1遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０３１７９７やＮＰ＿００４０６６に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００７７７１に登録されている塩基配列の５８４番目から２４０４番目までの塩基配列をオープンリーディングフレーム（以下、「ＯＲＦ」ともいう）として有する遺伝子や、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００４０７５に登録されている塩基配列の５８７番目から２３４７番目までの塩基配列をＯＲＦとして有する遺伝子を例示することができる。
【００４８】
また、上記Cry2遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０３４０９３やＮＰ＿０６６９４０に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００９９６３に登録されている塩基配列の６番目から１７８４番目までの塩基配列をＯＲＦとして有する遺伝子や、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０２１１１７に登録されている塩基配列の１４番目から１７９５番目までの塩基配列をＯＲＦとして有する遺伝子を例示することができる。
【００４９】
上記Clock遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０３１７４１やＮＰ＿００４８８９に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００７７１５に登録されている塩基配列の３８９番目から２９５６番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子や、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００４８９８に登録されている塩基配列の３３９番目から２８７９番目までの塩基配列をＯＲＦとして有する遺伝子を例示することができる。
【００５０】
上記BMAL1遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＡ１９９３５に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＢ０００８１２に登録されている塩基配列の４１番目から１９２１番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子を例示することができる。
【００５１】
上記Per1遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０３５１９５やＮＰ＿００２６０７に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１１０６５に登録されている塩基配列の２２６番目から４１０１番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子や、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００２６１６に登録されている塩基配列の１８８番目から４０６０番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子を例示することができる。
【００５２】
上記Per2遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０３５１９６やＮＰ＿０７３７２８に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１１０６６に登録されている塩基配列の１４５番目から３９１８番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子や、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０２２８１７に登録されている塩基配列の１２３番目から３８９０番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子を例示することができる。
【００５３】
上記Per3遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０３５１９７やＮＰ＿０５８５１５に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１１０６７に登録されている塩基配列の３５８番目から３６９９番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子や、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１６８３１に登録されている塩基配列の１７６番目から３７８１番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子を例示することができる。
【００５４】
上記カゼインキナーゼ遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿００１３１０に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１３１９に登録されている塩基配列の５４番目から１３０１番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子を例示することができる。
【００５５】
本発明にかかる体内時計遺伝子は、上記例示したものに限定されるものではなく、上記例示した遺伝子とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズし、かつ、上記例示した遺伝子の翻訳産物と同様の機能を有する翻訳産物を生じる遺伝子であってもよい。
【００５６】
上記「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の具体的な例として、例えば、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。また、上記ハイブリダイゼーションは、J.Sambrook et al. Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory（1989）に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができ、特に限定されるものではない。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（ハイブリダイズし難くなる）。
【００５７】
上記のような条件でハイブリダイズする遺伝子としては、一般的には、少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在する遺伝子が挙げられる。
【００５８】
本発明にかかるＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法においては、上記のような体内時計遺伝子のうち、少なくとも１つ以上の遺伝子の発現を評価する工程を含んでいればよい。
【００５９】
本明細書において、「Ｘ遺伝子の発現を評価する」とは、以下の（ｉ）〜（ｖ）の全てを含む意味である。
（ｉ）Ｘ遺伝子の発現量を測定する。
（ｉｉ）Ｘ遺伝子の翻訳産物であるタンパク質の発現量を測定する。
（ｉｉｉ）Ｘ遺伝子の翻訳産物であるタンパク質に由来する活性量を測定する。
（ｉｖ）Ｘ遺伝子の変異の有無を調べる。
（ｖ）Ｘ遺伝子の有無を調べる。
【００６０】
以下、本発明にかかるＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法について、より詳細に説明するが、本明細書において、「遺伝子の発現量」とは、当該遺伝子の転写量、すなわち、ｍＲＮＡ量を意味するだけではなく、当該遺伝子の翻訳産物であるタンパク質量をも含む意味で用いている。逆に、「タンパク質の発現量」についても、当該タンパク質の発現量に加えて、当該タンパク質をコードする遺伝子の発現量、すなわち、ｍＲＮＡ量をも含む意味で用いている。
【００６１】
体内時計遺伝子の発現を評価する方法として、体内時計遺伝子の発現量を測定する方法を用いる場合、上記体内時計遺伝子の発現量の測定方法は、特に限定されるものではない。具体的には、上記体内時計遺伝子の発現量の測定方法は、ｍＲＮＡレベルで当該体内時計遺伝子の発現量を測定する方法であっても、また、タンパク質レベルで上記体内時計遺伝子の発現量の測定する方法であっても、さらにその両方を測定する方法であってもよい。より具体的には、（Ａ）体内時計遺伝子のｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を定量することにより、当該体内時計遺伝子の発現量を測定する方法、（Ｂ）体内時計遺伝子の翻訳産物であるタンパク質を定量することにより、当該体内時計遺伝子の発現量を測定する方法のいずれをも用いることができる。また、上記（Ａ）および（Ｂ）の両方の方法で上記体内時計遺伝子の発現量を測定してもよい。そうすることにより、上記体内時計遺伝子の発現量をより正確に測定することができる。以下、上記（Ａ）および（Ｂ）の方法について説明する。
【００６２】
（Ａ）ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を用いる方法
ｍＲＮＡを利用する場合、例えば、被験者から採取した試料より抽出したｍＲＮＡまたは全ＲＮＡを用いて、ノザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイを用いた方法などにより当該体内時計遺伝子のｍＲＮＡを定量することができる。さらには、ＲＴ−ＰＣＲ法等の遺伝子増幅技術を利用することができる。ＲＴ−ＰＣＲ法においては、遺伝子の増幅過程においてＰＣＲ増幅モニター法を用いることにより、本発明の遺伝子の発現について、より定量的な解析を行うことが可能である。
【００６３】
上記ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法においては、両端に互いの蛍光を打ち消し合うことができる異なる蛍光色素で標識したプライマーを用い、検出対象（ＤＮＡもしくはＲＮＡの逆転写産物）にハイブリダイズさせる。ＰＣＲが進んでＴａｑポリメラーゼの５'−３'エクソヌクレアーゼ（exonuclease）活性により上記プライマーが分解されると二つの蛍光色素が離れ、蛍光が検出されるようになる。この蛍光の検出をリアルタイムに行う。上記検出対象についてコピー数の明らかな標準試料についても同時に測定することにより、ＰＣＲ増幅の直線性のあるサイクル数で目的試料中の検出対象のコピー数を決定する（Holland,P.M.et al.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7276-7280;Livak,K.J.et al.,1995,PCR Methods and Applications 4(6):357-362;Heid,C.A.et al.,Genome Research 6:986-994;Gibson,E.M.U.et al.,1996,Genome Research 6:995-1001を参照）。これにより、検出対象を定量することができる。ＰＣＲ増幅モニター法においては、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００（ＰＥバイオシステムズ社）を用いることができる。
【００６４】
上記プライマーは、特に限定されるものではなく、当該体内時計遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を利用して、従来公知の方法で設計すればよい。
【００６５】
上記試料からｍＲＮＡまたは全ＲＮＡを抽出する方法は、特に限定されるものではなく、上記体内時計遺伝子を発現する生物学的試料（例えば、細胞、組織、生物個体等）などから、従来公知の方法を用いてｍＲＮＡまたは全ＲＮＡを抽出することができる。上記生物学的試料としては、具体的には、胸腺、肝、脾、および四肢関節周囲軟部組織を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００６６】
また、上記ＲＴ−ＰＣＲに用いるプライマーや、ノザンハイブリダイゼーション法やドットブロット法に用いるプローブを蛍光色素などにより標識する場合、その標識方法は特に限定されるものではない。例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩを用いるニックトランスレーション法、ポリヌクレオチドキナーゼを用いる末端標識法、クレノーフラグメントによるフィルイン末端標識法（Berger SL,Kimmel AR.(1987)Guide to Molecular Cloning Techniques,Method in Enzymology,Academic Press;Hames BD,Higgins SJ(1985)Genes Probes:A Practical Approach.IRL Press;Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.(1989)Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2nd Edn.Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照）、ＲＮＡポリメラーゼを用いる転写による標識法（Melton DA,Krieg,PA,Rebagkiati MR,Maniatis T,Zinn K,Green MR.(1984)Nucleic Acid Res.,12,7035−7056を参照）、放射性同位体を用いない修飾ヌクレオチドをＤＮＡに取り込ませる方法（Krick a LJ.(1992)Nonisotopic DNA Probing Techniques.Academic Pressを参照）などを用いることができる。
【００６７】
（Ｂ）タンパク質を用いる方法
被験者から採取した試料より抽出したタンパク質を用いる場合、分析対象となる体内時計遺伝子の翻訳産物であるタンパク質に特異的に結合する抗体を用いて、ウェスタンブロット法やＥＬＩＳＡ法などの従来公知の免疫化学的手法により当該タンパク質を定量することができる。また、分析対象となるタンパク質の活性を測定することにより、当該タンパク質を定量することができる。さらに、本発明はこれに限定されず、従来公知のあらゆる手法を用いて、当該タンパク質を定量することができる。このように、体内時計遺伝子の翻訳産物であるタンパク質を定量することで、上記体内時計遺伝子の発現量を測定することができる。
【００６８】
また、試料からタンパク質を抽出する方法は、特に限定されるものではなく、上記タンパク質を含有する生物学的試料（例えば、細胞、組織、生物個体等）などから、当該タンパク質が分解されない条件下で、従来公知の緩衝液および装置、キット等を用いてタンパク質を抽出することができる。上記生物学的試料としては、具体的には、胸腺、肝、脾、四肢関節周囲軟部組織、末梢血リンパ球、および胸腺もしくは脾より採取したリンパ球を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００６９】
上記抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。また、上記抗体の取得方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。例えば、ポリクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物 の血液を取り出し、この血液から公知の方法により血清を分離することにより取得することができる。また、ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用することができる。さらに、必要に応じてこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離してもよい。
【００７０】
また、モノクローナル抗体は、例えば、抗原を感作した哺乳動物から免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞などと細胞融合させて得られたハイブリドーマをクローニングして、その培養物から抗体を回収することにより取得することができる。
【００７１】
本発明にかかるＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法においては、上記（Ａ）および／または（Ｂ）に例示したような方法で、被験者における体内時計遺伝子の発現量を測定する。その後、その発現量を、同様の方法で測定した健常者の発現量と比較する。両者の間で有意な相違が見られた場合、当該被験者は、体内時計に異常がある可能性があると判定する。上述したように、体内時計の異常は、睡眠障害を引き起こし、ＲＡを発症する可能性を示唆するものである。
【００７２】
より具体的にいえば、上記体内時計遺伝子がCry1遺伝子またはCry2遺伝子である場合、これら遺伝子の発現量が健常者と比較して低下していれば、ＲＡを発症している、もしくは将来発症する可能性が高いと判定することができる。また、上記体内時計遺伝子がPer1遺伝子、Per2遺伝子、またはPer3遺伝子である場合、これら遺伝子の発現量が健常者と比較して低下していれば、ＲＡを発症している、もしくは将来発症する可能性が高いと判定することができる。さらに上記体内時計遺伝子がClock遺伝子またはBMAL1遺伝子である場合、これら遺伝子の発現量が健常者と比較して上昇していれば、ＲＡを発症している、もしくは将来発症する可能性が高いと判定することができる。
【００７３】
すなわち、本発明によれば、ＲＡおよびＲＡの睡眠障害を現在発症しているか、もしくは将来的にＲＡおよびＲＡの睡眠障害を発症する可能性があると判定することができる。
【００７４】
また、本発明では、体内時計遺伝子の発現を評価する方法として、体内時計遺伝子の変異の有無を調べる方法を用いることもできる。この場合の体内時計遺伝子の変異は、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）、または翻訳産物であるタンパク質を用いて、従来公知の方法により調べることができる。
【００７５】
具体的には、ゲノムＤＮＡを用いる場合、例えば、アリル特異的オリゴヌクレオチドプローブ法、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（Oligonucleotide Ligation Assay）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＣＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＨＰＦＡ法、インベーダー法、ＲＣＡ（Rolling Circle Amplification）法、プライマーオリゴベースエクステンション（Primer Oligo Base Extension）法、タイリング・アレイ法、および変性勾配ゲル電気泳動法などを用いて変異の有無を調べることができる。上記ゲノムＤＮＡは、常法により人体の全ての細胞より得ることが可能であるが、例えば、毛髪、各臓器、末梢リンパ球、滑膜細胞などから得ることができる。また、得られた細胞を培養し、増殖したものから得ることもできる。さらに、末梢血から得ることも可能である。
【００７６】
得られたゲノムは、そのまま用いてもよいし、例えば、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence based amplification）法、ＴＭＡ（Transcription-mediated amplification）法およびＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅して用いてもよい。
【００７７】
また、ｍＲＮＡを用いる場合、例えば、被験者の細胞より抽出したｍＲＮＡから逆転写反応によってｃＤＮＡを作製し、上記遺伝子の領域を増幅後、増幅断片の塩基配列を直接シークエンスすることにより、またはＤＮＡチップを用いることにより、あるいはＲＦＬＰ（Restriction Fragment Length Polymorphism）法を用いることにより、体内時計遺伝子の変異の有無を決定することができる。
【００７８】
また、被験者の細胞より調製したタンパク質を用いる場合、通常のタンパク質のシークエンス方法に準ずればよく、例えば、正常型もしくは変異型の体内時計タンパク質のみを認識する抗体を作製し、ＥＬＩＳＡ法で検出する方法、タンパク質を単離し、直接または必要に応じ、酵素等で切断し、プロテインシークエンサーを利用して変異を検出する方法、アミノ酸の等電点の変異を検出する方法および質量分析により質量の差を検出する方法が挙げられる。
【００７９】
このように、体内時計遺伝子の発現を評価する方法として、体内時計遺伝子の変異の有無を調べる方法を用いる場合、体内時計遺伝子における変異が検出されれば、ＲＡおよびＲＡの睡眠障害を現在発症しているか、もしくは将来的にＲＡおよびＲＡの睡眠障害を発症する可能性があると判定することができる。この場合、さらに、翻訳産物であるタンパク質の定量や活性を評価することにより、健常者と比較して、体内時計遺伝子の発現に異常がないか調べることが好ましい。これにより、判定精度をより高めることができる。
【００８０】
例えば、Cry1遺伝子、Cry2遺伝子、Per1遺伝子、Per2遺伝子、またはPer3遺伝子に変異が検出され、その結果、これら遺伝子の発現量が健常者と比較して低下していれば、ＲＡを発症している、もしくは将来発症する可能性が高いと判定することができる。また、Clock遺伝子またはBMAL1遺伝子に変異があり、その結果、これら遺伝子の発現量が健常者と比較して上昇していれば、ＲＡを発症している、もしくは将来発症する可能性が高いと判定することができる。
【００８１】
また、本発明では、体内時計遺伝子の発現を評価する方法として、体内時計遺伝子の有無を調べる方法を用いることもできる。具体的には、被験者のゲノムＤＮＡ上に、体内時計遺伝子が存在するかを従来公知の方法により調べることで、体内時計遺伝子の有無を調べることができる。体内時計遺伝子の欠損は、睡眠障害を引き起こし、ＲＡを発症する可能性を示唆するものである。
【００８２】
より具体的にいえば、Cry1遺伝子、Cry2遺伝子、Per1遺伝子、Per2遺伝子、またはPer3遺伝子が欠損している場合、ＲＡおよびＲＡの睡眠障害を発症している、もしくは将来発症する可能性が高いと判定することができる。
【００８３】
本発明にかかるＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法は、さらに、Wee1キナーゼの発現量を測定する工程を含むことが好ましい。これにより、より精度よく、ＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性を判定することができる。より具体的には、被験者において測定したWee1キナーゼの発現量を、同様の方法で測定した健常者におけるWee1キナーゼの発現量と比較する。その結果、両者の間で有意な相違が見られた場合、具体的には、被験者においてWee1キナーゼの発現量の上昇が見られた場合、当該被験者は、ＲＡおよびＲＡの睡眠障害を現在発症しているか、もしくは将来的にＲＡおよびＲＡの睡眠障害を発症する可能性があると判定することができる。
【００８４】
上記「Wee1キナーゼの発現量」には、Wee1キナーゼをコードするwee1遺伝子の転写レベルでの発現量、すなわちwee1遺伝子のｍＲＮＡ量、およびWee1キナーゼのタンパク質レベルでの発現量、すなわちWee1キナーゼのタンパク質量の両方の意味が含まれる。つまり、上記「Wee1キナーゼの発現量を測定する」とは、Wee1キナーゼの転写レベルでの発現量およびタンパク質レベルでの発現量のいずれを測定するものであってもよい。また、転写レベルでの発現量およびタンパク質レベルの両方の発現量を測定するものであってもよい。これにより、Wee1キナーゼの発現量をより精度よく測定することができる。
【００８５】
Wee1キナーゼの発現量を測定する方法は、特に限定されるものではなく、上述した体内時計遺伝子の発現量を測定する方法と同様の方法を用いることができる。
【００８６】
また、上記wee1遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０３３５４２やＮＰ＿００３３８１に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００９５１６に登録されている塩基配列の３１１番目から２２５１番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子や、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００３３９０に登録されている塩基配列の１１４２番目から３０８２番目までの塩基配列をＯＲＦとして有している遺伝子を例示することができる。
【００８７】
さらに、本発明にかかるＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法は、c-fos遺伝子の発現量を測定する工程を含むことが好ましい。これにより、さらに高精度にＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性を判定することができる。より具体的には、被験者において測定したc-fos遺伝子の発現量を、同様の方法で測定した健常者におけるc-fos遺伝子の発現量と比較する。その結果、両者の間で有意な相違が見られた場合、具体的には、被験者においてc-fos遺伝子の発現量の上昇が見られた場合、当該被験者は、ＲＡおよびＲＡの睡眠障害を現在発症しているか、もしくは将来的にＲＡおよびＲＡの睡眠障害を発症する可能性があると判定することができる。
【００８８】
上記「c-fos遺伝子の発現量」には、c-fos遺伝子の転写レベルでの発現量、すなわちc-fos遺伝子のｍＲＮＡ量、およびc-fos遺伝子の翻訳産物であるタンパク質の発現量、すなわちc-fos遺伝子タンパク質の量の両方の意味が含まれる。つまり、上記「c-fos遺伝子の発現量を測定する」とは、c-fos遺伝子の転写レベルでの発現量およびタンパク質レベルでの発現量のいずれを測定するものであってもよい。また、転写レベルでの発現量およびタンパク質レベルの両方の発現量を測定するものであってもよい。これにより、c-fos遺伝子の発現量をより精度よく測定することができる。
【００８９】
c-fos遺伝子の発現量を測定する方法は、特に限定されるものではなく、上述した体内時計遺伝子の発現量を測定する方法と同様の方法を用いることができる。
【００９０】
また、上記c-fos遺伝子としては、例えば、ＮＣＢＩアクセション番号ＣＡＡ２４７５６に登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
【００９１】
本発明において、上記被験者は、特に限定されるものではないが、自覚症状として、睡眠障害、例えば、不眠を訴えている者や、関節炎を疑わせる症状を有する者であることが好ましい。さらに、本発明にかかるＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法が適用される試料は、人体等の生体から分離された試料であればよく、上記例示されたものに限定されるものではない。
【００９２】
＜２．ＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定キット＞
本発明にかかるＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定キット（換言すれば、ＲＡの診断キット）は、上記体内時計遺伝子の発現量を測定するための試薬を少なくとも含んでいればよく、その他の構成は特に限定されるものではない。上記体内時計遺伝子の発現量を測定するための試薬としては、例えば、プライマー、プローブ、および抗体などを挙げることができる。これらの試薬は、単独で含まれてもよく、また、複数の組み合わせで含まれていてもよい。さらに、上記判定キットは、上記例示する試薬に加えて、その他の試薬を組み合わせることによっても得ることができる。
【００９３】
具体的には、ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）または全ＲＮＡを用いて上記体内時計遺伝子の発現量を測定するキットとしては、上記体内時計遺伝子のｃＤＮＡの一部の領域を増幅できるように設計されたプライマーおよび／または上記体内時計遺伝子のｍＲＮＡに結合できるように設計されたプローブを含み、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法やノザンブロット法に用いられる試薬など、体内時計遺伝子の発現量を測定するために必要な試薬を１つ以上組み合わせたキットが挙げられる。なお、かかる試薬は、採用される検出方法に応じて適宜選択採用されるが、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ＤＮＡ合成酵素等を挙げることができる。さらに、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法やノザンブロット法に用いることが可能な適当な緩衝液および洗浄液等が含まれていてもよい。
【００９４】
上記プライマーやプローブは、特に限定されるものではない。具体的には、上記プライマーは、上記体内時計遺伝子のｃＤＮＡの一部の領域を増幅できるものであればよい。また、上記プローブは、上記体内時計遺伝子のｍＲＮＡに結合できるように設計されたものであればよい。
【００９５】
さらに、タンパク質レベルで上記体内時計遺伝子の発現量を測定するキットとしては、例えば体内時計遺伝子の翻訳産物であるタンパク質を認識する抗体を含むキットなどが挙げられる。
【００９６】
また、上記判定キットには、Wee1キナーゼおよび／またはc-fos遺伝子の発現量を測定するために用いるプライマーや、プローブ、抗体が含まれることが好ましい。上記構成によれば、より精度よく、ＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性を判定することができる。
【００９７】
上述した判定キットを使用することにより、上記＜１．ＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法＞の項で述べたように、ＲＡの診断（発症または発症可能性の判定）を客観的かつ簡便に行うことができる
また、本発明にかかるＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定キットが適用される被験者は、特に限定されるものではないが、自覚症状として、睡眠障害、例えば、不眠を訴えている者や、関節炎を疑わせる症状を有する者であることが好ましい。
【００９８】
＜３．ＲＡ発症モデル動物およびその製造方法＞
本発明にかかるＲＡ発症モデル動物は、体内時計遺伝子に異常が見られ、Wee1キナーゼの発現量が過剰に上昇し、ＲＡを発症しているモデル動物である。
【００９９】
本明細書において、「モデル動物」とは、ヒトの疾患に対する予防法または治療法を開発するために用いられる実験動物をいい、具体的には、マウス、ラット、ウサギ、サル、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、イヌなどの非ヒト哺乳動物、およびその他の脊椎動物が挙げられる。
【０１００】
上記体内時計遺伝子の異常とは、当該体内時計遺伝子の発現量の異常をもたらす体内時計遺伝子の異常であって、その原因は特に限定されるものではない。具体的には、体内時計遺伝子が破壊されることにより、体内時計遺伝子の発現量に異常が見られるモデル動物、いわゆる体内時計遺伝子のノックアウトモデル動物や、体内時計遺伝子に変異が導入された結果、体内時計遺伝子の発現量に異常が見られるモデル動物の変異体などが挙げられる。上記変異は、体内時計遺伝子の発現量を低下させる変異であっても、上昇させる変異であってもよい。
【０１０１】
上記変異とは、遺伝子の置換、欠失、挿入、あるいは付加を示すものである。本発明においては、当該体内時計遺伝子の翻訳産物であるタンパク質のアミノ酸配列に変異を導入するものであることが好ましい。また、別の形態としては、当該体内時計遺伝子の転写調節領域を変異させることにより、当該体内時計遺伝子の発現そのものを調節するものであってもよい。
【０１０２】
本発明にかかるＲＡ発症モデル動物では、さらに、c-fos遺伝子の発現量が過剰に上昇していることが好ましい。このようなモデル動物では、Wee1キナーゼの過剰発現により細胞分裂が抑制され、かつc-fos遺伝子の発現量が過剰に上昇することにより細胞増殖が活性化されるので、モデル動物にＲＡを発症させることができる。
【０１０３】
上記体内時計遺伝子は特に限定されるものではなく、具体的には、上記＜１．ＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法＞の項で例示したものを同様に挙げることができる。その中でも、上記体内時計遺伝子は、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子であって、上記体内時計遺伝子の異常は、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子の破壊であることが好ましい。すなわち、本発明にかかるＲＡ発症モデル動物は、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子がともに破壊されたノックアウトモデル動物（以下、「cry1/2KOモデル動物」ともいう）であることが好ましい。
【０１０４】
後述の実施例においても実証しているように、cry1/2KOモデル動物では、c-fos遺伝子およびwee1遺伝子の発現が上昇する。つまり、c-fos遺伝子の発現の上昇により細胞増殖が活性化され、wee1遺伝子の発現の上昇により細胞分裂が抑制されるので、ＲＡが発症する。
【０１０５】
上記体内時計遺伝子が、Per1遺伝子、Per2遺伝子、またはPer3遺伝子である場合、当該体内時計遺伝子の異常は、Per1遺伝子、Per2遺伝子、またはPer3遺伝子の発現を低下させる異常であることが好ましい。
【０１０６】
これによれば、wee1遺伝子の発現の上昇させることができ、その結果、当該モデル動物において、ＲＡを発症させることができる。
【０１０７】
上記体内時計遺伝子がClock遺伝子またはBMAL1遺伝子である場合、上記体内時計遺伝子の異常は、Clock遺伝子またはBMAL1遺伝子が過剰発現する異常であることが好ましい。
【０１０８】
Clock遺伝子またはBMAL1遺伝子の過剰発現は、上記wee1遺伝子を活性化し、発現量を増加させることができる。これにより、当該モデル動物において、ＲＡを発症させることができる。
【０１０９】
このようなＲＡ発症モデル動物は、体内時計の異常に伴い、睡眠障害を起こしている。したがって、上記ＲＡ発症モデル動物を用いることにより、ＲＡ患者に対する睡眠改善治療がＲＡの病態に及ぼす影響を評価することができ、新たなＲＡの治療方法の開発に用いることができる。
【０１１０】
本発明にかかるＲＡ発症モデル動物の製造方法は、Wee1キナーゼの発現量が過剰に上昇するようにモデル動物の体内時計遺伝子を操作する工程を含んでいればよく、その他の具体的な工程、材料、条件、使用装置、および使用機器等については、特に限定されるものではない。
【０１１１】
本明細書において、「モデル動物の遺伝子を操作する」とは、従来公知の遺伝子操作技術を用いて、モデル動物の遺伝子を操作するものであって、特に限定されるものではない。具体的には、モデル動物の遺伝子の遺伝子を破壊したり、当該遺伝子に変異を導入したり、さらには、当該モデル動物に外来遺伝子を導入したり、モデル動物を交雑したりすることをすべて包含する意味である。
【０１１２】
本発明において、モデル動物に特定の遺伝子を導入する方法としては、例えば、遺伝子と卵を混合してリン酸カルシウムで処理する方法；位相差顕微鏡下で前核期卵の核に、微小ピペットで遺伝子を直接導入する方法（マイクロインジェクション法、米国特許第４８７３１９１号）；胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を使用する方法；レトロウィルスベクターに遺伝子を挿入し、卵に感染させる方法；精子を介して遺伝子を卵に導入する精子ベクター法等を挙げることができる。上記精子ベクター法とは、精子に外来遺伝子を付着またはエレクトロポレーション等の方法で精子細胞内に取り込ませた後に、卵子に受精させることにより、外来遺伝子を導入する遺伝子組換え法である（M.LavitranoetらCell,57,717,1989を参照）。
【０１１３】
また、本発明にかかるＲＡ発症モデル動物の製造方法において、モデル動物の体内時計遺伝子を破壊する場合の方法としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞ともいう）を用いて相同組換えを行い、一方の対立遺伝子を改変・破壊した胚性幹細胞を選別することにより、ノックアウト動物を製造する方法を用いることができる。より具体的には、受精卵に遺伝子を操作した胚性幹細胞を注入して、胚性幹細胞由来の細胞と胚由来の細胞が混ざったキメラ動物を得る。このキメラ動物と正常マウスとを交配することにより、一方の対立遺伝子の全てが改変・破壊されたヘテロ接合体を得ることができる。さらに、ヘテロ接合体同士を交配することにより、ホモ接合体を得ることができる。本発明にかかるＲＡ発症モデル動物は、これらヘテロ接合体と、ホモ接合体とのいずれをも含むものである。
【０１１４】
上記用語「キメラ」とは、２個以上の受精卵に基づいた体細胞で形成される単一個体をいう。また、用語「相同組換え」とは、遺伝子組換え機構で塩基配列が同じ、または非常に類似している２つの遺伝子間で起こる組換えのことをいう。相同組換えを起こした細胞の選別は、従来公知の方法およびそれらの変法を用いて容易に行うことができる。例えば、挿入遺伝子の一部、および挿入が期待される領域の一部の配列をもとに設計したプライマーを用いて、ＰＣＲを行い、増幅産物が生じた場合には、その細胞で相同組換えを起こしていると判定することができる。また、胚性幹細胞で発現している遺伝子に相同組み換えを起こさせる場合には、導入遺伝子にネオマイシン耐性遺伝子などのマーカー遺伝子を結合させておき、そのマーカー遺伝子を用いて相同組換えが起こった細胞を選択することができる。
【０１１５】
以上のように、本発明にかかるＲＡ発症モデル動物の製造方法によれば、Wee1キナーゼの発現量が上昇するように、モデル動物の体内時計遺伝子を操作することにより、ＲＡを発症したモデル動物を製造することができる。
【０１１６】
このようにして得られるＲＡ発症モデル動物は、ＲＡの治療薬剤のスクリーニングやＲＡの研究に利用することができる。したがって、抗ＲＡ薬の候補物質をスクリーニングするスクリーニング方法であって、ＲＡのモデル動物に被験化合物を与える過程と、上記＜１．ＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法＞の項に記載の判定方法により、上記モデル動物のＲＡが治癒または改善されたか否かを診断する過程と、上記モデル動物のＲＡが治癒または改善していることを指標として、上記被験化合物が抗ＲＡ薬の候補化合物であると判定する過程と、を備えるスクリーニング方法も本発明に含まれる。
【０１１７】
＜４．ＲＡの治療薬剤のスクリーニング方法＞
本発明にかかるＲＡの治療薬剤のスクリーニング方法について、以下より詳細に説明する。
【０１１８】
本発明にかかるＲＡの治療薬剤のスクリーニング方法は、本発明にかかるＲＡ発症モデル動物に被験化合物を投与する工程と、当該被験化合物を投与されたＲＡ発症モデル動物におけるＲＡのマーカーを測定する工程とを含んでいればよい。つまり、上記ＲＡの治療薬剤のスクリーニング方法によれば、ＲＡ発症モデル動物に被験化合物を投与し、当該被験化合物を投与されたＲＡ発症モデル動物において、ＲＡが治癒または改善していることを指標として、上記被験物質が抗ＲＡ薬の候補化合物であると判定することができる。
【０１１９】
上記被験化合物は、特に限定されるものではないが、Wee1キナーゼの発現を阻害することが期待される化合物またはWee1キナーゼの活性を阻害することが期待される化合物であることが好ましい。また、上記被験化合物は、睡眠を誘導する薬剤などのように、睡眠障害の治療に用いることができる薬剤であってもよい。
【０１２０】
このような被験化合物を本発明にかかるＲＡ発症モデル動物に投与する方法は、特に限定されるものではなく、その被験化合物の物性等に応じて、それに適した方法を従来公知のものから選択して用いればよい。
【０１２１】
また、上記ＲＡのマーカーとは、ＲＡの診断や治療において、ＲＡの発症や進行を判定するために用いられるマーカーを意味する。本発明において、上記ＲＡのマーカーは、特に限定されるものではないが、例えば、上述した体内時計遺伝子、wee1遺伝子、またはc-fos遺伝子を挙げることができる。また、本発明においては、ＩＬ−１、ＩＬ−６、またはＴＮＦ−αのような炎症性サイトカインや、リウマトイド因子（以下、「ＲＦ」という）、抗ガラクトース欠損ＩｇＧ抗体などをＲＡのマーカーとして用いることができる。
【０１２２】
上記ＲＡのマーカーの測定方法は、特に限定されるものではなく、測定するＲＡのマーカーに種類に応じて、適宜従来公知の方法から選択することが好ましい。例えば、上述した体内時計遺伝子、wee1遺伝子、またはc-fos遺伝子をＲＡのマーカーとする場合、それら遺伝子の発現量は、＜１．ＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法＞の項で述べた方法を用いて測定することができる。
【０１２３】
＜５．ＲＡの治療薬剤および治療方法＞
本発明にかかるＲＡの治療薬剤は、睡眠障害を改善する物質を含有するものであればよく、その他の具体的な構成は特に限定されるものではない。特に、Wee1キナーゼの発現量を抑制するものであることが好ましい。上記構成によれば、ＲＡ患者において、c-fos遺伝子の過剰発現により細胞が過剰増殖した場合であっても、細胞分裂が阻止されることがなく、ＲＡにおける腫瘍様の病態の進行を抑制することができる。
【０１２４】
上記睡眠障害を改善する物質としては、睡眠導入薬を挙げることができる。より具体的には、ジアゼパム剤や、メラトニンとビタミンＢ１２とを含む配合剤などを挙げることができる。
【０１２５】
また、本発明にかかるＲＡの治療薬剤は、＜４．ＲＡの治療薬剤のスクリーニング方法＞の項で述べた方法を用いることにより、候補化合物から選抜することにより取得することができる。
【０１２６】
ところで、臨床適用のための治療薬剤の投与条件は、本明細書に記載したＲＡのモデル動物系を用いて決定することができる。すなわち、上記モデル動物を用いて投与量、投与間隔、投与ルートを含む投与条件を検討し、適切な予防または治療効果を得られる条件を決定することができる。このような治療薬剤は、ＲＡに対する予防または治療のための医薬となる。
【０１２７】
また、治療薬剤は、薬学的に許容できる所望の担体と組み合わせて組成物とすることができる。担体としては、例えば、滅菌水、生理食塩水、緩衝剤、植物油、乳化剤、懸濁剤、塩、安定剤、保存剤、界面活性剤、徐放剤、他のタンパク質（ＢＳＡなど）、トランスフェクション試薬（リポフェクション試薬、リポソーム等を含む）等が挙げられる。さらに、使用可能な担体としては、グルコース、ラクトース、アラビアゴム、ゼラチン、マンニトール、デンプンのり、マグネシウムトリシリケート、タルク、コーンスターチ、ケラチン、コロイドシリカ、ばれいしょデンプン、尿素などが挙げられる。
【０１２８】
製剤化する場合の剤型は制限されず、たとえば溶液（注射剤）、粉体、マイクロカプセル、錠剤などであってよい。投与は全身または局所的に行い得るが、全身投与による副作用や効果の低下がある場合には、局所投与することが好ましい。例えば本治療薬剤を徐放剤と組み合わせ、ＲＡを呈する疾患部位を標的とするドラッグデリバリーにより効果的に治療を行うことが可能と考えられる。
【０１２９】
また、患者への投与は、特に限定されるものではなく、有効成分の性質に応じて、経口的に、または非経口的に行うことができる。経口的に投与する剤型としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、または懸濁剤等を選択することができる。非経口的な投与としては、例えば、経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、関節内、皮下、脊髄腔内、もしくは脳室内への投与が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、非経口的に投与する剤型としては、例えば、注射剤、座薬、塗り薬等を挙げることができる。上記注射剤としては、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を挙げることができる。投与は全身的または局所的にされ得るが、全身投与による副作用が問題となる場合には病変部位への局所投与が好ましい。投与量、投与方法は、治療薬剤の有効成分の組織移行性、治療目的、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
【０１３０】
また、本発明の治療薬剤は一般的に、総組成物の重量で０．１〜９０％の治療薬物を含む。非経口投与では、１日当たり体重１ｋｇ当たり、０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜３００ｍｇ、より好ましくは０．０１ｍｇ〜１００ｍｇである。しかし、疾患状態、体重、及び治療に対する患者の個々反応、治療薬剤が投与される組成物の種類、および投与形態、病気の経過の段階または投与の間隔に依存して、これら投与速度は適宜調整する。したがって、上述した最小投与量より少なく使うことがときには適量であり、一方、他の場合には治療効果を得るために上限を越える必要がある。投与は１回〜数回に分けて行うことができ、１日あたり１〜５回投与することができる。
【０１３１】
対象となる個体は、例えばヒト、およびマウス、ラット、ウサギ、サルなどの非ヒト哺乳動物、およびその他の脊椎動物が挙げられる。非ヒト哺乳動物への適用は、ヒトＲＡに対する予防法または治療法を開発するためのモデルとする上でも有用である。これにより、例えばＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症を予防する新たな治療プロトコルを開発することができる。したがって、本発明には、本発明にかかる治療薬剤を、ＲＡ患者に睡眠障害を緩和する薬剤を投与することにより、Wee1キナーゼの発現を抑制することにより、ＲＡを予防または治療するＲＡおよびＲＡの睡眠障害の予防または治療の方法が含まれる。
【０１３２】
なお本発明は、以上例示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術範囲に含まれる。
【実施例】
【０１３３】
本発明について、実施例および図１〜３に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。
【０１３４】
〔実施例１：体内時計の破壊による関節炎の発症〕
７〜８週齢のマウス（野生型マウス、並びに、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子を破壊したマウス（以下、「Cry-/-マウス」ともいう））の腹腔内に関節炎惹起モノクローナル抗体カクテル（Chondrex社、商品コードNo.62200）を５ｍｇ投与し、四肢関節の腫脹を１〜４点のスコア化することにより関節炎の発症を評価した。観察は、関節炎カクテル投与後、４〜５週間後まで行った。
【０１３５】
野生型マウス、およびCry-/-マウスにおいて、関節炎の発症を比較したところ、Cry-/-マウスにやや強い関節炎誘導の傾向が見られた。すなわち、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子を破壊したマウスでは、関節炎を発症することが分かった。
【０１３６】
〔実施例２：関節炎におけるc-Fosタンパク質およびWee1キナーゼタンパク質の発現の上昇〕
関節炎発症後のマウスを屠殺し、肝臓より抽出したタンパク質におけるc-Fosタンパク質およびWee1キナーゼの発現量を、各タンパク質に対して特異的な抗体を用いて、ウェスタンブロット法により評価した。その結果、Cry-/-マウスにおいては、c-Fosタンパク質およびWee1キナーゼの発現が有意に強く誘導された。すなわち、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子を破壊したマウスでは、ＲＡに見られるのと同様の現象が起こることが分かった。
【０１３７】
〔実施例３：体内時計の破壊による炎症性サイトカインの上昇〕
関節炎発症後のマウスを屠殺し、単離した脾細胞を抗ＣＤ３抗体（２μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ２８抗体（５μｇ／ｍｌ）を用いて２４時間刺激培養した。その後、培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法により培養上清中のＴＮＦ−αを測定した。
【０１３８】
その結果、免疫の有無に関わらず、Cry-/-マウスの血清ＴＮＦ−α値が有意に高かった。ＲＡでは、ＴＮＦ−αが上昇することから、本実施例の結果からも、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子を破壊したマウスでは、ＲＡに見られるのと同様の現象が起こることが分かった。
【０１３９】
なお、本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１４０】
以上のように、本発明では、体内時計遺伝子の発現量を指標として、ＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性を判定することができる。それゆえ、ＲＡおよびＲＡの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法や判定キットに代表される診断医療の分野だけでなく、保健医学分野に広く利用することができる。さらに、本発明では、上記体内時計遺伝子を用いてＲＡ発症モデル動物を製造することができる。このようなＲＡ発症モデル動物は、ＲＡの治療薬剤や治療方法の開発に用いることができる。それゆえ、本発明は、製薬分野をはじめ、生命科学分野の産業に広く利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】本発明の実施形態にかかるＲＡ発症モデル動物における関節炎の発症を調べた結果を示す図である。
【図２】本発明の実施形態にかかるＲＡ発症モデル動物におけるc-Fosタンパク質およびWee1キナーゼタンパク質の発現を調べた結果を示す図である。
【図３】本発明の実施形態にかかるＲＡ発症モデル動物における炎症性サイトカインを測定した結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から分離した試料を用いて、体内時計遺伝子の発現を評価する工程を含むことを特徴とする関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法。
【請求項２】
体内時計遺伝子が、Cry1遺伝子、Cry2遺伝子、Clock遺伝子、BMAL1遺伝子、Per1遺伝子、Per2遺伝子、Per3遺伝子、およびカゼインキナーゼ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法。
【請求項３】
Wee1キナーゼの発現量を測定する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１または２に記載の関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法を実施するために用いるキットであって、
体内時計遺伝子の発現量を測定するために用いるプライマー、プローブ、および抗体のうち、少なくとも１つを含有することを特徴とする関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定キット。
【請求項５】
さらに、Wee1キナーゼの発現量を測定するために用いるプライマー、プローブ、および抗体のうち、少なくとも１つを含有することを特徴とする請求項４に記載の関節リウマチの発症またはその可能性の判定キット。
【請求項６】
体内時計遺伝子に異常が見られ、Wee1キナーゼの発現量が過剰に上昇していることを特徴とする関節リウマチ発症モデル動物。
【請求項７】
上記体内時計遺伝子の異常が、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子の破壊であることを特徴とする請求項６に記載の関節リウマチ発症モデル動物。
【請求項８】
Wee1キナーゼの発現量が過剰に上昇するように体内時計遺伝子を操作する工程を含むことを特徴とする関節リウマチ発症モデル動物の製造方法。
【請求項９】
上記体内時計遺伝子の操作が、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子の破壊であることを特徴とする請求項８に記載の関節リウマチ発症モデル動物の製造方法。
【請求項１０】
請求項６または７に記載の関節リウマチ発症モデル動物に、被験化合物を投与する工程と、
当該被験化合物を投与された関節リウマチ発症モデル動物における関節リウマチのマーカーを測定する工程とを含むことを特徴とする関節リウマチの治療薬剤のスクリーニング方法。
【請求項１１】
上記被験化合物が、Wee1キナーゼの発現を阻害することが期待される化合物またはWee1キナーゼの活性を阻害することが期待される化合物であることを特徴とする請求項１０に記載の関節リウマチの治療薬剤のスクリーニング方法。
【請求項１２】
睡眠障害を改善する物質を含有することを特徴とする関節リウマチの治療薬剤。
【請求項１３】
Wee1キナーゼの発現量を抑制することを特徴とする請求項１２に記載の関節リウマチの治療薬剤。
【請求項１】
生体から分離した試料を用いて、体内時計遺伝子の発現を評価する工程を含むことを特徴とする関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法。
【請求項２】
体内時計遺伝子が、Cry1遺伝子、Cry2遺伝子、Clock遺伝子、BMAL1遺伝子、Per1遺伝子、Per2遺伝子、Per3遺伝子、およびカゼインキナーゼ遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法。
【請求項３】
Wee1キナーゼの発現量を測定する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１または２に記載の関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定方法を実施するために用いるキットであって、
体内時計遺伝子の発現量を測定するために用いるプライマー、プローブ、および抗体のうち、少なくとも１つを含有することを特徴とする関節リウマチおよび関節リウマチの睡眠障害の発症または発症可能性の判定キット。
【請求項５】
さらに、Wee1キナーゼの発現量を測定するために用いるプライマー、プローブ、および抗体のうち、少なくとも１つを含有することを特徴とする請求項４に記載の関節リウマチの発症またはその可能性の判定キット。
【請求項６】
体内時計遺伝子に異常が見られ、Wee1キナーゼの発現量が過剰に上昇していることを特徴とする関節リウマチ発症モデル動物。
【請求項７】
上記体内時計遺伝子の異常が、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子の破壊であることを特徴とする請求項６に記載の関節リウマチ発症モデル動物。
【請求項８】
Wee1キナーゼの発現量が過剰に上昇するように体内時計遺伝子を操作する工程を含むことを特徴とする関節リウマチ発症モデル動物の製造方法。
【請求項９】
上記体内時計遺伝子の操作が、Cry1遺伝子およびCry2遺伝子の破壊であることを特徴とする請求項８に記載の関節リウマチ発症モデル動物の製造方法。
【請求項１０】
請求項６または７に記載の関節リウマチ発症モデル動物に、被験化合物を投与する工程と、
当該被験化合物を投与された関節リウマチ発症モデル動物における関節リウマチのマーカーを測定する工程とを含むことを特徴とする関節リウマチの治療薬剤のスクリーニング方法。
【請求項１１】
上記被験化合物が、Wee1キナーゼの発現を阻害することが期待される化合物またはWee1キナーゼの活性を阻害することが期待される化合物であることを特徴とする請求項１０に記載の関節リウマチの治療薬剤のスクリーニング方法。
【請求項１２】
睡眠障害を改善する物質を含有することを特徴とする関節リウマチの治療薬剤。
【請求項１３】
Wee1キナーゼの発現量を抑制することを特徴とする請求項１２に記載の関節リウマチの治療薬剤。
【図１】
【図３】
【図２】
【図３】
【図２】
【公開番号】特開２００７−１７４９５２（Ｐ２００７−１７４９５２Ａ）
【公開日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３７５９７９（Ｐ２００５−３７５９７９）
【出願日】平成１７年１２月２７日（２００５．１２．２７）
【出願人】（５０４１５６７０６）株式会社膠原病研究所 (13)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月２７日（２００５．１２．２７）
【出願人】（５０４１５６７０６）株式会社膠原病研究所 (13)
【Ｆターム（参考）】
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