関節炎を治療または予防するための薬学的組成物
【課題】 関節リウマチを治療（すなわち、関節炎を治療または予防）することを実現すること。
【解決手段】 配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む薬学的組成物を提供する。または、配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリヌクレオチドを含む薬学的組成物を提供する。
【解決手段】 配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む薬学的組成物を提供する。または、配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリヌクレオチドを含む薬学的組成物を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節炎を治療または予防するための薬学的組成物、および関節炎を治療または予防する方法に関するものである。より詳細には、本発明は、関節炎を治療または予防するためのＴＬ１Ａを含む薬学的組成物、およびＴＬ１Ａを投与することを特徴とする関節炎を治療または予防する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：以下「ＲＡ」ともいう）は、多発するびらん性関節炎を主徴とするが、同時に多臓器を障害する原因不明の全身性炎症疾患である。ＲＡは寛解と増悪とを繰り返しながら慢性に進行し、無治療で放置すると関節の破壊や変形を来し、やがて運動器の機能障害を呈してくる。時には生命をも脅かす。したがって、ＲＡ患者は身体的にも精神的にも大きな苦痛を生涯に亘って背負うことになる。ＲＡ治療（すなわち、関節炎の治療または予防）のための方法および治療剤の開発が望まれている。
【０００３】
本願発明者らは、マイクロサテライトマーカーを用いた連鎖解析をＲＡ患者およびその血縁者に対して実施することにより、関節リウマチの疾患遺伝子が位置する３カ所の遺伝子座を特定し、以下の疾患遺伝子を同定した（例えば、特許文献１を参照のこと）：
（１）ヒト第１染色体の、マイクロサテライトマーカーＤ１Ｓ２１４および／またはＤ１Ｓ２５３がハイブリダイズするＤＮＡ配列から±１センチモルガン以内に位置する関節リウマチの疾患遺伝子；
（２）ヒト第８染色体の、マイクロサテライトマーカーＤ８Ｓ５５６がハイブリダイズするＤＮＡ配列から±１センチモルガン以内に位置する関節リウマチの疾患遺伝子；
（３）ヒトＸ染色体の、マイクロサテライトマーカーＤＸＳｌ００１、ＤＸＳ１０４７、ＤＸＳ１２０５、ＤＸＳ１２２７および／またはＤＸＳ１２３２がハイブリダイズするＤＮＡ配列から±１センチモルガン以内に位置する関節リウマチの疾患遺伝子。
【０００４】
本願発明者らは、前記（１）の疾患関与遺伝子に関係するマーカーＤ１Ｓ２１４およびＤ１Ｓ２５３の疾患関与遺伝子として、デスレセプター３（ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３：「ＤＲ３」または「ＤＲ３遺伝子」ともいう）を挙げ、健常人とＲＡ患者との間にＤＲ３の制限断片長多型を確認し、ＤＲ３がＲＡにおける疾患関与遺伝子である可能性を示している（例えば、非特許文献１を参照のこと）。
【０００５】
さらに、本願発明者らは、ＤＲ３遺伝子のゲノム変異と関節リウマチ（慢性関節リウマチ）発症との関係について開示している（例えば、特許文献２を参照のこと）。
【０００６】
ＤＲ３は、６０アミノ酸残基からなるｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ（ＤＤ）を有し、ＮＦ−κＢの活性化およびアポトーシスを誘導する（例えば、非特許文献２および３を参照のこと）。このようなアポトーシスのシグナル伝達に関与するレセプターであるＤＲ３は、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリー（ＴＮＦＲ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ：ＴＮＦＲＳＦ）に属し（ＴＮＦＲＳＦ２５）、ＴＮＦＲ１と高い相同性を有することが知られている（例えば、非特許文献２および３を参照のこと）。また、ＤＲ３は主にリンパ系組織に発現しているが、本発明者らは、ＤＲ３が滑膜細胞にも発現されていることを確認している（例えば、非特許文献４を参照のこと）。
【０００７】
本発明者らは、これまでに、エクソン５とイントロン５において４つのＳＮＰおよび／または１４塩基の欠損を有する新たなＤＲ３ハプロタイプを同定し、これらの変異によって生じるＤＤ欠損型ＤＲ３が、正常型ＤＲ３とともに３量体を形成することによってアポトーシスを阻害することを明らかにした（未発表）。このＤＤ欠損型ＤＲ３は、家族性ＲＡ患者において高頻度に認められ、ＤＤ欠損型ＤＲ３を有するＲＡ患者の関節破壊は進行性であることが臨床的に示されている（未発表）。しかし、ＤＲ３が関節炎に関与することを示す直接的な証拠はなく、そのことを示すための具体的な手法も見出されていない
このようなＤＲ３について、そのリガンドを同定することが試みられている。ＤＲ３のリガンドとして、以前はＴＷＥＡＫなどが考えられていたが、ＴＷＥＡＫはＤＲ３を欠損している細胞においてもＮＦκＢ活性化およびアポトーシスを引き起こすため、ＤＲ３の特異的リガンドであるとは言い難く、よって、ＲＡ治療（関節炎の治療または予防）に有効であるとは言い難い（例えば、非特許文献５および６を参照のこと）。
【０００８】
現在、ＤＲ３に結合する因子の１つとしてＴＬ１Ａが同定されている（例えば、非特許文献２を参照のこと）。ＴＬ１ＡはＴＮＦＳＦに属するＴＮＦのひとつで、ＴＮＦＳＦ１５とも呼ばれている（例えば、非特許文献７を参照のこと）。ＴＬ１Ａは、ＤＲ３とｄｅｃｏｙレセプター（ＴＲ６／ＤｃＲ３）に対するリガンドであり、その発現はＴＮＦまたはＩＬ−１αによって誘導される（例えば、非特許文献２を参照のこと）。ＴＮＦおよびＩＬ−１αは、炎症性サイトカインであり、関節炎を増悪させる。また、ＤＲ３を発現している細胞において、ＴＬ１Ａは、ＮＦ−κＢ活性化およびアポトーシスを引き起こす（例えば、非特許文献２を参照のこと）。さらに、ＴＲ６とＦｃとの融合タンパク質であるＴＲ６−Ｆｃタンパク質は、ＴＬ１Ａ依存的なＮＦ−κＢ活性化およびアポトーシスのシグナル伝達を競合的に中和する（例えば、非特許文献２を参照のこと）。
【特許文献１】国際公開ＷＯ９８／５１７９１号（国際公開日：１９９８年１１月１９日）
【特許文献２】国際公開ＷＯ０２／３４９１２（国際公開日：２００２年５月２日）
【非特許文献１】リウマチ、第３９号、第２号、第４４４頁および第４４５頁（１９９９年）
【非特許文献２】Migone TS, et al. (2002) TL1A is a TNF-like ligand for DR3 and TR6/DcR3 and functions as a T cell costimulator. Immunity 16:479-92.
【非特許文献３】Chinnaiyan, A.M., et al. (1996) Signal transduction by DR3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95. Science 274:990-992
【非特許文献４】Miura Y., et al. (2004) Death Receptor 3 is specially expressed in rheumatoid synovium and TL1A, a physiological ligand for DR3, efficiently induces apoptosis in rheumatoid synovial fibroblasts that express DR3. Arthritis Rheum.50, S354
【非特許文献５】Kaptein, A. et al. (2000) Studies interaction between TWEAK and death receptor WSL1/TRAMP (DR3) . FEBS Lett. 485, 135-141
【非特許文献６】Wiley, S.R. et al. (2001) A novel TNF receptor family member binds TWEAK and is implicated in angiogenesis. Immunity 15, 837-846
【非特許文献７】Ware CF. (2004) The TNF superfamily. Cytokine Growth Factor Rev. 14:181-4.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このように、ＴＬ１Ａは、ＤＲ３特異的なリガンドとして有力な候補である。しかしながら、ＤＲ３を発現している細胞において、ＴＬ１ＡがＮＦ−κＢ活性化およびアポトーシスを引き起こすとはいえ、従来ＤＲ３のリガンドとして有力であったＴＷＥＡＫがＤＲ３を欠損している細胞においてもＮＦκＢ活性化およびアポトーシスを引き起こすことを考慮すると、ＴＬ１ＡがＤＲ３またはＴＲ６／ＤｃＲ３に結合するからといって、ＴＬ１Ａが生体内において実際にＤＲ３特異的なリガンドとして機能するとは言い難い。さらに、アポトーシスの誘導は炎症を抑制する働きがあるが、ＮＦ−κＢの活性化は細胞増殖反応および／または炎症反応を増強する働きがあり、このような相反するシグナル伝達に関与するＴＬ１Ａが実際にＤＲ３関連関節炎を抑制および／または阻害することができるのかどうかは、これまで具体的な手段がなかったために実証することができなかった。
【００１０】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＴＬ１Ａが関節炎に対してアポトーシスを誘導して炎症を抑制する働きをするのか、またはＮＦ−κＢを活性化して増殖反応および／または炎症反応を高める働きをするのかをインビトロおよび／またはインビボで示し、ＲＡ治療（関節炎の治療または予防）を実現することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に係る薬学的組成物は、関節炎を治療または予防するために、以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチド：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位からなるポリペプチド、または
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されているポリペプチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチド、
を含むことを特徴としている。
【００１２】
本発明に係る薬学的組成物は、関節炎を治療または予防するために、以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位において１もしくは数個の塩基が置換、欠失もしくは付加されているポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
を含むことを特徴としている。
【００１３】
本発明に係る薬学的組成物は、関節炎を治療または予防するために、以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
を含むことを特徴としている。
【００１４】
本発明に係る薬学的組成物は、関節炎を治療または予防するために、以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチド：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位からなるポリペプチド、または
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されているポリペプチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチド、
をコードするポリヌクレオチドを含みかつ（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチドを発現する細胞を含むことを特徴としている。
【００１５】
本発明に係る薬学的組成物は、関節炎を治療または予防するために、以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチド：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位において１もしくは数個の塩基が置換、欠失もしくは付加されているポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
を含みかつ（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現する細胞を含むことを特徴としている。
【００１６】
本発明に係る薬学的組成物は、関節炎を治療または予防するために、以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチド：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
を含みかつ（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現する細胞を含むことを特徴としている。
【００１７】
本発明に係る関節炎を治療または予防するための方法は、上記の薬学的組成物を投与する工程を包含することを特徴としている。
【００１８】
本発明に係るＤＲ３タンパク質発現細胞を検出する方法は、以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチドを、被験体サンプルから単離した細胞とインキュベートする工程を包含する、ＤＲ３タンパク質発現細胞を検出する方法：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位からなるポリペプチド、または
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されているポリペプチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチド。
【００１９】
本発明に係るＤＲ３タンパク質発現細胞を検出する方法は、以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを、被験体サンプルから単離した細胞とインキュベートする工程を包含する、ＤＲ３タンパク質発現細胞を検出する方法：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位において１もしくは数個の塩基が置換、欠失もしくは付加されているポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００２０】
本発明に係るＤＲ３タンパク質発現細胞を検出する方法は、以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを、被験体サンプルから単離した細胞とインキュベートする工程を包含する、ＤＲ３タンパク質発現細胞を検出する方法：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００２１】
本発明に係るＤＲ３タンパク質発現細胞を検出する方法は、上記被験体サンプルが、末梢血単核細胞、末梢血白血球または滑膜生検組織であることが好ましい。
【００２２】
本発明に係るＤＲ３タンパク質発現細胞を検出する方法は、上記ポリペプチドとインキュベートした細胞におけるアポトーシスの誘導を検出する工程をさらに包含することが好ましい。
【００２３】
本発明に係る検出キットは、ＤＲ３タンパク質発現細胞を検出するために、以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチドを備えることを特徴としている：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位からなるポリペプチド、または
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されているポリペプチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチド。
【００２４】
本発明に係る検出キットは、ＤＲ３タンパク質発現細胞を検出するために、以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを備えることを特徴としている：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位において１もしくは数個の塩基が置換、欠失もしくは付加されているポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００２５】
本発明に係る検出キットは、ＤＲ３タンパク質発現細胞を検出するために、以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを備えることを特徴としている：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００２６】
本発明に係る検出キットは、アポトーシスの誘導を検出するための試薬をさらに備えることが好ましい。
【００２７】
本発明に係る診断キットは、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するために、以下の（Ｉ）および（ＩＩ）：
（Ｉ）以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチド：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位からなるポリペプチド、または
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されているポリペプチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチド；および
（ＩＩ）アポトーシスの誘導を検出するための試薬
を備えることを特徴としている。
【００２８】
本発明に係る診断キットは、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するために、以下の（Ｉ）および（ＩＩ）：
（Ｉ）以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位において１もしくは数個の塩基が置換、欠失もしくは付加されているポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および
（ＩＩ）アポトーシスの誘導を検出するための試薬
を備えることを特徴としている。
【００２９】
本発明に係る診断キットは、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するために、以下の（Ｉ）および（ＩＩ）：
（Ｉ）以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および
（ＩＩ）アポトーシスの誘導を検出するための試薬
を備えることを特徴としている。
【００３０】
本発明に係る診断方法は、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するために、以下の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の工程：
（Ｉ）以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチドを、被験体サンプルから単離した細胞とインキュベートする工程：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位からなるポリペプチド、または
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されているポリペプチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチド；
（ＩＩ）上記ポリペプチドとインキュベートした細胞におけるアポトーシスの誘導を検出する工程；および
（ＩＩＩ）上記インキュベート前後での上記細胞のアポトーシスの程度を比較する工程
を包含することを特徴としている。
【００３１】
本発明に係る診断方法は、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するために、以下の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の工程：
（Ｉ）以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを、被験体サンプルから単離した細胞とインキュベートする工程：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位において１もしくは数個の塩基が置換、欠失もしくは付加されているポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ＩＩ）上記ポリペプチドとインキュベートした細胞におけるアポトーシスの誘導を検出する工程；および
（ＩＩＩ）上記インキュベート前後での上記細胞のアポトーシスの程度を比較する工程
を包含することを特徴としている。
【００３２】
本発明に係る診断方法は、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するために、以下の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の工程：
（Ｉ）以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを、被験体サンプルから単離した細胞とインキュベートする工程：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ＩＩ）上記ポリペプチドとインキュベートした細胞におけるアポトーシスの誘導を検出する工程；および
（ＩＩＩ）上記インキュベート前後での上記細胞のアポトーシスの程度を比較する工程
を包含することを特徴としている。
【発明の効果】
【００３３】
本発明に係る薬学的組成物を使用すれば、関節炎を治療または予防することができる。また、本発明に係るＤＲ３タンパク質発現細胞を検出するための検出方法および検出キットを使用すれば、関節リウマチ（ＲＡ）を罹患する被験体を同定することができ、当該被験体に本発明に係る薬学的組成物を使用することによって、ＲＡ依存的な関節炎を治療または予防することができる。さらに、本発明に係る診断（判定）キットおよび診断（判定）方法を使用することにより、関節リウマチ（ＲＡ）の診断（発症またはその発症可能性の判定）を高精度に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下、本発明についてより詳細に説明するが、本発明はこの記載に限定されるものではない。
【００３５】
〔１〕薬学的組成物および治療方法
本発明は、関節炎を治療または予防するための薬学的組成物を提供する。一実施形態において、本発明に係る薬学的組成物は、以下に詳述するポリペプチドを含むことが好ましい。他の実施形態において、本発明に係る薬学的組成物は、以下に詳述するポリヌクレオチドを含む細胞を含むことが好ましい。また、本発明に係る薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリアを併せて含んでもよい。
【００３６】
本発明はまた、関節炎を治療または予防するための方法を提供する。一実施形態において、本発明に係る治療方法は、以下に詳述するポリペプチドを用いることが好ましい。また、本発明に係る治療方法は、他の工程を包含してもよい。
【００３７】
本発明に係る薬学的組成物および治療方法を使用することにより、関節リウマチにおける関節炎を有意に治療（治療または予防）することができる。
【００３８】
（１−ａ）ポリペプチド
本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位からなるポリペプチドを含む薬学的組成物を提供する。また、本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位からなるポリペプチドを用いる治療方法を提供する。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。本発明に係る薬学的組成物または治療方法において使用されるポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、組換え生成されても、化学合成されてもよいが、天然の細胞もしくは組織由来の精製産物、化学合成手順の産物、または原核生物宿主もしくは真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生されることが好ましい。
【００４０】
本発明に係る薬学的組成物または治療方法において使用されるポリペプチドは、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入して、そのポリペプチドを細胞内発現させた状態であってもよいし、発現させた細胞または組織などから単離精製されてもよい。
【００４１】
用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。
【００４２】
上記ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するために、種々のベクターが使用され得る。ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に上記ポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと上記ポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【００４３】
発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、およびＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
【００４４】
上記選択マーカーを用いれば、上記ポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。
【００４５】
上記の宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。
【００４６】
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明に係る薬学的組成物または治療方法において使用されるポリペプチドを昆虫で転移発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよい。
【００４７】
また、本実施形態に係るポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。好ましい実施形態において、本発明に係る薬学的組成物または治療方法において使用されるポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で組換え発現され得る。例えば、本発明に係る薬学的組成物または治療方法において使用されるポリペプチドの付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間または引き続く操作および保存の間の安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。
【００４８】
遺伝子が細胞に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。例えば、形質転換細胞からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動などを行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液などによって染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素などによって標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレートなどの固相に増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応などによって増幅産物を確認する方法も採用することができる。
【００４９】
ポリペプチドを精製する工程は、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞または組織から細胞抽出液（例えば、核抽出液）を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。
【００５０】
一実施形態において、本発明に係る薬学的組成物または治療方法において使用されるポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位からなるポリペプチドの変異体であり得る。上記変異体は、ＴＬ１Ａポリペプチド活性を有する。本明細書中で使用される場合、用語「ＴＬ１Ａポリペプチド活性」は、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドが意図される。
【００５１】
このような変異体は、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性の残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む。小さな変化、またはこのような「中性」アミノ酸置換は、一般的にほとんど活性に影響しない。本明細書中で使用される場合、ポリペプチドの活性は、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害することが意図される。
【００５２】
１つの局面において、上記変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されているポリペプチドであることが好ましい。
【００５３】
ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００５４】
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が所望の活性を有するか否かを容易に決定し得る。
【００５５】
好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加を有する。好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、ＴＬ１Ａポリペプチド活性を変化させない。
【００５６】
代表的に保存的置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
【００５７】
上記に詳細に示されるように、どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントでありそうか（すなわち、機能に対して有意に有害な効果を有しそうにないか）に関するさらなるガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ， Ｊ．Ｕ．ら「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ： Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０ （１９９０）（本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。
【００５８】
他の局面において、上記変異体は、配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位において１もしくは数個の塩基が置換、欠失もしくは付加されているポリヌクレオチドからなるポリペプチドであることが好ましい。
【００５９】
別の局面において、上記変異体は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドからなるポリペプチドであることが好ましい。
【００６０】
用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。
【００６１】
本発明に係る薬学的組成物または治療方法において使用されるポリペプチドは、ＤＲ３シグナル伝達を活性化する。従って、上記ポリペプチドが所望の活性を有しているか否かは、ＤＲ３を発現する細胞に添加して、ＤＲ３シグナル伝達を活性化するか否かを調べればよい。上記ポリペプチドを上記細胞に添加する時間は、特に限定されないが、例えば、６時間〜１６時間程度であればよく、１２時間〜１６時間が好ましい。また、比較検討の目的で、刺激を与えないコントロール細胞を用意する必要がある。
【００６２】
本発明に係る薬学的組成物または治療方法において使用されるポリペプチドは、関節炎を治療または予防するための薬学的組成物だけでなく、関節リウマチを治療するための薬剤、ならびに関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するため方法およびキットに利用することができる。
【００６３】
このように、本発明に係る薬学的組成物または治療方法において使用されるポリペプチドは、少なくとも、ＴＬ１Ａポリペプチド活性を保持するポリペプチドであればよいといえる。すなわち、当該ポリペプチドが、特定の機能（例えば、タグ）を有する任意のアミノ酸配列とからなるポリペプチドと連結されている場合もまた本発明に含まれることに留意すべきである。また、当該ポリペプチドおよび当該任意のアミノ酸配列は、それぞれの機能を阻害しないように適切なリンカーペプチドで連結されていてもよい。
【００６４】
つまり、本発明の目的は、ＴＬ１Ａポリペプチド活性を保持するポリペプチドを含む薬学的組成物または治療方法を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリペプチド作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得されるポリペプチドも本発明の範囲に属することに留意しなければならない。
【００６５】
（１−ｂ）ポリヌクレオチド
本発明は、上記（１−ａ）項において詳述したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含みかつ当該ポリペプチドを発現する細胞を含む薬学的組成物を提供する。また、本発明は、上記（１−ａ）項において詳述したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含みかつ当該ポリペプチドを発現する細胞を用いる治療方法を提供する。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「遺伝子配列」、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。
【００６７】
塩基配列に関して本明細書中で使用される場合、特に断らない限り、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴは、アデニン、シトシン、グアニンおよびチミンの各塩基を示す。また、アミノ酸およびアミノ酸残基は、ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める１文字表記または３文字表記を使用する。また、転写産物とは、ゲノムが転写および翻訳される結果として生じる産物であり、たとえば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびタンパク質（ポリペプチド）などが挙げられる。
【００６８】
本発明において用いられるポリヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチド（例えば、本発明において使用されるＴＬ１ＡポリペプチドをコードするｃＤＮＡ全長からなるポリヌクレオチド）の切断フラグメントとして生成されても、化合合成されてもよい。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断は、種々のサイズのフラグメントを作製するために容易に使用され得る。あるいは、このようなフラグメントは、合成的に作製され得る。適切なフラグメント（オリゴヌクレオチド）が、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ＡＢＩ，８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｄｒ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ ９４４０４）３９２型シンセサイザーなどによって合成される。
【００６９】
本発明において用いられるポリヌクレオチドを取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ）のうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明において用いられるポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
【００７０】
また本発明において用いられるポリヌクレオチドは、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。
【００７１】
つまり、本発明の目的は、ＴＬ１Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリヌクレオチドの作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得されるポリヌクレオチドもまた本発明の範囲に属することに留意しなければならない。
【００７２】
〔２〕ＤＲ３タンパク質発現細胞を検出するための検出キットおよび検出方法
本発明は、ＤＲ３タンパク質発現細胞を検出するための検出キットを提供する。一実施形態において、本発明に係る検出キットは、（１−ａ）で詳述したポリペプチドを備えることが好ましい。さらなる実施形態において、本発明に係る検出キットは、アポトーシスの誘導を検出するための試薬をさらに備えることが好ましい。
【００７３】
「アポトーシスの誘導を検出するための試薬」としては、公知の市販の種々の試薬を用いればよく、好ましい試薬としては、例えば、抗Ｃａｓｐａｓｅ３抗体および抗ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ） ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＰＡＲＰ）抗体が挙げられる。また、「アポトーシスの誘導を検出するための試薬」として市販されている試薬だけでなく、公知の種々のアポトーシス検出方法に用いられる試薬もまた、「アポトーシスの誘導を検出するための試薬」に包含されることを、当業者は容易に理解する。アポトーシス検出方法としては、上記試薬（抗体）を用いたウエスタンブロット法、またははｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ＵＴＰ ｎｉｃｋ ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ（ＴＵＮＥＬ）法が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７４】
本発明はまた、ＤＲ３タンパク質発現細胞を検出するための検出方法を提供する。一実施形態において、本発明に係る検出方法は、（１−ａ）で詳述したポリペプチドを、被験体サンプルから単離した細胞とインキュベートする工程を包含することが好ましい。さらなる実施形態において、本発明に係る検出方法は、上記ポリペプチドとインキュベートした細胞におけるアポトーシスの誘導を検出する工程をさらに包含することが好ましい。
【００７５】
本発明に係る検出キットおよび検出方法を使用することにより、ＤＲ３タンパク質発現細胞の検出を高精度に行うことができる。
【００７６】
〔３〕診断キットおよび診断方法
感染因子、または、代謝産物、核酸、およびタンパク質を含む病気の指標となる分子の検出および測定は、医学的疾患の診断および治療、ならびに研究における基本的な要素である。現在、多くの方法論が検出に使用されている。
【００７７】
本発明は、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するための診断キットを提供する。本明細書中で使用される場合、関節リウマチの「発症可能性」とは、関節リウマチ（ＲＡ）が発生する危険度を示す指標をいい、発症可能性が高ければそれだけＲＡになりやすく、逆に発症可能性が低ければＲＡになり難いということを示す。
【００７８】
一実施形態において、本発明に係る診断キットは、本発明に用いられるポリペプチドを備えることが好ましい。また、本発明に係る診断キットは、他の試薬を併せて備えてもよい。好ましい実施形態において、本発明に係る診断キットは、アポトーシスの誘導を検出するための試薬を備える。
【００７９】
本発明はまた、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するための診断方法を提供する。一実施形態において、本発明に係る診断キットは、本発明に用いられるポリペプチドを用いることが好ましい。また、本発明に係る診断方法は、他の工程を包含してもよい。好ましい実施形態において、本発明に係る診断方法は、上記ポリペプチドとインキュベートした細胞におけるアポトーシスの誘導を検出する工程、および、上記インキュベート前後での上記細胞のアポトーシスの程度を比較する工程をさらに包含する。
【００８０】
本発明に係る診断（判定）キットおよび診断（判定）方法を使用することにより、ＲＡの診断（発症またはその発症可能性の判定）を高精度に行うことができる。
【００８１】
以下、実施例を示し、本発明についてさらに詳しく説明するが、もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００８２】
ＤＲ３の特異的リガンドとして同定されたＴＬ１ＡはＴＮＦスーパーファミリーに属し、ＤＲ３およびｄｅｃｏｙレセプター（ＴＲ６／ＤｃＲ３）に対して作用し、ＤＲ３発現細胞においてアポトーシスおよびＮＦ−κＢ活性化を誘導する。ヒトＴＬ１Ａ（ｈＴＬ１Ａ）は、マウスＴＬ１Ａ（ｍＴＬ１Ａ）と６３．７％の相同性を有し、マウスリンパ球に作用することが報告されている（非特許文献２を参照のこと）。
【００８３】
本発明者らは、ＩＩ型コラーゲン誘発関節炎を発症させたマウスにｈＴＬ１Ａを投与することによって、ＴＬ１Ａが、アポトーシスを誘導して炎症を抑制するのか、または、ＮＦ−κＢを活性化して炎症反応を高めるのかを検討した。
【００８４】
なお、本実施例において、他で詳述しない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法に従った。
【００８５】
（実施例１：ｈＴＬ１Ａ組換えタンパク質発現用プラスミドの作製）
全長ｈＴＬ１Ａ（ｈＴＬ１Ａ−ｆｕｌｌ）は７５３ｂｐのポリヌクレオチドからなり、２５１ａａからなるポリペプチドをコードする。ｈＴＬ１Ａのアミノ酸３６〜６０位は膜結合部であり、可溶化型ＴＬ１Ａとして同定されるｓｏｌｕｂｌｅ ｈＴＬ１Ａ（ｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌ）は、ｈＴＬ１Ａのアミノ酸７２〜２５１位によってコードされていることが知られている（図１を参照のこと）（非特許文献２を参照のこと）。
【００８６】
ｈＴＬ１Ａは主に血管内皮細胞に強く発現しているので、Ｒｎｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ）を製造業者の推奨する方法に従って使用して、ヒト臍静脈内皮細胞（ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ：ＨＵＶＥＣ）から総ＲＮＡを抽出した。
【００８７】
上記ＲＮＡを逆転写して合成したｃＤＮＡをテンプレートとして、順方向プライマーＦ７５（ＣＴＣＴＧＣＣＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＡＧ：配列番号３）と逆方向プライマーＲ８７９（ＴＣＴＣＣＴＣＣＴＡＴＡＧＴＡＡＧＡＡＧＧＣＴＣＣ：配列番号４）またはＲ９２２（ＴＴＡＧＧＡＡＣＴＣＧＧＴＧＧＣＡＧＡＧ：配列番号５）とを用いて、以下のようにＰＣＲを行った：５０μｌの反応混合液（１μｌ ｃＤＮＡ、１×Ｔａｋａｒａ ＬＡ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ、５０ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ、５ＵのＬＡ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ （Ｔａｋａｒａ）、および１μＭの各オリゴヌクレオチドプライマーを含む）を、９５℃で１０分間加熱した後、９４℃で３０秒間、５４℃で３０秒間および７２℃で２分間のサイクルを４５サイクル行い、増幅産物を７２℃で１０分間によって完全に伸長させた。増幅産物をアガロースゲルにて電気泳動した（図２）。図２に示すように、Ｆ７５とＲ８７９とを用いたＰＣＲによって８０４ｂｐのバンドを、Ｆ７５とＲ９２２とを用いたＰＣＲによって８４７ｂｐのバンドを得た。
【００８８】
ｈＴＬ１Ａ−ｆｕｌｌを含むと考えられる８４７ｂｐまたは８０４ｂｐのバンドをゲルから抽出して、ＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、キットのクローニングベクターに連結した。得られたプラスミドを用いてＴｏｐ−１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換した後、アンピシリンを含有するＬＢプレートに播種し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００８９】
上記プレートからピックアップしたコロニーを、アンピシリンを含有するＬＢ培地（１．５ｍｌ）中にて３７℃で一晩（約１６時間）培養し、遠心分離によって収集した菌からプラスミドを回収した。このプラスミドをＥｃｏＲＩを用いて消化して、所望長のインサートを有するプラスミドについて配列決定を行った。
【００９０】
ｈＴＬ１Ａ−ｆｕｌｌを含むことを確認したプラスミドをテンプレートにして、順方向プライマーＦ７５＋ＮｄｅＩ（ＣＡＴＡＴＧＣＴＣＴＧＣＣＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＡＧ：配列番号６）と逆方向プライマーＲ８７７＋ＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣＴＣＣＴＡＴＡＧＴＡＡＧＡＡＧＧＣＴＣＣ：配列番号７）とを用いてＰＣＲを行って、ｓｏｌｕｂｌｅ ＴＬ１Ａを増幅した（図３）。順方向プライマーＦ７５＋ＮｄｅＩはＮｄｅＩ部位を、逆方向プライマーＲ８７７＋ＢａｍＨＩはＢａｍＨＩ部位を有する。得られたフラグメントを、ｐＥＴ−１９ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ部位に挿入した。得られたプラスミドを用いてＴｏｐ−１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換した後、上述したように所望長のインサートを有するプラスミドについて配列決定を行った。
【００９１】
ｓｏｌｕｂｌｅ ＴＬ１Ａを含むことを確認したプラスミドを用いてＢＬ２１Ｓｔａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換した後、アンピシリンを含有するＬＢプレートに播種し、３７℃で一晩インキュベートした。次いで、アンピシリンを含有するＬＢ培地（２ｍｌ）中にて３７℃で培養した後、培養液１００μｌにグリセロール９００μｌを加えて−８０℃で保存した（グリセロールストック）。
【００９２】
（実施例２：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｈＴＬ１Ａ組換えタンパク質の発現に用いるＩＰＴＧ濃度の検討）
実施例１で得た少量のグリセロールストックをアンピシリンを含有するＬＢ培地（５ｍｌ）に添加して、シェーカー（２００ｒｐｍ）中にて３７℃で一晩インキュベートした（一次培養液）。一次培養液（２５０μｌ）をアンピシリンを含有するＬＢ培地（５ｍｌ）に添加して、ＯＤ６００が０．３〜０．４になるまでシェーカー（２００ｒｐｍ）中にて３７℃でインキュベートした。続いて、最終濃度が０．５ｍＭ、２ｍＭ、または５ｍＭになるようにＩＰＴＧを培養液中に添加し、ＯＤ６００が約１．０になるまでシェーカー（２００ｒｐｍ）中にて３７℃でインキュベートした後、培養液を３０００ｒｐｍにて４℃で１５分間遠心分離して菌体を収集した。
【００９３】
収集した菌体をＰＢＳを用いて２〜３回洗浄した後、ペレットを１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含有するＰＢＳ（−）中に懸濁した。この懸濁液を、氷上にて３０秒間超音波処理した後、３３０００ｒｐｍにて４℃で１時間遠心分離した。上清を回収し、ペレットを１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含有するＰＢＳ（−）中に懸濁した。上清サンプルおよびペレットサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、ニトロセルロース膜に転写した。この膜を用いて、抗ＴＬ１Ａマウスモノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＶＥＧＩ／ＴＮＦＳＦ１５ Ａｎｔｉｂｏｄｙ （Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ））によるイムノブロットを行った（図４）。
【００９４】
図４に示すように、ｓｏｌｕｂｌｅ ｈＴＬ１Ａ組換えタンパク質（ｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌ）の発現を確認した。ｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌの発現は、ＩＰＴＧによって有意に誘導された。最終濃度０．５ｍＭまたは２ｍＭのＩＰＴＧを添加した場合、これらの間でｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌ発現量にほとんど差がなかったが、最終濃度５ｍＭのＩＰＴＧを添加した場合、発現量は増加した。しかし、大量培養を行なった場合は、いずれの濃度を用いてもｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌ発現量にほとんど差がなかった（結果は示さず）。従って、以下の実験において、最終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧ濃度を用いた。
【００９５】
（実施例３：ｈＴＬ１Ａ組換えタンパク質の精製条件の検討）
実施例１で得た少量のグリセロールストックをアンピシリンを含有するＬＢ培地（１５０ｍｌ）に添加して、シェーカー（２００ｒｐｍ）中にて３７℃で一晩インキュベートした（一次培養液）。一次培養液（２５ｍｌ）をアンピシリンを含有するＬＢ培地（５００ｍｌ）に添加して、ＯＤ６００が０．３〜０．４になるまでシェーカー（２００ｒｐｍ）中にて３７℃でインキュベートした。続いて、最終濃度が０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧを培養液中に添加し、ＯＤ６００が約１．０になるまでシェーカー（２００ｒｐｍ）中にて３７℃でインキュベートした後（２〜３時間）、培養液を３０００ｒｐｍにて４℃で１５分間遠心分離して菌体を収集した。
【００９６】
収集した菌体をＰＢＳを用いて２〜３回洗浄した後、ペレットを２５ｍｌの緩衝液Ａ（２ｍＭイミダゾール、１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、プロテアーゼインヒビターを含むＰＢＳ（−））中に懸濁した。この懸濁液を、氷上にて３０秒間×６回超音波処理した後、３３０００ｒｐｍにて４℃で１時間遠心分離して上清を回収した。
【００９７】
この上清から、ＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムを用いて、ｈＴＬ１Ａ組換えタンパク質（ｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌ）を精製した。
【００９８】
カラムを、超純水（５ｍｌ）、０．１Ｍ ＮｉＳＯ４（０．５ｍｌ）、超純水（５ｍｌ）の順番で洗浄した後、緩衝液Ａ（１０ｍｌ）を用いて平衡化した。上記上清サンプルをカラムにアプライした後、カラムを緩衝液Ａ（１０ｍｌ）を用いて洗浄し、緩衝液Ｂ（５０ｍＭまたは５００ｍＭのイミダゾールを含有するＰＢＳ（−）（ｐＨ７．４））を用いて溶出し、溶出物を０．５ｍｌずつ分画した。各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ゲルを銀染色した（図５）。
【００９９】
図５に示すように、緩衝液Ｂ中に含まれるイミダゾールが５０ｍＭの場合、ｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌ以外のタンパク質も溶出されたが、ｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌタンパク質は溶出されなかった。緩衝液Ｂ中に含まれるイミダゾールが１００ｍＭの場合、ｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌ以外のタンパク質とともにｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌタンパク質が溶出された。
【０１００】
そこで、上清サンプルをカラムにアプライした後、カラムを５０ｍＭイミダゾールを含む緩衝液（１０ｍｌ）を用いて１ｍｌずつ分画しながら溶出した後、５００ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液（１０ｍｌ）を用いて０．５ｍｌずつ分画しながら溶出した。各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ゲルを銀染色した（図６）。
【０１０１】
図６に示すように、５０ｍＭイミダゾールを含む緩衝液を用いて十分溶出を行った後に、５００ｍＭイミダゾールを含む緩衝液を用いてｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌタンパク質を溶出すると、目的のｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌタンパク質を高純度で精製することができることがわかった。
【０１０２】
続いて、上記画分７〜１３をあわせた後、１×ＰＢＳ（７５０ｍｌ）中で透析して、開始精製画分からイミダゾールを除去した。透析液を、一晩透析した後、その２時間後に交換し、上記画分をさらに２時間透析した。透析後のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ゲルをＣＢＢ染色した（図７）。
【０１０３】
ＢＳＡの濃度を指標にすると、サンプル中のタンパク質濃度は５０μｇ／ｍｌであった。すなわち、３ｌの培養液から１７５μｇのｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌタンパク質を得た。
【０１０４】
（実施例４：ｈＴＬ１Ａ組換えタンパク質によるアポトーシス誘導）
浮遊細胞であるＴＦ−１細胞株（ｈｕｍａｎ ｍｙｅｌｏ−ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ＣＤ３４＋ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）は、内因性のＤＲ３を過剰発現している。また、ＴＦ−１細胞をタンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミド（ＣＨＸ）で前処理した後にＴＬ１Ａで刺激すると、アポトーシスが誘導される（Ｍｉｇｏｎｅ，Ｔ．Ｓ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１６：４７９−４７２（２００２））。
【０１０５】
１．５ｍｌの１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ培地中に懸濁したＴＦ−１細胞を、１×１０６細胞／ウェルにて６ウェルプレートに分注した。ＣＨＸを各ウェルに添加した（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）。３７℃で１時間インキュベートした後、ＴＬ１Ａを各ウェルに添加した。ＴＬ１Ａとして、０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、または１μｇ／ｍｌのｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌタンパク質、あるいは３００ｎｇ／ｍｌのｒｈＴＬ１Ａ（Ｒ＆Ｄ社）を用いた。
【０１０６】
ＴＬ１Ａ添加後、細胞を３７℃で一晩インキュベートした。遠心分離によって回収したＴＦ−１細胞を、ＰＢＳ（リン酸緩衝化緩衝液）で２〜３回洗浄した後、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含有するＰＢＳを用いて融解した。融解液を遠心分離して上清をサンプルとして回収した。各サンプルのタンパク質量を測定した後、各サンプル中のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、ニトロセルロース膜に転写した。この膜を用いて、抗カスパーゼ８抗体または抗ＰＡＲＰ抗体によるイムノブロットを行った（図８）。
【０１０７】
図８に示すように、ＴＬ１Ａのポジティブコントロールとして用いたｒｈＴＬ１Ａ（Ｒ＆Ｄ社）と同様に、ｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌタンパク質によってアポトーシスのシグナル伝達が生じることがわかった。
【０１０８】
（実施例５：精製ｈＴＬ１Ａ組換えタンパク質サンプル中のエンドトキシンの測定）
エンドトキシンの測定試薬として、エンドスペシーＬＳ−６０セット、トキシカラーＤＩＡ−ＭＰセット、エンドトキシン標準品ＥＳ−２（生化学工業株式会社）を、製造業者の指示書に従って使用して、ｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌタンパク質サンプル中のエンドトキシンを測定した。
【０１０９】
【表１】
【０１１０】
ｒｈＴＬ１Ａ（Ｒ＆Ｄ社）中のエンドトキシンと比較した結果、同レベルであることがわかった。
【０１１１】
（実施例６：コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）の誘発、およびＣＩＡに対するｒｈＴＬ１Ａの効果）
ヒトＴＬ１Ａ（ｈＴＬ１Ａ）はマウスＴＬ１Ａ（ｍＴＬ１Ａ）とアミノ酸レベルで６３．７％の相同性を有している。ヒトＴＬ１Ａをマウスに静脈内投与すると、移植片対宿主反応（ＧＶＨＲ：ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を増強する。またＧＶＨＲを生じたマウスの脾臓細胞を培養すると、投与していない対象群と比較して、細胞増殖、ＩＦＮ−γ、ＧＭＣＳＦの産生増加がみられる。（非特許文献２を参照のこと）。
【０１１２】
コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）を発症させたマウスを作製し、当該マウスにｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌタンパク質を投与して、ＣＩＡに対するｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌタンパク質の効果を調べた。
【０１１３】
０．３％ｃａｌｆ ＴｙｐｅＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎと０．１Ｍ ＡｃＯＨとを３：２の割合で混合して０．２％コラーゲン液を得た。このコラーゲン液とフロイント完全アジュバントとを１：１で氷上にて混和して、抗原液を得た。
【０１１４】
６週齢ＤＢＡ／１Ｊ 雌（日本チャールズ・リバー）を購入し、７週齢で実験に供した。ウサギの背部〜尾部にわたって上記抗原液を２００μｌずつ４箇所（２００μｇ ＴｙｐｅＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ／匹）投与した（一次感作）。一次感作の３週間後に、同様に二次感作を行うことによって、ウサギにＣＩＡを誘発させた。二次感作の３日後から３日毎にＰＢＳまたはｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌタンパク質を腹腔内投与して、四肢の関節炎の評価を、二次感作を行った日から連日行なった（図９）。ＰＢＳまたはｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌタンパク質の投与終了２日後に屠殺し、四肢を切断した後にソフテックスを用いてＸ線撮影を行って、関節破壊を評価した（図１０）。Ｘ線画像の評価を富山化学に依頼した。
【０１１５】
関節炎の症状およびＸ線画像の評価を以下の基準に基づいて行った。
関節炎症状評価（関節炎スコア（四肢で最高１２点））
０：変化なし
１：１，２指関節の腫脹もしくは手根部・足根部関節のみの軽い腫脹
２：３指以上の関節に腫脹、または、手根部・足根部の明らかな腫脹
３：前肢又は後肢全体にわたって明らかな腫脹
Ｘ線像評価法 （四肢で最高１０５点）
・骨粗鬆スコア（四肢で最高２１点）
０：変化なし
０．５：関節および関節近傍の骨粗鬆像
・骨びらんスコア（四肢で最高８４点）
０：変化なし
１：関節および関節近傍の部分的な骨破壊
２：関節および関節近傍の全体的な骨破壊。
【０１１６】
図１０は、ＣＩＡ誘発マウスにおける関節腫脹スコアの経時的変化を示す。図１１は、一次感作の４８日後のＣＩＡ誘発マウスにおける骨破壊スコアを示す。
【０１１７】
一次感作の４８日後の関節炎スコア（最高１２点）は、ＰＢＳ投与群が９．６±０．９であるのに対し、ＴＬ１Ａ投与群は５．６±１．６であり、ＴＬ１Ａ投与マウスにおいて関節炎の抑制が観察された（ｐ＜０．０５）（図１０）。一次感作の４８日後の関節破壊スコア（最高１０５点）は、ＰＢＳ投与群が３２．１±１０．４であるのに対し、ＴＬ１Ａ投与群は１３．６±７．６であり、ＴＬ１Ａ投与マウスにおいて関節破壊の抑制が観察された（ｐ＜０．０５）（図１１）。また、個々のマウスにおいて、関節炎の程度と関節破壊の程度とはほぼ一致していた（図１２）。
【０１１８】
以上のように、ＣＩＡマウスにおいて、ＤＲ３特異的リガンドであるＴＬ１Ａを投与することによって、関節炎が抑制された。このことは、ＤＲ３がＲＡ関節炎の発症に重要な役割を果たすこと、および、ＴＬ１ＡがＤＲ３を介してＲＡの治療薬または予防薬になり得ることを示す。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
ＤＲ３がＲＡ関節炎の発症に重要な役割を果たすこと、および、ＴＬ１ＡがＤＲ３を介してＲＡの治療薬または予防薬になり得ることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】図１は、全長ｈＴＬ１Ａ（ｈＴＬ１Ａ−ｆｕｌｌ）ポリペプチド、および可溶化型ＴＬ１Ａ（ｓｏｌｕｂｌｅ ｈＴＬ１Ａ（ｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌ））ポリペプチドの模式図を示す。
【図２】図２は、ヒト臍静脈内皮細胞からＲＴ−ＰＣＲを行って得たフラグメントを示すアガロースゲル電気泳動の写真である。
【図３】図３は、ｈＴＬ１Ａ−ｆｕｌｌをテンプレートにしてＰＣＲ増幅して得た可溶化型ＴＬ１Ａを示すアガロースゲル電気泳動の写真である。
【図４】図４は、大腸菌における可溶化型ＴＬ１Ａポリペプチドの発現を示すイムノブロットの結果を示す写真である。
【図５】図５は、キレーティングカラムを用いる精製における、大腸菌において発現させた可溶化型ＴＬ１Ａポリペプチドの溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後に銀染色したゲルを示す図である。
【図６】図６は、キレーティングカラムを用いる精製における、大腸菌において発現させた可溶化型ＴＬ１Ａポリペプチドの溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後に銀染色したゲルを示す図である。
【図７】図７は、キレーティングカラムを用いる精製における、大腸菌において発現させた可溶化型ＴＬ１Ａポリペプチドの溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後にＣＢＢ染色したゲルを示す図である。
【図８】図８は、ＣＨＸ処理後に可溶化型ＴＬ１Ａポリペプチドで刺激したＴＦ−１細胞におけるカスパーゼ８またはＰＡＲＰの活性化を調べたイムノブロットの結果を示す写真である。
【図９】図９は、マウスにおいてコラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）を発症させるプロトコルを示す図である。
【図１０】図１０は、コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）を発症させたマウスにおける関節腫脹の経時的スコアを示すグラフである。
【図１１】図１１は、コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）を発症させたマウスにおける一次感作の４８日後の骨破壊スコアを示すグラフである。
【図１２】図１２は、ＴＬ１Ａ投与マウスまたは未投与（ＰＢＳ投与（対照群））マウスにおける関節炎および関節破壊の程度を示すＸ線写真である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節炎を治療または予防するための薬学的組成物、および関節炎を治療または予防する方法に関するものである。より詳細には、本発明は、関節炎を治療または予防するためのＴＬ１Ａを含む薬学的組成物、およびＴＬ１Ａを投与することを特徴とする関節炎を治療または予防する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：以下「ＲＡ」ともいう）は、多発するびらん性関節炎を主徴とするが、同時に多臓器を障害する原因不明の全身性炎症疾患である。ＲＡは寛解と増悪とを繰り返しながら慢性に進行し、無治療で放置すると関節の破壊や変形を来し、やがて運動器の機能障害を呈してくる。時には生命をも脅かす。したがって、ＲＡ患者は身体的にも精神的にも大きな苦痛を生涯に亘って背負うことになる。ＲＡ治療（すなわち、関節炎の治療または予防）のための方法および治療剤の開発が望まれている。
【０００３】
本願発明者らは、マイクロサテライトマーカーを用いた連鎖解析をＲＡ患者およびその血縁者に対して実施することにより、関節リウマチの疾患遺伝子が位置する３カ所の遺伝子座を特定し、以下の疾患遺伝子を同定した（例えば、特許文献１を参照のこと）：
（１）ヒト第１染色体の、マイクロサテライトマーカーＤ１Ｓ２１４および／またはＤ１Ｓ２５３がハイブリダイズするＤＮＡ配列から±１センチモルガン以内に位置する関節リウマチの疾患遺伝子；
（２）ヒト第８染色体の、マイクロサテライトマーカーＤ８Ｓ５５６がハイブリダイズするＤＮＡ配列から±１センチモルガン以内に位置する関節リウマチの疾患遺伝子；
（３）ヒトＸ染色体の、マイクロサテライトマーカーＤＸＳｌ００１、ＤＸＳ１０４７、ＤＸＳ１２０５、ＤＸＳ１２２７および／またはＤＸＳ１２３２がハイブリダイズするＤＮＡ配列から±１センチモルガン以内に位置する関節リウマチの疾患遺伝子。
【０００４】
本願発明者らは、前記（１）の疾患関与遺伝子に関係するマーカーＤ１Ｓ２１４およびＤ１Ｓ２５３の疾患関与遺伝子として、デスレセプター３（ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３：「ＤＲ３」または「ＤＲ３遺伝子」ともいう）を挙げ、健常人とＲＡ患者との間にＤＲ３の制限断片長多型を確認し、ＤＲ３がＲＡにおける疾患関与遺伝子である可能性を示している（例えば、非特許文献１を参照のこと）。
【０００５】
さらに、本願発明者らは、ＤＲ３遺伝子のゲノム変異と関節リウマチ（慢性関節リウマチ）発症との関係について開示している（例えば、特許文献２を参照のこと）。
【０００６】
ＤＲ３は、６０アミノ酸残基からなるｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ（ＤＤ）を有し、ＮＦ−κＢの活性化およびアポトーシスを誘導する（例えば、非特許文献２および３を参照のこと）。このようなアポトーシスのシグナル伝達に関与するレセプターであるＤＲ３は、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリー（ＴＮＦＲ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ：ＴＮＦＲＳＦ）に属し（ＴＮＦＲＳＦ２５）、ＴＮＦＲ１と高い相同性を有することが知られている（例えば、非特許文献２および３を参照のこと）。また、ＤＲ３は主にリンパ系組織に発現しているが、本発明者らは、ＤＲ３が滑膜細胞にも発現されていることを確認している（例えば、非特許文献４を参照のこと）。
【０００７】
本発明者らは、これまでに、エクソン５とイントロン５において４つのＳＮＰおよび／または１４塩基の欠損を有する新たなＤＲ３ハプロタイプを同定し、これらの変異によって生じるＤＤ欠損型ＤＲ３が、正常型ＤＲ３とともに３量体を形成することによってアポトーシスを阻害することを明らかにした（未発表）。このＤＤ欠損型ＤＲ３は、家族性ＲＡ患者において高頻度に認められ、ＤＤ欠損型ＤＲ３を有するＲＡ患者の関節破壊は進行性であることが臨床的に示されている（未発表）。しかし、ＤＲ３が関節炎に関与することを示す直接的な証拠はなく、そのことを示すための具体的な手法も見出されていない
このようなＤＲ３について、そのリガンドを同定することが試みられている。ＤＲ３のリガンドとして、以前はＴＷＥＡＫなどが考えられていたが、ＴＷＥＡＫはＤＲ３を欠損している細胞においてもＮＦκＢ活性化およびアポトーシスを引き起こすため、ＤＲ３の特異的リガンドであるとは言い難く、よって、ＲＡ治療（関節炎の治療または予防）に有効であるとは言い難い（例えば、非特許文献５および６を参照のこと）。
【０００８】
現在、ＤＲ３に結合する因子の１つとしてＴＬ１Ａが同定されている（例えば、非特許文献２を参照のこと）。ＴＬ１ＡはＴＮＦＳＦに属するＴＮＦのひとつで、ＴＮＦＳＦ１５とも呼ばれている（例えば、非特許文献７を参照のこと）。ＴＬ１Ａは、ＤＲ３とｄｅｃｏｙレセプター（ＴＲ６／ＤｃＲ３）に対するリガンドであり、その発現はＴＮＦまたはＩＬ−１αによって誘導される（例えば、非特許文献２を参照のこと）。ＴＮＦおよびＩＬ−１αは、炎症性サイトカインであり、関節炎を増悪させる。また、ＤＲ３を発現している細胞において、ＴＬ１Ａは、ＮＦ−κＢ活性化およびアポトーシスを引き起こす（例えば、非特許文献２を参照のこと）。さらに、ＴＲ６とＦｃとの融合タンパク質であるＴＲ６−Ｆｃタンパク質は、ＴＬ１Ａ依存的なＮＦ−κＢ活性化およびアポトーシスのシグナル伝達を競合的に中和する（例えば、非特許文献２を参照のこと）。
【特許文献１】国際公開ＷＯ９８／５１７９１号（国際公開日：１９９８年１１月１９日）
【特許文献２】国際公開ＷＯ０２／３４９１２（国際公開日：２００２年５月２日）
【非特許文献１】リウマチ、第３９号、第２号、第４４４頁および第４４５頁（１９９９年）
【非特許文献２】Migone TS, et al. (2002) TL1A is a TNF-like ligand for DR3 and TR6/DcR3 and functions as a T cell costimulator. Immunity 16:479-92.
【非特許文献３】Chinnaiyan, A.M., et al. (1996) Signal transduction by DR3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95. Science 274:990-992
【非特許文献４】Miura Y., et al. (2004) Death Receptor 3 is specially expressed in rheumatoid synovium and TL1A, a physiological ligand for DR3, efficiently induces apoptosis in rheumatoid synovial fibroblasts that express DR3. Arthritis Rheum.50, S354
【非特許文献５】Kaptein, A. et al. (2000) Studies interaction between TWEAK and death receptor WSL1/TRAMP (DR3) . FEBS Lett. 485, 135-141
【非特許文献６】Wiley, S.R. et al. (2001) A novel TNF receptor family member binds TWEAK and is implicated in angiogenesis. Immunity 15, 837-846
【非特許文献７】Ware CF. (2004) The TNF superfamily. Cytokine Growth Factor Rev. 14:181-4.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このように、ＴＬ１Ａは、ＤＲ３特異的なリガンドとして有力な候補である。しかしながら、ＤＲ３を発現している細胞において、ＴＬ１ＡがＮＦ−κＢ活性化およびアポトーシスを引き起こすとはいえ、従来ＤＲ３のリガンドとして有力であったＴＷＥＡＫがＤＲ３を欠損している細胞においてもＮＦκＢ活性化およびアポトーシスを引き起こすことを考慮すると、ＴＬ１ＡがＤＲ３またはＴＲ６／ＤｃＲ３に結合するからといって、ＴＬ１Ａが生体内において実際にＤＲ３特異的なリガンドとして機能するとは言い難い。さらに、アポトーシスの誘導は炎症を抑制する働きがあるが、ＮＦ−κＢの活性化は細胞増殖反応および／または炎症反応を増強する働きがあり、このような相反するシグナル伝達に関与するＴＬ１Ａが実際にＤＲ３関連関節炎を抑制および／または阻害することができるのかどうかは、これまで具体的な手段がなかったために実証することができなかった。
【００１０】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＴＬ１Ａが関節炎に対してアポトーシスを誘導して炎症を抑制する働きをするのか、またはＮＦ−κＢを活性化して増殖反応および／または炎症反応を高める働きをするのかをインビトロおよび／またはインビボで示し、ＲＡ治療（関節炎の治療または予防）を実現することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に係る薬学的組成物は、関節炎を治療または予防するために、以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチド：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位からなるポリペプチド、または
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されているポリペプチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチド、
を含むことを特徴としている。
【００１２】
本発明に係る薬学的組成物は、関節炎を治療または予防するために、以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位において１もしくは数個の塩基が置換、欠失もしくは付加されているポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
を含むことを特徴としている。
【００１３】
本発明に係る薬学的組成物は、関節炎を治療または予防するために、以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
を含むことを特徴としている。
【００１４】
本発明に係る薬学的組成物は、関節炎を治療または予防するために、以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチド：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位からなるポリペプチド、または
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されているポリペプチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチド、
をコードするポリヌクレオチドを含みかつ（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチドを発現する細胞を含むことを特徴としている。
【００１５】
本発明に係る薬学的組成物は、関節炎を治療または予防するために、以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチド：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位において１もしくは数個の塩基が置換、欠失もしくは付加されているポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
を含みかつ（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現する細胞を含むことを特徴としている。
【００１６】
本発明に係る薬学的組成物は、関節炎を治療または予防するために、以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチド：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
を含みかつ（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現する細胞を含むことを特徴としている。
【００１７】
本発明に係る関節炎を治療または予防するための方法は、上記の薬学的組成物を投与する工程を包含することを特徴としている。
【００１８】
本発明に係るＤＲ３タンパク質発現細胞を検出する方法は、以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチドを、被験体サンプルから単離した細胞とインキュベートする工程を包含する、ＤＲ３タンパク質発現細胞を検出する方法：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位からなるポリペプチド、または
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されているポリペプチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチド。
【００１９】
本発明に係るＤＲ３タンパク質発現細胞を検出する方法は、以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを、被験体サンプルから単離した細胞とインキュベートする工程を包含する、ＤＲ３タンパク質発現細胞を検出する方法：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位において１もしくは数個の塩基が置換、欠失もしくは付加されているポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００２０】
本発明に係るＤＲ３タンパク質発現細胞を検出する方法は、以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを、被験体サンプルから単離した細胞とインキュベートする工程を包含する、ＤＲ３タンパク質発現細胞を検出する方法：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００２１】
本発明に係るＤＲ３タンパク質発現細胞を検出する方法は、上記被験体サンプルが、末梢血単核細胞、末梢血白血球または滑膜生検組織であることが好ましい。
【００２２】
本発明に係るＤＲ３タンパク質発現細胞を検出する方法は、上記ポリペプチドとインキュベートした細胞におけるアポトーシスの誘導を検出する工程をさらに包含することが好ましい。
【００２３】
本発明に係る検出キットは、ＤＲ３タンパク質発現細胞を検出するために、以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチドを備えることを特徴としている：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位からなるポリペプチド、または
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されているポリペプチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチド。
【００２４】
本発明に係る検出キットは、ＤＲ３タンパク質発現細胞を検出するために、以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを備えることを特徴としている：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位において１もしくは数個の塩基が置換、欠失もしくは付加されているポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００２５】
本発明に係る検出キットは、ＤＲ３タンパク質発現細胞を検出するために、以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを備えることを特徴としている：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００２６】
本発明に係る検出キットは、アポトーシスの誘導を検出するための試薬をさらに備えることが好ましい。
【００２７】
本発明に係る診断キットは、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するために、以下の（Ｉ）および（ＩＩ）：
（Ｉ）以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチド：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位からなるポリペプチド、または
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されているポリペプチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチド；および
（ＩＩ）アポトーシスの誘導を検出するための試薬
を備えることを特徴としている。
【００２８】
本発明に係る診断キットは、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するために、以下の（Ｉ）および（ＩＩ）：
（Ｉ）以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位において１もしくは数個の塩基が置換、欠失もしくは付加されているポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および
（ＩＩ）アポトーシスの誘導を検出するための試薬
を備えることを特徴としている。
【００２９】
本発明に係る診断キットは、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するために、以下の（Ｉ）および（ＩＩ）：
（Ｉ）以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および
（ＩＩ）アポトーシスの誘導を検出するための試薬
を備えることを特徴としている。
【００３０】
本発明に係る診断方法は、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するために、以下の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の工程：
（Ｉ）以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチドを、被験体サンプルから単離した細胞とインキュベートする工程：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位からなるポリペプチド、または
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されているポリペプチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチド；
（ＩＩ）上記ポリペプチドとインキュベートした細胞におけるアポトーシスの誘導を検出する工程；および
（ＩＩＩ）上記インキュベート前後での上記細胞のアポトーシスの程度を比較する工程
を包含することを特徴としている。
【００３１】
本発明に係る診断方法は、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するために、以下の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の工程：
（Ｉ）以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを、被験体サンプルから単離した細胞とインキュベートする工程：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位において１もしくは数個の塩基が置換、欠失もしくは付加されているポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ＩＩ）上記ポリペプチドとインキュベートした細胞におけるアポトーシスの誘導を検出する工程；および
（ＩＩＩ）上記インキュベート前後での上記細胞のアポトーシスの程度を比較する工程
を包含することを特徴としている。
【００３２】
本発明に係る診断方法は、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するために、以下の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の工程：
（Ｉ）以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを、被験体サンプルから単離した細胞とインキュベートする工程：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ＩＩ）上記ポリペプチドとインキュベートした細胞におけるアポトーシスの誘導を検出する工程；および
（ＩＩＩ）上記インキュベート前後での上記細胞のアポトーシスの程度を比較する工程
を包含することを特徴としている。
【発明の効果】
【００３３】
本発明に係る薬学的組成物を使用すれば、関節炎を治療または予防することができる。また、本発明に係るＤＲ３タンパク質発現細胞を検出するための検出方法および検出キットを使用すれば、関節リウマチ（ＲＡ）を罹患する被験体を同定することができ、当該被験体に本発明に係る薬学的組成物を使用することによって、ＲＡ依存的な関節炎を治療または予防することができる。さらに、本発明に係る診断（判定）キットおよび診断（判定）方法を使用することにより、関節リウマチ（ＲＡ）の診断（発症またはその発症可能性の判定）を高精度に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下、本発明についてより詳細に説明するが、本発明はこの記載に限定されるものではない。
【００３５】
〔１〕薬学的組成物および治療方法
本発明は、関節炎を治療または予防するための薬学的組成物を提供する。一実施形態において、本発明に係る薬学的組成物は、以下に詳述するポリペプチドを含むことが好ましい。他の実施形態において、本発明に係る薬学的組成物は、以下に詳述するポリヌクレオチドを含む細胞を含むことが好ましい。また、本発明に係る薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリアを併せて含んでもよい。
【００３６】
本発明はまた、関節炎を治療または予防するための方法を提供する。一実施形態において、本発明に係る治療方法は、以下に詳述するポリペプチドを用いることが好ましい。また、本発明に係る治療方法は、他の工程を包含してもよい。
【００３７】
本発明に係る薬学的組成物および治療方法を使用することにより、関節リウマチにおける関節炎を有意に治療（治療または予防）することができる。
【００３８】
（１−ａ）ポリペプチド
本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位からなるポリペプチドを含む薬学的組成物を提供する。また、本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位からなるポリペプチドを用いる治療方法を提供する。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。本発明に係る薬学的組成物または治療方法において使用されるポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、組換え生成されても、化学合成されてもよいが、天然の細胞もしくは組織由来の精製産物、化学合成手順の産物、または原核生物宿主もしくは真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生されることが好ましい。
【００４０】
本発明に係る薬学的組成物または治療方法において使用されるポリペプチドは、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入して、そのポリペプチドを細胞内発現させた状態であってもよいし、発現させた細胞または組織などから単離精製されてもよい。
【００４１】
用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。
【００４２】
上記ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するために、種々のベクターが使用され得る。ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に上記ポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと上記ポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【００４３】
発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、およびＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
【００４４】
上記選択マーカーを用いれば、上記ポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。
【００４５】
上記の宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。
【００４６】
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明に係る薬学的組成物または治療方法において使用されるポリペプチドを昆虫で転移発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよい。
【００４７】
また、本実施形態に係るポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。好ましい実施形態において、本発明に係る薬学的組成物または治療方法において使用されるポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で組換え発現され得る。例えば、本発明に係る薬学的組成物または治療方法において使用されるポリペプチドの付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間または引き続く操作および保存の間の安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。
【００４８】
遺伝子が細胞に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。例えば、形質転換細胞からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動などを行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液などによって染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素などによって標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレートなどの固相に増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応などによって増幅産物を確認する方法も採用することができる。
【００４９】
ポリペプチドを精製する工程は、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞または組織から細胞抽出液（例えば、核抽出液）を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。
【００５０】
一実施形態において、本発明に係る薬学的組成物または治療方法において使用されるポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位からなるポリペプチドの変異体であり得る。上記変異体は、ＴＬ１Ａポリペプチド活性を有する。本明細書中で使用される場合、用語「ＴＬ１Ａポリペプチド活性」は、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドが意図される。
【００５１】
このような変異体は、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性の残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む。小さな変化、またはこのような「中性」アミノ酸置換は、一般的にほとんど活性に影響しない。本明細書中で使用される場合、ポリペプチドの活性は、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害することが意図される。
【００５２】
１つの局面において、上記変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されているポリペプチドであることが好ましい。
【００５３】
ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００５４】
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が所望の活性を有するか否かを容易に決定し得る。
【００５５】
好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加を有する。好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、ＴＬ１Ａポリペプチド活性を変化させない。
【００５６】
代表的に保存的置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
【００５７】
上記に詳細に示されるように、どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントでありそうか（すなわち、機能に対して有意に有害な効果を有しそうにないか）に関するさらなるガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ， Ｊ．Ｕ．ら「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ： Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０ （１９９０）（本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。
【００５８】
他の局面において、上記変異体は、配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位において１もしくは数個の塩基が置換、欠失もしくは付加されているポリヌクレオチドからなるポリペプチドであることが好ましい。
【００５９】
別の局面において、上記変異体は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドからなるポリペプチドであることが好ましい。
【００６０】
用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。
【００６１】
本発明に係る薬学的組成物または治療方法において使用されるポリペプチドは、ＤＲ３シグナル伝達を活性化する。従って、上記ポリペプチドが所望の活性を有しているか否かは、ＤＲ３を発現する細胞に添加して、ＤＲ３シグナル伝達を活性化するか否かを調べればよい。上記ポリペプチドを上記細胞に添加する時間は、特に限定されないが、例えば、６時間〜１６時間程度であればよく、１２時間〜１６時間が好ましい。また、比較検討の目的で、刺激を与えないコントロール細胞を用意する必要がある。
【００６２】
本発明に係る薬学的組成物または治療方法において使用されるポリペプチドは、関節炎を治療または予防するための薬学的組成物だけでなく、関節リウマチを治療するための薬剤、ならびに関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するため方法およびキットに利用することができる。
【００６３】
このように、本発明に係る薬学的組成物または治療方法において使用されるポリペプチドは、少なくとも、ＴＬ１Ａポリペプチド活性を保持するポリペプチドであればよいといえる。すなわち、当該ポリペプチドが、特定の機能（例えば、タグ）を有する任意のアミノ酸配列とからなるポリペプチドと連結されている場合もまた本発明に含まれることに留意すべきである。また、当該ポリペプチドおよび当該任意のアミノ酸配列は、それぞれの機能を阻害しないように適切なリンカーペプチドで連結されていてもよい。
【００６４】
つまり、本発明の目的は、ＴＬ１Ａポリペプチド活性を保持するポリペプチドを含む薬学的組成物または治療方法を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリペプチド作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得されるポリペプチドも本発明の範囲に属することに留意しなければならない。
【００６５】
（１−ｂ）ポリヌクレオチド
本発明は、上記（１−ａ）項において詳述したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含みかつ当該ポリペプチドを発現する細胞を含む薬学的組成物を提供する。また、本発明は、上記（１−ａ）項において詳述したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含みかつ当該ポリペプチドを発現する細胞を用いる治療方法を提供する。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「遺伝子配列」、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。
【００６７】
塩基配列に関して本明細書中で使用される場合、特に断らない限り、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴは、アデニン、シトシン、グアニンおよびチミンの各塩基を示す。また、アミノ酸およびアミノ酸残基は、ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める１文字表記または３文字表記を使用する。また、転写産物とは、ゲノムが転写および翻訳される結果として生じる産物であり、たとえば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびタンパク質（ポリペプチド）などが挙げられる。
【００６８】
本発明において用いられるポリヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチド（例えば、本発明において使用されるＴＬ１ＡポリペプチドをコードするｃＤＮＡ全長からなるポリヌクレオチド）の切断フラグメントとして生成されても、化合合成されてもよい。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断は、種々のサイズのフラグメントを作製するために容易に使用され得る。あるいは、このようなフラグメントは、合成的に作製され得る。適切なフラグメント（オリゴヌクレオチド）が、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ＡＢＩ，８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｄｒ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ ９４４０４）３９２型シンセサイザーなどによって合成される。
【００６９】
本発明において用いられるポリヌクレオチドを取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ）のうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明において用いられるポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
【００７０】
また本発明において用いられるポリヌクレオチドは、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。
【００７１】
つまり、本発明の目的は、ＴＬ１Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリヌクレオチドの作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得されるポリヌクレオチドもまた本発明の範囲に属することに留意しなければならない。
【００７２】
〔２〕ＤＲ３タンパク質発現細胞を検出するための検出キットおよび検出方法
本発明は、ＤＲ３タンパク質発現細胞を検出するための検出キットを提供する。一実施形態において、本発明に係る検出キットは、（１−ａ）で詳述したポリペプチドを備えることが好ましい。さらなる実施形態において、本発明に係る検出キットは、アポトーシスの誘導を検出するための試薬をさらに備えることが好ましい。
【００７３】
「アポトーシスの誘導を検出するための試薬」としては、公知の市販の種々の試薬を用いればよく、好ましい試薬としては、例えば、抗Ｃａｓｐａｓｅ３抗体および抗ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ） ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＰＡＲＰ）抗体が挙げられる。また、「アポトーシスの誘導を検出するための試薬」として市販されている試薬だけでなく、公知の種々のアポトーシス検出方法に用いられる試薬もまた、「アポトーシスの誘導を検出するための試薬」に包含されることを、当業者は容易に理解する。アポトーシス検出方法としては、上記試薬（抗体）を用いたウエスタンブロット法、またははｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ＵＴＰ ｎｉｃｋ ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ（ＴＵＮＥＬ）法が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７４】
本発明はまた、ＤＲ３タンパク質発現細胞を検出するための検出方法を提供する。一実施形態において、本発明に係る検出方法は、（１−ａ）で詳述したポリペプチドを、被験体サンプルから単離した細胞とインキュベートする工程を包含することが好ましい。さらなる実施形態において、本発明に係る検出方法は、上記ポリペプチドとインキュベートした細胞におけるアポトーシスの誘導を検出する工程をさらに包含することが好ましい。
【００７５】
本発明に係る検出キットおよび検出方法を使用することにより、ＤＲ３タンパク質発現細胞の検出を高精度に行うことができる。
【００７６】
〔３〕診断キットおよび診断方法
感染因子、または、代謝産物、核酸、およびタンパク質を含む病気の指標となる分子の検出および測定は、医学的疾患の診断および治療、ならびに研究における基本的な要素である。現在、多くの方法論が検出に使用されている。
【００７７】
本発明は、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するための診断キットを提供する。本明細書中で使用される場合、関節リウマチの「発症可能性」とは、関節リウマチ（ＲＡ）が発生する危険度を示す指標をいい、発症可能性が高ければそれだけＲＡになりやすく、逆に発症可能性が低ければＲＡになり難いということを示す。
【００７８】
一実施形態において、本発明に係る診断キットは、本発明に用いられるポリペプチドを備えることが好ましい。また、本発明に係る診断キットは、他の試薬を併せて備えてもよい。好ましい実施形態において、本発明に係る診断キットは、アポトーシスの誘導を検出するための試薬を備える。
【００７９】
本発明はまた、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するための診断方法を提供する。一実施形態において、本発明に係る診断キットは、本発明に用いられるポリペプチドを用いることが好ましい。また、本発明に係る診断方法は、他の工程を包含してもよい。好ましい実施形態において、本発明に係る診断方法は、上記ポリペプチドとインキュベートした細胞におけるアポトーシスの誘導を検出する工程、および、上記インキュベート前後での上記細胞のアポトーシスの程度を比較する工程をさらに包含する。
【００８０】
本発明に係る診断（判定）キットおよび診断（判定）方法を使用することにより、ＲＡの診断（発症またはその発症可能性の判定）を高精度に行うことができる。
【００８１】
以下、実施例を示し、本発明についてさらに詳しく説明するが、もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００８２】
ＤＲ３の特異的リガンドとして同定されたＴＬ１ＡはＴＮＦスーパーファミリーに属し、ＤＲ３およびｄｅｃｏｙレセプター（ＴＲ６／ＤｃＲ３）に対して作用し、ＤＲ３発現細胞においてアポトーシスおよびＮＦ−κＢ活性化を誘導する。ヒトＴＬ１Ａ（ｈＴＬ１Ａ）は、マウスＴＬ１Ａ（ｍＴＬ１Ａ）と６３．７％の相同性を有し、マウスリンパ球に作用することが報告されている（非特許文献２を参照のこと）。
【００８３】
本発明者らは、ＩＩ型コラーゲン誘発関節炎を発症させたマウスにｈＴＬ１Ａを投与することによって、ＴＬ１Ａが、アポトーシスを誘導して炎症を抑制するのか、または、ＮＦ−κＢを活性化して炎症反応を高めるのかを検討した。
【００８４】
なお、本実施例において、他で詳述しない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法に従った。
【００８５】
（実施例１：ｈＴＬ１Ａ組換えタンパク質発現用プラスミドの作製）
全長ｈＴＬ１Ａ（ｈＴＬ１Ａ−ｆｕｌｌ）は７５３ｂｐのポリヌクレオチドからなり、２５１ａａからなるポリペプチドをコードする。ｈＴＬ１Ａのアミノ酸３６〜６０位は膜結合部であり、可溶化型ＴＬ１Ａとして同定されるｓｏｌｕｂｌｅ ｈＴＬ１Ａ（ｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌ）は、ｈＴＬ１Ａのアミノ酸７２〜２５１位によってコードされていることが知られている（図１を参照のこと）（非特許文献２を参照のこと）。
【００８６】
ｈＴＬ１Ａは主に血管内皮細胞に強く発現しているので、Ｒｎｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ）を製造業者の推奨する方法に従って使用して、ヒト臍静脈内皮細胞（ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ：ＨＵＶＥＣ）から総ＲＮＡを抽出した。
【００８７】
上記ＲＮＡを逆転写して合成したｃＤＮＡをテンプレートとして、順方向プライマーＦ７５（ＣＴＣＴＧＣＣＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＡＧ：配列番号３）と逆方向プライマーＲ８７９（ＴＣＴＣＣＴＣＣＴＡＴＡＧＴＡＡＧＡＡＧＧＣＴＣＣ：配列番号４）またはＲ９２２（ＴＴＡＧＧＡＡＣＴＣＧＧＴＧＧＣＡＧＡＧ：配列番号５）とを用いて、以下のようにＰＣＲを行った：５０μｌの反応混合液（１μｌ ｃＤＮＡ、１×Ｔａｋａｒａ ＬＡ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ、５０ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ、５ＵのＬＡ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ （Ｔａｋａｒａ）、および１μＭの各オリゴヌクレオチドプライマーを含む）を、９５℃で１０分間加熱した後、９４℃で３０秒間、５４℃で３０秒間および７２℃で２分間のサイクルを４５サイクル行い、増幅産物を７２℃で１０分間によって完全に伸長させた。増幅産物をアガロースゲルにて電気泳動した（図２）。図２に示すように、Ｆ７５とＲ８７９とを用いたＰＣＲによって８０４ｂｐのバンドを、Ｆ７５とＲ９２２とを用いたＰＣＲによって８４７ｂｐのバンドを得た。
【００８８】
ｈＴＬ１Ａ−ｆｕｌｌを含むと考えられる８４７ｂｐまたは８０４ｂｐのバンドをゲルから抽出して、ＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、キットのクローニングベクターに連結した。得られたプラスミドを用いてＴｏｐ−１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換した後、アンピシリンを含有するＬＢプレートに播種し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００８９】
上記プレートからピックアップしたコロニーを、アンピシリンを含有するＬＢ培地（１．５ｍｌ）中にて３７℃で一晩（約１６時間）培養し、遠心分離によって収集した菌からプラスミドを回収した。このプラスミドをＥｃｏＲＩを用いて消化して、所望長のインサートを有するプラスミドについて配列決定を行った。
【００９０】
ｈＴＬ１Ａ−ｆｕｌｌを含むことを確認したプラスミドをテンプレートにして、順方向プライマーＦ７５＋ＮｄｅＩ（ＣＡＴＡＴＧＣＴＣＴＧＣＣＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＡＧ：配列番号６）と逆方向プライマーＲ８７７＋ＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣＴＣＣＴＡＴＡＧＴＡＡＧＡＡＧＧＣＴＣＣ：配列番号７）とを用いてＰＣＲを行って、ｓｏｌｕｂｌｅ ＴＬ１Ａを増幅した（図３）。順方向プライマーＦ７５＋ＮｄｅＩはＮｄｅＩ部位を、逆方向プライマーＲ８７７＋ＢａｍＨＩはＢａｍＨＩ部位を有する。得られたフラグメントを、ｐＥＴ−１９ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ部位に挿入した。得られたプラスミドを用いてＴｏｐ−１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換した後、上述したように所望長のインサートを有するプラスミドについて配列決定を行った。
【００９１】
ｓｏｌｕｂｌｅ ＴＬ１Ａを含むことを確認したプラスミドを用いてＢＬ２１Ｓｔａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換した後、アンピシリンを含有するＬＢプレートに播種し、３７℃で一晩インキュベートした。次いで、アンピシリンを含有するＬＢ培地（２ｍｌ）中にて３７℃で培養した後、培養液１００μｌにグリセロール９００μｌを加えて−８０℃で保存した（グリセロールストック）。
【００９２】
（実施例２：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｈＴＬ１Ａ組換えタンパク質の発現に用いるＩＰＴＧ濃度の検討）
実施例１で得た少量のグリセロールストックをアンピシリンを含有するＬＢ培地（５ｍｌ）に添加して、シェーカー（２００ｒｐｍ）中にて３７℃で一晩インキュベートした（一次培養液）。一次培養液（２５０μｌ）をアンピシリンを含有するＬＢ培地（５ｍｌ）に添加して、ＯＤ６００が０．３〜０．４になるまでシェーカー（２００ｒｐｍ）中にて３７℃でインキュベートした。続いて、最終濃度が０．５ｍＭ、２ｍＭ、または５ｍＭになるようにＩＰＴＧを培養液中に添加し、ＯＤ６００が約１．０になるまでシェーカー（２００ｒｐｍ）中にて３７℃でインキュベートした後、培養液を３０００ｒｐｍにて４℃で１５分間遠心分離して菌体を収集した。
【００９３】
収集した菌体をＰＢＳを用いて２〜３回洗浄した後、ペレットを１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含有するＰＢＳ（−）中に懸濁した。この懸濁液を、氷上にて３０秒間超音波処理した後、３３０００ｒｐｍにて４℃で１時間遠心分離した。上清を回収し、ペレットを１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含有するＰＢＳ（−）中に懸濁した。上清サンプルおよびペレットサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、ニトロセルロース膜に転写した。この膜を用いて、抗ＴＬ１Ａマウスモノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＶＥＧＩ／ＴＮＦＳＦ１５ Ａｎｔｉｂｏｄｙ （Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ））によるイムノブロットを行った（図４）。
【００９４】
図４に示すように、ｓｏｌｕｂｌｅ ｈＴＬ１Ａ組換えタンパク質（ｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌ）の発現を確認した。ｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌの発現は、ＩＰＴＧによって有意に誘導された。最終濃度０．５ｍＭまたは２ｍＭのＩＰＴＧを添加した場合、これらの間でｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌ発現量にほとんど差がなかったが、最終濃度５ｍＭのＩＰＴＧを添加した場合、発現量は増加した。しかし、大量培養を行なった場合は、いずれの濃度を用いてもｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌ発現量にほとんど差がなかった（結果は示さず）。従って、以下の実験において、最終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧ濃度を用いた。
【００９５】
（実施例３：ｈＴＬ１Ａ組換えタンパク質の精製条件の検討）
実施例１で得た少量のグリセロールストックをアンピシリンを含有するＬＢ培地（１５０ｍｌ）に添加して、シェーカー（２００ｒｐｍ）中にて３７℃で一晩インキュベートした（一次培養液）。一次培養液（２５ｍｌ）をアンピシリンを含有するＬＢ培地（５００ｍｌ）に添加して、ＯＤ６００が０．３〜０．４になるまでシェーカー（２００ｒｐｍ）中にて３７℃でインキュベートした。続いて、最終濃度が０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧを培養液中に添加し、ＯＤ６００が約１．０になるまでシェーカー（２００ｒｐｍ）中にて３７℃でインキュベートした後（２〜３時間）、培養液を３０００ｒｐｍにて４℃で１５分間遠心分離して菌体を収集した。
【００９６】
収集した菌体をＰＢＳを用いて２〜３回洗浄した後、ペレットを２５ｍｌの緩衝液Ａ（２ｍＭイミダゾール、１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、プロテアーゼインヒビターを含むＰＢＳ（−））中に懸濁した。この懸濁液を、氷上にて３０秒間×６回超音波処理した後、３３０００ｒｐｍにて４℃で１時間遠心分離して上清を回収した。
【００９７】
この上清から、ＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムを用いて、ｈＴＬ１Ａ組換えタンパク質（ｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌ）を精製した。
【００９８】
カラムを、超純水（５ｍｌ）、０．１Ｍ ＮｉＳＯ４（０．５ｍｌ）、超純水（５ｍｌ）の順番で洗浄した後、緩衝液Ａ（１０ｍｌ）を用いて平衡化した。上記上清サンプルをカラムにアプライした後、カラムを緩衝液Ａ（１０ｍｌ）を用いて洗浄し、緩衝液Ｂ（５０ｍＭまたは５００ｍＭのイミダゾールを含有するＰＢＳ（−）（ｐＨ７．４））を用いて溶出し、溶出物を０．５ｍｌずつ分画した。各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ゲルを銀染色した（図５）。
【００９９】
図５に示すように、緩衝液Ｂ中に含まれるイミダゾールが５０ｍＭの場合、ｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌ以外のタンパク質も溶出されたが、ｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌタンパク質は溶出されなかった。緩衝液Ｂ中に含まれるイミダゾールが１００ｍＭの場合、ｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌ以外のタンパク質とともにｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌタンパク質が溶出された。
【０１００】
そこで、上清サンプルをカラムにアプライした後、カラムを５０ｍＭイミダゾールを含む緩衝液（１０ｍｌ）を用いて１ｍｌずつ分画しながら溶出した後、５００ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液（１０ｍｌ）を用いて０．５ｍｌずつ分画しながら溶出した。各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ゲルを銀染色した（図６）。
【０１０１】
図６に示すように、５０ｍＭイミダゾールを含む緩衝液を用いて十分溶出を行った後に、５００ｍＭイミダゾールを含む緩衝液を用いてｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌタンパク質を溶出すると、目的のｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌタンパク質を高純度で精製することができることがわかった。
【０１０２】
続いて、上記画分７〜１３をあわせた後、１×ＰＢＳ（７５０ｍｌ）中で透析して、開始精製画分からイミダゾールを除去した。透析液を、一晩透析した後、その２時間後に交換し、上記画分をさらに２時間透析した。透析後のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ゲルをＣＢＢ染色した（図７）。
【０１０３】
ＢＳＡの濃度を指標にすると、サンプル中のタンパク質濃度は５０μｇ／ｍｌであった。すなわち、３ｌの培養液から１７５μｇのｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌタンパク質を得た。
【０１０４】
（実施例４：ｈＴＬ１Ａ組換えタンパク質によるアポトーシス誘導）
浮遊細胞であるＴＦ−１細胞株（ｈｕｍａｎ ｍｙｅｌｏ−ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ＣＤ３４＋ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）は、内因性のＤＲ３を過剰発現している。また、ＴＦ−１細胞をタンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミド（ＣＨＸ）で前処理した後にＴＬ１Ａで刺激すると、アポトーシスが誘導される（Ｍｉｇｏｎｅ，Ｔ．Ｓ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１６：４７９−４７２（２００２））。
【０１０５】
１．５ｍｌの１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ培地中に懸濁したＴＦ−１細胞を、１×１０６細胞／ウェルにて６ウェルプレートに分注した。ＣＨＸを各ウェルに添加した（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）。３７℃で１時間インキュベートした後、ＴＬ１Ａを各ウェルに添加した。ＴＬ１Ａとして、０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、または１μｇ／ｍｌのｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌタンパク質、あるいは３００ｎｇ／ｍｌのｒｈＴＬ１Ａ（Ｒ＆Ｄ社）を用いた。
【０１０６】
ＴＬ１Ａ添加後、細胞を３７℃で一晩インキュベートした。遠心分離によって回収したＴＦ−１細胞を、ＰＢＳ（リン酸緩衝化緩衝液）で２〜３回洗浄した後、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含有するＰＢＳを用いて融解した。融解液を遠心分離して上清をサンプルとして回収した。各サンプルのタンパク質量を測定した後、各サンプル中のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、ニトロセルロース膜に転写した。この膜を用いて、抗カスパーゼ８抗体または抗ＰＡＲＰ抗体によるイムノブロットを行った（図８）。
【０１０７】
図８に示すように、ＴＬ１Ａのポジティブコントロールとして用いたｒｈＴＬ１Ａ（Ｒ＆Ｄ社）と同様に、ｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌタンパク質によってアポトーシスのシグナル伝達が生じることがわかった。
【０１０８】
（実施例５：精製ｈＴＬ１Ａ組換えタンパク質サンプル中のエンドトキシンの測定）
エンドトキシンの測定試薬として、エンドスペシーＬＳ−６０セット、トキシカラーＤＩＡ−ＭＰセット、エンドトキシン標準品ＥＳ−２（生化学工業株式会社）を、製造業者の指示書に従って使用して、ｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌタンパク質サンプル中のエンドトキシンを測定した。
【０１０９】
【表１】
【０１１０】
ｒｈＴＬ１Ａ（Ｒ＆Ｄ社）中のエンドトキシンと比較した結果、同レベルであることがわかった。
【０１１１】
（実施例６：コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）の誘発、およびＣＩＡに対するｒｈＴＬ１Ａの効果）
ヒトＴＬ１Ａ（ｈＴＬ１Ａ）はマウスＴＬ１Ａ（ｍＴＬ１Ａ）とアミノ酸レベルで６３．７％の相同性を有している。ヒトＴＬ１Ａをマウスに静脈内投与すると、移植片対宿主反応（ＧＶＨＲ：ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を増強する。またＧＶＨＲを生じたマウスの脾臓細胞を培養すると、投与していない対象群と比較して、細胞増殖、ＩＦＮ−γ、ＧＭＣＳＦの産生増加がみられる。（非特許文献２を参照のこと）。
【０１１２】
コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）を発症させたマウスを作製し、当該マウスにｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌタンパク質を投与して、ＣＩＡに対するｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌタンパク質の効果を調べた。
【０１１３】
０．３％ｃａｌｆ ＴｙｐｅＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎと０．１Ｍ ＡｃＯＨとを３：２の割合で混合して０．２％コラーゲン液を得た。このコラーゲン液とフロイント完全アジュバントとを１：１で氷上にて混和して、抗原液を得た。
【０１１４】
６週齢ＤＢＡ／１Ｊ 雌（日本チャールズ・リバー）を購入し、７週齢で実験に供した。ウサギの背部〜尾部にわたって上記抗原液を２００μｌずつ４箇所（２００μｇ ＴｙｐｅＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ／匹）投与した（一次感作）。一次感作の３週間後に、同様に二次感作を行うことによって、ウサギにＣＩＡを誘発させた。二次感作の３日後から３日毎にＰＢＳまたはｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌタンパク質を腹腔内投与して、四肢の関節炎の評価を、二次感作を行った日から連日行なった（図９）。ＰＢＳまたはｒｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌタンパク質の投与終了２日後に屠殺し、四肢を切断した後にソフテックスを用いてＸ線撮影を行って、関節破壊を評価した（図１０）。Ｘ線画像の評価を富山化学に依頼した。
【０１１５】
関節炎の症状およびＸ線画像の評価を以下の基準に基づいて行った。
関節炎症状評価（関節炎スコア（四肢で最高１２点））
０：変化なし
１：１，２指関節の腫脹もしくは手根部・足根部関節のみの軽い腫脹
２：３指以上の関節に腫脹、または、手根部・足根部の明らかな腫脹
３：前肢又は後肢全体にわたって明らかな腫脹
Ｘ線像評価法 （四肢で最高１０５点）
・骨粗鬆スコア（四肢で最高２１点）
０：変化なし
０．５：関節および関節近傍の骨粗鬆像
・骨びらんスコア（四肢で最高８４点）
０：変化なし
１：関節および関節近傍の部分的な骨破壊
２：関節および関節近傍の全体的な骨破壊。
【０１１６】
図１０は、ＣＩＡ誘発マウスにおける関節腫脹スコアの経時的変化を示す。図１１は、一次感作の４８日後のＣＩＡ誘発マウスにおける骨破壊スコアを示す。
【０１１７】
一次感作の４８日後の関節炎スコア（最高１２点）は、ＰＢＳ投与群が９．６±０．９であるのに対し、ＴＬ１Ａ投与群は５．６±１．６であり、ＴＬ１Ａ投与マウスにおいて関節炎の抑制が観察された（ｐ＜０．０５）（図１０）。一次感作の４８日後の関節破壊スコア（最高１０５点）は、ＰＢＳ投与群が３２．１±１０．４であるのに対し、ＴＬ１Ａ投与群は１３．６±７．６であり、ＴＬ１Ａ投与マウスにおいて関節破壊の抑制が観察された（ｐ＜０．０５）（図１１）。また、個々のマウスにおいて、関節炎の程度と関節破壊の程度とはほぼ一致していた（図１２）。
【０１１８】
以上のように、ＣＩＡマウスにおいて、ＤＲ３特異的リガンドであるＴＬ１Ａを投与することによって、関節炎が抑制された。このことは、ＤＲ３がＲＡ関節炎の発症に重要な役割を果たすこと、および、ＴＬ１ＡがＤＲ３を介してＲＡの治療薬または予防薬になり得ることを示す。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
ＤＲ３がＲＡ関節炎の発症に重要な役割を果たすこと、および、ＴＬ１ＡがＤＲ３を介してＲＡの治療薬または予防薬になり得ることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】図１は、全長ｈＴＬ１Ａ（ｈＴＬ１Ａ−ｆｕｌｌ）ポリペプチド、および可溶化型ＴＬ１Ａ（ｓｏｌｕｂｌｅ ｈＴＬ１Ａ（ｈＴＬ１Ａ−ｓｏｌ））ポリペプチドの模式図を示す。
【図２】図２は、ヒト臍静脈内皮細胞からＲＴ−ＰＣＲを行って得たフラグメントを示すアガロースゲル電気泳動の写真である。
【図３】図３は、ｈＴＬ１Ａ−ｆｕｌｌをテンプレートにしてＰＣＲ増幅して得た可溶化型ＴＬ１Ａを示すアガロースゲル電気泳動の写真である。
【図４】図４は、大腸菌における可溶化型ＴＬ１Ａポリペプチドの発現を示すイムノブロットの結果を示す写真である。
【図５】図５は、キレーティングカラムを用いる精製における、大腸菌において発現させた可溶化型ＴＬ１Ａポリペプチドの溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後に銀染色したゲルを示す図である。
【図６】図６は、キレーティングカラムを用いる精製における、大腸菌において発現させた可溶化型ＴＬ１Ａポリペプチドの溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後に銀染色したゲルを示す図である。
【図７】図７は、キレーティングカラムを用いる精製における、大腸菌において発現させた可溶化型ＴＬ１Ａポリペプチドの溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後にＣＢＢ染色したゲルを示す図である。
【図８】図８は、ＣＨＸ処理後に可溶化型ＴＬ１Ａポリペプチドで刺激したＴＦ−１細胞におけるカスパーゼ８またはＰＡＲＰの活性化を調べたイムノブロットの結果を示す写真である。
【図９】図９は、マウスにおいてコラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）を発症させるプロトコルを示す図である。
【図１０】図１０は、コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）を発症させたマウスにおける関節腫脹の経時的スコアを示すグラフである。
【図１１】図１１は、コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）を発症させたマウスにおける一次感作の４８日後の骨破壊スコアを示すグラフである。
【図１２】図１２は、ＴＬ１Ａ投与マウスまたは未投与（ＰＢＳ投与（対照群））マウスにおける関節炎および関節破壊の程度を示すＸ線写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチドを含むことを特徴とする関節炎を治療または予防するための薬学的組成物：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位からなるポリペプチド、または
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されているポリペプチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチド。
【請求項２】
以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含むことを特徴とする関節炎を治療または予防するための薬学的組成物：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位において１もしくは数個の塩基が置換、欠失もしくは付加されているポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含むことを特徴とする関節炎を治療または予防するための薬学的組成物：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含みかつ（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチドを発現する細胞を含むことを特徴とする関節炎を治療または予防するための薬学的組成物：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位からなるポリペプチド、または
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されているポリペプチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチド。
【請求項５】
以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドを含みかつ（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現する細胞を含むことを特徴とする関節炎を治療または予防するための薬学的組成物：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位において１もしくは数個の塩基が置換、欠失もしくは付加されているポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドを含みかつ（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現する細胞を含むことを特徴とする関節炎を治療または予防するための薬学的組成物：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、関節炎を治療または予防するための方法。
【請求項８】
以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチドを、被験体サンプルから単離した細胞とインキュベートする工程を包含する、ＤＲ３タンパク質発現細胞を検出する方法：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位からなるポリペプチド、または
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されているポリペプチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチド。
【請求項９】
以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを、被験体サンプルから単離した細胞とインキュベートする工程を包含する、ＤＲ３タンパク質発現細胞を検出する方法：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位において１もしくは数個の塩基が置換、欠失もしくは付加されているポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを、被験体サンプルから単離した細胞とインキュベートする工程を包含する、ＤＲ３タンパク質発現細胞を検出する方法：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
上記被験体サンプルが、末梢血単核細胞、末梢血白血球または滑膜生検組織であることを特徴とする請求項８〜１０のいずれか１項に記載のＤＲ３タンパク質発現細胞を検出する方法。
【請求項１２】
上記ポリペプチドとインキュベートした細胞におけるアポトーシスの誘導を検出する工程をさらに包含する、請求項８〜１１のいずれか１項に記載のＤＲ３タンパク質発現細胞を検出する方法。
【請求項１３】
以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチドを備える、ＤＲ３タンパク質発現細胞を検出するためのキット：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位からなるポリペプチド、または
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されているポリペプチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチド。
【請求項１４】
以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを備える、ＤＲ３タンパク質発現細胞を検出するためのキット：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位において１もしくは数個の塩基が置換、欠失もしくは付加されているポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを備える、ＤＲ３タンパク質発現細胞を検出するためのキット：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１６】
アポトーシスの誘導を検出するための試薬をさらに備える、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のＤＲ３タンパク質発現細胞を検出するためのキット。
【請求項１７】
以下の（Ｉ）および（ＩＩ）を備える、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するための診断キット：
（Ｉ）以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチド：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位からなるポリペプチド、または
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されているポリペプチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチド、および
（ＩＩ）アポトーシスの誘導を検出するための試薬。
【請求項１８】
以下の（Ｉ）および（ＩＩ）を備える、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するための診断キット：
（Ｉ）以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位において１もしくは数個の塩基が置換、欠失もしくは付加されているポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および
（ＩＩ）アポトーシスの誘導を検出するための試薬。
【請求項１９】
以下の（Ｉ）および（ＩＩ）を備える、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するための診断キット：
（Ｉ）以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および
（ＩＩ）アポトーシスの誘導を検出するための試薬。
【請求項２０】
以下の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の工程を包含する、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するための診断方法：
（Ｉ）以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチドを、被験体サンプルから単離した細胞とインキュベートする工程：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位からなるポリペプチド、または
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されているポリペプチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチド；
（ＩＩ）上記ポリペプチドとインキュベートした細胞におけるアポトーシスの誘導を検出する工程；および
（ＩＩＩ）上記インキュベート前後での上記細胞において生じているアポトーシスの程度を比較する工程。
【請求項２１】
以下の（Ｉ）および（ＩＩ）を備える、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するための診断キット：
（Ｉ）以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを、被験体サンプルから単離した細胞とインキュベートする工程：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位において１もしくは数個の塩基が置換、欠失もしくは付加されているポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および
（ＩＩ）上記ポリペプチドとインキュベートした細胞におけるアポトーシスの誘導を検出する工程；および
（ＩＩＩ）上記インキュベート前後での上記細胞において生じているアポトーシスの程度を比較する工程。
【請求項２２】
以下の（Ｉ）および（ＩＩ）を備える、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するための診断キット：
（Ｉ）以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを、被験体サンプルから単離した細胞とインキュベートする工程：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および
（ＩＩ）上記ポリペプチドとインキュベートした細胞におけるアポトーシスの誘導を検出する工程；および
（ＩＩＩ）上記インキュベート前後での上記細胞において生じているアポトーシスの程度を比較する工程。
【請求項１】
以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチドを含むことを特徴とする関節炎を治療または予防するための薬学的組成物：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位からなるポリペプチド、または
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されているポリペプチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチド。
【請求項２】
以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含むことを特徴とする関節炎を治療または予防するための薬学的組成物：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位において１もしくは数個の塩基が置換、欠失もしくは付加されているポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含むことを特徴とする関節炎を治療または予防するための薬学的組成物：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含みかつ（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチドを発現する細胞を含むことを特徴とする関節炎を治療または予防するための薬学的組成物：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位からなるポリペプチド、または
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されているポリペプチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチド。
【請求項５】
以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドを含みかつ（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現する細胞を含むことを特徴とする関節炎を治療または予防するための薬学的組成物：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位において１もしくは数個の塩基が置換、欠失もしくは付加されているポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドを含みかつ（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現する細胞を含むことを特徴とする関節炎を治療または予防するための薬学的組成物：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、関節炎を治療または予防するための方法。
【請求項８】
以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチドを、被験体サンプルから単離した細胞とインキュベートする工程を包含する、ＤＲ３タンパク質発現細胞を検出する方法：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位からなるポリペプチド、または
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されているポリペプチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチド。
【請求項９】
以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを、被験体サンプルから単離した細胞とインキュベートする工程を包含する、ＤＲ３タンパク質発現細胞を検出する方法：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位において１もしくは数個の塩基が置換、欠失もしくは付加されているポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを、被験体サンプルから単離した細胞とインキュベートする工程を包含する、ＤＲ３タンパク質発現細胞を検出する方法：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
上記被験体サンプルが、末梢血単核細胞、末梢血白血球または滑膜生検組織であることを特徴とする請求項８〜１０のいずれか１項に記載のＤＲ３タンパク質発現細胞を検出する方法。
【請求項１２】
上記ポリペプチドとインキュベートした細胞におけるアポトーシスの誘導を検出する工程をさらに包含する、請求項８〜１１のいずれか１項に記載のＤＲ３タンパク質発現細胞を検出する方法。
【請求項１３】
以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチドを備える、ＤＲ３タンパク質発現細胞を検出するためのキット：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位からなるポリペプチド、または
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されているポリペプチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチド。
【請求項１４】
以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを備える、ＤＲ３タンパク質発現細胞を検出するためのキット：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位において１もしくは数個の塩基が置換、欠失もしくは付加されているポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを備える、ＤＲ３タンパク質発現細胞を検出するためのキット：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１６】
アポトーシスの誘導を検出するための試薬をさらに備える、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のＤＲ３タンパク質発現細胞を検出するためのキット。
【請求項１７】
以下の（Ｉ）および（ＩＩ）を備える、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するための診断キット：
（Ｉ）以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチド：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位からなるポリペプチド、または
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されているポリペプチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチド、および
（ＩＩ）アポトーシスの誘導を検出するための試薬。
【請求項１８】
以下の（Ｉ）および（ＩＩ）を備える、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するための診断キット：
（Ｉ）以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位において１もしくは数個の塩基が置換、欠失もしくは付加されているポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および
（ＩＩ）アポトーシスの誘導を検出するための試薬。
【請求項１９】
以下の（Ｉ）および（ＩＩ）を備える、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するための診断キット：
（Ｉ）以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および
（ＩＩ）アポトーシスの誘導を検出するための試薬。
【請求項２０】
以下の（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の工程を包含する、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するための診断方法：
（Ｉ）以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリペプチドを、被験体サンプルから単離した細胞とインキュベートする工程：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位からなるポリペプチド、または
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の７２〜２５１位において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されているポリペプチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチド；
（ＩＩ）上記ポリペプチドとインキュベートした細胞におけるアポトーシスの誘導を検出する工程；および
（ＩＩＩ）上記インキュベート前後での上記細胞において生じているアポトーシスの程度を比較する工程。
【請求項２１】
以下の（Ｉ）および（ＩＩ）を備える、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するための診断キット：
（Ｉ）以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを、被験体サンプルから単離した細胞とインキュベートする工程：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位において１もしくは数個の塩基が置換、欠失もしくは付加されているポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および
（ＩＩ）上記ポリペプチドとインキュベートした細胞におけるアポトーシスの誘導を検出する工程；および
（ＩＩＩ）上記インキュベート前後での上記細胞において生じているアポトーシスの程度を比較する工程。
【請求項２２】
以下の（Ｉ）および（ＩＩ）を備える、関節リウマチの発症またはその発症可能性を判定するための診断キット：
（Ｉ）以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを、被験体サンプルから単離した細胞とインキュベートする工程：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチド、または
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列の１１７〜８７２位からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ＤＲ３依存的アポトーシスを阻害するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および
（ＩＩ）上記ポリペプチドとインキュベートした細胞におけるアポトーシスの誘導を検出する工程；および
（ＩＩＩ）上記インキュベート前後での上記細胞において生じているアポトーシスの程度を比較する工程。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２００６−１１１５９０（Ｐ２００６−１１１５９０Ａ）
【公開日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３０２１１８（Ｐ２００４−３０２１１８）
【出願日】平成１６年１０月１５日（２００４．１０．１５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００４年９月 ウィリーインターサイエンス発行の「関節炎とリウマチ学 第５０巻 ９号（増刊）」に発表
【出願人】（５０４１５６７０６）株式会社膠原病研究所 (13)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月１５日（２００４．１０．１５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００４年９月 ウィリーインターサイエンス発行の「関節炎とリウマチ学 第５０巻 ９号（増刊）」に発表
【出願人】（５０４１５６７０６）株式会社膠原病研究所 (13)
【Ｆターム（参考）】
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