関節炎関連遺伝子及びこれの関節炎検査等への利用
本発明は、関節炎、特にリウマチ性関節炎の発症に関与する因子の解明を第一の目的とし、さらに、見出した因子をターゲットとした関節炎治療薬のスクリーニング方法、関節炎治療薬ならびに検査薬を提供することを課題とする。 ミッドカイン遺伝子ノックアウトマウスでは関節炎の発症が野性型マウスに比較して有意に少なかった。また、関節リウマチ患者のほとんどの例では血清中および滑膜液中のミッドカインレベルが高値であった。このことからミッドカイン発現と関節リウマチとの間に強い相関があることが示された。ミッドカイン遺伝子欠損マウスへのミッドカインの投与により、抗体誘導性関節炎の頻度が高まった。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、関節炎、とりわけリウマチ性関節炎に関連する因子、ミッドカインタンパク質およびこれをコードした遺伝子に関する。また、本発明はミッドカインを基にした関節炎の検査方法ならびに検査薬に関する。さらに、本発明はミッドカインをターゲットとした関節炎治療用薬剤のスクリーニング方法、および関節炎治療用組成物に関する。
【背景技術】
慢性関節リウマチ（ＲＡ）は多発性の関節痛と関節腫脹を主症状とする原因不明の破壊性、進行性の炎症性疾患である。当初は滑膜炎であるが、炎症が軽快と増悪を繰り返して、関節軟骨や骨組織が破壊され、関節の変形と機能障害を生じる。ＲＡは一般的によく知られており、患者数も多い疾患にもかかわらず、病態も病因も解明されていない。診断についても、確定診断を行うためにはアメリカリウマチ学会診断基準（１９８７年、アメリカリウマチ学会）を４つ以上満たす必要がある。
ＲＡの病因については様々な因子が提唱されている。遺伝子異常、環境因子、感染などが有名で、それらの総合的な影響により、ＲＡは発症、形成されるといわれている。ＲＡの発生機序には種々のサイトカインが関与している。それらの主な役割はリンパ球の活性化、炎症性白血球の移動および破骨細胞の分化にある（Ｆｅｌｄｍａｎｎ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４：３９７−４４０，１９９６）。ケモカインは白血球の移動に関与し、ＮＦ−κＢ活性化受容体リガンド（ＲＡＮＫＬ）およびＭ−ＣＳＦは破骨細胞の分化に関与する（Ｙａｓｕｄａ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：３５９７−６０２，１９９８；Ｗｉｋｔｏｒ−Ｊｅｄｒｚｅｊｃｚａｋ Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：４８２８−３２，１９９０）。インターロイキン６（ＩＬ−６）は主としてリンパ球活性化の段階に作用する（Ｉｓｈｉｈａｒａ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ １３：３５７−６８，２００２；Ｏｓｈｉｍａ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：８２２２−６，１９９８）。ＩＬ−１およびＴＮＦ−αはケモカイン合成を誘導し、滑膜細胞および破骨細胞を活性化する（Ｆｅｌｄｍａｎｎ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４：３９７−４４０，１９９６；Ｆｅｌｄｍａｎｎ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｓ ４：２４７−５５，１９９２；Ｊｉ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９６：７７−８５，２００２）。さらに、ＴＮＦ−αはＲＡＮＫＬとは異なる経路によって破骨細胞の分化を誘導することが報告されている（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９１：２７５−８６，２０００）。ＩＬ−１７およびＩＬ−１８はＩＬ−１およびＴＮＦ−αと類似した役割を果たす（Ｙａｍａｍｕｒａ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４４：２７５−８５，２００１）。
上記の通りＲＡは多因子が関与するため、治療は画一的でなく、治療薬の効果も個人差が大きい。ＲＡの治療の目的は、ＲＡの炎症を鎮静化させ、患者の生活の質を維持、向上させることである。そのため、薬物療法、理学療法、生活指導が行われ、関節破壊が著しいときには、膝、股関節などの人工関節置換術が行われる。
ＲＡの治療は薬物療法を基本とし、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤｓ）、副腎皮質ステロイドの３種類の薬剤が用いられる。現在は、ＤＭＡＲＤｓを中心としてＮＳＡＩＤｓおよびステロイドを補助的に用いるという考え方が一般的となっている。
ＮＳＡＩＤｓはあくまで対症療法であり、疼痛の緩和を目的とする。ＲＡは長期投与が必要となることが多く、副作用が必ずしも少なくないことから、ＮＳＡＩＤｓの服用量は、疼痛の程度に応じて減量する必要がある。
ＤＭＡＲＤｓは、炎症自体を抑える作用はもたないが、ＲＡの免疫異常を修飾することによってＲＡの活動性をコントロールする薬剤である。近年、ＤＭＡＲＤｓの寛解導入作用と関節保護作用が明らかになり、早期からの導入が進められている。特に炎症反応が強く、関節の破壊・変形が進行する症例に適応される。しかし、遅効姓であるため、速効性のあるＮＳＡＩＤｓと組み含わせて用いられることが多い。ＤＭＡＲＤｓは、効果に個体差が大きいこと、連用しているうちにＲＡの活動性が亢進してくるエスケープ現象がみられること、副作用が多いこと、効果発現が遅いことなどの特徴があり、使用には注意を要する。特に、血液障害、腎障害、間質性肺炎などの生命に関わる重篤な副作用も少なくない。
ステロイド薬は最も強い抗炎症作用を有する薬剤であるが、長期投与による副作用が問題となるため、安易なステロイド使用は控えるべきであるとされている。少量投与でもステロイドは早期から骨粗鬆症をはじめとする種々の重大な副作用をきたすとの報告も多い。
ＯＩＣを行っても疾患の活動性、疼痛がコントロールできない場合、手術治療の適応となる。手術は、滑膜切除術、人工関節置換術、関節固定術などが行われる。
最近、ＴＮＦ−αに対するモノクローナル抗体、ならびにＴＮＦ−α受容体およびＩＬ−１受容体に対する拮抗物質がＲＡに対する治療薬として登場し、有望な成績を上げているが（Ｗｅｉｎｂｌａｔｔ ＭＥ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４８：３５−４５，２００３；Ｂｒｅｓｎｉｈａｎ Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４１：２１９６−２０４，１９９８）、症例によっては副作用、特に感染症が生じている（Ｓｌｉｆｍａｎ ＮＲ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４８：３１９−２４，２００３；Ｗｏｏｄ ＫＬ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １６７：１２７９−８２，２００３）。
【発明の開示】
本発明は、関節炎、特にリウマチ性関節炎の発症に関与する因子の解明を第一の目的とし、さらに、見出した因子をターゲットとした関節炎治療薬のスクリーニング方法、関節炎治療薬ならびに検査薬を提供することを課題とする。
本発明者らは、遺伝的背景の異なるマウス間で、リウマチ性関節炎のモデルである抗体による関節炎の発症に差があるかを系統的に調べた。そして、意外にもミッドカイン遺伝子ノックアウトマウスでは関節炎の発症が野性型マウスに比較して有意に少ないことを発見した。ミッドカインは、ヘパリン結合性増殖因子であり、細胞の増殖、移動、生存を促進する成長因子であり（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ Ｔ．，Ｗｉｌｅｙ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｍｏｌ．２０８６−２０８８，２００２；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２：３５９−３７１，２００２）、その遺伝子はマウスおよびヒトにおいてクローニングされている（特開平９−９５４５４）。ミッドカインは好中球、マクロファージを炎症刺激部位に誘導し、炎症反応の一翼を担う（Ｔａｋａｄａ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２２：４５３−４５８，１９９７；Ｈｏｒｉｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５：４８９−４９５，２０００）。ミッドカインがリウマチ発症に関与すると考え、さらに患者におけるＭＫの発現レベルを検討したところ、関節リウマチ患者のほとんどの例では血清中および滑膜液中のミッドカインレベルが高値であり、このことからミッドカイン発現と関節リウマチとの間に強い相関があることが示された。ミッドカインは患者の滑膜内のマクロファージ様細胞および線維芽細胞様細胞で発現されていた。ミッドカイン遺伝子欠損マウスへのミッドカインの投与により、抗体誘導性関節炎の頻度が高まった。疾患モデルにおける炎症性白血球の滑膜への移動は、ミッドカイン欠損マウスでは抑制された。さらに、ミッドカインはマクロファージからの破骨細胞の分化を促進することを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものであり、以下の通りである。
〔１ａ〕関節炎発生に関連する因子であって、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかからなる関節炎関連因子。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、関節炎誘導活性を有するポリペプチドをコードしたＤＮＡ。
〔１ｂ〕関節炎発生に関連する因子であって、下記（ａ）または（ｂ）のいずれかからなる関節炎関連因子。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、関節炎誘導活性を有するポリペプチド。
〔２〕被検者より採取した試料中のミッドカイン遺伝子の発現を測定する工程を含む、関節炎の検査方法。
〔３〕抗ミッドカイン抗体を含む、関節炎検査用試薬。
〔４ａ〕下記（ａ）および（ｂ）工程を含む、関節炎の治療または予防のため薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ミッドカインに被検物質を接触させる工程
（ｂ）前記ミッドカインと被検物質との結合を検出する工程
〔４ｂ〕下記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）工程を含む、関節炎の治療または予防のため薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ミッドカイン遺伝子が発現している細胞に被検物質を接触させる工程
（ｂ）被検物質接触後にミッドカイン遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検物質と接触させていない対照細胞のミッドカイン発現レベルに比べてミッドカイン遺伝子の発現レベルを低下させた被検物質を選択する工程
〔４ｃ〕下記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）工程を含む、関節炎の治療または予防のため薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ミッドカイン遺伝子のプロモータ領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞に被検物質を接触させる工程
（ｂ）被検物質接触後にレポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる被検物質を選択する工程
〔５〕ミッドカイン遺伝子の発現を抑制し得るオリゴヌクレオチドを有効成分とする関節炎予防または治療用組成物。
〔６〕抗ミッドカイン抗体を有効成分とする、関節炎予防または治療用組成物。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＲＡ患者由来の標本におけるＭＫ発現レベルを示す図である。Ａ、ＲＡ患者（ｎ＝５５）またはＯＡ（骨関節炎）患者（ｎ＝１８）由来の滑膜液中のＭＫに関する酵素イムノアッセイ。破線はカットオフレベル３３２ｐｇ／ｍｌを示し、これはＯＡ患者における最も高いＭＫ値に対応する。ＲＡ患者を、リウマトイド因子に関して強陽性の例［ＲＦ（＋＋）］（ｎ＝２６）、この因子に関して中等度に陽性の例［ＲＦ（＋）］（ｎ＝１１）およびＲＦに関して陰性の例［ＲＥ（−）］（ｎ＝１８）に分類した。Ｂ、ＲＡ患者の血清中のＭＫに関する酵素イムノアッセイ。破線はカットオフレベル６００ｐｇ／ｍｌを示しており、これは過去の研究で設定されたものである（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １１９：１１７１−５，１９９６；Ｉｋｅｍａｔｓｕ Ｓ．ｅｔ ａｌ，Ｂｒｉｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８３：７０１−６，２０００）。ＲＡ患者をＲＥ（＋＋）（ｎ＝５１）、ＲＥ（＋）（ｎ＝３７）およびＲＥ（−）（ｎ＝３２）患者に分類した。
図２はＲＡ患者の炎症性滑膜におけるＭＫ発現を示す写真である。Ａ、抗マクロファージ（ＣＤ６８）抗体および抗ＭＫ抗体による組織切片の二重染色。抗ＭＫ抗体による赤血球染色が対照染色（抗ＭＫ抗体を用いずに、すなわち抗ＭＫ抗体を吸収して行った染色）で観察され、これは非特異的であった。滑膜はある女性患者（６２歳、ステージ４、グレード５）から得た。ａ．ｃ．：関節腔、ｂ．ｖ．：血管、バー：２００μｍ。Ｂ、滑膜由来の線維芽細胞様細胞またはマクロファージ様細胞を２ウェルチェンバースライド上で増殖させ、抗ＭＫ抗体によって染色した。バー：１００μｍ。
図３は、Ｍｄｋ−／−では抗体媒介性関節炎が抑制された結果を示す写真である。Ａ、抗ＩＩ型コラーゲン抗体の注入から７日後のＷＴ（野生型）またはＭｄｋ−／−の肢の代表的な写真。Ｂ、抗体注入後第０、２、５および７日の時点でＨＥ（ヘマトキシリン−エオジン）または抗ＭＫ抗体により染色した前肢関節の切片。ＭＫ発現は滑膜細胞、特に関節腔内壁の細胞（矢印）で観察された。図中Ｂは骨、Ｓは滑膜細胞。矢印はＭｄｋ−／−における滑膜細胞を示す。バー；２００μｍ。枠で囲んだ領域を以下に示した２枚の写真で拡大している。
図４は抗体誘発性関節炎における血清サイトカインレベルおよび浸潤白血球数を示す図である。Ａ、ＷＴにおける血清ＭＫレベル。Ｂ、ＷＴまたはＭｄｋ−／−における血清ＴＮＦ−αレベル。Ｃ、ＷＴまたはＭｄｋ−／−の滑膜内のマクロファージ数。Ｄ、ＷＴまたはＭｄｋ−／−の滑膜内の好中球数。好中球およびマクロファージの数はランダムに選択した３つの視野（４００倍）について算定し、その平均値を示している。第２日〜第７日は抗体投与後の日数を表す。＊ｐ＜０．０５。黒のバー、ＷＴ；白抜きバー、Ｍｄｋ−／−。
図５はＭＫがマクロファージから破骨細胞への分化を促進することを示す図および写真である。Ａ、ＲＡ患者（女性、６２歳、ステージ４、グレード５）の滑膜由来のマクロファージ様細胞を諸因子とともに培養し、ＴＲＡＰ染色を行った。ＭＫは単独で、またはＭ−ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬとの併用下で、ヒトマクロファージ様細胞からのＴＲＡＰ陽性細胞の分化を促進した。Ｂ、ヒトマクロファージ様細胞からの破骨細胞の分化はＭＫ単独で、またはそれとＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦとの併用下で促進された。多核性ＴＲＡＰ陽性細胞を破骨細胞とみなした。Ｃ、諸因子とともに培養することによって滑膜のマクロファージ様細胞から分化したＴＲＡＰ陽性細胞の代表的な写真。バー：５０μｍ。Ｄ、ＲＡＮＫＬによる、またはＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦによるマウスマクロファージからの破骨細胞の分化はＭＫにより増強された。「５０」および「１００」は濃度をｎｇ／ｍｌ単位で示したものである。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明の第一の側面として、関節炎発生関連因子が提供される。上述したように従来、ミッドカインは細胞の増殖や分化に関与し、ヒト癌の発生にも関与することから注目されているが、本願発明者らは、ミッドカインの新たな機能として、関節炎の発生・誘導に関与することを見出した。すなわち、本発明の関節炎発生に関連する因子はミッドカイン遺伝子またはミッドカインポリペプチドである。
関節炎関連因子としてのミッドカイン遺伝子は、好適には、配列番号：１に示すヒトミッドカイン遺伝子を挙げることができるが、これに限定されるものではなく、ミッドカイン遺伝子と同等に関節炎を発生・誘導し得るタンパク質をコードした類似のＤＮＡも「関節炎関連因子」としてのミッドカイン遺伝子に含まれる。配列番号１に記載のＤＮＡと機能的に同等な配列は、同種由来の変異体や異種由来のミッドカイン遺伝子ホモログ、又はこうした天然に得られる遺伝子を人工的に合成若しくは改変したものなどが含まれる。例えば、既に報告されているマウスミッドカイン遺伝子（Ｋａｄｏｍａｔｕ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１５１，１３１２（１９８８））は配列番号１に記載のＤＮＡと機能的に同等な配列の一例であり、本発明の関節炎関連因子としてのミッドカイン遺伝子に含まれる。
このような配列番号１に記載のＤＮＡと機能的に同等の配列は、例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡや、配列番号：１に記載の塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ関節炎誘導活性を有するポリペプチドをコードしたＤＮＡを挙げることかできる。
上記配列番号：１に記載のヒト由来のミッドカイン遺伝子の調製は、ヒトｃＤＮＡライブラリーより配列番号：１に記載された配列またはその一部と相同性の高い配列を保持するクローンを選択し、選択されたクローンより回収することにより実施することができる。ミッドカイン遺伝子を得るためのヒトｃＤＮＡライブラリーは、たとえば、ヒトの腎臓、ヒトの胎児の腎臓、脳、結合組織又はこれらの培養細胞由来トータルＲＮＡに基づき構築されたものを用いることができる。また、天然から取得する以外に、配列番号：１に記載の配列に基づいてＤＮＡ合成器により合成してもよい。
また、配列番号１に記載のＤＮＡと機能的に同等の配列の調製は、ヒト以外の哺乳動物細胞（例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ブタ、ウシ）由来のｃＤＮＡライブラリーより配列番号：１記載の配列またはその一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするクローンを選択することにより実施することができる。ハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜選択することができる。例えば、ハイブリダイゼーションの条件として、好ましくは、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られると期待される。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
また、配列番号１に記載のＤＮＡと機能的に同等の配列の調製は、上述のように天然に存在するものから選抜する方法の他に、配列番号：１に記載の配列からなるＤＮＡを適宜、遺伝子工学的に改変して調製することもできる。
関節炎関連因子としてのミッドカインポリペプチドは、好ましくは、配列番号２に示すヒトミッドカインポリペプチドを挙げることができるが、これに限定されるものではなく、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、関節炎誘導活性を有するポリペプチドを含めることができる。
上記ミッドカインと機能的に同等なポリペプチドは、通常、ミッドカインとアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも５０％以上の同一性、好ましくは７５％以上の同一性、さらに好ましくは８５％以上の同一性、さらに好ましくは９５％以上の同一性を指す。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７，１９９３）などによって決定することができる。
配列番号：２に示すミッドカインのアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなり、該ポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドもまた本発明に含まれる。変異するアミノ酸数は、通常、３０アミノ酸以内であり、好ましくは１５アミノ酸以内であり、より好ましくは５アミノ酸以内（例えば、３アミノ酸以内）であり、さらに好ましくは２アミノ酸以内である。これら変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えば、アミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
配列番号：２に示すミッドカインの調製は、配列番号：１記載のＭＫ遺伝子配列を発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のＭＫタンパクを公知の方法で精製し、この精製ＭＫタンパクを感作抗原として用いればよい。またはミッドカインを発現している細胞から細胞破砕液を調製し、後述する抗ミッドカイン抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーなどにより単離してもよい。
一方、ミッドカインと機能的に同等なポリペプチドを調製するためには、当業者によく知られた方法としてポリペプチドに変異を導入する方法がある。例えば、部位特異的変異誘発法（Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ １５２，２７１−２７５、Ｚｏｌｌｅｒ，ＭＪ，ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，４６８−５００、Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２，９４４１−９４５６、Ｋｒａｍｅｒ Ｗ，ａｎｄ Ｆｒｉｔｚ ＨＪ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３５０−３６７、Ｋｕｎｋｅｌ，ＴＡ（１９８５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８２，４８８−４９２、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５，２７６３−２７６６）などを用いて、配列番号：１に示す配列に変異を導入し、これを上記と同様に発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させて、形質転換体から回収することにより、ミッドカインと機能的に同等なポリペプチドを調製してもよい。
上記関節炎関連因子は、関節炎を発生、誘導し得る活性を保持しているため、例えば、関節炎モデル動物を作製する際の関節炎誘導剤として利用し得る。また、上記ミッドカインは、炎症性白血球などの炎症細胞の移動や破骨細胞の増殖等のようなリウマチ性関節炎で見られる現象を誘導し得ることから、特に、リウマチ性関節炎を誘導するための試薬として研究分野等で利用することができる。
本発明の第二の側面として、被検者より採取した試料中のミッドカイン遺伝子の発現を測定する工程を含む関節炎の検査方法が提供される。
ミッドカインは後述の実施例でも説明するように、関節炎を誘発し得るＴＮＦ−αとは異なる側面から関節炎の発生に関与することが予想される。従って、患者における関節炎の発生原因を調査し、患者に対して適切な処理を行うためには、関節炎の検査としてミッドカイン遺伝子の発現を測定することが有用となる。
被検者より採取される試料としては、例えば、血液または滑膜組織などを用いることができる。
ミッドカイン遺伝子発現の測定における第一の態様として、翻訳産物であるミッドカインタンパク質を測定する。先ず、上述した被検者の試料よりタンパク質試料を調製する。次いで、該タンパク質試料からミッドカインタンパク質量を測定する。測定されたタンパク質量を健常者などのミッドカイン発現量に基づいた対照値などと比較する。この比較の結果、被検者のミッドカインタンパク質が対照に比べて有意に上昇している場合には、関節炎発症原因としてミッドカインが関与している可能性または関節炎を発症し得る素因が予測できる。
上記ミッドカインタンパク質の測定は、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法、並びにミッドカインタンパク質に対する抗体を用いた、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、および免疫蛍光法を例示することができる。
また、ミッドカイン遺伝子の発現を測定するための別の方法としては、転写産物であるミッドカインｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを測定する。先ず、上記被検者試料からトータルＲＮＡ試料を調製する。トータルＲＮＡの調製は、当業者に周知の方法で行うことができる。例えば、トータルＲＮＡ調製用のキット”Ｉｓｏｇｅｎ”（ニッポンジーン社）を用いて実施することができる。次いで、該トータルＲＮＡ試料に含まれるミッドカインｍＲＮＡ量を測定する。測定されたＲＮＡの量を対照と比較する。
別の態様としては、被検者試料からｃＤＮＡ試料を調製する。ｃＤＮＡ試料の調製は、上述したトータルＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡの合成を行うことで実施し得る。次いで、該ｃＤＮＡ試料に含まれるミッドカインｃＤＮＡ量を測定する。測定されたｃＤＮＡの量を対照と比較する。
これらｍＲＮＡやｃＤＮＡを基に遺伝子発現を測定する方法としては、当業者に周知の方法、例えばノーザンブロッティング法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡアレイ法等を挙げることができる。例えば、ＤＮＡアレイ法においては、被検者から調製したＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡ試料を調製し、ミッドカイン遺伝子（例えば、配列番号：１）の一部配列を含むオリゴヌクレオチドが固定された基板と接触させ、該ｃＤＮＡ試料と該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出することにより、該ｃＤＮＡ試料に含まれるミッドカイン遺伝子の発現量が測定される。ヌクレオチドプローブと該ｃＤＮＡとのハイブリダイズの強度の検出は、ｃＤＮＡ試料を標識した物質の種類に応じて当業者において適宜行うことができる。例えば、ｃＤＮＡが蛍光物質によって標識されている場合、スキャナーによって蛍光シグナルを読み取ることによって強度すなわち遺伝子発現を検出することができる。
上記検査方法によれば、個別の患者において関節炎の発症にミッドカインが関与しているか否かを判定することができる。特に、リウマチ性関節炎の場合には、患者の多数においてミッドカイン遺伝子の発現が上昇し、ミッドカインが関節炎発生に関与していることが示唆されている。そのため、本検査方法は関節炎、特にリウマチ性関節炎の原因因子の特定に有用である。
本発明の第三の側面として、関節炎の検査方法に用いるための検査薬が提供される。このような検査薬としては、上記検査方法に使用し得るミッドカイン遺伝子の一部配列を含むオリゴヌクレオチドを主成分とする検査薬（オリゴヌクレオチドプローブが固定された基板を含む）や、抗ミッドカイン抗体を含む検査薬が挙げられる。これら抗体やオリゴヌクレオチドは、検査方法に応じて、標識が付加されていてもよい。
上記検査薬としての抗ミッドカイン抗体は、例えば、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、ミッドカインを検出し得る抗体であればよい。例えば、ポリクローナル抗体であれば、既に本願発明者らにより開発されている抗体を用いてもよい（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１５９：３９２−４０２，１９９３）。モノクローナル抗体もまた既に開発されており（特開２００２−０８５０５８）、これを好適に利用することができる。
ミッドカインに対する特異抗体の作製は、公知の方法に準じて実施することができる。モノクローナル抗体は、例えば、配列番号：２に示したヒトミッドカインポリペプチド全体を感作抗原として、または抗原性を保持し得る長さを有する一部配列を感作抗原として用いて作製してもよい。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には、ケーラーとミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ．＆ Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７，１９７５）に準じて、以下のようにして作製できる。すなわち、上述したＭＫタンパク質またはその一部を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法に従って免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナル抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般には、齧歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を免疫動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳや生理食塩水等で適量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、免疫動物に１４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。このようにして免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後、免疫動物から免疫細胞（好ましくは、脾細胞など）を取り出し、細胞融合に付す。
上記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞が用いられ、こうしたミエローマ細胞は、例えばＰ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８，６５３）（Ｋｅａｒｎｙ Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３：１５４８−１５５０，１９７９）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｙｅｌｔｏｎ Ｄ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ８１：１−７，１９７８）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ．＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９，１９７６）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７６：２６９−２７０，１９７８）、ＦＯ（ｄｅ Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ Ｓ．Ｆ．＆ Ｓｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒ Ｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３５：１−２１，１９８０）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ Ｉ．Ｓ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４８：３１３−３２３，１９７８）、Ｒ２１０（Ｇａｌｒｅ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７７：１３１−１３３，１９７９）、等が好適である。
上記免疫細砲とミエローマ細胞の細胞融合は、基本的には、公知の方法、例えば、ミルステインらの方法（Ｇａｌｆｒｅ Ｇ．＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４６，１９８１）等に準じて行うことができる。具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウィルス等が使用され、さらに、融合効率を高めるため、ジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することができる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して、免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。細胞融合に用いる培養液としては、例えば、ミエローマ細胞株に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補助液を併用することもできる。
細胞融合は、免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を上記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１０００〜６０００程度のＰＥＧ溶液を、通常、３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的の融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を遂次添加し、遠心して、上清を除去する操作を繰り返すことにより、ハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等が除去される。
当該ハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日から数週間継続する。次いで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマスクリーニング及び単一クローニングが行われ、モノクローナル抗体を産生する細胞が調製される。このようにモノクローナル抗体は、ポリクローナル抗体のように他の免疫グロブリンが混在していないハイブリドーマ培養により生成されるため、精製が容易であり、また特異性が高い。
上記本発明の検査薬によれば、特異的にミッドカインタンパク質やｍＲＮＡなどのミッドカイン遺伝子産物を検出することができることから、患者試料を基に患者におけるミッドカイン遺伝子の発現を検出することが可能となる。そのため、本発明の検査薬は、患者における関節炎の発症にミッドカイン遺伝子の発現が関与しているか否かを判定するために大いに役立つ。
本発明の第四の側面として、関節炎の治療または予防のため薬剤の候補化合物のスクリーニング方法が提供される。関節炎の発症機序には、ＴＮＦ−αとは異なる側面からミッドカインが関与していることが予想されている。特に、ＴＮＦ−αに対する抗体を用いた治療が必ずしもすべての患者に対して有効ではないことから、更に新たな標的となる原因因子に対する薬剤が要望される。また、リウマチ性関節炎患者の多数の場合において、ミッドカインの発現が亢進していることからも、ミッドカインを標的とし、この活性を抑制する薬剤またはこの遺伝子の発現を抑制する薬剤は関節炎の治療または予防のための薬剤の重要な候補化合物となることが期待される。
本発明の関節炎の治療または予防のため薬剤の候補化合物のスクリーニング方法における第一の態様は、（ａ）ミッドカインとこれに結合する化合物を含むと予想される被検試料とを接触させ、（ｂ）該ポリペプチドと被検試料との結合活性を検出し、そして本発明のポリペプチドに結合する活性を有する化合物を選択することが含まれる。
スクリーニングに用いられるミッドカインポリペプチドは、組換えポリペプチドであっても、天然由来のポリペプチドであっても、あるいは部分ペプチドであってもよい。ミッドカインポリペプチド形態は、例えば、精製したポリペプチドとして、担体に結合させた形態として、他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして、後述する被検試料に接触させることができる。被検試料としては特に制限はなく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製若しくは粗精製ポリペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物が挙げられる。
ミッドカインポリペプチドと被検物質との結合を解析する方法としては、例えば、免疫沈降法（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐｐ．５１１−５５２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８））、ウエストウエスタンブロッティング法（Ｓｋｏｌｎｉｋ，Ｅ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９１）６５，８３−９０）、２−ハイブリッドシステム（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．ａｎｄ Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ，Ｒ．，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９４）１０，２８６−２９２、Ｄａｌｔｏｎ Ｓ，ａｎｄ Ｔｒｅｉｓｍａｎ Ｒ（１９９２）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＰ−１，ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ ｂｙ ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｏ ｔｈｅ ｃ−ｆｏｓ ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ ６８，５９７−６１２、「ＭＡＴＣＨＭＡＲＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ」，「Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」，「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ」（いずれもクロンテック社製）、アフィニティークロマトグラフィーを用いた解析方法などが挙げられる。これら方法は、被検物質がポリペプチドである場合に、該ポリペプチドとミッドカインとの結合を検出する際に有効である。
上記各方法の概要は次の通りである。免疫沈降法では、ミッドカインポリペプチドと、被検物質とを接触させる。その後、抗ミッドカイン抗体を添加し、ミッドカインと抗体との免疫複合体を形成、沈降させる。被検物質がミッドカインと結合する場合には、被検物質は免疫複合体とともに沈降する。沈降した免疫複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等により解析することにより、被検物質がミッドカインに結合しているか否かを移動度に基づき検出、さらには被検物質の分子量の予測も行うことができる。
ウエストウエスタンブロッティング法では、被検物質であるポリペプチドを発現していることが予想される細胞、組織よりｃＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーの各クローンを発現させ、発現産物であるポリペプチドをフィルターに固定する。このフィルターに、精製して標識したミッドカインポリペプチドを接触させる。ミッドカインの標識に基づいて、ミッドカインと結合したポリペプチドを発現するクローンが検出される。
２−ハイブリッドシステムでは、ミッドカインまたはその部分ペプチドをＳＲＦ ＤＮＡ結合領域またはＧＡＬ４ ＤＮＡ結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現させる。一方、被検物質であるポリペプチドを発現している細胞より、ＶＰ１６またはＧＡＬ４転写活性化領域と融合する形で発現するようなｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを上記酵母細胞に導入し、被検物質を発現、ミッドカインと接触させる。酵母細胞内で被検物質とミッドカインとは結合するとレポーター遺伝子が活性化される。このレポーター遺伝子の発現に基づいて、被検物質とミッドカインとの結合が検出される。なお、２−ハイブリッドシステムにおいて用いられるレポーター遺伝子は、例えば、ＨＩＳ３遺伝子の他、Ａｄｅ２遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ＰＡＩ−１（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｙｐｅ１）遺伝子等が挙げられるが、これらに制限されない。２−ハイブリッド法によるスクリーニングは、酵母の他、哺乳動物細胞などを使って行うこともできる。
アフィニティークロマトグラフィーを用いた検出方法としては、例えば、ミッドカインを固定した担体と被検物質であるポリペプチドを接触させる。接触後、担体を洗浄し、担体上に結合している物質を解析する。なお、このアフィニティークロマトグラフィーはバッチ法で行うこともできる。
また、被検物質が低分子化合物などの場合には、例えば、固定したミッドカインに、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを作用させ、本発明のポリペプチドに結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング方法（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ ＮＣ；Ｆａｒｒｅｌｌ ＦＸ；Ｃｈａｎｇ Ｒ；Ｋａｓｈｙａｐ ＡＫ；Ｂａｒｂｏｎｅ ＦＰ；Ｍｕｌｃａｈｙ ＬＳ；Ｊｏｈｎｓｏｎ ＤＬ；Ｂａｒｒｅｔｔ ＲＷ；Ｊｏｌｌｉｆｆｅ ＬＫ；Ｄｏｗｅｒ ＷＪ．，Ｓｍａｌｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔ ｍｉｍｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｒｍｏｎｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ）Ｊｕｌ ２６ １９９６，２７３ ｐ４５８−６４、Ｖｅｒｄｉｎｅ ＧＬ．，Ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｎａｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ ７ １９９６，３８４ ｐ１１−１３、Ｈｏｇａｎ ＪＣ Ｊｒ．，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ ７ １９９６，３８４ ｐ１７−９）が当業者に公知である。
また、被検物質がポリペプチド、低分子化合物のいずれにおいても、ミッドカインと被検物質との結合を検出又は測定する手段として表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーは、ミッドカインと被検物質との間の相互作用を微量のポリペプチドを用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅ等のバイオセンサーを用いることにより本発明のポリペプチドと被検物質との結合を評価することが可能である。
本発明のスクリーニングおいて、ミッドカインとの結合が検出された物質は、ミッドカインの活性を調節するための薬剤の候補となる。この中でもミッドカインの活性を抑制し得る物質は関節炎、特にリウマチ性関節炎の予防または治療薬に応用し得る。なお、上記スクリーニング方法により選択された物質が、ミッドカインの活性を阻害し得るか否かは、後述する実施例に示した、炎症性白血球などの炎症細胞の滑膜への移動、関節炎の誘導などに基づいて簡便に解析することができる。すなわち、ミッドカインは炎症細胞を滑膜へ移動させる活性を有するが、この活性を阻害するか否かによりミッドカイン活性を阻害し得る物質をさらにスクリーニングすることができる。または、実施例に示した抗体カクテルを用いた関節炎誘導の際に、スクリーニングで選択された物質を投与することにより、関節炎の発症が抑制されるか否かに基づいて、解析することもできる。
関節炎の治療または予防のため薬剤の候補化合物のスクリーニング方法における第二の態様は、ミッドカイン遺伝子が発現している細胞に被検物質を接触させ、被検物質接触後にミッドカイン遺伝子の発現レベルを測定し、ここで被検物質と接触させていない対照細胞のミッドカイン発現レベルに比べてミッドカイン遺伝子の発現レベルを低下させた被検物質を選択するものである。このスクリーニング方法によれば、ミッドカイン遺伝子の発現を抑制し得る化合物を選択することができる。
ミッドカイン遺伝子が発現している細胞としては、特に限定はなく、内在ミッドカイン遺伝子が発現している細胞系、または発現ベクターにミッドカイン遺伝子を連結して外来より導入されたミッドカイン遺伝子が発現している細胞系のいずれでもよい。被検物質は上記第一の態様と同様である。
上記被検物質とミッドカイン遺伝子が発現している細胞とを接触させる。接触は、被検物質が低分子化合物のような場合には、細胞の培養液中に添加することにより行うことができる。また、被検物質が、ポリペプチドなどの場合には被検物質であるポリペプチドをコードしたＤＮＡを発現ベクターに載せて、細胞内に導入することにより、被検物質をミッドカイン遺伝子に接触させる。
接触後、ミッドカイン遺伝子の発現を測定する。ミッドカイン遺伝子の発現は、上述した検査方法と同様に、ミッドカインタンパク質またはミッドカインｍＲＮＡを測定することにより行うことができる。
被検物質存在下のミッドカイン遺伝子の発現レベルが、被検物質非存在下の対照ミッドカイン遺伝子発現レベルと比較して、低下しているものを「関節炎の治療または予防のため薬剤の候補化合物」として選択する。
上記方法では、ミッドカイン遺伝子の発現を検出するために、ミッドカインタンパク質またはミッドカインｍＲＮＡを抗体やオリゴヌクレオチドを用いて検出する工程が必要となるが、この工程を簡略化するために、ミッドカイン遺伝子のプロモータ領域にレポーター遺伝子を接続させ、レポーター遺伝子の発現を直接モニターする系を構築してもよい。すなわち、スクリーニング方法の第三の態様は、ミッドカイン遺伝子のプロモータ領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞に被検物質を接触させ、被検物質接触後にレポーター遺伝子の発現レベルを測定し、レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる被検物質を選択することから構成される。
ミッドカイン遺伝子のプロモータ領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを調製する。ここで「機能的に結合した」とは、ミッドカイン遺伝子のプロモータ領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、ミッドカイン遺伝子のプロモータ領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。上記レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるＣＡＴ遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）およびＧＦＰ遺伝子等を挙げることができる。
次いで、上記細胞または上記細胞抽出液に被検化合物を接触させる。次いで、該細胞または該細胞抽出液における上記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。レポーター遺伝子の発現レベルは、使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がＣＡＴ遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。レポーター遺伝子がｌａｃＺ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用によるＧｌｕｃｕｒｏｎ（ＩＣＮ社）の発光や５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）の発色を検出することにより、さらに、ＧＦＰ遺伝子である場合には、ＧＦＰタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。
被検物質存在下における上記レポーター遺伝子の発現レベルが対照の被検物質非存在下の発現レベルと比較して低下している場合には、その物質を候補物質として選択する。
上記スクリーニングにおいて選択された物質は、ミッドカインの発現を抑制することにより関節炎を予防または治療するための薬剤となり得る。特に、ミッドカインはリウマチ患者の多くで発現が亢進していることから、本スクリーニングで選択された物質はリウマチ性関節炎の予防・治療薬の有力な候補物質となる。
本発明の第五の側面として、ミッドカイン遺伝子の発現を抑制し得るヌクレオチドを有効成分とする関節炎予防または治療用組成物が提供される。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、本発明のポリペプチドの産生細胞に作用して、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡに結合することにより、その転写又は翻訳を阻害、またはｍＲＮＡの分解を促進することにより、本発明のポリペプチドの発現を抑制する。実施例においてミッドカイン遺伝子のノックアウトマウスを用いた解析結果では、ミッドカイン遺伝子の発現を阻止・抑制することにより関節炎の発生が著しく抑制された。従って、ミッドカインの発現を抑制し得るヌクレオチドまたはその誘導体は、関節炎の予防または治療用の薬剤として有用となる。
ミッドカイン遺伝子の発現を抑制し得るヌクレオチドの第一の態様としては、ミッドカイン遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号：１の塩基配列中のいずれかの箇所にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは配列番号：１の塩基配列中の連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的となるミッドカインＤＮＡ又はｍＲＮＡの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補配列であるもののみならず、オリゴヌクレオチドと配列番号：１に示される塩基配列に特異的にハイブリダイズできる限り、１又は複数個のヌクレオチドのミスマッチが存在しているものも含まれる。
ミッドカイン遺伝子発現を抑制し得るアンチセンスオリゴヌクレオチドの分子設計については、例えば、ミッドカインｍＲＮＡの一次配列を基に、最小のエネルギーを持つ二次構造をコンピュータープログラムで予測する。この予測される二次構造に基づいて、塩基対を作らないループ部分をアンチセンスオリゴヌクレオチド配列候補として選択することができる。一例を示せば、ヒトミッドカインのｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ６９１４８：Ｔｓｕｔｓｕｉ Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１７６：７９２−７９７，１９９１）の二次構造予測をコンピュータ解析により行うと、（ヒトＭＫ ｍＲＮＡ配列の塩基番号１５番目から３２番目に基づく）（配列番号：３）、および５’末端近傍でループを作らない配列に対応するアンチセンスＤＮＡ、（ヒトＭＫ ｍＲＮＡ配列の塩基番号１番目から１８番目に基づく）（配列番号：４）を設計することができる。
しかし、本発明のオリゴヌクレオチドは上記具体的に示された配列に限定されるものではく、配列番号：１の配列に基づいて、適宜設計することができる。そして、設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチド配列がＭＫの発現抑制活性を有するか否かの判定は、次の通り行うことができる。アンチセンスオリゴヌクレオチド配列を持つ物質を、ミッドカインを合成分泌している細胞に投与し、培養液中に分泌されるＭＫを免疫生化学的に定量する。ミッドカインの免疫生化学的定量法としては酵素免疫法（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１９：１１７１−１１７５，１９９６）あるいはＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動後のウェスタンブロッティング（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．：Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１５９；３９２−４０２，１９９３）そしてデンシトメーターによる定量がある。この定量によりミッドカイン遺伝子産物の産生を低下させ得るアンチセンスオリゴヌクレオチドはミッドカインの遺伝子発現を抑制し得るものとして選択することができる。
また上記「オリゴヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡのデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド構造のような天然に存在するオリゴマーの核酸部分、ならびに天然に存在する核酸に結合する能力のある人工アナログの両方を包含する。人工アナログとしては、例えばメチルホスホネート型又はエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、ホスホロチオエート修飾体又はホスホロアミデート修飾体、モルホリノ修飾体、逆向きチミジン修飾体等が挙げられる。したがって、上記設計されたオリゴヌクレオチドは必要に応じて、これらいずれかにより修飾されてもよい。こうした修飾体は既に開発されており、既に開発されている修飾体を本発明の関節炎治療薬に応用してもよい。例えば、モルホリノ修飾体は特開２００３−２１０１７０に、ホスホロチオエート修飾体は特開２００２−１４２７７８に、逆向きチミジン修飾体は特開２００３−２１０１７１に開示されている。
これら修飾体のうちホスホジエステル結合したオリゴヌクレオチドは、血清でまたは細胞内部でヌクレアーゼの作用を特に受けやすい。そのため本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの好適な態様としては、ヌクレアーゼ抵抗性であるホスホロチオエート結合あるいはメチロホスホネート結合したアナログなどである（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４８：２６５９，１９９８）。
なお、このようなオリゴヌクレオチドの人工アナログは、当業者らに周知の方法、例えば、市販の機械およびＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）より入手できる試薬を用いる方法によって調製することができる。
本発明の他の態様において、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドそのものの形態でなくともよく、例えば、発現ベクターなどに搭載させた発現構築物として標的細胞を感染させた後にアンチセンスＲＮＡ分子として生成させてもよい。
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは標的となるｍＲＮＡとハイブリッドを形成して、相応する遺伝子産物の発現を多重機構で阻害する。「翻訳停止」状態では、標的ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳が阻止される（Ｈａｅｕｐｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１４：１４２７，１９８６）。ホスホジエステルＤＮＡまたはホスホロチオエートＤＮＡオリゴヌクレオチドなどの場合では、標的となるＲＮＡ配列がそのＤＮＡオリゴマーにハイブリダイズするとすぐに、細胞内ＲＮａｓｅ Ｈがその標的ＲＮＡ配列を消化することができる（Ｗａｌｄｅｒ ＆ Ｗａｌｄｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５：５０１１，１９８８）。
「翻訳停止」状態におけるさらなる作用機構としては、ある種のオリゴヌクレオチドは、目的の遺伝子を含む二本鎖の標準的なゲノムＤＮＡとともに「トリップレクス」すなわち三重らせん構造を形成することが可能で、それによってＲＮＡポリメラーゼによる転写が妨げられることも明らかになっている（Ｇｉｏｖａｎｎａｎｇｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９０：１００１３，１９９３）。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは患者の患部に直接適用するか、又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用する。さらには、持続性、膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いることもできる。例えば、リポソーム、ポリ−Ｌ−リジン、リピッド、コレステロール、リポフェクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体の投与量は、患者の状態に応じて適宜調整し、好ましい量を用いることができる。例えば、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲で投与することができる。
ミッドカイン遺伝子の発現を抑制するヌクレオチドの第二の態様としては、ミッドカイン遺伝子を標的としたｄｓＲＮＡである。
「ミッドカイン遺伝子を標的としたｄｓＲＮＡ」とは、ミッドカイン遺伝子の発現をＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により抑制し得るｄｓＲＮＡを意味する。ミッドカイン遺伝子発現をＲＮＡｉ干渉で抑制するためのｄｓＲＮＡは、一方の鎖は少なくともミッドカインｍＲＮＡと相補する配列を備える。発現抑制し得る部位であれば、ミッドカインｍＲＮＡのいずれの領域において相補関係を有してもよい。また、この相補性は、ＲＮＡｉを誘導しミッドカイン遺伝子発現を抑制し得る限り、完全である必要はなく、標的配列との間で数塩基程度のミスマッチを有しても良い。
ｄｓＲＮＡは、人工的に合成されたｄｓＲＮＡそのもの、あるいは発現ベクターにより哺乳動物細胞内で発現させたｄｓＲＮＡの双方の形態を採用することができる。
ｄｓＲＮＡを人工的に合成し、哺乳動物細胞に導入する場合、発現ベクターからｄｓＲＮＡを発現させる場合のいずれの場合にも、長鎖ｄｓＲＮＡによる哺乳動物細胞への細胞毒性を考慮する必要がある。そのため、人工的に合成したｄｓＲＮＡ（以下「合成ｄｓＲＮＡ」という）、発現により結果生成されるｄｓＲＮＡのいずれも、鎖長は例えば１９〜３０塩基対とすることがよいが、これよりも長いｄｓＲＮＡであっても細胞毒性を与えないものであれば用いることができる。
上記ミッドカインｍＲＮＡを標的としたｄｓＲＮＡは、生体内でミッドカインｍＲＮＡと対合し、生体内の酵素によりミッドカインｍＲＮＡの切断を誘導する。そのため、ミッドカインのｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害し、結果としてミッドカインの発現を抑制し、関節炎発症を抑制することが可能となる。
本発明の第六の側面として、抗ミッドカイン抗体を有効成分とする、関節炎予防または治療用組成物が提供される。
ミッドカインの作用を抑え得る既に開発されている抗ミッドカイン抗体（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１５９：３９２−４０２，１９９３）を本発明の関節炎治療・予防用に応用してもよい。また、ヒトミッドカインに対するモノクローナル抗体も開発されており（特開２００２−０８５０５８）、これを応用してもよい。しかし、本発明の抗体はこれら既に報告されている抗体に限定されるものではなく、上記検査方法において説明した抗ミッドカイン抗体の作製方法により作製された抗ミッドカインポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いることもできる。
また、治療剤に使用するミッドカイン抗体は組み換え型抗体や改変抗体を用いることも有効である。組み換え型抗体としては、例えば、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んでこれを宿主に導入し、遺伝子組み換え技術を用いて産生させた組み換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ Ｃ．Ａ．Ｋ．＆ Ｌａｒｒｉｃｋ Ｊ．Ｗ．，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ ＬＴＤ，１９９０）。改変抗体としては、例えばキメラ抗体、ヒト型化抗体が使用できる。キメラ抗体は、ヒト抗体以外の抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡとヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡとを連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し、産生させることにより得ることができる（ＥＰ １２５０２３，ＰＣＴ ＷＯ９６／０２５７６）。
本発明で使用される抗体は、ミッドカインに結合しミッドカインの活性を阻害するかぎり、抗体の断片や修飾物であってもよい。例えば、抗体の断片として、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェイン Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
Ｃ５７ＢＬ／６バックグランドの６−８週令の野生型およびミッドカイン遺伝子ノックアウトマウスを使用した。ミッドカイン遺伝子ノックアウトマウスは既に報告されている方法に従って創生された（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ｔｏ Ｃｅｌｌｓ，３：８１１−８２２，１９９８）。このＭＫノックマウスおよび対照の野生型マウスにおいて関節炎の誘導を試みた。両マウスに８ｍｇの抗コラーゲンモノクローナル抗体カクテル（岩井化学）を注射し、２日後同様に皮下注射した。さらに二日後５００μｇ／ｍｌのリポ多糖を１００μｌ腹腔内注射した。操作の詳細はＴｅｒｏｔｏ Ｋ．らの報告（Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ，１４８：２１０８，１９９２）に従った。最初の注射から７日目に関節のいずれかが腫れ、発赤すれば関節炎発症（＋）、そのような現象が起こらない時は発症（−）と判定した。
上記ミッドカイン遺伝子ノックアウトマウスと対照の野生型マウスで、抗体による関節炎の発症を比較すると、ノックアウトマウスでは著しく低下していた（表１）。ノックアウトマウスと野生型マウスの間では、ミッドカインの存在の有無のみが異なるので、ミッドカインの発現を抑えるか、作用を抑えれば、リウマチの治療が可能になることが示唆された。
〔実施例２〕 ＲＡ患者からの標本におけるＭＫレベルの上昇
患者から得た試料を用いてＭＫ発現とＲＡとの相関を調べた。本実施例では患者試料として、ＲＡまたは変形性関節症（ＯＡ）の患者から滑膜液および血清の試料を採取した。滑膜液はＲＡ患者およびＯＡ患者の膝関節から治療プログラムの一環として吸引した。患者は全例、米国リウマチ学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ）（旧米国リウマチ協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ））による１９８７年のＲＡ基準を満たした。患者は全例、非ステロイド性抗炎症薬および疾患修飾性抗リウマチ薬による治療を受けていた。ＲＡ患者１４５例の平均年齢は６３．１歳であった（１７〜８５歳の範囲）；ＯＡ患者１８例の平均年齢は６７．２歳であった（５４〜７８歳の範囲）。ほとんどのＲＡ患者に対してＬａｒｓｅｎのグレード分類およびステージ分類（米国リウマチ学会）を行った。各グレードの患者数は以下の通りである：グレード１、１０；グレード２、２４；グレード３、２７；グレード４、４１；グレード５、４９。各ステージの患者数は以下の通りである：ステージ１、２３；ステージ２、３４；ステージ３、４２；ステージ４、５２。標本（手術標本を含む）を採取した患者の全例から、名古屋大学審査委員会により承認されたインフォームドコンセント文書への記載および署名を得た。
ＭＫ濃度は報告されている方法の通り、上記患者由来の滑膜液および血清の固相酵素免疫アッセイによって測定した（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １１９：１１７１−５，１９９６）。すなわち、アフィニティー精製したウサギ抗ヒトＭＫ抗体（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １１９：１１７１−５，１９９６）をマイクロタイタープレートの壁に吸着させた後に、ＭＫを含む試料溶液をウェルに添加した。続いて、ビオチン化抗ヒトＭＫ抗体を添加し、吸着したビオチン標識抗体を、アビジン標識したβ−ガラクトシダーゼおよびその蛍光性基質を利用して酵素的に定量した。ＲＡ患者の血清中のリウマトイド因子（ＲＦ）を製造者（栄研化学、東京、日本）の指示に従って測定した。
大半の例において、ＲＡ患者からの滑膜液中のＭＫ値は高値であり（図１Ａ）、一方、ＯＡ患者で認められたＭＫ値は低値に過ぎなかった。ＯＡ患者（３３２ｐｇ／ｍｌ）で測定された最も高いＭＫ値をカットオフレベルとした場合、ＲＡ患者の８５．４％はこれよりも高値を示した。ＭＫレベルはＲＡ患者におけるＲＦの血清レベルと相関した（相関係数、０．６８３；ｐ＜０．００１）。患者を高レベルのＲＦ例［ＲＦ（＋＋）］、中等度レベルのＲＦ例［ＲＦ（＋）］およびＲＦを認めない例［ＲＦ（−）］に分類したところ、ＲＦ（＋）またはＲＦ（＋＋）の患者は全例、カットオフ値を上回る値を示した。さらにＲＦ（−）の患者１８例中１０例も高値を示した。ＲＦ（＋＋）、ＲＦ（＋）およびＲＦ（−）の患者に関する平均ＭＫ値はそれぞれ９，６７０、７，５９０および１，２４０ｐｇ／ｍｌであった。
ＲＡ患者では血清ＭＫ値も高値であった。正常ヒト被検者における血清ＭＫ値は６００ｐｇ／ｍｌに達しなかった（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １１９：１１７１−５，１９９６；Ｉｋｅｍａｔｓｕ Ｓ．ｅｔ ａｌ，Ｂｒｉｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８３：７０１−６，２０００）。この値をカットオフ値として用いると、ＲＡ患者の９１．６％が高値を示した（図１Ｂ）。血清ＭＫ値もＲＦレベルと相関したが（相関係数０．７４４；ｐ＜０．００１）、これはＣ反応性タンパク質レベル、赤血球沈降速度、疾患のステージ、グレード、期間または持続期間とは相関しなかった。ＲＦ（＋＋）患者は全例高値を示し、ＲＦ（＋）患者の９４．６％が陽性であった（図１Ｂ）。さらにＲＦ（−）患者の７１．９％も陽性であった（図１Ｂ）。ＲＦ（＋＋）、ＲＦ（＋）およびＲＦ（−）の患者に関する平均ＭＫ値はそれぞれ９，７９０、５，２４０および８５４ｐｇ／ｍｌであった。血清ＭＫレベルは同じ患者の滑膜液中のＭＫレベルとよく相関した（相関係数、０．６２３；ｐ＝０．００２）。血清のゲル濾過によってＭＫ免疫反応性は低分子量画分に溶出されたため、抗ＭＫ抗体がＲＦと交差反応した可能性はないと判断した（非提示データ）。
本発明者らは次にＭＫ上昇の由来について患者骨膜組織を用いて検討した。外科手術前にステロイド投与を受けていなかった女性ＲＡ患者（６０〜６５歳、ステージ４、グレード５）から滑膜組織を外科的に採取した。滑膜組織を直ちに氷上で冷却し、１０％ホルマリン溶液（和光ケミカル、東京、日本）中で７日間固定した。脱水後に組織をパラフィン中に包埋し、長軸全体にわたり３μｍ厚の切片として切り出した。連続切片をスライドにマウントし、一晩乾燥させた後に気密容器内に保存した。切片を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ＰＢＳ溶液にて１５分間室温で処理し、３％ＢＳＡ ＰＢＳ溶液で３０分間ブロックした上で、ウサギ抗ヒトＭＫ抗体（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １１９：１１７１−５，１９９６）および／またはマウスモノクローナル抗体抗ＣＤ６８（マクロファージのマーカー）（Ｎｅｏｍａｅｋｅｒｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）により４０℃で一晩かけて染色し、その後にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４ヤギ抗ウサギＩｇＧおよび／またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）により室温で１時間染色した。続いて、蛍光顕微鏡Ａｘｉｏｓｋｏｐ ２ ｐｌｕｓ（ＺＥＩＳＳ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて標本を観察した。
ＲＡ患者の滑膜は主としてマクロファージ様細胞および線維芽細胞様細胞から構成されていた（図２Ａ）。抗ＭＫ抗体は関節腔に面した細胞を強く染色し、これらの細胞は抗ＣＤ６８抗体（マクロファージのマーカー）によっても染色される（図２Ａ）。滑膜内の他の細胞は抗ＭＫ抗体によって中程度に染色される。本発明者らは全例がステージ４およびグレード５である患者４例の試料を染色し、本質的には同一の結果であることを確認した。
さらに、本発明者らは滑膜からマクロファージ様細胞および線維芽細胞様細胞を単離し、細胞レベルでのＭＫの発現を確認した。
マクロファージ様細胞および線維芽細胞様細胞の分離は、滑膜組織から以前に記載された方法に従って行った（Ｔａｋａｙａｎａｇｉ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２４０：２７９−８６，１９９７）。抗ヒトＣＤ１４モノクローナル抗体をコーティングしたビーズおよびカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を製造者の指示に従って用いて、ＭＡＣＳシステムにより、ＣＤ１４＋細胞を浮遊細胞から分離した。ＣＤ−１４＋細胞は抗ＣＤ６８抗体による染色および形態によってマクロファージ様細胞として同定された。ＣＤ−１４コーティングビーズのカラムを通過した細胞を培養し、０．１２５％トリプシンおよび０．０１％ＥＤＴＡを用いて２ウェルチェンバースライド（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）上に継代した。付着細胞を形態に基づいて線維芽細胞様細胞とみなした。分離した細胞の培養に用いた培地は、１０％ウシ胎仔血清を加えたダルベッコ変法最小必須培地であった。
上記滑膜から単離した細胞の免疫染色の前処理として、細胞を４％パラホルムアルデヒドにより室温で２０分間固定してＰＢＳで洗浄し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ＰＢＳ溶液で９分間処理してＰＢＳで洗浄した上で１％正常ヤギ血清により２０分間処理した。続いて細胞をウサギ抗ヒトＭＫ抗体と反応させた。フルオレセインイソチオシアネートで標識したヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｉｓ，ＭＯ）を二次抗体として用い、標本をレーザー共焦点画像化システムＭＲＣ１０２４（日本バイオラッド、東京、日本）により観察した。
滑膜から単離したマクロファージ様細胞および線維芽細胞様細胞を用いた実験でも、上記免疫組織化学染色の結果（図２Ａ）と一致する結果が得られた。すなわち、滑膜から単離されたマクロファージ様細胞および線維芽細胞様細胞の両方がＭＫを発現していることが確認された（図２Ｂ）。
〔実施例３〕 ＭＫ欠損マウスにおける抗体誘発性関節炎の抑制
ＲＡ患者の標本におけるＭＫの高発現はＲＡの発生機序と関係することが示唆されたため、本発明者らはこの可能性についてさらに検討した。
ＲＡの代表的な実験モデルは抗体誘発性関節炎であり、これは抗ＩＩ型コラーゲン抗体の注入後にＬＰＳ注入を行うことによって誘発される（Ｔｅｒａｔｏ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：２１０３−８，１９９２）。本発明者らは抗体誘発性関節炎がＭＫ遺伝子欠損マウス（Ｍｄｋ−／−）で起こるか否かを調べた。
なお、ミッドカイン遺伝子（Ｍｄｋ）が欠損したマウスの作出については以前に報告があり（Ｎａｋａｍｕｒａ Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ ３：８１１−２２，１９９８）、その方法に従って実施した。ヘテロ接合性変異マウス（Ｍｄｋ＋／−）をＣ５７ＢＬ／６マウスと７〜８回戻し交雑させた後に相互に交配させた。このようにして得られたＷＴまたはＭｄｋ−／−を１回同系交配させ、雄の子孫をＷＴまたはＭｄｋ−／−として実験に用いた。各実験におけるＷＴおよびＭｄｋ−／−の週齢には１週を上回る差がないようにした。ｄｄＹ系統のマウスは日本ＳＬＣ（静岡、日本）から購入した。これらの実験に用いたマウスはすべて６〜８週齢であり、名古屋大学医学部の実験動物施設で滅菌した食餌、水および床敷きを与えた上で飼育および維持を行った。実験はすべて名古屋大学の動物倫理委員会による承認を得た。
マウスへの関節炎の誘導は以前報告された方法に従って行った（Ｔｅｒａｔｏ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：２１０３−８，１９９２）。各マウスに対して、抗ＩＩ型コラーゲン抗体を含む関節炎誘発性モノクローナル抗体カクテル（岩井化学薬品、東京、日本）８ｍｇを投与した。注射は腹腔内に２日間連続して行った。第４日に５００μｇ／ｍｌ ＬＰＳ溶液（ＰＢＳ中）１００μｌを腹腔内注射した。各肢について関節炎の重症度を０〜４の尺度で判定した：０＝正常；１＝後肢関節または前肢関節の軽度であるが明確な発赤および腫脹；２＝後肢関節または前肢関節の中程度の発赤および腫脹；３＝肢全体の発赤および腫脹；４＝複数の関節に生じた肢の極度の炎症（Ｔｅｒａｔｏ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：２１０３−８，１９９２）。四肢に関して得た値を合計した。ポンプ試験では、ヒトＭＫ生理食塩水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）またはヒト血清アルブミン（和光純薬工業、大阪、日本）生理食塩水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を、浸透ポンプ（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いてＭｄｋ−／−に注入した。腹部皮下に植え込んだポンプから７日間をかけて計９０μｌを連続注入した。ヒトＭＫは酵母内で産生されたものであり（Ｉｋｅｍａｔｓｕ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８３：７０１−６，２０００）、セルシグナルズ社（横浜、日本）のＳ．Ｓａｋｕｍａ博士より寄贈された。全マウスの血清中のＭＫレベル（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １１９：１１７１−５，１９９６）およびＴＮＦ−αレベル（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を測定した。
ＷＴの場合には、抗体投与後第５日および第６日に関節の急激な腫脹が起こり、第７日にはほとんどのマウスが顕著な関節炎を発症した（表２、図３Ａ）。しかし、ほとんどのＭｄｋ−／−では第７日（表２、図３Ａ）にもそれ以後にも関節炎は認められなかった。第７日の平均関節炎スコアはＷＴでは８．３であり、Ｍｄｋ−／−では０．７であった。
さらに、上記Ｍｄｋ−／−マウスおよびＷＴマウスの関節組織の組織学的および免疫組織化学的な検査を行った。
マウスの前肢関節を摘出し、１０％ホルマリン溶液（和光ケミカル、東京、日本）中で７日間固定した上で、０．５ｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡにより脱灰処理を行った（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２２：１３７３−８２，１９８８）。脱水後に組織をパラフィン中に包埋し、長軸全体にわたり３μｍ厚の切片として切り出した。連続切片をスライドにマウントし、一晩乾燥させた後に気密容器内に保存した。切片はヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。同じく、切片を０．３％Ｈ２Ｏ２ ＰＢＳ溶液により室温で３０分間処理し、１％ＢＳＡ ＰＢＳ溶液で２０分間ブロックした上で、一次抗体としてウサギ抗マウスＭＫ抗体、ラット抗マウスマクロファージ（Ｆ４／８０抗原）抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）またはラット抗マウス好中球（Ｓｅｒｏｔｅｃ）抗体により４℃で一晩染色し、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したアフィニティー精製ヤギ抗ウサギＩｇＧ、または西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したアフィニティー精製ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｂｅ，ＰＡ）を二次抗体として用いた。染色したものをジアミノベンチジン四塩酸（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、東京、日本）によって可視化した。なお、ウサギ抗マウスＭＫ抗体は以前の記載の通りに調製した（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １５９：３９２−４０２，１９９３）。
なお、統計分析は、動物モデルおよび培養細胞に関する統計的比較はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定によって行った。
上記組織学的および免疫組織化学的な検査により、ＷＴでは第５日および第７日に滑膜の増殖が認められ（図３Ｂ中の矢印）、第７日には関節腔の増大および滑膜液の蓄積が認められた（図３Ｂ）。Ｍｄｋ−／−の場合には第５日および第７日の滑膜はＷＴのものよりもはるかに薄かった（図３Ｂ中の矢印）。Ｍｄｋ−／−では第７日に関節腔の増大は観察されなかった（図３Ｂ）。免疫組織化学染色により、ＷＴの滑膜内の細胞は第２日の方が第０日よりも抗ＭＫによって強く染色された（図３Ｂ）。染色は第５日および第７日にはさらに強くなり、これは特に関節腔に面した細胞で顕著であった。血清の固相酵素免疫アッセイにより、関節炎の発生過程ではＭＫ含量が次第に増加することが確認された（図４Ａ）。
分析の次の段階として、本発明者らは関節炎発症に関するＭｄｋ−／−とＷＴとの間の違いが実際にＭｄｋの有無に起因することを立証することを試みた。ＷＴはＣ５７ＢＬ／６マウスであり、Ｍｄｋ−／−はＣ５７ＢＬ／６マウスに対して戻し交雑を７〜８回行ったものであるが、その起源は１２９／ＳＶマウスにある。このため、１２９／ＳＶマウス由来の少量の遺伝子がＭｄｋ−／−を関節炎誘発に対して抵抗性を付与したと考えることもできなくはない。しかし、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは関節炎誘発に対して比較的抵抗性が高く、関節炎を誘発するには高用量の抗体を必要とするため、その可能性は低い。本発明者らは、同一条件下では１２９／ＳＶマウス５匹すべてがＣ５７ＢＬ／６マウスと同じく関節炎を発症することを確認した。さらに、浸透ポンプによってＭｄｋ−／−の腹膜にＭＫを与えると、ヒト血清アルブミンを与えた場合よりも関節炎発症の頻度は高かった（表２）。この実験により、ＭＫが関節炎の発症に重要な因子であることが明確に立証された。
〔実施例４〕ＭＫは炎症細胞の移動と破骨細胞の分化の両方を増強する
本発明者らは抗体誘発性関節炎の発生機序におけるＭＫの役割について検討した。まず、炎症を誘導する因子として、ＴＮＦ−αの血清レベルを比較したところ、ＷＴとＭｄｋ−／−との間に差はみられなかった（図４Ｂ）。したがって、ＭＫはＴＮＦ−αとは異なる側面から関節炎の発生機序に関与している。本発明者らは、マクロファージおよび好中球の滑膜への移動はＭｄｋ−／−の方がＷＴよりも少ないことを見いだした（図４Ｃ、Ｄ）。すなわち、Ｍｄｋ−／−における炎症性白血球の移動の低下は、虚血後の新生内膜形成（Ｈｏｒｉｂａ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０５：４８９−９５，２０００）および腎炎（Ｓａｔｏ Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６７：３４６３−９，２００１）の場合と同じように、これらのマウスで関節炎が軽減される理由の一つである。
破骨細胞は骨破壊において中心的な役割を果たすため（Ｒｅｄｌｉｃｈ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１０：１４１９−２７，２００２）、本発明者らはＭＫが破骨細胞の分化を促進するか否かを検討した。これまでにＭ−ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬの組み合わせ（単独では不可）が、マクロファージからの破骨細胞の分化を誘導することが知られている（Ｙａｓｕｄａ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：３５９７−６０２，１９９８；Ｔａｋｅｓｈｉｔａ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ １５：１４７７−８８，２０００）。本発明者らはＲＡ患者の滑膜由来のマクロファージ様細胞をＭＫまたは他のサイトカインとともに培養した。破骨細胞の分化については、これらの細胞で発現されるＴＲＡＰの染色によって評価した。
より詳細には、破骨細胞の分化実験は次のように行った。単離したＣＤ１４＋細胞（１０６個／ウェル）を２ウェルチェンバースライド（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐ．）上に播種し、１０％ウシ胎仔血清を加えたダルベッコ変法最小必須培地中にて、組換えヒトＭ−ＣＳＦ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｎａｄａ）および／またはＲＡＮＫＬ（５０ｎｇ／ｍｌ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ ＥＣ，Ｌｔｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕ．Ｋ．）および／またはヒトＭＫの存在下（１００ｎｇ／ｍｌ）または非存在下で３週間培養した。培地は３日毎に交換した。
Ｍ−ＣＳＦ依存性骨髄マクロファージを雄性ｄｄＹマウスの全骨髄から調製し、これらの細胞の破骨細胞への分化を刺激する組換えマウスＭＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＩＮＮ）とともに２日間培養した（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ １５：１４７７−８８，２０００；Ｔａｋａｙａｎａｇｉ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０８：６００−５，２０００）。続いて、細胞を以下の因子の存在下または非存在下で３日間培養した；マウスＭ−ＣＳＦ（１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）、ＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびヒトＭＫ。
ヒトおよびマウスの破骨細胞は酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）染色によって同定した（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２２：１３７３−８２，１９８８）。ウェルの全領域内のＴＲＡＰ陽性細胞を算定した。各実験において４つのウェルを算定し、その平均値を示した。３つの独立した実験における結果には再現性があった。
ＭＫは１００ｎｇ／ｍｌでＴＲＡＰ陽性細胞の数を有意に増加させた（図５Ａ）。以前に報告されているように、ＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦは単独ではＴＲＰ陽性細胞を増加させないが、これらを組み合わることによりＴＲＡＰ陽性細胞を増加させた。Ｍ−ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬの組合せにＭＫを添加すると、Ｍ−ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬのみを添加した場合よりも分化を促すように思われたが、その違いは有意に達するほど大きくはなかった。
完全に分化した破骨細胞は多核性であるため、本発明者らは次に、核の数が４個以上のＴＲＡＰ陽性細胞を算定することによってＭＫの効果を評価し、同じ結論に達した（図５Ｂ）。ＭＫによる破骨細胞への分化誘導活性の強さはこのＴＲＡＰアッセイの方が強く示された。ＴＲＡＰ染色の写真を図５Ｃに示している。
本発明者らはまた、マウス骨髄マクロファージを標的細胞として用いて、ＭＫの破骨細胞誘導活性についても検討した。この樹立系において、ＭＫは単独では破骨細胞の分化を誘導しなかった（図５Ｄ）。すなわち、ヒト滑膜内では前駆細胞がすでに何らかの分化段階に達している可能性がある。以前に報告されているように、Ｍ−ＣＳＦまたはＲＡＮＫＬは単独では分化を誘導しない（Ｔａｋａｙａｎａｇｉ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２４０：２７９−８６，１９９７；Ｔａｋｅｓｈｉｔａ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ １５：１４７７−８８，２０００）。ＭＫおよびＲＡＮＫＬの組み合わせは分化を誘導し、その誘導のレベルはＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦによるものと同程度であった。ＭＫ、Ｍ−ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬの添加はＭ−ＣＳＦとＲＡＮＫＬの組み合わせよりも破骨細胞の分化を増強するように思われるが、その差は統計学的に有意ではなかった。
実施例の考察：ＲＡの発生機序には種々のサイトカインがさまざまな役割を果たしている（Ｆｅｌｄｍａｎｎ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４：３９７−４４０，１９９６）。本発明者らは、ＭＫがこの過程において炎症性白血球の移動および破骨細胞の分化の両方に役割を果たしていることを見いだした。インビトロ試験により、ＭＫが直接的作用およびケモカイン誘導の両方を介して炎症性白血球の移動を増強することが示された（Ｈｏｒｉｂａ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０５：４８９−９５，２０００；Ｓａｔｏ Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６７：３４６３−９，２００１；Ｔａｋａｄａ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １２２：４５３−８，１９９７）。破骨細胞の分化を促進する活性は骨破壊との関連から重要である。ＭＫがＲＡＮＫＬと協同的に作用する活性はＭ−ＣＳＦのものと同程度に強かった。ＭＫのこの活性スペクトルは他のサイトカインには認められない。
Ｍｄｋ−／−において抗体誘発性関節炎が事実上生じなかったことは、ＲＡの発生機序にＭＫが必須な役割を果たすことを意味する。実験モデルにおける本疾患に対する抵抗性はＩＬ−１欠損マウスで認められるレベルである（Ｊｉ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９６：７７−８５，２００２）。これに対して、ＴＮＦ−α欠損マウスは実験的関節炎を時に発症する（Ｊｉ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９６：７７−８５，２００２）。ＩＬ−６欠損マウスではコラーゲン誘導性関節炎の発症が著しく抑制されるが（Ｏｈｓｈｉｍａ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：８２２２−６，１９９８）、免疫複合体誘導性関節炎については抑制されない（Ｊｉ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９６：７７−８５，２００２）。これはＩＬ−６が主にリンパ球活性化に関与しているためと考えられる。本発明者らは本研究で抗体誘発性モデルを用いたが、これはこのモデルでは抗体産生の影響を除外できるためである。
ＭＫとＲＡとの密接な相関関係は、ＲＡ患者の滑膜内および血清中のＭＫ値が高いことからも裏づけられる。ＲＡ患者の９０％以上で血清ＭＫレベルの上昇が認められた。ＲＡに伴うこうした高頻度の上昇はＩＬ−６レベルに関して観察されているが、ＩＬ−１レベルおよびＴＮＦ−αレベルについては観察されていない（Ｄａｎｉｓ ＶＡ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ ５１：９４６−５０，１９９２）。早期ＲＡの診断には多数の要因の判定を要するため、ＲＡ患者の標本におけるＭＫ発現レベルの高さは、ＭＫレベルをＲＡのスクリーニングに利用しうる。
ＭＫが関節炎の発生機序に決定的な役割を果たすことに一致して、ＭＫはＲＡ患者および関節炎の発症過程にあるマウスのいずれの滑膜内にも検出された。本発明者らは以前に、ＲＡ患者の滑膜内におけるＭＫ発現を報告しているが、その際にＭＫ発現を伴う細胞は同定されなかった（Ｔａｋａｄａ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １２２：４５３−８，１９９７）。本研究により、滑膜内のマクロファージ様細胞および線維芽細胞様細胞の両方におけるＭＫ発現が明らかになった。すなわち、ＭＫは適切な時期および場所に存在して、関節炎の発生機序に関係する２種類の活性を発揮する。さらに、活性化リンパ球によって分泌されるＭＫも関節炎の発症に寄与する可能性がある（Ｃａｌｌｅｂａｕｔ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２８１：２４８−６４，２００１）。
ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１に加えて、ＩＬ−６もＲＡの治療法の有望な標的となりつつある（Ｃｈｏｙ ＥＨ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４６：３１４３−５０，２００２）。本願における知見は、ＭＫが治療的応用のもう一つの候補であることを示唆する。重要な点の一つは、ＭＫがＲＡ発生機序の２つの異なる段階で決定的な役割を果たすことである。ＲＡの抗サイトカイン療法における問題の一つは、奏功しない患者が存在することである。ＴＮＦ−α、ＩＬ−１およびＩＬ−６と比較したＭＫの作用機序の違いは、奏功する患者集団の違いを生む可能性がある。指摘すべきもう一つの点は、ＭＫが主として妊娠中期に発現され、成人では限定された領域でしか発現されないことである（Ｋａｄｏｍａｔｓｕ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１０：６０７−１６，１９９０；Ｔｓｕｔｓｕｉ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３：１２８１−５，１９９３）。成人におけるＭＫの限定的な発現は重大な副作用を避けるのに役立つと思われる。
最近、ＭＫと約４５％の配列同一性を有するプレイオトロフィンがＲＡ患者の滑膜内で誘導されることが見いだされ（Ｐｕｆｅ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４８：６６０−７，２００３）、このことからプレイオトロフィンもＲＡの発生機序に寄与することが示唆されている。ＭＫおよびプレイオトロフィンは多くの系で類似した機能を示すが（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ Ｔ．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １３２：３５９−７１，２００２；Ｋｕｒｔｚ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｇ ６：１５１−７７，１９９５）、関節炎発症に関するＭｄｋ−／−の明らかな表現型からみて、この２つの因子はこの過程で異なる役割を果たすと考えられる。実際に、滑膜由来の細胞に対するプレイオトロフィンのインビトロ活性は増殖の賦活である（Ｐｕｆｅ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４８：６６０−７，２００３）。
【産業上の利用の可能性】
本発明により、関節炎発症に関与する因子としてミッドカインが新たに同定された。ミッドカインは、ＲＡ患者において有意に発現が高く、また、関節炎の実験動物モデルでも同様にミッドカインの高発現が観察された。したがって。本発明の関節炎関連因子は、関節炎の発生を研究するための試薬としてまたは、関節炎モデルを作製する際の試薬として有用となる。
また、本発明の関節炎の検査方法は、ＲＡ患者を多面的に診断する手段として有用となる。特に、抗ＴＮＦ−α抗体などで治療効果が認められない患者の診断さらにはその後の処理方法を検討する上で重要な検査方法になる可能性がある。
本発明のスクリーニング方法により得られる物質および関節炎の治療薬は、関節炎患者、特にリウマチ性関節炎患者においてミッドカインの発現が有意に高いこと、およびミッドカインノックアウト動物では関節炎の発生が著しく低減されていることを考慮すると、有望な治療薬となることが期待される。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【技術分野】
本発明は、関節炎、とりわけリウマチ性関節炎に関連する因子、ミッドカインタンパク質およびこれをコードした遺伝子に関する。また、本発明はミッドカインを基にした関節炎の検査方法ならびに検査薬に関する。さらに、本発明はミッドカインをターゲットとした関節炎治療用薬剤のスクリーニング方法、および関節炎治療用組成物に関する。
【背景技術】
慢性関節リウマチ（ＲＡ）は多発性の関節痛と関節腫脹を主症状とする原因不明の破壊性、進行性の炎症性疾患である。当初は滑膜炎であるが、炎症が軽快と増悪を繰り返して、関節軟骨や骨組織が破壊され、関節の変形と機能障害を生じる。ＲＡは一般的によく知られており、患者数も多い疾患にもかかわらず、病態も病因も解明されていない。診断についても、確定診断を行うためにはアメリカリウマチ学会診断基準（１９８７年、アメリカリウマチ学会）を４つ以上満たす必要がある。
ＲＡの病因については様々な因子が提唱されている。遺伝子異常、環境因子、感染などが有名で、それらの総合的な影響により、ＲＡは発症、形成されるといわれている。ＲＡの発生機序には種々のサイトカインが関与している。それらの主な役割はリンパ球の活性化、炎症性白血球の移動および破骨細胞の分化にある（Ｆｅｌｄｍａｎｎ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４：３９７−４４０，１９９６）。ケモカインは白血球の移動に関与し、ＮＦ−κＢ活性化受容体リガンド（ＲＡＮＫＬ）およびＭ−ＣＳＦは破骨細胞の分化に関与する（Ｙａｓｕｄａ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：３５９７−６０２，１９９８；Ｗｉｋｔｏｒ−Ｊｅｄｒｚｅｊｃｚａｋ Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：４８２８−３２，１９９０）。インターロイキン６（ＩＬ−６）は主としてリンパ球活性化の段階に作用する（Ｉｓｈｉｈａｒａ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ １３：３５７−６８，２００２；Ｏｓｈｉｍａ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：８２２２−６，１９９８）。ＩＬ−１およびＴＮＦ−αはケモカイン合成を誘導し、滑膜細胞および破骨細胞を活性化する（Ｆｅｌｄｍａｎｎ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４：３９７−４４０，１９９６；Ｆｅｌｄｍａｎｎ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｓ ４：２４７−５５，１９９２；Ｊｉ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９６：７７−８５，２００２）。さらに、ＴＮＦ−αはＲＡＮＫＬとは異なる経路によって破骨細胞の分化を誘導することが報告されている（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９１：２７５−８６，２０００）。ＩＬ−１７およびＩＬ−１８はＩＬ−１およびＴＮＦ−αと類似した役割を果たす（Ｙａｍａｍｕｒａ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４４：２７５−８５，２００１）。
上記の通りＲＡは多因子が関与するため、治療は画一的でなく、治療薬の効果も個人差が大きい。ＲＡの治療の目的は、ＲＡの炎症を鎮静化させ、患者の生活の質を維持、向上させることである。そのため、薬物療法、理学療法、生活指導が行われ、関節破壊が著しいときには、膝、股関節などの人工関節置換術が行われる。
ＲＡの治療は薬物療法を基本とし、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤｓ）、副腎皮質ステロイドの３種類の薬剤が用いられる。現在は、ＤＭＡＲＤｓを中心としてＮＳＡＩＤｓおよびステロイドを補助的に用いるという考え方が一般的となっている。
ＮＳＡＩＤｓはあくまで対症療法であり、疼痛の緩和を目的とする。ＲＡは長期投与が必要となることが多く、副作用が必ずしも少なくないことから、ＮＳＡＩＤｓの服用量は、疼痛の程度に応じて減量する必要がある。
ＤＭＡＲＤｓは、炎症自体を抑える作用はもたないが、ＲＡの免疫異常を修飾することによってＲＡの活動性をコントロールする薬剤である。近年、ＤＭＡＲＤｓの寛解導入作用と関節保護作用が明らかになり、早期からの導入が進められている。特に炎症反応が強く、関節の破壊・変形が進行する症例に適応される。しかし、遅効姓であるため、速効性のあるＮＳＡＩＤｓと組み含わせて用いられることが多い。ＤＭＡＲＤｓは、効果に個体差が大きいこと、連用しているうちにＲＡの活動性が亢進してくるエスケープ現象がみられること、副作用が多いこと、効果発現が遅いことなどの特徴があり、使用には注意を要する。特に、血液障害、腎障害、間質性肺炎などの生命に関わる重篤な副作用も少なくない。
ステロイド薬は最も強い抗炎症作用を有する薬剤であるが、長期投与による副作用が問題となるため、安易なステロイド使用は控えるべきであるとされている。少量投与でもステロイドは早期から骨粗鬆症をはじめとする種々の重大な副作用をきたすとの報告も多い。
ＯＩＣを行っても疾患の活動性、疼痛がコントロールできない場合、手術治療の適応となる。手術は、滑膜切除術、人工関節置換術、関節固定術などが行われる。
最近、ＴＮＦ−αに対するモノクローナル抗体、ならびにＴＮＦ−α受容体およびＩＬ−１受容体に対する拮抗物質がＲＡに対する治療薬として登場し、有望な成績を上げているが（Ｗｅｉｎｂｌａｔｔ ＭＥ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４８：３５−４５，２００３；Ｂｒｅｓｎｉｈａｎ Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４１：２１９６−２０４，１９９８）、症例によっては副作用、特に感染症が生じている（Ｓｌｉｆｍａｎ ＮＲ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４８：３１９−２４，２００３；Ｗｏｏｄ ＫＬ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １６７：１２７９−８２，２００３）。
【発明の開示】
本発明は、関節炎、特にリウマチ性関節炎の発症に関与する因子の解明を第一の目的とし、さらに、見出した因子をターゲットとした関節炎治療薬のスクリーニング方法、関節炎治療薬ならびに検査薬を提供することを課題とする。
本発明者らは、遺伝的背景の異なるマウス間で、リウマチ性関節炎のモデルである抗体による関節炎の発症に差があるかを系統的に調べた。そして、意外にもミッドカイン遺伝子ノックアウトマウスでは関節炎の発症が野性型マウスに比較して有意に少ないことを発見した。ミッドカインは、ヘパリン結合性増殖因子であり、細胞の増殖、移動、生存を促進する成長因子であり（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ Ｔ．，Ｗｉｌｅｙ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｍｏｌ．２０８６−２０８８，２００２；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２：３５９−３７１，２００２）、その遺伝子はマウスおよびヒトにおいてクローニングされている（特開平９−９５４５４）。ミッドカインは好中球、マクロファージを炎症刺激部位に誘導し、炎症反応の一翼を担う（Ｔａｋａｄａ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２２：４５３−４５８，１９９７；Ｈｏｒｉｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５：４８９−４９５，２０００）。ミッドカインがリウマチ発症に関与すると考え、さらに患者におけるＭＫの発現レベルを検討したところ、関節リウマチ患者のほとんどの例では血清中および滑膜液中のミッドカインレベルが高値であり、このことからミッドカイン発現と関節リウマチとの間に強い相関があることが示された。ミッドカインは患者の滑膜内のマクロファージ様細胞および線維芽細胞様細胞で発現されていた。ミッドカイン遺伝子欠損マウスへのミッドカインの投与により、抗体誘導性関節炎の頻度が高まった。疾患モデルにおける炎症性白血球の滑膜への移動は、ミッドカイン欠損マウスでは抑制された。さらに、ミッドカインはマクロファージからの破骨細胞の分化を促進することを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものであり、以下の通りである。
〔１ａ〕関節炎発生に関連する因子であって、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかからなる関節炎関連因子。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、関節炎誘導活性を有するポリペプチドをコードしたＤＮＡ。
〔１ｂ〕関節炎発生に関連する因子であって、下記（ａ）または（ｂ）のいずれかからなる関節炎関連因子。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、関節炎誘導活性を有するポリペプチド。
〔２〕被検者より採取した試料中のミッドカイン遺伝子の発現を測定する工程を含む、関節炎の検査方法。
〔３〕抗ミッドカイン抗体を含む、関節炎検査用試薬。
〔４ａ〕下記（ａ）および（ｂ）工程を含む、関節炎の治療または予防のため薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ミッドカインに被検物質を接触させる工程
（ｂ）前記ミッドカインと被検物質との結合を検出する工程
〔４ｂ〕下記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）工程を含む、関節炎の治療または予防のため薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ミッドカイン遺伝子が発現している細胞に被検物質を接触させる工程
（ｂ）被検物質接触後にミッドカイン遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検物質と接触させていない対照細胞のミッドカイン発現レベルに比べてミッドカイン遺伝子の発現レベルを低下させた被検物質を選択する工程
〔４ｃ〕下記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）工程を含む、関節炎の治療または予防のため薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ミッドカイン遺伝子のプロモータ領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞に被検物質を接触させる工程
（ｂ）被検物質接触後にレポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる被検物質を選択する工程
〔５〕ミッドカイン遺伝子の発現を抑制し得るオリゴヌクレオチドを有効成分とする関節炎予防または治療用組成物。
〔６〕抗ミッドカイン抗体を有効成分とする、関節炎予防または治療用組成物。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＲＡ患者由来の標本におけるＭＫ発現レベルを示す図である。Ａ、ＲＡ患者（ｎ＝５５）またはＯＡ（骨関節炎）患者（ｎ＝１８）由来の滑膜液中のＭＫに関する酵素イムノアッセイ。破線はカットオフレベル３３２ｐｇ／ｍｌを示し、これはＯＡ患者における最も高いＭＫ値に対応する。ＲＡ患者を、リウマトイド因子に関して強陽性の例［ＲＦ（＋＋）］（ｎ＝２６）、この因子に関して中等度に陽性の例［ＲＦ（＋）］（ｎ＝１１）およびＲＦに関して陰性の例［ＲＥ（−）］（ｎ＝１８）に分類した。Ｂ、ＲＡ患者の血清中のＭＫに関する酵素イムノアッセイ。破線はカットオフレベル６００ｐｇ／ｍｌを示しており、これは過去の研究で設定されたものである（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １１９：１１７１−５，１９９６；Ｉｋｅｍａｔｓｕ Ｓ．ｅｔ ａｌ，Ｂｒｉｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８３：７０１−６，２０００）。ＲＡ患者をＲＥ（＋＋）（ｎ＝５１）、ＲＥ（＋）（ｎ＝３７）およびＲＥ（−）（ｎ＝３２）患者に分類した。
図２はＲＡ患者の炎症性滑膜におけるＭＫ発現を示す写真である。Ａ、抗マクロファージ（ＣＤ６８）抗体および抗ＭＫ抗体による組織切片の二重染色。抗ＭＫ抗体による赤血球染色が対照染色（抗ＭＫ抗体を用いずに、すなわち抗ＭＫ抗体を吸収して行った染色）で観察され、これは非特異的であった。滑膜はある女性患者（６２歳、ステージ４、グレード５）から得た。ａ．ｃ．：関節腔、ｂ．ｖ．：血管、バー：２００μｍ。Ｂ、滑膜由来の線維芽細胞様細胞またはマクロファージ様細胞を２ウェルチェンバースライド上で増殖させ、抗ＭＫ抗体によって染色した。バー：１００μｍ。
図３は、Ｍｄｋ−／−では抗体媒介性関節炎が抑制された結果を示す写真である。Ａ、抗ＩＩ型コラーゲン抗体の注入から７日後のＷＴ（野生型）またはＭｄｋ−／−の肢の代表的な写真。Ｂ、抗体注入後第０、２、５および７日の時点でＨＥ（ヘマトキシリン−エオジン）または抗ＭＫ抗体により染色した前肢関節の切片。ＭＫ発現は滑膜細胞、特に関節腔内壁の細胞（矢印）で観察された。図中Ｂは骨、Ｓは滑膜細胞。矢印はＭｄｋ−／−における滑膜細胞を示す。バー；２００μｍ。枠で囲んだ領域を以下に示した２枚の写真で拡大している。
図４は抗体誘発性関節炎における血清サイトカインレベルおよび浸潤白血球数を示す図である。Ａ、ＷＴにおける血清ＭＫレベル。Ｂ、ＷＴまたはＭｄｋ−／−における血清ＴＮＦ−αレベル。Ｃ、ＷＴまたはＭｄｋ−／−の滑膜内のマクロファージ数。Ｄ、ＷＴまたはＭｄｋ−／−の滑膜内の好中球数。好中球およびマクロファージの数はランダムに選択した３つの視野（４００倍）について算定し、その平均値を示している。第２日〜第７日は抗体投与後の日数を表す。＊ｐ＜０．０５。黒のバー、ＷＴ；白抜きバー、Ｍｄｋ−／−。
図５はＭＫがマクロファージから破骨細胞への分化を促進することを示す図および写真である。Ａ、ＲＡ患者（女性、６２歳、ステージ４、グレード５）の滑膜由来のマクロファージ様細胞を諸因子とともに培養し、ＴＲＡＰ染色を行った。ＭＫは単独で、またはＭ−ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬとの併用下で、ヒトマクロファージ様細胞からのＴＲＡＰ陽性細胞の分化を促進した。Ｂ、ヒトマクロファージ様細胞からの破骨細胞の分化はＭＫ単独で、またはそれとＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦとの併用下で促進された。多核性ＴＲＡＰ陽性細胞を破骨細胞とみなした。Ｃ、諸因子とともに培養することによって滑膜のマクロファージ様細胞から分化したＴＲＡＰ陽性細胞の代表的な写真。バー：５０μｍ。Ｄ、ＲＡＮＫＬによる、またはＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦによるマウスマクロファージからの破骨細胞の分化はＭＫにより増強された。「５０」および「１００」は濃度をｎｇ／ｍｌ単位で示したものである。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明の第一の側面として、関節炎発生関連因子が提供される。上述したように従来、ミッドカインは細胞の増殖や分化に関与し、ヒト癌の発生にも関与することから注目されているが、本願発明者らは、ミッドカインの新たな機能として、関節炎の発生・誘導に関与することを見出した。すなわち、本発明の関節炎発生に関連する因子はミッドカイン遺伝子またはミッドカインポリペプチドである。
関節炎関連因子としてのミッドカイン遺伝子は、好適には、配列番号：１に示すヒトミッドカイン遺伝子を挙げることができるが、これに限定されるものではなく、ミッドカイン遺伝子と同等に関節炎を発生・誘導し得るタンパク質をコードした類似のＤＮＡも「関節炎関連因子」としてのミッドカイン遺伝子に含まれる。配列番号１に記載のＤＮＡと機能的に同等な配列は、同種由来の変異体や異種由来のミッドカイン遺伝子ホモログ、又はこうした天然に得られる遺伝子を人工的に合成若しくは改変したものなどが含まれる。例えば、既に報告されているマウスミッドカイン遺伝子（Ｋａｄｏｍａｔｕ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１５１，１３１２（１９８８））は配列番号１に記載のＤＮＡと機能的に同等な配列の一例であり、本発明の関節炎関連因子としてのミッドカイン遺伝子に含まれる。
このような配列番号１に記載のＤＮＡと機能的に同等の配列は、例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡや、配列番号：１に記載の塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ関節炎誘導活性を有するポリペプチドをコードしたＤＮＡを挙げることかできる。
上記配列番号：１に記載のヒト由来のミッドカイン遺伝子の調製は、ヒトｃＤＮＡライブラリーより配列番号：１に記載された配列またはその一部と相同性の高い配列を保持するクローンを選択し、選択されたクローンより回収することにより実施することができる。ミッドカイン遺伝子を得るためのヒトｃＤＮＡライブラリーは、たとえば、ヒトの腎臓、ヒトの胎児の腎臓、脳、結合組織又はこれらの培養細胞由来トータルＲＮＡに基づき構築されたものを用いることができる。また、天然から取得する以外に、配列番号：１に記載の配列に基づいてＤＮＡ合成器により合成してもよい。
また、配列番号１に記載のＤＮＡと機能的に同等の配列の調製は、ヒト以外の哺乳動物細胞（例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ブタ、ウシ）由来のｃＤＮＡライブラリーより配列番号：１記載の配列またはその一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするクローンを選択することにより実施することができる。ハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜選択することができる。例えば、ハイブリダイゼーションの条件として、好ましくは、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られると期待される。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
また、配列番号１に記載のＤＮＡと機能的に同等の配列の調製は、上述のように天然に存在するものから選抜する方法の他に、配列番号：１に記載の配列からなるＤＮＡを適宜、遺伝子工学的に改変して調製することもできる。
関節炎関連因子としてのミッドカインポリペプチドは、好ましくは、配列番号２に示すヒトミッドカインポリペプチドを挙げることができるが、これに限定されるものではなく、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、関節炎誘導活性を有するポリペプチドを含めることができる。
上記ミッドカインと機能的に同等なポリペプチドは、通常、ミッドカインとアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも５０％以上の同一性、好ましくは７５％以上の同一性、さらに好ましくは８５％以上の同一性、さらに好ましくは９５％以上の同一性を指す。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７，１９９３）などによって決定することができる。
配列番号：２に示すミッドカインのアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなり、該ポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドもまた本発明に含まれる。変異するアミノ酸数は、通常、３０アミノ酸以内であり、好ましくは１５アミノ酸以内であり、より好ましくは５アミノ酸以内（例えば、３アミノ酸以内）であり、さらに好ましくは２アミノ酸以内である。これら変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えば、アミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
配列番号：２に示すミッドカインの調製は、配列番号：１記載のＭＫ遺伝子配列を発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のＭＫタンパクを公知の方法で精製し、この精製ＭＫタンパクを感作抗原として用いればよい。またはミッドカインを発現している細胞から細胞破砕液を調製し、後述する抗ミッドカイン抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーなどにより単離してもよい。
一方、ミッドカインと機能的に同等なポリペプチドを調製するためには、当業者によく知られた方法としてポリペプチドに変異を導入する方法がある。例えば、部位特異的変異誘発法（Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ １５２，２７１−２７５、Ｚｏｌｌｅｒ，ＭＪ，ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，４６８−５００、Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２，９４４１−９４５６、Ｋｒａｍｅｒ Ｗ，ａｎｄ Ｆｒｉｔｚ ＨＪ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３５０−３６７、Ｋｕｎｋｅｌ，ＴＡ（１９８５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８２，４８８−４９２、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５，２７６３−２７６６）などを用いて、配列番号：１に示す配列に変異を導入し、これを上記と同様に発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させて、形質転換体から回収することにより、ミッドカインと機能的に同等なポリペプチドを調製してもよい。
上記関節炎関連因子は、関節炎を発生、誘導し得る活性を保持しているため、例えば、関節炎モデル動物を作製する際の関節炎誘導剤として利用し得る。また、上記ミッドカインは、炎症性白血球などの炎症細胞の移動や破骨細胞の増殖等のようなリウマチ性関節炎で見られる現象を誘導し得ることから、特に、リウマチ性関節炎を誘導するための試薬として研究分野等で利用することができる。
本発明の第二の側面として、被検者より採取した試料中のミッドカイン遺伝子の発現を測定する工程を含む関節炎の検査方法が提供される。
ミッドカインは後述の実施例でも説明するように、関節炎を誘発し得るＴＮＦ−αとは異なる側面から関節炎の発生に関与することが予想される。従って、患者における関節炎の発生原因を調査し、患者に対して適切な処理を行うためには、関節炎の検査としてミッドカイン遺伝子の発現を測定することが有用となる。
被検者より採取される試料としては、例えば、血液または滑膜組織などを用いることができる。
ミッドカイン遺伝子発現の測定における第一の態様として、翻訳産物であるミッドカインタンパク質を測定する。先ず、上述した被検者の試料よりタンパク質試料を調製する。次いで、該タンパク質試料からミッドカインタンパク質量を測定する。測定されたタンパク質量を健常者などのミッドカイン発現量に基づいた対照値などと比較する。この比較の結果、被検者のミッドカインタンパク質が対照に比べて有意に上昇している場合には、関節炎発症原因としてミッドカインが関与している可能性または関節炎を発症し得る素因が予測できる。
上記ミッドカインタンパク質の測定は、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法、並びにミッドカインタンパク質に対する抗体を用いた、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、および免疫蛍光法を例示することができる。
また、ミッドカイン遺伝子の発現を測定するための別の方法としては、転写産物であるミッドカインｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを測定する。先ず、上記被検者試料からトータルＲＮＡ試料を調製する。トータルＲＮＡの調製は、当業者に周知の方法で行うことができる。例えば、トータルＲＮＡ調製用のキット”Ｉｓｏｇｅｎ”（ニッポンジーン社）を用いて実施することができる。次いで、該トータルＲＮＡ試料に含まれるミッドカインｍＲＮＡ量を測定する。測定されたＲＮＡの量を対照と比較する。
別の態様としては、被検者試料からｃＤＮＡ試料を調製する。ｃＤＮＡ試料の調製は、上述したトータルＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡの合成を行うことで実施し得る。次いで、該ｃＤＮＡ試料に含まれるミッドカインｃＤＮＡ量を測定する。測定されたｃＤＮＡの量を対照と比較する。
これらｍＲＮＡやｃＤＮＡを基に遺伝子発現を測定する方法としては、当業者に周知の方法、例えばノーザンブロッティング法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡアレイ法等を挙げることができる。例えば、ＤＮＡアレイ法においては、被検者から調製したＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡ試料を調製し、ミッドカイン遺伝子（例えば、配列番号：１）の一部配列を含むオリゴヌクレオチドが固定された基板と接触させ、該ｃＤＮＡ試料と該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出することにより、該ｃＤＮＡ試料に含まれるミッドカイン遺伝子の発現量が測定される。ヌクレオチドプローブと該ｃＤＮＡとのハイブリダイズの強度の検出は、ｃＤＮＡ試料を標識した物質の種類に応じて当業者において適宜行うことができる。例えば、ｃＤＮＡが蛍光物質によって標識されている場合、スキャナーによって蛍光シグナルを読み取ることによって強度すなわち遺伝子発現を検出することができる。
上記検査方法によれば、個別の患者において関節炎の発症にミッドカインが関与しているか否かを判定することができる。特に、リウマチ性関節炎の場合には、患者の多数においてミッドカイン遺伝子の発現が上昇し、ミッドカインが関節炎発生に関与していることが示唆されている。そのため、本検査方法は関節炎、特にリウマチ性関節炎の原因因子の特定に有用である。
本発明の第三の側面として、関節炎の検査方法に用いるための検査薬が提供される。このような検査薬としては、上記検査方法に使用し得るミッドカイン遺伝子の一部配列を含むオリゴヌクレオチドを主成分とする検査薬（オリゴヌクレオチドプローブが固定された基板を含む）や、抗ミッドカイン抗体を含む検査薬が挙げられる。これら抗体やオリゴヌクレオチドは、検査方法に応じて、標識が付加されていてもよい。
上記検査薬としての抗ミッドカイン抗体は、例えば、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、ミッドカインを検出し得る抗体であればよい。例えば、ポリクローナル抗体であれば、既に本願発明者らにより開発されている抗体を用いてもよい（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１５９：３９２−４０２，１９９３）。モノクローナル抗体もまた既に開発されており（特開２００２−０８５０５８）、これを好適に利用することができる。
ミッドカインに対する特異抗体の作製は、公知の方法に準じて実施することができる。モノクローナル抗体は、例えば、配列番号：２に示したヒトミッドカインポリペプチド全体を感作抗原として、または抗原性を保持し得る長さを有する一部配列を感作抗原として用いて作製してもよい。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には、ケーラーとミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ．＆ Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７，１９７５）に準じて、以下のようにして作製できる。すなわち、上述したＭＫタンパク質またはその一部を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法に従って免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナル抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般には、齧歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を免疫動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳや生理食塩水等で適量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、免疫動物に１４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。このようにして免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後、免疫動物から免疫細胞（好ましくは、脾細胞など）を取り出し、細胞融合に付す。
上記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞が用いられ、こうしたミエローマ細胞は、例えばＰ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８，６５３）（Ｋｅａｒｎｙ Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３：１５４８−１５５０，１９７９）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｙｅｌｔｏｎ Ｄ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ８１：１−７，１９７８）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ．＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９，１９７６）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７６：２６９−２７０，１９７８）、ＦＯ（ｄｅ Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ Ｓ．Ｆ．＆ Ｓｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒ Ｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３５：１−２１，１９８０）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ Ｉ．Ｓ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４８：３１３−３２３，１９７８）、Ｒ２１０（Ｇａｌｒｅ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７７：１３１−１３３，１９７９）、等が好適である。
上記免疫細砲とミエローマ細胞の細胞融合は、基本的には、公知の方法、例えば、ミルステインらの方法（Ｇａｌｆｒｅ Ｇ．＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４６，１９８１）等に準じて行うことができる。具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウィルス等が使用され、さらに、融合効率を高めるため、ジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することができる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して、免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。細胞融合に用いる培養液としては、例えば、ミエローマ細胞株に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補助液を併用することもできる。
細胞融合は、免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を上記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１０００〜６０００程度のＰＥＧ溶液を、通常、３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的の融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を遂次添加し、遠心して、上清を除去する操作を繰り返すことにより、ハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等が除去される。
当該ハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日から数週間継続する。次いで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマスクリーニング及び単一クローニングが行われ、モノクローナル抗体を産生する細胞が調製される。このようにモノクローナル抗体は、ポリクローナル抗体のように他の免疫グロブリンが混在していないハイブリドーマ培養により生成されるため、精製が容易であり、また特異性が高い。
上記本発明の検査薬によれば、特異的にミッドカインタンパク質やｍＲＮＡなどのミッドカイン遺伝子産物を検出することができることから、患者試料を基に患者におけるミッドカイン遺伝子の発現を検出することが可能となる。そのため、本発明の検査薬は、患者における関節炎の発症にミッドカイン遺伝子の発現が関与しているか否かを判定するために大いに役立つ。
本発明の第四の側面として、関節炎の治療または予防のため薬剤の候補化合物のスクリーニング方法が提供される。関節炎の発症機序には、ＴＮＦ−αとは異なる側面からミッドカインが関与していることが予想されている。特に、ＴＮＦ−αに対する抗体を用いた治療が必ずしもすべての患者に対して有効ではないことから、更に新たな標的となる原因因子に対する薬剤が要望される。また、リウマチ性関節炎患者の多数の場合において、ミッドカインの発現が亢進していることからも、ミッドカインを標的とし、この活性を抑制する薬剤またはこの遺伝子の発現を抑制する薬剤は関節炎の治療または予防のための薬剤の重要な候補化合物となることが期待される。
本発明の関節炎の治療または予防のため薬剤の候補化合物のスクリーニング方法における第一の態様は、（ａ）ミッドカインとこれに結合する化合物を含むと予想される被検試料とを接触させ、（ｂ）該ポリペプチドと被検試料との結合活性を検出し、そして本発明のポリペプチドに結合する活性を有する化合物を選択することが含まれる。
スクリーニングに用いられるミッドカインポリペプチドは、組換えポリペプチドであっても、天然由来のポリペプチドであっても、あるいは部分ペプチドであってもよい。ミッドカインポリペプチド形態は、例えば、精製したポリペプチドとして、担体に結合させた形態として、他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして、後述する被検試料に接触させることができる。被検試料としては特に制限はなく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製若しくは粗精製ポリペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物が挙げられる。
ミッドカインポリペプチドと被検物質との結合を解析する方法としては、例えば、免疫沈降法（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐｐ．５１１−５５２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８））、ウエストウエスタンブロッティング法（Ｓｋｏｌｎｉｋ，Ｅ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９１）６５，８３−９０）、２−ハイブリッドシステム（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．ａｎｄ Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ，Ｒ．，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９４）１０，２８６−２９２、Ｄａｌｔｏｎ Ｓ，ａｎｄ Ｔｒｅｉｓｍａｎ Ｒ（１９９２）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＰ−１，ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ ｂｙ ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｏ ｔｈｅ ｃ−ｆｏｓ ｓｅｒｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ ６８，５９７−６１２、「ＭＡＴＣＨＭＡＲＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ」，「Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」，「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ」（いずれもクロンテック社製）、アフィニティークロマトグラフィーを用いた解析方法などが挙げられる。これら方法は、被検物質がポリペプチドである場合に、該ポリペプチドとミッドカインとの結合を検出する際に有効である。
上記各方法の概要は次の通りである。免疫沈降法では、ミッドカインポリペプチドと、被検物質とを接触させる。その後、抗ミッドカイン抗体を添加し、ミッドカインと抗体との免疫複合体を形成、沈降させる。被検物質がミッドカインと結合する場合には、被検物質は免疫複合体とともに沈降する。沈降した免疫複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等により解析することにより、被検物質がミッドカインに結合しているか否かを移動度に基づき検出、さらには被検物質の分子量の予測も行うことができる。
ウエストウエスタンブロッティング法では、被検物質であるポリペプチドを発現していることが予想される細胞、組織よりｃＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーの各クローンを発現させ、発現産物であるポリペプチドをフィルターに固定する。このフィルターに、精製して標識したミッドカインポリペプチドを接触させる。ミッドカインの標識に基づいて、ミッドカインと結合したポリペプチドを発現するクローンが検出される。
２−ハイブリッドシステムでは、ミッドカインまたはその部分ペプチドをＳＲＦ ＤＮＡ結合領域またはＧＡＬ４ ＤＮＡ結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現させる。一方、被検物質であるポリペプチドを発現している細胞より、ＶＰ１６またはＧＡＬ４転写活性化領域と融合する形で発現するようなｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを上記酵母細胞に導入し、被検物質を発現、ミッドカインと接触させる。酵母細胞内で被検物質とミッドカインとは結合するとレポーター遺伝子が活性化される。このレポーター遺伝子の発現に基づいて、被検物質とミッドカインとの結合が検出される。なお、２−ハイブリッドシステムにおいて用いられるレポーター遺伝子は、例えば、ＨＩＳ３遺伝子の他、Ａｄｅ２遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ＰＡＩ−１（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｙｐｅ１）遺伝子等が挙げられるが、これらに制限されない。２−ハイブリッド法によるスクリーニングは、酵母の他、哺乳動物細胞などを使って行うこともできる。
アフィニティークロマトグラフィーを用いた検出方法としては、例えば、ミッドカインを固定した担体と被検物質であるポリペプチドを接触させる。接触後、担体を洗浄し、担体上に結合している物質を解析する。なお、このアフィニティークロマトグラフィーはバッチ法で行うこともできる。
また、被検物質が低分子化合物などの場合には、例えば、固定したミッドカインに、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを作用させ、本発明のポリペプチドに結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング方法（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ ＮＣ；Ｆａｒｒｅｌｌ ＦＸ；Ｃｈａｎｇ Ｒ；Ｋａｓｈｙａｐ ＡＫ；Ｂａｒｂｏｎｅ ＦＰ；Ｍｕｌｃａｈｙ ＬＳ；Ｊｏｈｎｓｏｎ ＤＬ；Ｂａｒｒｅｔｔ ＲＷ；Ｊｏｌｌｉｆｆｅ ＬＫ；Ｄｏｗｅｒ ＷＪ．，Ｓｍａｌｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔ ｍｉｍｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｒｍｏｎｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ）Ｊｕｌ ２６ １９９６，２７３ ｐ４５８−６４、Ｖｅｒｄｉｎｅ ＧＬ．，Ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｎａｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ ７ １９９６，３８４ ｐ１１−１３、Ｈｏｇａｎ ＪＣ Ｊｒ．，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ ７ １９９６，３８４ ｐ１７−９）が当業者に公知である。
また、被検物質がポリペプチド、低分子化合物のいずれにおいても、ミッドカインと被検物質との結合を検出又は測定する手段として表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーは、ミッドカインと被検物質との間の相互作用を微量のポリペプチドを用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅ等のバイオセンサーを用いることにより本発明のポリペプチドと被検物質との結合を評価することが可能である。
本発明のスクリーニングおいて、ミッドカインとの結合が検出された物質は、ミッドカインの活性を調節するための薬剤の候補となる。この中でもミッドカインの活性を抑制し得る物質は関節炎、特にリウマチ性関節炎の予防または治療薬に応用し得る。なお、上記スクリーニング方法により選択された物質が、ミッドカインの活性を阻害し得るか否かは、後述する実施例に示した、炎症性白血球などの炎症細胞の滑膜への移動、関節炎の誘導などに基づいて簡便に解析することができる。すなわち、ミッドカインは炎症細胞を滑膜へ移動させる活性を有するが、この活性を阻害するか否かによりミッドカイン活性を阻害し得る物質をさらにスクリーニングすることができる。または、実施例に示した抗体カクテルを用いた関節炎誘導の際に、スクリーニングで選択された物質を投与することにより、関節炎の発症が抑制されるか否かに基づいて、解析することもできる。
関節炎の治療または予防のため薬剤の候補化合物のスクリーニング方法における第二の態様は、ミッドカイン遺伝子が発現している細胞に被検物質を接触させ、被検物質接触後にミッドカイン遺伝子の発現レベルを測定し、ここで被検物質と接触させていない対照細胞のミッドカイン発現レベルに比べてミッドカイン遺伝子の発現レベルを低下させた被検物質を選択するものである。このスクリーニング方法によれば、ミッドカイン遺伝子の発現を抑制し得る化合物を選択することができる。
ミッドカイン遺伝子が発現している細胞としては、特に限定はなく、内在ミッドカイン遺伝子が発現している細胞系、または発現ベクターにミッドカイン遺伝子を連結して外来より導入されたミッドカイン遺伝子が発現している細胞系のいずれでもよい。被検物質は上記第一の態様と同様である。
上記被検物質とミッドカイン遺伝子が発現している細胞とを接触させる。接触は、被検物質が低分子化合物のような場合には、細胞の培養液中に添加することにより行うことができる。また、被検物質が、ポリペプチドなどの場合には被検物質であるポリペプチドをコードしたＤＮＡを発現ベクターに載せて、細胞内に導入することにより、被検物質をミッドカイン遺伝子に接触させる。
接触後、ミッドカイン遺伝子の発現を測定する。ミッドカイン遺伝子の発現は、上述した検査方法と同様に、ミッドカインタンパク質またはミッドカインｍＲＮＡを測定することにより行うことができる。
被検物質存在下のミッドカイン遺伝子の発現レベルが、被検物質非存在下の対照ミッドカイン遺伝子発現レベルと比較して、低下しているものを「関節炎の治療または予防のため薬剤の候補化合物」として選択する。
上記方法では、ミッドカイン遺伝子の発現を検出するために、ミッドカインタンパク質またはミッドカインｍＲＮＡを抗体やオリゴヌクレオチドを用いて検出する工程が必要となるが、この工程を簡略化するために、ミッドカイン遺伝子のプロモータ領域にレポーター遺伝子を接続させ、レポーター遺伝子の発現を直接モニターする系を構築してもよい。すなわち、スクリーニング方法の第三の態様は、ミッドカイン遺伝子のプロモータ領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞に被検物質を接触させ、被検物質接触後にレポーター遺伝子の発現レベルを測定し、レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる被検物質を選択することから構成される。
ミッドカイン遺伝子のプロモータ領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを調製する。ここで「機能的に結合した」とは、ミッドカイン遺伝子のプロモータ領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、ミッドカイン遺伝子のプロモータ領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。上記レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるＣＡＴ遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）およびＧＦＰ遺伝子等を挙げることができる。
次いで、上記細胞または上記細胞抽出液に被検化合物を接触させる。次いで、該細胞または該細胞抽出液における上記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。レポーター遺伝子の発現レベルは、使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がＣＡＴ遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。レポーター遺伝子がｌａｃＺ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用によるＧｌｕｃｕｒｏｎ（ＩＣＮ社）の発光や５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）の発色を検出することにより、さらに、ＧＦＰ遺伝子である場合には、ＧＦＰタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。
被検物質存在下における上記レポーター遺伝子の発現レベルが対照の被検物質非存在下の発現レベルと比較して低下している場合には、その物質を候補物質として選択する。
上記スクリーニングにおいて選択された物質は、ミッドカインの発現を抑制することにより関節炎を予防または治療するための薬剤となり得る。特に、ミッドカインはリウマチ患者の多くで発現が亢進していることから、本スクリーニングで選択された物質はリウマチ性関節炎の予防・治療薬の有力な候補物質となる。
本発明の第五の側面として、ミッドカイン遺伝子の発現を抑制し得るヌクレオチドを有効成分とする関節炎予防または治療用組成物が提供される。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、本発明のポリペプチドの産生細胞に作用して、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡに結合することにより、その転写又は翻訳を阻害、またはｍＲＮＡの分解を促進することにより、本発明のポリペプチドの発現を抑制する。実施例においてミッドカイン遺伝子のノックアウトマウスを用いた解析結果では、ミッドカイン遺伝子の発現を阻止・抑制することにより関節炎の発生が著しく抑制された。従って、ミッドカインの発現を抑制し得るヌクレオチドまたはその誘導体は、関節炎の予防または治療用の薬剤として有用となる。
ミッドカイン遺伝子の発現を抑制し得るヌクレオチドの第一の態様としては、ミッドカイン遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、配列番号：１の塩基配列中のいずれかの箇所にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは配列番号：１の塩基配列中の連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的となるミッドカインＤＮＡ又はｍＲＮＡの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補配列であるもののみならず、オリゴヌクレオチドと配列番号：１に示される塩基配列に特異的にハイブリダイズできる限り、１又は複数個のヌクレオチドのミスマッチが存在しているものも含まれる。
ミッドカイン遺伝子発現を抑制し得るアンチセンスオリゴヌクレオチドの分子設計については、例えば、ミッドカインｍＲＮＡの一次配列を基に、最小のエネルギーを持つ二次構造をコンピュータープログラムで予測する。この予測される二次構造に基づいて、塩基対を作らないループ部分をアンチセンスオリゴヌクレオチド配列候補として選択することができる。一例を示せば、ヒトミッドカインのｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ６９１４８：Ｔｓｕｔｓｕｉ Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１７６：７９２−７９７，１９９１）の二次構造予測をコンピュータ解析により行うと、（ヒトＭＫ ｍＲＮＡ配列の塩基番号１５番目から３２番目に基づく）（配列番号：３）、および５’末端近傍でループを作らない配列に対応するアンチセンスＤＮＡ、（ヒトＭＫ ｍＲＮＡ配列の塩基番号１番目から１８番目に基づく）（配列番号：４）を設計することができる。
しかし、本発明のオリゴヌクレオチドは上記具体的に示された配列に限定されるものではく、配列番号：１の配列に基づいて、適宜設計することができる。そして、設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチド配列がＭＫの発現抑制活性を有するか否かの判定は、次の通り行うことができる。アンチセンスオリゴヌクレオチド配列を持つ物質を、ミッドカインを合成分泌している細胞に投与し、培養液中に分泌されるＭＫを免疫生化学的に定量する。ミッドカインの免疫生化学的定量法としては酵素免疫法（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１９：１１７１−１１７５，１９９６）あるいはＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動後のウェスタンブロッティング（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．：Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１５９；３９２−４０２，１９９３）そしてデンシトメーターによる定量がある。この定量によりミッドカイン遺伝子産物の産生を低下させ得るアンチセンスオリゴヌクレオチドはミッドカインの遺伝子発現を抑制し得るものとして選択することができる。
また上記「オリゴヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡのデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド構造のような天然に存在するオリゴマーの核酸部分、ならびに天然に存在する核酸に結合する能力のある人工アナログの両方を包含する。人工アナログとしては、例えばメチルホスホネート型又はエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、ホスホロチオエート修飾体又はホスホロアミデート修飾体、モルホリノ修飾体、逆向きチミジン修飾体等が挙げられる。したがって、上記設計されたオリゴヌクレオチドは必要に応じて、これらいずれかにより修飾されてもよい。こうした修飾体は既に開発されており、既に開発されている修飾体を本発明の関節炎治療薬に応用してもよい。例えば、モルホリノ修飾体は特開２００３−２１０１７０に、ホスホロチオエート修飾体は特開２００２−１４２７７８に、逆向きチミジン修飾体は特開２００３−２１０１７１に開示されている。
これら修飾体のうちホスホジエステル結合したオリゴヌクレオチドは、血清でまたは細胞内部でヌクレアーゼの作用を特に受けやすい。そのため本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの好適な態様としては、ヌクレアーゼ抵抗性であるホスホロチオエート結合あるいはメチロホスホネート結合したアナログなどである（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４８：２６５９，１９９８）。
なお、このようなオリゴヌクレオチドの人工アナログは、当業者らに周知の方法、例えば、市販の機械およびＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）より入手できる試薬を用いる方法によって調製することができる。
本発明の他の態様において、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドそのものの形態でなくともよく、例えば、発現ベクターなどに搭載させた発現構築物として標的細胞を感染させた後にアンチセンスＲＮＡ分子として生成させてもよい。
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは標的となるｍＲＮＡとハイブリッドを形成して、相応する遺伝子産物の発現を多重機構で阻害する。「翻訳停止」状態では、標的ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳が阻止される（Ｈａｅｕｐｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１４：１４２７，１９８６）。ホスホジエステルＤＮＡまたはホスホロチオエートＤＮＡオリゴヌクレオチドなどの場合では、標的となるＲＮＡ配列がそのＤＮＡオリゴマーにハイブリダイズするとすぐに、細胞内ＲＮａｓｅ Ｈがその標的ＲＮＡ配列を消化することができる（Ｗａｌｄｅｒ ＆ Ｗａｌｄｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５：５０１１，１９８８）。
「翻訳停止」状態におけるさらなる作用機構としては、ある種のオリゴヌクレオチドは、目的の遺伝子を含む二本鎖の標準的なゲノムＤＮＡとともに「トリップレクス」すなわち三重らせん構造を形成することが可能で、それによってＲＮＡポリメラーゼによる転写が妨げられることも明らかになっている（Ｇｉｏｖａｎｎａｎｇｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９０：１００１３，１９９３）。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは患者の患部に直接適用するか、又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用する。さらには、持続性、膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いることもできる。例えば、リポソーム、ポリ−Ｌ−リジン、リピッド、コレステロール、リポフェクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体の投与量は、患者の状態に応じて適宜調整し、好ましい量を用いることができる。例えば、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲で投与することができる。
ミッドカイン遺伝子の発現を抑制するヌクレオチドの第二の態様としては、ミッドカイン遺伝子を標的としたｄｓＲＮＡである。
「ミッドカイン遺伝子を標的としたｄｓＲＮＡ」とは、ミッドカイン遺伝子の発現をＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により抑制し得るｄｓＲＮＡを意味する。ミッドカイン遺伝子発現をＲＮＡｉ干渉で抑制するためのｄｓＲＮＡは、一方の鎖は少なくともミッドカインｍＲＮＡと相補する配列を備える。発現抑制し得る部位であれば、ミッドカインｍＲＮＡのいずれの領域において相補関係を有してもよい。また、この相補性は、ＲＮＡｉを誘導しミッドカイン遺伝子発現を抑制し得る限り、完全である必要はなく、標的配列との間で数塩基程度のミスマッチを有しても良い。
ｄｓＲＮＡは、人工的に合成されたｄｓＲＮＡそのもの、あるいは発現ベクターにより哺乳動物細胞内で発現させたｄｓＲＮＡの双方の形態を採用することができる。
ｄｓＲＮＡを人工的に合成し、哺乳動物細胞に導入する場合、発現ベクターからｄｓＲＮＡを発現させる場合のいずれの場合にも、長鎖ｄｓＲＮＡによる哺乳動物細胞への細胞毒性を考慮する必要がある。そのため、人工的に合成したｄｓＲＮＡ（以下「合成ｄｓＲＮＡ」という）、発現により結果生成されるｄｓＲＮＡのいずれも、鎖長は例えば１９〜３０塩基対とすることがよいが、これよりも長いｄｓＲＮＡであっても細胞毒性を与えないものであれば用いることができる。
上記ミッドカインｍＲＮＡを標的としたｄｓＲＮＡは、生体内でミッドカインｍＲＮＡと対合し、生体内の酵素によりミッドカインｍＲＮＡの切断を誘導する。そのため、ミッドカインのｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害し、結果としてミッドカインの発現を抑制し、関節炎発症を抑制することが可能となる。
本発明の第六の側面として、抗ミッドカイン抗体を有効成分とする、関節炎予防または治療用組成物が提供される。
ミッドカインの作用を抑え得る既に開発されている抗ミッドカイン抗体（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１５９：３９２−４０２，１９９３）を本発明の関節炎治療・予防用に応用してもよい。また、ヒトミッドカインに対するモノクローナル抗体も開発されており（特開２００２−０８５０５８）、これを応用してもよい。しかし、本発明の抗体はこれら既に報告されている抗体に限定されるものではなく、上記検査方法において説明した抗ミッドカイン抗体の作製方法により作製された抗ミッドカインポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いることもできる。
また、治療剤に使用するミッドカイン抗体は組み換え型抗体や改変抗体を用いることも有効である。組み換え型抗体としては、例えば、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んでこれを宿主に導入し、遺伝子組み換え技術を用いて産生させた組み換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ Ｃ．Ａ．Ｋ．＆ Ｌａｒｒｉｃｋ Ｊ．Ｗ．，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ ＬＴＤ，１９９０）。改変抗体としては、例えばキメラ抗体、ヒト型化抗体が使用できる。キメラ抗体は、ヒト抗体以外の抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡとヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡとを連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し、産生させることにより得ることができる（ＥＰ １２５０２３，ＰＣＴ ＷＯ９６／０２５７６）。
本発明で使用される抗体は、ミッドカインに結合しミッドカインの活性を阻害するかぎり、抗体の断片や修飾物であってもよい。例えば、抗体の断片として、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェイン Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
Ｃ５７ＢＬ／６バックグランドの６−８週令の野生型およびミッドカイン遺伝子ノックアウトマウスを使用した。ミッドカイン遺伝子ノックアウトマウスは既に報告されている方法に従って創生された（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ｔｏ Ｃｅｌｌｓ，３：８１１−８２２，１９９８）。このＭＫノックマウスおよび対照の野生型マウスにおいて関節炎の誘導を試みた。両マウスに８ｍｇの抗コラーゲンモノクローナル抗体カクテル（岩井化学）を注射し、２日後同様に皮下注射した。さらに二日後５００μｇ／ｍｌのリポ多糖を１００μｌ腹腔内注射した。操作の詳細はＴｅｒｏｔｏ Ｋ．らの報告（Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ，１４８：２１０８，１９９２）に従った。最初の注射から７日目に関節のいずれかが腫れ、発赤すれば関節炎発症（＋）、そのような現象が起こらない時は発症（−）と判定した。
上記ミッドカイン遺伝子ノックアウトマウスと対照の野生型マウスで、抗体による関節炎の発症を比較すると、ノックアウトマウスでは著しく低下していた（表１）。ノックアウトマウスと野生型マウスの間では、ミッドカインの存在の有無のみが異なるので、ミッドカインの発現を抑えるか、作用を抑えれば、リウマチの治療が可能になることが示唆された。
〔実施例２〕 ＲＡ患者からの標本におけるＭＫレベルの上昇
患者から得た試料を用いてＭＫ発現とＲＡとの相関を調べた。本実施例では患者試料として、ＲＡまたは変形性関節症（ＯＡ）の患者から滑膜液および血清の試料を採取した。滑膜液はＲＡ患者およびＯＡ患者の膝関節から治療プログラムの一環として吸引した。患者は全例、米国リウマチ学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ）（旧米国リウマチ協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ））による１９８７年のＲＡ基準を満たした。患者は全例、非ステロイド性抗炎症薬および疾患修飾性抗リウマチ薬による治療を受けていた。ＲＡ患者１４５例の平均年齢は６３．１歳であった（１７〜８５歳の範囲）；ＯＡ患者１８例の平均年齢は６７．２歳であった（５４〜７８歳の範囲）。ほとんどのＲＡ患者に対してＬａｒｓｅｎのグレード分類およびステージ分類（米国リウマチ学会）を行った。各グレードの患者数は以下の通りである：グレード１、１０；グレード２、２４；グレード３、２７；グレード４、４１；グレード５、４９。各ステージの患者数は以下の通りである：ステージ１、２３；ステージ２、３４；ステージ３、４２；ステージ４、５２。標本（手術標本を含む）を採取した患者の全例から、名古屋大学審査委員会により承認されたインフォームドコンセント文書への記載および署名を得た。
ＭＫ濃度は報告されている方法の通り、上記患者由来の滑膜液および血清の固相酵素免疫アッセイによって測定した（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １１９：１１７１−５，１９９６）。すなわち、アフィニティー精製したウサギ抗ヒトＭＫ抗体（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １１９：１１７１−５，１９９６）をマイクロタイタープレートの壁に吸着させた後に、ＭＫを含む試料溶液をウェルに添加した。続いて、ビオチン化抗ヒトＭＫ抗体を添加し、吸着したビオチン標識抗体を、アビジン標識したβ−ガラクトシダーゼおよびその蛍光性基質を利用して酵素的に定量した。ＲＡ患者の血清中のリウマトイド因子（ＲＦ）を製造者（栄研化学、東京、日本）の指示に従って測定した。
大半の例において、ＲＡ患者からの滑膜液中のＭＫ値は高値であり（図１Ａ）、一方、ＯＡ患者で認められたＭＫ値は低値に過ぎなかった。ＯＡ患者（３３２ｐｇ／ｍｌ）で測定された最も高いＭＫ値をカットオフレベルとした場合、ＲＡ患者の８５．４％はこれよりも高値を示した。ＭＫレベルはＲＡ患者におけるＲＦの血清レベルと相関した（相関係数、０．６８３；ｐ＜０．００１）。患者を高レベルのＲＦ例［ＲＦ（＋＋）］、中等度レベルのＲＦ例［ＲＦ（＋）］およびＲＦを認めない例［ＲＦ（−）］に分類したところ、ＲＦ（＋）またはＲＦ（＋＋）の患者は全例、カットオフ値を上回る値を示した。さらにＲＦ（−）の患者１８例中１０例も高値を示した。ＲＦ（＋＋）、ＲＦ（＋）およびＲＦ（−）の患者に関する平均ＭＫ値はそれぞれ９，６７０、７，５９０および１，２４０ｐｇ／ｍｌであった。
ＲＡ患者では血清ＭＫ値も高値であった。正常ヒト被検者における血清ＭＫ値は６００ｐｇ／ｍｌに達しなかった（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １１９：１１７１−５，１９９６；Ｉｋｅｍａｔｓｕ Ｓ．ｅｔ ａｌ，Ｂｒｉｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８３：７０１−６，２０００）。この値をカットオフ値として用いると、ＲＡ患者の９１．６％が高値を示した（図１Ｂ）。血清ＭＫ値もＲＦレベルと相関したが（相関係数０．７４４；ｐ＜０．００１）、これはＣ反応性タンパク質レベル、赤血球沈降速度、疾患のステージ、グレード、期間または持続期間とは相関しなかった。ＲＦ（＋＋）患者は全例高値を示し、ＲＦ（＋）患者の９４．６％が陽性であった（図１Ｂ）。さらにＲＦ（−）患者の７１．９％も陽性であった（図１Ｂ）。ＲＦ（＋＋）、ＲＦ（＋）およびＲＦ（−）の患者に関する平均ＭＫ値はそれぞれ９，７９０、５，２４０および８５４ｐｇ／ｍｌであった。血清ＭＫレベルは同じ患者の滑膜液中のＭＫレベルとよく相関した（相関係数、０．６２３；ｐ＝０．００２）。血清のゲル濾過によってＭＫ免疫反応性は低分子量画分に溶出されたため、抗ＭＫ抗体がＲＦと交差反応した可能性はないと判断した（非提示データ）。
本発明者らは次にＭＫ上昇の由来について患者骨膜組織を用いて検討した。外科手術前にステロイド投与を受けていなかった女性ＲＡ患者（６０〜６５歳、ステージ４、グレード５）から滑膜組織を外科的に採取した。滑膜組織を直ちに氷上で冷却し、１０％ホルマリン溶液（和光ケミカル、東京、日本）中で７日間固定した。脱水後に組織をパラフィン中に包埋し、長軸全体にわたり３μｍ厚の切片として切り出した。連続切片をスライドにマウントし、一晩乾燥させた後に気密容器内に保存した。切片を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ＰＢＳ溶液にて１５分間室温で処理し、３％ＢＳＡ ＰＢＳ溶液で３０分間ブロックした上で、ウサギ抗ヒトＭＫ抗体（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １１９：１１７１−５，１９９６）および／またはマウスモノクローナル抗体抗ＣＤ６８（マクロファージのマーカー）（Ｎｅｏｍａｅｋｅｒｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）により４０℃で一晩かけて染色し、その後にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４ヤギ抗ウサギＩｇＧおよび／またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）により室温で１時間染色した。続いて、蛍光顕微鏡Ａｘｉｏｓｋｏｐ ２ ｐｌｕｓ（ＺＥＩＳＳ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて標本を観察した。
ＲＡ患者の滑膜は主としてマクロファージ様細胞および線維芽細胞様細胞から構成されていた（図２Ａ）。抗ＭＫ抗体は関節腔に面した細胞を強く染色し、これらの細胞は抗ＣＤ６８抗体（マクロファージのマーカー）によっても染色される（図２Ａ）。滑膜内の他の細胞は抗ＭＫ抗体によって中程度に染色される。本発明者らは全例がステージ４およびグレード５である患者４例の試料を染色し、本質的には同一の結果であることを確認した。
さらに、本発明者らは滑膜からマクロファージ様細胞および線維芽細胞様細胞を単離し、細胞レベルでのＭＫの発現を確認した。
マクロファージ様細胞および線維芽細胞様細胞の分離は、滑膜組織から以前に記載された方法に従って行った（Ｔａｋａｙａｎａｇｉ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２４０：２７９−８６，１９９７）。抗ヒトＣＤ１４モノクローナル抗体をコーティングしたビーズおよびカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を製造者の指示に従って用いて、ＭＡＣＳシステムにより、ＣＤ１４＋細胞を浮遊細胞から分離した。ＣＤ−１４＋細胞は抗ＣＤ６８抗体による染色および形態によってマクロファージ様細胞として同定された。ＣＤ−１４コーティングビーズのカラムを通過した細胞を培養し、０．１２５％トリプシンおよび０．０１％ＥＤＴＡを用いて２ウェルチェンバースライド（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）上に継代した。付着細胞を形態に基づいて線維芽細胞様細胞とみなした。分離した細胞の培養に用いた培地は、１０％ウシ胎仔血清を加えたダルベッコ変法最小必須培地であった。
上記滑膜から単離した細胞の免疫染色の前処理として、細胞を４％パラホルムアルデヒドにより室温で２０分間固定してＰＢＳで洗浄し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ＰＢＳ溶液で９分間処理してＰＢＳで洗浄した上で１％正常ヤギ血清により２０分間処理した。続いて細胞をウサギ抗ヒトＭＫ抗体と反応させた。フルオレセインイソチオシアネートで標識したヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｉｓ，ＭＯ）を二次抗体として用い、標本をレーザー共焦点画像化システムＭＲＣ１０２４（日本バイオラッド、東京、日本）により観察した。
滑膜から単離したマクロファージ様細胞および線維芽細胞様細胞を用いた実験でも、上記免疫組織化学染色の結果（図２Ａ）と一致する結果が得られた。すなわち、滑膜から単離されたマクロファージ様細胞および線維芽細胞様細胞の両方がＭＫを発現していることが確認された（図２Ｂ）。
〔実施例３〕 ＭＫ欠損マウスにおける抗体誘発性関節炎の抑制
ＲＡ患者の標本におけるＭＫの高発現はＲＡの発生機序と関係することが示唆されたため、本発明者らはこの可能性についてさらに検討した。
ＲＡの代表的な実験モデルは抗体誘発性関節炎であり、これは抗ＩＩ型コラーゲン抗体の注入後にＬＰＳ注入を行うことによって誘発される（Ｔｅｒａｔｏ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：２１０３−８，１９９２）。本発明者らは抗体誘発性関節炎がＭＫ遺伝子欠損マウス（Ｍｄｋ−／−）で起こるか否かを調べた。
なお、ミッドカイン遺伝子（Ｍｄｋ）が欠損したマウスの作出については以前に報告があり（Ｎａｋａｍｕｒａ Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ ３：８１１−２２，１９９８）、その方法に従って実施した。ヘテロ接合性変異マウス（Ｍｄｋ＋／−）をＣ５７ＢＬ／６マウスと７〜８回戻し交雑させた後に相互に交配させた。このようにして得られたＷＴまたはＭｄｋ−／−を１回同系交配させ、雄の子孫をＷＴまたはＭｄｋ−／−として実験に用いた。各実験におけるＷＴおよびＭｄｋ−／−の週齢には１週を上回る差がないようにした。ｄｄＹ系統のマウスは日本ＳＬＣ（静岡、日本）から購入した。これらの実験に用いたマウスはすべて６〜８週齢であり、名古屋大学医学部の実験動物施設で滅菌した食餌、水および床敷きを与えた上で飼育および維持を行った。実験はすべて名古屋大学の動物倫理委員会による承認を得た。
マウスへの関節炎の誘導は以前報告された方法に従って行った（Ｔｅｒａｔｏ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：２１０３−８，１９９２）。各マウスに対して、抗ＩＩ型コラーゲン抗体を含む関節炎誘発性モノクローナル抗体カクテル（岩井化学薬品、東京、日本）８ｍｇを投与した。注射は腹腔内に２日間連続して行った。第４日に５００μｇ／ｍｌ ＬＰＳ溶液（ＰＢＳ中）１００μｌを腹腔内注射した。各肢について関節炎の重症度を０〜４の尺度で判定した：０＝正常；１＝後肢関節または前肢関節の軽度であるが明確な発赤および腫脹；２＝後肢関節または前肢関節の中程度の発赤および腫脹；３＝肢全体の発赤および腫脹；４＝複数の関節に生じた肢の極度の炎症（Ｔｅｒａｔｏ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：２１０３−８，１９９２）。四肢に関して得た値を合計した。ポンプ試験では、ヒトＭＫ生理食塩水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）またはヒト血清アルブミン（和光純薬工業、大阪、日本）生理食塩水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を、浸透ポンプ（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いてＭｄｋ−／−に注入した。腹部皮下に植え込んだポンプから７日間をかけて計９０μｌを連続注入した。ヒトＭＫは酵母内で産生されたものであり（Ｉｋｅｍａｔｓｕ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８３：７０１−６，２０００）、セルシグナルズ社（横浜、日本）のＳ．Ｓａｋｕｍａ博士より寄贈された。全マウスの血清中のＭＫレベル（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １１９：１１７１−５，１９９６）およびＴＮＦ−αレベル（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を測定した。
ＷＴの場合には、抗体投与後第５日および第６日に関節の急激な腫脹が起こり、第７日にはほとんどのマウスが顕著な関節炎を発症した（表２、図３Ａ）。しかし、ほとんどのＭｄｋ−／−では第７日（表２、図３Ａ）にもそれ以後にも関節炎は認められなかった。第７日の平均関節炎スコアはＷＴでは８．３であり、Ｍｄｋ−／−では０．７であった。
さらに、上記Ｍｄｋ−／−マウスおよびＷＴマウスの関節組織の組織学的および免疫組織化学的な検査を行った。
マウスの前肢関節を摘出し、１０％ホルマリン溶液（和光ケミカル、東京、日本）中で７日間固定した上で、０．５ｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡにより脱灰処理を行った（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２２：１３７３−８２，１９８８）。脱水後に組織をパラフィン中に包埋し、長軸全体にわたり３μｍ厚の切片として切り出した。連続切片をスライドにマウントし、一晩乾燥させた後に気密容器内に保存した。切片はヘマトキシリンおよびエオジンで染色した。同じく、切片を０．３％Ｈ２Ｏ２ ＰＢＳ溶液により室温で３０分間処理し、１％ＢＳＡ ＰＢＳ溶液で２０分間ブロックした上で、一次抗体としてウサギ抗マウスＭＫ抗体、ラット抗マウスマクロファージ（Ｆ４／８０抗原）抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）またはラット抗マウス好中球（Ｓｅｒｏｔｅｃ）抗体により４℃で一晩染色し、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したアフィニティー精製ヤギ抗ウサギＩｇＧ、または西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したアフィニティー精製ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｂｅ，ＰＡ）を二次抗体として用いた。染色したものをジアミノベンチジン四塩酸（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、東京、日本）によって可視化した。なお、ウサギ抗マウスＭＫ抗体は以前の記載の通りに調製した（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １５９：３９２−４０２，１９９３）。
なお、統計分析は、動物モデルおよび培養細胞に関する統計的比較はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定によって行った。
上記組織学的および免疫組織化学的な検査により、ＷＴでは第５日および第７日に滑膜の増殖が認められ（図３Ｂ中の矢印）、第７日には関節腔の増大および滑膜液の蓄積が認められた（図３Ｂ）。Ｍｄｋ−／−の場合には第５日および第７日の滑膜はＷＴのものよりもはるかに薄かった（図３Ｂ中の矢印）。Ｍｄｋ−／−では第７日に関節腔の増大は観察されなかった（図３Ｂ）。免疫組織化学染色により、ＷＴの滑膜内の細胞は第２日の方が第０日よりも抗ＭＫによって強く染色された（図３Ｂ）。染色は第５日および第７日にはさらに強くなり、これは特に関節腔に面した細胞で顕著であった。血清の固相酵素免疫アッセイにより、関節炎の発生過程ではＭＫ含量が次第に増加することが確認された（図４Ａ）。
分析の次の段階として、本発明者らは関節炎発症に関するＭｄｋ−／−とＷＴとの間の違いが実際にＭｄｋの有無に起因することを立証することを試みた。ＷＴはＣ５７ＢＬ／６マウスであり、Ｍｄｋ−／−はＣ５７ＢＬ／６マウスに対して戻し交雑を７〜８回行ったものであるが、その起源は１２９／ＳＶマウスにある。このため、１２９／ＳＶマウス由来の少量の遺伝子がＭｄｋ−／−を関節炎誘発に対して抵抗性を付与したと考えることもできなくはない。しかし、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは関節炎誘発に対して比較的抵抗性が高く、関節炎を誘発するには高用量の抗体を必要とするため、その可能性は低い。本発明者らは、同一条件下では１２９／ＳＶマウス５匹すべてがＣ５７ＢＬ／６マウスと同じく関節炎を発症することを確認した。さらに、浸透ポンプによってＭｄｋ−／−の腹膜にＭＫを与えると、ヒト血清アルブミンを与えた場合よりも関節炎発症の頻度は高かった（表２）。この実験により、ＭＫが関節炎の発症に重要な因子であることが明確に立証された。
〔実施例４〕ＭＫは炎症細胞の移動と破骨細胞の分化の両方を増強する
本発明者らは抗体誘発性関節炎の発生機序におけるＭＫの役割について検討した。まず、炎症を誘導する因子として、ＴＮＦ−αの血清レベルを比較したところ、ＷＴとＭｄｋ−／−との間に差はみられなかった（図４Ｂ）。したがって、ＭＫはＴＮＦ−αとは異なる側面から関節炎の発生機序に関与している。本発明者らは、マクロファージおよび好中球の滑膜への移動はＭｄｋ−／−の方がＷＴよりも少ないことを見いだした（図４Ｃ、Ｄ）。すなわち、Ｍｄｋ−／−における炎症性白血球の移動の低下は、虚血後の新生内膜形成（Ｈｏｒｉｂａ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０５：４８９−９５，２０００）および腎炎（Ｓａｔｏ Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６７：３４６３−９，２００１）の場合と同じように、これらのマウスで関節炎が軽減される理由の一つである。
破骨細胞は骨破壊において中心的な役割を果たすため（Ｒｅｄｌｉｃｈ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１０：１４１９−２７，２００２）、本発明者らはＭＫが破骨細胞の分化を促進するか否かを検討した。これまでにＭ−ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬの組み合わせ（単独では不可）が、マクロファージからの破骨細胞の分化を誘導することが知られている（Ｙａｓｕｄａ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：３５９７−６０２，１９９８；Ｔａｋｅｓｈｉｔａ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ １５：１４７７−８８，２０００）。本発明者らはＲＡ患者の滑膜由来のマクロファージ様細胞をＭＫまたは他のサイトカインとともに培養した。破骨細胞の分化については、これらの細胞で発現されるＴＲＡＰの染色によって評価した。
より詳細には、破骨細胞の分化実験は次のように行った。単離したＣＤ１４＋細胞（１０６個／ウェル）を２ウェルチェンバースライド（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐ．）上に播種し、１０％ウシ胎仔血清を加えたダルベッコ変法最小必須培地中にて、組換えヒトＭ−ＣＳＦ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃａｎａｄａ）および／またはＲＡＮＫＬ（５０ｎｇ／ｍｌ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ ＥＣ，Ｌｔｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕ．Ｋ．）および／またはヒトＭＫの存在下（１００ｎｇ／ｍｌ）または非存在下で３週間培養した。培地は３日毎に交換した。
Ｍ−ＣＳＦ依存性骨髄マクロファージを雄性ｄｄＹマウスの全骨髄から調製し、これらの細胞の破骨細胞への分化を刺激する組換えマウスＭＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＩＮＮ）とともに２日間培養した（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ １５：１４７７−８８，２０００；Ｔａｋａｙａｎａｇｉ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０８：６００−５，２０００）。続いて、細胞を以下の因子の存在下または非存在下で３日間培養した；マウスＭ−ＣＳＦ（１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）、ＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびヒトＭＫ。
ヒトおよびマウスの破骨細胞は酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）染色によって同定した（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２２：１３７３−８２，１９８８）。ウェルの全領域内のＴＲＡＰ陽性細胞を算定した。各実験において４つのウェルを算定し、その平均値を示した。３つの独立した実験における結果には再現性があった。
ＭＫは１００ｎｇ／ｍｌでＴＲＡＰ陽性細胞の数を有意に増加させた（図５Ａ）。以前に報告されているように、ＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦは単独ではＴＲＰ陽性細胞を増加させないが、これらを組み合わることによりＴＲＡＰ陽性細胞を増加させた。Ｍ−ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬの組合せにＭＫを添加すると、Ｍ−ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬのみを添加した場合よりも分化を促すように思われたが、その違いは有意に達するほど大きくはなかった。
完全に分化した破骨細胞は多核性であるため、本発明者らは次に、核の数が４個以上のＴＲＡＰ陽性細胞を算定することによってＭＫの効果を評価し、同じ結論に達した（図５Ｂ）。ＭＫによる破骨細胞への分化誘導活性の強さはこのＴＲＡＰアッセイの方が強く示された。ＴＲＡＰ染色の写真を図５Ｃに示している。
本発明者らはまた、マウス骨髄マクロファージを標的細胞として用いて、ＭＫの破骨細胞誘導活性についても検討した。この樹立系において、ＭＫは単独では破骨細胞の分化を誘導しなかった（図５Ｄ）。すなわち、ヒト滑膜内では前駆細胞がすでに何らかの分化段階に達している可能性がある。以前に報告されているように、Ｍ−ＣＳＦまたはＲＡＮＫＬは単独では分化を誘導しない（Ｔａｋａｙａｎａｇｉ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２４０：２７９−８６，１９９７；Ｔａｋｅｓｈｉｔａ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ １５：１４７７−８８，２０００）。ＭＫおよびＲＡＮＫＬの組み合わせは分化を誘導し、その誘導のレベルはＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦによるものと同程度であった。ＭＫ、Ｍ−ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬの添加はＭ−ＣＳＦとＲＡＮＫＬの組み合わせよりも破骨細胞の分化を増強するように思われるが、その差は統計学的に有意ではなかった。
実施例の考察：ＲＡの発生機序には種々のサイトカインがさまざまな役割を果たしている（Ｆｅｌｄｍａｎｎ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４：３９７−４４０，１９９６）。本発明者らは、ＭＫがこの過程において炎症性白血球の移動および破骨細胞の分化の両方に役割を果たしていることを見いだした。インビトロ試験により、ＭＫが直接的作用およびケモカイン誘導の両方を介して炎症性白血球の移動を増強することが示された（Ｈｏｒｉｂａ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０５：４８９−９５，２０００；Ｓａｔｏ Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６７：３４６３−９，２００１；Ｔａｋａｄａ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １２２：４５３−８，１９９７）。破骨細胞の分化を促進する活性は骨破壊との関連から重要である。ＭＫがＲＡＮＫＬと協同的に作用する活性はＭ−ＣＳＦのものと同程度に強かった。ＭＫのこの活性スペクトルは他のサイトカインには認められない。
Ｍｄｋ−／−において抗体誘発性関節炎が事実上生じなかったことは、ＲＡの発生機序にＭＫが必須な役割を果たすことを意味する。実験モデルにおける本疾患に対する抵抗性はＩＬ−１欠損マウスで認められるレベルである（Ｊｉ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９６：７７−８５，２００２）。これに対して、ＴＮＦ−α欠損マウスは実験的関節炎を時に発症する（Ｊｉ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９６：７７−８５，２００２）。ＩＬ−６欠損マウスではコラーゲン誘導性関節炎の発症が著しく抑制されるが（Ｏｈｓｈｉｍａ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：８２２２−６，１９９８）、免疫複合体誘導性関節炎については抑制されない（Ｊｉ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９６：７７−８５，２００２）。これはＩＬ−６が主にリンパ球活性化に関与しているためと考えられる。本発明者らは本研究で抗体誘発性モデルを用いたが、これはこのモデルでは抗体産生の影響を除外できるためである。
ＭＫとＲＡとの密接な相関関係は、ＲＡ患者の滑膜内および血清中のＭＫ値が高いことからも裏づけられる。ＲＡ患者の９０％以上で血清ＭＫレベルの上昇が認められた。ＲＡに伴うこうした高頻度の上昇はＩＬ−６レベルに関して観察されているが、ＩＬ−１レベルおよびＴＮＦ−αレベルについては観察されていない（Ｄａｎｉｓ ＶＡ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ ５１：９４６−５０，１９９２）。早期ＲＡの診断には多数の要因の判定を要するため、ＲＡ患者の標本におけるＭＫ発現レベルの高さは、ＭＫレベルをＲＡのスクリーニングに利用しうる。
ＭＫが関節炎の発生機序に決定的な役割を果たすことに一致して、ＭＫはＲＡ患者および関節炎の発症過程にあるマウスのいずれの滑膜内にも検出された。本発明者らは以前に、ＲＡ患者の滑膜内におけるＭＫ発現を報告しているが、その際にＭＫ発現を伴う細胞は同定されなかった（Ｔａｋａｄａ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １２２：４５３−８，１９９７）。本研究により、滑膜内のマクロファージ様細胞および線維芽細胞様細胞の両方におけるＭＫ発現が明らかになった。すなわち、ＭＫは適切な時期および場所に存在して、関節炎の発生機序に関係する２種類の活性を発揮する。さらに、活性化リンパ球によって分泌されるＭＫも関節炎の発症に寄与する可能性がある（Ｃａｌｌｅｂａｕｔ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２８１：２４８−６４，２００１）。
ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１に加えて、ＩＬ−６もＲＡの治療法の有望な標的となりつつある（Ｃｈｏｙ ＥＨ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４６：３１４３−５０，２００２）。本願における知見は、ＭＫが治療的応用のもう一つの候補であることを示唆する。重要な点の一つは、ＭＫがＲＡ発生機序の２つの異なる段階で決定的な役割を果たすことである。ＲＡの抗サイトカイン療法における問題の一つは、奏功しない患者が存在することである。ＴＮＦ−α、ＩＬ−１およびＩＬ−６と比較したＭＫの作用機序の違いは、奏功する患者集団の違いを生む可能性がある。指摘すべきもう一つの点は、ＭＫが主として妊娠中期に発現され、成人では限定された領域でしか発現されないことである（Ｋａｄｏｍａｔｓｕ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１０：６０７−１６，１９９０；Ｔｓｕｔｓｕｉ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３：１２８１−５，１９９３）。成人におけるＭＫの限定的な発現は重大な副作用を避けるのに役立つと思われる。
最近、ＭＫと約４５％の配列同一性を有するプレイオトロフィンがＲＡ患者の滑膜内で誘導されることが見いだされ（Ｐｕｆｅ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４８：６６０−７，２００３）、このことからプレイオトロフィンもＲＡの発生機序に寄与することが示唆されている。ＭＫおよびプレイオトロフィンは多くの系で類似した機能を示すが（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ Ｔ．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １３２：３５９−７１，２００２；Ｋｕｒｔｚ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｇ ６：１５１−７７，１９９５）、関節炎発症に関するＭｄｋ−／−の明らかな表現型からみて、この２つの因子はこの過程で異なる役割を果たすと考えられる。実際に、滑膜由来の細胞に対するプレイオトロフィンのインビトロ活性は増殖の賦活である（Ｐｕｆｅ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ４８：６６０−７，２００３）。
【産業上の利用の可能性】
本発明により、関節炎発症に関与する因子としてミッドカインが新たに同定された。ミッドカインは、ＲＡ患者において有意に発現が高く、また、関節炎の実験動物モデルでも同様にミッドカインの高発現が観察された。したがって。本発明の関節炎関連因子は、関節炎の発生を研究するための試薬としてまたは、関節炎モデルを作製する際の試薬として有用となる。
また、本発明の関節炎の検査方法は、ＲＡ患者を多面的に診断する手段として有用となる。特に、抗ＴＮＦ−α抗体などで治療効果が認められない患者の診断さらにはその後の処理方法を検討する上で重要な検査方法になる可能性がある。
本発明のスクリーニング方法により得られる物質および関節炎の治療薬は、関節炎患者、特にリウマチ性関節炎患者においてミッドカインの発現が有意に高いこと、およびミッドカインノックアウト動物では関節炎の発生が著しく低減されていることを考慮すると、有望な治療薬となることが期待される。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
関節炎発生に関連する因子であって、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の関節炎関連因子。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、関節炎誘導活性を有するポリペプチドをコードしたＤＮＡ。
【請求項２】
関節炎発生に関連する因子であって、下記（ａ）または（ｂ）のいずれかに記載の関節炎関連因子。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、関節炎誘導活性を有するポリペプチド。
【請求項３】
関節炎がリウマチ性関節炎である、請求項１または２に記載の関節炎関連因子。
【請求項４】
被検者より採取した試料中のミッドカイン遺伝子の発現を測定する工程を含む、関節炎の検査方法。
【請求項５】
被検者より採取した試料が血液又は滑膜組織である、請求項４記載の検査方法。
【請求項６】
ミッドカイン遺伝子発現の測定がミッドカイン蛋白質またはミッドカインをコードしたｍＲＮＡを基に測定される、請求項４又は５記載の検査方法。
【請求項７】
抗ミッドカイン抗体を含む、関節炎検査用試薬。
【請求項８】
下記（ａ）および（ｂ）工程を含む、関節炎の治療または予防用薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ミッドカインに被検物質を接触させる工程
（ｂ）前記ミッドカインと被検物質との結合を検出する工程
【請求項９】
下記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）工程を含む、関節炎の治療または予防用薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ミッドカイン遺伝子が発現している細胞に被検物質を接触させる工程
（ｂ）被検物質接触後にミッドカイン遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検物質と接触させていない対照細胞のミッドカイン発現レベルに比べてミッドカイン遺伝子の発現レベルを低下させた被検物質を選択する工程
【請求項１０】
下記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）工程を含む、関節炎の治療または予防用薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ミッドカイン遺伝子のプロモータ領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞に被検物質を接触させる工程
（ｂ）被検物質接触後にレポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる被検物質を選択する工程
【請求項１１】
関節炎がリウマチ性関節炎である、請求項８から１０のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
ミッドカイン遺伝子の発現を抑制し得るオリゴヌクレオチドを有効成分とする関節炎予防または治療用組成物。
【請求項１３】
ミッドカイン遺伝子の発現を抑制するオリゴヌクレオチドがミッドカイン遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡである、請求項１２記載の関節炎予防または治療用組成物。
【請求項１４】
ミッドカイン遺伝子の発現を抑制し得るオリゴヌクレオチドがミッドカイン遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１３記載の関節炎予防または治療用組成物。
【請求項１５】
抗ミッドカイン抗体を有効成分とする、関節炎予防または治療用組成物。
【請求項１６】
関節炎がリウマチ性関節炎である、請求項１２から１５のいずれかに記載の関節炎予防または治療用組成物。
【請求項１】
関節炎発生に関連する因子であって、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の関節炎関連因子。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、関節炎誘導活性を有するポリペプチドをコードしたＤＮＡ。
【請求項２】
関節炎発生に関連する因子であって、下記（ａ）または（ｂ）のいずれかに記載の関節炎関連因子。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、関節炎誘導活性を有するポリペプチド。
【請求項３】
関節炎がリウマチ性関節炎である、請求項１または２に記載の関節炎関連因子。
【請求項４】
被検者より採取した試料中のミッドカイン遺伝子の発現を測定する工程を含む、関節炎の検査方法。
【請求項５】
被検者より採取した試料が血液又は滑膜組織である、請求項４記載の検査方法。
【請求項６】
ミッドカイン遺伝子発現の測定がミッドカイン蛋白質またはミッドカインをコードしたｍＲＮＡを基に測定される、請求項４又は５記載の検査方法。
【請求項７】
抗ミッドカイン抗体を含む、関節炎検査用試薬。
【請求項８】
下記（ａ）および（ｂ）工程を含む、関節炎の治療または予防用薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ミッドカインに被検物質を接触させる工程
（ｂ）前記ミッドカインと被検物質との結合を検出する工程
【請求項９】
下記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）工程を含む、関節炎の治療または予防用薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ミッドカイン遺伝子が発現している細胞に被検物質を接触させる工程
（ｂ）被検物質接触後にミッドカイン遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検物質と接触させていない対照細胞のミッドカイン発現レベルに比べてミッドカイン遺伝子の発現レベルを低下させた被検物質を選択する工程
【請求項１０】
下記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）工程を含む、関節炎の治療または予防用薬剤の候補化合物のスクリーニング方法。
（ａ）ミッドカイン遺伝子のプロモータ領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞に被検物質を接触させる工程
（ｂ）被検物質接触後にレポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる被検物質を選択する工程
【請求項１１】
関節炎がリウマチ性関節炎である、請求項８から１０のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
ミッドカイン遺伝子の発現を抑制し得るオリゴヌクレオチドを有効成分とする関節炎予防または治療用組成物。
【請求項１３】
ミッドカイン遺伝子の発現を抑制するオリゴヌクレオチドがミッドカイン遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡである、請求項１２記載の関節炎予防または治療用組成物。
【請求項１４】
ミッドカイン遺伝子の発現を抑制し得るオリゴヌクレオチドがミッドカイン遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１３記載の関節炎予防または治療用組成物。
【請求項１５】
抗ミッドカイン抗体を有効成分とする、関節炎予防または治療用組成物。
【請求項１６】
関節炎がリウマチ性関節炎である、請求項１２から１５のいずれかに記載の関節炎予防または治療用組成物。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８５６４２
【国際公開日】平成１６年１０月７日（２００４．１０．７）
【発行日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０４１２６（Ｐ２００５−５０４１２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００４３５２
【国際出願日】平成１６年３月２６日（２００４．３．２６）
【出願人】（５９１０３８９４５）
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年１０月７日（２００４．１０．７）
【発行日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００４３５２
【国際出願日】平成１６年３月２６日（２００４．３．２６）
【出願人】（５９１０３８９４５）
【Ｆターム（参考）】
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