院内感染に対する免疫化のための多糖ブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質接合体
【課題】院内感染症に対する有効な免疫原性組成物の提供。
【解決手段】多糖抗原およびブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質の両方に対する抗体反応を惹起するための、ブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質に接合した院内病原菌に由来する多糖抗原を有する免疫原性多糖タンパク質接合体（またはその１以上の抗原エピトープを表すジサッカライドフラグメント）の免疫原性組成物としての使用。当該免疫原性組成物は、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピデルミディスまたは他の院内病原菌により引き起こされる疾患に対して免疫化するために使用される。
【解決手段】多糖抗原およびブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質の両方に対する抗体反応を惹起するための、ブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質に接合した院内病原菌に由来する多糖抗原を有する免疫原性多糖タンパク質接合体（またはその１以上の抗原エピトープを表すジサッカライドフラグメント）の免疫原性組成物としての使用。当該免疫原性組成物は、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピデルミディスまたは他の院内病原菌により引き起こされる疾患に対して免疫化するために使用される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、院内病原菌から得られる多糖抗原（または１以上の抗原性エピトープを表すそのオリゴ糖フラグメント）およびブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質を含む免疫原性多糖タンパク質接合体に関する。本発明はさらに、多糖−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物、およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
毎年、米国において病院に入院している推定４０００００００人のうち約２００００００人が院内感染を発症している（Ａｎｏｎｙｏｍｏｕｓ １９９７）。死亡率は約４．４％であるので、院内感染のため毎年８８０００人が死亡している。米国における院内感染の費用は、１年あたり推定４５００００００００ドルである（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ １９９８）。これらの推定値は毎年行われる３１００００００人の外来患者の手術（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ’ ｗｅｂｓｉｔｅ)、１５０００００人の養護施設居住者、拡張看護施設、または外来治療を受けている者において発生する感染症を包含しない。
【０００３】
スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）および凝集酵素陰性ブドウ球菌（ＣｏＮＳ）、特にエス・エピデルミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）は、院内感染の大部分の原因であるグラム陽性日和見院内病原菌である。ブドウ球菌感染症はすべての院内感染症のほぼ２５％（約５０００００人）の原因である（Ｈａｌｅｙ，Ｃｕｌｖｅｒら、１９８５）（Ｂｏｙｃｅ １９９７）。一部の病院では入院患者全体の１％までがエス・アウレウス感染症にかかっている（ＳｔｏｒｃｈおよびＲａｊａｇｏｐａｌａｎ １９８６）。ブドウ球菌（エス・アウレウスおよびエス・エピデルミディス）は院内血流感染症の約４７％、手術部位感染症（ＳＳＩ）の２４％、および院内感染肺炎の１７％の原因である（Ａｎｏｎｙｏｍｏｕｓ １９９７）。院内エス・アウレウスおよびＣｏＮＳ感染症の患者の死亡率は５％〜６８％までの範囲で相当変化する（Ｎａｄａ，Ｉｃｈｉｙａｍａら、１９９６）；（Ｔｈｙｌｅｆｏｒｓ，Ｈａｒｂａｒｔｈら、１９９８）。
【０００４】
ブドウ球菌感染症は、範囲が広く、皮膚感染症、例えば、膿痂疹、できもの、創傷感染および埋め込み装置からの感染症から重度の命にかかわる感染症、例えば骨髄炎、心内膜炎および転移性合併症を伴う菌血症にまで及ぶ。このような多様性のために、ブドウ球菌に対する有効な免疫原性組成物の設計を非常に困難になる。薬剤耐性院内細菌の出現が急激に増加し、そのためにこのような設計がさらに困難になっている。メチシリン耐性エス・アウレウスは院内感染症の原因の約４０％である（Ｂｏｙｃｅ １９９７）。最近、バンコマイシン中間耐性エス・アウレウス（ＶＩＳＡ）が出現し、その拡大に関する不安がさらに大きくなっている。従って、院内感染症に対する有効な免疫原性組成物に対する需要が強く、そして急速に増大している。
【０００５】
莢膜多糖（ｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）
ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびＢ群ストレプトコッカスをはじめとする多くの病原菌の毒性における莢膜多糖（ＣＰ）の関与は、十分に証明されている。莢膜で覆われた細菌は、白血球による食菌作用に対して耐性であり、従って血液および組織に感染し得る。莢膜多糖に対する抗体は細菌莢膜の抗食細胞特性を中和するので（Ｋａｒａｋａｗａ、Ｓｕｔｔｏｎら、１９８８，Ｔｈａｋｋｅｒ、Ｐａｒｋら、１９８８）、ブドウ球菌莢膜は、人間におけるブドウ球菌感染症を予防するための免疫原性組成物の開発における主要な標的である。
【０００６】
エス・アウレウスの１２の公知莢膜血清型のうち、血清型５（ＣＰ５）および血清型８（ＣＰ８）は全臨床分離株の約８５〜９０％を占める（Ａｒｂｅｉｔ，Ｋａｒａｋａｗａら、１９８４、Ｋａｒａｋａｗａ，Ｆｏｕｒｎｉｅｒら、１９８５、Ｅｓｓａｗｉ，Ｎａ’ｗａｓら、１９９８、Ｎａ’ｗａｓ、Ｈａｗｗａｒｉら、１９９８）。ほとんどのメチシリン耐性エス・アウレウス分離株はＣＰ５を発現する（Ｓｏｍｐｏｌｉｎｓｋｙ，Ｓａｍｒａら、１９８５）。ＣＰ５およびＣＰ８に対する抗体は、インビトロのヒト多形核好中球による型特異性オプソニン作用による食菌現象を誘発し、動物において保護を付与する（Ｋａｒａｋａｗａ，Ｓｕｔｔｏｎら、１９８８、Ｆａｔｔｏｍ，Ｓａｒｗａｒら、１９９６）。
【０００７】
ほとんどの細菌莢膜多糖は、動物および人間において不十分な免疫原である。しかしながら、精製された多糖がタンパク質キャリア分子と接合するならば、これらは免疫原性およびＴ細胞依存性を獲得する。いくつかの研究所は、タンパク質と共有結合したＣＰ５およびＣＰ８からなる免疫原性接合体を合成した。これらの接合体は、マウスおよびヒトにおいて高度に免疫原性であり、食菌作用のためにマイクロカプセル化エス・アウレウスをオプソニン化する抗体を誘発する（Ｆａｔｔｏｍ，Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎら、１９９３、Ｇｉｌｂｅｒｔら、１９９４，Ｒｅｙｎａｕｄ−Ｒｏｎｄｉｅｒら、１９９１）。シュードモナス・エルジノーサ組み換え外毒素Ａに接合したＣＰ５を含有する一価免疫原性組成物は、免疫原性であり、健康な成人および末期の腎臓病の患者において良好な耐容性を示す（Ｗｅｌｃｈら、１９９６）。血液透析を受けている末期腎臓病の患者を含む二重盲検法において、シュードモナス・エルジノーサ組み換え外毒素Ａと共有結合したＣＰ５およびＣＰ８からなる二価接合体ワクチンは、約４０週間エス・アウレウス菌血症に対して部分的免疫を付与し、その後、防御は抗体レベルが減少するにつれて減少した（Ｓｈｉｎｅｆｉｅｌｄら、２００２）。この試験の結果は、さらに完全な防御をもたらすことができる改善された免疫原性組成物が必要とされていることを示す。
【０００８】
多糖付着因子（ＰＳ／Ａ；（Ｔｏｊｏ，Ｙａｍａｓｈｉｔａら、１９８８））、ポリ−Ｎ−スクシニルβ−１−６−グルコサミン（ＰＮＳＧ、（ＭｃＫｅｎｎｅｙ，Ｐｏｕｌｉｏｔら、１９９９））、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン表面多糖（ＰＮＡＧ、（Ｍａｒｉａ−Ｌｉｔｒａｎ，Ｋｒｏｐｅｃら、２００２））、または多糖細胞間付着因子（ＰＩＡ（Ｍａｃｋ，Ｆｉｓｈｅｒら、１９９６））と称する別の種類の細胞外多糖は、エス・アウレウスおよびエス・エピデルミディスの両方により発現される。ＰＩＡまたはＰＳ／Ａは直鎖β−１，６−結合グルコサミングリカンである。マウスをＰＳ／Ａ（ＰＮＳＧ、ＰＮＡＧ）で免疫化すると腎臓の転移増殖が減少し、インビトロで若干のＰＳ／Ａ（ＰＮＳＧ、ＰＮＡＧ）を産生するエス・アウレウス株で攻撃した後にマウスを死から防御する（ＭｃＫｅｎｎｅｙ，Ｐｏｕｌｉｏｔら、１９９９）。ＰＩＡは静脈内カテーテルに関連する感染症の発生機序において重要な役割を果たす（Ｒｕｐｐ，Ｕｌｐｈａｎｉら、１９９９；Ｒｕｐｐ，Ｕｌｐｈａｎｉら、１９９９；ＲｕｐｐおよびＦｅｙ ２００１；Ｒｕｐｐ，Ｆｅｙら、２００１）。個々のエス・エピデルミディス細胞間の接着を促進することに加えて、ＰＩＡは赤血球と結合し、ヘマグルチニンとして作用する（Ｆｅｙ，Ｕｌｐｈａｎｉら、１９９９）。
【０００９】
ブドウ球菌表面付着因子
ブドウ球菌は複数の表面付着因子（接着性マトリックス分子を認識する微生物表面成分と称する）を発現し、これらには、例えば、フィブロネクチン結合タンパク質、フィブリノゲン結合タンパク質、コラーゲン結合タンパク質およびビトロネクチン結合タンパク質が含まれる。これらの付着因子は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分、例えば、フィブロネクチン、フィブリノゲン、コラーゲンおよびビトロネクチンを特異的に認識し、結合する。エス・アウレウスにより発現される多数の接着因子は、様々な組織に対する接着および感染の代替法を提供することにより、その病原性に寄与する。ブドウ球菌付着因子の抗体は、細菌が哺乳動物宿主組織を侵襲することを防止するか、またはオプソニン作用による食菌作用を促進することにより疾患を軽減することができる。エス・アウレウスフィブロネクチン結合タンパク質Ａ（融合タンパク質として提供される）の一部で免疫化されたラットは、実験的心内膜炎から適度に保護された。フィブロネクチン結合タンパク質Ａの抗体を惹起するように設計された同様の免疫原性組成物をエス・アウレウス乳腺炎のマウスモデルにおいて試験した。免疫化されたマウスは対照マウスよりも重度の乳腺炎の症例が少なく、免疫化されたマウスの乳腺炎から回収される細菌は対照マウスよりも少なかった。１９および８７ｋＤａのフィブリノゲン結合タンパク質で免疫化されたマウスは、非免疫化対照と比較して乳腺炎の発病率が減少し、一方、コラーゲン結合タンパク質での免疫化は保護しなかった（Ｌｅｅ，Ｐｉｅｒ １９９７）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、多糖抗原を様々なタンパク質キャリアに接合させるためのこれらおよび他の試みにもかかわらず、院内感染を治療または予防するための有効な免疫原性組成物は現在のところない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、従って、院内病原菌に由来する少なくとも１種の多糖抗原、または少なくとも１種のブドウ球菌表面付着キャリアタンパク質に接合した少なくとも１種の多糖抗原（合成または天然の多糖の加水分解により調製）の１以上の抗原エピトープを表すオリゴ糖フラグメントを含む免疫原性多糖−タンパク質接合体を提供する。本発明の接合体は、院内病原菌の多糖抗原および表面付着因子キャリアタンパク質の両方に対して特異的な抗体反応を対象において惹起する際に有用な免疫原性組成物において用いられる。従って、これらの接合体は、エス・アウレウス、エス・エピデルミディスまたは他の院内病原菌により引き起こされる院内感染症に対して免疫化するために、また受動免疫化のための免疫グロブリンの生成に関しては、院内感染症の予防または重篤度の軽減のために使用することができる。
【００１２】
本発明の一態様において、少なくとも１種のブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質と接合した院内病原菌に由来する少なくとも１種の多糖抗原を含む免疫原性多糖タンパク質接合体が提供され、ここにおいて該接合体は、多糖抗原および表面付着因子キャリアタンパク質の両方に対する特異的抗体を生成する。
本発明のもう一つ別の態様において、少なくとも１種のブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質と接合した院内病原菌から得られる少なくとも１種の多糖抗原の１以上の抗原エピトープを表すオリゴ糖フラグメントを含む免疫原性多糖タンパク質接合体が提供され、ここにおいて、該接合体は、多糖抗原および表面付着因子キャリアタンパク質の両方に対する特異的抗体を生成する。
【００１３】
さらにもう一つ別の態様において、多糖抗原−表面付着因子タンパク質接合体を適当な担体または希釈剤との組み合わせにおいて含む免疫原性組成物が提供される。本発明の免疫原性組成物はさらにアジュバント、例えば、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムを含んでもよい。
さらにもう一つ別の態様において、哺乳動物において院内感染症に対する活性免疫を誘発する方法であって、このような感染症にかかっているヒトをはじめとする哺乳動物に、免疫原性量の本発明の免疫原性組成物を投与することを含む方法が提供される。
さらにもう一つ別の態様において、院内感染症に対する免疫治療薬の調製法であって、哺乳動物を本発明の免疫原性組成物で免疫化する工程、免疫化された哺乳動物から血漿を採集する工程、および集められた血漿から抗多糖抗体および抗表面付着因子抗体を含有する高度免疫グロブリンを収穫する工程を含む方法が提供される。高度免疫グロブリンは、院内感染症に対する受動免疫を誘発するために使用できる。
本発明の接合体は、多糖抗原および表面付着因子キャリアタンパク質の両方（両方とも毒性因子である）に対する抗体を惹起し、院内病原菌により引き起こされる疾患に対する免疫を付与する明確な利点を有する。すなわち、表面付着因子タンパク質それ自体が単に多糖抗原のタンパク質キャリアとして作用するだけでなく、免疫を付与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＧＬＣおよびＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析により決定されるエス・アウレウスＣＰ５およびＣＰ８の組成を示す。
【図２】デ−Ｏ−アセチル化エス・アウレウスＣＰ５およびＣＰ８の１Ｈ−ＮＭＲ分析を示す。
【図３】エス・アウレウス−ＣｌｆＡから得られるクランピング因子の概略図である。
【図４】エス・アウレウスＣｌｆＡに由来する組み換えタンパク質Ｃｌｆ４０およびＣｌｆ４１の概略図である。
【図５】エス・エピデルミディス−ＳｄｒＧから得られるクランピング因子の概略図である。
【図６】エス・エピデルミディスＳｄｒＧ：ＳｄｒＧ（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）およびＳｄｒＧ（Ｎ２Ｎ３）に由来する組み換えタンパク質の概略図である。
【図７】表面付着因子タンパク質のブロモアセチル化を示す。
【図８】エス・アウレウスＣＰの３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）での活性化を示す。
【図９】チオール化エス・アウレウスＣＰの表面付着因子タンパク質への接合を示す。
【図１０】ＣＰ特異性ウサギ抗血清に関する抗原性についてのＣＰ５−およびＣＰ８−ＳｄｒＧ（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）およびＣＰ５−およびＣＰ８−Ｃｌｆ４１（Ｎ２Ｎ３）接合体の分析を示す。
【図１１】ＣｌｆＡ特異性ウサギ抗血清に関する抗原性についてのＣＰ５−およびＣＰ８−Ｃｌｆ４１（Ｎ２Ｎ３）接合体の分析を示す。
【図１２】二重免疫拡散検定による抗原性についてのＣＰ５−およびＣＰ８−ＳｄｒＧ（Ｎ２Ｎ３）６ｘＨｉｓおよびＣＰ５−およびＣＰ８−Ｃｌｆ４０（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）６ｘＨｉｓ接合体の分析を示す。
【図１３】Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ免疫拡散検定による抗原性についてのＣＰ５−およびＣＰ８−ＳｄｒＧ（Ｎ２Ｎ３）およびＣＰ５−およびＣＰ８−ＦｎｂＡ接合体の分析を示す。
【図１４】ドットブロットによる接合体の分析を示す。
【図１５Ａ】ＳｄｒＧ（Ｎ２Ｎ３）に接合したエス・アウレウスＣＰ８に対する免疫応答を示す。
【図１５Ｂ】アジュバントを含む、ＳｄｒＧ（Ｎ２Ｎ３）に接合したエス・アウレウスＣＰ８に対する免疫応答を示す。
【図１５Ｃ】Ｃｌｆ４０（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に接合したエス・アウレウスＣＰ８に対する免疫応答を示す。
【図１５Ｄ】アジュバントを含む、Ｃｌｆ４０（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に接合したエス・アウレウスＣＰ８に対する免疫応答を示す。
【図１５Ｅ】アジュバントを含む、Ｃｌｆ４１（Ｎ２Ｎ３）に接合したエス・アウレウスＣＰ８に対する免疫応答を示す。
【図１５Ｆ】Ｃｌｆ４１（Ｎ２Ｎ３）に接合したエス・アウレウスＣＰ８に対する免疫応答を示す。
【図１５Ｇ】アジュバントを含む、ＳｄｒＧ（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に接合したエス・アウレウスＣＰ８に対する免疫応答を示す。
【図１５Ｈ】ＳｄｒＧ（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に接合したエス・アウレウスＣＰ８に対する免疫応答を示す。
【図１６Ａ】ＳｄｒＧ（Ｎ２Ｎ３）に接合したエス・アウレウスＣＰ５に対する免疫応答を示す。
【図１６Ｂ】アジュバントを含む、ＳｄｒＧ（Ｎ２Ｎ３）に接合したエス・アウレウスＣＰ５に対する免疫応答を示す。
【図１６Ｃ】Ｃｌｆ４０（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に接合したエス・アウレウスＣＰ５に対する免疫応答を示す。
【図１６Ｄ】アジュバントを含む、Ｃｌｆ４０（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に接合したエス・アウレウスＣＰ５に対する免疫応答を示す。
【図１６Ｅ】アジュバントを含む、Ｃｌｆ４１（Ｎ２Ｎ３）に接合したエス・アウレウスＣＰ５に対する免疫応答を示す。
【図１６Ｆ】Ｃｌｆ４１（Ｎ２Ｎ３）に接合したエス・アウレウスＣＰ５に対する免疫応答を示す。
【図１６Ｇ】アジュバントを含む、ＳｄｒＧ（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に接合したエス・アウレウスＣＰ５に対する免疫応答を示す。
【図１６Ｈ】ＳｄｒＧ（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に接合したエス・アウレウスＣＰ５に対する免疫応答を示す。
【図１７Ａ】アジュバントを含まない、未接合エス・アウレウスＣｌｆ４０（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図１７Ｂ】アジュバントを含まない、ＣＰ８に接合したエス・アウレウスＣｌｆ４０（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図１７Ｃ】アジュバントを含まない、ＣＰ５に接合したエス・アウレウスＣｌｆ４０（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図１７Ｄ】アジュバントを含む、ＣＰ５に接合したエス・アウレウスＣｌｆ４０（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図１７Ｅ】アジュバントを含む、ＣＰ８に接合したエス・アウレウスＣｌｆ４０（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図１７Ｆ】アジュバントを含む、未接合エス・アウレウスＣｌｆ４０（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図１８Ａ】アジュバントを含まない、ＣＰ５に接合したエス・アウレウスＣｌｆ４１（Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図１８Ｂ】アジュバントを含まない、ＣＰ８に接合したエス・アウレウスＣｌｆ４１（Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図１８Ｃ】アジュバントを含まない、未接合エス・アウレウスＣｌｆ４１（Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図１８Ｄ】アジュバントを含む、ＣＰ５に接合したエス・アウレウスＣｌｆ４１（Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図１８Ｅ】アジュバントを含む、ＣＰ８に接合したエス・アウレウスＣｌｆ４１（Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図１８Ｆ】アジュバントを含む、未接合エス・アウレウスＣｌｆ４１（Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図１９Ａ】アジュバントを含まない、ＣＰ５に接合したエス・エピデルミディスＳｄｒＧ（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図１９Ｂ】アジュバントを含まない、ＣＰ８に接合したエス・エピデルミディスＳｄｒＧ（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図１９Ｃ】アジュバントを含まない、未接合エス・エピデルミディスＳｄｒＧ（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図１９Ｄ】アジュバントを含む、ＣＰ５に接合したエス・エピデルミディスＳｄｒＧ（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図１９Ｅ】アジュバントを含む、ＣＰ８に接合したエス・エピデルミディスＳｄｒＧ（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図１９Ｆ】アジュバントを含む、未接合エス・エピデルミディスＳｄｒＧ（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図２０Ａ】アジュバントを含まない、ＣＰ５に接合したエス・エピデルミディスＳｄｒＧ（Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図２０Ｂ】アジュバントを含まない、ＣＰ８に接合したエス・エピデルミディスＳｄｒＧ（Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図２０Ｃ】アジュバントを含まない、未接合エス・エピデルミディスＳｄｒＧ（Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図２０Ｄ】アジュバントを含む、ＣＰ５に接合したエス・エピデルミディスＳｄｒＧ（Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図２０Ｅ】アジュバントを含む、ＣＰ８に接合したエス・エピデルミディスＳｄｒＧ（Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図２０Ｆ】アジュバントを含む、未接合エス・エピデルミディスＳｄｒＧ（Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
院内感染症は複数の毒性因子を含む。従って、一つの毒性決定因子のみを含有する免疫原性組成物と比較して、免疫原性組成物中に成分として含まれる毒性決定因子の組み合わせが防御を増大させる可能性が非常に高い。本発明の多糖抗原は、これらに限定されないが、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）および他の凝固酵素陰性ブドウ球菌（ＣｏＮＳ）、エンテロコッカス種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、エンテロバクター種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、およびシュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）をはじめとする様々な院内病原微生物に由来する。これらの抗原は全身性感染症における毒性因子であり、不十分な免疫源である。その免疫原性は、キャリアタンパク質への接合により向上させることができる。本発明の目的に関して、表面付着因子タンパク質は接着性マトリックス分子を認識する微生物表面成分である。これらはＩｎｈｉｂｉｔｅｘ Ｉｎｃ．（Ａｌｐｈａｒｅｔｔａ，ＧＡ、ＵＳＡ）からＭＳＣＲＡＭＭの登録商標で入手可能である。以下に記載するように、ブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質を多糖抗原のキャリアタンパク質として利用することにより、多糖がＴ細胞依存性抗原に変換され、かくして抗多糖ＩｇＧ応答が誘発される。さらに、接合体は感染症に対して防御し、哺乳動物宿主組織への細菌の付着の防止を助ける抗表面付着因子キャリアタンパク質抗体を誘発する。タンパク質−サッカライド接合法の化学反応はキャリアタンパク質抗体の免疫原性エピトープに対して有害な影響を及ぼし得ることが知られているが、驚くべきことに、本発明において、このような影響は見られず、タンパク質は保護エピトープに対して反応を惹起できる状態のままである。
【００１６】
細菌細胞表面上の表面付着因子タンパク質および宿主組織内のリガンドは厳重に相互作用し、その結果、細菌が宿主に付着する。付着はしばしば細菌の生存に必要であり、細菌が宿主防御メカニズムおよび抗生物質の攻撃をくぐりぬける助けをする。細菌がうまく宿主組織に付着し、コロニー化すると、その生理機能は劇的に変化し、毒素および酵素などの損傷成分が分泌される。さらに、付着性細菌はしばしばバイオフィルムを生成し、ほとんどの抗生物質の殺菌効果に対して素速く耐性になる。
表面付着因子タンパク質の代表例としては、フィブロネクチン結合タンパク質、フィブリノゲン結合タンパク質、コラーゲン結合タンパク質およびビトロネクチン結合タンパク質が挙げられる。これらの付着因子は細胞外マトリックス成分フィブリノゲン、フィブロネクチン、コラーゲンおよびビトロネクチンを特異的に認識し、結合する。
【００１７】
フィブロネクチン結合タンパク質
フィブロネクチン（Ｆｎ）は、動物のＥＣＭおよび体液において見いだされる４４０ｋＤａ糖タンパクである。フィブロネクチンの第一の生物学的機能は、適当なインテグリンを発現する細胞の付着に関して基質として作用するその能力に関連するようである。いくつかの細菌種がフィブロネクチンと特異的に結合し、フィブロネクチン含有低質に付着することが証明されている。ほとんどのエス・アウレウス分離株はＦｎと結合するが、様々な程度で結合し、このことは細菌表面上に発現される表面付着因子分子の数の多様性を反映する。Ｆｎとエス・アウレウス間の相互作用は非常に特異性である（Ｋｕｕｓｅｌａ １９７８）。Ｆｎ結合は、１１０ｋＤａの分子量を有する、ＦｎＢＰ−ＡおよびＦｎＢＰ−Ｂと称する２つの表面が露出したタンパク質により媒介される。第一Ｆｎ結合部位は、３〜５回繰り返す３５〜４０アミノ酸のモチーフからなる。これらの遺伝子はクローンされ、配列決定されている（Ｊｏｎｓｓｏｎ １９９１）。
【００１８】
ＷＯ−Ａ−８５／０５５５３は、フィブロネクチン−、フィブリノゲン、コラーゲン、および／またはラミニン結合能力を有する細菌細胞表面タンパク質を開示している。
米国特許第５３２０９５１号および第５５７１５１４号（Ｈｏｏｋら）は、フィブロネクチン結合タンパク質Ａ（ｆｎｇＡ）遺伝子配列、およびこの配列に基づく生成物および方法を開示している。
【００１９】
米国特許第５１７５０９６号（Ｈｏｏｋら）は、ｆｎｂＢの遺伝子配列、ハイブリッドＤＮＡ分子（ｆｎｂＢ）およびこの配列に基づく生物学的産物および方法を開示している。
米国特許第５６５２２１７号は、定義された配列を有するエス・アウレウスから得られるハイブリッドＤＮＡ分子によりエンコードされる結合活性を有する単離および精製タンパク質を開示している。
米国特許第５４４００１４号は、ブドウ球菌感染症により引き起こされる乳腺炎に対する反芻動物の免疫化、傷の治療、タンパク質レセプターのブロッキング、他の動物の免疫化、または診断検定における使用のために用いることができるエス・アウレウスのフィブロネクチン結合タンパク質のＤ３相同性単位内のフィブロネクチン結合ペプチドを開示している。
【００２０】
米国特許第５１８９０１５号は、哺乳動物におけるフィブロネクチンと結合する能力を有するエス・アウレウス細菌株のコロニー化の予防的治療のための方法であって、フィブロネクチンと結合する能力を有するエス・アウレウス細菌株により引き起こされる感染症の発生を予防するために、治療を必要とする哺乳動物に、予防的に有効な量のフィブロネクチン結合特性を有するタンパク質を投与することを含む方法を開示し、ここにおいて、タンパク質は８７ｋＤａ〜１６５ｋＤａの分子量を有する。
米国特許第５４１６０２１号は、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）から得られるフィブロネクチン結合タンパク質をエンコードするＤＮＡとイー・コリに含まれるエス・ディスガラクティエから得られるフィブロネクチン結合タンパク質をエンコードするＤＮＡを含むプラスミド、エス・ディスガラクティエからのフィブロネクチン結合タンパク質をエンコードするＤＮＡおよびエス・ディスガラクティエからのフィブロネクチンをエンコードするＤＮＡにより形質転換されたイー・コリ微生物を開示している。
【００２１】
コラーゲン結合タンパク質
コラーゲンは軟骨の主な構成成分である。コラーゲン（Ｃｎ）結合タンパク質は通常、ブドウ球菌株により発現される。エス・アウレウスのコラーゲン結合表面付着因子タンパク質は、ブドウ球菌感染症における発病のメカニズムの重要な部分を構成するプロセスにおいて軟骨に付着する（Ｓｗｉｔａｌｓｋｉ １９９３）。エス・アウレウスによるコラーゲン結合は、これだけではないが、少なくとも関節炎および敗血症に関与することが判明している。１３３、１１０および８７ｋＤａの分子量を有するコラーゲン付着因子（ＣＮＡ）（Ｐａｔｔｉ，Ｊ．ら、１９９２）が同定されている。異なる分子量を有するＣＮＡを発現する株は、そのコラーゲン結合能力に差はない（Ｓｗｉｔａｌｓｋｉ １９９３）。
敗血症性関節炎または骨髄炎と診断された患者の関節から回収されるブドウ球菌株は、ほぼ必ずと言っていいほどコラーゲン結合タンパク質を発現するが、創傷感染から得られる分離株でこの付着因子を発現するものは著しく少ない（Ｓｗｉｔａｌｓｋｉら １９９３）。同様に、骨髄炎の患者から単離されたエス・アウレウス株はしばしば骨特異性タンパク質、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）を認識する表面付着因子タンパク質を有する（Ｒｙｄｅｎら、１９８７）。関節空間内の関節軟骨のエス・アウレウスコロニー化は、敗血症性関節炎の発症に寄与する重要な因子であるらしい。
【００２２】
ＷＯ９２／０７００２は、コラーゲン結合活性を有するタンパク質またはポリペプチドをコードするエス・アウレウスからのヌクレオチド配列および該ヌクレオチド配列を含むプラスミドまたはファージを含むハイブリッドＤＮＡ分子を開示している。
コラーゲン結合タンパク質を発現するイー・コリ株、組み換えＤＮＡにより形質転換された微生物、コラーゲン結合タンパク質またはポリペプチドを産生する方法、およびコラーゲン結合タンパク質またはポリペプチドのタンパク質配列も開示されている。
エス・アウレウスコラーゲン結合タンパク質をエンコードする遺伝子ｃｎａのクローニング、配列決定、および発現が報告されている（Ｐａｔｔｉ，Ｊら、１９９２）。
ｃｎａ遺伝子は、グラム陽性菌から単離される表面タンパク質に特徴的な構造特性を含む１３３ｋＤａ付着因子をエンコードする。
【００２３】
最近、リガンド結合部位がコラーゲン結合タンパク質のＮ−末端側の半分内に特定された（Ｐａｔｔｉ，Ｊら、１９９３）。表面付着因子タンパク質の異なるセグメントに対応する組み換えタンパク質のコラーゲン結合活性を分析することにより、相当のコラーゲン結合活性を有する１６８アミノ酸長のタンパク質フラグメント（アミン酸残基１５１〜３１８に対応）が同定された。ＮまたはＣ末端においてこのタンパク質を切断すると、リガンド結合活性が失われるが、円偏光二色性分光分析により示されるようにタンパク質において構造変化が起きた。
Ｐａｔｔｉら（１９９５）は、ｃｎａ遺伝子によりエンコードされるエス・アウレウス付着因子におけるコラーゲン結合エピトープを開示している。その研究において、著者らは前記タンパク質の配列に由来するペプチドを合成し、抗体を産生するためにこれらを使用した。これらの抗体の内のいくつかはタンパク質のコラーゲンに対する結合を阻害する。
【００２４】
ＷＯ９７／４３３１４は、コラーゲン結合タンパク質のある同定されたエピトープ（Ｍ５５、Ｍ３３、およびＭ１７）は保護抗体を生成させるために使用できることを開示している。
該出願は、エス・アウレウスコラーゲン結合タンパク質に対するコラーゲンの結合と相互作用するか、または完全にブロックする組成物を同定するために必要な重要な情報を提供するコラーゲン結合タンパク質の結晶構造も開示している。エス・アウレウスコラーゲン結合タンパク質および２５−アミノ酸ペプチドにおけるリガンド結合部位は、１２５Ｉ標識ＩＩ型コラーゲンに対するエス・アウレウスの結合を直接阻害することを特徴とする。
【００２５】
フィブリノゲン結合タンパク質
フィブリンは血餅の主成分であり、フィブリノゲン／フィブリンは埋め込まれた生体適合物質上に沈着する主な血漿タンパク質の一つである。細菌のフィブリノゲン／フィブリンへの付着が装置に関連する感染症の開始に重要であるということを示唆する証拠がかなり存在する。例えば、Ｖａｕｄａｕｘら（１９８９）により示されるように、エス・アウレウスはインビトロでフィブリノゲンでコートされたプラスチックに用量に依存した方法で付着する。加えて、血餅または心臓弁に対する損傷を模倣したモデルにおいて、Ｈｅｒｍａｎｎら（１９９３）は、エス・アウレウスはフィブリノゲンブリッジを介して表面に付着する血小板に強力に結合することを示した。エス・アウレウスはインビトロで形成された血餅中のフィブリノゲンに直接付着することができ、ブリッジとして作用する血漿から沈着したフィブリノゲンにより培養された内皮細胞に付着することができる（Ｍｏｒｅｉｌｌｏｎら、１９９５、Ｃｈｅｕｎｇら、１９９１）。ＶａｕｄａｕｘらおよびＭｏｒｅｉｌｌｏｎらにより示されるように、フィブリノゲン結合タンパク質クランピング因子（ＣｌｆＡ）が欠損した突然変異体は、心内膜炎のラットモデルにおいて、インビトロでのフィブリノゲン、外植カテーテル、血餅、および損傷を受けた心臓弁に対する付着が減少した（Ｖａｕｄａｕｘら、１９９５、Ｍｏｒｅｉｌｌｏｎら、１９９５）。
【００２６】
フィブリノゲンの付着因子（「クランピング因子」と称することが多い）はエス・アウレウス細胞の表面上に位置する。溶液中での細菌とフィブリノゲン間の相互作用の結果、細菌細胞が即座に凝集する。フィブリノゲン上の結合部位はダイマーフィブリノゲン糖タンパク質のγ鎖のＣ末端に位置する。親和力は非常に高く、凝集は低濃度のフィブリノゲンで起こる。科学者らは最近、クランピング因子が固相フィブリノゲン、血餅、および損傷を受けた心臓弁への付着も促進することを示している（ＭｃＤｅｖｉｔｔら、１９９４；Ｖａｕｄａｕｘら、１９９５；Ｍｏｒｅｉｌｌｏｎら、１９９５）。
エス・アウレウスにおける２つの遺伝子が２つのフィブリノゲン結合タンパク質ＣｌｆＡおよびＣｌｆＢをコードすることが見いだされた。遺伝子ｃｌｆＡはクローンされ、配列決定され、９２ｋＤａのポリペプチドをコードすることが見いだされた。ＣｌｆＡはフィブリノゲンのγ鎖と結合し、ＣｌｆＢはαおよびβ鎖と結合する（Ｅｉｄｈｉｎら、１９９８）。ＣｌｆＢは推定分子量８８ｋＤａ、見かけの分子量１２４ｋＤａを有する、可溶性および固定化フィブリノゲンの両方に結合し、クランピング因子として作用する細胞壁に結合したタンパク質である。
【００２７】
クランピング因子タンパク質の遺伝子（ＣｌｆＡと表示）はクローンされ、配列決定され、分子レベルで詳細に分析された（ＭｃＤｅｖｉｔｔら、１９９４、ＭｃＤｅｖｉｔｔら、１９９５）。予想されるタンパク質は、９３３アミノ酸から構成される。３９残基のシグナル配列はＮ末端にあり、その後に５２０残基の領域（領域Ａ）が続き、これはフィブリノゲン結合ドメインを含有する。ジペプチドセリン−アスパルテートの１５４の繰り返しからなる３０８残基領域（領域Ｒ）がその後に続く。Ｒ領域配列は、１８塩基対繰り返しＧＡＹ ＴＣＮ ＧＡＹ ＴＣＮ ＧＡＹ ＡＧＹ（Ｙはピリミジンであり、Ｎは任意の塩基である）によりエンコードされる。ＣｌｆＡのＣ末端は、タンパク質を細胞壁、膜アンカー、およびＣ末端の正に荷電した残基に固定するＬＰＤＴＧモチーフなどのグラム陽性菌の多くの表面タンパク質中に存在する特徴を有する。
【００２８】
血小板インテグリンαＩＩｂβ３はフィブリノゲンのγ鎖のＣ末端を認識する。これは凝集中の血液凝固の開始における重大な事象である。ＣｌｆＡは血小板凝集をブロックでき、γ鎖のＣ末端に対応するペプチド（１９８−４１１）はインテグリンおよびフィブリノゲンと相互作用するＣｌｆＡの両方をブロックできるので、ＣｌｆＡおよびαＩＩｂβ３はフィブリノゲンγ鎖上の正確に同じ部位を認識するようである（ＭｃＤｅｖｉｔｔら、１９９７）。αＩＩｂβ３のフィブリノゲン結合部位は、「ＥＦハンド」と称するＣａ２＋結合決定因子の近くにあるか、または重複する。ＣｌｆＡ領域ＡはいくつかのＥＦハンド様モチーフを有する。３〜５ｍＭの範囲のＣａ２＋の濃度は、これらのＣｌｆＡ−フィブリノゲン相互作用をブロックし、ＣｌｆＡタンパク質の二次構造を変化させる。ＣｌｆＡ ＥＦハンドに影響を及ぼす突然変異はフィブリノゲンとの相互作用を軽減または防止する。Ｃａ２＋およびフィブリノゲンγ鎖はＣｌｆＡ領域Ａの同じ部位に結合するか、または重複するようである。
【００２９】
白血球インテグリンのα鎖、αＭβ２は、２００アミノ酸（ＡまたはＩドメイン）の挿入を有し、これはリガンド結合活性の原因である。Ｉドメインにおける新規金属イオン依存性付着部位（ＭＩＤＡＳ）モチーフはリガンド結合に必要とされる。認識されるリガンドにはフィブリノゲンが含まれる。フィブリノゲン上の結合部位はγ鎖にある（残基１９０〜２０２）。カンジダ・アルビカンスは、白血球インテグリンとよく似た性質を有する表面タンパク質、αＩｎｔｌｐを有することが近年報告された。表面タンパク質は、ＭＩＤＡＳモチーフを包含するＭβ２のＩドメインと相同性であるアミノ酸配列を有する。さらに、Ｉｎｔｌｐはフィブリノゲンと結合する。
【００３０】
ＣｌｆＡ領域Ａはさらに、αＩｎｔｌｐと相同性である配列もある程度示す。ＣｌｆＡ領域Ａ配列の調査により有効なＭＩＤＡＳモチーフが明らかになった。ＣｌｆＡにおけるＭＩＤＡＳモチーフのＤｘＳｘＳ部分における推定カチオン配位残基における突然変異の結果、フィブリノゲン結合が著しく減少する。αＭβ２のγ鎖結合部位に対応するペプチド（１９０−２０２）は、Ｏ’ＣｏｎｎｅｌｌらによりＣｌｆＡ−フィブリノゲン相互作用を阻害することが示されている（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ、１９９８）。したがって、ＣｌｆＡは２つの別個の部位でフィブリノゲンのγ鎖と結合できるようである。ＣｌｆＡ上のリガンド結合部位は真核細胞インテグリンにより採用されるものと類似し、二価カチオン結合ＥＦハンドおよびＭＩＤＡＳモチーフを含む。
【００３１】
推定分子量約８８ｋＤａおよび見かけの分子量約１２４ｋＤａを有するフィブリノゲン結合タンパク質ＣｌｆＢも公知である。ＣｌｆＢは細胞壁結合タンパク質であり、可溶性および固定化フィブリノゲンの両方と結合する。加えて、ＣｌｆＢはフィブリノゲンのαおよびβ鎖の両方と結合し、クランピング因子として作用する。
細胞外マトリックスと結合するフィブリノゲン結合ＣｌｆＡおよびＣｌｆＢに関連するタンパク質が見いだされている。ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤおよびＳｄｒＥタンパク質は一次配列および構造機構においてＣｌｆＡおよびＣｌｆＢタンパク質に関連し、また細胞表面上に局在化する。細胞表面上に局在化するこれらのタンパク質のＡ領域に関して、タンパク質は血漿中のタンパク質、細胞外マトリックスまたは宿主細胞の表面上の分子と相互作用する。ＳｄｒＣは細胞外マトリックスタンパク質、例えばビトロネクチンと結合することができる。ＳｄｒＥも細胞外マトリックスと結合することができ；例えばＳｄｒＥは骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）と結合する。
【００３２】
ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＣｌｆＡおよびＣｌｆＢのＡ領域において、コンセンサスＴＹＴＦＴＤＹＶＤモチーフを誘導するために使用できる高度に保存されたアミノ酸配列が存在することが見いだされた。このモチーフは細菌感染症に対して広範囲の免疫を付与する多成分ワクチンにおいて使用でき、また広範囲の受動免疫を付与するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を産生するために使用できる。別の具体例において、免疫を付与するために、または保護抗体を誘発するために、ＳｄｒおよびＣｌｆタンパク質ファミリーに由来する様々な配列モチーフの任意の組み合わせ（Ｔ／Ｉ）（Ｙ／Ｆ）（Ｔ／Ｖ）（Ｆ）（Ｔ）（Ｄ／Ｎ）（Ｙ）（Ｖ）（Ｄ／Ｎ）を使用できる。
【００３３】
ＭＨＣ−ＩＩ類似タンパク質
フィブリノゲン、フィブロネクチンおよびコラーゲンに加えて、エス・アウレウス株は、その多くが付着性マトリックスタンパク質のファミリーに属するビトロネクチンなどの他の付着性真核細胞タンパク質に関連する（Ｃｈａｔｗａｌら、１９８７）。米国特許第５６４８２４０号は、約７０ｋＤａの分子量を有するエス・アウレウスの広範囲の付着因子をエンコードする遺伝子を含むＤＮＡセグメントを開示している。この付着因子は、フィブロネクチンまたはビトロネクチンと結合することができ、約３０アミノ酸のＭＨＣ ＩＩ様単位を含む。このタンパク質の結合特異性をさらに分析すると、これは合成ペプチドと結合する点でＭＨＣ ＩＩ抗原と機能的に類似していることが明らかになる。従って、細胞外マトリックスタンパク質に対する細菌付着を媒介することに加えて、宿主の免疫系を抑制することにより、ブドウ球菌感染症に関与し得る。
【００３４】
スタフィロコッカス・エピデルミディスからのＳｄｒタンパク質
スタフィロコッカス・エピデルミディスは凝固酵素陰性菌であり、人間の皮膚の一般的な常在菌であり、しばしば異物感染症を引き起こす。病原性は、人工弁、整形外科用装置、ならびに静脈内および腹膜透析カテーテルなどの留置医療装置と生物体がまず付着し、その後、その上にバイオフィルムを形成する生物体の能力により促進される。装置に関連する感染症は、医療の成功を危うくし、患者の死亡率を著しく増大させる。従って、エス・エピデルミディス感染症の発生を制御または防止できるワクチンを開発できることは、同時に凝固酵素陽性および凝固酵素陰性菌の両方を包含する広範囲の細菌からの感染症を予防または治療できる複合ワクチンの開発と同様に非常に重要である。
エス・エピデルミディスにより発現される３つのＳｄｒ（セリン−アスパルテート（ＳＤ）繰り返し領域）タンパク質は、ＳｄｒＦ、ＳｄｒＧおよびＳｄｒＨと表示され、これらのタンパク質のアミノ酸配列およびその核酸配列はＷＯ００／１２１３１（出典明示により本発明の一部として参照される）に示されている。
【００３５】
本発明に従って、前記の表面付着因子タンパク質の少なくとも１つと接合した少なくとも１種の多糖抗原を含む免疫原性組成物として有用な接合体が提供される。加えて、多糖抗原および表面付着因子タンパク質に対する抗体は通常の手段を用いて産生される。従って、ＳｄｒＧなどの表面付着因子タンパク質を含む免疫原性組成物は、凝固酵素陽性菌および凝固酵素陰性菌の両方に由来するものを含む広範囲の細菌感染症を治療するために使用される。
本発明の接合体の他の成分は、院内病原菌に由来する少なくとも１種の多糖抗原を含む。このような院内病原菌としては、これらに限定されないが、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）および他の凝固酵素陰性ブドウ球菌（ＣｏＮＳ）、エンテロコッカス種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、エンテロバクター種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）およびシュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）が挙げられる。
【００３６】
本発明の一具体例において、多糖抗原は、エス・アウレウスＣＰ５およびＣＰ８の少なくとも１つを含む。
本発明のもう一つ別の具体例において、多糖抗原は、エス・アウレウスおよび／またはエス・エピデルミディスにより発現されるようなＰＳ／Ａ、ＰＮＳＧ、ＰＮＡＧおよびＰＩＡのうちの少なくとも１つを含む。
【００３７】
免疫原性組成物の調製および使用
免疫原性組成物は、本明細書に開示されるような多糖抗原−表面付着因子タンパク質接合体から調製される。免疫原性組成物は、多糖抗原および表面付着因子キャリアタンパク質の両方に対する抗体を産生する免疫応答を惹起する。
免疫原性組成物は、本明細書において開示されるようなオリゴ糖抗原−表面付着因子タンパク質接合体からも調製される。免疫原性組成物は、オリゴ糖抗原および表面付着因子キャリアタンパク質の両方に対する抗体を産生する免疫応答を惹起する。
【００３８】
免疫原性組成物としての使用に好適な、本発明において提供される接合体は、これらに限定されないが、以下のものを包含する：
（ｉ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）などのエス・アウレウスのフィブリノゲン結合タンパク質またはペプチドと接合するＣＰ５、またはその有用なフラグメント、またはこれと十分高度に相同性であるタンパク質またはフラグメント；または
（ｉｉ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）などのエス・アウレウスのフィブリノゲン結合タンパク質またはペプチドと接合するＣＰ８、またはその有用なフラグメント、またはこれと十分高度に相同性であるタンパク質またはフラグメント；または
（ｉｉｉ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）などのエス・アウレウスのフィブリノゲン結合タンパク質またはペプチドと接合するＰＩＡ、またはその有用なフラグメント、またはこれと十分高度に相同性であるタンパク質またはフラグメント；または
（ｉｖ）ＳｄｒＧなどのエス・エピデルミディスのフィブリノゲン結合タンパク質またはペプチドと接合するＣＰ５、またはその有用なフラグメント、またはこれと十分高度に相同性であるタンパク質またはフラグメント；または
（ｖ）ＳｄｒＧなどのエス・エピデルミディスのフィブリノゲン結合タンパク質またはペプチドと接合するＣＰ８、またはその有用なフラグメント、またはこれと十分高度に相同性であるタンパク質またはフラグメント；または
（ｖｉ）ＳｄｒＧなどのエス・エピデルミディスのフィブリノゲン結合タンパク質またはペプチドと接合するＰＩＡ、またはその有用なフラグメント、またはこれと十分高度に相同性であるタンパク質またはフラグメント。
【００３９】
各例において、任意の接合体（ｉ）〜（ｖｉ）から調製された免疫原性組成物は、エス・アウレウスなどの凝固酵素陽性菌、ならびにエス・エピデルミディスなどの凝固酵素陰性菌からの感染症に対して患者を免疫化するために有用である。
表面付着因子キャリアタンパク質がフィブリノゲン結合タンパク質である前記の接合体（ｉ）〜（ｖｉ）に加えて、本発明はさらに、表面付着因子キャリアタンパク質が、例えばフィブロネクチン結合タンパク質、コラーゲン結合タンパク質およびビトロネクチン結合タンパク質などの任意のブドウ球菌表面付着因子タンパク質である接合体を包含する。本発明はさらに、多糖抗原がＰＳ／Ａ、ＰＮＡＧまたはＰＮＳＧ、またはエス・アウレウス、エス・エピデルミディスおよび他のＣｏＮｓ、エンテロコッカス種、カンジダ・アルビカンス、エンテロバクター種、ヘモフィルス・インフルエンゼ、クレブシエラ・ニューモニエ、エシェリキア・コリ、およびシュードモナス・エルジノーサなどの院内病原微生物からの他の多糖抗原であり得ることも意図する。
【００４０】
多糖をタンパク質に接合するための多くの方法が当該分野において公知であり、本発明における使用に適している。一般に、多糖を活性化させるか、または他の方法で接合しやすくする、すなわち、少なくとも１つの部分をタンパク質または他の分子と共有結合できるようにしなければならない。多くのこのような方法は当該分野において公知である。例えば、米国特許第４３５６１７０号（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ）は、多糖上にアルデヒド基を生成させるために過ヨウ素酸を使用し、次いでシアノボロヒドリドを用いて還元的アミノ化を行うことを記載している。米国特許第４６６３１６０号は（Ｔｓａｙら）もアルデヒド基を生成させるために過ヨウ素酸を使用したが、次にシアノボロヒドリドなどの還元剤の存在下でのシッフ塩基反応で４〜１２の炭素部分（縮合剤の存在下で調製）で誘導化されたタンパク質に多糖を結合させた。米国特許第４６１９８２８号（Ｇｏｒｄｏｎ）は、多糖を活性化するために臭化シアンを使用し、次いで４〜８個の炭素原子のスペーサーブリッジによりタンパク質と接合させた。さらに他の接合法も当該分野において公知である。
【００４１】
本発明の一具体例において、ＣＰはリンカー３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）で活性化され、これによりＣＰにおけるＮ−アセチルマンノースアミノウロン酸のカルボジイミド活性化カルボキシレート基がＰＤＰＨのヒドラジド基とカップリングする（図８）。ＭＳＣＲＭＡＭＭキャリアタンパク質はブロモ酢酸のＮ−ヒドロキシスクシイミドエステルでのリシン残基のブロモアセチル化により活性化される（図７）。ＰＤＰＨ−チオール化ＣＰを次いで、チオールでブロモアセチル化タンパク質における臭素を置換することにより活性化表面付着因子タンパク質に接合させると、結果として安定なチオエーテル結合が得られる（図９）。
ＣＰ−ＣＯＮＨＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＯＮＨ−表面付着因子タンパク質
【００４２】
本発明のＣＰ−表面抗原タンパク質接合体を含む免疫原性組成物をマウスにおいて試験し、不十分な免疫原性未接合ＣＰと比較して、向上された免疫原性を有することが示された（図１５〜２０）。加えて、莢膜多糖特異性抗体ならびにＣＰ−表面付着因子接合免疫原性組成物により誘発されたＣｌｆＡおよびＳｄｒＧ特異性抗体はどちらも対応する抗原を発現する生株と結合することが示された（表５および６）。これらの結果を考慮すると、本発明の免疫原性組成物はエス・アウレウスまたはエス・エピデルミディスなどの病原体により引き起こされる院内感染症に対して有用であると考えられる。また、ＣＰ−表面付着因子接合体により誘発される抗体が免疫原性組成物として傷に投与されるか、またはインビトロまたはインビボで医療装置またはポリマー生体適合物質をコートするために使用される場合、組成物は創傷部位または生体適合物質へのブドウ球菌菌の結合を防止または抑制するであろう。本発明に従って処理された接合体は、患者を院内感染に対して保護するための免疫原性組成物の調製において使用される。本明細書において用いられる「対象」とは、温血哺乳動物であり、例えば、ヒト、霊長類、ウマ、ウシ、イヌおよびネコを包含する。
【００４３】
注射可能な液体溶液または懸濁液を調製するために、接合体を免疫学的に許容される希釈剤または担体に通常の方法で添加することができる。
本発明の免疫原性組成物は、典型的には、任意の適当な医薬的に許容される担体、例えば生理食塩水または他の注射可能な液体中に接合体を分散させることにより形成される。本明細書において用いられる場合、「医薬的に許容される担体」なる語句は、医薬投与に適合するありとあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを包含することを意図される。医薬的に活性な物質に関するかかる媒体および薬剤の使用は当該分野において周知である。通常の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、かかる媒体を本発明の組成物において用いることができる。例えば、接合体調製物をリン酸ナトリウム緩衝塩溶液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．０〜８．０）中に多糖１ｍｌあたり１〜１００μｇの濃度で懸濁させる。本発明の免疫原性組成物の投与は、これらに限定されないが、非経口（例えば、皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮内）、経口および鼻内を包含する任意の周知の方法により行うことができる。免疫原性組成物の好ましい投与方法は非経口投与である。非経口投与に用いられる溶液または懸濁液は、次の成分を含む：無菌希釈剤、例えば、注射用水、塩溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、ポリプロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；キレート化剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩および等張性を調節するための薬剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは酸または塩基、例えば、塩酸または水酸化ナトリウムで調節することができる。非経口製剤はアンプル、使い捨て注射器あるいはガラスまたはプラスチック製の複数回投与用バイアル中に封入することができる。
【００４４】
注射可能な用途に適した免疫原性組成物は、無菌水性溶液（水溶性の場合）または分散液および無菌注射可能な溶液または分散液の即時調製用無菌粉末を含む。あらゆる場合において、組成物は無菌でなければならず、容易に注射可能である程度に流動性でなければならない。製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびその適当な混合物を含有する溶媒または分散媒体である。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合は必要とされる粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用により維持される。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成される。多くの場合において、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、および塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。組成物中に吸収を遅らせる薬剤、例えばアルミニウムモノステアレートおよびゼラチンを含めることにより注射可能な組成物の吸収が延長される。
【００４５】
無菌注射可能な溶液は、本発明の接合体を必要とされる量、適当な溶媒中に、単独または必要に応じて前記の成分と組み合わせて配合し、続いて濾過滅菌することにより調製される。一般に、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒体および前記のもののうち必要とされる他の成分を含有する無菌ビヒクル中に配合することにより調製される。無菌注射可能な溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製法は真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより活性成分の粉末と、あらかじめ無菌濾過されたその溶液からの任意のさらなる所望の成分が得られる。
ある具体例において、免疫原性組成物は１以上のアジュバントを含む。本明細書において定義されるように、「アジュバント」は本発明の免疫原性組成物の免疫原性を向上させる働きをする物質である。従って、アジュバントは免疫反応の追加免疫（ｂｏｏｓｔ）のために投与され、当業者には周知である。
【００４６】
組成物の有効性を向上させるための好ましいアジュバントとしては、これらに限定されないが、次のものが挙げられる：
（１）アルミニウム塩（ａｌｕｍ）、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど；
（２）水中油エマルジョン処方（他の特異的免疫刺激剤、例えばムラミルペプチド（以下参照）または細菌細胞壁成分の存在下または非存在下）、例えば
（ａ）ミクロフルイダイザー、例えば１１０型ミクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）を用いて１ミクロン以下の粒子に処方された５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５（任意に様々な量のＭＴＰ−ＰＥ（必要ではないが、以下参照）を含有してもよい）を含有するＭＦ５９（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１４８３７）、
（ｂ）１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロンブロックされたポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下参照）（ミクロ流動化されて１ミクロン以下のエマルジョンにされているか、または撹拌されて大きな粒子サイズのエマルジョンが生じるかのいずれか）を含有するＳＡＦ、
（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、および米国特許第４９１２０９４号（Ｃｏｒｉｘａ）に記載されている３−デアシル化モノホスホリピッドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ）からなる群からの１以上の細菌細胞壁成分を含有するＲｉｂｉアジュバント系（ＲＡＳ）（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）；
（３）サポニンアジュバント、例えばＱｕｉｌ ＡまたはＳＴＩＭＵＬＯＮ ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）（米国特許第５，０５７，５４０号）またはこれから生成する粒子、例えばＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）；
（４）細菌リポ多糖、合成リピッドＡ類似体、例えばアミノアルキルグルコサミンホスフェート化合物（ＡＧＰ）、またはその誘導体または類似体（Ｃｏｒｉｘａから入手可能で、米国特許第６，１１３，９１８号に記載されている）；例えばＡＧＰは２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシド（５２９（以前はＲＣ５２９と呼んだ）をも呼ばれ、水性形態または安定なエマルジョンとして処方される）、合成ポリヌクレオチド、例えばＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチド（米国特許第６，２０７，６４６号）；
（５）サイトカイン、例えばインターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８など）、インターフェロン（例えば、ガンマインターフェロン）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など；
（６）コレラ毒素（ＣＴ）（野生型または突然変異形態、例えば公開国際特許出願番号ＷＯ００／１８４３４に従ってアミノ酸２９位でグルタミン酸が別のアミノ酸、好ましくはヒスチジンにより置換されている場合（ＷＯ０２／０９８３６８およびＷＯ０２／０９８３６９も参照））などの細菌ＡＤＰ−リボシル化トキシンの無毒化突然変異体、狂犬病毒素（ＰＴ）、またはイー・コリ易熱性毒素（ＬＴ）、特にＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＣＴ−Ｓ１０９、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（例えば、ＷＯ９３／１３３０２およびＷＯ９２／１９２６５参照）；および
（７）組成物の有効性を向上させるために免疫刺激剤として作用する他の物質。
【００４７】
前記のように、ムラミルペプチドとしては、これらに限定されないが、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが挙げられる。
本発明の免疫原性組成物は、免疫原性反応を誘発するために十分な量で投与される。用量は、該免疫原性組成物を受容する個体の大きさ、体重または年齢に基づいて調節することができる。個体における抗体応答は、抗体価または殺菌活性について分析することによりモニターすることができ、必要に応じて追加免疫して反応を向上させることができる。
【００４８】
本発明の免疫原性組成物は、体液性免疫応答を誘発するために対象に投与される。対象は次に免疫原組成物に応答して生成されたイムノグロブリンの供給源（高度免疫イムノグロブリン）として作用する。免疫化された対象は血漿を供与し、これから通常の血漿分画技術により高イムノグロブリンが得られ、院内感染に対する耐性を付与するため、または院内感染を治療するために別の対象に投与される。
【００４９】
（実施例）
前記開示は一般に本発明を説明する。以下の実施例を参照することによりさらに完全に理解することができる。これらの実施例は、説明の目的のみで記載したものであり、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【００５０】
実施例１
エス・アウレウスＣＰ５およびＣＰ８多糖の精製
ＣＰ５およびＣＰ８それぞれの精製のためにエス・アウレウス株（ＡＴＣＣ＃４９５２１）およびＷｒｉｇｈｔ（ＡＴＣＣ＃４９５２１）を使用した。既に公開されている方法（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ｖａｎｎら、１９８４；Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ｈａｎｎｏｎら、１９８７）を変更した方法により細胞から多糖を精製した。２％ＮａＣｌで補足されたＣｏｌｕｍｉａブロス中で成長させた細胞を３時間３７℃で、リソスタフィン（１７５Ｕ／ｇの細胞）で、ＲＮＡｓｅおよびＤＮＡｓｅ（それぞれ０．１ｍｇ／ｇ）で４時間、３７℃で消化し、続いてプロナーゼ（１ｍｇ／ｇの細胞）で３時間、３７℃で消化した。１０ｍＭ ＣａＣｌ２の存在下、２５％および７５％エタノールで連続して沈降させることにより酵素消化物から粗ＣＰを調製した。０．０５〜０．５Ｍ ＮａＣｌの直線的勾配を用い、Ｑ−セファロースカラム上でアニオン交換クロマトグラフィーによりＣＰを次いでペレットから精製した。残留するテイコ酸を０．０５Ｍ ＮａｌＯ４で酸化した。透析後、ＣＰを次いでＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ３００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）カラム上で寸法排除クロマトグラフィーによりさらに精製した。フラクション中のＣＰの存在をエス・アウレウスＣＰ５およびＣＰ８特異性抗血清との反応性により決定した。
【００５１】
ＰＩＡを、Ｍａｃｋら（Ｍａｃｋ，Ｆｉｓｃｈｅｒら、１９９６）により記載されているように、熱抽出した静止期のエス・エピデルミディス細胞から精製し、ＰＩＡ含有培養上清と組み合わせた。抽出された物質および培養上清を、１０Ｋ膜を用いて濃縮し、処理して、核酸および残存するタンパク質を除去した。ゲル濾過または透析濾過を用いて粗ＰＩＡを分画した。アニオン交換クロマトグラフィーによりＰＩＡ抗原陽性物質をさらに分画し、ＰＩＡフラクション含有エステル結合サクシネートを精製した。非スクシニル化および部分的非Ｎ−アセチル化ＰＩＡを含有するフロースルーフラクションを、カチオン交換クロマトグラフィーにより精製した。ＰＳ／Ａ（ＰＮＳＧ、ＰＮＡＧ）を（Ｍａｒｉａ−Ｌｉｔｒａｎ，Ｋｒｏｐｅｃら、２００２）またはＭｃＫｅｎｎｅｙ，Ｐｏｕｌｉｏｔら、１９９９により記載されているようにして精製した。
【００５２】
実施例２
エス・アウレウスＣＰ５およびＣＰ８の分析
精製されたＣＰ５およびＣＰ８の化学的特徴化により、両多糖は事実上核酸および残存するタンパク質が無いことが示された（表１）。
ＨＰＡＥＣクロマトグラフィーにより決定された糖組成により、ＣＰ５およびＣＰ８におけるＦｕｃρＮＡｃおよびＭａｎρＮａｃＡの存在が明らかになった（図１）。Ｏ−デアシル化多糖の１Ｈ ＮＭＲスペクトル（図２）は、既に公開されているスペクトル（Ｖａｎｎ，Ｍｏｒｅａｕら、１９８７；Ｍｏｒｅａｕ，Ｒｉｃｈａｒｄｓら、１９９０）と類似しており、３種の単糖：２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−マンヌロン酸、２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｌ−フコースおよび２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−フコースの構造および存在が確認された。
精製されたＣＰ５、ＣＰ８およびＴＡは、対応する全細胞抗血清と反応した場合に二重免疫拡散検定における１つの沈降素のバンドにより確かめられるように免疫学的に異なっていた（データは省略）。
【００５３】
実施例３
表面付着因子タンパク質の精製
評価した表面付着因子タンパク質は：
エス・アウレウスＣｌｆ４０（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）−クランピング因子Ａの完全長Ａドメイン（アミノ酸（ＡＡ）４０−５５９）−図３。
エス・アウレウスＣｌｆ４１（Ｎ２Ｎ３）−Ｃｌｆ４０のポストプロテアーゼ部位フラグメント（ＡＡ２２３−５５９）−図４。
エス・エピデルミディスＳｄｒＧ（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）−ＳｄｒＧの完全長Ａドメイン（ＡＡ５０−５９７）−図５。
エス・エピデルミディスＳｄｒＧ（Ｎ２Ｎ３）−ＳｄｒＧのポストプロテアーゼ部位フラグメント（ＡＡ２７３−５９７）−図６。
コレラの表面付着因子タンパク質は、Ｉｎｈｉｂｉｔｅｘ，Ｉｎｃ．，Ａｌｐｈａｒｅｔｔａ，ＧＡ，ＵＳＡから入手した。
【００５４】
表面付着因子タンパク質のＨｉｓｔａｇマイナスバージョンをイー・コリプラスミド宿主株から精製した。イー・コリｐＬＰ１１３４ＢＬ２１（ＤＥ３）をエス・アウレウスＣｌｆ４１（Ｎ２，Ｎ３）について使用し、ｐＬＰ１１３５Ｂ２１（ＤＥ３）をエス・エピデルミディスＳｄｒＧ（Ｎ２，Ｎ３）精製に使用した。両タンパク質を、硫酸アンモニウム沈殿およびその後のセファクリルＱ−セファロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上でのイオン交換クロマトグラフィーにより細胞溶解物の可溶性フラクションから単離した。最終物質の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定すると９０％より高かった。
【００５５】
過剰発現されたエス・アウレウスＣｌｆ４０（Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３）またはＣｌｆ４１（Ｎ２，Ｎ３）、エス・エピデルミディスＳｄｒＧ（Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３）またはＳｄｒＧ（Ｎ２，Ｎ３）を含有するイー・コリ細胞を、約１３０００ｐｓｉで、Ｍｉｃｒｏｆｕｉｄｉｃｓ Ｍ１１０−Ｙミクロフルイダイザーを１回通過させて可溶化させた。細胞片を１７０００ｒｐｍで３０分間４℃で遠心分離することにより精製した。過剰発現されたタンパク質を、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＸＫカラムキレート化セファロースファーストフローおよびＱセファロースＨＰ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））を用いて上清から精製した。粗Ｈｉｓ標識されたタンパク質を、０．１Ｍ ＮｉＣｌ２を装填したキレート化セファロースファーストフローを用いたアフィニティ工程により上清から精製した。粗溶解物を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾールで平衡化させたカラム上にロードし、カラムを５カラム体積の緩衝剤で洗浄することにより未結合タンパク質をカラムから溶出させた。未結合タンパク質を次いで２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール緩衝液で溶出させ、バルクで集めた。タンパク質を次いでＱセファロースＨＰカラム上イオン交換クロマトグラフィーにより残存する不純物から精製した。
【００５６】
実施例４
エス・アウレウスＣＰ５−およびＣＰ−８表面付着因子キャリアタンパク質接合体免疫原性組成物の合成
エス・アウレウスＣＰ５およびＣＰ８多糖を、リンカーを含有するチオール基を多糖に導入し、ハロアセチル基をタンパク質キャリアに導入した後、本発明により提供された表面付着因子キャリアタンパク質とチオエーテル結合を介して別々に結合させた。アミン基をブロモ酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させることにより、ブロモアセチル基を表面付着因子タンパク質中に導入した（図７）。チオール化ＣＰを生成させるために、莢膜多糖におけるＮ−アセチルマンノースアミノウロン酸のカルボジイミド活性化カルボキシレート基をスルフヒドリル反応性ヒドラジドヘテロ二官能性リンカー３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ、図８）のヒドラジド基とカップリングさせた。ジチオトレイトール（ＤＴＴ）での還元により生成し、Ｓｄｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム上ＳＥＣにより精製されたＰＤＰＨ−チオール化ＣＰのチオールを、活性化タンパク質のブロモアセチル基と反応させると、ＣＰとタンパク質間の臭素置換により形成された共有チオエーテル結合が生じた（図９）。未反応ブロモアセチル基をシステアミン塩酸塩（２−アミノエタンチオール塩酸塩）で「キャップ」した。反応混合物を次いでＡｍｉｃｏｎ ＸＭ１００膜上で濃縮した。
【００５７】
実施例５
ＣＰ−およびＣＰ−８表面付着因子キャリアタンパク質接合体免疫原性組成物の特徴化
４Ｎトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）での加水分解後、ＣａｒｂｏＰａｃ−ＰＡ１カラム上ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤクロマトグラフィーによるＣＰの定量化により、接合免疫原性組成物をＣＰおよび表面付着因子キャリアタンパク質含量について分析した。タンパク質含量をＬｏｗｒｙ比色検定により決定した。接合免疫原性組成物の分子量を寸法排除クロマトグラフィーおよび多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）の組み合わせにより測定した。結果を表２および３に記載する。接合ＣＰおよび表面付着因子タンパク質の抗原性を二重免疫拡散法（図１０〜１３）およびドットブロット分析（図１４）により決定した。結果は、ＣＰの表面付着因子タンパク質への接合は、ＣＰまたはタンパク質のいずれかの抗原性を変更しないことを示す。ＣＰのタンパク質への接合は、接合体がニトロセルロース膜に結合する能力により確認された。未接合ＣＰはニトロセルロース膜に結合しなかった。
【００５８】
実施例６
マウスにおけるＣＰ−表面付着因子キャリアタンパク質接合体免疫原性組成物の免疫原性
接合免疫原性組成物を、ＣＰ５およびＣＰ８および表面付着因子タンパク質キャリアに対するＩｇＧ応答を誘発する能力について試験した。Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスを１マイクログラム用量（ＣＰ基準）で２週間間隔で３回、皮下的に（ＳＣ）免疫化した。接合免疫原性組成物の免疫原性を、アジュバントとしての１００マイクログラムのリン酸アルミニウムの存在下または不在下で試験した。各タンパク質免疫原性組成物候補を同様のプロトコルを用いて同様に評価した。エス・アウレウスＣＰおよび表面付着因子タンパク質に対する免疫応答を標準的抗原ＥＬＩＳＡによる各注射の１週間後に分析した（以下の実施例７および８参照）。
【００５９】
実施例７
エス・アウレウスＣＰ５およびＣＰ８−表面付着因子キャリアタンパク質接合体免疫原性組成物で免疫化されたマウスにおけるＣＰの抗体反応
結果（図１５および１６）は、ＣＰの表面付着因子タンパク質への共有結合の結果、莢膜多糖（ＣＰ）特異性ＩｇＧ反応が誘発されることを示す。このことは、ＣＰ−Ｔ細胞非依存性免疫反応はＣＰの表面付着因子キャリアタンパク質へのカップリング後にＴ細胞依存性免疫反応に変換されたことを示す。接合免疫原性組成物のリン酸アルミニウムへの吸着は、タンパク質キャリアとしてＳｄｒＧ（Ｎ２Ｎ３）を投与されたマウスを除いて約１０倍に増大した。ＣＰ５−およびＣＰ８−ＳｄｒＧ（Ｎ２Ｎ３）接合体のアジュバントへの吸着の結果、ＣＰに対する免疫応答は増大しなかったが、ＣＰの抗体反応はこの実験においてアジュバントと混合された（吸着されていないが）他の表面付着因子タンパク質接合体と同様に良好であった。ＣｌｆＡおよびＳｄｒＧのＮ１ドメインの欠失は、これらのタンパク質のキャリア特性に対して影響を及ぼさなかった。
【００６０】
実施例８
エス・アウレウスＣＰ５およびＣＰ８−表面付着因子キャリアタンパク質接合体でワクチン接種されたマウスにおける表面付着因子タンパク質抗体反応
接合表面付着因子タンパク質は、未接合のものと比較して類似した力価の表面付着因子タンパク質特異性抗体を誘発した（図１７〜２０）。このことにより、表面付着因子タンパク質のＣＰに対する接合により抗原性エピトープが修飾されないことが確認される。未接合ＣｌｆＡまたはＣＰ−ＣｌｆＡ接合体のリン酸アルミニウムへの吸着の結果、アジュバントを含まない同じ免疫原性組成物で免疫化されたマウスと比較して、マウスにおけるＣｌｆＡ抗体価が増大した。未接合ＳｄｒＧで免疫化されたマウスは、ＣＰ−ＳｄｒＧ接合免疫原性組成物で免疫化されたマウスと比較して低いＳｄｒＧ抗体価で反応した。未接合ＳｄｒＧのリン酸アルミニウムへの吸着の結果、ａｌｕｍなしで投与されたＣＰ−ＳｄｒＧ接合体により誘発されたレベルと比較してＳｄｒＧ抗体価が増大した。ＣＰ−ＳｄｒＧ接合体のａｌｕｍへの吸着はＳｄｒＧ抗体価を増大させなかった。
【００６１】
実施例９
ＣＰ表面付着因子キャリアタンパク質接合体により誘発された抗体による生菌上に発現されたＣＰおよび表面付着因子キャリアタンパク質の認識
マウスにおけるＣＰ−表面付着因子タンパク質接合体により誘発された抗体の生菌に対する結合をフローサイトメトリー分析により試験した。この検定において使用したエス・アウレウス株を表４に示す。ＳｄｒＧ接合体に対して誘発された抗体の分析について、ＳｄｒＧを発現するエル・ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）を使用した。結果は（表５および６）、莢膜多糖特異性抗体ならびに対応するＣＰ５−およびＣＰ８−表面付着因子タンパク質接合体により誘発されるＣｌｆＡまたはＳｄｒＧ特異性抗体はどちらも対応する抗原を発現する生株に結合することを示す。これにより、ＣＰの表面付着因子タンパク質に対する接合は、ＣＰ上に存在する自然に発現されたエピトープおよび表面付着因子タンパク質抗原に対する免疫反応を変更しないことが示される。
【００６２】
実施例１０
フローサイトメトリー分析法
使用したエス・アウレウス株は次の通りであった：Ｎｅｗｍａｎ、ＮｅｗｍａｎのＣｌｆＡノックアウト突然変異体（Ｎｅｗｍａｎ ＣｌｆＡ：：ｅｍｒ）およびＷｒｉｇｈｔ（ＡＴＣＣ４９５２５）。ＣｌｆＡ発現を最大にするために、エス・アウレウス菌をトリプシンソイブロス中で静止期まで成長させた。莢膜発現を最大にするために、エス・アウレウス菌をＣｏｌｕｍｂｉａ２％ＮａＣｌ寒天（ＢＤ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）上で一夜成長させた。Ｎｅｗｍａｎ ＣｌｆＡ：：ｅｍｒ株を、５μｇ／ｍｌのエリスロマイシンの存在下で成長させて、ノックアウト突然変異を維持した。ＳｄｒＧ抗原認識を評価するためにＳｄｒＧを発現する組み換えラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ（Ｌ．Ｌａｃｔｉｓ））株を使用した。５μｇ／ｍｌのエリスロマイシンの存在下、Ｍ１７ブロス中、エル・ラクチス株を後期対数期まで成長させた。
【００６３】
細菌培養物を収穫し、１０ｍｌの冷１×ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中で２回洗浄し、分析前に氷上で保存した。細菌濃度を、ＵＶ−可視記録分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３０００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて１×ＰＢＳでＤ６００ｎｍ＝２．０に調節した。非特異性およびプロテインＡによるマウスＩｇＧの細胞表面に対する結合を排除するために、細菌調製物を全部、氷上で、１×ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中１０ｍｌの１：５０希釈度（２．３２ｍｇ ＩｇＧ）のウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）中で３０分間インキュベートした。ＣｌｆＡ結合の不在下での８型莢膜認識を評価するために、さらに３０分間高力価ＣｌｆＡ特異性ウサギ抗血清（Ｉｎｈｉｂｉｔｅｘ，Ａｌｐｈａｒｅｔｔａ，ＧＡ）（１：１００希釈）でインキュベーションすることにより、ＣｌｆＡエピトープをエス・アウレウス株Ｗｒｉｇｈｔ上でブロックした。インキュベーションのブロッキング後、細菌を、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより、１０ｍｌの冷１×ＰＢＳ中で２回洗浄した。細菌ペレットを１×ＰＢＳ中２．５％ＢＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）（ＰＢＳＡ）中に再懸濁させ、氷上で保存した。
【００６４】
検定をｔｉｔｅｒｔｕｂｅ（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）中で行った。試験動物から得られるプレブリード（ｐｒｅｂｌｅｅｄ）および高力価抗血清をＰＢＳＡ中に希釈し、０．５ｍｌの各血清希釈物を、２０μｌの細菌懸濁液を含有する適当な試験管に添加した。全試験管を撹拌し、氷上で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、各試験管を撹拌し、次いで３０００ＲＰＭで１０分間遠心分離した。細菌ペレットを２回０．５ｍｌの冷ＰＢＳＡ中で洗浄した。各ペレットを抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｌａｂｓ，Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ，Ｐａ）のＰＥ接合Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの０．５ｍｌの１：２００希釈物中に再懸濁させた。細菌を再懸濁させ、撹拌することにより混合した。試験管を氷上で３０分間インキュベートし、１５分間隔で２回撹拌した。このインキュベーション後、細菌をＰＢＳＡ中最終再懸濁液で洗浄した。ＦＡＣＳ分析まで試験管を氷上で保存した。
【００６５】
各ｔｉｔｅｒｔｕｂｅを１２×７５ｍｍポリスチレン試験管に移し、Ｂ−Ｄ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，ＭＡ）フローサイトメーターを用いて分析した。結果を、所定の抗血清の蛍光強度が同じ希釈度でのプレブリードで得られるシグナルより大きいならばプラスと採点した。結果を表７に示す。
前記考察および実施例は単にある具体例の詳細な説明を提示するためのものであると理解すべきである。従って、当業者には本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な修正および等価物を調製することが可能であることは明らかである。
本出願中に記載した全ての文献、他の刊行物、特許および特許出願は全体として本発明の一部として参照される。
【００６６】
【表１】
【００６７】
【表２】
【００６８】
【表３】
【００６９】
【表４】
【００７０】
【表５−１】
【表５−２】
【００７１】
【表６−１】
【表６−２】
【００７２】
【表７】
＊ＣｌｆＡ＝ＣｌｆＡ ＡドメインのＮ１，Ｎ２，Ｎ３またはＮ２，Ｎ３領域
ＳｄｒＧ＝ＳｄｒＧ ＡドメインのＮ１，Ｎ２，Ｎ３領域
【００７３】
参考文献：
【００７４】
【００７５】
【００７６】
【００７７】
【００７８】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、院内病原菌から得られる多糖抗原（または１以上の抗原性エピトープを表すそのオリゴ糖フラグメント）およびブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質を含む免疫原性多糖タンパク質接合体に関する。本発明はさらに、多糖−タンパク質接合体を含む免疫原性組成物、およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
毎年、米国において病院に入院している推定４０００００００人のうち約２００００００人が院内感染を発症している（Ａｎｏｎｙｏｍｏｕｓ １９９７）。死亡率は約４．４％であるので、院内感染のため毎年８８０００人が死亡している。米国における院内感染の費用は、１年あたり推定４５００００００００ドルである（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ １９９８）。これらの推定値は毎年行われる３１００００００人の外来患者の手術（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ’ ｗｅｂｓｉｔｅ)、１５０００００人の養護施設居住者、拡張看護施設、または外来治療を受けている者において発生する感染症を包含しない。
【０００３】
スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）および凝集酵素陰性ブドウ球菌（ＣｏＮＳ）、特にエス・エピデルミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）は、院内感染の大部分の原因であるグラム陽性日和見院内病原菌である。ブドウ球菌感染症はすべての院内感染症のほぼ２５％（約５０００００人）の原因である（Ｈａｌｅｙ，Ｃｕｌｖｅｒら、１９８５）（Ｂｏｙｃｅ １９９７）。一部の病院では入院患者全体の１％までがエス・アウレウス感染症にかかっている（ＳｔｏｒｃｈおよびＲａｊａｇｏｐａｌａｎ １９８６）。ブドウ球菌（エス・アウレウスおよびエス・エピデルミディス）は院内血流感染症の約４７％、手術部位感染症（ＳＳＩ）の２４％、および院内感染肺炎の１７％の原因である（Ａｎｏｎｙｏｍｏｕｓ １９９７）。院内エス・アウレウスおよびＣｏＮＳ感染症の患者の死亡率は５％〜６８％までの範囲で相当変化する（Ｎａｄａ，Ｉｃｈｉｙａｍａら、１９９６）；（Ｔｈｙｌｅｆｏｒｓ，Ｈａｒｂａｒｔｈら、１９９８）。
【０００４】
ブドウ球菌感染症は、範囲が広く、皮膚感染症、例えば、膿痂疹、できもの、創傷感染および埋め込み装置からの感染症から重度の命にかかわる感染症、例えば骨髄炎、心内膜炎および転移性合併症を伴う菌血症にまで及ぶ。このような多様性のために、ブドウ球菌に対する有効な免疫原性組成物の設計を非常に困難になる。薬剤耐性院内細菌の出現が急激に増加し、そのためにこのような設計がさらに困難になっている。メチシリン耐性エス・アウレウスは院内感染症の原因の約４０％である（Ｂｏｙｃｅ １９９７）。最近、バンコマイシン中間耐性エス・アウレウス（ＶＩＳＡ）が出現し、その拡大に関する不安がさらに大きくなっている。従って、院内感染症に対する有効な免疫原性組成物に対する需要が強く、そして急速に増大している。
【０００５】
莢膜多糖（ｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）
ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびＢ群ストレプトコッカスをはじめとする多くの病原菌の毒性における莢膜多糖（ＣＰ）の関与は、十分に証明されている。莢膜で覆われた細菌は、白血球による食菌作用に対して耐性であり、従って血液および組織に感染し得る。莢膜多糖に対する抗体は細菌莢膜の抗食細胞特性を中和するので（Ｋａｒａｋａｗａ、Ｓｕｔｔｏｎら、１９８８，Ｔｈａｋｋｅｒ、Ｐａｒｋら、１９８８）、ブドウ球菌莢膜は、人間におけるブドウ球菌感染症を予防するための免疫原性組成物の開発における主要な標的である。
【０００６】
エス・アウレウスの１２の公知莢膜血清型のうち、血清型５（ＣＰ５）および血清型８（ＣＰ８）は全臨床分離株の約８５〜９０％を占める（Ａｒｂｅｉｔ，Ｋａｒａｋａｗａら、１９８４、Ｋａｒａｋａｗａ，Ｆｏｕｒｎｉｅｒら、１９８５、Ｅｓｓａｗｉ，Ｎａ’ｗａｓら、１９９８、Ｎａ’ｗａｓ、Ｈａｗｗａｒｉら、１９９８）。ほとんどのメチシリン耐性エス・アウレウス分離株はＣＰ５を発現する（Ｓｏｍｐｏｌｉｎｓｋｙ，Ｓａｍｒａら、１９８５）。ＣＰ５およびＣＰ８に対する抗体は、インビトロのヒト多形核好中球による型特異性オプソニン作用による食菌現象を誘発し、動物において保護を付与する（Ｋａｒａｋａｗａ，Ｓｕｔｔｏｎら、１９８８、Ｆａｔｔｏｍ，Ｓａｒｗａｒら、１９９６）。
【０００７】
ほとんどの細菌莢膜多糖は、動物および人間において不十分な免疫原である。しかしながら、精製された多糖がタンパク質キャリア分子と接合するならば、これらは免疫原性およびＴ細胞依存性を獲得する。いくつかの研究所は、タンパク質と共有結合したＣＰ５およびＣＰ８からなる免疫原性接合体を合成した。これらの接合体は、マウスおよびヒトにおいて高度に免疫原性であり、食菌作用のためにマイクロカプセル化エス・アウレウスをオプソニン化する抗体を誘発する（Ｆａｔｔｏｍ，Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎら、１９９３、Ｇｉｌｂｅｒｔら、１９９４，Ｒｅｙｎａｕｄ−Ｒｏｎｄｉｅｒら、１９９１）。シュードモナス・エルジノーサ組み換え外毒素Ａに接合したＣＰ５を含有する一価免疫原性組成物は、免疫原性であり、健康な成人および末期の腎臓病の患者において良好な耐容性を示す（Ｗｅｌｃｈら、１９９６）。血液透析を受けている末期腎臓病の患者を含む二重盲検法において、シュードモナス・エルジノーサ組み換え外毒素Ａと共有結合したＣＰ５およびＣＰ８からなる二価接合体ワクチンは、約４０週間エス・アウレウス菌血症に対して部分的免疫を付与し、その後、防御は抗体レベルが減少するにつれて減少した（Ｓｈｉｎｅｆｉｅｌｄら、２００２）。この試験の結果は、さらに完全な防御をもたらすことができる改善された免疫原性組成物が必要とされていることを示す。
【０００８】
多糖付着因子（ＰＳ／Ａ；（Ｔｏｊｏ，Ｙａｍａｓｈｉｔａら、１９８８））、ポリ−Ｎ−スクシニルβ−１−６−グルコサミン（ＰＮＳＧ、（ＭｃＫｅｎｎｅｙ，Ｐｏｕｌｉｏｔら、１９９９））、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン表面多糖（ＰＮＡＧ、（Ｍａｒｉａ−Ｌｉｔｒａｎ，Ｋｒｏｐｅｃら、２００２））、または多糖細胞間付着因子（ＰＩＡ（Ｍａｃｋ，Ｆｉｓｈｅｒら、１９９６））と称する別の種類の細胞外多糖は、エス・アウレウスおよびエス・エピデルミディスの両方により発現される。ＰＩＡまたはＰＳ／Ａは直鎖β−１，６−結合グルコサミングリカンである。マウスをＰＳ／Ａ（ＰＮＳＧ、ＰＮＡＧ）で免疫化すると腎臓の転移増殖が減少し、インビトロで若干のＰＳ／Ａ（ＰＮＳＧ、ＰＮＡＧ）を産生するエス・アウレウス株で攻撃した後にマウスを死から防御する（ＭｃＫｅｎｎｅｙ，Ｐｏｕｌｉｏｔら、１９９９）。ＰＩＡは静脈内カテーテルに関連する感染症の発生機序において重要な役割を果たす（Ｒｕｐｐ，Ｕｌｐｈａｎｉら、１９９９；Ｒｕｐｐ，Ｕｌｐｈａｎｉら、１９９９；ＲｕｐｐおよびＦｅｙ ２００１；Ｒｕｐｐ，Ｆｅｙら、２００１）。個々のエス・エピデルミディス細胞間の接着を促進することに加えて、ＰＩＡは赤血球と結合し、ヘマグルチニンとして作用する（Ｆｅｙ，Ｕｌｐｈａｎｉら、１９９９）。
【０００９】
ブドウ球菌表面付着因子
ブドウ球菌は複数の表面付着因子（接着性マトリックス分子を認識する微生物表面成分と称する）を発現し、これらには、例えば、フィブロネクチン結合タンパク質、フィブリノゲン結合タンパク質、コラーゲン結合タンパク質およびビトロネクチン結合タンパク質が含まれる。これらの付着因子は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分、例えば、フィブロネクチン、フィブリノゲン、コラーゲンおよびビトロネクチンを特異的に認識し、結合する。エス・アウレウスにより発現される多数の接着因子は、様々な組織に対する接着および感染の代替法を提供することにより、その病原性に寄与する。ブドウ球菌付着因子の抗体は、細菌が哺乳動物宿主組織を侵襲することを防止するか、またはオプソニン作用による食菌作用を促進することにより疾患を軽減することができる。エス・アウレウスフィブロネクチン結合タンパク質Ａ（融合タンパク質として提供される）の一部で免疫化されたラットは、実験的心内膜炎から適度に保護された。フィブロネクチン結合タンパク質Ａの抗体を惹起するように設計された同様の免疫原性組成物をエス・アウレウス乳腺炎のマウスモデルにおいて試験した。免疫化されたマウスは対照マウスよりも重度の乳腺炎の症例が少なく、免疫化されたマウスの乳腺炎から回収される細菌は対照マウスよりも少なかった。１９および８７ｋＤａのフィブリノゲン結合タンパク質で免疫化されたマウスは、非免疫化対照と比較して乳腺炎の発病率が減少し、一方、コラーゲン結合タンパク質での免疫化は保護しなかった（Ｌｅｅ，Ｐｉｅｒ １９９７）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、多糖抗原を様々なタンパク質キャリアに接合させるためのこれらおよび他の試みにもかかわらず、院内感染を治療または予防するための有効な免疫原性組成物は現在のところない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、従って、院内病原菌に由来する少なくとも１種の多糖抗原、または少なくとも１種のブドウ球菌表面付着キャリアタンパク質に接合した少なくとも１種の多糖抗原（合成または天然の多糖の加水分解により調製）の１以上の抗原エピトープを表すオリゴ糖フラグメントを含む免疫原性多糖−タンパク質接合体を提供する。本発明の接合体は、院内病原菌の多糖抗原および表面付着因子キャリアタンパク質の両方に対して特異的な抗体反応を対象において惹起する際に有用な免疫原性組成物において用いられる。従って、これらの接合体は、エス・アウレウス、エス・エピデルミディスまたは他の院内病原菌により引き起こされる院内感染症に対して免疫化するために、また受動免疫化のための免疫グロブリンの生成に関しては、院内感染症の予防または重篤度の軽減のために使用することができる。
【００１２】
本発明の一態様において、少なくとも１種のブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質と接合した院内病原菌に由来する少なくとも１種の多糖抗原を含む免疫原性多糖タンパク質接合体が提供され、ここにおいて該接合体は、多糖抗原および表面付着因子キャリアタンパク質の両方に対する特異的抗体を生成する。
本発明のもう一つ別の態様において、少なくとも１種のブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質と接合した院内病原菌から得られる少なくとも１種の多糖抗原の１以上の抗原エピトープを表すオリゴ糖フラグメントを含む免疫原性多糖タンパク質接合体が提供され、ここにおいて、該接合体は、多糖抗原および表面付着因子キャリアタンパク質の両方に対する特異的抗体を生成する。
【００１３】
さらにもう一つ別の態様において、多糖抗原−表面付着因子タンパク質接合体を適当な担体または希釈剤との組み合わせにおいて含む免疫原性組成物が提供される。本発明の免疫原性組成物はさらにアジュバント、例えば、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムを含んでもよい。
さらにもう一つ別の態様において、哺乳動物において院内感染症に対する活性免疫を誘発する方法であって、このような感染症にかかっているヒトをはじめとする哺乳動物に、免疫原性量の本発明の免疫原性組成物を投与することを含む方法が提供される。
さらにもう一つ別の態様において、院内感染症に対する免疫治療薬の調製法であって、哺乳動物を本発明の免疫原性組成物で免疫化する工程、免疫化された哺乳動物から血漿を採集する工程、および集められた血漿から抗多糖抗体および抗表面付着因子抗体を含有する高度免疫グロブリンを収穫する工程を含む方法が提供される。高度免疫グロブリンは、院内感染症に対する受動免疫を誘発するために使用できる。
本発明の接合体は、多糖抗原および表面付着因子キャリアタンパク質の両方（両方とも毒性因子である）に対する抗体を惹起し、院内病原菌により引き起こされる疾患に対する免疫を付与する明確な利点を有する。すなわち、表面付着因子タンパク質それ自体が単に多糖抗原のタンパク質キャリアとして作用するだけでなく、免疫を付与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＧＬＣおよびＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析により決定されるエス・アウレウスＣＰ５およびＣＰ８の組成を示す。
【図２】デ−Ｏ−アセチル化エス・アウレウスＣＰ５およびＣＰ８の１Ｈ−ＮＭＲ分析を示す。
【図３】エス・アウレウス−ＣｌｆＡから得られるクランピング因子の概略図である。
【図４】エス・アウレウスＣｌｆＡに由来する組み換えタンパク質Ｃｌｆ４０およびＣｌｆ４１の概略図である。
【図５】エス・エピデルミディス−ＳｄｒＧから得られるクランピング因子の概略図である。
【図６】エス・エピデルミディスＳｄｒＧ：ＳｄｒＧ（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）およびＳｄｒＧ（Ｎ２Ｎ３）に由来する組み換えタンパク質の概略図である。
【図７】表面付着因子タンパク質のブロモアセチル化を示す。
【図８】エス・アウレウスＣＰの３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）での活性化を示す。
【図９】チオール化エス・アウレウスＣＰの表面付着因子タンパク質への接合を示す。
【図１０】ＣＰ特異性ウサギ抗血清に関する抗原性についてのＣＰ５−およびＣＰ８−ＳｄｒＧ（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）およびＣＰ５−およびＣＰ８−Ｃｌｆ４１（Ｎ２Ｎ３）接合体の分析を示す。
【図１１】ＣｌｆＡ特異性ウサギ抗血清に関する抗原性についてのＣＰ５−およびＣＰ８−Ｃｌｆ４１（Ｎ２Ｎ３）接合体の分析を示す。
【図１２】二重免疫拡散検定による抗原性についてのＣＰ５−およびＣＰ８−ＳｄｒＧ（Ｎ２Ｎ３）６ｘＨｉｓおよびＣＰ５−およびＣＰ８−Ｃｌｆ４０（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）６ｘＨｉｓ接合体の分析を示す。
【図１３】Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ免疫拡散検定による抗原性についてのＣＰ５−およびＣＰ８−ＳｄｒＧ（Ｎ２Ｎ３）およびＣＰ５−およびＣＰ８−ＦｎｂＡ接合体の分析を示す。
【図１４】ドットブロットによる接合体の分析を示す。
【図１５Ａ】ＳｄｒＧ（Ｎ２Ｎ３）に接合したエス・アウレウスＣＰ８に対する免疫応答を示す。
【図１５Ｂ】アジュバントを含む、ＳｄｒＧ（Ｎ２Ｎ３）に接合したエス・アウレウスＣＰ８に対する免疫応答を示す。
【図１５Ｃ】Ｃｌｆ４０（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に接合したエス・アウレウスＣＰ８に対する免疫応答を示す。
【図１５Ｄ】アジュバントを含む、Ｃｌｆ４０（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に接合したエス・アウレウスＣＰ８に対する免疫応答を示す。
【図１５Ｅ】アジュバントを含む、Ｃｌｆ４１（Ｎ２Ｎ３）に接合したエス・アウレウスＣＰ８に対する免疫応答を示す。
【図１５Ｆ】Ｃｌｆ４１（Ｎ２Ｎ３）に接合したエス・アウレウスＣＰ８に対する免疫応答を示す。
【図１５Ｇ】アジュバントを含む、ＳｄｒＧ（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に接合したエス・アウレウスＣＰ８に対する免疫応答を示す。
【図１５Ｈ】ＳｄｒＧ（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に接合したエス・アウレウスＣＰ８に対する免疫応答を示す。
【図１６Ａ】ＳｄｒＧ（Ｎ２Ｎ３）に接合したエス・アウレウスＣＰ５に対する免疫応答を示す。
【図１６Ｂ】アジュバントを含む、ＳｄｒＧ（Ｎ２Ｎ３）に接合したエス・アウレウスＣＰ５に対する免疫応答を示す。
【図１６Ｃ】Ｃｌｆ４０（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に接合したエス・アウレウスＣＰ５に対する免疫応答を示す。
【図１６Ｄ】アジュバントを含む、Ｃｌｆ４０（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に接合したエス・アウレウスＣＰ５に対する免疫応答を示す。
【図１６Ｅ】アジュバントを含む、Ｃｌｆ４１（Ｎ２Ｎ３）に接合したエス・アウレウスＣＰ５に対する免疫応答を示す。
【図１６Ｆ】Ｃｌｆ４１（Ｎ２Ｎ３）に接合したエス・アウレウスＣＰ５に対する免疫応答を示す。
【図１６Ｇ】アジュバントを含む、ＳｄｒＧ（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に接合したエス・アウレウスＣＰ５に対する免疫応答を示す。
【図１６Ｈ】ＳｄｒＧ（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に接合したエス・アウレウスＣＰ５に対する免疫応答を示す。
【図１７Ａ】アジュバントを含まない、未接合エス・アウレウスＣｌｆ４０（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図１７Ｂ】アジュバントを含まない、ＣＰ８に接合したエス・アウレウスＣｌｆ４０（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図１７Ｃ】アジュバントを含まない、ＣＰ５に接合したエス・アウレウスＣｌｆ４０（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図１７Ｄ】アジュバントを含む、ＣＰ５に接合したエス・アウレウスＣｌｆ４０（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図１７Ｅ】アジュバントを含む、ＣＰ８に接合したエス・アウレウスＣｌｆ４０（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図１７Ｆ】アジュバントを含む、未接合エス・アウレウスＣｌｆ４０（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図１８Ａ】アジュバントを含まない、ＣＰ５に接合したエス・アウレウスＣｌｆ４１（Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図１８Ｂ】アジュバントを含まない、ＣＰ８に接合したエス・アウレウスＣｌｆ４１（Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図１８Ｃ】アジュバントを含まない、未接合エス・アウレウスＣｌｆ４１（Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図１８Ｄ】アジュバントを含む、ＣＰ５に接合したエス・アウレウスＣｌｆ４１（Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図１８Ｅ】アジュバントを含む、ＣＰ８に接合したエス・アウレウスＣｌｆ４１（Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図１８Ｆ】アジュバントを含む、未接合エス・アウレウスＣｌｆ４１（Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図１９Ａ】アジュバントを含まない、ＣＰ５に接合したエス・エピデルミディスＳｄｒＧ（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図１９Ｂ】アジュバントを含まない、ＣＰ８に接合したエス・エピデルミディスＳｄｒＧ（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図１９Ｃ】アジュバントを含まない、未接合エス・エピデルミディスＳｄｒＧ（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図１９Ｄ】アジュバントを含む、ＣＰ５に接合したエス・エピデルミディスＳｄｒＧ（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図１９Ｅ】アジュバントを含む、ＣＰ８に接合したエス・エピデルミディスＳｄｒＧ（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図１９Ｆ】アジュバントを含む、未接合エス・エピデルミディスＳｄｒＧ（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図２０Ａ】アジュバントを含まない、ＣＰ５に接合したエス・エピデルミディスＳｄｒＧ（Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図２０Ｂ】アジュバントを含まない、ＣＰ８に接合したエス・エピデルミディスＳｄｒＧ（Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図２０Ｃ】アジュバントを含まない、未接合エス・エピデルミディスＳｄｒＧ（Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図２０Ｄ】アジュバントを含む、ＣＰ５に接合したエス・エピデルミディスＳｄｒＧ（Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図２０Ｅ】アジュバントを含む、ＣＰ８に接合したエス・エピデルミディスＳｄｒＧ（Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【図２０Ｆ】アジュバントを含む、未接合エス・エピデルミディスＳｄｒＧ（Ｎ２Ｎ３）に対する免疫応答を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
院内感染症は複数の毒性因子を含む。従って、一つの毒性決定因子のみを含有する免疫原性組成物と比較して、免疫原性組成物中に成分として含まれる毒性決定因子の組み合わせが防御を増大させる可能性が非常に高い。本発明の多糖抗原は、これらに限定されないが、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）および他の凝固酵素陰性ブドウ球菌（ＣｏＮＳ）、エンテロコッカス種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、エンテロバクター種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、およびシュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）をはじめとする様々な院内病原微生物に由来する。これらの抗原は全身性感染症における毒性因子であり、不十分な免疫源である。その免疫原性は、キャリアタンパク質への接合により向上させることができる。本発明の目的に関して、表面付着因子タンパク質は接着性マトリックス分子を認識する微生物表面成分である。これらはＩｎｈｉｂｉｔｅｘ Ｉｎｃ．（Ａｌｐｈａｒｅｔｔａ，ＧＡ、ＵＳＡ）からＭＳＣＲＡＭＭの登録商標で入手可能である。以下に記載するように、ブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質を多糖抗原のキャリアタンパク質として利用することにより、多糖がＴ細胞依存性抗原に変換され、かくして抗多糖ＩｇＧ応答が誘発される。さらに、接合体は感染症に対して防御し、哺乳動物宿主組織への細菌の付着の防止を助ける抗表面付着因子キャリアタンパク質抗体を誘発する。タンパク質−サッカライド接合法の化学反応はキャリアタンパク質抗体の免疫原性エピトープに対して有害な影響を及ぼし得ることが知られているが、驚くべきことに、本発明において、このような影響は見られず、タンパク質は保護エピトープに対して反応を惹起できる状態のままである。
【００１６】
細菌細胞表面上の表面付着因子タンパク質および宿主組織内のリガンドは厳重に相互作用し、その結果、細菌が宿主に付着する。付着はしばしば細菌の生存に必要であり、細菌が宿主防御メカニズムおよび抗生物質の攻撃をくぐりぬける助けをする。細菌がうまく宿主組織に付着し、コロニー化すると、その生理機能は劇的に変化し、毒素および酵素などの損傷成分が分泌される。さらに、付着性細菌はしばしばバイオフィルムを生成し、ほとんどの抗生物質の殺菌効果に対して素速く耐性になる。
表面付着因子タンパク質の代表例としては、フィブロネクチン結合タンパク質、フィブリノゲン結合タンパク質、コラーゲン結合タンパク質およびビトロネクチン結合タンパク質が挙げられる。これらの付着因子は細胞外マトリックス成分フィブリノゲン、フィブロネクチン、コラーゲンおよびビトロネクチンを特異的に認識し、結合する。
【００１７】
フィブロネクチン結合タンパク質
フィブロネクチン（Ｆｎ）は、動物のＥＣＭおよび体液において見いだされる４４０ｋＤａ糖タンパクである。フィブロネクチンの第一の生物学的機能は、適当なインテグリンを発現する細胞の付着に関して基質として作用するその能力に関連するようである。いくつかの細菌種がフィブロネクチンと特異的に結合し、フィブロネクチン含有低質に付着することが証明されている。ほとんどのエス・アウレウス分離株はＦｎと結合するが、様々な程度で結合し、このことは細菌表面上に発現される表面付着因子分子の数の多様性を反映する。Ｆｎとエス・アウレウス間の相互作用は非常に特異性である（Ｋｕｕｓｅｌａ １９７８）。Ｆｎ結合は、１１０ｋＤａの分子量を有する、ＦｎＢＰ−ＡおよびＦｎＢＰ−Ｂと称する２つの表面が露出したタンパク質により媒介される。第一Ｆｎ結合部位は、３〜５回繰り返す３５〜４０アミノ酸のモチーフからなる。これらの遺伝子はクローンされ、配列決定されている（Ｊｏｎｓｓｏｎ １９９１）。
【００１８】
ＷＯ−Ａ−８５／０５５５３は、フィブロネクチン−、フィブリノゲン、コラーゲン、および／またはラミニン結合能力を有する細菌細胞表面タンパク質を開示している。
米国特許第５３２０９５１号および第５５７１５１４号（Ｈｏｏｋら）は、フィブロネクチン結合タンパク質Ａ（ｆｎｇＡ）遺伝子配列、およびこの配列に基づく生成物および方法を開示している。
【００１９】
米国特許第５１７５０９６号（Ｈｏｏｋら）は、ｆｎｂＢの遺伝子配列、ハイブリッドＤＮＡ分子（ｆｎｂＢ）およびこの配列に基づく生物学的産物および方法を開示している。
米国特許第５６５２２１７号は、定義された配列を有するエス・アウレウスから得られるハイブリッドＤＮＡ分子によりエンコードされる結合活性を有する単離および精製タンパク質を開示している。
米国特許第５４４００１４号は、ブドウ球菌感染症により引き起こされる乳腺炎に対する反芻動物の免疫化、傷の治療、タンパク質レセプターのブロッキング、他の動物の免疫化、または診断検定における使用のために用いることができるエス・アウレウスのフィブロネクチン結合タンパク質のＤ３相同性単位内のフィブロネクチン結合ペプチドを開示している。
【００２０】
米国特許第５１８９０１５号は、哺乳動物におけるフィブロネクチンと結合する能力を有するエス・アウレウス細菌株のコロニー化の予防的治療のための方法であって、フィブロネクチンと結合する能力を有するエス・アウレウス細菌株により引き起こされる感染症の発生を予防するために、治療を必要とする哺乳動物に、予防的に有効な量のフィブロネクチン結合特性を有するタンパク質を投与することを含む方法を開示し、ここにおいて、タンパク質は８７ｋＤａ〜１６５ｋＤａの分子量を有する。
米国特許第５４１６０２１号は、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）から得られるフィブロネクチン結合タンパク質をエンコードするＤＮＡとイー・コリに含まれるエス・ディスガラクティエから得られるフィブロネクチン結合タンパク質をエンコードするＤＮＡを含むプラスミド、エス・ディスガラクティエからのフィブロネクチン結合タンパク質をエンコードするＤＮＡおよびエス・ディスガラクティエからのフィブロネクチンをエンコードするＤＮＡにより形質転換されたイー・コリ微生物を開示している。
【００２１】
コラーゲン結合タンパク質
コラーゲンは軟骨の主な構成成分である。コラーゲン（Ｃｎ）結合タンパク質は通常、ブドウ球菌株により発現される。エス・アウレウスのコラーゲン結合表面付着因子タンパク質は、ブドウ球菌感染症における発病のメカニズムの重要な部分を構成するプロセスにおいて軟骨に付着する（Ｓｗｉｔａｌｓｋｉ １９９３）。エス・アウレウスによるコラーゲン結合は、これだけではないが、少なくとも関節炎および敗血症に関与することが判明している。１３３、１１０および８７ｋＤａの分子量を有するコラーゲン付着因子（ＣＮＡ）（Ｐａｔｔｉ，Ｊ．ら、１９９２）が同定されている。異なる分子量を有するＣＮＡを発現する株は、そのコラーゲン結合能力に差はない（Ｓｗｉｔａｌｓｋｉ １９９３）。
敗血症性関節炎または骨髄炎と診断された患者の関節から回収されるブドウ球菌株は、ほぼ必ずと言っていいほどコラーゲン結合タンパク質を発現するが、創傷感染から得られる分離株でこの付着因子を発現するものは著しく少ない（Ｓｗｉｔａｌｓｋｉら １９９３）。同様に、骨髄炎の患者から単離されたエス・アウレウス株はしばしば骨特異性タンパク質、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）を認識する表面付着因子タンパク質を有する（Ｒｙｄｅｎら、１９８７）。関節空間内の関節軟骨のエス・アウレウスコロニー化は、敗血症性関節炎の発症に寄与する重要な因子であるらしい。
【００２２】
ＷＯ９２／０７００２は、コラーゲン結合活性を有するタンパク質またはポリペプチドをコードするエス・アウレウスからのヌクレオチド配列および該ヌクレオチド配列を含むプラスミドまたはファージを含むハイブリッドＤＮＡ分子を開示している。
コラーゲン結合タンパク質を発現するイー・コリ株、組み換えＤＮＡにより形質転換された微生物、コラーゲン結合タンパク質またはポリペプチドを産生する方法、およびコラーゲン結合タンパク質またはポリペプチドのタンパク質配列も開示されている。
エス・アウレウスコラーゲン結合タンパク質をエンコードする遺伝子ｃｎａのクローニング、配列決定、および発現が報告されている（Ｐａｔｔｉ，Ｊら、１９９２）。
ｃｎａ遺伝子は、グラム陽性菌から単離される表面タンパク質に特徴的な構造特性を含む１３３ｋＤａ付着因子をエンコードする。
【００２３】
最近、リガンド結合部位がコラーゲン結合タンパク質のＮ−末端側の半分内に特定された（Ｐａｔｔｉ，Ｊら、１９９３）。表面付着因子タンパク質の異なるセグメントに対応する組み換えタンパク質のコラーゲン結合活性を分析することにより、相当のコラーゲン結合活性を有する１６８アミノ酸長のタンパク質フラグメント（アミン酸残基１５１〜３１８に対応）が同定された。ＮまたはＣ末端においてこのタンパク質を切断すると、リガンド結合活性が失われるが、円偏光二色性分光分析により示されるようにタンパク質において構造変化が起きた。
Ｐａｔｔｉら（１９９５）は、ｃｎａ遺伝子によりエンコードされるエス・アウレウス付着因子におけるコラーゲン結合エピトープを開示している。その研究において、著者らは前記タンパク質の配列に由来するペプチドを合成し、抗体を産生するためにこれらを使用した。これらの抗体の内のいくつかはタンパク質のコラーゲンに対する結合を阻害する。
【００２４】
ＷＯ９７／４３３１４は、コラーゲン結合タンパク質のある同定されたエピトープ（Ｍ５５、Ｍ３３、およびＭ１７）は保護抗体を生成させるために使用できることを開示している。
該出願は、エス・アウレウスコラーゲン結合タンパク質に対するコラーゲンの結合と相互作用するか、または完全にブロックする組成物を同定するために必要な重要な情報を提供するコラーゲン結合タンパク質の結晶構造も開示している。エス・アウレウスコラーゲン結合タンパク質および２５−アミノ酸ペプチドにおけるリガンド結合部位は、１２５Ｉ標識ＩＩ型コラーゲンに対するエス・アウレウスの結合を直接阻害することを特徴とする。
【００２５】
フィブリノゲン結合タンパク質
フィブリンは血餅の主成分であり、フィブリノゲン／フィブリンは埋め込まれた生体適合物質上に沈着する主な血漿タンパク質の一つである。細菌のフィブリノゲン／フィブリンへの付着が装置に関連する感染症の開始に重要であるということを示唆する証拠がかなり存在する。例えば、Ｖａｕｄａｕｘら（１９８９）により示されるように、エス・アウレウスはインビトロでフィブリノゲンでコートされたプラスチックに用量に依存した方法で付着する。加えて、血餅または心臓弁に対する損傷を模倣したモデルにおいて、Ｈｅｒｍａｎｎら（１９９３）は、エス・アウレウスはフィブリノゲンブリッジを介して表面に付着する血小板に強力に結合することを示した。エス・アウレウスはインビトロで形成された血餅中のフィブリノゲンに直接付着することができ、ブリッジとして作用する血漿から沈着したフィブリノゲンにより培養された内皮細胞に付着することができる（Ｍｏｒｅｉｌｌｏｎら、１９９５、Ｃｈｅｕｎｇら、１９９１）。ＶａｕｄａｕｘらおよびＭｏｒｅｉｌｌｏｎらにより示されるように、フィブリノゲン結合タンパク質クランピング因子（ＣｌｆＡ）が欠損した突然変異体は、心内膜炎のラットモデルにおいて、インビトロでのフィブリノゲン、外植カテーテル、血餅、および損傷を受けた心臓弁に対する付着が減少した（Ｖａｕｄａｕｘら、１９９５、Ｍｏｒｅｉｌｌｏｎら、１９９５）。
【００２６】
フィブリノゲンの付着因子（「クランピング因子」と称することが多い）はエス・アウレウス細胞の表面上に位置する。溶液中での細菌とフィブリノゲン間の相互作用の結果、細菌細胞が即座に凝集する。フィブリノゲン上の結合部位はダイマーフィブリノゲン糖タンパク質のγ鎖のＣ末端に位置する。親和力は非常に高く、凝集は低濃度のフィブリノゲンで起こる。科学者らは最近、クランピング因子が固相フィブリノゲン、血餅、および損傷を受けた心臓弁への付着も促進することを示している（ＭｃＤｅｖｉｔｔら、１９９４；Ｖａｕｄａｕｘら、１９９５；Ｍｏｒｅｉｌｌｏｎら、１９９５）。
エス・アウレウスにおける２つの遺伝子が２つのフィブリノゲン結合タンパク質ＣｌｆＡおよびＣｌｆＢをコードすることが見いだされた。遺伝子ｃｌｆＡはクローンされ、配列決定され、９２ｋＤａのポリペプチドをコードすることが見いだされた。ＣｌｆＡはフィブリノゲンのγ鎖と結合し、ＣｌｆＢはαおよびβ鎖と結合する（Ｅｉｄｈｉｎら、１９９８）。ＣｌｆＢは推定分子量８８ｋＤａ、見かけの分子量１２４ｋＤａを有する、可溶性および固定化フィブリノゲンの両方に結合し、クランピング因子として作用する細胞壁に結合したタンパク質である。
【００２７】
クランピング因子タンパク質の遺伝子（ＣｌｆＡと表示）はクローンされ、配列決定され、分子レベルで詳細に分析された（ＭｃＤｅｖｉｔｔら、１９９４、ＭｃＤｅｖｉｔｔら、１９９５）。予想されるタンパク質は、９３３アミノ酸から構成される。３９残基のシグナル配列はＮ末端にあり、その後に５２０残基の領域（領域Ａ）が続き、これはフィブリノゲン結合ドメインを含有する。ジペプチドセリン−アスパルテートの１５４の繰り返しからなる３０８残基領域（領域Ｒ）がその後に続く。Ｒ領域配列は、１８塩基対繰り返しＧＡＹ ＴＣＮ ＧＡＹ ＴＣＮ ＧＡＹ ＡＧＹ（Ｙはピリミジンであり、Ｎは任意の塩基である）によりエンコードされる。ＣｌｆＡのＣ末端は、タンパク質を細胞壁、膜アンカー、およびＣ末端の正に荷電した残基に固定するＬＰＤＴＧモチーフなどのグラム陽性菌の多くの表面タンパク質中に存在する特徴を有する。
【００２８】
血小板インテグリンαＩＩｂβ３はフィブリノゲンのγ鎖のＣ末端を認識する。これは凝集中の血液凝固の開始における重大な事象である。ＣｌｆＡは血小板凝集をブロックでき、γ鎖のＣ末端に対応するペプチド（１９８−４１１）はインテグリンおよびフィブリノゲンと相互作用するＣｌｆＡの両方をブロックできるので、ＣｌｆＡおよびαＩＩｂβ３はフィブリノゲンγ鎖上の正確に同じ部位を認識するようである（ＭｃＤｅｖｉｔｔら、１９９７）。αＩＩｂβ３のフィブリノゲン結合部位は、「ＥＦハンド」と称するＣａ２＋結合決定因子の近くにあるか、または重複する。ＣｌｆＡ領域ＡはいくつかのＥＦハンド様モチーフを有する。３〜５ｍＭの範囲のＣａ２＋の濃度は、これらのＣｌｆＡ−フィブリノゲン相互作用をブロックし、ＣｌｆＡタンパク質の二次構造を変化させる。ＣｌｆＡ ＥＦハンドに影響を及ぼす突然変異はフィブリノゲンとの相互作用を軽減または防止する。Ｃａ２＋およびフィブリノゲンγ鎖はＣｌｆＡ領域Ａの同じ部位に結合するか、または重複するようである。
【００２９】
白血球インテグリンのα鎖、αＭβ２は、２００アミノ酸（ＡまたはＩドメイン）の挿入を有し、これはリガンド結合活性の原因である。Ｉドメインにおける新規金属イオン依存性付着部位（ＭＩＤＡＳ）モチーフはリガンド結合に必要とされる。認識されるリガンドにはフィブリノゲンが含まれる。フィブリノゲン上の結合部位はγ鎖にある（残基１９０〜２０２）。カンジダ・アルビカンスは、白血球インテグリンとよく似た性質を有する表面タンパク質、αＩｎｔｌｐを有することが近年報告された。表面タンパク質は、ＭＩＤＡＳモチーフを包含するＭβ２のＩドメインと相同性であるアミノ酸配列を有する。さらに、Ｉｎｔｌｐはフィブリノゲンと結合する。
【００３０】
ＣｌｆＡ領域Ａはさらに、αＩｎｔｌｐと相同性である配列もある程度示す。ＣｌｆＡ領域Ａ配列の調査により有効なＭＩＤＡＳモチーフが明らかになった。ＣｌｆＡにおけるＭＩＤＡＳモチーフのＤｘＳｘＳ部分における推定カチオン配位残基における突然変異の結果、フィブリノゲン結合が著しく減少する。αＭβ２のγ鎖結合部位に対応するペプチド（１９０−２０２）は、Ｏ’ＣｏｎｎｅｌｌらによりＣｌｆＡ−フィブリノゲン相互作用を阻害することが示されている（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ、１９９８）。したがって、ＣｌｆＡは２つの別個の部位でフィブリノゲンのγ鎖と結合できるようである。ＣｌｆＡ上のリガンド結合部位は真核細胞インテグリンにより採用されるものと類似し、二価カチオン結合ＥＦハンドおよびＭＩＤＡＳモチーフを含む。
【００３１】
推定分子量約８８ｋＤａおよび見かけの分子量約１２４ｋＤａを有するフィブリノゲン結合タンパク質ＣｌｆＢも公知である。ＣｌｆＢは細胞壁結合タンパク質であり、可溶性および固定化フィブリノゲンの両方と結合する。加えて、ＣｌｆＢはフィブリノゲンのαおよびβ鎖の両方と結合し、クランピング因子として作用する。
細胞外マトリックスと結合するフィブリノゲン結合ＣｌｆＡおよびＣｌｆＢに関連するタンパク質が見いだされている。ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤおよびＳｄｒＥタンパク質は一次配列および構造機構においてＣｌｆＡおよびＣｌｆＢタンパク質に関連し、また細胞表面上に局在化する。細胞表面上に局在化するこれらのタンパク質のＡ領域に関して、タンパク質は血漿中のタンパク質、細胞外マトリックスまたは宿主細胞の表面上の分子と相互作用する。ＳｄｒＣは細胞外マトリックスタンパク質、例えばビトロネクチンと結合することができる。ＳｄｒＥも細胞外マトリックスと結合することができ；例えばＳｄｒＥは骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）と結合する。
【００３２】
ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＣｌｆＡおよびＣｌｆＢのＡ領域において、コンセンサスＴＹＴＦＴＤＹＶＤモチーフを誘導するために使用できる高度に保存されたアミノ酸配列が存在することが見いだされた。このモチーフは細菌感染症に対して広範囲の免疫を付与する多成分ワクチンにおいて使用でき、また広範囲の受動免疫を付与するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を産生するために使用できる。別の具体例において、免疫を付与するために、または保護抗体を誘発するために、ＳｄｒおよびＣｌｆタンパク質ファミリーに由来する様々な配列モチーフの任意の組み合わせ（Ｔ／Ｉ）（Ｙ／Ｆ）（Ｔ／Ｖ）（Ｆ）（Ｔ）（Ｄ／Ｎ）（Ｙ）（Ｖ）（Ｄ／Ｎ）を使用できる。
【００３３】
ＭＨＣ−ＩＩ類似タンパク質
フィブリノゲン、フィブロネクチンおよびコラーゲンに加えて、エス・アウレウス株は、その多くが付着性マトリックスタンパク質のファミリーに属するビトロネクチンなどの他の付着性真核細胞タンパク質に関連する（Ｃｈａｔｗａｌら、１９８７）。米国特許第５６４８２４０号は、約７０ｋＤａの分子量を有するエス・アウレウスの広範囲の付着因子をエンコードする遺伝子を含むＤＮＡセグメントを開示している。この付着因子は、フィブロネクチンまたはビトロネクチンと結合することができ、約３０アミノ酸のＭＨＣ ＩＩ様単位を含む。このタンパク質の結合特異性をさらに分析すると、これは合成ペプチドと結合する点でＭＨＣ ＩＩ抗原と機能的に類似していることが明らかになる。従って、細胞外マトリックスタンパク質に対する細菌付着を媒介することに加えて、宿主の免疫系を抑制することにより、ブドウ球菌感染症に関与し得る。
【００３４】
スタフィロコッカス・エピデルミディスからのＳｄｒタンパク質
スタフィロコッカス・エピデルミディスは凝固酵素陰性菌であり、人間の皮膚の一般的な常在菌であり、しばしば異物感染症を引き起こす。病原性は、人工弁、整形外科用装置、ならびに静脈内および腹膜透析カテーテルなどの留置医療装置と生物体がまず付着し、その後、その上にバイオフィルムを形成する生物体の能力により促進される。装置に関連する感染症は、医療の成功を危うくし、患者の死亡率を著しく増大させる。従って、エス・エピデルミディス感染症の発生を制御または防止できるワクチンを開発できることは、同時に凝固酵素陽性および凝固酵素陰性菌の両方を包含する広範囲の細菌からの感染症を予防または治療できる複合ワクチンの開発と同様に非常に重要である。
エス・エピデルミディスにより発現される３つのＳｄｒ（セリン−アスパルテート（ＳＤ）繰り返し領域）タンパク質は、ＳｄｒＦ、ＳｄｒＧおよびＳｄｒＨと表示され、これらのタンパク質のアミノ酸配列およびその核酸配列はＷＯ００／１２１３１（出典明示により本発明の一部として参照される）に示されている。
【００３５】
本発明に従って、前記の表面付着因子タンパク質の少なくとも１つと接合した少なくとも１種の多糖抗原を含む免疫原性組成物として有用な接合体が提供される。加えて、多糖抗原および表面付着因子タンパク質に対する抗体は通常の手段を用いて産生される。従って、ＳｄｒＧなどの表面付着因子タンパク質を含む免疫原性組成物は、凝固酵素陽性菌および凝固酵素陰性菌の両方に由来するものを含む広範囲の細菌感染症を治療するために使用される。
本発明の接合体の他の成分は、院内病原菌に由来する少なくとも１種の多糖抗原を含む。このような院内病原菌としては、これらに限定されないが、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）および他の凝固酵素陰性ブドウ球菌（ＣｏＮＳ）、エンテロコッカス種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、エンテロバクター種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）およびシュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）が挙げられる。
【００３６】
本発明の一具体例において、多糖抗原は、エス・アウレウスＣＰ５およびＣＰ８の少なくとも１つを含む。
本発明のもう一つ別の具体例において、多糖抗原は、エス・アウレウスおよび／またはエス・エピデルミディスにより発現されるようなＰＳ／Ａ、ＰＮＳＧ、ＰＮＡＧおよびＰＩＡのうちの少なくとも１つを含む。
【００３７】
免疫原性組成物の調製および使用
免疫原性組成物は、本明細書に開示されるような多糖抗原−表面付着因子タンパク質接合体から調製される。免疫原性組成物は、多糖抗原および表面付着因子キャリアタンパク質の両方に対する抗体を産生する免疫応答を惹起する。
免疫原性組成物は、本明細書において開示されるようなオリゴ糖抗原−表面付着因子タンパク質接合体からも調製される。免疫原性組成物は、オリゴ糖抗原および表面付着因子キャリアタンパク質の両方に対する抗体を産生する免疫応答を惹起する。
【００３８】
免疫原性組成物としての使用に好適な、本発明において提供される接合体は、これらに限定されないが、以下のものを包含する：
（ｉ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）などのエス・アウレウスのフィブリノゲン結合タンパク質またはペプチドと接合するＣＰ５、またはその有用なフラグメント、またはこれと十分高度に相同性であるタンパク質またはフラグメント；または
（ｉｉ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）などのエス・アウレウスのフィブリノゲン結合タンパク質またはペプチドと接合するＣＰ８、またはその有用なフラグメント、またはこれと十分高度に相同性であるタンパク質またはフラグメント；または
（ｉｉｉ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）などのエス・アウレウスのフィブリノゲン結合タンパク質またはペプチドと接合するＰＩＡ、またはその有用なフラグメント、またはこれと十分高度に相同性であるタンパク質またはフラグメント；または
（ｉｖ）ＳｄｒＧなどのエス・エピデルミディスのフィブリノゲン結合タンパク質またはペプチドと接合するＣＰ５、またはその有用なフラグメント、またはこれと十分高度に相同性であるタンパク質またはフラグメント；または
（ｖ）ＳｄｒＧなどのエス・エピデルミディスのフィブリノゲン結合タンパク質またはペプチドと接合するＣＰ８、またはその有用なフラグメント、またはこれと十分高度に相同性であるタンパク質またはフラグメント；または
（ｖｉ）ＳｄｒＧなどのエス・エピデルミディスのフィブリノゲン結合タンパク質またはペプチドと接合するＰＩＡ、またはその有用なフラグメント、またはこれと十分高度に相同性であるタンパク質またはフラグメント。
【００３９】
各例において、任意の接合体（ｉ）〜（ｖｉ）から調製された免疫原性組成物は、エス・アウレウスなどの凝固酵素陽性菌、ならびにエス・エピデルミディスなどの凝固酵素陰性菌からの感染症に対して患者を免疫化するために有用である。
表面付着因子キャリアタンパク質がフィブリノゲン結合タンパク質である前記の接合体（ｉ）〜（ｖｉ）に加えて、本発明はさらに、表面付着因子キャリアタンパク質が、例えばフィブロネクチン結合タンパク質、コラーゲン結合タンパク質およびビトロネクチン結合タンパク質などの任意のブドウ球菌表面付着因子タンパク質である接合体を包含する。本発明はさらに、多糖抗原がＰＳ／Ａ、ＰＮＡＧまたはＰＮＳＧ、またはエス・アウレウス、エス・エピデルミディスおよび他のＣｏＮｓ、エンテロコッカス種、カンジダ・アルビカンス、エンテロバクター種、ヘモフィルス・インフルエンゼ、クレブシエラ・ニューモニエ、エシェリキア・コリ、およびシュードモナス・エルジノーサなどの院内病原微生物からの他の多糖抗原であり得ることも意図する。
【００４０】
多糖をタンパク質に接合するための多くの方法が当該分野において公知であり、本発明における使用に適している。一般に、多糖を活性化させるか、または他の方法で接合しやすくする、すなわち、少なくとも１つの部分をタンパク質または他の分子と共有結合できるようにしなければならない。多くのこのような方法は当該分野において公知である。例えば、米国特許第４３５６１７０号（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ）は、多糖上にアルデヒド基を生成させるために過ヨウ素酸を使用し、次いでシアノボロヒドリドを用いて還元的アミノ化を行うことを記載している。米国特許第４６６３１６０号は（Ｔｓａｙら）もアルデヒド基を生成させるために過ヨウ素酸を使用したが、次にシアノボロヒドリドなどの還元剤の存在下でのシッフ塩基反応で４〜１２の炭素部分（縮合剤の存在下で調製）で誘導化されたタンパク質に多糖を結合させた。米国特許第４６１９８２８号（Ｇｏｒｄｏｎ）は、多糖を活性化するために臭化シアンを使用し、次いで４〜８個の炭素原子のスペーサーブリッジによりタンパク質と接合させた。さらに他の接合法も当該分野において公知である。
【００４１】
本発明の一具体例において、ＣＰはリンカー３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）で活性化され、これによりＣＰにおけるＮ−アセチルマンノースアミノウロン酸のカルボジイミド活性化カルボキシレート基がＰＤＰＨのヒドラジド基とカップリングする（図８）。ＭＳＣＲＭＡＭＭキャリアタンパク質はブロモ酢酸のＮ−ヒドロキシスクシイミドエステルでのリシン残基のブロモアセチル化により活性化される（図７）。ＰＤＰＨ−チオール化ＣＰを次いで、チオールでブロモアセチル化タンパク質における臭素を置換することにより活性化表面付着因子タンパク質に接合させると、結果として安定なチオエーテル結合が得られる（図９）。
ＣＰ−ＣＯＮＨＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＯＮＨ−表面付着因子タンパク質
【００４２】
本発明のＣＰ−表面抗原タンパク質接合体を含む免疫原性組成物をマウスにおいて試験し、不十分な免疫原性未接合ＣＰと比較して、向上された免疫原性を有することが示された（図１５〜２０）。加えて、莢膜多糖特異性抗体ならびにＣＰ−表面付着因子接合免疫原性組成物により誘発されたＣｌｆＡおよびＳｄｒＧ特異性抗体はどちらも対応する抗原を発現する生株と結合することが示された（表５および６）。これらの結果を考慮すると、本発明の免疫原性組成物はエス・アウレウスまたはエス・エピデルミディスなどの病原体により引き起こされる院内感染症に対して有用であると考えられる。また、ＣＰ−表面付着因子接合体により誘発される抗体が免疫原性組成物として傷に投与されるか、またはインビトロまたはインビボで医療装置またはポリマー生体適合物質をコートするために使用される場合、組成物は創傷部位または生体適合物質へのブドウ球菌菌の結合を防止または抑制するであろう。本発明に従って処理された接合体は、患者を院内感染に対して保護するための免疫原性組成物の調製において使用される。本明細書において用いられる「対象」とは、温血哺乳動物であり、例えば、ヒト、霊長類、ウマ、ウシ、イヌおよびネコを包含する。
【００４３】
注射可能な液体溶液または懸濁液を調製するために、接合体を免疫学的に許容される希釈剤または担体に通常の方法で添加することができる。
本発明の免疫原性組成物は、典型的には、任意の適当な医薬的に許容される担体、例えば生理食塩水または他の注射可能な液体中に接合体を分散させることにより形成される。本明細書において用いられる場合、「医薬的に許容される担体」なる語句は、医薬投与に適合するありとあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを包含することを意図される。医薬的に活性な物質に関するかかる媒体および薬剤の使用は当該分野において周知である。通常の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、かかる媒体を本発明の組成物において用いることができる。例えば、接合体調製物をリン酸ナトリウム緩衝塩溶液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．０〜８．０）中に多糖１ｍｌあたり１〜１００μｇの濃度で懸濁させる。本発明の免疫原性組成物の投与は、これらに限定されないが、非経口（例えば、皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮内）、経口および鼻内を包含する任意の周知の方法により行うことができる。免疫原性組成物の好ましい投与方法は非経口投与である。非経口投与に用いられる溶液または懸濁液は、次の成分を含む：無菌希釈剤、例えば、注射用水、塩溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、ポリプロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；キレート化剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩および等張性を調節するための薬剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは酸または塩基、例えば、塩酸または水酸化ナトリウムで調節することができる。非経口製剤はアンプル、使い捨て注射器あるいはガラスまたはプラスチック製の複数回投与用バイアル中に封入することができる。
【００４４】
注射可能な用途に適した免疫原性組成物は、無菌水性溶液（水溶性の場合）または分散液および無菌注射可能な溶液または分散液の即時調製用無菌粉末を含む。あらゆる場合において、組成物は無菌でなければならず、容易に注射可能である程度に流動性でなければならない。製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびその適当な混合物を含有する溶媒または分散媒体である。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合は必要とされる粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用により維持される。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成される。多くの場合において、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、および塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。組成物中に吸収を遅らせる薬剤、例えばアルミニウムモノステアレートおよびゼラチンを含めることにより注射可能な組成物の吸収が延長される。
【００４５】
無菌注射可能な溶液は、本発明の接合体を必要とされる量、適当な溶媒中に、単独または必要に応じて前記の成分と組み合わせて配合し、続いて濾過滅菌することにより調製される。一般に、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒体および前記のもののうち必要とされる他の成分を含有する無菌ビヒクル中に配合することにより調製される。無菌注射可能な溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製法は真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより活性成分の粉末と、あらかじめ無菌濾過されたその溶液からの任意のさらなる所望の成分が得られる。
ある具体例において、免疫原性組成物は１以上のアジュバントを含む。本明細書において定義されるように、「アジュバント」は本発明の免疫原性組成物の免疫原性を向上させる働きをする物質である。従って、アジュバントは免疫反応の追加免疫（ｂｏｏｓｔ）のために投与され、当業者には周知である。
【００４６】
組成物の有効性を向上させるための好ましいアジュバントとしては、これらに限定されないが、次のものが挙げられる：
（１）アルミニウム塩（ａｌｕｍ）、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど；
（２）水中油エマルジョン処方（他の特異的免疫刺激剤、例えばムラミルペプチド（以下参照）または細菌細胞壁成分の存在下または非存在下）、例えば
（ａ）ミクロフルイダイザー、例えば１１０型ミクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）を用いて１ミクロン以下の粒子に処方された５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５（任意に様々な量のＭＴＰ−ＰＥ（必要ではないが、以下参照）を含有してもよい）を含有するＭＦ５９（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１４８３７）、
（ｂ）１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロンブロックされたポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下参照）（ミクロ流動化されて１ミクロン以下のエマルジョンにされているか、または撹拌されて大きな粒子サイズのエマルジョンが生じるかのいずれか）を含有するＳＡＦ、
（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、および米国特許第４９１２０９４号（Ｃｏｒｉｘａ）に記載されている３−デアシル化モノホスホリピッドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ）からなる群からの１以上の細菌細胞壁成分を含有するＲｉｂｉアジュバント系（ＲＡＳ）（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）；
（３）サポニンアジュバント、例えばＱｕｉｌ ＡまたはＳＴＩＭＵＬＯＮ ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）（米国特許第５，０５７，５４０号）またはこれから生成する粒子、例えばＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）；
（４）細菌リポ多糖、合成リピッドＡ類似体、例えばアミノアルキルグルコサミンホスフェート化合物（ＡＧＰ）、またはその誘導体または類似体（Ｃｏｒｉｘａから入手可能で、米国特許第６，１１３，９１８号に記載されている）；例えばＡＧＰは２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシド（５２９（以前はＲＣ５２９と呼んだ）をも呼ばれ、水性形態または安定なエマルジョンとして処方される）、合成ポリヌクレオチド、例えばＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチド（米国特許第６，２０７，６４６号）；
（５）サイトカイン、例えばインターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８など）、インターフェロン（例えば、ガンマインターフェロン）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など；
（６）コレラ毒素（ＣＴ）（野生型または突然変異形態、例えば公開国際特許出願番号ＷＯ００／１８４３４に従ってアミノ酸２９位でグルタミン酸が別のアミノ酸、好ましくはヒスチジンにより置換されている場合（ＷＯ０２／０９８３６８およびＷＯ０２／０９８３６９も参照））などの細菌ＡＤＰ−リボシル化トキシンの無毒化突然変異体、狂犬病毒素（ＰＴ）、またはイー・コリ易熱性毒素（ＬＴ）、特にＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＣＴ−Ｓ１０９、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（例えば、ＷＯ９３／１３３０２およびＷＯ９２／１９２６５参照）；および
（７）組成物の有効性を向上させるために免疫刺激剤として作用する他の物質。
【００４７】
前記のように、ムラミルペプチドとしては、これらに限定されないが、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが挙げられる。
本発明の免疫原性組成物は、免疫原性反応を誘発するために十分な量で投与される。用量は、該免疫原性組成物を受容する個体の大きさ、体重または年齢に基づいて調節することができる。個体における抗体応答は、抗体価または殺菌活性について分析することによりモニターすることができ、必要に応じて追加免疫して反応を向上させることができる。
【００４８】
本発明の免疫原性組成物は、体液性免疫応答を誘発するために対象に投与される。対象は次に免疫原組成物に応答して生成されたイムノグロブリンの供給源（高度免疫イムノグロブリン）として作用する。免疫化された対象は血漿を供与し、これから通常の血漿分画技術により高イムノグロブリンが得られ、院内感染に対する耐性を付与するため、または院内感染を治療するために別の対象に投与される。
【００４９】
（実施例）
前記開示は一般に本発明を説明する。以下の実施例を参照することによりさらに完全に理解することができる。これらの実施例は、説明の目的のみで記載したものであり、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【００５０】
実施例１
エス・アウレウスＣＰ５およびＣＰ８多糖の精製
ＣＰ５およびＣＰ８それぞれの精製のためにエス・アウレウス株（ＡＴＣＣ＃４９５２１）およびＷｒｉｇｈｔ（ＡＴＣＣ＃４９５２１）を使用した。既に公開されている方法（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ｖａｎｎら、１９８４；Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ｈａｎｎｏｎら、１９８７）を変更した方法により細胞から多糖を精製した。２％ＮａＣｌで補足されたＣｏｌｕｍｉａブロス中で成長させた細胞を３時間３７℃で、リソスタフィン（１７５Ｕ／ｇの細胞）で、ＲＮＡｓｅおよびＤＮＡｓｅ（それぞれ０．１ｍｇ／ｇ）で４時間、３７℃で消化し、続いてプロナーゼ（１ｍｇ／ｇの細胞）で３時間、３７℃で消化した。１０ｍＭ ＣａＣｌ２の存在下、２５％および７５％エタノールで連続して沈降させることにより酵素消化物から粗ＣＰを調製した。０．０５〜０．５Ｍ ＮａＣｌの直線的勾配を用い、Ｑ−セファロースカラム上でアニオン交換クロマトグラフィーによりＣＰを次いでペレットから精製した。残留するテイコ酸を０．０５Ｍ ＮａｌＯ４で酸化した。透析後、ＣＰを次いでＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ３００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）カラム上で寸法排除クロマトグラフィーによりさらに精製した。フラクション中のＣＰの存在をエス・アウレウスＣＰ５およびＣＰ８特異性抗血清との反応性により決定した。
【００５１】
ＰＩＡを、Ｍａｃｋら（Ｍａｃｋ，Ｆｉｓｃｈｅｒら、１９９６）により記載されているように、熱抽出した静止期のエス・エピデルミディス細胞から精製し、ＰＩＡ含有培養上清と組み合わせた。抽出された物質および培養上清を、１０Ｋ膜を用いて濃縮し、処理して、核酸および残存するタンパク質を除去した。ゲル濾過または透析濾過を用いて粗ＰＩＡを分画した。アニオン交換クロマトグラフィーによりＰＩＡ抗原陽性物質をさらに分画し、ＰＩＡフラクション含有エステル結合サクシネートを精製した。非スクシニル化および部分的非Ｎ−アセチル化ＰＩＡを含有するフロースルーフラクションを、カチオン交換クロマトグラフィーにより精製した。ＰＳ／Ａ（ＰＮＳＧ、ＰＮＡＧ）を（Ｍａｒｉａ−Ｌｉｔｒａｎ，Ｋｒｏｐｅｃら、２００２）またはＭｃＫｅｎｎｅｙ，Ｐｏｕｌｉｏｔら、１９９９により記載されているようにして精製した。
【００５２】
実施例２
エス・アウレウスＣＰ５およびＣＰ８の分析
精製されたＣＰ５およびＣＰ８の化学的特徴化により、両多糖は事実上核酸および残存するタンパク質が無いことが示された（表１）。
ＨＰＡＥＣクロマトグラフィーにより決定された糖組成により、ＣＰ５およびＣＰ８におけるＦｕｃρＮＡｃおよびＭａｎρＮａｃＡの存在が明らかになった（図１）。Ｏ−デアシル化多糖の１Ｈ ＮＭＲスペクトル（図２）は、既に公開されているスペクトル（Ｖａｎｎ，Ｍｏｒｅａｕら、１９８７；Ｍｏｒｅａｕ，Ｒｉｃｈａｒｄｓら、１９９０）と類似しており、３種の単糖：２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−マンヌロン酸、２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｌ−フコースおよび２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−フコースの構造および存在が確認された。
精製されたＣＰ５、ＣＰ８およびＴＡは、対応する全細胞抗血清と反応した場合に二重免疫拡散検定における１つの沈降素のバンドにより確かめられるように免疫学的に異なっていた（データは省略）。
【００５３】
実施例３
表面付着因子タンパク質の精製
評価した表面付着因子タンパク質は：
エス・アウレウスＣｌｆ４０（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）−クランピング因子Ａの完全長Ａドメイン（アミノ酸（ＡＡ）４０−５５９）−図３。
エス・アウレウスＣｌｆ４１（Ｎ２Ｎ３）−Ｃｌｆ４０のポストプロテアーゼ部位フラグメント（ＡＡ２２３−５５９）−図４。
エス・エピデルミディスＳｄｒＧ（Ｎ１Ｎ２Ｎ３）−ＳｄｒＧの完全長Ａドメイン（ＡＡ５０−５９７）−図５。
エス・エピデルミディスＳｄｒＧ（Ｎ２Ｎ３）−ＳｄｒＧのポストプロテアーゼ部位フラグメント（ＡＡ２７３−５９７）−図６。
コレラの表面付着因子タンパク質は、Ｉｎｈｉｂｉｔｅｘ，Ｉｎｃ．，Ａｌｐｈａｒｅｔｔａ，ＧＡ，ＵＳＡから入手した。
【００５４】
表面付着因子タンパク質のＨｉｓｔａｇマイナスバージョンをイー・コリプラスミド宿主株から精製した。イー・コリｐＬＰ１１３４ＢＬ２１（ＤＥ３）をエス・アウレウスＣｌｆ４１（Ｎ２，Ｎ３）について使用し、ｐＬＰ１１３５Ｂ２１（ＤＥ３）をエス・エピデルミディスＳｄｒＧ（Ｎ２，Ｎ３）精製に使用した。両タンパク質を、硫酸アンモニウム沈殿およびその後のセファクリルＱ−セファロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上でのイオン交換クロマトグラフィーにより細胞溶解物の可溶性フラクションから単離した。最終物質の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定すると９０％より高かった。
【００５５】
過剰発現されたエス・アウレウスＣｌｆ４０（Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３）またはＣｌｆ４１（Ｎ２，Ｎ３）、エス・エピデルミディスＳｄｒＧ（Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３）またはＳｄｒＧ（Ｎ２，Ｎ３）を含有するイー・コリ細胞を、約１３０００ｐｓｉで、Ｍｉｃｒｏｆｕｉｄｉｃｓ Ｍ１１０−Ｙミクロフルイダイザーを１回通過させて可溶化させた。細胞片を１７０００ｒｐｍで３０分間４℃で遠心分離することにより精製した。過剰発現されたタンパク質を、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＸＫカラムキレート化セファロースファーストフローおよびＱセファロースＨＰ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））を用いて上清から精製した。粗Ｈｉｓ標識されたタンパク質を、０．１Ｍ ＮｉＣｌ２を装填したキレート化セファロースファーストフローを用いたアフィニティ工程により上清から精製した。粗溶解物を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾールで平衡化させたカラム上にロードし、カラムを５カラム体積の緩衝剤で洗浄することにより未結合タンパク質をカラムから溶出させた。未結合タンパク質を次いで２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール緩衝液で溶出させ、バルクで集めた。タンパク質を次いでＱセファロースＨＰカラム上イオン交換クロマトグラフィーにより残存する不純物から精製した。
【００５６】
実施例４
エス・アウレウスＣＰ５−およびＣＰ−８表面付着因子キャリアタンパク質接合体免疫原性組成物の合成
エス・アウレウスＣＰ５およびＣＰ８多糖を、リンカーを含有するチオール基を多糖に導入し、ハロアセチル基をタンパク質キャリアに導入した後、本発明により提供された表面付着因子キャリアタンパク質とチオエーテル結合を介して別々に結合させた。アミン基をブロモ酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させることにより、ブロモアセチル基を表面付着因子タンパク質中に導入した（図７）。チオール化ＣＰを生成させるために、莢膜多糖におけるＮ−アセチルマンノースアミノウロン酸のカルボジイミド活性化カルボキシレート基をスルフヒドリル反応性ヒドラジドヘテロ二官能性リンカー３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ、図８）のヒドラジド基とカップリングさせた。ジチオトレイトール（ＤＴＴ）での還元により生成し、Ｓｄｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム上ＳＥＣにより精製されたＰＤＰＨ−チオール化ＣＰのチオールを、活性化タンパク質のブロモアセチル基と反応させると、ＣＰとタンパク質間の臭素置換により形成された共有チオエーテル結合が生じた（図９）。未反応ブロモアセチル基をシステアミン塩酸塩（２−アミノエタンチオール塩酸塩）で「キャップ」した。反応混合物を次いでＡｍｉｃｏｎ ＸＭ１００膜上で濃縮した。
【００５７】
実施例５
ＣＰ−およびＣＰ−８表面付着因子キャリアタンパク質接合体免疫原性組成物の特徴化
４Ｎトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）での加水分解後、ＣａｒｂｏＰａｃ−ＰＡ１カラム上ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤクロマトグラフィーによるＣＰの定量化により、接合免疫原性組成物をＣＰおよび表面付着因子キャリアタンパク質含量について分析した。タンパク質含量をＬｏｗｒｙ比色検定により決定した。接合免疫原性組成物の分子量を寸法排除クロマトグラフィーおよび多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）の組み合わせにより測定した。結果を表２および３に記載する。接合ＣＰおよび表面付着因子タンパク質の抗原性を二重免疫拡散法（図１０〜１３）およびドットブロット分析（図１４）により決定した。結果は、ＣＰの表面付着因子タンパク質への接合は、ＣＰまたはタンパク質のいずれかの抗原性を変更しないことを示す。ＣＰのタンパク質への接合は、接合体がニトロセルロース膜に結合する能力により確認された。未接合ＣＰはニトロセルロース膜に結合しなかった。
【００５８】
実施例６
マウスにおけるＣＰ−表面付着因子キャリアタンパク質接合体免疫原性組成物の免疫原性
接合免疫原性組成物を、ＣＰ５およびＣＰ８および表面付着因子タンパク質キャリアに対するＩｇＧ応答を誘発する能力について試験した。Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスを１マイクログラム用量（ＣＰ基準）で２週間間隔で３回、皮下的に（ＳＣ）免疫化した。接合免疫原性組成物の免疫原性を、アジュバントとしての１００マイクログラムのリン酸アルミニウムの存在下または不在下で試験した。各タンパク質免疫原性組成物候補を同様のプロトコルを用いて同様に評価した。エス・アウレウスＣＰおよび表面付着因子タンパク質に対する免疫応答を標準的抗原ＥＬＩＳＡによる各注射の１週間後に分析した（以下の実施例７および８参照）。
【００５９】
実施例７
エス・アウレウスＣＰ５およびＣＰ８−表面付着因子キャリアタンパク質接合体免疫原性組成物で免疫化されたマウスにおけるＣＰの抗体反応
結果（図１５および１６）は、ＣＰの表面付着因子タンパク質への共有結合の結果、莢膜多糖（ＣＰ）特異性ＩｇＧ反応が誘発されることを示す。このことは、ＣＰ−Ｔ細胞非依存性免疫反応はＣＰの表面付着因子キャリアタンパク質へのカップリング後にＴ細胞依存性免疫反応に変換されたことを示す。接合免疫原性組成物のリン酸アルミニウムへの吸着は、タンパク質キャリアとしてＳｄｒＧ（Ｎ２Ｎ３）を投与されたマウスを除いて約１０倍に増大した。ＣＰ５−およびＣＰ８−ＳｄｒＧ（Ｎ２Ｎ３）接合体のアジュバントへの吸着の結果、ＣＰに対する免疫応答は増大しなかったが、ＣＰの抗体反応はこの実験においてアジュバントと混合された（吸着されていないが）他の表面付着因子タンパク質接合体と同様に良好であった。ＣｌｆＡおよびＳｄｒＧのＮ１ドメインの欠失は、これらのタンパク質のキャリア特性に対して影響を及ぼさなかった。
【００６０】
実施例８
エス・アウレウスＣＰ５およびＣＰ８−表面付着因子キャリアタンパク質接合体でワクチン接種されたマウスにおける表面付着因子タンパク質抗体反応
接合表面付着因子タンパク質は、未接合のものと比較して類似した力価の表面付着因子タンパク質特異性抗体を誘発した（図１７〜２０）。このことにより、表面付着因子タンパク質のＣＰに対する接合により抗原性エピトープが修飾されないことが確認される。未接合ＣｌｆＡまたはＣＰ−ＣｌｆＡ接合体のリン酸アルミニウムへの吸着の結果、アジュバントを含まない同じ免疫原性組成物で免疫化されたマウスと比較して、マウスにおけるＣｌｆＡ抗体価が増大した。未接合ＳｄｒＧで免疫化されたマウスは、ＣＰ−ＳｄｒＧ接合免疫原性組成物で免疫化されたマウスと比較して低いＳｄｒＧ抗体価で反応した。未接合ＳｄｒＧのリン酸アルミニウムへの吸着の結果、ａｌｕｍなしで投与されたＣＰ−ＳｄｒＧ接合体により誘発されたレベルと比較してＳｄｒＧ抗体価が増大した。ＣＰ−ＳｄｒＧ接合体のａｌｕｍへの吸着はＳｄｒＧ抗体価を増大させなかった。
【００６１】
実施例９
ＣＰ表面付着因子キャリアタンパク質接合体により誘発された抗体による生菌上に発現されたＣＰおよび表面付着因子キャリアタンパク質の認識
マウスにおけるＣＰ−表面付着因子タンパク質接合体により誘発された抗体の生菌に対する結合をフローサイトメトリー分析により試験した。この検定において使用したエス・アウレウス株を表４に示す。ＳｄｒＧ接合体に対して誘発された抗体の分析について、ＳｄｒＧを発現するエル・ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）を使用した。結果は（表５および６）、莢膜多糖特異性抗体ならびに対応するＣＰ５−およびＣＰ８−表面付着因子タンパク質接合体により誘発されるＣｌｆＡまたはＳｄｒＧ特異性抗体はどちらも対応する抗原を発現する生株に結合することを示す。これにより、ＣＰの表面付着因子タンパク質に対する接合は、ＣＰ上に存在する自然に発現されたエピトープおよび表面付着因子タンパク質抗原に対する免疫反応を変更しないことが示される。
【００６２】
実施例１０
フローサイトメトリー分析法
使用したエス・アウレウス株は次の通りであった：Ｎｅｗｍａｎ、ＮｅｗｍａｎのＣｌｆＡノックアウト突然変異体（Ｎｅｗｍａｎ ＣｌｆＡ：：ｅｍｒ）およびＷｒｉｇｈｔ（ＡＴＣＣ４９５２５）。ＣｌｆＡ発現を最大にするために、エス・アウレウス菌をトリプシンソイブロス中で静止期まで成長させた。莢膜発現を最大にするために、エス・アウレウス菌をＣｏｌｕｍｂｉａ２％ＮａＣｌ寒天（ＢＤ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）上で一夜成長させた。Ｎｅｗｍａｎ ＣｌｆＡ：：ｅｍｒ株を、５μｇ／ｍｌのエリスロマイシンの存在下で成長させて、ノックアウト突然変異を維持した。ＳｄｒＧ抗原認識を評価するためにＳｄｒＧを発現する組み換えラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ（Ｌ．Ｌａｃｔｉｓ））株を使用した。５μｇ／ｍｌのエリスロマイシンの存在下、Ｍ１７ブロス中、エル・ラクチス株を後期対数期まで成長させた。
【００６３】
細菌培養物を収穫し、１０ｍｌの冷１×ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中で２回洗浄し、分析前に氷上で保存した。細菌濃度を、ＵＶ−可視記録分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３０００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて１×ＰＢＳでＤ６００ｎｍ＝２．０に調節した。非特異性およびプロテインＡによるマウスＩｇＧの細胞表面に対する結合を排除するために、細菌調製物を全部、氷上で、１×ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中１０ｍｌの１：５０希釈度（２．３２ｍｇ ＩｇＧ）のウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）中で３０分間インキュベートした。ＣｌｆＡ結合の不在下での８型莢膜認識を評価するために、さらに３０分間高力価ＣｌｆＡ特異性ウサギ抗血清（Ｉｎｈｉｂｉｔｅｘ，Ａｌｐｈａｒｅｔｔａ，ＧＡ）（１：１００希釈）でインキュベーションすることにより、ＣｌｆＡエピトープをエス・アウレウス株Ｗｒｉｇｈｔ上でブロックした。インキュベーションのブロッキング後、細菌を、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより、１０ｍｌの冷１×ＰＢＳ中で２回洗浄した。細菌ペレットを１×ＰＢＳ中２．５％ＢＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）（ＰＢＳＡ）中に再懸濁させ、氷上で保存した。
【００６４】
検定をｔｉｔｅｒｔｕｂｅ（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）中で行った。試験動物から得られるプレブリード（ｐｒｅｂｌｅｅｄ）および高力価抗血清をＰＢＳＡ中に希釈し、０．５ｍｌの各血清希釈物を、２０μｌの細菌懸濁液を含有する適当な試験管に添加した。全試験管を撹拌し、氷上で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、各試験管を撹拌し、次いで３０００ＲＰＭで１０分間遠心分離した。細菌ペレットを２回０．５ｍｌの冷ＰＢＳＡ中で洗浄した。各ペレットを抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｌａｂｓ，Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ，Ｐａ）のＰＥ接合Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの０．５ｍｌの１：２００希釈物中に再懸濁させた。細菌を再懸濁させ、撹拌することにより混合した。試験管を氷上で３０分間インキュベートし、１５分間隔で２回撹拌した。このインキュベーション後、細菌をＰＢＳＡ中最終再懸濁液で洗浄した。ＦＡＣＳ分析まで試験管を氷上で保存した。
【００６５】
各ｔｉｔｅｒｔｕｂｅを１２×７５ｍｍポリスチレン試験管に移し、Ｂ−Ｄ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，ＭＡ）フローサイトメーターを用いて分析した。結果を、所定の抗血清の蛍光強度が同じ希釈度でのプレブリードで得られるシグナルより大きいならばプラスと採点した。結果を表７に示す。
前記考察および実施例は単にある具体例の詳細な説明を提示するためのものであると理解すべきである。従って、当業者には本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な修正および等価物を調製することが可能であることは明らかである。
本出願中に記載した全ての文献、他の刊行物、特許および特許出願は全体として本発明の一部として参照される。
【００６６】
【表１】
【００６７】
【表２】
【００６８】
【表３】
【００６９】
【表４】
【００７０】
【表５−１】
【表５−２】
【００７１】
【表６−１】
【表６−２】
【００７２】
【表７】
＊ＣｌｆＡ＝ＣｌｆＡ ＡドメインのＮ１，Ｎ２，Ｎ３またはＮ２，Ｎ３領域
ＳｄｒＧ＝ＳｄｒＧ ＡドメインのＮ１，Ｎ２，Ｎ３領域
【００７３】
参考文献：
【００７４】
【００７５】
【００７６】
【００７７】
【００７８】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
院内病原菌から由来する少なくとも１種の多糖抗原および少なくとも１種のブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質を含む免疫原性多糖タンパク質接合体であって、多糖抗原およびブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質の両方に対する特異性抗体を産生する接合体。
【請求項２】
院内病原菌から由来する少なくとも１種の多糖抗原の１またはそれ以上の抗原エピトープを提示するオリゴ糖フラグメントおよび少なくとも１種のブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質を含む免疫原性多糖タンパク質接合体であって、多糖抗原およびブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質の両方に対する特異性抗体を産生する接合体。
【請求項３】
多糖抗原が、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、凝固酵素陰性ブドウ球菌（ＣｏＮＳ）、エンテロコッカス種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、エンテロバクター種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、およびシュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）からなる群から選択される院内病原菌から由来する請求項１または２記載の接合体。
【請求項４】
多糖抗原が、スタフィロコッカス・アウレウスまたはＣｏＮＳから由来する請求項３記載の接合体。
【請求項５】
ＣｏＮＳがスタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）である請求項４記載の接合体。
【請求項６】
多糖抗原が、スタフィロコッカス・アウレウス５型（ＣＰ５）または８型（ＣＰ８）から由来する請求項４記載の接合体。
【請求項７】
多糖抗原が、スタフィロコッカス・アウレウスまたはスタフィロコッカス・エピデルミディスにより発現される多糖細胞間付着因子（ＰＩＡ）、多糖付着因子（ＰＳ／Ａ）、ポリ−Ｎ−スクシニルβ−１−６−グルコサミン（ＰＮＳＧ）、またはポリ−Ｎ−アセチル−β−１−６−グルコサミン（ＰＮＡＧ）である請求項３記載の接合体。
【請求項８】
ブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質が、フィブリノゲン結合タンパク質、フィブロネクチン結合タンパク質、コラーゲン結合タンパク質およびビトロネクチン結合タンパク質からなる群から選択される請求項１〜７のいずれか一つに記載の接合体。
【請求項９】
ブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質が、スタフィロコッカス・アウレウスのフィブリノゲン結合タンパク質（クランピング因子Ａ［ＣｌｆＡ］）である請求項８記載の接合体。
【請求項１０】
ブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質がスタフィロコッカス・エピデルミディスのフィブリノゲン結合タンパク質（ＳｄｒＧ）である請求項８記載の接合体。
【請求項１１】
ブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質がスタフィロコッカス・アウレウスのフィブロネクチン結合タンパク質である請求項８記載の接合体。
【請求項１２】
ブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質がスタフィロコッカス・アウレウスのコラーゲン結合タンパク質である請求項８記載の接合体。
【請求項１３】
ブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質がスタフィロコッカス・アウレウスのビトロネクチン結合タンパク質である請求項８記載の接合体。
【請求項１４】
多糖抗原がリンカーを介してブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質と結合している請求項１〜１３のいずれか１つに記載の接合体。
【請求項１５】
ブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質がＩｎｈｉｂｉｔｅｘ Ｉｎｃ、Ａｌｐｈａｒｅｔｔａ、ＧＡから入手したＭＳＣＲＡＭＭ（登録商標）である請求項１〜１４のいずれか１つに記載の接合体。
【請求項１６】
リンカーが３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）である請求項１４記載の接合体。
【請求項１７】
免疫学的に許容される担体または希釈剤中に請求項１〜１６のいずれか１つに記載の接合体を含む免疫原性組成物。
【請求項１８】
さらにアジュバントを含む請求項１７記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
接合体がＣｌｆＡに接合したＣＰ５を含み、その接合体がＣＰ５およびＣｌｆＡの両方に対する特異性反応性抗体を産生する請求項１７または１８のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
接合体がＣｌｆＡに接合したＣＰ８を含み、その接合体がＣＰ８およびＣｌｆＡの両方に対する特異性反応性抗体を産生する請求項１７に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
接合体がＣｌｆＡに接合したＰＩＡ、ＰＳ／Ａ、ＰＮＡＧまたはＰＮＳＧの任意の多糖を含み、その接合体が多糖およびＣｌｆＡに対する特異性反応性抗体を産生する請求項１７記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
接合体がＳｄｒＧに接合したＣＰ５を含み、その接合体がＣＰ５およびＳｄｒＧの両方に対する特異性反応性抗体を生成する請求項１７記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
接合体がＳｄｒＧと接合したＣＰ８を含み、その接合体がＣＰ８およびＳｄｒＧの両方に対する特異性反応性抗体を産生する請求項１７記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
接合体がＳｄｒＧに接合したＰＩＡ、ＰＳ／Ａ、ＰＮＡＧまたはＰＮＳＧの任意の多糖を含み、その接合体が多糖およびＳｄｒＧに対する特異性反応性抗体を産生する請求項１７記載の免疫原性組成物。
【請求項１】
院内病原菌から由来する少なくとも１種の多糖抗原および少なくとも１種のブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質を含む免疫原性多糖タンパク質接合体であって、多糖抗原およびブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質の両方に対する特異性抗体を産生する接合体。
【請求項２】
院内病原菌から由来する少なくとも１種の多糖抗原の１またはそれ以上の抗原エピトープを提示するオリゴ糖フラグメントおよび少なくとも１種のブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質を含む免疫原性多糖タンパク質接合体であって、多糖抗原およびブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質の両方に対する特異性抗体を産生する接合体。
【請求項３】
多糖抗原が、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、凝固酵素陰性ブドウ球菌（ＣｏＮＳ）、エンテロコッカス種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、エンテロバクター種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、およびシュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）からなる群から選択される院内病原菌から由来する請求項１または２記載の接合体。
【請求項４】
多糖抗原が、スタフィロコッカス・アウレウスまたはＣｏＮＳから由来する請求項３記載の接合体。
【請求項５】
ＣｏＮＳがスタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）である請求項４記載の接合体。
【請求項６】
多糖抗原が、スタフィロコッカス・アウレウス５型（ＣＰ５）または８型（ＣＰ８）から由来する請求項４記載の接合体。
【請求項７】
多糖抗原が、スタフィロコッカス・アウレウスまたはスタフィロコッカス・エピデルミディスにより発現される多糖細胞間付着因子（ＰＩＡ）、多糖付着因子（ＰＳ／Ａ）、ポリ−Ｎ−スクシニルβ−１−６−グルコサミン（ＰＮＳＧ）、またはポリ−Ｎ−アセチル−β−１−６−グルコサミン（ＰＮＡＧ）である請求項３記載の接合体。
【請求項８】
ブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質が、フィブリノゲン結合タンパク質、フィブロネクチン結合タンパク質、コラーゲン結合タンパク質およびビトロネクチン結合タンパク質からなる群から選択される請求項１〜７のいずれか一つに記載の接合体。
【請求項９】
ブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質が、スタフィロコッカス・アウレウスのフィブリノゲン結合タンパク質（クランピング因子Ａ［ＣｌｆＡ］）である請求項８記載の接合体。
【請求項１０】
ブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質がスタフィロコッカス・エピデルミディスのフィブリノゲン結合タンパク質（ＳｄｒＧ）である請求項８記載の接合体。
【請求項１１】
ブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質がスタフィロコッカス・アウレウスのフィブロネクチン結合タンパク質である請求項８記載の接合体。
【請求項１２】
ブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質がスタフィロコッカス・アウレウスのコラーゲン結合タンパク質である請求項８記載の接合体。
【請求項１３】
ブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質がスタフィロコッカス・アウレウスのビトロネクチン結合タンパク質である請求項８記載の接合体。
【請求項１４】
多糖抗原がリンカーを介してブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質と結合している請求項１〜１３のいずれか１つに記載の接合体。
【請求項１５】
ブドウ球菌表面付着因子キャリアタンパク質がＩｎｈｉｂｉｔｅｘ Ｉｎｃ、Ａｌｐｈａｒｅｔｔａ、ＧＡから入手したＭＳＣＲＡＭＭ（登録商標）である請求項１〜１４のいずれか１つに記載の接合体。
【請求項１６】
リンカーが３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）である請求項１４記載の接合体。
【請求項１７】
免疫学的に許容される担体または希釈剤中に請求項１〜１６のいずれか１つに記載の接合体を含む免疫原性組成物。
【請求項１８】
さらにアジュバントを含む請求項１７記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
接合体がＣｌｆＡに接合したＣＰ５を含み、その接合体がＣＰ５およびＣｌｆＡの両方に対する特異性反応性抗体を産生する請求項１７または１８のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
接合体がＣｌｆＡに接合したＣＰ８を含み、その接合体がＣＰ８およびＣｌｆＡの両方に対する特異性反応性抗体を産生する請求項１７に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
接合体がＣｌｆＡに接合したＰＩＡ、ＰＳ／Ａ、ＰＮＡＧまたはＰＮＳＧの任意の多糖を含み、その接合体が多糖およびＣｌｆＡに対する特異性反応性抗体を産生する請求項１７記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
接合体がＳｄｒＧに接合したＣＰ５を含み、その接合体がＣＰ５およびＳｄｒＧの両方に対する特異性反応性抗体を生成する請求項１７記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
接合体がＳｄｒＧと接合したＣＰ８を含み、その接合体がＣＰ８およびＳｄｒＧの両方に対する特異性反応性抗体を産生する請求項１７記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
接合体がＳｄｒＧに接合したＰＩＡ、ＰＳ／Ａ、ＰＮＡＧまたはＰＮＳＧの任意の多糖を含み、その接合体が多糖およびＳｄｒＧに対する特異性反応性抗体を産生する請求項１７記載の免疫原性組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１５Ｃ】
【図１５Ｄ】
【図１５Ｅ】
【図１５Ｆ】
【図１５Ｇ】
【図１５Ｈ】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１６Ｄ】
【図１６Ｅ】
【図１６Ｆ】
【図１６Ｇ】
【図１６Ｈ】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１７Ｃ】
【図１７Ｄ】
【図１７Ｅ】
【図１７Ｆ】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１８Ｃ】
【図１８Ｄ】
【図１８Ｅ】
【図１８Ｆ】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図１９Ｃ】
【図１９Ｄ】
【図１９Ｅ】
【図１９Ｆ】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２０Ｃ】
【図２０Ｄ】
【図２０Ｅ】
【図２０Ｆ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１５Ｃ】
【図１５Ｄ】
【図１５Ｅ】
【図１５Ｆ】
【図１５Ｇ】
【図１５Ｈ】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１６Ｄ】
【図１６Ｅ】
【図１６Ｆ】
【図１６Ｇ】
【図１６Ｈ】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１７Ｃ】
【図１７Ｄ】
【図１７Ｅ】
【図１７Ｆ】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１８Ｃ】
【図１８Ｄ】
【図１８Ｅ】
【図１８Ｆ】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図１９Ｃ】
【図１９Ｄ】
【図１９Ｅ】
【図１９Ｆ】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２０Ｃ】
【図２０Ｄ】
【図２０Ｅ】
【図２０Ｆ】
【公開番号】特開２０１２−５１９２２（Ｐ２０１２−５１９２２Ａ）
【公開日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−２２８９９５（Ｐ２０１１−２２８９９５）
【出願日】平成２３年１０月１８日（２０１１．１０．１８）
【分割の表示】特願２００６−５０９１４０（Ｐ２００６−５０９１４０）の分割
【原出願日】平成１６年３月４日（２００４．３．４）
【出願人】（５９１０００７９１）ワイス・ホールディングズ・コーポレイション (43)
【出願人】（５０５３３８５０１）インヒビテックス・インコーポレイテッド (3)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＨＩＢＩＴＥＸ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２２８９９５（Ｐ２０１１−２２８９９５）
【出願日】平成２３年１０月１８日（２０１１．１０．１８）
【分割の表示】特願２００６−５０９１４０（Ｐ２００６−５０９１４０）の分割
【原出願日】平成１６年３月４日（２００４．３．４）
【出願人】（５９１０００７９１）ワイス・ホールディングズ・コーポレイション (43)
【出願人】（５０５３３８５０１）インヒビテックス・インコーポレイテッド (3)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＨＩＢＩＴＥＸ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]