電気化学測定装置用電極、電気化学測定装置およびバイオセンサ用電極
【課題】 白金およびパラジウムと同様に溶液に含まれる特定成分に対して電流出力を生じさせることができ、安価でかつ耐久性に優れた安価な電極を提供する。
【解決手段】溶液中の特定成分の濃度を測定する電気化学測定装置３に用いられる作用電極９（電気化学測定装置用電極１）は、パラジウムとニオブを含む合金が用いられており、作用電極９は溶液中に含まれる過酸化水素を検出可能に構成されている。
【解決手段】溶液中の特定成分の濃度を測定する電気化学測定装置３に用いられる作用電極９（電気化学測定装置用電極１）は、パラジウムとニオブを含む合金が用いられており、作用電極９は溶液中に含まれる過酸化水素を検出可能に構成されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気化学測定装置用電極、電気化学測定装置用電極を用いた電気化学測定装置、およびバイオセンサ用電極に関する。
【背景技術】
【０００２】
多種多様な溶液に含まれる各種成分の分析は、電極表面で生じる電気化学反応を測定する方法や、同反応と特定のタンパク質が持つ触媒反応とを組み合わせた測定方法が広く用いられている。
【０００３】
前述の例としては、洗浄液等に使用されている溶液中の過酸化水素濃度は、カーボン電極、あるいは白金等の貴金属電極を用い、印加時に得られる過酸化水素の酸化電流値を測定することによって算出することができる。
【０００４】
この理由は印加時に過酸化水素の濃度に応じた酸化電流が発生するためである。
【０００５】
後述の例としては、溶液中の化学物質を酵素の触媒機能により、過酸化水素に変換し、この過酸化水素を酸化還元反応により計測するバイオセンサが汎用化している。
【０００６】
具体的には、グルコースバイオセンサの場合、グルコースをグルコースオキシダーゼによって酸化すると、グルコノラクトンと過酸化水素が生成される。
【０００７】
生成される過酸化水素はグルコース濃度に比例することから、この過酸化水素の生成量を測定することによって試料中のグルコース量を定量することが可能になる。
【０００８】
この過酸化水素の生成量は、前述したように電極表面で生じる電気化学反応を測定することによって算出されている。
【０００９】
ここで、この種の電極においては、過酸化水素に対する酸化能力の高い材料として貴金属が使用される場合が多い。
【００１０】
例えば特許文献１の図１に示されている電極材料は、白金が好ましく用いられると記載されている（特許文献１）。
【００１１】
また、非特許文献１のＦｉｇｕｒｅ２に示されている作用極の材料は白金であり、両電極共に、過酸化水素に対する印加後の電流値を測定することによってグルコース量を測定するものであった（非特許文献１）。
【００１２】
さらに、非特許文献２で公開されている電極材料は酸化イリジウムである（非特許文献２）。
【００１３】
また、その他のこの種の電極としては、イリジウム−ニッケル合金が用いられている（特許文献２）。
【００１４】
一方、特許文献３には、溶液中の過酸化水素濃度を測定する電極として、パラジウムが用いられる旨が開示されている（特許文献３）。
【００１５】
さらに、特許文献４においては、パラジウムやニオブ，およびこれらの酸化物が電極材料として記載されている（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特開２００１−１１６７１６号公報
【特許文献２】特開２０１０−０６０３７５号公報
【特許文献３】特開平０５−０７２１６０号公報
【特許文献４】米国特許７４７６８２７号明細書
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】G.Piechotta,J.Albers and R.Hintsche”,Novel micromachined silicon sensor for continuous glucose monitoring”,Biosensors and Bioelectronics,Volume21,Issue5, Elsevier B.V,（Netherlands）,15 novemember 2005,p.802-808
【非特許文献２】Faming Tian and Guoyi Zhu,”Sol-gel derived iridium composite glucouse biosensor”,Sensors and Actuators B：Chemical,Elsevier B.V, （Netherlands）,Volume86,September 2002,p.266-270
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
特許文献１、非特許文献１のような白金を用いた電極は、過酸化水素の検出用電極およびそれを用いた電気化学測定装置やバイオセンサ用の電極としては有用である。
【００１９】
しかしながら、白金を電極材料に用いて製作された電流検出型の過酸化水素センサの場合においては、白金は希少金属であるために、非常に高価になってしまうという問題があった。
【００２０】
一方で、非特許文献２や特許文献３のように、イリジウムやパラジウムを電極材料に用いた場合、白金よりも安価であるものの、さらにコストを下げる工夫が要求されている。
【００２１】
また、特許文献２のイリジウム−ニッケル合金は、イリジウム単体よりも安価ではあるものの、電流検出型の過酸化水素センサもしくはバイオセンサは過酸化水素の酸化力が白金よりも劣るという問題がある。
【００２２】
さらに、特許文献４では、パラジウムやニオブ、これらの酸化物や合金を電極材料に用いることができる旨は記載さているが、特性については全く記載されていない。このため、これらの材料が電流検出型の過酸化水素センサもしくはバイオセンサに適用できるかどうかは全く不明である。
【００２３】
本発明は上記理由に鑑みてなされたものであり、その目的は、白金およびパラジウム電極の代替となる電気化学測定装置用電極を提供することである。
【００２４】
より詳しくは、白金ならびにパラジウムと同等、もしくはそれ以上に過酸化水素に対して高い電流出力を生じさせることができる電極材料を用いて製作される電気化学測定装置用電極を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
前述した目的を達成するために、本発明の第１の態様は、パラジウムとニオブとを、過酸化水素に対して電流出力を生じさせることが可能な組成となるように含有した合金で構成されていることを特徴とする電気化学測定装置用電極である。
【００２６】
本発明の第２の態様は、第１の発明に記載の電気化学測定装置用電極を有することを特徴とする電気化学測定装置である。
【００２７】
第３の発明は、第１の発明に記載の電気化学測定装置用電極の表面に、固定化触媒層を設けてなることを特徴とするバイオセンサ用電極である。
【００２８】
第４の発明は、第３の発明に記載のバイオセンサ用電極を有することを特徴とするバイオセンサである。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、白金およびパラジウム電極の代替となる電気化学測定装置用電極を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】電気化学測定装置３を示す模式図である。
【図２】図２（ａ）は、バイオセンサ３ａを示す模式図であって、図２（ｂ）は、図２（ａ）の作用電極９ａ（バイオセンサ用電極４）の縦断面図を示す図である。
【図３】バイオセンサ３ｂを示す模式図である。
【図４】図３のバイオセンサ用電極４ａのＡ方向から見た断面図である。
【図５】実施例１の実験結果を示す図である。
【図６】実施例１の実験結果を示す図である。
【図７】実施例２の実験結果を示す図である。
【図８】実施例４の実験結果を示す図である。
【図９】実施例５の実験結果を示す図である。
【図１０】実施例６の実験結果を示す図である。
【図１１】実施例７の実験結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、図面に基づいて本発明に好適な実施形態を詳細に説明する。
【００３２】
まず、図１を参照して、本発明の第１の実施形態に係る電気化学測定装置用電極１を有する電気化学測定装置３の構成を説明する。
【００３３】
ここでは、電気化学測定装置３として、溶液１５中に含まれる特定成分としての過酸化水素の濃度を測定する電気化学測定装置が例示されている。
【００３４】
図１に示された電気化学測定装置３は、溶液１５中の過酸化水素を酸化する作用電極９（電気化学測定装置用電極１）、電位の基準となる電極である参照電極５、および必要に応じて設けられる対極７を有している。
【００３５】
さらに、電気化学測定装置３は、測定の際の電位の印加等の制御および酸化電流を計測して過酸化水素濃度の測定を行う測定装置１３、各電極と測定装置１３を接続する配線１１を有している。
【００３６】
電気化学測定装置３は、作用電極９、対極７、参照電極５を過酸化水素を含む溶液１５中に浸漬し、測定装置１３を介して例えば定電位を印加し、作用電極９の表面で過酸化水素が酸化される際に得られる酸化電流の値を測定することにより、溶液１５中の過酸化水素濃度を測定する装置である。
【００３７】
即ち、電気化学測定装置３は、電流検出方式により、溶液中の過酸化水素の濃度を測定する。
【００３８】
ここで、前述の通り、作用電極９は、白金ならびにパラジウムと同様に過酸化水素に対して効率よく電流出力を生じさせることができ、安価な材料であることが望ましい。
【００３９】
上記問題に対して、発明者らは鋭意検討の結果、電極に、パラジウムとニオブを含み、かつ、パラジウムとニオブとを、過酸化水素に対して電流出力を生じさせることが可能な組成となるように含有した合金を用いることにより、白金やパラジウムのみを用いた電極よりも安価な電極とすることが可能であることを見出した。
【００４０】
以下、合金中の各物質についてより詳細に説明する。
パラジウムは、過酸化水素に対する高い酸化力を有し、かつ従来の作用電極の材料として用いられる白金と比べて、安価で加工性に優れた材料であり、溶液１５中の過酸化水素を酸化するために必須である。
【００４１】
ニオブは白金やパラジウムと比べて安価な元素であり、また、パラジウムと特定の割合で合金化することにより、当該合金が過酸化水素に対する酸化力を有するため、必須である。
【００４２】
ここで、合金中のパラジウムとニオブの含有率は、原子比率が９０：１０〜６０：４０の範囲であることが望ましく、７９：２１〜６９：３１の範囲であることがより望ましい。
【００４３】
上記組成範囲外では、十分な過酸化水素に対する選択性が得られなくなるという問題を生じる。
【００４４】
この原因はパラジウムとニオブの比率によって、合金の結晶構造や結晶方位が異なるためと考えられる。
【００４５】
即ち、合金の結晶構造や結晶方位が異なると、過酸化水素を酸化する分子レベルの部位が異なるため、過酸化水素の酸化力が変動するものと考えられる。
【００４６】
さらに、電極を構成する合金には、パラジウムとニオブの原子比率が３：１であり、結晶構造がＤ２２型である化合物を含有させるのが特に望ましい。これは、このような化合物を合金に含有させることにより、特定電位の印加時において、過酸化水素などの電極活物質を酸化もしくは還元する作用、すなわち触媒機能が向上する作用が生じるためである。このような作用が生じる原因としては、これらの電極活物質を酸化もしくは還元する合金の反応部位が、この結晶構造において、最も高密度（全体面積に占める反応部位の面積）になるからである。この結果、これらの電極活物質から効率的かつ大きな酸化還元電流が得られるようになり、Ｓ／Ｎ比の高い電極を構築することが可能になる。
なお、合金をパラジウムとニオブのみで構成してもよい。
【００４７】
上記合金は、例えばアーク放電法、蒸着法、スパッタリング法によって製造されるが、材料を無駄なく利用できる点において、アーク放電法によって製造されるのが好ましい。
【００４８】
なお、参照電極５としては公知の電極を用いることができ、例えばガラス複合電極が用いられる。
また、対極７としても公知の電極を用いることができ、例えば白金電極が用いられる。
【００４９】
ここで、電気化学測定装置３を用いた、溶液１５中の過酸化水素の濃度の測定方法について詳細に説明する。
【００５０】
まず、作用電極９、対極７、参照電極５を、過酸化水素を含まない溶液１５中に浸漬する。
【００５１】
各電極が溶液１５中に浸漬されると、測定装置１３を用いて定電位を印加し、電流値が定常状態になってから過酸化水素を添加する。
【００５２】
電位の印加により、作用電極９の表面では過酸化水素が酸化され、酸化電流が生じる。
【００５３】
測定装置１３は定常状態の電流値から酸化電流の差を元に、溶液１５中の過酸化水素濃度を算出する。
【００５４】
溶液１５に過酸化水素が添加された溶液としては、例えば食品製造に用いられる洗浄液が該当する。
なお、測定方法は上記した定電位測定に限定されるものではない。
【００５５】
即ち、定電位測定の他にも、サイクリックボルタンメトリ測定、パルスボルタンメトリ測定、方形波ボルタンメトリ測定などを用いることができる。
【００５６】
ただし、上記方法の中では、定電位測定が好ましい。これは定電位状態での酸化電流を測定する場合、過酸化水素に対する応答時間が速く、短時間で電流値を測定できるからである。
【００５７】
このように、第１の実施形態によれば、電気化学測定装置３は、作用電極９、対極７、参照電極５、測定装置１３を有し、作用電極９は、パラジウムとニオブを含み、かつ、パラジウムとニオブとを、過酸化水素に対して電流出力を生じさせることが可能な組成となるように含有した合金が用いられている。
【００５８】
そのため、作用電極９は、白金やパラジウムのみを用いた電極よりも安価であり、白金、パラジウム電極の代替電極として用いることができる。
【００５９】
次に、第２の実施形態について、図２を参照して説明する。
第２の実施形態は、第１の実施形態において、作用電極９ａを、表面が触媒機能を有する固定化触媒層６で覆われたバイオセンサ用電極４とし、装置全体をバイオセンサ３ａとしたものである。
【００６０】
なお、第２の実施形態において、第１の実施形態と同様の効果を奏する要素については同一の番号を付し、説明を省略する。
【００６１】
図２（ａ）に示すように、バイオセンサ３ａの構成は電気化学測定装置３と同様であるが、表面が固定化触媒層６で覆われた作用電極９ａ（バイオセンサ用電極４）を有している。
【００６２】
さらに、バイオセンサ３ａは、測定の際の電位の印加等の制御および酸化電流を計測して、測定対象物質の濃度を測定する測定装置１３ａを有している。
【００６３】
図２（ｂ）に示すように、バイオセンサ用電極４は、電気化学測定装置用電極１と、電気化学測定装置用電極１の表面に設けられた固定化触媒層６を有している。
【００６４】
電気化学測定装置用電極１の構造、組成は、第１の実施形態に係る電気化学測定装置用電極１と同様であり、パラジウムとニオブを含み、かつ、パラジウムとニオブとを、過酸化水素に対して電流出力を生じさせることが可能な組成となるように含有した合金が用いられている。
【００６５】
固定化触媒層６は、例えば固定化酵素層、固定化抗体層、（固定化）ＤＮＡ層、（固定化）ＲＮＡ層である。
【００６６】
固定化酵素層は、測定対象物質を過酸化水素に変換する酵素を含む層である。
【００６７】
固定化触媒層６が固定化酵素層の場合、バイオセンサ３ａは、固定化触媒層６の酵素が測定対象物質を過酸化水素に変換し、得られた過酸化水素が電気化学測定装置用電極１の表面で酸化される際に生じる酸化電流を測定することにより、溶液１５ａ中の測定対象物質の濃度を測定することができる。
【００６８】
即ち、バイオセンサ３ａは、電流検出方式により、溶液中の過酸化水素の濃度を測定することにより、溶液中の測定対象物質の濃度を測定することができる。
【００６９】
酵素としては、測定対象物質の触媒反応の生成物として過酸化水素を生成する、または酸素を消費する酵素である必要があり、測定対象物質に応じて乳酸酸化酵素、グルコース酸化酵素、尿酸酸化酵素、アルコール酸化酵素等の酸化酵素が用いられる。
【００７０】
また、２種類以上の酵素を同時に用いてもよい。例えば、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、およびサルコシンオキシダーゼがこれに該当する。
【００７１】
これらの酵素を用いることによってクレアチニンの検出が可能になる。
さらに、酵素と補酵素を同時に用いる方法も適用できることは言うまでもない。
【００７２】
まず、固定化触媒層６として酵素を用いる場合、固定化触媒層２を固定する方法としては、酵素をアルブミン等のタンパク質とグルタルアルデヒド等の架橋剤を用いて固定化する方法が好ましく使われる。
【００７３】
また、酵素を固定化する前に、パラジウム−ニオブ合金の表面をシランカップリング剤などで表面を処理しておき、酵素の固定化強度を高めてもよい。
【００７４】
シランカップリング剤の種類としては、アミノシラン、ビニルシラン、エポキシシランが挙げられるが、このうち、密着性の観点から、アミノシランの一種であるγ−アミノプロピルトリエトキシシランが好ましい。処理方法は電極の形状を考慮するとデップコート法やスプレーコート法などが好ましい。
【００７５】
一方、固定化触媒層６として抗体を用いる場合、抗体としては、ダイオキシン抗体、内分泌攪乱物質、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、残留農薬の抗体が好ましく用いられるが、これ以外の抗体も使用可能である。
【００７６】
抗体の固定化方法は特に限定されないが、合金表面にカルボキシル基やアミノ基を導入後、カルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドで両基を活性化させた後抗体を固定化する方法が好ましく使われる。
【００７７】
具体的に説明すると、まず、パラジウム−ニオブ合金の表面をアミノ基を持ったシランカップリング剤で処理を施し、アミノ基を導入する。密着性の観点からは、アミノシランの一種であるγ−アミノプロピルトリエトキシシランを用いるのが好ましい。その後、カルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドでこのアミノ基を活性化した後、抗体を固定化する。
【００７８】
その他の抗体の固定化方法としてはパラジウム−ニオブ合金の表面をチオール基とカルボン酸から主としてなるカルボキシチオールなどで処理を施し、カルボキシル基を導入する。その後、同様にカルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドでこのアミノ基を活性化した後、抗体を固定化する方法が挙げられる。
【００７９】
測定方法は第１の実施形態で挙げた方法と同様の測定方法を用いることができる。
【００８０】
また、ボルタンメトリ法としてはノーマルパルスボルタンメトリ法、微分パルスボルタンメトリ法等を用いても良いし、あるいはサイクリックボルタンメトリ法を用いてもよい。
【００８１】
ただし、高い測定精度を得られるという点で方形波ボルタンメトリ法が好ましい。
これは、抗体内に含まれる電極活性物質を高感度に測定できるからである。
【００８２】
また、その他の測定方法としては、予め、電極活性物質を測定前の溶液中に加えておき、抗原抗体反応によって生じる電極表面への電極活性物質の低下量を、酸化還元電流として測定する方法もある。
【００８３】
なお、前述のように、固定化触媒層２は、酵素を含む場合、測定対象物質を過酸化水素に変換する機能を持つ構成を、抗体を含む場合、特定の印加電位において電子の授受が発生し、出力として電流値を生じる構成を、また、抗原抗体反応によって電極活性物質の電極表面への透過量が低下する構成を、それぞれ有するものであれば、特に限定されない。
【００８４】
一方、固定化触媒層２として（固定化）ＤＮＡ層、（固定化）ＲＮＡ層を用いる場合、ＤＮＡ／ＲＮＡは特に限定されず、ＤＮＡもしくはＲＮＡアプタマーが好ましい。
【００８５】
これは、ＤＮＡもしくはＲＮＡアプタマーに人工的に電極活性物質を修飾できるからである。
【００８６】
電極活性物質としてはインターカレータであるフェロセン化ナフタレンジイミド（ferrocenylnaphthalene diimide）、キナクリン（qunacrine）、アクリジンオレンジ（acridine orange）、プロフラビン（proflavine）、メチレンブルー（methylene blue）、エチジウムブロマイド（ethidium bromaide）、ドーノマイシン（duanomycin）、ドーノルビシン（daunorubicin）、ポリインターカレータであるエチノマイシン（echinomycin）、溝結合試薬であるヘキスト（Hoechest 33258, Hoechest 33342）、Dapi（４’，６−Diamidino−２−phenylindole， dihydrochloride），ディスタマイシン（distmycin）に結合する金属錯体誘導体、Ｃｏ（phen）３３＋， Ｒｕ（bpy）３２＋などが挙げられ、また、共有結合的に電気化学活性物質を結合させたものを利用することも可能である。
【００８７】
これらの電極活性物質を人工的に修飾したＤＮＡもしくはＲＮＡアプタマーは電気化学測定装置用電極１の表面に固定化される。
【００８８】
固定化に際しては直接これらのアプタマーを電極表面に接触させもよいが、電極活性物質が修飾されていない方のアプタマーの末端にチオール基を新たに修飾して、このチオール基を介してこれらのアプタマーを電極表面に固定化してもよい。
【００８９】
このようにして作製したバイオセンサ用電極４を作用極として用いることによって、これらの電極活性物質の酸化電流を高感度で測定することが可能になる。
【００９０】
その結果、ＤＮＡもしくはＲＮＡアプタマーのバイオセンサとして、これらのアプタマーのアナライトを高感度で検出することが可能になる。
【００９１】
ここで、バイオセンサ３ａを用いた溶液１５ａ中の測定対象物質の濃度の測定方法について詳細に説明する。
【００９２】
まず、作用電極９ａ、対極７、参照電極５を、測定対象物質を含まない溶液１５ａ中に浸漬する。
【００９３】
ここで、固定化触媒層６が固定化酵素層の場合は、各電極が溶液１５ａ中に浸漬されると、測定装置１３ａを介して定電位を印加し、定常状態になってから測定対象物質を添加する。
【００９４】
各電極が測定対象物質が添加された溶液１５ａ中に浸漬されると、溶液１５ａ中の測定対象物質は作用電極９ａの固定化酵素層と接触し、触媒反応により、過酸化水素に変換される。
【００９５】
得られた過酸化水素は、電位の印加により、作用電極９ａの電気化学測定装置用電極１の表面で酸化され、酸化電流が生じる。
【００９６】
測定装置１３ａは酸化電流から定常状態の電流値の差から過酸化水素濃度を算出する。
【００９７】
さらに、測定装置１３ａは測定した過酸化水素濃度をもとに、溶液１５ａ中の測定対象物質の濃度を測定する。
【００９８】
固定化触媒層２が固定化抗体層の場合は、各電極が溶液１５ａ中に浸漬されると、抗体と測定対象物質が反応するため、測定装置１３ａを介して、例えば方形波ボルタンメトリ法にて、反応により得られる電流値を測定し、電流値をもとに、溶液１５ａ中の測定対象物質の濃度を測定する。
【００９９】
このように、第２の実施形態によれば、バイオセンサ３ａは、作用電極９ａ、対極７、参照電極５、測定装置１３ａを有し、作用電極９ａの電気化学測定装置用電極１は、パラジウムとニオブを含む合金が用いられており、上記合金は過酸化水素に対して電流出力を生じさせることが可能な組成となっている。
そのため、第１の実施形態と同様の効果を奏する。
【０１００】
次に、第３の実施形態について図３および図４を参照して説明する。
第３の実施形態におけるバイオセンサ３ｂは、第２の実施形態において、電気化学測定装置用電極１を絶縁基板２３上に設け、電気化学測定装置用電極１と固定化触媒層６の間に結合層２４をさらに設けて作用電極２５ａ（バイオセンサ用電極４ａ）を構成したものである。
【０１０１】
図３および図４に示すように、作用電極２５ａ（バイオセンサ用電極４ａ）は絶縁基板２３、絶縁基板２３の表面に設けられた電気化学測定装置用電極１を有している。
【０１０２】
また、図４に示すように、作用電極２５ａ（バイオセンサ用電極４ａ）は、図４における電気化学測定装置用電極１の上方に固定化触媒層６が設けられている。
【０１０３】
さらに、作用電極２５ａは、電気化学測定装置用電極１と固定化触媒層６の間に設けられ、かつ電気化学測定装置用電極１を覆うように絶縁基板２３および電気化学測定装置用電極１上に設けられた結合層２４を有している。
結合層２４上には、固定化触媒層６が設けられている。
【０１０４】
なお、電気化学測定装置用電極１、固定化触媒層６、結合層２４で電極部１０を構成している。
【０１０５】
絶縁基板２３は電極部１０を保持する部材であり、耐水性、耐熱性、耐薬品性、絶縁性および電気化学測定装置用電極１との密着性に優れた材料であることが好ましい。
【０１０６】
このような要件を満たす材料としては、例えばセラミックス、ガラス、石英、プラスチックスが挙げられる。
【０１０７】
結合層２４は、固定化触媒層６と絶縁基板２３および電気化学測定装置用電極１との密着性（結合性）を向上させるために設けられるものである。
【０１０８】
また、結合層２４は、絶縁基板２３の表面のぬれ性を改善し、固定化触媒層６を形成する際の膜厚の均一性を向上させる効果も有している。
【０１０９】
結合層２４を構成する材料としては、例えばシランカップリング剤が挙げられる。
シランカップリング剤の種類としては、アミノシラン、ビニルシラン、エポキシシランが挙げられるが、このうち、密着性の観点から、アミノシランの一種であるγ−アミノプロピルトリエトキシシランがより好ましい。
【０１１０】
結合層２４は例えばシランカップリング剤溶液をスピンコートすることにより絶縁基板２３および電気化学測定装置用電極１上に形成することができる。
【０１１１】
この際、シランカップリング剤濃度は１ｖ／ｖ％（体積／体積％）程度とすることが好ましい。この濃度であれば、アルコキシル基が十分に水和し、十分な密着性が発揮されるからである。
【０１１２】
なお、図４では一枚の絶縁基板２３上に１つの電極部１０が設けられているが、一枚の絶縁基板２３上に複数の電極部１０を設けてもよい。
【０１１３】
また、図３では対極７および参照電極５も別々の絶縁基板２３上に形成されているが、全ての電極を一枚の絶縁基板２３上に形成してもよい。
【０１１４】
ここで、作用電極２５ａの製造方法について、簡単に説明する。
まず、絶縁基板２３上に、電気化学測定装置用電極１を蒸着法、またはスパッタリング法等を用いて設ける。
【０１１５】
次に、絶縁基板２３および電気化学測定装置用電極１上に、電気化学測定装置用電極１を覆うようにして結合層２４をスピンコートにより設ける。
【０１１６】
次に、結合層２４上に、酵素溶液、グルタルアルデヒド等の蛋白質の架橋剤、およびアルブミンを含む溶液を、滴下することにより固定化触媒層６としての固定化酵素層が形成され、作用電極２５ａが完成する。
【０１１７】
なお、バイオセンサ３ｂを用いた、溶液中１５ａ中の測定対象物質の濃度の測定方法については、第２の実施形態と同様であるため、説明を省略する。
【０１１８】
このように、第３の実施形態によれば、バイオセンサ３ｂは、作用電極２５ａ、対極７、参照電極５、測定装置１３ａを有し、作用電極２５ａの電気化学測定装置用電極１は、パラジウムとニオブを含む合金が用いられており、上記合金は過酸化水素に対して電流出力を生じさせることが可能な組成となっている。
そのため、第２の実施形態と同様の効果を奏する。
【０１１９】
また、第３の実施形態によれば、作用電極２５ａは、電気化学測定装置用電極１を絶縁基板２３上に設け、電気化学測定装置用電極１と固定化触媒層６の間に結合層２４をさらに設けた構造を有している。
【０１２０】
そのため、第２の実施形態と比較して、固定化触媒層６と電気化学測定装置用電極１との密着性（結合性）を向上させることができ、また、固定化触媒層６を形成する際の膜厚の均一性を向上させることができる。
【実施例】
【０１２１】
次に、具体的な実施例に基づき、本発明をさらに詳細に説明する。
【０１２２】
（実施例１）
図１に示す電気化学測定装置３をパラジウム−ニオブ合金の電極を用いて作製し、指示電解質溶液に対するサイクリックボルタンメトリ測定を行い、パラジウムおよびニオブのみで構成された電極を用いた場合と比較した。
【０１２３】
まず、作用電極９（電気化学測定装置用電極１）の製作を以下のように行った。
はじめに、パラジウムワイヤー（フルウチ化学社製）とニオブワイヤー（フルウチ化学社製）を用意し、アーク放電によってパラジウム−ニオブ合金を製作した。
【０１２４】
具体的には、パラジウムとニオブの原子比率が１００：０、９０：１０、７９：２１、７５：２５、６９：３１、６０：４０、０：１００の７種類のサンプルを製造した。
【０１２５】
次に、製造したサンプルを、プリント配線が施されたフレキシブル基板に接着剤を用いて固定化し、ワイヤボンデングによって結線した後、信越化学社製のシリコーン封止剤で防水処理を施し、作用電極９（電気化学測定装置用電極１）とした。
なお、作用電極９の電極面積は３６−３９ｍｍ２とした。
【０１２６】
次に、参照電極５として既存のガラス複合電極（東亞ディーケーケー（株）社製、ＧＳＴ−５７４１Ｃ）を用意し、対極７として既存の白金電極（ＢＡＳ社製、００２２３３）を用意した。
【０１２７】
次に、溶液１５として、指示電解質溶液（１００ｍＭ（１００ｍｏｌ／ｍ３）のエヌ−トリス（ハイドロキシ−メチル）−メチル−２−アミノエタンサルフォニックアシッド（同仁化学研究所製ｐＨ緩衝液、ｐＨを７に調整済み、１５０ｍＭ（１５０ｍｏｌ／ｍ３）の塩化ナトリウム（和光純薬工業社製）を含む）を用意し、溶液１５に作用電極９、参照電極５、対極７を浸漬し、配線１１を通じてこれらの電極を測定装置１３としてのＩｖｉｕｍ社製ＣｏｍｐａｃｔＳｔａｔに接続し、電気化学測定装置３を作製した。
【０１２８】
測定は指示電解質溶液に対するサイクリックボルタンメトリ測定を行った。
測定条件は−０．３Ｖ〜＋１．２Ｖの範囲を０．０１Ｖ／ｓで１回掃引するものである。
【０１２９】
得られた結果を図５および図６に示す。
図５に示すように、パラジウムとニオブの原子比率が０：１００のサンプルは過酸化水素に対して酸化電流がほとんど生じなかったが、それ以外のサンプルは全て酸化電流が生じた。また、パラジウムとニオブの原子比率が７５：２５のときに０．７Ｖ付近の印加電位において、過酸化水素の酸化電流が最も高くなり、効率よく過酸化水素を酸化できることがわかった。
【０１３０】
以上の結果から、パラジウムとニオブを所定の割合で含む合金を用いることにより、低コストで過酸化水素を検出可能（過酸化水素に対して電流出力を生じさせることが可能）な電極を提供できることがわかった。
【０１３１】
（実施例２）
パラジウムとニオブの原子比率が１００：０、９０：１０、７９：２１、７５：２５、６９：３１、６０：４０、０：１００の７種類の電極をそれぞれ実施例１と同様に製作し、同様に作用電極９として実験に供試した。
【０１３２】
次に、参照電極として既存のガラス複合電極（東亞ディーケーケー（株）社製、ＧＳＴ−５７４１Ｃ）、と対極として既存の白金電極（ＢＡＳ社製、００２２３３）を用意した。
【０１３３】
続いて、実施例１の指示電解質に終濃度として２ｍＭ（２ｍｏｌ／ｍ３）の過酸化水素（関東化学社製）および１０ｍＭ（１０ｍｏｌ／ｍ３）のアスコルビン酸（和光純薬工業社製）に対する定電位測定を行った。測定は前述の作用電極９を前述の指示電解質に浸漬し、０．７Ｖの電位を印加後、定常状態となるまで放置した（約５分間）。
【０１３４】
その後、終濃度として前述の濃度となるように過酸化水素ならびにアスコルビン酸をそれぞれ添加した。
【０１３５】
応答電流値は過酸化水素ならびにアスコルビン酸から得られる電流値から定常状態の電流値の差とした。結果を図７に示す。
【０１３６】
その結果、本実施例の７種類のパラジウム−ニオブ合金の電極は、パラジウム単体と同様に過酸化水素とアスコルビン酸に反応するが、この反応に電極間によって大きな差が認められた。すなわち、パラジウムとニオブの原子比率が７５：２５の電極は、アスコルビン酸よりも過酸化水素に選択的に応答することがわかった。一方で、７５：２５の原子比率以外の電極は過酸化水素よりもアスコルビン酸の応答が高くなり、また、ニオブ含量の増加と共に、過酸化水素の応答は低下することがわかった。
【０１３７】
以上の結果から、７５：２５の比率のパラジウムとニオブの合金がアンペロメトリック型のバイオセンサの電極として好適に使用できることが示された。
【０１３８】
（実施例３）
実施例２で用いた電極のうち、パラジウムとニオブの原子比率が１００：０と７５：２５の２種類の電極，およびコントロールの電極として白金電極を用意し、０．１Ｍ（１００ｍｏｌ／ｍ３）の硫酸ナトリウム溶液中で電気化学クリーニングを行った。
【０１３９】
クリーニング条件は−１．５Ｖ〜＋１．５Ｖの範囲を０．５Ｖ／ｓで１００回掃引するものである。
【０１４０】
続いて、純水で１ｖ／ｖ％に希釈したガンマ−アミノプロピルトリエトキシシラン（信越化学社製）を電極表面にスピンコートし、１１０℃で乾燥させた。
【０１４１】
続いて、前出した指示電解質溶液で調整した牛アルブミン溶液（和光純薬工業社製）と純水で０．５ｖ／ｖ％に調整したグルタルアルデヒド溶液（アルドリッチ社製）、および１８９．４Ｕ／μｌに調整したグルコース酸化酵素を混合し、すみやかに同様にスピンコートし、グルコース酵素センサ（バイオセンサ用電極）を製作した。
【０１４２】
続いて、終濃度として１０ｍｇ／ｄｌ（０．１×１０−３ｋｇ／ｌ）グルコース（和光純薬工業社製）に対する定電位測定を行った。
【０１４３】
測定はグルコース酵素センサを作用極、既存のガラス複合電極（東亞ディーケーケー（株）社製、ＧＳＴ−５７４１Ｃ）を参照電極、そして既存の白金電極（ＢＡＳ社製、００２２３３）を対極とする３電極法で実施した。
【０１４４】
具体的には、これらの電極をを指示電解質に浸漬し、０．７Ｖの電位を印加後、定常状態となるまで放置した（約５分間）。
その後、終濃度として前述の濃度となるようにグルコース溶液を添加した。
グルコースの添加後に得られる電流値から定常状態の電流値の差とした。
なお、印加電位は０．７Ｖとした。
【０１４５】
上記測定を１０回繰り返し、以下の式を用いて繰り返し再現性の値を計算し、比較を行った。
【０１４６】
繰り返し再現性の値（％）＝（電流値の標準偏差／電流値の平均値）×１００…（式）
その結果、繰り返し再現性は白金電極を用いたグルコース酵素センサが２．８％、１００：０の電極を用いたグルコース酵素センサが２．８％、７５：２５の電極を用いたグルコース酵素センサが２．７％を示し、ニオブ添加によるセンサ特性の低下が発生せず、従来の電極である白金電極と同等に使用できることがわかった。
【０１４７】
（実施例４）
初めに実施例３で記載したグルコース酵素センサを製作した。
続いて、前述の支持電解質溶液中に保管し、一定時間ごとに１０ｍｇ／ｄｌ（０．１×１０−３ｋｇ／ｌ）グルコースに対する応答電流を測定し長期使用寿命を評価した。測定条件は実施例３と同様である。評価方法は毎日前述の測定を行い、２日間事に１４日間続けた。結果を図８に示す。
【０１４８】
その結果、白金電極を用いたグルコース酵素センサ、１００：０の電極を用いたグルコース酵素センサ，および７５：２５の電極を用いたグルコース酵素センサともにほとんど変動せず、極めて安定していることがわかった。なお、図中における“黒三角”は白金電極で製作されたグルコース酵素センサ、“黒四角”はパラジウムのみの電極（１００：０）で製作されたグルコース酵素センサ、“黒丸”はパラジウムとニオブの比率が７５：２５の電極で製作されたグルコース酵素センサの電流値である。
【０１４９】
以上の結果から、電極材料としてパラジウムにニオブを添加しても、長期使用寿命に影響を与えないことがわかった。
【０１５０】
（実施例５）
パラジウムとニオブの原子比率が７５：２５の電極を用意し、０．１Ｍの硫酸ナトリウム溶液中で電気化学クリーニングを行った。クリーニング条件は−１．５Ｖ〜＋１．５Ｖの範囲を０．５Ｖ／ｓで１００回掃引するものである。
【０１５１】
続いて、純水で１ｖ／ｖ％に希釈したガンマ−アミノプロピルトリエトキシシラン（信越化学社製）を電極表面にスピンコートし、１１０℃で乾燥させた。
【０１５２】
続いて、５ｍＭのヒト絨毛性ゴナドトロピン抗体、１００ｍＭのカルボジイミド、１００ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドの混合溶液にパラジウム−ニオブ合金を３０分間浸漬し、ヒト絨毛性ゴナドトロピン抗体をパラジウム−ニオブ合金表面に固定化した。
【０１５３】
続いて１ｍＭのモノエタノールアミン溶液に３０分間浸漬し、活性なアミノ基を不活性化した。
【０１５４】
測定は１ｍＭのフェロシアン化カリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＧＥヘルスケアジャパン社製）を含む５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．８）中に抗体を固定化したパラジウム−ニオブ合金を作用極として浸漬し、同時にガラス参照電極、白金の対極も浸漬した。これらの電極を電気化学測定装置（IVIUM Technologies社のIviumStat）に接続し、方形波ボルタンメトリ測定を行った。測定条件は０．３−１．０Ｖ掃引範囲、４０ｍＶのパルス電位、４Ｈｚの周波数、１０ｍＶのステップ電位とした。これらの測定結果を図９に示す。
【０１５５】
まず初めに、ヒト絨毛性ゴナドトロピンを含まない状態で上記測定を１秒間隔で、連続繰り返し掃引した。その結果、電流値は５回目以降に安定し、フェロシアン化カリウムの酸化ピークである０．２２Ｖに酸化電流のピークとして２０μＡ／ｍｍ２の電流が観測された。次に、測定開始後、１０回目に終濃度として１μＭのヒト絨毛性ゴナドトロピンを添加したところ、１１回目の測定から０．２２Ｖの酸化電流値が低下し始め、２０回目には２０％電流値が低下した。電流値が低下した原因はヒト絨毛性ゴナドトロピン抗体にヒト絨毛性ゴナドトロピンが結合することによって、フェロシアン化カリウムの電極表面への透過率が低下したため、電極表面で酸化できるフェロシアン化カリウムの量が低下したためであると考えられる。コントロールとして１μＭのアルブミンを添加しても、電流値の低下や変動は認められなかった。抗原抗体反応が生じないことからフェロシアン化カリウムの電極表面への透過量は変化しなかったためである。
【０１５６】
（実施例６）
パラジウムとニオブの原子比率が７５：２５の電極を用意し、０．１Ｍの硫酸ナトリウム溶液中で電気化学クリーニングを行った。クリーニング条件は−１．５Ｖ〜＋１．５Ｖの範囲を０．５Ｖ／ｓで１００回掃引するものである。
【０１５７】
続いて、エタノールで５ｍＭに希釈した１５−カルボキシ−１−ペンタデカンチオール（同仁化学研究所製）に３時間浸漬し、パラジウム−ニオブ合金の表面にカルボキシル基を導入した。
【０１５８】
続いて、５ｍＭのトリプシンインヒビター抗体、１００ｍＭのカルボジイミド、１００ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドの混合溶液にパラジウム−ニオブ合金を３０分間浸漬し、トリプシンインヒビター抗体をパラジウム−ニオブ合金表面に固定化した。
【０１５９】
続いて１ｍＭのモノエタノールアミン溶液に３０分間浸漬し、活性なアミノ基を不活性化した。
【０１６０】
測定は１ｍＭのフェロシアン化カリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＧＥヘルスケアジャパン社製）を含む５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．８）中に抗体を固定化したパラジウム−ニオブ合金を作用極として浸漬し、同時にガラス参照電極、白金の対極も浸漬した。これらの電極を電気化学測定装置（IVIUM Technologies社のIviumStat）に接続し、方形波ボルタンメトリ測定を行った。測定条件は０．３−１．０Ｖ掃引範囲、４０ｍＶのパルス電位、４Ｈｚの周波数、１０ｍＶのステップ電位とした。これらの測定結果を図１０に示す。
【０１６１】
まず初めに、トリプシンインヒビターを含まない状態で上記測定を１秒間隔で、連続繰り返して行った。その結果、電流値は５回目以降に安定し、フェロシアン化カリウムの酸化ピークである０．２２Ｖに酸化電流のピークとして２０μＡ／ｍｍ２の電流が観測された。そして、測定開始後、１０回目に終濃度として１μＭのトリプシンインヒビターを添加したところ、１１回目の測定から電流値が低下し始め、２０回目には２２％電流値が低下した。電流値が低下した原因はトリプシンインヒビター抗体にトリプシンインヒビターが結合することによって、フェロシアン化カリウムの電極表面への透過率が低下したためであると考えられる。コントロールとして１μＭのストレプトアビジンを添加しても、電流値の低下や変動は認められなかった。抗原抗体反応が生じないことからフェロシアン化カリウムの電極表面への透過量は変化しなかったためである。
【０１６２】
（実施例７）
パラジウムとニオブの原子比率が７５：２５の電極を用意し，０．１Ｍの硫酸ナトリウム溶液中で電気化学クリーニングを行った。クリーニング条件は−１．５Ｖ〜＋１．５Ｖの範囲を０．５Ｖ／ｓで１００回掃引するものであり、電極面積は５ｍｍ２とした。
【０１６３】
次に、末端の一方をフェロセンで修飾し、もう一方の末端をチオールで修飾したオリゴＤＮＡ（１５ｍｅｒ ＴＧ）を用意した。このオリゴＤＮＡを０．０１ｍｏｌのリン酸緩衝液で１０ｐｍｏｌに調整し、２μｌを電極表面に滴下後、３７℃で２時間放置した。
【０１６４】
その後、１０ミリｍｏｌの６−メルカプトヘキサノールを乗せ４５℃で１時間放置し、パラジウム−ニオブ電極の非修飾部位をマスクした。この電極を銀／塩化銀参照電極、白金製対極と一緒にリン酸緩衝液０．０５Ｍ，塩化カリウム０．１Ｍの混合測定溶液中にて、スクウェアウェイブボルタンメトリ法にて−０．２Ｖ ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌから０．５Ｖ ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌの範囲で電流を測定した。
その結果、０．２Ｖをピークとするフェロセンの酸化に由来する電流が観測された。
【０１６５】
次に、このリン酸溶液中にＰｏｌｙＡＣオリゴヌクレオチドを添加し、終濃度を１００ｐｍｏｌとした。その後、同様にスクウェアウェイブボルタンメトリ法で測定した。
この測定結果を図１１に示す。
【０１６６】
図１１における棒グラフは、０．２ＶにおけるＰｏｌｙＡＣオリゴヌクレオチドの添加の前後の電流値を示している。
また、グラフ中ではＰｏｌｙＡＣオリゴヌクレオチドをＰＯＮと記載している。
【０１６７】
図１１に示すように、ＰｏｌｙＡＣオリゴヌクレオチドを添加することによって電流値が低下することが明らかになった。これは、ＰｏｌｙＡＣオリゴヌクレオチドが、パラジウム−ニオブ電極表面に固定化されたオリゴＤＮＡとハイブリダイズすることにより、電極活性物質であるフェロセンの酸化反応に影響を与えたためであると考えられる。
【０１６８】
以上のように、本発明によれば、白金電極およびパラジウム電極の代替材料としてパラジウム−ニオブ合金の電極が適用できることがわかった。
【０１６９】
また、この電極を用いて酵素センサを製作した場合、白金電極と同様に測定できる酵素センサを提供できることがわかった。
【０１７０】
さらに、この電極を用いて抗体センサを製作した場合、抗原抗体反応に起因する反応を電流値として検出できる抗体センサを提供できることがわかった。
【０１７１】
さらに、このパラジウム−ニオブ合金をＤＮＡアプタマーの電極として使用できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１７２】
以上、実施形態および実施例に基づき本発明を説明したが、本発明はこれらに限定されない。当業者であれば本発明の範囲内において、各種変形例および改良例に相当するのは当然のことであり、これらも本発明の範囲内に含まれるものと了承される。
【符号の説明】
【０１７３】
１…………電気化学測定装置用電極
３…………電気化学測定装置
３ａ………バイオセンサ
３ｂ………バイオセンサ
４…………バイオセンサ用電極
５…………参照電極
６…………固定化触媒層
７…………対極
９…………作用電極
１１………配線
１３………測定装置
１５………溶液
２３………絶縁基板
２４………結合層
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気化学測定装置用電極、電気化学測定装置用電極を用いた電気化学測定装置、およびバイオセンサ用電極に関する。
【背景技術】
【０００２】
多種多様な溶液に含まれる各種成分の分析は、電極表面で生じる電気化学反応を測定する方法や、同反応と特定のタンパク質が持つ触媒反応とを組み合わせた測定方法が広く用いられている。
【０００３】
前述の例としては、洗浄液等に使用されている溶液中の過酸化水素濃度は、カーボン電極、あるいは白金等の貴金属電極を用い、印加時に得られる過酸化水素の酸化電流値を測定することによって算出することができる。
【０００４】
この理由は印加時に過酸化水素の濃度に応じた酸化電流が発生するためである。
【０００５】
後述の例としては、溶液中の化学物質を酵素の触媒機能により、過酸化水素に変換し、この過酸化水素を酸化還元反応により計測するバイオセンサが汎用化している。
【０００６】
具体的には、グルコースバイオセンサの場合、グルコースをグルコースオキシダーゼによって酸化すると、グルコノラクトンと過酸化水素が生成される。
【０００７】
生成される過酸化水素はグルコース濃度に比例することから、この過酸化水素の生成量を測定することによって試料中のグルコース量を定量することが可能になる。
【０００８】
この過酸化水素の生成量は、前述したように電極表面で生じる電気化学反応を測定することによって算出されている。
【０００９】
ここで、この種の電極においては、過酸化水素に対する酸化能力の高い材料として貴金属が使用される場合が多い。
【００１０】
例えば特許文献１の図１に示されている電極材料は、白金が好ましく用いられると記載されている（特許文献１）。
【００１１】
また、非特許文献１のＦｉｇｕｒｅ２に示されている作用極の材料は白金であり、両電極共に、過酸化水素に対する印加後の電流値を測定することによってグルコース量を測定するものであった（非特許文献１）。
【００１２】
さらに、非特許文献２で公開されている電極材料は酸化イリジウムである（非特許文献２）。
【００１３】
また、その他のこの種の電極としては、イリジウム−ニッケル合金が用いられている（特許文献２）。
【００１４】
一方、特許文献３には、溶液中の過酸化水素濃度を測定する電極として、パラジウムが用いられる旨が開示されている（特許文献３）。
【００１５】
さらに、特許文献４においては、パラジウムやニオブ，およびこれらの酸化物が電極材料として記載されている（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特開２００１−１１６７１６号公報
【特許文献２】特開２０１０−０６０３７５号公報
【特許文献３】特開平０５−０７２１６０号公報
【特許文献４】米国特許７４７６８２７号明細書
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】G.Piechotta,J.Albers and R.Hintsche”,Novel micromachined silicon sensor for continuous glucose monitoring”,Biosensors and Bioelectronics,Volume21,Issue5, Elsevier B.V,（Netherlands）,15 novemember 2005,p.802-808
【非特許文献２】Faming Tian and Guoyi Zhu,”Sol-gel derived iridium composite glucouse biosensor”,Sensors and Actuators B：Chemical,Elsevier B.V, （Netherlands）,Volume86,September 2002,p.266-270
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
特許文献１、非特許文献１のような白金を用いた電極は、過酸化水素の検出用電極およびそれを用いた電気化学測定装置やバイオセンサ用の電極としては有用である。
【００１９】
しかしながら、白金を電極材料に用いて製作された電流検出型の過酸化水素センサの場合においては、白金は希少金属であるために、非常に高価になってしまうという問題があった。
【００２０】
一方で、非特許文献２や特許文献３のように、イリジウムやパラジウムを電極材料に用いた場合、白金よりも安価であるものの、さらにコストを下げる工夫が要求されている。
【００２１】
また、特許文献２のイリジウム−ニッケル合金は、イリジウム単体よりも安価ではあるものの、電流検出型の過酸化水素センサもしくはバイオセンサは過酸化水素の酸化力が白金よりも劣るという問題がある。
【００２２】
さらに、特許文献４では、パラジウムやニオブ、これらの酸化物や合金を電極材料に用いることができる旨は記載さているが、特性については全く記載されていない。このため、これらの材料が電流検出型の過酸化水素センサもしくはバイオセンサに適用できるかどうかは全く不明である。
【００２３】
本発明は上記理由に鑑みてなされたものであり、その目的は、白金およびパラジウム電極の代替となる電気化学測定装置用電極を提供することである。
【００２４】
より詳しくは、白金ならびにパラジウムと同等、もしくはそれ以上に過酸化水素に対して高い電流出力を生じさせることができる電極材料を用いて製作される電気化学測定装置用電極を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
前述した目的を達成するために、本発明の第１の態様は、パラジウムとニオブとを、過酸化水素に対して電流出力を生じさせることが可能な組成となるように含有した合金で構成されていることを特徴とする電気化学測定装置用電極である。
【００２６】
本発明の第２の態様は、第１の発明に記載の電気化学測定装置用電極を有することを特徴とする電気化学測定装置である。
【００２７】
第３の発明は、第１の発明に記載の電気化学測定装置用電極の表面に、固定化触媒層を設けてなることを特徴とするバイオセンサ用電極である。
【００２８】
第４の発明は、第３の発明に記載のバイオセンサ用電極を有することを特徴とするバイオセンサである。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、白金およびパラジウム電極の代替となる電気化学測定装置用電極を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】電気化学測定装置３を示す模式図である。
【図２】図２（ａ）は、バイオセンサ３ａを示す模式図であって、図２（ｂ）は、図２（ａ）の作用電極９ａ（バイオセンサ用電極４）の縦断面図を示す図である。
【図３】バイオセンサ３ｂを示す模式図である。
【図４】図３のバイオセンサ用電極４ａのＡ方向から見た断面図である。
【図５】実施例１の実験結果を示す図である。
【図６】実施例１の実験結果を示す図である。
【図７】実施例２の実験結果を示す図である。
【図８】実施例４の実験結果を示す図である。
【図９】実施例５の実験結果を示す図である。
【図１０】実施例６の実験結果を示す図である。
【図１１】実施例７の実験結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、図面に基づいて本発明に好適な実施形態を詳細に説明する。
【００３２】
まず、図１を参照して、本発明の第１の実施形態に係る電気化学測定装置用電極１を有する電気化学測定装置３の構成を説明する。
【００３３】
ここでは、電気化学測定装置３として、溶液１５中に含まれる特定成分としての過酸化水素の濃度を測定する電気化学測定装置が例示されている。
【００３４】
図１に示された電気化学測定装置３は、溶液１５中の過酸化水素を酸化する作用電極９（電気化学測定装置用電極１）、電位の基準となる電極である参照電極５、および必要に応じて設けられる対極７を有している。
【００３５】
さらに、電気化学測定装置３は、測定の際の電位の印加等の制御および酸化電流を計測して過酸化水素濃度の測定を行う測定装置１３、各電極と測定装置１３を接続する配線１１を有している。
【００３６】
電気化学測定装置３は、作用電極９、対極７、参照電極５を過酸化水素を含む溶液１５中に浸漬し、測定装置１３を介して例えば定電位を印加し、作用電極９の表面で過酸化水素が酸化される際に得られる酸化電流の値を測定することにより、溶液１５中の過酸化水素濃度を測定する装置である。
【００３７】
即ち、電気化学測定装置３は、電流検出方式により、溶液中の過酸化水素の濃度を測定する。
【００３８】
ここで、前述の通り、作用電極９は、白金ならびにパラジウムと同様に過酸化水素に対して効率よく電流出力を生じさせることができ、安価な材料であることが望ましい。
【００３９】
上記問題に対して、発明者らは鋭意検討の結果、電極に、パラジウムとニオブを含み、かつ、パラジウムとニオブとを、過酸化水素に対して電流出力を生じさせることが可能な組成となるように含有した合金を用いることにより、白金やパラジウムのみを用いた電極よりも安価な電極とすることが可能であることを見出した。
【００４０】
以下、合金中の各物質についてより詳細に説明する。
パラジウムは、過酸化水素に対する高い酸化力を有し、かつ従来の作用電極の材料として用いられる白金と比べて、安価で加工性に優れた材料であり、溶液１５中の過酸化水素を酸化するために必須である。
【００４１】
ニオブは白金やパラジウムと比べて安価な元素であり、また、パラジウムと特定の割合で合金化することにより、当該合金が過酸化水素に対する酸化力を有するため、必須である。
【００４２】
ここで、合金中のパラジウムとニオブの含有率は、原子比率が９０：１０〜６０：４０の範囲であることが望ましく、７９：２１〜６９：３１の範囲であることがより望ましい。
【００４３】
上記組成範囲外では、十分な過酸化水素に対する選択性が得られなくなるという問題を生じる。
【００４４】
この原因はパラジウムとニオブの比率によって、合金の結晶構造や結晶方位が異なるためと考えられる。
【００４５】
即ち、合金の結晶構造や結晶方位が異なると、過酸化水素を酸化する分子レベルの部位が異なるため、過酸化水素の酸化力が変動するものと考えられる。
【００４６】
さらに、電極を構成する合金には、パラジウムとニオブの原子比率が３：１であり、結晶構造がＤ２２型である化合物を含有させるのが特に望ましい。これは、このような化合物を合金に含有させることにより、特定電位の印加時において、過酸化水素などの電極活物質を酸化もしくは還元する作用、すなわち触媒機能が向上する作用が生じるためである。このような作用が生じる原因としては、これらの電極活物質を酸化もしくは還元する合金の反応部位が、この結晶構造において、最も高密度（全体面積に占める反応部位の面積）になるからである。この結果、これらの電極活物質から効率的かつ大きな酸化還元電流が得られるようになり、Ｓ／Ｎ比の高い電極を構築することが可能になる。
なお、合金をパラジウムとニオブのみで構成してもよい。
【００４７】
上記合金は、例えばアーク放電法、蒸着法、スパッタリング法によって製造されるが、材料を無駄なく利用できる点において、アーク放電法によって製造されるのが好ましい。
【００４８】
なお、参照電極５としては公知の電極を用いることができ、例えばガラス複合電極が用いられる。
また、対極７としても公知の電極を用いることができ、例えば白金電極が用いられる。
【００４９】
ここで、電気化学測定装置３を用いた、溶液１５中の過酸化水素の濃度の測定方法について詳細に説明する。
【００５０】
まず、作用電極９、対極７、参照電極５を、過酸化水素を含まない溶液１５中に浸漬する。
【００５１】
各電極が溶液１５中に浸漬されると、測定装置１３を用いて定電位を印加し、電流値が定常状態になってから過酸化水素を添加する。
【００５２】
電位の印加により、作用電極９の表面では過酸化水素が酸化され、酸化電流が生じる。
【００５３】
測定装置１３は定常状態の電流値から酸化電流の差を元に、溶液１５中の過酸化水素濃度を算出する。
【００５４】
溶液１５に過酸化水素が添加された溶液としては、例えば食品製造に用いられる洗浄液が該当する。
なお、測定方法は上記した定電位測定に限定されるものではない。
【００５５】
即ち、定電位測定の他にも、サイクリックボルタンメトリ測定、パルスボルタンメトリ測定、方形波ボルタンメトリ測定などを用いることができる。
【００５６】
ただし、上記方法の中では、定電位測定が好ましい。これは定電位状態での酸化電流を測定する場合、過酸化水素に対する応答時間が速く、短時間で電流値を測定できるからである。
【００５７】
このように、第１の実施形態によれば、電気化学測定装置３は、作用電極９、対極７、参照電極５、測定装置１３を有し、作用電極９は、パラジウムとニオブを含み、かつ、パラジウムとニオブとを、過酸化水素に対して電流出力を生じさせることが可能な組成となるように含有した合金が用いられている。
【００５８】
そのため、作用電極９は、白金やパラジウムのみを用いた電極よりも安価であり、白金、パラジウム電極の代替電極として用いることができる。
【００５９】
次に、第２の実施形態について、図２を参照して説明する。
第２の実施形態は、第１の実施形態において、作用電極９ａを、表面が触媒機能を有する固定化触媒層６で覆われたバイオセンサ用電極４とし、装置全体をバイオセンサ３ａとしたものである。
【００６０】
なお、第２の実施形態において、第１の実施形態と同様の効果を奏する要素については同一の番号を付し、説明を省略する。
【００６１】
図２（ａ）に示すように、バイオセンサ３ａの構成は電気化学測定装置３と同様であるが、表面が固定化触媒層６で覆われた作用電極９ａ（バイオセンサ用電極４）を有している。
【００６２】
さらに、バイオセンサ３ａは、測定の際の電位の印加等の制御および酸化電流を計測して、測定対象物質の濃度を測定する測定装置１３ａを有している。
【００６３】
図２（ｂ）に示すように、バイオセンサ用電極４は、電気化学測定装置用電極１と、電気化学測定装置用電極１の表面に設けられた固定化触媒層６を有している。
【００６４】
電気化学測定装置用電極１の構造、組成は、第１の実施形態に係る電気化学測定装置用電極１と同様であり、パラジウムとニオブを含み、かつ、パラジウムとニオブとを、過酸化水素に対して電流出力を生じさせることが可能な組成となるように含有した合金が用いられている。
【００６５】
固定化触媒層６は、例えば固定化酵素層、固定化抗体層、（固定化）ＤＮＡ層、（固定化）ＲＮＡ層である。
【００６６】
固定化酵素層は、測定対象物質を過酸化水素に変換する酵素を含む層である。
【００６７】
固定化触媒層６が固定化酵素層の場合、バイオセンサ３ａは、固定化触媒層６の酵素が測定対象物質を過酸化水素に変換し、得られた過酸化水素が電気化学測定装置用電極１の表面で酸化される際に生じる酸化電流を測定することにより、溶液１５ａ中の測定対象物質の濃度を測定することができる。
【００６８】
即ち、バイオセンサ３ａは、電流検出方式により、溶液中の過酸化水素の濃度を測定することにより、溶液中の測定対象物質の濃度を測定することができる。
【００６９】
酵素としては、測定対象物質の触媒反応の生成物として過酸化水素を生成する、または酸素を消費する酵素である必要があり、測定対象物質に応じて乳酸酸化酵素、グルコース酸化酵素、尿酸酸化酵素、アルコール酸化酵素等の酸化酵素が用いられる。
【００７０】
また、２種類以上の酵素を同時に用いてもよい。例えば、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、およびサルコシンオキシダーゼがこれに該当する。
【００７１】
これらの酵素を用いることによってクレアチニンの検出が可能になる。
さらに、酵素と補酵素を同時に用いる方法も適用できることは言うまでもない。
【００７２】
まず、固定化触媒層６として酵素を用いる場合、固定化触媒層２を固定する方法としては、酵素をアルブミン等のタンパク質とグルタルアルデヒド等の架橋剤を用いて固定化する方法が好ましく使われる。
【００７３】
また、酵素を固定化する前に、パラジウム−ニオブ合金の表面をシランカップリング剤などで表面を処理しておき、酵素の固定化強度を高めてもよい。
【００７４】
シランカップリング剤の種類としては、アミノシラン、ビニルシラン、エポキシシランが挙げられるが、このうち、密着性の観点から、アミノシランの一種であるγ−アミノプロピルトリエトキシシランが好ましい。処理方法は電極の形状を考慮するとデップコート法やスプレーコート法などが好ましい。
【００７５】
一方、固定化触媒層６として抗体を用いる場合、抗体としては、ダイオキシン抗体、内分泌攪乱物質、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、残留農薬の抗体が好ましく用いられるが、これ以外の抗体も使用可能である。
【００７６】
抗体の固定化方法は特に限定されないが、合金表面にカルボキシル基やアミノ基を導入後、カルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドで両基を活性化させた後抗体を固定化する方法が好ましく使われる。
【００７７】
具体的に説明すると、まず、パラジウム−ニオブ合金の表面をアミノ基を持ったシランカップリング剤で処理を施し、アミノ基を導入する。密着性の観点からは、アミノシランの一種であるγ−アミノプロピルトリエトキシシランを用いるのが好ましい。その後、カルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドでこのアミノ基を活性化した後、抗体を固定化する。
【００７８】
その他の抗体の固定化方法としてはパラジウム−ニオブ合金の表面をチオール基とカルボン酸から主としてなるカルボキシチオールなどで処理を施し、カルボキシル基を導入する。その後、同様にカルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドでこのアミノ基を活性化した後、抗体を固定化する方法が挙げられる。
【００７９】
測定方法は第１の実施形態で挙げた方法と同様の測定方法を用いることができる。
【００８０】
また、ボルタンメトリ法としてはノーマルパルスボルタンメトリ法、微分パルスボルタンメトリ法等を用いても良いし、あるいはサイクリックボルタンメトリ法を用いてもよい。
【００８１】
ただし、高い測定精度を得られるという点で方形波ボルタンメトリ法が好ましい。
これは、抗体内に含まれる電極活性物質を高感度に測定できるからである。
【００８２】
また、その他の測定方法としては、予め、電極活性物質を測定前の溶液中に加えておき、抗原抗体反応によって生じる電極表面への電極活性物質の低下量を、酸化還元電流として測定する方法もある。
【００８３】
なお、前述のように、固定化触媒層２は、酵素を含む場合、測定対象物質を過酸化水素に変換する機能を持つ構成を、抗体を含む場合、特定の印加電位において電子の授受が発生し、出力として電流値を生じる構成を、また、抗原抗体反応によって電極活性物質の電極表面への透過量が低下する構成を、それぞれ有するものであれば、特に限定されない。
【００８４】
一方、固定化触媒層２として（固定化）ＤＮＡ層、（固定化）ＲＮＡ層を用いる場合、ＤＮＡ／ＲＮＡは特に限定されず、ＤＮＡもしくはＲＮＡアプタマーが好ましい。
【００８５】
これは、ＤＮＡもしくはＲＮＡアプタマーに人工的に電極活性物質を修飾できるからである。
【００８６】
電極活性物質としてはインターカレータであるフェロセン化ナフタレンジイミド（ferrocenylnaphthalene diimide）、キナクリン（qunacrine）、アクリジンオレンジ（acridine orange）、プロフラビン（proflavine）、メチレンブルー（methylene blue）、エチジウムブロマイド（ethidium bromaide）、ドーノマイシン（duanomycin）、ドーノルビシン（daunorubicin）、ポリインターカレータであるエチノマイシン（echinomycin）、溝結合試薬であるヘキスト（Hoechest 33258, Hoechest 33342）、Dapi（４’，６−Diamidino−２−phenylindole， dihydrochloride），ディスタマイシン（distmycin）に結合する金属錯体誘導体、Ｃｏ（phen）３３＋， Ｒｕ（bpy）３２＋などが挙げられ、また、共有結合的に電気化学活性物質を結合させたものを利用することも可能である。
【００８７】
これらの電極活性物質を人工的に修飾したＤＮＡもしくはＲＮＡアプタマーは電気化学測定装置用電極１の表面に固定化される。
【００８８】
固定化に際しては直接これらのアプタマーを電極表面に接触させもよいが、電極活性物質が修飾されていない方のアプタマーの末端にチオール基を新たに修飾して、このチオール基を介してこれらのアプタマーを電極表面に固定化してもよい。
【００８９】
このようにして作製したバイオセンサ用電極４を作用極として用いることによって、これらの電極活性物質の酸化電流を高感度で測定することが可能になる。
【００９０】
その結果、ＤＮＡもしくはＲＮＡアプタマーのバイオセンサとして、これらのアプタマーのアナライトを高感度で検出することが可能になる。
【００９１】
ここで、バイオセンサ３ａを用いた溶液１５ａ中の測定対象物質の濃度の測定方法について詳細に説明する。
【００９２】
まず、作用電極９ａ、対極７、参照電極５を、測定対象物質を含まない溶液１５ａ中に浸漬する。
【００９３】
ここで、固定化触媒層６が固定化酵素層の場合は、各電極が溶液１５ａ中に浸漬されると、測定装置１３ａを介して定電位を印加し、定常状態になってから測定対象物質を添加する。
【００９４】
各電極が測定対象物質が添加された溶液１５ａ中に浸漬されると、溶液１５ａ中の測定対象物質は作用電極９ａの固定化酵素層と接触し、触媒反応により、過酸化水素に変換される。
【００９５】
得られた過酸化水素は、電位の印加により、作用電極９ａの電気化学測定装置用電極１の表面で酸化され、酸化電流が生じる。
【００９６】
測定装置１３ａは酸化電流から定常状態の電流値の差から過酸化水素濃度を算出する。
【００９７】
さらに、測定装置１３ａは測定した過酸化水素濃度をもとに、溶液１５ａ中の測定対象物質の濃度を測定する。
【００９８】
固定化触媒層２が固定化抗体層の場合は、各電極が溶液１５ａ中に浸漬されると、抗体と測定対象物質が反応するため、測定装置１３ａを介して、例えば方形波ボルタンメトリ法にて、反応により得られる電流値を測定し、電流値をもとに、溶液１５ａ中の測定対象物質の濃度を測定する。
【００９９】
このように、第２の実施形態によれば、バイオセンサ３ａは、作用電極９ａ、対極７、参照電極５、測定装置１３ａを有し、作用電極９ａの電気化学測定装置用電極１は、パラジウムとニオブを含む合金が用いられており、上記合金は過酸化水素に対して電流出力を生じさせることが可能な組成となっている。
そのため、第１の実施形態と同様の効果を奏する。
【０１００】
次に、第３の実施形態について図３および図４を参照して説明する。
第３の実施形態におけるバイオセンサ３ｂは、第２の実施形態において、電気化学測定装置用電極１を絶縁基板２３上に設け、電気化学測定装置用電極１と固定化触媒層６の間に結合層２４をさらに設けて作用電極２５ａ（バイオセンサ用電極４ａ）を構成したものである。
【０１０１】
図３および図４に示すように、作用電極２５ａ（バイオセンサ用電極４ａ）は絶縁基板２３、絶縁基板２３の表面に設けられた電気化学測定装置用電極１を有している。
【０１０２】
また、図４に示すように、作用電極２５ａ（バイオセンサ用電極４ａ）は、図４における電気化学測定装置用電極１の上方に固定化触媒層６が設けられている。
【０１０３】
さらに、作用電極２５ａは、電気化学測定装置用電極１と固定化触媒層６の間に設けられ、かつ電気化学測定装置用電極１を覆うように絶縁基板２３および電気化学測定装置用電極１上に設けられた結合層２４を有している。
結合層２４上には、固定化触媒層６が設けられている。
【０１０４】
なお、電気化学測定装置用電極１、固定化触媒層６、結合層２４で電極部１０を構成している。
【０１０５】
絶縁基板２３は電極部１０を保持する部材であり、耐水性、耐熱性、耐薬品性、絶縁性および電気化学測定装置用電極１との密着性に優れた材料であることが好ましい。
【０１０６】
このような要件を満たす材料としては、例えばセラミックス、ガラス、石英、プラスチックスが挙げられる。
【０１０７】
結合層２４は、固定化触媒層６と絶縁基板２３および電気化学測定装置用電極１との密着性（結合性）を向上させるために設けられるものである。
【０１０８】
また、結合層２４は、絶縁基板２３の表面のぬれ性を改善し、固定化触媒層６を形成する際の膜厚の均一性を向上させる効果も有している。
【０１０９】
結合層２４を構成する材料としては、例えばシランカップリング剤が挙げられる。
シランカップリング剤の種類としては、アミノシラン、ビニルシラン、エポキシシランが挙げられるが、このうち、密着性の観点から、アミノシランの一種であるγ−アミノプロピルトリエトキシシランがより好ましい。
【０１１０】
結合層２４は例えばシランカップリング剤溶液をスピンコートすることにより絶縁基板２３および電気化学測定装置用電極１上に形成することができる。
【０１１１】
この際、シランカップリング剤濃度は１ｖ／ｖ％（体積／体積％）程度とすることが好ましい。この濃度であれば、アルコキシル基が十分に水和し、十分な密着性が発揮されるからである。
【０１１２】
なお、図４では一枚の絶縁基板２３上に１つの電極部１０が設けられているが、一枚の絶縁基板２３上に複数の電極部１０を設けてもよい。
【０１１３】
また、図３では対極７および参照電極５も別々の絶縁基板２３上に形成されているが、全ての電極を一枚の絶縁基板２３上に形成してもよい。
【０１１４】
ここで、作用電極２５ａの製造方法について、簡単に説明する。
まず、絶縁基板２３上に、電気化学測定装置用電極１を蒸着法、またはスパッタリング法等を用いて設ける。
【０１１５】
次に、絶縁基板２３および電気化学測定装置用電極１上に、電気化学測定装置用電極１を覆うようにして結合層２４をスピンコートにより設ける。
【０１１６】
次に、結合層２４上に、酵素溶液、グルタルアルデヒド等の蛋白質の架橋剤、およびアルブミンを含む溶液を、滴下することにより固定化触媒層６としての固定化酵素層が形成され、作用電極２５ａが完成する。
【０１１７】
なお、バイオセンサ３ｂを用いた、溶液中１５ａ中の測定対象物質の濃度の測定方法については、第２の実施形態と同様であるため、説明を省略する。
【０１１８】
このように、第３の実施形態によれば、バイオセンサ３ｂは、作用電極２５ａ、対極７、参照電極５、測定装置１３ａを有し、作用電極２５ａの電気化学測定装置用電極１は、パラジウムとニオブを含む合金が用いられており、上記合金は過酸化水素に対して電流出力を生じさせることが可能な組成となっている。
そのため、第２の実施形態と同様の効果を奏する。
【０１１９】
また、第３の実施形態によれば、作用電極２５ａは、電気化学測定装置用電極１を絶縁基板２３上に設け、電気化学測定装置用電極１と固定化触媒層６の間に結合層２４をさらに設けた構造を有している。
【０１２０】
そのため、第２の実施形態と比較して、固定化触媒層６と電気化学測定装置用電極１との密着性（結合性）を向上させることができ、また、固定化触媒層６を形成する際の膜厚の均一性を向上させることができる。
【実施例】
【０１２１】
次に、具体的な実施例に基づき、本発明をさらに詳細に説明する。
【０１２２】
（実施例１）
図１に示す電気化学測定装置３をパラジウム−ニオブ合金の電極を用いて作製し、指示電解質溶液に対するサイクリックボルタンメトリ測定を行い、パラジウムおよびニオブのみで構成された電極を用いた場合と比較した。
【０１２３】
まず、作用電極９（電気化学測定装置用電極１）の製作を以下のように行った。
はじめに、パラジウムワイヤー（フルウチ化学社製）とニオブワイヤー（フルウチ化学社製）を用意し、アーク放電によってパラジウム−ニオブ合金を製作した。
【０１２４】
具体的には、パラジウムとニオブの原子比率が１００：０、９０：１０、７９：２１、７５：２５、６９：３１、６０：４０、０：１００の７種類のサンプルを製造した。
【０１２５】
次に、製造したサンプルを、プリント配線が施されたフレキシブル基板に接着剤を用いて固定化し、ワイヤボンデングによって結線した後、信越化学社製のシリコーン封止剤で防水処理を施し、作用電極９（電気化学測定装置用電極１）とした。
なお、作用電極９の電極面積は３６−３９ｍｍ２とした。
【０１２６】
次に、参照電極５として既存のガラス複合電極（東亞ディーケーケー（株）社製、ＧＳＴ−５７４１Ｃ）を用意し、対極７として既存の白金電極（ＢＡＳ社製、００２２３３）を用意した。
【０１２７】
次に、溶液１５として、指示電解質溶液（１００ｍＭ（１００ｍｏｌ／ｍ３）のエヌ−トリス（ハイドロキシ−メチル）−メチル−２−アミノエタンサルフォニックアシッド（同仁化学研究所製ｐＨ緩衝液、ｐＨを７に調整済み、１５０ｍＭ（１５０ｍｏｌ／ｍ３）の塩化ナトリウム（和光純薬工業社製）を含む）を用意し、溶液１５に作用電極９、参照電極５、対極７を浸漬し、配線１１を通じてこれらの電極を測定装置１３としてのＩｖｉｕｍ社製ＣｏｍｐａｃｔＳｔａｔに接続し、電気化学測定装置３を作製した。
【０１２８】
測定は指示電解質溶液に対するサイクリックボルタンメトリ測定を行った。
測定条件は−０．３Ｖ〜＋１．２Ｖの範囲を０．０１Ｖ／ｓで１回掃引するものである。
【０１２９】
得られた結果を図５および図６に示す。
図５に示すように、パラジウムとニオブの原子比率が０：１００のサンプルは過酸化水素に対して酸化電流がほとんど生じなかったが、それ以外のサンプルは全て酸化電流が生じた。また、パラジウムとニオブの原子比率が７５：２５のときに０．７Ｖ付近の印加電位において、過酸化水素の酸化電流が最も高くなり、効率よく過酸化水素を酸化できることがわかった。
【０１３０】
以上の結果から、パラジウムとニオブを所定の割合で含む合金を用いることにより、低コストで過酸化水素を検出可能（過酸化水素に対して電流出力を生じさせることが可能）な電極を提供できることがわかった。
【０１３１】
（実施例２）
パラジウムとニオブの原子比率が１００：０、９０：１０、７９：２１、７５：２５、６９：３１、６０：４０、０：１００の７種類の電極をそれぞれ実施例１と同様に製作し、同様に作用電極９として実験に供試した。
【０１３２】
次に、参照電極として既存のガラス複合電極（東亞ディーケーケー（株）社製、ＧＳＴ−５７４１Ｃ）、と対極として既存の白金電極（ＢＡＳ社製、００２２３３）を用意した。
【０１３３】
続いて、実施例１の指示電解質に終濃度として２ｍＭ（２ｍｏｌ／ｍ３）の過酸化水素（関東化学社製）および１０ｍＭ（１０ｍｏｌ／ｍ３）のアスコルビン酸（和光純薬工業社製）に対する定電位測定を行った。測定は前述の作用電極９を前述の指示電解質に浸漬し、０．７Ｖの電位を印加後、定常状態となるまで放置した（約５分間）。
【０１３４】
その後、終濃度として前述の濃度となるように過酸化水素ならびにアスコルビン酸をそれぞれ添加した。
【０１３５】
応答電流値は過酸化水素ならびにアスコルビン酸から得られる電流値から定常状態の電流値の差とした。結果を図７に示す。
【０１３６】
その結果、本実施例の７種類のパラジウム−ニオブ合金の電極は、パラジウム単体と同様に過酸化水素とアスコルビン酸に反応するが、この反応に電極間によって大きな差が認められた。すなわち、パラジウムとニオブの原子比率が７５：２５の電極は、アスコルビン酸よりも過酸化水素に選択的に応答することがわかった。一方で、７５：２５の原子比率以外の電極は過酸化水素よりもアスコルビン酸の応答が高くなり、また、ニオブ含量の増加と共に、過酸化水素の応答は低下することがわかった。
【０１３７】
以上の結果から、７５：２５の比率のパラジウムとニオブの合金がアンペロメトリック型のバイオセンサの電極として好適に使用できることが示された。
【０１３８】
（実施例３）
実施例２で用いた電極のうち、パラジウムとニオブの原子比率が１００：０と７５：２５の２種類の電極，およびコントロールの電極として白金電極を用意し、０．１Ｍ（１００ｍｏｌ／ｍ３）の硫酸ナトリウム溶液中で電気化学クリーニングを行った。
【０１３９】
クリーニング条件は−１．５Ｖ〜＋１．５Ｖの範囲を０．５Ｖ／ｓで１００回掃引するものである。
【０１４０】
続いて、純水で１ｖ／ｖ％に希釈したガンマ−アミノプロピルトリエトキシシラン（信越化学社製）を電極表面にスピンコートし、１１０℃で乾燥させた。
【０１４１】
続いて、前出した指示電解質溶液で調整した牛アルブミン溶液（和光純薬工業社製）と純水で０．５ｖ／ｖ％に調整したグルタルアルデヒド溶液（アルドリッチ社製）、および１８９．４Ｕ／μｌに調整したグルコース酸化酵素を混合し、すみやかに同様にスピンコートし、グルコース酵素センサ（バイオセンサ用電極）を製作した。
【０１４２】
続いて、終濃度として１０ｍｇ／ｄｌ（０．１×１０−３ｋｇ／ｌ）グルコース（和光純薬工業社製）に対する定電位測定を行った。
【０１４３】
測定はグルコース酵素センサを作用極、既存のガラス複合電極（東亞ディーケーケー（株）社製、ＧＳＴ−５７４１Ｃ）を参照電極、そして既存の白金電極（ＢＡＳ社製、００２２３３）を対極とする３電極法で実施した。
【０１４４】
具体的には、これらの電極をを指示電解質に浸漬し、０．７Ｖの電位を印加後、定常状態となるまで放置した（約５分間）。
その後、終濃度として前述の濃度となるようにグルコース溶液を添加した。
グルコースの添加後に得られる電流値から定常状態の電流値の差とした。
なお、印加電位は０．７Ｖとした。
【０１４５】
上記測定を１０回繰り返し、以下の式を用いて繰り返し再現性の値を計算し、比較を行った。
【０１４６】
繰り返し再現性の値（％）＝（電流値の標準偏差／電流値の平均値）×１００…（式）
その結果、繰り返し再現性は白金電極を用いたグルコース酵素センサが２．８％、１００：０の電極を用いたグルコース酵素センサが２．８％、７５：２５の電極を用いたグルコース酵素センサが２．７％を示し、ニオブ添加によるセンサ特性の低下が発生せず、従来の電極である白金電極と同等に使用できることがわかった。
【０１４７】
（実施例４）
初めに実施例３で記載したグルコース酵素センサを製作した。
続いて、前述の支持電解質溶液中に保管し、一定時間ごとに１０ｍｇ／ｄｌ（０．１×１０−３ｋｇ／ｌ）グルコースに対する応答電流を測定し長期使用寿命を評価した。測定条件は実施例３と同様である。評価方法は毎日前述の測定を行い、２日間事に１４日間続けた。結果を図８に示す。
【０１４８】
その結果、白金電極を用いたグルコース酵素センサ、１００：０の電極を用いたグルコース酵素センサ，および７５：２５の電極を用いたグルコース酵素センサともにほとんど変動せず、極めて安定していることがわかった。なお、図中における“黒三角”は白金電極で製作されたグルコース酵素センサ、“黒四角”はパラジウムのみの電極（１００：０）で製作されたグルコース酵素センサ、“黒丸”はパラジウムとニオブの比率が７５：２５の電極で製作されたグルコース酵素センサの電流値である。
【０１４９】
以上の結果から、電極材料としてパラジウムにニオブを添加しても、長期使用寿命に影響を与えないことがわかった。
【０１５０】
（実施例５）
パラジウムとニオブの原子比率が７５：２５の電極を用意し、０．１Ｍの硫酸ナトリウム溶液中で電気化学クリーニングを行った。クリーニング条件は−１．５Ｖ〜＋１．５Ｖの範囲を０．５Ｖ／ｓで１００回掃引するものである。
【０１５１】
続いて、純水で１ｖ／ｖ％に希釈したガンマ−アミノプロピルトリエトキシシラン（信越化学社製）を電極表面にスピンコートし、１１０℃で乾燥させた。
【０１５２】
続いて、５ｍＭのヒト絨毛性ゴナドトロピン抗体、１００ｍＭのカルボジイミド、１００ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドの混合溶液にパラジウム−ニオブ合金を３０分間浸漬し、ヒト絨毛性ゴナドトロピン抗体をパラジウム−ニオブ合金表面に固定化した。
【０１５３】
続いて１ｍＭのモノエタノールアミン溶液に３０分間浸漬し、活性なアミノ基を不活性化した。
【０１５４】
測定は１ｍＭのフェロシアン化カリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＧＥヘルスケアジャパン社製）を含む５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．８）中に抗体を固定化したパラジウム−ニオブ合金を作用極として浸漬し、同時にガラス参照電極、白金の対極も浸漬した。これらの電極を電気化学測定装置（IVIUM Technologies社のIviumStat）に接続し、方形波ボルタンメトリ測定を行った。測定条件は０．３−１．０Ｖ掃引範囲、４０ｍＶのパルス電位、４Ｈｚの周波数、１０ｍＶのステップ電位とした。これらの測定結果を図９に示す。
【０１５５】
まず初めに、ヒト絨毛性ゴナドトロピンを含まない状態で上記測定を１秒間隔で、連続繰り返し掃引した。その結果、電流値は５回目以降に安定し、フェロシアン化カリウムの酸化ピークである０．２２Ｖに酸化電流のピークとして２０μＡ／ｍｍ２の電流が観測された。次に、測定開始後、１０回目に終濃度として１μＭのヒト絨毛性ゴナドトロピンを添加したところ、１１回目の測定から０．２２Ｖの酸化電流値が低下し始め、２０回目には２０％電流値が低下した。電流値が低下した原因はヒト絨毛性ゴナドトロピン抗体にヒト絨毛性ゴナドトロピンが結合することによって、フェロシアン化カリウムの電極表面への透過率が低下したため、電極表面で酸化できるフェロシアン化カリウムの量が低下したためであると考えられる。コントロールとして１μＭのアルブミンを添加しても、電流値の低下や変動は認められなかった。抗原抗体反応が生じないことからフェロシアン化カリウムの電極表面への透過量は変化しなかったためである。
【０１５６】
（実施例６）
パラジウムとニオブの原子比率が７５：２５の電極を用意し、０．１Ｍの硫酸ナトリウム溶液中で電気化学クリーニングを行った。クリーニング条件は−１．５Ｖ〜＋１．５Ｖの範囲を０．５Ｖ／ｓで１００回掃引するものである。
【０１５７】
続いて、エタノールで５ｍＭに希釈した１５−カルボキシ−１−ペンタデカンチオール（同仁化学研究所製）に３時間浸漬し、パラジウム−ニオブ合金の表面にカルボキシル基を導入した。
【０１５８】
続いて、５ｍＭのトリプシンインヒビター抗体、１００ｍＭのカルボジイミド、１００ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドの混合溶液にパラジウム−ニオブ合金を３０分間浸漬し、トリプシンインヒビター抗体をパラジウム−ニオブ合金表面に固定化した。
【０１５９】
続いて１ｍＭのモノエタノールアミン溶液に３０分間浸漬し、活性なアミノ基を不活性化した。
【０１６０】
測定は１ｍＭのフェロシアン化カリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＧＥヘルスケアジャパン社製）を含む５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．８）中に抗体を固定化したパラジウム−ニオブ合金を作用極として浸漬し、同時にガラス参照電極、白金の対極も浸漬した。これらの電極を電気化学測定装置（IVIUM Technologies社のIviumStat）に接続し、方形波ボルタンメトリ測定を行った。測定条件は０．３−１．０Ｖ掃引範囲、４０ｍＶのパルス電位、４Ｈｚの周波数、１０ｍＶのステップ電位とした。これらの測定結果を図１０に示す。
【０１６１】
まず初めに、トリプシンインヒビターを含まない状態で上記測定を１秒間隔で、連続繰り返して行った。その結果、電流値は５回目以降に安定し、フェロシアン化カリウムの酸化ピークである０．２２Ｖに酸化電流のピークとして２０μＡ／ｍｍ２の電流が観測された。そして、測定開始後、１０回目に終濃度として１μＭのトリプシンインヒビターを添加したところ、１１回目の測定から電流値が低下し始め、２０回目には２２％電流値が低下した。電流値が低下した原因はトリプシンインヒビター抗体にトリプシンインヒビターが結合することによって、フェロシアン化カリウムの電極表面への透過率が低下したためであると考えられる。コントロールとして１μＭのストレプトアビジンを添加しても、電流値の低下や変動は認められなかった。抗原抗体反応が生じないことからフェロシアン化カリウムの電極表面への透過量は変化しなかったためである。
【０１６２】
（実施例７）
パラジウムとニオブの原子比率が７５：２５の電極を用意し，０．１Ｍの硫酸ナトリウム溶液中で電気化学クリーニングを行った。クリーニング条件は−１．５Ｖ〜＋１．５Ｖの範囲を０．５Ｖ／ｓで１００回掃引するものであり、電極面積は５ｍｍ２とした。
【０１６３】
次に、末端の一方をフェロセンで修飾し、もう一方の末端をチオールで修飾したオリゴＤＮＡ（１５ｍｅｒ ＴＧ）を用意した。このオリゴＤＮＡを０．０１ｍｏｌのリン酸緩衝液で１０ｐｍｏｌに調整し、２μｌを電極表面に滴下後、３７℃で２時間放置した。
【０１６４】
その後、１０ミリｍｏｌの６−メルカプトヘキサノールを乗せ４５℃で１時間放置し、パラジウム−ニオブ電極の非修飾部位をマスクした。この電極を銀／塩化銀参照電極、白金製対極と一緒にリン酸緩衝液０．０５Ｍ，塩化カリウム０．１Ｍの混合測定溶液中にて、スクウェアウェイブボルタンメトリ法にて−０．２Ｖ ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌから０．５Ｖ ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌの範囲で電流を測定した。
その結果、０．２Ｖをピークとするフェロセンの酸化に由来する電流が観測された。
【０１６５】
次に、このリン酸溶液中にＰｏｌｙＡＣオリゴヌクレオチドを添加し、終濃度を１００ｐｍｏｌとした。その後、同様にスクウェアウェイブボルタンメトリ法で測定した。
この測定結果を図１１に示す。
【０１６６】
図１１における棒グラフは、０．２ＶにおけるＰｏｌｙＡＣオリゴヌクレオチドの添加の前後の電流値を示している。
また、グラフ中ではＰｏｌｙＡＣオリゴヌクレオチドをＰＯＮと記載している。
【０１６７】
図１１に示すように、ＰｏｌｙＡＣオリゴヌクレオチドを添加することによって電流値が低下することが明らかになった。これは、ＰｏｌｙＡＣオリゴヌクレオチドが、パラジウム−ニオブ電極表面に固定化されたオリゴＤＮＡとハイブリダイズすることにより、電極活性物質であるフェロセンの酸化反応に影響を与えたためであると考えられる。
【０１６８】
以上のように、本発明によれば、白金電極およびパラジウム電極の代替材料としてパラジウム−ニオブ合金の電極が適用できることがわかった。
【０１６９】
また、この電極を用いて酵素センサを製作した場合、白金電極と同様に測定できる酵素センサを提供できることがわかった。
【０１７０】
さらに、この電極を用いて抗体センサを製作した場合、抗原抗体反応に起因する反応を電流値として検出できる抗体センサを提供できることがわかった。
【０１７１】
さらに、このパラジウム−ニオブ合金をＤＮＡアプタマーの電極として使用できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１７２】
以上、実施形態および実施例に基づき本発明を説明したが、本発明はこれらに限定されない。当業者であれば本発明の範囲内において、各種変形例および改良例に相当するのは当然のことであり、これらも本発明の範囲内に含まれるものと了承される。
【符号の説明】
【０１７３】
１…………電気化学測定装置用電極
３…………電気化学測定装置
３ａ………バイオセンサ
３ｂ………バイオセンサ
４…………バイオセンサ用電極
５…………参照電極
６…………固定化触媒層
７…………対極
９…………作用電極
１１………配線
１３………測定装置
１５………溶液
２３………絶縁基板
２４………結合層
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パラジウムとニオブとを、過酸化水素に対して電流出力を生じさせることが可能な組成となるように含有した合金で構成されていることを特徴とする電気化学測定装置用電極。
【請求項２】
前記合金は、パラジウムとニオブの原子比率が９０：１０〜６０：４０の範囲であることを特徴とする請求項１に記載の電気化学測定装置用電極。
【請求項３】
前記合金は、パラジウムとニオブの原子比率が７９：２１〜６９：３１の範囲であることを特徴とする請求項１または２のいずれか一項に記載の電気化学測定装置用電極。
【請求項４】
パラジウムとニオブの原子比率が３：１であり、結晶構造がＤ２２型である化合物を含有することを特徴とする請求項３記載の電気化学測定装置用電極。
【請求項５】
前記合金は、
パラジウム−ニオブ合金であることを特徴とする請求項１〜請求項４のいずれかに記載の電気化学測定装置用電極。
【請求項６】
前記パラジウムと前記ニオブからなる前記電極が放電アーク法、蒸着法、およびスパッタリング法のいずれかを用いて製造されたことを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の電気化学測定装置用電極。
【請求項７】
作用極、参照電極、および対極を有し、
前記作用極は、請求項１〜６のいずれかに記載の電気化学測定装置用電極であることを特徴とする電気化学測定装置。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の電気化学測定装置用電極と、
前記電気化学測定装置用電極の表面に設けられ、触媒機能を持ったタンパク質を含む固定化触媒層と、
を有することを特徴とするバイオセンサ用電極。
【請求項９】
前記固定化触媒層は、酵素、抗体、ＤＮＡ、およびＲＮＡのいずれかを有することを特徴とする請求項８記載のバイオセンサ用電極。
【請求項１０】
前記固定化触媒層は、酸化酵素を有することを特徴とする請求項８記載のバイオセンサ用電極。
【請求項１１】
前記電気化学測定装置用電極を保持する絶縁基板と、
前記電気化学測定装置用電極と前記固定化触媒層の間に設けられ、かつ前記電気化学測定装置用電極を覆うように、前記絶縁基板および電気化学測定装置用電極上に設けられた結合層と、
をさらに有することを特徴とする請求項８〜１０のいずれか一項に記載のバイオセンサ用電極。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか一項に記載のバイオセンサ用電極を有することを特徴とするバイオセンサ。
【請求項１】
パラジウムとニオブとを、過酸化水素に対して電流出力を生じさせることが可能な組成となるように含有した合金で構成されていることを特徴とする電気化学測定装置用電極。
【請求項２】
前記合金は、パラジウムとニオブの原子比率が９０：１０〜６０：４０の範囲であることを特徴とする請求項１に記載の電気化学測定装置用電極。
【請求項３】
前記合金は、パラジウムとニオブの原子比率が７９：２１〜６９：３１の範囲であることを特徴とする請求項１または２のいずれか一項に記載の電気化学測定装置用電極。
【請求項４】
パラジウムとニオブの原子比率が３：１であり、結晶構造がＤ２２型である化合物を含有することを特徴とする請求項３記載の電気化学測定装置用電極。
【請求項５】
前記合金は、
パラジウム−ニオブ合金であることを特徴とする請求項１〜請求項４のいずれかに記載の電気化学測定装置用電極。
【請求項６】
前記パラジウムと前記ニオブからなる前記電極が放電アーク法、蒸着法、およびスパッタリング法のいずれかを用いて製造されたことを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の電気化学測定装置用電極。
【請求項７】
作用極、参照電極、および対極を有し、
前記作用極は、請求項１〜６のいずれかに記載の電気化学測定装置用電極であることを特徴とする電気化学測定装置。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の電気化学測定装置用電極と、
前記電気化学測定装置用電極の表面に設けられ、触媒機能を持ったタンパク質を含む固定化触媒層と、
を有することを特徴とするバイオセンサ用電極。
【請求項９】
前記固定化触媒層は、酵素、抗体、ＤＮＡ、およびＲＮＡのいずれかを有することを特徴とする請求項８記載のバイオセンサ用電極。
【請求項１０】
前記固定化触媒層は、酸化酵素を有することを特徴とする請求項８記載のバイオセンサ用電極。
【請求項１１】
前記電気化学測定装置用電極を保持する絶縁基板と、
前記電気化学測定装置用電極と前記固定化触媒層の間に設けられ、かつ前記電気化学測定装置用電極を覆うように、前記絶縁基板および電気化学測定装置用電極上に設けられた結合層と、
をさらに有することを特徴とする請求項８〜１０のいずれか一項に記載のバイオセンサ用電極。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか一項に記載のバイオセンサ用電極を有することを特徴とするバイオセンサ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１２−２４２３３５（Ｐ２０１２−２４２３３５Ａ）
【公開日】平成２４年１２月１０日（２０１２．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１１５０５４（Ｐ２０１１−１１５０５４）
【出願日】平成２３年５月２３日（２０１１．５．２３）
【出願人】（０００００４２３７）日本電気株式会社 (19,353)
【出願人】（３０１０２３２３８）独立行政法人物質・材料研究機構 (1,333)
【公開日】平成２４年１２月１０日（２０１２．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年５月２３日（２０１１．５．２３）
【出願人】（０００００４２３７）日本電気株式会社 (19,353)
【出願人】（３０１０２３２３８）独立行政法人物質・材料研究機構 (1,333)
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