非内在性の構成的に活性化されるヒトＧタンパク質共役型受容体
【課題】受容体は、内在性リガンドもしくは薬物のような化合物により活性状態で安定化させることができ、リガンドに依存しない手段による構成的受容体活性化した受容体を提供する。
【解決手段】ｈＡＲＥ−３（Ｆ３１３Ｋ）等の各種ヒトオーファン受容体を含む、非内在性で、構成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）をコードするｃＤＮＡとベクター、該ＧＰＣＲ蛋白質、およびそれらを含む宿主細胞。
【解決手段】ｈＡＲＥ−３（Ｆ３１３Ｋ）等の各種ヒトオーファン受容体を含む、非内在性で、構成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）をコードするｃＤＮＡとベクター、該ＧＰＣＲ蛋白質、およびそれらを含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、１９９８年１０月１３日に米国特許・商標庁に出願された米国
第０９／１７０，４９６号の一部継続出願であり、かつそれからの優先権を主張
する。本出願は、以下の仮出願（全部は示された日付に米国特許・商標庁に米国
エクスプレスメール（Ｕ．Ｓ．Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｍａｉｌ）を介して出願された
）、すなわち１９９８年１１月２７日に出願された米国仮出願第６０／１１０，
０６０号；１９９９年２月１６日に出願された米国仮出願第６０／１２０，４１
６号；１９９８年１１月２０日に出願された米国仮出願第６０／１０９，２１３
号の利益を主張する１９９９年２月２６日に出願された米国仮出願第６０／１２
１，８５２号；１９９９年３月１２日に出願された米国仮出願第６０／１２３，
９４４号；１９９９年３月１２日に出願された米国仮出願第６０／１２３，９４
５号；１９９９年３月１２日に出願された米国仮出願第６０／１２３，９４８号
；１９９９年３月１２日に出願された米国仮出願第６０／１２３，９５１号；１
９９９年３月１２日に出願された米国仮出願第６０／１２３，９４６号；１９９
９年３月１２日に出願された米国仮出願第６０／１２３，９４９号；１９９９年
８月２７日に出願された米国仮出願第６０／１５１，１１４号および１９９８年
１１月１２日に出願された米国仮出願第６０／１０８，０２９号の利益を主張す
る１９９９年９月３日に出願された米国仮出願第６０／１５２，５２４号；１９
９９年５月２８日に出願された米国仮出願第６０／１３６，４３６号；１９９９
年５月２８日に出願された米国仮出願第６０／１３６，４３９号；１９９９年５
月２８日に出願された米国仮出願第６０／１３６，５６７号；１９９９年５月２
８日に出願された米国仮出願第６０／１３７，１２７号；１９９９年５月２８日
に出願された米国仮出願第６０／１３７，１３１号；１９９９年５月２８日に出
願された米国仮出願第６０／１３６，４３７号の利益を主張する１９９９年６月
２９日に出願された米国仮出願第６０／１４１，４４８号；１９９９年９月２９
日に出願された米国仮出願第６０／１５６，６３３号；１９９９年９月２９日に
出願された米国仮出願第６０／１５６，５５５号；１９９９年９月２９日に出願
された米国仮出願第６０／１５６，６３４号；１９９９年９月２９日に出願され
た米国仮出願第＿＿＿＿号（アリーナ ファーマシューティカルズ インク（Ａ
ｒｅｎａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）処理予定表番号：ＣＨ
Ｎ１０−１）；１９９９年１０月１日に出願された米国仮出願第＿＿＿＿号（ア
リーナ ファーマシューティカルズ インク（Ａｒｅｎａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕ
ｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）処理予定表番号：ＲＵＰ６−１）；１９９９年１０月
１日に出願された米国仮出願第＿＿＿＿号（アリーナ ファーマシューティカル
ズ インク（Ａｒｅｎａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）処理予
定表番号：ＲＵＰ７−１）；１９９９年１０月１日に出願された米国仮出願第＿
＿＿＿号（アリーナ ファーマシューティカルズ インク（Ａｒｅｎａ Ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）処理予定表番号：ＣＨＮ６−１）；１９
９９年１０月１日に出願された米国仮出願第＿＿＿＿号（アリーナ ファーマシ
ューティカルズ インク（Ａｒｅｎａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎ
ｃ．）処理予定表番号：ＲＵＰ５−１）；ならびに１９９９年１０月１日に出願
された米国仮出願第＿＿＿＿号（アリーナ ファーマシューティカルズ インク
（Ａｒｅｎａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）処理予定表番号：
ＣＨＮ９−１）からの優先権の利益もまた主張する。本出願は、１９９９年１０
月１２日に（米国エクスプレスメール（Ｕ．Ｓ．Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｍａｉｌ）を
介して）出願された同時係属中の米国第＿＿＿＿号（ウッドコック（Ｗｏｏｄｃ
ｏｃｋ）、ウォッシュバーン（Ｗａｓｈｂｕｒｎ）、クルツ（Ｋｕｒｔｚ）、マ
キエヴィッツ（Ｍａｋｉｅｗｉｃｚ）とノリス（Ｎｏｒｒｉｓ））、ＬＬＰ処理
予定表番号ＡＲＥＮ−００５０）および１９９９年７月３０日に出願された米国
第０９／３６４，４２５号（双方は引用により本明細書に組み込まれる）にもま
た関する。本出願は、１９９９年１０月１２日に（米国エクスプレスメール（Ｕ
．Ｓ．Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｍａｉｌ）を介して）出願された米国第＿＿＿＿号（ウ
ッドコック（Ｗｏｏｄｃｏｃｋ）、ウォッシュバーン（Ｗａｓｈｂｕｒｎ）、ク
ルツ（Ｋｕｒｔｚ）、マキエヴィッツ（Ｍａｋｉｅｗｉｃｚ）とノリス（Ｎｏｒ
ｒｉｓ））、ＬＬＰ処理予定表番号ＡＲＥＮ−００５４）（そっくりそのまま引
用により本明細書に組み込まれる）に対する優先権もまた主張する。前述の出願
のそれぞれはそっくりそのまま引用により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本特許明細書に開示される発明は、膜貫通受容体、およびより具体的にはヒト
Ｇタンパク質共役型受容体、そしてとりわけ該受容体の構成的活性を確立するも
しくは高めるよう改変されているＧＰＣＲに関する。好ましくは、改変されたＧ
ＰＣＲは、治療薬として潜在的応用性を有する受容体のアゴニスト、反作用薬も
しくは部分的アゴニストとしての候補化合物の直接の同定に使用される。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ヒトでは多数の受容体のクラスが存在するが、はるかに最も豊富かつ治療に関
係するものは、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲもしくは複数ＧＰＣＲ）の
クラスにより代表される。ヒトゲノム内には数十万個の遺伝子が存在することが
推定されており、そしてこれらのなかでおよそ２％もしくは２，０００個の遺伝
子がＧＰＣＲをコードすると推定されている。内在性リガンドが同定されている
、ＧＰＣＲを包含する受容体は「既知」受容体と称される一方、内在性リガンド
が同定されていない受容体は「オーファン」受容体と称される。ＧＰＣＲは製薬
学的製品の開発に重要な一領域を代表する。すなわち、１００種の既知のＧＰＣ
Ｒのおよそ２０種から全処方薬の６０％が開発されている。
【０００４】
ＧＰＣＲは１つの共通な構造モチーフを共有する。全部のこれらの受容体は、
７個のαヘリックスを形成する２２ないし２４個の間の疎水性アミノ酸の７個の
連なりを有し、そのそれぞれは膜にまたがる（各広がり(span)は数字により同定
されている。すなわち膜貫通−１（ＴＭ−１）、膜貫通−２（ＴＭ−２）など）
。膜貫通ヘリックスは、細胞膜の外もしくは「細胞外」側で、膜貫通−２と膜貫
通−３、膜貫通−４と膜貫通−５、および膜貫通−６と膜貫通−７の間でアミノ
酸の鎖により結合されている（これらはそれぞれ「細胞外」領域１、２および３
（ＥＣ−１、ＥＣ−２およびＥＣ−３）と称される）。膜貫通ヘリックスは、細
胞膜の内もしくは「細胞内」側で、膜貫通−１と膜貫通−２、膜貫通−３と膜貫
通−４、および膜貫通−５と膜貫通−６の間でもまたアミノ酸の鎖により結合さ
れている（これらはそれぞれ「細胞内」領域１、２および３（ＩＣ−１、ＩＣ−
２およびＩＣ−３）と称される）。受容体の「カルボキシ」（「Ｃ」）末端は細
胞内の細胞内空隙中に存し、また、受容体の「アミノ」（「Ｎ」）末端は細胞の
外側の細胞外空隙中に存する。
【０００５】
一般に、内在性リガンドが受容体と結合する場合（しばしば受容体の「活性化
」と称される）、細胞内領域のコンホメーションの変化が存在し、それは細胞内
領域と細胞内の「Ｇタンパク質」との間の共役(coupling)を見込む。ＧＰＣＲは
Ｇタンパク質に関して「混雑して」いる、すなわちＧＰＣＲは１種以上のＧタン
パク質と相互作用する可能性があることが報告されている。ケナキン（Ｋｅｎａ
ｋｉｎ，Ｔ．）、４３ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０９５（１９８８）を
参照されたい。他のＧタンパク質が存在するが、現在のところＧｑ、Ｇｓ、Ｇｉ
、ＧｚおよびＧｏが同定されたＧタンパク質である。Ｇタンパク質との内在性リ
ガンドで活性化されたＧＰＣＲの共役がシグナル伝達カスケード過程（「シグナ
ル伝達」と称される）を開始する。正常な条件下では、シグナル伝達は最終的に
細胞の活性化もしくは細胞の阻害をもたらす。受容体のＩＣ−３ループならびに
カルボキシ末端がＧタンパク質と相互作用すると考えられている。
【０００６】
ＧＰＣＲは、生理学的条件下では２種の異なるコンホメーション、すなわち「
不活性」状態と「活性状態」との間の平衡で細胞膜中に存在する。不活性状態の
受容体は、細胞内のシグナル伝達経路に連結して生物学的応答を生じさせること
が不可能である。受容体のコンホメーションの活性状態への変化は（Ｇタンパク
質を介する）伝達経路への連鎖を可能にし、そして生物学的応答を生じさせる。
【０００７】
受容体は、内在性リガンドもしくは薬物のような化合物により活性状態で安定
化させることができる。独占的に限定されるものでないが受容体のアミノ酸配列
に対する改変を挙げることができる最近の発見は、活性状態のコンホメーション
にある受容体を助長かつ安定化するための内在性リガンドもしくは薬物以外の手
段を提供する。これらの手段は、受容体への内在性リガンドの結合の効果を刺激
することにより、受容体を活性状態で効果的に安定化する。こうしたリガンドに
依存しない手段による安定化を「構成的受容体活性化」と命名する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要約）
内在性ヒトＧＰＣＲの非内在性変種およびそれらの用途を本明細書で開示する
。
本発明は、例えば、以下を提供する：
（項目１） ｈＡＲＥ−３（Ｆ３１３Ｋ）を含んで成る、非内在性で、構
成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目２） 項目１記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性の変
種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目３） ベクターおよび項目１記載のｃＤＮＡを含んで成るプラス
ミド。
（項目４） 項目３記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目５） ｈＡＲＥ−４（Ｖ２３３Ｋ）を含んで成る、非内在性で、構
成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目６） 項目５記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性の変
種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目７） ベクターおよび項目５記載のｃＤＮＡを含んで成るプラス
ミド。
（項目８） 項目７記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目９） ｈＡＲＥ−５（Ａ２４０Ｋ）を含んで成る、非内在性で、構
成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目１０） 項目９記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性の
変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目１１） ベクターおよび項目５記載のｃＤＮＡを含んで成るプラ
スミド。
（項目１２） 項目１１記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目１３） ｈＧＰＣＲ１４（Ｌ２５７Ｋ）を含んで成る、非内在性で
、構成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮ
Ａ。
（項目１４） 項目１３記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性
の変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目１５） ベクターおよび項目１３記載のｃＤＮＡを含んで成るプ
ラスミド。
（項目１６） 項目１５記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目１７） ｈＧＰＣＲ２７（Ｃ２８３Ｋ）を含んで成る、非内在性で
、構成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮ
Ａ。
（項目１８） 項目１７記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性
の変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目１９） ベクターおよび項目１７記載のｃＤＮＡを含んで成るプ
ラスミド。
（項目２０） 項目１９記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目２１） ｈＡＲＥ−１（Ｅ２３２Ｋ）を含んで成る、非内在性で、
構成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ
。
（項目２２） 項目２１記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性
の変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目２３） ベクターおよび項目２１記載のｃＤＮＡを含んで成るプ
ラスミド。
（項目２４） 項目２３記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目２５） ｈＡＲＥ−２（Ｇ２８５Ｋ）を含んで成る、非内在性で、
構成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ
。
（項目２６） 項目２５記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性
の変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目２７） ベクターおよび項目２５記載のｃＤＮＡを含んで成るプ
ラスミド。
（項目２８） 項目２７記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目２９） ｈＰＰＲ１（Ｌ２３９Ｋ）を含んで成る、非内在性で、構
成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目３０） 項目２９記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性
の変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目３１） ベクターおよび項目２９記載のｃＤＮＡを含んで成るプ
ラスミド。
（項目３２） 項目３１記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目３３） ｈＧ２Ａ（Ｋ２３２Ａ）を含んで成る、非内在性で、構成
的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目３４） 項目３３記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性
の変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目３５） ベクターおよび項目３３記載のｃＤＮＡを含んで成るプ
ラスミド。
（項目３６） 項目３５記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目３７） ｈＲＵＰ３（Ｌ２２４Ｋ）を含んで成る、非内在性で、構
成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目３８） 項目３７記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性
の変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目３９） ベクターおよび項目３７記載のｃＤＮＡを含んで成るプ
ラスミド。
（項目４０） 項目３９記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目４１） ｈＲＵＰ５（Ａ２３６Ｋ）を含んで成る、非内在性で、構
成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目４２） 項目４１記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性
の変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目４３） ベクターおよび項目４１記載のｃＤＮＡを含んで成るプ
ラスミド。
（項目４４） 項目４２記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目４５） ｈＲＵＰ６（Ｎ２６７Ｋ）を含んで成る、非内在性で、構
成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目４６） 項目４５記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性
の変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目４７） ベクターおよび項目４５記載のｃＤＮＡを含んで成るプ
ラスミド。
（項目４８） 項目４７記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目４９） ｈＲＵＰ７（Ａ３０２Ｋ）を含んで成る、非内在性で、構
成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目５０） 項目４９記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性
の変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目５１） ベクターおよび項目４９記載のｃＤＮＡを含んで成るプ
ラスミド。
（項目５２） 項目５１記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目５３） ｈＣＨＮ４（Ｖ２３６Ｋ）を含んで成る、非内在性で、構
成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目５４） 項目５３記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性
の変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目５５） ベクターおよび項目５３記載のｃＤＮＡを含んで成るプ
ラスミド。
（項目５６） 項目５５記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目５７） ｈＭＣ４（Ａ２４４Ｋ）を含んで成る、非内在性で、構成
的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目５８） 項目５７記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性
の変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目５９） ベクターおよび項目５７記載のｃＤＮＡを含んで成るプ
ラスミド。
（項目６０） 項目６０記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目６１） ｈＣＨＮ３（Ｓ２８４Ｋ）を含んで成る、非内在性で、構
成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目６２） 項目６１記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性
の変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目６３） ベクターおよび項目６１記載のｃＤＮＡを含んで成るプ
ラスミド。
（項目６４） 項目６３記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目６５） ｈＣＨＮ６（Ｌ３５２Ｋ）を含んで成る、非内在性で、構
成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目６６） 項目６５記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性
の変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目６７） ベクターおよび項目６５記載のｃＤＮＡを含んで成るプ
ラスミド。
（項目６８） 項目６７記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目６９） ｈＣＨＮ８（Ｎ２３５Ｋ）を含んで成る、非内在性で、構
成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目７０） 項目６９記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性
の変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目７１） ベクターおよび項目６９記載のｃＤＮＡを含んで成るプ
ラスミド。
（項目７２） 項目７１記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目７３） ｈＨ９（Ｆ２３６Ｋ）を含んで成る、非内在性で、構成的
に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目７４） 項目７３記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性
の変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目７５） ベクターおよび項目７３記載のｃＤＮＡを含んで成るプ
ラスミド。
（項目７６） 項目７４記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目７７） ｈＡＴ１（Ｆ２３９Ｋ）；ｈＡＴ１（Ｎ１１１Ａ）；ｈＡ
Ｔ１（ＡＴ２Ｋ２５５ＩＣ３）；およびｈＡＴ１（Ａ２４３＋）より成る群から
選択される、非内在性で、構成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型Ａ
Ｔ１受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目７８） 項目７７記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性
の変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目７９） ベクターおよび項目７７記載のｃＤＮＡを含んで成るプ
ラスミド。
（項目８０） 項目７９記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】発明にかかる、８ＸＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミドの表示である（実施例４（ｃ）３を参照されたい）。
【図２】発明にかかる、内在性ＴＤＡＧ８へのＡＴＰおよびＡＤＰの結合の結果のグラフ表示（２Ａ）ならびに血清および血清を含まない培地中での比較（２Ｂ）である。
【図３】発明にかかる、ＧＰＣＲ融合タンパク質Ｈ９（Ｆ２３６Ｋ）：Ｇｓαに対するＣＭＶの比較的なシグナル伝達の結果のグラフ表示である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（詳細な記述）
受容体を中核として発展してきた学術文献は、受容体に対する多様な影響を有
するリガンドを指す多数の用語を採用している。明瞭化および一貫性のため、本
特許明細書を通じて以下の定義を使用するであろう。これらの定義がこれらの用
語の他の定義と矛盾する限り、以下の定義が支配する：
アゴニストは、それらが受容体に結合する場合に細胞内応答を活性化する、も
しくは膜へのＧＴＰ結合を高める物質（例えばリガンド、候補化合物）を意味す
る。
【００１１】
本明細書で使用されるアミノ酸の略語を表Ａに示す：
【００１２】
【表１】
【００１３】
部分的アゴニストは、それらが受容体に結合する場合にアゴニストが活性化す
るより小さい度合(degree)／程度(extent)まで細胞内応答を活性化する、もしく
はアゴニストが高めるより小さい度合(degree)／程度(extent)まで膜へのＧＴＰ
結合を高める物質（例えばリガンド、候補化合物）を意味する。
【００１４】
アンタゴニストは、アゴニストと同一の部位で受容体に競争的に結合するがし
かし活性型の受容体により開始される細胞内応答を活性化せず、そしてそれによ
りアゴニストもしくは部分的アゴニストによる細胞内応答を阻害する可能性のあ
る物質（例えばリガンド、候補化合物）を意味する。アンタゴニストは、アゴニ
ストもしくは部分的アゴニストの非存在下で基線の細胞内応答を減少させない。
【００１５】
候補化合物は、スクリーニング技術に基づいて分析できる分子（例えば、そし
て制限でなく化合物）を意味する。好ましくは、「候補化合物」という句は、間
接的同定方法により既に決定されたような、受容体に対する反作用薬、アゴニス
トもしくはアンタゴニストより成る群から選択される化合物であることが公知で
あった化合物（「間接的に同定された化合物」）を包含せず；より好ましくは、
最低１種の哺乳動物で治療上の効能を有することが既に決定されている間接的に
同定された化合物を包含せず；そして最も好ましくは、ヒトで治療上の有用性を
有することが既に決定されている間接的に同定された化合物を包含しない。
【００１６】
組成物は最低１種の成分を含んで成る物質を意味し；「製薬学的組成物」は組
成物の一例である。
【００１７】
化合物の効能は、受容体結合親和性と対照的に、受容体の機能性を阻害もしく
は刺激する化合物の能力の大きさを意味する。化合物の効能の検出の例示的手段
を本特許明細書の実施例のセクションに開示する。
【００１８】
コドンは、リン酸基に結合されたヌクレオシド（アデノシン（Ａ）、グアノシ
ン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）、ウリジン（Ｕ）およびチミジン（Ｔ））を一般に含
んで成りかつ翻訳される場合に１個のアミノ酸をコードするひとそろいの３個の
ヌクレオチド（もしくはヌクレオチドに対する同等物）を意味する。
【００１９】
構成的に活性化される受容体は構成的受容体活性化にさらされる受容体を意味
する。構成的に活性化される受容体は内在性もしくは非内在性であることができ
る。
【００２０】
構成的な受容体の活性化は、その内在性リガンドもしくはその化学的同等物と
の受容体の結合以外の手段による、活性状態での受容体の安定化を意味する。
【００２１】
接触させるもしくは接触することは、インビトロの系であろうとインビボの系
であろうと最低２つの部分を一緒にすることを意味する。
【００２２】
直接同定するもしくは直接同定されるは、「候補化合物」という句に関係して
、構成的に活性化される受容体、好ましくは構成的に活性化されるオーファン受
容体、そして最も好ましくは構成的に活性化されるＧタンパク質共役型の細胞表
面のオーファン受容体に対する候補化合物のスクリーニング、およびこうした化
合物の化合物の効能の評価を意味する。この句は、どの状況下でも、「間接的に
同定する」もしくは「間接的に同定される」という句により包含されるもしくは
それを包含すると解釈もしくは理解されるべきでない。
【００２３】
内在性は哺乳動物が天然に産生する物質を意味する。例えば、そして制限でな
く「受容体」という用語に関しての内在性は、哺乳動物（例えば、そして制限で
なくヒト）もしくはウイルスにより天然に産生されるものを意味する。対照的に
、これに関して非内在性という用語は、哺乳動物（例えば、そして制限でなくヒ
ト）もしくはウイルスにより天然に産生されないものを意味する。例えば、そし
て制限でなく、その内在性の形態で構成的に活性でないがしかし操作される場合
に構成的に活性になる受容体は、本明細書で「非内在性の構成的に活性化される
受容体」と最も好ましく称される。双方の用語は「インビボ」および「インビト
ロ」双方の系を記述するのに利用することができる。例えば、そして制限でなく
、スクリーニングのアプローチにおいて、内在性もしくは非内在性の受容体はイ
ンビトロのスクリーニング系に関してであってよい。さらなる一例として、そし
て制限としてでなく、非内在性の構成的に活性化される受容体を包含するように
哺乳動物のゲノムが操作されている場合には、インビボ系による候補化合物のス
クリーニングが実現可能である。
【００２４】
Ｇタンパク質共役型受容体融合タンパク質およびＧＰＣＲ融合タンパク質は、
本明細書に開示される本発明に関して、それぞれ、最低１種のＧタンパク質、最
も好ましくはこうしたＧタンパク質のαサブユニット（これはＧＴＰを結合する
サブユニットである）に融合された、内在性の構成的に活性化されるＧＰＣＲも
しくは非内在性の構成的に活性化されるＧＰＣＲを含んで成る非内在性タンパク
質を意味し、Ｇタンパク質は好ましくは内在性のオーファンＧＰＣＲと天然に共
役するＧタンパク質と同一の型のものである。例えば、そして制限でなく、内在
性の状態において、Ｇタンパク質「Ｇｓα」がＧＰＣＲと共役する主なＧタンパ
ク質である場合、特定のＧＰＣＲに基づくＧＰＣＲ融合タンパク質はＧｓαに融
合されたＧＰＣＲを含んで成る非内在性タンパク質であることができ；下に示さ
れるであろうようないくつかの状況では、主なものでないＧタンパク質をＧＰＣ
Ｒに融合することができる。Ｇタンパク質は構成的に活性なＧＰＣＲのＣ末端に
直接融合することができるか、もしくは２者の間にスペーサーが存在してよい。
【００２５】
宿主細胞は、その中に組み込まれたプラスミドおよび／もしくはベクターを有
することが可能な細胞を意味する。原核生物宿主細胞の場合には、プラスミドは
宿主細胞の複製物のような自律的分子として典型的に複製され（一般に、プラス
ミドはその後真核生物宿主細胞への導入のため単離される）；真核生物宿主細胞
の場合には、真核生物宿主細胞が複製する場合にプラスミドが複製するように、
プラスミドが宿主細胞の細胞ＤＮＡに組み込まれる。好ましくは、本明細書に開
示される本発明の目的上、宿主細胞は真核生物、より好ましくは哺乳動物であり
、そして最も好ましくは２９３、２９３ＴおよびＣＯＳ−７細胞より成る群から
選択される。
【００２６】
間接的に同定するもしくは間接的に同定されるは、内在性受容体に特異的な内
在性リガンドの同定、リガンド−受容体の相互作用を妨害および／もしくはそれ
と競争するものの決定のための受容体に対する候補化合物のスクリーニング、な
らびに活性化された受容体に関連する最低１種のセカンドメッセンジャー経路に
影響を及ぼす化合物の効能の評価を必要とする、薬物発見過程への伝統的アプロ
ーチを意味する。
【００２７】
「応答」という用語に関係した阻害するもしくは阻害は、化合物の非存在下と
対照的に、化合物の存在下で応答が低下もしくは予防されることを意味する。
【００２８】
反作用薬は、内在性の形態の受容体もしくは構成的に活性化された形態の受容
体のいずれかに結合し、かつ、アゴニストもしくは部分的アゴニストの非存在下
で観察される正常の基準レベルの活性より低い、活性の形態の受容体により開始
される基線の細胞内応答を阻害するか、もしくは膜へのＧＴＰ結合を減少させる
物質（例えばリガンド、候補化合物）を意味する。好ましくは、基線の細胞内応
答は、反作用薬の非存在下の基礎の応答に比較して、反作用薬の存在下で最低３
０％、より好ましくは最低５０％、そして最も好ましくは最低７５％阻害される
。
【００２９】
既知の受容体は、その受容体に特異的な内在性リガンドが同定されている内在
性受容体を意味する。
【００３０】
リガンドは、内在性の天然に存在する受容体に特異的な内在性の天然に存在す
る分子を意味する。
【００３１】
内在性受容体の核酸および／もしくはアミノ酸の配列に関しての突然変異体も
しくは突然変異は、突然変異された形態の内在性の構成的に活性化されない受容
体が該受容体の構成的活性化を明示するような、こうした内在性の配列に対する
指定された１個の変化もしくは複数の変化を意味する。特定の配列に対する同等
物に関して、（ａ）その後の突然変異された形態のヒト受容体の構成的活性化の
レベルが該受容体の第一の突然変異により明示されるものと実質的に同一であり
；そして（ｂ）その後の突然変異された形態の受容体と該受容体の第一の突然変
異との間の配列（アミノ酸および／もしくは核酸）の相同性のパーセントが最低
約８０％、より好ましくは最低約９０％、そして最も好ましくは最低９５％であ
る場合、その後の突然変異された形態のヒト受容体は該ヒト受容体の第一の突然
変異に同等であるとみなされる。理想的には、また、構成的活性化を達成するた
めの本明細書に開示される最も好ましいカセットはＧＰＣＲの内在性の形態と非
内在性の形態との間の単一のアミノ酸および／もしくはコドンの変化を包含する
という事実のために、配列の相同性のパーセントは最低９８％であるべきである
。
【００３２】
非オーファン受容体は、内在性の天然に存在するリガンドに特異的な内在性の
天然に存在する分子を意味し、ここで、受容体へのリガンドの結合が細胞内シグ
ナル伝達経路を活性化する。
【００３３】
オーファン受容体は、その受容体に特異的な内在性リガンドが同定されていな
いかもしくは未知である内在性受容体を意味する。
【００３４】
製薬学的組成物は最低１種の有効成分を含んで成る組成物を意味し、それによ
り該組成物は哺乳動物（例えば、そして制限でなくヒト）における特定の効能の
ある結果についての検討に基づいて分析できる。当業者は、ある有効成分が当業
者のニーズに基づき所望の効能のある結果を有するかどうかを決定するのに適切
な技術を理解かつ認識するであろう。
【００３５】
プラスミドはベクターおよびｃＤＮＡの組み合わせを意味する。一般に、プラ
スミドは、ｃＤＮＡの複製および／もしくはそのタンパク質としての発現の目的
上、宿主細胞に導入される。
【００３６】
「応答」という用語に関係した刺激するもしくは刺激することは、化合物の非
存在下と対照的に化合物の存在下で応答が増大されることを意味する。
【００３７】
ｃＤＮＡに関してのベクターは、最低１個のｃＤＮＡを組み込むことが可能か
つ宿主細胞への組み込みが可能な環状ＤＮＡを意味する。
【００３８】
以下のセクションの階層は表象的な効能について示され、また、後に続く開示
もしくは請求の範囲に対する制限として意図されず、またそのように解釈される
べきでもない。
Ａ．緒言
受容体の伝統的な研究は、発見が受容体に影響を及ぼす可能性のあるアンタゴ
ニストおよび他の分子を見出すよう進めることができる前に、内在性リガンドを
最初に同定しなければならないという（歴史的に基づく）演繹的仮定から常に進
められてきた。アンタゴニストを最初に知ることができた場合であっても、内在
性リガンドを探すように研究が直ちに拡大されてきた。この思考様式は、構成的
に活性化される受容体の発見の後でさえ、受容体の研究で持続してきた。これま
で認識されていなかったことは、受容体のアゴニスト、部分的アゴニストおよび
反作用薬の発見に最も有用であるのは活性状態の受容体であるということである
。過度に活性の受容体もしくは過小活性の受容体から生じる疾患に対して、治療
薬で望まれるものは、必ずしも内在性リガンドに対するアンタゴニストである薬
物でなく、それぞれ、受容体の活性状態を低下させるもしくは受容体の活性を高
めるよう作用する化合物である。これは、活性の受容体状態の活性を低下させる
もしくは高める化合物は内在性リガンドと同一の部位で結合する必要がないため
である。従って、本発明の方法により教示されるとおり、治療的化合物について
のいかなる研究も、リガンドに依存しない活性状態に対して化合物をスクリーニ
ングすることにより開始すべきである。
Ｂ．ヒトＧＰＣＲの同定
ヒトゲノムプロジェクトの努力の成果は、ヒトゲノム内に配置されている核酸
配列に関する夥しい量の情報の同定につながり；それは、いずれかの特定のゲノ
ム配列がヒトタンパク質を翻訳する読取り枠情報を含有するもしくは含有するか
も知れないかどうかに関する理解もしくは認識を伴わずに、遺伝子配列情報が利
用可能にされているというこの努力において真実である。ヒトゲノム内の核酸配
列のいくつかの同定方法は当業者の範囲内にある。例えば、そして制限でなく、
本明細書で開示される多様なヒトＧＰＣＲは、ジェンバンク［ＧｅｎＢａｎｋ］
（商標）データベースを再検討することにより発見された一方、他のＧＰＣＲは
、既に配列決定されたＧＰＣＲの核酸配列を利用してＥＳＴデータベースのＢＬ
ＡＳＴ（商標）検索を実施することにより発見された。下の表Ｂは、ＧＰＣＲの
それぞれの相同受容体と一緒に、われわれが発見した数種の内在性ＧＰＣＲを列
挙する。
【００３９】
【表２】
【００４０】
受容体の相同性は、人体内での受容体の役割の正しい認識を得ることに関して
有用である。本特許明細書が進めるように、われわれは、これらの受容体の非内
在性で構成的に活性化される変種を確立するようにこれらの受容体を突然変異す
るための技術を開示するであろう。
【００４１】
本明細書に開示される技術は、本特許明細書が進行するに従って明らかになる
であろうように、技術既知の他のヒトのオーファンＧＰＣＲにもまた適用されて
いる。
Ｃ．受容体スクリーニング
本明細書に開示される、非内在性で、構成的に活性化される変種ヒトＧＰＣＲ
に対する候補化合物のスクリーニングは、受容体の内在性リガンドの使用を必要
とすることなく、この細胞表面受容体で作用する候補化合物の直接の同定を許す
。本明細書に開示される内在性の変種ヒトＧＰＣＲが発現および／もしくは過剰
発現されている身体内の領域を決定することにより、受容体の発現および／もし
くは過剰発現を伴う関連疾患／障害状態を決定することが可能であり；こうした
一アプローチを本特許明細書で開示する。
【００４２】
本明細書に開示されるヒトＧＰＣＲの構成的活性化を明示することができる突
然変異の創製に関して、ＧＰＣＲのＴＭ６内に配置されると想定されているプロ
リン残基からの距離に基づき；このアルゴリズム技術は、引用により本明細書に
組み込まれる同時係属中かつ共通に譲渡される特許明細書米国第０９／１７０，
４９６号に開示されている。該アルゴリズム技術は、伝統的な配列の「整列」で
はなく、しかしむしろ前述のＴＭ６のプロリン残基からの指定された距離に基づ
く。（思うに受容体のＩＣ３領域中に配置される）この残基から１６アミノ酸残
基に配置されるアミノ酸残基を最も好ましくはリシン残基に突然変異することに
より、こうした活性化を得てよい。この目的を達成するためにはこの位置の突然
変異で他のアミノ酸残基が有用であるかも知れない。
Ｄ．疾患／障害の同定および／もしくは選択
下により詳細に示されるであろうとおり、最も好ましくは非内在性で、構成的
に活性化されるＧＰＣＲに対する反作用薬を本発明の方法論により同定すること
ができる。こうした反作用薬は、本受容体に関連する疾患治療のための薬物発見
プログラムでのリード化合物として理想的な候補である。ＧＰＣＲに対する反作
用薬を直接同定してそれにより製薬学的組成物の開発を可能にする能力のため、
ＧＰＣＲに関連する疾患および障害の研究が適切である。例えば、ＧＰＣＲの存
在について疾患に罹った組織サンプルおよび正常な組織サンプルの双方を走査す
ることは、今や、学究的修練、もしくは特定のＧＰＣＲに対する内在性リガンド
を同定する途に沿って追跡することができるもの以上となっている。組織の走査
は広範な健康なおよび疾患に罹った組織にわたって実施することができる。こう
した組織の走査は、特定の受容体のある疾患および／もしくは障害との関連付け
の好ましい第一段階を提供する。例えば、本明細書に開示されるＧＰＣＲのいく
つかの例示的ドットブロットおよびＲＴ−ＰＣＲの結果については、同時係属中
の出願（処理予定表番号ＡＲＥ−００５０）を参照されたい。
【００４３】
好ましくは、（ａ）組織ｍＲＮＡに対するドットブロット分析、および／もし
くは（ｂ）組織サンプルでの受容体の発現のＲＴ−ＰＣＲ同定のためのプローブ
を作成するのにヒトＧＰＣＲのＤＮＡ配列を使用する。組織供給源、もしくは疾
患に罹った組織中での受容体の存在、または正常組織に比較して疾患に罹った組
織中での上昇された濃度での受容体の存在は、限定されるものでないがその疾患
に関連する疾患を挙げることができる治療レジメンとの相関を同定するのに好ま
しく利用することができる。受容体はこの技術により器官の領域に等しく十分に
局在化する可能性がある。受容体が局在化されている特定の組織の既知の機能に
基づき、受容体の推定の機能上の役割を推定することができる。
Ｅ．候補化合物のスクリーニング
１．包括的ＧＰＣＲスクリーニングアッセイの技術
Ｇタンパク質受容体が構成的に活性になった場合、それはＧタンパク質（例え
ばＧｑ、Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｚ、Ｇｏ）に結合しかつＧタンパク質へのＧＴＰの結合
を刺激する。その後、Ｇタンパク質がＧＴＰアーゼとして作用し、そしてＧＴＰ
をＧＤＰにゆっくりと加水分解し、それにより受容体は正常条件下で失活したよ
うになる。しかしながら、構成的に活性化された受容体はＧＤＰをＧＴＰに交換
し続ける。構成的に活性化される受容体を発現する膜への高められた結合をモニ
ターするのに、ＧＴＰの加水分解不可能な類似物［35Ｓ］ＧＴＰγＳを使用する
ことができる。［35Ｓ］ＧＴＰγＳはリガンドの非存在下および存在下での膜へ
のＧタンパク質の共役をモニターするのに使用することができることが報告され
ている。このモニタリングの一例、なかんずく当業者に公知かつ利用可能な例は
、１９９５年にトレイノル（Ｔｒａｙｎｏｒ）とナホルスキ（Ｎａｈｏｒｓｋｉ
）により報告された。本アッセイ系の好ましい使用は候補化合物の初期スクリー
ニングのためである。なぜなら、該系は、受容体の細胞内ドメインと相互作用す
る特定のＧタンパク質に関係なく、全部のＧタンパク質共役型受容体に包括的に
応用可能であるからである。
２．特異的ＧＰＣＲスクリーニングアッセイの技術
「包括的」Ｇタンパク質共役型受容体アッセイ（すなわちアゴニスト、部分的
アゴニストもしくは反作用薬である化合物を選択するためのアッセイ）を使用し
て候補化合物が同定されれば、該化合物が受容体部位で相互作用していることを
確認するためのさらなるスクリーニングが好ましい。例えば、「包括的」アッセ
イにより同定された化合物は受容体に結合しないかも知れないが、しかし代わり
に細胞内ドメインからＧタンパク質を単に「分離する」かも知れない。
ａ．Ｇｓ、ＧｚおよびＧｉ
Ｇｓは酵素アデニリルシクラーゼを刺激する。他方、Ｇｉ（ならびにＧｚおよ
びＧｏ）はこの酵素を阻害する。アデニリルシクラーゼはＡＴＰのｃＡＭＰへの
転化を触媒し；従って、Ｇｓタンパク質を共役する構成的に活性化されたＧＰＣ
Ｒは、ｃＡＭＰの増大された細胞レベルと関連する。他方、Ｇｉ（もしくはＧｚ
、Ｇｏ）タンパク質を共役する構成的に活性化されたＧＰＣＲは、ｃＡＭＰの低
下された細胞レベルと関連する。一般に、“Ｉｎｄｉｒｅｃｔ Ｍｅｃｈａｎｉ
ｓｍｓ ｏｆ Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ，”第８章、Ｆｒ
ｏｍ Ｎｅｕｒｏｎ Ｔｏ Ｂｒａｉｎ（第３版）ニコルス（Ｎｉｃｈｏｌｓ，
Ｊ．Ｇ．）ら編 サイナウア アソシエーツ インク（Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓ
ｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）（１９９２）を参照されたい。従って、ｃＡＭＰを
検出するアッセイを利用して、ある候補化合物が例えば受容体に対する反作用薬
（すなわちこうした化合物はｃＡＭＰのレベルを低下させることができる）であ
るかどうかを決定することができる。ｃＡＭＰを測定するための当該技術分野で
既知の多様なアプローチを利用することができ；最も好ましいアプローチはＥＬ
ＩＳＡに基づく形式での抗ｃＡＭＰ抗体の使用に頼る。利用することができる別
の型のアッセイは全細胞セカンドメッセンジャーレポーター系アッセイである。
遺伝子のプロモーターは特定の遺伝子がコードするタンパク質の発現を司る。環
状ＡＭＰは、ｃＡＭＰ応答性のＤＮＡ結合タンパク質もしくは転写因子（ＣＲＥ
Ｂ）（その後ｃＡＭＰ応答要素と呼ばれる特定の部位でプロモーターに結合しそ
して遺伝子の発現を司る）の結合を促進することにより遺伝子発現を司る。レポ
ーター遺伝子（例えばβ−ガラクトシダーゼもしくはルシフェラーゼ）の前に複
数のｃＡＭＰ応答要素を含有するプロモーターを有するレポーター系を構築する
ことができる。従って、構成的に活性化されたＧｓに結合された受容体は、ｃＡ
ＭＰの蓄積を引き起こし、これがその後遺伝子およびレポータータンパク質の発
現を活性化する。その後、標準的な生化学的アッセイを使用して、β−ガラクト
シダーゼもしくはルシフェラーゼのようなレポータータンパク質を検出すること
ができる（チェン（Ｃｈｅｎ）ら １９９５）。
ｂ．ＧｏおよびＧｑ
ＧｑおよびＧｏは酵素ホスホリパーゼＣの活性化に関連し、この酵素は順にリ
ン脂質ＰＩＰ2を加水分解して、２種の細胞内メッセンジャー、すなわちジアシ
ルグリセロール（ＤＡＧ）およびイノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ3）
を放出する。ＩＰ3の増大された蓄積はＧｑおよびＧｏ会合型受容体の活性化と
関連する。一般に、“Ｉｎｄｉｒｅｃｔ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｓｙｎ
ａｐｔｉｃ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ，”第８章、Ｆｒｏｍ Ｎｅｕｒｏｎ
Ｔｏ Ｂｒａｉｎ（第３版）ニコルス（Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．Ｇ．）ら編 サイ
ナウア アソシエーツ インク（Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎ
ｃ．）（１９９２）を参照されたい。ＩＰ3の蓄積を検出するアッセイは、候補
化合物が例えばＧｑもしくはＧｏ会合型受容体に対する反作用薬である（すなわ
ちこうした化合物はＩＰ3のレベルを低下させることができる）かどうかを決定
するのに利用することができる。Ｇｑ会合型受容体はＡＰ１レポーターアッセイ
（ここでＧｑ依存性のホスホリパーゼＣがＡＰ１要素を含有する遺伝子の活性化
を引き起こす）を使用してもまた検査することができ；従って、活性化されたＧ
ｑ会合型受容体は、こうした遺伝子の発現の増大を明示することができ、それに
より、それに対する反作用薬はこうした発現の減少を明示することができ、また
、アゴニストはこうした発現の増大を明示することができる。こうした検出のた
めの商業的に入手可能なアッセイが利用可能である。
３．ＧＰＣＲ融合タンパク質
反作用薬、アゴニストおよび部分的アゴニストの直接の同定のための候補化合
物のスクリーニングでの使用のための内在性で、構成的に活性化されるオーファ
ンＧＰＣＲもしくは非内在性で、構成的に活性化されるオーファンＧＰＣＲの使
用は興味深いスクリーニングの挑戦を提供し、ここでは当然、それに結合される
内在性リガンドの非存在下でさえ該受容体は活性である。従って、こうした化合
物が反作用薬、アゴニスト、部分的アゴニストであることができるかどうか、も
しくはこうした受容体に対する影響を有することができるかどうかに関しての理
解を許すこうした識別の目的をもって、例えば候補化合物の存在下の非内在性受
容体とその化合物の非存在下の非内在性受容体とを識別するために、こうした識
別を高める可能性のあるアプローチを利用することが好ましい。好ましい一アプ
ローチはＧＰＣＲ融合タンパク質の使用である。
【００４４】
一般に、非内在性のオーファンＧＰＣＲが上で示されたアッセイ技術（ならび
に他者）を使用して構成的に活性化されていることを決定すれば、内在性ＧＰＣ
Ｒと共役する優勢なＧタンパク質を決定することが可能である。ＧＰＣＲへのＧ
タンパク質の共役はシグナル伝達経路を提供し、これは評価することが可能であ
る。哺乳動物発現系の使用によりスクリーニングが行われることが最も好ましい
ため、こうした系はその中に内在性Ｇタンパク質を有することが期待されよう。
従って、当然、こうした系においては、非内在性の構成的に活性化されたオーフ
ァンＧＰＣＲが連続的にシグナルを発するであろう。この点に関して、例えば受
容体に対する反作用薬の存在下で、とりわけスクリーニングに関してそれが反作
用薬と接触される場合にそれが受容体をより容易に識別することが可能であろう
ことがよりありそうであるように、このシグナルを高めることが好ましい。
【００４５】
ＧＰＣＲ融合タンパク質は、非内在性ＧＰＣＲと共役するＧタンパク質の効能
を高めることを意図している。ＧＰＣＲ融合タンパク質は非内在性の構成的に活
性化されたＧＰＣＲを用いるスクリーニングに好ましい。なぜなら、こうしたア
プローチは、こうしたスクリーニング技術で最も好ましく利用されるシグナルを
増大させるからである。これは大きな「Ｓ／Ｎ」比の助長で重要であり；こうし
た大きな比は本明細書で開示されるような候補化合物のスクリーニングに重要か
つ好ましい。
【００４６】
ＧＰＣＲ融合タンパク質の発現に有用な構築物の構築は当業者の範囲内にある
。商業的に入手可能な発現ベクターおよび系が、研究者の特定のニーズに合う可
能性のある多様なアプローチを提供する。こうしたＧＰＣＲ融合タンパク質構築
物に対する重要な基準は、内在性のＧＰＣＲ配列およびＧタンパク質配列の双方
が同じ読み枠にある（好ましくは内在性ＧＰＣＲの配列はＧタンパク質配列の上
流である）こと、および、ＧＰＣＲの発現に際してＧタンパク質もまた発現する
ことが可能であるようにＧＰＣＲの「終止」コドンを欠失もしくは置き換えなく
てはならないことである。ＧＰＣＲはＧタンパク質に直接連結することができる
か、もしくは２者の間にスペーサー残基（好ましくは約１２を越えないが、この
数字は当業者により容易に確かめることが可能である）が存在することができる
。われわれは、使用されないいくつかの制限部位が発現に際して効果的にスペー
サーとなるであろうことに、スペーサーの使用が（便宜性に基づくと）好ましい
。最も好ましくは、ＧＰＣＲ融合タンパク質構築物の創製に先立ち非内在性ＧＰ
ＣＲに共役するＧタンパク質を同定することができる。同定された数種のＧタン
パク質が存在するにすぎないため、その中の内在性のＧＰＣＲ配列の挿入にＧタ
ンパク質の配列を含んで成る構築物（すなわち普遍的Ｇタンパク質構築物）が利
用可能であることが好ましく；これは、異なる配列を有する多様な異なった内在
性ＧＰＣＲの大スケールのスクリーニングにおいて効率を提供する。
【００４７】
上に示されたとおり、Ｇｉ、ＧｚおよびＧｏに共役する構成的に活性化される
ＧＰＣＲは、これらの型のＧＰＣＲに基づくアッセイを挑戦的にするｃＡＭＰの
形成を阻害すると期待される（すなわち、ｃＡＭＰシグナルは活性化に際して減
少し、従って例えば（このシグナルをさらに減少させることができる）反作用薬
の直接の同定を興味深いものとする）。本明細書に開示されるであろうとおり、
われわれは、実現可能なシクラーゼに基づくアッセイを確立する努力において、
これらの型の受容体について内在性のＧＰＣＲの内在性のＧタンパク質に基づか
ないＧＰＣＲ融合タンパク質を創製することが可能であることを確かめた。従っ
て、例えば、Ｈ９のようなＧｚ共役型受容体、Ｇｓ融合タンパク質を利用するＧ
ＰＣＲ融合タンパク質を確立することが可能である。われわれは、こうした融合
構築物は、発現に際して非内在性のＧＰＣＲが例えば「天然の」Ｇｚタンパク質
よりもむしろＧｓと共役することを「誘導」もしくは「強要」し、その結果シク
ラーゼに基づくアッセイを確立することが可能であると考える。従って、Ｇｉ、
ＧｚおよびＧｏ共役型受容体について、われわれは、ＧＰＣＲ融合タンパク質を
使用しかつアッセイがアデニルシクラーゼ活性の検出に基づく場合は、Ｇｓ（も
しくは酵素アデニリルシクラーゼの形成を刺激する同等のＧタンパク質）を用い
て融合構築物を確立することを好む。
Ｆ．医薬品化学
一般に（しかし常にでなく）、候補化合物の直接の同定はコンビナトリアル化
学の技術を介して生成される化合物に関連して好ましく実施され、それにより何
千もの化合物がこうした分析のため無作為に調製される。一般に、こうしたスク
リーニングの結果は独特のコア構造を有する化合物であることができ；その後、
これらの化合物は、その医薬特性をさらに高めるため、好ましいコア構造（１種
もしくは複数）を取り巻く付加的な化学的改変に好ましくかけられる。こうした
技術は当業者に既知でありかつ本特許明細書で詳細に取り扱わないであろう。
Ｇ．製薬学的組成物
さらなる開発に選択された候補化合物は、当業者に公知の技術を使用して製薬
学的組成物に処方することができる。適する製薬学的に許容できる担体は当業者
に利用可能であり；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ
ｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、１９８０、マック パブリッシング
カンパニー（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）（オスロ（Ｏｓｌｏ）
ら編）を参照されたい。
Ｈ．他の利用性
本明細書に開示される非内在性の変種ヒトＧＰＣＲの好ましい使用は、（好ま
しくは製薬学的作用物質としての使用のための）反作用薬、アゴニストもしくは
部分的アゴニストとしての候補化合物の直接の同定のためのものであることがで
きるが、これらの変種ヒトＧＰＣＲはまた研究の設定でも利用することができる
。例えば、ＧＰＣＲを組み込むインビトロおよびインビボの系は、正常のおよび
疾患に罹った双方のヒトの状態でこれらの受容体が演じる役割をさらに解明かつ
理解するため、ならびに構成的活性化の役割の理解（それがシグナル伝達カスケ
ードの理解に適用されるため）に利用することができる。非内在性のヒトＧＰＣ
Ｒの価値は、そのための内在性リガンドが同定される前に人体でのこれらの受容
体の役割を理解するのに、それらの独特の特徴のため非内在性のヒトＧＰＣＲを
使用することができることにおいて、研究ツールとしてのそれらの利用性が高め
られることである。開示される受容体の他の用途は、とりわけ本特許明細書の検
討に基づき当業者に明らかとなるであろう。
【実施例】
【００４８】
以下の実施例は本発明の解明の目的上（そして制限でなく）提示する。本明細
書で特定の核酸およびアミノ酸の配列が開示される一方、当業者は、下に報告さ
れる同一のもしくは実質的に類似の結果を達成しつつこれらの配列に対する小さ
な改変を行う能力があると信じられる。１配列から別のものまで（例えばラット
受容体からヒト受容体まで、もしくはヒト受容体Ａからヒト受容体Ｂまで）の配
列カセットの応用もしくは理解への伝統的アプローチは、配列整列の技術（それ
により配列は共通の領域を決定する活動で整列される）に一般に基づく。本明細
書に開示される突然変異のアプローチはこのアプローチに頼らないが、しかし、
代わりにアルゴリズムのアプローチ、およびヒトＧＰＣＲのＴＭ６領域内に配置
される保存されたプロリン残基からの位置上の距離に基づく。このアプローチが
確実にされれば、当業者は、それに対して小さな変更を行って本明細書に開示さ
れる実質的に同一の結果（すなわち構成的活性化）を達成する能力があると信じ
られる。こうした改変されたアプローチは本開示の範囲内と考えられる。
実施例１
内在性のヒトＧＰＣＲ
１．ヒトＧＰＣＲの同定
ジェンバンク［ＧｅｎＢａｎｋ］（商標）データベース情報の再検討に基づき
、開示された内在性ヒトＧＰＣＲのあるものを同定した。データベースを検索す
る間に以下のｃＤＮＡクローンを下に明示されるとおり同定した（表Ｃ）。
【００４９】
【表３】
【００５０】
他の開示された内在性ヒトＧＰＣＲは、以下のＥＳＴクローンをクエリ配列と
して使用するＥＳＴデータベース（ｄｂｅｓｔ）のＢＬＡＳＴ（商標）検索を実
施することにより同定した。その後、同定された以下のＥＳＴクローンをプロー
ブとして使用して、ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングした（表Ｄ）。
【００５１】
【表４】
【００５２】
２．完全長のクローニング
Ａ．ヒトＧ２Ａ
マウスＥＳＴクローン１１７９４２６を使用して、３種のアミノ酸Ｇ２Ａコー
ディング配列を除く全部を含有するヒトゲノムクローンを得た。このコーディン
グ配列の５’は５’ＲＡＣＥを使用することにより得、また、ＰＣＲのための鋳
型はクロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のヒト脾マラソン−レディ［Ｍａｒａｔ
ｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ］（商標）ｃＤＮＡであった。開示されるヒトＧ２Ａは、以
下：
５’−ＣＴＧＴＧＴＡＣＡＧＣＡＧＴＴＣＧＣＡＧＡＧＴＧ−３’（配列番号４
１；１回目のＰＣＲ）
５’−ＧＡＧＴＧＣＣＡＧＧＣＡＧＡＧＣＡＧＧＴＡＧＡＣ−３’（配列番号４
２；２回目のＰＣＲ）
のような配列番号４１および配列番号４２に示されるような第一回および第二回
のＰＣＲのためのＧ２ＡのｃＤＮＡに特異的なプライマーを使用するＰＣＲによ
り増幅した。ＰＣＲは、９４℃３０秒間、次いで９４℃５秒間および７２℃４分
間の５周期；ならびに９４°５秒間および７０°４分間の３０周期で、アドバン
テージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）ＧＣポリメラーゼキット（クロンテック（Ｃｌｏ
ｎｔｅｃｈ）；製造説明書に従うことができる）を使用して実施した。およそ１
．３ｋｂのＰＣＲフラグメントをアガロースゲルから精製し、ＨｉｎｄＩＩＩお
よびＸｂａＩで消化し、そして発現ベクターｐＲＣ／ＣＭＶ２（インヴィトロジ
ェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化した。Ｔ７シークェナーゼ［Ｓｅ
ｑｕｅｎａｓｅ］（商標）キット（ＵＳＢ アマーシャム（ＵＳＢ Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ）；製造元の説明書が従われた）を使用してクローン化された挿入物を配
列決定し、そして提示された配列と配列を比較した。Ｐ32標識されたフラグメン
トを用いてＲＮＡドットブロット（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；製造元
の説明書が従われた）をプロービングすることによりヒトＧ２Ａの発現を検出し
た。
ｂ．ＣＨＮ９
ＥＳＴクローン１５４１５３６の配列決定は、ＣＨＮ９が１個の開始コドンの
みを有する（すなわち終止コドンは欠けていた）部分的ｃＤＮＡクローンである
ことを示した。ＣＨＮ９をデータベース（ｎｒ）に対してＢＬＡＳＴ検索する(b
last)のに使用した場合、ＣＨＮ９の３’の配列はロイコトリエンＢ４受容体の
ｃＤＮＡの５’非翻訳領域（ＣＨＮ９のコーディング配列と同じ読み枠に終止コ
ドンを含有した）に１００％相同であった。ＬＴＢ４ＲのｃＤＮＡの５’非翻訳
領域がＣＨＮ９の３’配列であったかどうかを決定するために、ＣＨＮ９に見出
される開始コドンに隣接する５’配列およびＬＴＢ４Ｒの５’非翻訳領域に見出
される終止コドンを取り巻く３’配列に基づくプライマーを使用してＰＣＲを実
施した。利用された５’プライマー配列は以下のとおりであった：
５’−ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＣＣＣＡＧＣＴＴＧＧＣＣＣ−３
’（配列番号４３；センス）および
５’−ＴＧＴＧＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＴＣＡＡＡＧＧＴＣＣＣＡＴＴＣＣＧＧ−
３’（配列番号４４；アンチセンス）
製造元により供給される緩衝液系、０．２５μＭの各プライマーおよび０．２ｍ
Ｍの各４種のヌクレオチドとともに鋳型としての胸腺ｃＤＮＡおよびｒＴｔｈポ
リメラーゼ（パーキン エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））を使用してＰ
ＣＲを実施した。周期条件は、９４℃１分間、６５℃１分間ならびに７２℃１分
および１０秒間の３０周期であった。予測された大きさと一致する１．１ｋｂの
フラグメントをＰＣＲから得た。本ＰＣＲフラグメントをｐＣＭＶにサブクロー
ニングし（下を参照されたい）そして配列決定した（配列番号３５を参照された
い）。
ｃ．ＲＵＰ４
鋳型としてヒト脳ｃＤＮＡ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を用いるＲ
Ｔ−ＰＣＲにより完全長のＲＵＰ４をクローン化した：
５’−ＴＣＡＣＡＡＴＧＣＴＡＧＧＴＧＴＧＧＴＣ−３’（配列番号４５；セン
ス）および
５’−ＴＧＣＡＴＡＧＡＣＡＡＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＧ−３’（配列番号４６；
アンチセンス）。
以下の周期、すなわち９４℃２分間；９４℃３０秒間；５５℃３０秒間、７２℃
４５秒間および７２℃１０分間により、タックプラス プレシジョン［ＴａｑＰ
ｌａｓ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ］（商標）ポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ）；製造説明書が従われた）を使用してＰＣＲを実施した。周期
２から４を３０回反復した。
【００５３】
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで分離し、そして５００ｂｐのＰＣＲフラグ
メントを単離しかつｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（商標）ベクター（インヴィトロジェ
ン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化し、そしてＴ７ ＤＮＡシークェナ
ーゼ［Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ］（商標）キット（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ
））およびＳＰ６／Ｔ７プライマー（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
）を使用して配列決定した。ＰＣＲフラグメントから示される配列分析は、実際
に、他のＧＰＣＲとの類似性をもつ１個の連続的読取り枠を有する、代替スプラ
イシングされた形態のＡＩ３０７６５８であった。このＰＣＲフラグメントの完
了された配列は以下のとおりであった：
【００５４】
【表５】
【００５５】
上の配列に基づき、２種のセンスオリゴヌクレオチドプライマーの組：
５’−ＣＴＧＣＴＴＡＧＡＡＧＡＧＴＧＧＡＣＣＡＧ−３’（配列番号４８；オ
リゴ１）、
５’−ＣＴＧＴＧＣＡＣＣＡＧＡＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ−３’（配列番号４９；
オリゴ２）および
２種のアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーの組：
５’−ＣＡＡＧＧＡＴＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＴＡＧＡ−３’（配列番号５０；オ
リゴ３）
５’−ＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＴＣＴＧＧＴＧＣＡＣＡＧＧ−３’（配列番号５１
；オリゴ４）
を、製造元の説明書に従って鋳型としてヒト脳マラソン−レディ［Ｍａｒａｔｈ
ｏｎ−Ｒｅａｄｙ］（商標）ｃＤＮＡ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、カ
タログ番号７４００−１）を用いる３’−および５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲに使用
した。ＲＡＣＥ ＰＣＲにより生成されたＤＮＡフラグメントをｐＣＲＩＩ−Ｔ
ＯＰＯ（商標）ベクター（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にク
ローン化し、そしてＳＰ６／Ｔ７プライマー（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ））および数種の内的プライマーを使用して配列決定した。３’ＲＡＣＥ
産物はポリ（Ａ）テール(tail)およびＴＡＡ終止コドンで終了する１個の完了さ
れる読取り枠を含有した。５’ＲＡＣＥ産物は不完全な５’末端を含有した（す
なわちＡＴＧ開始コドンが存在しなかった）。
【００５６】
新たな５’配列に基づき、オリゴ３および以下のプライマー：
５’−ＧＣＡＡＴＧＣＡＧＧＴＣＡＴＡＧＴＧＡＧＣ−３’（配列番号５２；オ
リゴ５）
を第２回の５’ｒａｃｅ ＰＣＲに使用し、そしてＰＣＲ産物を上のとおり分析
した。第３回の５’ｒａｃｅ ＰＣＲは、アンチセンスプライマー：
５’−ＴＧＧＡＧＣＡＴＧＧＴＧＡＣＧＧＧＡＡＴＧＣＡＧＡＡＧ−３’（配列
番号５３；オリゴ６）および
５’−ＧＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＧＴＣＡＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＡＧ−３’（配列
番号５４；オリゴ７）
を利用して実施した。５’ＲＡＣＥ ＰＣＲの産物の配列は開始コドンＡＴＧの
存在を示し、また、さらなる回の５’ｒａｃｅ ＰＣＲはいかなるそれ以上の５
’配列も生成しなかった。プライマーとして、センスプライマー
５’−ＧＣＡＡＴＧＣＡＧＧＣＧＣＴＴＡＡＣＡＴＴＡＣ−３’（配列番号５５
；オリゴ８）
およびオリゴ４を使用するＲＴ−ＰＣＲ、ならびにヒト脳および心のｃＤＮＡ鋳
型（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、カタログ番号７４０４−１）から生成
された６５０ｂｐのＰＣＲ産物の配列分析により、完了された５’配列を確認し
た。オリゴ２および以下のアンチセンスプライマー：
５’−ＴＴＧＧＧＴＴＡＣＡＡＴＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡ−３’（配列番号５６；
オリゴ９）
を使用するＲＴ−ＰＣＲ、ならびにヒト脳および心のｃＤＮＡ鋳型（クロンテッ
ク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、カタログ番号７４０４−１）から生成された６７０ｂ
ｐのＰＣＲ産物の配列分析により、完了された３’配列を確認した。
ｄ．ＲＵＰ５
以下の配列：
５’−ＡＣＴＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣＡＧＧＡＣＴＣＴＧ−３’（配列番号５７
）
５’−ＴＧＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＧＡＣＣＣＴＣＡＣＧＴＧ−３’（配列番号５
８）
を有した、ＡＴＧ開始コドンから上流のセンスプライマー（配列番号５７）、お
よび終止コドンとしてＴＣＡを含有するアンチセンスプライマー（配列番号５８
）、ならびに鋳型としてヒト末梢白血球ｃＤＮＡ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅ
ｃｈ））を使用するＲＴ−ＰＣＲにより完全長のＲＵＰ５をクローン化した。段
階２から段階４が３０回反復された以下の周期、すなわち９４℃３０秒間；９４
℃１５秒間；６９℃４０秒間；７２℃３分間；および７２℃６分間による５０μ
ｌの反応中での増幅にアドバンテージ［Ａｄｖａｎｔａｇｅ］（商標）ｃＤＮＡ
ポリメラーゼ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用した。１．４ｋｂの
ＰＣＲフラグメントを単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（商標）ベクター（
インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いてクローン化し、そして
Ｔ７ ＤＮＡシークェナーゼ［Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ］（商標）キット（アマーシ
ャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を使用して完全に配列決定した。配列番号９を参照
されたい。
ｅ．ＲＵＰ６
プライマー：
５’−ＣＡＧＧＣＣＴＴＧＧＡＴＴＴＴＡＡＴＧＴＣＡＧＧＧＡＴＧＧ−３’（
配列番号５９）および
５’−ＧＧＡＧＡＧＴＣＡＧＣＴＣＴＧＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＧＧ−３’（配列
番号６０）
ならびに鋳型としてヒト胸腺マラソン−レディ［Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ
］（商標）ｃＤＮＡ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用するＲＴ−Ｐ
ＣＲにより完全長のＲＵＰ６をクローン化した。以下の周期、すなわち９４℃３
０秒間；９４℃５秒間；６６℃４０秒間；７２℃２．５秒間および７２℃７分間
による５０μｌ反応中での増幅にアドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）ｃＤＮ
Ａポリメラーゼ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、製造元の説明書に従う）
を使用した。周期２から４を３０回反復した。１．３ｋｂのＰＣＲフラグメント
を単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ［商標］ベクター（インヴィトロジェン
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化し、そしてＡＢＩ ビッグ ダイ タ
ーミネーター［Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ］（商標）キット（Ｐ．
Ｅ．バイオシステム（Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ））を使用して完全に配列決
定した（配列番号１１を参照されたい）。
ｆ．ＲＵＰ７
プライマー：
５’−ＴＧＡＴＧＴＧＡＴＧＣＣＡＧＡＴＡＣＴＡＡＴＡＧＣＡＣ−３’（配列
番号６１；センス）および
５’−ＣＣＴＧＡＴＴＣＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＧＡＴＴＧＡＧＡＣ−３’（配列
番号６２；アンチセンス）
ならびに鋳型としてヒト末梢白血球ｃＤＮＡ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
））を使用するＲＴ−ＰＣＲにより完全長のＲＵＰ７をクローン化した。段階２
ないし段階４が３０回反復された以下の周期、すなわち９４℃２分間；９４℃１
５秒間；６０℃２０秒間；７２℃２分間；７２℃１０分間による５０μｌ反応中
での増幅にアドバンテージ［Ａｄｖａｎｔａｇｅ］（商標）ｃＤＮＡポリメラー
ゼ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用した。１．２５ｋｂのＰＣＲフ
ラグメントを単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（商標）ベクター（インヴィ
トロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化し、そしてＡＢＩ ビッグ
ダイ ターミネーター［Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ］（商標）キ
ット（Ｐ．Ｅ．バイオシステム（Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ））を使用して完
全に配列決定した。配列番号１３を参照されたい。
３．アンジオテンシンＩＩタイプ１受容体（「ＡＴ１」）
製造元により供給される緩衝液系、０．２５μＭの各プライマーおよび０．２
ｍＭの各４種のヌクレオチドとともに鋳型としてのゲノムＤＮＡおよびｒＴｔｈ
ポリメラーゼ（パーキン エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））を使用する
ＰＣＲにより、内在性のヒトアンジオテンシンＩＩタイプ１受容体（「ＡＴ１」
）を得た。周期条件は、９４℃１分間、５５℃１分間および７２℃１．５分間の
３０周期であった。５’ＰＣＲプライマーは、配列：
５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＣＡＧＧＴＧＴＡＴＴＴＧＡＴ−３’（配列番
号６３）
とともにＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有し、そして３’プライマーは以下の配列：
５’−ＧＴＴＧＧＡＴＣＣＡＣＡＴＡＡＴＧＣＡＴＴＴＴＣＴＣ−３’（配列番
号６４）
とともにＢａｍＨＩ部位を含有する。生じる１．３ｋｂのＰＣＲフラグメントを
ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そしてｐＣＭＶ発現ベクターのＨｉ
ｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローン化した。ｃＤＮＡクローンを完全に配列
決定した。その後、ヒトＡＴ１の核酸（配列番号６５）およびアミノ酸（配列番
号６６）の配列を決定しかつ確かめた。
４．ＧＰＲ３８
ＧＰＲ３８を得るため、製造元により供給される緩衝液系、０．２５μＭの各
プライマーおよび０．２ｍＭの各４種のヌクレオチドとともに鋳型としてのヒト
ゲノムｃＤＮＡおよびｒＴｔｈポリメラーゼ（パーキン エルマー（Ｐｅｒｋｉ
ｎ Ｅｌｍｅｒ））を使用して、２種のＰＣＲフラグメントを組み合わせること
によりＰＣＲを実施した。各ＰＣＲ反応の周期条件は９４℃１分間、６２℃１分
間および７２℃２分間の３０周期であった。
【００５７】
第一のフラグメントは、以下の配列：
５’−ＡＣＣＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＴＧＧＡＡＣＧＧＣＡＧＣ−３’（配列
番号６７）
を伴う端部位を含有した５’ＰＣＲプライマー、および以下の配列：
５’−ＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＧＧＡＣＧＣＧＧＡＣＧＧＴＣＴＧＣ
ＣＧＧＴＧＧ−３’（配列番号６８）
を有する３’プライマーを用いて増幅した。第二のＰＣＲフラグメントは、以下
の配列：
５’−ＧＴＣＣＧＣＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＡＴＴＴ
ＡＴＡＡＴＴ−３’（配列番号６９）
を有する５’プライマー、ならびにＢａｍＨＩ部位を含有しかつ以下の配列：
５’−ＣＣＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＣＣＡＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＧＴＴＡＧＣ
−３’（配列番号７０）
を有する３’プライマーを用いて増幅した。配列番号６７および配列番号７０を
プライマーとして使用して（上に示された周期条件を使用する）、２種のフラグ
メントを鋳型として使用してＧＰＲ３８を増幅した。生じる１．４４ｋｂのＰＣ
ＲフラグメントをＢａｍＨＩで消化し、そしてｐＣＭＶ発現ベクターの平滑Ｂａ
ｍＨＩ部位にクローン化した。
５．ＭＣ４
ＭＣ４を得るため、製造元により供給される緩衝液系、０．２５μＭの各プラ
イマーおよび０．２ｍＭの各４種のヌクレオチドとともに鋳型としてのヒトゲノ
ムｃＤＮＡおよびｒＴｔｈポリメラーゼ（パーキン エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ））を使用してＰＣＲを実施した。各ＰＣＲ反応の周期条件は９４℃
１分間、５４℃１分間および７２℃１．５分間の３０周期であった。
【００５８】
５’ＰＣＲは配列：
５’−ＣＴＧＧＡＡＴＴＣＴＣＣＴＧＣＣＡＧＣＡＴＧＧＴＧＡ−３’（配列番
号７１）
とともにＥｃｏＲＩ部位を含有し、そして３’プライマーは配列：
５’−ＧＣＡＧＧＡＴＣＣＴＡＴＡＴＴＧＣＧＴＧＣＴＣＴＧＴＣＣＣＣ−３’
（配列番号７２）
とともにＢａｍＨＩ部位を含有した。１．０ｋｂのＰＣＲフラグメントをＥｃｏ
ＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そしてｐＣＭＶ発現ベクターのＥｃｏＲＩ−Ｂ
ａｍＨＩ部位にクローン化した。その後、ヒトＭＣ４の核酸（配列番号７３）お
よびアミノ酸（配列番号７４）の配列を決定した。
６．ＣＣＫＢ
ＣＣＫＢを得るため、製造元により供給される緩衝液系、０．２５μＭの各プ
ライマーおよび０．２ｍＭの各４種のヌクレオチドとともに鋳型としてのヒト胃
ｃＤＮＡおよびｒＴｔｈポリメラーゼ（パーキン エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅ
ｌｍｅｒ））を使用してＰＣＲを実施した。各ＰＣＲ反応の周期条件は９４℃１
分間、６５℃１分間ならびに７２℃１分および３０秒間の３０周期であった。
【００５９】
５’ＰＣＲは配列：
５’−ＣＣＧＡＡＧＣＴＴＣＧＡＧＣＴＧＡＧＴＡＡＧＧＣＧＧＣＧＧＧＣＴ−
３’（配列番号７５）
とともにＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有し、また、３’プライマーは配列：
５’−ＧＴＧＧＡＡＴＴＣＡＴＴＴＧＣＣＣＴＧＣＣＴＣＡＡＣＣＣＣＣＡ−３
’（配列番号７６）
とともにＥｃｏＲＩ部位を含有した。生じる１．４４ｋｂのＰＣＲフラグメント
をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そしてｐＣＭＶ発現ベクターのＨ
ｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。その後、ヒトＣＣＫＢの核酸
（配列番号７７）およびアミノ酸（配列番号７８）の配列を決定した。
７．ＴＤＡＧ８
ＴＤＡＧ８を得るため、製造元により供給される緩衝液系、０．２５μＭの各
プライマーおよび０．２ｍＭの各４種のヌクレオチドとともに鋳型としてのゲノ
ムＤＮＡおよびｒＴｔｈポリメラーゼ（パーキン エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅ
ｌｍｅｒ））を使用してＰＣＲを実施した。周期条件は９４℃１分間、５６℃１
分間ならびに７２℃１分および２０秒間の３０周期であった。５’ＰＣＲプライ
マーは以下の配列：
５’−ＴＧＣＡＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣ−３’
（配列番号７９）
とともにＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有し、また、３’プライマーは以下の配列：
５’−ＴＡＡＧＧＡＴＣＣＣＴＴＣＣＣＴＴＣＡＡＡＡＣＡＴＣＣＴＴＧ−３’
（配列番号８０）
とともにＢａｍＨＩ部位を含有した。生じる１．１ｋｂのＰＣＲフラグメントを
ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そしてｐＣＭＶ発現ベクターのＨｉ
ｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローン化した。配列決定された３種の生じるク
ローンは、ＰｒｏからＡｌａへのアミノ酸４３、ＬｙｓからＡｓｎへのアミノ酸
９７、およびＩｌｅからＰｈｅへのアミノ酸１３０の変化を伴う３種の潜在的多
形を含有した。その後、ヒトＴＤＡＧ８の核酸（配列番号８１）およびアミノ酸
（配列番号８２）の配列を決定した。
８．Ｈ９
Ｈ９を得るため、製造元により供給される緩衝液系、０．２５μＭの各プライ
マーおよび０．２ｍＭの各４種のヌクレオチドとともに鋳型としての下垂体ｃＤ
ＮＡおよびｒＴｔｈポリメラーゼ（パーキン エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍ
ｅｒ））を使用してＰＣＲを実施した。周期条件は９４℃１分間、６２℃１分間
および７２℃２分間の３０周期であった。５’ＰＣＲプライマーは以下の配列：
５’−ＧＧＡＡＡＧＣＴＴＡＡＣＧＡＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＣＡＡＣＡＴ−３’
（配列番号１５）
とともにＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有し、また、３’プライマーは以下の配列：
５’−ＣＴＧＧＧＡＴＣＣＴＡＣＧＡＧＡＧＣＡＴＴＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧ−３
’（配列番号１６）
とともにＢａｍＨＩ部位を含有した。生じる１．９ｋｂのＰＣＲフラグメントを
ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そしてｐＣＭＶ発現ベクターのＨｉ
ｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローン化した。Ｈ９は、アミノ酸Ｐ３２０Ｓ、
Ｓ４９３Ｎおよびアミノ酸Ｇ４４８Ａの変化を伴う３種の潜在的多形を含有した
。その後、ヒトＨ９の核酸（配列番号１３９）およびアミノ酸（配列番号１４０
）の配列を決定しかつ確かめた。
実施例２
非内在性の構成的に活性化されるＧＰＣＲの調製
当業者は、核酸配列の突然変異のための技術を選択する能力があると信じられ
る。上に開示された非内在性の変種数種のヒトＧＰＣＲを創製するのに利用され
たアプローチを下に提示する。下に開示される突然変異はアルゴリズムのアプロ
ーチに基づき、それにより（ＴＭ６／ＩＣ３の界面近くのＧＰＣＲのＴＭ６領域
に配置される）保存されるプロリン残基からの（ＧＰＣＲのＩＣ３領域に配置さ
れる）１６番目のアミノ酸が、最も好ましくはリシンアミノ酸残基に突然変異さ
れる。
１．トランスフォーマー部位特異的［Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｓｉｔｅ−Ｄｉ
ｒｅｃｔｅｄ］（商標）突然変異誘発
非内在性のヒトＧＰＣＲの調製は、製造元の説明書に従い、トランスフォーマ
ー部位特異的［Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ］（商標
）突然変異誘発キット（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用してヒトＧ
ＰＣＲで達成することができる。２種の突然変異誘発プライマー、最も好ましく
はリシン突然変異を創製するリシン突然変異誘発オリゴヌクレオチド、および選
択マーカーオリゴヌクレオチドを利用する。便宜上、ヒトＧＰＣＲに組み込まれ
るべきコドン突然変異を標準的形態でもまた示す（表Ｅ）：
【００６０】
【表６】
【００６１】
指定される配列プライマーを使用して、上の方法に従い、以下のＧＰＣＲを突
然変異した（表Ｆ）。
【００６２】
【表７】
【００６３】
その後、非内在性のヒトＧＰＣＲを配列決定し、また、形成されかつ確かめら
れた核酸およびアミノ酸の配列を、下に表Ｇに要約されるとおり、本特許明細書
への付随する「配列表」付録に列挙する：
【００６４】
【表８】
【００６５】
２．非内在性ヒトＧＰＣＲの創製のための代替アプローチ
ａ．ＡＴ１
１．Ｆ２３９Ｋ突然変異
Ｆ２３９突然変異（核酸配列について配列番号８９、およびアミノ酸配列につ
いて配列番号９０を参照されたい）を創製することにより、非内在性の構成的に
活性化されるヒトＡＴ１受容体の調製を達成した。突然変異誘発は、製造元の説
明書に従い、トランスフォーマー部位特異的突然変異誘発［Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ
ｅｒ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ］（商標）キット
（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用して実施した。２種の突然変異誘
発プライマー、リシン突然変異誘発オリゴヌクレオチド（配列番号９１）および
選択マーカーオリゴヌクレオチド（配列番号９２）を使用した。これらはそれぞ
れ以下の配列を有した：
５’−ＣＣＡＡＧＡＡＡＴＧＡＴＧＡＴＡＴＴＡＡＡＡＡＧＡＴＡＡＴＴＡＴＧ
ＧＣ−３’（配列番号９１）
５’−ＣＴＣＣＴＴＣＧＧＴＣＣＴＣＣＴＡＴＣＧＴＴＧＴＣＡＧＡＡＧＴ−３
’（配列番号９２）
２．Ｎ１１１Ａ突然変異
非内在性のヒトＡＴ１受容体の調製もまた、Ｎ１１１Ａ突然変異（核酸配列に
ついて配列番号９３、およびアミノ酸配列について配列番号９４を参照されたい
）を創製することにより達成した。１０％ＤＭＳＯ、０．２５μＭの各プライマ
ー、および０．５ｍＭの各４種のヌクレオチドを補充された、製造元により提供
される緩衝液系を用いてｐｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ））を使用して、２回のＰＣＲ反応を実施した。使用された５’ＰＣＲの
センスプライマーは以下の配列：
５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＣＡＧＧＴＧＴＡＴＴＴＧＡＴ−３’（配列番
号９５）
を有し、また、アンチセンスプライマーは以下の配列：
５’−ＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＡＡＡＣＴＧＡＣＴＣＴＧＧＣＴＧＡＡＧ−３’（
配列番号９６）
を有した。生じる４００ｂｐのＰＣＲフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩ部位で消化
し、そしてｐＣＭＶベクターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩ部位にサブクローニン
グした（５’構築物）。使用された３’ＰＣＲのセンスプライマーは以下の配列
：
５’−ＣＴＧＴＡＣＧＣＴＡＧＴＧＴＧＴＴＴＣＴＡＣＴＣＡＣＧＴＧＴＣＴＣ
ＡＧＣＡＴＴＧＡＴ−３’（配列番号９７）
を有し、また、アンチセンスプライマーは以下の配列：
５’−ＧＴＴＧＧＡＴＣＣＡＣＡＴＡＡＴＧＣＡＴＴＴＴＣＴＣ−３’（配列番
号９８）
を有した。生じる８８０ｂｐのＰＣＲフラグメントをＢａｍＨＩで消化し、そし
て５’構築物のＰｓｔ（Ｔ４ポリメラーゼにより平滑化された）およびＢａｍＨ
Ｉ部位に挿入して完全長のＮ１１１Ａ構築物を生成した。周期条件は、９４℃１
分間、６０℃１分間および７２℃１分間（５’ＰＣＲ）もしくは１．５分間（３
’ＰＣＲ）の２５周期であった。
３．ＡＴ２Ｋ２５５ＩＣ３突然変異
ＡＴ２Ｋ２５５ＩＣ３の「ドメインスワップ(domain swap)」突然変異（核酸
配列について配列番号９９を、およびアミノ酸配列について配列番号１００を参
照されたい）を創製することにより、非内在性の構成的に活性化されるヒトＡＴ
１の調製を達成した。ＡＴ１のＩＣ３に隣接する制限部位を生成させて、アンジ
オテンシンＩＩタイプ２受容体（ＡＴ２）からの対応するＩＣ３でのＩＣ３の置
き換えを助長した。これは２回のＰＣＲ反応を実施することにより達成した。セ
ンスプライマーとして配列番号６３を、およびアンチセンスプライマーとして以
下の配列：
５’−ＴＣＣＧＡＡＴＴＣＣＡＡＡＡＴＡＡＣＴＴＧＴＡＡＧＡＡＴＧＡＴＣＡ
ＧＡＡＡ−３’（配列番号１０１）
を利用することにより、５’非翻訳領域からＩＣ３の開始までをコードする５’
ＰＣＲフラグメント（フラグメントＡ）を生成させた。センスプライマーとして
以下の配列：
５’−ＡＧＡＴＣＴＴＡＡＧＡＡＧＡＴＡＡＴＴＡＴＧＧＣＡＡＴＴＧＴＧＣＴ
−３’（配列番号１０２）
およびアンチセンスプライマーとして配列番号６４を使用することにより、ＩＣ
３の終了から３’非翻訳領域までをコードする３’ＰＣＲフラグメント（フラグ
メントＢ）を生成させた。ＰＣＲ条件は、１０％ＤＭＳＯ、０．２５μＭの各プ
ライマーおよび０．５ｍＭの各４種のヌクレオチドを補充された、製造元により
供給される緩衝液系を用いて、鋳型としての内在性のＡＴ１ ｃＤＮＡクローン
およびｐｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用
して、９４℃１分間、５５℃１分間および７２℃１．５分間の３０周期であった
。フラグメントＡ（７２０ｂｐ）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化しそ
してサブクローニングした。フラグメントＢはＢａｍＨＩで消化し、そしてクロ
ーン化されたＰＣＲフラグメントの５’にＥｃｏＲＩ部位をもつｐＣＭＶベクタ
ーにサブクローニングした。
【００６６】
以下の配列：
５’ＡＡＴＴＣＧＡＡＡＡＣＡＣＴＴＡＣＴＧＡＡＧＡＣＧＡＡＴＡＧＣＴＡＴ
ＧＧＧＡＡＧＡＡＣＡＧＧＡＴＡＡＣＣＣＧＴＧＡＣＣＡＡＧ−３’（センス；
配列番号１０３）
５’ＴＴＡＡＣＴＴＧＧＴＣＡＣＧＧＧＴＴＡＴＣＣＴＧＴＴＣＴＴＣＣＣＡＴ
ＡＧＣＴＡＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＧＴＡＡＧＴＧＴＴＴＴＣＧ−３’（アンチセ
ンス；配列番号１０４）
を有する２種の合成オリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより、Ｌ２５
５Ｋ突然変異を伴いＡＴ２のＩＣ３をコードしそして５’にＥｃｏＲＩ付着端お
よび３’にＡｆＩＩＩ付着端を含有するＤＮＡフラグメント（フラグメントＣ）
を生成させた。
【００６７】
フラグメントＣを、ＥｃｏＲＩおよびＡｆＩＩＩ部位によりフラグメントＢの
前に挿入した。その後、生じるクローンをＥｃｏＲＩ部位によりフラグメントＡ
と連結して、ＡＴ２Ｋ２５５ＩＣ３をもつＡＴ１を生成させた。
４．Ａ２４３＋突然変異
Ａ２４３＋突然変異（核酸配列について配列番号１０５、およびアミノ酸配列
について配列番号１０６を参照されたい）を創製することにより、非内在性のヒ
トＡＴ１受容体の調製もまた達成した。Ａ２４３＋突然変異は以下のＰＣＲに基
づく戦略を使用して構築した。すなわち、１０％ＤＭＳＯ、０．２５μＭの各プ
ライマーおよび０．５ｍＭの各４種のヌクレオチドを補充された、製造元により
提供される緩衝液系とともにｐｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ））を使用して２回のＰＣＲ反応を実施した。利用された５’ＰＣＲ
のセンスプライマーは以下の配列：
５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＣＡＧＧＴＧＴＡＴＴＴＧＡＴ−３’（配列番
号１０７）
を有し、また、アンチセンスプライマーは以下の配列：
５’−ＡＡＧＣＡＣＡＡＴＴＧＣＴＧＣＡＴＡＡＴＴＡＴＣＴＴＡＡＡＡＡＴＡ
ＴＣＡＴＣ−３’（配列番号１０８）
を有した。利用された３’ＰＣＲのセンスプライマーは、Ａｌａ挿入を含有する
以下の配列：
５’−ＡＡＧＡＴＡＡＴＴＡＴＧＧＣＡＧＣＡＡＴＴＧＴＧＣＴＴＴＴＣＴＴＴ
ＴＴＣＴＴＴ−３’（配列番号１０９）
そしてアンチセンスプライマー：
５’−ＧＴＴＧＧＡＴＣＣＡＣＡＴＡＡＴＧＣＡＴＴＴＴＣＴＣ−３’（配列番
号１１０）
を有した。周期条件は、９４℃１分間、５４℃１分間および７２℃１．５分間の
２５周期であった。その後、５’および３’のＰＣＲのアリコートを共鋳型(co-
template)として使用して、５’ＰＣＲのセンスプライマーおよび３’ＰＣＲの
アンチセンスプライマーを使用する二次的ＰＣＲを実施した。ＰＣＲ条件は、伸
長時間が２．５分であったことを除き一次ＰＣＲと同一であった。生じるＰＣＲ
フラグメントをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そしてｐＣＭＶベク
ターにサブクローニングした（配列番号１０５を参照されたい）。
４．ＣＣＫＢ
Ｖ３２２Ｋ突然変異（核酸配列について配列番号１１１、およびアミノ酸配列
について配列番号１１２を参照されたい）を創製することにより、非内在性の構
成的に活性化されるヒトＣＣＫＢ受容体の調製を達成した。突然変異誘発は、実
施例１からの野性型ＣＣＫＢを使用する増幅を介してＰＣＲにより実施した。
【００６８】
配列番号７５、およびＶ３２２Ｋ突然変異を含んで成るアンチセンスプライマ
ー：
５’−ＣＡＧＣＡＧＣＡＴＧＣＧＣＴＴＣＡＣＧＣＧＣＴＴＣＴＴＡＧＣＣＣＡ
Ｇ−３’（配列番号１１３）
を使用することにより第一のＰＣＲフラグメント（１ｋｂ）を増幅した。Ｖ３２
２Ｋ突然変異を含んで成るセンスプライマー：
５’−ＡＧＡＡＧＣＧＣＧＴＧＡＡＧＣＧＣＡＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＡＴＣＧ
ＴＴ−３’（配列番号１１４）および配列番号７６を使用することにより第二の
ＰＣＲフラグメント（０．４４ｋｂ）を増幅した。その後、配列番号７５および
配列番号７６、ならびに上で示された系および条件を使用して、Ｖ３３２Ｋを含
んで成るＣＣＫＢを増幅するための鋳型として２種の生じるＰＣＲフラグメント
を使用した。Ｖ３３２Ｋ突然変異を含有する生じる１．４４ｋｂのＰＣＲフラグ
メントをＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そしてｐＣＭＶ発現ベクタ
ーのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位にクローン化した（配列番号１１１を参照
されたい）。
３．クイックチェンジ［ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ］（商標）部位特異的［Ｓｉｔｅ
−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ］（商標）突然変異誘発
クイックチェンジ［ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ］（商標）部位特異的［Ｓｉｔｅ−
Ｄｉｒｅｃｔｅｄ］（商標）突然変異誘発キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ）、製造元の説明書に従う）を使用することにより、非内在性のヒト
ＧＰＣＲの調製もまた達成することができる。内在性ＧＰＣＲを鋳型として好ま
しく使用し、また、２種の突然変異誘発プライマー、ならびに最も好ましくはリ
シン突然変異誘発オリゴヌクレオチドおよび選択マーカーオリゴヌクレオチド（
キットに包含される）を利用する。便宜上、ヒトＧＰＣＲに組み込まれたコドン
の突然変異およびそれぞれのオリゴヌクレオチドを標準的形態で示す（表Ｈ）：
【００６９】
【表９】
【００７０】
実施例３
受容体の発現
タンパク質の発現のために多様な細胞が当該技術に使用可能であるが、哺乳動
物細胞を利用することが最も好ましい。これの主要な理由は実地的なことに基づ
く。すなわち、例えばＧＰＣＲの発現のための酵母細胞の利用が可能な一方で、
受容体共役型の遺伝子的機構を包含しなくてもよい（事実、酵母の場合は包含し
ない）非哺乳動物細胞および哺乳動物の系について発展した分泌経路をプロトコ
ルに導入し、従って、非哺乳動物細胞で得られる結果は、潜在的に有用な一方で
哺乳動物細胞から得られるものと同じくらい好ましくはない。哺乳動物細胞のう
ち、ＣＯＳ−７、２９３および２９３Ｔ細胞がとりわけ好ましいが、利用される
特定の哺乳動物細胞は当業者の特定のニーズに基づくことが可能である。
【００７１】
第１日に、１５０ｍｍプレートあたり１×１０7個の２９３Ｔ細胞をプレート
培養した。第２日に２本の反応チューブを準備した（各チューブについて後に続
く比率はプレート１枚あたりである）。すなわち、チューブＡは、１．２ｍｌの
血清を含まないＤＭＥＭ（アーヴィン サイエンティフィック（Ｉｒｖｉｎｅ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、カリフォルニア州アーヴィン）中に２０μｇのＤＮＡ
（例えばｐＣＭＶベクター；受容体ｃＤＮＡを含むｐＣＭＶベクター、など）を
混合することにより準備し；チューブＢは１．２ｍｌの血清を含まないＤＭＥＭ
中に１２０μｌのリポフェクタミン（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）を混合する
ことにより準備した。チューブＡおよびＢは反転（数回）により混合し、次いで
室温で３０〜４５分間インキュベートした。混合状態を「トランスフェクション
混合物」と称する。プレート培養された２９３Ｔ細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、次
いで１０ｍｌの血清を含まないＤＭＥＭを添加した。細胞に２．４ｍｌのトラン
スフェクション混合物を添加し、次いで３７℃／５％ＣＯ2で４時間インキュベ
ートした。トランスフェクション混合物を吸引により除去し、次いで２５ｍｌの
ＤＭＥＭ／１０％ウシ胎児血清を添加した。細胞を３７℃／５％ＣＯ2でインキ
ュベートした。７２時間のインキュベーション後に細胞を収穫し、そして分析に
利用した。
実施例４
非内在性ＧＰＣＲの構成的活性の測定のためのアッセイ
非内在性のヒトＧＰＣＲの構成的活性の評価には多様なアプローチが利用可能
である。以下は具体的説明であり；当業者は、当業者のニーズに優先的に利益を
もたらす技術を決定する能力があると信じられる。
１．膜結合アッセイ：［35Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイ
Ｇタンパク質共役型受容体がリガンド結合もしくは構成的活性化のいずれかの
結果としてその活性状態にある場合、受容体はＧタンパク質に共役しそしてＧＤ
Ｐの放出およびＧＴＰのＧタンパク質へのその後の結合を刺激する。Ｇタンパク
質−受容体複合体のαサブユニットがＧＴＰアーゼとして作用し、そしてＧＴＰ
をＧＤＰにゆっくりと加水分解し、この点で受容体が通常非活性化される。構成
的に活性化された受容体はＧＤＰをＧＴＰと交換し続ける。構成的に活性化され
る受容体を発現する膜への［35Ｓ］ＧＴＰγＳの高められた結合を立証するのに
、加水分解不可能なＧＴＰ類似物［35Ｓ］ＧＴＰγＳを利用することができる。
構成的活性化を測定するための［35Ｓ］ＧＴＰγＳ結合の使用の利点は：（ａ）
それが全部のＧタンパク質共役型受容体に包括的に応用可能である；（ｂ）それ
は膜表面の近接であり、細胞内カスケードに影響を及ぼす分子を拾い上げること
をより少なくありそうにすることである。
【００７２】
該アッセイは、直接的に関連する受容体を発現する膜への［35Ｓ］ＧＴＰγＳ
の結合を刺激するＧタンパク質共役型受容体の能力を利用する。従って、該アッ
セイは、既知の、オーファンのおよび構成的に活性化されるＧタンパク質共役型
受容体に対する候補化合物をスクリーニングするための直接同定法で使用するこ
とができる。該アッセイは包括的であり、また、全部のＧタンパク質共役型受容
体での薬物発見に対する応用性を有する。
【００７３】
［35Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイは、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および１ｍＭと約２
０ｍＭとの間のＭｇＣｌ2（この量は結果の至適化のため調節することができる
が、２０ｍＭが好ましい）ｐＨ７．４、約０．３ｎＭと約１．２ｎＭとの間の［
35Ｓ］ＧＴＰγＳ（この量は結果の至適化のため調節することができるが、１．
２が好ましい）および１２．５ないし７５μｇの膜タンパク質（例えば受容体を
発現するＣＯＳ−７細胞；この量は至適化のため調節することができるが、７５
μｇが好ましい）および１μＭ ＧＤＰ（この量は至適化のため変更することが
できる）を含む結合緩衝液中で１時間インキュベートすることが可能である。そ
の後、コムギ胚芽アグルチニンビーズ（２５μｌ；アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ））を添加し、そして混合物を室温で別の３０分間インキュベートする。そ
の後、チューブを１５００×ｇで室温で５分間遠心分離し、そしてその後シンチ
レーション計数器で計数する。
【００７４】
より少なく高価なしかし同等に応用可能な代替物が同定されており、これはま
た大スケールのスクリーニングのニーズにも合致する。フラッシュプレート［Ｆ
ｌａｓｈ ｐｌａｔｅ］（商標）およびワラック［Ｗａｌｌａｃ］（商標）シン
チストリップを利用して、高スループットの［35Ｓ］ＧＴＰγＳ結合アッセイの
全体構成を定めることができる。さらに、この技術を使用すれば、［35Ｓ］ＧＴ
ＰγＳ結合を介して効力をモニターするのと同一時点で受容体へのトリチウム化
されたリガンドの結合を同時にモニターするために、該アッセイを既知のＧＰＣ
Ｒに利用することができる。トリチウム標識プローブおよび35Ｓ標識プローブの
双方を見るようにワラック（Ｗａｌｌａｃ）ベータ計数器がエネルギーウィンド
ウを切り替えることができるために、これが可能である。このアッセイはまた、
受容体の活性化をもたらす他の型の膜活性化事象を検出するのにも使用してよい
。例えば、該アッセイは多様な受容体（Ｇタンパク質共役型受容体およびチロシ
ンキナーゼ受容体の双方）の32Ｐホスホリル化をモニターするのに使用してよい
。膜がウェルの底部に遠心分離されている場合、結合された［35Ｓ］ＧＴＰγＳ
もしくは32Ｐ−ホスホリル化された受容体が、ウェルの被覆されているシンチラ
ントを活性化することができる。この原理を立証するのにシンチ［Ｓｃｉｎｔｉ
］（商標）ストリップ（ワラック（Ｗａｌｌａｃ））が使用されている。加えて
、該アッセイはまた、放射活性に標識されたリガンドを使用して受容体へのリガ
ンド結合を測定するための有用性も有する。類似の様式で、放射標識された結合
されたリガンドがウェルの底部に遠心分離されている場合、シンチストリップの
標識は放射標識されたリガンドに接近して活性化および検出をもたらす。
２．アデニリルシクラーゼ
細胞に基づくアッセイのため設計されたフラッシュプレート［Ｆｌａｓｈ Ｐ
ｌａｔｅ］（商標）アデニリルシクラーゼキット（ニュー イングランド ニュ
ークリア（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）；カタログ番号ＳＭＰ０
０４Ａ）を、粗原形質膜との使用のため改変することができる。フラッシュプレ
ート（Ｆｌａｓｈ Ｐｌａｔｅ）のウェルはシンチラントのコーティングを含有
し、このコーティングはｃＡＭＰを認識する特異的抗体もまた含有する。ｃＡＭ
Ｐ抗体への放射活性のｃＡＭＰトレーサーの結合についての直接の競争により、
ウェル中で生成されたｃＡＭＰを定量した。以下は、受容体を発現する膜中のｃ
ＡＭＰレベルの変化の測定のための簡潔なプロトコルとしてはたらく。
【００７５】
トランスフェクションされた細胞をトランスフェクションのおよそ３日後に収
穫する。２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４および１０ｍＭ ＭｇＣｌ2を含有
する緩衝液に懸濁された細胞の均質化により膜を調製した。均質化は、ブリンク
マン（Ｂｒｉｎｋｍａｎ）ポリトロン［Ｐｏｌｙｔｒｏｎ］（商標）を使用し氷
上でおよそ１０秒間実施する。生じるホモジェネートを４℃で４９，０００×ｇ
で１５分間遠心分離する。その後、生じるペレットを２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐ
Ｈ７．４および０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する緩衝液に再懸濁し、１０秒間均
質化し、次いで４９，０００×ｇで４℃で１５分間遠心分離する。生じるペレッ
トは利用されるまで−８０℃で保存することができる。測定の日に膜ペレットを
室温でゆっくりと融解させ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４および１０ｍＭ
ＭｇＣｌ2（これらの量は至適化することができるが、本明細書に列挙される
値が好ましい）を含有する緩衝液に再懸濁して０．６０ｍｇ／ｍｌの最終タンパ
ク質濃度を生じる（再懸濁された膜は使用まで氷上に置いた）。
【００７６】
ｃＡＭＰ標準および検出緩衝液（１１ｍｌの検出緩衝液に対し２μＣｉのトレ
ーサー［125Ｉ］ｃＡＭＰ（１００μｌ）を含んで成る）を調製し、そして製造
元の説明書に従って維持する。アッセイ緩衝液はスクリーニングのため新たに調
製し、そして２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、２０
ｍＭ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、０．１単位／ｍｌのクレアチンホスホキナーゼ
（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、５０μＭ ＧＴＰ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））および
０．２ｍＭ ＡＴＰ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を含有し；アッセイ緩衝液は利用
されるまで氷上で保存することができる。ＮＥＮ フラッシュプレート（Ｆｌａ
ｓｈ Ｐｌａｔｅ）への５０μｌのアッセイ緩衝液の添加、次いで５０μｌの膜
懸濁液の添加によりアッセイを開始する。結果として生じるアッセイ混合物を室
温で６０分間インキュベートし、次いで１００μｌの検出緩衝液を添加する。そ
の後、プレートを追加の２〜４時間インキュベートし、次いでワラック（Ｗａｌ
ｌａｃ）マイクロベータ［ＭｉｃｒｏＢｅｔａ］（商標）シンチレーション計数
器で計数する。各アッセイプレート内に含有される標準ｃＡＭＰ曲線からウェル
あたりのｃＡＭＰの値を外挿する。
Ｃ．レポーターに基づくアッセイ
１．ＣＲＥＢレポーターアッセイ（Ｇｓ会合型受容体）
Ｇｓ刺激を検出する方法はｃＡＭＰ依存性の様式で活性化される転写因子ＣＲ
ＥＢの既知の特性に依存する。２９３もしくは２９３Ｔ細胞中でのＧｓ共役型の
活性についてアッセイするのに、パスディテクト［ＰａｔｈＤｅｔｅｃｔ］（商
標）ＣＲＥＢトランスレポーティング（ＣＲＥＢ ｔｒａｎｓ−Ｒｅｐｏｒｔｉ
ｎｇ）系（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カタログ番号２１９０１
０）を利用することができる。細胞は、哺乳動物トランスフェクションキット（
ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カタログ番号２００２８５）を製造
元の説明書に従って使用して、この上の系のプラスミド成分、および内在性もし
くは突然変異体の受容体をコードする指定された発現プラスミドでトランスフェ
クションする。簡潔には、４００ｎｇのｐＦＲ−Ｌｕｃ（Ｇａｌ４認識配列を含
有するルシフェラーゼレポータープラスミド）、４０ｎｇのＦＡ２−ＣＲＥＢ（
Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメインを含有するＧａｌ４−ＣＲＥＢ融合タンパク質）
、８０ｎｇのｐＣＭＶ−受容体発現プラスミド（受容体を含んで成る）および２
０ｎｇのＣＭＶ−ＳＥＡＰ（分泌型アルカリホスファターゼ発現プラスミド；ト
ランスフェクションされた細胞の培地中でアルカリホスファターゼ活性を測定し
て、サンプル間のトランスフェクション効率の変動について制御する）を、キッ
トの説明書に従ってリン酸カルシウム沈殿中に組み合わせる。沈殿物の半分を９
６穴プレートの３個のウェルに同等に配分し、細胞上で一夜保ち、そして翌朝に
新鮮培地で置き換える。トランスフェクションの開始４８時間後に細胞を処理し
、そして例えばルシフェラーゼ活性についてアッセイする。
２．ＡＰ１レポーターアッセイ（Ｇｑ会合型受容体）
Ｇｑ刺激を検出する方法は、それらのプロモーター中にＡＰ１要素を含有する
遺伝子の活性化を引き起こすＧｑ依存性ホスホリパーゼＣの既知の特性に依存す
る。リン酸カルシウム沈殿物の成分が４１０ｎｇのｐＡＰ１−Ｌｕｃ、８０ｎｇ
のｐＣＭＶ−受容体発現プラスミドおよび２０ｎｇのＣＭＶ−ＳＥＡＰであった
ことを除いて、ＣＲＥＢレポーターアッセイに関して上に示されたプロトコルに
従い、パスディテクト［Ｐａｔｈｄｅｔｅｃｔ］（商標）ＡＰ−１シスレポーテ
ィング（ＡＰ−１ ｃｉｓ−Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ）系（ストラタジーン（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ）、カタログ番号２１９０７３）を利用することができる。
３．ＣＲＥ−Ｌｕｃレポーターアッセイ
２９３および２９３Ｔ細胞をウェルあたり細胞２×１０4個の密度で９６穴プ
レート上でプレート培養し、そして翌日、製造元の説明書に従ってリポフェクタ
ミン試薬（ＢＲＬ）を使用してトランスフェクションした。ＤＮＡ／脂質混合物
を以下のとおり各６個のウェルのトランスフェクションのため調製する。すなわ
ち、１００μｌのＤＭＥＭ中の２６０ｎｇのプラスミドＤＮＡを、１００μｌの
ＤＭＥＭ中２μｌの脂質と穏やかに混合した（２６０ｎｇのプラスミドＤＮＡは
、２００ｎｇの８ｘＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミド（プラスミドの一部分
の表示については下および図１を参照されたい）、５０ｎｇの内在性受容体もし
くは非内在性受容体を含んで成るｐＣＭＶまたはｐＣＭＶ単独、ならびに１０ｎ
ｇのＧＰＲＳ発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ）中のＧＰＲＳ）より成った）。８ＸＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラ
スミドは以下のとおり調製した。すなわち、ｐβｇａｌ−基本ベクター（Ｂａｓ
ｉｃ Ｖｅｃｔｏｒ）（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））のＢｇｌＶ−Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ部位にラットソマトスタチンプロモーター（−７１／＋５１）をクロ
ーン化することにより、ベクターＳＲＩＦ−β−ｇａｌを得た。アデノウイルス
鋳型ＡｄｐＣＦ１２６ＣＣＲＥ８（７ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
１８８３（１９９６）を参照されたい）からのＰＣＲにより、８コピーのｃＡ
ＭＰ応答要素を得、そしてＫｐｎ−ＢｇｌＶ部位でＳＲＩＦ−β−ｇａｌベクタ
ーにクローン化して８ｘＣＲＥ−β−ｇａｌレポーターベクターをもたらした。
８ｘＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミドは、８ｘＣＲＥ−β−ｇａｌレポータ
ーベクター中のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部
位でｐＧＬ３−基本ベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））から得られたルシ
フェラーゼ遺伝子で置き換えることにより生成した。室温で３０分のインキュベ
ーション後に、４００μｌのＤＭＥＭでＤＮＡ／脂質混合物を希釈し、そして１
００μｌの希釈された混合物を各ウェルに添加した。細胞培養インキュベーター
中での４時間のインキュベーション後に、１０％ＦＣＳを含む１００μｌのＤＭ
ＥＭを各ウェルに添加した。翌日、トランスフェクションされた細胞を、１０％
ＦＣＳを含むウェルあたり２００μｌのＤＭＥＭで変更した。８時間後、ＰＢＳ
での１回の洗浄後に、ウェルをウェルあたり１００μｌのフェノールレッドを含
まないＤＭＥＭに変更した。翌日、製造元の説明書に従って、ルックライト［Ｌ
ｕｃＬｉｔｅ］（商標）レポーター遺伝子アッセイキット（パッカード（Ｐａｃ
ｋａｒｄ））を使用してルシフェラーゼ活性を測定し、そして１４５０マイクロ
ベータ［ＭｉｃｒｏＢｅｔａ］（商標）シンチレーションおよび発光計数器（ワ
ラック（Ｗａｌｌａｃ））で読み取った。
４．ＳＲＦ−Ｌｕｃレポーターアッセイ
Ｇｑ刺激を検出するための一方法は、それらのプロモーター中に血清応答因子
を含有する遺伝子の活性化を引き起こすＧｑ依存性のホスホリパーゼＣの既知の
特性に依存する。例えばＣＯＳ７細胞でのＧｑ共役型の活性についてアッセイす
るのに、パスディテクト［Ｐａｔｈｄｅｔｅｃｔ］（商標）ＳＲＦ−Ｌｕｃレポ
ーティング系（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を利用することがで
きる。製造元の説明書に従って哺乳動物トランスフェクション［Ｍａｍｍａｌｉ
ａｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ］（商標）キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ）、カタログ番号２００２８５）を使用して、系のプラスミド成分
および内在性もしくは非内在性のＧＰＣＲをコードする指定された発現プラスミ
ドで細胞をトランスフェクションする。簡潔には、４１０ｎｇのＳＲＦ−Ｌｕｃ
、８０ｎｇのｐＣＭＶ受容体発現プラスミドおよび２０ｎｇのＣＭＶ−ＳＥＡＰ
（分泌型アルカリホスファターゼ発現プラスミド；トランスフェクションされた
細胞の培地中でアルカリホスファターゼ活性を測定して、サンプル間のトランス
フェクションの効率の変動について制御する）を、製造元の説明書に従ってリン
酸カルシウム沈殿物中で組み合わせる。沈殿物の半分を９６穴プレートの３個の
ウェルに同等に配分し、血清を含まない培地中で細胞上で２４時間保つ。指定さ
れた場合は、最後の５時間、細胞を１μＭのアンジオテンシンとともにインキュ
ベートする。その後細胞を溶解し、そして、製造元の説明書に従ってルックライ
ト［Ｌｕｃｌｉｔｅ］（商標）キット（パッカード（Ｐａｃｋａｒｄ）、カタロ
グ番号６０１６９１１）および「トライルックス（Ｔｒｉｌｕｘ）１４５０マイ
クロベータ（ＭｉｃｒｏＢｅｔａ）」液体シンチレーションおよび発光計数器（
ワラック（Ｗａｌｌａｃ））を使用してルシフェラーゼ活性についてアッセイす
る。データはグラフパッド プリズム［ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ］（商標
）２．０ａ（グラフパッド ソフトウェア インク（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆ
ｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．））を使用して解析することができる。
５．細胞内ＩＰ3蓄積アッセイ
第１日に、受容体（内在性および／もしくは非内在性）を含んで成る細胞を２
４穴プレート上でプレート培養することができる（通常、ウェルあたり細胞１×
１０5個、とは言えこの数字は至適化することができる）。第２日に、ウェルあ
たり５０μｌの血清を含まないＤＭＥＭ中の０．２５μｇのＤＮＡおよびウェル
あたり５０μｌの血清を含まないＤＭＥＭ中の２μｌのリポフェクタミンを最初
に混合することにより、細胞をトランスフェクションすることができる。溶液は
穏やかに混合し、そして室温で１５〜３０分間インキュベートする。０．５ｍｌ
のＰＢＳで細胞を洗浄し、そして４００μｌの血清を含まない培地をトランスフ
ェクション培地と混合しかつ細胞に添加する。その後、細胞を３７℃／５％ＣＯ
2で３〜４時間インキュベートし、そしてその後、トランスフェクション培地を
除去しかつウェルあたり１ｍｌの通常の成長培地で置き換える。第３日に、細胞
を3Ｈ−ミオイノシトールで標識する。簡潔には、培地を除去し、そして細胞を
０．５ｍｌのＰＢＳで洗浄する。その後、０．５ｍｌのイノシトールを含まない
／血清を含まない培地（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）ＢＲＬ）を、ウェルあたり０．２
５μＣｉの3Ｈ−ミオイノシトールとともにウェルあたりに添加し、そして細胞
を３７℃／５％ＣＯ2で１６〜１８時間一夜インキュベートする。第４日に、細
胞を０．５ｍｌのＰＢＳで洗浄し、そして、イノシトールを含まない／血清を含
まない培地、１０μＭパージリン、１０ｍＭ塩化リチウムを含有する０．４５ｍ
ｌのアッセイ培地、もしくは０．４ｍｌのアッセイ培地および１０μＭの最終濃
度までの５０μｌの１０×ケタンセリン（ｋｅｔ）を添加する。その後細胞を３
７℃で３０分間インキュベートする。その後細胞を０．５ｍｌのＰＢＳで洗浄し
、そしてウェルあたり２００μｌの新鮮／氷冷停止溶液（１Ｍ ＫＯＨ；１８ｍ
Ｍホウ酸ナトリウム；３．８ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加する。溶液を５〜１０分間
もしくは細胞が溶解されるまで氷上で保ち、そしてその後、２００μｌの新鮮／
氷冷中和溶液（７．５％ＨＣｌ）により中和する。その後、ライセートを１．５
ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、そしてチューブあたり１ｍｌのクロロホ
ルム／メタノール（１：２）を添加する。溶液を１５秒間ボルテックス攪拌し、
そして上層をバイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）ＡＧ１−Ｘ８（商標）陰イオン交換
樹脂（１００〜２００メッシュ）に適用する。最初に樹脂を１：１．２５Ｗ／Ｖ
の水で洗浄し、そして０．９ｍｌの上層をカラムに負荷する。カラムを１０ｍｌ
の５ｍＭミオイノシトールおよび１０ｍｌの５ｍＭホウ酸ナトリウム／６０ｍＭ
ギ酸ナトリウムで洗浄する。２ｍｌの０．１Ｍギ酸／１Ｍギ酸アンモニウムを用
い、１０ｍｌのシンチレーションカクテルを含有するシンチレーションバイアル
中にイノシトールトリスリン酸を溶出する。１０ｍｌの０．１Ｍギ酸／３Ｍギ酸
アンモニウムで洗浄することによりカラムを再生し、そしてｄｄＨ2Ｏで２回す
すぎ、そして水中で４℃で保存する。
【００７７】
例示的結果を下の表Ｉに提示する：
【００７８】
【表１０】
【００７９】
Ｃ．細胞に基づく検出アッセイ（例−ＴＤＡＧ８）
２９３細胞をプレートあたり細胞１．３×１０7個の密度で１５０ｍｍプレー
ト上でプレート培養し、そしてプレートあたり１２μｇのそれぞれのＤＮＡおよ
び６０μｌのリポフェクタミン試薬（ＢＲＬ）を使用してトランスフェクション
した。トランスフェクションされた細胞は、トランスフェクション後２４時間に
実施されるアッセイのため血清を含有する培地中で成長させた。トランスフェク
ション後４８時間に実施される検出アッセイ（血清および血清を含まない培地を
比較するアッセイ；図３を参照されたい）のため、初期培地を血清もしくは血清
を含まない培地のいずれかに変更した。血清を含まない培地は、単にダルベッコ
の改変イーグル（ＤＭＥ）高グルコース培地（アーヴィン サイエンティフィッ
ク（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）＃９０２４）から構成された。上の
ＤＭＥ培地に加えて、血清を含む培地は以下、すなわち１０％ウシ胎児血清（ハ
イクロン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）＃ＳＨ３００７１．０３）、１％の１００ｍＭピル
ビン酸ナトリウム（アーヴィン サイエンティフィック（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉ
ｅｎｔｉｆｉｃ）＃９３３４）、１％の２０ｍＭ Ｌ−グルタミン（アーヴィン
サイエンティフィック（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）＃９３１７）
および１％のペニシリン−ストレプトマイシン溶液（アーヴィン サイエンティ
フィック（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）＃９３６６）を含有した。
【００８０】
９６穴のアデニリルシクラーゼ活性化フラッシュプレート［Ｆｌａｓｈｐｌａ
ｔｅ］（商標）を使用した（ＮＥＮ：＃ＳＭＰ００４Ａ）。最初に、アッセイの
ための標準５０μｌを、ウェルあたり５０ｐｍｏｌから０ｐｍｏｌまでのｃＡＭ
Ｐ濃度の範囲にわたるプレート（二重(in duplicate)）に添加した。標準ｃＡＭ
Ｐ（ＮＥＮ：＃ＳＭＰ００４Ａ）を水で再構成し、そして１×ＰＢＳ（アーヴィ
ン サイエンティフィック（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）＃９２４０
）を使用して連続的希釈物を作成した。次に、５０μｌの刺激緩衝液（ＮＥＮ：
＃ＳＭＰ００４Ａ）を全部のウェルに添加した。ｃＡＭＰの活性化もしくは不活
性化を測定するのに化合物を使用する場合は、水で希釈された各化合物１０μｌ
を三重でそのそれぞれのウェルに添加した。使用された多様な最終濃度は１μＭ
から１ｍＭまでの範囲にわたる。アデノシン５’−三リン酸、ＡＴＰ（リサーチ
バイオケミカルズ インターナショナル（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ：＃Ａ−１４１）およびアデノシン５
’−二リン酸、ＡＤＰ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）：＃Ａ２７５４）をアッセイで使
用した。次に、それぞれのｃＤＮＡ（ＣＭＶもしくはＴＤＡＧ８）でトランスフ
ェクションされた２９３細胞を、トランスフェクション後２４（血清培地中での
アッセイの検出）もしくは４８（血清および血清を含まない培地を比較するアッ
セイの検出）時間で収穫した。培地を吸引し、そして細胞を１×ＰＢＳで１回洗
浄した。その後、５ｍｌの１×ＰＢＳを３ｍｌの細胞解離緩衝液（シグマ（Ｓｉ
ｇｍａ）：＃Ｃ−１５４４）とともに細胞に添加した。解離された細胞を遠心分
離チューブに移し、そして室温で５分間遠心分離した。上清を除去し、そして、
１ミリリットルあたり細胞２×１０6個の最終濃度を得るように、細胞ペレット
を適切な量の１×ＰＢＳに再懸濁した。化合物を含有するウェルに、１×ＰＢＳ
中の細胞５０μｌ（ウェルあたり細胞１×１０5個）を添加した。プレートを室
温で１５分間振とう機でインキュベートした。トレーサーｃＡＭＰを含有する検
出緩衝液を調製した。１１ｍｌの検出緩衝液（ＮＥＮ：＃ＳＭＰ００４Ａ）中で
５０μｌ（１μＣｉに等しい）の［125Ｉ］ｃＡＭＰ（ＮＥＮ：＃ＳＭＰ００４
Ａ）を添加した。インキュベーション後に、トレーサーｃＡＭＰを含有するこの
検出緩衝液５０μｌを各ウェルに添加した。プレートを振とう機に設置し、そし
て室温で２時間インキュベートした。最後に、プレートのウェルからの溶液を吸
引し、そしてワラック（Ｗａｌｌａｃ）マイクロベータ［ＭｉｃｒｏＢｅｔａ］
（商標）シンチレーション計数器を使用してフラッシュプレートを計数した。
【００８１】
図２Ａにおいて、ＡＴＰおよびＡＤＰは内在性のＴＤＡＧ８に結合し、それぞ
れ約５９％および約５５％のｃＡＭＰの増大をもたらす。図２Ｂは、内在性のＴ
ＤＡＧ８へのＡＴＰおよびＡＤＰの結合を明示し、ここでは内在性ＴＤＡＧ８が
トランスフェクションされ、そして血清および血清を含まない培地中で成長され
た。血清培地中で成長された内在性のＴＤＡＧ８へのＡＴＰの結合は、化合物を
伴わない内在性のＴＤＡＧ８に比較して、約６５％のｃＡＭＰの増大を明示し；
血清を含まない培地中では約６８％の増大が存在した。血清中の内在性ＴＤＡＧ
８へのＡＤＰの結合は約６１％の増大を明示する一方、血清を含まない培地中で
はＡＤＰ結合が約６２％増大の増大を明示する。ＡＴＰおよびＡＤＰは、それぞ
れ１３９．８μＭおよび１２０．５μＭのＥＣ５０値で内在性のＴＤＡＧ８に結
合する（データは示されない）。
【００８２】
図２Ｂに提示される結果は、血清および血清を含まない培地を比較した場合に
実質的に同一の結果を示すが、われわれの選択は血清に基づく培地を使用するこ
とである。とは言え血清を含まない培地もまた利用することが可能である。
実施例６
ＧＰＣＲ融合タンパク質の調製
構成的に活性化されるＧＰＣＲ−Ｇタンパク質融合構築物の設計を以下のとお
り達成した。すなわち、ラットＧタンパク質Ｇｓα（長形態；伊藤（Ｉｔｏｈ，
Ｈ．）ら、８３ ＰＮＡＳ ３７７６（１９８６））の５’および３’双方の端
をそれにＨｉｎｄＩＩＩ（５’−ＡＡＧＣＴＴ−３’）配列を包含するように工
作した。正しい配列（隣接するＨｉｎｄＩＩＩ配列を包含する）の確認後に、そ
のベクターのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を使用してサブクローニングすることによ
り、配列全体をｐｃＤＮＡ３．１（−）（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ）、カタログ番号Ｖ７９５−２０）にｓｎｕｔｔｌｅした。ｐｃＤＮＡ３
．１（−）へのサブクローニング後にＧｓαの配列について正しい向きを決定し
た。ＨｉｎｄＩＩＩ配列でラットＧｓα遺伝子を含有する改変されたｐｃＤＮＡ
３．１（−）をその後確認し；このベクターは今や「普遍的」Ｇｓαタンパク質
ベクターとして利用可能となった。ｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクターは、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ部位の上流に多様な公知の制限部位を含有し、従ってＧｓタンパク質の
上流に内在性の構成的に活性なＧＰＣＲのコーディング配列を挿入する能力を有
益に提供する。他の「普遍的」Ｇタンパク質ベクターを創製するのにこの同一の
アプローチを利用することができ、そして、もちろん、当業者に既知の他の商業
的に入手可能なもしくは占有のベクターを利用することができる。重要な基準は
、ＧＰＣＲの配列がＧタンパク質の配列の上流にかつ同じ読み枠で存在すること
である。
【００８３】
ＴＤＡＧ８はＧｓを介して共役する一方、Ｈ９はＧｚを介して共役する。以下
の例示的ＧＰＣＲ融合タンパク質についてＧｓαへの融合を達成した。
【００８４】
ＴＤＡＧ８（Ｉ２２５Ｋ）−Ｇｓα融合タンパク質構築物は以下のとおり作成
した。すなわち、プライマーを以下のとおり設計した：
５’−ｇａｔｃＴＣＴＡＧＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＡＣＡＴＧＴＡＴＴＧＡＡＧ−
３’（配列番号１２５；センス）
５’−ｃｔａｇＧＧＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＡＧＧＡＣＣＴＣＴＡＡＴＴＣＣＡＴ
ＡＧ−３’（配列番号１２６；アンチセンス）。
【００８５】
小文字のヌクレオチドはＧタンパク質とＴＤＡＧ８との間の制限部位中のスペ
ーサーとして包含される。該センスおよびアンチセンスプライマーはそれぞれＸ
ｂａＩおよびＫｐｎＩの制限部位を包含した。
【００８６】
その後、それぞれについて以下のプロトコルを使用し、ＰＣＲを利用して、上
に開示されたＧｓα普遍的ベクター内の融合についてそれぞれの受容体配列を保
証した。すなわち、２μｌの各プライマー（センスおよびアンチセンス）、３μ
Ｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、１０μＬの１０×タックプラス［ＴａｑＰｌｕｓ］（
商標）プレシジョン（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）緩衝液、１μＬのタックプラス［Ｔ
ａｑＰｌｕｓ］（商標）プレシジョン（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）ポリメラーゼ（ス
トラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）：＃６００２１１）ならびに８０μＬの
水を含有する別個のチューブに、１００ｎｇのＴＤＡＧ８のｃＤＮＡを添加した
。ＴＤＡＧ８についての反応温度および周期時間は以下のとおりであった。すな
わち、最初の変性段階はそれを９４℃で５分間、そして、９４℃３０秒間；５５
℃３０秒間；７２℃２分間の周期を行った。最後の伸長時間は７２℃で１０分間
行った。順向きのＰＣＲ産物(PCR product for)を１％アガロースゲル上で泳動
し、そしてその後精製した（データは示されない）。精製された産物をＸｂａＩ
およびＫｐｎＩ（ニュー イングランド バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））で消化し、そして所望の挿入物を精製しかつそれぞれの
制限部位でＧｓ普遍的ベクターに連結した。形質転換後に陽性のクローンを単離
し、そして制限酵素消化により決定し；２９３細胞を使用する発現は下に示され
るプロトコルに従って達成した。ＴＤＡＧ８：Ｇｓ融合タンパク質についてのそ
れぞれの陽性のクローンを配列決定して正しさを確かめた。
【００８７】
非内在性の構成的に活性化されるＴＤＡＧ８（Ｉ２２５Ｋ）を含んで成るＧＰ
ＣＲ融合タンパク質を上のとおり分析し、そして構成的活性化について確かめた
。
【００８８】
Ｈ９（Ｆ２３６Ｋ）−Ｇｓα融合タンパク質構築物は以下のとおり作成した。
すなわち、プライマーを以下のとおり設計した：
５’−ＴＴＡｇａｔａｔｃＧＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＴＡＧＣＧＧＴ−３’（配列
番号１４５；センス）
５’−ｇｇｔａｃｃＣＣＣＡＣＡＧＣＣＡＴＴＴＣＡＴＣＡＧＧＡＴＣ−３’（
配列番号１４６；アンチセンス）。
【００８９】
小文字のヌクレオチドはＧタンパク質とＨ９との間の制限部位中のスペーサー
として包含される。センスおよびアンチセンスプライマーはそれぞれＥｃｏＲＶ
およびＫｐｎＩの制限部位を包含し、その結果、スペーサー（制限部位に帰され
る）がＧタンパク質とＨ９との間に存在する。
【００９０】
その後、それぞれについて以下のプロトコルを使用し、ＰＣＲを利用して、上
に開示されたＧｓα普遍的ベクター内の融合についてそれぞれの受容体配列を保
証した。すなわち、１００ｎｇの各プライマー（センスおよびアンチセンス）な
らびに４５μＬのＰＣＲスーパーミックス［Ｓｕｐｅｒｍｉｘ］（商標）（ギブ
コ（Ｇｉｂｃｏ）−Ｂｒｌ、ライフテック（ＬｉｆｅＴｅｃｈ））を含有する別
個のチューブに、８０ｎｇのＨ９のｃＤＮＡを添加した（５０μＬの総反応体積
）。Ｈ９についての反応温度および周期時間は以下のとおりであった。すなわち
、最初の変性段階はそれを９４℃で１、そして、９４℃３０秒間；５５℃３０秒
間、７２℃２分間の周期を行った。最後の伸長時間は７２℃で７分間行った。順
向きのＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で泳動し、そしてその後精製した（デ
ータは示されない）。精製された産物をｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（商標）系にクロ
ーン化し、次いで陽性のクローンを同定した。陽性のクローンを単離し、Ｅｃｏ
ＲＶおよびＫｐｎＩ（ニュー イングランド バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ
ａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））で消化し、そして所望の挿入物を単離し、精製しか
つそれぞれの制限部位でＧｓ普遍的ベクターに連結した。形質転換後に陽性のク
ローンを単離し、そして制限酵素消化により決定し；２９３細胞を使用する発現
は下に示されたプロトコルに従って達成した。Ｈ９（Ｆ２３６Ｋ）：Ｇｓ融合タ
ンパク質についての各陽性のクローンを配列決定して正しさを確かめた。膜は利
用されるまで凍結（−８０℃）した。
【００９１】
（Ｈ９はＧｚと共役するのであるが）Ｇｓタンパク質により媒介されるｃＡＭ
Ｐ応答を測定する能力を確かめるため、ＮＥＮアデニルシクラーゼ活性化フラッ
シュプレート［Ｆｌａｓｈｐｌａｔｅ］（商標）アッセイキット（９６穴の形式
）に基づき、以下のｃＡＭＰ膜アッセイを利用した。「結合緩衝液」は１０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌｍおよび１０ｍＭ ＭｇＣｌ（ｐＨ７．４
）より成った。「再生緩衝液」は結合緩衝液中で調製し、そして２０ｍＭホスホ
クレアチン、２０Ｕのクレアチンホスホキナーゼ、２０μＭ ＧＴＰ、０．２ｍ
Ｍ ＡＴＰおよび０．６ｍＭ ＩＢＭＸより成った。「ｃＡＭＰ標準」は以下の
とおり結合緩衝液中で調製した：
【００９２】
【表１１】
【００９３】
凍結された膜（対照としてのｐＣＭＶおよび非内在性のＨ（−Ｇｓ融合タンパ
ク質の双方）を（溶液中まで室温で氷上で）融解した。膜を懸濁液中までポリト
ロンで均質化した（２×１５秒）。ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッ
セイプロトコル（下を参照されたい）を使用して膜タンパク質濃度を測定した。
再生緩衝液中で膜の濃度を０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した（最終アッセイ濃度−ウ
ェルあたり２５μｇ）。その後、５０μｌの結合緩衝液を各ウェルに添加した。
対照には、ウェルあたり５０μｌのｃＡＭＰ標準をウェル１１および１２Ａ−Ｇ
に、結合緩衝液単独を１２Ｈに添加した（９６穴の形式で）。その後、ウェルあ
たり５０μｌのタンパク質をウェルに添加し、そして室温で（振とう機上で）６
０分間インキュベートした。検出緩衝液（下を参照されたい）中１００μｌの［
125Ｉ］ｃＡＭＰを各ウェルに添加した（最終−１１ｍｌの検出緩衝液中に５０
μｌの［125Ｉ］ｃＡＭＰ）。これらを室温で２時間インキュベートした。プレ
ートを８チャンネルのマニホールドで吸引し、そしてプレートの蓋で封止した。
結果（結合されたｃＡＭＰのｐｍｏｌ）を「プロット＃１５」でワラック［Ｗａ
ｌｌａｃ］（商標）１４５０で読み取った。結果を図３に提示する。
【００９４】
図３に提示される結果は、Ｇｓ共役型融合がシクラーゼ反応を「駆動する」こ
とが可能であり、その結果Ｈ９（Ｆ２３６Ｋ）の構成的活性化の測定が実現可能
であったことを示す。これらの結果に基づけば、反作用薬、アゴニストおよび部
分的アゴニストである候補化合物の直接同定がシクラーゼに基づくアッセイを使
用して可能である。
実施例６
プロトコル：［35Ｓ］ＧＴＰγＳを使用する反作用薬およびアゴニストの直接同
定
われわれは、全く理解されていない理由上、例えば反作用薬のような候補化合
物の直接同定に内在性の構成的に活性のＧＰＣＲを利用したが、アッセイ間の変
動が悪化されたようになる可能性がある。その場合、好ましくは、上に開示され
たようなＧＰＣＲ融合タンパク質を非内在性の構成的に活性化されるＧＰＣＲと
ともにもまた利用する。われわれは、こうしたタンパク質を使用する場合にアッ
セイ間の変動が実質的に安定化されるようであり、それにより有効なＳ／Ｎ比が
得られることを決定した。これは候補化合物のより確固たる同定を見込むという
有益な結果を有する。従って、直接同定のためにはＧＰＣＲ融合タンパク質を使
用すること、また、利用される場合は以下のアッセイプロトコルを利用すること
が好ましい。
膜の調製
目的の、および反作用薬、アゴニストもしくは部分的アゴニストとしての候補
化合物の直接同定での使用のための非内在性の構成的に活性のオーファンＧＰＣ
Ｒ融合タンパク質を含んで成る膜は、以下のように好ましく調製する：
ａ．材料
「膜掻き取り緩衝液」は２０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐ
Ｈ７．４より構成され；「膜洗浄緩衝液」は２０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび０．１
ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４から構成され；「結合緩衝液」は２０ｍＭ ＨＥＰ
ＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．４から構成
される。
ｂ．手順
全部の材料は処置の間中氷上に保つ。最初に、細胞のコンフルエントな単層か
ら培地を吸引し、次いで１０ｍｌの冷ＰＢＳですすぎ、次いで吸引する。その後
、５ｍｌの膜掻き取り緩衝液を添加して細胞を掻き取り；これに次いで細胞抽出
物を５０ｍｌ遠心管に移す（２０，０００ｒｐｍで４℃で１７分間遠心分離され
る）。その後、上清を吸引し、そしてペレットを３０ｍｌの膜洗浄緩衝液に再懸
濁し、次いで２０，０００ｒｐｍで４℃で１７分間遠心分離する。上清をその後
吸引し、そしてペレットを結合緩衝液に再懸濁する。その後、ブリンクマン（Ｂ
ｒｉｎｋｍａｎ）ポリトロン［ｐｏｌｙｔｒｏｎ］（商標）ホモジェナイザーを
使用してこれを均質化する（全部の物質が懸濁液中にあるまで１５〜２０秒破裂
させる）。これを本明細書で「膜タンパク質」と称する。
ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）タンパク質アッセイ
均質化の後に、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）タンパク質アッセイを
使用して膜のタンパク質濃度を測定する（タンパク質を約１．５ｍｇ／ｍｌに希
釈し、等分し、そして後の使用のため凍結する（−８０℃）ことができ；凍結さ
れる場合、使用のためのプロトコルは以下のとおりである。すなわち、アッセイ
の日に、凍結された膜タンパク質を室温で融解し、次いでボルテックス攪拌し、
そしてその後、約５〜１０秒間約１２×１，０００ｒｐｍでポリトロンで均質化
し；複数の調製のためには、異なる調製物の均質化の間にホモジェナイザーを徹
底的に洗浄すべきであることが言及される）。
ａ．材料
結合緩衝液（上に従う）；ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）色素試薬；
ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）タンパク質標準を製造元の説明書に従っ
て（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）カタログ番号５００−０００６）利用する。
ｂ．手順
二重のチューブを準備する（１本は膜を包含し、そして１本は対照の「ブラン
ク」として）。それぞれは８００μｌの結合緩衝液を含有した。その後、１０μ
ｌのブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）タンパク質標準（１ｍｇ／ｍｌ）を
各チューブに添加し、そしてその後１０μｌの膜タンパク質を１本のチューブに
だけ添加する（ブランクでない）。その後、２００μｌのブラッドフォード（Ｂ
ｒａｄｆｏｒｄ）色素試薬を各チューブに添加し、次いでそれぞれをボルテック
ス攪拌する。５分後にチューブを再度ボルテックス攪拌し、そして、その中の物
質をキュベットに移す。その後、波長５９５でＣＥＣＩＬ ３０４１分光光度計
を使用してキュベットを読み取る。
直接同定アッセイ
ａ．材料
ＧＤＰ緩衝液は３７．５ｍｌの結合緩衝液および２ｍｇのＧＤＰ（シグマ（Ｓ
ｉｇｍａ）、カタログ番号Ｇ−７１２７）より成り、次いで０．２μＭ ＧＤＰ
を得るため結合緩衝液で一連の希釈を行い（各ウェル中でのＧＤＰの最終濃度は
０．１μＭ ＧＤＰであった）；候補化合物を含んで成る各ウェルは、１００μ
ｌのＧＤＰ緩衝液（最終濃度、０．１μＭ ＧＤＰ）、５０μｌの結合緩衝液中
の膜タンパク質、および５０μｌの結合緩衝液中の［35Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．６
ｎＭ）（１０ｍｌの結合緩衝液あたり２．５μｌの［35Ｓ］ＧＴＰγＳ）より成
る２００μｌの最終体積を有する。
ｂ．手順
候補化合物は９６穴プレートの形式（これらは−８０℃で凍結させることがで
きる）を使用して好ましくスクリーニングする。膜タンパク質（もしくは、対照
として、ＧＰＣＲ融合タンパク質を除外する発現ベクターを含む膜）を懸濁液中
まで短く均質化する。その後、上に示されたブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒ
ｄ）タンパク質アッセイを使用してタンパク質濃度を測定する。その後、膜タン
パク質（および対照）を結合緩衝液で０．２５ｍｇ／ｍｌに希釈する（最終アッ
セイ濃度、ウェルあたり１２．５μｇ）。その後、１００μｌのＧＤＰ緩衝液を
ワラック（Ｗａｌｌａｃ）シンチストリップ［Ｓｃｉｎｔｉｓｔｒｉｐ］（商標
）（ワラック（Ｗａｌｌａｃ））の各ウェルに添加する。その後、５μｌのピン
ツール(pin-tool)を使用して、こうしたウェルに５μｌの候補化合物を移す（す
なわち、２００μｌの総アッセイ体積中の５μｌは１：４０の比であり、その結
果候補化合物の最終スクリーニング濃度は１０μＭである）。再度、汚染を回避
するため、各移送段階の後にはピンツールを水（１×）、エタノール（１×）お
よび水（２×）を含んで成る３個の水槽ですすぐべきであり、過剰の液体は各す
すぎの後にツールから振りそして紙およびキムワイプでぬぐって乾かすべきであ
る。その後、５０μｌの膜タンパク質を各ウェルに添加し（ＧＰＣＲ融合タンパ
ク質を含まない膜を含んで成る対照ウェルもまた利用する）、そして室温で５〜
１０分間前インキュベートする。その後、５０μｌの結合緩衝液中の［35Ｓ］Ｇ
ＴＰγＳ（０．６ｎＭ）を各ウェルに添加し、次いで室温で振とう機で６０分間
インキュベートする（再度、この実施例において、プレートをホイルで覆った）
。その後、２２℃で４０００ＲＰＭで１５分間のプレートの回転によりアッセイ
を停止する。その後、プレートを８チャンネルのマニホールドで吸引し、そして
プレートの蓋で封止する。その後、（製造元の説明書に従って）「Ｐｒｏｔ．＃
３７」の設定を使用してワラック（Ｗａｌｌａｃｃ）１４５０でプレートを読み
取る。
実施例７
プロトコル：確認アッセイ
上に示されたような直接同定された候補化合物の確認を提供するための独立の
アッセイのアプローチを使用して、その後確認アッセイを利用することが好まし
い。この場合、好ましい確認アッセイはシクラーゼに基づくアッセイである。
【００９５】
改変されたフラッシュプレート［Ｆｌａｓｈ Ｐｌａｔｅ］（商標）アデニリ
ルシクラーゼキット（ニュー イングランド ニュークリア（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ
ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）；カタログ番号ＳＭＰ００４Ａ）を、以下のプロトコ
ルに従って、非内在性の構成的に活性化されるオーファンＧＰＣＲに対する反作
用薬およびアゴニストとして直接同定された候補化合物の確認に、好ましく利用
する。
【００９６】
トランスフェクションされた細胞をトランスフェクション後およそ３日に収穫
する。２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４および１０ｍＭ ＭｇＣｌ2を含有す
る緩衝液中に懸濁された細胞の均質化により膜を調製する。均質化は、ブリンク
マン（Ｂｒｉｎｋｍａｎ）ポリトロン［Ｐｏｌｙｔｒｏｎ］（商標）を使用して
氷上でおよそ１０秒間実施する。生じるホモジェネートは４９，０００×ｇで４
℃で１５分間遠心分離する。その後、生じるペレットを、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ
、ｐＨ７．４および０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する緩衝液に再懸濁し、１０秒
間均質化し、次いで４９，０００×ｇで４℃で１５分間遠心分離する。生じるペ
レットは利用されるまで−８０℃で保存することができる。直接同定スクリーニ
ングの日に、膜ペレットを室温でゆっくりと融解し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐ
Ｈ７．４および１０ｍＭ ＭｇＣｌ2を含有する緩衝液に再懸濁して、０．６０
ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度を生じる（再懸濁された膜は使用まで氷上に置
く）。
【００９７】
ｃＡＭＰ標準および検出緩衝液（１１ｍｌの検出緩衝液に対して２μＣｉのト
レーサー［125Ｉ］ｃＡＭＰ（１００μｌ）を含んで成る）は、製造元の説明書
に従って調製しかつ維持する。アッセイ緩衝液はスクリーニングのために新たに
調製し、そして２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、２
０ｍＭホスホクレアチン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、０．１単位／ｍｌのクレア
チンホスホキナーゼ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、５０μＭ ＧＴＰ（シグマ（Ｓ
ｉｇｍａ））および０．２ｍＭ ＡＴＰ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を含有し；ア
ッセイ緩衝液は利用されるまで氷上で保存することができる。
【００９８】
上に従って同定された候補化合物（凍結されている場合は室温で融解させる）
を、４０μＭの膜タンパク質（ウェルあたり３０μｇ）および５０μｌのアッセ
イ緩衝液と一緒に、好ましくは９６穴プレートのウェルに添加する（ウェルあた
り３μｌ；１２μＭの最終アッセイ濃度）。その後、この混合状態を穏やかに振
とうしながら室温で３０分間インキュベートする。
【００９９】
インキュベーション後に、各ウェルに１００μｌの検出緩衝液を添加し、次い
で２〜２４時間インキュベートする。その後、プレートを、（製造元の説明書に
従い）「Ｐｒｏｔ．＃３１」を使用してワラック（Ｗａｌｌａｃ）マイクロベー
タ［ＭｉｃｒｏＢｅｔａ］（商標）プレートリーダーで計数する。
【０１００】
本特許文書で挙げられる特許、出願および印刷された刊行物のそれぞれはこれ
によりそっくりそのまま引用により組み込まれることが意図される。
【０１０１】
当業者は、多数の変更および改変を、本発明の技術思想から離れることなく本
発明の好ましい態様に対し行ってよいことを認識するであろう。全部のこうした
変形物は本発明の範囲内にあることが意図される。
【０１０２】
多様な発現ベクターが当業者に利用可能であるが、内在性および非内在性双方
のヒトＧＰＣＲに対する利用の目的上、利用されるベクターはｐＣＭＶであるこ
とが最も好ましい。このベクターは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に
関するブダペスト条約（ｔｈｅ Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ ｆｏｒ ｔ
ｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕ
ｒｐｏｓｅ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）の規定の下に、１９９
８年１０月１３日にアメリカン タイプ カルチャー コレクション（Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）（
１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，米国バージニア州マナサス
２０１１０−２２０９）に寄託された。該ＤＮＡはＡＴＣＣにより試験され、そ
してそうであることが決定された。ＡＴＣＣはｐＣＭＶに対し以下の寄託番号：
ＡＴＣＣ＃２０３３５１を割り当てている。
（配列表）
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、１９９８年１０月１３日に米国特許・商標庁に出願された米国
第０９／１７０，４９６号の一部継続出願であり、かつそれからの優先権を主張
する。本出願は、以下の仮出願（全部は示された日付に米国特許・商標庁に米国
エクスプレスメール（Ｕ．Ｓ．Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｍａｉｌ）を介して出願された
）、すなわち１９９８年１１月２７日に出願された米国仮出願第６０／１１０，
０６０号；１９９９年２月１６日に出願された米国仮出願第６０／１２０，４１
６号；１９９８年１１月２０日に出願された米国仮出願第６０／１０９，２１３
号の利益を主張する１９９９年２月２６日に出願された米国仮出願第６０／１２
１，８５２号；１９９９年３月１２日に出願された米国仮出願第６０／１２３，
９４４号；１９９９年３月１２日に出願された米国仮出願第６０／１２３，９４
５号；１９９９年３月１２日に出願された米国仮出願第６０／１２３，９４８号
；１９９９年３月１２日に出願された米国仮出願第６０／１２３，９５１号；１
９９９年３月１２日に出願された米国仮出願第６０／１２３，９４６号；１９９
９年３月１２日に出願された米国仮出願第６０／１２３，９４９号；１９９９年
８月２７日に出願された米国仮出願第６０／１５１，１１４号および１９９８年
１１月１２日に出願された米国仮出願第６０／１０８，０２９号の利益を主張す
る１９９９年９月３日に出願された米国仮出願第６０／１５２，５２４号；１９
９９年５月２８日に出願された米国仮出願第６０／１３６，４３６号；１９９９
年５月２８日に出願された米国仮出願第６０／１３６，４３９号；１９９９年５
月２８日に出願された米国仮出願第６０／１３６，５６７号；１９９９年５月２
８日に出願された米国仮出願第６０／１３７，１２７号；１９９９年５月２８日
に出願された米国仮出願第６０／１３７，１３１号；１９９９年５月２８日に出
願された米国仮出願第６０／１３６，４３７号の利益を主張する１９９９年６月
２９日に出願された米国仮出願第６０／１４１，４４８号；１９９９年９月２９
日に出願された米国仮出願第６０／１５６，６３３号；１９９９年９月２９日に
出願された米国仮出願第６０／１５６，５５５号；１９９９年９月２９日に出願
された米国仮出願第６０／１５６，６３４号；１９９９年９月２９日に出願され
た米国仮出願第＿＿＿＿号（アリーナ ファーマシューティカルズ インク（Ａ
ｒｅｎａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）処理予定表番号：ＣＨ
Ｎ１０−１）；１９９９年１０月１日に出願された米国仮出願第＿＿＿＿号（ア
リーナ ファーマシューティカルズ インク（Ａｒｅｎａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕ
ｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）処理予定表番号：ＲＵＰ６−１）；１９９９年１０月
１日に出願された米国仮出願第＿＿＿＿号（アリーナ ファーマシューティカル
ズ インク（Ａｒｅｎａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）処理予
定表番号：ＲＵＰ７−１）；１９９９年１０月１日に出願された米国仮出願第＿
＿＿＿号（アリーナ ファーマシューティカルズ インク（Ａｒｅｎａ Ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）処理予定表番号：ＣＨＮ６−１）；１９
９９年１０月１日に出願された米国仮出願第＿＿＿＿号（アリーナ ファーマシ
ューティカルズ インク（Ａｒｅｎａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎ
ｃ．）処理予定表番号：ＲＵＰ５−１）；ならびに１９９９年１０月１日に出願
された米国仮出願第＿＿＿＿号（アリーナ ファーマシューティカルズ インク
（Ａｒｅｎａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）処理予定表番号：
ＣＨＮ９−１）からの優先権の利益もまた主張する。本出願は、１９９９年１０
月１２日に（米国エクスプレスメール（Ｕ．Ｓ．Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｍａｉｌ）を
介して）出願された同時係属中の米国第＿＿＿＿号（ウッドコック（Ｗｏｏｄｃ
ｏｃｋ）、ウォッシュバーン（Ｗａｓｈｂｕｒｎ）、クルツ（Ｋｕｒｔｚ）、マ
キエヴィッツ（Ｍａｋｉｅｗｉｃｚ）とノリス（Ｎｏｒｒｉｓ））、ＬＬＰ処理
予定表番号ＡＲＥＮ−００５０）および１９９９年７月３０日に出願された米国
第０９／３６４，４２５号（双方は引用により本明細書に組み込まれる）にもま
た関する。本出願は、１９９９年１０月１２日に（米国エクスプレスメール（Ｕ
．Ｓ．Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｍａｉｌ）を介して）出願された米国第＿＿＿＿号（ウ
ッドコック（Ｗｏｏｄｃｏｃｋ）、ウォッシュバーン（Ｗａｓｈｂｕｒｎ）、ク
ルツ（Ｋｕｒｔｚ）、マキエヴィッツ（Ｍａｋｉｅｗｉｃｚ）とノリス（Ｎｏｒ
ｒｉｓ））、ＬＬＰ処理予定表番号ＡＲＥＮ−００５４）（そっくりそのまま引
用により本明細書に組み込まれる）に対する優先権もまた主張する。前述の出願
のそれぞれはそっくりそのまま引用により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本特許明細書に開示される発明は、膜貫通受容体、およびより具体的にはヒト
Ｇタンパク質共役型受容体、そしてとりわけ該受容体の構成的活性を確立するも
しくは高めるよう改変されているＧＰＣＲに関する。好ましくは、改変されたＧ
ＰＣＲは、治療薬として潜在的応用性を有する受容体のアゴニスト、反作用薬も
しくは部分的アゴニストとしての候補化合物の直接の同定に使用される。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ヒトでは多数の受容体のクラスが存在するが、はるかに最も豊富かつ治療に関
係するものは、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲもしくは複数ＧＰＣＲ）の
クラスにより代表される。ヒトゲノム内には数十万個の遺伝子が存在することが
推定されており、そしてこれらのなかでおよそ２％もしくは２，０００個の遺伝
子がＧＰＣＲをコードすると推定されている。内在性リガンドが同定されている
、ＧＰＣＲを包含する受容体は「既知」受容体と称される一方、内在性リガンド
が同定されていない受容体は「オーファン」受容体と称される。ＧＰＣＲは製薬
学的製品の開発に重要な一領域を代表する。すなわち、１００種の既知のＧＰＣ
Ｒのおよそ２０種から全処方薬の６０％が開発されている。
【０００４】
ＧＰＣＲは１つの共通な構造モチーフを共有する。全部のこれらの受容体は、
７個のαヘリックスを形成する２２ないし２４個の間の疎水性アミノ酸の７個の
連なりを有し、そのそれぞれは膜にまたがる（各広がり(span)は数字により同定
されている。すなわち膜貫通−１（ＴＭ−１）、膜貫通−２（ＴＭ−２）など）
。膜貫通ヘリックスは、細胞膜の外もしくは「細胞外」側で、膜貫通−２と膜貫
通−３、膜貫通−４と膜貫通−５、および膜貫通−６と膜貫通−７の間でアミノ
酸の鎖により結合されている（これらはそれぞれ「細胞外」領域１、２および３
（ＥＣ−１、ＥＣ−２およびＥＣ−３）と称される）。膜貫通ヘリックスは、細
胞膜の内もしくは「細胞内」側で、膜貫通−１と膜貫通−２、膜貫通−３と膜貫
通−４、および膜貫通−５と膜貫通−６の間でもまたアミノ酸の鎖により結合さ
れている（これらはそれぞれ「細胞内」領域１、２および３（ＩＣ−１、ＩＣ−
２およびＩＣ−３）と称される）。受容体の「カルボキシ」（「Ｃ」）末端は細
胞内の細胞内空隙中に存し、また、受容体の「アミノ」（「Ｎ」）末端は細胞の
外側の細胞外空隙中に存する。
【０００５】
一般に、内在性リガンドが受容体と結合する場合（しばしば受容体の「活性化
」と称される）、細胞内領域のコンホメーションの変化が存在し、それは細胞内
領域と細胞内の「Ｇタンパク質」との間の共役(coupling)を見込む。ＧＰＣＲは
Ｇタンパク質に関して「混雑して」いる、すなわちＧＰＣＲは１種以上のＧタン
パク質と相互作用する可能性があることが報告されている。ケナキン（Ｋｅｎａ
ｋｉｎ，Ｔ．）、４３ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０９５（１９８８）を
参照されたい。他のＧタンパク質が存在するが、現在のところＧｑ、Ｇｓ、Ｇｉ
、ＧｚおよびＧｏが同定されたＧタンパク質である。Ｇタンパク質との内在性リ
ガンドで活性化されたＧＰＣＲの共役がシグナル伝達カスケード過程（「シグナ
ル伝達」と称される）を開始する。正常な条件下では、シグナル伝達は最終的に
細胞の活性化もしくは細胞の阻害をもたらす。受容体のＩＣ−３ループならびに
カルボキシ末端がＧタンパク質と相互作用すると考えられている。
【０００６】
ＧＰＣＲは、生理学的条件下では２種の異なるコンホメーション、すなわち「
不活性」状態と「活性状態」との間の平衡で細胞膜中に存在する。不活性状態の
受容体は、細胞内のシグナル伝達経路に連結して生物学的応答を生じさせること
が不可能である。受容体のコンホメーションの活性状態への変化は（Ｇタンパク
質を介する）伝達経路への連鎖を可能にし、そして生物学的応答を生じさせる。
【０００７】
受容体は、内在性リガンドもしくは薬物のような化合物により活性状態で安定
化させることができる。独占的に限定されるものでないが受容体のアミノ酸配列
に対する改変を挙げることができる最近の発見は、活性状態のコンホメーション
にある受容体を助長かつ安定化するための内在性リガンドもしくは薬物以外の手
段を提供する。これらの手段は、受容体への内在性リガンドの結合の効果を刺激
することにより、受容体を活性状態で効果的に安定化する。こうしたリガンドに
依存しない手段による安定化を「構成的受容体活性化」と命名する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要約）
内在性ヒトＧＰＣＲの非内在性変種およびそれらの用途を本明細書で開示する
。
本発明は、例えば、以下を提供する：
（項目１） ｈＡＲＥ−３（Ｆ３１３Ｋ）を含んで成る、非内在性で、構
成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目２） 項目１記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性の変
種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目３） ベクターおよび項目１記載のｃＤＮＡを含んで成るプラス
ミド。
（項目４） 項目３記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目５） ｈＡＲＥ−４（Ｖ２３３Ｋ）を含んで成る、非内在性で、構
成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目６） 項目５記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性の変
種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目７） ベクターおよび項目５記載のｃＤＮＡを含んで成るプラス
ミド。
（項目８） 項目７記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目９） ｈＡＲＥ−５（Ａ２４０Ｋ）を含んで成る、非内在性で、構
成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目１０） 項目９記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性の
変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目１１） ベクターおよび項目５記載のｃＤＮＡを含んで成るプラ
スミド。
（項目１２） 項目１１記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目１３） ｈＧＰＣＲ１４（Ｌ２５７Ｋ）を含んで成る、非内在性で
、構成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮ
Ａ。
（項目１４） 項目１３記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性
の変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目１５） ベクターおよび項目１３記載のｃＤＮＡを含んで成るプ
ラスミド。
（項目１６） 項目１５記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目１７） ｈＧＰＣＲ２７（Ｃ２８３Ｋ）を含んで成る、非内在性で
、構成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮ
Ａ。
（項目１８） 項目１７記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性
の変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目１９） ベクターおよび項目１７記載のｃＤＮＡを含んで成るプ
ラスミド。
（項目２０） 項目１９記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目２１） ｈＡＲＥ−１（Ｅ２３２Ｋ）を含んで成る、非内在性で、
構成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ
。
（項目２２） 項目２１記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性
の変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目２３） ベクターおよび項目２１記載のｃＤＮＡを含んで成るプ
ラスミド。
（項目２４） 項目２３記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目２５） ｈＡＲＥ−２（Ｇ２８５Ｋ）を含んで成る、非内在性で、
構成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ
。
（項目２６） 項目２５記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性
の変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目２７） ベクターおよび項目２５記載のｃＤＮＡを含んで成るプ
ラスミド。
（項目２８） 項目２７記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目２９） ｈＰＰＲ１（Ｌ２３９Ｋ）を含んで成る、非内在性で、構
成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目３０） 項目２９記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性
の変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目３１） ベクターおよび項目２９記載のｃＤＮＡを含んで成るプ
ラスミド。
（項目３２） 項目３１記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目３３） ｈＧ２Ａ（Ｋ２３２Ａ）を含んで成る、非内在性で、構成
的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目３４） 項目３３記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性
の変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目３５） ベクターおよび項目３３記載のｃＤＮＡを含んで成るプ
ラスミド。
（項目３６） 項目３５記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目３７） ｈＲＵＰ３（Ｌ２２４Ｋ）を含んで成る、非内在性で、構
成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目３８） 項目３７記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性
の変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目３９） ベクターおよび項目３７記載のｃＤＮＡを含んで成るプ
ラスミド。
（項目４０） 項目３９記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目４１） ｈＲＵＰ５（Ａ２３６Ｋ）を含んで成る、非内在性で、構
成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目４２） 項目４１記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性
の変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目４３） ベクターおよび項目４１記載のｃＤＮＡを含んで成るプ
ラスミド。
（項目４４） 項目４２記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目４５） ｈＲＵＰ６（Ｎ２６７Ｋ）を含んで成る、非内在性で、構
成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目４６） 項目４５記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性
の変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目４７） ベクターおよび項目４５記載のｃＤＮＡを含んで成るプ
ラスミド。
（項目４８） 項目４７記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目４９） ｈＲＵＰ７（Ａ３０２Ｋ）を含んで成る、非内在性で、構
成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目５０） 項目４９記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性
の変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目５１） ベクターおよび項目４９記載のｃＤＮＡを含んで成るプ
ラスミド。
（項目５２） 項目５１記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目５３） ｈＣＨＮ４（Ｖ２３６Ｋ）を含んで成る、非内在性で、構
成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目５４） 項目５３記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性
の変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目５５） ベクターおよび項目５３記載のｃＤＮＡを含んで成るプ
ラスミド。
（項目５６） 項目５５記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目５７） ｈＭＣ４（Ａ２４４Ｋ）を含んで成る、非内在性で、構成
的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目５８） 項目５７記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性
の変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目５９） ベクターおよび項目５７記載のｃＤＮＡを含んで成るプ
ラスミド。
（項目６０） 項目６０記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目６１） ｈＣＨＮ３（Ｓ２８４Ｋ）を含んで成る、非内在性で、構
成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目６２） 項目６１記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性
の変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目６３） ベクターおよび項目６１記載のｃＤＮＡを含んで成るプ
ラスミド。
（項目６４） 項目６３記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目６５） ｈＣＨＮ６（Ｌ３５２Ｋ）を含んで成る、非内在性で、構
成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目６６） 項目６５記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性
の変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目６７） ベクターおよび項目６５記載のｃＤＮＡを含んで成るプ
ラスミド。
（項目６８） 項目６７記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目６９） ｈＣＨＮ８（Ｎ２３５Ｋ）を含んで成る、非内在性で、構
成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目７０） 項目６９記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性
の変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目７１） ベクターおよび項目６９記載のｃＤＮＡを含んで成るプ
ラスミド。
（項目７２） 項目７１記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目７３） ｈＨ９（Ｆ２３６Ｋ）を含んで成る、非内在性で、構成的
に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目７４） 項目７３記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性
の変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目７５） ベクターおよび項目７３記載のｃＤＮＡを含んで成るプ
ラスミド。
（項目７６） 項目７４記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
（項目７７） ｈＡＴ１（Ｆ２３９Ｋ）；ｈＡＴ１（Ｎ１１１Ａ）；ｈＡ
Ｔ１（ＡＴ２Ｋ２５５ＩＣ３）；およびｈＡＴ１（Ａ２４３＋）より成る群から
選択される、非内在性で、構成的に活性化される変種ヒトＧタンパク質共役型Ａ
Ｔ１受容体をコードするｃＤＮＡ。
（項目７８） 項目７７記載のｃＤＮＡによりコードされる、非内在性
の変種ヒトＧタンパク質共役型受容体。
（項目７９） ベクターおよび項目７７記載のｃＤＮＡを含んで成るプ
ラスミド。
（項目８０） 項目７９記載のプラスミドを含んで成る宿主細胞。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】発明にかかる、８ＸＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミドの表示である（実施例４（ｃ）３を参照されたい）。
【図２】発明にかかる、内在性ＴＤＡＧ８へのＡＴＰおよびＡＤＰの結合の結果のグラフ表示（２Ａ）ならびに血清および血清を含まない培地中での比較（２Ｂ）である。
【図３】発明にかかる、ＧＰＣＲ融合タンパク質Ｈ９（Ｆ２３６Ｋ）：Ｇｓαに対するＣＭＶの比較的なシグナル伝達の結果のグラフ表示である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（詳細な記述）
受容体を中核として発展してきた学術文献は、受容体に対する多様な影響を有
するリガンドを指す多数の用語を採用している。明瞭化および一貫性のため、本
特許明細書を通じて以下の定義を使用するであろう。これらの定義がこれらの用
語の他の定義と矛盾する限り、以下の定義が支配する：
アゴニストは、それらが受容体に結合する場合に細胞内応答を活性化する、も
しくは膜へのＧＴＰ結合を高める物質（例えばリガンド、候補化合物）を意味す
る。
【００１１】
本明細書で使用されるアミノ酸の略語を表Ａに示す：
【００１２】
【表１】
【００１３】
部分的アゴニストは、それらが受容体に結合する場合にアゴニストが活性化す
るより小さい度合(degree)／程度(extent)まで細胞内応答を活性化する、もしく
はアゴニストが高めるより小さい度合(degree)／程度(extent)まで膜へのＧＴＰ
結合を高める物質（例えばリガンド、候補化合物）を意味する。
【００１４】
アンタゴニストは、アゴニストと同一の部位で受容体に競争的に結合するがし
かし活性型の受容体により開始される細胞内応答を活性化せず、そしてそれによ
りアゴニストもしくは部分的アゴニストによる細胞内応答を阻害する可能性のあ
る物質（例えばリガンド、候補化合物）を意味する。アンタゴニストは、アゴニ
ストもしくは部分的アゴニストの非存在下で基線の細胞内応答を減少させない。
【００１５】
候補化合物は、スクリーニング技術に基づいて分析できる分子（例えば、そし
て制限でなく化合物）を意味する。好ましくは、「候補化合物」という句は、間
接的同定方法により既に決定されたような、受容体に対する反作用薬、アゴニス
トもしくはアンタゴニストより成る群から選択される化合物であることが公知で
あった化合物（「間接的に同定された化合物」）を包含せず；より好ましくは、
最低１種の哺乳動物で治療上の効能を有することが既に決定されている間接的に
同定された化合物を包含せず；そして最も好ましくは、ヒトで治療上の有用性を
有することが既に決定されている間接的に同定された化合物を包含しない。
【００１６】
組成物は最低１種の成分を含んで成る物質を意味し；「製薬学的組成物」は組
成物の一例である。
【００１７】
化合物の効能は、受容体結合親和性と対照的に、受容体の機能性を阻害もしく
は刺激する化合物の能力の大きさを意味する。化合物の効能の検出の例示的手段
を本特許明細書の実施例のセクションに開示する。
【００１８】
コドンは、リン酸基に結合されたヌクレオシド（アデノシン（Ａ）、グアノシ
ン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）、ウリジン（Ｕ）およびチミジン（Ｔ））を一般に含
んで成りかつ翻訳される場合に１個のアミノ酸をコードするひとそろいの３個の
ヌクレオチド（もしくはヌクレオチドに対する同等物）を意味する。
【００１９】
構成的に活性化される受容体は構成的受容体活性化にさらされる受容体を意味
する。構成的に活性化される受容体は内在性もしくは非内在性であることができ
る。
【００２０】
構成的な受容体の活性化は、その内在性リガンドもしくはその化学的同等物と
の受容体の結合以外の手段による、活性状態での受容体の安定化を意味する。
【００２１】
接触させるもしくは接触することは、インビトロの系であろうとインビボの系
であろうと最低２つの部分を一緒にすることを意味する。
【００２２】
直接同定するもしくは直接同定されるは、「候補化合物」という句に関係して
、構成的に活性化される受容体、好ましくは構成的に活性化されるオーファン受
容体、そして最も好ましくは構成的に活性化されるＧタンパク質共役型の細胞表
面のオーファン受容体に対する候補化合物のスクリーニング、およびこうした化
合物の化合物の効能の評価を意味する。この句は、どの状況下でも、「間接的に
同定する」もしくは「間接的に同定される」という句により包含されるもしくは
それを包含すると解釈もしくは理解されるべきでない。
【００２３】
内在性は哺乳動物が天然に産生する物質を意味する。例えば、そして制限でな
く「受容体」という用語に関しての内在性は、哺乳動物（例えば、そして制限で
なくヒト）もしくはウイルスにより天然に産生されるものを意味する。対照的に
、これに関して非内在性という用語は、哺乳動物（例えば、そして制限でなくヒ
ト）もしくはウイルスにより天然に産生されないものを意味する。例えば、そし
て制限でなく、その内在性の形態で構成的に活性でないがしかし操作される場合
に構成的に活性になる受容体は、本明細書で「非内在性の構成的に活性化される
受容体」と最も好ましく称される。双方の用語は「インビボ」および「インビト
ロ」双方の系を記述するのに利用することができる。例えば、そして制限でなく
、スクリーニングのアプローチにおいて、内在性もしくは非内在性の受容体はイ
ンビトロのスクリーニング系に関してであってよい。さらなる一例として、そし
て制限としてでなく、非内在性の構成的に活性化される受容体を包含するように
哺乳動物のゲノムが操作されている場合には、インビボ系による候補化合物のス
クリーニングが実現可能である。
【００２４】
Ｇタンパク質共役型受容体融合タンパク質およびＧＰＣＲ融合タンパク質は、
本明細書に開示される本発明に関して、それぞれ、最低１種のＧタンパク質、最
も好ましくはこうしたＧタンパク質のαサブユニット（これはＧＴＰを結合する
サブユニットである）に融合された、内在性の構成的に活性化されるＧＰＣＲも
しくは非内在性の構成的に活性化されるＧＰＣＲを含んで成る非内在性タンパク
質を意味し、Ｇタンパク質は好ましくは内在性のオーファンＧＰＣＲと天然に共
役するＧタンパク質と同一の型のものである。例えば、そして制限でなく、内在
性の状態において、Ｇタンパク質「Ｇｓα」がＧＰＣＲと共役する主なＧタンパ
ク質である場合、特定のＧＰＣＲに基づくＧＰＣＲ融合タンパク質はＧｓαに融
合されたＧＰＣＲを含んで成る非内在性タンパク質であることができ；下に示さ
れるであろうようないくつかの状況では、主なものでないＧタンパク質をＧＰＣ
Ｒに融合することができる。Ｇタンパク質は構成的に活性なＧＰＣＲのＣ末端に
直接融合することができるか、もしくは２者の間にスペーサーが存在してよい。
【００２５】
宿主細胞は、その中に組み込まれたプラスミドおよび／もしくはベクターを有
することが可能な細胞を意味する。原核生物宿主細胞の場合には、プラスミドは
宿主細胞の複製物のような自律的分子として典型的に複製され（一般に、プラス
ミドはその後真核生物宿主細胞への導入のため単離される）；真核生物宿主細胞
の場合には、真核生物宿主細胞が複製する場合にプラスミドが複製するように、
プラスミドが宿主細胞の細胞ＤＮＡに組み込まれる。好ましくは、本明細書に開
示される本発明の目的上、宿主細胞は真核生物、より好ましくは哺乳動物であり
、そして最も好ましくは２９３、２９３ＴおよびＣＯＳ−７細胞より成る群から
選択される。
【００２６】
間接的に同定するもしくは間接的に同定されるは、内在性受容体に特異的な内
在性リガンドの同定、リガンド−受容体の相互作用を妨害および／もしくはそれ
と競争するものの決定のための受容体に対する候補化合物のスクリーニング、な
らびに活性化された受容体に関連する最低１種のセカンドメッセンジャー経路に
影響を及ぼす化合物の効能の評価を必要とする、薬物発見過程への伝統的アプロ
ーチを意味する。
【００２７】
「応答」という用語に関係した阻害するもしくは阻害は、化合物の非存在下と
対照的に、化合物の存在下で応答が低下もしくは予防されることを意味する。
【００２８】
反作用薬は、内在性の形態の受容体もしくは構成的に活性化された形態の受容
体のいずれかに結合し、かつ、アゴニストもしくは部分的アゴニストの非存在下
で観察される正常の基準レベルの活性より低い、活性の形態の受容体により開始
される基線の細胞内応答を阻害するか、もしくは膜へのＧＴＰ結合を減少させる
物質（例えばリガンド、候補化合物）を意味する。好ましくは、基線の細胞内応
答は、反作用薬の非存在下の基礎の応答に比較して、反作用薬の存在下で最低３
０％、より好ましくは最低５０％、そして最も好ましくは最低７５％阻害される
。
【００２９】
既知の受容体は、その受容体に特異的な内在性リガンドが同定されている内在
性受容体を意味する。
【００３０】
リガンドは、内在性の天然に存在する受容体に特異的な内在性の天然に存在す
る分子を意味する。
【００３１】
内在性受容体の核酸および／もしくはアミノ酸の配列に関しての突然変異体も
しくは突然変異は、突然変異された形態の内在性の構成的に活性化されない受容
体が該受容体の構成的活性化を明示するような、こうした内在性の配列に対する
指定された１個の変化もしくは複数の変化を意味する。特定の配列に対する同等
物に関して、（ａ）その後の突然変異された形態のヒト受容体の構成的活性化の
レベルが該受容体の第一の突然変異により明示されるものと実質的に同一であり
；そして（ｂ）その後の突然変異された形態の受容体と該受容体の第一の突然変
異との間の配列（アミノ酸および／もしくは核酸）の相同性のパーセントが最低
約８０％、より好ましくは最低約９０％、そして最も好ましくは最低９５％であ
る場合、その後の突然変異された形態のヒト受容体は該ヒト受容体の第一の突然
変異に同等であるとみなされる。理想的には、また、構成的活性化を達成するた
めの本明細書に開示される最も好ましいカセットはＧＰＣＲの内在性の形態と非
内在性の形態との間の単一のアミノ酸および／もしくはコドンの変化を包含する
という事実のために、配列の相同性のパーセントは最低９８％であるべきである
。
【００３２】
非オーファン受容体は、内在性の天然に存在するリガンドに特異的な内在性の
天然に存在する分子を意味し、ここで、受容体へのリガンドの結合が細胞内シグ
ナル伝達経路を活性化する。
【００３３】
オーファン受容体は、その受容体に特異的な内在性リガンドが同定されていな
いかもしくは未知である内在性受容体を意味する。
【００３４】
製薬学的組成物は最低１種の有効成分を含んで成る組成物を意味し、それによ
り該組成物は哺乳動物（例えば、そして制限でなくヒト）における特定の効能の
ある結果についての検討に基づいて分析できる。当業者は、ある有効成分が当業
者のニーズに基づき所望の効能のある結果を有するかどうかを決定するのに適切
な技術を理解かつ認識するであろう。
【００３５】
プラスミドはベクターおよびｃＤＮＡの組み合わせを意味する。一般に、プラ
スミドは、ｃＤＮＡの複製および／もしくはそのタンパク質としての発現の目的
上、宿主細胞に導入される。
【００３６】
「応答」という用語に関係した刺激するもしくは刺激することは、化合物の非
存在下と対照的に化合物の存在下で応答が増大されることを意味する。
【００３７】
ｃＤＮＡに関してのベクターは、最低１個のｃＤＮＡを組み込むことが可能か
つ宿主細胞への組み込みが可能な環状ＤＮＡを意味する。
【００３８】
以下のセクションの階層は表象的な効能について示され、また、後に続く開示
もしくは請求の範囲に対する制限として意図されず、またそのように解釈される
べきでもない。
Ａ．緒言
受容体の伝統的な研究は、発見が受容体に影響を及ぼす可能性のあるアンタゴ
ニストおよび他の分子を見出すよう進めることができる前に、内在性リガンドを
最初に同定しなければならないという（歴史的に基づく）演繹的仮定から常に進
められてきた。アンタゴニストを最初に知ることができた場合であっても、内在
性リガンドを探すように研究が直ちに拡大されてきた。この思考様式は、構成的
に活性化される受容体の発見の後でさえ、受容体の研究で持続してきた。これま
で認識されていなかったことは、受容体のアゴニスト、部分的アゴニストおよび
反作用薬の発見に最も有用であるのは活性状態の受容体であるということである
。過度に活性の受容体もしくは過小活性の受容体から生じる疾患に対して、治療
薬で望まれるものは、必ずしも内在性リガンドに対するアンタゴニストである薬
物でなく、それぞれ、受容体の活性状態を低下させるもしくは受容体の活性を高
めるよう作用する化合物である。これは、活性の受容体状態の活性を低下させる
もしくは高める化合物は内在性リガンドと同一の部位で結合する必要がないため
である。従って、本発明の方法により教示されるとおり、治療的化合物について
のいかなる研究も、リガンドに依存しない活性状態に対して化合物をスクリーニ
ングすることにより開始すべきである。
Ｂ．ヒトＧＰＣＲの同定
ヒトゲノムプロジェクトの努力の成果は、ヒトゲノム内に配置されている核酸
配列に関する夥しい量の情報の同定につながり；それは、いずれかの特定のゲノ
ム配列がヒトタンパク質を翻訳する読取り枠情報を含有するもしくは含有するか
も知れないかどうかに関する理解もしくは認識を伴わずに、遺伝子配列情報が利
用可能にされているというこの努力において真実である。ヒトゲノム内の核酸配
列のいくつかの同定方法は当業者の範囲内にある。例えば、そして制限でなく、
本明細書で開示される多様なヒトＧＰＣＲは、ジェンバンク［ＧｅｎＢａｎｋ］
（商標）データベースを再検討することにより発見された一方、他のＧＰＣＲは
、既に配列決定されたＧＰＣＲの核酸配列を利用してＥＳＴデータベースのＢＬ
ＡＳＴ（商標）検索を実施することにより発見された。下の表Ｂは、ＧＰＣＲの
それぞれの相同受容体と一緒に、われわれが発見した数種の内在性ＧＰＣＲを列
挙する。
【００３９】
【表２】
【００４０】
受容体の相同性は、人体内での受容体の役割の正しい認識を得ることに関して
有用である。本特許明細書が進めるように、われわれは、これらの受容体の非内
在性で構成的に活性化される変種を確立するようにこれらの受容体を突然変異す
るための技術を開示するであろう。
【００４１】
本明細書に開示される技術は、本特許明細書が進行するに従って明らかになる
であろうように、技術既知の他のヒトのオーファンＧＰＣＲにもまた適用されて
いる。
Ｃ．受容体スクリーニング
本明細書に開示される、非内在性で、構成的に活性化される変種ヒトＧＰＣＲ
に対する候補化合物のスクリーニングは、受容体の内在性リガンドの使用を必要
とすることなく、この細胞表面受容体で作用する候補化合物の直接の同定を許す
。本明細書に開示される内在性の変種ヒトＧＰＣＲが発現および／もしくは過剰
発現されている身体内の領域を決定することにより、受容体の発現および／もし
くは過剰発現を伴う関連疾患／障害状態を決定することが可能であり；こうした
一アプローチを本特許明細書で開示する。
【００４２】
本明細書に開示されるヒトＧＰＣＲの構成的活性化を明示することができる突
然変異の創製に関して、ＧＰＣＲのＴＭ６内に配置されると想定されているプロ
リン残基からの距離に基づき；このアルゴリズム技術は、引用により本明細書に
組み込まれる同時係属中かつ共通に譲渡される特許明細書米国第０９／１７０，
４９６号に開示されている。該アルゴリズム技術は、伝統的な配列の「整列」で
はなく、しかしむしろ前述のＴＭ６のプロリン残基からの指定された距離に基づ
く。（思うに受容体のＩＣ３領域中に配置される）この残基から１６アミノ酸残
基に配置されるアミノ酸残基を最も好ましくはリシン残基に突然変異することに
より、こうした活性化を得てよい。この目的を達成するためにはこの位置の突然
変異で他のアミノ酸残基が有用であるかも知れない。
Ｄ．疾患／障害の同定および／もしくは選択
下により詳細に示されるであろうとおり、最も好ましくは非内在性で、構成的
に活性化されるＧＰＣＲに対する反作用薬を本発明の方法論により同定すること
ができる。こうした反作用薬は、本受容体に関連する疾患治療のための薬物発見
プログラムでのリード化合物として理想的な候補である。ＧＰＣＲに対する反作
用薬を直接同定してそれにより製薬学的組成物の開発を可能にする能力のため、
ＧＰＣＲに関連する疾患および障害の研究が適切である。例えば、ＧＰＣＲの存
在について疾患に罹った組織サンプルおよび正常な組織サンプルの双方を走査す
ることは、今や、学究的修練、もしくは特定のＧＰＣＲに対する内在性リガンド
を同定する途に沿って追跡することができるもの以上となっている。組織の走査
は広範な健康なおよび疾患に罹った組織にわたって実施することができる。こう
した組織の走査は、特定の受容体のある疾患および／もしくは障害との関連付け
の好ましい第一段階を提供する。例えば、本明細書に開示されるＧＰＣＲのいく
つかの例示的ドットブロットおよびＲＴ−ＰＣＲの結果については、同時係属中
の出願（処理予定表番号ＡＲＥ−００５０）を参照されたい。
【００４３】
好ましくは、（ａ）組織ｍＲＮＡに対するドットブロット分析、および／もし
くは（ｂ）組織サンプルでの受容体の発現のＲＴ−ＰＣＲ同定のためのプローブ
を作成するのにヒトＧＰＣＲのＤＮＡ配列を使用する。組織供給源、もしくは疾
患に罹った組織中での受容体の存在、または正常組織に比較して疾患に罹った組
織中での上昇された濃度での受容体の存在は、限定されるものでないがその疾患
に関連する疾患を挙げることができる治療レジメンとの相関を同定するのに好ま
しく利用することができる。受容体はこの技術により器官の領域に等しく十分に
局在化する可能性がある。受容体が局在化されている特定の組織の既知の機能に
基づき、受容体の推定の機能上の役割を推定することができる。
Ｅ．候補化合物のスクリーニング
１．包括的ＧＰＣＲスクリーニングアッセイの技術
Ｇタンパク質受容体が構成的に活性になった場合、それはＧタンパク質（例え
ばＧｑ、Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｚ、Ｇｏ）に結合しかつＧタンパク質へのＧＴＰの結合
を刺激する。その後、Ｇタンパク質がＧＴＰアーゼとして作用し、そしてＧＴＰ
をＧＤＰにゆっくりと加水分解し、それにより受容体は正常条件下で失活したよ
うになる。しかしながら、構成的に活性化された受容体はＧＤＰをＧＴＰに交換
し続ける。構成的に活性化される受容体を発現する膜への高められた結合をモニ
ターするのに、ＧＴＰの加水分解不可能な類似物［35Ｓ］ＧＴＰγＳを使用する
ことができる。［35Ｓ］ＧＴＰγＳはリガンドの非存在下および存在下での膜へ
のＧタンパク質の共役をモニターするのに使用することができることが報告され
ている。このモニタリングの一例、なかんずく当業者に公知かつ利用可能な例は
、１９９５年にトレイノル（Ｔｒａｙｎｏｒ）とナホルスキ（Ｎａｈｏｒｓｋｉ
）により報告された。本アッセイ系の好ましい使用は候補化合物の初期スクリー
ニングのためである。なぜなら、該系は、受容体の細胞内ドメインと相互作用す
る特定のＧタンパク質に関係なく、全部のＧタンパク質共役型受容体に包括的に
応用可能であるからである。
２．特異的ＧＰＣＲスクリーニングアッセイの技術
「包括的」Ｇタンパク質共役型受容体アッセイ（すなわちアゴニスト、部分的
アゴニストもしくは反作用薬である化合物を選択するためのアッセイ）を使用し
て候補化合物が同定されれば、該化合物が受容体部位で相互作用していることを
確認するためのさらなるスクリーニングが好ましい。例えば、「包括的」アッセ
イにより同定された化合物は受容体に結合しないかも知れないが、しかし代わり
に細胞内ドメインからＧタンパク質を単に「分離する」かも知れない。
ａ．Ｇｓ、ＧｚおよびＧｉ
Ｇｓは酵素アデニリルシクラーゼを刺激する。他方、Ｇｉ（ならびにＧｚおよ
びＧｏ）はこの酵素を阻害する。アデニリルシクラーゼはＡＴＰのｃＡＭＰへの
転化を触媒し；従って、Ｇｓタンパク質を共役する構成的に活性化されたＧＰＣ
Ｒは、ｃＡＭＰの増大された細胞レベルと関連する。他方、Ｇｉ（もしくはＧｚ
、Ｇｏ）タンパク質を共役する構成的に活性化されたＧＰＣＲは、ｃＡＭＰの低
下された細胞レベルと関連する。一般に、“Ｉｎｄｉｒｅｃｔ Ｍｅｃｈａｎｉ
ｓｍｓ ｏｆ Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ，”第８章、Ｆｒ
ｏｍ Ｎｅｕｒｏｎ Ｔｏ Ｂｒａｉｎ（第３版）ニコルス（Ｎｉｃｈｏｌｓ，
Ｊ．Ｇ．）ら編 サイナウア アソシエーツ インク（Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓ
ｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）（１９９２）を参照されたい。従って、ｃＡＭＰを
検出するアッセイを利用して、ある候補化合物が例えば受容体に対する反作用薬
（すなわちこうした化合物はｃＡＭＰのレベルを低下させることができる）であ
るかどうかを決定することができる。ｃＡＭＰを測定するための当該技術分野で
既知の多様なアプローチを利用することができ；最も好ましいアプローチはＥＬ
ＩＳＡに基づく形式での抗ｃＡＭＰ抗体の使用に頼る。利用することができる別
の型のアッセイは全細胞セカンドメッセンジャーレポーター系アッセイである。
遺伝子のプロモーターは特定の遺伝子がコードするタンパク質の発現を司る。環
状ＡＭＰは、ｃＡＭＰ応答性のＤＮＡ結合タンパク質もしくは転写因子（ＣＲＥ
Ｂ）（その後ｃＡＭＰ応答要素と呼ばれる特定の部位でプロモーターに結合しそ
して遺伝子の発現を司る）の結合を促進することにより遺伝子発現を司る。レポ
ーター遺伝子（例えばβ−ガラクトシダーゼもしくはルシフェラーゼ）の前に複
数のｃＡＭＰ応答要素を含有するプロモーターを有するレポーター系を構築する
ことができる。従って、構成的に活性化されたＧｓに結合された受容体は、ｃＡ
ＭＰの蓄積を引き起こし、これがその後遺伝子およびレポータータンパク質の発
現を活性化する。その後、標準的な生化学的アッセイを使用して、β−ガラクト
シダーゼもしくはルシフェラーゼのようなレポータータンパク質を検出すること
ができる（チェン（Ｃｈｅｎ）ら １９９５）。
ｂ．ＧｏおよびＧｑ
ＧｑおよびＧｏは酵素ホスホリパーゼＣの活性化に関連し、この酵素は順にリ
ン脂質ＰＩＰ2を加水分解して、２種の細胞内メッセンジャー、すなわちジアシ
ルグリセロール（ＤＡＧ）およびイノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ3）
を放出する。ＩＰ3の増大された蓄積はＧｑおよびＧｏ会合型受容体の活性化と
関連する。一般に、“Ｉｎｄｉｒｅｃｔ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｓｙｎ
ａｐｔｉｃ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ，”第８章、Ｆｒｏｍ Ｎｅｕｒｏｎ
Ｔｏ Ｂｒａｉｎ（第３版）ニコルス（Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．Ｇ．）ら編 サイ
ナウア アソシエーツ インク（Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎ
ｃ．）（１９９２）を参照されたい。ＩＰ3の蓄積を検出するアッセイは、候補
化合物が例えばＧｑもしくはＧｏ会合型受容体に対する反作用薬である（すなわ
ちこうした化合物はＩＰ3のレベルを低下させることができる）かどうかを決定
するのに利用することができる。Ｇｑ会合型受容体はＡＰ１レポーターアッセイ
（ここでＧｑ依存性のホスホリパーゼＣがＡＰ１要素を含有する遺伝子の活性化
を引き起こす）を使用してもまた検査することができ；従って、活性化されたＧ
ｑ会合型受容体は、こうした遺伝子の発現の増大を明示することができ、それに
より、それに対する反作用薬はこうした発現の減少を明示することができ、また
、アゴニストはこうした発現の増大を明示することができる。こうした検出のた
めの商業的に入手可能なアッセイが利用可能である。
３．ＧＰＣＲ融合タンパク質
反作用薬、アゴニストおよび部分的アゴニストの直接の同定のための候補化合
物のスクリーニングでの使用のための内在性で、構成的に活性化されるオーファ
ンＧＰＣＲもしくは非内在性で、構成的に活性化されるオーファンＧＰＣＲの使
用は興味深いスクリーニングの挑戦を提供し、ここでは当然、それに結合される
内在性リガンドの非存在下でさえ該受容体は活性である。従って、こうした化合
物が反作用薬、アゴニスト、部分的アゴニストであることができるかどうか、も
しくはこうした受容体に対する影響を有することができるかどうかに関しての理
解を許すこうした識別の目的をもって、例えば候補化合物の存在下の非内在性受
容体とその化合物の非存在下の非内在性受容体とを識別するために、こうした識
別を高める可能性のあるアプローチを利用することが好ましい。好ましい一アプ
ローチはＧＰＣＲ融合タンパク質の使用である。
【００４４】
一般に、非内在性のオーファンＧＰＣＲが上で示されたアッセイ技術（ならび
に他者）を使用して構成的に活性化されていることを決定すれば、内在性ＧＰＣ
Ｒと共役する優勢なＧタンパク質を決定することが可能である。ＧＰＣＲへのＧ
タンパク質の共役はシグナル伝達経路を提供し、これは評価することが可能であ
る。哺乳動物発現系の使用によりスクリーニングが行われることが最も好ましい
ため、こうした系はその中に内在性Ｇタンパク質を有することが期待されよう。
従って、当然、こうした系においては、非内在性の構成的に活性化されたオーフ
ァンＧＰＣＲが連続的にシグナルを発するであろう。この点に関して、例えば受
容体に対する反作用薬の存在下で、とりわけスクリーニングに関してそれが反作
用薬と接触される場合にそれが受容体をより容易に識別することが可能であろう
ことがよりありそうであるように、このシグナルを高めることが好ましい。
【００４５】
ＧＰＣＲ融合タンパク質は、非内在性ＧＰＣＲと共役するＧタンパク質の効能
を高めることを意図している。ＧＰＣＲ融合タンパク質は非内在性の構成的に活
性化されたＧＰＣＲを用いるスクリーニングに好ましい。なぜなら、こうしたア
プローチは、こうしたスクリーニング技術で最も好ましく利用されるシグナルを
増大させるからである。これは大きな「Ｓ／Ｎ」比の助長で重要であり；こうし
た大きな比は本明細書で開示されるような候補化合物のスクリーニングに重要か
つ好ましい。
【００４６】
ＧＰＣＲ融合タンパク質の発現に有用な構築物の構築は当業者の範囲内にある
。商業的に入手可能な発現ベクターおよび系が、研究者の特定のニーズに合う可
能性のある多様なアプローチを提供する。こうしたＧＰＣＲ融合タンパク質構築
物に対する重要な基準は、内在性のＧＰＣＲ配列およびＧタンパク質配列の双方
が同じ読み枠にある（好ましくは内在性ＧＰＣＲの配列はＧタンパク質配列の上
流である）こと、および、ＧＰＣＲの発現に際してＧタンパク質もまた発現する
ことが可能であるようにＧＰＣＲの「終止」コドンを欠失もしくは置き換えなく
てはならないことである。ＧＰＣＲはＧタンパク質に直接連結することができる
か、もしくは２者の間にスペーサー残基（好ましくは約１２を越えないが、この
数字は当業者により容易に確かめることが可能である）が存在することができる
。われわれは、使用されないいくつかの制限部位が発現に際して効果的にスペー
サーとなるであろうことに、スペーサーの使用が（便宜性に基づくと）好ましい
。最も好ましくは、ＧＰＣＲ融合タンパク質構築物の創製に先立ち非内在性ＧＰ
ＣＲに共役するＧタンパク質を同定することができる。同定された数種のＧタン
パク質が存在するにすぎないため、その中の内在性のＧＰＣＲ配列の挿入にＧタ
ンパク質の配列を含んで成る構築物（すなわち普遍的Ｇタンパク質構築物）が利
用可能であることが好ましく；これは、異なる配列を有する多様な異なった内在
性ＧＰＣＲの大スケールのスクリーニングにおいて効率を提供する。
【００４７】
上に示されたとおり、Ｇｉ、ＧｚおよびＧｏに共役する構成的に活性化される
ＧＰＣＲは、これらの型のＧＰＣＲに基づくアッセイを挑戦的にするｃＡＭＰの
形成を阻害すると期待される（すなわち、ｃＡＭＰシグナルは活性化に際して減
少し、従って例えば（このシグナルをさらに減少させることができる）反作用薬
の直接の同定を興味深いものとする）。本明細書に開示されるであろうとおり、
われわれは、実現可能なシクラーゼに基づくアッセイを確立する努力において、
これらの型の受容体について内在性のＧＰＣＲの内在性のＧタンパク質に基づか
ないＧＰＣＲ融合タンパク質を創製することが可能であることを確かめた。従っ
て、例えば、Ｈ９のようなＧｚ共役型受容体、Ｇｓ融合タンパク質を利用するＧ
ＰＣＲ融合タンパク質を確立することが可能である。われわれは、こうした融合
構築物は、発現に際して非内在性のＧＰＣＲが例えば「天然の」Ｇｚタンパク質
よりもむしろＧｓと共役することを「誘導」もしくは「強要」し、その結果シク
ラーゼに基づくアッセイを確立することが可能であると考える。従って、Ｇｉ、
ＧｚおよびＧｏ共役型受容体について、われわれは、ＧＰＣＲ融合タンパク質を
使用しかつアッセイがアデニルシクラーゼ活性の検出に基づく場合は、Ｇｓ（も
しくは酵素アデニリルシクラーゼの形成を刺激する同等のＧタンパク質）を用い
て融合構築物を確立することを好む。
Ｆ．医薬品化学
一般に（しかし常にでなく）、候補化合物の直接の同定はコンビナトリアル化
学の技術を介して生成される化合物に関連して好ましく実施され、それにより何
千もの化合物がこうした分析のため無作為に調製される。一般に、こうしたスク
リーニングの結果は独特のコア構造を有する化合物であることができ；その後、
これらの化合物は、その医薬特性をさらに高めるため、好ましいコア構造（１種
もしくは複数）を取り巻く付加的な化学的改変に好ましくかけられる。こうした
技術は当業者に既知でありかつ本特許明細書で詳細に取り扱わないであろう。
Ｇ．製薬学的組成物
さらなる開発に選択された候補化合物は、当業者に公知の技術を使用して製薬
学的組成物に処方することができる。適する製薬学的に許容できる担体は当業者
に利用可能であり；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ
ｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、１９８０、マック パブリッシング
カンパニー（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）（オスロ（Ｏｓｌｏ）
ら編）を参照されたい。
Ｈ．他の利用性
本明細書に開示される非内在性の変種ヒトＧＰＣＲの好ましい使用は、（好ま
しくは製薬学的作用物質としての使用のための）反作用薬、アゴニストもしくは
部分的アゴニストとしての候補化合物の直接の同定のためのものであることがで
きるが、これらの変種ヒトＧＰＣＲはまた研究の設定でも利用することができる
。例えば、ＧＰＣＲを組み込むインビトロおよびインビボの系は、正常のおよび
疾患に罹った双方のヒトの状態でこれらの受容体が演じる役割をさらに解明かつ
理解するため、ならびに構成的活性化の役割の理解（それがシグナル伝達カスケ
ードの理解に適用されるため）に利用することができる。非内在性のヒトＧＰＣ
Ｒの価値は、そのための内在性リガンドが同定される前に人体でのこれらの受容
体の役割を理解するのに、それらの独特の特徴のため非内在性のヒトＧＰＣＲを
使用することができることにおいて、研究ツールとしてのそれらの利用性が高め
られることである。開示される受容体の他の用途は、とりわけ本特許明細書の検
討に基づき当業者に明らかとなるであろう。
【実施例】
【００４８】
以下の実施例は本発明の解明の目的上（そして制限でなく）提示する。本明細
書で特定の核酸およびアミノ酸の配列が開示される一方、当業者は、下に報告さ
れる同一のもしくは実質的に類似の結果を達成しつつこれらの配列に対する小さ
な改変を行う能力があると信じられる。１配列から別のものまで（例えばラット
受容体からヒト受容体まで、もしくはヒト受容体Ａからヒト受容体Ｂまで）の配
列カセットの応用もしくは理解への伝統的アプローチは、配列整列の技術（それ
により配列は共通の領域を決定する活動で整列される）に一般に基づく。本明細
書に開示される突然変異のアプローチはこのアプローチに頼らないが、しかし、
代わりにアルゴリズムのアプローチ、およびヒトＧＰＣＲのＴＭ６領域内に配置
される保存されたプロリン残基からの位置上の距離に基づく。このアプローチが
確実にされれば、当業者は、それに対して小さな変更を行って本明細書に開示さ
れる実質的に同一の結果（すなわち構成的活性化）を達成する能力があると信じ
られる。こうした改変されたアプローチは本開示の範囲内と考えられる。
実施例１
内在性のヒトＧＰＣＲ
１．ヒトＧＰＣＲの同定
ジェンバンク［ＧｅｎＢａｎｋ］（商標）データベース情報の再検討に基づき
、開示された内在性ヒトＧＰＣＲのあるものを同定した。データベースを検索す
る間に以下のｃＤＮＡクローンを下に明示されるとおり同定した（表Ｃ）。
【００４９】
【表３】
【００５０】
他の開示された内在性ヒトＧＰＣＲは、以下のＥＳＴクローンをクエリ配列と
して使用するＥＳＴデータベース（ｄｂｅｓｔ）のＢＬＡＳＴ（商標）検索を実
施することにより同定した。その後、同定された以下のＥＳＴクローンをプロー
ブとして使用して、ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングした（表Ｄ）。
【００５１】
【表４】
【００５２】
２．完全長のクローニング
Ａ．ヒトＧ２Ａ
マウスＥＳＴクローン１１７９４２６を使用して、３種のアミノ酸Ｇ２Ａコー
ディング配列を除く全部を含有するヒトゲノムクローンを得た。このコーディン
グ配列の５’は５’ＲＡＣＥを使用することにより得、また、ＰＣＲのための鋳
型はクロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のヒト脾マラソン−レディ［Ｍａｒａｔ
ｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ］（商標）ｃＤＮＡであった。開示されるヒトＧ２Ａは、以
下：
５’−ＣＴＧＴＧＴＡＣＡＧＣＡＧＴＴＣＧＣＡＧＡＧＴＧ−３’（配列番号４
１；１回目のＰＣＲ）
５’−ＧＡＧＴＧＣＣＡＧＧＣＡＧＡＧＣＡＧＧＴＡＧＡＣ−３’（配列番号４
２；２回目のＰＣＲ）
のような配列番号４１および配列番号４２に示されるような第一回および第二回
のＰＣＲのためのＧ２ＡのｃＤＮＡに特異的なプライマーを使用するＰＣＲによ
り増幅した。ＰＣＲは、９４℃３０秒間、次いで９４℃５秒間および７２℃４分
間の５周期；ならびに９４°５秒間および７０°４分間の３０周期で、アドバン
テージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）ＧＣポリメラーゼキット（クロンテック（Ｃｌｏ
ｎｔｅｃｈ）；製造説明書に従うことができる）を使用して実施した。およそ１
．３ｋｂのＰＣＲフラグメントをアガロースゲルから精製し、ＨｉｎｄＩＩＩお
よびＸｂａＩで消化し、そして発現ベクターｐＲＣ／ＣＭＶ２（インヴィトロジ
ェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化した。Ｔ７シークェナーゼ［Ｓｅ
ｑｕｅｎａｓｅ］（商標）キット（ＵＳＢ アマーシャム（ＵＳＢ Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ）；製造元の説明書が従われた）を使用してクローン化された挿入物を配
列決定し、そして提示された配列と配列を比較した。Ｐ32標識されたフラグメン
トを用いてＲＮＡドットブロット（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；製造元
の説明書が従われた）をプロービングすることによりヒトＧ２Ａの発現を検出し
た。
ｂ．ＣＨＮ９
ＥＳＴクローン１５４１５３６の配列決定は、ＣＨＮ９が１個の開始コドンの
みを有する（すなわち終止コドンは欠けていた）部分的ｃＤＮＡクローンである
ことを示した。ＣＨＮ９をデータベース（ｎｒ）に対してＢＬＡＳＴ検索する(b
last)のに使用した場合、ＣＨＮ９の３’の配列はロイコトリエンＢ４受容体の
ｃＤＮＡの５’非翻訳領域（ＣＨＮ９のコーディング配列と同じ読み枠に終止コ
ドンを含有した）に１００％相同であった。ＬＴＢ４ＲのｃＤＮＡの５’非翻訳
領域がＣＨＮ９の３’配列であったかどうかを決定するために、ＣＨＮ９に見出
される開始コドンに隣接する５’配列およびＬＴＢ４Ｒの５’非翻訳領域に見出
される終止コドンを取り巻く３’配列に基づくプライマーを使用してＰＣＲを実
施した。利用された５’プライマー配列は以下のとおりであった：
５’−ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＣＣＣＡＧＣＴＴＧＧＣＣＣ−３
’（配列番号４３；センス）および
５’−ＴＧＴＧＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＴＣＡＡＡＧＧＴＣＣＣＡＴＴＣＣＧＧ−
３’（配列番号４４；アンチセンス）
製造元により供給される緩衝液系、０．２５μＭの各プライマーおよび０．２ｍ
Ｍの各４種のヌクレオチドとともに鋳型としての胸腺ｃＤＮＡおよびｒＴｔｈポ
リメラーゼ（パーキン エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））を使用してＰ
ＣＲを実施した。周期条件は、９４℃１分間、６５℃１分間ならびに７２℃１分
および１０秒間の３０周期であった。予測された大きさと一致する１．１ｋｂの
フラグメントをＰＣＲから得た。本ＰＣＲフラグメントをｐＣＭＶにサブクロー
ニングし（下を参照されたい）そして配列決定した（配列番号３５を参照された
い）。
ｃ．ＲＵＰ４
鋳型としてヒト脳ｃＤＮＡ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を用いるＲ
Ｔ−ＰＣＲにより完全長のＲＵＰ４をクローン化した：
５’−ＴＣＡＣＡＡＴＧＣＴＡＧＧＴＧＴＧＧＴＣ−３’（配列番号４５；セン
ス）および
５’−ＴＧＣＡＴＡＧＡＣＡＡＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＧ−３’（配列番号４６；
アンチセンス）。
以下の周期、すなわち９４℃２分間；９４℃３０秒間；５５℃３０秒間、７２℃
４５秒間および７２℃１０分間により、タックプラス プレシジョン［ＴａｑＰ
ｌａｓ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ］（商標）ポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ）；製造説明書が従われた）を使用してＰＣＲを実施した。周期
２から４を３０回反復した。
【００５３】
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで分離し、そして５００ｂｐのＰＣＲフラグ
メントを単離しかつｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（商標）ベクター（インヴィトロジェ
ン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化し、そしてＴ７ ＤＮＡシークェナ
ーゼ［Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ］（商標）キット（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ
））およびＳＰ６／Ｔ７プライマー（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
）を使用して配列決定した。ＰＣＲフラグメントから示される配列分析は、実際
に、他のＧＰＣＲとの類似性をもつ１個の連続的読取り枠を有する、代替スプラ
イシングされた形態のＡＩ３０７６５８であった。このＰＣＲフラグメントの完
了された配列は以下のとおりであった：
【００５４】
【表５】
【００５５】
上の配列に基づき、２種のセンスオリゴヌクレオチドプライマーの組：
５’−ＣＴＧＣＴＴＡＧＡＡＧＡＧＴＧＧＡＣＣＡＧ−３’（配列番号４８；オ
リゴ１）、
５’−ＣＴＧＴＧＣＡＣＣＡＧＡＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ−３’（配列番号４９；
オリゴ２）および
２種のアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーの組：
５’−ＣＡＡＧＧＡＴＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＴＡＧＡ−３’（配列番号５０；オ
リゴ３）
５’−ＧＴＧＴＡＧＡＴＣＴＴＣＴＧＧＴＧＣＡＣＡＧＧ−３’（配列番号５１
；オリゴ４）
を、製造元の説明書に従って鋳型としてヒト脳マラソン−レディ［Ｍａｒａｔｈ
ｏｎ−Ｒｅａｄｙ］（商標）ｃＤＮＡ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、カ
タログ番号７４００−１）を用いる３’−および５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲに使用
した。ＲＡＣＥ ＰＣＲにより生成されたＤＮＡフラグメントをｐＣＲＩＩ−Ｔ
ＯＰＯ（商標）ベクター（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にク
ローン化し、そしてＳＰ６／Ｔ７プライマー（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ））および数種の内的プライマーを使用して配列決定した。３’ＲＡＣＥ
産物はポリ（Ａ）テール(tail)およびＴＡＡ終止コドンで終了する１個の完了さ
れる読取り枠を含有した。５’ＲＡＣＥ産物は不完全な５’末端を含有した（す
なわちＡＴＧ開始コドンが存在しなかった）。
【００５６】
新たな５’配列に基づき、オリゴ３および以下のプライマー：
５’−ＧＣＡＡＴＧＣＡＧＧＴＣＡＴＡＧＴＧＡＧＣ−３’（配列番号５２；オ
リゴ５）
を第２回の５’ｒａｃｅ ＰＣＲに使用し、そしてＰＣＲ産物を上のとおり分析
した。第３回の５’ｒａｃｅ ＰＣＲは、アンチセンスプライマー：
５’−ＴＧＧＡＧＣＡＴＧＧＴＧＡＣＧＧＧＡＡＴＧＣＡＧＡＡＧ−３’（配列
番号５３；オリゴ６）および
５’−ＧＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＧＴＣＡＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＡＧ−３’（配列
番号５４；オリゴ７）
を利用して実施した。５’ＲＡＣＥ ＰＣＲの産物の配列は開始コドンＡＴＧの
存在を示し、また、さらなる回の５’ｒａｃｅ ＰＣＲはいかなるそれ以上の５
’配列も生成しなかった。プライマーとして、センスプライマー
５’−ＧＣＡＡＴＧＣＡＧＧＣＧＣＴＴＡＡＣＡＴＴＡＣ−３’（配列番号５５
；オリゴ８）
およびオリゴ４を使用するＲＴ−ＰＣＲ、ならびにヒト脳および心のｃＤＮＡ鋳
型（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、カタログ番号７４０４−１）から生成
された６５０ｂｐのＰＣＲ産物の配列分析により、完了された５’配列を確認し
た。オリゴ２および以下のアンチセンスプライマー：
５’−ＴＴＧＧＧＴＴＡＣＡＡＴＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡ−３’（配列番号５６；
オリゴ９）
を使用するＲＴ−ＰＣＲ、ならびにヒト脳および心のｃＤＮＡ鋳型（クロンテッ
ク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、カタログ番号７４０４−１）から生成された６７０ｂ
ｐのＰＣＲ産物の配列分析により、完了された３’配列を確認した。
ｄ．ＲＵＰ５
以下の配列：
５’−ＡＣＴＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣＡＧＧＡＣＴＣＴＧ−３’（配列番号５７
）
５’−ＴＧＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＧＡＣＣＣＴＣＡＣＧＴＧ−３’（配列番号５
８）
を有した、ＡＴＧ開始コドンから上流のセンスプライマー（配列番号５７）、お
よび終止コドンとしてＴＣＡを含有するアンチセンスプライマー（配列番号５８
）、ならびに鋳型としてヒト末梢白血球ｃＤＮＡ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅ
ｃｈ））を使用するＲＴ−ＰＣＲにより完全長のＲＵＰ５をクローン化した。段
階２から段階４が３０回反復された以下の周期、すなわち９４℃３０秒間；９４
℃１５秒間；６９℃４０秒間；７２℃３分間；および７２℃６分間による５０μ
ｌの反応中での増幅にアドバンテージ［Ａｄｖａｎｔａｇｅ］（商標）ｃＤＮＡ
ポリメラーゼ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用した。１．４ｋｂの
ＰＣＲフラグメントを単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（商標）ベクター（
インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いてクローン化し、そして
Ｔ７ ＤＮＡシークェナーゼ［Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ］（商標）キット（アマーシ
ャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を使用して完全に配列決定した。配列番号９を参照
されたい。
ｅ．ＲＵＰ６
プライマー：
５’−ＣＡＧＧＣＣＴＴＧＧＡＴＴＴＴＡＡＴＧＴＣＡＧＧＧＡＴＧＧ−３’（
配列番号５９）および
５’−ＧＧＡＧＡＧＴＣＡＧＣＴＣＴＧＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＧＧ−３’（配列
番号６０）
ならびに鋳型としてヒト胸腺マラソン−レディ［Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ
］（商標）ｃＤＮＡ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用するＲＴ−Ｐ
ＣＲにより完全長のＲＵＰ６をクローン化した。以下の周期、すなわち９４℃３
０秒間；９４℃５秒間；６６℃４０秒間；７２℃２．５秒間および７２℃７分間
による５０μｌ反応中での増幅にアドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）ｃＤＮ
Ａポリメラーゼ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、製造元の説明書に従う）
を使用した。周期２から４を３０回反復した。１．３ｋｂのＰＣＲフラグメント
を単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ［商標］ベクター（インヴィトロジェン
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化し、そしてＡＢＩ ビッグ ダイ タ
ーミネーター［Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ］（商標）キット（Ｐ．
Ｅ．バイオシステム（Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ））を使用して完全に配列決
定した（配列番号１１を参照されたい）。
ｆ．ＲＵＰ７
プライマー：
５’−ＴＧＡＴＧＴＧＡＴＧＣＣＡＧＡＴＡＣＴＡＡＴＡＧＣＡＣ−３’（配列
番号６１；センス）および
５’−ＣＣＴＧＡＴＴＣＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＧＡＴＴＧＡＧＡＣ−３’（配列
番号６２；アンチセンス）
ならびに鋳型としてヒト末梢白血球ｃＤＮＡ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
））を使用するＲＴ−ＰＣＲにより完全長のＲＵＰ７をクローン化した。段階２
ないし段階４が３０回反復された以下の周期、すなわち９４℃２分間；９４℃１
５秒間；６０℃２０秒間；７２℃２分間；７２℃１０分間による５０μｌ反応中
での増幅にアドバンテージ［Ａｄｖａｎｔａｇｅ］（商標）ｃＤＮＡポリメラー
ゼ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用した。１．２５ｋｂのＰＣＲフ
ラグメントを単離し、そしてｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（商標）ベクター（インヴィ
トロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローン化し、そしてＡＢＩ ビッグ
ダイ ターミネーター［Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ］（商標）キ
ット（Ｐ．Ｅ．バイオシステム（Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ））を使用して完
全に配列決定した。配列番号１３を参照されたい。
３．アンジオテンシンＩＩタイプ１受容体（「ＡＴ１」）
製造元により供給される緩衝液系、０．２５μＭの各プライマーおよび０．２
ｍＭの各４種のヌクレオチドとともに鋳型としてのゲノムＤＮＡおよびｒＴｔｈ
ポリメラーゼ（パーキン エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））を使用する
ＰＣＲにより、内在性のヒトアンジオテンシンＩＩタイプ１受容体（「ＡＴ１」
）を得た。周期条件は、９４℃１分間、５５℃１分間および７２℃１．５分間の
３０周期であった。５’ＰＣＲプライマーは、配列：
５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＣＡＧＧＴＧＴＡＴＴＴＧＡＴ−３’（配列番
号６３）
とともにＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有し、そして３’プライマーは以下の配列：
５’−ＧＴＴＧＧＡＴＣＣＡＣＡＴＡＡＴＧＣＡＴＴＴＴＣＴＣ−３’（配列番
号６４）
とともにＢａｍＨＩ部位を含有する。生じる１．３ｋｂのＰＣＲフラグメントを
ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そしてｐＣＭＶ発現ベクターのＨｉ
ｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローン化した。ｃＤＮＡクローンを完全に配列
決定した。その後、ヒトＡＴ１の核酸（配列番号６５）およびアミノ酸（配列番
号６６）の配列を決定しかつ確かめた。
４．ＧＰＲ３８
ＧＰＲ３８を得るため、製造元により供給される緩衝液系、０．２５μＭの各
プライマーおよび０．２ｍＭの各４種のヌクレオチドとともに鋳型としてのヒト
ゲノムｃＤＮＡおよびｒＴｔｈポリメラーゼ（パーキン エルマー（Ｐｅｒｋｉ
ｎ Ｅｌｍｅｒ））を使用して、２種のＰＣＲフラグメントを組み合わせること
によりＰＣＲを実施した。各ＰＣＲ反応の周期条件は９４℃１分間、６２℃１分
間および７２℃２分間の３０周期であった。
【００５７】
第一のフラグメントは、以下の配列：
５’−ＡＣＣＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＴＧＧＡＡＣＧＧＣＡＧＣ−３’（配列
番号６７）
を伴う端部位を含有した５’ＰＣＲプライマー、および以下の配列：
５’−ＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＧＧＡＣＧＣＧＧＡＣＧＧＴＣＴＧＣ
ＣＧＧＴＧＧ−３’（配列番号６８）
を有する３’プライマーを用いて増幅した。第二のＰＣＲフラグメントは、以下
の配列：
５’−ＧＴＣＣＧＣＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＡＴＴＴ
ＡＴＡＡＴＴ−３’（配列番号６９）
を有する５’プライマー、ならびにＢａｍＨＩ部位を含有しかつ以下の配列：
５’−ＣＣＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＣＣＡＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＧＴＴＡＧＣ
−３’（配列番号７０）
を有する３’プライマーを用いて増幅した。配列番号６７および配列番号７０を
プライマーとして使用して（上に示された周期条件を使用する）、２種のフラグ
メントを鋳型として使用してＧＰＲ３８を増幅した。生じる１．４４ｋｂのＰＣ
ＲフラグメントをＢａｍＨＩで消化し、そしてｐＣＭＶ発現ベクターの平滑Ｂａ
ｍＨＩ部位にクローン化した。
５．ＭＣ４
ＭＣ４を得るため、製造元により供給される緩衝液系、０．２５μＭの各プラ
イマーおよび０．２ｍＭの各４種のヌクレオチドとともに鋳型としてのヒトゲノ
ムｃＤＮＡおよびｒＴｔｈポリメラーゼ（パーキン エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ））を使用してＰＣＲを実施した。各ＰＣＲ反応の周期条件は９４℃
１分間、５４℃１分間および７２℃１．５分間の３０周期であった。
【００５８】
５’ＰＣＲは配列：
５’−ＣＴＧＧＡＡＴＴＣＴＣＣＴＧＣＣＡＧＣＡＴＧＧＴＧＡ−３’（配列番
号７１）
とともにＥｃｏＲＩ部位を含有し、そして３’プライマーは配列：
５’−ＧＣＡＧＧＡＴＣＣＴＡＴＡＴＴＧＣＧＴＧＣＴＣＴＧＴＣＣＣＣ−３’
（配列番号７２）
とともにＢａｍＨＩ部位を含有した。１．０ｋｂのＰＣＲフラグメントをＥｃｏ
ＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そしてｐＣＭＶ発現ベクターのＥｃｏＲＩ−Ｂ
ａｍＨＩ部位にクローン化した。その後、ヒトＭＣ４の核酸（配列番号７３）お
よびアミノ酸（配列番号７４）の配列を決定した。
６．ＣＣＫＢ
ＣＣＫＢを得るため、製造元により供給される緩衝液系、０．２５μＭの各プ
ライマーおよび０．２ｍＭの各４種のヌクレオチドとともに鋳型としてのヒト胃
ｃＤＮＡおよびｒＴｔｈポリメラーゼ（パーキン エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅ
ｌｍｅｒ））を使用してＰＣＲを実施した。各ＰＣＲ反応の周期条件は９４℃１
分間、６５℃１分間ならびに７２℃１分および３０秒間の３０周期であった。
【００５９】
５’ＰＣＲは配列：
５’−ＣＣＧＡＡＧＣＴＴＣＧＡＧＣＴＧＡＧＴＡＡＧＧＣＧＧＣＧＧＧＣＴ−
３’（配列番号７５）
とともにＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有し、また、３’プライマーは配列：
５’−ＧＴＧＧＡＡＴＴＣＡＴＴＴＧＣＣＣＴＧＣＣＴＣＡＡＣＣＣＣＣＡ−３
’（配列番号７６）
とともにＥｃｏＲＩ部位を含有した。生じる１．４４ｋｂのＰＣＲフラグメント
をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そしてｐＣＭＶ発現ベクターのＨ
ｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。その後、ヒトＣＣＫＢの核酸
（配列番号７７）およびアミノ酸（配列番号７８）の配列を決定した。
７．ＴＤＡＧ８
ＴＤＡＧ８を得るため、製造元により供給される緩衝液系、０．２５μＭの各
プライマーおよび０．２ｍＭの各４種のヌクレオチドとともに鋳型としてのゲノ
ムＤＮＡおよびｒＴｔｈポリメラーゼ（パーキン エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅ
ｌｍｅｒ））を使用してＰＣＲを実施した。周期条件は９４℃１分間、５６℃１
分間ならびに７２℃１分および２０秒間の３０周期であった。５’ＰＣＲプライ
マーは以下の配列：
５’−ＴＧＣＡＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣ−３’
（配列番号７９）
とともにＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有し、また、３’プライマーは以下の配列：
５’−ＴＡＡＧＧＡＴＣＣＣＴＴＣＣＣＴＴＣＡＡＡＡＣＡＴＣＣＴＴＧ−３’
（配列番号８０）
とともにＢａｍＨＩ部位を含有した。生じる１．１ｋｂのＰＣＲフラグメントを
ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そしてｐＣＭＶ発現ベクターのＨｉ
ｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローン化した。配列決定された３種の生じるク
ローンは、ＰｒｏからＡｌａへのアミノ酸４３、ＬｙｓからＡｓｎへのアミノ酸
９７、およびＩｌｅからＰｈｅへのアミノ酸１３０の変化を伴う３種の潜在的多
形を含有した。その後、ヒトＴＤＡＧ８の核酸（配列番号８１）およびアミノ酸
（配列番号８２）の配列を決定した。
８．Ｈ９
Ｈ９を得るため、製造元により供給される緩衝液系、０．２５μＭの各プライ
マーおよび０．２ｍＭの各４種のヌクレオチドとともに鋳型としての下垂体ｃＤ
ＮＡおよびｒＴｔｈポリメラーゼ（パーキン エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍ
ｅｒ））を使用してＰＣＲを実施した。周期条件は９４℃１分間、６２℃１分間
および７２℃２分間の３０周期であった。５’ＰＣＲプライマーは以下の配列：
５’−ＧＧＡＡＡＧＣＴＴＡＡＣＧＡＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＣＡＡＣＡＴ−３’
（配列番号１５）
とともにＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有し、また、３’プライマーは以下の配列：
５’−ＣＴＧＧＧＡＴＣＣＴＡＣＧＡＧＡＧＣＡＴＴＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧ−３
’（配列番号１６）
とともにＢａｍＨＩ部位を含有した。生じる１．９ｋｂのＰＣＲフラグメントを
ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そしてｐＣＭＶ発現ベクターのＨｉ
ｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローン化した。Ｈ９は、アミノ酸Ｐ３２０Ｓ、
Ｓ４９３Ｎおよびアミノ酸Ｇ４４８Ａの変化を伴う３種の潜在的多形を含有した
。その後、ヒトＨ９の核酸（配列番号１３９）およびアミノ酸（配列番号１４０
）の配列を決定しかつ確かめた。
実施例２
非内在性の構成的に活性化されるＧＰＣＲの調製
当業者は、核酸配列の突然変異のための技術を選択する能力があると信じられ
る。上に開示された非内在性の変種数種のヒトＧＰＣＲを創製するのに利用され
たアプローチを下に提示する。下に開示される突然変異はアルゴリズムのアプロ
ーチに基づき、それにより（ＴＭ６／ＩＣ３の界面近くのＧＰＣＲのＴＭ６領域
に配置される）保存されるプロリン残基からの（ＧＰＣＲのＩＣ３領域に配置さ
れる）１６番目のアミノ酸が、最も好ましくはリシンアミノ酸残基に突然変異さ
れる。
１．トランスフォーマー部位特異的［Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｓｉｔｅ−Ｄｉ
ｒｅｃｔｅｄ］（商標）突然変異誘発
非内在性のヒトＧＰＣＲの調製は、製造元の説明書に従い、トランスフォーマ
ー部位特異的［Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ］（商標
）突然変異誘発キット（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用してヒトＧ
ＰＣＲで達成することができる。２種の突然変異誘発プライマー、最も好ましく
はリシン突然変異を創製するリシン突然変異誘発オリゴヌクレオチド、および選
択マーカーオリゴヌクレオチドを利用する。便宜上、ヒトＧＰＣＲに組み込まれ
るべきコドン突然変異を標準的形態でもまた示す（表Ｅ）：
【００６０】
【表６】
【００６１】
指定される配列プライマーを使用して、上の方法に従い、以下のＧＰＣＲを突
然変異した（表Ｆ）。
【００６２】
【表７】
【００６３】
その後、非内在性のヒトＧＰＣＲを配列決定し、また、形成されかつ確かめら
れた核酸およびアミノ酸の配列を、下に表Ｇに要約されるとおり、本特許明細書
への付随する「配列表」付録に列挙する：
【００６４】
【表８】
【００６５】
２．非内在性ヒトＧＰＣＲの創製のための代替アプローチ
ａ．ＡＴ１
１．Ｆ２３９Ｋ突然変異
Ｆ２３９突然変異（核酸配列について配列番号８９、およびアミノ酸配列につ
いて配列番号９０を参照されたい）を創製することにより、非内在性の構成的に
活性化されるヒトＡＴ１受容体の調製を達成した。突然変異誘発は、製造元の説
明書に従い、トランスフォーマー部位特異的突然変異誘発［Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ
ｅｒ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ］（商標）キット
（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用して実施した。２種の突然変異誘
発プライマー、リシン突然変異誘発オリゴヌクレオチド（配列番号９１）および
選択マーカーオリゴヌクレオチド（配列番号９２）を使用した。これらはそれぞ
れ以下の配列を有した：
５’−ＣＣＡＡＧＡＡＡＴＧＡＴＧＡＴＡＴＴＡＡＡＡＡＧＡＴＡＡＴＴＡＴＧ
ＧＣ−３’（配列番号９１）
５’−ＣＴＣＣＴＴＣＧＧＴＣＣＴＣＣＴＡＴＣＧＴＴＧＴＣＡＧＡＡＧＴ−３
’（配列番号９２）
２．Ｎ１１１Ａ突然変異
非内在性のヒトＡＴ１受容体の調製もまた、Ｎ１１１Ａ突然変異（核酸配列に
ついて配列番号９３、およびアミノ酸配列について配列番号９４を参照されたい
）を創製することにより達成した。１０％ＤＭＳＯ、０．２５μＭの各プライマ
ー、および０．５ｍＭの各４種のヌクレオチドを補充された、製造元により提供
される緩衝液系を用いてｐｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ））を使用して、２回のＰＣＲ反応を実施した。使用された５’ＰＣＲの
センスプライマーは以下の配列：
５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＣＡＧＧＴＧＴＡＴＴＴＧＡＴ−３’（配列番
号９５）
を有し、また、アンチセンスプライマーは以下の配列：
５’−ＣＣＴＧＣＡＧＧＣＧＡＡＡＣＴＧＡＣＴＣＴＧＧＣＴＧＡＡＧ−３’（
配列番号９６）
を有した。生じる４００ｂｐのＰＣＲフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩ部位で消化
し、そしてｐＣＭＶベクターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩ部位にサブクローニン
グした（５’構築物）。使用された３’ＰＣＲのセンスプライマーは以下の配列
：
５’−ＣＴＧＴＡＣＧＣＴＡＧＴＧＴＧＴＴＴＣＴＡＣＴＣＡＣＧＴＧＴＣＴＣ
ＡＧＣＡＴＴＧＡＴ−３’（配列番号９７）
を有し、また、アンチセンスプライマーは以下の配列：
５’−ＧＴＴＧＧＡＴＣＣＡＣＡＴＡＡＴＧＣＡＴＴＴＴＣＴＣ−３’（配列番
号９８）
を有した。生じる８８０ｂｐのＰＣＲフラグメントをＢａｍＨＩで消化し、そし
て５’構築物のＰｓｔ（Ｔ４ポリメラーゼにより平滑化された）およびＢａｍＨ
Ｉ部位に挿入して完全長のＮ１１１Ａ構築物を生成した。周期条件は、９４℃１
分間、６０℃１分間および７２℃１分間（５’ＰＣＲ）もしくは１．５分間（３
’ＰＣＲ）の２５周期であった。
３．ＡＴ２Ｋ２５５ＩＣ３突然変異
ＡＴ２Ｋ２５５ＩＣ３の「ドメインスワップ(domain swap)」突然変異（核酸
配列について配列番号９９を、およびアミノ酸配列について配列番号１００を参
照されたい）を創製することにより、非内在性の構成的に活性化されるヒトＡＴ
１の調製を達成した。ＡＴ１のＩＣ３に隣接する制限部位を生成させて、アンジ
オテンシンＩＩタイプ２受容体（ＡＴ２）からの対応するＩＣ３でのＩＣ３の置
き換えを助長した。これは２回のＰＣＲ反応を実施することにより達成した。セ
ンスプライマーとして配列番号６３を、およびアンチセンスプライマーとして以
下の配列：
５’−ＴＣＣＧＡＡＴＴＣＣＡＡＡＡＴＡＡＣＴＴＧＴＡＡＧＡＡＴＧＡＴＣＡ
ＧＡＡＡ−３’（配列番号１０１）
を利用することにより、５’非翻訳領域からＩＣ３の開始までをコードする５’
ＰＣＲフラグメント（フラグメントＡ）を生成させた。センスプライマーとして
以下の配列：
５’−ＡＧＡＴＣＴＴＡＡＧＡＡＧＡＴＡＡＴＴＡＴＧＧＣＡＡＴＴＧＴＧＣＴ
−３’（配列番号１０２）
およびアンチセンスプライマーとして配列番号６４を使用することにより、ＩＣ
３の終了から３’非翻訳領域までをコードする３’ＰＣＲフラグメント（フラグ
メントＢ）を生成させた。ＰＣＲ条件は、１０％ＤＭＳＯ、０．２５μＭの各プ
ライマーおよび０．５ｍＭの各４種のヌクレオチドを補充された、製造元により
供給される緩衝液系を用いて、鋳型としての内在性のＡＴ１ ｃＤＮＡクローン
およびｐｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用
して、９４℃１分間、５５℃１分間および７２℃１．５分間の３０周期であった
。フラグメントＡ（７２０ｂｐ）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化しそ
してサブクローニングした。フラグメントＢはＢａｍＨＩで消化し、そしてクロ
ーン化されたＰＣＲフラグメントの５’にＥｃｏＲＩ部位をもつｐＣＭＶベクタ
ーにサブクローニングした。
【００６６】
以下の配列：
５’ＡＡＴＴＣＧＡＡＡＡＣＡＣＴＴＡＣＴＧＡＡＧＡＣＧＡＡＴＡＧＣＴＡＴ
ＧＧＧＡＡＧＡＡＣＡＧＧＡＴＡＡＣＣＣＧＴＧＡＣＣＡＡＧ−３’（センス；
配列番号１０３）
５’ＴＴＡＡＣＴＴＧＧＴＣＡＣＧＧＧＴＴＡＴＣＣＴＧＴＴＣＴＴＣＣＣＡＴ
ＡＧＣＴＡＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＧＴＡＡＧＴＧＴＴＴＴＣＧ−３’（アンチセ
ンス；配列番号１０４）
を有する２種の合成オリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより、Ｌ２５
５Ｋ突然変異を伴いＡＴ２のＩＣ３をコードしそして５’にＥｃｏＲＩ付着端お
よび３’にＡｆＩＩＩ付着端を含有するＤＮＡフラグメント（フラグメントＣ）
を生成させた。
【００６７】
フラグメントＣを、ＥｃｏＲＩおよびＡｆＩＩＩ部位によりフラグメントＢの
前に挿入した。その後、生じるクローンをＥｃｏＲＩ部位によりフラグメントＡ
と連結して、ＡＴ２Ｋ２５５ＩＣ３をもつＡＴ１を生成させた。
４．Ａ２４３＋突然変異
Ａ２４３＋突然変異（核酸配列について配列番号１０５、およびアミノ酸配列
について配列番号１０６を参照されたい）を創製することにより、非内在性のヒ
トＡＴ１受容体の調製もまた達成した。Ａ２４３＋突然変異は以下のＰＣＲに基
づく戦略を使用して構築した。すなわち、１０％ＤＭＳＯ、０．２５μＭの各プ
ライマーおよび０．５ｍＭの各４種のヌクレオチドを補充された、製造元により
提供される緩衝液系とともにｐｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ））を使用して２回のＰＣＲ反応を実施した。利用された５’ＰＣＲ
のセンスプライマーは以下の配列：
５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＣＡＧＧＴＧＴＡＴＴＴＧＡＴ−３’（配列番
号１０７）
を有し、また、アンチセンスプライマーは以下の配列：
５’−ＡＡＧＣＡＣＡＡＴＴＧＣＴＧＣＡＴＡＡＴＴＡＴＣＴＴＡＡＡＡＡＴＡ
ＴＣＡＴＣ−３’（配列番号１０８）
を有した。利用された３’ＰＣＲのセンスプライマーは、Ａｌａ挿入を含有する
以下の配列：
５’−ＡＡＧＡＴＡＡＴＴＡＴＧＧＣＡＧＣＡＡＴＴＧＴＧＣＴＴＴＴＣＴＴＴ
ＴＴＣＴＴＴ−３’（配列番号１０９）
そしてアンチセンスプライマー：
５’−ＧＴＴＧＧＡＴＣＣＡＣＡＴＡＡＴＧＣＡＴＴＴＴＣＴＣ−３’（配列番
号１１０）
を有した。周期条件は、９４℃１分間、５４℃１分間および７２℃１．５分間の
２５周期であった。その後、５’および３’のＰＣＲのアリコートを共鋳型(co-
template)として使用して、５’ＰＣＲのセンスプライマーおよび３’ＰＣＲの
アンチセンスプライマーを使用する二次的ＰＣＲを実施した。ＰＣＲ条件は、伸
長時間が２．５分であったことを除き一次ＰＣＲと同一であった。生じるＰＣＲ
フラグメントをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そしてｐＣＭＶベク
ターにサブクローニングした（配列番号１０５を参照されたい）。
４．ＣＣＫＢ
Ｖ３２２Ｋ突然変異（核酸配列について配列番号１１１、およびアミノ酸配列
について配列番号１１２を参照されたい）を創製することにより、非内在性の構
成的に活性化されるヒトＣＣＫＢ受容体の調製を達成した。突然変異誘発は、実
施例１からの野性型ＣＣＫＢを使用する増幅を介してＰＣＲにより実施した。
【００６８】
配列番号７５、およびＶ３２２Ｋ突然変異を含んで成るアンチセンスプライマ
ー：
５’−ＣＡＧＣＡＧＣＡＴＧＣＧＣＴＴＣＡＣＧＣＧＣＴＴＣＴＴＡＧＣＣＣＡ
Ｇ−３’（配列番号１１３）
を使用することにより第一のＰＣＲフラグメント（１ｋｂ）を増幅した。Ｖ３２
２Ｋ突然変異を含んで成るセンスプライマー：
５’−ＡＧＡＡＧＣＧＣＧＴＧＡＡＧＣＧＣＡＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＡＴＣＧ
ＴＴ−３’（配列番号１１４）および配列番号７６を使用することにより第二の
ＰＣＲフラグメント（０．４４ｋｂ）を増幅した。その後、配列番号７５および
配列番号７６、ならびに上で示された系および条件を使用して、Ｖ３３２Ｋを含
んで成るＣＣＫＢを増幅するための鋳型として２種の生じるＰＣＲフラグメント
を使用した。Ｖ３３２Ｋ突然変異を含有する生じる１．４４ｋｂのＰＣＲフラグ
メントをＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そしてｐＣＭＶ発現ベクタ
ーのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位にクローン化した（配列番号１１１を参照
されたい）。
３．クイックチェンジ［ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ］（商標）部位特異的［Ｓｉｔｅ
−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ］（商標）突然変異誘発
クイックチェンジ［ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ］（商標）部位特異的［Ｓｉｔｅ−
Ｄｉｒｅｃｔｅｄ］（商標）突然変異誘発キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ）、製造元の説明書に従う）を使用することにより、非内在性のヒト
ＧＰＣＲの調製もまた達成することができる。内在性ＧＰＣＲを鋳型として好ま
しく使用し、また、２種の突然変異誘発プライマー、ならびに最も好ましくはリ
シン突然変異誘発オリゴヌクレオチドおよび選択マーカーオリゴヌクレオチド（
キットに包含される）を利用する。便宜上、ヒトＧＰＣＲに組み込まれたコドン
の突然変異およびそれぞれのオリゴヌクレオチドを標準的形態で示す（表Ｈ）：
【００６９】
【表９】
【００７０】
実施例３
受容体の発現
タンパク質の発現のために多様な細胞が当該技術に使用可能であるが、哺乳動
物細胞を利用することが最も好ましい。これの主要な理由は実地的なことに基づ
く。すなわち、例えばＧＰＣＲの発現のための酵母細胞の利用が可能な一方で、
受容体共役型の遺伝子的機構を包含しなくてもよい（事実、酵母の場合は包含し
ない）非哺乳動物細胞および哺乳動物の系について発展した分泌経路をプロトコ
ルに導入し、従って、非哺乳動物細胞で得られる結果は、潜在的に有用な一方で
哺乳動物細胞から得られるものと同じくらい好ましくはない。哺乳動物細胞のう
ち、ＣＯＳ−７、２９３および２９３Ｔ細胞がとりわけ好ましいが、利用される
特定の哺乳動物細胞は当業者の特定のニーズに基づくことが可能である。
【００７１】
第１日に、１５０ｍｍプレートあたり１×１０7個の２９３Ｔ細胞をプレート
培養した。第２日に２本の反応チューブを準備した（各チューブについて後に続
く比率はプレート１枚あたりである）。すなわち、チューブＡは、１．２ｍｌの
血清を含まないＤＭＥＭ（アーヴィン サイエンティフィック（Ｉｒｖｉｎｅ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、カリフォルニア州アーヴィン）中に２０μｇのＤＮＡ
（例えばｐＣＭＶベクター；受容体ｃＤＮＡを含むｐＣＭＶベクター、など）を
混合することにより準備し；チューブＢは１．２ｍｌの血清を含まないＤＭＥＭ
中に１２０μｌのリポフェクタミン（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）を混合する
ことにより準備した。チューブＡおよびＢは反転（数回）により混合し、次いで
室温で３０〜４５分間インキュベートした。混合状態を「トランスフェクション
混合物」と称する。プレート培養された２９３Ｔ細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、次
いで１０ｍｌの血清を含まないＤＭＥＭを添加した。細胞に２．４ｍｌのトラン
スフェクション混合物を添加し、次いで３７℃／５％ＣＯ2で４時間インキュベ
ートした。トランスフェクション混合物を吸引により除去し、次いで２５ｍｌの
ＤＭＥＭ／１０％ウシ胎児血清を添加した。細胞を３７℃／５％ＣＯ2でインキ
ュベートした。７２時間のインキュベーション後に細胞を収穫し、そして分析に
利用した。
実施例４
非内在性ＧＰＣＲの構成的活性の測定のためのアッセイ
非内在性のヒトＧＰＣＲの構成的活性の評価には多様なアプローチが利用可能
である。以下は具体的説明であり；当業者は、当業者のニーズに優先的に利益を
もたらす技術を決定する能力があると信じられる。
１．膜結合アッセイ：［35Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイ
Ｇタンパク質共役型受容体がリガンド結合もしくは構成的活性化のいずれかの
結果としてその活性状態にある場合、受容体はＧタンパク質に共役しそしてＧＤ
Ｐの放出およびＧＴＰのＧタンパク質へのその後の結合を刺激する。Ｇタンパク
質−受容体複合体のαサブユニットがＧＴＰアーゼとして作用し、そしてＧＴＰ
をＧＤＰにゆっくりと加水分解し、この点で受容体が通常非活性化される。構成
的に活性化された受容体はＧＤＰをＧＴＰと交換し続ける。構成的に活性化され
る受容体を発現する膜への［35Ｓ］ＧＴＰγＳの高められた結合を立証するのに
、加水分解不可能なＧＴＰ類似物［35Ｓ］ＧＴＰγＳを利用することができる。
構成的活性化を測定するための［35Ｓ］ＧＴＰγＳ結合の使用の利点は：（ａ）
それが全部のＧタンパク質共役型受容体に包括的に応用可能である；（ｂ）それ
は膜表面の近接であり、細胞内カスケードに影響を及ぼす分子を拾い上げること
をより少なくありそうにすることである。
【００７２】
該アッセイは、直接的に関連する受容体を発現する膜への［35Ｓ］ＧＴＰγＳ
の結合を刺激するＧタンパク質共役型受容体の能力を利用する。従って、該アッ
セイは、既知の、オーファンのおよび構成的に活性化されるＧタンパク質共役型
受容体に対する候補化合物をスクリーニングするための直接同定法で使用するこ
とができる。該アッセイは包括的であり、また、全部のＧタンパク質共役型受容
体での薬物発見に対する応用性を有する。
【００７３】
［35Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイは、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および１ｍＭと約２
０ｍＭとの間のＭｇＣｌ2（この量は結果の至適化のため調節することができる
が、２０ｍＭが好ましい）ｐＨ７．４、約０．３ｎＭと約１．２ｎＭとの間の［
35Ｓ］ＧＴＰγＳ（この量は結果の至適化のため調節することができるが、１．
２が好ましい）および１２．５ないし７５μｇの膜タンパク質（例えば受容体を
発現するＣＯＳ−７細胞；この量は至適化のため調節することができるが、７５
μｇが好ましい）および１μＭ ＧＤＰ（この量は至適化のため変更することが
できる）を含む結合緩衝液中で１時間インキュベートすることが可能である。そ
の後、コムギ胚芽アグルチニンビーズ（２５μｌ；アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ））を添加し、そして混合物を室温で別の３０分間インキュベートする。そ
の後、チューブを１５００×ｇで室温で５分間遠心分離し、そしてその後シンチ
レーション計数器で計数する。
【００７４】
より少なく高価なしかし同等に応用可能な代替物が同定されており、これはま
た大スケールのスクリーニングのニーズにも合致する。フラッシュプレート［Ｆ
ｌａｓｈ ｐｌａｔｅ］（商標）およびワラック［Ｗａｌｌａｃ］（商標）シン
チストリップを利用して、高スループットの［35Ｓ］ＧＴＰγＳ結合アッセイの
全体構成を定めることができる。さらに、この技術を使用すれば、［35Ｓ］ＧＴ
ＰγＳ結合を介して効力をモニターするのと同一時点で受容体へのトリチウム化
されたリガンドの結合を同時にモニターするために、該アッセイを既知のＧＰＣ
Ｒに利用することができる。トリチウム標識プローブおよび35Ｓ標識プローブの
双方を見るようにワラック（Ｗａｌｌａｃ）ベータ計数器がエネルギーウィンド
ウを切り替えることができるために、これが可能である。このアッセイはまた、
受容体の活性化をもたらす他の型の膜活性化事象を検出するのにも使用してよい
。例えば、該アッセイは多様な受容体（Ｇタンパク質共役型受容体およびチロシ
ンキナーゼ受容体の双方）の32Ｐホスホリル化をモニターするのに使用してよい
。膜がウェルの底部に遠心分離されている場合、結合された［35Ｓ］ＧＴＰγＳ
もしくは32Ｐ−ホスホリル化された受容体が、ウェルの被覆されているシンチラ
ントを活性化することができる。この原理を立証するのにシンチ［Ｓｃｉｎｔｉ
］（商標）ストリップ（ワラック（Ｗａｌｌａｃ））が使用されている。加えて
、該アッセイはまた、放射活性に標識されたリガンドを使用して受容体へのリガ
ンド結合を測定するための有用性も有する。類似の様式で、放射標識された結合
されたリガンドがウェルの底部に遠心分離されている場合、シンチストリップの
標識は放射標識されたリガンドに接近して活性化および検出をもたらす。
２．アデニリルシクラーゼ
細胞に基づくアッセイのため設計されたフラッシュプレート［Ｆｌａｓｈ Ｐ
ｌａｔｅ］（商標）アデニリルシクラーゼキット（ニュー イングランド ニュ
ークリア（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）；カタログ番号ＳＭＰ０
０４Ａ）を、粗原形質膜との使用のため改変することができる。フラッシュプレ
ート（Ｆｌａｓｈ Ｐｌａｔｅ）のウェルはシンチラントのコーティングを含有
し、このコーティングはｃＡＭＰを認識する特異的抗体もまた含有する。ｃＡＭ
Ｐ抗体への放射活性のｃＡＭＰトレーサーの結合についての直接の競争により、
ウェル中で生成されたｃＡＭＰを定量した。以下は、受容体を発現する膜中のｃ
ＡＭＰレベルの変化の測定のための簡潔なプロトコルとしてはたらく。
【００７５】
トランスフェクションされた細胞をトランスフェクションのおよそ３日後に収
穫する。２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４および１０ｍＭ ＭｇＣｌ2を含有
する緩衝液に懸濁された細胞の均質化により膜を調製した。均質化は、ブリンク
マン（Ｂｒｉｎｋｍａｎ）ポリトロン［Ｐｏｌｙｔｒｏｎ］（商標）を使用し氷
上でおよそ１０秒間実施する。生じるホモジェネートを４℃で４９，０００×ｇ
で１５分間遠心分離する。その後、生じるペレットを２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐ
Ｈ７．４および０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する緩衝液に再懸濁し、１０秒間均
質化し、次いで４９，０００×ｇで４℃で１５分間遠心分離する。生じるペレッ
トは利用されるまで−８０℃で保存することができる。測定の日に膜ペレットを
室温でゆっくりと融解させ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４および１０ｍＭ
ＭｇＣｌ2（これらの量は至適化することができるが、本明細書に列挙される
値が好ましい）を含有する緩衝液に再懸濁して０．６０ｍｇ／ｍｌの最終タンパ
ク質濃度を生じる（再懸濁された膜は使用まで氷上に置いた）。
【００７６】
ｃＡＭＰ標準および検出緩衝液（１１ｍｌの検出緩衝液に対し２μＣｉのトレ
ーサー［125Ｉ］ｃＡＭＰ（１００μｌ）を含んで成る）を調製し、そして製造
元の説明書に従って維持する。アッセイ緩衝液はスクリーニングのため新たに調
製し、そして２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、２０
ｍＭ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、０．１単位／ｍｌのクレアチンホスホキナーゼ
（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、５０μＭ ＧＴＰ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））および
０．２ｍＭ ＡＴＰ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を含有し；アッセイ緩衝液は利用
されるまで氷上で保存することができる。ＮＥＮ フラッシュプレート（Ｆｌａ
ｓｈ Ｐｌａｔｅ）への５０μｌのアッセイ緩衝液の添加、次いで５０μｌの膜
懸濁液の添加によりアッセイを開始する。結果として生じるアッセイ混合物を室
温で６０分間インキュベートし、次いで１００μｌの検出緩衝液を添加する。そ
の後、プレートを追加の２〜４時間インキュベートし、次いでワラック（Ｗａｌ
ｌａｃ）マイクロベータ［ＭｉｃｒｏＢｅｔａ］（商標）シンチレーション計数
器で計数する。各アッセイプレート内に含有される標準ｃＡＭＰ曲線からウェル
あたりのｃＡＭＰの値を外挿する。
Ｃ．レポーターに基づくアッセイ
１．ＣＲＥＢレポーターアッセイ（Ｇｓ会合型受容体）
Ｇｓ刺激を検出する方法はｃＡＭＰ依存性の様式で活性化される転写因子ＣＲ
ＥＢの既知の特性に依存する。２９３もしくは２９３Ｔ細胞中でのＧｓ共役型の
活性についてアッセイするのに、パスディテクト［ＰａｔｈＤｅｔｅｃｔ］（商
標）ＣＲＥＢトランスレポーティング（ＣＲＥＢ ｔｒａｎｓ−Ｒｅｐｏｒｔｉ
ｎｇ）系（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カタログ番号２１９０１
０）を利用することができる。細胞は、哺乳動物トランスフェクションキット（
ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カタログ番号２００２８５）を製造
元の説明書に従って使用して、この上の系のプラスミド成分、および内在性もし
くは突然変異体の受容体をコードする指定された発現プラスミドでトランスフェ
クションする。簡潔には、４００ｎｇのｐＦＲ−Ｌｕｃ（Ｇａｌ４認識配列を含
有するルシフェラーゼレポータープラスミド）、４０ｎｇのＦＡ２−ＣＲＥＢ（
Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメインを含有するＧａｌ４−ＣＲＥＢ融合タンパク質）
、８０ｎｇのｐＣＭＶ−受容体発現プラスミド（受容体を含んで成る）および２
０ｎｇのＣＭＶ−ＳＥＡＰ（分泌型アルカリホスファターゼ発現プラスミド；ト
ランスフェクションされた細胞の培地中でアルカリホスファターゼ活性を測定し
て、サンプル間のトランスフェクション効率の変動について制御する）を、キッ
トの説明書に従ってリン酸カルシウム沈殿中に組み合わせる。沈殿物の半分を９
６穴プレートの３個のウェルに同等に配分し、細胞上で一夜保ち、そして翌朝に
新鮮培地で置き換える。トランスフェクションの開始４８時間後に細胞を処理し
、そして例えばルシフェラーゼ活性についてアッセイする。
２．ＡＰ１レポーターアッセイ（Ｇｑ会合型受容体）
Ｇｑ刺激を検出する方法は、それらのプロモーター中にＡＰ１要素を含有する
遺伝子の活性化を引き起こすＧｑ依存性ホスホリパーゼＣの既知の特性に依存す
る。リン酸カルシウム沈殿物の成分が４１０ｎｇのｐＡＰ１−Ｌｕｃ、８０ｎｇ
のｐＣＭＶ−受容体発現プラスミドおよび２０ｎｇのＣＭＶ−ＳＥＡＰであった
ことを除いて、ＣＲＥＢレポーターアッセイに関して上に示されたプロトコルに
従い、パスディテクト［Ｐａｔｈｄｅｔｅｃｔ］（商標）ＡＰ−１シスレポーテ
ィング（ＡＰ−１ ｃｉｓ−Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ）系（ストラタジーン（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ）、カタログ番号２１９０７３）を利用することができる。
３．ＣＲＥ−Ｌｕｃレポーターアッセイ
２９３および２９３Ｔ細胞をウェルあたり細胞２×１０4個の密度で９６穴プ
レート上でプレート培養し、そして翌日、製造元の説明書に従ってリポフェクタ
ミン試薬（ＢＲＬ）を使用してトランスフェクションした。ＤＮＡ／脂質混合物
を以下のとおり各６個のウェルのトランスフェクションのため調製する。すなわ
ち、１００μｌのＤＭＥＭ中の２６０ｎｇのプラスミドＤＮＡを、１００μｌの
ＤＭＥＭ中２μｌの脂質と穏やかに混合した（２６０ｎｇのプラスミドＤＮＡは
、２００ｎｇの８ｘＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミド（プラスミドの一部分
の表示については下および図１を参照されたい）、５０ｎｇの内在性受容体もし
くは非内在性受容体を含んで成るｐＣＭＶまたはｐＣＭＶ単独、ならびに１０ｎ
ｇのＧＰＲＳ発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ）中のＧＰＲＳ）より成った）。８ＸＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラ
スミドは以下のとおり調製した。すなわち、ｐβｇａｌ−基本ベクター（Ｂａｓ
ｉｃ Ｖｅｃｔｏｒ）（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））のＢｇｌＶ−Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ部位にラットソマトスタチンプロモーター（−７１／＋５１）をクロ
ーン化することにより、ベクターＳＲＩＦ−β−ｇａｌを得た。アデノウイルス
鋳型ＡｄｐＣＦ１２６ＣＣＲＥ８（７ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
１８８３（１９９６）を参照されたい）からのＰＣＲにより、８コピーのｃＡ
ＭＰ応答要素を得、そしてＫｐｎ−ＢｇｌＶ部位でＳＲＩＦ−β−ｇａｌベクタ
ーにクローン化して８ｘＣＲＥ−β−ｇａｌレポーターベクターをもたらした。
８ｘＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミドは、８ｘＣＲＥ−β−ｇａｌレポータ
ーベクター中のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部
位でｐＧＬ３−基本ベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））から得られたルシ
フェラーゼ遺伝子で置き換えることにより生成した。室温で３０分のインキュベ
ーション後に、４００μｌのＤＭＥＭでＤＮＡ／脂質混合物を希釈し、そして１
００μｌの希釈された混合物を各ウェルに添加した。細胞培養インキュベーター
中での４時間のインキュベーション後に、１０％ＦＣＳを含む１００μｌのＤＭ
ＥＭを各ウェルに添加した。翌日、トランスフェクションされた細胞を、１０％
ＦＣＳを含むウェルあたり２００μｌのＤＭＥＭで変更した。８時間後、ＰＢＳ
での１回の洗浄後に、ウェルをウェルあたり１００μｌのフェノールレッドを含
まないＤＭＥＭに変更した。翌日、製造元の説明書に従って、ルックライト［Ｌ
ｕｃＬｉｔｅ］（商標）レポーター遺伝子アッセイキット（パッカード（Ｐａｃ
ｋａｒｄ））を使用してルシフェラーゼ活性を測定し、そして１４５０マイクロ
ベータ［ＭｉｃｒｏＢｅｔａ］（商標）シンチレーションおよび発光計数器（ワ
ラック（Ｗａｌｌａｃ））で読み取った。
４．ＳＲＦ−Ｌｕｃレポーターアッセイ
Ｇｑ刺激を検出するための一方法は、それらのプロモーター中に血清応答因子
を含有する遺伝子の活性化を引き起こすＧｑ依存性のホスホリパーゼＣの既知の
特性に依存する。例えばＣＯＳ７細胞でのＧｑ共役型の活性についてアッセイす
るのに、パスディテクト［Ｐａｔｈｄｅｔｅｃｔ］（商標）ＳＲＦ−Ｌｕｃレポ
ーティング系（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を利用することがで
きる。製造元の説明書に従って哺乳動物トランスフェクション［Ｍａｍｍａｌｉ
ａｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ］（商標）キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ）、カタログ番号２００２８５）を使用して、系のプラスミド成分
および内在性もしくは非内在性のＧＰＣＲをコードする指定された発現プラスミ
ドで細胞をトランスフェクションする。簡潔には、４１０ｎｇのＳＲＦ−Ｌｕｃ
、８０ｎｇのｐＣＭＶ受容体発現プラスミドおよび２０ｎｇのＣＭＶ−ＳＥＡＰ
（分泌型アルカリホスファターゼ発現プラスミド；トランスフェクションされた
細胞の培地中でアルカリホスファターゼ活性を測定して、サンプル間のトランス
フェクションの効率の変動について制御する）を、製造元の説明書に従ってリン
酸カルシウム沈殿物中で組み合わせる。沈殿物の半分を９６穴プレートの３個の
ウェルに同等に配分し、血清を含まない培地中で細胞上で２４時間保つ。指定さ
れた場合は、最後の５時間、細胞を１μＭのアンジオテンシンとともにインキュ
ベートする。その後細胞を溶解し、そして、製造元の説明書に従ってルックライ
ト［Ｌｕｃｌｉｔｅ］（商標）キット（パッカード（Ｐａｃｋａｒｄ）、カタロ
グ番号６０１６９１１）および「トライルックス（Ｔｒｉｌｕｘ）１４５０マイ
クロベータ（ＭｉｃｒｏＢｅｔａ）」液体シンチレーションおよび発光計数器（
ワラック（Ｗａｌｌａｃ））を使用してルシフェラーゼ活性についてアッセイす
る。データはグラフパッド プリズム［ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ］（商標
）２．０ａ（グラフパッド ソフトウェア インク（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆ
ｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．））を使用して解析することができる。
５．細胞内ＩＰ3蓄積アッセイ
第１日に、受容体（内在性および／もしくは非内在性）を含んで成る細胞を２
４穴プレート上でプレート培養することができる（通常、ウェルあたり細胞１×
１０5個、とは言えこの数字は至適化することができる）。第２日に、ウェルあ
たり５０μｌの血清を含まないＤＭＥＭ中の０．２５μｇのＤＮＡおよびウェル
あたり５０μｌの血清を含まないＤＭＥＭ中の２μｌのリポフェクタミンを最初
に混合することにより、細胞をトランスフェクションすることができる。溶液は
穏やかに混合し、そして室温で１５〜３０分間インキュベートする。０．５ｍｌ
のＰＢＳで細胞を洗浄し、そして４００μｌの血清を含まない培地をトランスフ
ェクション培地と混合しかつ細胞に添加する。その後、細胞を３７℃／５％ＣＯ
2で３〜４時間インキュベートし、そしてその後、トランスフェクション培地を
除去しかつウェルあたり１ｍｌの通常の成長培地で置き換える。第３日に、細胞
を3Ｈ−ミオイノシトールで標識する。簡潔には、培地を除去し、そして細胞を
０．５ｍｌのＰＢＳで洗浄する。その後、０．５ｍｌのイノシトールを含まない
／血清を含まない培地（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）ＢＲＬ）を、ウェルあたり０．２
５μＣｉの3Ｈ−ミオイノシトールとともにウェルあたりに添加し、そして細胞
を３７℃／５％ＣＯ2で１６〜１８時間一夜インキュベートする。第４日に、細
胞を０．５ｍｌのＰＢＳで洗浄し、そして、イノシトールを含まない／血清を含
まない培地、１０μＭパージリン、１０ｍＭ塩化リチウムを含有する０．４５ｍ
ｌのアッセイ培地、もしくは０．４ｍｌのアッセイ培地および１０μＭの最終濃
度までの５０μｌの１０×ケタンセリン（ｋｅｔ）を添加する。その後細胞を３
７℃で３０分間インキュベートする。その後細胞を０．５ｍｌのＰＢＳで洗浄し
、そしてウェルあたり２００μｌの新鮮／氷冷停止溶液（１Ｍ ＫＯＨ；１８ｍ
Ｍホウ酸ナトリウム；３．８ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加する。溶液を５〜１０分間
もしくは細胞が溶解されるまで氷上で保ち、そしてその後、２００μｌの新鮮／
氷冷中和溶液（７．５％ＨＣｌ）により中和する。その後、ライセートを１．５
ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、そしてチューブあたり１ｍｌのクロロホ
ルム／メタノール（１：２）を添加する。溶液を１５秒間ボルテックス攪拌し、
そして上層をバイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）ＡＧ１−Ｘ８（商標）陰イオン交換
樹脂（１００〜２００メッシュ）に適用する。最初に樹脂を１：１．２５Ｗ／Ｖ
の水で洗浄し、そして０．９ｍｌの上層をカラムに負荷する。カラムを１０ｍｌ
の５ｍＭミオイノシトールおよび１０ｍｌの５ｍＭホウ酸ナトリウム／６０ｍＭ
ギ酸ナトリウムで洗浄する。２ｍｌの０．１Ｍギ酸／１Ｍギ酸アンモニウムを用
い、１０ｍｌのシンチレーションカクテルを含有するシンチレーションバイアル
中にイノシトールトリスリン酸を溶出する。１０ｍｌの０．１Ｍギ酸／３Ｍギ酸
アンモニウムで洗浄することによりカラムを再生し、そしてｄｄＨ2Ｏで２回す
すぎ、そして水中で４℃で保存する。
【００７７】
例示的結果を下の表Ｉに提示する：
【００７８】
【表１０】
【００７９】
Ｃ．細胞に基づく検出アッセイ（例−ＴＤＡＧ８）
２９３細胞をプレートあたり細胞１．３×１０7個の密度で１５０ｍｍプレー
ト上でプレート培養し、そしてプレートあたり１２μｇのそれぞれのＤＮＡおよ
び６０μｌのリポフェクタミン試薬（ＢＲＬ）を使用してトランスフェクション
した。トランスフェクションされた細胞は、トランスフェクション後２４時間に
実施されるアッセイのため血清を含有する培地中で成長させた。トランスフェク
ション後４８時間に実施される検出アッセイ（血清および血清を含まない培地を
比較するアッセイ；図３を参照されたい）のため、初期培地を血清もしくは血清
を含まない培地のいずれかに変更した。血清を含まない培地は、単にダルベッコ
の改変イーグル（ＤＭＥ）高グルコース培地（アーヴィン サイエンティフィッ
ク（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）＃９０２４）から構成された。上の
ＤＭＥ培地に加えて、血清を含む培地は以下、すなわち１０％ウシ胎児血清（ハ
イクロン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）＃ＳＨ３００７１．０３）、１％の１００ｍＭピル
ビン酸ナトリウム（アーヴィン サイエンティフィック（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉ
ｅｎｔｉｆｉｃ）＃９３３４）、１％の２０ｍＭ Ｌ−グルタミン（アーヴィン
サイエンティフィック（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）＃９３１７）
および１％のペニシリン−ストレプトマイシン溶液（アーヴィン サイエンティ
フィック（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）＃９３６６）を含有した。
【００８０】
９６穴のアデニリルシクラーゼ活性化フラッシュプレート［Ｆｌａｓｈｐｌａ
ｔｅ］（商標）を使用した（ＮＥＮ：＃ＳＭＰ００４Ａ）。最初に、アッセイの
ための標準５０μｌを、ウェルあたり５０ｐｍｏｌから０ｐｍｏｌまでのｃＡＭ
Ｐ濃度の範囲にわたるプレート（二重(in duplicate)）に添加した。標準ｃＡＭ
Ｐ（ＮＥＮ：＃ＳＭＰ００４Ａ）を水で再構成し、そして１×ＰＢＳ（アーヴィ
ン サイエンティフィック（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）＃９２４０
）を使用して連続的希釈物を作成した。次に、５０μｌの刺激緩衝液（ＮＥＮ：
＃ＳＭＰ００４Ａ）を全部のウェルに添加した。ｃＡＭＰの活性化もしくは不活
性化を測定するのに化合物を使用する場合は、水で希釈された各化合物１０μｌ
を三重でそのそれぞれのウェルに添加した。使用された多様な最終濃度は１μＭ
から１ｍＭまでの範囲にわたる。アデノシン５’−三リン酸、ＡＴＰ（リサーチ
バイオケミカルズ インターナショナル（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ：＃Ａ−１４１）およびアデノシン５
’−二リン酸、ＡＤＰ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）：＃Ａ２７５４）をアッセイで使
用した。次に、それぞれのｃＤＮＡ（ＣＭＶもしくはＴＤＡＧ８）でトランスフ
ェクションされた２９３細胞を、トランスフェクション後２４（血清培地中での
アッセイの検出）もしくは４８（血清および血清を含まない培地を比較するアッ
セイの検出）時間で収穫した。培地を吸引し、そして細胞を１×ＰＢＳで１回洗
浄した。その後、５ｍｌの１×ＰＢＳを３ｍｌの細胞解離緩衝液（シグマ（Ｓｉ
ｇｍａ）：＃Ｃ−１５４４）とともに細胞に添加した。解離された細胞を遠心分
離チューブに移し、そして室温で５分間遠心分離した。上清を除去し、そして、
１ミリリットルあたり細胞２×１０6個の最終濃度を得るように、細胞ペレット
を適切な量の１×ＰＢＳに再懸濁した。化合物を含有するウェルに、１×ＰＢＳ
中の細胞５０μｌ（ウェルあたり細胞１×１０5個）を添加した。プレートを室
温で１５分間振とう機でインキュベートした。トレーサーｃＡＭＰを含有する検
出緩衝液を調製した。１１ｍｌの検出緩衝液（ＮＥＮ：＃ＳＭＰ００４Ａ）中で
５０μｌ（１μＣｉに等しい）の［125Ｉ］ｃＡＭＰ（ＮＥＮ：＃ＳＭＰ００４
Ａ）を添加した。インキュベーション後に、トレーサーｃＡＭＰを含有するこの
検出緩衝液５０μｌを各ウェルに添加した。プレートを振とう機に設置し、そし
て室温で２時間インキュベートした。最後に、プレートのウェルからの溶液を吸
引し、そしてワラック（Ｗａｌｌａｃ）マイクロベータ［ＭｉｃｒｏＢｅｔａ］
（商標）シンチレーション計数器を使用してフラッシュプレートを計数した。
【００８１】
図２Ａにおいて、ＡＴＰおよびＡＤＰは内在性のＴＤＡＧ８に結合し、それぞ
れ約５９％および約５５％のｃＡＭＰの増大をもたらす。図２Ｂは、内在性のＴ
ＤＡＧ８へのＡＴＰおよびＡＤＰの結合を明示し、ここでは内在性ＴＤＡＧ８が
トランスフェクションされ、そして血清および血清を含まない培地中で成長され
た。血清培地中で成長された内在性のＴＤＡＧ８へのＡＴＰの結合は、化合物を
伴わない内在性のＴＤＡＧ８に比較して、約６５％のｃＡＭＰの増大を明示し；
血清を含まない培地中では約６８％の増大が存在した。血清中の内在性ＴＤＡＧ
８へのＡＤＰの結合は約６１％の増大を明示する一方、血清を含まない培地中で
はＡＤＰ結合が約６２％増大の増大を明示する。ＡＴＰおよびＡＤＰは、それぞ
れ１３９．８μＭおよび１２０．５μＭのＥＣ５０値で内在性のＴＤＡＧ８に結
合する（データは示されない）。
【００８２】
図２Ｂに提示される結果は、血清および血清を含まない培地を比較した場合に
実質的に同一の結果を示すが、われわれの選択は血清に基づく培地を使用するこ
とである。とは言え血清を含まない培地もまた利用することが可能である。
実施例６
ＧＰＣＲ融合タンパク質の調製
構成的に活性化されるＧＰＣＲ−Ｇタンパク質融合構築物の設計を以下のとお
り達成した。すなわち、ラットＧタンパク質Ｇｓα（長形態；伊藤（Ｉｔｏｈ，
Ｈ．）ら、８３ ＰＮＡＳ ３７７６（１９８６））の５’および３’双方の端
をそれにＨｉｎｄＩＩＩ（５’−ＡＡＧＣＴＴ−３’）配列を包含するように工
作した。正しい配列（隣接するＨｉｎｄＩＩＩ配列を包含する）の確認後に、そ
のベクターのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を使用してサブクローニングすることによ
り、配列全体をｐｃＤＮＡ３．１（−）（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ）、カタログ番号Ｖ７９５−２０）にｓｎｕｔｔｌｅした。ｐｃＤＮＡ３
．１（−）へのサブクローニング後にＧｓαの配列について正しい向きを決定し
た。ＨｉｎｄＩＩＩ配列でラットＧｓα遺伝子を含有する改変されたｐｃＤＮＡ
３．１（−）をその後確認し；このベクターは今や「普遍的」Ｇｓαタンパク質
ベクターとして利用可能となった。ｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクターは、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ部位の上流に多様な公知の制限部位を含有し、従ってＧｓタンパク質の
上流に内在性の構成的に活性なＧＰＣＲのコーディング配列を挿入する能力を有
益に提供する。他の「普遍的」Ｇタンパク質ベクターを創製するのにこの同一の
アプローチを利用することができ、そして、もちろん、当業者に既知の他の商業
的に入手可能なもしくは占有のベクターを利用することができる。重要な基準は
、ＧＰＣＲの配列がＧタンパク質の配列の上流にかつ同じ読み枠で存在すること
である。
【００８３】
ＴＤＡＧ８はＧｓを介して共役する一方、Ｈ９はＧｚを介して共役する。以下
の例示的ＧＰＣＲ融合タンパク質についてＧｓαへの融合を達成した。
【００８４】
ＴＤＡＧ８（Ｉ２２５Ｋ）−Ｇｓα融合タンパク質構築物は以下のとおり作成
した。すなわち、プライマーを以下のとおり設計した：
５’−ｇａｔｃＴＣＴＡＧＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＡＣＡＴＧＴＡＴＴＧＡＡＧ−
３’（配列番号１２５；センス）
５’−ｃｔａｇＧＧＴＡＣＣＣＧＣＴＣＡＡＧＧＡＣＣＴＣＴＡＡＴＴＣＣＡＴ
ＡＧ−３’（配列番号１２６；アンチセンス）。
【００８５】
小文字のヌクレオチドはＧタンパク質とＴＤＡＧ８との間の制限部位中のスペ
ーサーとして包含される。該センスおよびアンチセンスプライマーはそれぞれＸ
ｂａＩおよびＫｐｎＩの制限部位を包含した。
【００８６】
その後、それぞれについて以下のプロトコルを使用し、ＰＣＲを利用して、上
に開示されたＧｓα普遍的ベクター内の融合についてそれぞれの受容体配列を保
証した。すなわち、２μｌの各プライマー（センスおよびアンチセンス）、３μ
Ｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、１０μＬの１０×タックプラス［ＴａｑＰｌｕｓ］（
商標）プレシジョン（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）緩衝液、１μＬのタックプラス［Ｔ
ａｑＰｌｕｓ］（商標）プレシジョン（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）ポリメラーゼ（ス
トラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）：＃６００２１１）ならびに８０μＬの
水を含有する別個のチューブに、１００ｎｇのＴＤＡＧ８のｃＤＮＡを添加した
。ＴＤＡＧ８についての反応温度および周期時間は以下のとおりであった。すな
わち、最初の変性段階はそれを９４℃で５分間、そして、９４℃３０秒間；５５
℃３０秒間；７２℃２分間の周期を行った。最後の伸長時間は７２℃で１０分間
行った。順向きのＰＣＲ産物(PCR product for)を１％アガロースゲル上で泳動
し、そしてその後精製した（データは示されない）。精製された産物をＸｂａＩ
およびＫｐｎＩ（ニュー イングランド バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））で消化し、そして所望の挿入物を精製しかつそれぞれの
制限部位でＧｓ普遍的ベクターに連結した。形質転換後に陽性のクローンを単離
し、そして制限酵素消化により決定し；２９３細胞を使用する発現は下に示され
るプロトコルに従って達成した。ＴＤＡＧ８：Ｇｓ融合タンパク質についてのそ
れぞれの陽性のクローンを配列決定して正しさを確かめた。
【００８７】
非内在性の構成的に活性化されるＴＤＡＧ８（Ｉ２２５Ｋ）を含んで成るＧＰ
ＣＲ融合タンパク質を上のとおり分析し、そして構成的活性化について確かめた
。
【００８８】
Ｈ９（Ｆ２３６Ｋ）−Ｇｓα融合タンパク質構築物は以下のとおり作成した。
すなわち、プライマーを以下のとおり設計した：
５’−ＴＴＡｇａｔａｔｃＧＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＴＡＧＣＧＧＴ−３’（配列
番号１４５；センス）
５’−ｇｇｔａｃｃＣＣＣＡＣＡＧＣＣＡＴＴＴＣＡＴＣＡＧＧＡＴＣ−３’（
配列番号１４６；アンチセンス）。
【００８９】
小文字のヌクレオチドはＧタンパク質とＨ９との間の制限部位中のスペーサー
として包含される。センスおよびアンチセンスプライマーはそれぞれＥｃｏＲＶ
およびＫｐｎＩの制限部位を包含し、その結果、スペーサー（制限部位に帰され
る）がＧタンパク質とＨ９との間に存在する。
【００９０】
その後、それぞれについて以下のプロトコルを使用し、ＰＣＲを利用して、上
に開示されたＧｓα普遍的ベクター内の融合についてそれぞれの受容体配列を保
証した。すなわち、１００ｎｇの各プライマー（センスおよびアンチセンス）な
らびに４５μＬのＰＣＲスーパーミックス［Ｓｕｐｅｒｍｉｘ］（商標）（ギブ
コ（Ｇｉｂｃｏ）−Ｂｒｌ、ライフテック（ＬｉｆｅＴｅｃｈ））を含有する別
個のチューブに、８０ｎｇのＨ９のｃＤＮＡを添加した（５０μＬの総反応体積
）。Ｈ９についての反応温度および周期時間は以下のとおりであった。すなわち
、最初の変性段階はそれを９４℃で１、そして、９４℃３０秒間；５５℃３０秒
間、７２℃２分間の周期を行った。最後の伸長時間は７２℃で７分間行った。順
向きのＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で泳動し、そしてその後精製した（デ
ータは示されない）。精製された産物をｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（商標）系にクロ
ーン化し、次いで陽性のクローンを同定した。陽性のクローンを単離し、Ｅｃｏ
ＲＶおよびＫｐｎＩ（ニュー イングランド バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ
ａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））で消化し、そして所望の挿入物を単離し、精製しか
つそれぞれの制限部位でＧｓ普遍的ベクターに連結した。形質転換後に陽性のク
ローンを単離し、そして制限酵素消化により決定し；２９３細胞を使用する発現
は下に示されたプロトコルに従って達成した。Ｈ９（Ｆ２３６Ｋ）：Ｇｓ融合タ
ンパク質についての各陽性のクローンを配列決定して正しさを確かめた。膜は利
用されるまで凍結（−８０℃）した。
【００９１】
（Ｈ９はＧｚと共役するのであるが）Ｇｓタンパク質により媒介されるｃＡＭ
Ｐ応答を測定する能力を確かめるため、ＮＥＮアデニルシクラーゼ活性化フラッ
シュプレート［Ｆｌａｓｈｐｌａｔｅ］（商標）アッセイキット（９６穴の形式
）に基づき、以下のｃＡＭＰ膜アッセイを利用した。「結合緩衝液」は１０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌｍおよび１０ｍＭ ＭｇＣｌ（ｐＨ７．４
）より成った。「再生緩衝液」は結合緩衝液中で調製し、そして２０ｍＭホスホ
クレアチン、２０Ｕのクレアチンホスホキナーゼ、２０μＭ ＧＴＰ、０．２ｍ
Ｍ ＡＴＰおよび０．６ｍＭ ＩＢＭＸより成った。「ｃＡＭＰ標準」は以下の
とおり結合緩衝液中で調製した：
【００９２】
【表１１】
【００９３】
凍結された膜（対照としてのｐＣＭＶおよび非内在性のＨ（−Ｇｓ融合タンパ
ク質の双方）を（溶液中まで室温で氷上で）融解した。膜を懸濁液中までポリト
ロンで均質化した（２×１５秒）。ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッ
セイプロトコル（下を参照されたい）を使用して膜タンパク質濃度を測定した。
再生緩衝液中で膜の濃度を０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した（最終アッセイ濃度−ウ
ェルあたり２５μｇ）。その後、５０μｌの結合緩衝液を各ウェルに添加した。
対照には、ウェルあたり５０μｌのｃＡＭＰ標準をウェル１１および１２Ａ−Ｇ
に、結合緩衝液単独を１２Ｈに添加した（９６穴の形式で）。その後、ウェルあ
たり５０μｌのタンパク質をウェルに添加し、そして室温で（振とう機上で）６
０分間インキュベートした。検出緩衝液（下を参照されたい）中１００μｌの［
125Ｉ］ｃＡＭＰを各ウェルに添加した（最終−１１ｍｌの検出緩衝液中に５０
μｌの［125Ｉ］ｃＡＭＰ）。これらを室温で２時間インキュベートした。プレ
ートを８チャンネルのマニホールドで吸引し、そしてプレートの蓋で封止した。
結果（結合されたｃＡＭＰのｐｍｏｌ）を「プロット＃１５」でワラック［Ｗａ
ｌｌａｃ］（商標）１４５０で読み取った。結果を図３に提示する。
【００９４】
図３に提示される結果は、Ｇｓ共役型融合がシクラーゼ反応を「駆動する」こ
とが可能であり、その結果Ｈ９（Ｆ２３６Ｋ）の構成的活性化の測定が実現可能
であったことを示す。これらの結果に基づけば、反作用薬、アゴニストおよび部
分的アゴニストである候補化合物の直接同定がシクラーゼに基づくアッセイを使
用して可能である。
実施例６
プロトコル：［35Ｓ］ＧＴＰγＳを使用する反作用薬およびアゴニストの直接同
定
われわれは、全く理解されていない理由上、例えば反作用薬のような候補化合
物の直接同定に内在性の構成的に活性のＧＰＣＲを利用したが、アッセイ間の変
動が悪化されたようになる可能性がある。その場合、好ましくは、上に開示され
たようなＧＰＣＲ融合タンパク質を非内在性の構成的に活性化されるＧＰＣＲと
ともにもまた利用する。われわれは、こうしたタンパク質を使用する場合にアッ
セイ間の変動が実質的に安定化されるようであり、それにより有効なＳ／Ｎ比が
得られることを決定した。これは候補化合物のより確固たる同定を見込むという
有益な結果を有する。従って、直接同定のためにはＧＰＣＲ融合タンパク質を使
用すること、また、利用される場合は以下のアッセイプロトコルを利用すること
が好ましい。
膜の調製
目的の、および反作用薬、アゴニストもしくは部分的アゴニストとしての候補
化合物の直接同定での使用のための非内在性の構成的に活性のオーファンＧＰＣ
Ｒ融合タンパク質を含んで成る膜は、以下のように好ましく調製する：
ａ．材料
「膜掻き取り緩衝液」は２０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐ
Ｈ７．４より構成され；「膜洗浄緩衝液」は２０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび０．１
ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４から構成され；「結合緩衝液」は２０ｍＭ ＨＥＰ
ＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．４から構成
される。
ｂ．手順
全部の材料は処置の間中氷上に保つ。最初に、細胞のコンフルエントな単層か
ら培地を吸引し、次いで１０ｍｌの冷ＰＢＳですすぎ、次いで吸引する。その後
、５ｍｌの膜掻き取り緩衝液を添加して細胞を掻き取り；これに次いで細胞抽出
物を５０ｍｌ遠心管に移す（２０，０００ｒｐｍで４℃で１７分間遠心分離され
る）。その後、上清を吸引し、そしてペレットを３０ｍｌの膜洗浄緩衝液に再懸
濁し、次いで２０，０００ｒｐｍで４℃で１７分間遠心分離する。上清をその後
吸引し、そしてペレットを結合緩衝液に再懸濁する。その後、ブリンクマン（Ｂ
ｒｉｎｋｍａｎ）ポリトロン［ｐｏｌｙｔｒｏｎ］（商標）ホモジェナイザーを
使用してこれを均質化する（全部の物質が懸濁液中にあるまで１５〜２０秒破裂
させる）。これを本明細書で「膜タンパク質」と称する。
ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）タンパク質アッセイ
均質化の後に、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）タンパク質アッセイを
使用して膜のタンパク質濃度を測定する（タンパク質を約１．５ｍｇ／ｍｌに希
釈し、等分し、そして後の使用のため凍結する（−８０℃）ことができ；凍結さ
れる場合、使用のためのプロトコルは以下のとおりである。すなわち、アッセイ
の日に、凍結された膜タンパク質を室温で融解し、次いでボルテックス攪拌し、
そしてその後、約５〜１０秒間約１２×１，０００ｒｐｍでポリトロンで均質化
し；複数の調製のためには、異なる調製物の均質化の間にホモジェナイザーを徹
底的に洗浄すべきであることが言及される）。
ａ．材料
結合緩衝液（上に従う）；ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）色素試薬；
ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）タンパク質標準を製造元の説明書に従っ
て（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）カタログ番号５００−０００６）利用する。
ｂ．手順
二重のチューブを準備する（１本は膜を包含し、そして１本は対照の「ブラン
ク」として）。それぞれは８００μｌの結合緩衝液を含有した。その後、１０μ
ｌのブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）タンパク質標準（１ｍｇ／ｍｌ）を
各チューブに添加し、そしてその後１０μｌの膜タンパク質を１本のチューブに
だけ添加する（ブランクでない）。その後、２００μｌのブラッドフォード（Ｂ
ｒａｄｆｏｒｄ）色素試薬を各チューブに添加し、次いでそれぞれをボルテック
ス攪拌する。５分後にチューブを再度ボルテックス攪拌し、そして、その中の物
質をキュベットに移す。その後、波長５９５でＣＥＣＩＬ ３０４１分光光度計
を使用してキュベットを読み取る。
直接同定アッセイ
ａ．材料
ＧＤＰ緩衝液は３７．５ｍｌの結合緩衝液および２ｍｇのＧＤＰ（シグマ（Ｓ
ｉｇｍａ）、カタログ番号Ｇ−７１２７）より成り、次いで０．２μＭ ＧＤＰ
を得るため結合緩衝液で一連の希釈を行い（各ウェル中でのＧＤＰの最終濃度は
０．１μＭ ＧＤＰであった）；候補化合物を含んで成る各ウェルは、１００μ
ｌのＧＤＰ緩衝液（最終濃度、０．１μＭ ＧＤＰ）、５０μｌの結合緩衝液中
の膜タンパク質、および５０μｌの結合緩衝液中の［35Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．６
ｎＭ）（１０ｍｌの結合緩衝液あたり２．５μｌの［35Ｓ］ＧＴＰγＳ）より成
る２００μｌの最終体積を有する。
ｂ．手順
候補化合物は９６穴プレートの形式（これらは−８０℃で凍結させることがで
きる）を使用して好ましくスクリーニングする。膜タンパク質（もしくは、対照
として、ＧＰＣＲ融合タンパク質を除外する発現ベクターを含む膜）を懸濁液中
まで短く均質化する。その後、上に示されたブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒ
ｄ）タンパク質アッセイを使用してタンパク質濃度を測定する。その後、膜タン
パク質（および対照）を結合緩衝液で０．２５ｍｇ／ｍｌに希釈する（最終アッ
セイ濃度、ウェルあたり１２．５μｇ）。その後、１００μｌのＧＤＰ緩衝液を
ワラック（Ｗａｌｌａｃ）シンチストリップ［Ｓｃｉｎｔｉｓｔｒｉｐ］（商標
）（ワラック（Ｗａｌｌａｃ））の各ウェルに添加する。その後、５μｌのピン
ツール(pin-tool)を使用して、こうしたウェルに５μｌの候補化合物を移す（す
なわち、２００μｌの総アッセイ体積中の５μｌは１：４０の比であり、その結
果候補化合物の最終スクリーニング濃度は１０μＭである）。再度、汚染を回避
するため、各移送段階の後にはピンツールを水（１×）、エタノール（１×）お
よび水（２×）を含んで成る３個の水槽ですすぐべきであり、過剰の液体は各す
すぎの後にツールから振りそして紙およびキムワイプでぬぐって乾かすべきであ
る。その後、５０μｌの膜タンパク質を各ウェルに添加し（ＧＰＣＲ融合タンパ
ク質を含まない膜を含んで成る対照ウェルもまた利用する）、そして室温で５〜
１０分間前インキュベートする。その後、５０μｌの結合緩衝液中の［35Ｓ］Ｇ
ＴＰγＳ（０．６ｎＭ）を各ウェルに添加し、次いで室温で振とう機で６０分間
インキュベートする（再度、この実施例において、プレートをホイルで覆った）
。その後、２２℃で４０００ＲＰＭで１５分間のプレートの回転によりアッセイ
を停止する。その後、プレートを８チャンネルのマニホールドで吸引し、そして
プレートの蓋で封止する。その後、（製造元の説明書に従って）「Ｐｒｏｔ．＃
３７」の設定を使用してワラック（Ｗａｌｌａｃｃ）１４５０でプレートを読み
取る。
実施例７
プロトコル：確認アッセイ
上に示されたような直接同定された候補化合物の確認を提供するための独立の
アッセイのアプローチを使用して、その後確認アッセイを利用することが好まし
い。この場合、好ましい確認アッセイはシクラーゼに基づくアッセイである。
【００９５】
改変されたフラッシュプレート［Ｆｌａｓｈ Ｐｌａｔｅ］（商標）アデニリ
ルシクラーゼキット（ニュー イングランド ニュークリア（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ
ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）；カタログ番号ＳＭＰ００４Ａ）を、以下のプロトコ
ルに従って、非内在性の構成的に活性化されるオーファンＧＰＣＲに対する反作
用薬およびアゴニストとして直接同定された候補化合物の確認に、好ましく利用
する。
【００９６】
トランスフェクションされた細胞をトランスフェクション後およそ３日に収穫
する。２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４および１０ｍＭ ＭｇＣｌ2を含有す
る緩衝液中に懸濁された細胞の均質化により膜を調製する。均質化は、ブリンク
マン（Ｂｒｉｎｋｍａｎ）ポリトロン［Ｐｏｌｙｔｒｏｎ］（商標）を使用して
氷上でおよそ１０秒間実施する。生じるホモジェネートは４９，０００×ｇで４
℃で１５分間遠心分離する。その後、生じるペレットを、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ
、ｐＨ７．４および０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する緩衝液に再懸濁し、１０秒
間均質化し、次いで４９，０００×ｇで４℃で１５分間遠心分離する。生じるペ
レットは利用されるまで−８０℃で保存することができる。直接同定スクリーニ
ングの日に、膜ペレットを室温でゆっくりと融解し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐ
Ｈ７．４および１０ｍＭ ＭｇＣｌ2を含有する緩衝液に再懸濁して、０．６０
ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度を生じる（再懸濁された膜は使用まで氷上に置
く）。
【００９７】
ｃＡＭＰ標準および検出緩衝液（１１ｍｌの検出緩衝液に対して２μＣｉのト
レーサー［125Ｉ］ｃＡＭＰ（１００μｌ）を含んで成る）は、製造元の説明書
に従って調製しかつ維持する。アッセイ緩衝液はスクリーニングのために新たに
調製し、そして２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、２
０ｍＭホスホクレアチン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、０．１単位／ｍｌのクレア
チンホスホキナーゼ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、５０μＭ ＧＴＰ（シグマ（Ｓ
ｉｇｍａ））および０．２ｍＭ ＡＴＰ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を含有し；ア
ッセイ緩衝液は利用されるまで氷上で保存することができる。
【００９８】
上に従って同定された候補化合物（凍結されている場合は室温で融解させる）
を、４０μＭの膜タンパク質（ウェルあたり３０μｇ）および５０μｌのアッセ
イ緩衝液と一緒に、好ましくは９６穴プレートのウェルに添加する（ウェルあた
り３μｌ；１２μＭの最終アッセイ濃度）。その後、この混合状態を穏やかに振
とうしながら室温で３０分間インキュベートする。
【００９９】
インキュベーション後に、各ウェルに１００μｌの検出緩衝液を添加し、次い
で２〜２４時間インキュベートする。その後、プレートを、（製造元の説明書に
従い）「Ｐｒｏｔ．＃３１」を使用してワラック（Ｗａｌｌａｃ）マイクロベー
タ［ＭｉｃｒｏＢｅｔａ］（商標）プレートリーダーで計数する。
【０１００】
本特許文書で挙げられる特許、出願および印刷された刊行物のそれぞれはこれ
によりそっくりそのまま引用により組み込まれることが意図される。
【０１０１】
当業者は、多数の変更および改変を、本発明の技術思想から離れることなく本
発明の好ましい態様に対し行ってよいことを認識するであろう。全部のこうした
変形物は本発明の範囲内にあることが意図される。
【０１０２】
多様な発現ベクターが当業者に利用可能であるが、内在性および非内在性双方
のヒトＧＰＣＲに対する利用の目的上、利用されるベクターはｐＣＭＶであるこ
とが最も好ましい。このベクターは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に
関するブダペスト条約（ｔｈｅ Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ ｆｏｒ ｔ
ｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕ
ｒｐｏｓｅ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）の規定の下に、１９９
８年１０月１３日にアメリカン タイプ カルチャー コレクション（Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）（
１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，米国バージニア州マナサス
２０１１０−２２０９）に寄託された。該ＤＮＡはＡＴＣＣにより試験され、そ
してそうであることが決定された。ＡＴＣＣはｐＣＭＶに対し以下の寄託番号：
ＡＴＣＣ＃２０３３５１を割り当てている。
（配列表）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載のｃＤＮＡ。
【請求項１】
明細書に記載のｃＤＮＡ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−１４２２３５（Ｐ２０１０−１４２２３５Ａ）
【公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−８７（Ｐ２０１０−８７）
【出願日】平成２２年１月４日（２０１０．１．４）
【分割の表示】特願２０００−５７６０２１（Ｐ２０００−５７６０２１）の分割
【原出願日】平成１１年１０月１３日（１９９９．１０．１３）
【出願人】（５００４７８０９７）アリーナ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (97)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月４日（２０１０．１．４）
【分割の表示】特願２０００−５７６０２１（Ｐ２０００−５７６０２１）の分割
【原出願日】平成１１年１０月１３日（１９９９．１０．１３）
【出願人】（５００４７８０９７）アリーナ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (97)
【Ｆターム（参考）】
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