非結合体化フィコビリタンパク質を含む、マルチカラーフローサイトメトリー組成物
（ｉ）リガンド結合体化フィコビリタンパク質タンデム色素および（ｉｉ）非結合体化フィコビリタンパク質を含み、前記フィコビリタンパク質が、同じ細菌または真核藻種から得られるものである、新規組成物を提供する。前記フィコビリタンパク質は、同じでなくてはならないか、または、異なり、交換する幾つかの非架橋サブユニットを含有しなくてはならない。これらの組成物を調製するための方法、これらの組成物を含有するキットまたはそれらの成分、ならびに細胞および非細胞分析のためのこれらの組成物の使用方法も提供する。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
フィコビリタンパク質およびそれらのタンデム色素（ｔａｎｄｅｍ ｄｙｅ）は、フローサイトメトリーにおける蛍光標識として広く用いられている重要な蛍光色素である。タンデム色素の使用は、異なる発光スペクトルを有する追加の蛍光色素を供給することによるフローサイトメトリーでの進展されたマルチカラー分析能力を、１つのレーザー線によって励起される単一ドナー色素を使用して進展させた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
マルチカラー組み合わせで多数のタンデム色素を使用すると、蛍光シグナル間の識別困難が生ずることがある。今日まで、当該技術分野は、一般に、これらの「困難」を色素不安定性のためであるとしてきた。しかし、これらの問題に対処するための明確な回答および提案は、一切されていない。従って、フィコビリタンパク質結合体化リガンドのユニークな組み合わせを用いる分析のための組成物および方法が、当該技術分野において依然として必要とされている。詳細には、当該技術分野において公知の組成物で遭遇する経時的分解を制限するフィコビリタンパク質含有タンデム色素組成物が、当該技術分野において依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の概要）
理解を容易にするために、以下の概要および詳細な説明においてフィコビリタンパク質、リガンド、色素または種に適用する場合、用語「第一の」、「第二の」、「第三の」などは、あるフィコビリタンパク質、リガンド、色素または種と別のフィコビリタンパク質、リガンド、色素または種とを、同じ組成物中に存在するときにそれぞれ区別するために用いる。量、順序または重要度を特定するためにこれらの用語を用いてはいない。
【０００４】
１つの態様において、第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンドを含有する組成物を提供する。前記第一のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含む第一のフィコビリタンパク質と、前記第一のフィコビリタンパク質に結合体化した第一のパートナー色素とを含む。前記組成物は、非結合体化第二のフィコビリタンパク質も含む。前記第一のフィコビリタンパク質および前記第二のフィコビリタンパク質は、第一の（すなわち同じ）細菌種または真核藻種から得られる。１つの実施形態において、前記第一のフィコビリタンパク質と前記第二のフィコビリタンパク質は同じである。もう１つの実施形態において、前記第一および第二のフィコビリタンパク質は異なり、前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する。
【０００５】
もう１つの態様において、上に記載したような組成物は、第二のタンデム色素に結合体化した第二のリガンドをさらに含有する。前記第二のタンデム色素は、第三のフィコビリタンパク質と、該第三のフィコビリタンパク質に結合体化した第二のパートナー色素とを含む。前記第三のフィコビリタンパク質は、架橋および非架橋サブユニットを含有し、ならびに前記第一の細菌または真核藻種から得られる。この組成物は、サブユニットを含む非結合体化第四フィコビリタンパク質も含有する。前記第四のフィコビリタンパク質も前記第一の細菌または真核藻種から得られる。１つの実施形態において、前記第一、第二、第三および第四のフィコビリタンパク質は、同じである。もう１つの実施形態において、前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二および第三のフィコビリタンパク質と異なり、ならびに前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二および第三のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する。
【０００６】
さらなる態様において、上に記載したような組成物は、第三のタンデム色素に結合体化した第三のリガンドを含有する。前記第三のタンデム色素は、第五のフィコビリタンパク質と、該第五のフィコビリタンパク質に結合体化した第三のパートナー色素とを含有する。前記第五のフィコビリタンパク質は、架橋および非架橋サブユニットを含有し、ならびに前記第一の細菌または真核藻種から得られる。この組成物は、非結合体化第六のフィコビリタンパク質も含有する。前記非結合体化第六のフィコビリタンパク質は、サブユニットを含有し、および前記第一の細菌または真核藻種から得られる。１つの実施形態において、前記第一、第二、第三、第四、第五および第六のフィコビリタンパク質は、同じである。もう１つの実施形態において、前記第六のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二、第三、第四および第五のフィコビリタンパク質と異なり、ならびに前記第六のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二、第三、第四および第五のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する。
【０００７】
さらにもう１つの実施形態において、上に記載したような組成物は、第四のタンデム色素に結合体化した第四のリガンドも含有する。前記第四のタンデム色素は、第七のフィコビリタンパク質と、該第七のフィコビリタンパク質に結合体化した第四のパートナー色素とを含む。前記第七のフィコビリタンパク質は、架橋および非架橋サブユニットを含有し、ならびに前記第一の細菌または真核藻種から得られる。この組成物は、非結合体化第八のフィコビリタンパク質も含有する。前記非結合体化第八のフィコビリタンパク質は、サブユニットを含有し、および前記第一の細菌または真核藻種から得られる。１つの実施形態において、前記第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七および第八のフィコビリタンパク質は、同じである。もう１つの実施形態において、前記第八のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二、第三、第四、第五、第六および第七のフィコビリタンパク質と異なり、ならびに前記第八のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二、第三、第四、第五、第六および第七のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する。
【０００８】
もう１つの態様では、上に記載した組成物のいずれもが、フィコビリタンパク質でない色素に結合体化した１つ以上の追加のリガンドを含む。
【０００９】
さらにもう１つの態様において、前記第一のタンデム色素に結合体化した前記第一のリガンドと前記非結合体化第二のフィコビリタンパク質とを含有する上記組成物は、第一の細菌または真核藻種から得られる第三のフィコビリタンパク質に結合体化した１つ以上の追加のリガンドも含む。１つの実施形態において、前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質または前記第二のフィコビリタンパク質と同じである。もう１つの実施形態において、前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質または前記第二のフィコビリタンパク質と異なり、ならびに前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一および第二のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する。
【００１０】
なおまたさらなる態様において、前記第一のタンデム色素に結合体化した前記第一のリガンドと前記非結合体化第二のフィコビリタンパク質とを含有する上記組成物は、（ａ）第二のタンデム色素に結合体化した第二のリガンドおよび（ｂ）非結合体化第四のフィコビリタンパク質も含む。前記第二のタンデム色素は、第三のフィコビリタンパク質と、該第三のフィコビリタンパク質に結合体化した第二のパートナー色素とを含む。前記第三のフィコビリタンパク質は、架橋および非架橋サブユニットを含有し、ならびに第二の細菌または真核藻種から得られる。前記非結合体化第四のフィコビリタンパク質は、サブユニットを含有し、および前記第二の細菌または真核藻種から得られる。１つの実施形態において、前記第三および第四のフィコビリタンパク質は同じである。さらなる実施形態において、前記第三および第四のフィコビリタンパク質は異なり、ならびに前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第三のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する。
【００１１】
さらなる態様において、検体における細胞および非細胞集団を分析するための方法を提供する。この方法は、前記検体と本明細書に記載する組成物とを併せる工程、および蛍光を分析することによって前記検体中の前記集団を同定する工程を含む。望ましくは、前記細胞および非細胞集団の少なくとも１つは、前記第一のリガンドの受容体を含む。
【００１２】
本特許請求の範囲の本発明の様々な実施形態の他の態様および利点を、以下の発明の詳細な説明において開示する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図１Ａ〜３Ｊは、２つの異なる蛍光色素の蛍光強度を同じ全血検体の様々な細胞集団についてプロットしている、２および３色試薬組成物の二重パラメータヒストグラムである。これらのヒストグラムは、異なる量の遊離フィコビリタンパク質の使用による本明細書に記載するリガンド−色素組成物の保管中の安定性向上を明示している。図１Ａは、２から８℃で２１日間個々に保管した成分から新たに処方した、リガンド／色素結合体、すなわちＣＤ３−アロフィコシアニン（ＡＰＣ）（０．５μｇ）、およびリガンド／タンデム色素結合体、すなわちＣＤ１９−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素（０．５μｇ）、を含有する先行技術分野において入手可能な試薬組成物、すなわち「先行技術の作りたて（ｆｒｅｓｈ）混合物」を使用して調製した検体の、および該試薬組成物の効果を示す、二重パラメータヒストグラムを提供するものである。両方の結合体におけるＡＰＣは、同じ細菌種、すなわちＳｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓからのものである。遊離（非結合体化）ＡＰＣは存在しない。
【図１Ｂ】図１Ｂは、２から８℃で事前処方して２１日間保持した、ＣＤ３−ＡＰＣ（０．５μｇ）およびＣＤ１９−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素（０．５μｇ）を含有する先行技術分野において入手可能な組成物、すなわち「先行技術の保管混合物」を使用して調製した検体の、および該組成物の効果を示す、二重パラメータヒストグラムを提供するものである。両方の結合体中のＡＰＣは、同じ細菌種、すなわちＳｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓからのものである。遊離（非結合体化）ＡＰＣは存在しない。
【図１Ｃ】図１Ｃは、２から８℃で２１日間個々に保持した成分から新たに処方した、ＣＤ３−ＡＰＣ（０．５μｇ）、ＣＤ１９−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素（０．５μｇ）、および非結合体化ＡＰＣ（０．５μｇ）を含有する本明細書に記載する２色試薬組成物を使用して調製した検体の、および該２色試薬組成物の効果を示す、二重パラメータヒストグラムを提供するものである。
【図１Ｄ】図１Ｄは、２１日間、２から８℃で事前処方しておいた、ＣＤ３−ＡＰＣ（０．５μｇ）、ＣＤ１９−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素（０．５μｇ）、および非結合体化ＡＰＣ（０．５μｇ）を含有する本明細書に記載する２色試薬組成物を使用して調製した同じ検体の、および該２色試薬組成物の効果を示す、二重パラメータヒストグラムを提供するものである。図１Ａおよび１Ｂを図１Ｃおよび１Ｄと対比させる。
【図２Ａ】図２Ａは、ＣＤ３−ＡＰＣ（０．５μｇ）およびＣＤ１９−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素（０．５μｇ）を含有する先行技術の２色試薬組成物、すなわち「先行技術の作りたて混合物」を使用して新たに調製した対照検体の、二重パラメータ蛍光ヒストグラムを提供するものである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＣＤ３−ＡＰＣ（０．５μｇ）およびＣＤ１９−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素（０．５μｇ）を含有し、ならびに２から８℃で２１日間保持された、先行技術の２色試薬組成物、すなわち「先行技術の保管混合物」を使用する検体の、二重パラメータ蛍光ヒストグラムを提供するものである。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＣＤ３−ＡＰＣ（０．５μｇ）、ＣＤ１９−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素（０．５μｇ）、および０．０６２５μｇの天然の、非結合体化ＡＰＣを含有し、ならびに２から８℃で２１日間保持された、本明細書に記載する２色試薬組成物を使用する検体の二重パラメータ蛍光ヒストグラムを提供するものである。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＣＤ３−ＡＰＣ（０．５μｇ）、ＣＤ１９−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素（０．５μｇ）、および０．１２５μｇの天然の、非結合体化ＡＰＣを含有し、ならびに２から８℃で２１日間保持された、本明細書に記載する２色試薬組成物を使用する検体の二重パラメータ蛍光ヒストグラムを提供するものである。
【図２Ｅ】図２Ｅは、ＣＤ３−ＡＰＣ（０．５μｇ）、ＣＤ１９−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素（０．５μｇ）、および０．２５μｇの天然の、非結合体化ＡＰＣを含有し、ならびに２から８℃で２１日間保持された、本明細書に記載する２色試薬組成物を使用する検体の二重パラメータ蛍光ヒストグラムを提供するものである。
【図２Ｆ】図２Ｆは、ＣＤ３−ＡＰＣ（０．５μｇ）、ＣＤ１９−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素（０．５μｇ）、および０．５μｇの天然の、非結合体化ＡＰＣを含有し、ならびに２から８℃で２１日間保持された、本明細書に記載する２色試薬組成物を使用する検体の二重パラメータ蛍光ヒストグラムを提供するものである。
【図２Ｇ】図２Ｇは、ＣＤ３−ＡＰＣ（０．５μｇ）、ＣＤ１９−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素（０．５μｇ）、および２．０μｇの天然の、非結合体化ＡＰＣを含有し、ならびに２から８℃で２１日間保持された、本明細書に記載する２色試薬組成物を使用する検体の二重パラメータ蛍光ヒストグラムを提供するものである。
【図２Ｈ】図２Ｈは、ＣＤ３−ＡＰＣ（０．５μｇ）、ＣＤ１９−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素（０．５μｇ）、および５．０μｇの天然の、非結合体化ＡＰＣを含有し、ならびに２から８℃で２１日間保持された、本明細書に記載する２色試薬組成物を使用する検体の二重パラメータ蛍光ヒストグラムを提供するものである。
【図２Ｉ】図２Ｉは、ＣＤ３−ＡＰＣ（０．５μｇ）、ＣＤ１９−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素（０．５μｇ）、および１０μｇの天然の、非結合体化ＡＰＣを含有し、ならびに２から８℃で２１日間保持された、本明細書に記載する２色試薬組成物を使用する検体の二重パラメータ蛍光ヒストグラムを提供するものである。図２Ａおよび２Ｂと２Ｃから２Ｉとの比較により、先行技術のものに対する本明細書に記載する組成物の安定性向上が示される。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｊは、２つの異なる蛍光色素の蛍光強度を同じ全血検体の様々な細胞集団についてプロットしている、３色試薬組成物を使用することによって得た二重パラメータヒストグラムである。図３Ａおよび３Ｂは、ＣＤ４−ＸＬ−４−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００タンデム色素、ＣＤ１９−ＡＰＣおよびＣＤ８−ＸＬ−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素を含有する先行技術の組成物、すなわち「先行技術の作りたて混合物」を使用して新たに調製した検体の、蛍光ヒストグラムを提供するものである。図３Ｅ〜３Ｊのものとの比較のために、これらのヒストグラムを提供する。
【図３Ｂ】図３Ａおよび３Ｂは、ＣＤ４−ＸＬ−４−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００タンデム色素、ＣＤ１９−ＡＰＣおよびＣＤ８−ＸＬ−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素を含有する先行技術の組成物、すなわち「先行技術の作りたて混合物」を使用して新たに調製した検体の、蛍光ヒストグラムを提供するものである。図３Ｅ〜３Ｊのものとの比較のために、これらのヒストグラムを提供する。
【図３Ｃ】図３Ｃおよび３Ｄは、ＣＤ４−ＸＬ−４−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００タンデム色素、ＣＤ１９−ＡＰＣおよびＣＤ８−ＸＬ−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素を含有し、ならびに２から８℃で１２０日間保持された先行技術の組成物、すなわち「先行技術の保管混合物」を使用する検体の、蛍光ヒストグラムを提供するものである。図３Ｅ〜３Ｊのものとの比較のために、これらのヒストグラムを提供する。
【図３Ｄ】図３Ｃおよび３Ｄは、ＣＤ４−ＸＬ−４−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００タンデム色素、ＣＤ１９−ＡＰＣおよびＣＤ８−ＸＬ−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素を含有し、ならびに２から８℃で１２０日間保持された先行技術の組成物、すなわち「先行技術の保管混合物」を使用する検体の、蛍光ヒストグラムを提供するものである。図３Ｅ〜３Ｊのものとの比較のために、これらのヒストグラムを提供する。
【図３Ｅ】図３Ｅおよび３Ｆは、ＣＤ４−ＸＬ−４−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００タンデム色素、ＣＤ１９−ＡＰＣおよびＣＤ８−ＸＬ−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素および０．５μｇの天然の、非結合体化ＡＰＣを含有し、ならびに２から８℃で１２０日間保持された、本明細書に記載するとおりの組成物を使用する検体の蛍光ヒストグラムを提供するものである。
【図３Ｆ】図３Ｅおよび３Ｆは、ＣＤ４−ＸＬ−４−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００タンデム色素、ＣＤ１９−ＡＰＣおよびＣＤ８−ＸＬ−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素および０．５μｇの天然の、非結合体化ＡＰＣを含有し、ならびに２から８℃で１２０日間保持された、本明細書に記載するとおりの組成物を使用する検体の蛍光ヒストグラムを提供するものである。
【図３Ｇ】図３Ｇおよび３Ｈは、ＣＤ４−ＸＬ−４−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００タンデム色素、ＣＤ１９−ＡＰＣおよびＣＤ８−ＸＬ−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデムおよび１．０μｇの天然の、非結合体化ＡＰＣを含有し、ならびに２から８℃で１２０日間保持された、本明細書に記載するとおりの組成物を使用する検体の蛍光ヒストグラムを提供するものである。
【図３Ｈ】図３Ｇおよび３Ｈは、ＣＤ４−ＸＬ−４−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００タンデム色素、ＣＤ１９−ＡＰＣおよびＣＤ８−ＸＬ−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデムおよび１．０μｇの天然の、非結合体化ＡＰＣを含有し、ならびに２から８℃で１２０日間保持された、本明細書に記載するとおりの組成物を使用する検体の蛍光ヒストグラムを提供するものである。
【図３Ｉ】図３Ｉおよび３Ｊは、ＣＤ４−ＸＬ−４−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００タンデム色素、ＣＤ１９−ＡＰＣおよびＣＤ８−ＸＬ−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素および２．０μｇの天然の、非結合体化ＡＰＣを含有し、ならびに２から８℃で１２０日間保持された、本明細書に記載するとおりの組成物を使用する検体の蛍光ヒストグラムを提供するものである。
【図３Ｊ】図３Ｉおよび３Ｊは、ＣＤ４−ＸＬ−４−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００タンデム色素、ＣＤ１９−ＡＰＣおよびＣＤ８−ＸＬ−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素および２．０μｇの天然の、非結合体化ＡＰＣを含有し、ならびに２から８℃で１２０日間保持された、本明細書に記載するとおりの組成物を使用する検体の蛍光ヒストグラムを提供するものである。
【図４】図４は、様々な架橋度を有するＳｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓから単離したＡＰＣサンプルの、ならびにＳｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓから単離した架橋を有さない一（１）つのＡＰＣサンプルの、サイズ排除クロマトグラフィー保持容積に対する波長（Ａ２８０）のプロットを提供するものである。前記ＡＰＣの架橋率は、溶出ピーク下面積を計算することによって決定した。クロマトグラムにおける全面積に対するインタクトピークの積分面積の比によってサンプルについての架橋率を得た。このプロットの右側の最高ピークは、前記一（１）つの非架橋ＡＰＣサンプルに対応する。このプロットの残りのピークは、前記架橋ＡＰＣサンプルに対応する。具体的には、このプロットの左側のピークは、インタクトＡＰＣ分子に対応し、およびこのプロットの右側の（非架橋ＡＰＣピークの下の）小ピークは、ＡＰＣサブユニットに対応する。
【図５】図５は、フィコビリタンパク質と蛍光発生性（ｆｌｕｏｒｅｓｃａｂｌｅ）色素とを含むタンデム色素で標識したリガンドを、フィコビリタンパク質で直接標識したリガンドと共に保管したときに経時的に発生するサブユニット交換を示す略図である。山括弧（＾）は、架橋を表し、Ｌ１は、第一のリガンドを表し、Ｌ２は、第二のリガンドを表し、「色素」は、蛍光発生性色素を表し、「α」は、フィコビリタンパク質の１つのサブユニットを表し、および「β」は、フィコビリタンパク質の第二のサブユニットを表す。用語「架橋」またはその変化形は、容易に破壊されない共有結合による分子ユニットの連結を指す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本明細書に記載する組成物および方法は、マルチカラー試薬処方物中のフィコビリタンパク質含有タンデム色素の分解または不安定性に関連した困難に対する解決策をもたらす。
【００１５】
本出願の発明者らは、一緒に保管したフィコビリタンパク質およびそれらのタンデム色素への異なる抗体の結合体を含有する組成物を使用してこの問題を確認した。具体的には、異なる抗体に結合体化したアロフィコシアニン（ＡＰＣ）およびＡＰＣ−タンデム色素（例えば、ＡＰＣ．ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００、ＡＰＣ．ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０、ＡＰＣ．Ｃｙ（登録商標）７など）の結合体を、マルチカラー処方物において一緒に保管し、生物検体と併せ、その後、フローサイトメトリーを用いてそのサンプルを分析したとき、上に記載した「困難」が観察された。それらの蛍光ヒストグラムでは、別々に保管した同じ試薬の新たな混合物を他の点では同一の条件下で使用したときの蛍光ヒストグラムと比較して、補正要求（ブリード・オーバー（ｂｌｅｅｄ ｏｖｅｒ））の漸進的増加が観察された。フィコエリトリン（ＰＥ）およびＰＥ系タンデム色素（例えば、ＰＥ−Ｔｅｘａｓ ＲｅｄＴＭ、ＰＥＣｙ（登録商標）５、ＰＥＣｙ（登録商標）５．５、ＰＥ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７、ＰＥ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００およびＰＥＣｙ（登録商標）７）の抗体結合体を使用したときも、類似した観察がなされた。
【００１６】
理論により拘束されることを望まないが、本発明者らは、フィコビリタンパク質を含有するリガンド−タンデム色素結合体とリガンド−フィコビリタンパク質結合体との間で、それらが混合状態にあるとき、発生するサブユニット交換が、該タンデム色素と該直接結合体化フィコビリタンパク質との間での補正要求の望ましくない増加（ブリード・オーバー）を生じさせる結果となると推測した。本発明者らは、架橋フィコビリタンパク質の結合体、例えばＸＬ．ＡＰＣ、と架橋タンデム色素の対応する結合体、例えば、ＸＬ．ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０、とを併せ、約２から約８℃の温度で保持したとき、個々のフィコビリタンパク質分子のサブユニットが交換するようであることに気づいた。例として、本発明者らは、ＣＤ３−ＡＰＣをＣＤ１９−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０と混合し、ある期間にわたって約２から約８℃で保持したとき、蛍光ヒストグラムによって証明されるように、ＣＤ３−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０およびＣＤ１９−ＡＰＣ結合体が形成されたようであることに気づいた。
【００１７】
このフィコビリタンパク質サブユニット交換の１つの態様を図５において図によって明らかにする。勿論、図５に示すリガンドおよび／または蛍光発生性色素の１つ以上を架橋サブユニットまたは非架橋サブユニットに結合体化し得ること、ならびにこのサブユニット交換の様々な変更形態が同じ溶液中で発生し得ることは、当業者には理解される。
【００１８】
アロフィコシアニンＢ（ＡＰＣ−Ｂ）とアロフィコシアニン（ＡＰＣ）（両方とも、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ６３０１、シアノバクテリウム、から単離されたものである）の間のサブユニット交換は、文献において論じられている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５６，１２６００（１９８１）参照）。要約すると、ＡＰＣ−ＢとＡＰＣの混合物では、異種三量体がサブユニット交換によってほぼ統計量で形成されることが書き留められている。例えば、ＡＰＣが、個々のサブユニットの構造およびアミノ酸配列に基づき疎水性相互作用ならびに水素およびイオン結合の組み合わせによって会合している３つのα−サブユニットおよび３つのβ−サブユニットを含む四量体構造を有することは公知である。低濃度で、低ｐＨ条件で、および１つ以上のカオトロピックイオンに曝露されたとき、ＡＰＣがそのサブユニット（α−βモノマーならびにαおよびβ成分）に解離することも公知である。本明細書において用いる場合の用語「カオトロピックイオン」は、分子内相互作用の安定化に干渉することによりフィコビリタンパク質の三次元構造を破壊する作用因子を指す。架橋ＡＰＣ組成物は、様々な販売元（数ある中でも、Ｐｒｏｚｙｍｅ Ｉｎｃ．およびＭａｒｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって報告され、市販されている。
【００１９】
本発明者らは、この望ましくないサブユニット交換問題に対処するために本明細書において論じる新規試薬組成物を考案した。本発明者らは、リガンド結合体化フィコビリタンパク質タンデム色素を含有する試薬組成物に、該リガンド結合体化タンデム色素におけるフィコビリタンパク質と同じ細菌種からのものであるか、またはそれらとサブユニット交換することができる、非結合体化フィコビリタンパク質を添加することによって、比較的安定な試薬組成物が得られることを発見した。上の概要において述べた、および下で詳細に論ずるようなこれらの安定な色素組成物の様々な実施形態により、生物検体分析用の先行技術のマルチカラー組成物について本発明者が確認した安定性の問題は解決される。本明細書に記載する組成物の様々な実施形態は、次の標識リガンドを含有することがある：（ａ）フィコビリタンパク質を含有するタンデム色素に結合体化した少なくとも１つのリガンド；（ｂ）場合により、フィコビリタンパク質に直接結合体化した１つ以上のリガンド；および（ｃ）場合により、フィコビリタンパク質ではない蛍光性色素または標識に結合体化した１つ以上のリガンド。前記組成物は、タンデム色素に結合体化したリガンドのフィコビリタンパク質とサブユニットを交換する少なくとも１つの非結合体化フィコビリタンパク質も、別の成分として含有する。
【００２０】
本明細書において用いる場合の用語「安定な」は、生物検体との混合前および／または後の本発明の組成物を指す。１つの実施形態において、「安定な」は、生物検体に添加し、その後、蛍光を用いて細胞集団についてそれを分析したとき、蛍光特性に有意な変化を生じさせる結果とならない、本明細書に記載する組成物を指す。望ましくは、「安定な」は、リガンド結合体化タンデム色素の蛍光特性、および任意の他のリガンド結合体化フィコビリタンパク質の蛍光特性が、混合後に変化しない組成物を指す。さらなる実施形態において、前記組成物は、その成分を混合した直後および生物検体と混合する前に「安定」している。もう１つの実施形態において、前記組成物は、混合後少なくとも１週間から約５２週間まで約２から約８℃で保管した後、「安定」している。追加の例として、そのような組成物は、混合後少なくとも４、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、または５１週間、安定している。
【００２１】
望ましくは、前記組成物は、それらの保管または取扱いに必要な任意の温度で安定している。１つの実施形態において、前記組成物は、低温、すなわち室温より低い温度、で安定している。もう１つの実施形態において、前記組成物は、約２から約１０℃で安定している。特定の実施形態において、前記組成物は、約２、３、４、５、６、７、８、９または１０℃で安定している。さらにもう１つの実施形態において、前記組成物は、室温で安定している。いっそうさらなる実施形態において、前記組成物は、高温、すなわち室温より高い温度、で安定している。
【００２２】
本明細書に記載する新規色素組成物を細胞および非細胞分析のための方法において用いたとき、リガンド結合体化タンデム色素、またはリガンド結合体化フィコビリタンパク質、いずれかで標識した細胞の蛍光特性に関して、低減されたブリードオーバーが観察されたか、または新たに調製した組成物に比べてブリードオーバーは観察されなかった。例えば、本図面、および本明細書の中で提供する実施例を参照のこと。さらに、前記色素組成物は、誤ったデータの減少、より少ない廃棄色素組成物に起因する費用低減、および作りたて色素組成物（作りたて対照組成物を含む）を連続調製するために必要とされる時間の低減をもたらした。
【００２３】
（Ｉ．定義）
以下の定義を提供する。以下の定義は、当該技術分野において広範に利用できる情報を含む。ある用語の例を提供する場合、それは、網羅的であることを意図したものではなく、当該技術分野において公知のまたは利用できる他の例を含むことがある。従って、そのような例は、本発明の限定を意味するものではない。
【００２４】
（Ａ．「検体」）
本明細書において用いる場合の「検体」は、細胞および／または非細胞集団を含有する任意の哺乳動物細胞含有懸濁物、すなわち生物検体、である。特定の実施形態において、検体を提供する哺乳動物はヒトであるが、他の非ヒト哺乳動物からの検体も用いることができる。用語「細胞の」および「非細胞の」は、当業者には容易に理解される。細胞または非細胞集団の少なくとも１つは、上で記載した組成物に用いられる異なるリガンドそれぞれについての受容体を必要とする。典型的「細胞」集団としては、限定ではないが、血液学的細胞および非血液学的細胞が挙げられる。そのような検体としては、限定ではないが、全血、末梢血、骨髄吸引液、リンパ節組織、脾臓組織、脳脊髄液、皮膚組織、粘膜組織、胸腔穿刺液、胸膜液、および脊髄液が挙げられる。血液学的（すなわち血液）細胞集団は、単球、リンパ球、好中球、好酸球、好塩基球、骨髄球、後骨髄球、前骨髄球、未成熟顆粒球、杵状球（ｂａｎｄ）、芽球、変異（ｖａｒｉａｎｔ）リンパ球および異型（ａｔｙｐｉｃａｌ）リンパ球の中から選択される。非白血球血液学的細胞集団としては、赤血球、網状赤血球、有核赤血球、血小板、網状血小板および巨核球が挙げられる。血液中の異型細胞としては、骨髄球、後骨髄球、前骨髄球、未成熟顆粒球、杵状球（ｂａｎｄ ｃｅｌｌｓ）、芽球、異形リンパ球、変異リンパ球、有核赤血球、巨大血小板、血漿細胞などが挙げられる。非血液学的細胞としては、数ある中でも、上皮細胞および内皮細胞が挙げられる。典型的な「非細胞」集団としては、限定ではないが、数ある中でも、ビーズ、タンパク質、微粒子、ミクロソームが挙げられる。
【００２５】
１つの実施形態において、検体は、単球、リンパ球、好中球、好酸球および好塩基球である５つの「正常」な白血球集団を含有し、ならびに疾患、有害な環境刺激、例えば発癌性物質、に対する反応、または治療処置の結果に起因する多数の異型細胞集団をことによると含有する、ヒト全血または末梢血検体である。従って、これらの方法による分析に適する検体は、成熟および未成熟両方の白血球および非白血球集団、ならびに異型細胞を含有し得る可能性が高いヒト患者血液検体である。１つの例では、検体は、芽球を含有する。さらなる例では、検体は、有核赤血球を含有する。もう１つの例として、検体は、未成熟顆粒球を含有する。さらにもう１つの例として、検体は、異形リンパ球を含有する。異常検体中の細胞の他の組み合わせも、本明細書に記載する方法および組成物によって分析することができる。
【００２６】
（Ｂ．「リガンド」）
本明細書に記載する組成物のすべての実施形態において、用語「リガンド」は、細胞または非細胞粒子の表面に存在する受容体に結合する部分（例えば、抗体）を指す。１つの実施形態において、リガンドを、上で記載したタンデム色素のフィコビリタンパク質「に結合体化させる」、「と会合させる」または「に結合させる」。当業者は、当該技術分野における方法により、タンデム色素をモノクローナル抗体などのリガンドに容易に結合体化させることができる。１つの実施形態では、前記タンデム色素を、該色素のイミノチオラン活性化によって、前記リガンドに結合体化させる。
【００２７】
本明細書において用いる場合、リガンドは、１つ以上の特定の受容体を検出して該受容体と反応する様々な作用因子を含む。すべての適するリガンドは、粒子集団の特定受容体を結合する望ましい能力を特徴とする。１つの実施形態において、前記リガンドは、細胞表面受容体のすべてまたは一部分に優先的に結合する成分である。典型的に、前記リガンドは、単離することができ、および自然に存在することがあり、または組換え生産することができ、または人工のもしくは合成のものであり得る、アミノ配列または核酸配列を含有する。１つの実施形態において、前記リガンドは、タンパク質、例えば抗体もしくは酵素、またはそれらのフラグメントである。もう１つの実施形態において、前記リガンドは、核酸プローブである。さらに他の実施形態において、前記リガンドは、多分子集合体、例えば組換えタンパク質の四量体、である。そのようなリガンドの構築に有用な方法は、当業者に公知である。
【００２８】
慣例的には、細胞分析のために、細胞表面決定基に対する抗体または抗体フラグメントが、一般に好まれるリガンドである。本明細書において用いる場合の用語「抗体」は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥのポリクローナル、モノクローナル、合成または組換え抗体を包含することを意図したものである。抗体フラグメントも有用であり、抗体フラグメントとしては、限定ではないが、上のインタクト抗体の１つ以上についてのＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントまたはＦｃ抗体フラグメントが挙げられる。類似して、一本鎖可変抗体フラグメントまたは抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む組換え構築物をこれらの方法において有用なリガンドとして用いることができる。さらに、所望の細胞表面抗原を結合する抗体の機能的に等価の結合特性を保持するために十分なＣＤＲを共有する合成抗体またはキメラ抗体またはヒト化抗体構築物も、一般に好まれるリガンドとして利用することができる。
【００２９】
１つの実施形態において、本明細書に記載する組成物に使用するための個々のリガンドまたは抗体は、選択された検体中の細胞集団上で差次的に発現される抗原決定基にそれぞれ結合するものであり、ならびに光散乱および／または電気的パラメータとの特定の組み合わせによって所望の差次的情報が得られるように選択される。例えば、１つの実施形態において、本明細書において有用な抗体は、白血球および非白血球の集団上で差次的に発現される抗原決定基に結合する。そのような抗原決定基は、非白血球には完全になく、白血球上でしか発現されない場合がある。あるいは、そのような抗原決定基は、白血球上で豊富に発現され、非白血球上で最小限にしか発現されないことがある。従って、そのような抗体は、白血球と非白血球、例えば赤血球（ＲＢＣ）、有核赤血球または血小板、を識別および差別化することができる。さらに他の実施形態は、同じ細胞タイプまたは集団上の異なる決定基を結合する１つより多くの抗体を用いる。従って、同じ細胞タイプまたは集団上の異なる決定基を結合する異なる抗体の組み合わせを、細胞集団上の１つの決定基を結合する単一の抗体の代わりに用いることができる。もう１つの実施形態において、そのような抗体（または抗体の組み合わせ）は、白血球が成熟および加齢するにつれての該白血球上の抗原決定基の差次的発現に基づき、成熟白血球と未成熟白血球とを区別することもできる。
【００３０】
本明細書に記載する組成物においてリガンドとして有用な、および血液学的分析のために有用な抗体としては、限定ではないが、当該技術分野に公知であるものの中でもとりわけ、抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ５、抗ＣＤ７、抗ＣＤ８、抗ＣＤ９、抗ＣＤ１０、抗ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、抗ＣＤ１３、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ１５、抗ＣＤ１６、抗ＣＤ１６ｂ、抗ＣＤ１８、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２３、抗ＣＤ２４、抗ＣＤ２５、抗ＣＤ３３、抗ＣＤ３５、抗ＣＤ３６、抗ＣＤ３８、抗ＣＤ４１、抗ＣＤ４５、抗ＣＤ４５ＲＡ、抗ＣＤ４８、抗ＣＤ４９ｄ、抗ＣＤ５０、抗ＣＤ５２、抗ＣＤ５３、抗ＣＤ５５、抗ＣＤ５６、抗ＣＤ５９、抗Ｃｄ６１、抗ＣＤ６２Ｌ、抗ＣＤ６２ｐ、抗ＣＤ６４、抗ＣＤ６６ｂ、抗ＣＤ６６ｃ、抗ＣＤ７３、抗ＣＤ８２、抗ＣＤ８７、抗ＣＤ９０、抗ＣＤ１１７、抗ＣＤ１４２、抗ＣＤ２３５ａ、抗ＣＤ２３５ｂ、抗ＣＤ２３５ｃ、抗ＣＤ２３６、抗ＣＤ２３６ｒ、抗ＣＤ２３９、抗ＣＤ２４０、抗ＣＤ２４１、抗ＣＤ２４２、抗ｇｐ４２、抗ＬＹ−６、抗ＲＴ ６、抗ＳＣＡ−２、抗Ｋａｐｐａ、抗Ｌａｍｂｄａ、および抗ＨＬＡ−ＤＲが特に挙げられる。前記組成物中の特定のリガンド（単数または複数）の選択によって本発明が限定されないこと、および当業者が、前記組成物に含めるために、本明細書に具体的に列挙しない他のリガンドまたは抗体を選択し利用できるだろうということは、容易に理解される。
【００３１】
前記組成物は、１つ以上のリガンドを含有する。１つの実施形態において、前記組成物は、２つ以上のリガンドを含有する。もう１つの実施形態において、前記組成物は、３つ以上のリガンドを含有する。さらなる実施形態において、前記組成物は、４つ以上のリガンドを含有する。さらにもう１つの実施形態において、前記組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のリガンドを含有する。単一の試薬組成物において用いることができるリガンドの「最大」数がないこと、ならびにその選択が利用する試薬および計器の能力に依存することは、当業者には容易に理解される。
【００３２】
単一の組成物中に存在するリガンドは、同じであることもあり、または異なることもある。１つの実施形態において、前記組成物は、２つのリガンドを含有し、それらのリガンドは同じである（Ｌ１およびＬ１）。もう１つの実施形態において、前記組成物は、２つのリガンドを含有し、それらのリガンドは異なる（Ｌ１およびＬ２）。さらなる実施形態において、前記組成物は、３つのリガンドを含有し、それらのリガンドのすべてが同じである（Ｌ１、Ｌ１、およびＬ１）。なおまたさらなる実施形態において、前記組成物は、３つのリガンドを含有し、３つすべてのリガンドが異なる（Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３）。さらにもう１つの実施形態において、前記組成物は、３つのリガンドを含有し、それらのリガンドのうちの２つが同じであり、１つのリガンドが異なる（Ｌ１、Ｌ１およびＬ２）。さらなる実施形態において、前記組成物は、４つのリガンドを含有し、それらのリガンドのすべてが同じである（Ｌ１、Ｌ１、Ｌ１、Ｌ１）。なおまたさらなる実施形態において、前記組成物は、４つのリガンドを含有し、それらのリガンドの４つすべてが異なる（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４）。さらにもう１つの実施形態において、前記組成物は、４つのリガンドを含有し、それらのリガンドのうちの任意の２つが同じであり、および他の２つは同じであるが、最初の２つのリガンドとは異なる（Ｌ１、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ２）。なおまたさらなる実施形態において、前記組成物は、４つのリガンドを含有し、それらのリガンドのうちの任意の３つは同じであり、第四のリガンドが異なる（Ｌ１、Ｌ１、Ｌ１、およびＬ２）。同様の数列を、５つ以上のリガンドを含有する組成物に用いることができ、当業者はそれを容易に決定できる。下記方程式を参照のこと（式中、ｎは、リガンドの総数であり、ｒは、他のものと異なるリガンドの数であり、および０≦ｒ≦ｎ）。
【００３３】
【化１】
本明細書に記載する組成物または方法において使用するために選択されるそれぞれのリガンドを、蛍光色素または蛍光性色素と呼ばれる蛍光検出可能標識と会合させるか、該標識に結合体化させるか、または該標識に結合させる。そのような蛍光色素または蛍光性色素には、フィコビリタンパク質；フィコビリタンパク質である場合もあり、ない場合もあるパートナー色素に結合体化した、フィコビリタンパク質を用いるタンデム色素；ならびにリガンドを標識するために従来用いられている他の色素などがある。本明細書に記載する組成物の実施形態のすべてにおいて、少なくとも１つのリガンドを、フィコビリタンパク質を含有するタンデム色素に結合体化させる。他の実施形態では、加えて、少なくとも１つのフィコビリタンパク質または他の蛍光性色素を、リガンドに直接結合させる。
【００３４】
選択された蛍光色素とリガンドを会合、結合体化またはカップリングさせるための方法は、同様に従来的であり、当業者に公知である。公知の蛍光色素取付け法は、記載されている（例えば、数ある中でも、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，第６版，Ｒ．Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，１９９６；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，１９９４／１９９５；米国特許第６，６９２，９６８号および同第５，１６４，３１１号を参照のこと（これらは、参照により本明細書に援用されている））。従って、タンデム色素またはフィコビリタンパク質または他の非フィコビリタンパク質色素のカップリング方法の選択により、本明細書に記載する組成物は限定されない。同様に、タンデム色素の成分を結合体化させる方法は、従来的であり、当該技術分野に公知である。
【００３５】
前記方法において使用されるリガンドの最適な濃度は、選択されるリガンドに基づいて規定され、当業者はそれを決定できる。
【００３６】
（Ｃ．「タンデム色素」）
本明細書に記載する組成物の実施形態のすべてにおいて、フィコビリタンパク質を含有するタンデム色素に少なくとも１つのリガンドを結合体化させる。当業者に公知のとおり、および本明細書において用いる場合の用語「タンデム色素」は、本明細書において「パートナー」色素と呼ぶ別の蛍光性色素に結合体化した、そのサブユニット間にある程度の架橋を有するフィコビリタンパク質で構成された自然に存在しない分子を指す。様々な公知のおよび市販されているタンデム色素を本記載組成物に用いることができる。
【００３７】
本明細書における組成物に有用なタンデム色素の例は、米国特許第４，５４２，１０４号；同第５，２７２，２５７号；および同第５，１７１，８４６号；Ａ．Ｓ．Ｗａｇｇｏｎｅｒら、１９９３ Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６７７：１８５−１９３；Ｍ．Ｒｏｅｄｅｒｅｒら、１９９６ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２４：１９１−１９７に記載されており、これらは参照により本明細書に援用されている。１つの望ましい実施形態において、前記タンデム色素は、アロフィコシアニンとＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００色素のタンデム色素、アロフィコシアニンとＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０色素のタンデム色素、アロフィコシアニンとＣｙ（登録商標）７色素のタンデム色素、フィコエリトリンとＴｅｘａｓ ＲｅｄＴＭ色素のタンデム色素、フィコエリトリンとＣｙ（登録商標）５色素のタンデム色素、フィコエリトリンとＣｙ（登録商標）５．５色素のタンデム色素、フィコエリトリンとＣｙ（登録商標）７色素のタンデム色素、およびアロフィコシアニンとＨ７ＴＭ色素のタンデム色素である。
【００３８】
１つの特定の実施形態において、前記タンデム色素は、ＡＰＣ．ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００色素である。もう１つの特定の実施形態において、前記タンデム色素は、ＡＰＣ．ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０色素である。さらにもう１つの特定の実施形態において、前記タンデム色素は、ＡＰＣ．Ｃｙ（登録商標）７色素である。
【００３９】
（Ｄ．「フィコビリタンパク質」）
当業者に公知のとおり、および本明細書において用いる場合のフィコビリタンパク質は、細菌または真核藻から単離される２つ以上の連結されたサブユニットで構成された蛍光タンパク質であり、血液学的分析に広範に用いられている。参照により本明細書に援用されている「Ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｒｏｂｅｒｔ ＭａｃＣｏｌｌ ａｎｄ Ｄｅｂｏｒａｈ Ｇｕａｒｄ−Ｆｒｉａｒ，ＣＲＳ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）を参照のこと。フィコビリタンパク質は、当該技術分野において、限定ではないが、数ある中でも、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｓｉｇｍａ、およびＰｒｏｚｙｍｅをはじめとする販売元から、幅広く入手できる。
【００４０】
１つの実施形態では、前記フィコビリタンパク質を細菌種から単離することができる。一定のフィコビリタンパク質は、シアノバクテリウムから単離される。フィコビリタンパク質を発現することができるシアノバクテリア種の例としては、限定ではないが、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｏｌａｃｅｕｓ、Ｔｏｌｙｐｏｔｈｒｉｘ ｔｅｎｕｉｓ、またはＬｙｎｇｂｙａ ｌａｇｅｒｈｅｉｍｉｉが挙げられる。さらなる実施形態では、前記フィコビリタンパク質を真核藻種から単離することができる。
【００４１】
１つの実施形態において、前記フィコビリタンパク質は、限定ではないが、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、フィコシアニン（ＰＣ）、およびフィコエリスロシアニン（ＰＥＣ）である。さらなる実施形態において、前記フィコビリタンパク質は、Ｒ−フィコエリトリン（ＲＰＥ）、Ｂ−フィコエリトリン（ＢＰＥ）、Ｃ−フィコエリトリン（ＣＰＥ）、Ｙ−フィコエリトリン（ＹＰＥ）、Ｃ−フィコシアニン（ＣＰＣ）、フィコエリトリン５６６（ＰＥ５６６）、フィコエリスロシアニン（ＰＥＣ）、Ｒ−フィコシアニン（ＲＰＣ）、およびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）である。もう１つの実施形態において、前記フィコビリタンパク質は、アロフィコシアニンである。
【００４２】
（Ｅ．蛍光性色素または蛍光色素）
本明細書において用いる場合、タンデム色素を形成するために、今記載したばかりのフィコビリタンパク質に結合体化させる、「パートナー」と記述するいずれの色素も、非フィコビリタンパク質色素に直接結合体化した１つ以上のリガンドを含有する組成物の実施形態において用いることができる。従って、フィコビリタンパク質以外の蛍光色素、蛍光標識、または蛍光性色素についての以下の記載は、タンデムパートナー色素（これは、一般に、フィコビリタンパク質以外のものである）にも、これらの組成物の自由選択のリガンド成分に直接結合体化した個々の色素にも、あてはまる。これらの組成物および方法の一定の実施形態では、少なくとも１つのフィコビリタンパク質または他の蛍光性色素をリガンドに直接結合させる。タンデム色素についてのドナー−アクセプターペアの望ましい特性は、参照により本明細書に援用されている米国特許第４，５４２，１０４号に記載されている。
【００４３】
それぞれの蛍光性色素は、特性「発光スペクトル」を有し、その一部分が特性「ピーク発光スペクトル」である。本明細書において用いる場合、用語「発光スペクトル」は、蛍光色素が励起されたときに放射する、それぞれの周波数の電磁放射線の量を一般に意味する。一般に、発光スペクトルは、ナノメートルで通常は測定される一定の周波数帯（すなわち波長）によって構成される範囲またはプロフィールである。本明細書において用いる場合、用語「ピーク発光スペクトル」は、発光スペクトルの最大強度部分を意味する。多種多様な色素についての発光スペクトルが当該技術分野において公知であり、ならびに限定ではないが、参照により本明細書に援用されているＳｈａｐｉｒｏ，Ｈｏｗａｒｄ Ｍ．（２００３）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ 第４版，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ ｐｐ．２９６−２９７を含む様々な周知テキストにおいて公表されている。任意の所与の蛍光色素についてのピーク発光スペクトルは、公知であり、ならびにそのような蛍光色素を記載している出版物、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，第６版，Ｒ．Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，１９９６；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，１９９４／１９９５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、および当業者に公知の他の類似のテキストから容易に得ることができ、ならびに参照により本明細書に援用されている。蛍光分光光度計を使用してスペクトルスキャンを行うことにより、任意の所与の蛍光色素についての発光スペクトル特性を得ることもできる。
【００４４】
当業者は、任意の数の追加の、および従来用いられている、蛍光性色素を、タンデム色素の「パートナー」色素として、またはリガンドに直接結合体化させられる色素として、容易に選択することができる。前記パートナーおよび他の色素は、供給源、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲおよびＰｒｏｚｙｍｅ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡから商業的に容易に入手することができる。前記パートナー色素は、市販されており、それらの使用は、当該技術分野において公知である。
【００４５】
さらに他の蛍光性色素が他の供給源から入手可能であり得、または将来開発されることがあり得る。そのような蛍光性色素または蛍光色素は、下の実施例の例示的蛍光性色素と同様にこれらの様々な方法において有用であると予想される。下で提供する蛍光色素のこれらのリストは、前記組成物および方法の実施形態のうちの１つにおいて「パートナー」色素としてのまたはリガンドに直接結合体化した色素としての使用に適する色素の代表的なものにすぎず、網羅的リストを含むことを企図したものではない。当業者は、本明細書の追加の教示にかんがみて本明細書に記載する組成物および方法における使用に適する蛍光色素組み合わせを容易に選択できるはずである。
【００４６】
前記パートナーまたは他の色素が、細胞透過性であることもあり、非細胞透過性である場合もある、蛍光性色素。用語「細胞透過性の」とは、組成物または反応混合物中に透過性化剤（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）の追加の存在を必要とすることなく、細胞膜を容易に透過して細胞の成分を染色する色素を記述するためのものである。もう１つの実施形態において、前記パートナーまたは他の色素が選択され得る蛍光色素は、細胞不透過性色素、例えば、赤色、緑色または青色励起波長領域内の細胞不透過性色素である。
【００４７】
本明細書におけるタンデム色素において用いることができる蛍光性「パートナー」色素、または一定の実施形態においてリガンドに直接結合体化させることができる色素の例としては、限定ではないが、シアニン色素、例えば、Ｃｙ（登録商標）５色素、Ｃｙ（登録商標）５．５色素、およびＣｙ（登録商標）７色素；ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）色素、例えば、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４０５色素、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６１０色素、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９５色素、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７色素、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００色素、およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０色素、およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８色素；Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １２３；Ｔｅｘａｓ ＲｅｄＴＭ色素；ならびにＡｔｔｏＴＭ色素が挙げられる。これらの色素の多く、ならびに本明細書に記載する方法においてタンデム「パートナー」色素としてまたはリガンド（単数もしくは複数）への直接結合体化のための色素として用いることができる他のものが、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．（オレゴン州ユージーン）から市販されている。参照により本明細書に援用されている米国特許第５，５６３，０７０号を参照のこと。
【００４８】
１つの特定の実施形態において、前記蛍光性パートナー色素は、Ｔｅｘａｓ ＲｅｄＴＭ色素、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）色素、シアニン色素、およびＡｔｔｏＴＭ色素から選択される。もう１つの特定の実施形態において、前記ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）色素は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６１０色素、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９５色素、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７色素、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００色素、およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０色素の中から選択される。さらに特定の実施形態において、前記シアニン色素は、Ｃｙ（登録商標）５色素、Ｃｙ（登録商標）５．５色素、およびＣｙ（登録商標）７色素から選択される。
【００４９】
（ＩＩ．フィコビリタンパク質含有組成物）
上で論じたように、本明細書において提供する組成物は、一番単純な実施形態では、フィコビリタンパク質含有タンデム色素に結合体化したリガンドと、非結合体化フィコビリタンパク質とを含有する。
【００５０】
（Ａ．パートナー色素に結合体化したフィコビリタンパク質を含有するタンデム色素）
前記タンデム色素のフィコビリタンパク質成分を、上で述べた任意のフィコビリタンパク質、市販されている任意のフィコビリタンパク質および従来の方法によって調製または精製することができる任意のフィコビリタンパク質から選択することができる。幾つかの架橋サブユニット（および場合により非架橋サブユニットも）を含有するか、または架橋を含有するように修飾される任意のフィコビリタンパク質を、本明細書に記載する組成物および方法においてタンデム色素として用いることができる。
【００５１】
当該技術分野において販売元から入手できるＡＰＣにおける架橋度を決定しようとして、本発明者らは、限定ではないが高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む、当該技術分野において公知の技術を用いた。さらに、当業者は、商業的供給源から入手できるものと一致するかまたはそれより高度な架橋を有するフィコビリタンパク質を得るために、販売元から入手できるＡＰＣにおいて公知の精製および架橋技術を実行することが容易にできる。より高度に架橋したフィコビリタンパク質を精製または獲得するそのような方法は、当業者に公知である。そのような従来の方法としては、Ｔｒｉｎｑｕｅｔ Ｅ．，Ｍａｕｒｉｎ Ｆ．，Ｐｒｅａｕｄａｔ Ｍ．，Ｍａｔｈｉｓ Ｇ．（２００１）「Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ １ ａｓ ａ Ｎｅａｒ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ ｉｎ ａ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ」，Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９６，２３２−２４４が挙げられる。
【００５２】
１つの実施形態において、前記タンデム色素のフィコビリタンパク質成分は、少なくとも約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、７６、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％、またはそれらの間の分数百分率、の架橋を含有する。もう１つの実施形態において、前記タンデム色素のフィコビリタンパク質成分は、約５０％から約１００％架橋を含有する。さらなる実施形態において、前記タンデム色素のフィコビリタンパク質成分は、約６０％から約１００％架橋を含有する。さらにもう１つの実施形態において、前記タンデム色素のフィコビリタンパク質成分は、約７０％から約１００％架橋を含有する。なおまたさらなる実施形態において、前記タンデム色素のフィコビリタンパク質成分は、約８０％から約１００％架橋を含有する。さらにもう１つの実施形態において、前記タンデム色素のフィコビリタンパク質成分は、約９０％から約１００％架橋を含有する。いっそうさらなる実施形態において、前記タンデム色素のフィコビリタンパク質成分は、約９５％から約１００％架橋を含有する。しかし、前記タンデム色素のフィコビリタンパク質成分が２０％未満の架橋を有したとしても、それは本発明の制限ではない。
【００５３】
タンデム色素を形成するためにフィコビリタンパク質に結合体化させる蛍光性「パートナー」色素は、上に記載した色素から選択することができる。本明細書に記載する方法および組成物の様々な実施形態によると、リガンド（単数または複数）に結合体化させる、タンデム色素におけるパートナー色素として使用する色素は、別のフィコビリタンパク質を有するタンデム色素においても使用することができ、またはその組成物中のリガンドを独立して標識するために使用することもできる。
【００５４】
（Ｂ．非結合体化フィコビリタンパク質）
上で論じた標識リガンドに加えて、本明細書に記載する組成物の実施形態は、非結合体化フィコビリタンパク質の存在も必要とする。本明細書において用いる場合の「非結合体化」または「遊離」フィコビリタンパク質は、上で記載したフィコビリタンパク質であるが、リガンドに結合体化していないものである。非結合体化フィコビリタンパク質は、サブユニットを含有し、これらのサブユニットのうちのいくつかは、架橋していてはいけない。１つの実施形態において、前記非結合体化フィコビリタンパク質は、そのサブユニット間の架橋を含有しない。もう１つの実施形態において、前記非結合体化フィコビリタンパク質は、サブユニット間の架橋を含有する。前記非結合体化フィコビリタンパク質に架橋が存在する場合、前記非結合体化フィコビリタンパク質中の架橋の量は、前記タンデム色素の結合体化フィコビリタンパク質における架橋の量より少ないことが望ましい。
【００５５】
１つの実施形態では、前記非結合体化フィコビリタンパク質を、前記タンデム色素の結合体化フィコビリタンパク質と同じ細菌または真核藻種から得なければならない。最良の結果のために、それぞれのリガンド結合体化タンデム色素について、（前記タンデム色素中のフィコビリタンパク質と同じ種から得た）対応する非結合体化フィコビリタンパク質をその組成物に添加しなければならない。１つの実施形態において、前記非結合体化フィコビリタンパク質は、前記結合体化フィコビリタンパク質と同じである。用語「同じ」は、結合体化および非結合体化フィコビリタンパク質を記述するために用いるとき、それぞれの分子の同一の構造的特徴を指す。
【００５６】
もう１つの実施形態において、前記非結合体化フィコビリタンパク質は、前記タンデム色素の結合体化フィコビリタンパク質とは異なるが、前記タンデム色素のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する。
【００５７】
前記非結合体化フィコビリタンパク質は、上で述べた販売元から購入することもでき、または上に記載したように、単離されたタンパク質、天然タンパク質、合成タンパク質、または修飾タンパク質である場合がある。しかし、フィコビリタンパク質の供給源またはここでの使用のためにそれに施される修飾の量は、本発明の制限ではない。前記非結合体化フィコビリタンパク質を、その蛍光を除去するかまたは減少させるように改変または修飾することもできる。１つの実施形態では、前記非結合体化フィコビリタンパク質を、例えばＵＶ光の照射によって、フォトブリーチ（ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈ）する。もう１つの実施形態では、前記フィコビリタンパク質を、化学的に、すなわち１〜３％Ｃｌｏｒｏｘ（登録商標）試薬を使用することにより、ブリーチ（ｂｌｅａｃｈ）することができる。当業者は、当該技術分野において標準的な方法論を用いてここで使用するために非結合体化フィコビリタンパク質を修飾することが容易にできる。
【００５８】
前記組成物において必要とされる非結合体化フィコビリタンパク質の量は、その組成物を安定させるために十分である量である。望ましくは、前記非結合体化フィコビリタンパク質は、定常状態で非架橋サブユニットの交換を可能にする量で存在する。１つの実施形態において、前記非結合体化フィコビリタンパク質対、前記タンデム色素の結合体化フィコビリタンパク質の比は、少なくとも０．１２５：１、０．２５：１、０．５０：１、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、もしくは２０：１、およびそれらの間の分数比率である。もう１つの実施形態において、前記非結合体化フィコビリタンパク質対前記結合体化フィコビリタンパク質の比は、約０．１２５：１から約２０：１である。さらにもう１つの実施形態において、前記非結合体化フィコビリタンパク質対前記結合体化フィコビリタンパク質の比は、約０．２５：１から約１０：１である。さらなる実施形態において、前記非結合体化フィコビリタンパク質対前記結合体化フィコビリタンパク質の比は、４：１から０．２５：１である。
【００５９】
１つの実施形態において、前記タンデム色素の結合体化フィコビリタンパク質と、非結合体化フィコビリタンパク質は、同じであり、アロフィコシアニン、フィコエリトリン、フィコシアニンまたはフィコエリスロシアニンである。もう１つの実施形態において、前記タンデム色素の結合体化フィコビリタンパク質と、非結合体化フィコビリタンパク質は、異なる。しかし、前記タンデム色素の結合体化フィコビリタンパク質と、非結合体化フィコビリタンパク質が異なる場合、それらは、互いに交換する非架橋サブユニットを含有しなければならない。例えば、前記タンデム色素の結合体化フィコビリタンパク質と、非結合体化フィコビリタンパク質は、異なり、独立してアロフィコシアニン、フィコエリトリン、フィコシアニンまたはフィコエリスロシアニンであり、および互いに交換する非架橋サブユニットを含有する。さらなる実施形態において、前記タンデム色素の結合体化フィコビリタンパク質と、非結合体化フィコビリタンパク質は、同じであり、ＡＰＣ、Ｒ−ＰＥ、Ｂ−ＰＥ、Ｃ−ＰＥ、Ｙ−ＰＥ、またはＰＥＣである。いっそうさらなる実施形態において、前記タンデム色素の結合体化フィコビリタンパク質と、非結合体化フィコビリタンパク質は、異なり、独立してＡＰＣ、Ｒ−ＰＥ、Ｂ−ＰＥ、Ｃ−ＰＥ、Ｙ−ＰＥ、またはＰＥＣであり、および互いに交換する非架橋サブユニットを含有する。さらにもう１つの実施形態において、前記タンデム色素の結合体化フィコビリタンパク質と、非結合体化フィコビリタンパク質は、同じであり、Ｒ−ＰＥ、Ｂ−ＰＥ、Ｙ−ＰＥ、ＰＥ５６６、ＰＥＣ、Ｒ−ＰＣまたはＡＰＣである。さらなる実施形態において、前記タンデム色素の結合体化フィコビリタンパク質と、非結合体化フィコビリタンパク質は、異なり、Ｒ−ＰＥ、Ｂ−ＰＥ、Ｙ−ＰＥ、ＰＥ５６６、ＰＥＣ、Ｒ−ＰＣまたはＡＰＣから独立して選択され、および互いに交換する非架橋サブユニットを含有する。さらにもう１つの実施形態において、前記タンデム色素の結合体化フィコビリタンパク質と、非結合体化フィコビリタンパク質は、同じであり、アロフィコシアニンである。さらにもう１つの実施形態において、前記タンデム色素の結合体化フィコビリタンパク質と、非結合体化フィコビリタンパク質は、同じであり、フィコエリトリンである。
【００６０】
（Ｃ．前記組成物中の追加のリガンド結合体化色素成分）
単一のフィコビリタンパク質含有タンデム色素および単一の非結合体化フィコビリタンパク質に加えて、色素およびリガンド含有組成物の他の実施形態は、複数のリガンド、複数のタンデム色素、複数の非結合体化色素および他の自由選択成分を含有することがある。列挙している様々な細胞集団に最も有用であるために、前記色素組成物が、複数のリガンド結合体化蛍光性色素を含有することは有利である。当業者は、これに関連して用いる場合の「追加の」という用語を容易に判断することができる。例えば、用語「追加の」は、リガンド結合体化色素成分および非結合体化フィコビリタンパク質を含む、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の成分を含むことがある。
【００６１】
前記色素組成物に含まれるそれぞれの追加の色素または追加のフィコビリタンパク質を該組成物の１つ以上のリガンドに直接結合体化させなければならない。本明細書に記載する組成物の大部分において、前記色素組成物中には非標識または非結合体化リガンドは存在しない。
【００６２】
１つの実施形態において、本発明の組成物は、フィコビリタンパク質でない蛍光性色素または蛍光色素に結合体化した１つ以上の追加のリガンドを含む。例えば、前記色素組成物は、ｙ個の色素に結合体化したｘ個のリガンドを含むことがある（この場合、ｘ＝ｙ、および整数である）。１つの実施形態において、ｘおよびｙは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。さらなる実施形態において、ｘおよびｙは、１、２、３、または４である。前記色素は、上に記載した色素のいずれであってもよい。当業者は、前記色素組成物への追加に適する色素を容易に選択することができる。
【００６３】
もう１つの実施形態において、本発明の色素組成物は、追加のフィコビリタンパク質に直接結合体化した１つ以上の追加のリガンドを含む。１つの実施形態において、前記追加のフィコビリタンパク質は、前記色素組成物中のリガンド結合体化タンデム色素のフィコビリタンパク質と同じ細菌または真核藻種からのものである。もう１つの実施形態において、前記追加のフィコビリタンパク質は、前記色素組成物中の前記リガンド結合体化タンデム色素のフィコビリタンパク質とは別の細菌または真核藻種からのものである。例えば、前記色素組成物は、ｙ’個のフィコビリタンパク質に結合体化したｘ’個のリガンドを含むことがある（この場合、ｘ’＝ｙ’、および整数である）。１つの実施形態において、ｘ’およびｙ’は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。さらなる実施形態において、ｘ’およびｙ’は、１、２、３、または４である。別のリガンドを直接標識するために用いるフィコビリタンパク質は、上に記載したフィコビリタンパク質のいずれであってもよい。１つの実施形態において、前記追加のフィコビリタンパク質は、前記組成物中のフィコビリタンパク質のいずれか（前記リガンド結合体化タンデム色素、または前記非結合体化フィコビリタンパク質のいずれか）の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有しない。さらなる実施形態において、前記追加のフィコビリタンパク質は、前記組成物の前記リガンド結合体化タンデム色素のフィコビリタンパク質または前記非結合体化フィコビリタンパク質の１つ以上の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する。当業者は、リガンドへの直接結合体化および試薬混合物へのその後の添加に適するフィコビリタンパク質を容易に選択することができる。
【００６４】
もう１つの実施形態において、本発明の色素組成物は、追加のフィコビリタンパク質を含有する追加のタンデム色素に結合体化した１つ以上の追加のリガンドを含む。例えば、前記色素組成物は、ｙ’’個のタンデム色素にそれぞれが別個に結合体化したｘ’’個のリガンドを含むことがある（この場合、ｘ’’＝ｙ’’、および整数である）。１つの実施形態において、ｘ’’およびｙ’’は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。さらなる実施形態において、ｘ’’およびｙ’’は、１、２、３、または４である。１つの実施形態において、前記追加のタンデム色素中の前記フィコビリタンパク質は、第一のリガンド結合体化タンデム色素組成物中のフィコビリタンパク質と同じ細菌または真核藻種からのものである。もう１つの実施形態において、前記追加のフィコビリタンパク質は、第一の色素組成物中のフィコビリタンパク質のものとは異なる細菌種または真核藻種からのものである。しかし、前記追加のタンデム色素中の追加のフィコビリタンパク質が、別の細菌または真核藻種からのものである場合、非結合体化形態の同じフィコビリタンパク質をその色素組成物に添加しなければならない。しかし、フィコビリタンパク質の供給源に係らず、当業者は、上に記載したフィコビリタンパク質のいずれかからそれを選択することができる。
【００６５】
組成物の様々な実施形態は、タンデム色素に結合体化した複数のリガンドを含有する。例えば、１つの望ましい実施形態において、前記組成物は、（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンドおよび（ｂ）第一の非結合体化フィコビリタンパク質に加えて、次の成分を含有することがある：（ｃ）第二のタンデム色素に結合体化した第二のリガンド（前記第二のタンデム色素は、（ｉ）架橋および非架橋サブユニットを含有する第三のフィコビリタンパク質（前記第三のフィコビリタンパク質は、第二の細菌または真核藻種から得られる）と、（ｉｉ）前記第三のフィコビリタンパク質に結合体化した第二のパートナー色素と含む）；および（ｄ）サブユニットを含有する非結合体化第四のフィコビリタンパク質。前記第二のフィコビリタンパク質は、第二の細菌または真核藻種から得られる。前記第四のフィコビリタンパク質と前記第三のフィコビリタンパク質は、同じである。あるいは、前記第三および第四のフィコビリタンパク質は異なり、前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第三のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する。
【００６６】
もう１つの望ましい実施形態において、前記組成物は、すぐ上で記載した成分に加えて、（ｅ）第四のフィコビリタンパク質に結合体化した第三のリガンドをさらに含有することがあり、前記第四のフィコビリタンパク質は、第一の細菌種、第一の真核藻種、第二の細菌種、または第二の真核藻種から得られる。前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二または第三のフィコビリタンパク質と同じであるか；あるいは、前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二または第三のフィコビリタンパク質と異なり、および前記第一、第二または第三のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する。
【００６７】
さらなる望ましい実施形態において、前記組成物は、（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンドおよび（ｂ）第一の非結合体化フィコビリタンパク質に加えて、次の成分を含有することがある：（ｃ）第三のフィコビリタンパク質に結合体化した第二のリガンド（前記第三のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られる）。前記第三のフィコビリタンパク質は、第一もしくは第二のフィコビリタンパク質と同じであるか；あるいは、前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一もしくは第二のフィコビリタンパク質と異なり、ならびに前記第一および第二のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する。１つの態様において、前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一または第二のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有しない。もう１つの態様において、前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一または第二のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する。
【００６８】
もう１つの望ましい実施形態において、前記組成物は、フィコビリタンパク質でない色素に結合体化した１つ以上の追加のリガンドをさらに含有する。
【００６９】
（Ｄ．前記組成物中の他の自由選択の非色素成分）
追加のリガンド、フィコビリタンパク質、タンデム色素、および蛍光性色素以外の成分を、本明細書に記載する組成物に含めることができる。当業者は、それらの追加の成分の選択を容易に選択することができ、ならびにそれらの追加の成分は、数ある中でも、分析する検体、その組成物の成分、分析するパラメータに依存する。例えば、参照により本明細書に援用されている米国特許第６，５５１，８３１号において列挙されている界面活性剤を参照のこと。
【００７０】
組成物の実施形態は、その組成物のｐＨを約６から約９の範囲内の任意の所望のｐＨに維持する緩衝液などの、他の成分をさらに含有することがある。緩衝液の例としては、限定ではないが、リン酸緩衝生理食塩水または等張食塩水、例えば、ＩＳＯＴＯＮ ＩＩバッファー（フロリダ州マイアミのＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）および参照により本明細書に援用されている米国特許第３，９６２，１２５号において特定されているものが挙げられる。
【００７１】
保存薬も前記組成物に添加することができ、それらは、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、および２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンから選択することができるが、これらに限定されない（そのような保存薬を、例えばＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００またはＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）１５０として、商業的に購入することができる）。
【００７２】
当業者は、本明細書に記載する様々な方法において使用するための組成物に用いることができる適切な界面活性剤、緩衝液、保存薬または他の従来の試薬の選択を行うことができる。そのような選択は、本明細書において教示する方法および組成物の制限ではない。
【００７３】
（Ｅ．複数の標識リガンドを含有する組成物）
１つの望ましい実施形態において、前記組成物は、タンデム色素に結合体化した１つのリガンドを含有する（Ｌ１−タンデム色素１）。もう１つの実施形態において、前記組成物は、２つのリガンドを含有し、この場合、１つの抗体は、タンデム色素に結合体化しており（Ｌ１−タンデム色素１）、および他のリガンドは、フィコビリタンパク質に直接結合体化している（Ｌ２−ｐｂｐ）。さらなる実施形態において、前記組成物は、２つのリガンドを含有し、この場合、１つのリガンドは、１つのタンデム色素に結合体化しており（Ｌ１−タンデム色素１）、および１つのリガンドは、第二のタンデム色素に結合体化している（Ｌ２−タンデム色素２）。もう１つの実施形態において、前記組成物は、３つのリガンドを含有し、この場合、１つのリガンドは、１つのタンデム色素に結合体化しており（Ｌ１−タンデム色素１）、第二のリガンドは、第二のタンデム色素に結合体化しており（Ｌ２−タンデム色素２）、および第三のリガンドは、フィコビリタンパク質に結合体化している（Ｌ３−ｐｂｐ）。さらにもう１つの実施形態において、前記組成物は、１つのタンデム色素に結合体化した１つのリガンド（Ｌ１−タンデム色素１）、フィコビリタンパク質に結合体化した第二のリガンド（Ｌ２−ｐｂｐ）、およびｘ数のタンデム色素に独立して結合体化したｘ数のリガンド（Ｌｘ−タンデム色素ｘ）を含有する。さらなる実施形態において、前記組成物は、１つのタンデム色素に結合体化した１つのリガンド（Ｌ１−タンデム色素１）、フィコビリタンパク質に結合体化した第二のリガンド（Ｌ２−ｐｂｐ）、およびｘ数の非フィコビリタンパク質蛍光性色素に独立して結合体化したｘ数のリガンド（Ｌｘ−色素ｘ）を含有する。
【００７４】
（ＩＩＩ．本発明の組成物の特定の実施形態）
上で一般に説明した組成物の第一の例として、組成物は、（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンドを含有する。前記第一のタンデム色素は、第一のフィコビリタンパク質を含有し、前記第一のフィコビリタンパク質は、該第一のフィコビリタンパク質に結合体化した第一のパートナー色素に結合体化した架橋および非架橋サブユニットを含有する。前記第一のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られる。前記組成物は、（ｂ）サブユニットを含有する非結合体化第二のフィコビリタンパク質も含有し、この第二のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られる。この組成物の１つの実施形態において、前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は、同じである。この組成物のもう１つの実施形態において、前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は異なり、前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する。表１参照。
【００７５】
【表１】
本明細書に記載する組成物の第二の例または実施形態として、組成物は、（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンドを含有する。前記第一のタンデム色素は、第一のフィコビリタンパク質を含み、前記第一のフィコビリタンパク質は、該第一のフィコビリタンパク質に結合体化した第一のパートナー色素に結合体化した架橋および非架橋サブユニットを含有する。前記第一のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られる。前記組成物は、（ｂ）サブユニットを含有する非結合体化第二のフィコビリタンパク質も含有し、この第二のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られる。この組成物の１つの実施形態において、前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は同じである。この組成物のもう１つの実施形態において、前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する。組成物のこの第二の実施形態は、（ｃ）第二のタンデム色素に結合体化した第二のリガンドをさらに含有し、前記第二のタンデム色素は、（ｉ）架橋および非架橋サブユニットを含有する第三のフィコビリタンパク質と、（ｉｉ）前記第三のフィコビリタンパク質に結合体化した第二のパートナー色素とを含む。前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られる。この組成物の１つの実施形態において、前記第一、第二および第三のフィコビリタンパク質は、同じである。この組成物のもう１つの実施形態において、前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一および第二のフィコビリタンパク質とは異なり、ならびに前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一および第二のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する。表２参照。
【００７６】
【表２】
さらなる実施形態において、組成物は、
（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンド（前記第一のタンデム色素は、（ｉ）架橋および非架橋サブユニットを含有する第一のフィコビリタンパク質（前記第一のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られる）、および（ｉｉ）前記第一のフィコビリタンパク質に結合体化した第一のパートナー色素を含む）と；
（ｂ）サブユニットを含有する非結合体化第二のフィコビリタンパク質（前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ；この場合、前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は、同じであるか；または前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）と；
（ｃ）第二のタンデム色素に結合体化した第二のリガンド（前記第二のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第三のフィコビリタンパク質を含み、前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ、および第二のパートナー色素に結合体化しており；この場合、前記第一、第二、および第三のフィコビリタンパク質は、同じであるか；または前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一および第二のフィコビリタンパク質とは異なり、ならびに前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一および第二のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）と；
（ｄ）第三のタンデム色素に結合体化した第三のリガンド（前記第三のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第四のフィコビリタンパク質を含み、前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ、および第三のパートナー色素に結合体化しており；この場合、前記第一、第二、第三および第四のフィコビリタンパク質は、同じであるか；または前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二もしくは第三のフィコビリタンパク質とは異なり、および前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二もしくは第三のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）
を含有する。表３参照。
【００７７】
【表３】
いっそうさらなる実施形態において、組成物は、
（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンド（前記第一のタンデム色素は、（ｉ）架橋および非架橋サブユニットを含有する第一のフィコビリタンパク質（前記第一のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られる）、および（ｉｉ）前記第一のフィコビリタンパク質に結合体化した第一のパートナー色素を含む）と；
（ｂ）サブユニットを含有する非結合体化第二のフィコビリタンパク質（前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ；この場合、前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は、同じであるか；または前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）と；
（ｃ）第二のタンデム色素に結合体化した第二のリガンド（前記第二のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第三のフィコビリタンパク質を含み、前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ、および第二のパートナー色素に結合体化しており；この場合、前記第一、第二、および第三のフィコビリタンパク質は、同じであるか；または前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一および第二のフィコビリタンパク質とは異なり、ならびに前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一および第二のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）と；
（ｄ）第三のタンデム色素に結合体化した第三のリガンド（前記第三のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第四のフィコビリタンパク質を含み、前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ、および第三のパートナー色素に結合体化しており；この場合、前記第一、第二、第三および第四のフィコビリタンパク質は、同じであるか；または前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二もしくは第三のフィコビリタンパク質とは異なり、および前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二もしくは第三のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）と；
（ｅ）第四のタンデム色素に結合体化した第四のリガンド（前記第四のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含む第五のフィコビリタンパク質を含み、前記第五のフィコビリタンパク質は、前記細菌または真核藻種から得られ、および第四のパートナー色素に結合体化しており；この場合、前記第一、第二、第三、第四および第五のフィコビリタンパク質は、同じであるか；または前記第五のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二、第三もしくは第四のフィコビリタンパク質とは異なり、および前記第五のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二、第三もしくは第四のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）
を含有する。表４参照。
【００７８】
【表４】
さらにもう１つの実施形態において、組成物は、
（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンド（前記第一のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第一のフィコビリタンパク質を含有し、前記第一のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られ、および第一のパートナー色素に結合体化している）と；
（ｂ）サブユニットを含有する非結合体化第二のフィコビリタンパク質（前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または第一の真核藻種から得られ；この場合、前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は、同じであるか；または前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）と；
（ｃ）フィコビリタンパク質でない色素に結合体化した１つ以上の追加のリガンド
を含有する。表５参照。
【００７９】
【表５】
さらなる実施形態において、組成物を提供し、この組成物は、
（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンド（前記第一のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第一のフィコビリタンパク質を含有し、前記第一のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られ、および第一のパートナー色素に結合体化している）と；
（ｂ）サブユニットを含有する非結合体化第二のフィコビリタンパク質（前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ；この場合、前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は、同じであるか；または前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）と；
（ｃ）第二のタンデム色素に結合体化した第二のリガンド（前記第二のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第三のフィコビリタンパク質を含み、前記第三のフィコビリタンパク質は、第二の細菌または真核藻種から得られ、および第二のパートナー色素に結合体化している）と；
（ｄ）サブユニットを含有する非結合体化第四のフィコビリタンパク質（前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第二の細菌または真核藻種から得られ；この場合、前記第四のフィコビリタンパク質と前記第三のフィコビリタンパク質は、同じであるか；または前記第四のフィコビリタンパク質と前記第三のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第三のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）
を含有する。表６参照。
【００８０】
【表６】
もう１つの実施形態において、組成物を提供し、この組成物は、
（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンド（前記第一のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第一のフィコビリタンパク質を含有し、前記第一のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られ、および第一のパートナー色素に結合体化している）と；
（ｂ）サブユニットを含有する非結合体化第二のフィコビリタンパク質（前記第二のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られ；この場合、前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は、同じであるか；または前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）と；
（ｃ）第二のタンデム色素に結合体化した第二のリガンド（前記第二のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第三のフィコビリタンパク質を含み、前記第三のフィコビリタンパク質は、第二の細菌または真核藻種から得られ、および第二のパートナー色素に結合体化している）と；
（ｄ）サブユニットを含有する非結合体化第四のフィコビリタンパク質（前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第二の細菌または真核藻種から得られ；この場合、前記第四のフィコビリタンパク質と前記第三のフィコビリタンパク質は、同じであるか；または前記第四のフィコビリタンパク質と前記第三のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第三のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）と；
（ｅ）第四のフィコビリタンパク質に結合体化した第三のリガンド（前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌種、前記第一の真核藻種、前記第二の細菌種、または前記第二の真核藻種から得られ；この場合、前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質、前記第二のフィコビリタンパク質、もしくは前記第三のフィコビリタンパク質と同じであるか；または前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二もしくは第三のフィコビリタンパク質とは異なり、および前記第一、第二もしくは第三のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）
を含有する。表７参照。
【００８１】
【表７】
当業者は、本明細書の教示を用いて、選択された追加の成分を含有する他の組成物を調製することができる。
【００８２】
（ＩＶ．本発明の組成物を調製および使用するための方法）
本明細書において論じる組成物を調製するための方法は、選択されたマルチカラー組成物の標識リガンド成分と遊離フィコビリタンパク質成分とを併せるかまたは事前混合する工程、および場合により、前記事前混合組成物を保管する工程を一般に含む。その後、前記組成物を、当業者が判定して必要な場合には希釈し、分析を意図して選択された生物検体と併せる。
【００８３】
具体的には、（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンド（前記第一のタンデム色素は、架橋を含有する第一のフィコビリタンパク質と第一の色素とを含み、前記第一のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られ、および前記第一の色素に結合体化している）と、（ｂ）前記第一の細菌または真核藻種から得られる非結合体化第一のフィコビリタンパク質とを混合することによって、前記組成物を調製する。分析する集団に依存して、上で説明したように、追加の成分を添加してもよい。１つの実施形態において、第二のフィコビリタンパク質、前記第二のフィコビリタンパク質を含む第二のタンデム色素、およびフィコビリタンパク質ではない色素からなる群より選択される、第二の色素に結合体化した第二のリガンドを、前記反応混合物に添加する。
【００８４】
当業者は、下で記載する方法において使用するために必要な組成物の量を決定することができる。１つの実施形態では、少なくとも約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００μＬの前記組成物を用いる。もう１つの実施形態では、約５から約２００μＬの前記組成物を用いる。さらなる実施形態では、約１００μＬの組成物を使用する。
【００８５】
これらの成分を、一般に、室温、周囲温度または２℃ほどもの低さの低温を含む任意の選択された温度でインキュベートすることによって混合するかまたは反応させる。もう１つの実施形態では、約４０℃という高温を用いることがある。しかし、分析時の前記組成物の温度は、検体中の細胞の生存可能性にとって十分なものでなければならない。１つの実施形態では、約２から約８℃の温度を、詳細には前記混合物の混合と保管の両方に、用いることができる。
【００８６】
前記反応の時間範囲は、一般に、約１５秒、３０秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、または１５分より長期であるか、それらの間の秒数である。もう１つの実施形態において、前記インキュベーションの時間は、約１５秒から約３０分である。さらなる実施形態では、前記組成物の成分の濃度を調整すれば、より速い反応時間を得ることができる。
【００８７】
上で説明した成分を含有する、上で調製したような組成物は、下の実施例によって実証するように、検体中の細胞および非細胞集団を分析するための従来の方法において有用である。そのような従来のフローサイトメトリー法は、当業者に公知であり、ならびに検体と本明細書に記載する組成物とを併せる工程、および蛍光を分析することにより検体中の集団を同定する工程を含む。望ましくは、前記細胞および非細胞集団の少なくとも１つは、前記第一のリガンドの受容体を含む。参照により本明細書に援用されている米国特許第６，５５１，８３１号を参照のこと。
【００８８】
（Ｖ．本発明のキット）
さらにもう１つの態様において、これらの組成物の混合または従来のフローサイトメトリー分析での使用を可能にするキットを提供する。望ましくは、本発明のフローサイトメトリー診断方法を行うためにそのようなキットを用いる。しかし、他の安定化試薬の開発および評価における研究のためにそのようなキットを組み立てることができる。
【００８９】
好都合な使用のために、前記組成物、それらの成分、ならびに上で記載した方法の任意の数の変形形態を実施するために必要な成分を組み合わせてキットを作ることができる。そのようなキットは、別々の成分として組成物を形成するために必要な成分を含有し得る。１つの実施形態において、別個の容器の中に存在する１つの別個の成分は、第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンドであり、前記第一のタンデム色素は、第一の色素に結合体化し、架橋を含有し、および第一の細菌または真核藻種から得られる、第一のフィコビリタンパク質を含有する。第二の容器の中に存在する第二の別個の成分は、前記第一の細菌または真核藻種から得られる非結合体化第一のフィコビリタンパク質である。これら２つの成分を、使用のために購入者の裁量で併せることができる。もう１つの実施形態において、前記キットは、１つの「事前混合」容器を含有することがあり、この容器は、（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンド（前記第一のタンデム色素は、（ｉ）架橋を含有する第一のフィコビリタンパク質（前記第一のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られる）と（ｉｉ）第一のパートナー色素とを含む）；および（ｂ）前記第一の細菌または真核藻種から得られる非結合体化第一のフィコビリタンパク質を含む。上で論じたように、本明細書において論じる組成物の利点は、それらが分解しない点、血液学的分析に干渉する別個の成分間でのサブユニット交換を有しない点である。
【００９０】
追加の容器を前記キットにさらに含めることができる。これらの追加の容器は、上で特定した自由選択の成分のいずれかを独立して含むことができる。しかし、もしあれば、その（それらの）追加の成分は、前記試薬組成物の安定性に悪影響を及ぼさない生理的ｐＨを有さなければならない。
【００９１】
そのようなキットは、前記組成物の別個の成分を混合するための説明書；前記組成物の成分を含む適切な器；前記組成物と生物検体を混合するための適切な器；細胞の正常または疾患特性値についての適切な対照または表；抗凝固剤または凝固経路インヒビター、フローサイトメトリー分析の実施に適する他の試薬およびそれらの組み合わせ；検体に適する希釈剤および緩衝液；使い捨て手袋；除染についての説明書；アプリケータースティックまたは容器；ならびに調製用カップのうちの１つ以上をさらに含有し得る。
【００９２】
当業者は、分析用の検体に対して前記方法を行うために必要な情報および成分を有する任意の数のキットを組み立てることができる。
【００９３】
１つの実施形態において、キットを提供し、このキットは、（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンド（前記第一のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第一のフィコビリタンパク質を含み、前記第一のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られ、および第一のパートナー色素に結合体化している）を含む第一の容器と、（ｂ）サブユニットを含有する非結合体化第二のフィコビリタンパク質（前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ；この場合、前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は同じであるか；または前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）を含む第二の容器とを含有する。１つ以上の追加の容器を前記キットに含めることができ、およびそれらの容器は、上に書き留めた試薬のいずれか１つを含むことができる。表８参照。あるいは、前記組成物の成分が１つの容器に存在することがある。
【００９４】
【表８】
もう１つの実施形態において、キットを提供し、このキットは、（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンド（前記第一のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第一のフィコビリタンパク質を含み、前記第一のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られ、および第一のパートナー色素に結合体化している）を含む第一の容器と、（ｂ）サブユニットを含有する非結合体化第二のフィコビリタンパク質（前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ；この場合、前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は同じであるか；または前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）を含む第二の容器と、（ｃ）第二のタンデム色素に結合体化した第二のリガンド（前記第二タンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第三のフィコビリタンパク質を含み、前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ、および第二のパートナー色素に結合体化しており；この場合、前記第一、第二および第三のフィコビリタンパク質は同じであるか；または前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一および第二のフィコビリタンパク質とは異なり、ならびに前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一および第二のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）を含む第三の容器を含有する。表９参照。あるいは、前記組成物の成分が１つの容器に存在することがある。
【００９５】
【表９】
さらなる実施形態において、キットを提供し、このキットは、（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンド（前記第一のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第一のフィコビリタンパク質を含み、前記第一のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られ、および第一のパートナー色素に結合体化している）を含む第一の容器と、（ｂ）サブユニットを含有する非結合体化第二のフィコビリタンパク質（前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ；この場合、前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は同じであるか；または前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）を含む第二の容器と、（ｃ）第二のタンデム色素に結合体化した第二のリガンド（前記第二タンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第三のフィコビリタンパク質を含み、前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ、および第二のパートナー色素に結合体化しており；この場合、前記第一、第二および第三のフィコビリタンパク質は同じであるか；または前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一および第二のフィコビリタンパク質とは異なり、ならびに前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一および第二のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）を含む第三の容器と、（ｄ）第三のタンデム色素に結合体化した第三のリガンド（前記第三のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第四のフィコビリタンパク質を含み、前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ、および第三のパートナー色素に結合体化しており；この場合、前記第一、第二、第三および第四のフィコビリタンパク質は同じであるか；または前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二もしくは第三のフィコビリタンパク質とは異なり、および前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二もしくは第三のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）を含む第四の容器を含有する。表１０参照。あるいは、前記組成物の成分が１つの容器に存在することがある。
【００９６】
【表１０】
いっそうさらなる実施形態において、キットを提供し、このキットは、（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンド（前記第一のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第一のフィコビリタンパク質を含み、前記第一のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られ、および第一のパートナー色素に結合体化している）を含む第一の容器と、（ｂ）サブユニットを含有する非結合体化第二のフィコビリタンパク質（前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ；この場合、前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は同じであるか；または前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）を含む第二の容器と、（ｃ）第二のタンデム色素に結合体化した第二のリガンド（前記第二タンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第三のフィコビリタンパク質を含み、前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ；第三のフィコビリタンパク質に結合体化した第二のパートナー色素に結合体化しており；この場合、前記第一、第二および第三のフィコビリタンパク質は同じであるか；または前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一および第二のフィコビリタンパク質とは異なり、ならびに前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一および第二のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）を含む第三の容器と、（ｄ）第三のタンデム色素に結合体化した第三のリガンド（前記第三のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第四のフィコビリタンパク質を含み、前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ、および第三のパートナー色素に結合体化しており；この場合、前記第一、第二、第三および第四のフィコビリタンパク質は同じであるか；または前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二もしくは第三のフィコビリタンパク質とは異なり、および前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二もしくは第三のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）を含む第四の容器と、（ｅ）第四のタンデム色素に結合体化した第四のリガンド（前記第四のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含む第五のフィコビリタンパク質を含み、前記第五のフィコビリタンパク質は、前記細菌または真核藻種から得られ、および第四のパートナー色素に結合体化しており；この場合、前記第一、第二、第三、第四および第五のフィコビリタンパク質は同じであるか；または前記第五のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二、第三もしくは第四のフィコビリタンパク質とは異なり、ならびに前記第五のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二、第三もしくは第四のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）を含む第五の容器を含有する。表１１参照。あるいは、前記組成物の成分が１つの容器に存在することがある。
【００９７】
【表１１】
さらにもう１つの実施形態において、キットを提供し、このキットは、（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンド（前記第一のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第一のフィコビリタンパク質を含み、前記第一のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られ、および第一のパートナー色素に結合体化している）を含む第一の容器と、（ｂ）サブユニットを含有する非結合体化第二のフィコビリタンパク質（前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ；この場合、前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は同じであるか；または前記第二のフィコビリタンパク質と第一のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）を含む第二の容器と、（ｃ）フィコビリタンパク質ではない色素に結合体化した１つ以上の追加のリガンドを含む第三の容器を含有する。表１２参照。あるいは、前記組成物の成分が１つの容器に存在することがある。
【００９８】
【表１２】
さらなる実施形態において、キットを提供し、このキットは、（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンド（前記第一のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第一のフィコビリタンパク質を含み、前記第一のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られ、および第一のパートナー色素に結合体化している）を含む第一の容器と、（ｂ）サブユニットを含有する非結合体化第二のフィコビリタンパク質（前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ；この場合、前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は同じであるか；または前記第二のフィコビリタンパク質と第一のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）を含む第二の容器と、（ｃ）第二のタンデム色素に結合体化した第二のリガンド（前記第二のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第三のフィコビリタンパク質を含み、前記第三のフィコビリタンパク質は、第二の細菌または真核藻種から得られ、および第二のパートナー色素に結合体化している）を含む第三の容器と、（ｄ）サブユニットを含有する非結合体化第四のフィコビリタンパク質（前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第二の細菌または真核藻種から得られ；この場合、前記第四のフィコビリタンパク質と前記第三のフィコビリタンパク質は同じであるか；または前記第四のフィコビリタンパク質と前記第三のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第三のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）を含む第四の容器を含有する。表１３参照。あるいは、前記組成物の成分が１つの容器に存在することがある。
【００９９】
【表１３】
もう１つの実施形態において、キットを提供し、このキットは、（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンド（前記第一のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第一のフィコビリタンパク質を含み、前記第一のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られ、および結合体化した第一のパートナー色素に結合体化している）と、（ｂ）サブユニットを含有する非結合体化第二のフィコビリタンパク質（前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ；この場合、前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は同じであるか；または前記第二のフィコビリタンパク質と第一のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）と、（ｃ）第二のタンデム色素に結合体化した第二のリガンド（前記第二のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第三のフィコビリタンパク質を含み、前記第三のフィコビリタンパク質は、第二の細菌または真核藻種から得られ、および第二のパートナー色素に結合体化している）と、（ｄ）サブユニットを含有する非結合体化第四のフィコビリタンパク質（前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第二の細菌または真核藻種から得られ；この場合、前記第四のフィコビリタンパク質と前記第三のフィコビリタンパク質は同じであるか；または前記第四のフィコビリタンパク質と前記第三のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第三のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）と、（ｅ）第四のフィコビリタンパク質に結合体化した第三のリガンド（前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌種、前記第一の真核藻種、前記第二の細菌種または前記第二の真核藻種から得られ；この場合、前記第四のフィコビリタンパク質は前記第一のフィコビリタンパク質、前記第二のフィコビリタンパク質もしくは前記第三のフィコビリタンパク質と同じであるか；または前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二もしくは第三のフィコビリタンパク質とは異なり、および前記第一、第二もしくは第三のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）を含有する。表１４参照。あるいは、前記組成物の成分が１つの容器に存在することがある。
【０１００】
【表１４】
以下の実施例は、本発明の様々な態様を例証するものである。これらの実施例は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定しない。
【実施例】
【０１０１】
（実施例）
（実施例１）
Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓから単離したＡＰＣにおける架橋率を判定するためにこの実施例を行った。
【０１０２】
Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−５０カラムを用いてＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭ Ｋ３ＰＯ４＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．２）で様々な架橋および非架橋ＡＰＣサンプルを脱塩した。Ｍｉｃｒｏｎ（登録商標）ＹＭ−３０膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａｒｔ♯ ＵＦＣ９０３０２４）を用いて、それらの脱塩溶液を約１５±２ｍｇ／ｍＬに濃縮した。次に、当該技術分野における技術および下記の条件／計器を用いてＨＰＬＣによりこれらのＡＰＣサンプルを分析した：
カラム： Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００ ＨＲサイズ排除カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｐａｒｔ♯１７−１０８８−０１）
溶離剤： １０ｍＭ Ｋ３ＰＯ４＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ＋１Ｍ ＮａＣｌＯ４ ｐＨ７．２
流速： ０．８ｍＬ／分。
【０１０３】
濃縮したＡＰＣサンプルのそれぞれを緩衝液中０．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、３０分間、約２２±２℃でインキュベートした。その後、それぞれのサンプルを前記サイズ排除カラムに注入し、溶出中、波長Ａ２８０、Ａ６５２およびＡ６１６をモニターした。代表サンプルおよびｎ−ＡＰＣについてのＡ２８０のプロットを図４に示す。インタクトＡＰＣは、１２ｍＬの保持容積で溶出し、および解離ＡＰＣは、１４．５ｍＬの保持容積で溶出した。溶出ピーク下面積を計算することによって、ＡＰＣにおける架橋率を決定した。クロマトグラムの総面積に対するインタクトピークの積分面積の比によって、サンプルについての架橋率を得た。図４は、これらの架橋および非架橋ＡＰＣのクロマトグラムである。
【０１０４】
プロットの右側の最高ピークは、一（１）つの非架橋ＡＰＣサンプルに対応する。プロットの残りのピークは、架橋ＡＰＣサンプルに対応する。具体的には、プロットの左側のピークは、インタクトＡＰＣ分子に対応し、プロットの右側の（非架橋ＡＰＣピークの下の）小ピークは、ＡＰＣサブユニットに対応する。これらのクロマトグラムに基づき、架橋ＡＰＣサンプルについての架橋率は、約７６から約９６％であった。
【０１０５】
（実施例２）
この実施例は、非結合体化フィコビリタンパク質を含有する２色リガンド結合体化タンデム色素組成物を含む、本明細書に記載する組成物および方法の利点を例証するものである。
【０１０６】
四（４）つの組成物を調製し、それぞれが、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓから単離したフィコビリタンパク質およびタンデム色素に独立して結合している二（２）つのモノクローナル抗体を含有した。具体的には、それぞれの組成物（１０μＬ）は、アロフィコシアニンに結合体化したＣＤ３（ＣＤ３−ＡＰＣ）０．５μｇ、およびアロフィコシアニン−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素に結合体化したＣＤ１９（ＣＤ１９−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０）０．５μｇを含有した。
【０１０７】
組成物１、すなわち対照組成物は、新たに調製したものであり、追加の成分を含有しなかった。組成物２は、追加の成分を含有しなかったが、２から８℃で２１日間保持したものであった。組成物３および４は、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓから単離した０．５μｇの非結合体ＡＰＣも含有し、組成物３は、すべての成分を新たに混合したものであったが、組成物４は、生物検体への添加および分析前に２１日間、２から８℃で保持したものであった。
【０１０８】
その後、これらの組成物を、全血（０．１ｍＬ）を含有する生物検体と独立して併せ、１０〜１２分間インキュベートし、標準的なＶｅｒｓａＬｙｓｅ（登録商標）法を用いて処理し、フローサイトメーターを用いて分析した。当業者は、処理した生物検体とＶｅｒｓａｌｙｓｅ（登録商標）試薬／０．２％ホルムアルデヒド（１ｍＬ）とを１０分間、併せる工程、処理した検体をスピンダウン（ｓｐｉｎｎｉｎｇ ｄｏｗｎ）させる工程、上清を吸引する工程、ＰＢＳ（３ｍＬ）にそのペレットを再懸濁させる工程、そのＰＢＳ溶液をスピンダウンさせる工程、および分析のためにそのペレットをＰＢＳ／０．１％ホルムアルデヒド（０．５ｍｌ）に再懸濁させる工程を含む当該技術分野において公知であるようなＶｅｒｓａＬｙｓｅ（登録商標）法を容易に行うことができる。図１Ａ〜１Ｄ参照。
【０１０９】
これらの結果は、フローサイトメトリー分析に関して、先行技術（図１Ｂ）と比較して、本発明の組成物（図１Ｄ）の有用性を明確に示す。
【０１１０】
（実施例３）
この実施例は、２色リガンド結合体化タンデム色素組成物に非結合体化フィコビリタンパク質を添加することを含む、本明細書に記載する組成物および方法の利点を例証するものである。
【０１１１】
九（９）つの組成物を調製し、それぞれが、フィコビリタンパク質およびタンデム色素に独立して結合している二（２）つのモノクローナル抗体を含有した。具体的には、それぞれの組成物（１０μＬ）は、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓから単離したアロフィコシアニンに結合体化したＣＤ３（０．５μｇ；ＣＤ３−ＡＰＣ）と、アロフィコシアニン（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓから単離したもの）−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素に結合体化したＣＤ１９（ＣＤ１９−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０）０．５μｇとを含有した。組成物１、すなわち「先行技術の作りたて混合物」は、新たに調製したものであり、追加の成分を含有しなかった。組成物２、すなわち「先行技術の保管混合物」は、追加の成分を含有しなかったが、２から８℃で２１日間保持したものであった。組成物３〜９は、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓから単離した様々な量の非結合体化ＡＰＣも含有し、生物検体への添加および分析前に２１日間、２から８℃で保持したものであった。表１５参照。
【０１１２】
【表１５】
その後、上の実施例２におけるように血液検体のフローサイトメトリー分析のためにこれらの組成物を用いた。図２Ａ〜２Ｉ参照。
【０１１３】
これらの結果は、サブユニット交換の影響を最小にする点での、二色リガンド結合体化ＡＰＣタンデム色素およびリガンド結合体化ＡＰＣ試薬組成物への（広範にわたる）天然非結合体化ＡＰＣ添加の有用性の例証となる。より高い濃度（具体的には５００μｇ／ｍＬ以上）は、細胞の非特異的標識の増加につながる。しかし、０．０６２５μｇ（図２Ｃ）から２μｇ（図２Ｇ）の量での非結合体化ＡＰＣは、細胞の非特異的標識のそのような増加を示さず、およびまた、先行技術の組成物に所望の安定性をもたらした（図２Ｂ）。これらの結果はまた、０．０６２５μｇから１０．０μｇにわたる遊離、非結合体化フィコビリタンパク質の添加が、事前処方製品の経時的な分解を制限することの例証になる。
【０１１４】
（実施例４）
この実施例は、３色リガンド結合体化フィコビリタンパク質およびリガンド結合体化タンデム色素組成物への非結合体化フィコビリタンパク質の添加を含む、本明細書に記載する組成物および方法の利点を例証するものである。五（５）つの組成物を調製し、これらの組成物は、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓから単離したフィコビリタンパク質および２つのタンデム色素に独立して結合している三（３）つのモノクローナル抗体を含有した。具体的には、それぞれの組成物（１０μＬ）は、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓから単離したアロフィコシアニンに結合体化したＣＤ１９（ＣＤ１９−ＡＰＣ）０．５μｇと、アロフィコシアニン（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓから単離したもの）−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００タンデム色素に結合体化したＣＤ４（ＣＤ１９−ＡＰＣ−Ａ７００）０．５μｇと、アロフィコシアニン（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓから単離したもの）−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素に結合体化したＣＤ８（ＣＤ８−ＡＰＣ−Ａ７５０）０．５μｇを含有した。組成物１、すなわち対照組成物は、新たに調製したものであり、追加の成分を含有しなかった。組成物２は、追加の成分を含有しなかったが、２から８℃で１２０日間保持したものであった。組成物３〜５は、加えて、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓから単離した様々な量の非結合体化ＡＰＣを含有し、分析前に１２０日間、２から８℃で保持した。表１６参照。
【０１１５】
【表１６】
その後、これらの組成物を、実施例２におけるように血液検体を分析するために独立して使用した。図３Ａ〜３Ｊ参照。これらの図は、異なる量の遊離フィコビリタンパク質の使用による保管中のリガンド−色素組成物の安定性を明示している。それにより、これらの結果は、遊離、非結合体化フィコビリタンパク質が、３色試薬のさらに複雑な混合物において事前処方組成物の経時的な分解を制限することの例証となる。
【０１１６】
上に列挙したすべての出版物、特許および特許出願、ならびに優先権書類の開示は、参照により本明細書に援用されている。本明細書に記載する方法および組成物についての非常に多数の従来の変更形態および変形形態が上記明細書に含まれており、それらは当業者には明らかであると予想される。本発明の様々な実施形態の組成物およびプロセスに対するそのような変更形態および変形形態は、本明細書に添付する特許請求の範囲に包含されると考えられる。
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
フィコビリタンパク質およびそれらのタンデム色素（ｔａｎｄｅｍ ｄｙｅ）は、フローサイトメトリーにおける蛍光標識として広く用いられている重要な蛍光色素である。タンデム色素の使用は、異なる発光スペクトルを有する追加の蛍光色素を供給することによるフローサイトメトリーでの進展されたマルチカラー分析能力を、１つのレーザー線によって励起される単一ドナー色素を使用して進展させた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
マルチカラー組み合わせで多数のタンデム色素を使用すると、蛍光シグナル間の識別困難が生ずることがある。今日まで、当該技術分野は、一般に、これらの「困難」を色素不安定性のためであるとしてきた。しかし、これらの問題に対処するための明確な回答および提案は、一切されていない。従って、フィコビリタンパク質結合体化リガンドのユニークな組み合わせを用いる分析のための組成物および方法が、当該技術分野において依然として必要とされている。詳細には、当該技術分野において公知の組成物で遭遇する経時的分解を制限するフィコビリタンパク質含有タンデム色素組成物が、当該技術分野において依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の概要）
理解を容易にするために、以下の概要および詳細な説明においてフィコビリタンパク質、リガンド、色素または種に適用する場合、用語「第一の」、「第二の」、「第三の」などは、あるフィコビリタンパク質、リガンド、色素または種と別のフィコビリタンパク質、リガンド、色素または種とを、同じ組成物中に存在するときにそれぞれ区別するために用いる。量、順序または重要度を特定するためにこれらの用語を用いてはいない。
【０００４】
１つの態様において、第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンドを含有する組成物を提供する。前記第一のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含む第一のフィコビリタンパク質と、前記第一のフィコビリタンパク質に結合体化した第一のパートナー色素とを含む。前記組成物は、非結合体化第二のフィコビリタンパク質も含む。前記第一のフィコビリタンパク質および前記第二のフィコビリタンパク質は、第一の（すなわち同じ）細菌種または真核藻種から得られる。１つの実施形態において、前記第一のフィコビリタンパク質と前記第二のフィコビリタンパク質は同じである。もう１つの実施形態において、前記第一および第二のフィコビリタンパク質は異なり、前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する。
【０００５】
もう１つの態様において、上に記載したような組成物は、第二のタンデム色素に結合体化した第二のリガンドをさらに含有する。前記第二のタンデム色素は、第三のフィコビリタンパク質と、該第三のフィコビリタンパク質に結合体化した第二のパートナー色素とを含む。前記第三のフィコビリタンパク質は、架橋および非架橋サブユニットを含有し、ならびに前記第一の細菌または真核藻種から得られる。この組成物は、サブユニットを含む非結合体化第四フィコビリタンパク質も含有する。前記第四のフィコビリタンパク質も前記第一の細菌または真核藻種から得られる。１つの実施形態において、前記第一、第二、第三および第四のフィコビリタンパク質は、同じである。もう１つの実施形態において、前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二および第三のフィコビリタンパク質と異なり、ならびに前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二および第三のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する。
【０００６】
さらなる態様において、上に記載したような組成物は、第三のタンデム色素に結合体化した第三のリガンドを含有する。前記第三のタンデム色素は、第五のフィコビリタンパク質と、該第五のフィコビリタンパク質に結合体化した第三のパートナー色素とを含有する。前記第五のフィコビリタンパク質は、架橋および非架橋サブユニットを含有し、ならびに前記第一の細菌または真核藻種から得られる。この組成物は、非結合体化第六のフィコビリタンパク質も含有する。前記非結合体化第六のフィコビリタンパク質は、サブユニットを含有し、および前記第一の細菌または真核藻種から得られる。１つの実施形態において、前記第一、第二、第三、第四、第五および第六のフィコビリタンパク質は、同じである。もう１つの実施形態において、前記第六のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二、第三、第四および第五のフィコビリタンパク質と異なり、ならびに前記第六のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二、第三、第四および第五のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する。
【０００７】
さらにもう１つの実施形態において、上に記載したような組成物は、第四のタンデム色素に結合体化した第四のリガンドも含有する。前記第四のタンデム色素は、第七のフィコビリタンパク質と、該第七のフィコビリタンパク質に結合体化した第四のパートナー色素とを含む。前記第七のフィコビリタンパク質は、架橋および非架橋サブユニットを含有し、ならびに前記第一の細菌または真核藻種から得られる。この組成物は、非結合体化第八のフィコビリタンパク質も含有する。前記非結合体化第八のフィコビリタンパク質は、サブユニットを含有し、および前記第一の細菌または真核藻種から得られる。１つの実施形態において、前記第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七および第八のフィコビリタンパク質は、同じである。もう１つの実施形態において、前記第八のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二、第三、第四、第五、第六および第七のフィコビリタンパク質と異なり、ならびに前記第八のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二、第三、第四、第五、第六および第七のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する。
【０００８】
もう１つの態様では、上に記載した組成物のいずれもが、フィコビリタンパク質でない色素に結合体化した１つ以上の追加のリガンドを含む。
【０００９】
さらにもう１つの態様において、前記第一のタンデム色素に結合体化した前記第一のリガンドと前記非結合体化第二のフィコビリタンパク質とを含有する上記組成物は、第一の細菌または真核藻種から得られる第三のフィコビリタンパク質に結合体化した１つ以上の追加のリガンドも含む。１つの実施形態において、前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質または前記第二のフィコビリタンパク質と同じである。もう１つの実施形態において、前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質または前記第二のフィコビリタンパク質と異なり、ならびに前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一および第二のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する。
【００１０】
なおまたさらなる態様において、前記第一のタンデム色素に結合体化した前記第一のリガンドと前記非結合体化第二のフィコビリタンパク質とを含有する上記組成物は、（ａ）第二のタンデム色素に結合体化した第二のリガンドおよび（ｂ）非結合体化第四のフィコビリタンパク質も含む。前記第二のタンデム色素は、第三のフィコビリタンパク質と、該第三のフィコビリタンパク質に結合体化した第二のパートナー色素とを含む。前記第三のフィコビリタンパク質は、架橋および非架橋サブユニットを含有し、ならびに第二の細菌または真核藻種から得られる。前記非結合体化第四のフィコビリタンパク質は、サブユニットを含有し、および前記第二の細菌または真核藻種から得られる。１つの実施形態において、前記第三および第四のフィコビリタンパク質は同じである。さらなる実施形態において、前記第三および第四のフィコビリタンパク質は異なり、ならびに前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第三のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する。
【００１１】
さらなる態様において、検体における細胞および非細胞集団を分析するための方法を提供する。この方法は、前記検体と本明細書に記載する組成物とを併せる工程、および蛍光を分析することによって前記検体中の前記集団を同定する工程を含む。望ましくは、前記細胞および非細胞集団の少なくとも１つは、前記第一のリガンドの受容体を含む。
【００１２】
本特許請求の範囲の本発明の様々な実施形態の他の態様および利点を、以下の発明の詳細な説明において開示する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図１Ａ〜３Ｊは、２つの異なる蛍光色素の蛍光強度を同じ全血検体の様々な細胞集団についてプロットしている、２および３色試薬組成物の二重パラメータヒストグラムである。これらのヒストグラムは、異なる量の遊離フィコビリタンパク質の使用による本明細書に記載するリガンド−色素組成物の保管中の安定性向上を明示している。図１Ａは、２から８℃で２１日間個々に保管した成分から新たに処方した、リガンド／色素結合体、すなわちＣＤ３−アロフィコシアニン（ＡＰＣ）（０．５μｇ）、およびリガンド／タンデム色素結合体、すなわちＣＤ１９−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素（０．５μｇ）、を含有する先行技術分野において入手可能な試薬組成物、すなわち「先行技術の作りたて（ｆｒｅｓｈ）混合物」を使用して調製した検体の、および該試薬組成物の効果を示す、二重パラメータヒストグラムを提供するものである。両方の結合体におけるＡＰＣは、同じ細菌種、すなわちＳｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓからのものである。遊離（非結合体化）ＡＰＣは存在しない。
【図１Ｂ】図１Ｂは、２から８℃で事前処方して２１日間保持した、ＣＤ３−ＡＰＣ（０．５μｇ）およびＣＤ１９−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素（０．５μｇ）を含有する先行技術分野において入手可能な組成物、すなわち「先行技術の保管混合物」を使用して調製した検体の、および該組成物の効果を示す、二重パラメータヒストグラムを提供するものである。両方の結合体中のＡＰＣは、同じ細菌種、すなわちＳｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓからのものである。遊離（非結合体化）ＡＰＣは存在しない。
【図１Ｃ】図１Ｃは、２から８℃で２１日間個々に保持した成分から新たに処方した、ＣＤ３−ＡＰＣ（０．５μｇ）、ＣＤ１９−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素（０．５μｇ）、および非結合体化ＡＰＣ（０．５μｇ）を含有する本明細書に記載する２色試薬組成物を使用して調製した検体の、および該２色試薬組成物の効果を示す、二重パラメータヒストグラムを提供するものである。
【図１Ｄ】図１Ｄは、２１日間、２から８℃で事前処方しておいた、ＣＤ３−ＡＰＣ（０．５μｇ）、ＣＤ１９−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素（０．５μｇ）、および非結合体化ＡＰＣ（０．５μｇ）を含有する本明細書に記載する２色試薬組成物を使用して調製した同じ検体の、および該２色試薬組成物の効果を示す、二重パラメータヒストグラムを提供するものである。図１Ａおよび１Ｂを図１Ｃおよび１Ｄと対比させる。
【図２Ａ】図２Ａは、ＣＤ３−ＡＰＣ（０．５μｇ）およびＣＤ１９−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素（０．５μｇ）を含有する先行技術の２色試薬組成物、すなわち「先行技術の作りたて混合物」を使用して新たに調製した対照検体の、二重パラメータ蛍光ヒストグラムを提供するものである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＣＤ３−ＡＰＣ（０．５μｇ）およびＣＤ１９−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素（０．５μｇ）を含有し、ならびに２から８℃で２１日間保持された、先行技術の２色試薬組成物、すなわち「先行技術の保管混合物」を使用する検体の、二重パラメータ蛍光ヒストグラムを提供するものである。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＣＤ３−ＡＰＣ（０．５μｇ）、ＣＤ１９−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素（０．５μｇ）、および０．０６２５μｇの天然の、非結合体化ＡＰＣを含有し、ならびに２から８℃で２１日間保持された、本明細書に記載する２色試薬組成物を使用する検体の二重パラメータ蛍光ヒストグラムを提供するものである。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＣＤ３−ＡＰＣ（０．５μｇ）、ＣＤ１９−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素（０．５μｇ）、および０．１２５μｇの天然の、非結合体化ＡＰＣを含有し、ならびに２から８℃で２１日間保持された、本明細書に記載する２色試薬組成物を使用する検体の二重パラメータ蛍光ヒストグラムを提供するものである。
【図２Ｅ】図２Ｅは、ＣＤ３−ＡＰＣ（０．５μｇ）、ＣＤ１９−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素（０．５μｇ）、および０．２５μｇの天然の、非結合体化ＡＰＣを含有し、ならびに２から８℃で２１日間保持された、本明細書に記載する２色試薬組成物を使用する検体の二重パラメータ蛍光ヒストグラムを提供するものである。
【図２Ｆ】図２Ｆは、ＣＤ３−ＡＰＣ（０．５μｇ）、ＣＤ１９−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素（０．５μｇ）、および０．５μｇの天然の、非結合体化ＡＰＣを含有し、ならびに２から８℃で２１日間保持された、本明細書に記載する２色試薬組成物を使用する検体の二重パラメータ蛍光ヒストグラムを提供するものである。
【図２Ｇ】図２Ｇは、ＣＤ３−ＡＰＣ（０．５μｇ）、ＣＤ１９−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素（０．５μｇ）、および２．０μｇの天然の、非結合体化ＡＰＣを含有し、ならびに２から８℃で２１日間保持された、本明細書に記載する２色試薬組成物を使用する検体の二重パラメータ蛍光ヒストグラムを提供するものである。
【図２Ｈ】図２Ｈは、ＣＤ３−ＡＰＣ（０．５μｇ）、ＣＤ１９−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素（０．５μｇ）、および５．０μｇの天然の、非結合体化ＡＰＣを含有し、ならびに２から８℃で２１日間保持された、本明細書に記載する２色試薬組成物を使用する検体の二重パラメータ蛍光ヒストグラムを提供するものである。
【図２Ｉ】図２Ｉは、ＣＤ３−ＡＰＣ（０．５μｇ）、ＣＤ１９−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素（０．５μｇ）、および１０μｇの天然の、非結合体化ＡＰＣを含有し、ならびに２から８℃で２１日間保持された、本明細書に記載する２色試薬組成物を使用する検体の二重パラメータ蛍光ヒストグラムを提供するものである。図２Ａおよび２Ｂと２Ｃから２Ｉとの比較により、先行技術のものに対する本明細書に記載する組成物の安定性向上が示される。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｊは、２つの異なる蛍光色素の蛍光強度を同じ全血検体の様々な細胞集団についてプロットしている、３色試薬組成物を使用することによって得た二重パラメータヒストグラムである。図３Ａおよび３Ｂは、ＣＤ４−ＸＬ−４−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００タンデム色素、ＣＤ１９−ＡＰＣおよびＣＤ８−ＸＬ−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素を含有する先行技術の組成物、すなわち「先行技術の作りたて混合物」を使用して新たに調製した検体の、蛍光ヒストグラムを提供するものである。図３Ｅ〜３Ｊのものとの比較のために、これらのヒストグラムを提供する。
【図３Ｂ】図３Ａおよび３Ｂは、ＣＤ４−ＸＬ−４−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００タンデム色素、ＣＤ１９−ＡＰＣおよびＣＤ８−ＸＬ−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素を含有する先行技術の組成物、すなわち「先行技術の作りたて混合物」を使用して新たに調製した検体の、蛍光ヒストグラムを提供するものである。図３Ｅ〜３Ｊのものとの比較のために、これらのヒストグラムを提供する。
【図３Ｃ】図３Ｃおよび３Ｄは、ＣＤ４−ＸＬ−４−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００タンデム色素、ＣＤ１９−ＡＰＣおよびＣＤ８−ＸＬ−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素を含有し、ならびに２から８℃で１２０日間保持された先行技術の組成物、すなわち「先行技術の保管混合物」を使用する検体の、蛍光ヒストグラムを提供するものである。図３Ｅ〜３Ｊのものとの比較のために、これらのヒストグラムを提供する。
【図３Ｄ】図３Ｃおよび３Ｄは、ＣＤ４−ＸＬ−４−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００タンデム色素、ＣＤ１９−ＡＰＣおよびＣＤ８−ＸＬ−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素を含有し、ならびに２から８℃で１２０日間保持された先行技術の組成物、すなわち「先行技術の保管混合物」を使用する検体の、蛍光ヒストグラムを提供するものである。図３Ｅ〜３Ｊのものとの比較のために、これらのヒストグラムを提供する。
【図３Ｅ】図３Ｅおよび３Ｆは、ＣＤ４−ＸＬ−４−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００タンデム色素、ＣＤ１９−ＡＰＣおよびＣＤ８−ＸＬ−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素および０．５μｇの天然の、非結合体化ＡＰＣを含有し、ならびに２から８℃で１２０日間保持された、本明細書に記載するとおりの組成物を使用する検体の蛍光ヒストグラムを提供するものである。
【図３Ｆ】図３Ｅおよび３Ｆは、ＣＤ４−ＸＬ−４−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００タンデム色素、ＣＤ１９−ＡＰＣおよびＣＤ８−ＸＬ−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素および０．５μｇの天然の、非結合体化ＡＰＣを含有し、ならびに２から８℃で１２０日間保持された、本明細書に記載するとおりの組成物を使用する検体の蛍光ヒストグラムを提供するものである。
【図３Ｇ】図３Ｇおよび３Ｈは、ＣＤ４−ＸＬ−４−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００タンデム色素、ＣＤ１９−ＡＰＣおよびＣＤ８−ＸＬ−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデムおよび１．０μｇの天然の、非結合体化ＡＰＣを含有し、ならびに２から８℃で１２０日間保持された、本明細書に記載するとおりの組成物を使用する検体の蛍光ヒストグラムを提供するものである。
【図３Ｈ】図３Ｇおよび３Ｈは、ＣＤ４−ＸＬ−４−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００タンデム色素、ＣＤ１９−ＡＰＣおよびＣＤ８−ＸＬ−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデムおよび１．０μｇの天然の、非結合体化ＡＰＣを含有し、ならびに２から８℃で１２０日間保持された、本明細書に記載するとおりの組成物を使用する検体の蛍光ヒストグラムを提供するものである。
【図３Ｉ】図３Ｉおよび３Ｊは、ＣＤ４−ＸＬ−４−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００タンデム色素、ＣＤ１９−ＡＰＣおよびＣＤ８−ＸＬ−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素および２．０μｇの天然の、非結合体化ＡＰＣを含有し、ならびに２から８℃で１２０日間保持された、本明細書に記載するとおりの組成物を使用する検体の蛍光ヒストグラムを提供するものである。
【図３Ｊ】図３Ｉおよび３Ｊは、ＣＤ４−ＸＬ−４−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００タンデム色素、ＣＤ１９−ＡＰＣおよびＣＤ８−ＸＬ−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素および２．０μｇの天然の、非結合体化ＡＰＣを含有し、ならびに２から８℃で１２０日間保持された、本明細書に記載するとおりの組成物を使用する検体の蛍光ヒストグラムを提供するものである。
【図４】図４は、様々な架橋度を有するＳｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓから単離したＡＰＣサンプルの、ならびにＳｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓから単離した架橋を有さない一（１）つのＡＰＣサンプルの、サイズ排除クロマトグラフィー保持容積に対する波長（Ａ２８０）のプロットを提供するものである。前記ＡＰＣの架橋率は、溶出ピーク下面積を計算することによって決定した。クロマトグラムにおける全面積に対するインタクトピークの積分面積の比によってサンプルについての架橋率を得た。このプロットの右側の最高ピークは、前記一（１）つの非架橋ＡＰＣサンプルに対応する。このプロットの残りのピークは、前記架橋ＡＰＣサンプルに対応する。具体的には、このプロットの左側のピークは、インタクトＡＰＣ分子に対応し、およびこのプロットの右側の（非架橋ＡＰＣピークの下の）小ピークは、ＡＰＣサブユニットに対応する。
【図５】図５は、フィコビリタンパク質と蛍光発生性（ｆｌｕｏｒｅｓｃａｂｌｅ）色素とを含むタンデム色素で標識したリガンドを、フィコビリタンパク質で直接標識したリガンドと共に保管したときに経時的に発生するサブユニット交換を示す略図である。山括弧（＾）は、架橋を表し、Ｌ１は、第一のリガンドを表し、Ｌ２は、第二のリガンドを表し、「色素」は、蛍光発生性色素を表し、「α」は、フィコビリタンパク質の１つのサブユニットを表し、および「β」は、フィコビリタンパク質の第二のサブユニットを表す。用語「架橋」またはその変化形は、容易に破壊されない共有結合による分子ユニットの連結を指す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本明細書に記載する組成物および方法は、マルチカラー試薬処方物中のフィコビリタンパク質含有タンデム色素の分解または不安定性に関連した困難に対する解決策をもたらす。
【００１５】
本出願の発明者らは、一緒に保管したフィコビリタンパク質およびそれらのタンデム色素への異なる抗体の結合体を含有する組成物を使用してこの問題を確認した。具体的には、異なる抗体に結合体化したアロフィコシアニン（ＡＰＣ）およびＡＰＣ−タンデム色素（例えば、ＡＰＣ．ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００、ＡＰＣ．ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０、ＡＰＣ．Ｃｙ（登録商標）７など）の結合体を、マルチカラー処方物において一緒に保管し、生物検体と併せ、その後、フローサイトメトリーを用いてそのサンプルを分析したとき、上に記載した「困難」が観察された。それらの蛍光ヒストグラムでは、別々に保管した同じ試薬の新たな混合物を他の点では同一の条件下で使用したときの蛍光ヒストグラムと比較して、補正要求（ブリード・オーバー（ｂｌｅｅｄ ｏｖｅｒ））の漸進的増加が観察された。フィコエリトリン（ＰＥ）およびＰＥ系タンデム色素（例えば、ＰＥ−Ｔｅｘａｓ ＲｅｄＴＭ、ＰＥＣｙ（登録商標）５、ＰＥＣｙ（登録商標）５．５、ＰＥ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７、ＰＥ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００およびＰＥＣｙ（登録商標）７）の抗体結合体を使用したときも、類似した観察がなされた。
【００１６】
理論により拘束されることを望まないが、本発明者らは、フィコビリタンパク質を含有するリガンド−タンデム色素結合体とリガンド−フィコビリタンパク質結合体との間で、それらが混合状態にあるとき、発生するサブユニット交換が、該タンデム色素と該直接結合体化フィコビリタンパク質との間での補正要求の望ましくない増加（ブリード・オーバー）を生じさせる結果となると推測した。本発明者らは、架橋フィコビリタンパク質の結合体、例えばＸＬ．ＡＰＣ、と架橋タンデム色素の対応する結合体、例えば、ＸＬ．ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０、とを併せ、約２から約８℃の温度で保持したとき、個々のフィコビリタンパク質分子のサブユニットが交換するようであることに気づいた。例として、本発明者らは、ＣＤ３−ＡＰＣをＣＤ１９−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０と混合し、ある期間にわたって約２から約８℃で保持したとき、蛍光ヒストグラムによって証明されるように、ＣＤ３−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０およびＣＤ１９−ＡＰＣ結合体が形成されたようであることに気づいた。
【００１７】
このフィコビリタンパク質サブユニット交換の１つの態様を図５において図によって明らかにする。勿論、図５に示すリガンドおよび／または蛍光発生性色素の１つ以上を架橋サブユニットまたは非架橋サブユニットに結合体化し得ること、ならびにこのサブユニット交換の様々な変更形態が同じ溶液中で発生し得ることは、当業者には理解される。
【００１８】
アロフィコシアニンＢ（ＡＰＣ−Ｂ）とアロフィコシアニン（ＡＰＣ）（両方とも、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ６３０１、シアノバクテリウム、から単離されたものである）の間のサブユニット交換は、文献において論じられている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５６，１２６００（１９８１）参照）。要約すると、ＡＰＣ−ＢとＡＰＣの混合物では、異種三量体がサブユニット交換によってほぼ統計量で形成されることが書き留められている。例えば、ＡＰＣが、個々のサブユニットの構造およびアミノ酸配列に基づき疎水性相互作用ならびに水素およびイオン結合の組み合わせによって会合している３つのα−サブユニットおよび３つのβ−サブユニットを含む四量体構造を有することは公知である。低濃度で、低ｐＨ条件で、および１つ以上のカオトロピックイオンに曝露されたとき、ＡＰＣがそのサブユニット（α−βモノマーならびにαおよびβ成分）に解離することも公知である。本明細書において用いる場合の用語「カオトロピックイオン」は、分子内相互作用の安定化に干渉することによりフィコビリタンパク質の三次元構造を破壊する作用因子を指す。架橋ＡＰＣ組成物は、様々な販売元（数ある中でも、Ｐｒｏｚｙｍｅ Ｉｎｃ．およびＭａｒｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって報告され、市販されている。
【００１９】
本発明者らは、この望ましくないサブユニット交換問題に対処するために本明細書において論じる新規試薬組成物を考案した。本発明者らは、リガンド結合体化フィコビリタンパク質タンデム色素を含有する試薬組成物に、該リガンド結合体化タンデム色素におけるフィコビリタンパク質と同じ細菌種からのものであるか、またはそれらとサブユニット交換することができる、非結合体化フィコビリタンパク質を添加することによって、比較的安定な試薬組成物が得られることを発見した。上の概要において述べた、および下で詳細に論ずるようなこれらの安定な色素組成物の様々な実施形態により、生物検体分析用の先行技術のマルチカラー組成物について本発明者が確認した安定性の問題は解決される。本明細書に記載する組成物の様々な実施形態は、次の標識リガンドを含有することがある：（ａ）フィコビリタンパク質を含有するタンデム色素に結合体化した少なくとも１つのリガンド；（ｂ）場合により、フィコビリタンパク質に直接結合体化した１つ以上のリガンド；および（ｃ）場合により、フィコビリタンパク質ではない蛍光性色素または標識に結合体化した１つ以上のリガンド。前記組成物は、タンデム色素に結合体化したリガンドのフィコビリタンパク質とサブユニットを交換する少なくとも１つの非結合体化フィコビリタンパク質も、別の成分として含有する。
【００２０】
本明細書において用いる場合の用語「安定な」は、生物検体との混合前および／または後の本発明の組成物を指す。１つの実施形態において、「安定な」は、生物検体に添加し、その後、蛍光を用いて細胞集団についてそれを分析したとき、蛍光特性に有意な変化を生じさせる結果とならない、本明細書に記載する組成物を指す。望ましくは、「安定な」は、リガンド結合体化タンデム色素の蛍光特性、および任意の他のリガンド結合体化フィコビリタンパク質の蛍光特性が、混合後に変化しない組成物を指す。さらなる実施形態において、前記組成物は、その成分を混合した直後および生物検体と混合する前に「安定」している。もう１つの実施形態において、前記組成物は、混合後少なくとも１週間から約５２週間まで約２から約８℃で保管した後、「安定」している。追加の例として、そのような組成物は、混合後少なくとも４、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、または５１週間、安定している。
【００２１】
望ましくは、前記組成物は、それらの保管または取扱いに必要な任意の温度で安定している。１つの実施形態において、前記組成物は、低温、すなわち室温より低い温度、で安定している。もう１つの実施形態において、前記組成物は、約２から約１０℃で安定している。特定の実施形態において、前記組成物は、約２、３、４、５、６、７、８、９または１０℃で安定している。さらにもう１つの実施形態において、前記組成物は、室温で安定している。いっそうさらなる実施形態において、前記組成物は、高温、すなわち室温より高い温度、で安定している。
【００２２】
本明細書に記載する新規色素組成物を細胞および非細胞分析のための方法において用いたとき、リガンド結合体化タンデム色素、またはリガンド結合体化フィコビリタンパク質、いずれかで標識した細胞の蛍光特性に関して、低減されたブリードオーバーが観察されたか、または新たに調製した組成物に比べてブリードオーバーは観察されなかった。例えば、本図面、および本明細書の中で提供する実施例を参照のこと。さらに、前記色素組成物は、誤ったデータの減少、より少ない廃棄色素組成物に起因する費用低減、および作りたて色素組成物（作りたて対照組成物を含む）を連続調製するために必要とされる時間の低減をもたらした。
【００２３】
（Ｉ．定義）
以下の定義を提供する。以下の定義は、当該技術分野において広範に利用できる情報を含む。ある用語の例を提供する場合、それは、網羅的であることを意図したものではなく、当該技術分野において公知のまたは利用できる他の例を含むことがある。従って、そのような例は、本発明の限定を意味するものではない。
【００２４】
（Ａ．「検体」）
本明細書において用いる場合の「検体」は、細胞および／または非細胞集団を含有する任意の哺乳動物細胞含有懸濁物、すなわち生物検体、である。特定の実施形態において、検体を提供する哺乳動物はヒトであるが、他の非ヒト哺乳動物からの検体も用いることができる。用語「細胞の」および「非細胞の」は、当業者には容易に理解される。細胞または非細胞集団の少なくとも１つは、上で記載した組成物に用いられる異なるリガンドそれぞれについての受容体を必要とする。典型的「細胞」集団としては、限定ではないが、血液学的細胞および非血液学的細胞が挙げられる。そのような検体としては、限定ではないが、全血、末梢血、骨髄吸引液、リンパ節組織、脾臓組織、脳脊髄液、皮膚組織、粘膜組織、胸腔穿刺液、胸膜液、および脊髄液が挙げられる。血液学的（すなわち血液）細胞集団は、単球、リンパ球、好中球、好酸球、好塩基球、骨髄球、後骨髄球、前骨髄球、未成熟顆粒球、杵状球（ｂａｎｄ）、芽球、変異（ｖａｒｉａｎｔ）リンパ球および異型（ａｔｙｐｉｃａｌ）リンパ球の中から選択される。非白血球血液学的細胞集団としては、赤血球、網状赤血球、有核赤血球、血小板、網状血小板および巨核球が挙げられる。血液中の異型細胞としては、骨髄球、後骨髄球、前骨髄球、未成熟顆粒球、杵状球（ｂａｎｄ ｃｅｌｌｓ）、芽球、異形リンパ球、変異リンパ球、有核赤血球、巨大血小板、血漿細胞などが挙げられる。非血液学的細胞としては、数ある中でも、上皮細胞および内皮細胞が挙げられる。典型的な「非細胞」集団としては、限定ではないが、数ある中でも、ビーズ、タンパク質、微粒子、ミクロソームが挙げられる。
【００２５】
１つの実施形態において、検体は、単球、リンパ球、好中球、好酸球および好塩基球である５つの「正常」な白血球集団を含有し、ならびに疾患、有害な環境刺激、例えば発癌性物質、に対する反応、または治療処置の結果に起因する多数の異型細胞集団をことによると含有する、ヒト全血または末梢血検体である。従って、これらの方法による分析に適する検体は、成熟および未成熟両方の白血球および非白血球集団、ならびに異型細胞を含有し得る可能性が高いヒト患者血液検体である。１つの例では、検体は、芽球を含有する。さらなる例では、検体は、有核赤血球を含有する。もう１つの例として、検体は、未成熟顆粒球を含有する。さらにもう１つの例として、検体は、異形リンパ球を含有する。異常検体中の細胞の他の組み合わせも、本明細書に記載する方法および組成物によって分析することができる。
【００２６】
（Ｂ．「リガンド」）
本明細書に記載する組成物のすべての実施形態において、用語「リガンド」は、細胞または非細胞粒子の表面に存在する受容体に結合する部分（例えば、抗体）を指す。１つの実施形態において、リガンドを、上で記載したタンデム色素のフィコビリタンパク質「に結合体化させる」、「と会合させる」または「に結合させる」。当業者は、当該技術分野における方法により、タンデム色素をモノクローナル抗体などのリガンドに容易に結合体化させることができる。１つの実施形態では、前記タンデム色素を、該色素のイミノチオラン活性化によって、前記リガンドに結合体化させる。
【００２７】
本明細書において用いる場合、リガンドは、１つ以上の特定の受容体を検出して該受容体と反応する様々な作用因子を含む。すべての適するリガンドは、粒子集団の特定受容体を結合する望ましい能力を特徴とする。１つの実施形態において、前記リガンドは、細胞表面受容体のすべてまたは一部分に優先的に結合する成分である。典型的に、前記リガンドは、単離することができ、および自然に存在することがあり、または組換え生産することができ、または人工のもしくは合成のものであり得る、アミノ配列または核酸配列を含有する。１つの実施形態において、前記リガンドは、タンパク質、例えば抗体もしくは酵素、またはそれらのフラグメントである。もう１つの実施形態において、前記リガンドは、核酸プローブである。さらに他の実施形態において、前記リガンドは、多分子集合体、例えば組換えタンパク質の四量体、である。そのようなリガンドの構築に有用な方法は、当業者に公知である。
【００２８】
慣例的には、細胞分析のために、細胞表面決定基に対する抗体または抗体フラグメントが、一般に好まれるリガンドである。本明細書において用いる場合の用語「抗体」は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥのポリクローナル、モノクローナル、合成または組換え抗体を包含することを意図したものである。抗体フラグメントも有用であり、抗体フラグメントとしては、限定ではないが、上のインタクト抗体の１つ以上についてのＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントまたはＦｃ抗体フラグメントが挙げられる。類似して、一本鎖可変抗体フラグメントまたは抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む組換え構築物をこれらの方法において有用なリガンドとして用いることができる。さらに、所望の細胞表面抗原を結合する抗体の機能的に等価の結合特性を保持するために十分なＣＤＲを共有する合成抗体またはキメラ抗体またはヒト化抗体構築物も、一般に好まれるリガンドとして利用することができる。
【００２９】
１つの実施形態において、本明細書に記載する組成物に使用するための個々のリガンドまたは抗体は、選択された検体中の細胞集団上で差次的に発現される抗原決定基にそれぞれ結合するものであり、ならびに光散乱および／または電気的パラメータとの特定の組み合わせによって所望の差次的情報が得られるように選択される。例えば、１つの実施形態において、本明細書において有用な抗体は、白血球および非白血球の集団上で差次的に発現される抗原決定基に結合する。そのような抗原決定基は、非白血球には完全になく、白血球上でしか発現されない場合がある。あるいは、そのような抗原決定基は、白血球上で豊富に発現され、非白血球上で最小限にしか発現されないことがある。従って、そのような抗体は、白血球と非白血球、例えば赤血球（ＲＢＣ）、有核赤血球または血小板、を識別および差別化することができる。さらに他の実施形態は、同じ細胞タイプまたは集団上の異なる決定基を結合する１つより多くの抗体を用いる。従って、同じ細胞タイプまたは集団上の異なる決定基を結合する異なる抗体の組み合わせを、細胞集団上の１つの決定基を結合する単一の抗体の代わりに用いることができる。もう１つの実施形態において、そのような抗体（または抗体の組み合わせ）は、白血球が成熟および加齢するにつれての該白血球上の抗原決定基の差次的発現に基づき、成熟白血球と未成熟白血球とを区別することもできる。
【００３０】
本明細書に記載する組成物においてリガンドとして有用な、および血液学的分析のために有用な抗体としては、限定ではないが、当該技術分野に公知であるものの中でもとりわけ、抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ５、抗ＣＤ７、抗ＣＤ８、抗ＣＤ９、抗ＣＤ１０、抗ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、抗ＣＤ１３、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ１５、抗ＣＤ１６、抗ＣＤ１６ｂ、抗ＣＤ１８、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２３、抗ＣＤ２４、抗ＣＤ２５、抗ＣＤ３３、抗ＣＤ３５、抗ＣＤ３６、抗ＣＤ３８、抗ＣＤ４１、抗ＣＤ４５、抗ＣＤ４５ＲＡ、抗ＣＤ４８、抗ＣＤ４９ｄ、抗ＣＤ５０、抗ＣＤ５２、抗ＣＤ５３、抗ＣＤ５５、抗ＣＤ５６、抗ＣＤ５９、抗Ｃｄ６１、抗ＣＤ６２Ｌ、抗ＣＤ６２ｐ、抗ＣＤ６４、抗ＣＤ６６ｂ、抗ＣＤ６６ｃ、抗ＣＤ７３、抗ＣＤ８２、抗ＣＤ８７、抗ＣＤ９０、抗ＣＤ１１７、抗ＣＤ１４２、抗ＣＤ２３５ａ、抗ＣＤ２３５ｂ、抗ＣＤ２３５ｃ、抗ＣＤ２３６、抗ＣＤ２３６ｒ、抗ＣＤ２３９、抗ＣＤ２４０、抗ＣＤ２４１、抗ＣＤ２４２、抗ｇｐ４２、抗ＬＹ−６、抗ＲＴ ６、抗ＳＣＡ−２、抗Ｋａｐｐａ、抗Ｌａｍｂｄａ、および抗ＨＬＡ−ＤＲが特に挙げられる。前記組成物中の特定のリガンド（単数または複数）の選択によって本発明が限定されないこと、および当業者が、前記組成物に含めるために、本明細書に具体的に列挙しない他のリガンドまたは抗体を選択し利用できるだろうということは、容易に理解される。
【００３１】
前記組成物は、１つ以上のリガンドを含有する。１つの実施形態において、前記組成物は、２つ以上のリガンドを含有する。もう１つの実施形態において、前記組成物は、３つ以上のリガンドを含有する。さらなる実施形態において、前記組成物は、４つ以上のリガンドを含有する。さらにもう１つの実施形態において、前記組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のリガンドを含有する。単一の試薬組成物において用いることができるリガンドの「最大」数がないこと、ならびにその選択が利用する試薬および計器の能力に依存することは、当業者には容易に理解される。
【００３２】
単一の組成物中に存在するリガンドは、同じであることもあり、または異なることもある。１つの実施形態において、前記組成物は、２つのリガンドを含有し、それらのリガンドは同じである（Ｌ１およびＬ１）。もう１つの実施形態において、前記組成物は、２つのリガンドを含有し、それらのリガンドは異なる（Ｌ１およびＬ２）。さらなる実施形態において、前記組成物は、３つのリガンドを含有し、それらのリガンドのすべてが同じである（Ｌ１、Ｌ１、およびＬ１）。なおまたさらなる実施形態において、前記組成物は、３つのリガンドを含有し、３つすべてのリガンドが異なる（Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３）。さらにもう１つの実施形態において、前記組成物は、３つのリガンドを含有し、それらのリガンドのうちの２つが同じであり、１つのリガンドが異なる（Ｌ１、Ｌ１およびＬ２）。さらなる実施形態において、前記組成物は、４つのリガンドを含有し、それらのリガンドのすべてが同じである（Ｌ１、Ｌ１、Ｌ１、Ｌ１）。なおまたさらなる実施形態において、前記組成物は、４つのリガンドを含有し、それらのリガンドの４つすべてが異なる（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４）。さらにもう１つの実施形態において、前記組成物は、４つのリガンドを含有し、それらのリガンドのうちの任意の２つが同じであり、および他の２つは同じであるが、最初の２つのリガンドとは異なる（Ｌ１、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ２）。なおまたさらなる実施形態において、前記組成物は、４つのリガンドを含有し、それらのリガンドのうちの任意の３つは同じであり、第四のリガンドが異なる（Ｌ１、Ｌ１、Ｌ１、およびＬ２）。同様の数列を、５つ以上のリガンドを含有する組成物に用いることができ、当業者はそれを容易に決定できる。下記方程式を参照のこと（式中、ｎは、リガンドの総数であり、ｒは、他のものと異なるリガンドの数であり、および０≦ｒ≦ｎ）。
【００３３】
【化１】
本明細書に記載する組成物または方法において使用するために選択されるそれぞれのリガンドを、蛍光色素または蛍光性色素と呼ばれる蛍光検出可能標識と会合させるか、該標識に結合体化させるか、または該標識に結合させる。そのような蛍光色素または蛍光性色素には、フィコビリタンパク質；フィコビリタンパク質である場合もあり、ない場合もあるパートナー色素に結合体化した、フィコビリタンパク質を用いるタンデム色素；ならびにリガンドを標識するために従来用いられている他の色素などがある。本明細書に記載する組成物の実施形態のすべてにおいて、少なくとも１つのリガンドを、フィコビリタンパク質を含有するタンデム色素に結合体化させる。他の実施形態では、加えて、少なくとも１つのフィコビリタンパク質または他の蛍光性色素を、リガンドに直接結合させる。
【００３４】
選択された蛍光色素とリガンドを会合、結合体化またはカップリングさせるための方法は、同様に従来的であり、当業者に公知である。公知の蛍光色素取付け法は、記載されている（例えば、数ある中でも、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，第６版，Ｒ．Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，１９９６；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，１９９４／１９９５；米国特許第６，６９２，９６８号および同第５，１６４，３１１号を参照のこと（これらは、参照により本明細書に援用されている））。従って、タンデム色素またはフィコビリタンパク質または他の非フィコビリタンパク質色素のカップリング方法の選択により、本明細書に記載する組成物は限定されない。同様に、タンデム色素の成分を結合体化させる方法は、従来的であり、当該技術分野に公知である。
【００３５】
前記方法において使用されるリガンドの最適な濃度は、選択されるリガンドに基づいて規定され、当業者はそれを決定できる。
【００３６】
（Ｃ．「タンデム色素」）
本明細書に記載する組成物の実施形態のすべてにおいて、フィコビリタンパク質を含有するタンデム色素に少なくとも１つのリガンドを結合体化させる。当業者に公知のとおり、および本明細書において用いる場合の用語「タンデム色素」は、本明細書において「パートナー」色素と呼ぶ別の蛍光性色素に結合体化した、そのサブユニット間にある程度の架橋を有するフィコビリタンパク質で構成された自然に存在しない分子を指す。様々な公知のおよび市販されているタンデム色素を本記載組成物に用いることができる。
【００３７】
本明細書における組成物に有用なタンデム色素の例は、米国特許第４，５４２，１０４号；同第５，２７２，２５７号；および同第５，１７１，８４６号；Ａ．Ｓ．Ｗａｇｇｏｎｅｒら、１９９３ Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６７７：１８５−１９３；Ｍ．Ｒｏｅｄｅｒｅｒら、１９９６ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２４：１９１−１９７に記載されており、これらは参照により本明細書に援用されている。１つの望ましい実施形態において、前記タンデム色素は、アロフィコシアニンとＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００色素のタンデム色素、アロフィコシアニンとＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０色素のタンデム色素、アロフィコシアニンとＣｙ（登録商標）７色素のタンデム色素、フィコエリトリンとＴｅｘａｓ ＲｅｄＴＭ色素のタンデム色素、フィコエリトリンとＣｙ（登録商標）５色素のタンデム色素、フィコエリトリンとＣｙ（登録商標）５．５色素のタンデム色素、フィコエリトリンとＣｙ（登録商標）７色素のタンデム色素、およびアロフィコシアニンとＨ７ＴＭ色素のタンデム色素である。
【００３８】
１つの特定の実施形態において、前記タンデム色素は、ＡＰＣ．ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００色素である。もう１つの特定の実施形態において、前記タンデム色素は、ＡＰＣ．ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０色素である。さらにもう１つの特定の実施形態において、前記タンデム色素は、ＡＰＣ．Ｃｙ（登録商標）７色素である。
【００３９】
（Ｄ．「フィコビリタンパク質」）
当業者に公知のとおり、および本明細書において用いる場合のフィコビリタンパク質は、細菌または真核藻から単離される２つ以上の連結されたサブユニットで構成された蛍光タンパク質であり、血液学的分析に広範に用いられている。参照により本明細書に援用されている「Ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｒｏｂｅｒｔ ＭａｃＣｏｌｌ ａｎｄ Ｄｅｂｏｒａｈ Ｇｕａｒｄ−Ｆｒｉａｒ，ＣＲＳ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）を参照のこと。フィコビリタンパク質は、当該技術分野において、限定ではないが、数ある中でも、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｓｉｇｍａ、およびＰｒｏｚｙｍｅをはじめとする販売元から、幅広く入手できる。
【００４０】
１つの実施形態では、前記フィコビリタンパク質を細菌種から単離することができる。一定のフィコビリタンパク質は、シアノバクテリウムから単離される。フィコビリタンパク質を発現することができるシアノバクテリア種の例としては、限定ではないが、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｏｌａｃｅｕｓ、Ｔｏｌｙｐｏｔｈｒｉｘ ｔｅｎｕｉｓ、またはＬｙｎｇｂｙａ ｌａｇｅｒｈｅｉｍｉｉが挙げられる。さらなる実施形態では、前記フィコビリタンパク質を真核藻種から単離することができる。
【００４１】
１つの実施形態において、前記フィコビリタンパク質は、限定ではないが、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、フィコシアニン（ＰＣ）、およびフィコエリスロシアニン（ＰＥＣ）である。さらなる実施形態において、前記フィコビリタンパク質は、Ｒ−フィコエリトリン（ＲＰＥ）、Ｂ−フィコエリトリン（ＢＰＥ）、Ｃ−フィコエリトリン（ＣＰＥ）、Ｙ−フィコエリトリン（ＹＰＥ）、Ｃ−フィコシアニン（ＣＰＣ）、フィコエリトリン５６６（ＰＥ５６６）、フィコエリスロシアニン（ＰＥＣ）、Ｒ−フィコシアニン（ＲＰＣ）、およびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）である。もう１つの実施形態において、前記フィコビリタンパク質は、アロフィコシアニンである。
【００４２】
（Ｅ．蛍光性色素または蛍光色素）
本明細書において用いる場合、タンデム色素を形成するために、今記載したばかりのフィコビリタンパク質に結合体化させる、「パートナー」と記述するいずれの色素も、非フィコビリタンパク質色素に直接結合体化した１つ以上のリガンドを含有する組成物の実施形態において用いることができる。従って、フィコビリタンパク質以外の蛍光色素、蛍光標識、または蛍光性色素についての以下の記載は、タンデムパートナー色素（これは、一般に、フィコビリタンパク質以外のものである）にも、これらの組成物の自由選択のリガンド成分に直接結合体化した個々の色素にも、あてはまる。これらの組成物および方法の一定の実施形態では、少なくとも１つのフィコビリタンパク質または他の蛍光性色素をリガンドに直接結合させる。タンデム色素についてのドナー−アクセプターペアの望ましい特性は、参照により本明細書に援用されている米国特許第４，５４２，１０４号に記載されている。
【００４３】
それぞれの蛍光性色素は、特性「発光スペクトル」を有し、その一部分が特性「ピーク発光スペクトル」である。本明細書において用いる場合、用語「発光スペクトル」は、蛍光色素が励起されたときに放射する、それぞれの周波数の電磁放射線の量を一般に意味する。一般に、発光スペクトルは、ナノメートルで通常は測定される一定の周波数帯（すなわち波長）によって構成される範囲またはプロフィールである。本明細書において用いる場合、用語「ピーク発光スペクトル」は、発光スペクトルの最大強度部分を意味する。多種多様な色素についての発光スペクトルが当該技術分野において公知であり、ならびに限定ではないが、参照により本明細書に援用されているＳｈａｐｉｒｏ，Ｈｏｗａｒｄ Ｍ．（２００３）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ 第４版，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ ｐｐ．２９６−２９７を含む様々な周知テキストにおいて公表されている。任意の所与の蛍光色素についてのピーク発光スペクトルは、公知であり、ならびにそのような蛍光色素を記載している出版物、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，第６版，Ｒ．Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，１９９６；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，１９９４／１９９５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、および当業者に公知の他の類似のテキストから容易に得ることができ、ならびに参照により本明細書に援用されている。蛍光分光光度計を使用してスペクトルスキャンを行うことにより、任意の所与の蛍光色素についての発光スペクトル特性を得ることもできる。
【００４４】
当業者は、任意の数の追加の、および従来用いられている、蛍光性色素を、タンデム色素の「パートナー」色素として、またはリガンドに直接結合体化させられる色素として、容易に選択することができる。前記パートナーおよび他の色素は、供給源、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲおよびＰｒｏｚｙｍｅ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡから商業的に容易に入手することができる。前記パートナー色素は、市販されており、それらの使用は、当該技術分野において公知である。
【００４５】
さらに他の蛍光性色素が他の供給源から入手可能であり得、または将来開発されることがあり得る。そのような蛍光性色素または蛍光色素は、下の実施例の例示的蛍光性色素と同様にこれらの様々な方法において有用であると予想される。下で提供する蛍光色素のこれらのリストは、前記組成物および方法の実施形態のうちの１つにおいて「パートナー」色素としてのまたはリガンドに直接結合体化した色素としての使用に適する色素の代表的なものにすぎず、網羅的リストを含むことを企図したものではない。当業者は、本明細書の追加の教示にかんがみて本明細書に記載する組成物および方法における使用に適する蛍光色素組み合わせを容易に選択できるはずである。
【００４６】
前記パートナーまたは他の色素が、細胞透過性であることもあり、非細胞透過性である場合もある、蛍光性色素。用語「細胞透過性の」とは、組成物または反応混合物中に透過性化剤（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）の追加の存在を必要とすることなく、細胞膜を容易に透過して細胞の成分を染色する色素を記述するためのものである。もう１つの実施形態において、前記パートナーまたは他の色素が選択され得る蛍光色素は、細胞不透過性色素、例えば、赤色、緑色または青色励起波長領域内の細胞不透過性色素である。
【００４７】
本明細書におけるタンデム色素において用いることができる蛍光性「パートナー」色素、または一定の実施形態においてリガンドに直接結合体化させることができる色素の例としては、限定ではないが、シアニン色素、例えば、Ｃｙ（登録商標）５色素、Ｃｙ（登録商標）５．５色素、およびＣｙ（登録商標）７色素；ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）色素、例えば、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４０５色素、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６１０色素、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９５色素、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７色素、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００色素、およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０色素、およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８色素；Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １２３；Ｔｅｘａｓ ＲｅｄＴＭ色素；ならびにＡｔｔｏＴＭ色素が挙げられる。これらの色素の多く、ならびに本明細書に記載する方法においてタンデム「パートナー」色素としてまたはリガンド（単数もしくは複数）への直接結合体化のための色素として用いることができる他のものが、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．（オレゴン州ユージーン）から市販されている。参照により本明細書に援用されている米国特許第５，５６３，０７０号を参照のこと。
【００４８】
１つの特定の実施形態において、前記蛍光性パートナー色素は、Ｔｅｘａｓ ＲｅｄＴＭ色素、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）色素、シアニン色素、およびＡｔｔｏＴＭ色素から選択される。もう１つの特定の実施形態において、前記ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）色素は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６１０色素、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９５色素、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７色素、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００色素、およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０色素の中から選択される。さらに特定の実施形態において、前記シアニン色素は、Ｃｙ（登録商標）５色素、Ｃｙ（登録商標）５．５色素、およびＣｙ（登録商標）７色素から選択される。
【００４９】
（ＩＩ．フィコビリタンパク質含有組成物）
上で論じたように、本明細書において提供する組成物は、一番単純な実施形態では、フィコビリタンパク質含有タンデム色素に結合体化したリガンドと、非結合体化フィコビリタンパク質とを含有する。
【００５０】
（Ａ．パートナー色素に結合体化したフィコビリタンパク質を含有するタンデム色素）
前記タンデム色素のフィコビリタンパク質成分を、上で述べた任意のフィコビリタンパク質、市販されている任意のフィコビリタンパク質および従来の方法によって調製または精製することができる任意のフィコビリタンパク質から選択することができる。幾つかの架橋サブユニット（および場合により非架橋サブユニットも）を含有するか、または架橋を含有するように修飾される任意のフィコビリタンパク質を、本明細書に記載する組成物および方法においてタンデム色素として用いることができる。
【００５１】
当該技術分野において販売元から入手できるＡＰＣにおける架橋度を決定しようとして、本発明者らは、限定ではないが高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む、当該技術分野において公知の技術を用いた。さらに、当業者は、商業的供給源から入手できるものと一致するかまたはそれより高度な架橋を有するフィコビリタンパク質を得るために、販売元から入手できるＡＰＣにおいて公知の精製および架橋技術を実行することが容易にできる。より高度に架橋したフィコビリタンパク質を精製または獲得するそのような方法は、当業者に公知である。そのような従来の方法としては、Ｔｒｉｎｑｕｅｔ Ｅ．，Ｍａｕｒｉｎ Ｆ．，Ｐｒｅａｕｄａｔ Ｍ．，Ｍａｔｈｉｓ Ｇ．（２００１）「Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ １ ａｓ ａ Ｎｅａｒ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ ｉｎ ａ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ」，Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９６，２３２−２４４が挙げられる。
【００５２】
１つの実施形態において、前記タンデム色素のフィコビリタンパク質成分は、少なくとも約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、７６、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％、またはそれらの間の分数百分率、の架橋を含有する。もう１つの実施形態において、前記タンデム色素のフィコビリタンパク質成分は、約５０％から約１００％架橋を含有する。さらなる実施形態において、前記タンデム色素のフィコビリタンパク質成分は、約６０％から約１００％架橋を含有する。さらにもう１つの実施形態において、前記タンデム色素のフィコビリタンパク質成分は、約７０％から約１００％架橋を含有する。なおまたさらなる実施形態において、前記タンデム色素のフィコビリタンパク質成分は、約８０％から約１００％架橋を含有する。さらにもう１つの実施形態において、前記タンデム色素のフィコビリタンパク質成分は、約９０％から約１００％架橋を含有する。いっそうさらなる実施形態において、前記タンデム色素のフィコビリタンパク質成分は、約９５％から約１００％架橋を含有する。しかし、前記タンデム色素のフィコビリタンパク質成分が２０％未満の架橋を有したとしても、それは本発明の制限ではない。
【００５３】
タンデム色素を形成するためにフィコビリタンパク質に結合体化させる蛍光性「パートナー」色素は、上に記載した色素から選択することができる。本明細書に記載する方法および組成物の様々な実施形態によると、リガンド（単数または複数）に結合体化させる、タンデム色素におけるパートナー色素として使用する色素は、別のフィコビリタンパク質を有するタンデム色素においても使用することができ、またはその組成物中のリガンドを独立して標識するために使用することもできる。
【００５４】
（Ｂ．非結合体化フィコビリタンパク質）
上で論じた標識リガンドに加えて、本明細書に記載する組成物の実施形態は、非結合体化フィコビリタンパク質の存在も必要とする。本明細書において用いる場合の「非結合体化」または「遊離」フィコビリタンパク質は、上で記載したフィコビリタンパク質であるが、リガンドに結合体化していないものである。非結合体化フィコビリタンパク質は、サブユニットを含有し、これらのサブユニットのうちのいくつかは、架橋していてはいけない。１つの実施形態において、前記非結合体化フィコビリタンパク質は、そのサブユニット間の架橋を含有しない。もう１つの実施形態において、前記非結合体化フィコビリタンパク質は、サブユニット間の架橋を含有する。前記非結合体化フィコビリタンパク質に架橋が存在する場合、前記非結合体化フィコビリタンパク質中の架橋の量は、前記タンデム色素の結合体化フィコビリタンパク質における架橋の量より少ないことが望ましい。
【００５５】
１つの実施形態では、前記非結合体化フィコビリタンパク質を、前記タンデム色素の結合体化フィコビリタンパク質と同じ細菌または真核藻種から得なければならない。最良の結果のために、それぞれのリガンド結合体化タンデム色素について、（前記タンデム色素中のフィコビリタンパク質と同じ種から得た）対応する非結合体化フィコビリタンパク質をその組成物に添加しなければならない。１つの実施形態において、前記非結合体化フィコビリタンパク質は、前記結合体化フィコビリタンパク質と同じである。用語「同じ」は、結合体化および非結合体化フィコビリタンパク質を記述するために用いるとき、それぞれの分子の同一の構造的特徴を指す。
【００５６】
もう１つの実施形態において、前記非結合体化フィコビリタンパク質は、前記タンデム色素の結合体化フィコビリタンパク質とは異なるが、前記タンデム色素のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する。
【００５７】
前記非結合体化フィコビリタンパク質は、上で述べた販売元から購入することもでき、または上に記載したように、単離されたタンパク質、天然タンパク質、合成タンパク質、または修飾タンパク質である場合がある。しかし、フィコビリタンパク質の供給源またはここでの使用のためにそれに施される修飾の量は、本発明の制限ではない。前記非結合体化フィコビリタンパク質を、その蛍光を除去するかまたは減少させるように改変または修飾することもできる。１つの実施形態では、前記非結合体化フィコビリタンパク質を、例えばＵＶ光の照射によって、フォトブリーチ（ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈ）する。もう１つの実施形態では、前記フィコビリタンパク質を、化学的に、すなわち１〜３％Ｃｌｏｒｏｘ（登録商標）試薬を使用することにより、ブリーチ（ｂｌｅａｃｈ）することができる。当業者は、当該技術分野において標準的な方法論を用いてここで使用するために非結合体化フィコビリタンパク質を修飾することが容易にできる。
【００５８】
前記組成物において必要とされる非結合体化フィコビリタンパク質の量は、その組成物を安定させるために十分である量である。望ましくは、前記非結合体化フィコビリタンパク質は、定常状態で非架橋サブユニットの交換を可能にする量で存在する。１つの実施形態において、前記非結合体化フィコビリタンパク質対、前記タンデム色素の結合体化フィコビリタンパク質の比は、少なくとも０．１２５：１、０．２５：１、０．５０：１、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、もしくは２０：１、およびそれらの間の分数比率である。もう１つの実施形態において、前記非結合体化フィコビリタンパク質対前記結合体化フィコビリタンパク質の比は、約０．１２５：１から約２０：１である。さらにもう１つの実施形態において、前記非結合体化フィコビリタンパク質対前記結合体化フィコビリタンパク質の比は、約０．２５：１から約１０：１である。さらなる実施形態において、前記非結合体化フィコビリタンパク質対前記結合体化フィコビリタンパク質の比は、４：１から０．２５：１である。
【００５９】
１つの実施形態において、前記タンデム色素の結合体化フィコビリタンパク質と、非結合体化フィコビリタンパク質は、同じであり、アロフィコシアニン、フィコエリトリン、フィコシアニンまたはフィコエリスロシアニンである。もう１つの実施形態において、前記タンデム色素の結合体化フィコビリタンパク質と、非結合体化フィコビリタンパク質は、異なる。しかし、前記タンデム色素の結合体化フィコビリタンパク質と、非結合体化フィコビリタンパク質が異なる場合、それらは、互いに交換する非架橋サブユニットを含有しなければならない。例えば、前記タンデム色素の結合体化フィコビリタンパク質と、非結合体化フィコビリタンパク質は、異なり、独立してアロフィコシアニン、フィコエリトリン、フィコシアニンまたはフィコエリスロシアニンであり、および互いに交換する非架橋サブユニットを含有する。さらなる実施形態において、前記タンデム色素の結合体化フィコビリタンパク質と、非結合体化フィコビリタンパク質は、同じであり、ＡＰＣ、Ｒ−ＰＥ、Ｂ−ＰＥ、Ｃ−ＰＥ、Ｙ−ＰＥ、またはＰＥＣである。いっそうさらなる実施形態において、前記タンデム色素の結合体化フィコビリタンパク質と、非結合体化フィコビリタンパク質は、異なり、独立してＡＰＣ、Ｒ−ＰＥ、Ｂ−ＰＥ、Ｃ−ＰＥ、Ｙ−ＰＥ、またはＰＥＣであり、および互いに交換する非架橋サブユニットを含有する。さらにもう１つの実施形態において、前記タンデム色素の結合体化フィコビリタンパク質と、非結合体化フィコビリタンパク質は、同じであり、Ｒ−ＰＥ、Ｂ−ＰＥ、Ｙ−ＰＥ、ＰＥ５６６、ＰＥＣ、Ｒ−ＰＣまたはＡＰＣである。さらなる実施形態において、前記タンデム色素の結合体化フィコビリタンパク質と、非結合体化フィコビリタンパク質は、異なり、Ｒ−ＰＥ、Ｂ−ＰＥ、Ｙ−ＰＥ、ＰＥ５６６、ＰＥＣ、Ｒ−ＰＣまたはＡＰＣから独立して選択され、および互いに交換する非架橋サブユニットを含有する。さらにもう１つの実施形態において、前記タンデム色素の結合体化フィコビリタンパク質と、非結合体化フィコビリタンパク質は、同じであり、アロフィコシアニンである。さらにもう１つの実施形態において、前記タンデム色素の結合体化フィコビリタンパク質と、非結合体化フィコビリタンパク質は、同じであり、フィコエリトリンである。
【００６０】
（Ｃ．前記組成物中の追加のリガンド結合体化色素成分）
単一のフィコビリタンパク質含有タンデム色素および単一の非結合体化フィコビリタンパク質に加えて、色素およびリガンド含有組成物の他の実施形態は、複数のリガンド、複数のタンデム色素、複数の非結合体化色素および他の自由選択成分を含有することがある。列挙している様々な細胞集団に最も有用であるために、前記色素組成物が、複数のリガンド結合体化蛍光性色素を含有することは有利である。当業者は、これに関連して用いる場合の「追加の」という用語を容易に判断することができる。例えば、用語「追加の」は、リガンド結合体化色素成分および非結合体化フィコビリタンパク質を含む、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の成分を含むことがある。
【００６１】
前記色素組成物に含まれるそれぞれの追加の色素または追加のフィコビリタンパク質を該組成物の１つ以上のリガンドに直接結合体化させなければならない。本明細書に記載する組成物の大部分において、前記色素組成物中には非標識または非結合体化リガンドは存在しない。
【００６２】
１つの実施形態において、本発明の組成物は、フィコビリタンパク質でない蛍光性色素または蛍光色素に結合体化した１つ以上の追加のリガンドを含む。例えば、前記色素組成物は、ｙ個の色素に結合体化したｘ個のリガンドを含むことがある（この場合、ｘ＝ｙ、および整数である）。１つの実施形態において、ｘおよびｙは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。さらなる実施形態において、ｘおよびｙは、１、２、３、または４である。前記色素は、上に記載した色素のいずれであってもよい。当業者は、前記色素組成物への追加に適する色素を容易に選択することができる。
【００６３】
もう１つの実施形態において、本発明の色素組成物は、追加のフィコビリタンパク質に直接結合体化した１つ以上の追加のリガンドを含む。１つの実施形態において、前記追加のフィコビリタンパク質は、前記色素組成物中のリガンド結合体化タンデム色素のフィコビリタンパク質と同じ細菌または真核藻種からのものである。もう１つの実施形態において、前記追加のフィコビリタンパク質は、前記色素組成物中の前記リガンド結合体化タンデム色素のフィコビリタンパク質とは別の細菌または真核藻種からのものである。例えば、前記色素組成物は、ｙ’個のフィコビリタンパク質に結合体化したｘ’個のリガンドを含むことがある（この場合、ｘ’＝ｙ’、および整数である）。１つの実施形態において、ｘ’およびｙ’は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。さらなる実施形態において、ｘ’およびｙ’は、１、２、３、または４である。別のリガンドを直接標識するために用いるフィコビリタンパク質は、上に記載したフィコビリタンパク質のいずれであってもよい。１つの実施形態において、前記追加のフィコビリタンパク質は、前記組成物中のフィコビリタンパク質のいずれか（前記リガンド結合体化タンデム色素、または前記非結合体化フィコビリタンパク質のいずれか）の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有しない。さらなる実施形態において、前記追加のフィコビリタンパク質は、前記組成物の前記リガンド結合体化タンデム色素のフィコビリタンパク質または前記非結合体化フィコビリタンパク質の１つ以上の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する。当業者は、リガンドへの直接結合体化および試薬混合物へのその後の添加に適するフィコビリタンパク質を容易に選択することができる。
【００６４】
もう１つの実施形態において、本発明の色素組成物は、追加のフィコビリタンパク質を含有する追加のタンデム色素に結合体化した１つ以上の追加のリガンドを含む。例えば、前記色素組成物は、ｙ’’個のタンデム色素にそれぞれが別個に結合体化したｘ’’個のリガンドを含むことがある（この場合、ｘ’’＝ｙ’’、および整数である）。１つの実施形態において、ｘ’’およびｙ’’は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。さらなる実施形態において、ｘ’’およびｙ’’は、１、２、３、または４である。１つの実施形態において、前記追加のタンデム色素中の前記フィコビリタンパク質は、第一のリガンド結合体化タンデム色素組成物中のフィコビリタンパク質と同じ細菌または真核藻種からのものである。もう１つの実施形態において、前記追加のフィコビリタンパク質は、第一の色素組成物中のフィコビリタンパク質のものとは異なる細菌種または真核藻種からのものである。しかし、前記追加のタンデム色素中の追加のフィコビリタンパク質が、別の細菌または真核藻種からのものである場合、非結合体化形態の同じフィコビリタンパク質をその色素組成物に添加しなければならない。しかし、フィコビリタンパク質の供給源に係らず、当業者は、上に記載したフィコビリタンパク質のいずれかからそれを選択することができる。
【００６５】
組成物の様々な実施形態は、タンデム色素に結合体化した複数のリガンドを含有する。例えば、１つの望ましい実施形態において、前記組成物は、（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンドおよび（ｂ）第一の非結合体化フィコビリタンパク質に加えて、次の成分を含有することがある：（ｃ）第二のタンデム色素に結合体化した第二のリガンド（前記第二のタンデム色素は、（ｉ）架橋および非架橋サブユニットを含有する第三のフィコビリタンパク質（前記第三のフィコビリタンパク質は、第二の細菌または真核藻種から得られる）と、（ｉｉ）前記第三のフィコビリタンパク質に結合体化した第二のパートナー色素と含む）；および（ｄ）サブユニットを含有する非結合体化第四のフィコビリタンパク質。前記第二のフィコビリタンパク質は、第二の細菌または真核藻種から得られる。前記第四のフィコビリタンパク質と前記第三のフィコビリタンパク質は、同じである。あるいは、前記第三および第四のフィコビリタンパク質は異なり、前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第三のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する。
【００６６】
もう１つの望ましい実施形態において、前記組成物は、すぐ上で記載した成分に加えて、（ｅ）第四のフィコビリタンパク質に結合体化した第三のリガンドをさらに含有することがあり、前記第四のフィコビリタンパク質は、第一の細菌種、第一の真核藻種、第二の細菌種、または第二の真核藻種から得られる。前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二または第三のフィコビリタンパク質と同じであるか；あるいは、前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二または第三のフィコビリタンパク質と異なり、および前記第一、第二または第三のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する。
【００６７】
さらなる望ましい実施形態において、前記組成物は、（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンドおよび（ｂ）第一の非結合体化フィコビリタンパク質に加えて、次の成分を含有することがある：（ｃ）第三のフィコビリタンパク質に結合体化した第二のリガンド（前記第三のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られる）。前記第三のフィコビリタンパク質は、第一もしくは第二のフィコビリタンパク質と同じであるか；あるいは、前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一もしくは第二のフィコビリタンパク質と異なり、ならびに前記第一および第二のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する。１つの態様において、前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一または第二のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有しない。もう１つの態様において、前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一または第二のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する。
【００６８】
もう１つの望ましい実施形態において、前記組成物は、フィコビリタンパク質でない色素に結合体化した１つ以上の追加のリガンドをさらに含有する。
【００６９】
（Ｄ．前記組成物中の他の自由選択の非色素成分）
追加のリガンド、フィコビリタンパク質、タンデム色素、および蛍光性色素以外の成分を、本明細書に記載する組成物に含めることができる。当業者は、それらの追加の成分の選択を容易に選択することができ、ならびにそれらの追加の成分は、数ある中でも、分析する検体、その組成物の成分、分析するパラメータに依存する。例えば、参照により本明細書に援用されている米国特許第６，５５１，８３１号において列挙されている界面活性剤を参照のこと。
【００７０】
組成物の実施形態は、その組成物のｐＨを約６から約９の範囲内の任意の所望のｐＨに維持する緩衝液などの、他の成分をさらに含有することがある。緩衝液の例としては、限定ではないが、リン酸緩衝生理食塩水または等張食塩水、例えば、ＩＳＯＴＯＮ ＩＩバッファー（フロリダ州マイアミのＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）および参照により本明細書に援用されている米国特許第３，９６２，１２５号において特定されているものが挙げられる。
【００７１】
保存薬も前記組成物に添加することができ、それらは、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、および２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンから選択することができるが、これらに限定されない（そのような保存薬を、例えばＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００またはＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）１５０として、商業的に購入することができる）。
【００７２】
当業者は、本明細書に記載する様々な方法において使用するための組成物に用いることができる適切な界面活性剤、緩衝液、保存薬または他の従来の試薬の選択を行うことができる。そのような選択は、本明細書において教示する方法および組成物の制限ではない。
【００７３】
（Ｅ．複数の標識リガンドを含有する組成物）
１つの望ましい実施形態において、前記組成物は、タンデム色素に結合体化した１つのリガンドを含有する（Ｌ１−タンデム色素１）。もう１つの実施形態において、前記組成物は、２つのリガンドを含有し、この場合、１つの抗体は、タンデム色素に結合体化しており（Ｌ１−タンデム色素１）、および他のリガンドは、フィコビリタンパク質に直接結合体化している（Ｌ２−ｐｂｐ）。さらなる実施形態において、前記組成物は、２つのリガンドを含有し、この場合、１つのリガンドは、１つのタンデム色素に結合体化しており（Ｌ１−タンデム色素１）、および１つのリガンドは、第二のタンデム色素に結合体化している（Ｌ２−タンデム色素２）。もう１つの実施形態において、前記組成物は、３つのリガンドを含有し、この場合、１つのリガンドは、１つのタンデム色素に結合体化しており（Ｌ１−タンデム色素１）、第二のリガンドは、第二のタンデム色素に結合体化しており（Ｌ２−タンデム色素２）、および第三のリガンドは、フィコビリタンパク質に結合体化している（Ｌ３−ｐｂｐ）。さらにもう１つの実施形態において、前記組成物は、１つのタンデム色素に結合体化した１つのリガンド（Ｌ１−タンデム色素１）、フィコビリタンパク質に結合体化した第二のリガンド（Ｌ２−ｐｂｐ）、およびｘ数のタンデム色素に独立して結合体化したｘ数のリガンド（Ｌｘ−タンデム色素ｘ）を含有する。さらなる実施形態において、前記組成物は、１つのタンデム色素に結合体化した１つのリガンド（Ｌ１−タンデム色素１）、フィコビリタンパク質に結合体化した第二のリガンド（Ｌ２−ｐｂｐ）、およびｘ数の非フィコビリタンパク質蛍光性色素に独立して結合体化したｘ数のリガンド（Ｌｘ−色素ｘ）を含有する。
【００７４】
（ＩＩＩ．本発明の組成物の特定の実施形態）
上で一般に説明した組成物の第一の例として、組成物は、（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンドを含有する。前記第一のタンデム色素は、第一のフィコビリタンパク質を含有し、前記第一のフィコビリタンパク質は、該第一のフィコビリタンパク質に結合体化した第一のパートナー色素に結合体化した架橋および非架橋サブユニットを含有する。前記第一のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られる。前記組成物は、（ｂ）サブユニットを含有する非結合体化第二のフィコビリタンパク質も含有し、この第二のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られる。この組成物の１つの実施形態において、前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は、同じである。この組成物のもう１つの実施形態において、前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は異なり、前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する。表１参照。
【００７５】
【表１】
本明細書に記載する組成物の第二の例または実施形態として、組成物は、（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンドを含有する。前記第一のタンデム色素は、第一のフィコビリタンパク質を含み、前記第一のフィコビリタンパク質は、該第一のフィコビリタンパク質に結合体化した第一のパートナー色素に結合体化した架橋および非架橋サブユニットを含有する。前記第一のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られる。前記組成物は、（ｂ）サブユニットを含有する非結合体化第二のフィコビリタンパク質も含有し、この第二のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られる。この組成物の１つの実施形態において、前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は同じである。この組成物のもう１つの実施形態において、前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する。組成物のこの第二の実施形態は、（ｃ）第二のタンデム色素に結合体化した第二のリガンドをさらに含有し、前記第二のタンデム色素は、（ｉ）架橋および非架橋サブユニットを含有する第三のフィコビリタンパク質と、（ｉｉ）前記第三のフィコビリタンパク質に結合体化した第二のパートナー色素とを含む。前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られる。この組成物の１つの実施形態において、前記第一、第二および第三のフィコビリタンパク質は、同じである。この組成物のもう１つの実施形態において、前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一および第二のフィコビリタンパク質とは異なり、ならびに前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一および第二のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する。表２参照。
【００７６】
【表２】
さらなる実施形態において、組成物は、
（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンド（前記第一のタンデム色素は、（ｉ）架橋および非架橋サブユニットを含有する第一のフィコビリタンパク質（前記第一のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られる）、および（ｉｉ）前記第一のフィコビリタンパク質に結合体化した第一のパートナー色素を含む）と；
（ｂ）サブユニットを含有する非結合体化第二のフィコビリタンパク質（前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ；この場合、前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は、同じであるか；または前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）と；
（ｃ）第二のタンデム色素に結合体化した第二のリガンド（前記第二のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第三のフィコビリタンパク質を含み、前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ、および第二のパートナー色素に結合体化しており；この場合、前記第一、第二、および第三のフィコビリタンパク質は、同じであるか；または前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一および第二のフィコビリタンパク質とは異なり、ならびに前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一および第二のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）と；
（ｄ）第三のタンデム色素に結合体化した第三のリガンド（前記第三のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第四のフィコビリタンパク質を含み、前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ、および第三のパートナー色素に結合体化しており；この場合、前記第一、第二、第三および第四のフィコビリタンパク質は、同じであるか；または前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二もしくは第三のフィコビリタンパク質とは異なり、および前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二もしくは第三のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）
を含有する。表３参照。
【００７７】
【表３】
いっそうさらなる実施形態において、組成物は、
（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンド（前記第一のタンデム色素は、（ｉ）架橋および非架橋サブユニットを含有する第一のフィコビリタンパク質（前記第一のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られる）、および（ｉｉ）前記第一のフィコビリタンパク質に結合体化した第一のパートナー色素を含む）と；
（ｂ）サブユニットを含有する非結合体化第二のフィコビリタンパク質（前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ；この場合、前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は、同じであるか；または前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）と；
（ｃ）第二のタンデム色素に結合体化した第二のリガンド（前記第二のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第三のフィコビリタンパク質を含み、前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ、および第二のパートナー色素に結合体化しており；この場合、前記第一、第二、および第三のフィコビリタンパク質は、同じであるか；または前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一および第二のフィコビリタンパク質とは異なり、ならびに前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一および第二のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）と；
（ｄ）第三のタンデム色素に結合体化した第三のリガンド（前記第三のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第四のフィコビリタンパク質を含み、前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ、および第三のパートナー色素に結合体化しており；この場合、前記第一、第二、第三および第四のフィコビリタンパク質は、同じであるか；または前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二もしくは第三のフィコビリタンパク質とは異なり、および前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二もしくは第三のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）と；
（ｅ）第四のタンデム色素に結合体化した第四のリガンド（前記第四のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含む第五のフィコビリタンパク質を含み、前記第五のフィコビリタンパク質は、前記細菌または真核藻種から得られ、および第四のパートナー色素に結合体化しており；この場合、前記第一、第二、第三、第四および第五のフィコビリタンパク質は、同じであるか；または前記第五のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二、第三もしくは第四のフィコビリタンパク質とは異なり、および前記第五のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二、第三もしくは第四のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）
を含有する。表４参照。
【００７８】
【表４】
さらにもう１つの実施形態において、組成物は、
（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンド（前記第一のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第一のフィコビリタンパク質を含有し、前記第一のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られ、および第一のパートナー色素に結合体化している）と；
（ｂ）サブユニットを含有する非結合体化第二のフィコビリタンパク質（前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または第一の真核藻種から得られ；この場合、前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は、同じであるか；または前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）と；
（ｃ）フィコビリタンパク質でない色素に結合体化した１つ以上の追加のリガンド
を含有する。表５参照。
【００７９】
【表５】
さらなる実施形態において、組成物を提供し、この組成物は、
（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンド（前記第一のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第一のフィコビリタンパク質を含有し、前記第一のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られ、および第一のパートナー色素に結合体化している）と；
（ｂ）サブユニットを含有する非結合体化第二のフィコビリタンパク質（前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ；この場合、前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は、同じであるか；または前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）と；
（ｃ）第二のタンデム色素に結合体化した第二のリガンド（前記第二のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第三のフィコビリタンパク質を含み、前記第三のフィコビリタンパク質は、第二の細菌または真核藻種から得られ、および第二のパートナー色素に結合体化している）と；
（ｄ）サブユニットを含有する非結合体化第四のフィコビリタンパク質（前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第二の細菌または真核藻種から得られ；この場合、前記第四のフィコビリタンパク質と前記第三のフィコビリタンパク質は、同じであるか；または前記第四のフィコビリタンパク質と前記第三のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第三のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）
を含有する。表６参照。
【００８０】
【表６】
もう１つの実施形態において、組成物を提供し、この組成物は、
（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンド（前記第一のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第一のフィコビリタンパク質を含有し、前記第一のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られ、および第一のパートナー色素に結合体化している）と；
（ｂ）サブユニットを含有する非結合体化第二のフィコビリタンパク質（前記第二のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られ；この場合、前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は、同じであるか；または前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）と；
（ｃ）第二のタンデム色素に結合体化した第二のリガンド（前記第二のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第三のフィコビリタンパク質を含み、前記第三のフィコビリタンパク質は、第二の細菌または真核藻種から得られ、および第二のパートナー色素に結合体化している）と；
（ｄ）サブユニットを含有する非結合体化第四のフィコビリタンパク質（前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第二の細菌または真核藻種から得られ；この場合、前記第四のフィコビリタンパク質と前記第三のフィコビリタンパク質は、同じであるか；または前記第四のフィコビリタンパク質と前記第三のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第三のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）と；
（ｅ）第四のフィコビリタンパク質に結合体化した第三のリガンド（前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌種、前記第一の真核藻種、前記第二の細菌種、または前記第二の真核藻種から得られ；この場合、前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質、前記第二のフィコビリタンパク質、もしくは前記第三のフィコビリタンパク質と同じであるか；または前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二もしくは第三のフィコビリタンパク質とは異なり、および前記第一、第二もしくは第三のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）
を含有する。表７参照。
【００８１】
【表７】
当業者は、本明細書の教示を用いて、選択された追加の成分を含有する他の組成物を調製することができる。
【００８２】
（ＩＶ．本発明の組成物を調製および使用するための方法）
本明細書において論じる組成物を調製するための方法は、選択されたマルチカラー組成物の標識リガンド成分と遊離フィコビリタンパク質成分とを併せるかまたは事前混合する工程、および場合により、前記事前混合組成物を保管する工程を一般に含む。その後、前記組成物を、当業者が判定して必要な場合には希釈し、分析を意図して選択された生物検体と併せる。
【００８３】
具体的には、（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンド（前記第一のタンデム色素は、架橋を含有する第一のフィコビリタンパク質と第一の色素とを含み、前記第一のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られ、および前記第一の色素に結合体化している）と、（ｂ）前記第一の細菌または真核藻種から得られる非結合体化第一のフィコビリタンパク質とを混合することによって、前記組成物を調製する。分析する集団に依存して、上で説明したように、追加の成分を添加してもよい。１つの実施形態において、第二のフィコビリタンパク質、前記第二のフィコビリタンパク質を含む第二のタンデム色素、およびフィコビリタンパク質ではない色素からなる群より選択される、第二の色素に結合体化した第二のリガンドを、前記反応混合物に添加する。
【００８４】
当業者は、下で記載する方法において使用するために必要な組成物の量を決定することができる。１つの実施形態では、少なくとも約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００μＬの前記組成物を用いる。もう１つの実施形態では、約５から約２００μＬの前記組成物を用いる。さらなる実施形態では、約１００μＬの組成物を使用する。
【００８５】
これらの成分を、一般に、室温、周囲温度または２℃ほどもの低さの低温を含む任意の選択された温度でインキュベートすることによって混合するかまたは反応させる。もう１つの実施形態では、約４０℃という高温を用いることがある。しかし、分析時の前記組成物の温度は、検体中の細胞の生存可能性にとって十分なものでなければならない。１つの実施形態では、約２から約８℃の温度を、詳細には前記混合物の混合と保管の両方に、用いることができる。
【００８６】
前記反応の時間範囲は、一般に、約１５秒、３０秒、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、または１５分より長期であるか、それらの間の秒数である。もう１つの実施形態において、前記インキュベーションの時間は、約１５秒から約３０分である。さらなる実施形態では、前記組成物の成分の濃度を調整すれば、より速い反応時間を得ることができる。
【００８７】
上で説明した成分を含有する、上で調製したような組成物は、下の実施例によって実証するように、検体中の細胞および非細胞集団を分析するための従来の方法において有用である。そのような従来のフローサイトメトリー法は、当業者に公知であり、ならびに検体と本明細書に記載する組成物とを併せる工程、および蛍光を分析することにより検体中の集団を同定する工程を含む。望ましくは、前記細胞および非細胞集団の少なくとも１つは、前記第一のリガンドの受容体を含む。参照により本明細書に援用されている米国特許第６，５５１，８３１号を参照のこと。
【００８８】
（Ｖ．本発明のキット）
さらにもう１つの態様において、これらの組成物の混合または従来のフローサイトメトリー分析での使用を可能にするキットを提供する。望ましくは、本発明のフローサイトメトリー診断方法を行うためにそのようなキットを用いる。しかし、他の安定化試薬の開発および評価における研究のためにそのようなキットを組み立てることができる。
【００８９】
好都合な使用のために、前記組成物、それらの成分、ならびに上で記載した方法の任意の数の変形形態を実施するために必要な成分を組み合わせてキットを作ることができる。そのようなキットは、別々の成分として組成物を形成するために必要な成分を含有し得る。１つの実施形態において、別個の容器の中に存在する１つの別個の成分は、第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンドであり、前記第一のタンデム色素は、第一の色素に結合体化し、架橋を含有し、および第一の細菌または真核藻種から得られる、第一のフィコビリタンパク質を含有する。第二の容器の中に存在する第二の別個の成分は、前記第一の細菌または真核藻種から得られる非結合体化第一のフィコビリタンパク質である。これら２つの成分を、使用のために購入者の裁量で併せることができる。もう１つの実施形態において、前記キットは、１つの「事前混合」容器を含有することがあり、この容器は、（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンド（前記第一のタンデム色素は、（ｉ）架橋を含有する第一のフィコビリタンパク質（前記第一のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られる）と（ｉｉ）第一のパートナー色素とを含む）；および（ｂ）前記第一の細菌または真核藻種から得られる非結合体化第一のフィコビリタンパク質を含む。上で論じたように、本明細書において論じる組成物の利点は、それらが分解しない点、血液学的分析に干渉する別個の成分間でのサブユニット交換を有しない点である。
【００９０】
追加の容器を前記キットにさらに含めることができる。これらの追加の容器は、上で特定した自由選択の成分のいずれかを独立して含むことができる。しかし、もしあれば、その（それらの）追加の成分は、前記試薬組成物の安定性に悪影響を及ぼさない生理的ｐＨを有さなければならない。
【００９１】
そのようなキットは、前記組成物の別個の成分を混合するための説明書；前記組成物の成分を含む適切な器；前記組成物と生物検体を混合するための適切な器；細胞の正常または疾患特性値についての適切な対照または表；抗凝固剤または凝固経路インヒビター、フローサイトメトリー分析の実施に適する他の試薬およびそれらの組み合わせ；検体に適する希釈剤および緩衝液；使い捨て手袋；除染についての説明書；アプリケータースティックまたは容器；ならびに調製用カップのうちの１つ以上をさらに含有し得る。
【００９２】
当業者は、分析用の検体に対して前記方法を行うために必要な情報および成分を有する任意の数のキットを組み立てることができる。
【００９３】
１つの実施形態において、キットを提供し、このキットは、（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンド（前記第一のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第一のフィコビリタンパク質を含み、前記第一のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られ、および第一のパートナー色素に結合体化している）を含む第一の容器と、（ｂ）サブユニットを含有する非結合体化第二のフィコビリタンパク質（前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ；この場合、前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は同じであるか；または前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）を含む第二の容器とを含有する。１つ以上の追加の容器を前記キットに含めることができ、およびそれらの容器は、上に書き留めた試薬のいずれか１つを含むことができる。表８参照。あるいは、前記組成物の成分が１つの容器に存在することがある。
【００９４】
【表８】
もう１つの実施形態において、キットを提供し、このキットは、（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンド（前記第一のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第一のフィコビリタンパク質を含み、前記第一のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られ、および第一のパートナー色素に結合体化している）を含む第一の容器と、（ｂ）サブユニットを含有する非結合体化第二のフィコビリタンパク質（前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ；この場合、前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は同じであるか；または前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）を含む第二の容器と、（ｃ）第二のタンデム色素に結合体化した第二のリガンド（前記第二タンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第三のフィコビリタンパク質を含み、前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ、および第二のパートナー色素に結合体化しており；この場合、前記第一、第二および第三のフィコビリタンパク質は同じであるか；または前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一および第二のフィコビリタンパク質とは異なり、ならびに前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一および第二のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）を含む第三の容器を含有する。表９参照。あるいは、前記組成物の成分が１つの容器に存在することがある。
【００９５】
【表９】
さらなる実施形態において、キットを提供し、このキットは、（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンド（前記第一のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第一のフィコビリタンパク質を含み、前記第一のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られ、および第一のパートナー色素に結合体化している）を含む第一の容器と、（ｂ）サブユニットを含有する非結合体化第二のフィコビリタンパク質（前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ；この場合、前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は同じであるか；または前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）を含む第二の容器と、（ｃ）第二のタンデム色素に結合体化した第二のリガンド（前記第二タンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第三のフィコビリタンパク質を含み、前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ、および第二のパートナー色素に結合体化しており；この場合、前記第一、第二および第三のフィコビリタンパク質は同じであるか；または前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一および第二のフィコビリタンパク質とは異なり、ならびに前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一および第二のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）を含む第三の容器と、（ｄ）第三のタンデム色素に結合体化した第三のリガンド（前記第三のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第四のフィコビリタンパク質を含み、前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ、および第三のパートナー色素に結合体化しており；この場合、前記第一、第二、第三および第四のフィコビリタンパク質は同じであるか；または前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二もしくは第三のフィコビリタンパク質とは異なり、および前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二もしくは第三のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）を含む第四の容器を含有する。表１０参照。あるいは、前記組成物の成分が１つの容器に存在することがある。
【００９６】
【表１０】
いっそうさらなる実施形態において、キットを提供し、このキットは、（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンド（前記第一のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第一のフィコビリタンパク質を含み、前記第一のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られ、および第一のパートナー色素に結合体化している）を含む第一の容器と、（ｂ）サブユニットを含有する非結合体化第二のフィコビリタンパク質（前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ；この場合、前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は同じであるか；または前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）を含む第二の容器と、（ｃ）第二のタンデム色素に結合体化した第二のリガンド（前記第二タンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第三のフィコビリタンパク質を含み、前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ；第三のフィコビリタンパク質に結合体化した第二のパートナー色素に結合体化しており；この場合、前記第一、第二および第三のフィコビリタンパク質は同じであるか；または前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一および第二のフィコビリタンパク質とは異なり、ならびに前記第三のフィコビリタンパク質は、前記第一および第二のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）を含む第三の容器と、（ｄ）第三のタンデム色素に結合体化した第三のリガンド（前記第三のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第四のフィコビリタンパク質を含み、前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ、および第三のパートナー色素に結合体化しており；この場合、前記第一、第二、第三および第四のフィコビリタンパク質は同じであるか；または前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二もしくは第三のフィコビリタンパク質とは異なり、および前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二もしくは第三のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）を含む第四の容器と、（ｅ）第四のタンデム色素に結合体化した第四のリガンド（前記第四のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含む第五のフィコビリタンパク質を含み、前記第五のフィコビリタンパク質は、前記細菌または真核藻種から得られ、および第四のパートナー色素に結合体化しており；この場合、前記第一、第二、第三、第四および第五のフィコビリタンパク質は同じであるか；または前記第五のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二、第三もしくは第四のフィコビリタンパク質とは異なり、ならびに前記第五のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二、第三もしくは第四のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）を含む第五の容器を含有する。表１１参照。あるいは、前記組成物の成分が１つの容器に存在することがある。
【００９７】
【表１１】
さらにもう１つの実施形態において、キットを提供し、このキットは、（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンド（前記第一のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第一のフィコビリタンパク質を含み、前記第一のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られ、および第一のパートナー色素に結合体化している）を含む第一の容器と、（ｂ）サブユニットを含有する非結合体化第二のフィコビリタンパク質（前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ；この場合、前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は同じであるか；または前記第二のフィコビリタンパク質と第一のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）を含む第二の容器と、（ｃ）フィコビリタンパク質ではない色素に結合体化した１つ以上の追加のリガンドを含む第三の容器を含有する。表１２参照。あるいは、前記組成物の成分が１つの容器に存在することがある。
【００９８】
【表１２】
さらなる実施形態において、キットを提供し、このキットは、（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンド（前記第一のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第一のフィコビリタンパク質を含み、前記第一のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られ、および第一のパートナー色素に結合体化している）を含む第一の容器と、（ｂ）サブユニットを含有する非結合体化第二のフィコビリタンパク質（前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ；この場合、前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は同じであるか；または前記第二のフィコビリタンパク質と第一のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）を含む第二の容器と、（ｃ）第二のタンデム色素に結合体化した第二のリガンド（前記第二のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第三のフィコビリタンパク質を含み、前記第三のフィコビリタンパク質は、第二の細菌または真核藻種から得られ、および第二のパートナー色素に結合体化している）を含む第三の容器と、（ｄ）サブユニットを含有する非結合体化第四のフィコビリタンパク質（前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第二の細菌または真核藻種から得られ；この場合、前記第四のフィコビリタンパク質と前記第三のフィコビリタンパク質は同じであるか；または前記第四のフィコビリタンパク質と前記第三のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第三のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）を含む第四の容器を含有する。表１３参照。あるいは、前記組成物の成分が１つの容器に存在することがある。
【００９９】
【表１３】
もう１つの実施形態において、キットを提供し、このキットは、（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンド（前記第一のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第一のフィコビリタンパク質を含み、前記第一のフィコビリタンパク質は、第一の細菌または真核藻種から得られ、および結合体化した第一のパートナー色素に結合体化している）と、（ｂ）サブユニットを含有する非結合体化第二のフィコビリタンパク質（前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌または真核藻種から得られ；この場合、前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は同じであるか；または前記第二のフィコビリタンパク質と第一のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）と、（ｃ）第二のタンデム色素に結合体化した第二のリガンド（前記第二のタンデム色素は、架橋および非架橋サブユニットを含有する第三のフィコビリタンパク質を含み、前記第三のフィコビリタンパク質は、第二の細菌または真核藻種から得られ、および第二のパートナー色素に結合体化している）と、（ｄ）サブユニットを含有する非結合体化第四のフィコビリタンパク質（前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第二の細菌または真核藻種から得られ；この場合、前記第四のフィコビリタンパク質と前記第三のフィコビリタンパク質は同じであるか；または前記第四のフィコビリタンパク質と前記第三のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第三のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）と、（ｅ）第四のフィコビリタンパク質に結合体化した第三のリガンド（前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一の細菌種、前記第一の真核藻種、前記第二の細菌種または前記第二の真核藻種から得られ；この場合、前記第四のフィコビリタンパク質は前記第一のフィコビリタンパク質、前記第二のフィコビリタンパク質もしくは前記第三のフィコビリタンパク質と同じであるか；または前記第四のフィコビリタンパク質は、前記第一、第二もしくは第三のフィコビリタンパク質とは異なり、および前記第一、第二もしくは第三のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含有する）を含有する。表１４参照。あるいは、前記組成物の成分が１つの容器に存在することがある。
【０１００】
【表１４】
以下の実施例は、本発明の様々な態様を例証するものである。これらの実施例は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定しない。
【実施例】
【０１０１】
（実施例）
（実施例１）
Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓから単離したＡＰＣにおける架橋率を判定するためにこの実施例を行った。
【０１０２】
Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−５０カラムを用いてＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭ Ｋ３ＰＯ４＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．２）で様々な架橋および非架橋ＡＰＣサンプルを脱塩した。Ｍｉｃｒｏｎ（登録商標）ＹＭ−３０膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａｒｔ♯ ＵＦＣ９０３０２４）を用いて、それらの脱塩溶液を約１５±２ｍｇ／ｍＬに濃縮した。次に、当該技術分野における技術および下記の条件／計器を用いてＨＰＬＣによりこれらのＡＰＣサンプルを分析した：
カラム： Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００ ＨＲサイズ排除カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｐａｒｔ♯１７−１０８８−０１）
溶離剤： １０ｍＭ Ｋ３ＰＯ４＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ＋１Ｍ ＮａＣｌＯ４ ｐＨ７．２
流速： ０．８ｍＬ／分。
【０１０３】
濃縮したＡＰＣサンプルのそれぞれを緩衝液中０．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、３０分間、約２２±２℃でインキュベートした。その後、それぞれのサンプルを前記サイズ排除カラムに注入し、溶出中、波長Ａ２８０、Ａ６５２およびＡ６１６をモニターした。代表サンプルおよびｎ−ＡＰＣについてのＡ２８０のプロットを図４に示す。インタクトＡＰＣは、１２ｍＬの保持容積で溶出し、および解離ＡＰＣは、１４．５ｍＬの保持容積で溶出した。溶出ピーク下面積を計算することによって、ＡＰＣにおける架橋率を決定した。クロマトグラムの総面積に対するインタクトピークの積分面積の比によって、サンプルについての架橋率を得た。図４は、これらの架橋および非架橋ＡＰＣのクロマトグラムである。
【０１０４】
プロットの右側の最高ピークは、一（１）つの非架橋ＡＰＣサンプルに対応する。プロットの残りのピークは、架橋ＡＰＣサンプルに対応する。具体的には、プロットの左側のピークは、インタクトＡＰＣ分子に対応し、プロットの右側の（非架橋ＡＰＣピークの下の）小ピークは、ＡＰＣサブユニットに対応する。これらのクロマトグラムに基づき、架橋ＡＰＣサンプルについての架橋率は、約７６から約９６％であった。
【０１０５】
（実施例２）
この実施例は、非結合体化フィコビリタンパク質を含有する２色リガンド結合体化タンデム色素組成物を含む、本明細書に記載する組成物および方法の利点を例証するものである。
【０１０６】
四（４）つの組成物を調製し、それぞれが、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓから単離したフィコビリタンパク質およびタンデム色素に独立して結合している二（２）つのモノクローナル抗体を含有した。具体的には、それぞれの組成物（１０μＬ）は、アロフィコシアニンに結合体化したＣＤ３（ＣＤ３−ＡＰＣ）０．５μｇ、およびアロフィコシアニン−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素に結合体化したＣＤ１９（ＣＤ１９−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０）０．５μｇを含有した。
【０１０７】
組成物１、すなわち対照組成物は、新たに調製したものであり、追加の成分を含有しなかった。組成物２は、追加の成分を含有しなかったが、２から８℃で２１日間保持したものであった。組成物３および４は、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓから単離した０．５μｇの非結合体ＡＰＣも含有し、組成物３は、すべての成分を新たに混合したものであったが、組成物４は、生物検体への添加および分析前に２１日間、２から８℃で保持したものであった。
【０１０８】
その後、これらの組成物を、全血（０．１ｍＬ）を含有する生物検体と独立して併せ、１０〜１２分間インキュベートし、標準的なＶｅｒｓａＬｙｓｅ（登録商標）法を用いて処理し、フローサイトメーターを用いて分析した。当業者は、処理した生物検体とＶｅｒｓａｌｙｓｅ（登録商標）試薬／０．２％ホルムアルデヒド（１ｍＬ）とを１０分間、併せる工程、処理した検体をスピンダウン（ｓｐｉｎｎｉｎｇ ｄｏｗｎ）させる工程、上清を吸引する工程、ＰＢＳ（３ｍＬ）にそのペレットを再懸濁させる工程、そのＰＢＳ溶液をスピンダウンさせる工程、および分析のためにそのペレットをＰＢＳ／０．１％ホルムアルデヒド（０．５ｍｌ）に再懸濁させる工程を含む当該技術分野において公知であるようなＶｅｒｓａＬｙｓｅ（登録商標）法を容易に行うことができる。図１Ａ〜１Ｄ参照。
【０１０９】
これらの結果は、フローサイトメトリー分析に関して、先行技術（図１Ｂ）と比較して、本発明の組成物（図１Ｄ）の有用性を明確に示す。
【０１１０】
（実施例３）
この実施例は、２色リガンド結合体化タンデム色素組成物に非結合体化フィコビリタンパク質を添加することを含む、本明細書に記載する組成物および方法の利点を例証するものである。
【０１１１】
九（９）つの組成物を調製し、それぞれが、フィコビリタンパク質およびタンデム色素に独立して結合している二（２）つのモノクローナル抗体を含有した。具体的には、それぞれの組成物（１０μＬ）は、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓから単離したアロフィコシアニンに結合体化したＣＤ３（０．５μｇ；ＣＤ３−ＡＰＣ）と、アロフィコシアニン（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓから単離したもの）−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素に結合体化したＣＤ１９（ＣＤ１９−ＡＰＣ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０）０．５μｇとを含有した。組成物１、すなわち「先行技術の作りたて混合物」は、新たに調製したものであり、追加の成分を含有しなかった。組成物２、すなわち「先行技術の保管混合物」は、追加の成分を含有しなかったが、２から８℃で２１日間保持したものであった。組成物３〜９は、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓから単離した様々な量の非結合体化ＡＰＣも含有し、生物検体への添加および分析前に２１日間、２から８℃で保持したものであった。表１５参照。
【０１１２】
【表１５】
その後、上の実施例２におけるように血液検体のフローサイトメトリー分析のためにこれらの組成物を用いた。図２Ａ〜２Ｉ参照。
【０１１３】
これらの結果は、サブユニット交換の影響を最小にする点での、二色リガンド結合体化ＡＰＣタンデム色素およびリガンド結合体化ＡＰＣ試薬組成物への（広範にわたる）天然非結合体化ＡＰＣ添加の有用性の例証となる。より高い濃度（具体的には５００μｇ／ｍＬ以上）は、細胞の非特異的標識の増加につながる。しかし、０．０６２５μｇ（図２Ｃ）から２μｇ（図２Ｇ）の量での非結合体化ＡＰＣは、細胞の非特異的標識のそのような増加を示さず、およびまた、先行技術の組成物に所望の安定性をもたらした（図２Ｂ）。これらの結果はまた、０．０６２５μｇから１０．０μｇにわたる遊離、非結合体化フィコビリタンパク質の添加が、事前処方製品の経時的な分解を制限することの例証になる。
【０１１４】
（実施例４）
この実施例は、３色リガンド結合体化フィコビリタンパク質およびリガンド結合体化タンデム色素組成物への非結合体化フィコビリタンパク質の添加を含む、本明細書に記載する組成物および方法の利点を例証するものである。五（５）つの組成物を調製し、これらの組成物は、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓから単離したフィコビリタンパク質および２つのタンデム色素に独立して結合している三（３）つのモノクローナル抗体を含有した。具体的には、それぞれの組成物（１０μＬ）は、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓから単離したアロフィコシアニンに結合体化したＣＤ１９（ＣＤ１９−ＡＰＣ）０．５μｇと、アロフィコシアニン（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓから単離したもの）−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７００タンデム色素に結合体化したＣＤ４（ＣＤ１９−ＡＰＣ−Ａ７００）０．５μｇと、アロフィコシアニン（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓから単離したもの）−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）７５０タンデム色素に結合体化したＣＤ８（ＣＤ８−ＡＰＣ−Ａ７５０）０．５μｇを含有した。組成物１、すなわち対照組成物は、新たに調製したものであり、追加の成分を含有しなかった。組成物２は、追加の成分を含有しなかったが、２から８℃で１２０日間保持したものであった。組成物３〜５は、加えて、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓから単離した様々な量の非結合体化ＡＰＣを含有し、分析前に１２０日間、２から８℃で保持した。表１６参照。
【０１１５】
【表１６】
その後、これらの組成物を、実施例２におけるように血液検体を分析するために独立して使用した。図３Ａ〜３Ｊ参照。これらの図は、異なる量の遊離フィコビリタンパク質の使用による保管中のリガンド−色素組成物の安定性を明示している。それにより、これらの結果は、遊離、非結合体化フィコビリタンパク質が、３色試薬のさらに複雑な混合物において事前処方組成物の経時的な分解を制限することの例証となる。
【０１１６】
上に列挙したすべての出版物、特許および特許出願、ならびに優先権書類の開示は、参照により本明細書に援用されている。本明細書に記載する方法および組成物についての非常に多数の従来の変更形態および変形形態が上記明細書に含まれており、それらは当業者には明らかであると予想される。本発明の様々な実施形態の組成物およびプロセスに対するそのような変更形態および変形形態は、本明細書に添付する特許請求の範囲に包含されると考えられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンドであって、前記第一のタンデム色素は、
（ｉ）架橋および非架橋サブユニットを含み、第一の細菌種または第一の真核藻種から得られる第一のフィコビリタンパク質；および
（ｉｉ）前記第一のフィコビリタンパク質に結合体化した第一のパートナー色素
を含む、第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンドと、
（ｂ）サブユニットを含み、前記第一の細菌種または前記第一の真核藻種から得られる非結合体化第二のフィコビリタンパク質
を含む組成物であって、
前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は同じであるか；または
前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質の前記非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含む、組成物。
【請求項２】
前記第二のフィコビリタンパク質が、前記サブユニット間の架橋を含有しない、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第二のフィコビリタンパク質が、前記サブユニット間の架橋を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記第二のフィコビリタンパク質が、天然タンパク質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記第二のフィコビリタンパク質が、修飾タンパク質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記第一のフィコビリタンパク質における架橋の量が、前記第二のフィコビリタンパク質における架橋の量より多い、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記第二のフィコビリタンパク質が、蛍光を除去するかまたは減少させるように修飾される、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記修飾が、前記第二のフィコビリタンパク質の架橋に影響を及ぼさない、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記第二のフィコビリタンパク質が、ブリーチされる、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記第二のフィコビリタンパク質対前記第一のフィコビリタンパク質の比が、約０．２５：１から約１０：１である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記第一のフィコビリタンパク質および前記第二のフィコビリタンパク質が、アロフィコシアニン、フィコエリトリン、フィコシアニン、およびフィコエリスロシアニンからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記第一のフィコビリタンパク質および前記第二のフィコビリタンパク質が、Ｒ−フィコエリトリン、Ｂ−フィコエリトリン、Ｙ−フィコエリトリン、フィコエリトリン５６６、フィコエリスロシアニン、Ｒ−フィコシアニン、およびアロフィコシアニンからなる群より選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記第一のフィコビリタンパク質および前記第二のフィコビリタンパク質が、アロフィコシアニンである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記第一の細菌種が、シアノバクテリウムである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記シアノバクテリウムが、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｏｌａｃｅｕｓ、Ｔｏｌｙｐｏｔｈｒｉｘ ｔｅｎｕｉｓ、およびＬｙｎｇｂｙａ ｌａｇｅｒｈｅｉｍｉｉからなる群より選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
（ｃ）第二のタンデム色素に結合体化した第二のリガンド
をさらに含む組成物であって、
前記第二のタンデム色素が、
（ｉ）架橋および非架橋サブユニットを含み、前記第一の細菌種または前記第一の真核藻種から得られる第三のフィコビリタンパク質と、
（ｉｉ）前記第三のフィコビリタンパク質に結合体化した第二のパートナー色素
を含み；
前記第一、第二および第三のフィコビリタンパク質が同じであるか；または
前記第三のフィコビリタンパク質が、前記第一および第二のフィコビリタンパク質と異なり、ならびに前記第三のフィコビリタンパク質が、前記第一および第二のフィコビリタンパク質の前記非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含む、
請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
（ｄ）第三のタンデム色素に結合体化した第三のリガンド
をさらに含む組成物であって、
前記第三のタンデム色素が、
（ｉ）架橋および非架橋サブユニットを含み、前記第一の細菌種または前記第一の真核藻種から得られる第四のフィコビリタンパク質と、
（ｉｉ）前記第四のフィコビリタンパク質に結合体化した第三のパートナー色素
を含み；
前記第一、第二、第三および第四のフィコビリタンパク質が同じであるか；または
前記第四のフィコビリタンパク質が、前記第一、第二もしくは第三のフィコビリタンパク質と異なり、および前記第四のフィコビリタンパク質が、前記第一、第二もしくは第三のフィコビリタンパク質の前記非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含む、
請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
（ｅ）第四のタンデム色素に結合体化した第四のリガンド
をさらに含む組成物であって、
前記第四のタンデム色素が、
（ｉ）架橋および非架橋サブユニットを含み、前記第一の細菌種または前記第一の真核藻種から得られる第五のフィコビリタンパク質と、
（ｉｉ）前記第五のフィコビリタンパク質に結合体化した第四のパートナー色素
を含み；
前記第一、第二、第三、第四および第五のフィコビリタンパク質が同じであるか；または
前記第五のフィコビリタンパク質が、前記第一、第二、第三もしくは第四のフィコビリタンパク質と異なり、および前記第五のフィコビリタンパク質が、前記第一、第二、第三もしくは第四のフィコビリタンパク質の前記非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含む、
請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
フィコビリタンパク質でない色素に結合体化した１つ以上の追加のリガンドをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
（ｃ）第三のフィコビリタンパク質に結合体化した第二のリガンド
をさらに含む組成物であって、
前記第三のフィコビリタンパク質が、前記第一の細菌種または前記第一の真核藻種から得られ；
前記第三のフィコビリタンパク質が、前記第一のフィコビリタンパク質もしくは前記第二のフィコビリタンパク質と同じであるか；または
前記第三のフィコビリタンパク質が、前記第一のフィコビリタンパク質もしく前記第二のフィコビリタンパク質と異なり、ならびに前記第三のフィコビリタンパク質が、前記第一および第二のフィコビリタンパク質の前記非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含む、
請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記第三のフィコビリタンパク質が、前記第一のフィコビリタンパク質または前記第二のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含まない、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記第三のフィコビリタンパク質が、前記第一のフィコビリタンパク質または前記第二のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記第一のリガンドと前記第二のリガンドが同じである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２４】
前記第一のリガンドと前記第二のリガンドが異なる、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２５】
フィコビリタンパク質でない色素に結合体化した１つ以上の追加のリガンドをさらに含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２６】
（ｃ）第二のタンデム色素に結合体化した第二のリガンドであって、前記第二のタンデム色素は、
（ｉ）架橋および非架橋サブユニットを含み、第二の細菌種または第二の真核藻種から得られる第三のフィコビリタンパク質；および
（ｉｉ）前記第三のフィコビリタンパク質に結合体化した第二のパートナー色素
を含む、第二のタンデム色素に結合体化した第二のリガンドと、
（ｄ）サブユニットを含み、前記第二の細菌種または前記第二の真核藻種から得られる非結合体化第四のフィコビリタンパク質
をさらに含む組成物であって；
前記第四のフィコビリタンパク質と前記第三のフィコビリタンパク質が同じであるか；または
前記第四のフィコビリタンパク質と前記第三のフィコビリタンパク質が異なり、および前記第四のフィコビリタンパク質が、前記第三のフィコビリタンパク質の前記非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含む、
請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
（ｅ）第四のフィコビリタンパク質に結合体化した第三のリガンド
をさらに含む組成物であって、
前記第四のフィコビリタンパク質が、前記第一の細菌種、前記第一の真核藻種、前記第二の細菌種、または前記第二の真核藻種から得られ；
前記第四のフィコビリタンパク質が、前記第一のフィコビリタンパク質、前記第二のフィコビリタンパク質、もしくは前記第三のフィコビリタンパク質と同じであるか；または
前記第四のフィコビリタンパク質が、前記第一、第二、もしくは第三のフィコビリタンパク質と異なり、および前記第一、第二、もしくは第三のフィコビリタンパク質の前記非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含む、
請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記第一のリガンドが、アミノ酸配列または核酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２９】
前記アミノ酸配列が、抗体、酵素、組換えタンパク質、多分子集合体、またはそれらのフラグメントを含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記多分子集合体が、組換えタンパク質の四量体である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
検体中の細胞および非細胞集団を分析するための方法であって、
（ａ）前記検体と請求項１に記載の組成物を併せる工程であって、ここで、前記細胞および非細胞集団の少なくとも１つは、前記第一のリガンドの受容体を含む、工程；および
（ｂ）蛍光を分析することにより前記検体中の前記集団を同定する工程
を含む、方法。
【請求項３２】
前記集団のそれぞれについて少なくとも１つの追加のパラメータを同定する工程をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記追加のパラメータが、１つ以上の蛍光チャネル、１つ以上の光学パラメータ、１つ以上の電気的パラメータ、時間、散乱、およびそれらの組み合わせからなる群より独立して選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項１】
（ａ）第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンドであって、前記第一のタンデム色素は、
（ｉ）架橋および非架橋サブユニットを含み、第一の細菌種または第一の真核藻種から得られる第一のフィコビリタンパク質；および
（ｉｉ）前記第一のフィコビリタンパク質に結合体化した第一のパートナー色素
を含む、第一のタンデム色素に結合体化した第一のリガンドと、
（ｂ）サブユニットを含み、前記第一の細菌種または前記第一の真核藻種から得られる非結合体化第二のフィコビリタンパク質
を含む組成物であって、
前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は同じであるか；または
前記第二のフィコビリタンパク質と前記第一のフィコビリタンパク質は異なり、および前記第二のフィコビリタンパク質は、前記第一のフィコビリタンパク質の前記非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含む、組成物。
【請求項２】
前記第二のフィコビリタンパク質が、前記サブユニット間の架橋を含有しない、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第二のフィコビリタンパク質が、前記サブユニット間の架橋を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記第二のフィコビリタンパク質が、天然タンパク質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記第二のフィコビリタンパク質が、修飾タンパク質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記第一のフィコビリタンパク質における架橋の量が、前記第二のフィコビリタンパク質における架橋の量より多い、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記第二のフィコビリタンパク質が、蛍光を除去するかまたは減少させるように修飾される、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記修飾が、前記第二のフィコビリタンパク質の架橋に影響を及ぼさない、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記第二のフィコビリタンパク質が、ブリーチされる、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記第二のフィコビリタンパク質対前記第一のフィコビリタンパク質の比が、約０．２５：１から約１０：１である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記第一のフィコビリタンパク質および前記第二のフィコビリタンパク質が、アロフィコシアニン、フィコエリトリン、フィコシアニン、およびフィコエリスロシアニンからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記第一のフィコビリタンパク質および前記第二のフィコビリタンパク質が、Ｒ−フィコエリトリン、Ｂ−フィコエリトリン、Ｙ−フィコエリトリン、フィコエリトリン５６６、フィコエリスロシアニン、Ｒ−フィコシアニン、およびアロフィコシアニンからなる群より選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記第一のフィコビリタンパク質および前記第二のフィコビリタンパク質が、アロフィコシアニンである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記第一の細菌種が、シアノバクテリウムである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記シアノバクテリウムが、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｏｌａｃｅｕｓ、Ｔｏｌｙｐｏｔｈｒｉｘ ｔｅｎｕｉｓ、およびＬｙｎｇｂｙａ ｌａｇｅｒｈｅｉｍｉｉからなる群より選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
（ｃ）第二のタンデム色素に結合体化した第二のリガンド
をさらに含む組成物であって、
前記第二のタンデム色素が、
（ｉ）架橋および非架橋サブユニットを含み、前記第一の細菌種または前記第一の真核藻種から得られる第三のフィコビリタンパク質と、
（ｉｉ）前記第三のフィコビリタンパク質に結合体化した第二のパートナー色素
を含み；
前記第一、第二および第三のフィコビリタンパク質が同じであるか；または
前記第三のフィコビリタンパク質が、前記第一および第二のフィコビリタンパク質と異なり、ならびに前記第三のフィコビリタンパク質が、前記第一および第二のフィコビリタンパク質の前記非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含む、
請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
（ｄ）第三のタンデム色素に結合体化した第三のリガンド
をさらに含む組成物であって、
前記第三のタンデム色素が、
（ｉ）架橋および非架橋サブユニットを含み、前記第一の細菌種または前記第一の真核藻種から得られる第四のフィコビリタンパク質と、
（ｉｉ）前記第四のフィコビリタンパク質に結合体化した第三のパートナー色素
を含み；
前記第一、第二、第三および第四のフィコビリタンパク質が同じであるか；または
前記第四のフィコビリタンパク質が、前記第一、第二もしくは第三のフィコビリタンパク質と異なり、および前記第四のフィコビリタンパク質が、前記第一、第二もしくは第三のフィコビリタンパク質の前記非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含む、
請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
（ｅ）第四のタンデム色素に結合体化した第四のリガンド
をさらに含む組成物であって、
前記第四のタンデム色素が、
（ｉ）架橋および非架橋サブユニットを含み、前記第一の細菌種または前記第一の真核藻種から得られる第五のフィコビリタンパク質と、
（ｉｉ）前記第五のフィコビリタンパク質に結合体化した第四のパートナー色素
を含み；
前記第一、第二、第三、第四および第五のフィコビリタンパク質が同じであるか；または
前記第五のフィコビリタンパク質が、前記第一、第二、第三もしくは第四のフィコビリタンパク質と異なり、および前記第五のフィコビリタンパク質が、前記第一、第二、第三もしくは第四のフィコビリタンパク質の前記非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含む、
請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
フィコビリタンパク質でない色素に結合体化した１つ以上の追加のリガンドをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
（ｃ）第三のフィコビリタンパク質に結合体化した第二のリガンド
をさらに含む組成物であって、
前記第三のフィコビリタンパク質が、前記第一の細菌種または前記第一の真核藻種から得られ；
前記第三のフィコビリタンパク質が、前記第一のフィコビリタンパク質もしくは前記第二のフィコビリタンパク質と同じであるか；または
前記第三のフィコビリタンパク質が、前記第一のフィコビリタンパク質もしく前記第二のフィコビリタンパク質と異なり、ならびに前記第三のフィコビリタンパク質が、前記第一および第二のフィコビリタンパク質の前記非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含む、
請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記第三のフィコビリタンパク質が、前記第一のフィコビリタンパク質または前記第二のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含まない、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記第三のフィコビリタンパク質が、前記第一のフィコビリタンパク質または前記第二のフィコビリタンパク質の非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記第一のリガンドと前記第二のリガンドが同じである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２４】
前記第一のリガンドと前記第二のリガンドが異なる、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２５】
フィコビリタンパク質でない色素に結合体化した１つ以上の追加のリガンドをさらに含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２６】
（ｃ）第二のタンデム色素に結合体化した第二のリガンドであって、前記第二のタンデム色素は、
（ｉ）架橋および非架橋サブユニットを含み、第二の細菌種または第二の真核藻種から得られる第三のフィコビリタンパク質；および
（ｉｉ）前記第三のフィコビリタンパク質に結合体化した第二のパートナー色素
を含む、第二のタンデム色素に結合体化した第二のリガンドと、
（ｄ）サブユニットを含み、前記第二の細菌種または前記第二の真核藻種から得られる非結合体化第四のフィコビリタンパク質
をさらに含む組成物であって；
前記第四のフィコビリタンパク質と前記第三のフィコビリタンパク質が同じであるか；または
前記第四のフィコビリタンパク質と前記第三のフィコビリタンパク質が異なり、および前記第四のフィコビリタンパク質が、前記第三のフィコビリタンパク質の前記非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含む、
請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
（ｅ）第四のフィコビリタンパク質に結合体化した第三のリガンド
をさらに含む組成物であって、
前記第四のフィコビリタンパク質が、前記第一の細菌種、前記第一の真核藻種、前記第二の細菌種、または前記第二の真核藻種から得られ；
前記第四のフィコビリタンパク質が、前記第一のフィコビリタンパク質、前記第二のフィコビリタンパク質、もしくは前記第三のフィコビリタンパク質と同じであるか；または
前記第四のフィコビリタンパク質が、前記第一、第二、もしくは第三のフィコビリタンパク質と異なり、および前記第一、第二、もしくは第三のフィコビリタンパク質の前記非架橋サブユニットと交換する非架橋サブユニットを含む、
請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記第一のリガンドが、アミノ酸配列または核酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２９】
前記アミノ酸配列が、抗体、酵素、組換えタンパク質、多分子集合体、またはそれらのフラグメントを含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記多分子集合体が、組換えタンパク質の四量体である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
検体中の細胞および非細胞集団を分析するための方法であって、
（ａ）前記検体と請求項１に記載の組成物を併せる工程であって、ここで、前記細胞および非細胞集団の少なくとも１つは、前記第一のリガンドの受容体を含む、工程；および
（ｂ）蛍光を分析することにより前記検体中の前記集団を同定する工程
を含む、方法。
【請求項３２】
前記集団のそれぞれについて少なくとも１つの追加のパラメータを同定する工程をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記追加のパラメータが、１つ以上の蛍光チャネル、１つ以上の光学パラメータ、１つ以上の電気的パラメータ、時間、散乱、およびそれらの組み合わせからなる群より独立して選択される、請求項３１に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図２Ｇ】
【図２Ｈ】
【図２Ｉ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図３Ｇ】
【図３Ｈ】
【図３Ｉ】
【図３Ｊ】
【図４】
【図５】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図２Ｇ】
【図２Ｈ】
【図２Ｉ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図３Ｇ】
【図３Ｈ】
【図３Ｉ】
【図３Ｊ】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１２−５１２１６１（Ｐ２０１２−５１２１６１Ａ）
【公表日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４０８８７（Ｐ２０１１−５４０８８７）
【出願日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６７４８１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６８７４２
【国際公開日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【出願人】（５１０００５８８９）ベックマン コールター， インコーポレイテッド (174)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６７４８１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６８７４２
【国際公開日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【出願人】（５１０００５８８９）ベックマン コールター， インコーポレイテッド (174)
【Ｆターム（参考）】
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