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順列置換及び非順列置換ルシフェラーゼバイオセンサー
説明

順列置換及び非順列置換ルシフェラーゼバイオセンサー

【課題】cAMP、cGMP、カルシウム、そのキレート剤、キナーゼ、又はホスファターゼを含む分子のセンサーである、改変ルシフェラーゼタンパク質を提供する。
【解決手段】少なくともその1つが直接又は間接に対象の分子と相互作用する、1つ又は複数の異種アミノ酸配列を含む、例えば、円順列置換花虫類ルシフェラーゼタンパク質及び円順列置換十脚甲殻類の改変ルシフェラーゼタンパク質を構成する。少なくともその1つが直接又は間接に対象の分子と相互作用する、1つ又は複数の異種アミノ酸配列の挿入を含む。


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【特許請求の範囲】
【請求項1】
サイクリックヌクレオチド結合部位を含む円順列置換ルシフェラーゼのオープンリーディングフレームを含む核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、このルシフェラーゼが、対応する非順列置換ルシフェラーゼ中の、改変に対して耐性である部位又は領域において順列置換されており、円順列置換ルシフェラーゼの活性が検出可能であるポリヌクレオチド。
【請求項2】
円順列置換ルシフェラーゼが、N末端、C末端、又はその両方において、少なくとも1つのアミノ酸タグをさらに含む、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項3】
タグが、PEST配列、GST配列、又はポリヒスチジン配列である、請求項2に記載のポリヌクレオチド。
【請求項4】
円順列置換ルシフェラーゼが、非順列置換ルシフェラーゼのN末端及び/又はC末端に対応する配列においてルシフェラーゼ配列の欠失をさらに含む、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項5】
N末端又はC末端における欠失がルシフェラーゼ配列の15残基以下である、請求項4に記載のポリヌクレオチド。
【請求項6】
サイクリックヌクレオチド結合部位が、非順列置換ルシフェラーゼのN末端及び/又はC末端に対応する配列に存在する、請求項1又は5に記載のポリヌクレオチド。
【請求項7】
サイクリックヌクレオチド結合部位が約4〜約200アミノ酸残基の長さである、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項8】
ルシフェラーゼが鞘翅目ルシフェラーゼである、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項9】
ルシフェラーゼがヒカリコメツキルシフェラーゼ又はホタルルシフェラーゼである、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項10】
ルシフェラーゼが花虫類ルシフェラーゼである、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項11】
ルシフェラーゼがレニラルシフェラーゼである、請求項10に記載のポリヌクレオチド。
【請求項12】
サイクリックヌクレオチド結合部位が、ホタルルシフェラーゼの残基2〜12、残基32〜53、残基70〜88、残基102〜126、残基139〜165、残基183〜203、残基220〜247、残基262〜273、残基303〜313、残基353〜408、残基485〜495、又は残基535〜546に対応する領域に存在する、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項13】
サイクリックヌクレオチド結合部位が、ヒカリコメツキルシフェラーゼの残基15〜30、残基112〜122、残基352〜362、残基371〜384、残基393〜414、又は残基485〜495に対応する領域に存在する、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項14】
サイクリックヌクレオチド結合部位が、レニラルシフェラーゼの残基2〜12、残基26〜47、残基64〜74、残基86〜116、残基147〜157、残基223〜234、又は残基301〜311に対応する領域に存在する、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項15】
円順列置換が、ホタルルシフェラーゼの残基2〜12、残基32〜53、残基70〜88、残基102〜126、残基139〜165、残基203〜193、残基220〜247、残基262〜273、残基303〜313、残基353〜408、残基485〜495、又は残基535〜546に対応する領域に存在する、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項16】
円順列置換が、ヒカリコメツキルシフェラーゼの残基15〜30、残基112〜122、残基352〜362、残基371〜384、残基393〜414、又は残基485〜495に対応する領域に存在する、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項17】
円順列置換が、レニラルシフェラーゼの残基26〜47、残基64〜74、残基85〜116、残基147〜157、残基223〜234、又は残基301〜311に対応する領域に存在する、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項18】
サイクリックヌクレオチド結合部位がcAMPに結合する、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項19】
サイクリックヌクレオチド結合部位がcGMPに結合する、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項20】
請求項1から19までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項21】
請求項20に記載のベクター中のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項22】
請求項1から19までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドがコードする円順列置換ルシフェラーゼ。
【請求項23】
細胞内におけるサイクリックヌクレオチドを検出又は定量する方法であって、
a)請求項21に記載の宿主細胞又はその溶解物、及び発光反応用の試薬を含む混合物を提供するステップと、
b)混合物中の発光を検出又は定量し、これにより細胞内におけるサイクリックヌクレオチドの存在又は量を検出又は定量するステップと
を含む方法。
【請求項24】
試料中におけるサイクリックヌクレオチドを検出又は定量する方法であって、
a)サイクリックヌクレオチドを有すると推定される試料、請求項22に記載の円順列置換ルシフェラーゼ、及び発光反応用の試薬を含む混合物を提供するステップと、
b)混合物中の発光を検出又は定量するステップと
を含む方法。
【請求項25】
ルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼである、請求項23又は24に記載の方法。
【請求項26】
ルシフェラーゼがヒカリコメツキルシフェラーゼである、請求項23又は24に記載の方法。
【請求項27】
ルシフェラーゼがレニラルシフェラーゼである、請求項23又は24に記載の方法。
【請求項28】
サイクリックヌクレオチド結合部位へのサイクリックヌクレオチドの結合が発光の上昇をもたらす、請求項23又は24に記載の方法。
【請求項29】
試料が細胞を含む、請求項24に記載の方法。
【請求項30】
試料が細胞溶解物又は細胞画分を含む、請求項24に記載の方法。
【請求項31】
Gタンパク質共役受容体の1つ又は複数の調節因子を検出する方法であって、
a)1つ又は複数の被験作用物質を含む試料、請求項21に記載の宿主細胞又はその溶解物、及び発光反応用の試薬を提供するステップと、
b)試料中の発光を検出又は定量するステップと
を含む方法。
【請求項32】
Gタンパク質共役受容体の1つ又は複数の調節因子を検出する方法であって、
a)1つ又は複数の被験作用物質を含む試料、請求項22に記載の円順列置換ルシフェラーゼ、及び発光反応用の試薬を提供するステップと、
b)試料中の発光を検出又は定量するステップと
を含む方法。
【請求項33】
Gタンパク質共役受容体の1つ又は複数の調節因子を検出する方法であって、
a)1つ又は複数の被験作用物質、請求項21に記載の宿主細胞又はその溶解物、及び発光反応用の試薬を含む第1の発光反応混合物からの発光を、1つ又は複数の被験作用物質を含まず、請求項21に記載の宿主細胞又はその溶解物、及び発光反応用の試薬を含む、対応する発光反応混合物からの発光と比較するステップと、
b)第1の発光反応混合物中の1つ又は複数の被験作用物質が、対応する発光反応混合物と比べ、第1の発光反応混合物中の発光を変化させるかどうかを検出又は判定するステップと
を含む方法。
【請求項34】
Gタンパク質共役受容体の1つ又は複数の調節因子を検出する方法であって、
a)1つ又は複数の被験作用物質、請求項22に記載の円順列置換ルシフェラーゼ、及び発光反応用の試薬を含む第1の発光反応混合物からの発光を、1つ又は複数の被験作用物質を含まず、請求項22に記載の円順列置換ルシフェラーゼ、及び発光反応用の試薬を含む、対応する発光反応混合物からの発光と比較するステップと、
b)第1の発光反応混合物中の作用物質が、対応する発光反応混合物と比べ、第1の発光反応混合物中の発光を変化させるかどうかを検出又は判定するステップと
を含む方法。
【請求項35】
1つ又は複数の作用物質が、Gタンパク質共役受容体活性を高める、請求項31から34までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
1つ又は複数の作用物質が、Gタンパク質共役受容体活性を阻害する、請求項31から34までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
宿主細胞又はその溶解物及び試薬の添加前に、1つ又は複数の作用物質を固体基質と接触させる、請求項31又は34に記載の方法。
【請求項38】
円順列置換ルシフェラーゼ及び試薬の添加前に、1つ又は複数の作用物質を固体基質と接触させる、請求項32又は34に記載の方法。
【請求項39】
宿主細胞が組み換えGタンパク質共役受容体を発現する、請求項31又は33に記載の方法。
【請求項40】
対象の分子と直接又は間接に相互作用するアミノ酸配列を含む挿入を場合によって含む、円順列置換花虫類ルシフェラーゼのオープンリーディングフレームを含む核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、円順列置換が、改変に対して耐性である花虫類ルシフェラーゼ配列中の残基又は領域に存在し、挿入が、改変に対して耐性である花虫類ルシフェラーゼ配列中の異なる残基又は領域に存在するポリヌクレオチド。
【請求項41】
核酸配列が、円順列置換花虫類ルシフェラーゼと、N末端、C末端、又はその両方に少なくとも1つのアミノ酸タグとを含む融合タンパク質をコードする、請求項40に記載のポリヌクレオチド。
【請求項42】
円順列置換花虫類ルシフェラーゼが、対応する非円順列置換ルシフェラーゼのN末端及び/又はC末端に対応する花虫類ルシフェラーゼ配列の欠失をさらに含む、請求項40に記載のポリヌクレオチド。
【請求項43】
欠失が花虫類ルシフェラーゼ配列の15残基以下である、請求項42に記載のポリヌクレオチド。
【請求項44】
円順列置換花虫類ルシフェラーゼが、挿入に対してN末端側及び/又はC末端側にある花虫類ルシフェラーゼ配列の欠失をさらに含む、請求項40に記載のポリヌクレオチド。
【請求項45】
欠失が花虫類ルシフェラーゼ配列の15残基以下である、請求項44に記載のポリヌクレオチド。
【請求項46】
挿入が、対応する非円順列置換花虫類ルシフェラーゼのN末端及び/又はC末端に対応する配列に存在する、請求項40に記載のポリヌクレオチド。
【請求項47】
挿入が約4〜約200アミノ酸残基である、請求項40に記載のポリヌクレオチド。
【請求項48】
挿入が、非円順列置換レニラルシフェラーゼの残基2〜12、残基26〜47、残基64〜74、残基86〜116、残基147〜157、残基223〜234、又は残基301〜311に対応する領域に存在する、請求項40に記載のポリヌクレオチド。
【請求項49】
順列置換が、非円順列置換レニラルシフェラーゼの残基2〜12、残基26〜47、残基64〜74、残基86〜116、残基147〜157、残基223〜234、又は残基301〜311に対応する領域に存在する、請求項40に記載のポリヌクレオチド。
【請求項50】
請求項40から49までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項51】
請求項50に記載のベクター中のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項52】
請求項40から49までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドがコードする改変花虫類ルシフェラーゼ。
【請求項53】
細胞内における対象の分子を検出又は定量する方法であって、
a)請求項51に記載の宿主細胞又はその溶解物、及び発光反応用の試薬を含む混合物を提供するステップであって、円順列置換ルシフェラーゼが挿入を含むステップと、
b)混合物中の発光を検出又は定量し、これにより前記細胞内における前記分子の存在又は量を検出又は定量するステップと
を含む方法。
【請求項54】
試料中における対象の分子を検出又は定量する方法であって、
a)サイクリックヌクレオチドを有すると推定される試料、挿入を含む請求項52に記載の改変ルシフェラーゼ、及び発光反応用の試薬を含む混合物を提供するステップと、
b)混合物中の発光を検出又は定量するステップと
を含む方法。
【請求項55】
対象の分子の1つ又は複数の調節因子を検出する方法であって、
a)1つ又は複数の被験作用物質を含む試料、請求項51に記載の宿主細胞又はその溶解物、及び発光反応用の試薬を提供するステップと、
b)試料中の発光を検出又は定量するステップと
を含む方法。
【請求項56】
対象の分子の1つ又は複数の調節因子を検出する方法であって、
a)1つ又は複数の被験作用物質を含む試料、挿入を含む請求項52に記載の改変ルシフェラーゼ、及び発光反応用の試薬を提供するステップと、
b)試料中の発光を検出又は定量するステップと
を含む方法。
【請求項57】
改変甲虫ルシフェラーゼのオープンリーディングフレームを含む核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、改変甲虫ルシフェラーゼが、対応する非改変甲虫ルシフェラーゼと比べてサイクリックヌクレオチド結合部位を含み、サイクリックヌクレオチド結合部位が、改変に対して耐性である甲虫ルシフェラーゼ配列中の残基又は領域に存在し、改変甲虫ルシフェラーゼの活性が検出可能であるポリヌクレオチド。
【請求項58】
サイクリックヌクレオチド結合部位が、改変甲虫ルシフェラーゼのC末端に存在する、請求項57に記載のポリヌクレオチド。
【請求項59】
サイクリックヌクレオチド結合部位が、N末端及びC末端に対して内部に存在する、請求項57に記載のポリヌクレオチド。
【請求項60】
核酸配列が、改変甲虫ルシフェラーゼのN末端、C末端、又はその両方において、少なくとも1つのアミノ酸タグをさらにコードする、請求項57に記載のポリヌクレオチド。
【請求項61】
改変甲虫ルシフェラーゼが、サイクリックヌクレオチド結合部位に対してN末端側及び/又はC末端側にある甲虫ルシフェラーゼ配列の欠失をさらに含む、請求項57に記載のポリヌクレオチド。
【請求項62】
欠失が甲虫ルシフェラーゼ配列の15残基以下である、請求項61に記載のポリヌクレオチド。
【請求項63】
改変甲虫ルシフェラーゼが、非改変甲虫ルシフェラーゼのN末端及び/又はC末端に対応する配列において甲虫ルシフェラーゼ配列の欠失をさらに含む、請求項57に記載のポリヌクレオチド。
【請求項64】
N末端又はC末端における欠失が甲虫ルシフェラーゼ配列の15残基以下である、請求項63に記載のポリヌクレオチド。
【請求項65】
甲虫ルシフェラーゼがヒカリコメツキルシフェラーゼである、請求項57に記載のポリヌクレオチド。
【請求項66】
甲虫ルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼである、請求項57に記載のポリヌクレオチド。
【請求項67】
サイクリックヌクレオチド結合部位が、ホタルルシフェラーゼの残基2〜12、残基32〜53、残基70〜88、残基102〜126、残基139〜165、残基183〜203、残基220〜247、残基262〜273、残基303〜313、残基353〜408、残基485〜495、又は残基535〜546に対応する領域に存在する、請求項57に記載のポリヌクレオチド。
【請求項68】
サイクリックヌクレオチド結合部位が、ヒカリコメツキルシフェラーゼの残基15〜30、残基112〜122、残基352〜362、残基371〜384、残基393〜414、又は残基485〜495に対応する領域に存在する、請求項57に記載のポリヌクレオチド。
【請求項69】
サイクリックヌクレオチド結合部位がcAMPに結合する、請求項57に記載のポリヌクレオチド。
【請求項70】
サイクリックヌクレオチド結合部位がcGMPに結合する、請求項57に記載のポリヌクレオチド。
【請求項71】
請求項57から70までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項72】
請求項71に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項73】
請求項57から70までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドがコードする改変甲虫ルシフェラーゼ。
【請求項74】
細胞内におけるサイクリックヌクレオチドを検出する方法であって、a)細胞を請求項71に記載のベクターと接触させるステップと、b)前記ベクターがコードする改変甲虫ルシフェラーゼの活性を検出又は定量するステップとを含む方法。
【請求項75】
試料中におけるサイクリックヌクレオチドを検出する方法であって、a)試料を請求項73に記載の改変甲虫ルシフェラーゼと接触させるステップと、b)ベクターがコードする改変甲虫ルシフェラーゼの活性を検出又は定量するステップとを含む方法。
【請求項76】
改変花虫類ルシフェラーゼのオープンリーディングフレームを含む核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、改変花虫類ルシフェラーゼが、対応する非改変花虫類ルシフェラーゼと比べて内部挿入を含み、この挿入が、対応する野生型の花虫類ルシフェラーゼ中の、改変に対して耐性である残基又は領域に存在し、前記挿入が対象の分子と直接又は間接に相互作用するアミノ酸を含み、改変花虫類ルシフェラーゼの活性が検出可能であるポリヌクレオチド。
【請求項77】
挿入が、レニラルシフェラーゼの残基2〜12、残基26〜47、残基64〜74、残基86〜116、残基147〜157、残基223〜234、又は残基301〜311に対応する領域に存在する、請求項76に記載のポリヌクレオチド。
【請求項78】
請求項76又は77に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項79】
請求項78に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項80】
請求項76又は77に記載のポリヌクレオチドがコードする改変花虫類ルシフェラーゼ。
【請求項81】
細胞内における対象の分子を検出する方法であって、a)細胞又はin vitroにおける転写/翻訳混合物を有する試料及び請求項78に記載のベクターを接触させるステップであって、挿入が対象の分子によって認識されるステップと、b)前記ベクターがコードする改変花虫類ルシフェラーゼの活性を検出又は定量し、これにより試料中における前記分子の存在又は量を検出又は定量するステップとを含む方法。
【請求項82】
改変ホタルルシフェラーゼのオープンリーディングフレームを含む核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、改変ホタルルシフェラーゼが、対応する非改変ホタルルシフェラーゼと比べて内部挿入を含み、この挿入が、改変に対して耐性であるホタルルシフェラーゼ配列中の残基又は領域に存在し、前記挿入が、対応する非改変ホタルルシフェラーゼと比べて対象の分子と直接又は間接に相互作用するアミノ酸配列を含み、改変ホタルルシフェラーゼの活性が検出可能であり、前記挿入が、ホタルルシフェラーゼの残基2〜12、残基116〜126、残基228〜238、残基262〜272、残基289〜308、残基356〜366、残基432〜442、又は残基535〜546に対応する領域には存在しないポリヌクレオチド。
【請求項83】
改変ホタルルシフェラーゼのオープンリーディングフレームを含む核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、改変ホタルルシフェラーゼが、対応する非改変ホタルルシフェラーゼと比べて挿入及びホタルルシフェラーゼ配列の断片を含み、前記断片が、対応する非改変ホタルルシフェラーゼの少なくとも50の隣接するアミノ酸残基を有し、挿入が、改変に対して耐性であるホタルルシフェラーゼ配列中の残基又は領域に存在し、改変ホタルルシフェラーゼの活性が、対応する非改変ホタルルシフェラーゼの少なくとも50の隣接するアミノ酸残基の異なる断片に対応するホタルルシフェラーゼ配列の別の断片により上昇し、挿入が、対象の分子と直接又は間接に相互作用するアミノ酸配列を含み、前記断片のC末端又はN末端が、ホタルルシフェラーゼの残基116〜126、残基228〜238、残基262〜272、残基289〜308、残基356〜366、又は残基432〜442に対応する領域における残基には対応しないポリヌクレオチド。
【請求項84】
改変ホタルルシフェラーゼが、挿入に対してN末端側及び/又はC末端側にあるホタルルシフェラーゼ配列の欠失をさらに含む、請求項82又は83に記載のポリヌクレオチド。
【請求項85】
欠失がホタルルシフェラーゼ配列の15残基以下である、請求項84に記載のポリヌクレオチド。
【請求項86】
改変ホタルルシフェラーゼが、非改変ホタルルシフェラーゼのN末端及び/又はC末端に対応する配列においてホタルルシフェラーゼ配列の欠失をさらに含む、請求項82又は83に記載のポリヌクレオチド。
【請求項87】
N末端又はC末端における欠失がホタルルシフェラーゼ配列の15残基以下である、請求項86に記載のポリヌクレオチド。
【請求項88】
対象の分子と直接又は間接に相互作用するアミノ酸配列を含む挿入を場合によっては含む、円順列置換カイアシ類ルシフェラーゼのオープンリーディングフレームを含む核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、順列置換が、改変に対して耐性であるカイアシ類ルシフェラーゼ配列中の残基又は領域に存在し、挿入が、改変に対して耐性であるカイアシ類ルシフェラーゼ配列中の異なる残基又は領域に存在するポリヌクレオチド。
【請求項89】
順列置換が、ガウシアルシフェラーゼの残基43〜53、残基63〜73、残基79〜89、残基95〜105、残基105〜115、残基109〜119、残基121〜131、又は残基157〜168に対応する領域に存在する、請求項88に記載のポリヌクレオチド。
【請求項90】
混合物、宿主細胞、発光の検出若しくは定量、又はその任意の組合せが、約30℃〜約47℃である、請求項23又は33に記載の方法。
【請求項91】
宿主細胞、試料、発光の検出若しくは定量、又はその任意の組合せが、約30℃〜約47℃である、請求項31に記載の方法。
【請求項92】
細胞、活性の検出若しくは定量、又はその任意の組合せが、約30℃〜約47℃である、請求項74に記載の方法。
【請求項93】
宿主細胞にポリヌクレオチドを安定的にトランスフェクトする、請求項23、31、又は33に記載の方法。
【請求項94】
細胞にベクターを安定的にトランスフェクトする、請求項74に記載の方法。
【請求項95】
細胞内における対象の分子の存在又は活性を検出又は定量する方法であって、a)改変ルシフェラーゼのオープンリーディングフレームを含む核酸配列を有するベクターを含む細胞を含む発光反応混合物を提供するステップであって、改変ルシフェラーゼが、対応する非改変ルシフェラーゼと比べて挿入を含み、この挿入が、改変に対して耐性であるルシフェラーゼ配列中の残基又は領域に存在し、前記挿入が、対応する非改変ルシフェラーゼと比べて対象の分子と直接又は間接に相互作用するアミノ酸配列を含み、改変ルシフェラーゼの活性が検出可能であり、前記混合物が約30℃〜約47℃であるステップと、b)前記混合物中の発光を検出又は定量し、これにより細胞内における前記分子の存在、量、又は活性を検出又は定量するステップと
を含む方法。
【請求項96】
改変ルシフェラーゼが甲虫ルシフェラーゼである、請求項95に記載の方法。
【請求項97】
改変甲虫ルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼである、請求項96に記載の方法。
【請求項98】
改変甲虫ルシフェラーゼがヒカリコメツキルシフェラーゼである、請求項96に記載の方法。
【請求項99】
改変ルシフェラーゼが円順列置換ルシフェラーゼである、請求項95に記載の方法。
【請求項100】
挿入がサイクリックヌクレオチド結合部位である、請求項95に記載の方法。
【請求項101】
混合物が1つ又は複数の被験作用物質をさらに含む、請求項95に記載の方法。
【請求項102】
混合物中の発光を、1つ又は複数の被験作用物質を含まない対応する混合物における発光と比較する、請求項101に記載の方法。
【請求項103】
混合物を約5%のCO2下に置く、請求項95に記載の方法。
【請求項104】
改変甲虫ルシフェラーゼ中における異種配列の活性を直接又は間接に変化させる作用物質を同定する方法であって、
a)改変ルシフェラーゼを発現する細胞を含む発光反応混合物を、1つ又は複数の作用物質と接触させるステップであって、改変ルシフェラーゼのオープンリーディングフレームを含む核酸配列を有するベクターが改変ルシフェラーゼをコードし、改変ルシフェラーゼが、対応する非改変ルシフェラーゼと比べて異種配列を含み、この異種配列が、改変に対して耐性であるルシフェラーゼ配列中の残基又は領域に存在し、前記異種配列が、対応する非改変ルシフェラーゼと比べて対象の分子と直接又は間接に相互作用するアミノ酸配列を含み、改変ルシフェラーゼの活性が検出可能であり、前記混合物が約30℃〜約47℃であるステップと、
b)1つ又は複数の作用物質が、改変甲虫ルシフェラーゼの活性を変化させるかどうかを確認するステップと
を含む方法。
【請求項105】
改変ルシフェラーゼが甲虫ルシフェラーゼである、請求項104に記載の方法。
【請求項106】
甲虫ルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼである、請求項105に記載の方法。
【請求項107】
甲虫ルシフェラーゼがヒカリコメツキルシフェラーゼである、請求項105に記載の方法。
【請求項108】
細胞にベクターを安定的にトランスフェクトする、請求項95又は105に記載の方法。
【請求項109】
異種配列がサイクリックヌクレオチド結合部位である、請求項104に記載の方法。
【請求項110】
混合物を約5%のCO2下に置く、請求項104に記載の方法。
【請求項111】
改変ルシフェラーゼが改変花虫類ルシフェラーゼである、請求項95又は104に記載の方法。
【請求項112】
挿入がセリンキナーゼ、スレオニンキナーゼ、又はチロシンキナーゼのペプチド基質を含む、請求項40に記載のポリヌクレオチド。
【請求項113】
挿入がホスホセリンペプチド結合ドメイン、ホスホスレオニンペプチド結合ドメイン、又はホスホチロシンペプチド結合ドメインを含む、請求項40に記載のポリヌクレオチド。
【請求項114】
セリンキナーゼ、スレオニンキナーゼ、又はチロシンキナーゼのペプチド基質を含む異種アミノ酸配列を含む、円順列置換ルシフェラーゼのオープンリーディングフレームを含む核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、このルシフェラーゼが、対応する非順列置換ルシフェラーゼ中の、改変に対して耐性である部位又は領域において順列置換されており、円順列置換ルシフェラーゼの活性が検出可能であるポリヌクレオチド。
【請求項115】
ホスホセリンペプチド結合ドメイン、ホスホスレオニンペプチド結合ドメイン、又はホスホチロシンペプチド結合ドメインを含む異種アミノ酸配列を含む、円順列置換ルシフェラーゼのオープンリーディングフレームを含む核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、このルシフェラーゼが、対応する非順列置換ルシフェラーゼ中の、改変に対して耐性である部位又は領域において順列置換されており、円順列置換ルシフェラーゼの活性が検出可能であるポリヌクレオチド。
【請求項116】
ルシフェラーゼが花虫類ルシフェラーゼである、請求項114又は115に記載のポリヌクレオチド。
【請求項117】
ルシフェラーゼが甲虫ルシフェラーゼである、請求項114又は115に記載のポリヌクレオチド。
【請求項118】
改変十脚甲殻類ルシフェラーゼのオープンリーディングフレームを含む核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、改変十脚甲殻類ルシフェラーゼが、対応する非改変十脚甲殻類ルシフェラーゼと比べて挿入及び十脚甲殻類ルシフェラーゼ配列の第1の断片を含み、第1の断片が、対応する非改変成体十脚甲殻類ルシフェラーゼの少なくとも35の隣接するアミノ酸残基を有し、挿入が、改変に対して耐性である成体十脚甲殻類ルシフェラーゼ配列中の残基又は領域に存在し、改変十脚甲殻類ルシフェラーゼの活性が、対応する非改変成体十脚甲殻類ルシフェラーゼの少なくとも35の隣接するアミノ酸残基の異なる断片に対応する十脚甲殻類ルシフェラーゼ配列の第2の断片により上昇し、挿入が対象の分子と直接又は間接に相互作用するアミノ酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項119】
改変十脚甲殻類ルシフェラーゼのオープンリーディングフレームを含む核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、改変十脚甲殻類ルシフェラーゼが、対応する非改変十脚甲殻類ルシフェラーゼと比べて内部挿入を含み、この挿入が、改変に対して耐性である成体十脚甲殻類ルシフェラーゼ配列中の残基又は領域に存在し、前記挿入が、対応する非改変十脚甲殻類ルシフェラーゼと比べて、対象の分子と直接又は間接に相互作用するアミノ酸配列を含み、改変十脚甲殻類ルシフェラーゼの活性が検出可能であるポリヌクレオチド。
【請求項120】
第1の断片が、少なくとも45〜少なくとも85の残基を有する、請求項118に記載のポリヌクレオチド。
【請求項121】
挿入が、ヒオドシエビルシフェラーゼの残基45〜55、又は同残基79〜89に対応する領域に存在する、請求項119に記載のポリヌクレオチド。
【請求項122】
天然のタンパク質における、改変に対して耐性である1つ又は複数の部位を決定する方法であって、
二次構造を含む天然の構造を有する可能性の高いタンパク質において、親水性残基の大半を有する領域であって、天然のタンパク質構造において二次構造を形成する可能性の高くない領域に存在するタンパク質のアミノ酸配列における1つ又は複数の残基を同定するステップを含む方法。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【図5A】
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【図5B】
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【図5C】
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【図5D】
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【図6】
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【図7】
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【図8A】
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【図8B】
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【図9A】
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【図9B】
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【図10A】
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【図10B】
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【図11A】
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【図11B】
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【図11C】
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【図12】
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【図13】
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【図14】
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【図15】
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【図16A】
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【図16B】
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【図17A】
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【図17B】
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【図18A】
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【図18B】
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【図19】
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【図20】
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【図21】
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【図22】
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【図23】
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【図24】
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【図25】
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【図26】
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【図27A】
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【図27B】
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【図28】
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【図29】
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【図30A】
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【図30B】
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【図31】
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【図32A】
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【図32B】
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【図33】
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【図34A】
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【図34B】
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【図35A】
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【図35B】
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【図36A】
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【図36B】
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【図37】
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【図38】
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【図39】
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【図40A】
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【図40B】
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【図41】
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【図42】
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【図43A】
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【図43B】
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【図44】
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【図45】
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【図46】
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【図47】
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【図48】
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【図49】
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【図50】
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【図51】
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【図52A】
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【図52B】
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【図52C】
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【図52D】
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【図53】
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【図54A】
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【図54B】
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【図55A】
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【図55B】
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【図56】
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【図57】
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【図58】
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【図59】
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【図60】
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【図61】
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【図62】
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【図63】
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【図64A】
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【図64B】
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【図64C】
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【図64D】
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【図65】
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【図66】
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【図67−1】
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【図67−2】
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【図67−3】
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【図67−5】
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【図67−8】
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【図67−11】
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【図67−12】
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【図67−15】
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【図67−40】
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【図67−50】
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【図67−55】
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【図67−80】
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【図67−90】
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【図67−93】
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【図67−98】
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【図67−100】
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【図67−101】
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【図67−102】
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【図67−103】
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【図67−104】
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【図67−109】
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【図67−110】
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【図67−111】
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【図67−112】
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【図67−113】
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【図67−115】
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【図67−116】
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【図67−117】
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【図67−118】
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【図67−119】
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【図67−120】
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【公開番号】特開2013−51968(P2013−51968A)
【公開日】平成25年3月21日(2013.3.21)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2012−248580(P2012−248580)
【出願日】平成24年11月12日(2012.11.12)
【分割の表示】特願2009−504249(P2009−504249)の分割
【原出願日】平成19年4月2日(2007.4.2)
【出願人】(593089149)プロメガ コーポレイション (57)
【氏名又は名称原語表記】Promega Corporation
【Fターム(参考)】