類型不能ＨＡＥＭＯＰＨＩＬＵＳＩＮＦＬＵＥＮＺＡＥの中耳炎単離株の遺伝子
本発明は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨｉ）の類型不能株のポリヌクレオチド配列、そのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドならびにその使用に関する。本発明はまた、中耳または鼻咽頭のＮＴＨｉ感染の間またはその感染に応じて、アップレギュレートされるＮＴＨｉ遺伝子に関する。本発明はまた、ＮＴＨｉ関連障害を処置および予防するワクチンおよび方法を含む、これらのＮＴＨｉポリヌクレオチドおよびＮＴＨｉポリペプチドの使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２００３年３月６日出願の米国仮特許出願第６０／４５３，１３４号（これは、その全体が本明細書に参考として援用される）の優先権の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨｉ）ゲノムの類型不能株のポリヌクレオチド配列、そのゲノム内に含まれるＮＴＨｉ遺伝子およびそのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに関する。本発明はまた、ＮＴＨｉ関連障害を処置および予防するワクチンおよび方法を含む、これらのＮＴＨｉポリヌクレオチドおよびＮＴＨｉポリペプチドの使用に関する。本発明はまた、中耳または鼻咽頭のＮＴＨｉ感染の間またはその感染に応じて、アップレギュレートされるＮＴＨｉ遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
中耳炎（ＯＭ）は、全世界で非常に優勢な小児疾患であり、小児が救急室に運ばれる主な原因である（Ｉｎｆａｎｔｅ−Ｒｉｖａｎｄ ａｎｄ Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１５：４４４−４６５，１９９３）。最近の統計では、１９９０年に、ＯＭが原因で２億４５００万回の通院（ｐｈｙｓｉｃｉａｎ ｏｆｆｉｃｅ ｖｉｓｉｔ）があったことが示されている。このことは、１９８０年代において報告されたものより２００％を超えて増大していることを示している。もはや死と関連することは稀であるが、ＯＭと関連する罹患率は、重大である。聴覚喪失は、この疾患と関連する一般的な問題であり、しばしば、小児の行動、教育および言語能力の発達に影響を与える（Ｂａｌｄｗｉｎ，Ａｍ．Ｊ．Ｏｔｏｌ．，１４：６０１−６０４，１９９３；Ｈｕｎｔｅｒｅｔら，Ａｎｎ．Ｏｔｏｌ．Ｒｈｉｎｏｌ．Ｌａｒｙｎｇｏｌ．Ｓｕｐｐｌ．，１６３：５９−６１，１９９４；Ｔｅｅｌｅら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６２：６８５−６９４，１９９０）。ＯＭのその社会経済的な影響もまた大きく、ＯＭを診断および管理する直接的および間接的な費用は、米国単独で年間５０億ドルを超えている（Ｋａｐｌａｎら，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．，１６：Ｓ９−１１，１９９７）。
【０００４】
抗生物質療法は、一般的かつ中耳腔換気用チューブの外科手術による置換は、滲出液を排出すること、感染を除去すること、および中耳に流体が蓄積することと関連する頭痛を緩和することという観点から好結果であったが、多剤耐性細菌の出現およびチューブの置換と関連するその侵襲的性質によって、ＯＭの管理、より好ましくはＯＭの予防に対するより有効かつ容認されたアプローチが必要であることが明らかにされた。慢性ＯＭの外科手術的管理は、小児に全身麻酔をかけている間に、鼓膜を通して中耳腔換気用チューブを挿入することを包含する。この手順は平凡であり（普及率は約１３％である；Ｂｒｉｇｈｔら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ，８３（７）：１０２６−８，１９９３）、蓄積した流体を中耳から排出することによって、痛みの伴う症状を軽減するという点で非常に有効であるが、これは、その手順の侵襲的性質およびその伴う危険性に起因して、数多くの批判を受けている（Ｂｅｒｍａｎら，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，９３（３）：３５３−６３，１９９４；Ｂｒｉｇｈｔら，前出；Ｃｉｍｏｎｓ，ＡＳＭＮｅｗｓ，６０：５２７−５２８；Ｐａａｐ，Ａｎｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．，３０（１１）：１２９１−７，１９９６）。
【０００５】
ワクチン開発における進歩は、７価の莢膜結合体ワクチンであるＰＲＥＶＮＡＲ（登録商標）（ＥｓｋｏｌａおよびＫｉｌｐｉ，Ｐｅｄｒｉａｔｒ．Ｅｆｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．１６：Ｓ７２−７８，２０００）が最近認可および解放されたことによって明らかなように、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＯＭの主な原因となる因子）について最も促進されている（ＡＯＭ）。ＰＲＥＶＮＡＲ（登録商標）は、侵襲性の肺炎球菌疾患に非常に有用であったが、ＯＭについての適用範囲は、そのワクチンに含まれない血清型に起因して、数が増大したＯＭの症例の報告によって期待が裏切られている（６〜８％）（Ｂｌａｃｋら，Ｐｅｄｒｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ Ｊ．，１９：１８７−１９５；Ｅｓｋｏｌａら，Ｐｅｄｒｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ Ｊ．，１９：Ｓ７２−７８，２０００；Ｅｓｋｏｌａら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ Ｍｅｄ．３４４：４０３−４０９，２００１；Ｓｎｏｗら，Ｏｔｏｌ．Ｎｅｕｒｏｔｏｌ．，２３：１−２，２００２）。類型不可Ｈａｅｍｏｐｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨｉ）（滲出液を伴う慢性ＯＭ中で優勢なグラム陰性病原体（Ｋｌｅｉｎ，Ｐｅｄｒｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ Ｊ．，１６：Ｓ５−８，１９９７；Ｓｐｉｎｏｌａら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１５４：１００−１０９，１９８６））については、あまり進歩していない。ＮＴＨｉに対する有効なワクチン開発の妨害は、ＮＴＨｉ誘導性中耳疾患の病原の現在の不完全な理解である。この遅れの一因は、その疾患が、良性鼻咽頭共生生物の宿主の免疫学的寛容性のうちの１つから進行するので、微生物が発現する毒性因子と宿主の免疫応答との間の動的な相互作用の理解が欠如していることであり、通常は無菌の中耳腔の日和見的な侵入物に対する活発な防御反応の欠如に起因している。
【０００６】
現在では、小児においてＮＴＨｉがどのようにＯＭを引き起こすかということの理解は乏しい。ＯＭの誘導に必要な推定毒性因子の同定は、その宿主−病原体相互作用の理解、最終的には、潜在的なワクチン候補および化学療法の標的の同定に大きく寄与する。中耳炎の管理、好ましくは、その予防により有効かつ容認されたアプローチを開発することは非常に必要とされている。ワクチン開発は、この目的を達成するための非常に有望なかつ費用効果的な方法である（Ｇｉｅｂａｎｋ，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ Ｊ．，１３（１１）：１０６４−８，１９９４：Ｋａｒｍａら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｄｒｉｔｒ．Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌ．，３２（Ｓｕｐｐｌ．）：Ｓ１２７−３４，１９９５）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ＮＴＨｉであるＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株８６−０２８ＮＰのゲノム配列の同定および特徴付け、ならびにこれらによりコードされるポリペプチド配列を提供する。ＮＴＨｉゲノム配列の三倍分析（３−ｆｏｌｄ ａｎａｌｙｓｉｓ）を、配列番号１〜５７６として示される一連のコンティグ配列において設定し、その後のゲノム配列の八倍分析（８−ｆｏｌｄ ａｎａｌｙｓｉｓ）を、配列番号６７５〜６８５として示される一連の１１個のコンティグ配列において設定する。これらのコンティグは、稀なデータであり、当業者は、重複する配列を比較して、慣用的な方法を使用して、ＮＴＨｉ株８６−０２８ＮＰの完全ゲノムを構築することによって、これらのコンティグを組み立て得る。
【０００８】
本発明はまた、本発明のＮＴＨｉポリペプチドに特異的な抗体を提供する。ヒトにおいて、またはサンプル（例えば、血清、精液、耳からの分泌液（ｅａｒ ｆｌｕｉｄ）、血液、尿、リンパ液および脳脊髄液）において、ＮＴＨｉ細菌を検出する方法が、企図される。これらの方法は、ＮＴＨｉポリヌクレオチドを、特異的ポリヌクレオチドプローブで検出する工程、またはＮＴＨｉポリペプチドを特異的抗体で検出する工程を包含する。本発明はまた、ＮＴＨｉ細菌を検出するこれらの方法を利用する診断キットを企図する。
【０００９】
本発明はまた、本発明のＮＴＨｉポリペプチドまたはそのＮＴＨｉペプチドを投与することによって、免疫応答を誘発する方法を企図する。これらの方法は、ＮＴＨｉポリペプチドまたはＮＴＨｉペプチドを、ＮＴＨｉ感染によって引き起こされる疾患（例えば、ＯＭ）の処置および／または予防のためのワクチンとして投与する工程を包含する。以下のＮＴＨｉ遺伝子は、中耳および／または鼻咽頭の感染の間またはその感染に応答してアップレギュレートされ；これらの遺伝子によってコードされるポリペプチドおよびそのペプチドは、あり得るＯＭワクチン候補および／または化学療法の標的として企図される：ｈｉｓＢ、ｌｐｐＢ、ｓａｐＡ、ｌｏｌＡ、ｒｂｓＣ、ｐｕｒＥ、ｒｉｂＢ、ａｒｃＢ、ｕｘｕＡ、ｄｓｂＢ、ｕｒｅＨ、ｌｉｃＣ、ＨＩ１６４７、ｉｓｐＺ、ｒａｄＣ、ｍｕｋＦ、ｇｌｐＲ、ｉｈｆＢ、ａｒｇＲ、ｃｓｐＤ、ＨＩ００９４、ＨＩ１１６３、ＨＩ１０６３、ＨＩ０６６５、ＨＩ１２９２、ＨＩ１０６４。ＮＴＨｉ ｈｉｓＢ遺伝子は、配列番号６１５のヌクレオチド配列として表され、配列番号６１６として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ｓａｐＡ遺伝子は、配列番号６１７のヌクレオチド配列として表され、配列番号６１８として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ｒｂｓＣ遺伝子は、配列番号６１９のヌクレオチド配列として表され、配列番号６２０として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ｐｕｒＥ遺伝子は、配列番号６２１のヌクレオチド配列として表され、配列番号６２２として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ｒｉｂＢ遺伝子は、配列番号６２３のヌクレオチド配列として表され、配列番号６２４として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ａｒｃＢ遺伝子は、配列番号６２５のヌクレオチド配列として表され、配列番号６２６として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ｕｘｕＡ遺伝子は、配列番号６２７のヌクレオチド配列として表され、配列番号６２８として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ｄｓｂＢ遺伝子は、配列番号６２９のヌクレオチド配列として表され、配列番号６３０として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ｕｒｅＨ遺伝子は、配列番号６３１のヌクレオチド配列として表され、配列番号６３２として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ｌｉｃＣ遺伝子は、配列番号６３３のヌクレオチド配列として表され、配列番号６３４として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ＨＩ１６４７遺伝子は、配列番号６３５のヌクレオチド配列として表され、配列番号６３６として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ｉｓｐＺ遺伝子は、配列番号６３７のヌクレオチド配列として表され、配列番号６３８として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ｒａｄＣ遺伝子は、配列番号６３９のヌクレオチド配列として表され、配列番号６４０として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ｍｕｋＦ遺伝子は、配列番号６４１のヌクレオチド配列として表され、配列番号６４２として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ｇｌｐＲ遺伝子は、配列番号６４３のヌクレオチド配列として表され、配列番号６４４として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ｉｈｆＢ遺伝子は、配列番号６４５のヌクレオチド配列として表され、配列番号６４６として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ａｒｇＲ遺伝子は、配列番号６４７のヌクレオチド配列として表され、配列番号６４８として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ｃｓｐＤ遺伝子は、配列番号６４９のヌクレオチド配列として表され、配列番号６５０として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ＨＩ１１６３遺伝子は、配列番号６５１のヌクレオチド配列として表され、配列番号６５２として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ＨＩ１０６３遺伝子は、配列番号６５３のヌクレオチド配列として表され、配列番号６５４として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ＨＩ０６６５遺伝子は、配列番号６５５のヌクレオチド配列として表され、配列番号６５６として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ＨＩ１２９２遺伝子は、配列番号６５７のヌクレオチド配列として表され、配列番号６５８として表されるアミノ酸配列をコードする。
【００１０】
配列番号１〜５７６、配列番号６７５〜６８５として示されるポリヌクレオチド配列ならびに表４および表４Ｂにおいて示されるポリヌクレオチド配列中に含まれる新規なＮＴＨｉ遺伝子はまた、中耳および／または鼻咽頭の感染の間にアップレギュレートされ、従って、ＯＭワクチン候補および／または化学療法の標的をコードすると予測される。さらに、以下のＮＴＨｉ遺伝子は、毒性関連遺伝子であると予測され、従って、あり得るＯＭワクチン候補および／または化学療法の標的をコードすることが予測される：ＨＩ１３８６、ＨＩ１４６２、ＨＩ１３６９、ｌａｖ、ＨＩ１５９８。ＮＴＨｉ ＨＩ１３８６遺伝子配列は、配列番号６５９として表され、配列番号６６０として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ＨＩ１４６２遺伝子配列は、配列番号６６１として表され、配列番号６６２として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ＨＩ１３６９遺伝子配列は、配列番号６６５として表され、配列番号６６６として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ｌａｖ遺伝子配列は、配列番号６６３として表され、配列番号６６４として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ＨＩ１５９８遺伝子配列は、配列番号６６９および配列番号６７１として表され、配列番号６７０および配列番号６７２として表されるアミノ酸配列をコードする。毒性と関連したさらなるＮＴＨｉ遺伝子としては、配列番号６６７および配列番号６７３として示されるポリヌクレオチド配列が挙げられる。
【００１１】
ＮＴＨｉ感染を処置または予防する方法として、本発明は、その感染の間にアップレギュレートまたは活性になるＮＴＨｉポリペプチドの発現または活性を阻害する分子を投与することを企図する。特に、本発明は、ＮＴＨｉ感染を処置または予防する方法を企図し、この方法は、ＮＴＨｉ感染の間にアップレギュレートされるＮＴＨｉ遺伝子に特異的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することによって、ＮＴＨｉタンパク質発現を調節する工程を包含する。このような遺伝子としては、ｈｉｓＢ、ｌｐｐＢ、ｓａｐＡ、ｌｏｌＡ、ｒｂｓＣ、ｐｕｒＥ、ｒｉｂＢ、ａｒｃＢ、ｕｘｕＡ、ｄｓｂＢ、ｕｒｅＨ、ｌｉｃＣ、ＨＩ１６４７、ｉｓｐＺ、ｒａｄＣ、ｍｕ、ｇｌｐＲ、ｉｈｆＢ、ａｒｇＲ、ｃｓｐＤ、ＨＩ００９４、ＨＩ１１６３、ＨＩ１０６３、ＨＩ０６６５、ＨＩ１２９２、ＨＩ１０６４が挙げられる。本発明はまた、ＮＴＨｉ感染を処置または予防する方法を企図し、この方法は、これらの遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を調節する抗体または低分子を投与する工程を包含する。配列番号１〜５７６、配列番号６７５〜６８５として示されるポリヌクレオチド配列ならびに表４および表４Ｂに示されるヌクレオチド配列に含まれる新規なＮＴＨｉ遺伝子もまた、中耳および／または鼻咽頭の感染の間にアップレギュレートされ、従って、これらのポリヌクレオチド配列に特異的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた、企図される。
【００１２】
（本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド）
本発明は、ＮＴＨｉ株８６−０２８ＮＰゲノムの配列を提供する。このゲノム配列は、本明細書中で「コンティグ１〜５７６」として表される一連のコンティグ配列として示される。各コンティグは、その「コンティグ番号」と関連して配列識別番号を割り当てられる。従って、本発明のコンティグは、配列番号１〜５７６として表される。これらのコンティグポリヌクレオチド配列は、慣用的な方法を使用して、ＮＴＨｉ株８６−０２８ＮＰの完全ゲノム配列に組み立てられ得る。ＮＴＨｉ株８２−０２８ＮＰゲノムの八倍配列分析の完了の際に、そのゲノム配列は、配列番号６７５〜６８５として本明細書中で表される１１のコンティグに組み立てられた。
【００１３】
本発明は、ＮＴＨｉポリヌクレオチド配列および配列番号１〜５７６、配列番号６７５〜６８５のコンティグ内に含まれるオープンリーディングフレーム、ならびに表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示されるヌクレオチド配列を提供する。本発明はまた、本発明のＮＴＨｉポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列（例えば、表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示されるアミノ酸配列）を提供する。本発明は、（ａ）配列番号１〜５７６のヌクレオチド配列の相補体；配列番号６７５〜６８５のヌクレオチド配列の相補体および本明細書中の表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示されるヌクレオチド配列の相補対；（ｂ）上記のポリヌクレオチドの対立遺伝子改変体であるポリヌクレオチド；（ｃ）上記のタンパク質のいずれかの種ホモログをコードするポリヌクレオチド；あるいは（ｄ）本発明のＮＴＨｉポリペプチドの特定のドメインまたは短縮を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。
【００１４】
本発明のＮＴＨｉポリヌクレオチドはまた、上記のポリヌクレオチドに実質的に等価なヌクレオチド配列を包含する。本発明に従うポリヌクレオチドは、上記のＮＴＨｉポリヌクレオチドに対して、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より代表的には、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％、およびより代表的には、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。
【００１５】
本発明の核酸配列の範囲内に含まれるのは、配列番号１〜５７６、配列番号６７５〜６８５のＮＴＨｉヌクレオチド配列、ならびに本明細書中の表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列フラグメントであり、これらのフラグメントは、約５ヌクレオチドより大きく、好ましくは７ヌクレオチド、より好ましくは、９ヌクレオチドより大きく、最も好ましくは１７ヌクレオチドより大きい。例えば、選択的な（すなわち、本発明のポリヌクレオチドのいずれか１つに特異的にハイブリダイズする）１５ヌクレオチド以上、１７ヌクレオチド以上、または２０ヌクレオチド以上のフラグメントが、企図される。ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズし得るプローブは、本発明のＮＴＨｉポリヌクレオチド配列を、遺伝子の同じファミリーにおける他のポリヌクレオチド配列から区別することができるか、またはＮＴＨｉ遺伝子を他の細菌遺伝子から区別することができ、より好ましくは、独特のヌクレオチド配列に基づく。
【００１６】
用語「ストリンジェント」とは、当該分野でストリンジェントとして一般に理解されている条件をいうために使用される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、原理的に、温度、イオン強度、および変性剤（例えば、ホルムアミド）の濃度によって決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄のためのストリンジェントなじょう件の例は、６５〜６８℃での０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウムまたは４２℃での０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および５０％ ホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）を参照のこと。よりストリンジェントな条件（例えば、より高温、より低いイオン強度、より高いホルムアミドもしくは他の変性剤）もまた、使用され得るが、ハイブリダイゼーションの速度は影響を受ける。デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが考慮される場合において、さらなる例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、３７℃（１４塩基オリゴについて）、４８℃（１７塩基オリゴについて）、５５℃（２０塩基オリゴについて）および６０℃（２３塩基オリゴについて）での６×ＳＳＣ ０．０５％ リン酸ナトリウム中での洗浄が挙げられる。
【００１７】
他の薬剤は、非特異的ハイブリダイゼーションかつ／またはバックグラウンドハイブリダイゼーションを減少させる目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液中に含まれ得る。例は、０．１％ ウシ血清アルブミン、０．１％ ポリビニル−ピロリドン、０．１％ ピロリン酸ナトリウム、０．１％ ドデシル硫酸ナトリウムＮａＤｏｄＳＯ４（ＳＤＳ）、フィコール、デンハルト溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（または他の非相補的ＤＮＡ）、および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を及ぼすことなく、変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で行われるが、代表的なイオン強度条件では、ハイブリダイゼーションの速度は、ｐＨとはほとんど関係ない。Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｈ．４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。ハイブリダイゼーション条件は、これらの変数を適合させ、異なる配列関連性のＤＮＡにハイブリッドを形成させるために、当業者によって調節され得る。
【００１８】
本発明の範囲内にある配列は、これらの特定の配列に限定されず、それらの対立遺伝子および種改変体もまた包含する。対立遺伝子および種改変体は、配列番号１〜５７６、配列番号６７５〜６８５に示される配列、および本明細書中の表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示されるヌクレオチド配列（好ましくはそれらのオープンリーディングフレーム、それらの代表的なフラグメント）、あるいは配列番号１〜５７６、配列番号６７５〜６８５に示される配列および本明細書中の表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一（好ましくは９５％同一）のヌクレオチド配列を、同種の別の単離体に由来する配列と比較することによって規定どおりに決定され得る。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラムとしては、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１２：３８７、１９８４；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０、１９９０）が挙げられる）が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）および他の供給元（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）から公的に入手可能である。公知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性を決定するために使用され得る。
【００１９】
さらに、コドン可変性に適応するために、本発明は、同じアミノ酸配列をコードする核酸分子を包含し、本明細書中に開示される特定のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）もまた包含する。換言すると、ＯＲＦのコード領域において、あるコドンの、同じアミノ酸をコードする別のコドンへの置換は、明示的に包含される。
【００２０】
本発明の単離されたポリペプチドとしては、以下：
配列番号１〜５７６、配列番号６７５〜６８５として示されるポリヌクレオチド配列に含まれるヌクレオチドならびに表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、あるいは対応する全長タンパク質または成熟タンパク質
を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のポリペプチドとしては、本明細書中の表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示される配列番号６１６、配列番号６１８、配列番号６２０、配列番号６２２、配列番号６２４、配列番号６２６、配列番号６２８、配列番号６３０、配列番号６３２、配列番号６３４、配列番号６３６、配列番号６３８、配列番号６４０、配列番号６４２、配列番号６４４、配列番号６４６、配列番号６４８、配列番号６５０、配列番号６５２、配列番号６５４、配列番号６５６、配列番号６５８、配列番号６６０、配列番号６６２、配列番号６６４、配列番号６６６、配列番号６６８、配列番号６７０、配列番号６７２、配列番号６７４、配列番号６８７、配列番号６８９、配列番号６９１、配列番号６９３、配列番号６９５、配列番号６９７、配列番号６９９、配列番号７０１、配列番号７０３、配列番号７０５、配列番号７０７、配列番号７０９、配列番号７１１、配列番号７１３、配列番号７１５、配列番号７１７、配列番号７１９、配列番号７２１、配列番号７２３、配列番号７２５、配列番号７２７、配列番号７２９、配列番号７３１、配列番号７３３、配列番号７３５、配列番号７３７、配列番号７３９、配列番号７４１、配列番号７４３、配列番号７４５、配列番号７４７、配列番号７４９、配列番号７５１、配列番号７５３、配列番号７５５、配列番号７５７、配列番号７５９、配列番号７６１、配列番号７６３、配列番号７６５、配列番号７６７、配列番号７６９または配列番号７７１のアミノ酸配列が挙げられる。
【００２１】
本発明のポリペプチドはまた、好ましくは以下：
（ａ）配列番号１〜５７６、配列番号６７５〜６８５として示されるヌクレオチド配列ならびに表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示されるヌクレオチド配列に含まれるオープンリーディングフレーム、あるいは
（ｂ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）のポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチド
によってコードされる生物学的活性または免疫学的活性を有するポリペプチドを包含する。
【００２２】
本発明はまた、本発明のアミノ酸配列の生物学的また免疫学的に活性な改変体；ならびに生物学的活性および／または免疫学的活性を保持するそれらの「実質的な等価物」（例えば、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、代表的には、少なくとも約９５％、９６％、９７％、より代表的には、少なくとも約９８％、または最も代表的には、少なくとも約９９％アミノ酸同一性を有するもの）を提供する。対立遺伝子改変体によってコードされるポリペプチドは、配列番号１〜５７６、配列番号６７５〜６８５に示されるヌクレオチド配列ならびに本明細書中で表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示されるヌクレオチド配列に含まれるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、および本明細書中で表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較して、類似の、増加した活性もしくは減少した活性を有し得る。
【００２３】
ＮＴＨｉペプチドとは、配列番号１〜５７６、配列番号６７５〜６８５に示されるヌクレオチド配列あるいは本明細書中で表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＮＴＨｉポリペプチドのフラグメント、および本明細書中で表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメントをいう。好ましいＮＴＨｉペプチドは、生物学的および／または免疫学的に活性である。
【００２４】
本発明はさらに、本発明のＮＴＨｉ核酸フラグメントまたは本発明の核酸フラグメントの縮重改変体によってコードされる、単離されたＮＴＨｉポリペプチドまたはＮＴＨｉペプチドを提供する。用語「変性改変体」とは、ヌクレオチド配列により本発明の核酸フラグメント（例えば、ＯＲＦ）とは異なるが、遺伝暗号の縮重に依存してＮＴＨｉポリペプチド配列をコードするヌクレオチドフラグメントをいう。本発明の好ましい核酸フラグメントは、タンパク質をコードするＯＲＦである。
【００２５】
本発明はまた、ＮＴＨｉポリペプチドを提供し、このＮＴＨｉポリペプチドは、そのポリペプチドの生物学的活性および／または免疫学的活性に影響を及ぼさない１以上の保存的アミノ酸置換を有する。あるいは、本発明のＮＴＨｉポリペプチドは、保存的アミノ酸置換を有することを包含し、この保存的アミノ酸置換は生物学的活性を変化させても変化させなくてもよい。用語「保存的アミノ酸置換」とは、その置換位置においてアミノ酸の極性または電荷にほとんど影響を及ぼさないかもしくは全く影響を及ぼさないように、ネイティブでない残基（天然のアミノ酸および非天然のアミノ酸が挙げられる）を有する天然のアミノ酸残基の置換をいう。例えば、保存的置換は、ポリペプチド中の無極性残基の、任意の他の無極性残基との交換から生じる。さらに、ポリペプチド中の任意のネイティブな残基もまた、「アラニンスキャニング変異誘発」の方法に従って、アラニンに置換され得る。天然のアミノ酸は、以下：
塩基性：アルギニン、リジン、ヒスチジン；
酸性：グルタミン酸、アルパラギン酸；
無電荷で極性：グルタミン、アスパラギン、セリン、スレオニン、チロシン；および
無極性：フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、グリシン、アラニン、バリン、プロリン、メチオニン、ロイシン、ノルロイシン、イソロイシン
のように、それらの側鎖に基づいて特徴付けられる。アミノ酸置換についての一般的な規定は、以下の表１に記載されている。
【００２６】
【表１】
ＮＴＨｉポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して相補的なアンチセンスポリヌクレオチドもまた、提供される。
【００２７】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドが、増幅または発現のためにベクターに挿入され得ることを包含する。発現のために、ポリヌクレオチドは、必要に応じて、適切な発現制御配列（例えば、プロモーター配列およびポリアデニル化シグナル配列）に連結される。本発明のポリヌクレオチドを含む細胞が、さらに提供される。例示的な真菌宿主としては、Ｅ．Ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａおよびＳｅｒｒａｔｉａのような細菌が挙げられる。
【００２８】
用語「単離された」とは、それが天然に存在する環境から取り出され、かつそれが天然に存在する環境の他の成分を実質的に含まない実体をいう。例えば、ポリペプチドは、他の細胞タンパク質から分離されるか、またはＤＮＡは、それが天然に生じるゲノムにおいてそれに隣接する他のＤＮＡから分離される。
【００２９】
（抗体および免疫応答を誘発するための方法）
本発明は、ＮＴＨｉポリペプチドに特有の（すなわち、ＮＴＨｉポリペプチドに特異的な）抗原性エピトープに結合する抗体を提供する。また、複数のＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅサブタイプ間で共通だが、任意の他の抗原性エピトープに関して特有である抗原性エピトープに結合する抗体が提供される。その抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、それらの特有のエピトープに結合する能力を保持する抗体フラグメント（例えば、Ｆｖフラグメント、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ）２フラグメント）、一本鎖抗体およびヒト抗体もしくはヒト化抗体であり得る。抗体は、当該分野で標準的な技術によって生成され得る。
【００３０】
当該分野において、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの莢膜多糖類に対する抗体が、インビトロアッセイで細菌を殺す能力を示すことが公知である。これらの抗体はまた、動物モデル系において、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅを用いるチャレンジから保護することが公知である。これらの研究は、莢膜多糖類に対する抗体がヒトにおいて防御免疫反応を誘導する可能性を有することを示す。本発明は、本発明のＮＴＨｉポリペプチドおよびそれらのフラグメントに特異的な抗体を提供し、それは、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ細菌を殺す活性およびヒトをＮＴＨｉ感染から守る活性の両方を示す。本発明はまた、本発明のＮＴＨｉポリペプチドに特異的な抗体を提供し、それは、毒性を減少し、付着を阻害し、細胞分裂を阻害し、そして／あるいはＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ細菌の上皮への侵入を阻害するかまたはＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ細菌の食作用を促進する。
【００３１】
インビトロ補体媒介性殺菌アッセイシステム（Ｍｕｓｈｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３９：２９７−３０４、１９８３；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５１：３１−３８、１９７２）が、抗ＮＴＨｉ抗体の殺菌活性を測定するために使用され得る。ＮＴＨｉポリペプチドおよびＮＴＨｉペプチドの防御抗体反応を誘導する活性におけるさらなるデータは、本明細書中に記載されるチンチラモデル系のような感染の動物モデルを使用することによって、生成され得る。
【００３２】
ＮＴＨｉのエピトープに対して予備形成された抗体（例えば、ＮＴＨｉ、ＯＭＰ、ＬＯＳまたは非被膜タンパク質に対する抗体）の投与を介する受動免疫治療によって宿主に短期間の防御を与えることもまた、可能である。従って、意図されたワクチン処方物が、受動免疫治療で使用するための抗体を産生するために使用され得る。ヒト免疫グロブリンがヒト医薬では好ましい。なぜなら、異種免疫グロブリンは、その外来の免疫原成分に対して免疫応答を誘発し得るからである。そのような受動免疫付与は、特別な危険性に曝された非免疫性の個体の即時的保護のための緊急性を根拠に使用され得る。あるいは、これらの抗体は、抗イディオタイプ抗体の産生に使用され得、それは次にＮＴＨｉエピトープに対する免疫応答を刺激するための抗体として使用され得る。
【００３３】
本発明は、個体においてＮＴＨｉに対する免疫応答を誘導する方法を包含する。これらの方法は、ＮＹＨｉ細菌を殺す免疫応答、および細胞へのＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ付着をブロックする免疫応答を包含する。１つの実施形態において、その方法は、本発明のＮＴＨｉタンパク質またはＮＴＨｉペプチドを含む組成物の免疫原性用量を投与する工程を包含する。別の実施形態において、その方法は、本発明のＮＴＨｉタンパク質またはＮＴＨｉペプチドを発現する細胞を含む組成物の免疫原性用量を投与する工程を包含する。なお別の実施形態において、その方法は、本発明のＮＴＨｉタンパク質またはＮＴＨｉペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物の免疫原性用量を投与する工程を包含する。そのポリヌクレオチドは、任意の他の核酸とは無関係の裸の（ｎａｋｅｄ）ポリヌクレオチドであっても、プラスミドまたはウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルスベクターまたはアデノウイルスベクター）のようなベクター中に存在していてもよい。組成物の投与は、当該分野で標準的な経路（例えば、非経口、静脈内、経口、口腔、鼻、肺、直腸、または膣）によってであり得る。その方法は、単一の個体において組み合わせて使用され得る。その方法は、個体のＮＴＨｉ感染前または感染後に使用され得る。
【００３４】
「免疫学的用量」は、上記個体をＮＴＨｉ感染（特に、中耳および／または鼻咽頭もしくは下気道のＮＴＨｉ感染）から守るために抗体免疫応答および／またはＴ細胞免疫応答を発生させるのに十分な用量である。そのような免疫学的応答が細菌複製を遅延させる方法もまた、提供される。本発明のさらなる局面は、免疫学的組成物に関し、それは、個体に取り込まれた場合に免疫学的応答を誘導し得るかまたは誘導する。その免疫学的応答は、治療的または予防的に使用され得、そしてＣＴＬまたはＣＤ４＋ Ｔ細胞から生じるような抗体免疫または細胞免疫の形態を取り得る。ＮＴＨｉタンパク質またはその抗原性ペプチドは、補タンパク質と融合され得、その補タンパク質は、それ自体抗体を産生し得ないが、第１のタンパク質を安定化し得、そして免疫原性特性および保護特性を有する融合タンパク質を生成し得る。従って、融合組換えタンパク質は、好ましくは、免疫原性の補タンパク質（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはβ−ガラクトシダーゼ、タンパク質を可溶化させその生成および精製を促進する比較的大きな補タンパク質）をさらに含む。さらに、補タンパク質は、免疫系の一般的な刺激を提供するという意味でアジュバントとして作用し得る。補タンパク質は、第１のタンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに結合し得る。本発明のポリヌクレオチドまたはその免疫原性ペプチドによってコードされるＮＴＨｉポリペプチドを含む組成物（特にワクチン組成物）、および方法が、本発明によって提供される。
【００３５】
本発明は、それに対応して、ＮＴＨｉ感染に対する免疫応答を誘導するのに適切な組成物を提供し、ここで、誘導される抗体は、宿主細胞へのＮＴＨｉ細菌の結合をブロックする。その組成物は、本発明のＮＴＨｉタンパク質もしくはＮＴＨｉペプチド、ＮＴＨｉポリペプチドを発現する細胞、またはそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。その組成物はまた、キャリアおよびアジュバントのような他の成分を含み得る。
【００３６】
中耳および／または鼻咽頭のＮＴＨｉ感染においてアップレギュレートされる遺伝子、ならびにＮＴＨｉ毒性に関連する遺伝子が、本明細書中に記載される。これらのＮＴＨｉ遺伝子によってコードされるそれらのポリペプチドおよびペプチドは、ＯＭのようなＮＴＨｉ感染に関連する障害を処置または予防するために免疫応答を誘導するのに有用であることが意図される。これらの遺伝子によってコードされるポリペプチドのいくつかとしては、以下が挙げられる：ヒスチジン生合成タンパク質、リポタンパク質Ｂ、ペプチドＡＢＣトランスポーター、ペリプラスムＳａｐＡ前駆体、外膜リポタンパク質キャリアタンパク質前駆体、リボース輸送系パーミアーゼタンパク質、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼ触媒性サブユニット、ＰｕｒＥ、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼ触媒性サブユニット、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ、マンノネートデヒドラターゼ、ジスルフィドオキシドレダクターゼ、ウレアーゼ補タンパク質、ホスホコリンシチジリルトランスフェラーゼ、推定ピリドキシン生合成タンパク質、一重項酸素耐性タンパク質、細胞内隔壁タンパク質（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｅｐｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＤＮＡ修復タンパク質、ＭｕｋＦタンパク質、グリセロール−３−ホスフェートレギュロンリプレッサー、融合宿主因子βサブユニット、アルギニンリプレッサー、低温ショック様タンパク質、ストレス反応タンパク質、ＬｉｃＡ、ＭｕｋＦ、ＲａｄＡおよびＨＩ００９４、ＨＩ１１６３、ＨＩ０６６５、ＨＩ１２９２、ＨＩ１０６４、ＨＩ１８６、ＨＩ０３５２遺伝子によってコードされるそれらの仮想タンパク質。ＮＴＨｉ ＯＭＰ、ＬＯＳおよび非被膜タンパク質もまた、ＮＴＨｉ感染に関連する障害の予防および処置のための免疫応答を誘導すると意図される。
【００３７】
本発明の組成物の「免疫原性用量」は、投与前に検出可能な免疫応答と比較してか、または投与前の標準的な免疫応答と比較して、投与後に、検出可能な体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を生じる用量である。本発明は、方法から生じる免疫応答が、予防的および／または治療的であり得ることを意図する。
【００３８】
本発明は、個体において宿主細胞に対するＮＴＨｉ細菌の結合をブロックする方法を包含する。その方法は、ＮＴＨｉ細胞の付着の結合をブロックする本発明の抗体またはポリペプチドを投与する工程を包含する。あるいは、ＮＴＨｉ細胞付着の結合をブロックする１以上の低分子の投与が意図される。インビトロアッセイは、本発明の抗体、ポリペプチドまたは低分子がＮＴＨｉ細胞付着をブロックする能力を示すために使用され得る。
【００３９】
ＮＴＨｉ細胞の付着をブロックする本発明の抗体、本発明のポリペプチドおよび／または本発明の低分子を含む薬学的組成物が提供される。その薬学的組成物は、上記の活性成分のうちの１つ単独からなっても、上記の活性成分の組み合わせを含んでも、細菌感染を処置するために使用されるさらなる活性成分を含んでもよい。その薬学的組成物は、薬学的に有効なキャリアのような１以上のさらなる成分を含み得る。薬学的組成物の投与の投薬量および頻度は、標準的な技術によって決定され、例えば、個体の体重および年齢、投与経路、ならびに症状の重篤度に依存する。薬学的組成物の投与は、当該分野で標準的な経路（例えば、非経口、静脈内、経口、口腔、鼻、肺、直腸、または膣）によってであり得る。
【００４０】
個体におけるＮＴＨｉ感染を検出するための方法もまた、提供される。１つの実施形態において、これらの方法は、サンプル中の本発明のＮＴＨｉポリヌクレオチドに特異的に結合するプライマーまたはプローブを使用して、そのポリヌクレオチドを検出する工程を包含する。そのポリヌクレオチドの検出は、例えば、ハイブリダイゼーションおよびＰＣＲに関連する当該分野での多くの技術的慣用法によって達成され得る。
【００４１】
本発明の抗体はまた、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの感染が疑われる個体の種々の体液中でＮＴＨｉ抗原（ＮＴＨｉポリペプチドおよびそのペプチド）を検出するための診断アッセイにおける用途のための試薬を提供するのに使用され得る。別の実施形態において、本発明のＮＴＨｉタンパク質およびＮＴＨｉペプチドは、種々の患者の組織および体液中でのＮＴＨｉの検出のためのイムノアッセイにおける抗原として使用され得る。これらの組織および流体としては、血液、血漿、耳滲出液（ｅａｒ ｆｌｕｉｄ）、脊髄液、唾、尿、リンパ液、および脳髄液が挙げられるが、これらの限定されない。本発明の抗原は、当該分野で公知のイムノアッセイのいずれかにおいて使用され得る。これらのイムノアッセイとしては、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ、サンドウィッチアッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、発光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイおよび免疫電気泳動アッセイが挙げられるが、これらの限定されない。
【００４２】
（ワクチン化学療法標的）
本発明の１つの局面は、個体（特に哺乳類）における免疫応答を誘導するための方法に関連し、この方法は、ＮＴＨｉ抗原タンパク質またはそれらの抗原性ペプチドをその個体に接種する工程を包含する。
【００４３】
本発明はまた、本発明の免疫原性組換えＮＴＨｉタンパク質またはＮＴＨｉペプチドを適切なキャリアとともに含むワクチン処方物を提供する。ワクチン候補および／または化学療法の標的として企図される、ＮＴＨｉポリペプチドおよびそれらのペプチドとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ヒスチジン生合成タンパク質、リポタンパク質Ｂ、ペプチドＡＢＣトランスポータ、ペリプラズムＳａｐＡ前駆体、外膜リポタンパク質キャリアタンパク質前駆体、リボース輸送系透過酵素タンパク質、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシレース触媒サブユニット、ＰｕｒＥ、３，４−ジヒドロキシ（ｈｙｄｒｏｘｔ）−２−ブトン４−ホスフェートシンターゼ、オミニチンカルバモリルトランスフェラーゼ、マンノエートデヒドラターゼ、ジスルフィドオキヒドレダクターゼ、ウレーゼ、オミチンカルバモリルトランスフェラーゼ（ｏｍｉｔｈｉｎｅ ｃａｒｂａｍｏｌｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、マンノネートデヒドラターゼ（ｍａｎｎｏｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）、ジスフィドオキシドレダクターゼ（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、ウレアーゼ修飾タンパク質（ｕｒｅａｓｅ ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ホスホコリンシチジリトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｓｈｏｃｈｏｌｉｎｅ ｃｙｔｉｄｙｌｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、推定ピリドキシン生合成タンパク質、一重項酸素耐性タンパク質（ｓｉｎｇｌｅｔ ｏｘｙｇｅｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、細胞内隔膜タンパク質（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｅｐｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＤＮＡ修復タンパク質、ＭＵＫＦタンパク質、グリセロール−３−ホスフェートレギュロンリプレッサー、組込み宿主因子βサブユニット、アルギニンリプレッサー、冷ショック様タンパク質、ストレス応答性タンパク質、ＬｉｃＡ、ＲａｄＡ、ならびにＨＩ００９４遺伝子、ＨＩ１１６３遺伝子、ＨＩ０６６５遺伝子、ＨＩ１２９２遺伝子、ＨＩ１０６４遺伝子、ＨＩ１３８６遺伝子、ＨＩ０３５２遺伝子によってコードされるそれらの推定タンパク質、ＮＴＨｉＯＭＰ、ＮＴＨｉ ＬＯＳおよびＮＴＨｉ非カプセル状タンパク質および配列番号１〜５７６、配列番号６７５〜６８５に示されるヌクレオチド配列、ならびに本明細書中の表３Ｂ、表４および表５に示されるヌクレオチド配列において存在するその新規ＮＴＨｉポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド、ならびに本明細書中の表３Ｂ、表４Ｂ、および表５に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【００４４】
このタンパク質は、胃の中で分解され得るので、好ましくは、このタンパク質は、非経口的に投与され、この投与としては、例えば、皮下、筋肉内、静脈内、皮内である投与が挙げられる。非経口投与にとって適切な処方物としては、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、およびその個体の体液、好ましくは血液と等張である処方物を与える溶質を含み得る、水溶性および非水溶性の滅菌注入溶液；ならびに懸濁剤または濃化剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁物が挙げられる。これらの処方物は、単位用量の容器または複数回用量の容器中に提供され得る。これらの容器としては、例えば、密閉したアンプルおよびバイアルである。そして、これらの処方物は、使用直前に、滅菌液体キャリアの添加のみが必要とされる凍結乾燥条件で貯蔵され得る。このワクチン処方物はまた、その処方物の免疫原性を増強するためのアジュバント系（例えば、水中油系および当該分野で公知の系）を包含し得る。この投与は、そのワクチンの比活性に依存し、そして、慣用的な実験によって容易に決定されされ得る。
【００４５】
（Ａ．ペプチドワクチン）
ペプチド治療剤（例えば、ペプチドワクチン）は、当該分野において周知であり、薬学分野において使用が増加している。このようなペプチド化合物の非経口投与の一貫した欠点は、破壊または変性が速いことである。注入ポンプあんらびびワックスまたはオイル移植物は、ペプチド様治療剤の存在を長引かせることおよびこのような薬剤の完全性を保存することの両方のために、治療剤の長期投与のために使用されている。さらに、ペプチド様薬剤は、（ペプチド様薬剤の各エピトープに対する特定の参照とともに）長期間、天然の状態の構成を理想的に維持し、さらに、チャレンジされた動物または免疫されたヒトにおいて免疫原性応答を誘発するために適した様式で提示されるべきである。
【００４６】
本発明のＮＴＨｉ抗原性ペプチドは、多くの従来の方法で調製され得る。短いペプチド配列は、標準的な手段を使用する化学合成によって調製され得る。固相技術（例えば、Ｅｒｉｋｓｏｎら、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９７６）ｖ．２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ２５５を参照のこと）が特に簡便である。自動固相合成機は、市販される。さらに、配列の改変は、適切な残基の置換、付加または省略によって容易になされる。例えば、システイン残基は、カルボキシ末端に付加されて、キャリアタンパク質への簡便な連結のためのスルフヒドリル基を提供し得るか、またはスペーサー要素（例えば、追加のグリシン残基）が、Ｃ末端の連結アミノ酸とペプチドの残りとの間の配列内に組み込まれ得る。短いＮＴＨｉペプチドはまた、組換え技術によって産生され得る。この長さのペプチドについてのコード配列は、化学技術（例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．，１０３：３１８５（１９８１）に記載されるホスホトリエステル法）によって容易に合成され得る。
【００４７】
本明細書中で企図されるＮＴＨｉペプチド配列のうちのいくつかは、免疫原性であるには小さすぎると考えられ得、これらは、それらにこの特質を与えるためにキャリア物質に連結され得る。当該分野で公知のこのような連結を作製するための任意の方法が使用され得る。連結は、一方の官能基末端にジスルフィド連結を生成し、そして他方のペプチド連結を生じるヘテロ二官能性剤（例えば、ジスルフィドアミド形成剤（例えば、Ｎ−スクシジミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロプリオネート（ＳＰＤＰ）（例えば、Ｊａｎｓｅｎら、，Ｉｍｍｕｎ．Ｒｅｖ．６２：１８５，１９８２を参照のこと）））およびジスルフィド連結以外のチオエーテルを形成する二官能性連結剤（例えば、６−マレイミドカプロン酸、２−ブロモ酢酸、２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸など）、ならびにカルボキシル基をスクシンイミドまたは１−ヒドロキシ−２−ニトロ−４−スルホン酸（スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）のようなナトリウム塩に対して）と組み合わせることによってカルボキシル基を活性化するカップリング剤を用いて形成され得る。
【００４８】
（Ｂ．ワクチン組成物および投与）
プライミング用量の免疫原（これは、免疫原への一回以上のブースター曝露が続く）は、有効ワクチンであることが必要であり得る（Ｋｒａｍｐら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，２５：７７１−７７３，１９７９；Ｄａｖｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１４：３４１−８ １９８６ １９８７）。同時投与される場合、免疫応答を有利に増強し得るタンパク質またはポリペプチドの例としては、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、Ｉｌ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ）、サイトカイン誘導分子（例えば、Ｌｅａｆ）または同時刺激分子が挙げられる。ヘルパー（ＨＴＬ）エピトープは、細胞内標的化シグナルに連結され得、ＣＴＬエピトープから別々に発現され得る。これにより、ＣＴＬエピトープとは異なる細胞区画へのＨＴＬエピトープの指向が可能になる。必要な場合、これは、ＨＴＬエピトープのＭＨＣクラスＩＩ経路へのより効率的な進入を容易にし得、それによって、ＶＴＬ誘導を改善する。ＣＴＬ誘導と対照的に、免疫抑制分子（例えば、ＴＧＦ−β）の同時発現による免疫応答を特異的に減少することは、特定の疾患において有利であり得る。
【００４９】
理想的には、免疫原は、２つ特性を示す；対応する抗体の形成を刺激する能力、およびこれらの抗体と特異的に反応する傾向。免疫原は、抗体の部位を組み合わせることによって認識可能な免疫原の最も小さな部分である１つ以上のエピトープを有する。特定の場合において、免疫原、免疫原の画分または免疫原が提示される条件は、促進するには不適切であり、不十分な免疫を生じる。これは、しばしば、免疫原として使用されるペプチドまたは他の低分子の場合である。他の物質（例えば、免疫調節剤（例えば、インターロイキンのようなサイトカイン）は、同様にワクチンにおいて組み合わされ得る。
【００５０】
上記のワクチンの分野は、免疫原と組み合わせて使用した場合に免疫応答を増強する特定の物質（アジュバントと呼ばれる）の使用を認識する。アジュバントは、そのアジュバントを使用することなく惹起されるよりも速いかまたは大きい免疫応答を惹起するために、さらに使用される。さらに、アジュバントは、アジュバントを含まずに必要とされるよりも少ない免疫原を使用して免疫学的応答を生成するため、免疫学的防御を与える特定の抗体物質の生成を増加するため、またはその免疫応答（例えば、体液性免疫応答、細胞性免疫応答）の成分を増強するために、使用され得る。公知のアジュバントとしては、エマルジョン（例えば、フロイントアジュバントおよび他のエマルジョン）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、ＭＦ５９、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ由来の精製サポニン（ＱＳ２１）、アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、およびミョウバン）、リン酸カルシウム（および他の金属塩）、ゲル（例えば、水酸化アルミニウム塩）、マイコバクテリア生成物（ムラミルジペプチドを含む）、固体物質、粒子（例えば、リポソームおよびビロソーム）が挙げられる。アジュバントとして使用されることが公知である天然生成物および細菌生成物の例としては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ＲＣ−５９（合成ＭＰＬ様アシル化単糖）、ＯＭ−１７４（これは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のリピドＡ誘導体である）、ホロ毒素（例えば、コレラ毒素（ＣＴ）もしくはその誘導体のうちの１つ、破傷風毒素（ＰＴ）、およびＥ．ｃｏｌｉの易熱性毒素（ＬＴ）、もしくはその誘導体のうちの１つ）、ならびにＣｐＧオリゴヌクレオチドが挙げられる。アジュバント活性は、多数の要因（例えば、キャリア効果、デポー（ｄｅｐｏｔ）形成、変化したリンパ球動員、Ｔリンパ球の刺激、Ｂリンパ球の直接刺激、およびマクロファージの刺激）によって影響を受け得る。
【００５１】
ワクチンは、代表的には、注射可能な物質として、液体溶液または液体懸濁液のいずれかとして、調製される。注射前に液体中の溶液または懸濁液のために適切な固体形態もまた、調製され得る。その調製物はまた、乳濁され得る。その活性な免疫原性成分は、しばしば、賦形剤（これは、薬学的に受容可能であり、そしてその活性成分と適合性である）と混合される。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。さらに、望ましい場合、そのワクチンは、少量の補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはアジュバント（これは、そのワクチンの有効性を増強する）を含み得る。このワクチンは、注射（例えば、皮下注射または筋肉内注射のいずれか）によって、従来のように非経口投与される。他の投与様式のために適切なさらなる処方物としては、坐剤が挙げられ、時には、経口処方物が挙げられる。坐剤について、従来の結合剤およびキャリアとしては、例えば、ポリアルカレングリコールまたはトリグリセリドが挙げられ得る。そのような坐剤は、０．５％〜１０％、好ましくは１〜２％の範囲で上記活性成分を含む混合物から形成され得る。経口処方物は、通常使用される賦形剤（例えば、薬剤グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなど）を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁物、錠剤、ピル剤、カプセル剤、徐放処方物または散剤の形態を採り得、１０％〜９５％（好ましくは２５〜７０％）の活性成分を含む。
【００５２】
ワクチンはまた、ジェット注射器、微小針、エレクトロポレーション、ソノポレーション、微小カプセル化、ポリマーまたはリポソームを使用して経皮経路を介して、噴霧器、エアロゾル、および鼻スプレーを使用して経粘膜経路および鼻腔内経路を介して、投与され得る。天然ポリマーまたは合成ポリマー（例えば、デンプン、アルギネート、およびキトサン、Ｄ−ポリＬ−ラクテート（ＰＬＡ）、Ｄ−ポリＤＬ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸ミクロスフェア、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、およびポリホスファゼン、ポリホスファタザン）を使用するマイクロカプセル化が、経皮投与および経粘膜投与の両方のために有用である。合成ポリ−オルニテート、ポリ−リジン、およびポリ−アルギニンまたは両親媒性ペプチドを含む、ポリマー性複合体は、経皮送達系のために有用である。さらに、それらの両親媒性の性質に起因して、リポソームは、経皮ワクチン送達系、経粘膜ワクチン送達系、および鼻腔内ワクチン送達系のために企図される。ワクチン送達のために使用される一般的脂質としては、Ｎ−（１）２，３−（ジオレイル−ジヒドロキシプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム−メチルスルフェート（ＤＯＴＡＰ）、ジオレイルオキシ−プロピル−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、および９Ｎ（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイルコレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）が、挙げられる。ヘルパー脂質とリポソームとの組み合わせは、皮膚を通してのそのリポソームの取り込みを増強する。これらのヘルパー脂質としては、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）が挙げられる。さらに、トリテルペノイドグリコシドまたはチリセッケンボク（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）由来のサポニンは、鼻腔内ワクチン送達および経粘膜ワクチン送達のための有用なアジュバントとして企図されている。
【００５３】
タンパク質は、中性形態または塩形態としてワクチンに処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基と共に形成される）が挙げられ、これは、例えば、塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸のような有機酸と共に形成される。遊離のカルボキシ基と共に形成される塩はまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第２鉄のような無機塩、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、およびプロカインのような有機塩に由来し得る。
【００５４】
ワクチンは、投薬処方物に適合する様式、そして治療的に有効かつ免疫原性な量で投与される。投与される量は、処置される被験体、被験体の免疫系が抗体を合成する能力、および所望される防御の程度に依存する。投与するのに必要な活性成分の正確な量は、開業医の判断に依存し、各個体で特有である。しかし、適切な投薬量範囲は、１個体当たり数百マイクログラムの活性成分のオーダーである。初回投与およびブースター投与のための適切なレジメンもまた可変性であるが、初回投与後１〜３ヶ月の間隔に次いでその後の注射もしくは他の投与に代表される。
【００５５】
本明細書中に記載されるようにワクチン組成物で免疫化する際に、宿主の免疫系は、所望の抗原に特異的な大量のＣＴＬを産生することによってワクチンに応答し、そしてその宿主は、少なくとも部分的に免疫化されて感染を遅らせるかまたは発生している慢性的感染に耐性を示す。本発明のＮＴＨｉポリペプチドまたはＮＴＨｉペプチドを含むワクチン組成物は、細菌感染に感受性であるかもしくはそれ以外では細菌感染の危険性を有する患者に投与されて、その抗原に対する免疫応答を誘発する。従って、患者自身の免疫応答能が増強される。そのような量は、「免疫原性的に有効な用量」として規定される。この使用において、正確な量は、この場合もまた、患者の健康状態および年齢、投与形式、処方物の性質などに依存するが、一般的には、７０ｋｇの患者１人当たり約１．０μｇ〜約５０００、より一般には７０ｋｇの体重当たり約１０〜５００ｍｇである。治療目的または免疫目的のために、本発明のＮＴＨｉポリペプチドまたはＮＴＨｉペプチドはまた、弱毒化したウイルス宿主（例えば、ワクチンまたは鶏痘）によって発現され得る。このアプローチは、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するためのベクターとして、ワクチンウイルスの使用を含む。急性的にかもしくは慢性的に感染した宿主への導入、または非感染宿主への導入の際、組換えワクチンウイルスは、免疫原性ペプチドを発現し、それによって、宿主ＣＴＬ応答を促進する。
【００５６】
体液性免疫応答は、多くの周知の方法（例えば、単一放射状免疫拡散アッセイ（ＳＲＩＤ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、および赤血球凝集阻害アッセイ（ＨＡＩ）によって測定され得る。詳細には、ＳＲＩＤは、試験される免疫原を含むゲル（例えば、アガロース）の層を利用する。ウェルが、そのゲル中に切除され、試験される血清が、そのウェル中に配置される。そのゲルの外から中への抗体の拡散は、沈殿環の形成をもたらす。その沈殿環の領域は、試験される血清中の抗体濃度に比例する。ＥＩＡ（ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノアッセイとしても公知）は、サンプル中の全抗体を決定するために使用される。その免疫原は、マイクロタイタープレートの表面に吸着される。その試験血清は、そのプレートに暴露され、その後、酵素結合した免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）に暴露される。そのプレートに付着する酵素活性は、従来の任意の手段（例えば、分光光度法）によって定量され、その活性は、その試験サンプル中に存在する免疫原に対する抗体の濃度に比例する。ＨＡＩは、免疫原（例えば、ウイルスタンパク質）がニワトリ赤血球（など）を凝集する能力を利用する。このアッセイは、中和抗体（すなわち、赤血球凝集を阻害可能な抗体）を検出する。その試験血清の希釈物が、標準濃度の免疫原とともにインキュベートされ、その後、上記赤血球が添加される。中和抗体の存在は、その免疫原による赤血球の凝集を阻害する。細胞性免疫応答を測定するための試験としては、遅延型過敏症の決定または標的免疫原に対するリンパ球の増殖応答の測定が挙げられる。
【００５７】
（分類不能型インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（ＮＴＨｉ））
Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅは、小さい非運動性のグラム陰性細菌である。他のＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株とは異なり、分類不能型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨｉ）下部は、多糖莢膜を欠き、時には、「非カプセル型」と示される」ＮＴＨｉ株は、カプセル型株とは遺伝的に別個であり、ｂ型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ単離株よりも異種である。ＮＴＨｉは、ヒト宿主に対して複雑した抗原群を提示する。防御を惹起し得る可能な抗原としては、ＯＭＰ、リポ多糖、リポタンパク質、接着タンパク質、および非莢膜タンパク質が挙げられる。
【００５８】
ヒトは、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのための唯一の宿主である。ＮＴＨｉ株は、呼吸管上部（鼻咽頭および口腔咽頭部後部を含む）、呼吸管下部および女性生殖管に一般的に存在する。ＮＴＨｉは、ヒトにおいて広範なスペクトルの疾患を引き起こす。その疾患としては、中耳炎、肺炎、静脈洞炎、敗血症、心内膜炎、喉頭蓋炎、化膿性関節炎、髄膜炎、分娩後感染症および新生児感染症、分娩後敗血症および新生児敗血症、急性卵管炎および慢性卵管炎、喉頭蓋炎、心膜炎、蜂巣炎、骨髄炎、心内膜炎、胆嚢炎、腹内感染、泌尿器管感染、乳様突起炎、大動脈移植片感染、結膜炎、ブラジル紫斑熱、潜在性菌血症、ならびに基礎となる肺疾患（例えば、慢性肺炎、気管支炎、および嚢胞性線維症）の憎悪が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
ＮＴＨｉの疫学的研究は、この株が、外膜タンパク質プロフィール（Ｂａｒｅｎｋａｍｐら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３６：５３５〜４０，１９８２）、酵素アロタイプ（Ｍｕｓｓｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５２：１８３〜１９１，１９８６）および他の一般的に使用される疫学的ツールに関して、不均質であることを示した。ＮＴＨｉをサブタイプに分けるいくつかの試みが存在したが、それらの方法論はいずれも、完全には満足のいくものではなかった。ＮＴＨｉの外膜タンパク質の組成は、約２０種のタンパク質からなる。すべてのＮＴＨｉ株は、２種の共通するＯＭＰを含み、これらは、分子量が３０，０００ダルトンおよび１６，６００ダルトンである。ＮＴＨｉ株は、３２，０００〜４２，０００ダルトンの範囲内にある２種のＯＭＰに基づいてサブタイプ分けされ得る。そのＮＴＨｉリポ多糖プロフィールは、腸内グラム陰性細菌とは基本的に異なり、２０，０００ダルトン未満の範囲の１〜４つの別個のバンドへと分かれる。
【００６０】
プロトタイプＮＴＨｉ単離株は、慢性中耳炎に罹患していた子供から回収された、低継代単離株８６−０２８ＮＰである。この株は、インビトロで（Ｂａｋａｌｅｔｚら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５３：３３１〜５，１９８８；Ｈｏｌｍｅｓら、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．２３：１５７〜６６，１９９７）ならびにチンチラＯＭモデル（本明細書中に記載される）（Ｂａｋａｌｅｔｚら、Ｖａｃｃｉｎｅ １５：９５５〜６１，１９９７；Ｓｕｚｕｋｉら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６２：１７１０〜８，１９９４；ＤｅＭａｒｉａら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４：５１８７〜９２，１９９６）で、充分に特徴付けられている。この８６−０２８ＮＰ株は、本明細書中に記載されるように、チンチラ中耳炎モデルにおいて発現がアップレギュレートされる遺伝子を同定するため、およびそのチンチラの中耳におけるＮＴＨｉの生存のために必要な遺伝子を同定するために、使用された。
【００６１】
（ＤＦＩ戦略）
差次的蛍光誘導（ＤＦＩ）戦略が、本明細書中において、チンチラ動物モデルにおいてＯＭの間に誘導されるＮＴＨｉ遺伝子を同定するために使用された。いくつかの方法が、感染の間の生物の毒性に寄与する細菌遺伝子を同定するために開発されている。そのような方法としては、細菌プロモーターが、宿主における生存のために必要な必須栄養素の合成のために必要とされる遺伝子の発現を調節する、インビボ発現方法（ＩＶＥＴ）；変異した場合に微生物のビルレンス特性を変化させる遺伝子のタグ特異的同定を可能にする、サイン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）タグ化変異誘発（ＳＴＭ）；転写的に活性ない電子について全体的にスクリーニングするためのＤＮＡマイクロアレイ技術、および転写的に活性なプロモーターについて選択するためにＦＡＣＳ分析を使用するＤＦＩ（Ｃｈｉａｎｇら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３：１２９〜１５４，１９９９）。ＤＦＩは、基礎発現レベルに関わらず差次的に調節される遺伝子の同定を可能にし、かつインビトロでの増殖のために必須の遺伝子は排除しない、高スループット方法である。
【００６２】
ＤＦＩは、多くの微生物において首尾良く利用されている。例えば、ＧＦＰレポーター系およびフローサイトメトリーが、マクロファージと相互作用する際の微生物遺伝子発現を研究するために使用された（Ｄｈａｎｄａｙｕｔｈａｐａｎｉら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７：９０１〜９１２，１９９５）。インビボ増殖を刺激する環境にＳａｌｍｏｎｅｌｌａｅが供された場合、および培養マクロファージ様細胞によりインターナライズされた場合に、転写が増加される遺伝子を同定するために、プロモータートラップ系が、使用された（ＶａｌｄｉｖａおよびＦａｌｋｏｗ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２２：３６７〜３７８，１９９６；ＶａｌｄｉｖｉａおよびＦａｌｋｏｗ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：２００７〜２０１１，１９９７；ＶａｌｄｉｖｉａおよびＦａｌｋｏｗ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：３５９〜３６３，１９９８）。さらに、ＤＦＩは、感染を模倣する変化したインビトロ状態下で増殖した場合にＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＳ．ａｕｒｅｕｓにおいて発現されるプロモーターを同定するために、使用された。さらに、ＤＦＩは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓにおいて、環境刺激に応答した遺伝子調節を研究するために（ＤｕｎｎおよびＨａｎｄｅｌｓｍａｎ、Ｇｅｎｅ，２２６：２９７〜３０５，１９９９）、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにおいてコンピテンス刺激ペプチドに応答した遺伝子調節を研究するために（Ｂａｒｔｉｌｓｏｎら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：１２６〜１３５，２００１）、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ（ＬｅｅおよびＦａｌｋｏｗ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６：３９６４〜３９６７，１９９８）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：５０１６〜５０２４，２００１）、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ（Ｅｓｋｒａら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：７７３６〜７７４２，２００１）、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｂａｄｇｅｒら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：１７４〜１８２，２０００）における宿主細胞との相互作用および宿主細胞の侵襲の際の遺伝子調節を研究するために、使用された。
【００６３】
ＤＦＩは、感染の細胞培養モデルまたはインビボ環境を刺激するように設計されたインビトロ条件において活性なプロモーターを同定するために首尾良く使用されているが、動物全体において特定の生物学的ニッチにおいて調節されるプロモーターを同定するためには、ＤＦＩはほとんど適用されていない。このことは、おそらく、インビボ環境から選別することに関連する多数の難問に起因する。宿主の免疫応答、感染部位からの細菌細胞の蔓延おおび／または除去、ならびに上皮細胞に対する細菌の付着（おそらく、バイオフィルム形成を介する）は、細菌を、生存動物から回収するために接近不能にし得る。これらの要因は、とりわけ、細菌がこれらの難問を感知して応答する場合に、微小環境の複雑性および遺伝子発現の不均一性に寄与する。最近、ＤＦＩは、最近が、呼吸器管感染のマウスモデルおよびＯＭのアレチネズミ感染モデルにおいてスクリーニングされた場合に、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにおいて発現されるプロモーターを同定するために使用されている（Ｍａｒｒａら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７０：１４２２〜３３，２００２；Ｍａｒｒａら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４８：１４８３〜９１，２００２）。
【００６４】
（動物モデル）
上記チンチラモデルは、ＯＭについての広範に受容されている実験モデルである。特に、ＮＴＨｉ誘導性ＯＭのチンチラモデルは、十分に特徴付けられており（Ｂａｋａｌｅｔｚら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６８：８６５〜８７２，１９９３；ＢａｋａｌｅｔｚおよびＨｏｌｍｅｓ，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：２２３〜２２５，１９９７；ＳｕｚｕｋｉおよびＢａｋａｌｅｔｚ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６２：１７１０〜１７１８，１９９４）、ＯＭに対する痘苗原としての、いくつかのＮＴＨｉ外膜タンパク質、外膜タンパク質の組み合わせ、キメラ合成ペプチドワクチン成分、およびアジュバント処方物の防御効力を決定するために使用されている（Ｂａｋａｌｅｔｚら、Ｖａｃｃｉｎｅ １５：９５５〜９６１，１９９７；Ｂａｋａｌｅｔｚら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：２７４６〜２７６２，１９９９；Ｋｅｎｎｅｄｙら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８：２７５６〜２７６５，２０００）。
【００６５】
特に、アデノウイルスが、チンチラをＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ誘導性中耳炎に対して罹りやすくする独特のインビボモデルが存在し、これにより、ＮＴＨｉの生物学的評価についての関連する細胞、組織、および器官の培養系の確立が可能になった（Ｂａｋａｌｅｔｚら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６８：８６５〜７２，１９９３；Ｓｕｚｕｋｉら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６２：１７１０〜８，１９９４）。アデノウイルス感染単独が、鼓室中への誘導された血清抗体の漏出について評価するために使用され（Ｂａｋａｌｅｔｚら、Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４（２）：２２３〜５，１９９７）、ＮＴＨｉとともに共病原体として使用されて、中耳炎に対する痘苗原として種々のＮＴＨｉ外膜タンパク質、ＯＭＰの組み合わせ、キメラ合成ペプチドワクチン成分、およびアジュバント処方物を標的とするいくつかの能動的免疫化レジメンおよび受動的免疫化レジメンの防御効力が決定された（Ｂａｋａｌｅｔｚら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，６７（６）：２７４６〜６２，１９９９；Ｋｅｎｎｅｄｙら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．６８（５）：２７５６〜６５、２０００；Ｎｏｖｏｔｎｙら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６８（４）：２１１９〜２８，２０００；Ｐｏｏｌｍａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ １９（補遺１）：Ｓ１０８〜１５，２０００。
【００６６】
（中耳炎のＮＴＨｉ感染に応答してインビボでアップレギュレートされる遺伝子）
中耳炎のＮＴＨｉ感染に応答して差次的に調節されるプロモーターを同定するために、プロモータートラップライブラリーが、構築され、そして選別パラメーターが、規定された。上記プロモータートラップライブラリーの一部が、上記チンチラ中耳に直接接種され、ＯＭ発症が、ビデオ耳鏡検査法およびティンパノメトリによって２４時間目および４８時間目にモニターされた。さらに、中耳液が、感染の２４時間後および４８時間後に回収された。二色ＦＡＣＳ分析が、浸出に関連する他の細胞および破片から、ＧＦＰを発現している細菌を単離するために使用された。単離後、ｇｆｐｍｕｔ３遺伝子の５’側にあるＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ挿入物のＤＮＡ配列が、決定され、分析された。この様式で、本発明者らは、ＮＴＨｉがＡＯＭの間にチンチラ中耳の環境を感知して応答する場合にアップレギュレートされる遺伝子を同定した。以下の遺伝子が、同定され、ＮＴＨｉ感染の間にそれらの遺伝子がアップレギュレートされることに起因して、それらの遺伝子は、ＮＴＨｉ感染および毒性において一定の役割を果たし得る。
【００６７】
下記実施例７に記載されるように、上記のＤＦＩ手順およびその後のｇｆｐ発現クローンのＦＡＣＳ分析の後、可能性のあるインビボで調節されるプロモーターを含む５２候補クローンが、単離された。これらのクローンが制御する遺伝子は、一般的内容およびその細胞中での機能に基づいて分類された。それらとしては、一般的代謝プロセス、環境情報処理および膜輸送、膜タンパク質、および仮想タンパク質が挙げられる。これらの５２個のクローンのうち８個が、ＮＴＨｉ株８６−０２８ＮＰについて独特である配列を含む。重要なことには、３つのクローンが、１つよりも多い動物において独立したスクリーニングから単離され、それによって、単離方法が確認された。
【００６８】
上記のＦＡＣＳデータを独立して確認するために、本発明者らは、定量的ＲＴ−ＰＣＲによる候補遺伝子の相対的発現を決定した。親株８６−０２８ＮＰを、これらの研究のために使用した。従って、遺伝子調節に対するプラスミドコピー数の影響を伴わない野生型遺伝子発現が、分析され、これにより、ＦＡＣＳによる擬陽性クローン同定を同定することが可能になった。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株Ｒｄにおいて同定された配列に類似する配列を含む４４個の候補クローンのうち、インビトロおよびインビボでの遺伝子発現の定量的比較により、チンチラ中耳中に存在する環境的合図にＮＴＨｉが応答する場合に、２６個の遺伝子についてのアップレギュレートされた遺伝子発現（６０％）が確認された。この分析により、膜輸送、環境情報処理、細胞代謝、遺伝子調節、ならびに未知の機能を有する仮想タンパク質に関与する遺伝子の発現を駆動する、インビボで調節されるプロモーターが同定された。（実施例６における表４参照）。
【００６９】
定量的ＲＴ−ＰＣＲは、ｌｏｌＡ発現の２倍の増加を示し、これは、内膜から外膜へのリポタンパク質輸送を可能にした。細菌は、中耳環境ちゅうで迅速に増殖して、４８時間以内に、中耳液１ｍｌ当たり５．０×１０８ ＧＦＵ ＮＴＨｉに達する。その細菌は、その環境を感知して応答し、増殖および生存のために必要な栄養素を獲得または合成する。リボース糖輸送における膜成分をコードする遺伝子であるｒｂｓＣ（配列番号６１９）は、インビトロで増殖する細胞と比較して、インビボでの発現の５倍増加を示した。さらに、代謝プロセスに関与する多くの遺伝子は、インビトロで増殖する細胞と比較して、インビボでの遺伝子発現の劇的な増加を示す。これらとしては、リボフラビン合成遺伝子ｒｉｂＢ（配列番号６２３）、プリンヌクレオチド生合成遺伝子ｐｕｒＥ（配列番号６２１）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼａｒｃＢ（配列番号６２５）（これは、尿素サイクルを介するアルギニン分解に関与する）、およびｕｘｕＡ（配列番号６２７）（これは、Ｄ−グルクロネートの取り込みおよびグリセルアルデヒド３リン酸への変換に必要な、マンノエートヒドロラーゼをコードする）が、挙げられる。さらに、より弱い程度ではあるが、ヒスチジン生合成についての遺伝子（ｈｉｓＢ；配列番号６１５）、ＤＮＡ修復についての遺伝子（ｒａｄＣ；配列番号６３９）および推定細胞内中隔形成膜貫通タンパク質についての遺伝子（ｉｓｐＺ；配列番号６３７）が、アップレギュレートされた。
【００７０】
ジスルフィド結合形成は、細菌における多くの分泌タンパク質のフォールディングおよびアセンブリのために重要である。原核生物において、ＤｓｂＡおよびＤｓｂＢは、ジスルフィドの形成を担う酸化経路を構成する。ＤｓｂＢは、ＤＮＡを再酸化する。これは、フォールディングしていないポリペプチドへとジスルフィド結合を直接提供する。ＤｓｂＢは、酸化キノンからジスルフィドを新規に生成することが示されている（ＣｏｌｌｅｔおよびＢａｒｄｗｅｌｌ、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：１〜８，２００２）。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株Ｒｄにおいて、ＤｓｂＡは、形質転換のためのコンピテンスのために必要である（Ｔｏｍｂ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９，１０２５２〜１０２５６，１９９２）。本明細書中で、ｄｓｂＢ遺伝子（配列番号６２９）の転写の約３倍の増加が、示された。これは、中耳環境において増殖するＮＴＨｉについてのジスルフィド交換のための重要な役割に光を当てる。
【００７１】
中耳の細菌コロニー形成（通常の滅菌環境）は、宿主炎症応答を生じ、引き続いて、好中球浸潤を生じる。細菌は、この宿主応答と戦うために、多くの戦略を引き起こす。ＮＴＨｉは、ｕｒｅＨ（配列番号６３１）（酸耐性に関与することが示されている（Ｙｏｕｎｇら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｏｌ．，１７８：６４８７−６４９５，１９９６）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ中の活性ウレアーゼの発現に必要な遺伝子のホモログ）の遺伝子発現を増加する（４倍）。最近、ウレアーゼ活性が、感染で生じるｐＨの低下を中和することによって、慢性Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ完成においてある役割を果たし得ることが報告されている（Ｂａｌｔｅｓら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６９：４７２−４７８，２０００；Ｂａｌｔｅｒｓら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６９：４７２−４７８，２００１；ＢｏｓｓｅおよびＭａｃＩｎｎｅｓ，Ｃａｎ．Ｊ．Ｖｅｔ。Ｒｅｓ．，６４：１４５−１５０）。中耳浸出液からのＮＴＨｉ単離物に対する生物型分析は、８７％がウレアーゼ陽性であることを実証した（ＤｅＭａｒｉａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０：１１０２−１１０４，１９８４）。しかし、ＮＴＨｉ毒性におけるウレアーゼの役割は未知である。同様に、産物が、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにおけるピリドキシン生合成タンパク質に対して８８％の配列同一性を示し、抗酸化剤として機能し得る推定一重項酸素耐性タンパク質に６０％の相同生を示す遺伝子の発現が増加した。ホスホリルコリン（ＣｈｏＰ）は、ＮＴＨｉの病因に関わっている（Ｗｅｉｓｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：９４３−９５０，１９９７）。ＮＴＨｉは、相変動によってＣｈｏＰ発現を調節し、細胞表面上にＬＯＳを装飾する。ＣｈｏＰは、抗微生物ペプチドに対する減少した感受性を介して気道におけるＮＴＨｉ残存に寄与し得（Ｌｙｓｅｃｋｏら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６８：１６６４−１６７１，２０００）、そしてＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）により媒介される血清殺傷に対する感受性を変化させる（Ｗｅｉｓｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：６３１−６４０，１９９８）。鼻咽腔および中耳腔の微環境は、ＣｈｏＰ＋菌株がチンチラ鼻咽腔のより多くのコロニー形成を示すので、ＣｈｏＰ＋表現型を選択し得る（Ｔｏｎｇら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６８：４５９３−４５９７，２０００）。ｌｉｃＣ遺伝子（配列番号６３３）の発現もまた増加した。ｌｉｃＣ遺伝子は、ホスホリルコリン誘導体化ＬＯＳの生合成におけるある役割を果たすホスホリルコリンシチジリルトランスフェラーゼをコードする（Ｒｏｃｋら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｏｌ．，１８３：４９２７−４９３１，２００１）。
【００７２】
産物が引き続いて遺伝子発現またはＤＮＡ複製を調節するセットがまた、インビボ誘導遺伝子に含まれる。これらの遺伝子は、ｇｌｐリプレッサー、ｇｌｐＲ（配列番号６４３）、アルギニンリプレッサー遺伝子、ａｒｇＲ（配列番号６４７）、および組込み宿主因子（ＩＨＦ）βサブユニット、ｉｈｆＢ（配列番号６４５）によるグリセロール代謝の転写調節を含む。ＩＨＦは、特定の配列においてＤＮＡに結合するヒストン様タンパク質（複製、部位特異的組換えおよび転写に関与し、多数のオペロンの活性を変化させる補助因子）である（Ｇｏｏｓｅｎおよびｖａｎ ｄｅ Ｐｕｔｔｅ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６１−７，１９９５）。さらに、ＣｓｐＤは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける静止期誘導ストレス応答の間のＤＮＡ複製を阻害し（Ｙａｍａｎａｋａら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３９：１５７２−１５８４，２００１）、そしてｍｕｋＦ（配列番号６４１）遺伝子タンパク質ホモログは、細胞分離の前により緻密な形態へのヌクレイド構造のリモデリングに寄与する（ＳａｗｉｔｚｋｅおよびＡｕｓｔｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，６２：１７１０−１７１８，２０００）。本明細書中に記載されるＤＦＩ戦略は、未知の機能についてインビボで誘導されるプロモーターを同定した。仮想タンパク質ＨＩ００９４は、初期ＯＭの間、遺伝子発現の８倍の増加を示したが、その役割は未知のままである。ＨＩ１１６３（配列番号６５１）は、Ｅ．ｃｏｌｉの推定オキシダーゼである仮想ＹｄｉＪタンパク質と５８％のアミノ酸同一性を示した。
【００７３】
高密度トランスポゾン突然変異誘発戦略は、高栄養培地上で増殖するために必須のＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ遺伝子を同定するために使用された（Ａｋｅｒｌｅｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９９：９６６−９７１，２００２）。本明細書において記載されるスクリーニングにおいて、Ａｋｅｒｌｅｙら（上述）に記載された必須の遺伝子セットに含まれる６つの遺伝子が同定された（ｈｉｓＢ、ｌｐｐＢ、ｌｏｌＸ、ｉｓｐＺ、ｍｕｋＦおよび未知のＨＩ０６６５）。最近、２種類のヒト気道由来上皮細胞株との相互作用によって発現される、分類不可能なＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの遺伝子が同定された。これらの遺伝子は、代謝プロセス、ストレス応答、遺伝子発現、細胞エンベロープ生合成、ＤＮＡ関連プロセス、細胞分裂、および機能未知のＯＲＦがコードするタンパク質に関与する遺伝子を含んだ（Ｕｌｓｅｎら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４５：４８５−５００，２００２）。同様に、ストレス応答遺伝子、ｃｓｐＤ（配列番号６４９）、プリンおよびリボフラビン生合成に関与する遺伝子、ならびに機能未知のタンパク質、ｖａｐＡが、本明細書において記載されるスクリーニングで同定された。ｖａｐＡの発現は、インビトロで検出され、さらにｖａｐＡ遺伝子発現は、インビボで２倍に増加した。これらの独自のアプローチは、ＮＴＨｉ誘導性ＯＭにおいてアップレギュレートされ、したがってＮＴＨｉの感染およびビルレンスに役割を果たす可能性があり；かつワクチン治療およびアンチセンス治療、ならびにＮＴＨｉ関連障害の処置の、他の治療法の潜在的な候補であり得る、既知の遺伝子を同定した。
【００７４】
ＤＦＩ戦略は、その上、機能未知の遺伝子のための、インビボで誘導されるプロモーターの同定という結果を生じた。仮説的タンパク質、ＨＩ００９４は、初期ＯＭの間、遺伝子発現における８倍の増加を示したが、その機能は未知のままである。ＨＩ１１６３（配列番号６５１）は、Ｅ．Ｃｏｌｉの仮説的ＹｄｉＪタンパク質（推定上のオキシダーゼ）と５８％のアミノ酸同一性を示した。したがって、これらの仮説的遺伝子は、ＮＴＨｉ感染によって誘導されるＯＭに役割を果たす可能性がある。
【００７５】
（詳細な説明）
以下の実施例は、本発明を説明する。ここで、実施例１は、ＮＴＨｉゲノムの配列を記載し、実施例２は、同定されたコンティグおよび最初の遺伝子発見を記載し、実施例３は、ＮＴＨｉプロモータートラップライブラリーの構築を記載し、実施例４は、ＧＦＰを発現する８６−０２８ＮＰ誘導体の分析を記載し、実施例５は、中耳の流体由来の細菌の直接標識を示し、実施例６は、急性中耳炎においてインビボで誘導されたプロモーターの同定を記載し、実施例７は、ビルレンス関連遺伝子の同定を記載し、そして実施例８は、固有のＮＴＨｉ遺伝子配列の同定を記載する。
【実施例】
【００７６】
（実施例１）
（分類不可能なＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅゲノムの配列）
ＮＴＨｉ８６−０２８ＮＰ株は、コロンバスのＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌにおいて鼓膜切開術および慢性ＯＭのための管挿入を受けた小児科患者から得られた、最小限に継代された臨床単離物である（Ｂａｋａｌｅｔｚら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，５６（２）：３３１−３３５，１９８８）。８６−０２８ＮＰ株は、２００２年１０月１６日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８ ＵＳＡ）に寄託され、そして受託番号ＰＴＡ−４７６４を割当てられた。
【００７７】
ＮＴＨｉにおけるビルレンス決定因子の同定により広範に近づくための試みにおいて、ＮＴＨｉ ８６−０２８ＮＰ株のゲノムを３倍の適用範囲（３−ｆｏｌｄ ｃｏｖｅｒａｇｅ）でシークエンシングした。染色体ＤＮＡ、８６−０２８ＮＰ株からＰｕｒｅｇｅｎｅプロトコールを用いて調製し、そしてＨｙｄｒｏｓｈｅａｒ装置（Ｇｅｎｅ Ｍａｃｈｉｎｅｓ）によって２ｋｂ〜４ｋｂのサイズにせん断した。Ｃｈｉｓｓｏｅら（Ｍｅｔｈｏｄｓ：ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３：５５−６５，１９９１）およびＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）に記載されたように、せん断したＤＮＡを、エタノール沈殿し、クレノウ酵素の混合物を用いて末端修復し、そしてアガロースゲル電気泳動によってサイズ選別して、２ｋｂ〜４ｋｂのフラグメントを得た。これらのフラグメントを、ＳｍａＩ制限酵素認識部位（ホスファターゼ処理されている）を用いてｐＵＣ１８ベクター中にクローニングし、そしてＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅに形質転換し、アンピシリン耐性について選択する。Ｘ−ｇａｌを含有するＬＢ−Ａｍｐプレート上での青／白スクリーニングによって、インサートを含むコロニーを同定し、そして１．５ｍｌのＴＢ−Ａｍｐ（ＴＢ＝Ｔｅｒｎｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）ブロスを含む９６ディープウェルプレートに移す。ディープウェルプレート培養物を、３７℃で一晩増殖させる。テンプレート調製、シークエンシングおよびコンティグアセンブリを行った。
【００７８】
Ｃｈｉｓｓｏｅら（上述）に記載されるように、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｂｉｏｍｅｋ２０００自動ロボットワークステーション上で、自動テンプレート調製を行った。簡単に言うと、上記で調製されたクローンを含む各９６ディープウェルプレートを遠心し、細胞をペレット化した。上清をデカントし、細胞を（必要な場合）−２０℃で凍結した。Ｃｈｉｓｓｏｅら（上述）に記載されるように、４つの９６ディープウェルブロックをＢｉｏｍｅｋテーブル上に配置し、液体ハンドリングロボットを使用して、代表的なＳＤＳ−ＮａＯＨ溶解プロトコールの自動バージョンを用いてテンプレートを調製した。最終的なエタノール沈殿テンプレートを、５０μｌのｄｄＨ２Ｏに各々溶解し、そしてＤＮＡシークエンシングのために使用した。
【００７９】
Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｈｙｄｒａ ９６ロボットを用いて、上記テンプレートを（９６ウェルプレートから）３８４ウェルプレートへと再整列化することによって、シークエンシング反応を実行した。ＰＥ Ｂｉｇ−ＤｙｅＴＭターミネーターおよびユニバーサルプライマー（Ｍ１３フォワードおよびリバース）を用いてサイクルシークエンシング反応を実行し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０カラムを通して浄化し、そしてＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７００キャピラリー電気泳動ＤＮＡシークエンサー上で、製造者の指示に従って分析した。シークエンシングの読み（８２１９）を、５７６のコンティグ（本明細書における配列番号１〜５７６）に組み立てた。３倍（３−ｆｏｌｄ）シークエンシングについての統計を、表２Ａに示す。アセンブリ１７の全固有配列は、１．７４Ｍｂである。
【００８０】
（表２Ａ）
【００８１】
【表２Ａ】
続いて、ＮＴＨｉゲノムの８倍（８−ｆｏｌｄ）シークエンシング分析を行った。８倍シークエンシングは、ＮＴＨｉゲノムを１１のコンティグに組み立てた。コンティグ５、８、９、１０、１２〜１８を、本明細書において配列番号６７５〜６８５として示す。８倍シークエンシングについての統計を、表２Ｂに示す。
【００８２】
（表２Ｂ）
【００８３】
【表２Ｂ】
（実施例２）
（コンティグ説明および最初の遺伝子発見）
３倍配列分析によって同定された、長さ５０００ｂｐ以上を有する８８個のコンティグ中７５個は、ＢＬＡＳＴＮを介して、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｄ株に対する有意な類似性を示す。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ８６−０２８ＮＰ株における遺伝子順とＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｄ株における遺伝子順との間の潜在的な関係を可視化するため、８６−０２８ＮＰ ３倍コンティグセットおよびＲｄ遺伝子セットを、ＢＬＡＳＴＮを用いて双方向性に比較した。結果を、ヒットしたＲｄ遺伝子の遺伝子座標に基づいてコンティグをソーティングし、Ｒａｙら（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １７：１１０５−１２，２００１）に記載されるように、見出された最小の座標で各コンティグを固定することによって、遺伝子順 対 コンティグ空間にプロットした。この様式で比較し、完全に既知のゲノムに対して同一の遺伝子順を有するゲノムの不完全なアセンブリを、単調増加する階段状の形態で表示した。
【００８４】
ＢＬＡＳＴＸを使用して、Ｒｄ株ゲノムにおける遺伝子に対して相同性を有する配列、およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｆｚｚａｅ Ｒｄ株に見出されない遺伝子に対して相同性を有する配列に対するヒットを同定した。
【００８５】
Ｒｄ株配列へのヒットをデータセットから除去し、そして他のセットを表３Ａにまとめた。データは以下のように提示される：コンティグ番号（＝配列番号）、カラム１；各ヒットについてのＥスコア、カラム２；引用されたコンティグのアミノ酸翻訳部分に対する相同性を有したタンパク質の名前、カラム３；上記ホモログを産生する生物体、カラム４；そして、カラム３に引用されたタンパク質の各々についてのＧｅｎｂａｎｋタンパク質識別子、カラム５；コンティグ内の対応するヌクレオチド（配列番号によって参照される）。ほとんどの例においていくつかのホモログが同定されたが、明確化のため、最も相同性の高いタンパク質を表３Ａに引用する。
【００８６】
表３Ａに列挙した遺伝子のいくつかについての配列を、ＮＴＨｉゲノムの８倍シークエンシング内で同定した。表３Ｂは、１１コンティグ内のこれらの遺伝子の配置、全長オープンリーディングフレーム配列（配列番号によって同定される）、上記オープンリーディングフレームによってコードされる生成されたアミノ酸配列、およびＢＬＡＳＴＸによって同定された高相同性を有する遺伝子（表３Ａで列挙されたようなもの）を列挙する。
【００８７】
ＮＴＨｉおよびＲｄ株中における比較的短い遺伝子の配置を検査するため、詳細に記載されている２つの遺伝子クラスター中の遺伝子順を比較した。第一に、血液凝集性線毛（ＬＫＰ）遺伝子領域中に存在する遺伝子を検査した（Ｍｈｌａｎｇａ−Ｍｕｔａｎｇａｄｕｒａら，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０（１７）：４６９３−７０３，１９９８）。線毛遺伝子クラスターは、ｐｕｒＥ遺伝子とｐｅｐＮ遺伝子との間に位置する。これらのフラグメントのみを、図１に記載する。血清型ｂ株、Ｅａｇａｎは、ｈｉｆＡＢＣＤＥ遺伝子クラスターを含み、そして血液凝集性線毛を生成する。Ｒｄ株は、ｈｉｃＡＢ遺伝子およびｈｉｆＡＢＣＤＥ遺伝子クラスターを欠損している。一般的に、既に検査した分類不可能な株は、ｈｉｃＡＢ遺伝子を含むが、血液凝集性線毛をコードするｈｉｆ遺伝子を含まない。８６−０２８ＮＰ株配列（本明細書において記載される）は、この領域において、ＮＴＨｉ Ｒ３００１株の配列と同一である（図１）。ｒｆａＤ遺伝子は、エンドトキシンの生合成に関与する酵素をコードする。さらに、ＮＴＨｉ ２０１９株由来のｒｆａＤ遺伝子は、Ｎｉｃｈｏｌｓら（Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６５（４）：１３７７−８６，１９９７）によって特徴付けられている。２０１９株において、ｒｆａＤ遺伝子は、エンドトキシン生合成に関与する別の酵素をコードするｒｆａＦ遺伝子のすぐ上流にある。Ｒｄ株における遺伝子配置は、様々である；ｒｆａＤ遺伝子およびｒｆａＦ遺伝子は、およそ１１ｋｂの配列によって分離されている。検査された最も分類不可能な株は、２０１９株において見られる遺伝子配置を含んでいた。対照的に、８６−０２８ＮＰ株は、Ｒｄ株に見られる遺伝子配置と同一の遺伝子配置を有する（図２）。
【００８８】
現行のアセンブリの全体的な分析は、遺伝子の内容および順序が、Ｒｄ株における内容および順序と類似することを示す。より詳細な分析は、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａにおいて以前見られなかったかなりの数のＮＴＨｉ遺伝子が存在すること、そしてＮＴＨｉ遺伝子の内容および順序がＲｄ株において見られる内容および順序と異なるいくつかの領域が存在することを、明らかにした。したがって、現行のデータは、８６−０２８ＮＰ株ゲノムが、Ｒｄ様性質と非Ｒｄ様性質との複雑なモザイクを含むことを示唆する。
【００８９】
ＤＦＩ戦略はまた、遺伝子発現を増加させる新規のＮＴＨｉ配列を同定した。他の生物体（主にグラム陰性細菌）のＯＲＦに対して相同性を有する遺伝子または遺伝子フラグメントを含む、これらの新規コンティグ配列のリストを、表３Ａに示す。例えば、コンティグ４４２（配列番号４４２）のヌクレオチド配列、ヌクレオチド１４９８〜１８４５は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｄ株リポタンパク質Ｂ（ＬｐｐＢ）のアミノ酸１〜１１６をコードする配列に対して、高度に相同性である。この遺伝子は、静止期生存遺伝子、ｓｕｒＥと、ビルレンスに関連している、最近同定された細菌リポタンパク質、ＬｐｐＢ／ＮｌｐＤに対して高度に相同性である、４３ｋＤの抗原外膜リポタンパク質をコードする遺伝子との間に位置する（Ｐａｄｍａｌａｙａｍら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６８：４９７２−４９７９，２０００）。最近、Ｚｈａｎｇおよび共同研究者らは、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａにおいて、ｎｌｐＤ遺伝子およびｓｕｒＥ遺伝子の発現が、細胞増殖の静止期の間に誘導されることを示した（Ｚｈａｎｇら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃａｍｂ），９：１０９５−１１０６，２００１）。したがって、中耳でのストレス誘導条件下において、このＮＴＨｉリポタンパク質が発現される。
【００９０】
【表３Ａ−１】
【表３Ａ−２】
【表３Ａ−３】
【表３Ａ−４】
【表３Ａ−５】
【表３Ａ−６】
【表３Ａ−７】
【表３Ａ−８】
【表３Ａ−９】
【表３Ａ−１０】
【表３Ａ−１１】
【表３Ａ−１２】
【表３Ａ−１３】
【表３Ａ−１４】
【表３Ａ−１５】
【表３Ａ−１６】
【表３Ａ−１７】
【表３Ａ−１８】
【表３Ｂ−１】
【表３Ｂ−２】
【表３Ｂ−３】
（実施例３）
（ＮＴＨｉプロモータートラップライブラリーの構築）
ＮＴＨｉの潜在的なビルレンス決定因子を同定するために、細菌遺伝子発現を、ＮＴＨｉ誘導中耳炎（ＯＭ）のチンチラモデルの１つの特定の解剖学的くぼみ（ｎｉｃｈｅ）における初期疾患の進行の間の微分蛍光誘導（ＤＦＩ）によって、モニターした。ＮＴＨｉ菌株８６−０２８ＮＰ由来のゲノムＤＮＡフラグメントを、プロモータートラップライブラリーを使用して、プロモーターレスｇｆｐｍｕｔ３遺伝子の上流にクローニングした。プラスミドｐＧＺＲＳ３９Ａ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅから単離したｐＧＺＥＳ−１の誘導体）は、Ａ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ−Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉシャトルベクターである。このプラスミドは、Ａ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の複製起点、ｐＵＣ１９由来のｌａｃＺα遺伝子およびＴｎ９０３由来のカナマイシン耐性遺伝子を含む（Ｗｅｓｔら、Ｇｅｎｅｓ，１６０：８１−８６，１９９５）。
【００９１】
プロモータートラップベクターを、ＧＴＰ変異ｇｆｐｍｕｔ３遺伝子を、ＥｃｏＲＩフラグメントに対するＢａｍＨＩとして、ｐＧＺＲＳ−３９Ａ内にクローニングしてｐＲＳＭ２１６７を形成することによって構築した。この変異ＧＴＰ遺伝子は、２つのアミノ酸変化（Ｓ６５ＧおよびＳ７２Ａ）を含み、これは、４８８ｎｍで励起される場合、蛍光発光を増強する。この変異体はまた、高い溶解性および発色団形成の速い動力学を有する（Ｃｏｒｍａｃｋら、Ｇｅｎｅ，１７３：３３−３８，１９９６）。このプラスミドは、ＮＴＨｉ菌株８６−０２８ＮＰ内へのエレクトロポレーションによって形質転換され、親のプラスミド菌株８６−０２８ＮＰ／ｐＲＳＭ２１６７を生成する。
【００９２】
ランダムゲノムＤＮＡフラグメント（実施例１に記載される）を、ｐｕｒｏもタープローブベクター内への連結のために調製した。ゲノムＤＮＡを、製造業者のプロトコルに従って、ＰｕｒｅｇｅｎｅＤＮＡ単離キット（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を使用して、菌株８６−０２８ＮＰから単離した。制限障壁に起因して、プラスミドＤＮＡを単離し、これをライブラリー作製のために使用することが必要であった。この単離されたＤＮＡを３７℃で１時間、Ｓａｕ３ＡＩ（ＮＥＢ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ；０．２５単位／μｇ ＤＮＡ）を用いて部分的に消化し、ゲル電気泳動によって分離し、そしてＤＮＡフラグメント（０．５〜１．５ｋｂのサイズ）を、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを使用して、回収した。ベクター調製のために、ｐＲＳＭ２１６７を、製造業者のプロトコルに従って、Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ Ｍａｘｉｐｒｅｐ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を使用して、一晩の培養物から単離した。
【００９３】
プラスミドＤＮＡを、ＢａｍＨＩ消化によって線形化し、そして５’リン酸基を、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ；ＧｉｂｃｏＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いる処置によって除去した。ゲノムＤＮＡフラグメントを、線形化されホスファターゼで処理されたベクターを用いて連結し、そして改変プロトコルに従ってエレクトロポレーションのための調製したコンピテントＮＴＨｉ菌株８６−０２８ＮＰ内エレクトロポレートした（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９：３６２５−３６２８，１９９１）。プラスミドＤＮＡをＮＴＨｉ菌株８６−０２８ＮＰ内にエレクトロポレーションで戻した場合、形質転換効率は、千倍改善した。簡単に述べると、細胞を、ｓＢＨＩ（脳心臓注入物）ブロスにおいて３７℃、２２０ｒｐｍで、ＯＤ６００＝０．３まで増殖させた。細胞を、３０分間、氷において冷やし、引き続いて、４℃で、等量の０．５×ＳＧ（１×ＳＧ：１５％グリセロール、２７２ｍＭスクロース）を用いて洗浄した。洗浄を合計３回繰り返した。引き続いて、細胞を、１×ＳＧ中で、１００×濃縮用量に希釈した。細胞を、２００オーム、２．５ｋＶおよび２５μＦで、ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩセットを使用して、エレクトロポレーションし、次いで、１ｍｌの予め温めたｓＢＨＩ中に希釈し、３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートし、そして形質転換体の一晩の増殖のためにチョコレート寒天にプレートした。
【００９４】
形質転換体を選択し、２０％グリセロール（容積／容積）を含む脱脂乳中、１０００クローンのプール中に凍結させた。６８，０００メンバーのｇｆｐプロモータープローブライブラリーを作製した。ＣｌａｒｋｅおよびＣａｒｂｏｎ（Ｃｅｌｌ，９：９１−９９，１９７６）の確率計算を使用して、菌株８６−０２８ＮＰ ＤＮＡの３００ｂｐフラグメントのライブラリー（１．８×１０６ｂｐ／ゲノム）に表される所定のＤＮＡ配列の９９％確率を達成するために、２７，６２９クローンのライブラリーを必要とした。従って、本発明のライブラリーは、８６−０２８ＮＰゲノムの２．５倍の適用範囲を表す。
【００９５】
ライブラリーの質を評価するために、５０クローンをランダムに選択し、チョコレート寒天で一晩増殖させ、そしてプラスミドを単離し、そして挿入ＤＮＡを配列決定した。選択されたクローンの大部分（６４％）は、２００ｂｐと５００ｂｐとの間の範囲挿入サイズを有したが、３２％は、５００ｂｐを超えた。挿入物の大部分は、独特のＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ菌株Ｒｄオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と相同性を示し、そして１５クローンが、菌株８６−０２８ＮＰ ＤＮＡに対して独特の配列を有した。菌株Ｒｄに対して相同性を有するこれらのクローンのうち、６０％が、正しい方向であり、その３６％が、ＯＲＦの上流に配列を含んだ。クローンの大部分が５００ｂｐ未満の挿入サイズを有したが、小さな挿入サイズと増加したＧＦＰ発現との間に相関は見出されなかった。実際、４つのクローンは、インビトロにおいて、わずかから中程度の蛍光を示し、これらの３つが、２００塩基対〜５００塩基対の間の挿入サイズを有し、１つが、７００塩基対よりも長い挿入物を有した。
【００９６】
ライブラリーの画分（約１０００クローン）を、チョコレート寒天で増殖させ、ＰＢＳ中で収集し、ＧＦＰ蛍光についてフローサイトメトリーによって分析した。挿入ＤＮＡの無いプロモータートラップベクターを含む菌株８６−０２８ＮＰ／ｐＲＳＭ２１６９と比較して、ライブラリークローンのプールは、増加した蛍光強度を示す。従って、ライブラリーは、種々のレベルの活性でプロモーターを有するクローンを含む。
【００９７】
（実施例４）
（ＧＦＰを発現する８６−０２８ＮＰ誘導体の分析）
ｇｆｐ発現細菌を同定および分類するために必要なＦＡＣＳプロモーターを確立するために、種々のレベルのｇｆｐ発現を示すパネル単離物を利用した。バックグラウンド蛍光を、菌株８６−０２８ＮＰ／ｐＲＳＭ２１６９（ネガティブコントロール）を使用して評価し、従って、任意の観察された蛍光は、ｌａｃＺプロモーター駆動ｇｆｐ発現に起因している。しかし、この菌株は、検出可能なレベルのＧＦＰを生成せず、実際、親の菌株８６−０２８ＮＰと比較した場合、増加した蛍光を示さない。高レベルのｇｆｐ発現単離物を、外膜タンパク質Ｐ２発現に対する強力なプロモーターを含む５００ｂｐフラグメントを、Ｓａｉ−ＢａｍＨＩ消化ｐＲＳＭ２１６７にクローニングすることによって作製した。このプラスミドを、エレクトロポレーションによって８６−０２８ＮＰ内に形質転換し、高レベルのｇｆｐ発現菌株８６−０２８ＮＰ／ｐＲＳＭ２２１１（高い蛍光コントロール）を生成する。この菌株は、菌株８６−０２８ＮＰ／ｐＲＳＭ２１６９と比較して、ＧＦＰ蛍光において約１００倍増加を示した。中程度の蛍光誘導体クローン、８６−０２８ＮＰ／ｐＫＭＭ４Ｂ５（中程度の蛍光コントロール）を、ＦＡＣＳ分析によって単離し、そして予備的実験および細胞選別のためのコントロールとして使用した。インビトロでｇｆｐ発現を駆動するプロモーターを含むＤＮＡフラグメントは、他の生物のＤＮＡに対して公知の相同を有さない、菌株８６−０２８ＮＰに対して独特である。このクローンは、菌株８６−０２８ＮＰ／ｐＲＳＭ２１６９と比較して、蛍光において約１０倍の増加を示す。
【００９８】
コントロール菌株をチョコレート寒天上での増殖物から再懸濁させ、４℃で３０分間、交差反応性Ｐｈｙｃｏｐｒｏｂｅ Ｒ−ＰＥ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（１００μｌＰＢＳ中、１０μｇ／ｍｌ；Ｂｉｏｍｅｄａ Ｃｏｒｐ）を用いて標識した。未結合の抗体を除去するための３回の連続洗浄に続いて、細菌をＦＡＣＳ分析のために、３００μｌＤＰＢＳ中で再懸濁させた。これらのコントロール調製物を使用して、４８８ｎｍを発するアルゴンレーザーを備えるＣｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ Ｅｌｉｔｅフローサイトメーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐ．）を使用して、適切なサイズおよび蛍光ゲートを設定した。細菌を、ログフォワードアングル（ｌｏｇ ｆｏｒｗａｒｄ ａｎｇｌｅ）および側方散乱検出に基づくサイズ、ならびに細菌のＦＩＴＣ／ＰＥ標識による選別のためにゲート（ｇａｔｅ）した。選別された細胞を、冷却したｓＢＨＩ中に収集し、そしてチョコレート寒天上にプレートした。一晩の増殖後、細胞を、第２回の感染のために収集するか、または個々に選択し、一晩増殖させ、インビトロで増殖する場合、蛍光について個々のクローンによってスクリーニングし、そしてプラスミド単離の前に、２０％（容積／容積）グリセロールを含む脱脂乳中で凍結させ、そして挿入物ＤＮＡを配列決定した。コントロール菌株の選別効率を、Ｃｏｕｌｔｅｒ ＥＰＩＣＳフローサイトメーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐ．）を使用して確認した。
【００９９】
多くのプラスミドを、抗生物質選択の非存在下でインビトロで迅速に分離した。従って、本明細書中で使用されるプロモータートラップベクターがこの事象の傾向があるか否かを評価するために、菌株８６−０２８ＮＰ／ｐＲＳＭ２２１１（高い蛍光コントロール）の単一のコロニーを、チョコレート寒天上で単離し、抗生物質選択の非存在下で２０回継代させた。抗生物質の存在下で増殖された細菌と比較した場合、蛍光強度の有意な減少は、観察されなかった。さらに、プラスミドをインビボでの抗生物質選択の非存在下で維持する。チンチラから収集された細菌含有中耳分泌液を、カナマイシン無しまたは有りでチョコレート寒天上にプレートした場合、類似の細菌カウントが観察された。これらのデータは、プロモータートラップベクターが抗生物質選択の非存在下で安定に維持されたことを実証する。
【０１００】
プラスミドの安定性に問題に加えて、宿主−病原体相互作用を研究するためのレポーターとしてのＧＦＰの使用についての初期の研究は、ＧＦＰが、細菌細胞−表面動力学に対して最小の効果を有する低い毒性で、細胞質タンパク質として連続的に合成され得ることを実証した（Ｃｈａｌｆｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６３：８０２−８０５，１９９４）。高いレベルのｇｆｐ発現誘導体の構築は、ＮＴＨｉに対するＧＦＰ毒性の評価を可能にした。野生型菌株（８６−０２８ＮＰ）および高いＧＦＰ産生菌株８６−０２８ＮＰ／ｐＲＳＭ２２１１の両方の増殖曲線を、類似の条件下で増殖した場合と比較した。増殖速度は類似し、ＧＦＰ発現が細胞に対して毒性でないことを示す。
【０１０１】
８６−０２８ＮＰ ｇｆｐ発現誘導体を使用して、効率的な細胞選別についてのパラメーターを規定した。菌株８６−０２８ＮＰ／ｐＲＳＭ２１６９を、中程度ｇｆｐ発現誘導体、菌株８６−０２８ＮＰ／ｐＫＭＭ４Ｂ５と、１００：１の比で混合し、細菌集団の合計に対して小さな割合のｇｆｐ発現クローンを含むことが予期されるインビボ環境をシミュレートした。この混合物をＦＡＣＳ分析に供し、１．８％最大蛍光集団および５２％最小蛍光集団を収集する。選別された集団のフローサイトメトリー分析は、細菌集団の６５％まで、菌株８６−０２８ＮＰ／ｐＫＭＭ４Ｂ５の富化を示し、これは、ネガティブ集団での選別の場合に観察されない減少である。引き続く回の選別は、この中程度蛍光集団をさらに富化させることをが期待される。ネガティブ選別において蛍光細菌の量を減少させることができないことは、ネガティブ選別についてのゲート設定のサイズに起因した。ＧＦＰ−ネガティブ細胞を、１０％の最小蛍光集団でゲーティングすることによって富化した。
【０１０２】
（実施例５）
（中耳分泌液からの細菌の直接的標識）
類似の戦略（実施例５に記載されるとおり）を、ＡＯＭの間にチンチラの中耳から得られた浸出液から蛍光クローンを選別するために適用した。インビボの微分蛍光誘導（ＤＦＩ）を使用する本発明者らの能力は、非蛍光細菌、蛍光および非経口細胞細片、ならびに真核生物細胞からｇｆｐ発現細菌を選別する本発明者らの能力に依存した。
【０１０３】
耳鏡検査法またはティンパノメトリのいずれによっても中耳感染の証拠のない健常な成体チンチラ（Ｃｈｉｎｃｈｉｌｌａ ｌａｎｉｇｅｒａ）を使用して、インビボのプロモーター活性についてライブラリーをスクリーニングした。ＮＴＨｉ／ｐＲＳＭ２１６９ライブラリーの２つのプール（それぞれ１０００クローン）を、カナマイシンを含むチョコレート寒天上で一晩増殖させた。このライブラリーを組合せ、冷却１０ｍＭ滅菌ＰＢＳ中に３．３×１０６ＣＦＵ／ｍｌまで希釈し、３００μｌ（１．０×１０６ＣＦＵ；５００ＣＦＵ／クローン）を使用して、左および右のチンチラトランスブラーキャビティー（ｔｒａｎｓｂｕｌｌａｒ ｃａｖｉｔｙ）を播種した（２０００クローン／耳）。ＯＭ発生（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）を、２４時間および４８時間で、ビデオ耳鏡検査法およびティンパノメトリーによってモニターした。細菌を中耳腔において増殖させ、予期されるように、４８時間で、接種材料用量の５００倍の濃度に達した（Ｂａｋａｌｅｔｚら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６７：２７４６−６２，１９９９）。宿主環境に対するこの細菌の適応は、炎症応答を生じ、これは、紅斑、脈管拡大および鼓膜の隆起、多形核球細胞（ＰＭＳ）の浸潤、ならびに回収される浸出液の耳鏡検査および顕微鏡検査によって観察されるような中耳腔の分泌液の蓄積によって示される。２４時間後および４８時間後、中耳分泌液を上鼓室タップによって回収し、そしてＦＡＣＳのために調製した。
【０１０４】
この分析が中耳分泌液中で回収可能な細菌に制限されたことに注意することが重要である。いくつかの場合において、ＦＡＣＳ分析のために細菌を収集するために、中耳腔を洗浄することが重要であった。従って、この分析は、ＮＴＨｉが粘膜にゆるく付着する場合、アップレギュレートされる遺伝子を含む。ＮＴＨｉは、ＯＭのチンチラモデルにおいて中耳腔内に生物膜を形成することが観察された（Ｅｒｈｌｉｃｈら、ＪＡＭＡ，２８７；１７１０−５，２００２）。本明細書中に記載されるプロトコルがプランクトンの集団から回収されるクローンを選択するので、細菌が粘膜生体膜と関連する場合、遺伝子がアップレギュレートされるクローンを回収することは予期されない。しかし、中耳粘膜の均質化および引き続く細菌細胞の単離によって、本発明者らは、これらのクローンを回収し得る。いくつかのＧＦＰ発現クローンがこの浸出液において回収されたが、剥離した細胞として浸出液中にまたは凝集物中に存在する真核生物細胞に付着したこともあり得る。これらの細菌は、選別効率を損なうことなく浸出液から回収することは困難である。従って、中耳分泌液を粘液溶解剤を用いて処理し、次いで、遠心分離して、標識化する前に、大きな凝集物および真核生物細胞を除去した。
【０１０５】
必要な場合に、チンチラの中耳の分泌液を、滅菌した生理食塩水を用いて２５０μｌまで希釈した。等量のＤＰＢＳ中のＮ−アセチル−Ｌ−システイン（０．５％；ｗ／ｖ）（ｐＨ ７．４）を、粘液溶解剤として室温で５分間添加した（ＭｉｙａｍｏｔｏおよびＢａｋａｌｅｔｚ，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．，２１：３４３〜３５６ １９９６）。分泌液を、細胞の残屑、赤血球、および炎症性細胞を除去するために遠心分離し（３００×ｇ、５分間）、そして細菌を含有する上清を、新しいチューブへ移した。細菌を、ＮＴＨｉ菌株８６−０２８ＮＰに由来する、全ＯＭＰ調製物に対して指向されるチンチラ抗血清（１：５０希釈）と共に、４℃で４５分間インキュベートし、遠心分離（２０００×ｇ、５分間）によってペレット化し、そして０．０５％ウシ血清アルブミンを含有する冷ＤＰＢＳを用いて２回洗浄した。続いて、細菌を、交差反応性フィコプローブ（ｐｈｙｃｏｐｒｏｂｅ）Ｒ−ＰＥ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（１００μｌＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ；Ｂｉｏｍｅｄａ Ｃｏｒｐ）を用いて、４℃で３０分間標識した。非結合の抗体を除去するために連続して３回洗浄し、続いて、細胞を、ＦＡＣＳ分析のために３００μｌ ＤＰＢＳに再懸濁した。
【０１０６】
（実施例６）
（急性中耳炎におけるインビボで誘導したプロモーターの同定）
プロモータートラップライブラリーを用いて形質転換したＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ８６−０２８ＮＰを、チョコレート寒天で一晩増殖させた。インビトロでｇｆｐを発現したプロモーターを含有するこれらクローンを選択するために、上記ライブラリーを、１回のＦＡＣＳ分析に供し（実施例６に記載するように）、低レベル量のＧＦＰを発現しているこれらのクローンのみを回収した。これらのクローンを、プールして、チンチラの中耳の骨胞を経由して（ｔｒａｎｓｂｕｌｌａｒｌｙ）接種するために用いた。注射の２４時間および４８時間の後、細菌含有滲出液を、鼓室または鼓膜の上部の穿刺によって除去した。細菌をＲ−ＰＥ標識化抗体を用いて間接的に標識し、蛍光タグ化された細菌のゲーティングによるが、発現もしている細菌について選別することによってＦＡＣＳ分析に供した。これらのクローンを、さらに富化するために動物を再感染させるために用いた。最終回の選別の後、単一のコロニー単離体を、蛍光の欠如についてインビトロでスクリーニングした。
【０１０７】
インビトロで蛍光を発していなかった、ＦＡＣＳ分析によって単離したこれらのクローン（インビボでＧＦＰ蛍光について陽性）を、プラスミド単離および挿入したＤＮＡ配列の同定のために調製した。これらのクローンを、カナマイシンを含有するチョコレート寒天プレートで一晩増殖させ、製造者のプロトコルに従ってＱｉａｐｒｅｐ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミド単離のために調製した。プラスミド挿入ＤＮＡを、ｇｆｐｍｕｔ３遺伝子に相補的であり、かつ挿入ＤＮＡの下流であるプライマー５’−ＴＧＣＣＣＡＴＴＡＡＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴＡ−３’（配列番号５８８）を用いて配列決定した。配列決定反応を、製造者のプロトコルに従って、ＡＢＩ ｐｒｉｓｍ ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）ターミネーター・サイクル・シークエンシング・レディー・リアクション・キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施した。この配列を次いで、９６ウェル・マルチスクリーンＨＶプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中のセファデックスＧ−５０を通過させることによって精製し、続いてＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ３１００ ＤＮＡアナライザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。
【０１０８】
挿入配列を、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ菌株Ｒｄの注釈をつけた全配列と比較した。菌株Ｒｄとヌクレオチド相同性を有さないこれらの挿入物を続いて、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸアルゴリズムを用いて分析した。さらに配列分析を、ＤＮＡＳＴＡＲ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ）を用いて実施した。正しい向きでかつ推定ＯＲＦの５’側配列を含む挿入物は、ＮＴＨｉ細菌が、チンチラの中耳に存在する場合、優先的に活性化した推定プロモーターを含有した。
【０１０９】
インビボで調節される推定プロモーターを有する５２個のクローンを、単離した。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ菌株Ｒｄに同定された配列と類似する配列を含む４４個の候補クローンの、インビトロおよびインビボでの遺伝子発現の定量的な比較によって、ＮＴＨｉが、チンチラの中耳内に存在する周囲のきっかけに応答する場合、２６個の遺伝子（６０％）がアップレギュレートした遺伝子発現があることを確認した。これらの遺伝子を以下の表４Ａに要約した。遺伝子発現を駆動するインビボ調節プロモーターは、膜輸送、周囲の情報のプロセシング、細胞の代謝、遺伝子調節、および未知の機能を有する仮想タンパク質に関係していると予測される。
【０１１０】
インビボで推定プロモーター候補の誘導を確認するために、ＮＴＨｉ菌株８６−０２８ＮＰが、インビトロで中間対数期まで、またはインビボで４８時間増殖させた場合に、メッセンジャーＲＮＡ発現の相対量を、比較した。このＲＮＡを、製造者のプロトコルに従って、ＴＲＩｚｏｌ ＬＳ試薬（Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて単離した。ＤＮＡを、製造者のプロトコルに従って、ＤＮＡフリー・キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてＲＮＡ調製物から除去した。ＤＮａｓｅ Ｉ処理したＲＮＡサンプルを、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙカラムを通過させることによって精製した。ＲＮＡの純度および完全性を、２６０／２８０ｎｍ分光光度計読み取りおよびＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によってそれぞれ、調べた。
【０１１１】
ＦＡＣＳデータを独立に確認するために、本発明者らは、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって候補遺伝子の相対的な発現を決定した。親株８６−０２８ＮＰを、これらの研究に用いた。製造者の説明書に従って、ワン・ステップＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いるリアル・タイム定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、転写レベルを調べた。簡単に言えば、ＦＡＣＳ分析によって同定した推定上のインビボで誘導されるプロモーターのオープン・リーディング・フレームの下流に作製したプライマーを用いて、遺伝子特異的ｍＲＮＡを、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００シークエンス・ディテクション・システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でのＲＴ−ＰＣＲによって、逆転写し、増幅した。産物の量を、ジャイレース（ｇｙｒ）遺伝子のフラグメントを増幅することによって、既知量の細菌のゲノムＤＮＡ（１０２〜１０７個のゲノムコピーＤＮＡ）について作製した検量線を用いて計算した。ＲＮＡ調製物（−ＲＴコントロール）中にＤＮＡが存在しないことおよび鋳型ＲＮＡのないコントロールサンプル中にプライマーダイマーが無いことを確認するために、コントロールを、同時に分析した。さらに、ＲＴ−ＰＣＲ産物を、ゲル電気泳動によって分析した。全ての場合において、単一の産物を、適切な塩基対サイズで観察した。サンプル間の細菌ＲＮＡの量を、インビトロで本発明者らが試験した種々の増殖条件の下、構成的に発現することを示す、ｇｙｒ発現に対して標準化した。既知量の細菌ゲノムＤＮＡ（１０２〜１０７個のゲノムコピーＤＮＡ）を用いて、ジャイレース（ｇｙｒ）遺伝子のフラグメントを増幅することによるＲＴ−ＰＣＲ定量のための標準曲線を作製した。ジャイレースは、種々の増殖条件の下インビトロで構成的に発現し、そのためサンプル間の全細菌ＲＮＡレベルの標準化のために用いた。インビボでの相対的な遺伝子発現を、インビトロでの遺伝子発現と比較し、倍率増加（ｆｏｌｄ−ｉｎｃｒｅａｓｅ）データを、表４に要約する。
【０１１２】
ＮＴＨｉゲノムの８倍の配列決定は、表４Ａに列挙した大部分の遺伝子についての全長オープン・リーディング・フレームを同定した。表４Ｂは、ＮＴＨｉゲノムおよび対応するアミノ酸配列内の全長ヌクレオチド配列を提供する。遺伝子の誘導倍率は、チンチラの中耳内に存在する周囲のきっかけに起因し、遺伝子の産物または機能を、便宜のために表４Ｂに繰り返す。
【０１１３】
【表４Ａ】
【０１１４】
【表４Ｂ−１】
【０１１５】
【表４Ｂ−２】
（実施例７）
（ビルレンス関連遺伝子の同定）
多くの細菌種において、ビルレンス関連遺伝子のサブセットは、短いリピートの複製における誤りによって調節される。これらのリピートは、遺伝子の５’またはコード配列内であり得、これらの存在は、ビルレンスと関連することを示す遺伝子の制御発現の指標である。リピートの付加または欠失は、特定のビルレンス決定因子の発現または発現を欠く結果を生じる。
【０１１６】
ＮＴＨｉ Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ菌株８６−０２８ＮＰコンティグセットは、短いオリゴヌクレオチド・リピートについて問い合わせた。このリピート周辺の領域を、このリピートに関連する遺伝子を同定するために分析した。表５に、同定したリピートおよび各リピートに関連するＯＲＦ（ＢＬＡＳＴによって同定した）を列挙する。
【０１１７】
さらに配列分析によって、ビルレンス関連遺伝子の全長ヌクレオチド配列およびＯＲＦによってコードされる対応するアミノ酸配列を同定した。誘導したアミノ酸配列は、列挙したＧｅｎｂａｎｋ配列と高い相同性である
【０１１８】
【表５−１】
【０１１９】
【表５−２】
（実施例８）
（独特のＮＴＨｉ遺伝子配列の同定）
ＮＴＨｉ毒性に関連する遺伝子をまた、ＮＴＨｉ細菌属が、組織に感染している場合の遺伝子発現レベルとＮＴＨｉを、人工的な検査室培地で増殖させた場合の同一遺伝子発現レベルとを比較することによって同定した。これらの新規遺伝子を、実施例４〜６の上記プロモーター・トラップ技術を用いて同定し、続いて公知のＲｄゲノムとの比較によってこれらの遺伝子がＮＴＨｉ菌株８６−０２８ＮＰに特有であることを示した。
【０１２０】
このスクリーニング方法を用いて同定したＤＮＡ配列を、配列番号５７７〜５８０として示す。これらの配列は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｄ．ゲノム配列と相同性を有する遺伝子または遺伝子フラグメントを含まなかった。これらは、完全に新規配列であるが、チンチラの中耳におけるＮＴＨｉ感染の間の遺伝子の発現レベルに起因して、これら遺伝子の発現は、ＮＴＨｉ毒性に関係する可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】図１は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ単離物のパネルにおけるＬＫＰ遺伝子領域を示す。８６−０２８ＮＰ株の配列は、この領域において、ＮＴＨｉＲ３００１株における配列と同一である。これらのＮＴＨｉの両方は、血球凝集性線毛をコードするｈｉｆ遺伝子クラスターを欠損している。
【図２】図２は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ単離物のパネルにおけるｒｆａＤ領域を示す。８６−０２８ＮＰ株のゲノムのｒｆａＤ領域における遺伝子の配置は、Ｒｄ株のゲノムの配置と類似するが、検査したほとんどのＮＴＨｉのゲノムにおいて見られるこれらの遺伝子の配置とは異なる。
【図３Ａ】図３Ａ〜図３Ｍは、表４に示されるヌクレオチド配列（配列番号５８９〜６１４）を提示する。これらは、ＯＭ感染の間にアップレギュレートされたと同定された（実施例６を参照のこと）。配列番号１〜５７６として提示される、既知の遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）およびコンティグ配列に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）もまた、示される。
【図３Ｂ】図３Ａ〜図３Ｍは、表４に示されるヌクレオチド配列（配列番号５８９〜６１４）を提示する。これらは、ＯＭ感染の間にアップレギュレートされたと同定された（実施例６を参照のこと）。配列番号１〜５７６として提示される、既知の遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）およびコンティグ配列に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）もまた、示される。
【図３Ｃ】図３Ａ〜図３Ｍは、表４に示されるヌクレオチド配列（配列番号５８９〜６１４）を提示する。これらは、ＯＭ感染の間にアップレギュレートされたと同定された（実施例６を参照のこと）。配列番号１〜５７６として提示される、既知の遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）およびコンティグ配列に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）もまた、示される。
【図３Ｄ】図３Ａ〜図３Ｍは、表４に示されるヌクレオチド配列（配列番号５８９〜６１４）を提示する。これらは、ＯＭ感染の間にアップレギュレートされたと同定された（実施例６を参照のこと）。配列番号１〜５７６として提示される、既知の遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）およびコンティグ配列に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）もまた、示される。
【図３Ｅ】図３Ａ〜図３Ｍは、表４に示されるヌクレオチド配列（配列番号５８９〜６１４）を提示する。これらは、ＯＭ感染の間にアップレギュレートされたと同定された（実施例６を参照のこと）。配列番号１〜５７６として提示される、既知の遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）およびコンティグ配列に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）もまた、示される。
【図３Ｆ】図３Ａ〜図３Ｍは、表４に示されるヌクレオチド配列（配列番号５８９〜６１４）を提示する。これらは、ＯＭ感染の間にアップレギュレートされたと同定された（実施例６を参照のこと）。配列番号１〜５７６として提示される、既知の遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）およびコンティグ配列に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）もまた、示される。
【図３Ｇ】図３Ａ〜図３Ｍは、表４に示されるヌクレオチド配列（配列番号５８９〜６１４）を提示する。これらは、ＯＭ感染の間にアップレギュレートされたと同定された（実施例６を参照のこと）。配列番号１〜５７６として提示される、既知の遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）およびコンティグ配列に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）もまた、示される。
【図３Ｈ】図３Ａ〜図３Ｍは、表４に示されるヌクレオチド配列（配列番号５８９〜６１４）を提示する。これらは、ＯＭ感染の間にアップレギュレートされたと同定された（実施例６を参照のこと）。配列番号１〜５７６として提示される、既知の遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）およびコンティグ配列に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）もまた、示される。
【図３Ｉ】図３Ａ〜図３Ｍは、表４に示されるヌクレオチド配列（配列番号５８９〜６１４）を提示する。これらは、ＯＭ感染の間にアップレギュレートされたと同定された（実施例６を参照のこと）。配列番号１〜５７６として提示される、既知の遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）およびコンティグ配列に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）もまた、示される。
【図３Ｊ】図３Ａ〜図３Ｍは、表４に示されるヌクレオチド配列（配列番号５８９〜６１４）を提示する。これらは、ＯＭ感染の間にアップレギュレートされたと同定された（実施例６を参照のこと）。配列番号１〜５７６として提示される、既知の遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）およびコンティグ配列に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）もまた、示される。
【図３Ｋ】図３Ａ〜図３Ｍは、表４に示されるヌクレオチド配列（配列番号５８９〜６１４）を提示する。これらは、ＯＭ感染の間にアップレギュレートされたと同定された（実施例６を参照のこと）。配列番号１〜５７６として提示される、既知の遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）およびコンティグ配列に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）もまた、示される。
【図３Ｌ】図３Ａ〜図３Ｍは、表４に示されるヌクレオチド配列（配列番号５８９〜６１４）を提示する。これらは、ＯＭ感染の間にアップレギュレートされたと同定された（実施例６を参照のこと）。配列番号１〜５７６として提示される、既知の遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）およびコンティグ配列に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）もまた、示される。
【図３Ｍ】図３Ａ〜図３Ｍは、表４に示されるヌクレオチド配列（配列番号５８９〜６１４）を提示する。これらは、ＯＭ感染の間にアップレギュレートされたと同定された（実施例６を参照のこと）。配列番号１〜５７６として提示される、既知の遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）およびコンティグ配列に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）もまた、示される。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２００３年３月６日出願の米国仮特許出願第６０／４５３，１３４号（これは、その全体が本明細書に参考として援用される）の優先権の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨｉ）ゲノムの類型不能株のポリヌクレオチド配列、そのゲノム内に含まれるＮＴＨｉ遺伝子およびそのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに関する。本発明はまた、ＮＴＨｉ関連障害を処置および予防するワクチンおよび方法を含む、これらのＮＴＨｉポリヌクレオチドおよびＮＴＨｉポリペプチドの使用に関する。本発明はまた、中耳または鼻咽頭のＮＴＨｉ感染の間またはその感染に応じて、アップレギュレートされるＮＴＨｉ遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
中耳炎（ＯＭ）は、全世界で非常に優勢な小児疾患であり、小児が救急室に運ばれる主な原因である（Ｉｎｆａｎｔｅ−Ｒｉｖａｎｄ ａｎｄ Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１５：４４４−４６５，１９９３）。最近の統計では、１９９０年に、ＯＭが原因で２億４５００万回の通院（ｐｈｙｓｉｃｉａｎ ｏｆｆｉｃｅ ｖｉｓｉｔ）があったことが示されている。このことは、１９８０年代において報告されたものより２００％を超えて増大していることを示している。もはや死と関連することは稀であるが、ＯＭと関連する罹患率は、重大である。聴覚喪失は、この疾患と関連する一般的な問題であり、しばしば、小児の行動、教育および言語能力の発達に影響を与える（Ｂａｌｄｗｉｎ，Ａｍ．Ｊ．Ｏｔｏｌ．，１４：６０１−６０４，１９９３；Ｈｕｎｔｅｒｅｔら，Ａｎｎ．Ｏｔｏｌ．Ｒｈｉｎｏｌ．Ｌａｒｙｎｇｏｌ．Ｓｕｐｐｌ．，１６３：５９−６１，１９９４；Ｔｅｅｌｅら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６２：６８５−６９４，１９９０）。ＯＭのその社会経済的な影響もまた大きく、ＯＭを診断および管理する直接的および間接的な費用は、米国単独で年間５０億ドルを超えている（Ｋａｐｌａｎら，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．，１６：Ｓ９−１１，１９９７）。
【０００４】
抗生物質療法は、一般的かつ中耳腔換気用チューブの外科手術による置換は、滲出液を排出すること、感染を除去すること、および中耳に流体が蓄積することと関連する頭痛を緩和することという観点から好結果であったが、多剤耐性細菌の出現およびチューブの置換と関連するその侵襲的性質によって、ＯＭの管理、より好ましくはＯＭの予防に対するより有効かつ容認されたアプローチが必要であることが明らかにされた。慢性ＯＭの外科手術的管理は、小児に全身麻酔をかけている間に、鼓膜を通して中耳腔換気用チューブを挿入することを包含する。この手順は平凡であり（普及率は約１３％である；Ｂｒｉｇｈｔら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ，８３（７）：１０２６−８，１９９３）、蓄積した流体を中耳から排出することによって、痛みの伴う症状を軽減するという点で非常に有効であるが、これは、その手順の侵襲的性質およびその伴う危険性に起因して、数多くの批判を受けている（Ｂｅｒｍａｎら，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，９３（３）：３５３−６３，１９９４；Ｂｒｉｇｈｔら，前出；Ｃｉｍｏｎｓ，ＡＳＭＮｅｗｓ，６０：５２７−５２８；Ｐａａｐ，Ａｎｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．，３０（１１）：１２９１−７，１９９６）。
【０００５】
ワクチン開発における進歩は、７価の莢膜結合体ワクチンであるＰＲＥＶＮＡＲ（登録商標）（ＥｓｋｏｌａおよびＫｉｌｐｉ，Ｐｅｄｒｉａｔｒ．Ｅｆｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．１６：Ｓ７２−７８，２０００）が最近認可および解放されたことによって明らかなように、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＯＭの主な原因となる因子）について最も促進されている（ＡＯＭ）。ＰＲＥＶＮＡＲ（登録商標）は、侵襲性の肺炎球菌疾患に非常に有用であったが、ＯＭについての適用範囲は、そのワクチンに含まれない血清型に起因して、数が増大したＯＭの症例の報告によって期待が裏切られている（６〜８％）（Ｂｌａｃｋら，Ｐｅｄｒｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ Ｊ．，１９：１８７−１９５；Ｅｓｋｏｌａら，Ｐｅｄｒｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ Ｊ．，１９：Ｓ７２−７８，２０００；Ｅｓｋｏｌａら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ Ｍｅｄ．３４４：４０３−４０９，２００１；Ｓｎｏｗら，Ｏｔｏｌ．Ｎｅｕｒｏｔｏｌ．，２３：１−２，２００２）。類型不可Ｈａｅｍｏｐｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨｉ）（滲出液を伴う慢性ＯＭ中で優勢なグラム陰性病原体（Ｋｌｅｉｎ，Ｐｅｄｒｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ Ｊ．，１６：Ｓ５−８，１９９７；Ｓｐｉｎｏｌａら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１５４：１００−１０９，１９８６））については、あまり進歩していない。ＮＴＨｉに対する有効なワクチン開発の妨害は、ＮＴＨｉ誘導性中耳疾患の病原の現在の不完全な理解である。この遅れの一因は、その疾患が、良性鼻咽頭共生生物の宿主の免疫学的寛容性のうちの１つから進行するので、微生物が発現する毒性因子と宿主の免疫応答との間の動的な相互作用の理解が欠如していることであり、通常は無菌の中耳腔の日和見的な侵入物に対する活発な防御反応の欠如に起因している。
【０００６】
現在では、小児においてＮＴＨｉがどのようにＯＭを引き起こすかということの理解は乏しい。ＯＭの誘導に必要な推定毒性因子の同定は、その宿主−病原体相互作用の理解、最終的には、潜在的なワクチン候補および化学療法の標的の同定に大きく寄与する。中耳炎の管理、好ましくは、その予防により有効かつ容認されたアプローチを開発することは非常に必要とされている。ワクチン開発は、この目的を達成するための非常に有望なかつ費用効果的な方法である（Ｇｉｅｂａｎｋ，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ Ｊ．，１３（１１）：１０６４−８，１９９４：Ｋａｒｍａら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｄｒｉｔｒ．Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌ．，３２（Ｓｕｐｐｌ．）：Ｓ１２７−３４，１９９５）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ＮＴＨｉであるＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株８６−０２８ＮＰのゲノム配列の同定および特徴付け、ならびにこれらによりコードされるポリペプチド配列を提供する。ＮＴＨｉゲノム配列の三倍分析（３−ｆｏｌｄ ａｎａｌｙｓｉｓ）を、配列番号１〜５７６として示される一連のコンティグ配列において設定し、その後のゲノム配列の八倍分析（８−ｆｏｌｄ ａｎａｌｙｓｉｓ）を、配列番号６７５〜６８５として示される一連の１１個のコンティグ配列において設定する。これらのコンティグは、稀なデータであり、当業者は、重複する配列を比較して、慣用的な方法を使用して、ＮＴＨｉ株８６−０２８ＮＰの完全ゲノムを構築することによって、これらのコンティグを組み立て得る。
【０００８】
本発明はまた、本発明のＮＴＨｉポリペプチドに特異的な抗体を提供する。ヒトにおいて、またはサンプル（例えば、血清、精液、耳からの分泌液（ｅａｒ ｆｌｕｉｄ）、血液、尿、リンパ液および脳脊髄液）において、ＮＴＨｉ細菌を検出する方法が、企図される。これらの方法は、ＮＴＨｉポリヌクレオチドを、特異的ポリヌクレオチドプローブで検出する工程、またはＮＴＨｉポリペプチドを特異的抗体で検出する工程を包含する。本発明はまた、ＮＴＨｉ細菌を検出するこれらの方法を利用する診断キットを企図する。
【０００９】
本発明はまた、本発明のＮＴＨｉポリペプチドまたはそのＮＴＨｉペプチドを投与することによって、免疫応答を誘発する方法を企図する。これらの方法は、ＮＴＨｉポリペプチドまたはＮＴＨｉペプチドを、ＮＴＨｉ感染によって引き起こされる疾患（例えば、ＯＭ）の処置および／または予防のためのワクチンとして投与する工程を包含する。以下のＮＴＨｉ遺伝子は、中耳および／または鼻咽頭の感染の間またはその感染に応答してアップレギュレートされ；これらの遺伝子によってコードされるポリペプチドおよびそのペプチドは、あり得るＯＭワクチン候補および／または化学療法の標的として企図される：ｈｉｓＢ、ｌｐｐＢ、ｓａｐＡ、ｌｏｌＡ、ｒｂｓＣ、ｐｕｒＥ、ｒｉｂＢ、ａｒｃＢ、ｕｘｕＡ、ｄｓｂＢ、ｕｒｅＨ、ｌｉｃＣ、ＨＩ１６４７、ｉｓｐＺ、ｒａｄＣ、ｍｕｋＦ、ｇｌｐＲ、ｉｈｆＢ、ａｒｇＲ、ｃｓｐＤ、ＨＩ００９４、ＨＩ１１６３、ＨＩ１０６３、ＨＩ０６６５、ＨＩ１２９２、ＨＩ１０６４。ＮＴＨｉ ｈｉｓＢ遺伝子は、配列番号６１５のヌクレオチド配列として表され、配列番号６１６として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ｓａｐＡ遺伝子は、配列番号６１７のヌクレオチド配列として表され、配列番号６１８として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ｒｂｓＣ遺伝子は、配列番号６１９のヌクレオチド配列として表され、配列番号６２０として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ｐｕｒＥ遺伝子は、配列番号６２１のヌクレオチド配列として表され、配列番号６２２として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ｒｉｂＢ遺伝子は、配列番号６２３のヌクレオチド配列として表され、配列番号６２４として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ａｒｃＢ遺伝子は、配列番号６２５のヌクレオチド配列として表され、配列番号６２６として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ｕｘｕＡ遺伝子は、配列番号６２７のヌクレオチド配列として表され、配列番号６２８として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ｄｓｂＢ遺伝子は、配列番号６２９のヌクレオチド配列として表され、配列番号６３０として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ｕｒｅＨ遺伝子は、配列番号６３１のヌクレオチド配列として表され、配列番号６３２として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ｌｉｃＣ遺伝子は、配列番号６３３のヌクレオチド配列として表され、配列番号６３４として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ＨＩ１６４７遺伝子は、配列番号６３５のヌクレオチド配列として表され、配列番号６３６として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ｉｓｐＺ遺伝子は、配列番号６３７のヌクレオチド配列として表され、配列番号６３８として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ｒａｄＣ遺伝子は、配列番号６３９のヌクレオチド配列として表され、配列番号６４０として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ｍｕｋＦ遺伝子は、配列番号６４１のヌクレオチド配列として表され、配列番号６４２として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ｇｌｐＲ遺伝子は、配列番号６４３のヌクレオチド配列として表され、配列番号６４４として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ｉｈｆＢ遺伝子は、配列番号６４５のヌクレオチド配列として表され、配列番号６４６として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ａｒｇＲ遺伝子は、配列番号６４７のヌクレオチド配列として表され、配列番号６４８として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ｃｓｐＤ遺伝子は、配列番号６４９のヌクレオチド配列として表され、配列番号６５０として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ＨＩ１１６３遺伝子は、配列番号６５１のヌクレオチド配列として表され、配列番号６５２として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ＨＩ１０６３遺伝子は、配列番号６５３のヌクレオチド配列として表され、配列番号６５４として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ＨＩ０６６５遺伝子は、配列番号６５５のヌクレオチド配列として表され、配列番号６５６として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ＨＩ１２９２遺伝子は、配列番号６５７のヌクレオチド配列として表され、配列番号６５８として表されるアミノ酸配列をコードする。
【００１０】
配列番号１〜５７６、配列番号６７５〜６８５として示されるポリヌクレオチド配列ならびに表４および表４Ｂにおいて示されるポリヌクレオチド配列中に含まれる新規なＮＴＨｉ遺伝子はまた、中耳および／または鼻咽頭の感染の間にアップレギュレートされ、従って、ＯＭワクチン候補および／または化学療法の標的をコードすると予測される。さらに、以下のＮＴＨｉ遺伝子は、毒性関連遺伝子であると予測され、従って、あり得るＯＭワクチン候補および／または化学療法の標的をコードすることが予測される：ＨＩ１３８６、ＨＩ１４６２、ＨＩ１３６９、ｌａｖ、ＨＩ１５９８。ＮＴＨｉ ＨＩ１３８６遺伝子配列は、配列番号６５９として表され、配列番号６６０として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ＨＩ１４６２遺伝子配列は、配列番号６６１として表され、配列番号６６２として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ＨＩ１３６９遺伝子配列は、配列番号６６５として表され、配列番号６６６として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ｌａｖ遺伝子配列は、配列番号６６３として表され、配列番号６６４として表されるアミノ酸配列をコードする。ＮＴＨｉ ＨＩ１５９８遺伝子配列は、配列番号６６９および配列番号６７１として表され、配列番号６７０および配列番号６７２として表されるアミノ酸配列をコードする。毒性と関連したさらなるＮＴＨｉ遺伝子としては、配列番号６６７および配列番号６７３として示されるポリヌクレオチド配列が挙げられる。
【００１１】
ＮＴＨｉ感染を処置または予防する方法として、本発明は、その感染の間にアップレギュレートまたは活性になるＮＴＨｉポリペプチドの発現または活性を阻害する分子を投与することを企図する。特に、本発明は、ＮＴＨｉ感染を処置または予防する方法を企図し、この方法は、ＮＴＨｉ感染の間にアップレギュレートされるＮＴＨｉ遺伝子に特異的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することによって、ＮＴＨｉタンパク質発現を調節する工程を包含する。このような遺伝子としては、ｈｉｓＢ、ｌｐｐＢ、ｓａｐＡ、ｌｏｌＡ、ｒｂｓＣ、ｐｕｒＥ、ｒｉｂＢ、ａｒｃＢ、ｕｘｕＡ、ｄｓｂＢ、ｕｒｅＨ、ｌｉｃＣ、ＨＩ１６４７、ｉｓｐＺ、ｒａｄＣ、ｍｕ、ｇｌｐＲ、ｉｈｆＢ、ａｒｇＲ、ｃｓｐＤ、ＨＩ００９４、ＨＩ１１６３、ＨＩ１０６３、ＨＩ０６６５、ＨＩ１２９２、ＨＩ１０６４が挙げられる。本発明はまた、ＮＴＨｉ感染を処置または予防する方法を企図し、この方法は、これらの遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を調節する抗体または低分子を投与する工程を包含する。配列番号１〜５７６、配列番号６７５〜６８５として示されるポリヌクレオチド配列ならびに表４および表４Ｂに示されるヌクレオチド配列に含まれる新規なＮＴＨｉ遺伝子もまた、中耳および／または鼻咽頭の感染の間にアップレギュレートされ、従って、これらのポリヌクレオチド配列に特異的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた、企図される。
【００１２】
（本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド）
本発明は、ＮＴＨｉ株８６−０２８ＮＰゲノムの配列を提供する。このゲノム配列は、本明細書中で「コンティグ１〜５７６」として表される一連のコンティグ配列として示される。各コンティグは、その「コンティグ番号」と関連して配列識別番号を割り当てられる。従って、本発明のコンティグは、配列番号１〜５７６として表される。これらのコンティグポリヌクレオチド配列は、慣用的な方法を使用して、ＮＴＨｉ株８６−０２８ＮＰの完全ゲノム配列に組み立てられ得る。ＮＴＨｉ株８２−０２８ＮＰゲノムの八倍配列分析の完了の際に、そのゲノム配列は、配列番号６７５〜６８５として本明細書中で表される１１のコンティグに組み立てられた。
【００１３】
本発明は、ＮＴＨｉポリヌクレオチド配列および配列番号１〜５７６、配列番号６７５〜６８５のコンティグ内に含まれるオープンリーディングフレーム、ならびに表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示されるヌクレオチド配列を提供する。本発明はまた、本発明のＮＴＨｉポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列（例えば、表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示されるアミノ酸配列）を提供する。本発明は、（ａ）配列番号１〜５７６のヌクレオチド配列の相補体；配列番号６７５〜６８５のヌクレオチド配列の相補体および本明細書中の表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示されるヌクレオチド配列の相補対；（ｂ）上記のポリヌクレオチドの対立遺伝子改変体であるポリヌクレオチド；（ｃ）上記のタンパク質のいずれかの種ホモログをコードするポリヌクレオチド；あるいは（ｄ）本発明のＮＴＨｉポリペプチドの特定のドメインまたは短縮を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。
【００１４】
本発明のＮＴＨｉポリヌクレオチドはまた、上記のポリヌクレオチドに実質的に等価なヌクレオチド配列を包含する。本発明に従うポリヌクレオチドは、上記のＮＴＨｉポリヌクレオチドに対して、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より代表的には、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％、およびより代表的には、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。
【００１５】
本発明の核酸配列の範囲内に含まれるのは、配列番号１〜５７６、配列番号６７５〜６８５のＮＴＨｉヌクレオチド配列、ならびに本明細書中の表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示されるヌクレオチド配列、またはそれらの相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列フラグメントであり、これらのフラグメントは、約５ヌクレオチドより大きく、好ましくは７ヌクレオチド、より好ましくは、９ヌクレオチドより大きく、最も好ましくは１７ヌクレオチドより大きい。例えば、選択的な（すなわち、本発明のポリヌクレオチドのいずれか１つに特異的にハイブリダイズする）１５ヌクレオチド以上、１７ヌクレオチド以上、または２０ヌクレオチド以上のフラグメントが、企図される。ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズし得るプローブは、本発明のＮＴＨｉポリヌクレオチド配列を、遺伝子の同じファミリーにおける他のポリヌクレオチド配列から区別することができるか、またはＮＴＨｉ遺伝子を他の細菌遺伝子から区別することができ、より好ましくは、独特のヌクレオチド配列に基づく。
【００１６】
用語「ストリンジェント」とは、当該分野でストリンジェントとして一般に理解されている条件をいうために使用される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、原理的に、温度、イオン強度、および変性剤（例えば、ホルムアミド）の濃度によって決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄のためのストリンジェントなじょう件の例は、６５〜６８℃での０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウムまたは４２℃での０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および５０％ ホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）を参照のこと。よりストリンジェントな条件（例えば、より高温、より低いイオン強度、より高いホルムアミドもしくは他の変性剤）もまた、使用され得るが、ハイブリダイゼーションの速度は影響を受ける。デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが考慮される場合において、さらなる例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、３７℃（１４塩基オリゴについて）、４８℃（１７塩基オリゴについて）、５５℃（２０塩基オリゴについて）および６０℃（２３塩基オリゴについて）での６×ＳＳＣ ０．０５％ リン酸ナトリウム中での洗浄が挙げられる。
【００１７】
他の薬剤は、非特異的ハイブリダイゼーションかつ／またはバックグラウンドハイブリダイゼーションを減少させる目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液中に含まれ得る。例は、０．１％ ウシ血清アルブミン、０．１％ ポリビニル−ピロリドン、０．１％ ピロリン酸ナトリウム、０．１％ ドデシル硫酸ナトリウムＮａＤｏｄＳＯ４（ＳＤＳ）、フィコール、デンハルト溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（または他の非相補的ＤＮＡ）、および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を及ぼすことなく、変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で行われるが、代表的なイオン強度条件では、ハイブリダイゼーションの速度は、ｐＨとはほとんど関係ない。Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｈ．４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。ハイブリダイゼーション条件は、これらの変数を適合させ、異なる配列関連性のＤＮＡにハイブリッドを形成させるために、当業者によって調節され得る。
【００１８】
本発明の範囲内にある配列は、これらの特定の配列に限定されず、それらの対立遺伝子および種改変体もまた包含する。対立遺伝子および種改変体は、配列番号１〜５７６、配列番号６７５〜６８５に示される配列、および本明細書中の表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示されるヌクレオチド配列（好ましくはそれらのオープンリーディングフレーム、それらの代表的なフラグメント）、あるいは配列番号１〜５７６、配列番号６７５〜６８５に示される配列および本明細書中の表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一（好ましくは９５％同一）のヌクレオチド配列を、同種の別の単離体に由来する配列と比較することによって規定どおりに決定され得る。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラムとしては、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１２：３８７、１９８４；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０、１９９０）が挙げられる）が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）および他の供給元（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）から公的に入手可能である。公知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性を決定するために使用され得る。
【００１９】
さらに、コドン可変性に適応するために、本発明は、同じアミノ酸配列をコードする核酸分子を包含し、本明細書中に開示される特定のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）もまた包含する。換言すると、ＯＲＦのコード領域において、あるコドンの、同じアミノ酸をコードする別のコドンへの置換は、明示的に包含される。
【００２０】
本発明の単離されたポリペプチドとしては、以下：
配列番号１〜５７６、配列番号６７５〜６８５として示されるポリヌクレオチド配列に含まれるヌクレオチドならびに表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、あるいは対応する全長タンパク質または成熟タンパク質
を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のポリペプチドとしては、本明細書中の表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示される配列番号６１６、配列番号６１８、配列番号６２０、配列番号６２２、配列番号６２４、配列番号６２６、配列番号６２８、配列番号６３０、配列番号６３２、配列番号６３４、配列番号６３６、配列番号６３８、配列番号６４０、配列番号６４２、配列番号６４４、配列番号６４６、配列番号６４８、配列番号６５０、配列番号６５２、配列番号６５４、配列番号６５６、配列番号６５８、配列番号６６０、配列番号６６２、配列番号６６４、配列番号６６６、配列番号６６８、配列番号６７０、配列番号６７２、配列番号６７４、配列番号６８７、配列番号６８９、配列番号６９１、配列番号６９３、配列番号６９５、配列番号６９７、配列番号６９９、配列番号７０１、配列番号７０３、配列番号７０５、配列番号７０７、配列番号７０９、配列番号７１１、配列番号７１３、配列番号７１５、配列番号７１７、配列番号７１９、配列番号７２１、配列番号７２３、配列番号７２５、配列番号７２７、配列番号７２９、配列番号７３１、配列番号７３３、配列番号７３５、配列番号７３７、配列番号７３９、配列番号７４１、配列番号７４３、配列番号７４５、配列番号７４７、配列番号７４９、配列番号７５１、配列番号７５３、配列番号７５５、配列番号７５７、配列番号７５９、配列番号７６１、配列番号７６３、配列番号７６５、配列番号７６７、配列番号７６９または配列番号７７１のアミノ酸配列が挙げられる。
【００２１】
本発明のポリペプチドはまた、好ましくは以下：
（ａ）配列番号１〜５７６、配列番号６７５〜６８５として示されるヌクレオチド配列ならびに表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示されるヌクレオチド配列に含まれるオープンリーディングフレーム、あるいは
（ｂ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）のポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチド
によってコードされる生物学的活性または免疫学的活性を有するポリペプチドを包含する。
【００２２】
本発明はまた、本発明のアミノ酸配列の生物学的また免疫学的に活性な改変体；ならびに生物学的活性および／または免疫学的活性を保持するそれらの「実質的な等価物」（例えば、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、代表的には、少なくとも約９５％、９６％、９７％、より代表的には、少なくとも約９８％、または最も代表的には、少なくとも約９９％アミノ酸同一性を有するもの）を提供する。対立遺伝子改変体によってコードされるポリペプチドは、配列番号１〜５７６、配列番号６７５〜６８５に示されるヌクレオチド配列ならびに本明細書中で表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示されるヌクレオチド配列に含まれるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、および本明細書中で表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと比較して、類似の、増加した活性もしくは減少した活性を有し得る。
【００２３】
ＮＴＨｉペプチドとは、配列番号１〜５７６、配列番号６７５〜６８５に示されるヌクレオチド配列あるいは本明細書中で表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＮＴＨｉポリペプチドのフラグメント、および本明細書中で表３Ｂ、表４Ｂおよび表５に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメントをいう。好ましいＮＴＨｉペプチドは、生物学的および／または免疫学的に活性である。
【００２４】
本発明はさらに、本発明のＮＴＨｉ核酸フラグメントまたは本発明の核酸フラグメントの縮重改変体によってコードされる、単離されたＮＴＨｉポリペプチドまたはＮＴＨｉペプチドを提供する。用語「変性改変体」とは、ヌクレオチド配列により本発明の核酸フラグメント（例えば、ＯＲＦ）とは異なるが、遺伝暗号の縮重に依存してＮＴＨｉポリペプチド配列をコードするヌクレオチドフラグメントをいう。本発明の好ましい核酸フラグメントは、タンパク質をコードするＯＲＦである。
【００２５】
本発明はまた、ＮＴＨｉポリペプチドを提供し、このＮＴＨｉポリペプチドは、そのポリペプチドの生物学的活性および／または免疫学的活性に影響を及ぼさない１以上の保存的アミノ酸置換を有する。あるいは、本発明のＮＴＨｉポリペプチドは、保存的アミノ酸置換を有することを包含し、この保存的アミノ酸置換は生物学的活性を変化させても変化させなくてもよい。用語「保存的アミノ酸置換」とは、その置換位置においてアミノ酸の極性または電荷にほとんど影響を及ぼさないかもしくは全く影響を及ぼさないように、ネイティブでない残基（天然のアミノ酸および非天然のアミノ酸が挙げられる）を有する天然のアミノ酸残基の置換をいう。例えば、保存的置換は、ポリペプチド中の無極性残基の、任意の他の無極性残基との交換から生じる。さらに、ポリペプチド中の任意のネイティブな残基もまた、「アラニンスキャニング変異誘発」の方法に従って、アラニンに置換され得る。天然のアミノ酸は、以下：
塩基性：アルギニン、リジン、ヒスチジン；
酸性：グルタミン酸、アルパラギン酸；
無電荷で極性：グルタミン、アスパラギン、セリン、スレオニン、チロシン；および
無極性：フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、グリシン、アラニン、バリン、プロリン、メチオニン、ロイシン、ノルロイシン、イソロイシン
のように、それらの側鎖に基づいて特徴付けられる。アミノ酸置換についての一般的な規定は、以下の表１に記載されている。
【００２６】
【表１】
ＮＴＨｉポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して相補的なアンチセンスポリヌクレオチドもまた、提供される。
【００２７】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドが、増幅または発現のためにベクターに挿入され得ることを包含する。発現のために、ポリヌクレオチドは、必要に応じて、適切な発現制御配列（例えば、プロモーター配列およびポリアデニル化シグナル配列）に連結される。本発明のポリヌクレオチドを含む細胞が、さらに提供される。例示的な真菌宿主としては、Ｅ．Ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａおよびＳｅｒｒａｔｉａのような細菌が挙げられる。
【００２８】
用語「単離された」とは、それが天然に存在する環境から取り出され、かつそれが天然に存在する環境の他の成分を実質的に含まない実体をいう。例えば、ポリペプチドは、他の細胞タンパク質から分離されるか、またはＤＮＡは、それが天然に生じるゲノムにおいてそれに隣接する他のＤＮＡから分離される。
【００２９】
（抗体および免疫応答を誘発するための方法）
本発明は、ＮＴＨｉポリペプチドに特有の（すなわち、ＮＴＨｉポリペプチドに特異的な）抗原性エピトープに結合する抗体を提供する。また、複数のＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅサブタイプ間で共通だが、任意の他の抗原性エピトープに関して特有である抗原性エピトープに結合する抗体が提供される。その抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、それらの特有のエピトープに結合する能力を保持する抗体フラグメント（例えば、Ｆｖフラグメント、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ）２フラグメント）、一本鎖抗体およびヒト抗体もしくはヒト化抗体であり得る。抗体は、当該分野で標準的な技術によって生成され得る。
【００３０】
当該分野において、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの莢膜多糖類に対する抗体が、インビトロアッセイで細菌を殺す能力を示すことが公知である。これらの抗体はまた、動物モデル系において、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅを用いるチャレンジから保護することが公知である。これらの研究は、莢膜多糖類に対する抗体がヒトにおいて防御免疫反応を誘導する可能性を有することを示す。本発明は、本発明のＮＴＨｉポリペプチドおよびそれらのフラグメントに特異的な抗体を提供し、それは、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ細菌を殺す活性およびヒトをＮＴＨｉ感染から守る活性の両方を示す。本発明はまた、本発明のＮＴＨｉポリペプチドに特異的な抗体を提供し、それは、毒性を減少し、付着を阻害し、細胞分裂を阻害し、そして／あるいはＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ細菌の上皮への侵入を阻害するかまたはＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ細菌の食作用を促進する。
【００３１】
インビトロ補体媒介性殺菌アッセイシステム（Ｍｕｓｈｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３９：２９７−３０４、１９８３；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５１：３１−３８、１９７２）が、抗ＮＴＨｉ抗体の殺菌活性を測定するために使用され得る。ＮＴＨｉポリペプチドおよびＮＴＨｉペプチドの防御抗体反応を誘導する活性におけるさらなるデータは、本明細書中に記載されるチンチラモデル系のような感染の動物モデルを使用することによって、生成され得る。
【００３２】
ＮＴＨｉのエピトープに対して予備形成された抗体（例えば、ＮＴＨｉ、ＯＭＰ、ＬＯＳまたは非被膜タンパク質に対する抗体）の投与を介する受動免疫治療によって宿主に短期間の防御を与えることもまた、可能である。従って、意図されたワクチン処方物が、受動免疫治療で使用するための抗体を産生するために使用され得る。ヒト免疫グロブリンがヒト医薬では好ましい。なぜなら、異種免疫グロブリンは、その外来の免疫原成分に対して免疫応答を誘発し得るからである。そのような受動免疫付与は、特別な危険性に曝された非免疫性の個体の即時的保護のための緊急性を根拠に使用され得る。あるいは、これらの抗体は、抗イディオタイプ抗体の産生に使用され得、それは次にＮＴＨｉエピトープに対する免疫応答を刺激するための抗体として使用され得る。
【００３３】
本発明は、個体においてＮＴＨｉに対する免疫応答を誘導する方法を包含する。これらの方法は、ＮＹＨｉ細菌を殺す免疫応答、および細胞へのＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ付着をブロックする免疫応答を包含する。１つの実施形態において、その方法は、本発明のＮＴＨｉタンパク質またはＮＴＨｉペプチドを含む組成物の免疫原性用量を投与する工程を包含する。別の実施形態において、その方法は、本発明のＮＴＨｉタンパク質またはＮＴＨｉペプチドを発現する細胞を含む組成物の免疫原性用量を投与する工程を包含する。なお別の実施形態において、その方法は、本発明のＮＴＨｉタンパク質またはＮＴＨｉペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物の免疫原性用量を投与する工程を包含する。そのポリヌクレオチドは、任意の他の核酸とは無関係の裸の（ｎａｋｅｄ）ポリヌクレオチドであっても、プラスミドまたはウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルスベクターまたはアデノウイルスベクター）のようなベクター中に存在していてもよい。組成物の投与は、当該分野で標準的な経路（例えば、非経口、静脈内、経口、口腔、鼻、肺、直腸、または膣）によってであり得る。その方法は、単一の個体において組み合わせて使用され得る。その方法は、個体のＮＴＨｉ感染前または感染後に使用され得る。
【００３４】
「免疫学的用量」は、上記個体をＮＴＨｉ感染（特に、中耳および／または鼻咽頭もしくは下気道のＮＴＨｉ感染）から守るために抗体免疫応答および／またはＴ細胞免疫応答を発生させるのに十分な用量である。そのような免疫学的応答が細菌複製を遅延させる方法もまた、提供される。本発明のさらなる局面は、免疫学的組成物に関し、それは、個体に取り込まれた場合に免疫学的応答を誘導し得るかまたは誘導する。その免疫学的応答は、治療的または予防的に使用され得、そしてＣＴＬまたはＣＤ４＋ Ｔ細胞から生じるような抗体免疫または細胞免疫の形態を取り得る。ＮＴＨｉタンパク質またはその抗原性ペプチドは、補タンパク質と融合され得、その補タンパク質は、それ自体抗体を産生し得ないが、第１のタンパク質を安定化し得、そして免疫原性特性および保護特性を有する融合タンパク質を生成し得る。従って、融合組換えタンパク質は、好ましくは、免疫原性の補タンパク質（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはβ−ガラクトシダーゼ、タンパク質を可溶化させその生成および精製を促進する比較的大きな補タンパク質）をさらに含む。さらに、補タンパク質は、免疫系の一般的な刺激を提供するという意味でアジュバントとして作用し得る。補タンパク質は、第１のタンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに結合し得る。本発明のポリヌクレオチドまたはその免疫原性ペプチドによってコードされるＮＴＨｉポリペプチドを含む組成物（特にワクチン組成物）、および方法が、本発明によって提供される。
【００３５】
本発明は、それに対応して、ＮＴＨｉ感染に対する免疫応答を誘導するのに適切な組成物を提供し、ここで、誘導される抗体は、宿主細胞へのＮＴＨｉ細菌の結合をブロックする。その組成物は、本発明のＮＴＨｉタンパク質もしくはＮＴＨｉペプチド、ＮＴＨｉポリペプチドを発現する細胞、またはそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。その組成物はまた、キャリアおよびアジュバントのような他の成分を含み得る。
【００３６】
中耳および／または鼻咽頭のＮＴＨｉ感染においてアップレギュレートされる遺伝子、ならびにＮＴＨｉ毒性に関連する遺伝子が、本明細書中に記載される。これらのＮＴＨｉ遺伝子によってコードされるそれらのポリペプチドおよびペプチドは、ＯＭのようなＮＴＨｉ感染に関連する障害を処置または予防するために免疫応答を誘導するのに有用であることが意図される。これらの遺伝子によってコードされるポリペプチドのいくつかとしては、以下が挙げられる：ヒスチジン生合成タンパク質、リポタンパク質Ｂ、ペプチドＡＢＣトランスポーター、ペリプラスムＳａｐＡ前駆体、外膜リポタンパク質キャリアタンパク質前駆体、リボース輸送系パーミアーゼタンパク質、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼ触媒性サブユニット、ＰｕｒＥ、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼ触媒性サブユニット、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ、マンノネートデヒドラターゼ、ジスルフィドオキシドレダクターゼ、ウレアーゼ補タンパク質、ホスホコリンシチジリルトランスフェラーゼ、推定ピリドキシン生合成タンパク質、一重項酸素耐性タンパク質、細胞内隔壁タンパク質（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｅｐｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＤＮＡ修復タンパク質、ＭｕｋＦタンパク質、グリセロール−３−ホスフェートレギュロンリプレッサー、融合宿主因子βサブユニット、アルギニンリプレッサー、低温ショック様タンパク質、ストレス反応タンパク質、ＬｉｃＡ、ＭｕｋＦ、ＲａｄＡおよびＨＩ００９４、ＨＩ１１６３、ＨＩ０６６５、ＨＩ１２９２、ＨＩ１０６４、ＨＩ１８６、ＨＩ０３５２遺伝子によってコードされるそれらの仮想タンパク質。ＮＴＨｉ ＯＭＰ、ＬＯＳおよび非被膜タンパク質もまた、ＮＴＨｉ感染に関連する障害の予防および処置のための免疫応答を誘導すると意図される。
【００３７】
本発明の組成物の「免疫原性用量」は、投与前に検出可能な免疫応答と比較してか、または投与前の標準的な免疫応答と比較して、投与後に、検出可能な体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を生じる用量である。本発明は、方法から生じる免疫応答が、予防的および／または治療的であり得ることを意図する。
【００３８】
本発明は、個体において宿主細胞に対するＮＴＨｉ細菌の結合をブロックする方法を包含する。その方法は、ＮＴＨｉ細胞の付着の結合をブロックする本発明の抗体またはポリペプチドを投与する工程を包含する。あるいは、ＮＴＨｉ細胞付着の結合をブロックする１以上の低分子の投与が意図される。インビトロアッセイは、本発明の抗体、ポリペプチドまたは低分子がＮＴＨｉ細胞付着をブロックする能力を示すために使用され得る。
【００３９】
ＮＴＨｉ細胞の付着をブロックする本発明の抗体、本発明のポリペプチドおよび／または本発明の低分子を含む薬学的組成物が提供される。その薬学的組成物は、上記の活性成分のうちの１つ単独からなっても、上記の活性成分の組み合わせを含んでも、細菌感染を処置するために使用されるさらなる活性成分を含んでもよい。その薬学的組成物は、薬学的に有効なキャリアのような１以上のさらなる成分を含み得る。薬学的組成物の投与の投薬量および頻度は、標準的な技術によって決定され、例えば、個体の体重および年齢、投与経路、ならびに症状の重篤度に依存する。薬学的組成物の投与は、当該分野で標準的な経路（例えば、非経口、静脈内、経口、口腔、鼻、肺、直腸、または膣）によってであり得る。
【００４０】
個体におけるＮＴＨｉ感染を検出するための方法もまた、提供される。１つの実施形態において、これらの方法は、サンプル中の本発明のＮＴＨｉポリヌクレオチドに特異的に結合するプライマーまたはプローブを使用して、そのポリヌクレオチドを検出する工程を包含する。そのポリヌクレオチドの検出は、例えば、ハイブリダイゼーションおよびＰＣＲに関連する当該分野での多くの技術的慣用法によって達成され得る。
【００４１】
本発明の抗体はまた、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの感染が疑われる個体の種々の体液中でＮＴＨｉ抗原（ＮＴＨｉポリペプチドおよびそのペプチド）を検出するための診断アッセイにおける用途のための試薬を提供するのに使用され得る。別の実施形態において、本発明のＮＴＨｉタンパク質およびＮＴＨｉペプチドは、種々の患者の組織および体液中でのＮＴＨｉの検出のためのイムノアッセイにおける抗原として使用され得る。これらの組織および流体としては、血液、血漿、耳滲出液（ｅａｒ ｆｌｕｉｄ）、脊髄液、唾、尿、リンパ液、および脳髄液が挙げられるが、これらの限定されない。本発明の抗原は、当該分野で公知のイムノアッセイのいずれかにおいて使用され得る。これらのイムノアッセイとしては、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ、サンドウィッチアッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、発光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイおよび免疫電気泳動アッセイが挙げられるが、これらの限定されない。
【００４２】
（ワクチン化学療法標的）
本発明の１つの局面は、個体（特に哺乳類）における免疫応答を誘導するための方法に関連し、この方法は、ＮＴＨｉ抗原タンパク質またはそれらの抗原性ペプチドをその個体に接種する工程を包含する。
【００４３】
本発明はまた、本発明の免疫原性組換えＮＴＨｉタンパク質またはＮＴＨｉペプチドを適切なキャリアとともに含むワクチン処方物を提供する。ワクチン候補および／または化学療法の標的として企図される、ＮＴＨｉポリペプチドおよびそれらのペプチドとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ヒスチジン生合成タンパク質、リポタンパク質Ｂ、ペプチドＡＢＣトランスポータ、ペリプラズムＳａｐＡ前駆体、外膜リポタンパク質キャリアタンパク質前駆体、リボース輸送系透過酵素タンパク質、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシレース触媒サブユニット、ＰｕｒＥ、３，４−ジヒドロキシ（ｈｙｄｒｏｘｔ）−２−ブトン４−ホスフェートシンターゼ、オミニチンカルバモリルトランスフェラーゼ、マンノエートデヒドラターゼ、ジスルフィドオキヒドレダクターゼ、ウレーゼ、オミチンカルバモリルトランスフェラーゼ（ｏｍｉｔｈｉｎｅ ｃａｒｂａｍｏｌｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、マンノネートデヒドラターゼ（ｍａｎｎｏｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）、ジスフィドオキシドレダクターゼ（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、ウレアーゼ修飾タンパク質（ｕｒｅａｓｅ ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ホスホコリンシチジリトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｓｈｏｃｈｏｌｉｎｅ ｃｙｔｉｄｙｌｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、推定ピリドキシン生合成タンパク質、一重項酸素耐性タンパク質（ｓｉｎｇｌｅｔ ｏｘｙｇｅｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、細胞内隔膜タンパク質（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｅｐｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＤＮＡ修復タンパク質、ＭＵＫＦタンパク質、グリセロール−３−ホスフェートレギュロンリプレッサー、組込み宿主因子βサブユニット、アルギニンリプレッサー、冷ショック様タンパク質、ストレス応答性タンパク質、ＬｉｃＡ、ＲａｄＡ、ならびにＨＩ００９４遺伝子、ＨＩ１１６３遺伝子、ＨＩ０６６５遺伝子、ＨＩ１２９２遺伝子、ＨＩ１０６４遺伝子、ＨＩ１３８６遺伝子、ＨＩ０３５２遺伝子によってコードされるそれらの推定タンパク質、ＮＴＨｉＯＭＰ、ＮＴＨｉ ＬＯＳおよびＮＴＨｉ非カプセル状タンパク質および配列番号１〜５７６、配列番号６７５〜６８５に示されるヌクレオチド配列、ならびに本明細書中の表３Ｂ、表４および表５に示されるヌクレオチド配列において存在するその新規ＮＴＨｉポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド、ならびに本明細書中の表３Ｂ、表４Ｂ、および表５に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【００４４】
このタンパク質は、胃の中で分解され得るので、好ましくは、このタンパク質は、非経口的に投与され、この投与としては、例えば、皮下、筋肉内、静脈内、皮内である投与が挙げられる。非経口投与にとって適切な処方物としては、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、およびその個体の体液、好ましくは血液と等張である処方物を与える溶質を含み得る、水溶性および非水溶性の滅菌注入溶液；ならびに懸濁剤または濃化剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁物が挙げられる。これらの処方物は、単位用量の容器または複数回用量の容器中に提供され得る。これらの容器としては、例えば、密閉したアンプルおよびバイアルである。そして、これらの処方物は、使用直前に、滅菌液体キャリアの添加のみが必要とされる凍結乾燥条件で貯蔵され得る。このワクチン処方物はまた、その処方物の免疫原性を増強するためのアジュバント系（例えば、水中油系および当該分野で公知の系）を包含し得る。この投与は、そのワクチンの比活性に依存し、そして、慣用的な実験によって容易に決定されされ得る。
【００４５】
（Ａ．ペプチドワクチン）
ペプチド治療剤（例えば、ペプチドワクチン）は、当該分野において周知であり、薬学分野において使用が増加している。このようなペプチド化合物の非経口投与の一貫した欠点は、破壊または変性が速いことである。注入ポンプあんらびびワックスまたはオイル移植物は、ペプチド様治療剤の存在を長引かせることおよびこのような薬剤の完全性を保存することの両方のために、治療剤の長期投与のために使用されている。さらに、ペプチド様薬剤は、（ペプチド様薬剤の各エピトープに対する特定の参照とともに）長期間、天然の状態の構成を理想的に維持し、さらに、チャレンジされた動物または免疫されたヒトにおいて免疫原性応答を誘発するために適した様式で提示されるべきである。
【００４６】
本発明のＮＴＨｉ抗原性ペプチドは、多くの従来の方法で調製され得る。短いペプチド配列は、標準的な手段を使用する化学合成によって調製され得る。固相技術（例えば、Ｅｒｉｋｓｏｎら、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９７６）ｖ．２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ２５５を参照のこと）が特に簡便である。自動固相合成機は、市販される。さらに、配列の改変は、適切な残基の置換、付加または省略によって容易になされる。例えば、システイン残基は、カルボキシ末端に付加されて、キャリアタンパク質への簡便な連結のためのスルフヒドリル基を提供し得るか、またはスペーサー要素（例えば、追加のグリシン残基）が、Ｃ末端の連結アミノ酸とペプチドの残りとの間の配列内に組み込まれ得る。短いＮＴＨｉペプチドはまた、組換え技術によって産生され得る。この長さのペプチドについてのコード配列は、化学技術（例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．，１０３：３１８５（１９８１）に記載されるホスホトリエステル法）によって容易に合成され得る。
【００４７】
本明細書中で企図されるＮＴＨｉペプチド配列のうちのいくつかは、免疫原性であるには小さすぎると考えられ得、これらは、それらにこの特質を与えるためにキャリア物質に連結され得る。当該分野で公知のこのような連結を作製するための任意の方法が使用され得る。連結は、一方の官能基末端にジスルフィド連結を生成し、そして他方のペプチド連結を生じるヘテロ二官能性剤（例えば、ジスルフィドアミド形成剤（例えば、Ｎ−スクシジミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロプリオネート（ＳＰＤＰ）（例えば、Ｊａｎｓｅｎら、，Ｉｍｍｕｎ．Ｒｅｖ．６２：１８５，１９８２を参照のこと）））およびジスルフィド連結以外のチオエーテルを形成する二官能性連結剤（例えば、６−マレイミドカプロン酸、２−ブロモ酢酸、２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸など）、ならびにカルボキシル基をスクシンイミドまたは１−ヒドロキシ−２−ニトロ−４−スルホン酸（スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）のようなナトリウム塩に対して）と組み合わせることによってカルボキシル基を活性化するカップリング剤を用いて形成され得る。
【００４８】
（Ｂ．ワクチン組成物および投与）
プライミング用量の免疫原（これは、免疫原への一回以上のブースター曝露が続く）は、有効ワクチンであることが必要であり得る（Ｋｒａｍｐら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，２５：７７１−７７３，１９７９；Ｄａｖｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１４：３４１−８ １９８６ １９８７）。同時投与される場合、免疫応答を有利に増強し得るタンパク質またはポリペプチドの例としては、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、Ｉｌ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ）、サイトカイン誘導分子（例えば、Ｌｅａｆ）または同時刺激分子が挙げられる。ヘルパー（ＨＴＬ）エピトープは、細胞内標的化シグナルに連結され得、ＣＴＬエピトープから別々に発現され得る。これにより、ＣＴＬエピトープとは異なる細胞区画へのＨＴＬエピトープの指向が可能になる。必要な場合、これは、ＨＴＬエピトープのＭＨＣクラスＩＩ経路へのより効率的な進入を容易にし得、それによって、ＶＴＬ誘導を改善する。ＣＴＬ誘導と対照的に、免疫抑制分子（例えば、ＴＧＦ−β）の同時発現による免疫応答を特異的に減少することは、特定の疾患において有利であり得る。
【００４９】
理想的には、免疫原は、２つ特性を示す；対応する抗体の形成を刺激する能力、およびこれらの抗体と特異的に反応する傾向。免疫原は、抗体の部位を組み合わせることによって認識可能な免疫原の最も小さな部分である１つ以上のエピトープを有する。特定の場合において、免疫原、免疫原の画分または免疫原が提示される条件は、促進するには不適切であり、不十分な免疫を生じる。これは、しばしば、免疫原として使用されるペプチドまたは他の低分子の場合である。他の物質（例えば、免疫調節剤（例えば、インターロイキンのようなサイトカイン）は、同様にワクチンにおいて組み合わされ得る。
【００５０】
上記のワクチンの分野は、免疫原と組み合わせて使用した場合に免疫応答を増強する特定の物質（アジュバントと呼ばれる）の使用を認識する。アジュバントは、そのアジュバントを使用することなく惹起されるよりも速いかまたは大きい免疫応答を惹起するために、さらに使用される。さらに、アジュバントは、アジュバントを含まずに必要とされるよりも少ない免疫原を使用して免疫学的応答を生成するため、免疫学的防御を与える特定の抗体物質の生成を増加するため、またはその免疫応答（例えば、体液性免疫応答、細胞性免疫応答）の成分を増強するために、使用され得る。公知のアジュバントとしては、エマルジョン（例えば、フロイントアジュバントおよび他のエマルジョン）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、ＭＦ５９、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ由来の精製サポニン（ＱＳ２１）、アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、およびミョウバン）、リン酸カルシウム（および他の金属塩）、ゲル（例えば、水酸化アルミニウム塩）、マイコバクテリア生成物（ムラミルジペプチドを含む）、固体物質、粒子（例えば、リポソームおよびビロソーム）が挙げられる。アジュバントとして使用されることが公知である天然生成物および細菌生成物の例としては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ＲＣ−５９（合成ＭＰＬ様アシル化単糖）、ＯＭ−１７４（これは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のリピドＡ誘導体である）、ホロ毒素（例えば、コレラ毒素（ＣＴ）もしくはその誘導体のうちの１つ、破傷風毒素（ＰＴ）、およびＥ．ｃｏｌｉの易熱性毒素（ＬＴ）、もしくはその誘導体のうちの１つ）、ならびにＣｐＧオリゴヌクレオチドが挙げられる。アジュバント活性は、多数の要因（例えば、キャリア効果、デポー（ｄｅｐｏｔ）形成、変化したリンパ球動員、Ｔリンパ球の刺激、Ｂリンパ球の直接刺激、およびマクロファージの刺激）によって影響を受け得る。
【００５１】
ワクチンは、代表的には、注射可能な物質として、液体溶液または液体懸濁液のいずれかとして、調製される。注射前に液体中の溶液または懸濁液のために適切な固体形態もまた、調製され得る。その調製物はまた、乳濁され得る。その活性な免疫原性成分は、しばしば、賦形剤（これは、薬学的に受容可能であり、そしてその活性成分と適合性である）と混合される。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。さらに、望ましい場合、そのワクチンは、少量の補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはアジュバント（これは、そのワクチンの有効性を増強する）を含み得る。このワクチンは、注射（例えば、皮下注射または筋肉内注射のいずれか）によって、従来のように非経口投与される。他の投与様式のために適切なさらなる処方物としては、坐剤が挙げられ、時には、経口処方物が挙げられる。坐剤について、従来の結合剤およびキャリアとしては、例えば、ポリアルカレングリコールまたはトリグリセリドが挙げられ得る。そのような坐剤は、０．５％〜１０％、好ましくは１〜２％の範囲で上記活性成分を含む混合物から形成され得る。経口処方物は、通常使用される賦形剤（例えば、薬剤グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなど）を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁物、錠剤、ピル剤、カプセル剤、徐放処方物または散剤の形態を採り得、１０％〜９５％（好ましくは２５〜７０％）の活性成分を含む。
【００５２】
ワクチンはまた、ジェット注射器、微小針、エレクトロポレーション、ソノポレーション、微小カプセル化、ポリマーまたはリポソームを使用して経皮経路を介して、噴霧器、エアロゾル、および鼻スプレーを使用して経粘膜経路および鼻腔内経路を介して、投与され得る。天然ポリマーまたは合成ポリマー（例えば、デンプン、アルギネート、およびキトサン、Ｄ−ポリＬ−ラクテート（ＰＬＡ）、Ｄ−ポリＤＬ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸ミクロスフェア、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、およびポリホスファゼン、ポリホスファタザン）を使用するマイクロカプセル化が、経皮投与および経粘膜投与の両方のために有用である。合成ポリ−オルニテート、ポリ−リジン、およびポリ−アルギニンまたは両親媒性ペプチドを含む、ポリマー性複合体は、経皮送達系のために有用である。さらに、それらの両親媒性の性質に起因して、リポソームは、経皮ワクチン送達系、経粘膜ワクチン送達系、および鼻腔内ワクチン送達系のために企図される。ワクチン送達のために使用される一般的脂質としては、Ｎ−（１）２，３−（ジオレイル−ジヒドロキシプロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム−メチルスルフェート（ＤＯＴＡＰ）、ジオレイルオキシ−プロピル−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、および９Ｎ（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイルコレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）が、挙げられる。ヘルパー脂質とリポソームとの組み合わせは、皮膚を通してのそのリポソームの取り込みを増強する。これらのヘルパー脂質としては、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）が挙げられる。さらに、トリテルペノイドグリコシドまたはチリセッケンボク（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）由来のサポニンは、鼻腔内ワクチン送達および経粘膜ワクチン送達のための有用なアジュバントとして企図されている。
【００５３】
タンパク質は、中性形態または塩形態としてワクチンに処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基と共に形成される）が挙げられ、これは、例えば、塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸のような有機酸と共に形成される。遊離のカルボキシ基と共に形成される塩はまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第２鉄のような無機塩、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、およびプロカインのような有機塩に由来し得る。
【００５４】
ワクチンは、投薬処方物に適合する様式、そして治療的に有効かつ免疫原性な量で投与される。投与される量は、処置される被験体、被験体の免疫系が抗体を合成する能力、および所望される防御の程度に依存する。投与するのに必要な活性成分の正確な量は、開業医の判断に依存し、各個体で特有である。しかし、適切な投薬量範囲は、１個体当たり数百マイクログラムの活性成分のオーダーである。初回投与およびブースター投与のための適切なレジメンもまた可変性であるが、初回投与後１〜３ヶ月の間隔に次いでその後の注射もしくは他の投与に代表される。
【００５５】
本明細書中に記載されるようにワクチン組成物で免疫化する際に、宿主の免疫系は、所望の抗原に特異的な大量のＣＴＬを産生することによってワクチンに応答し、そしてその宿主は、少なくとも部分的に免疫化されて感染を遅らせるかまたは発生している慢性的感染に耐性を示す。本発明のＮＴＨｉポリペプチドまたはＮＴＨｉペプチドを含むワクチン組成物は、細菌感染に感受性であるかもしくはそれ以外では細菌感染の危険性を有する患者に投与されて、その抗原に対する免疫応答を誘発する。従って、患者自身の免疫応答能が増強される。そのような量は、「免疫原性的に有効な用量」として規定される。この使用において、正確な量は、この場合もまた、患者の健康状態および年齢、投与形式、処方物の性質などに依存するが、一般的には、７０ｋｇの患者１人当たり約１．０μｇ〜約５０００、より一般には７０ｋｇの体重当たり約１０〜５００ｍｇである。治療目的または免疫目的のために、本発明のＮＴＨｉポリペプチドまたはＮＴＨｉペプチドはまた、弱毒化したウイルス宿主（例えば、ワクチンまたは鶏痘）によって発現され得る。このアプローチは、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するためのベクターとして、ワクチンウイルスの使用を含む。急性的にかもしくは慢性的に感染した宿主への導入、または非感染宿主への導入の際、組換えワクチンウイルスは、免疫原性ペプチドを発現し、それによって、宿主ＣＴＬ応答を促進する。
【００５６】
体液性免疫応答は、多くの周知の方法（例えば、単一放射状免疫拡散アッセイ（ＳＲＩＤ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、および赤血球凝集阻害アッセイ（ＨＡＩ）によって測定され得る。詳細には、ＳＲＩＤは、試験される免疫原を含むゲル（例えば、アガロース）の層を利用する。ウェルが、そのゲル中に切除され、試験される血清が、そのウェル中に配置される。そのゲルの外から中への抗体の拡散は、沈殿環の形成をもたらす。その沈殿環の領域は、試験される血清中の抗体濃度に比例する。ＥＩＡ（ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノアッセイとしても公知）は、サンプル中の全抗体を決定するために使用される。その免疫原は、マイクロタイタープレートの表面に吸着される。その試験血清は、そのプレートに暴露され、その後、酵素結合した免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）に暴露される。そのプレートに付着する酵素活性は、従来の任意の手段（例えば、分光光度法）によって定量され、その活性は、その試験サンプル中に存在する免疫原に対する抗体の濃度に比例する。ＨＡＩは、免疫原（例えば、ウイルスタンパク質）がニワトリ赤血球（など）を凝集する能力を利用する。このアッセイは、中和抗体（すなわち、赤血球凝集を阻害可能な抗体）を検出する。その試験血清の希釈物が、標準濃度の免疫原とともにインキュベートされ、その後、上記赤血球が添加される。中和抗体の存在は、その免疫原による赤血球の凝集を阻害する。細胞性免疫応答を測定するための試験としては、遅延型過敏症の決定または標的免疫原に対するリンパ球の増殖応答の測定が挙げられる。
【００５７】
（分類不能型インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（ＮＴＨｉ））
Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅは、小さい非運動性のグラム陰性細菌である。他のＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株とは異なり、分類不能型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨｉ）下部は、多糖莢膜を欠き、時には、「非カプセル型」と示される」ＮＴＨｉ株は、カプセル型株とは遺伝的に別個であり、ｂ型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ単離株よりも異種である。ＮＴＨｉは、ヒト宿主に対して複雑した抗原群を提示する。防御を惹起し得る可能な抗原としては、ＯＭＰ、リポ多糖、リポタンパク質、接着タンパク質、および非莢膜タンパク質が挙げられる。
【００５８】
ヒトは、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのための唯一の宿主である。ＮＴＨｉ株は、呼吸管上部（鼻咽頭および口腔咽頭部後部を含む）、呼吸管下部および女性生殖管に一般的に存在する。ＮＴＨｉは、ヒトにおいて広範なスペクトルの疾患を引き起こす。その疾患としては、中耳炎、肺炎、静脈洞炎、敗血症、心内膜炎、喉頭蓋炎、化膿性関節炎、髄膜炎、分娩後感染症および新生児感染症、分娩後敗血症および新生児敗血症、急性卵管炎および慢性卵管炎、喉頭蓋炎、心膜炎、蜂巣炎、骨髄炎、心内膜炎、胆嚢炎、腹内感染、泌尿器管感染、乳様突起炎、大動脈移植片感染、結膜炎、ブラジル紫斑熱、潜在性菌血症、ならびに基礎となる肺疾患（例えば、慢性肺炎、気管支炎、および嚢胞性線維症）の憎悪が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
ＮＴＨｉの疫学的研究は、この株が、外膜タンパク質プロフィール（Ｂａｒｅｎｋａｍｐら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３６：５３５〜４０，１９８２）、酵素アロタイプ（Ｍｕｓｓｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５２：１８３〜１９１，１９８６）および他の一般的に使用される疫学的ツールに関して、不均質であることを示した。ＮＴＨｉをサブタイプに分けるいくつかの試みが存在したが、それらの方法論はいずれも、完全には満足のいくものではなかった。ＮＴＨｉの外膜タンパク質の組成は、約２０種のタンパク質からなる。すべてのＮＴＨｉ株は、２種の共通するＯＭＰを含み、これらは、分子量が３０，０００ダルトンおよび１６，６００ダルトンである。ＮＴＨｉ株は、３２，０００〜４２，０００ダルトンの範囲内にある２種のＯＭＰに基づいてサブタイプ分けされ得る。そのＮＴＨｉリポ多糖プロフィールは、腸内グラム陰性細菌とは基本的に異なり、２０，０００ダルトン未満の範囲の１〜４つの別個のバンドへと分かれる。
【００６０】
プロトタイプＮＴＨｉ単離株は、慢性中耳炎に罹患していた子供から回収された、低継代単離株８６−０２８ＮＰである。この株は、インビトロで（Ｂａｋａｌｅｔｚら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５３：３３１〜５，１９８８；Ｈｏｌｍｅｓら、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．２３：１５７〜６６，１９９７）ならびにチンチラＯＭモデル（本明細書中に記載される）（Ｂａｋａｌｅｔｚら、Ｖａｃｃｉｎｅ １５：９５５〜６１，１９９７；Ｓｕｚｕｋｉら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６２：１７１０〜８，１９９４；ＤｅＭａｒｉａら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４：５１８７〜９２，１９９６）で、充分に特徴付けられている。この８６−０２８ＮＰ株は、本明細書中に記載されるように、チンチラ中耳炎モデルにおいて発現がアップレギュレートされる遺伝子を同定するため、およびそのチンチラの中耳におけるＮＴＨｉの生存のために必要な遺伝子を同定するために、使用された。
【００６１】
（ＤＦＩ戦略）
差次的蛍光誘導（ＤＦＩ）戦略が、本明細書中において、チンチラ動物モデルにおいてＯＭの間に誘導されるＮＴＨｉ遺伝子を同定するために使用された。いくつかの方法が、感染の間の生物の毒性に寄与する細菌遺伝子を同定するために開発されている。そのような方法としては、細菌プロモーターが、宿主における生存のために必要な必須栄養素の合成のために必要とされる遺伝子の発現を調節する、インビボ発現方法（ＩＶＥＴ）；変異した場合に微生物のビルレンス特性を変化させる遺伝子のタグ特異的同定を可能にする、サイン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）タグ化変異誘発（ＳＴＭ）；転写的に活性ない電子について全体的にスクリーニングするためのＤＮＡマイクロアレイ技術、および転写的に活性なプロモーターについて選択するためにＦＡＣＳ分析を使用するＤＦＩ（Ｃｈｉａｎｇら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３：１２９〜１５４，１９９９）。ＤＦＩは、基礎発現レベルに関わらず差次的に調節される遺伝子の同定を可能にし、かつインビトロでの増殖のために必須の遺伝子は排除しない、高スループット方法である。
【００６２】
ＤＦＩは、多くの微生物において首尾良く利用されている。例えば、ＧＦＰレポーター系およびフローサイトメトリーが、マクロファージと相互作用する際の微生物遺伝子発現を研究するために使用された（Ｄｈａｎｄａｙｕｔｈａｐａｎｉら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７：９０１〜９１２，１９９５）。インビボ増殖を刺激する環境にＳａｌｍｏｎｅｌｌａｅが供された場合、および培養マクロファージ様細胞によりインターナライズされた場合に、転写が増加される遺伝子を同定するために、プロモータートラップ系が、使用された（ＶａｌｄｉｖａおよびＦａｌｋｏｗ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２２：３６７〜３７８，１９９６；ＶａｌｄｉｖｉａおよびＦａｌｋｏｗ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：２００７〜２０１１，１９９７；ＶａｌｄｉｖｉａおよびＦａｌｋｏｗ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：３５９〜３６３，１９９８）。さらに、ＤＦＩは、感染を模倣する変化したインビトロ状態下で増殖した場合にＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＳ．ａｕｒｅｕｓにおいて発現されるプロモーターを同定するために、使用された。さらに、ＤＦＩは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓにおいて、環境刺激に応答した遺伝子調節を研究するために（ＤｕｎｎおよびＨａｎｄｅｌｓｍａｎ、Ｇｅｎｅ，２２６：２９７〜３０５，１９９９）、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにおいてコンピテンス刺激ペプチドに応答した遺伝子調節を研究するために（Ｂａｒｔｉｌｓｏｎら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：１２６〜１３５，２００１）、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ（ＬｅｅおよびＦａｌｋｏｗ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６：３９６４〜３９６７，１９９８）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：５０１６〜５０２４，２００１）、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ（Ｅｓｋｒａら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：７７３６〜７７４２，２００１）、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｂａｄｇｅｒら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：１７４〜１８２，２０００）における宿主細胞との相互作用および宿主細胞の侵襲の際の遺伝子調節を研究するために、使用された。
【００６３】
ＤＦＩは、感染の細胞培養モデルまたはインビボ環境を刺激するように設計されたインビトロ条件において活性なプロモーターを同定するために首尾良く使用されているが、動物全体において特定の生物学的ニッチにおいて調節されるプロモーターを同定するためには、ＤＦＩはほとんど適用されていない。このことは、おそらく、インビボ環境から選別することに関連する多数の難問に起因する。宿主の免疫応答、感染部位からの細菌細胞の蔓延おおび／または除去、ならびに上皮細胞に対する細菌の付着（おそらく、バイオフィルム形成を介する）は、細菌を、生存動物から回収するために接近不能にし得る。これらの要因は、とりわけ、細菌がこれらの難問を感知して応答する場合に、微小環境の複雑性および遺伝子発現の不均一性に寄与する。最近、ＤＦＩは、最近が、呼吸器管感染のマウスモデルおよびＯＭのアレチネズミ感染モデルにおいてスクリーニングされた場合に、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにおいて発現されるプロモーターを同定するために使用されている（Ｍａｒｒａら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７０：１４２２〜３３，２００２；Ｍａｒｒａら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４８：１４８３〜９１，２００２）。
【００６４】
（動物モデル）
上記チンチラモデルは、ＯＭについての広範に受容されている実験モデルである。特に、ＮＴＨｉ誘導性ＯＭのチンチラモデルは、十分に特徴付けられており（Ｂａｋａｌｅｔｚら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６８：８６５〜８７２，１９９３；ＢａｋａｌｅｔｚおよびＨｏｌｍｅｓ，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：２２３〜２２５，１９９７；ＳｕｚｕｋｉおよびＢａｋａｌｅｔｚ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６２：１７１０〜１７１８，１９９４）、ＯＭに対する痘苗原としての、いくつかのＮＴＨｉ外膜タンパク質、外膜タンパク質の組み合わせ、キメラ合成ペプチドワクチン成分、およびアジュバント処方物の防御効力を決定するために使用されている（Ｂａｋａｌｅｔｚら、Ｖａｃｃｉｎｅ １５：９５５〜９６１，１９９７；Ｂａｋａｌｅｔｚら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：２７４６〜２７６２，１９９９；Ｋｅｎｎｅｄｙら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８：２７５６〜２７６５，２０００）。
【００６５】
特に、アデノウイルスが、チンチラをＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ誘導性中耳炎に対して罹りやすくする独特のインビボモデルが存在し、これにより、ＮＴＨｉの生物学的評価についての関連する細胞、組織、および器官の培養系の確立が可能になった（Ｂａｋａｌｅｔｚら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６８：８６５〜７２，１９９３；Ｓｕｚｕｋｉら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６２：１７１０〜８，１９９４）。アデノウイルス感染単独が、鼓室中への誘導された血清抗体の漏出について評価するために使用され（Ｂａｋａｌｅｔｚら、Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４（２）：２２３〜５，１９９７）、ＮＴＨｉとともに共病原体として使用されて、中耳炎に対する痘苗原として種々のＮＴＨｉ外膜タンパク質、ＯＭＰの組み合わせ、キメラ合成ペプチドワクチン成分、およびアジュバント処方物を標的とするいくつかの能動的免疫化レジメンおよび受動的免疫化レジメンの防御効力が決定された（Ｂａｋａｌｅｔｚら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，６７（６）：２７４６〜６２，１９９９；Ｋｅｎｎｅｄｙら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．６８（５）：２７５６〜６５、２０００；Ｎｏｖｏｔｎｙら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６８（４）：２１１９〜２８，２０００；Ｐｏｏｌｍａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ １９（補遺１）：Ｓ１０８〜１５，２０００。
【００６６】
（中耳炎のＮＴＨｉ感染に応答してインビボでアップレギュレートされる遺伝子）
中耳炎のＮＴＨｉ感染に応答して差次的に調節されるプロモーターを同定するために、プロモータートラップライブラリーが、構築され、そして選別パラメーターが、規定された。上記プロモータートラップライブラリーの一部が、上記チンチラ中耳に直接接種され、ＯＭ発症が、ビデオ耳鏡検査法およびティンパノメトリによって２４時間目および４８時間目にモニターされた。さらに、中耳液が、感染の２４時間後および４８時間後に回収された。二色ＦＡＣＳ分析が、浸出に関連する他の細胞および破片から、ＧＦＰを発現している細菌を単離するために使用された。単離後、ｇｆｐｍｕｔ３遺伝子の５’側にあるＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ挿入物のＤＮＡ配列が、決定され、分析された。この様式で、本発明者らは、ＮＴＨｉがＡＯＭの間にチンチラ中耳の環境を感知して応答する場合にアップレギュレートされる遺伝子を同定した。以下の遺伝子が、同定され、ＮＴＨｉ感染の間にそれらの遺伝子がアップレギュレートされることに起因して、それらの遺伝子は、ＮＴＨｉ感染および毒性において一定の役割を果たし得る。
【００６７】
下記実施例７に記載されるように、上記のＤＦＩ手順およびその後のｇｆｐ発現クローンのＦＡＣＳ分析の後、可能性のあるインビボで調節されるプロモーターを含む５２候補クローンが、単離された。これらのクローンが制御する遺伝子は、一般的内容およびその細胞中での機能に基づいて分類された。それらとしては、一般的代謝プロセス、環境情報処理および膜輸送、膜タンパク質、および仮想タンパク質が挙げられる。これらの５２個のクローンのうち８個が、ＮＴＨｉ株８６−０２８ＮＰについて独特である配列を含む。重要なことには、３つのクローンが、１つよりも多い動物において独立したスクリーニングから単離され、それによって、単離方法が確認された。
【００６８】
上記のＦＡＣＳデータを独立して確認するために、本発明者らは、定量的ＲＴ−ＰＣＲによる候補遺伝子の相対的発現を決定した。親株８６−０２８ＮＰを、これらの研究のために使用した。従って、遺伝子調節に対するプラスミドコピー数の影響を伴わない野生型遺伝子発現が、分析され、これにより、ＦＡＣＳによる擬陽性クローン同定を同定することが可能になった。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株Ｒｄにおいて同定された配列に類似する配列を含む４４個の候補クローンのうち、インビトロおよびインビボでの遺伝子発現の定量的比較により、チンチラ中耳中に存在する環境的合図にＮＴＨｉが応答する場合に、２６個の遺伝子についてのアップレギュレートされた遺伝子発現（６０％）が確認された。この分析により、膜輸送、環境情報処理、細胞代謝、遺伝子調節、ならびに未知の機能を有する仮想タンパク質に関与する遺伝子の発現を駆動する、インビボで調節されるプロモーターが同定された。（実施例６における表４参照）。
【００６９】
定量的ＲＴ−ＰＣＲは、ｌｏｌＡ発現の２倍の増加を示し、これは、内膜から外膜へのリポタンパク質輸送を可能にした。細菌は、中耳環境ちゅうで迅速に増殖して、４８時間以内に、中耳液１ｍｌ当たり５．０×１０８ ＧＦＵ ＮＴＨｉに達する。その細菌は、その環境を感知して応答し、増殖および生存のために必要な栄養素を獲得または合成する。リボース糖輸送における膜成分をコードする遺伝子であるｒｂｓＣ（配列番号６１９）は、インビトロで増殖する細胞と比較して、インビボでの発現の５倍増加を示した。さらに、代謝プロセスに関与する多くの遺伝子は、インビトロで増殖する細胞と比較して、インビボでの遺伝子発現の劇的な増加を示す。これらとしては、リボフラビン合成遺伝子ｒｉｂＢ（配列番号６２３）、プリンヌクレオチド生合成遺伝子ｐｕｒＥ（配列番号６２１）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼａｒｃＢ（配列番号６２５）（これは、尿素サイクルを介するアルギニン分解に関与する）、およびｕｘｕＡ（配列番号６２７）（これは、Ｄ−グルクロネートの取り込みおよびグリセルアルデヒド３リン酸への変換に必要な、マンノエートヒドロラーゼをコードする）が、挙げられる。さらに、より弱い程度ではあるが、ヒスチジン生合成についての遺伝子（ｈｉｓＢ；配列番号６１５）、ＤＮＡ修復についての遺伝子（ｒａｄＣ；配列番号６３９）および推定細胞内中隔形成膜貫通タンパク質についての遺伝子（ｉｓｐＺ；配列番号６３７）が、アップレギュレートされた。
【００７０】
ジスルフィド結合形成は、細菌における多くの分泌タンパク質のフォールディングおよびアセンブリのために重要である。原核生物において、ＤｓｂＡおよびＤｓｂＢは、ジスルフィドの形成を担う酸化経路を構成する。ＤｓｂＢは、ＤＮＡを再酸化する。これは、フォールディングしていないポリペプチドへとジスルフィド結合を直接提供する。ＤｓｂＢは、酸化キノンからジスルフィドを新規に生成することが示されている（ＣｏｌｌｅｔおよびＢａｒｄｗｅｌｌ、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：１〜８，２００２）。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株Ｒｄにおいて、ＤｓｂＡは、形質転換のためのコンピテンスのために必要である（Ｔｏｍｂ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９，１０２５２〜１０２５６，１９９２）。本明細書中で、ｄｓｂＢ遺伝子（配列番号６２９）の転写の約３倍の増加が、示された。これは、中耳環境において増殖するＮＴＨｉについてのジスルフィド交換のための重要な役割に光を当てる。
【００７１】
中耳の細菌コロニー形成（通常の滅菌環境）は、宿主炎症応答を生じ、引き続いて、好中球浸潤を生じる。細菌は、この宿主応答と戦うために、多くの戦略を引き起こす。ＮＴＨｉは、ｕｒｅＨ（配列番号６３１）（酸耐性に関与することが示されている（Ｙｏｕｎｇら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｏｌ．，１７８：６４８７−６４９５，１９９６）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ中の活性ウレアーゼの発現に必要な遺伝子のホモログ）の遺伝子発現を増加する（４倍）。最近、ウレアーゼ活性が、感染で生じるｐＨの低下を中和することによって、慢性Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ完成においてある役割を果たし得ることが報告されている（Ｂａｌｔｅｓら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６９：４７２−４７８，２０００；Ｂａｌｔｅｒｓら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６９：４７２−４７８，２００１；ＢｏｓｓｅおよびＭａｃＩｎｎｅｓ，Ｃａｎ．Ｊ．Ｖｅｔ。Ｒｅｓ．，６４：１４５−１５０）。中耳浸出液からのＮＴＨｉ単離物に対する生物型分析は、８７％がウレアーゼ陽性であることを実証した（ＤｅＭａｒｉａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０：１１０２−１１０４，１９８４）。しかし、ＮＴＨｉ毒性におけるウレアーゼの役割は未知である。同様に、産物が、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにおけるピリドキシン生合成タンパク質に対して８８％の配列同一性を示し、抗酸化剤として機能し得る推定一重項酸素耐性タンパク質に６０％の相同生を示す遺伝子の発現が増加した。ホスホリルコリン（ＣｈｏＰ）は、ＮＴＨｉの病因に関わっている（Ｗｅｉｓｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：９４３−９５０，１９９７）。ＮＴＨｉは、相変動によってＣｈｏＰ発現を調節し、細胞表面上にＬＯＳを装飾する。ＣｈｏＰは、抗微生物ペプチドに対する減少した感受性を介して気道におけるＮＴＨｉ残存に寄与し得（Ｌｙｓｅｃｋｏら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６８：１６６４−１６７１，２０００）、そしてＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）により媒介される血清殺傷に対する感受性を変化させる（Ｗｅｉｓｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：６３１−６４０，１９９８）。鼻咽腔および中耳腔の微環境は、ＣｈｏＰ＋菌株がチンチラ鼻咽腔のより多くのコロニー形成を示すので、ＣｈｏＰ＋表現型を選択し得る（Ｔｏｎｇら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６８：４５９３−４５９７，２０００）。ｌｉｃＣ遺伝子（配列番号６３３）の発現もまた増加した。ｌｉｃＣ遺伝子は、ホスホリルコリン誘導体化ＬＯＳの生合成におけるある役割を果たすホスホリルコリンシチジリルトランスフェラーゼをコードする（Ｒｏｃｋら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｏｌ．，１８３：４９２７−４９３１，２００１）。
【００７２】
産物が引き続いて遺伝子発現またはＤＮＡ複製を調節するセットがまた、インビボ誘導遺伝子に含まれる。これらの遺伝子は、ｇｌｐリプレッサー、ｇｌｐＲ（配列番号６４３）、アルギニンリプレッサー遺伝子、ａｒｇＲ（配列番号６４７）、および組込み宿主因子（ＩＨＦ）βサブユニット、ｉｈｆＢ（配列番号６４５）によるグリセロール代謝の転写調節を含む。ＩＨＦは、特定の配列においてＤＮＡに結合するヒストン様タンパク質（複製、部位特異的組換えおよび転写に関与し、多数のオペロンの活性を変化させる補助因子）である（Ｇｏｏｓｅｎおよびｖａｎ ｄｅ Ｐｕｔｔｅ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６１−７，１９９５）。さらに、ＣｓｐＤは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける静止期誘導ストレス応答の間のＤＮＡ複製を阻害し（Ｙａｍａｎａｋａら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３９：１５７２−１５８４，２００１）、そしてｍｕｋＦ（配列番号６４１）遺伝子タンパク質ホモログは、細胞分離の前により緻密な形態へのヌクレイド構造のリモデリングに寄与する（ＳａｗｉｔｚｋｅおよびＡｕｓｔｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，６２：１７１０−１７１８，２０００）。本明細書中に記載されるＤＦＩ戦略は、未知の機能についてインビボで誘導されるプロモーターを同定した。仮想タンパク質ＨＩ００９４は、初期ＯＭの間、遺伝子発現の８倍の増加を示したが、その役割は未知のままである。ＨＩ１１６３（配列番号６５１）は、Ｅ．ｃｏｌｉの推定オキシダーゼである仮想ＹｄｉＪタンパク質と５８％のアミノ酸同一性を示した。
【００７３】
高密度トランスポゾン突然変異誘発戦略は、高栄養培地上で増殖するために必須のＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ遺伝子を同定するために使用された（Ａｋｅｒｌｅｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９９：９６６−９７１，２００２）。本明細書において記載されるスクリーニングにおいて、Ａｋｅｒｌｅｙら（上述）に記載された必須の遺伝子セットに含まれる６つの遺伝子が同定された（ｈｉｓＢ、ｌｐｐＢ、ｌｏｌＸ、ｉｓｐＺ、ｍｕｋＦおよび未知のＨＩ０６６５）。最近、２種類のヒト気道由来上皮細胞株との相互作用によって発現される、分類不可能なＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの遺伝子が同定された。これらの遺伝子は、代謝プロセス、ストレス応答、遺伝子発現、細胞エンベロープ生合成、ＤＮＡ関連プロセス、細胞分裂、および機能未知のＯＲＦがコードするタンパク質に関与する遺伝子を含んだ（Ｕｌｓｅｎら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４５：４８５−５００，２００２）。同様に、ストレス応答遺伝子、ｃｓｐＤ（配列番号６４９）、プリンおよびリボフラビン生合成に関与する遺伝子、ならびに機能未知のタンパク質、ｖａｐＡが、本明細書において記載されるスクリーニングで同定された。ｖａｐＡの発現は、インビトロで検出され、さらにｖａｐＡ遺伝子発現は、インビボで２倍に増加した。これらの独自のアプローチは、ＮＴＨｉ誘導性ＯＭにおいてアップレギュレートされ、したがってＮＴＨｉの感染およびビルレンスに役割を果たす可能性があり；かつワクチン治療およびアンチセンス治療、ならびにＮＴＨｉ関連障害の処置の、他の治療法の潜在的な候補であり得る、既知の遺伝子を同定した。
【００７４】
ＤＦＩ戦略は、その上、機能未知の遺伝子のための、インビボで誘導されるプロモーターの同定という結果を生じた。仮説的タンパク質、ＨＩ００９４は、初期ＯＭの間、遺伝子発現における８倍の増加を示したが、その機能は未知のままである。ＨＩ１１６３（配列番号６５１）は、Ｅ．Ｃｏｌｉの仮説的ＹｄｉＪタンパク質（推定上のオキシダーゼ）と５８％のアミノ酸同一性を示した。したがって、これらの仮説的遺伝子は、ＮＴＨｉ感染によって誘導されるＯＭに役割を果たす可能性がある。
【００７５】
（詳細な説明）
以下の実施例は、本発明を説明する。ここで、実施例１は、ＮＴＨｉゲノムの配列を記載し、実施例２は、同定されたコンティグおよび最初の遺伝子発見を記載し、実施例３は、ＮＴＨｉプロモータートラップライブラリーの構築を記載し、実施例４は、ＧＦＰを発現する８６−０２８ＮＰ誘導体の分析を記載し、実施例５は、中耳の流体由来の細菌の直接標識を示し、実施例６は、急性中耳炎においてインビボで誘導されたプロモーターの同定を記載し、実施例７は、ビルレンス関連遺伝子の同定を記載し、そして実施例８は、固有のＮＴＨｉ遺伝子配列の同定を記載する。
【実施例】
【００７６】
（実施例１）
（分類不可能なＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅゲノムの配列）
ＮＴＨｉ８６−０２８ＮＰ株は、コロンバスのＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌにおいて鼓膜切開術および慢性ＯＭのための管挿入を受けた小児科患者から得られた、最小限に継代された臨床単離物である（Ｂａｋａｌｅｔｚら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，５６（２）：３３１−３３５，１９８８）。８６−０２８ＮＰ株は、２００２年１０月１６日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８ ＵＳＡ）に寄託され、そして受託番号ＰＴＡ−４７６４を割当てられた。
【００７７】
ＮＴＨｉにおけるビルレンス決定因子の同定により広範に近づくための試みにおいて、ＮＴＨｉ ８６−０２８ＮＰ株のゲノムを３倍の適用範囲（３−ｆｏｌｄ ｃｏｖｅｒａｇｅ）でシークエンシングした。染色体ＤＮＡ、８６−０２８ＮＰ株からＰｕｒｅｇｅｎｅプロトコールを用いて調製し、そしてＨｙｄｒｏｓｈｅａｒ装置（Ｇｅｎｅ Ｍａｃｈｉｎｅｓ）によって２ｋｂ〜４ｋｂのサイズにせん断した。Ｃｈｉｓｓｏｅら（Ｍｅｔｈｏｄｓ：ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３：５５−６５，１９９１）およびＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）に記載されたように、せん断したＤＮＡを、エタノール沈殿し、クレノウ酵素の混合物を用いて末端修復し、そしてアガロースゲル電気泳動によってサイズ選別して、２ｋｂ〜４ｋｂのフラグメントを得た。これらのフラグメントを、ＳｍａＩ制限酵素認識部位（ホスファターゼ処理されている）を用いてｐＵＣ１８ベクター中にクローニングし、そしてＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅに形質転換し、アンピシリン耐性について選択する。Ｘ−ｇａｌを含有するＬＢ−Ａｍｐプレート上での青／白スクリーニングによって、インサートを含むコロニーを同定し、そして１．５ｍｌのＴＢ−Ａｍｐ（ＴＢ＝Ｔｅｒｎｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）ブロスを含む９６ディープウェルプレートに移す。ディープウェルプレート培養物を、３７℃で一晩増殖させる。テンプレート調製、シークエンシングおよびコンティグアセンブリを行った。
【００７８】
Ｃｈｉｓｓｏｅら（上述）に記載されるように、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｂｉｏｍｅｋ２０００自動ロボットワークステーション上で、自動テンプレート調製を行った。簡単に言うと、上記で調製されたクローンを含む各９６ディープウェルプレートを遠心し、細胞をペレット化した。上清をデカントし、細胞を（必要な場合）−２０℃で凍結した。Ｃｈｉｓｓｏｅら（上述）に記載されるように、４つの９６ディープウェルブロックをＢｉｏｍｅｋテーブル上に配置し、液体ハンドリングロボットを使用して、代表的なＳＤＳ−ＮａＯＨ溶解プロトコールの自動バージョンを用いてテンプレートを調製した。最終的なエタノール沈殿テンプレートを、５０μｌのｄｄＨ２Ｏに各々溶解し、そしてＤＮＡシークエンシングのために使用した。
【００７９】
Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｈｙｄｒａ ９６ロボットを用いて、上記テンプレートを（９６ウェルプレートから）３８４ウェルプレートへと再整列化することによって、シークエンシング反応を実行した。ＰＥ Ｂｉｇ−ＤｙｅＴＭターミネーターおよびユニバーサルプライマー（Ｍ１３フォワードおよびリバース）を用いてサイクルシークエンシング反応を実行し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０カラムを通して浄化し、そしてＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７００キャピラリー電気泳動ＤＮＡシークエンサー上で、製造者の指示に従って分析した。シークエンシングの読み（８２１９）を、５７６のコンティグ（本明細書における配列番号１〜５７６）に組み立てた。３倍（３−ｆｏｌｄ）シークエンシングについての統計を、表２Ａに示す。アセンブリ１７の全固有配列は、１．７４Ｍｂである。
【００８０】
（表２Ａ）
【００８１】
【表２Ａ】
続いて、ＮＴＨｉゲノムの８倍（８−ｆｏｌｄ）シークエンシング分析を行った。８倍シークエンシングは、ＮＴＨｉゲノムを１１のコンティグに組み立てた。コンティグ５、８、９、１０、１２〜１８を、本明細書において配列番号６７５〜６８５として示す。８倍シークエンシングについての統計を、表２Ｂに示す。
【００８２】
（表２Ｂ）
【００８３】
【表２Ｂ】
（実施例２）
（コンティグ説明および最初の遺伝子発見）
３倍配列分析によって同定された、長さ５０００ｂｐ以上を有する８８個のコンティグ中７５個は、ＢＬＡＳＴＮを介して、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｄ株に対する有意な類似性を示す。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ８６−０２８ＮＰ株における遺伝子順とＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｄ株における遺伝子順との間の潜在的な関係を可視化するため、８６−０２８ＮＰ ３倍コンティグセットおよびＲｄ遺伝子セットを、ＢＬＡＳＴＮを用いて双方向性に比較した。結果を、ヒットしたＲｄ遺伝子の遺伝子座標に基づいてコンティグをソーティングし、Ｒａｙら（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １７：１１０５−１２，２００１）に記載されるように、見出された最小の座標で各コンティグを固定することによって、遺伝子順 対 コンティグ空間にプロットした。この様式で比較し、完全に既知のゲノムに対して同一の遺伝子順を有するゲノムの不完全なアセンブリを、単調増加する階段状の形態で表示した。
【００８４】
ＢＬＡＳＴＸを使用して、Ｒｄ株ゲノムにおける遺伝子に対して相同性を有する配列、およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｆｚｚａｅ Ｒｄ株に見出されない遺伝子に対して相同性を有する配列に対するヒットを同定した。
【００８５】
Ｒｄ株配列へのヒットをデータセットから除去し、そして他のセットを表３Ａにまとめた。データは以下のように提示される：コンティグ番号（＝配列番号）、カラム１；各ヒットについてのＥスコア、カラム２；引用されたコンティグのアミノ酸翻訳部分に対する相同性を有したタンパク質の名前、カラム３；上記ホモログを産生する生物体、カラム４；そして、カラム３に引用されたタンパク質の各々についてのＧｅｎｂａｎｋタンパク質識別子、カラム５；コンティグ内の対応するヌクレオチド（配列番号によって参照される）。ほとんどの例においていくつかのホモログが同定されたが、明確化のため、最も相同性の高いタンパク質を表３Ａに引用する。
【００８６】
表３Ａに列挙した遺伝子のいくつかについての配列を、ＮＴＨｉゲノムの８倍シークエンシング内で同定した。表３Ｂは、１１コンティグ内のこれらの遺伝子の配置、全長オープンリーディングフレーム配列（配列番号によって同定される）、上記オープンリーディングフレームによってコードされる生成されたアミノ酸配列、およびＢＬＡＳＴＸによって同定された高相同性を有する遺伝子（表３Ａで列挙されたようなもの）を列挙する。
【００８７】
ＮＴＨｉおよびＲｄ株中における比較的短い遺伝子の配置を検査するため、詳細に記載されている２つの遺伝子クラスター中の遺伝子順を比較した。第一に、血液凝集性線毛（ＬＫＰ）遺伝子領域中に存在する遺伝子を検査した（Ｍｈｌａｎｇａ−Ｍｕｔａｎｇａｄｕｒａら，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０（１７）：４６９３−７０３，１９９８）。線毛遺伝子クラスターは、ｐｕｒＥ遺伝子とｐｅｐＮ遺伝子との間に位置する。これらのフラグメントのみを、図１に記載する。血清型ｂ株、Ｅａｇａｎは、ｈｉｆＡＢＣＤＥ遺伝子クラスターを含み、そして血液凝集性線毛を生成する。Ｒｄ株は、ｈｉｃＡＢ遺伝子およびｈｉｆＡＢＣＤＥ遺伝子クラスターを欠損している。一般的に、既に検査した分類不可能な株は、ｈｉｃＡＢ遺伝子を含むが、血液凝集性線毛をコードするｈｉｆ遺伝子を含まない。８６−０２８ＮＰ株配列（本明細書において記載される）は、この領域において、ＮＴＨｉ Ｒ３００１株の配列と同一である（図１）。ｒｆａＤ遺伝子は、エンドトキシンの生合成に関与する酵素をコードする。さらに、ＮＴＨｉ ２０１９株由来のｒｆａＤ遺伝子は、Ｎｉｃｈｏｌｓら（Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６５（４）：１３７７−８６，１９９７）によって特徴付けられている。２０１９株において、ｒｆａＤ遺伝子は、エンドトキシン生合成に関与する別の酵素をコードするｒｆａＦ遺伝子のすぐ上流にある。Ｒｄ株における遺伝子配置は、様々である；ｒｆａＤ遺伝子およびｒｆａＦ遺伝子は、およそ１１ｋｂの配列によって分離されている。検査された最も分類不可能な株は、２０１９株において見られる遺伝子配置を含んでいた。対照的に、８６−０２８ＮＰ株は、Ｒｄ株に見られる遺伝子配置と同一の遺伝子配置を有する（図２）。
【００８８】
現行のアセンブリの全体的な分析は、遺伝子の内容および順序が、Ｒｄ株における内容および順序と類似することを示す。より詳細な分析は、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａにおいて以前見られなかったかなりの数のＮＴＨｉ遺伝子が存在すること、そしてＮＴＨｉ遺伝子の内容および順序がＲｄ株において見られる内容および順序と異なるいくつかの領域が存在することを、明らかにした。したがって、現行のデータは、８６−０２８ＮＰ株ゲノムが、Ｒｄ様性質と非Ｒｄ様性質との複雑なモザイクを含むことを示唆する。
【００８９】
ＤＦＩ戦略はまた、遺伝子発現を増加させる新規のＮＴＨｉ配列を同定した。他の生物体（主にグラム陰性細菌）のＯＲＦに対して相同性を有する遺伝子または遺伝子フラグメントを含む、これらの新規コンティグ配列のリストを、表３Ａに示す。例えば、コンティグ４４２（配列番号４４２）のヌクレオチド配列、ヌクレオチド１４９８〜１８４５は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｄ株リポタンパク質Ｂ（ＬｐｐＢ）のアミノ酸１〜１１６をコードする配列に対して、高度に相同性である。この遺伝子は、静止期生存遺伝子、ｓｕｒＥと、ビルレンスに関連している、最近同定された細菌リポタンパク質、ＬｐｐＢ／ＮｌｐＤに対して高度に相同性である、４３ｋＤの抗原外膜リポタンパク質をコードする遺伝子との間に位置する（Ｐａｄｍａｌａｙａｍら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６８：４９７２−４９７９，２０００）。最近、Ｚｈａｎｇおよび共同研究者らは、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａにおいて、ｎｌｐＤ遺伝子およびｓｕｒＥ遺伝子の発現が、細胞増殖の静止期の間に誘導されることを示した（Ｚｈａｎｇら，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃａｍｂ），９：１０９５−１１０６，２００１）。したがって、中耳でのストレス誘導条件下において、このＮＴＨｉリポタンパク質が発現される。
【００９０】
【表３Ａ−１】
【表３Ａ−２】
【表３Ａ−３】
【表３Ａ−４】
【表３Ａ−５】
【表３Ａ−６】
【表３Ａ−７】
【表３Ａ−８】
【表３Ａ−９】
【表３Ａ−１０】
【表３Ａ−１１】
【表３Ａ−１２】
【表３Ａ−１３】
【表３Ａ−１４】
【表３Ａ−１５】
【表３Ａ−１６】
【表３Ａ−１７】
【表３Ａ−１８】
【表３Ｂ−１】
【表３Ｂ−２】
【表３Ｂ−３】
（実施例３）
（ＮＴＨｉプロモータートラップライブラリーの構築）
ＮＴＨｉの潜在的なビルレンス決定因子を同定するために、細菌遺伝子発現を、ＮＴＨｉ誘導中耳炎（ＯＭ）のチンチラモデルの１つの特定の解剖学的くぼみ（ｎｉｃｈｅ）における初期疾患の進行の間の微分蛍光誘導（ＤＦＩ）によって、モニターした。ＮＴＨｉ菌株８６−０２８ＮＰ由来のゲノムＤＮＡフラグメントを、プロモータートラップライブラリーを使用して、プロモーターレスｇｆｐｍｕｔ３遺伝子の上流にクローニングした。プラスミドｐＧＺＲＳ３９Ａ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅから単離したｐＧＺＥＳ−１の誘導体）は、Ａ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ−Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉシャトルベクターである。このプラスミドは、Ａ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の複製起点、ｐＵＣ１９由来のｌａｃＺα遺伝子およびＴｎ９０３由来のカナマイシン耐性遺伝子を含む（Ｗｅｓｔら、Ｇｅｎｅｓ，１６０：８１−８６，１９９５）。
【００９１】
プロモータートラップベクターを、ＧＴＰ変異ｇｆｐｍｕｔ３遺伝子を、ＥｃｏＲＩフラグメントに対するＢａｍＨＩとして、ｐＧＺＲＳ−３９Ａ内にクローニングしてｐＲＳＭ２１６７を形成することによって構築した。この変異ＧＴＰ遺伝子は、２つのアミノ酸変化（Ｓ６５ＧおよびＳ７２Ａ）を含み、これは、４８８ｎｍで励起される場合、蛍光発光を増強する。この変異体はまた、高い溶解性および発色団形成の速い動力学を有する（Ｃｏｒｍａｃｋら、Ｇｅｎｅ，１７３：３３−３８，１９９６）。このプラスミドは、ＮＴＨｉ菌株８６−０２８ＮＰ内へのエレクトロポレーションによって形質転換され、親のプラスミド菌株８６−０２８ＮＰ／ｐＲＳＭ２１６７を生成する。
【００９２】
ランダムゲノムＤＮＡフラグメント（実施例１に記載される）を、ｐｕｒｏもタープローブベクター内への連結のために調製した。ゲノムＤＮＡを、製造業者のプロトコルに従って、ＰｕｒｅｇｅｎｅＤＮＡ単離キット（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を使用して、菌株８６−０２８ＮＰから単離した。制限障壁に起因して、プラスミドＤＮＡを単離し、これをライブラリー作製のために使用することが必要であった。この単離されたＤＮＡを３７℃で１時間、Ｓａｕ３ＡＩ（ＮＥＢ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ；０．２５単位／μｇ ＤＮＡ）を用いて部分的に消化し、ゲル電気泳動によって分離し、そしてＤＮＡフラグメント（０．５〜１．５ｋｂのサイズ）を、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを使用して、回収した。ベクター調製のために、ｐＲＳＭ２１６７を、製造業者のプロトコルに従って、Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ Ｍａｘｉｐｒｅｐ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を使用して、一晩の培養物から単離した。
【００９３】
プラスミドＤＮＡを、ＢａｍＨＩ消化によって線形化し、そして５’リン酸基を、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ；ＧｉｂｃｏＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いる処置によって除去した。ゲノムＤＮＡフラグメントを、線形化されホスファターゼで処理されたベクターを用いて連結し、そして改変プロトコルに従ってエレクトロポレーションのための調製したコンピテントＮＴＨｉ菌株８６−０２８ＮＰ内エレクトロポレートした（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９：３６２５−３６２８，１９９１）。プラスミドＤＮＡをＮＴＨｉ菌株８６−０２８ＮＰ内にエレクトロポレーションで戻した場合、形質転換効率は、千倍改善した。簡単に述べると、細胞を、ｓＢＨＩ（脳心臓注入物）ブロスにおいて３７℃、２２０ｒｐｍで、ＯＤ６００＝０．３まで増殖させた。細胞を、３０分間、氷において冷やし、引き続いて、４℃で、等量の０．５×ＳＧ（１×ＳＧ：１５％グリセロール、２７２ｍＭスクロース）を用いて洗浄した。洗浄を合計３回繰り返した。引き続いて、細胞を、１×ＳＧ中で、１００×濃縮用量に希釈した。細胞を、２００オーム、２．５ｋＶおよび２５μＦで、ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩセットを使用して、エレクトロポレーションし、次いで、１ｍｌの予め温めたｓＢＨＩ中に希釈し、３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートし、そして形質転換体の一晩の増殖のためにチョコレート寒天にプレートした。
【００９４】
形質転換体を選択し、２０％グリセロール（容積／容積）を含む脱脂乳中、１０００クローンのプール中に凍結させた。６８，０００メンバーのｇｆｐプロモータープローブライブラリーを作製した。ＣｌａｒｋｅおよびＣａｒｂｏｎ（Ｃｅｌｌ，９：９１−９９，１９７６）の確率計算を使用して、菌株８６−０２８ＮＰ ＤＮＡの３００ｂｐフラグメントのライブラリー（１．８×１０６ｂｐ／ゲノム）に表される所定のＤＮＡ配列の９９％確率を達成するために、２７，６２９クローンのライブラリーを必要とした。従って、本発明のライブラリーは、８６−０２８ＮＰゲノムの２．５倍の適用範囲を表す。
【００９５】
ライブラリーの質を評価するために、５０クローンをランダムに選択し、チョコレート寒天で一晩増殖させ、そしてプラスミドを単離し、そして挿入ＤＮＡを配列決定した。選択されたクローンの大部分（６４％）は、２００ｂｐと５００ｂｐとの間の範囲挿入サイズを有したが、３２％は、５００ｂｐを超えた。挿入物の大部分は、独特のＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ菌株Ｒｄオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と相同性を示し、そして１５クローンが、菌株８６−０２８ＮＰ ＤＮＡに対して独特の配列を有した。菌株Ｒｄに対して相同性を有するこれらのクローンのうち、６０％が、正しい方向であり、その３６％が、ＯＲＦの上流に配列を含んだ。クローンの大部分が５００ｂｐ未満の挿入サイズを有したが、小さな挿入サイズと増加したＧＦＰ発現との間に相関は見出されなかった。実際、４つのクローンは、インビトロにおいて、わずかから中程度の蛍光を示し、これらの３つが、２００塩基対〜５００塩基対の間の挿入サイズを有し、１つが、７００塩基対よりも長い挿入物を有した。
【００９６】
ライブラリーの画分（約１０００クローン）を、チョコレート寒天で増殖させ、ＰＢＳ中で収集し、ＧＦＰ蛍光についてフローサイトメトリーによって分析した。挿入ＤＮＡの無いプロモータートラップベクターを含む菌株８６−０２８ＮＰ／ｐＲＳＭ２１６９と比較して、ライブラリークローンのプールは、増加した蛍光強度を示す。従って、ライブラリーは、種々のレベルの活性でプロモーターを有するクローンを含む。
【００９７】
（実施例４）
（ＧＦＰを発現する８６−０２８ＮＰ誘導体の分析）
ｇｆｐ発現細菌を同定および分類するために必要なＦＡＣＳプロモーターを確立するために、種々のレベルのｇｆｐ発現を示すパネル単離物を利用した。バックグラウンド蛍光を、菌株８６−０２８ＮＰ／ｐＲＳＭ２１６９（ネガティブコントロール）を使用して評価し、従って、任意の観察された蛍光は、ｌａｃＺプロモーター駆動ｇｆｐ発現に起因している。しかし、この菌株は、検出可能なレベルのＧＦＰを生成せず、実際、親の菌株８６−０２８ＮＰと比較した場合、増加した蛍光を示さない。高レベルのｇｆｐ発現単離物を、外膜タンパク質Ｐ２発現に対する強力なプロモーターを含む５００ｂｐフラグメントを、Ｓａｉ−ＢａｍＨＩ消化ｐＲＳＭ２１６７にクローニングすることによって作製した。このプラスミドを、エレクトロポレーションによって８６−０２８ＮＰ内に形質転換し、高レベルのｇｆｐ発現菌株８６−０２８ＮＰ／ｐＲＳＭ２２１１（高い蛍光コントロール）を生成する。この菌株は、菌株８６−０２８ＮＰ／ｐＲＳＭ２１６９と比較して、ＧＦＰ蛍光において約１００倍増加を示した。中程度の蛍光誘導体クローン、８６−０２８ＮＰ／ｐＫＭＭ４Ｂ５（中程度の蛍光コントロール）を、ＦＡＣＳ分析によって単離し、そして予備的実験および細胞選別のためのコントロールとして使用した。インビトロでｇｆｐ発現を駆動するプロモーターを含むＤＮＡフラグメントは、他の生物のＤＮＡに対して公知の相同を有さない、菌株８６−０２８ＮＰに対して独特である。このクローンは、菌株８６−０２８ＮＰ／ｐＲＳＭ２１６９と比較して、蛍光において約１０倍の増加を示す。
【００９８】
コントロール菌株をチョコレート寒天上での増殖物から再懸濁させ、４℃で３０分間、交差反応性Ｐｈｙｃｏｐｒｏｂｅ Ｒ−ＰＥ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（１００μｌＰＢＳ中、１０μｇ／ｍｌ；Ｂｉｏｍｅｄａ Ｃｏｒｐ）を用いて標識した。未結合の抗体を除去するための３回の連続洗浄に続いて、細菌をＦＡＣＳ分析のために、３００μｌＤＰＢＳ中で再懸濁させた。これらのコントロール調製物を使用して、４８８ｎｍを発するアルゴンレーザーを備えるＣｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ Ｅｌｉｔｅフローサイトメーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐ．）を使用して、適切なサイズおよび蛍光ゲートを設定した。細菌を、ログフォワードアングル（ｌｏｇ ｆｏｒｗａｒｄ ａｎｇｌｅ）および側方散乱検出に基づくサイズ、ならびに細菌のＦＩＴＣ／ＰＥ標識による選別のためにゲート（ｇａｔｅ）した。選別された細胞を、冷却したｓＢＨＩ中に収集し、そしてチョコレート寒天上にプレートした。一晩の増殖後、細胞を、第２回の感染のために収集するか、または個々に選択し、一晩増殖させ、インビトロで増殖する場合、蛍光について個々のクローンによってスクリーニングし、そしてプラスミド単離の前に、２０％（容積／容積）グリセロールを含む脱脂乳中で凍結させ、そして挿入物ＤＮＡを配列決定した。コントロール菌株の選別効率を、Ｃｏｕｌｔｅｒ ＥＰＩＣＳフローサイトメーター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐ．）を使用して確認した。
【００９９】
多くのプラスミドを、抗生物質選択の非存在下でインビトロで迅速に分離した。従って、本明細書中で使用されるプロモータートラップベクターがこの事象の傾向があるか否かを評価するために、菌株８６−０２８ＮＰ／ｐＲＳＭ２２１１（高い蛍光コントロール）の単一のコロニーを、チョコレート寒天上で単離し、抗生物質選択の非存在下で２０回継代させた。抗生物質の存在下で増殖された細菌と比較した場合、蛍光強度の有意な減少は、観察されなかった。さらに、プラスミドをインビボでの抗生物質選択の非存在下で維持する。チンチラから収集された細菌含有中耳分泌液を、カナマイシン無しまたは有りでチョコレート寒天上にプレートした場合、類似の細菌カウントが観察された。これらのデータは、プロモータートラップベクターが抗生物質選択の非存在下で安定に維持されたことを実証する。
【０１００】
プラスミドの安定性に問題に加えて、宿主−病原体相互作用を研究するためのレポーターとしてのＧＦＰの使用についての初期の研究は、ＧＦＰが、細菌細胞−表面動力学に対して最小の効果を有する低い毒性で、細胞質タンパク質として連続的に合成され得ることを実証した（Ｃｈａｌｆｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６３：８０２−８０５，１９９４）。高いレベルのｇｆｐ発現誘導体の構築は、ＮＴＨｉに対するＧＦＰ毒性の評価を可能にした。野生型菌株（８６−０２８ＮＰ）および高いＧＦＰ産生菌株８６−０２８ＮＰ／ｐＲＳＭ２２１１の両方の増殖曲線を、類似の条件下で増殖した場合と比較した。増殖速度は類似し、ＧＦＰ発現が細胞に対して毒性でないことを示す。
【０１０１】
８６−０２８ＮＰ ｇｆｐ発現誘導体を使用して、効率的な細胞選別についてのパラメーターを規定した。菌株８６−０２８ＮＰ／ｐＲＳＭ２１６９を、中程度ｇｆｐ発現誘導体、菌株８６−０２８ＮＰ／ｐＫＭＭ４Ｂ５と、１００：１の比で混合し、細菌集団の合計に対して小さな割合のｇｆｐ発現クローンを含むことが予期されるインビボ環境をシミュレートした。この混合物をＦＡＣＳ分析に供し、１．８％最大蛍光集団および５２％最小蛍光集団を収集する。選別された集団のフローサイトメトリー分析は、細菌集団の６５％まで、菌株８６−０２８ＮＰ／ｐＫＭＭ４Ｂ５の富化を示し、これは、ネガティブ集団での選別の場合に観察されない減少である。引き続く回の選別は、この中程度蛍光集団をさらに富化させることをが期待される。ネガティブ選別において蛍光細菌の量を減少させることができないことは、ネガティブ選別についてのゲート設定のサイズに起因した。ＧＦＰ−ネガティブ細胞を、１０％の最小蛍光集団でゲーティングすることによって富化した。
【０１０２】
（実施例５）
（中耳分泌液からの細菌の直接的標識）
類似の戦略（実施例５に記載されるとおり）を、ＡＯＭの間にチンチラの中耳から得られた浸出液から蛍光クローンを選別するために適用した。インビボの微分蛍光誘導（ＤＦＩ）を使用する本発明者らの能力は、非蛍光細菌、蛍光および非経口細胞細片、ならびに真核生物細胞からｇｆｐ発現細菌を選別する本発明者らの能力に依存した。
【０１０３】
耳鏡検査法またはティンパノメトリのいずれによっても中耳感染の証拠のない健常な成体チンチラ（Ｃｈｉｎｃｈｉｌｌａ ｌａｎｉｇｅｒａ）を使用して、インビボのプロモーター活性についてライブラリーをスクリーニングした。ＮＴＨｉ／ｐＲＳＭ２１６９ライブラリーの２つのプール（それぞれ１０００クローン）を、カナマイシンを含むチョコレート寒天上で一晩増殖させた。このライブラリーを組合せ、冷却１０ｍＭ滅菌ＰＢＳ中に３．３×１０６ＣＦＵ／ｍｌまで希釈し、３００μｌ（１．０×１０６ＣＦＵ；５００ＣＦＵ／クローン）を使用して、左および右のチンチラトランスブラーキャビティー（ｔｒａｎｓｂｕｌｌａｒ ｃａｖｉｔｙ）を播種した（２０００クローン／耳）。ＯＭ発生（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）を、２４時間および４８時間で、ビデオ耳鏡検査法およびティンパノメトリーによってモニターした。細菌を中耳腔において増殖させ、予期されるように、４８時間で、接種材料用量の５００倍の濃度に達した（Ｂａｋａｌｅｔｚら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６７：２７４６−６２，１９９９）。宿主環境に対するこの細菌の適応は、炎症応答を生じ、これは、紅斑、脈管拡大および鼓膜の隆起、多形核球細胞（ＰＭＳ）の浸潤、ならびに回収される浸出液の耳鏡検査および顕微鏡検査によって観察されるような中耳腔の分泌液の蓄積によって示される。２４時間後および４８時間後、中耳分泌液を上鼓室タップによって回収し、そしてＦＡＣＳのために調製した。
【０１０４】
この分析が中耳分泌液中で回収可能な細菌に制限されたことに注意することが重要である。いくつかの場合において、ＦＡＣＳ分析のために細菌を収集するために、中耳腔を洗浄することが重要であった。従って、この分析は、ＮＴＨｉが粘膜にゆるく付着する場合、アップレギュレートされる遺伝子を含む。ＮＴＨｉは、ＯＭのチンチラモデルにおいて中耳腔内に生物膜を形成することが観察された（Ｅｒｈｌｉｃｈら、ＪＡＭＡ，２８７；１７１０−５，２００２）。本明細書中に記載されるプロトコルがプランクトンの集団から回収されるクローンを選択するので、細菌が粘膜生体膜と関連する場合、遺伝子がアップレギュレートされるクローンを回収することは予期されない。しかし、中耳粘膜の均質化および引き続く細菌細胞の単離によって、本発明者らは、これらのクローンを回収し得る。いくつかのＧＦＰ発現クローンがこの浸出液において回収されたが、剥離した細胞として浸出液中にまたは凝集物中に存在する真核生物細胞に付着したこともあり得る。これらの細菌は、選別効率を損なうことなく浸出液から回収することは困難である。従って、中耳分泌液を粘液溶解剤を用いて処理し、次いで、遠心分離して、標識化する前に、大きな凝集物および真核生物細胞を除去した。
【０１０５】
必要な場合に、チンチラの中耳の分泌液を、滅菌した生理食塩水を用いて２５０μｌまで希釈した。等量のＤＰＢＳ中のＮ−アセチル−Ｌ−システイン（０．５％；ｗ／ｖ）（ｐＨ ７．４）を、粘液溶解剤として室温で５分間添加した（ＭｉｙａｍｏｔｏおよびＢａｋａｌｅｔｚ，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．，２１：３４３〜３５６ １９９６）。分泌液を、細胞の残屑、赤血球、および炎症性細胞を除去するために遠心分離し（３００×ｇ、５分間）、そして細菌を含有する上清を、新しいチューブへ移した。細菌を、ＮＴＨｉ菌株８６−０２８ＮＰに由来する、全ＯＭＰ調製物に対して指向されるチンチラ抗血清（１：５０希釈）と共に、４℃で４５分間インキュベートし、遠心分離（２０００×ｇ、５分間）によってペレット化し、そして０．０５％ウシ血清アルブミンを含有する冷ＤＰＢＳを用いて２回洗浄した。続いて、細菌を、交差反応性フィコプローブ（ｐｈｙｃｏｐｒｏｂｅ）Ｒ−ＰＥ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（１００μｌＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ；Ｂｉｏｍｅｄａ Ｃｏｒｐ）を用いて、４℃で３０分間標識した。非結合の抗体を除去するために連続して３回洗浄し、続いて、細胞を、ＦＡＣＳ分析のために３００μｌ ＤＰＢＳに再懸濁した。
【０１０６】
（実施例６）
（急性中耳炎におけるインビボで誘導したプロモーターの同定）
プロモータートラップライブラリーを用いて形質転換したＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ８６−０２８ＮＰを、チョコレート寒天で一晩増殖させた。インビトロでｇｆｐを発現したプロモーターを含有するこれらクローンを選択するために、上記ライブラリーを、１回のＦＡＣＳ分析に供し（実施例６に記載するように）、低レベル量のＧＦＰを発現しているこれらのクローンのみを回収した。これらのクローンを、プールして、チンチラの中耳の骨胞を経由して（ｔｒａｎｓｂｕｌｌａｒｌｙ）接種するために用いた。注射の２４時間および４８時間の後、細菌含有滲出液を、鼓室または鼓膜の上部の穿刺によって除去した。細菌をＲ−ＰＥ標識化抗体を用いて間接的に標識し、蛍光タグ化された細菌のゲーティングによるが、発現もしている細菌について選別することによってＦＡＣＳ分析に供した。これらのクローンを、さらに富化するために動物を再感染させるために用いた。最終回の選別の後、単一のコロニー単離体を、蛍光の欠如についてインビトロでスクリーニングした。
【０１０７】
インビトロで蛍光を発していなかった、ＦＡＣＳ分析によって単離したこれらのクローン（インビボでＧＦＰ蛍光について陽性）を、プラスミド単離および挿入したＤＮＡ配列の同定のために調製した。これらのクローンを、カナマイシンを含有するチョコレート寒天プレートで一晩増殖させ、製造者のプロトコルに従ってＱｉａｐｒｅｐ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミド単離のために調製した。プラスミド挿入ＤＮＡを、ｇｆｐｍｕｔ３遺伝子に相補的であり、かつ挿入ＤＮＡの下流であるプライマー５’−ＴＧＣＣＣＡＴＴＡＡＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴＡ−３’（配列番号５８８）を用いて配列決定した。配列決定反応を、製造者のプロトコルに従って、ＡＢＩ ｐｒｉｓｍ ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）ターミネーター・サイクル・シークエンシング・レディー・リアクション・キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施した。この配列を次いで、９６ウェル・マルチスクリーンＨＶプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中のセファデックスＧ−５０を通過させることによって精製し、続いてＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ３１００ ＤＮＡアナライザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。
【０１０８】
挿入配列を、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ菌株Ｒｄの注釈をつけた全配列と比較した。菌株Ｒｄとヌクレオチド相同性を有さないこれらの挿入物を続いて、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸアルゴリズムを用いて分析した。さらに配列分析を、ＤＮＡＳＴＡＲ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ）を用いて実施した。正しい向きでかつ推定ＯＲＦの５’側配列を含む挿入物は、ＮＴＨｉ細菌が、チンチラの中耳に存在する場合、優先的に活性化した推定プロモーターを含有した。
【０１０９】
インビボで調節される推定プロモーターを有する５２個のクローンを、単離した。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ菌株Ｒｄに同定された配列と類似する配列を含む４４個の候補クローンの、インビトロおよびインビボでの遺伝子発現の定量的な比較によって、ＮＴＨｉが、チンチラの中耳内に存在する周囲のきっかけに応答する場合、２６個の遺伝子（６０％）がアップレギュレートした遺伝子発現があることを確認した。これらの遺伝子を以下の表４Ａに要約した。遺伝子発現を駆動するインビボ調節プロモーターは、膜輸送、周囲の情報のプロセシング、細胞の代謝、遺伝子調節、および未知の機能を有する仮想タンパク質に関係していると予測される。
【０１１０】
インビボで推定プロモーター候補の誘導を確認するために、ＮＴＨｉ菌株８６−０２８ＮＰが、インビトロで中間対数期まで、またはインビボで４８時間増殖させた場合に、メッセンジャーＲＮＡ発現の相対量を、比較した。このＲＮＡを、製造者のプロトコルに従って、ＴＲＩｚｏｌ ＬＳ試薬（Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて単離した。ＤＮＡを、製造者のプロトコルに従って、ＤＮＡフリー・キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてＲＮＡ調製物から除去した。ＤＮａｓｅ Ｉ処理したＲＮＡサンプルを、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙカラムを通過させることによって精製した。ＲＮＡの純度および完全性を、２６０／２８０ｎｍ分光光度計読み取りおよびＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によってそれぞれ、調べた。
【０１１１】
ＦＡＣＳデータを独立に確認するために、本発明者らは、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって候補遺伝子の相対的な発現を決定した。親株８６−０２８ＮＰを、これらの研究に用いた。製造者の説明書に従って、ワン・ステップＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いるリアル・タイム定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、転写レベルを調べた。簡単に言えば、ＦＡＣＳ分析によって同定した推定上のインビボで誘導されるプロモーターのオープン・リーディング・フレームの下流に作製したプライマーを用いて、遺伝子特異的ｍＲＮＡを、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００シークエンス・ディテクション・システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でのＲＴ−ＰＣＲによって、逆転写し、増幅した。産物の量を、ジャイレース（ｇｙｒ）遺伝子のフラグメントを増幅することによって、既知量の細菌のゲノムＤＮＡ（１０２〜１０７個のゲノムコピーＤＮＡ）について作製した検量線を用いて計算した。ＲＮＡ調製物（−ＲＴコントロール）中にＤＮＡが存在しないことおよび鋳型ＲＮＡのないコントロールサンプル中にプライマーダイマーが無いことを確認するために、コントロールを、同時に分析した。さらに、ＲＴ−ＰＣＲ産物を、ゲル電気泳動によって分析した。全ての場合において、単一の産物を、適切な塩基対サイズで観察した。サンプル間の細菌ＲＮＡの量を、インビトロで本発明者らが試験した種々の増殖条件の下、構成的に発現することを示す、ｇｙｒ発現に対して標準化した。既知量の細菌ゲノムＤＮＡ（１０２〜１０７個のゲノムコピーＤＮＡ）を用いて、ジャイレース（ｇｙｒ）遺伝子のフラグメントを増幅することによるＲＴ−ＰＣＲ定量のための標準曲線を作製した。ジャイレースは、種々の増殖条件の下インビトロで構成的に発現し、そのためサンプル間の全細菌ＲＮＡレベルの標準化のために用いた。インビボでの相対的な遺伝子発現を、インビトロでの遺伝子発現と比較し、倍率増加（ｆｏｌｄ−ｉｎｃｒｅａｓｅ）データを、表４に要約する。
【０１１２】
ＮＴＨｉゲノムの８倍の配列決定は、表４Ａに列挙した大部分の遺伝子についての全長オープン・リーディング・フレームを同定した。表４Ｂは、ＮＴＨｉゲノムおよび対応するアミノ酸配列内の全長ヌクレオチド配列を提供する。遺伝子の誘導倍率は、チンチラの中耳内に存在する周囲のきっかけに起因し、遺伝子の産物または機能を、便宜のために表４Ｂに繰り返す。
【０１１３】
【表４Ａ】
【０１１４】
【表４Ｂ−１】
【０１１５】
【表４Ｂ−２】
（実施例７）
（ビルレンス関連遺伝子の同定）
多くの細菌種において、ビルレンス関連遺伝子のサブセットは、短いリピートの複製における誤りによって調節される。これらのリピートは、遺伝子の５’またはコード配列内であり得、これらの存在は、ビルレンスと関連することを示す遺伝子の制御発現の指標である。リピートの付加または欠失は、特定のビルレンス決定因子の発現または発現を欠く結果を生じる。
【０１１６】
ＮＴＨｉ Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ菌株８６−０２８ＮＰコンティグセットは、短いオリゴヌクレオチド・リピートについて問い合わせた。このリピート周辺の領域を、このリピートに関連する遺伝子を同定するために分析した。表５に、同定したリピートおよび各リピートに関連するＯＲＦ（ＢＬＡＳＴによって同定した）を列挙する。
【０１１７】
さらに配列分析によって、ビルレンス関連遺伝子の全長ヌクレオチド配列およびＯＲＦによってコードされる対応するアミノ酸配列を同定した。誘導したアミノ酸配列は、列挙したＧｅｎｂａｎｋ配列と高い相同性である
【０１１８】
【表５−１】
【０１１９】
【表５−２】
（実施例８）
（独特のＮＴＨｉ遺伝子配列の同定）
ＮＴＨｉ毒性に関連する遺伝子をまた、ＮＴＨｉ細菌属が、組織に感染している場合の遺伝子発現レベルとＮＴＨｉを、人工的な検査室培地で増殖させた場合の同一遺伝子発現レベルとを比較することによって同定した。これらの新規遺伝子を、実施例４〜６の上記プロモーター・トラップ技術を用いて同定し、続いて公知のＲｄゲノムとの比較によってこれらの遺伝子がＮＴＨｉ菌株８６−０２８ＮＰに特有であることを示した。
【０１２０】
このスクリーニング方法を用いて同定したＤＮＡ配列を、配列番号５７７〜５８０として示す。これらの配列は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｄ．ゲノム配列と相同性を有する遺伝子または遺伝子フラグメントを含まなかった。これらは、完全に新規配列であるが、チンチラの中耳におけるＮＴＨｉ感染の間の遺伝子の発現レベルに起因して、これら遺伝子の発現は、ＮＴＨｉ毒性に関係する可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】図１は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ単離物のパネルにおけるＬＫＰ遺伝子領域を示す。８６−０２８ＮＰ株の配列は、この領域において、ＮＴＨｉＲ３００１株における配列と同一である。これらのＮＴＨｉの両方は、血球凝集性線毛をコードするｈｉｆ遺伝子クラスターを欠損している。
【図２】図２は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ単離物のパネルにおけるｒｆａＤ領域を示す。８６−０２８ＮＰ株のゲノムのｒｆａＤ領域における遺伝子の配置は、Ｒｄ株のゲノムの配置と類似するが、検査したほとんどのＮＴＨｉのゲノムにおいて見られるこれらの遺伝子の配置とは異なる。
【図３Ａ】図３Ａ〜図３Ｍは、表４に示されるヌクレオチド配列（配列番号５８９〜６１４）を提示する。これらは、ＯＭ感染の間にアップレギュレートされたと同定された（実施例６を参照のこと）。配列番号１〜５７６として提示される、既知の遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）およびコンティグ配列に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）もまた、示される。
【図３Ｂ】図３Ａ〜図３Ｍは、表４に示されるヌクレオチド配列（配列番号５８９〜６１４）を提示する。これらは、ＯＭ感染の間にアップレギュレートされたと同定された（実施例６を参照のこと）。配列番号１〜５７６として提示される、既知の遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）およびコンティグ配列に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）もまた、示される。
【図３Ｃ】図３Ａ〜図３Ｍは、表４に示されるヌクレオチド配列（配列番号５８９〜６１４）を提示する。これらは、ＯＭ感染の間にアップレギュレートされたと同定された（実施例６を参照のこと）。配列番号１〜５７６として提示される、既知の遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）およびコンティグ配列に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）もまた、示される。
【図３Ｄ】図３Ａ〜図３Ｍは、表４に示されるヌクレオチド配列（配列番号５８９〜６１４）を提示する。これらは、ＯＭ感染の間にアップレギュレートされたと同定された（実施例６を参照のこと）。配列番号１〜５７６として提示される、既知の遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）およびコンティグ配列に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）もまた、示される。
【図３Ｅ】図３Ａ〜図３Ｍは、表４に示されるヌクレオチド配列（配列番号５８９〜６１４）を提示する。これらは、ＯＭ感染の間にアップレギュレートされたと同定された（実施例６を参照のこと）。配列番号１〜５７６として提示される、既知の遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）およびコンティグ配列に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）もまた、示される。
【図３Ｆ】図３Ａ〜図３Ｍは、表４に示されるヌクレオチド配列（配列番号５８９〜６１４）を提示する。これらは、ＯＭ感染の間にアップレギュレートされたと同定された（実施例６を参照のこと）。配列番号１〜５７６として提示される、既知の遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）およびコンティグ配列に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）もまた、示される。
【図３Ｇ】図３Ａ〜図３Ｍは、表４に示されるヌクレオチド配列（配列番号５８９〜６１４）を提示する。これらは、ＯＭ感染の間にアップレギュレートされたと同定された（実施例６を参照のこと）。配列番号１〜５７６として提示される、既知の遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）およびコンティグ配列に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）もまた、示される。
【図３Ｈ】図３Ａ〜図３Ｍは、表４に示されるヌクレオチド配列（配列番号５８９〜６１４）を提示する。これらは、ＯＭ感染の間にアップレギュレートされたと同定された（実施例６を参照のこと）。配列番号１〜５７６として提示される、既知の遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）およびコンティグ配列に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）もまた、示される。
【図３Ｉ】図３Ａ〜図３Ｍは、表４に示されるヌクレオチド配列（配列番号５８９〜６１４）を提示する。これらは、ＯＭ感染の間にアップレギュレートされたと同定された（実施例６を参照のこと）。配列番号１〜５７６として提示される、既知の遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）およびコンティグ配列に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）もまた、示される。
【図３Ｊ】図３Ａ〜図３Ｍは、表４に示されるヌクレオチド配列（配列番号５８９〜６１４）を提示する。これらは、ＯＭ感染の間にアップレギュレートされたと同定された（実施例６を参照のこと）。配列番号１〜５７６として提示される、既知の遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）およびコンティグ配列に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）もまた、示される。
【図３Ｋ】図３Ａ〜図３Ｍは、表４に示されるヌクレオチド配列（配列番号５８９〜６１４）を提示する。これらは、ＯＭ感染の間にアップレギュレートされたと同定された（実施例６を参照のこと）。配列番号１〜５７６として提示される、既知の遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）およびコンティグ配列に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）もまた、示される。
【図３Ｌ】図３Ａ〜図３Ｍは、表４に示されるヌクレオチド配列（配列番号５８９〜６１４）を提示する。これらは、ＯＭ感染の間にアップレギュレートされたと同定された（実施例６を参照のこと）。配列番号１〜５７６として提示される、既知の遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）およびコンティグ配列に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）もまた、示される。
【図３Ｍ】図３Ａ〜図３Ｍは、表４に示されるヌクレオチド配列（配列番号５８９〜６１４）を提示する。これらは、ＯＭ感染の間にアップレギュレートされたと同定された（実施例６を参照のこと）。配列番号１〜５７６として提示される、既知の遺伝子に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）およびコンティグ配列に対応するヌクレオチド（ｎｔ．）もまた、示される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、配列番号５７７〜５７９、配列番号５８９〜６１４、配列番号６７５〜６８５、配列番号６１５、配列番号６１７、配列番号６１９、配列番号６２１、配列番号６２３、配列番号６２５、配列番号６２７、配列番号６２９、配列番号６３１、配列番号６３３、配列番号６３５、配列番号６３７、配列番号６３９、配列番号６４１、配列番号６４３、配列番号６４５、配列番号６４７、配列番号６４９、配列番号６５１、配列番号６５３、配列番号６５５、配列番号６５７、配列番号６５９、配列番号６６１、配列番号６６３、配列番号６６５、配列番号６６７、配列番号６６９、配列番号６７１、配列番号６７３、配列番号６８６、配列番号６８８、配列番号６９２、配列番号６９４、配列番号６９６、配列番号６９８、配列番号７００、配列番号７０２、配列番号７０４、配列番号７０６、配列番号７０８、配列番号７１０、配列番号７１２、配列番号７１４、配列番号７１６、配列番号７１８、配列番号７２０、配列番号７２２、配列番号７２４、配列番号７２６、配列番号７２８、配列番号７３０、配列番号７３２、配列番号７３４、配列番号７３６、配列番号７３８、配列番号７４０、配列番号７４２、配列番号７４４、配列番号７４６、配列番号７４８、配列番号７５０、配列番号７５２、配列番号７５４、配列番号７５６、配列番号７５８、配列番号７６０、配列番号７６２、配列番号７６４、配列番号７６６、配列番号７６８または配列番号７７０のいずれか一つのヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に示されたヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドまたはそのフラグメント。
【請求項３】
単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号６１６、配列番号６１８、配列番号６２０、配列番号６２２、配列番号６２４、配列番号６２６、配列番号６２８、配列番号６２８、配列番号６３０、配列番号６３２、配列番号６３４、配列番号６３６、配列番号６３８、配列番号６４０、配列番号６４２、配列番号６４４、配列番号６４６、配列番号６４８、配列番号６５０、配列番号６５２、配列番号６５４、配列番号６５６、配列番号６５８、配列番号６６０、配列番号６６２、配列番号６６４、配列番号６６６、配列番号６６８、配列番号６７０、配列番号６７２、配列番号６７４、配列番号６８７、配列番号６８９、配列番号６９１、配列番号６９３、配列番号６９５、配列番号６９７、配列番号６９９、配列番号７０１、配列番号７０３、配列番号７０５、配列番号７０７、配列番号７０９、配列番号７１１、配列番号７１３、配列番号７１５、配列番号７１７、配列番号７１９、配列番号７２１、配列番号７２３、配列番号７２５、配列番号７２７、配列番号７２９、配列番号７３１、配列番号７３３、配列番号７３５、配列番号７３７、配列番号７３９、配列番号７４１、配列番号７４３、配列番号７４５、配列番号７４７、配列番号７４９、配列番号７５１、配列番号７５３、配列番号７５５、配列番号７５７、配列番号７５９、配列番号７６１、配列番号７６３、配列番号７６５、配列番号７６７、配列番号７６９または配列番号７７１のいずれか一つのアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項４】
請求項２または請求項３に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物。
【請求項５】
請求項２もしくは請求項３に記載のポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合する抗体。
【請求項６】
請求項５に記載の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物。
【請求項７】
生物学的サンプル中のＮＴＨｉ細菌を検出するための方法であって、該方法は、
（ａ）請求項１に記載のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントと生物学的サンプルとを接触させる工程、および
（ｂ）該サンプル中の該ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項８】
生物学的サンプル中のＮＴＨｉ細菌を検出するための方法であって、該方法は、
（ａ）請求項５に記載の抗体と生物学的サンプルとを接触させる工程、および
（ｂ）該サンプル中の該抗体の結合を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項９】
前記生物学的サンプルは、血清、唾液、耳の分泌液、血液、尿、リンパ液、および脳脊髄液からなる群より選択される、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
ＮＴＨｉ細菌に対する免疫応答を誘導するための方法であって、該方法は、免疫原性的に有効量の請求項２もしくは３に記載のポリペプチドまたはそのフラグメントをＮＴＨｉ細菌感染の危険にある患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１１】
請求項２もしくは３に記載のポリペプチドまたはそのフラグメントおよび薬学的に適切なキャリアを含むワクチン。
【請求項１２】
ＮＴＨｉ細菌感染を防止するための方法であって、該方法は、ＮＴＨｉの細胞接着をブロックする請求項２または３に記載のポリペプチドをＮＴＨｉ細菌感染の危険にある患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１３】
ＮＴＨｉ細菌感染を防止するための方法であって、該方法は、ＮＴＨｉの細胞接着をブロックする請求項５に記載の抗体をＮＴＨｉ細菌感染の危険にある患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１４】
前記ＮＴＨｉ感染は、中耳内である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＮＴＨｉ細菌感染を処置または防止するための方法であって、該方法は、請求項２もしくは３に記載のポリペプチドの発現または活性を阻害する分子を必要とする患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記ＮＴＨｉポリペプチドは、ｈｉｓＢ、ｌｐｐＢ、ｓａｐＡ、ｒｂｓＣ、ｐｕｒｅ、ｒｉｂ、ａｒｃＢ，ｕｘｕＡ、ｌｉｃＣ、ｉｓｐＺ、ｍｕｋＦ、ｇｌｐＲ、ｉｈｆＢ、ｃｓｐＤ、ｌａｖ、ＨＩ１６４７、ＨＩ００９４、ＨＩ１１６３、ＨＩ０６６５、ＨＩ１２９２、ＨＩ１０６４、ＨＩ１３８６、ＨＩ１４６２、ＨＩ１３６９、およびＨＩ１５９８からなる群より選択されるＮＴＨｉ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法であって、前記ＮＴＨｉポリペプチドは、配列番号６１６、配列番号６１８、配列番号６２０、配列番号６２２、配列番号６２４、配列番号６２６、配列番号６２８、配列番号６３４、配列番号６３８、配列番号６４２、配列番号６４４、配列番号６４６、配列番号６５０、配列番号６５２、配列番号６５６、配列番号６５８、配列番号６６０、配列番号６６２、配列番号６６４、配列番号６６６、配列番号６６８、配列番号６７０、配列番号６７２および配列番号６７４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項１８】
前記必要とする患者に投与される前記分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記必要とする患者に投与される前記分子は、抗体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記必要とする患者に投与される前記分子は、低分子である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＮＴＨｉ感染は、中耳内である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１】
単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、配列番号５７７〜５７９、配列番号５８９〜６１４、配列番号６７５〜６８５、配列番号６１５、配列番号６１７、配列番号６１９、配列番号６２１、配列番号６２３、配列番号６２５、配列番号６２７、配列番号６２９、配列番号６３１、配列番号６３３、配列番号６３５、配列番号６３７、配列番号６３９、配列番号６４１、配列番号６４３、配列番号６４５、配列番号６４７、配列番号６４９、配列番号６５１、配列番号６５３、配列番号６５５、配列番号６５７、配列番号６５９、配列番号６６１、配列番号６６３、配列番号６６５、配列番号６６７、配列番号６６９、配列番号６７１、配列番号６７３、配列番号６８６、配列番号６８８、配列番号６９２、配列番号６９４、配列番号６９６、配列番号６９８、配列番号７００、配列番号７０２、配列番号７０４、配列番号７０６、配列番号７０８、配列番号７１０、配列番号７１２、配列番号７１４、配列番号７１６、配列番号７１８、配列番号７２０、配列番号７２２、配列番号７２４、配列番号７２６、配列番号７２８、配列番号７３０、配列番号７３２、配列番号７３４、配列番号７３６、配列番号７３８、配列番号７４０、配列番号７４２、配列番号７４４、配列番号７４６、配列番号７４８、配列番号７５０、配列番号７５２、配列番号７５４、配列番号７５６、配列番号７５８、配列番号７６０、配列番号７６２、配列番号７６４、配列番号７６６、配列番号７６８または配列番号７７０のいずれか一つのヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に示されたヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドまたはそのフラグメント。
【請求項３】
単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号６１６、配列番号６１８、配列番号６２０、配列番号６２２、配列番号６２４、配列番号６２６、配列番号６２８、配列番号６２８、配列番号６３０、配列番号６３２、配列番号６３４、配列番号６３６、配列番号６３８、配列番号６４０、配列番号６４２、配列番号６４４、配列番号６４６、配列番号６４８、配列番号６５０、配列番号６５２、配列番号６５４、配列番号６５６、配列番号６５８、配列番号６６０、配列番号６６２、配列番号６６４、配列番号６６６、配列番号６６８、配列番号６７０、配列番号６７２、配列番号６７４、配列番号６８７、配列番号６８９、配列番号６９１、配列番号６９３、配列番号６９５、配列番号６９７、配列番号６９９、配列番号７０１、配列番号７０３、配列番号７０５、配列番号７０７、配列番号７０９、配列番号７１１、配列番号７１３、配列番号７１５、配列番号７１７、配列番号７１９、配列番号７２１、配列番号７２３、配列番号７２５、配列番号７２７、配列番号７２９、配列番号７３１、配列番号７３３、配列番号７３５、配列番号７３７、配列番号７３９、配列番号７４１、配列番号７４３、配列番号７４５、配列番号７４７、配列番号７４９、配列番号７５１、配列番号７５３、配列番号７５５、配列番号７５７、配列番号７５９、配列番号７６１、配列番号７６３、配列番号７６５、配列番号７６７、配列番号７６９または配列番号７７１のいずれか一つのアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項４】
請求項２または請求項３に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物。
【請求項５】
請求項２もしくは請求項３に記載のポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合する抗体。
【請求項６】
請求項５に記載の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物。
【請求項７】
生物学的サンプル中のＮＴＨｉ細菌を検出するための方法であって、該方法は、
（ａ）請求項１に記載のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントと生物学的サンプルとを接触させる工程、および
（ｂ）該サンプル中の該ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項８】
生物学的サンプル中のＮＴＨｉ細菌を検出するための方法であって、該方法は、
（ａ）請求項５に記載の抗体と生物学的サンプルとを接触させる工程、および
（ｂ）該サンプル中の該抗体の結合を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項９】
前記生物学的サンプルは、血清、唾液、耳の分泌液、血液、尿、リンパ液、および脳脊髄液からなる群より選択される、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
ＮＴＨｉ細菌に対する免疫応答を誘導するための方法であって、該方法は、免疫原性的に有効量の請求項２もしくは３に記載のポリペプチドまたはそのフラグメントをＮＴＨｉ細菌感染の危険にある患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１１】
請求項２もしくは３に記載のポリペプチドまたはそのフラグメントおよび薬学的に適切なキャリアを含むワクチン。
【請求項１２】
ＮＴＨｉ細菌感染を防止するための方法であって、該方法は、ＮＴＨｉの細胞接着をブロックする請求項２または３に記載のポリペプチドをＮＴＨｉ細菌感染の危険にある患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１３】
ＮＴＨｉ細菌感染を防止するための方法であって、該方法は、ＮＴＨｉの細胞接着をブロックする請求項５に記載の抗体をＮＴＨｉ細菌感染の危険にある患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１４】
前記ＮＴＨｉ感染は、中耳内である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＮＴＨｉ細菌感染を処置または防止するための方法であって、該方法は、請求項２もしくは３に記載のポリペプチドの発現または活性を阻害する分子を必要とする患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記ＮＴＨｉポリペプチドは、ｈｉｓＢ、ｌｐｐＢ、ｓａｐＡ、ｒｂｓＣ、ｐｕｒｅ、ｒｉｂ、ａｒｃＢ，ｕｘｕＡ、ｌｉｃＣ、ｉｓｐＺ、ｍｕｋＦ、ｇｌｐＲ、ｉｈｆＢ、ｃｓｐＤ、ｌａｖ、ＨＩ１６４７、ＨＩ００９４、ＨＩ１１６３、ＨＩ０６６５、ＨＩ１２９２、ＨＩ１０６４、ＨＩ１３８６、ＨＩ１４６２、ＨＩ１３６９、およびＨＩ１５９８からなる群より選択されるＮＴＨｉ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法であって、前記ＮＴＨｉポリペプチドは、配列番号６１６、配列番号６１８、配列番号６２０、配列番号６２２、配列番号６２４、配列番号６２６、配列番号６２８、配列番号６３４、配列番号６３８、配列番号６４２、配列番号６４４、配列番号６４６、配列番号６５０、配列番号６５２、配列番号６５６、配列番号６５８、配列番号６６０、配列番号６６２、配列番号６６４、配列番号６６６、配列番号６６８、配列番号６７０、配列番号６７２および配列番号６７４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項１８】
前記必要とする患者に投与される前記分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記必要とする患者に投与される前記分子は、抗体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記必要とする患者に投与される前記分子は、低分子である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＮＴＨｉ感染は、中耳内である、請求項１５に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図３Ｇ】
【図３Ｈ】
【図３Ｉ】
【図３Ｊ】
【図３Ｋ】
【図３Ｌ】
【図３Ｍ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図３Ｇ】
【図３Ｈ】
【図３Ｉ】
【図３Ｊ】
【図３Ｋ】
【図３Ｌ】
【図３Ｍ】
【公表番号】特表２００６−５１９６０５（Ｐ２００６−５１９６０５Ａ）
【公表日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０６９４２（Ｐ２００６−５０６９４２）
【出願日】平成１６年３月５日（２００４．３．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００７００１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７８９４９
【国際公開日】平成１６年９月１６日（２００４．９．１６）
【出願人】（５０２２００８３０）チルドレンズ ホスピタル， インコーポレイテッド (11)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年３月５日（２００４．３．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００７００１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７８９４９
【国際公開日】平成１６年９月１６日（２００４．９．１６）
【出願人】（５０２２００８３０）チルドレンズ ホスピタル， インコーポレイテッド (11)
【Ｆターム（参考）】
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