風疹ウイルスに特異的な抗体
本発明は、風疹ウイルス（Ｒｕｂｅｌｌａ ｖｉｒｕｓ：ＲｕＶ）に結合し、中和する新規な抗体配列を提供する。この新規な配列は、ＲｕＶ感染の医学的管理、特に、このウイルスを検出するために、又は医薬組成物を製造するために使用することができる。このような抗体配列によって認識されるＲｕＶ特異的抗原は、ペプチドを提示する新規なファージライブラリーを用いて同定することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ウイルスに結合し、ウイルスに特異的な活性を中和するファージディスプレイライブラリーから単離された新規な抗体配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ファージディスプレイ技術は、細胞の表面に発現され、標的と相互作用後に生物学的機能を発揮し得るポリペプチド（抗体フラグメント、生物活性ペプチド、酵素など）をクローニングし、選択し、操作するためのバクテリア細胞（例えば、大腸菌細胞）を感染させる線状ファージ（Ｍ１３など）のゲノムの小さなサイズ及び適応性を利用する。
【０００３】
いくつかのクローニング及び発現戦略、ベクター、ライブラリー、ファージを繁殖させる方法、スクリーニングアッセイは、異なる用途のために開発されている。論文（Ｂｒａｄｂｕｒｙ Ａ ａｎｄ Ｍａｒｋｓ Ｊ，２００４；Ｍａｎｃｉｎｉ Ｎ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｃｏｎｒａｄ Ｕ ａｎｄ Ｓｃｈｅｌｌｅｒ Ｊ，２００５；Ｈｕｓｔ Ｍ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ Ｓ，２００５）及び書籍（“Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”，ｖｏｌ．２６６，ｅｄ．Ｃｌａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｌｏｗｍａｎ Ｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，２００４；“Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，ｅｄ．Ｂｕｒｔｏｎ Ｄ ｅｔ ａｌ．，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，２００１）に概説されている。
【０００４】
ファージディスプレイライブラリーは、組換えファージの集団によって形成され、各々は、その表面上にタンパク質配列のレパートリーの１つの要素を提示する。特定のタンパク質を発現するファージは、反復親和性及び／又は活性に基づく選択プロセス（「パンニング」）によってライブラリーから単離することができる。例えば、タンパク質は、生物学的及び機能的アッセイにおいて、抗原に対する特定の結合親和性又は活性に基づいて、単離され、特徴付けることができる、可変重鎖／軽鎖ヘテロ二量体（通常、Ｆａｂと称される）又は一本鎖フラグメント可変部（ｓｃＦｖ）の形態で抗体フラグメントであってもよい。
【０００５】
特に、スクリーニングプロセスは、病原体及び生物学的標的物に高親和性及び特異性を有する抗体フラグメントを同定するために開発されつつあり、時として、関連する生物学的活性は、このような結合特性と関係している。実際に、全体の治療アプローチ（受動免疫療法又は受動血清療法と称される）は、ヒト又は非ヒト治療標的物に指向される抗体及び抗体フラグメントの抗原結合特性に基づいている（Ｄｕｎｍａｎ Ｐ ａｎｄ Ｎｅｓｉｎ Ｍ，２００３；Ｋｅｌｌｅｒ Ｍ ａｎｄ Ｓｔｉｅｈｍ Ｅ，２０００）。受動免疫療法は、病原性抗原（毒素、ヒトタンパク質、ウイルス、又は寄生生物など）に対する所定の結合特性を有する治療用抗体を含む医薬組成物の個体への投与からなる。
【０００６】
受動免疫療法は臨床診療に導入され、広範囲な疾患（例えば、感染症、免疫を媒介した疾患及び癌）の治療のための機会を急速に拡張する。このアプローチは、標的化された分子をブロックし、及び／又は排除するために必要とされる量で及び／又は特異性をもって、免疫系がそれらを生産することができない患者において特に効果的であり得る（Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ Ｌ，２００５；Ｌａｆｆｌｙ Ｅ ａｎｄ Ｓｏｄｏｙｅｒ Ｒ，２００５）。
【０００７】
治療用抗体を用いて標的化され得る病原性抗原のうち、ヒト細胞に影響を与えるウイルスが特に重要である。このような抗体の投与は、患者におけるウイルスの繁殖を阻害し、集団におけるウイルス感染の大発生を潜在的にブロックすることができる。あるいは、抗体は、免疫応答性個体の健康に重篤及び／又は持続的な結果を通常な有しないものを含む感染症に非常に感受性となる多かれ少なかれ延長された期間、免疫系が弱まった患者（例えば、免疫抑制された個体、高齢者、又は移植された個体）に投与されてもよい。
【０００８】
風疹ウイルス（ＲｕＶ、三日麻疹）は、このようなウイルスの一例である。ＲｕＶは、ＲＮＡゲノム、２つの非構造的タンパク質、宿主由来の脂質二重層に組み合わせられる３つのウイルス構造タンパク質（Ｅ１、Ｅ２、及びＣ）によって形成されるビリオンエンベロープを提示するトガウイルスファミリーのメンバーである（Ｂａｎａｔｖａｌａ Ｊ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ Ｄ，２００４；Ｌｅｅ Ｊ ａｎｄ Ｂｏｗｄｅｎ Ｄ，２０００；“Ｒｕｂｅｌｌａ Ｖｉｒｕｓｅｓ”Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｅｄ．Ｂａｎａｔｖａｌａ Ｊ ａｎｄ Ｐｅｃｋｈａｍ Ｃ，ｖｏｌ．１５，２００６，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）。
【０００９】
ＲｕＶは、感染した個体の鼻咽頭分泌物、血液、排泄物、尿に存在し、呼吸噴霧を介して、ヒトからヒトへと伝染される。Ｒｕｖは、神経向性ウイルスであり、初期には、神経系細胞（例えば、乏突起膠細胞）に感染するが、ＲｕＶ菌株は、種々の細胞型、特に神経及び関節組織（例えば、滑膜細胞）において感染し、複製し、持続する能力において変化する。ウイルス性アルトロトロピスム（ａｒｔｈｒｏｔｒｏｐｉｓｍ）は、関節症状とのＲｕＶ感染の関係を説明することができる（Ｌｕｎｄ Ｋ ａｎｄ Ｃｈａｎｔｌｅｒ Ｊ，２０００；Ｍａｓｕｋｏ−Ｈｏｎｇｏ Ｋ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ＲｕＶは、感染した細胞における細胞変性効果、アポトーシス、細胞周期停止を誘導する。実際には、ＲｕＶタンパク質は、タンパク質−タンパク質相互作用、遺伝子発現、及びタンパク質リン酸化と干渉することによって、宿主の細胞シグナル伝達及び代謝を修飾する（Ｈｏｆｍａｎｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｃｏｏｒａｙ Ｓ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ａｔｒｅｙａ Ｃ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｄｏｍｅｇａｎ Ｌ ａｎｄ Ａｔｋｉｎｓ Ｇ，２００２；Ａｄａｍｏ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｆｉｇｕｅｒｅｉｄｏ Ａ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
【００１０】
ＲｕＶは、一般に、軽度の疾病に関与し、曝露後の１６〜２０日間で発症し、主に顔及び四肢に観られる微熱及び多発を有する。また、ＲｕＶ感染は、全くの無症状である場合がある。ＲｕＶは、成人では、合併症、例えば感染後の脳障害、血小板減少性紫斑病、出血兆候、又は関節炎をめったに引き起こさない（Ｂａｎａｔｖａｌａ Ｊ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ Ｄ，２００４）。また、ＲｕＶ感染は、一連の眼障害、例えば、フックス虹彩毛様体炎に関与している（Ｄｅ Ｇｒｏｏｔ−Ｍｉｊｎｅｓ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２００６）。
【００１１】
しかしながら、ＲｕＶ感染は、感染した患者が妊娠女性、特に、発展途上国及び移民集団である場合には、主要な関心事になる。母体感染が必ずしも胎児感染に続かないとしても、胎盤障壁を横断し、胎児組織を感染する能力を有する。妊娠の最初の１２週間でのＲｕＶ感染は、８０〜９０％の症例において、胎児の死亡、又は様々な異なる以上をもたらし、通常、Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ Ｒｕｂｅｌｌａ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＣＲＳ）の定義下で分類され、例えば、心臓欠陥及び眼の欠陥、難聴、及び精神発達遅滞などが挙げられる。妊娠のその次の週に感染が見られる場合にはその危険性は減少するが、ウイルス性奇形発生を起因とした胎児障害も存在する場合がある（Ｈｉｎｍａｎ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｌｅｅ Ｊ ａｎｄ Ｂｏｗｄｅｎ Ｄ，２０００；Ａｔｒｅｙａ Ｃ ｅｔ ａｌ．，２００４）。さらに、偽陽性からの最近のＲｕＶ感染に起因する抗体、又は感染若しくはワクチン接種後の何カ月も持続している抗体に起因する抗体を区別することを可能にする血清診断アッセイは、十分に信頼できるわけではない（Ａｎｄｒｅｗｓ Ｊ，２００４；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ Ｅ ｅｔ ａｌ．，２００６）。
【００１２】
ＲｕＶワクチン接種は、工業世界において幅広く確立され、ＣＲＳ及びＲｕＶ誘導の胎児死亡の減少に非常に効果的である。それにもかかわらず、最近の大発生における野生型ＲｕＶゲノムの遺伝的特徴は、さらに、初期介入について、世界保健機関によって注意深く調査されている。この調査は、参照ＲｕＶの遺伝子型及び菌株の定義、並びに世界的な大発生において同定されたＲｕＶ菌株の感染的特徴及び遺伝的特徴の分析及び分類を伴う（ＷＨＯ２００５；ＷＨＯ ２００６；Ｒｅｅｆ Ｓ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｚｈｅｎｇ Ｄ ｅｔ ａｌ．，２００３）。
【００１３】
実際に、いくつかの試験によって、発展途上国の個体の無視できない割合（少なくとも５％）は、ＲｕＶに対する低い又は検出できない抗体濃度を有することが示された。これらの対象は、ワクチン接種してから数カ月又は数年後の集団、及びワクチン接種プログラムへのアクセスが限定された最近の移民又は難民において検出された。このようにして、ＲｕＶ感染、及びＣＲＳの可能性を防止するために、思春期に近づいている特定の女子、妊娠可能年齢の女性における特異免疫の衰退に起因した、ＲｕＶ感染に対する追加的処置については、非常に大多数の候補がある（Ｐｅｂｏｄｙ Ｒ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｎｉｃｏａｒａ Ｃ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｍａｔｔｅｒ Ｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｋｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｕｓｈｉｄａ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｂａｎｅｒｊｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｒｏｔａ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ Ｅ ｅｔ ａｌ．，２００６）。疫学の研究は、ＲｕＶの日常的な子供及び成人のワクチン接種、調査、並びに選択的な再免疫化のためにプログラムを確立することの重要性を示唆している（Ｇｒｅｅｎａｗａｙ Ｃ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｋｒｅｍｅｒ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｓｅｍｅｒｉｋｏｖ Ｖ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｂａｎａｔｖａｌａ Ｊ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ Ｄ，２００４；Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉ Ａ ａｎｄ Ｊａｉｎ Ｍ，２００６；Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｃｏｍ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，２００７）。
【００１４】
ＲｕＶ病因及び免疫生物学は、ヒト及び動物モデルにおけるＲｕＶ感染及びワクチン接種への免疫応答の機序及び効率に関連して研究されている。ＲｕＶ感染に対する細胞系モデルが確立されている（Ｃｕｓｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｄｕｎｃａｎ Ｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｇａｒｂｕｔｔ Ｍ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｃｏｒｄｏｂａ Ｐ ｅｔ ａｌ．，２０００ａ）。一次ＲｕＶ感染及びＲｕＶ特異的免疫応答の初期検出に対する高感度試験が開発されている（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｔｚｅｎｇ Ｗ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｇｉｅｓｓａｕｆ Ａ ｅｔ ａｌ．２００４；Ｗｉｌｓｏｎ Ｋ ｅｔ ａｌ．２００６）。しかしながら、ワクチン接種は、有効な免疫応答を備えるになるには数週間又は数カ月を要する場合があり、胎児は、その期間中、ＲｕＶ感染に対してなおも脆弱である。ＲｕＶ感染は、免疫抑制された患者においては危険であり得て、ワクチンの使用は必ずしも望ましいわけではない。
【００１５】
ＲｕＶに対して有用であり得る化学物質は、まだ開発の初期段階にある（Ｍｕｇｎａｉｎｉ Ｃ ｅｔ ａｌ．，２００７）。しかしながら、化学療法及び抗ウイルス治療は、ＲｕＶなどのウイルスに対する免疫保護を非常に喪失させ得て、再度のワクチン接種を必要とする場合があることが知られている（Ｙｕ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｂｅｋｋｅｒ Ｖ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｖａｎ Ｔｉｌｂｕｒｇ Ｃ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｎｉｌｓｓｏｎ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００２）。有意な抗ＲｕＶ力価を有するヒト抗体の生産物は、感染を治療又は予防するために投与することができる（Ｋｅｌｌｅｒ Ｍ ａｎｄ Ｓｔｉｅｈｍ Ｅ，２０００；Ｋｒａｕｓｅ Ｉ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｋａｗａｍｕｒａ Ｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）が、同様のアプローチの有効性は、組換え抗体フラグメント又はモノクローナル抗体などの、ウイルスを中和するためのより特異的な免疫学的生産物を用いることによって改善されたであろう。
【００１６】
ＲｕＶ、特にこのウイルスの構造タンパク質に対するヒト抗体応答は、ＲｕＶに対してワクチン接種された個体又は野生型ＲｕＶ菌株によって感染した個体の血清を用いて評価され、異なる対象における特異性及び応答の中和特性において実質的な差異を示した（Ｚｈａｎｇ Ｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｍａｕｒａｃｈｅｒ Ｃ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ Ｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｚｒｅｉｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ Ｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｔｈｏｍａｓ Ｈ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｂａｎｅｒｊｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００５）。赤血球凝集能及び異なる抗体の中和ドメインは、構造タンパク質Ｅ１及びＥ２として与えられた（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ Ｅ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｃｏｒｄｏｂａ Ｐ ｅｔ ａｌ．，２０００ａ；Ｇｒｅｅｎ Ｋ ａｎｄ Ｄｏｒｓｅｔｔ Ｐ，１９８６）。また、ＲｕＶ免疫病理学は、ＲｕＶ由来の扁桃腺フラグメントを移植された（Ｐｅｒｒｅｎｏｕｄ Ｇ ｅｔ ａｌ．，２００４）、又は腹腔を介したＲｕＶを用いて感染させた（Ｗａｎｇ Ｚ ｅｔ ａｌ．，２００３）、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスを用いた動物モデルにおいて試験された。
【００１７】
ＲｕＶに結合し、（数例において）ＲｕＶを中和することができるいくつかのマウスモノクローナル抗体を生じた。抗体は、細胞におけるウイルス感染及び複製を試験するために、異なるＲｕＶ関連標的（ウイルス様粒子、タンパク質抽出物、組換えタンパク質、ペプチド、細胞培養条件で感染させた細胞）を用いて試験された（Ｇｒｅｅｎ Ｋ ａｎｄ Ｄｏｒｓｅｔｔ Ｐ，１９８６；Ｔｅｒｒｙ Ｇ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｗｏｌｉｎｓｋｙ Ｊ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｃｈａｙｅ Ｈ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｃｌａｕｓ Ｃ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｑｉｕ Ｚ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｏｕ Ｄ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｗｏｌｉｎｓｋｙ Ｊ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｋ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｃｏｒｄｏｂａ Ｐ ｅｔ ａｌ．，２０００ａ；Ｃｏｒｄｏｂａ Ｐ ｅｔ ａｌ．，２０００ｂ；Ｃｏｒｄｏｂａ Ｐ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｓｔａｒｋｅｙ Ｗ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｇｉｅｓｓａｕｆ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｏｒｅｌｌａｎａ Ａ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｌｅｅ Ｊ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｈｏｆｍａｎｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２０００；ＥＰ２９９６７３；ＷＯ９３／１４２０６；ＷＯ９１／０２７４８；ＷＯ９５／０９２３２）。
【００１８】
文献では、ヒトモノクローナル抗ＲｕＶ抗体は非常に少なく、関連した抗ＲｕＶ中和抗体を有するものがないことが報告されている。このような抗体は、細胞融合及び／又はＥＢＶ感染によって不死化されたヒトＢ細胞を用いて同定された（ＷＯ０７／０１１６９８、クローンＲ３３５．６．４を参照されたい；Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓ Ｐ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｈｉｌｆｅｎｈａｕｓ Ｊ ｅｔ ａｌ．，１９８６）。ＲｕＶに対するヒトＦａｂ抗体フラグメントが同定されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ Ｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。
【００１９】
ワクチン接種は主な改善をもたらすが、疾患は持続する。ＲｕＶに効率的に結合し、中和する新規なヒト抗体及び抗体フラグメントの同定及び生産は、集団におけるこの感染症の診断、治療及び／又は予防のための改善された処置を確立するためになおも特に重要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、ＲｕＶに結合し、中和し、ＲｕＶ感染を検出、治療、阻害、予防、及び／又は改善するために使用可能な新規な抗体配列を提供する。
【００２１】
ヒト抗体フラグメントの一団は、組換えファージ上に提示され、ＲｕＶ特異的結合特異性は、ファージライブラリーにおいて検出されている。２つの抗体フラグメントの重鎖及び軽鎖可変領域をコードし、ＲｕＶを中和する抗体を有するＤＮＡ配列が同定され、ＤＤＦ−ＲｕＶ１及びＤＤＦ−ＲｕＶ２と命名された。ＲｕＶ特異的生物活性に関連する対応するタンパク質配列及び相補性決定領域（ＣＤＲ）が決定された。これらのＦａｂの結合活性は、さらに、組換えファージ上に提示さえる新規なペプチドライブラリーを用いて試験することができる。新規なタンパク質は、単離されたＣＤＲ、並びにＤＤＦ−ＲｕＶ１及びＤＤＦ−ＲｕＶ２に対する可変領域との同一性パーセントに基づいて定義される。
【００２２】
本発明の核酸は、適切な技術、及び組換えファージ、原核宿主細胞、又は有核宿主細胞を用いて、全長の抗体、抗体フラグメント、生物活性なペプチド、又は機能性タンパク質（特に融合タンパク質）の任意の他のフォーマットの形態で、ＲｕＶ特異的結合特性及び中和特性を有する組換えタンパク質を生産するために使用することができる。
【００２３】
本発明のタンパク質は、ＲｕＶ感染の治療検出、治療、阻害、予防、及び／又は改善のために用いることができる。特に、ＲｕＶ感染の管理における治療、予防、及び／又は診断の利用性を有する組成物は、それらのＲｕＶ特異的結合特性及び中和特性を与えるこれらのタンパク質を用いて調製可能である。これらの組成物は、抗ウイルス化合物又は静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）調製物に基づいているＲｕＶ治療を補足又は置換するために用いられてもよく、眼内又は局所投与に適していてもよい。
【００２４】
本発明の更なる態様は、単離されたＤＮＡ及びタンパク質配列、ベクター、組換えファージ、及び宿主細胞、並びに医学的方法、組成物、及び使用を含み、下記の説明に提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＤＤＦ−ＲｕＶ１及びＤＤＦ−ＲｕＶ２、又は負の対照として使用された無関係なヒトＦａｂ（ｅ１３７）を発現している組換えファージの調製物に対するＲｕＶ結合活性の特異性。結合活性は、プレートコーティング用の指示された抗原を用いたＥＬＩＳＡにおいて測定された。（Ａ）ＲｕＶの臨床単離物で感染させた線維芽細胞株（ＶＥＲＯ細胞）からの全タンパク質抽出物をプレートコーティングに使用した。各Ｆａｂについての２つのカラムは、２つの異なる実験を意味する。（Ｂ）ＲｕＶの臨床単離物で感染させた線維芽細胞株からのタンパク質抽出物、未感染細胞からのタンパク質抽出物、又は非特異的な精製タンパク質（ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ）をプレートコーティングに使用した。
【図２】（Ａ）ＤＤＦ−ＲｕＶ１の重鎖に関する可変領域のＤＮＡ（下段ケース）及びタンパク質（上段ケース）の整列（ＤＤＦ−ＲｕＶ１ ＶＨ；配列番号１及び２）。予測されるＣＤＲ（ＤＤＦ−ＲｕＶ１ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３；配列番号３、４、及び５）に下線を引く。（Ｂ）ＤＤＦ−ＲｕＶ１の軽鎖に関する可変領域のＤＮＡ（下段ケース）及びタンパク質（上段ケース）の整列（ＤＤＦ−ＲｕＶ１ ＶＬ；配列番号６及び７）。予測されるＣＤＲ（ＤＤＦ−ＲｕＶ１ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）に下線を引く。
【図３】（Ａ）ＤＤＦ−ＲｕＶ２の重鎖に関する可変領域のＤＮＡ（下段ケース）及びタンパク質（上段ケース）の整列（ＤＤＦ−ＲｕＶ１ ＶＨ；配列番号８及び９）。予測されるＣＤＲ（ＤＤＦ−ＲｕＶ２ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３；配列番号１０、１１、及び１２）に下線を引く。（Ｂ）ＤＤＦ−ＲｕＶ２の軽鎖に関する可変領域のＤＮＡ（下段ケース）及びタンパク質（上段ケース）の整列（ＤＤＦ−ＲｕＶ２ ＨＣ；配列番号１３及び１４）。予測されるＣＤＲ（ＤＤＦ−ＲｕＶ２ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）に下線を引く。
【図４】部分的に精製されたヒト組換えＦａｂとして発現され、ファージコートタンパク質に提示された場合のヒトＦａｂ ＤＤＦ−ＲｕＶ１（Ａ）及びＤＤＦ−ＲｕＶ２（Ｂ）に対するＲｕＶ中和活性。投薬量応答分析は、免疫蛍光法によって測定されるＲｕＶ感染細胞の数に基づいた。パーセント値は、いずれのＦａｂなしに前培養されたＲｕＶを用いて得られたＲｕＶ感染細胞（負の対照）に対するデータと比較することによって計算された。
【図５】（Ａ）ｐＤＬａｃ−ＲｕＶ１−ＦＬＡＧｈｉｓベクターを用いて発現されるヒトＦａｂ ＤＤＦ−ＲｕＶ１の重鎖のタンパク質配列（ＤＤＦ−ＲｕＶ１ ＨＣｔａｇ；配列番号１５）。最初にクローニングされたこの重鎖の改変領域（配列番号２）に下線を引く。ＰｅｌＢ配列は、アミノ酸１と２２との間に含まれる。アミノ酸１４７〜２５２は、ヒトＩｇガンマ−１鎖Ｃ領域のアミノ酸１〜１０６に対応する（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ａｃｃ．Ｎｏ．：Ｐ０１８５７）。アミノ酸２５３〜２６７は、ＦＬＡＧｈｉｓ配列に対応する。（Ｂ）ｐＤＬａｃ−ＲｕＶ１−ＦＬＡＧｈｉｓベクターを用いて発現されるヒトＦａｂ ＤＤＦ−ＲｕＶ１の軽鎖のタンパク質配列（ＤＤＦ−ＲｕＶ１ ＬＣ；配列番号１６）。最初にクローニングされたこの軽鎖の可変領域（配列番号７）に下線を引く。ＰｅｌＢ配列は、アミノ酸１と２２との間のアミノ酸に含まれる。アミノ酸１３５〜２４０は、Ｉｇカッパ鎖Ｃ領域のアミノ酸１〜１０６に対応する（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ａｃｃ．Ｎｏ．：Ｐ０１８３４）。（Ｃ）ｐＤＬａｃ−ＲｕＶ２−ＦＬＡＧｈｉｓベクターを用いて発現されるヒトＦａｂ ＤＤＦ−ＲｕＶ２の重鎖のタンパク質配列（ＤＤＦ−ＲｕＶ２ ＨＣｔａｇ；配列番号１７）。最初にクローニングされたこの重鎖の可変領域（配列番号９）に下線を引く。ＰｅｌＢ配列は、アミノ酸１と２２との間のアミノ酸に含まれる。アミノ酸１４６〜２５１は、ヒトＩｇガンマ−１鎖Ｃ領域のアミノ酸１〜１０６に対応する（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ａｃｃ．Ｎｏ．：Ｐ０１８５７）。アミノ酸２５２〜２６６は、ＦＬＡＧｈｉｓ配列に対応する。（Ｄ）ｐＤＬａｃ−ＲｕＶ２−ＦＬＡＧｈｉｓベクターを用いて発現されるヒトＦａｂ ＤＤＦ−ＲｕＶ２の軽鎖のタンパク質配列（ＤＤＦ−ＲｕＶ２ ＬＣ；配列番号１８）。最初にクローニングされたこの軽鎖の可変領域（配列番号１４）に下線を引く。ＰｅｌＢ配列は、アミノ酸１と２２との間のアミノ酸に含まれる。アミノ酸１２９〜２３４は、Ｉｇカッパ鎖Ｃ領域のアミノ酸１〜１０６に対応する（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ａｃｃ．Ｎｏ．：Ｐ０１８３４）。配列は、重鎖又は軽鎖の定常領域内に設計されたプライマーを用いたインサートの配列決定によって確かめられた。
【図６】（Ａ）Ｐｈ．Ｄ．−１２ファージディスプレイ・ペプチドライブラリーキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｎｅｂｅｃｏｍｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｐｒｏｄｕｃｔＥ８１１０．ａｓｐから入手可能）についえの指示マニュアルにおいて、生産者によって提供されるランダム１２マーのペプチド−ｃｐ３融合ライブラリーの配列。Ｍ１２ ＸｈｏＩ−フォワード（配列番号１９）及びＭ１３ ＳｐｅＩ−リバース（配列番号２０）プライマーにおける関連制限部位の位置を矢印で示す。Ｍ１３ ＫｐｎＩ−フォワード（配列番号２１）及びＭ１３ ＥａｇＩ−リバース（配列番号２２）プライマーにおける関連制限部位の位置に下線を引く。（Ｂ）ｐＤＤｃＸＳｍｅｒ−ｏｒｃｐ３ライブラリー内でクローニングされた場合のＰｈ．Ｄ．−１２ライブラリー（ＰｈＤ１２マー）のコーディング配列（ＷＯ０７／００７１５４の図３から修飾される；配列番号２５）。最初のファージミドによって提供される配列の位置（ＰｅｌＢシグナルペプチド、ＤＩＳリンカー、及びｐ３*５’末端）が示される。関連制限部位に下線を引く。１４個のアミノ酸のリンカー配列は、ペプチドライブラリーとｃｐ３*のＮ末端近傍（ｂｙ）との間に位置される。（Ｃ）ｐＤＤｃＫＥ１２ｍｅｒ−ｏｒｃｐ３ライブラリー内でクローニングされた場合のＰｈ．Ｄ．−１２ライブラリー（ＰｈＤ１２マー）のコーディング配列（ＷＯ０７／００７１５４の図３から修飾される；配列番号２６）。最初のファージミドによって提供される配列の位置（ＰｅｌＢシグナルペプチド、ＤＩＳリンカー、及びｐ３*５’末端）が示される。関連制限部位に下線を引く。１８個のアミノ酸のリンカー配列は、ペプチドライブラリーとｃｐ３*のＮ末端近傍（ｂｙ）との間に位置される。ＫｐｎＩ及びＥａｇＩ部位は、ＸｈｏＩ及びＳｐｅＩを用いたｐＤＤｃの消化、並びにＨＡｔａｇ配列、ＫｐｎＩ部位、ＥａｇＩ部位を含む２つのアニール化されたオリゴヌクレオチドの挿入によって導入され、ＸｈｏＩ及びＳｐｅＩ部位に適合可能な一本鎖５’末端を含む（配列番号２３及び２４）。また、ベクターは、ＤＤカセットにクローニングされるＺｅｏｃｉｎマーカー遺伝子内のＥａｇＩ部位を排除するために、ＰＣＲによって修飾した。
【図７】ｐＤＤｃＸＳｍｅｒ−ｏｒｃｐ３ライブラリー、及びｐＤＤｃＸＳｍｅｒ−ｏｒｃｐ３／ｃｐ８ライブラリーの生成の略図（ＷＯ０７／００７１５４の図５から修飾される）。ファージミドマップは、コートタンパク質（ｃｐ３*及びｃｐ８*）の位置、ファージミド骨格内のアンピシリンマーカー遺伝子（Ａｍｐr）及び複製起源（ＣｏｌＥ１及びＦ１（＋））を示す。下記の要素は、ＤＤカセットに存在する（ｐＤＤｃＸＳｍｅｒ−ｏｒｃｐ３／ｃｐ８ライブラリーを生成するために使用されるＢｇｌＩ／ＳｆｉＩ部位間においてクローニングされた）：Ｐｈ．Ｄペプチドライブラリー（Ｌｉｂ）、ＰｅｌＢ配列に融合されたｐＬａｃＺプロモーター（Ｌｐｅ）、スタッファー配列（Ｓｔ）及びＺｅｏｃｉｎマーカー遺伝子（Ｚｅｏr）。関連制限部位の位置を矢印で示す。ｐＤＤｃＫＥ１２ｍｅｒ−ｏｒｃｐ３ライブラリー及びｐＤＤｃＫＥ１２ｍｅｒ−ｏｒｃｐ３／ｃｐ８ライブラリーは、追加のＫｐｎＩ及びＥａｇＩ制限部位を提示する（図６Ｃを参照されたい）。
【図８】いずれかのパンニングなしのｐＤＤｃＸＳｍｅｒ−ｏｒｃｐ３／ｃｐ８ライブラリー（Ａ）、３ラウンドのパンニング後のｐＤＤｃＸＳｍｅｒ−ｏｒｃｐ３／ｃｐ８ライブラリー（Ｂ）３ラウンドのパンニング後のｐＤＤｃＫＥ１２ｍｅｒ−ｏｒｃｐ３／ｃｐ８ライブラリー（Ｃ）から無作為に選択されるクローンの消化。単離された細菌クローンは、ＮｈｅＩ及びＳｐｅＩを用いて消化されたファージミドＤＮＡのミニプレップを行うために使用された。反応物は、分離用の１％アガロースゲル上にロードされ、得られたフラグメント（ＮＳ）と対応する未消化のＤＮＡ（Ｃ）と比較した。３．８及び０．６Ｋｂフラグメントを示すクローンは、ｃｐ３*に配向されたＤＤカセットを有する。２．６及び１．８Ｋｂフラグメントを示すクローンは、ｃｐ８*に配向されたＤＤカセットを有する。矢印は、マーカーＤＮＡによって位置される。
【図９】下記のライブラリー：ｐＤＤｃＸＳｍｅｒ−ｏｒｃｐ３（Ａ；配列番号２７〜３４）、ｐＤＤｃＫＥ１２ｍｅｒ−ｏｒｃｐ３（Ｂ；配列番号３５〜４２）において無作為に選択されたクローン由来の配列例。アンバー停止コドン（ｔａｇ）は、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ Ｅ．ｃｏｌｉ菌株内に抑制され、アミノ酸（Ｑ）をコードする。配列は、ｃｐ３＊内で設計されたプライマーを用いたインサートの配列決定によって確かめられた。
【図１０】抗ＨＡｔａｇコロニースクリーニング。抗ＨＡｔａｇ抗体に対するパンニングの３ラウンド後に得られた細菌コロニーは、メンブレンに転写され、アルカリ条件で溶解した。最初のコロニーにおけるＨＡｔａｇの発現を検出するために、メンブレンをマウス抗ＨＡｔａｇ抗体（パンニングのために使用された抗体）、次に、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（１：１０００希釈）中のセイヨウワサビのペルオキシダーゼに結合した抗マウスＩｇＧ１とともにインキュベートした。ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０による３回の洗浄後、メンブレンは、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏケミルミネッセンス基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いた増大したケミルミネッセンス検出に供された。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
ＷＯ０７／００７１５４に記載されたｐＤＤファージミド及び関連した方法により、１つの又は他の２つの所定のファージミドコートタンパク質に融合されたタンパク質配列のクローニング、発現、及び選択が可能となる。このアプローチにより、組換えファージの表面に別個に発現されるか又は提示され、結果として、異なる効率を有するファージディスプレイライブラリーから選択され得るタンパク質配列の同定の選択を可能にする。
【００２７】
本ケースでは、ファージライブラリーは、ヒト重鎖及び軽鎖の免疫グロブリンの可変領域をクローニングすることによって、ｐＤＤファージミドに構築された。このライブラリーは、ＲｕＶ感染細胞のタンパク質抽出物に対してパンニングされ、選択されたクローンは、その後、ＲｕＶを中和する活性を示すクローンを決定するために細胞系圧死において試験された。２つの最大の有望なクローン（ＤＤＦ−ＲｕＶ１とＤＤＦ−ＲｕＶ２と命名される）をコードするＤＮＡ配列を決定し、次に、細菌発現用の適切なベクターにクローニングされた。
【００２８】
本発明は、ＲｕＶに結合及び中和することができ、Ｆａｂ ＤＤＦ−ＲｕＶ１又はＤＤＦ−ＲｕＶ２において同定された特定のＣＤＲ（相補性決定領域）を含む新規なタンパク質配列を提供する。特に、本発明のＨＣＤＲ３（重鎖可変領域のＣＤＲ３）の各々（配列番号５及び配列番号１２）は、それぞれＤＤＦ−ＲｕＶ１及びＤＤＦ−ＲｕＶ２の抗原結合部分を特徴とする。
【００２９】
ＨＣＤＲ３は、抗体の抗原結合部分を特徴付け、その結果、生物活性（例えば、ＲｕＶの結合及び中和）を与えるものと考えられる。抗体のいくつか又は全てのＣＤＲは、一般に、完全な抗原結合表面を得るために要求されるとしても、ＨＣＤＲ３は、抗体間の最大の相違を示すＣＤＲである。実際に、ＨＣＤＲ３の配列及び長さの多様性は、大部分の抗体に対する特異性を決定するために基本的である（Ｘｕ Ｊ及びＤａｖｉｅｓ Ｍ，２０００；Ｂａｒｒｉｏｓ Ｙ ｅｔ ａｌ．２００４；Ｂｏｎｄ Ｃ ｅｔ ａｌ．，２００３）。
【００３０】
ＲｕＶ結合部分としての本発明の特定のＨＣＤＲ３を含むタンパク質は、それ（又はなし）と、このようなＨＣＤＲ３が抗体タンパク質フレームワーク内で同定された同じＦａｂ由来の他のＣＤＲとを組み合わせることによって生じさせることができる（Ｋｎａｐｐｉｋ Ａ ｅｔ ａｌ．，２０００）。ＣＤＲの組み合わせは、抗体構造には関連しないタンパク質フレームワーク内であっても、元々の結合活性を破壊せずに、元々の結合性を維持する非常に短いタンパク質において互いに連結することができる（Ｋｉｓｓ Ｃ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｓｍｉｔｈ Ｊ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。
【００３１】
一態様では、本発明は、Ｆａｂ ＤＤＦ−ＲｕＶ１のＨＣＤＲ３（配列番号５）と少なくとも９０％同一性を有する配列を含むタンパク質を提供する。ＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２（配列番号３及び配列番号４、図２Ａ）と一緒に、このＨＣＤＲ３は、ＤＤＦ−ＲｕＶ１ Ｆａｂの重鎖の可変領域（ＤＤＦ−ＲｕＶ１ ＶＨ；配列番号２）に含まれる。このＦａｂを形成する軽鎖の可変領域（ＤＤＦ−ＲｕＶ１ ＶＬ：配列番号７）、並びにその特定のＬＣＤＲ（軽鎖可変領域のＣＤＲ）が決定されている（図２Ｂ）。
【００３２】
別の態様では、本発明は、Ｆａｂ ＤＤＦ−ＲｕＶ２のＨＣＤＲ３（配列番号１２）と少なくとも９０％同一性を有する配列を含むタンパク質を提供する。ＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２（配列番号１０及び配列番号１１、図３Ａ）と一緒に、このＨＣＤＲ３は、ＤＤＦ−ＲｕＶ２の重鎖の可変領域（ＤＤＦ−ＲｕＶ２ ＶＨ；配列番号９）に含まれる。このＦａｂを形成する軽鎖の可変領域（ＤＤＦ−ＲｕＶ１ ＶＬ；配列番号１４）、並びにその特異的ＬＣＤＲが決定されている（図３Ｂ）。
【００３３】
本発明のタンパク質がＤＤＦ−ＲｕＶ１の配列に基づく場合、それらは、配列番号５と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含まなければならない。特に、それらは、配列番号２と少なくとも９０％同一性を有する配列を含まなければならない。より特には、このようなタンパク質はまた、配列番号３及び配列番号４からなる群から選択される１以上の配列を含む。タンパク質、特に、ＤＤＦ−ＲｕＶ１に基づく抗体及び抗体フラグメントは、配列番号７と少なくとも９０％同一性を有する配列をさらに含むことができる。
【００３４】
あるいは、本発明のタンパク質がＤＤＦ−ＲｕＶ２の配列に基づく場合、それらは、配列番号１２と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含まなければならない。特に、それらは、配列番号９と少なくとも９０％同一性を有する配列を含まなければならない。より特には、このようなタンパク質はまた、配列番号１０及び配列番号１１からなる群から選択される１以上の配列を含む。タンパク質、特に、ＤＤＦ−ＲｕＶ２に基づく抗体及び抗体フラグメントは、配列番号１４と少なくとも９０％同一性を有する配列をさらに含むことができる。
【００３５】
本発明の更なる態様は、両方のＦａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡ配列、特に、クローニングされ、ＤＤＦ−ＲｕＶ１（重鎖については配列番号１；軽鎖については配列番号６）、並びにＤＤＦ−ＲｕＶ２（重鎖については配列番号８；軽鎖については配列番号１３）の可変領域が決定されている元々のＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一性を有するものである。
【００３６】
これらのＤＮＡ配列（又は選択された部分、例えば図２及び図３に示された単離されたＨＣＤＲとＬＣＤＲをコードするもの）は、組換え抗体（例えば、完全、アフィニティー成熟、ＣＤＲグラフト、または図５においてＤＤＦ−ＲｕＶ１及びＤＤＦ−ＲｕＶ２のタグ化されたバージョンについて示されたフラグメント）、又はＲｕＶ結合性及び中和性を与える融合タンパク質についての既知のフォーマットの１つ内にそれらを発現するための他のベクターに移すことができる。
【００３７】
同一性レベルが指示されるところはどこでも、この同一性レベルは、本発明の関連配列の全長に基づいて決定されなければならない。
【００３８】
重鎖及び軽鎖を形成するＤＤＦ−ＲｕＶ１又はＤＤＦ−ＲｕＶ２の可変領域（又は、選択された部分、例えば、単離されたＨＣＤＲ及びＬＣＤＲ）は、特定のアイソタイプを有する抗体、特に完全なヒト組換え抗体内に含むことができる。この抗体は、２つの軽鎖及び２つの重鎖によって形成される四量体複合体の天然の構造における軽鎖及び重鎖可変領域として、ＤＤＦ−ＲｕＶ１又はＤＤＦ−ＲｕＶ２のＶＬ及びＶＨ配列を含んでもよい。完全なヒト抗体が望まれる場合、固体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ及びＩｇＥ定常領域からなる群から選択される重鎖定常領域をさらに含まなければならない。例えば、ＩｇＧアイソタイプは、ほとんど全ての承認された治療用抗体の抗体フォーマットである（Ｌａｆｆｌｙ Ｅ及びＳｏｄｏｙｅｒ Ｒ，２００５）。しかしながら、ヒトＩｇＧ１から単離された抗原結合部分は、ヒトＩｇＡ配列に移され、得られた組換え抗体は元々のＩｇＧ１の活性を維持し、最近示されるように、抗体はＨＩＶ感染を阻害することができる（Ｍａｎｔｉｓ Ｎら，２００７）。
【００３９】
あるいは、ＤＤＦ−ＲｕＶ１又はＤＤＦ−ＲｕＶ２を形成する重鎖及び軽鎖の可変領域（又は、選択された部分、例えば単離されたＨＣＤＲ及びＬＣＤＥ）は、機能性抗体フラグメントについての任意の他のタンパク質フォーマットにおいて組み合わせることができ、異なる名称で文献に記載されているように、例えば、Ｓｃｆｖ（一本鎖フラグメント可変）、Ｆａｂ（可変重鎖／軽鎖ヘテロ二量体）、ダイアボディー、ペプタボディー、ＶＨＨ（重鎖抗体の可変ドメイン）単離された重鎖又は軽鎖、二重特異性抗体、非／臨床用途のための他の操作された抗体変異体などがある（Ｊａｉｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｌａｆｆｌｙ Ｅ ａｎｄ Ｓｏｄｏｙｅｒ Ｒ，２００５）。例えば、ＤＤＦ−ＲｕＶ１又はＤＤＦ−ＲｕＶ２の組換え改変体は、ｐＤＬａｃ−ＦＬＡＧｈｉｓ（ＰＣＴ／ＩＢ２００８／０００２６６）と呼ばれるｐＤＤ適合可能な発現ベクターにクローニングされ、タグ化されたＦａｂ（ＤＤＦ−ＲｕＶ１については、配列番号１５〜１６、図５Ａ〜Ｂ；ＤＤＦ−ＲｕＶ２については、配列番号１７〜１８、図５Ｃ〜Ｄ）の形態で発現可能である。
【００４０】
代替の抗体及び抗体フラグメントは、軽鎖をシャッフルするためのプロセスを介して、ＤＤＦ−ＲｕＶ１又はＤＤＦ−ＲｕＶ２の配列を用いて生じさせることができる。実際に、異なる抗体及び抗体フラグメントを生じさせ、例えば、共通のファージディスプレイ技術又はＷＯ０７／００７１５４に記載されたものを用いて、ＶＬ配列のライブラリーと合わせられる単一の重鎖可変ドメインＶＨ（例えば、ＤＤＦ−ＲｕＶ１又はＤＤＦ−ＲｕＶ２のいずれか１つ）を用いたＲｕＶ特異的活性について試験することができる。このアプローチは、親和性、安定性、特異性、及び／又は組換え産物に基づいて改善された特性を用いてＶＨ／ＶＬを決定してもよい（Ｒｏｊａｓ Ｇ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｓｕｚｕｋｉ Ｋ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
【００４１】
さらに、抗体は、特に臨床用途（良好な薬物動態プロファイル又は抗原に対するより高い親和性）のために、改善された特徴を有する抗体を持つために、特定の一で修飾されてもよいことは知られている。これらの変化は、ＤＤＦ−ＲｕＶ１又はＤＤＦ−ＲｕＶ２のいずれかのＣＤＲ及び又はフレームワークのいて行うことが可能である。配列は、親和性成熟の使用を作る抗体の合理的な設計のための任意の専用技術及び他の方法を適用することによって測定することができる（Ｋｉｍ Ｓ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｊａｉｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
【００４２】
また、新規な生物活性ペプチドを開発するための抗体に基づくストラテジーは、Ｌ−アミノ酸及び／又はＤ−アミノ酸を含むＣＤＲ誘導ペプチドを合成する実行可能性を示した。これらの代替の分子は、より適切な薬理学的プロフィールを有する元々の活性を維持することができる（Ｌｅｖｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｗｉｊｋｈｕｉｓｅｎ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００３）。このようにして、各々の新規なＨＣＤＲ３、並びにそれらに非常に類似した配列、それらを含む融合タンパク質、それらから誘導される合成ペプチド（例えば、Ｄ−アミノ酸を含むか又はレトロー−インバーソ型形態である）が試験され、ＲｕＶ結合タンパク質として使用することができる。
【００４３】
また、本発明のタンパク質は、ＲｕＶビリオンの抗原を中和することを特徴付けるために使用されてもよい。実際に、ＤＤＦ−ＲｕＶ１及びＤＤＦ−ＲｕＶ２は、ＥＬＩＳＡにおけるＲｕＶ感染細胞株由来の細胞抽出物へのそれらの特異的結合に奇異真して初期にクローニングされ（図１）、その後、ＲｕＶ感染を中和するそれらの能力は、ＲｕＶ臨床菌株を用いたインビトロの中和アッセイによって測定された（図４）。結論として、本発明のタンパク質は、ＲｕＶ感染を中和することができ、任意の関連した結合アッセイ（例えば、実施例に記載されるＥＬＩＳＡ）によって測定されるように、本発明のタンパク質と比較する他のＲｕＶ結合タンパク質（完全な句及び体、抗体フラグメント、生物活性ペプチド、又は融合タンパク質の形態で）を特定するために用いることができる。このような競合タンパク質は、場合により、ＤＤＦ−ＲｕＶ１又はＤＤＦ−ＲｕＶ２配列において同定されたものとは、部分的に又は完全に異なっている可能性があるＨＣＤＲ及びＬＣＤＲとともに、上記で定義されたＨＣＤＲ３配列の何れかを単に含んでもよい。
【００４４】
本発明のタンパク質は、抗体、抗体フラグメント、生物活性なペプチド、又はＲｕＶに結合及び中和する融合タンパク質として提供される。これらの代替のタンパク質は、ＤＤＦ−ＲｕＶ１及びＤＤＦ−ＲｕＶ２ Ｆａｂについて決定されるこのような特性を増大しない場合に維持されなければならない。
【００４５】
融合タンパク質の特定のケースでは、異種配列（単数又は複数）は、このような部分の正しい発現及び生物活性を負に影響を与えないで、ＲｕＶに特異的な結合及び中和する部分（例えば、特定のＨＣＤＲ３又は抗体フラグメントの可変領域に対してＮ末端位又はＣ末端位で位置しなければならない。
【００４６】
用語「異種タンパク質」は、タンパク質配列がＲｕＶに特異的に結合及び中和する部分（例えば、抗体フラグメント）に対してＮ末端位又はＣ末端位において天然に存在しないことを指示する。このタンパク質配列をコードするＤＮＡ配列は、一般に、組換えＤＮＡ技術によって融合され、少なくとも５個のアミノ酸をコードする配列を含む。この異種配列は、一般に、特定の診断及び／又は治療用途に関連した追加の特性を提供するために選択される。このような追加の特性の例には、検出又は精製のための良好な手段、追加の結合部分又は生物学的リガンド、又は融合タンパク質の翻訳後修飾（例えば、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、又は細胞内タンパク質分解的切断）が挙げられる。
【００４７】
タンパク質部分、リガンド、適切なリンカーを選択及び設計する手段、並びに融合タンパク質の構築、精製、検出及び使用についての方法及びストラテジーは、文献に提供され（Ｎｉｌｓｓｏｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．，１９９７；“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｏｆ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｇｅｎｅｓ Ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．３２６−３２８，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２０００；ＷＯ０１／７７１３７））、臨床及び研究所において利用可能である。例えば、融合タンパク質は、インビボ及び／又はインビトロでの融合タンパク質の同定、又はその精製を促進することができる市販の抗体（タグ、例えばポリヒスチジン、ＦＬＡＧ、ｃ−Ｍｙｃ、又はＨＡタグが含まれる；図５）によって認識される配列を含んでもよい。他のタンパク質配列は、直接的蛍光分析（緑色蛍光タンパク質など）によるか、又は特異的な基質又は酵素（酵素分解部位などの使用）によって容易に同定することができる。
【００４８】
治療活性は、別の抗ウイルスタンパク質あるいは細胞代謝及び／又は活性を変更するタンパク質などの別の治療タンパク質との融合によって改善され得る。ＲｕＶ特異的抗体、抗体フラグメント、融合タンパク質の安定性は、周知の担体タンパク質、例えばファージコートタンパク質（ｃｐ３又はｃｐ８）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をｍ値いて改善されてもよい。
【００４９】
あるいは（又は、異種タンパク質配列への融合に加えて）、本発明のＲｕＶ特異的タンパク質の活性は、治療薬又は診断薬などの異なる化合物との結合を用いて改善されてもよい。これらの試薬の例には、化学リンカー又はポリマーを用いて結合することができる検出可能な標識（例えば、放射性同位体、蛍光化合物、コロイド金属、ケミルミネッセンス化合物、生物発酵化合物、又は酵素）である。本発明のタンパク質のＲｕＶ特異的な生物活性はまた、診断又は治療用途における代謝及び／又は安定性を変更するポリマーなｄの化合物との融合によって改善されてもよい。
【００５０】
本発明のタンパク質（例えば、抗体、抗体フラグメント、生物活性ペプチド、融合タンパク質、又はそれらの結合された改変体）をスクリーニングし、元々のＤＤＦ−ＲｕＶ１及びＤＤＦ−ＲｕＶ２と競合するそれらの能力、可能であれば、実施例又は文献に記載された任意の関連アッセイによって測定される、ＲｕＶ感染を中和する類似の又はより優れた能力を示すために特徴付けることができる。
【００５１】
また、文献は、ＲｕＶ抗原、並びに各Ｆａｂによって認識される特定のエピトープが測定され、過去に測定されたもの比較されるものを用いるいくつかの技術の例を愛知今日する。例えば、ＲｕＶタンパク質、関連した一部切断された改変体又は合成ペプチドを用いたＥＬＩＳＡ、免疫沈降、又はウェスタンブロットは、Ｅ１又はＥ２タンパク質内の関連エピトープを決定するために用いた。特に、本発明の躯体、抗体フラグメント、他のタンパク質は、抗体フラグメント（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ Ｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、マウス又はヒトモノクローナル抗体（Ｇｒｅｅｎ Ｋ ａｎｄ Ｄｏｒｓｅｔｔ Ｐ，１９８６；Ｃｏｒｄｏｂａ Ｐ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｃｈａｙｅ Ｈ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｑｉｕ Ｚ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｏｕ Ｄ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓ Ｐ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｈｉｌｆｅｎｈａｕｓ Ｊ ｅｔ ａｌ．，１９８６；ＷＯ０７／０１１６９８；ＷＯ９３／１４２０６；ＷＯ９５／０９２３２）、ヒト血清（Ｇｉｅｓｓａｕｆ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｓｔａｒｋｅｙ Ｗ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｚｒｅｉｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ Ｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２）についてのＲｕＶ特異的生物活性及びエピトープを特徴付けるために使用されるアッセイにおいて試験することができる。次に、本発明のタンパク質のＲｕＶ関連予防的、診断的、及び治療的使用のためのより広範囲な特徴付け及び評価は、本発明の背景に要約されるように、ＲｕＶ病因及び免疫学を研究するための文献（Ｃｕｓｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｄｕｎｃａｎ Ｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｃｏｒｄｏｂａ Ｐ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｌｅｅ ａｎｄ Ｂｏｗｄｅｎ，２０００；Ｇａｒｂｕｔｔ Ｍ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｏｕ Ｄ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｔｚｅｎｇ Ｗ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｐｅｒｒｅｎｏｕｄ Ｇ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｗａｎｇ Ｚ ｅｔ ａｌ．，２００３）に開示されているインビトロ又はインビボアッセイ（組織又は細胞系アッセイ、齧歯類において確立した感染モデル）の１以上を用いて行うことができる。
【００５２】
本発明の更なる目的は、上記で定義される抗体、抗体フラグメント、融合タンパク質又は単離されたＣＤＲのいずれかをコードする核酸である。実施例は、このような配列、特に、ＤＤＦ−ＲｕＶ１及びＤＤＦ−ＲｕＶ２の完全な可変領域（配列番号１、６、８、及び１３）をコードするものとして提供する。核酸は、配列番号１、配列番号６、配列番号８、及び／又は配列番号１３と少なくとも９０％同一性を有していなくてはならない。
【００５３】
このような配列、特に、特定のＣＤＲに関連したもの含まれる配列（図２及び３）は、場合によりプロモーターに連結されたベクター及び発現カセットに含まれ、又はｐＤＤ系ファージミドにクローニングされ得る。この特定のタイプのベクターは、ｃｐ３又はｃｐ８ファージコートタンパク質のいずれかとの融合タンパク質としてそれらの発現を可能にし、結果として、このようなファージミドを含み、それらの表面上で本発明のＦａｂを発現する組換えファージを生産することができる。このようにして、本発明のタンパク質を発現するファージミドベクターを含む組換えファージは、ＲｕＶ感染を検出及び／又は中和するための手段として使用可能である。
【００５４】
本発明の配列がクローニングされ、対応する組換えファージによって特徴付けられたｐＤＤ系ファージミドがベクターに（部分的に又は全体として）移され得るＤＮＡ配列を含み、そこでは、元々のＦａｂ、又はそれらから誘導されるタンパク質配列は、宿主細胞内で組換えタンパク質として適切に発現され得る（ｐＤＬａｃ−ＦＬＡＧｈｉｓシステムを用いた実施例に示される）。
【００５５】
ファージディスプレイ技術を用いて単離される免疫グロブリン可変鎖（特にヒト免疫グロブリン可変鎖）の場合、重要な修飾は、好ましいアイソタイプ及び定常領域を有する完全な免疫グロブリンタンパク質へ選択されたＦａｂ又はｓｃＦＶの変換である。このようにして、完全なヒト抗体が望まれる場合、発現ベクターは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ及びＩｇＥ定常領域からなる群から選択される重鎖定常領域をさらに含まなければならない。この種の修飾は、例えば、ファージディスプレイライブラリー由来の一本鎖Ｆｖ又はＦａｂから構築される全てのアイソタイプの完全なヒトモノクローナル抗体を生じ、哺乳動物細胞又は昆虫細胞において発現を可能にする。文献（Ｐｅｒｓｉｃ Ｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｇｕｔｔｉｅｒｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２００３）に広く記載されているように、ベクターは、抗体を発現するために具体的に設計され、所望のアイソタイプ（例えば、ヒトＩｇＧガンマ１）の定常（Ｆｃ）領域へのこの配列の融合を可能にする。
【００５６】
抗体又は融合タンパク質は、原核生物（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ Ｈ ａｎｄ Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ Ｋ，２００５；Ｖｅｎｔｕｒｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２００２）、植物（Ｍａ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２００５）、又は真核細胞において組換えタンパク質として発現することができ、それらは、一時的又は安定に形質転換した細胞として高レベルの発現を可能にする（Ｄｉｎｎｉｓ Ｄ ａｎｄ Ｊａｍｅｓ Ｄ，２００５）。これは、特に、抗体の特徴がより厳しい機能的及び／又はインビボアッセイを用いて実行しなければならない場合に要求される。
【００５７】
文献は、記事及び書籍の章（”Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”，ｖｏｌ．２６６，ｅｄ．Ｃｌａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｌｏｗｍａｎ Ｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，２００４；”Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，ｅｄ．Ｂｕｒｔｏｎ Ｄ ｅｔ ａｌ．，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，２００１；Ｃｏｒｉｓｄｅｏ Ｓ ａｎｄ Ｗａｎｇ Ｂ，２００４；Ｂｅｎｈａｒ Ｉ，２００１）に概説されるように、原核宿主細胞において、Ｆａｂ又は抗体フラグメントについての同様のフォーマットとしてタンパク質を発現するための異なるストラテジーを提供する。
【００５８】
タンパク質、特に抗体が、真核宿主細胞（特に、哺乳動物細胞株）において発現される場合、異なるベクター及び発現系は、トランスフェクトされた細胞株の安定なプールを生じるように設計されている（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｔ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｂｉａｎｃｈｉ Ａ ａｎｄ ＭｃＧｒｅｗ Ｊ，２００３）。高レベルの、最適化された、安定な組換え抗体の発現は、細胞培養条件の最適化（Ｇｒｕｎｂｅｒｇ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｙｏｏｎ Ｓ ｅｔ ａｌ．，２００４）、より高レベルの抗体生産及び分泌を有するクローンの選択又は操作（Ｂｏｈｍ Ｅ ｅｔ ａｌ．， ２００４； Ｂｕｔｌｅｒ Ｍ， ２００５）によって達成される（Ｓｃｈｌａｔｔｅｒ Ｓ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
【００５９】
対象とする配列（例えば、重鎖及び軽鎖の関連する可変領域）をコードする核酸配列は、ベクターの発現カセット、又は区別されるベクターの発現カセットに適切にクローニングされなければならず、この場合、それらは、適切な調節配列（例えば、プロモーター、転写ターミーネーター）に操作可能に連結される。発現カセットには、プロモーター、リボソーム結合部位（必要に応じて）、開始コドン、リーダー／分泌配列が含まれ、それらは、したがって、所望のタンパク質をコードするＤＮＡを誘導体スルファターゼ得るモノ又はビシストロン転写物の発現を誘導することができる。
【００６０】
ベクターは、構造的に活性であるか又は誘導可能であるように選択される転写開始／末端調節配列の調節下で、原核又は真核宿主細胞において本発明のタンパク質の発現を可能にしなければならない。このようなタンパク質を生産するための方法には、タンパク質発現に適切である条件下で、それらのコーディング配列を含む発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞を培養し、宿主細胞培養物からタンパク質を回収することが含まれる。本発明の核酸を含む宿主細胞は、原核又は真核宿主細胞であってもよく、所望の組換えタンパク質の分泌を可能にする。次に、このような細胞に実質的に富んでいる細胞株は、単離され、安定な細胞株を提供することができる。
【００６１】
これらの核酸、組換えファージ、宿主細胞を生じ、共通の組換えＤＮＡ技術を適用することによって本発明のタンパク質を生産するために使用することができる。要約すると、所望のＤＮＡ配列は、制限酵素を用いたファージミドの消化によって抽出されるか、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための鋳型、重鎖及び軽鎖の完全な可変領域又はそれらの一部だけ（例えばＨＣＤＲ３）を特異的に増幅するＰＣＲプライマーとして元々のファージミドを用いて増幅することができる。次に、このようなＤＮＡフラグメントは、組換えタンパク質のクローニング法及び生産法についての多数の書籍及び概説に記載されるように、原核又は真核宿主細胞内に更なる修飾及び／又は発現のためにより適したベクターに移すことができ、シリーズのいくつかのタイトルであるオックスフォード大学プレスによって公開されている“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”（ “ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ”，１９９５；“ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ４：Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ”，１９９６；”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”，１９９９；”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，２００１）が含まれる。
【００６２】
提示され、選択されたタンパク質配列をコードするＤＮＡ配列は、適切なエピソーム又は非相同的若しくは相同的統合ベクターに挿入されると、任意の適切な手段（形質転換、トランスフェクション、コンジュゲーション、原形質融合、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、直接的なマイクロインジェクションなど）によって適切な宿主細胞に導入可能である。特定のプラスミド又はウイルスベクターを選択する際の重要な因子には、ベクターを含む受領細胞が認識され、ベクターを含まない受領細胞から選択される容易性；特定の細胞において望まれるベクターのコピー数；異なる種の宿主細胞間でベクターを「シャトル」することができることが望まれるかどうかが含まれる。
【００６３】
真核宿主（例えば、酵母、昆虫又は哺乳動物細胞）については、異なる転写及び翻訳調節配列が使用されてもよく、これは、宿主の性質に依存する。それらは、ウイルス起源、例えば、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、シミアンウイルスなどから誘導されてもよく、この場合、調節シグナルは、高レベルの発現を有する特定の遺伝子と関連付けられる。実施例は、ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーターなどである。転写初期調節シグナルが選択されてもよく、一時的（又は構造的）抑制及び活性、結果として、遺伝子発現の調節を可能にする。更なるクローニング工程において、抗体又は融合タンパク質をコードする配列が適用され、ＤＮＡ及びタンパク質レベルの両方でのみＤＮＡレベルの特定の修飾について他のベクターに再度クローニングすることができる。これらの変化は、例えば、コドン使用頻度及び制限部位が特定のベクター及び宿主細胞を用いた組換えタンパク質をクローニングし、発現するのに最も適しているＤＮＡ配列を選択するためのソフトウェアを用いて測定することができる（Ｒｏｄｉ Ｄ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｇｒｏｔｅ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｃａｒｔｏｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２００７）。また、タンパク質配列は、所望の抗体フォーマット（Ｓｃｆｖ、Ｆａｂ、完全なヒト抗体など）、又は１以上の内部アミノ酸の挿入、置換、若しくは欠失に関連して付加することができる。
【００６４】
また、これらの技術は、抗体の治療的特性の更なる構造及び機能的特徴付け及び最適化のために使用され（Ｋｉｍ Ｓら，２００５）、あるいは、それらの安定なインビボでの送達を可能にするベクターを生じさせるために使用可能である（Ｆａｎｇ Ｊら，２００５）。例えば、また、組換え抗体は、可変領域に融合されるべき特定のＦｃ領域を選択することによって（Ｆｕｒｅｂｒｉｎｇ Ｃら，２００２；Ｌｏｇｔｅｎｂｅｒｇ Ｔ，２００７）、組換え一本鎖抗体フラグメントを生じさせることによって（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ Ｌら，１９９６）、安定化ペプチド配列を融合することによって（ＷＯ０１／４９７１３）、又は放射化合物若しくはポリマーを化学的に修飾された残基に添加することによって（Ｃｈａｐｍａｎ Ａら，１９９９）、構造及び／又は活性のレベルで調節可能である。
【００６５】
導入されたＤＮＡによって安定に形質転換された細胞は、発現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする１以上のマーカーを導入することによっても選択することができる。また、マーカーは、栄養要求宿主への光合成、殺生物耐性、例えば抗生物質、又は重金属、例えば銅などを与えてもよく、必要に応じて、開裂可能であり、又は抑制されてもよい。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるべきＤＮＡ遺伝子配列に直接的に連結されるか、又は同時トランスフェクションによって同じ細胞に導入されてもよい。また、追加の転写調節因子は、最適発現に必要であってもよい。
【００６６】
宿主細胞は、原核又は真核のいずれかであってもよい。原核宿主細胞の中では、好ましいものは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＥ．ｃｏｌｉである。真核宿主細胞の中では、好ましいものは、酵母、昆虫細胞（バキュロウイルス系発現システムを使用）、又は哺乳動物細胞、例えばヒト、サル、昆虫（バキュロウイルス系発現システムを使用）及びチャイニーズ・ハムスター・オバレイ（ＣＨＯ）細胞であり、これは、それらが、正しいフォールディング又は正しい位置でグリコシル化のある種の形態を提供するためである。また、酵母細胞は、グリコシル化を含む翻訳後ペプチド修飾を実行することができる。強力なプロモーター配列、酵母における所望のタンパク質の生産のために利用可能な高コピー数のプラスミドを利用する多数の組換えＤＮＡストラテジーが存在する。酵母は、クローニングされた哺乳動物遺伝子産物においてリーダー配列を認識し、リーダー配列（即ち、プレペプチド）を有するペプチドを分泌する。
【００６７】
組換えポリペプチドの長期、高収率な生産に関して、安定な発現が好ましい。例えば、対象とするポリペプチドを安定に発現する細胞株は、同じであるか又は別個のベクターに、複製のウイルス起源及び／又は内因性発現要素、及び選択可能なマーカー遺伝子を含んでもよい。ベクターの導入後、細胞は、それらが選択培地にスイッチされる前に強化培地において１〜２日間増殖させることができる。選択可能なマーカーの目的は、選択への耐性を付与することであり、その存在は、誘導される配列を首尾よく発現する細胞の増殖及び回収を可能にする。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、細胞型に適切な組織培養技術を用いて増殖可能である。次に、このような細胞において実質的に富んだ細胞株が単離され、安定な細胞を提供することができる。宿主細胞は、組換えタンパク質の発現レベルに基づいてさらに選択可能である。
【００６８】
ＲｕＶを結合及び中和可能である抗体、抗体フラグメント、生物活性ペプチド、融合タンパク質、上記定義された任意の他の化合物は、細胞培養物又は合成調製物からの組換えタンパク質としてそれらを精製可能にする十分に確立した技術（即ち、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳動など）を用いて提供することができる。これらの調製物は、組換えタンパク質の十分な量（ミクログラムからミリグラムの範囲）を提供して、ＲｕＶに関連した予防、診断、及び治療用途のためにより広範囲な特徴付け及び評価を行わなければならない。
【００６９】
抗体精製の方法は、カラム内に含まれる固相化したゲルマトリックス（Ｎｉｓｎｅｖｉｔｃｈ Ｍ ａｎｄ Ｆｉｒｅｒ Ｍ，２００１；Ｈｕｓｅ Ｋ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｈｏｒｅｎｓｔｅｉｎ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００３）、特に、基質、例えばプロテインＡ、プロテインＧ、または合成基質に対する抗体の一般的な親和に基づいて（Ｖｅｒｄｏｌｉｖａ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｒｏｑｕｅ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００４）、並びに抗原又はエピトープに基づくアフィニティークロマトグラフィー（Ｍｕｒｒａｙ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｊｅｎｓｅｎ Ｌ ｅｔ ａｌ．，２００４）を利用することができる。洗浄後、タンパク質は、ｐＨ又はイオン強度の変化によってゲルから溶出される。あるいは、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を用いることができる。溶出は、タンパク質精製に一般に使用される水−アセトニトリル系溶媒を用いて実行可能である。
【００７０】
組換えタンパク質の調製物は、インビトロ又はインビボアッセイ（生化学、組織又は細胞系アッセイ、齧歯類において確立した疾患モデル、親和性測定のための生物物理学的方法、エピトープマッピングなど）において、特に、ＲｕＶ病因及び免疫学を兼有するための文献に開示されたものの１以上を用いて、例えば、国際的な健康協定（ＷＨＯ２００５；ＷＨＯ２００６）に従って定義される野生型及び参照ＲｕＶ菌株を用いて試験することができる。
【００７１】
ＲｕＶを結合及び中和することができるものとして上記で定義された抗体、抗体フラグメント、生物活性ペプチド、融合タンパク質、及び任意の他の化合物は、ＲｕＶ感染を検出、治療、阻害、予防、及び／又は改善するために使用することができる。この目的で、このような化合物は、ＲｕＶ感染の医療管理のための診断、治療、又は予防用組成物を調製するために使用することができる。
【００７２】
これらの組成物は、ヒトＤＤＦ−ＲｕＶ１及びＤＤＦ−ＲｕＶ２の配列及び活性に基づいて上記で定義された抗体、抗体フラグメント、融合タンパク質、生物活性ペプチド、任意の他の化合物を含んでもよい。組成物は、異なるＲｕＶ中和抗体又は抗体フラグメント、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）調製物、及び／又は抗ウイルス化合物をさらに含んでもよい。異なるＲｕＶ中和抗体又は抗体フラグメントは、異なる中和エピトープ、例えば文献に既に記載されているものによって特徴付けられなければならない。実際には、ぶんけんは、多くの例を示し、そこでは、ウイルス又はヒト標的に指向される２以上の抗体が医薬組成物に組み合わせられる場合、得られる組成物は、単なる相加効果ではなく、特定の相乗効果に起因して、改善された治療効果を有してもよい（Ｌｏｇｔｅｎｂｅｒｇ Ｔ，２００７）。
【００７３】
医薬組成物は、場合により、任意の医薬として許容されるビヒクル又は担体を含んでもよい。これらの組成物は、任意の付加的な治療薬又は予防薬、例えば、ワクチン、静脈内免疫グロブリン調製物、又は抗ウイルス化合物をさらに含んでもよい（又は一緒に投与されてもよい）。また、最近の文献は、ヒトモノクローナル抗体は、この静脈内免疫グロブリン調製物に補足する（可能であれば、置換する）ために用いられ、このような医薬組成物の頻度及び／又は投薬量を減少させる機会を与えることができる（Ｂａｙｒｙ Ｊら，２００７）。
【００７４】
任意のタンパク質（例えば、抗体、抗体フラグメント、融合タンパク質、生物活性ペプチド）、上記で定義される核酸を含む組成物は、ＲｕＶに関連した診断、治療、又は予防の目的のある個体に投与することができる。これらの組成物は、ＲｕＶビリオンを標的化することによって、治療される患者内のウイルスの繁殖を阻害し、潜在的には、集団におけるウイルス感染の発生をブロックすることができる治療的化合物（特に、治療用抗体又は治療用抗体フラグメント）を提供するＲｕＶ特異的受動免疫のための手段として投与することができる。
【００７５】
特定の使用に依存して、組成物は、長期間又は短期間、ヒト対象（幼児、妊娠女性、年配の個体、又はＲｕＶに感染し、又はＲｕＶ感染した個体との接触、入院、又は免疫抑制／化学療法的治療に起因してＲｕＶに危険であると考えられる任意の他の個体）に化合物を提供されなければならない。この目的で、組成物は、筋内、静脈内、皮下、局所、粘膜、噴霧器、吸引、点眼、非／生分解性マトリックス材料中、又はミクロビーズなどの微粒子薬物送達システムを用いることにより投与することができる。
【００７６】
医薬組成物は、特に、眼内、ウイルス血症に関連した皮膚疹でのウイルスの存在があれば、眼内又は局所投与のために、十分な期間、その化合物が活性を発揮することができる化合物の治療的又は予防的な有効量を対象に提供しなければならない。抗体又は抗体フラグメントを含む組成物が、創傷、皮膚、粘膜、又は角膜に局所投与される場合に効果的であることが証明された（Ｂｒｅｒｅｔｏｎ Ｈ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｃａｓｔｌｅ Ｐ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｓｔｒｅｉｔ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｎｗａｎｅｇｂｏ Ｅ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
【００７７】
所望の効果は、ＲｕＶ感染、再活性化、及び／又は再感染を調節することによって、ＲｕＶ感染の臨床症状の少なくとも幾つかを低減させることによって、患者の状態を改善することである。例えば、組成物は、投与経路、個人の状態に依存して、約０．００５〜約５０ｍｇ／ｋｇ／体重の有効量で投与されなければならない。
【００７８】
診断的使用を有する組成物の場合において、化合物は、生物学的試料中にウイルスを検出するための臨床及び研究所において一般に確立した技術（例えば、ＥＬＩＳＡ又は他の血清学的検定）を用いて、又は投与後の少なくとも１、２、５、１０、２４時間、若しくはそれを超えてインビボで対象に投与される場合に、検出されなければならない。ＲｕＶの検出は、免疫コンピテント及び免疫不全宿主の両方の危険な集団においてＲｕＶ感染をモニターするために確立された既知の手段及び手法に代えて又は結びつけて、本発明のタンパク質を用いて実行することができる。
【００７９】
ＲｕＶ又はＲｕＶに関連した疾患の治療、予防、又は診断のための方法は、上記で定義されるタンパク質又は核酸の投与を含むことが可能である。この方法は、異なるＲｕＶ中和抗体又は抗体フラグメント、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）調製物、及び／又は抗ウイルス化合物の投与をさらに含んでもよい。
【００８０】
臨床開発及び使用は、抗体薬物動態及び薬理学の特徴付け（Ｌｏｂｏ Ｅら，２００４）、臨床前及び臨床安全データ（Ｔａｂｒｉｚｉ Ｍ及びＲｉｓｋｏｓ Ｌ，２００７）、並びにヒトにおける治療的及びインビボでの診断的使用のために治療的組換え抗体の商業生産スケール調合及び分析的特徴付けのための正式な公的要求（Ｈａｒｒｉｓ Ｒら，２００４）に基づくべきである。
【００８１】
ここで、本発明は、下記の実施例によって記載されるが、多少なりとも、本発明を制限するものとして解釈されてはならない。
【実施例】
【００８２】
実施例１：ＥＬＩＳＡにおけるＲｕＶタンパク質抽出物に結合するヒトＦａｂの発現及び分泌
材料＆方法
ライブラリー構築
ヒトＩｇＧ１の重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡは、文献（Ｂｕｒｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８；”Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｂｕｒｔｏｎ ＤＲ ｅｔ ａｌ．，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，２００１）に従って、ＲｕＶ血清陽性反応の個体から得たリンパ球から得られた。ファージライブラリーは、ＰＣＴ特許出願ＷＯ０７／００７１５４に記載される技術に従って、ｐＤＤベクターと適合するクローニングカセットを用いて構築された。Ｆａｂは、ＤＤカセット内にクローニングされ、ライブラリーの組換えファージの表面に発現された。ｐＤＤに基づくＦａｂライブラリーのパンニングを介したヒトＦａｂの選択、陽性クローンの配列決定は、文献（Ｂｕｒｉｏｎｉ Ｒら，１９９８）に記載されるように行った。
【００８３】
Ｆａｂの特異的なＣＤＲは、ＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴ（Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ Ｖら，２００４）、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって提供されるもの、ＦＡＳＴＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｆａｓｔａ３３／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を用いて検出可能なものなどのヒト抗体のタンパク質配列を含む他のデータベースによって提供される予測及び配列整列を比較することによって特定された。
【００８４】
細胞培養の細胞からのタンパク質抽出物の精製
ＶＥＲＯ細胞（ＡＴＣＣ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＣＣＬ−８１）は、単層として増殖するサル線維芽細胞株であり、通常、ＲｕＶを含むヒトウイルスを試験し、繁殖させるために使用される。ＲｕＶに対する中和抗体は、ＶＥＲＯ細胞を用いて特徴付けられている（Ｃｏｒｄｏｂａ Ｐら，２０００ｂ）。
【００８５】
ＲｕＶ臨床単離物（Ｈ２）を用いて感染させたＶＥＲＯ細胞は、ファージディスプレイライブラリーをパンニングし、ＥＬＩＳＡにおいてＦａｂを試験するためのＲｕＶ特異的材料の調製のために使用した。ＶＥＲＯ細胞は、１０％の不活化されたウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５０μｇ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び２ｍＭのＬ−グルタミンを含む修飾されてイーグル培地において維持される。
【００８６】
細胞（ＲｕＶ感染又は未感染ＶＥＲＯ）を回収し、２５０ｍｌの溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；０．０２％アジ化ナトリウム；０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）に再懸濁させ、氷上で２０分間インキュベートし、次に、１２０００ｒｐｍで２分間、４℃で遠心分離した。得られた上清のタンパク質濃縮物は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて２重に測定し、既知濃度でウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の連続希釈に関してレポートした（０ｍｇ／ｍｌ＝ブランク〜２．０００ｍｇ／ｍｌ＝最大値）。全ての試料の吸光度は、分光計セットを用いて５４０ｎｍで測定した。
【００８７】
タンパク質抽出物を用いたパンニング及びＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡのためのタンパク質コーティングは、下記の抗原：ＶＥＲｏ細胞の溶解物、ＲｕＶ感染又は未感染（臨床単離物Ｈ２）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて９６ウェルプレートで行った。各試料は、カーボネートバッファー（１ウェルあたり２５μｌの最終体積に全タンパク質の１００ナノグラム）で希釈し、プレートを一晩、４℃でインキュベートした。蒸留水で洗浄後、プレートを１％ＢＳＡを含むＰＢＳにおいて１時間３７℃でインキュベートすることによってブロックした。
【００８８】
ＥＬＩＳＡは、文献（Ｂｕｇｌｉ Ｆら，２００１）に開示されているプロトコールを用いて下記のＦａｂ：ＤＤＦ−ＲｕＶ１、ＤＤＦ−ＲｕＶ２、およびｅ１３７、Ｃ型肝炎ウイルスに特異的な無関係なＦａｂを含む未希釈の試料４０μｌを用いて行った。Ｆａｂは、二重のウェルで試験した。各Ｆａｂを用いて、１時間３７℃でインキュベートし、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで５回洗浄後、４０μｌのヤギ抗ヒトＦａｂ、ペルオキシダーゼ結合体（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ ｎｏ．Ａ０２９３）を添加し、１時間３７℃でインキュベートした。プレート洗浄は上述のように繰り返し、酵素反応は、各ウェルに４０μｌの基質（ＴＭＢ基質キット；Ｐｉｅｒｃｅ）を添加することによって発色させた。ＥＬＩＳＡ反応は、１５分間３７℃で発色させた。酵素火星は、停止溶液（Ｈ2ＳＯ4）の添加によって停止させ、分光計セットを用いて、４５０ナノメートルで吸光度を測定した。
【００８９】
ＥＬＩＳＡ及び中和アッセイのためのＦａｂ調製
プロトコールは、ｐＤＤ又は他のファージミドを用いた文献（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９；Ｂｕｒｉｏｎｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８； Ｂｕｇｌｉ Ｆ ｅｔ ａｌ．，２００１；ＷＯ０７／００７１５４）に記載されるのと同じであった。
【００９０】
要約すると、ライブラリーの個々のＥ．ｃｏｌｉクローンは、抗生物質を含み、ＩＰＴＧを補足されたＳｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ（ＳＢ；３．５％バクト−トリプトン、２％酵母抽出物、０．５％ＮａＣｌ）培地２００ｍｌで増殖させ、回収し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。溶解は、調節されたパルスを用いた４℃での超音波処理によって、ペリプラスム空間に限定された。ペリプラスム抽出物中のＦａｂは、４５分間４℃でＪＡ−１０ローターで１２，０００ｒｐｍの超遠心分離によって部分的に精製した。生産物をろ過し、Ｃｅｎｔｒｉｏｎフィルターを用いて１０倍に濃縮した。
【００９１】
部分的に精製されたＦａｂの濃縮物は、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ；Ｃａｔ ｎｏ．３６９０）の表面に結合させたＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）2（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｃａｔ．ｎｏ．３１１３２）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによってペリプラスム抽出物で測定した。３７℃での１時間のインキュベーション後、脱イオン水でプレートを６回洗浄し、２％ＢＳＡを含む１７０μｌ／ウェルＰＢＳを用いてブロックした。３７℃でさらに１時間のインキュベーション後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中の各Ｆａｂの連続して３倍希釈物の５０μｌ、又は既知濃度の対照のヒトＦａｂ（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ．６００１−０１００）を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次に、プレートをＴＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ）で６回洗浄した。次に、抗体結合は、アルカリホスファターゼを結合したヤギ抗ヒト抗体（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｃａｔ．Ｎｏ．３１３１２）を５０μｌ添加することによって測定し、３７℃で１時間インキュベートした。プレート洗浄は、上述されるようにＴＰＢＳを用いて繰り返し、１００μｌのｐ−ニトロフェニルリン酸２ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに添加した。ＥＬＩＳＡ反応は、６０分間発色させ、結果は、既知の濃度で希釈した対照ヒトＦａｂに対してプロットした。全ての試料の吸光度は、５９０ｎｍで分光計セットを用いて測定した。
【００９２】
結果
組換えファージのライブラリーは、ｐＤＤ技術（ＷＯ０７／００７１５４）に従って生じさせ、ＲｕＶの臨床単離物を用いて感染させた線維芽細胞株から得たタンパク質抽出物について評価した。また、５ラウンドのパンニングは、ＲｕＶよって感染していない同じ細胞株からの対照タンパク質抽出物を用いて同ライブラリーを用いて並行して行った。
【００９３】
第３ラウンドによって、対照タンパク質抽出物に対して評価した試料のファージ力価は、１０4を下回り、一方、ＲｕＶ抽出物に対して評価した試料のファージ力価は、第４ラウンドで１０4を超え、第５ラウンドでは１０5に到達した。この値は、ＲｕＶ抗原に結合するそれらの表面Ｆａｂに発現している組換えファージにおけるライブラリーの進行的濃縮を示す。
【００９４】
パンニングの第５ラウンド後に得られた１４個のクローンは、ＥＬＩＳＡにおいて個別に試験され、陽性であることが確かめられた。選択されたクローンにおけるＨＣＤＲ３のＰＣＲ及び配列分析により、ここで命名されたＤＤＦ−ＲｕＶ１及びＤＤＦ−ＲｕＶ２のヒトＦａｂを特徴付ける２つの重鎖が同定された。ＤＤＦ−ＲｕＶ１又はＤＤＦ−ＲｕＶ２を発現している組換えファージの反応性は、ＲｕＶ特異的タンパク質抽出物、並びに無関係な抗原（ウシ血清アルブミン、未感染細胞からのタンパク質抽出物）に対して試験され、ＥＬＩＳＡフォーマットにおいてそれらの結合活性が確かめられた（図１）。また、結合の特異性は、対照のヒトＦａｂを用いて確認された。
【００９５】
これらのＦａｂの完全な重鎖及び軽鎖可変領域のＤＮＡ配列、並びにＤＤＦ−ＲｕＶ１及びＤＤＦ−ＲｕＶ２に対して、対応するＣＤＲを決定した（それぞれ、図２及び３）。これらのＦａｂはまた、タンパク質発現のためのＥ．ｃｏｌｉ系システムを用いて、更なるアッセイのための十分な組換えタンパク質を得るための他のベクターに再度クローニングされた。
【００９６】
実施例２：ＲｕＶ感染させた細胞培養物について試験されたＤＤＦ−ＲｕＶ１及びＤＤＦ−ＲｕＶ２の特性
材料＆方法
ＲｕＶ特異的ヒトＦａｂの中和アッセイ
免疫蛍光に基づくアッセイは、３７℃で７２時間のインキュベーション後には、通常、コンフルエントな単層を形成する条件下で、プレートに植菌された１０4〜１０5個のＶＥＲＯ細胞を用いて、Ｃｏｓｔｅｒの２４ウェルプレートで行った。ＲｕＶ臨床単離物であるＨ２を感染に使用した。
【００９７】
Ｆａｂは、実施例１に指示されるように部分的に精製し、維持培地に懸濁させた５０ＴＣＩＤ50（５０％組織培養感染用量）での等体積のＲｕＶ細胞不含ストックを用いて種々の濃度（０．０１、０．１、１、１０及び５０μｇ／ｍｌ）で混合した。対照は、Ｆａｂなし（ブランク対照）、又はヒトＣ型肝炎ウイルスに特異的な無関係なＦａｂ（ｅ１３７；Ｂｕｇｌｉ Ｆら，２００１）の存在で、等体積の維持培地及びウイルスから構成された。
【００９８】
３７℃でのインキュベーションの１時間後、２５０μｌのウイルス−フラグメントＦａｂ混合物又は対照混合物は、培地が除かれたウェル（２重）に植菌された。プレートを２時間３７℃でインキュベートし、中和されていないウイルスの吸着を可能にする。植菌物を除去し、１．５ｍｌの維持培地を添加した。細胞培養条件で１週間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、冷メタノール−アセトン溶液（１：２比）で１０分間、室温で固定した。固定された細胞は、３０分間、３７℃で、湿気雰囲気でＲｕＶのタンパク質Ｅ１に特異的な市販のモノクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＡＢ９２５）とともにインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、最後に、３０分間、３７℃で、湿気雰囲気で抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣ結合体（Ｓｉｇｍａ）とともにインキュベートした。スライドをＰＢＳで洗浄し、Ｅｖａｎｓ Ｂｌｕｅ色素で対比染色し、グリセロールを積層した。各Ｆａｂの中和活性は、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）によって観察される単一の蛍光を発する細胞をカウントし、対照試料の細胞（Ｆａｂ前インキュベーションなし）と比較して、ＲｕＶ陽性細胞の数の減少の割合を計算することによって測定された。
【００９９】
結果
ＤＤＦ−ＲｕＶ１及びＤＤＦ−ＲｕＶ２に関するＲｕＶ中和活性の分析は、部分的に精製したＦａｂの調製物の使用及び免疫蛍光に基づくアッセイによって行った。
【０１００】
ＲｕＶ感染細胞の減少に関するデータは、ＤＤＦ−ＲｕＶ１及びＤＤＦ−ＲｕＶ２が、ＲｕＶとともにプレインキュベートされた場合に中和活性とともに与えられることを指示する。実際に、対照（ＦａｂなしのＲｕＶまたは無関係なＦａｂとのＲｕＶ）と比較すると、これらのＲａｂの添加は、投薬量に依存して感染細胞の数を減少する（図４）。
【０１０１】
本明細書において提示された実験的証拠は、ＲｕＶ感染に関連した診断、治療、又は予防的応用のためのＤＤＦ−ＲｕＶ１及びＤＤＦ−ＲｕＶ２Ｆａｂ（又はそれらの特異的なＨＣＤＲ３に基づく代替のタンパク質配列であって、類似の性質を示す）候補化合物を作製する。
【０１０２】
ＤＤＦ−ＲｕＶ１及びＤＤＦ−ＲｕＶ２は、細菌宿主細胞における組換えタンパク質として発現することができる。特に、これらのＦａｂは、ｐＤＬａｃ−ＦＬＡＧｈｉｓベクターなどのＤＤカセット（ＰＣＴ／ＩＢ２００８／０００２６６）に存在する制限部位と適合するベクターにそれらのコーディング配列を再度クローニングすることによって発現可能である。このベクターは、ヘテロ二量体複合体を形成する適切な定常領域、重鎖のＣ末端での６−Ｈｉｓ及びＦａｇを含む可溶性Ｆａｂの発現を可能にする（図５）。このアプローチは、Ｆａｂのより直接的なクローニング、検出（例えば、ＥＬＩＳＡにおける）及び精製（例えば、固相化した金属親和性カラムに基づく手法を用い、免疫親和性精製と比較してより簡易でありよりコストが抑えられる）を可能にする。
【０１０３】
実施例３：ＲｕＶ特異的な中和エピトープを決定するためのｐＤＤに基づくペプチドライブラリーの構築及び評価
ＲｕＶ中和Ｆａｂは、パンニングのためのＲｕＶで感染させたＶＥＲＯ細胞のタンパク質抽出物を用いて、ヒトＦａｂのｐＤＤ系ライブラリーをパンニングすることによって初期に同定された。その後、ＲｕＶ特異的な中和活性は、細胞系モデルにおいて試験されたが、実際にはＤＤＦ−ＲｕＶ１及び／又はＤＤＦ−ＲｕＶ２によるウイルスエピトープは特定されなかった。
【０１０４】
類似のエピトープは、過去における異なるアプローチを用いて想定され、合成ペプチドＥＬＩＳＡ（Ｇｉｅｓｓａｕｆ Ａら，２００４）、タンパク質欠失突然変異体（Ｃｈａｙｅ Ｈら，１９９２）、マウスモノクローナル抗体のパネルを用いた競合分析（Ｇｒｅｅｎ Ｋ及びＤｏｒｓｅｔｔ Ｐ，１９８６）、又はこれらの技術の組み合わせ（Ｗｏｌｉｎｓｋｙ Ｊら，１９９３）が含まれる。
【０１０５】
この範囲で、ｐＤＤ技術は、ＷＯ０７／００７１５４における血球凝集素エピトープタグ（ＨＡｔａｇ）を利用することによって例示されるように、２つの機能性ファージコートタンパク質の１つ又は他方のいずれかのファージ表面に提示されるペプチドライブラリーを構築するために適用することができる。ｐＤＤ技術を用いて提示された非ランダム又はランダムペプチドのライブラリーは、抗体を特異的に結合するペプチドを提示するファージを選択するためにスクリーニングすることができる。ライブラリーにおいて選択されるペプチド配列モチーフは、抗体特異的なエピトープの特定を可能にする（Ｚｈｏｎｇ Ｇら，１９９７；Ｙｉｐ Ｙら，１９９９ａ）。
【０１０６】
異なるファージディスプレイフォーマットを用いて提示させたペプチド配列をスクリーニングし、比較するという重要性は、文献に示されている。第１の例では、モノクローナル抗体のエピトープは、異なる長さのペプチドを各々含み、異なるファージコートタンパク質に融合された２つのファージディスプレイライブラリーを用いて、ファージによって提示されたエピトープ（又は「ファゴトープ」）内で選択された。スクリーニングの結果は、異なるペプチド配列は、２つのファージディスプレイプラットフォームを用いて選択されたということであり、これは、ファゴトープの特徴付けが、ファージコートタンパク質における比較タイプのペプチド提示を必要とし得ることを示唆する（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ Ｋら，２００５）。同様の証拠はまた、有機（例えば、ヒトの毛髪又は皮膚）又は無機（例えば、ポリプロピレン）支持体に結合するペプチドの場合において見出された。文献（Ｓｃｈｏｌｌｅ Ｍら，２００５）に記載された方法、又はそれに従って修飾された方法などの、異なる長さを有するペプチドの市販のファージによって提示されたライブラリーをスクリーニングし、比較することによって、得られる配列が顕著に異なる（ＷＯ０７／０３５５１、ＷＯ０６／０９４０９３、ＷＯ０６／０９４０９４、ＷＯ０６／０９４０９５）。
【０１０７】
２つの異なるライブラリーは、ｐＤＤファージミド（ｐＤＤｃ）と市販のライブラリー（Ｐｈ．Ｄ．１２ファージディスプレイライブラリーキット；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，ｃａｔ，ｎｏ．Ｅ８１１０Ｓ）との組み合わせによって構築され、それは、抗体の線状又は立体的エピトープを決定するための過去においてすでに使用され（Ｌｉ Ｙら，２００７；Ｐｅｔｉｔ Ｍら，２００３）、異なる長さのペプチドライブラリーを生じるために修飾された（ＷＯ０７／０３５５１、ＷＯ０６／０９４０９３、ＷＯ０６／０９４０９４、ＷＯ０６／０９４０９５）。このライブラリーは、６４個の可能なコドンのうちほんの３２個を含む。それは、第３の位置がＴ又はＧに限定されているためであって、単一コドンを有する残基の相対的頻度を増加させ、３つの終始コドンの２つ（第３のものは適切なＥ．ｃｏｌｉ菌株において抑制され、グルタミンに翻訳され得る）を除去するためである。
【０１０８】
このライブラリーに含まれるファージミド由来の複製の二本鎖形態は、ＸｈｏＩ制限部位を含むフォワードプライマー、ＳｐｅＩ制限部位を含むリバースプライマーを用いたＰＣＲ増幅のための鋳型として使用された。第２のＰＣＲ増幅は、鋳型と同じライブラリー、ＫｐｎＩ制限部位を含むフォワードプライマー、ＥａｇＩ制限部位を含むリバースプライマーを用いて行われた（図６Ａ）。
【０１０９】
ＰＣＲ増幅に起因するＤＮＡフラグメントが消化され、各々が約１０8の力価を有し、初期には、ｃｐ３にだけ融合する、２つの異なるｐＤＤ系ペプチドライブラリーを生じるためのｐＤＤｃベクターにクローニングされた。第１のケースでは、ｐＤＤｃＸＳｍｅｒ−ｏｒｃｐ３ライブラリーは、ＸｈｏＩ及びＳｐｅＩ制限部位におけるＰＣＲ増幅産物をクローニングすることによって生じた（図６Ｂ）。第２のケースでは、ｐＤＤｃＫＥ１２ｍｅｒ−ｏｒｃｐ３ライブラリーは、中間のｐＤＤｃＫＥベクターにＰＣＲ増幅をクローニングすることによって生じさせ、それには、ＸｈｏＩ／ＳｐｅＩ部位の間のＫｐｎＩ及びＥａｇＩ制限部位、ＨＡコーディング領域の５’／３’末端を含む（図６Ｃ；ＷＯ０７／００７１５４）。
【０１１０】
クローニング部位としてＳｐｅＩの使用は、特定の効果を提供することを気づくことは重要である。それは、この制限酵素は、元々にペプチドライブラリーに存在する２つの連続コドン：スレオニンをコードするＡＣＴ、セリンをコードするＡＧＴに対応する配列（ＡＣＴＡＧＴ）内で切断するためである。他の２つの可能なフレームは、ライブラリー内で可能にしないため（即ち、Ａ及びＣは、コドンにおける第３の位置として存在しない）、ＤＤカセット内でライブラリーをクローニングするためのＳｐｅＩの利用は、ｐＤＤベクターのＳｐｅＩ部位がｐＤＤｃの場合のように同じコーディングフレームを有する場合に、低い頻度でペプチドのより短い変異体の導入を可能にする（図６Ｂ及び６Ｃ）。
【０１１１】
このようなアプローチは、ＡｌｗＮＩ（ＣＡＧＮＮＮＣＴＧを認識）、ＮｄｅＩ（ＣＡＴＡＴＧを認識）、ＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴを認識）、又はＰｖｕＩＩ（ＣＡＧＣＴＧを認識）などの類似の特性（第１塩基としてＡ又はＣ、第２塩基としてＡ又はＣ、第３塩基としてＧ又はＴ、６又は９塩基対を認識する）を有する認識部位を有する他の酵素を利用するこの種のライブラリーの変異体を生じるために使用することができる。また、類似の部位は、元々のライブラリーにおける追加の非／ランダムコドンを無作為に統合するために使用されてもよく、ライブラリーの複雑性をさらに改善する。
【０１１２】
ｃｐ３又はｃｐ８に融合したタンパク質を提示するために、２つのｐＤＤ系ペプチドライブラリーは、（例えば、ＸＬ１−ｂｌｕｅ Ｅ．ｃｏｌｉ菌株において）維持及び増幅することが必要である。ファージミドは精製され、ＢｇｌＩ（ＤＤカセットを抽出するために）で消化され、次に、ＢｇｌＩ消化されたｐＤＤｃベクターに再度連結される。連結反応は、細菌を形質転換するために使用され、その結果、２つのライブラリーが選択され、Ｚｅｏｃｉｎ耐性細菌細胞として維持された。この場合、ファージミドが増幅され得て、ヘルパーファージによる感染後に組換えファージに含まれ、単一のクローンは、所望のスクリーニング後に分析可能である。
【０１１３】
この方法では、ＤＤカセットのペプチドライブラリーがクローニングされ、対応するｐＤＤｃＸＳｍｅｒ−ｏｒｃｐ３／ｃｐ８及びｐＤＤｃＫＥ１２ｍｅｒ−ｏｒｃｐ３／ｃｐ８ライブラリーにおける２つの可能な配向のいずれか１つにスクリーニングされる（図７；ＷＯ０７／００７１５４）。次にライブラリーは、Ｅ．ｃｏｌｉで増幅され、組換えファージはパンニング実験の結果を比較することによって試験された。パンニングは、組換えファージを生じるためのヘルパーファージの使用を伴う。このファージの集団が単離され、文献に記載されるように、マイクロウェルプレートに被覆された対象の標的への結合親和性に基づいて試験することができる。対象の標的に対する３〜５つの連続的なパンニングラウンド後、特異的結合は、対照と比較されると、溶出されたファージの数の増加によって明示される。
【０１１４】
本ケースでは、２つのライブラリーは、市販の抗ＨＡｔａｇ抗体（マウスモノクローナル抗体ＨＡ．１１、クローン６Ｂ１２；Ｃｏｖａｎｃｅ）などの周知な線状エピトープを有する抗体に対して試験された。このアプローチは、ファージディスプレイプラットフォームを改善するための技術を評価するために従来使用されていた（Ｓｔｒａｔｍａｎｎ Ｔ及びＫａｎｇ Ａ，２００５；Ｖａｎｈｅｒｃｋｅ Ｔｒａ，２００５）。
【０１１５】
ライブラリーのタイトルにおける減少があるとしても（ＢｇｌＩ消化、再連結、Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換に関連する手法による）、関連した標的（抗ＨＡｔａｇモノクローナル抗体）又は負の対照（ＢＳＡ）に対するパンニングの比較は、ｐＤＤｃＸＳｍｅｒ−ｏｒｃｐ３／ｃｐ８（表Ｉ）及びｐＤＤｃＫＥ１２ｍｅｒ−ｏｒｃｐ３／ｃｐ８（表ＩＩ）ライブラリーに関して、計算されたインプット及びアウトプットについて有意な相違があることを示す。さらに、パンニングの第３ラウンドは、抗ＨＡｔａｇのアウトプットに対する１０２の特定濃縮をＢＳＡの１つと比較することを示す。
【０１１６】
ＤＤカセット及びペプチドが２つのライブラリーの各クローンに存在する配向は、制限分析によって容易に測定可能である（図７）。消化は、提示されるべき配列を有するＤＤカセットの末端近くを切断する酵素（例えば、ＸｈｏＩ又はＳｐｅＩ）と、ｐＤｄベクターの骨格にあるコートタンパク質をコードする配列の末端を切断する酵素（例えば、ｃｐ３*についてはＮｈｅＩ）とを組み合わせることによって行われる。得られる制限パターンは、コートタンパク質をコードする配列だけを含むＤＮＡフラグメント（ＤＤカセットがｃｐ３*に配向する場合）、又はＤＤカセット及びコートタンパク質をコードする配列を含むＤＮＡフラグメント（ＤＤカセットがｃｐ８*に配向する場合）を示す。
【０１１７】
ＮｈｅＩ／ＳｐｅＩ消化は、上記されるパンニング前及び／又は後に、２つのライブラリーから無作為に選択されるクローンのパネルにおいて行われた。消化から得られたＤＮＡフラグメントが電気泳動によって分離されると、約０．６ｋｂのフラグメントは、ＤＤカセットがｃｐ３*に配向される場合に検出され、約１．８ｋｂのフラグメントは、ＤＤカセットがｃｐ８*に配向される場合に検出される。この分析は、全ての状況において、ｃｐ８*配向を有するクローンの僅かな有病率を示した（図８）。
【０１１８】
ｐＤＤｃＸＳｍｅｒ−ｏｒｃｐ３／ｃｐ８及びｐＤＤｃＫＥ１２ｍｅｒ−ｏｒｃｐ３／ｃｐ８ライブラリーにおいてクローニングされたペプチドの配列は、無作為に選択されたクローンについて決定され、良好なレベルの変動、ｐＤＤｃＸＳｍｅｒ−ｏｒｃｐ３／ｃｐ８の場合には、７〜１２個のアミノ酸の範囲のより短い配列を有するペプチドの存在の両方を確実にした（図９）。同じ分析は、抗ＨＡｔａｇ抗体に対するｐＤＤｃＫＥ１２ｍｅｒ−ｏｒｃｐ３／ｃｐ８をパンニング後に得られたクローンにおいてなされ、ＨＡｔａｇ（テトラペプチドＹＰＹＤ）を含むペプチドの存在が選択されたクローンにおいて確かめられた。
【０１１９】
ライブラリーにおけるＨＡｔａｇ特異的ペプチドをコードするクローンの存在及び選択の更なる確認として、パンニング選択後に生じた細菌クローンはニトロセルロース様メンブレン上に移され、アルカリ条件で溶解された。この方法では、細菌タンパク質は、ニトロセルロースペーパーに固相化され、次に、抗ＨＡｔａｇとともにインキュベートされる。ＨＡｔａｇを提示する多量のクローンを確認する（図１０）。
【０１２０】
生物活性ペプチド（例えば、抗体、阻害剤又はプロテアーゼの認識部位を特徴付けるエピトープ、膜受容体に結合するペプチド、シグナルタンパク質、又は転写因子）が同定されるｐＤＤ系ペプチドライブラリーを生じ、パンニングするための本ストラテジーは、異なる使用又はクローニングストラテジーに適合することができる。ファージに提示されるランダムペプチドライブラリーの複雑性を改善及び評価するための条件は、文献に記載されている（Ｎｏｒｅｎ Ｋ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｒｏｄｉ Ｄ ｅｔ ａｌ．，２００２）。
【０１２１】
例えば、オリジナルなペプチドライブラリー（その長さ及び複雑性を維持することが望ましい場合）は、クローニング及び形質転換プロセスのより良好な効率を可能にし得る基準の組み合わせを満足する制限酵素の異なる組み合わせを用いてクローニングされ得る。例えば、制限酵素のＢｓｔＥＩＩ、ＭｌｕＩ、ＡｇｅＩ、ＥｃｏＲＶ、Ｓａｌｌ、ＳｎａＢＩ、及びＢｇ１ＩＩは、ｐＤＤｃベクター及びＰｈ．Ｄ．１２ライブラリーに切断するものがなく、（ＥａｇＩと比較して）メチル化不感覚である。
【０１２２】
この実施例は、複数の融合タンパク質を含むｐＤＤ系ペプチドライブラリーを提供し、各融合タンパク質は、ｐＤＤベクターのＤＤリンカーを含む配列によって連結されるウイルス表面タンパク質（ｃｐ３*又はｃｐ８*）及びランダムペプチド配列を含む。ｐＤＤベクター及びＤＤカセットの構造、機能、配列特徴は、ＷＯ０７／００７１５４において特定される。
【０１２３】
初期のペプチドライブラリーは、一般式ＮＮＫ（Ｎは任意の塩基であり、ＫはＧ又はＴである）を有するコドンを含むべきである。上述されるｐＤＤベクターにおけるコドン使用及びフレームと適合され得る部位を認識する制限酵素による消化後、ライブラリーは、元々の配列の完全又はより短い変異体として実際にクローニングされる。これらのペプチド変異体は、一般には遺伝的パッケージ、特に細菌細胞又は線状ファージの表面に提示され得る。
【０１２４】
異なる長さを有し、ｐＤＤベクターのＤＤカセット内に２つの機能性ファージコートタンパク質の１つ又は他方のいずれかと融合されたペプチドを提示するためのファージミドのライブラリーを構築する方法は、下記を含む：
ａ）少なくとも制限酵素を用いてＤＤカセット内にライブラリーをクローニングするために使用される制限部位（例えば、ＳｐｅＩ）に対応する、少なくともコドンの組み合わせを含むＤＮＡライブラリー（例えば、Ｐｈ．Ｄ．１２ペプチドライブラリー）の消化；
ｂ）得られたＤＮＡライブラリーと、少なくとも同じ制限酵素を用いて消化されたファージミド（例えば、ｐＤＤｃ）との連結；
ｃ）細菌細胞の形質転換のためのファージミドの第１ライブラリーの使用、及び細菌細胞の第１ライブラリーの生成；
ｄ）細菌細胞の第１ライブラリーからのファージミドの単離；
ｅ）ＤＤカセットのＤＤリンカーに存在する制限酵素を用いて前記ファージミドの消化；
ｆ）得られたＤＤカセットと、同じ制限酵素を用いて消化したｐＤＤベクターとの連結；
ｇ）細菌細胞の形質転換のためのファージミドの第２ライブラリーの使用、及び細菌細胞の第２ライブラリーの生成；
ｄ）細菌細胞の第１ライブラリーからのファージミドの単離。
【０１２５】
このプロセスの最後に、ＤＤカセットの調節配列、ｐＤＤベクターの１つ又は他の機能性ファージコートタンパク質（例えば、ｃｐ３*又はｃｐ８*）の配列への操作可能に連結されたｐＤＤ系ペプチドライブラリーが生じる。このようなファージミドを含む細菌細胞のライブラリーは、パンニング、又は任意の他の種のネガティブ／ポジティブ選択のために使用される組換えファージの集団を得るために、ヘルパーファージを用いて感染させることができる。
【０１２６】
このクローニングアプローチは、コートされたペプチドの長さの修飾に２つのファージコートタンパク質（ＷＯ０７／００７１５４におけるｐＤＤ技術について指示されるように）の融合を組み合わせる。この方法は、所望の標的に対してスクリーニングされ得るペプチドをコードするファージミドの新規なライブラリー、及びペプチドの新規なライブラリーを提供する。実際に、この方法に従って得られる複数のファージミドは、Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換のために使用することができる。次に、得られる細胞は、組換えファージのライブラリーを生成するためのヘルパーファージを用いて感染させ得る。
【０１２７】
ｐＤＤ系ペプチドライブラリーは、ファージによる提示されるランダムの元々の集団から選択される特定のペプチドをコードするＤＮＡ配列を増幅及び／又は配列決定するためのプライマーをさらに含むキットに（ファージミド又は細菌細胞として）含まれてもよい。
【０１２８】
ｐＤＤ系ペプチドライブラリーは、特定の生物活性を有するペプチドを選択するためにスクリーニングされ得る組換えファージを生成するか、又は特定のリガンド分子に結合するペプチドを単離及び生成するために使用可能である。インビトロでのパンニングの場合、このようなライブラリーは、エピトープマッピング（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ Ｋら，２００５；Ｚｈｏｎｇ Ｇら，１９９７；Ｙｉｐ Ｙら，１９９９ａ）、プロテアーゼ特異性のマッピング及びプロテアーゼ阻害剤の設計（Ｄｉａｍｏｎｄ Ｓ，２００８；Ｓｅｄｌａｃｅｋ Ｒ及びＣｈｅｎ Ｅ，２００５）、あるいは細胞表面の抗原のスクリーニング（Ｍｕｔｕｂｅｒｒｉａら，２００４）のために使用可能である。インビボのパンニングの場合、このようなライブラリー（並びに、ｃｐ３又はｃｐ８のいずれかと融合するだけでなく、異なる長さを有するペプチドを提示するｐＤＤｃＸＳｍｅｒ−ｏｒｃｐ３／ｃｐ８ライブラリーのような特定のもの）は、細胞外空間内、及び細胞膜上でタンパク質−リガンド相互作用の同定を可能にする（Ｆｉｎｇｅｒ Ａら，２００２；Ｙｉｐ Ｙら，１９９９ｂ）。
【０１２９】
【表１】
【０１３０】
【表２】
【０１３１】
【化１】
【０１３２】
【化２】
【０１３３】
【化３】
【０１３４】
【化４】
【０１３５】
【化５】
【０１３６】
【化６】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ウイルスに結合し、ウイルスに特異的な活性を中和するファージディスプレイライブラリーから単離された新規な抗体配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ファージディスプレイ技術は、細胞の表面に発現され、標的と相互作用後に生物学的機能を発揮し得るポリペプチド（抗体フラグメント、生物活性ペプチド、酵素など）をクローニングし、選択し、操作するためのバクテリア細胞（例えば、大腸菌細胞）を感染させる線状ファージ（Ｍ１３など）のゲノムの小さなサイズ及び適応性を利用する。
【０００３】
いくつかのクローニング及び発現戦略、ベクター、ライブラリー、ファージを繁殖させる方法、スクリーニングアッセイは、異なる用途のために開発されている。論文（Ｂｒａｄｂｕｒｙ Ａ ａｎｄ Ｍａｒｋｓ Ｊ，２００４；Ｍａｎｃｉｎｉ Ｎ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｃｏｎｒａｄ Ｕ ａｎｄ Ｓｃｈｅｌｌｅｒ Ｊ，２００５；Ｈｕｓｔ Ｍ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ Ｓ，２００５）及び書籍（“Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”，ｖｏｌ．２６６，ｅｄ．Ｃｌａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｌｏｗｍａｎ Ｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，２００４；“Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，ｅｄ．Ｂｕｒｔｏｎ Ｄ ｅｔ ａｌ．，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，２００１）に概説されている。
【０００４】
ファージディスプレイライブラリーは、組換えファージの集団によって形成され、各々は、その表面上にタンパク質配列のレパートリーの１つの要素を提示する。特定のタンパク質を発現するファージは、反復親和性及び／又は活性に基づく選択プロセス（「パンニング」）によってライブラリーから単離することができる。例えば、タンパク質は、生物学的及び機能的アッセイにおいて、抗原に対する特定の結合親和性又は活性に基づいて、単離され、特徴付けることができる、可変重鎖／軽鎖ヘテロ二量体（通常、Ｆａｂと称される）又は一本鎖フラグメント可変部（ｓｃＦｖ）の形態で抗体フラグメントであってもよい。
【０００５】
特に、スクリーニングプロセスは、病原体及び生物学的標的物に高親和性及び特異性を有する抗体フラグメントを同定するために開発されつつあり、時として、関連する生物学的活性は、このような結合特性と関係している。実際に、全体の治療アプローチ（受動免疫療法又は受動血清療法と称される）は、ヒト又は非ヒト治療標的物に指向される抗体及び抗体フラグメントの抗原結合特性に基づいている（Ｄｕｎｍａｎ Ｐ ａｎｄ Ｎｅｓｉｎ Ｍ，２００３；Ｋｅｌｌｅｒ Ｍ ａｎｄ Ｓｔｉｅｈｍ Ｅ，２０００）。受動免疫療法は、病原性抗原（毒素、ヒトタンパク質、ウイルス、又は寄生生物など）に対する所定の結合特性を有する治療用抗体を含む医薬組成物の個体への投与からなる。
【０００６】
受動免疫療法は臨床診療に導入され、広範囲な疾患（例えば、感染症、免疫を媒介した疾患及び癌）の治療のための機会を急速に拡張する。このアプローチは、標的化された分子をブロックし、及び／又は排除するために必要とされる量で及び／又は特異性をもって、免疫系がそれらを生産することができない患者において特に効果的であり得る（Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ Ｌ，２００５；Ｌａｆｆｌｙ Ｅ ａｎｄ Ｓｏｄｏｙｅｒ Ｒ，２００５）。
【０００７】
治療用抗体を用いて標的化され得る病原性抗原のうち、ヒト細胞に影響を与えるウイルスが特に重要である。このような抗体の投与は、患者におけるウイルスの繁殖を阻害し、集団におけるウイルス感染の大発生を潜在的にブロックすることができる。あるいは、抗体は、免疫応答性個体の健康に重篤及び／又は持続的な結果を通常な有しないものを含む感染症に非常に感受性となる多かれ少なかれ延長された期間、免疫系が弱まった患者（例えば、免疫抑制された個体、高齢者、又は移植された個体）に投与されてもよい。
【０００８】
風疹ウイルス（ＲｕＶ、三日麻疹）は、このようなウイルスの一例である。ＲｕＶは、ＲＮＡゲノム、２つの非構造的タンパク質、宿主由来の脂質二重層に組み合わせられる３つのウイルス構造タンパク質（Ｅ１、Ｅ２、及びＣ）によって形成されるビリオンエンベロープを提示するトガウイルスファミリーのメンバーである（Ｂａｎａｔｖａｌａ Ｊ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ Ｄ，２００４；Ｌｅｅ Ｊ ａｎｄ Ｂｏｗｄｅｎ Ｄ，２０００；“Ｒｕｂｅｌｌａ Ｖｉｒｕｓｅｓ”Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｅｄ．Ｂａｎａｔｖａｌａ Ｊ ａｎｄ Ｐｅｃｋｈａｍ Ｃ，ｖｏｌ．１５，２００６，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）。
【０００９】
ＲｕＶは、感染した個体の鼻咽頭分泌物、血液、排泄物、尿に存在し、呼吸噴霧を介して、ヒトからヒトへと伝染される。Ｒｕｖは、神経向性ウイルスであり、初期には、神経系細胞（例えば、乏突起膠細胞）に感染するが、ＲｕＶ菌株は、種々の細胞型、特に神経及び関節組織（例えば、滑膜細胞）において感染し、複製し、持続する能力において変化する。ウイルス性アルトロトロピスム（ａｒｔｈｒｏｔｒｏｐｉｓｍ）は、関節症状とのＲｕＶ感染の関係を説明することができる（Ｌｕｎｄ Ｋ ａｎｄ Ｃｈａｎｔｌｅｒ Ｊ，２０００；Ｍａｓｕｋｏ−Ｈｏｎｇｏ Ｋ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ＲｕＶは、感染した細胞における細胞変性効果、アポトーシス、細胞周期停止を誘導する。実際には、ＲｕＶタンパク質は、タンパク質−タンパク質相互作用、遺伝子発現、及びタンパク質リン酸化と干渉することによって、宿主の細胞シグナル伝達及び代謝を修飾する（Ｈｏｆｍａｎｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｃｏｏｒａｙ Ｓ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ａｔｒｅｙａ Ｃ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｄｏｍｅｇａｎ Ｌ ａｎｄ Ａｔｋｉｎｓ Ｇ，２００２；Ａｄａｍｏ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｆｉｇｕｅｒｅｉｄｏ Ａ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
【００１０】
ＲｕＶは、一般に、軽度の疾病に関与し、曝露後の１６〜２０日間で発症し、主に顔及び四肢に観られる微熱及び多発を有する。また、ＲｕＶ感染は、全くの無症状である場合がある。ＲｕＶは、成人では、合併症、例えば感染後の脳障害、血小板減少性紫斑病、出血兆候、又は関節炎をめったに引き起こさない（Ｂａｎａｔｖａｌａ Ｊ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ Ｄ，２００４）。また、ＲｕＶ感染は、一連の眼障害、例えば、フックス虹彩毛様体炎に関与している（Ｄｅ Ｇｒｏｏｔ−Ｍｉｊｎｅｓ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２００６）。
【００１１】
しかしながら、ＲｕＶ感染は、感染した患者が妊娠女性、特に、発展途上国及び移民集団である場合には、主要な関心事になる。母体感染が必ずしも胎児感染に続かないとしても、胎盤障壁を横断し、胎児組織を感染する能力を有する。妊娠の最初の１２週間でのＲｕＶ感染は、８０〜９０％の症例において、胎児の死亡、又は様々な異なる以上をもたらし、通常、Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ Ｒｕｂｅｌｌａ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＣＲＳ）の定義下で分類され、例えば、心臓欠陥及び眼の欠陥、難聴、及び精神発達遅滞などが挙げられる。妊娠のその次の週に感染が見られる場合にはその危険性は減少するが、ウイルス性奇形発生を起因とした胎児障害も存在する場合がある（Ｈｉｎｍａｎ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｌｅｅ Ｊ ａｎｄ Ｂｏｗｄｅｎ Ｄ，２０００；Ａｔｒｅｙａ Ｃ ｅｔ ａｌ．，２００４）。さらに、偽陽性からの最近のＲｕＶ感染に起因する抗体、又は感染若しくはワクチン接種後の何カ月も持続している抗体に起因する抗体を区別することを可能にする血清診断アッセイは、十分に信頼できるわけではない（Ａｎｄｒｅｗｓ Ｊ，２００４；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ Ｅ ｅｔ ａｌ．，２００６）。
【００１２】
ＲｕＶワクチン接種は、工業世界において幅広く確立され、ＣＲＳ及びＲｕＶ誘導の胎児死亡の減少に非常に効果的である。それにもかかわらず、最近の大発生における野生型ＲｕＶゲノムの遺伝的特徴は、さらに、初期介入について、世界保健機関によって注意深く調査されている。この調査は、参照ＲｕＶの遺伝子型及び菌株の定義、並びに世界的な大発生において同定されたＲｕＶ菌株の感染的特徴及び遺伝的特徴の分析及び分類を伴う（ＷＨＯ２００５；ＷＨＯ ２００６；Ｒｅｅｆ Ｓ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｚｈｅｎｇ Ｄ ｅｔ ａｌ．，２００３）。
【００１３】
実際に、いくつかの試験によって、発展途上国の個体の無視できない割合（少なくとも５％）は、ＲｕＶに対する低い又は検出できない抗体濃度を有することが示された。これらの対象は、ワクチン接種してから数カ月又は数年後の集団、及びワクチン接種プログラムへのアクセスが限定された最近の移民又は難民において検出された。このようにして、ＲｕＶ感染、及びＣＲＳの可能性を防止するために、思春期に近づいている特定の女子、妊娠可能年齢の女性における特異免疫の衰退に起因した、ＲｕＶ感染に対する追加的処置については、非常に大多数の候補がある（Ｐｅｂｏｄｙ Ｒ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｎｉｃｏａｒａ Ｃ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｍａｔｔｅｒ Ｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｋｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｕｓｈｉｄａ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｂａｎｅｒｊｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｒｏｔａ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ Ｅ ｅｔ ａｌ．，２００６）。疫学の研究は、ＲｕＶの日常的な子供及び成人のワクチン接種、調査、並びに選択的な再免疫化のためにプログラムを確立することの重要性を示唆している（Ｇｒｅｅｎａｗａｙ Ｃ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｋｒｅｍｅｒ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｓｅｍｅｒｉｋｏｖ Ｖ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｂａｎａｔｖａｌａ Ｊ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ Ｄ，２００４；Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉ Ａ ａｎｄ Ｊａｉｎ Ｍ，２００６；Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｃｏｍ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，２００７）。
【００１４】
ＲｕＶ病因及び免疫生物学は、ヒト及び動物モデルにおけるＲｕＶ感染及びワクチン接種への免疫応答の機序及び効率に関連して研究されている。ＲｕＶ感染に対する細胞系モデルが確立されている（Ｃｕｓｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｄｕｎｃａｎ Ｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｇａｒｂｕｔｔ Ｍ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｃｏｒｄｏｂａ Ｐ ｅｔ ａｌ．，２０００ａ）。一次ＲｕＶ感染及びＲｕＶ特異的免疫応答の初期検出に対する高感度試験が開発されている（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｔｚｅｎｇ Ｗ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｇｉｅｓｓａｕｆ Ａ ｅｔ ａｌ．２００４；Ｗｉｌｓｏｎ Ｋ ｅｔ ａｌ．２００６）。しかしながら、ワクチン接種は、有効な免疫応答を備えるになるには数週間又は数カ月を要する場合があり、胎児は、その期間中、ＲｕＶ感染に対してなおも脆弱である。ＲｕＶ感染は、免疫抑制された患者においては危険であり得て、ワクチンの使用は必ずしも望ましいわけではない。
【００１５】
ＲｕＶに対して有用であり得る化学物質は、まだ開発の初期段階にある（Ｍｕｇｎａｉｎｉ Ｃ ｅｔ ａｌ．，２００７）。しかしながら、化学療法及び抗ウイルス治療は、ＲｕＶなどのウイルスに対する免疫保護を非常に喪失させ得て、再度のワクチン接種を必要とする場合があることが知られている（Ｙｕ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｂｅｋｋｅｒ Ｖ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｖａｎ Ｔｉｌｂｕｒｇ Ｃ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｎｉｌｓｓｏｎ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００２）。有意な抗ＲｕＶ力価を有するヒト抗体の生産物は、感染を治療又は予防するために投与することができる（Ｋｅｌｌｅｒ Ｍ ａｎｄ Ｓｔｉｅｈｍ Ｅ，２０００；Ｋｒａｕｓｅ Ｉ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｋａｗａｍｕｒａ Ｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）が、同様のアプローチの有効性は、組換え抗体フラグメント又はモノクローナル抗体などの、ウイルスを中和するためのより特異的な免疫学的生産物を用いることによって改善されたであろう。
【００１６】
ＲｕＶ、特にこのウイルスの構造タンパク質に対するヒト抗体応答は、ＲｕＶに対してワクチン接種された個体又は野生型ＲｕＶ菌株によって感染した個体の血清を用いて評価され、異なる対象における特異性及び応答の中和特性において実質的な差異を示した（Ｚｈａｎｇ Ｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｍａｕｒａｃｈｅｒ Ｃ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ Ｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｚｒｅｉｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ Ｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｔｈｏｍａｓ Ｈ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｂａｎｅｒｊｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００５）。赤血球凝集能及び異なる抗体の中和ドメインは、構造タンパク質Ｅ１及びＥ２として与えられた（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ Ｅ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｃｏｒｄｏｂａ Ｐ ｅｔ ａｌ．，２０００ａ；Ｇｒｅｅｎ Ｋ ａｎｄ Ｄｏｒｓｅｔｔ Ｐ，１９８６）。また、ＲｕＶ免疫病理学は、ＲｕＶ由来の扁桃腺フラグメントを移植された（Ｐｅｒｒｅｎｏｕｄ Ｇ ｅｔ ａｌ．，２００４）、又は腹腔を介したＲｕＶを用いて感染させた（Ｗａｎｇ Ｚ ｅｔ ａｌ．，２００３）、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスを用いた動物モデルにおいて試験された。
【００１７】
ＲｕＶに結合し、（数例において）ＲｕＶを中和することができるいくつかのマウスモノクローナル抗体を生じた。抗体は、細胞におけるウイルス感染及び複製を試験するために、異なるＲｕＶ関連標的（ウイルス様粒子、タンパク質抽出物、組換えタンパク質、ペプチド、細胞培養条件で感染させた細胞）を用いて試験された（Ｇｒｅｅｎ Ｋ ａｎｄ Ｄｏｒｓｅｔｔ Ｐ，１９８６；Ｔｅｒｒｙ Ｇ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｗｏｌｉｎｓｋｙ Ｊ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｃｈａｙｅ Ｈ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｃｌａｕｓ Ｃ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｑｉｕ Ｚ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｏｕ Ｄ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｗｏｌｉｎｓｋｙ Ｊ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｋ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｃｏｒｄｏｂａ Ｐ ｅｔ ａｌ．，２０００ａ；Ｃｏｒｄｏｂａ Ｐ ｅｔ ａｌ．，２０００ｂ；Ｃｏｒｄｏｂａ Ｐ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｓｔａｒｋｅｙ Ｗ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｇｉｅｓｓａｕｆ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｏｒｅｌｌａｎａ Ａ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｌｅｅ Ｊ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｈｏｆｍａｎｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２０００；ＥＰ２９９６７３；ＷＯ９３／１４２０６；ＷＯ９１／０２７４８；ＷＯ９５／０９２３２）。
【００１８】
文献では、ヒトモノクローナル抗ＲｕＶ抗体は非常に少なく、関連した抗ＲｕＶ中和抗体を有するものがないことが報告されている。このような抗体は、細胞融合及び／又はＥＢＶ感染によって不死化されたヒトＢ細胞を用いて同定された（ＷＯ０７／０１１６９８、クローンＲ３３５．６．４を参照されたい；Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓ Ｐ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｈｉｌｆｅｎｈａｕｓ Ｊ ｅｔ ａｌ．，１９８６）。ＲｕＶに対するヒトＦａｂ抗体フラグメントが同定されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ Ｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。
【００１９】
ワクチン接種は主な改善をもたらすが、疾患は持続する。ＲｕＶに効率的に結合し、中和する新規なヒト抗体及び抗体フラグメントの同定及び生産は、集団におけるこの感染症の診断、治療及び／又は予防のための改善された処置を確立するためになおも特に重要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、ＲｕＶに結合し、中和し、ＲｕＶ感染を検出、治療、阻害、予防、及び／又は改善するために使用可能な新規な抗体配列を提供する。
【００２１】
ヒト抗体フラグメントの一団は、組換えファージ上に提示され、ＲｕＶ特異的結合特異性は、ファージライブラリーにおいて検出されている。２つの抗体フラグメントの重鎖及び軽鎖可変領域をコードし、ＲｕＶを中和する抗体を有するＤＮＡ配列が同定され、ＤＤＦ−ＲｕＶ１及びＤＤＦ−ＲｕＶ２と命名された。ＲｕＶ特異的生物活性に関連する対応するタンパク質配列及び相補性決定領域（ＣＤＲ）が決定された。これらのＦａｂの結合活性は、さらに、組換えファージ上に提示さえる新規なペプチドライブラリーを用いて試験することができる。新規なタンパク質は、単離されたＣＤＲ、並びにＤＤＦ−ＲｕＶ１及びＤＤＦ−ＲｕＶ２に対する可変領域との同一性パーセントに基づいて定義される。
【００２２】
本発明の核酸は、適切な技術、及び組換えファージ、原核宿主細胞、又は有核宿主細胞を用いて、全長の抗体、抗体フラグメント、生物活性なペプチド、又は機能性タンパク質（特に融合タンパク質）の任意の他のフォーマットの形態で、ＲｕＶ特異的結合特性及び中和特性を有する組換えタンパク質を生産するために使用することができる。
【００２３】
本発明のタンパク質は、ＲｕＶ感染の治療検出、治療、阻害、予防、及び／又は改善のために用いることができる。特に、ＲｕＶ感染の管理における治療、予防、及び／又は診断の利用性を有する組成物は、それらのＲｕＶ特異的結合特性及び中和特性を与えるこれらのタンパク質を用いて調製可能である。これらの組成物は、抗ウイルス化合物又は静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）調製物に基づいているＲｕＶ治療を補足又は置換するために用いられてもよく、眼内又は局所投与に適していてもよい。
【００２４】
本発明の更なる態様は、単離されたＤＮＡ及びタンパク質配列、ベクター、組換えファージ、及び宿主細胞、並びに医学的方法、組成物、及び使用を含み、下記の説明に提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＤＤＦ−ＲｕＶ１及びＤＤＦ−ＲｕＶ２、又は負の対照として使用された無関係なヒトＦａｂ（ｅ１３７）を発現している組換えファージの調製物に対するＲｕＶ結合活性の特異性。結合活性は、プレートコーティング用の指示された抗原を用いたＥＬＩＳＡにおいて測定された。（Ａ）ＲｕＶの臨床単離物で感染させた線維芽細胞株（ＶＥＲＯ細胞）からの全タンパク質抽出物をプレートコーティングに使用した。各Ｆａｂについての２つのカラムは、２つの異なる実験を意味する。（Ｂ）ＲｕＶの臨床単離物で感染させた線維芽細胞株からのタンパク質抽出物、未感染細胞からのタンパク質抽出物、又は非特異的な精製タンパク質（ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ）をプレートコーティングに使用した。
【図２】（Ａ）ＤＤＦ−ＲｕＶ１の重鎖に関する可変領域のＤＮＡ（下段ケース）及びタンパク質（上段ケース）の整列（ＤＤＦ−ＲｕＶ１ ＶＨ；配列番号１及び２）。予測されるＣＤＲ（ＤＤＦ−ＲｕＶ１ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３；配列番号３、４、及び５）に下線を引く。（Ｂ）ＤＤＦ−ＲｕＶ１の軽鎖に関する可変領域のＤＮＡ（下段ケース）及びタンパク質（上段ケース）の整列（ＤＤＦ−ＲｕＶ１ ＶＬ；配列番号６及び７）。予測されるＣＤＲ（ＤＤＦ−ＲｕＶ１ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）に下線を引く。
【図３】（Ａ）ＤＤＦ−ＲｕＶ２の重鎖に関する可変領域のＤＮＡ（下段ケース）及びタンパク質（上段ケース）の整列（ＤＤＦ−ＲｕＶ１ ＶＨ；配列番号８及び９）。予測されるＣＤＲ（ＤＤＦ−ＲｕＶ２ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３；配列番号１０、１１、及び１２）に下線を引く。（Ｂ）ＤＤＦ−ＲｕＶ２の軽鎖に関する可変領域のＤＮＡ（下段ケース）及びタンパク質（上段ケース）の整列（ＤＤＦ−ＲｕＶ２ ＨＣ；配列番号１３及び１４）。予測されるＣＤＲ（ＤＤＦ−ＲｕＶ２ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）に下線を引く。
【図４】部分的に精製されたヒト組換えＦａｂとして発現され、ファージコートタンパク質に提示された場合のヒトＦａｂ ＤＤＦ−ＲｕＶ１（Ａ）及びＤＤＦ−ＲｕＶ２（Ｂ）に対するＲｕＶ中和活性。投薬量応答分析は、免疫蛍光法によって測定されるＲｕＶ感染細胞の数に基づいた。パーセント値は、いずれのＦａｂなしに前培養されたＲｕＶを用いて得られたＲｕＶ感染細胞（負の対照）に対するデータと比較することによって計算された。
【図５】（Ａ）ｐＤＬａｃ−ＲｕＶ１−ＦＬＡＧｈｉｓベクターを用いて発現されるヒトＦａｂ ＤＤＦ−ＲｕＶ１の重鎖のタンパク質配列（ＤＤＦ−ＲｕＶ１ ＨＣｔａｇ；配列番号１５）。最初にクローニングされたこの重鎖の改変領域（配列番号２）に下線を引く。ＰｅｌＢ配列は、アミノ酸１と２２との間に含まれる。アミノ酸１４７〜２５２は、ヒトＩｇガンマ−１鎖Ｃ領域のアミノ酸１〜１０６に対応する（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ａｃｃ．Ｎｏ．：Ｐ０１８５７）。アミノ酸２５３〜２６７は、ＦＬＡＧｈｉｓ配列に対応する。（Ｂ）ｐＤＬａｃ−ＲｕＶ１−ＦＬＡＧｈｉｓベクターを用いて発現されるヒトＦａｂ ＤＤＦ−ＲｕＶ１の軽鎖のタンパク質配列（ＤＤＦ−ＲｕＶ１ ＬＣ；配列番号１６）。最初にクローニングされたこの軽鎖の可変領域（配列番号７）に下線を引く。ＰｅｌＢ配列は、アミノ酸１と２２との間のアミノ酸に含まれる。アミノ酸１３５〜２４０は、Ｉｇカッパ鎖Ｃ領域のアミノ酸１〜１０６に対応する（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ａｃｃ．Ｎｏ．：Ｐ０１８３４）。（Ｃ）ｐＤＬａｃ−ＲｕＶ２−ＦＬＡＧｈｉｓベクターを用いて発現されるヒトＦａｂ ＤＤＦ−ＲｕＶ２の重鎖のタンパク質配列（ＤＤＦ−ＲｕＶ２ ＨＣｔａｇ；配列番号１７）。最初にクローニングされたこの重鎖の可変領域（配列番号９）に下線を引く。ＰｅｌＢ配列は、アミノ酸１と２２との間のアミノ酸に含まれる。アミノ酸１４６〜２５１は、ヒトＩｇガンマ−１鎖Ｃ領域のアミノ酸１〜１０６に対応する（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ａｃｃ．Ｎｏ．：Ｐ０１８５７）。アミノ酸２５２〜２６６は、ＦＬＡＧｈｉｓ配列に対応する。（Ｄ）ｐＤＬａｃ−ＲｕＶ２−ＦＬＡＧｈｉｓベクターを用いて発現されるヒトＦａｂ ＤＤＦ−ＲｕＶ２の軽鎖のタンパク質配列（ＤＤＦ−ＲｕＶ２ ＬＣ；配列番号１８）。最初にクローニングされたこの軽鎖の可変領域（配列番号１４）に下線を引く。ＰｅｌＢ配列は、アミノ酸１と２２との間のアミノ酸に含まれる。アミノ酸１２９〜２３４は、Ｉｇカッパ鎖Ｃ領域のアミノ酸１〜１０６に対応する（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ａｃｃ．Ｎｏ．：Ｐ０１８３４）。配列は、重鎖又は軽鎖の定常領域内に設計されたプライマーを用いたインサートの配列決定によって確かめられた。
【図６】（Ａ）Ｐｈ．Ｄ．−１２ファージディスプレイ・ペプチドライブラリーキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｎｅｂｅｃｏｍｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｐｒｏｄｕｃｔＥ８１１０．ａｓｐから入手可能）についえの指示マニュアルにおいて、生産者によって提供されるランダム１２マーのペプチド−ｃｐ３融合ライブラリーの配列。Ｍ１２ ＸｈｏＩ−フォワード（配列番号１９）及びＭ１３ ＳｐｅＩ−リバース（配列番号２０）プライマーにおける関連制限部位の位置を矢印で示す。Ｍ１３ ＫｐｎＩ−フォワード（配列番号２１）及びＭ１３ ＥａｇＩ−リバース（配列番号２２）プライマーにおける関連制限部位の位置に下線を引く。（Ｂ）ｐＤＤｃＸＳｍｅｒ−ｏｒｃｐ３ライブラリー内でクローニングされた場合のＰｈ．Ｄ．−１２ライブラリー（ＰｈＤ１２マー）のコーディング配列（ＷＯ０７／００７１５４の図３から修飾される；配列番号２５）。最初のファージミドによって提供される配列の位置（ＰｅｌＢシグナルペプチド、ＤＩＳリンカー、及びｐ３*５’末端）が示される。関連制限部位に下線を引く。１４個のアミノ酸のリンカー配列は、ペプチドライブラリーとｃｐ３*のＮ末端近傍（ｂｙ）との間に位置される。（Ｃ）ｐＤＤｃＫＥ１２ｍｅｒ−ｏｒｃｐ３ライブラリー内でクローニングされた場合のＰｈ．Ｄ．−１２ライブラリー（ＰｈＤ１２マー）のコーディング配列（ＷＯ０７／００７１５４の図３から修飾される；配列番号２６）。最初のファージミドによって提供される配列の位置（ＰｅｌＢシグナルペプチド、ＤＩＳリンカー、及びｐ３*５’末端）が示される。関連制限部位に下線を引く。１８個のアミノ酸のリンカー配列は、ペプチドライブラリーとｃｐ３*のＮ末端近傍（ｂｙ）との間に位置される。ＫｐｎＩ及びＥａｇＩ部位は、ＸｈｏＩ及びＳｐｅＩを用いたｐＤＤｃの消化、並びにＨＡｔａｇ配列、ＫｐｎＩ部位、ＥａｇＩ部位を含む２つのアニール化されたオリゴヌクレオチドの挿入によって導入され、ＸｈｏＩ及びＳｐｅＩ部位に適合可能な一本鎖５’末端を含む（配列番号２３及び２４）。また、ベクターは、ＤＤカセットにクローニングされるＺｅｏｃｉｎマーカー遺伝子内のＥａｇＩ部位を排除するために、ＰＣＲによって修飾した。
【図７】ｐＤＤｃＸＳｍｅｒ−ｏｒｃｐ３ライブラリー、及びｐＤＤｃＸＳｍｅｒ−ｏｒｃｐ３／ｃｐ８ライブラリーの生成の略図（ＷＯ０７／００７１５４の図５から修飾される）。ファージミドマップは、コートタンパク質（ｃｐ３*及びｃｐ８*）の位置、ファージミド骨格内のアンピシリンマーカー遺伝子（Ａｍｐr）及び複製起源（ＣｏｌＥ１及びＦ１（＋））を示す。下記の要素は、ＤＤカセットに存在する（ｐＤＤｃＸＳｍｅｒ−ｏｒｃｐ３／ｃｐ８ライブラリーを生成するために使用されるＢｇｌＩ／ＳｆｉＩ部位間においてクローニングされた）：Ｐｈ．Ｄペプチドライブラリー（Ｌｉｂ）、ＰｅｌＢ配列に融合されたｐＬａｃＺプロモーター（Ｌｐｅ）、スタッファー配列（Ｓｔ）及びＺｅｏｃｉｎマーカー遺伝子（Ｚｅｏr）。関連制限部位の位置を矢印で示す。ｐＤＤｃＫＥ１２ｍｅｒ−ｏｒｃｐ３ライブラリー及びｐＤＤｃＫＥ１２ｍｅｒ−ｏｒｃｐ３／ｃｐ８ライブラリーは、追加のＫｐｎＩ及びＥａｇＩ制限部位を提示する（図６Ｃを参照されたい）。
【図８】いずれかのパンニングなしのｐＤＤｃＸＳｍｅｒ−ｏｒｃｐ３／ｃｐ８ライブラリー（Ａ）、３ラウンドのパンニング後のｐＤＤｃＸＳｍｅｒ−ｏｒｃｐ３／ｃｐ８ライブラリー（Ｂ）３ラウンドのパンニング後のｐＤＤｃＫＥ１２ｍｅｒ−ｏｒｃｐ３／ｃｐ８ライブラリー（Ｃ）から無作為に選択されるクローンの消化。単離された細菌クローンは、ＮｈｅＩ及びＳｐｅＩを用いて消化されたファージミドＤＮＡのミニプレップを行うために使用された。反応物は、分離用の１％アガロースゲル上にロードされ、得られたフラグメント（ＮＳ）と対応する未消化のＤＮＡ（Ｃ）と比較した。３．８及び０．６Ｋｂフラグメントを示すクローンは、ｃｐ３*に配向されたＤＤカセットを有する。２．６及び１．８Ｋｂフラグメントを示すクローンは、ｃｐ８*に配向されたＤＤカセットを有する。矢印は、マーカーＤＮＡによって位置される。
【図９】下記のライブラリー：ｐＤＤｃＸＳｍｅｒ−ｏｒｃｐ３（Ａ；配列番号２７〜３４）、ｐＤＤｃＫＥ１２ｍｅｒ−ｏｒｃｐ３（Ｂ；配列番号３５〜４２）において無作為に選択されたクローン由来の配列例。アンバー停止コドン（ｔａｇ）は、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ Ｅ．ｃｏｌｉ菌株内に抑制され、アミノ酸（Ｑ）をコードする。配列は、ｃｐ３＊内で設計されたプライマーを用いたインサートの配列決定によって確かめられた。
【図１０】抗ＨＡｔａｇコロニースクリーニング。抗ＨＡｔａｇ抗体に対するパンニングの３ラウンド後に得られた細菌コロニーは、メンブレンに転写され、アルカリ条件で溶解した。最初のコロニーにおけるＨＡｔａｇの発現を検出するために、メンブレンをマウス抗ＨＡｔａｇ抗体（パンニングのために使用された抗体）、次に、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（１：１０００希釈）中のセイヨウワサビのペルオキシダーゼに結合した抗マウスＩｇＧ１とともにインキュベートした。ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０による３回の洗浄後、メンブレンは、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏケミルミネッセンス基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いた増大したケミルミネッセンス検出に供された。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
ＷＯ０７／００７１５４に記載されたｐＤＤファージミド及び関連した方法により、１つの又は他の２つの所定のファージミドコートタンパク質に融合されたタンパク質配列のクローニング、発現、及び選択が可能となる。このアプローチにより、組換えファージの表面に別個に発現されるか又は提示され、結果として、異なる効率を有するファージディスプレイライブラリーから選択され得るタンパク質配列の同定の選択を可能にする。
【００２７】
本ケースでは、ファージライブラリーは、ヒト重鎖及び軽鎖の免疫グロブリンの可変領域をクローニングすることによって、ｐＤＤファージミドに構築された。このライブラリーは、ＲｕＶ感染細胞のタンパク質抽出物に対してパンニングされ、選択されたクローンは、その後、ＲｕＶを中和する活性を示すクローンを決定するために細胞系圧死において試験された。２つの最大の有望なクローン（ＤＤＦ−ＲｕＶ１とＤＤＦ−ＲｕＶ２と命名される）をコードするＤＮＡ配列を決定し、次に、細菌発現用の適切なベクターにクローニングされた。
【００２８】
本発明は、ＲｕＶに結合及び中和することができ、Ｆａｂ ＤＤＦ−ＲｕＶ１又はＤＤＦ−ＲｕＶ２において同定された特定のＣＤＲ（相補性決定領域）を含む新規なタンパク質配列を提供する。特に、本発明のＨＣＤＲ３（重鎖可変領域のＣＤＲ３）の各々（配列番号５及び配列番号１２）は、それぞれＤＤＦ−ＲｕＶ１及びＤＤＦ−ＲｕＶ２の抗原結合部分を特徴とする。
【００２９】
ＨＣＤＲ３は、抗体の抗原結合部分を特徴付け、その結果、生物活性（例えば、ＲｕＶの結合及び中和）を与えるものと考えられる。抗体のいくつか又は全てのＣＤＲは、一般に、完全な抗原結合表面を得るために要求されるとしても、ＨＣＤＲ３は、抗体間の最大の相違を示すＣＤＲである。実際に、ＨＣＤＲ３の配列及び長さの多様性は、大部分の抗体に対する特異性を決定するために基本的である（Ｘｕ Ｊ及びＤａｖｉｅｓ Ｍ，２０００；Ｂａｒｒｉｏｓ Ｙ ｅｔ ａｌ．２００４；Ｂｏｎｄ Ｃ ｅｔ ａｌ．，２００３）。
【００３０】
ＲｕＶ結合部分としての本発明の特定のＨＣＤＲ３を含むタンパク質は、それ（又はなし）と、このようなＨＣＤＲ３が抗体タンパク質フレームワーク内で同定された同じＦａｂ由来の他のＣＤＲとを組み合わせることによって生じさせることができる（Ｋｎａｐｐｉｋ Ａ ｅｔ ａｌ．，２０００）。ＣＤＲの組み合わせは、抗体構造には関連しないタンパク質フレームワーク内であっても、元々の結合活性を破壊せずに、元々の結合性を維持する非常に短いタンパク質において互いに連結することができる（Ｋｉｓｓ Ｃ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｓｍｉｔｈ Ｊ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。
【００３１】
一態様では、本発明は、Ｆａｂ ＤＤＦ−ＲｕＶ１のＨＣＤＲ３（配列番号５）と少なくとも９０％同一性を有する配列を含むタンパク質を提供する。ＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２（配列番号３及び配列番号４、図２Ａ）と一緒に、このＨＣＤＲ３は、ＤＤＦ−ＲｕＶ１ Ｆａｂの重鎖の可変領域（ＤＤＦ−ＲｕＶ１ ＶＨ；配列番号２）に含まれる。このＦａｂを形成する軽鎖の可変領域（ＤＤＦ−ＲｕＶ１ ＶＬ：配列番号７）、並びにその特定のＬＣＤＲ（軽鎖可変領域のＣＤＲ）が決定されている（図２Ｂ）。
【００３２】
別の態様では、本発明は、Ｆａｂ ＤＤＦ−ＲｕＶ２のＨＣＤＲ３（配列番号１２）と少なくとも９０％同一性を有する配列を含むタンパク質を提供する。ＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２（配列番号１０及び配列番号１１、図３Ａ）と一緒に、このＨＣＤＲ３は、ＤＤＦ−ＲｕＶ２の重鎖の可変領域（ＤＤＦ−ＲｕＶ２ ＶＨ；配列番号９）に含まれる。このＦａｂを形成する軽鎖の可変領域（ＤＤＦ−ＲｕＶ１ ＶＬ；配列番号１４）、並びにその特異的ＬＣＤＲが決定されている（図３Ｂ）。
【００３３】
本発明のタンパク質がＤＤＦ−ＲｕＶ１の配列に基づく場合、それらは、配列番号５と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含まなければならない。特に、それらは、配列番号２と少なくとも９０％同一性を有する配列を含まなければならない。より特には、このようなタンパク質はまた、配列番号３及び配列番号４からなる群から選択される１以上の配列を含む。タンパク質、特に、ＤＤＦ−ＲｕＶ１に基づく抗体及び抗体フラグメントは、配列番号７と少なくとも９０％同一性を有する配列をさらに含むことができる。
【００３４】
あるいは、本発明のタンパク質がＤＤＦ−ＲｕＶ２の配列に基づく場合、それらは、配列番号１２と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含まなければならない。特に、それらは、配列番号９と少なくとも９０％同一性を有する配列を含まなければならない。より特には、このようなタンパク質はまた、配列番号１０及び配列番号１１からなる群から選択される１以上の配列を含む。タンパク質、特に、ＤＤＦ−ＲｕＶ２に基づく抗体及び抗体フラグメントは、配列番号１４と少なくとも９０％同一性を有する配列をさらに含むことができる。
【００３５】
本発明の更なる態様は、両方のＦａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡ配列、特に、クローニングされ、ＤＤＦ−ＲｕＶ１（重鎖については配列番号１；軽鎖については配列番号６）、並びにＤＤＦ−ＲｕＶ２（重鎖については配列番号８；軽鎖については配列番号１３）の可変領域が決定されている元々のＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一性を有するものである。
【００３６】
これらのＤＮＡ配列（又は選択された部分、例えば図２及び図３に示された単離されたＨＣＤＲとＬＣＤＲをコードするもの）は、組換え抗体（例えば、完全、アフィニティー成熟、ＣＤＲグラフト、または図５においてＤＤＦ−ＲｕＶ１及びＤＤＦ−ＲｕＶ２のタグ化されたバージョンについて示されたフラグメント）、又はＲｕＶ結合性及び中和性を与える融合タンパク質についての既知のフォーマットの１つ内にそれらを発現するための他のベクターに移すことができる。
【００３７】
同一性レベルが指示されるところはどこでも、この同一性レベルは、本発明の関連配列の全長に基づいて決定されなければならない。
【００３８】
重鎖及び軽鎖を形成するＤＤＦ−ＲｕＶ１又はＤＤＦ−ＲｕＶ２の可変領域（又は、選択された部分、例えば、単離されたＨＣＤＲ及びＬＣＤＲ）は、特定のアイソタイプを有する抗体、特に完全なヒト組換え抗体内に含むことができる。この抗体は、２つの軽鎖及び２つの重鎖によって形成される四量体複合体の天然の構造における軽鎖及び重鎖可変領域として、ＤＤＦ−ＲｕＶ１又はＤＤＦ−ＲｕＶ２のＶＬ及びＶＨ配列を含んでもよい。完全なヒト抗体が望まれる場合、固体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ及びＩｇＥ定常領域からなる群から選択される重鎖定常領域をさらに含まなければならない。例えば、ＩｇＧアイソタイプは、ほとんど全ての承認された治療用抗体の抗体フォーマットである（Ｌａｆｆｌｙ Ｅ及びＳｏｄｏｙｅｒ Ｒ，２００５）。しかしながら、ヒトＩｇＧ１から単離された抗原結合部分は、ヒトＩｇＡ配列に移され、得られた組換え抗体は元々のＩｇＧ１の活性を維持し、最近示されるように、抗体はＨＩＶ感染を阻害することができる（Ｍａｎｔｉｓ Ｎら，２００７）。
【００３９】
あるいは、ＤＤＦ−ＲｕＶ１又はＤＤＦ−ＲｕＶ２を形成する重鎖及び軽鎖の可変領域（又は、選択された部分、例えば単離されたＨＣＤＲ及びＬＣＤＥ）は、機能性抗体フラグメントについての任意の他のタンパク質フォーマットにおいて組み合わせることができ、異なる名称で文献に記載されているように、例えば、Ｓｃｆｖ（一本鎖フラグメント可変）、Ｆａｂ（可変重鎖／軽鎖ヘテロ二量体）、ダイアボディー、ペプタボディー、ＶＨＨ（重鎖抗体の可変ドメイン）単離された重鎖又は軽鎖、二重特異性抗体、非／臨床用途のための他の操作された抗体変異体などがある（Ｊａｉｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｌａｆｆｌｙ Ｅ ａｎｄ Ｓｏｄｏｙｅｒ Ｒ，２００５）。例えば、ＤＤＦ−ＲｕＶ１又はＤＤＦ−ＲｕＶ２の組換え改変体は、ｐＤＬａｃ−ＦＬＡＧｈｉｓ（ＰＣＴ／ＩＢ２００８／０００２６６）と呼ばれるｐＤＤ適合可能な発現ベクターにクローニングされ、タグ化されたＦａｂ（ＤＤＦ−ＲｕＶ１については、配列番号１５〜１６、図５Ａ〜Ｂ；ＤＤＦ−ＲｕＶ２については、配列番号１７〜１８、図５Ｃ〜Ｄ）の形態で発現可能である。
【００４０】
代替の抗体及び抗体フラグメントは、軽鎖をシャッフルするためのプロセスを介して、ＤＤＦ−ＲｕＶ１又はＤＤＦ−ＲｕＶ２の配列を用いて生じさせることができる。実際に、異なる抗体及び抗体フラグメントを生じさせ、例えば、共通のファージディスプレイ技術又はＷＯ０７／００７１５４に記載されたものを用いて、ＶＬ配列のライブラリーと合わせられる単一の重鎖可変ドメインＶＨ（例えば、ＤＤＦ−ＲｕＶ１又はＤＤＦ−ＲｕＶ２のいずれか１つ）を用いたＲｕＶ特異的活性について試験することができる。このアプローチは、親和性、安定性、特異性、及び／又は組換え産物に基づいて改善された特性を用いてＶＨ／ＶＬを決定してもよい（Ｒｏｊａｓ Ｇ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｓｕｚｕｋｉ Ｋ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
【００４１】
さらに、抗体は、特に臨床用途（良好な薬物動態プロファイル又は抗原に対するより高い親和性）のために、改善された特徴を有する抗体を持つために、特定の一で修飾されてもよいことは知られている。これらの変化は、ＤＤＦ−ＲｕＶ１又はＤＤＦ−ＲｕＶ２のいずれかのＣＤＲ及び又はフレームワークのいて行うことが可能である。配列は、親和性成熟の使用を作る抗体の合理的な設計のための任意の専用技術及び他の方法を適用することによって測定することができる（Ｋｉｍ Ｓ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｊａｉｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
【００４２】
また、新規な生物活性ペプチドを開発するための抗体に基づくストラテジーは、Ｌ−アミノ酸及び／又はＤ−アミノ酸を含むＣＤＲ誘導ペプチドを合成する実行可能性を示した。これらの代替の分子は、より適切な薬理学的プロフィールを有する元々の活性を維持することができる（Ｌｅｖｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｗｉｊｋｈｕｉｓｅｎ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００３）。このようにして、各々の新規なＨＣＤＲ３、並びにそれらに非常に類似した配列、それらを含む融合タンパク質、それらから誘導される合成ペプチド（例えば、Ｄ−アミノ酸を含むか又はレトロー−インバーソ型形態である）が試験され、ＲｕＶ結合タンパク質として使用することができる。
【００４３】
また、本発明のタンパク質は、ＲｕＶビリオンの抗原を中和することを特徴付けるために使用されてもよい。実際に、ＤＤＦ−ＲｕＶ１及びＤＤＦ−ＲｕＶ２は、ＥＬＩＳＡにおけるＲｕＶ感染細胞株由来の細胞抽出物へのそれらの特異的結合に奇異真して初期にクローニングされ（図１）、その後、ＲｕＶ感染を中和するそれらの能力は、ＲｕＶ臨床菌株を用いたインビトロの中和アッセイによって測定された（図４）。結論として、本発明のタンパク質は、ＲｕＶ感染を中和することができ、任意の関連した結合アッセイ（例えば、実施例に記載されるＥＬＩＳＡ）によって測定されるように、本発明のタンパク質と比較する他のＲｕＶ結合タンパク質（完全な句及び体、抗体フラグメント、生物活性ペプチド、又は融合タンパク質の形態で）を特定するために用いることができる。このような競合タンパク質は、場合により、ＤＤＦ−ＲｕＶ１又はＤＤＦ−ＲｕＶ２配列において同定されたものとは、部分的に又は完全に異なっている可能性があるＨＣＤＲ及びＬＣＤＲとともに、上記で定義されたＨＣＤＲ３配列の何れかを単に含んでもよい。
【００４４】
本発明のタンパク質は、抗体、抗体フラグメント、生物活性なペプチド、又はＲｕＶに結合及び中和する融合タンパク質として提供される。これらの代替のタンパク質は、ＤＤＦ−ＲｕＶ１及びＤＤＦ−ＲｕＶ２ Ｆａｂについて決定されるこのような特性を増大しない場合に維持されなければならない。
【００４５】
融合タンパク質の特定のケースでは、異種配列（単数又は複数）は、このような部分の正しい発現及び生物活性を負に影響を与えないで、ＲｕＶに特異的な結合及び中和する部分（例えば、特定のＨＣＤＲ３又は抗体フラグメントの可変領域に対してＮ末端位又はＣ末端位で位置しなければならない。
【００４６】
用語「異種タンパク質」は、タンパク質配列がＲｕＶに特異的に結合及び中和する部分（例えば、抗体フラグメント）に対してＮ末端位又はＣ末端位において天然に存在しないことを指示する。このタンパク質配列をコードするＤＮＡ配列は、一般に、組換えＤＮＡ技術によって融合され、少なくとも５個のアミノ酸をコードする配列を含む。この異種配列は、一般に、特定の診断及び／又は治療用途に関連した追加の特性を提供するために選択される。このような追加の特性の例には、検出又は精製のための良好な手段、追加の結合部分又は生物学的リガンド、又は融合タンパク質の翻訳後修飾（例えば、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、又は細胞内タンパク質分解的切断）が挙げられる。
【００４７】
タンパク質部分、リガンド、適切なリンカーを選択及び設計する手段、並びに融合タンパク質の構築、精製、検出及び使用についての方法及びストラテジーは、文献に提供され（Ｎｉｌｓｓｏｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．，１９９７；“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｏｆ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｇｅｎｅｓ Ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．３２６−３２８，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２０００；ＷＯ０１／７７１３７））、臨床及び研究所において利用可能である。例えば、融合タンパク質は、インビボ及び／又はインビトロでの融合タンパク質の同定、又はその精製を促進することができる市販の抗体（タグ、例えばポリヒスチジン、ＦＬＡＧ、ｃ−Ｍｙｃ、又はＨＡタグが含まれる；図５）によって認識される配列を含んでもよい。他のタンパク質配列は、直接的蛍光分析（緑色蛍光タンパク質など）によるか、又は特異的な基質又は酵素（酵素分解部位などの使用）によって容易に同定することができる。
【００４８】
治療活性は、別の抗ウイルスタンパク質あるいは細胞代謝及び／又は活性を変更するタンパク質などの別の治療タンパク質との融合によって改善され得る。ＲｕＶ特異的抗体、抗体フラグメント、融合タンパク質の安定性は、周知の担体タンパク質、例えばファージコートタンパク質（ｃｐ３又はｃｐ８）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をｍ値いて改善されてもよい。
【００４９】
あるいは（又は、異種タンパク質配列への融合に加えて）、本発明のＲｕＶ特異的タンパク質の活性は、治療薬又は診断薬などの異なる化合物との結合を用いて改善されてもよい。これらの試薬の例には、化学リンカー又はポリマーを用いて結合することができる検出可能な標識（例えば、放射性同位体、蛍光化合物、コロイド金属、ケミルミネッセンス化合物、生物発酵化合物、又は酵素）である。本発明のタンパク質のＲｕＶ特異的な生物活性はまた、診断又は治療用途における代謝及び／又は安定性を変更するポリマーなｄの化合物との融合によって改善されてもよい。
【００５０】
本発明のタンパク質（例えば、抗体、抗体フラグメント、生物活性ペプチド、融合タンパク質、又はそれらの結合された改変体）をスクリーニングし、元々のＤＤＦ−ＲｕＶ１及びＤＤＦ−ＲｕＶ２と競合するそれらの能力、可能であれば、実施例又は文献に記載された任意の関連アッセイによって測定される、ＲｕＶ感染を中和する類似の又はより優れた能力を示すために特徴付けることができる。
【００５１】
また、文献は、ＲｕＶ抗原、並びに各Ｆａｂによって認識される特定のエピトープが測定され、過去に測定されたもの比較されるものを用いるいくつかの技術の例を愛知今日する。例えば、ＲｕＶタンパク質、関連した一部切断された改変体又は合成ペプチドを用いたＥＬＩＳＡ、免疫沈降、又はウェスタンブロットは、Ｅ１又はＥ２タンパク質内の関連エピトープを決定するために用いた。特に、本発明の躯体、抗体フラグメント、他のタンパク質は、抗体フラグメント（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ Ｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、マウス又はヒトモノクローナル抗体（Ｇｒｅｅｎ Ｋ ａｎｄ Ｄｏｒｓｅｔｔ Ｐ，１９８６；Ｃｏｒｄｏｂａ Ｐ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｃｈａｙｅ Ｈ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｑｉｕ Ｚ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｏｕ Ｄ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓ Ｐ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｈｉｌｆｅｎｈａｕｓ Ｊ ｅｔ ａｌ．，１９８６；ＷＯ０７／０１１６９８；ＷＯ９３／１４２０６；ＷＯ９５／０９２３２）、ヒト血清（Ｇｉｅｓｓａｕｆ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｓｔａｒｋｅｙ Ｗ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｚｒｅｉｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ Ｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２）についてのＲｕＶ特異的生物活性及びエピトープを特徴付けるために使用されるアッセイにおいて試験することができる。次に、本発明のタンパク質のＲｕＶ関連予防的、診断的、及び治療的使用のためのより広範囲な特徴付け及び評価は、本発明の背景に要約されるように、ＲｕＶ病因及び免疫学を研究するための文献（Ｃｕｓｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｄｕｎｃａｎ Ｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｃｏｒｄｏｂａ Ｐ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｌｅｅ ａｎｄ Ｂｏｗｄｅｎ，２０００；Ｇａｒｂｕｔｔ Ｍ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｏｕ Ｄ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｔｚｅｎｇ Ｗ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｐｅｒｒｅｎｏｕｄ Ｇ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｗａｎｇ Ｚ ｅｔ ａｌ．，２００３）に開示されているインビトロ又はインビボアッセイ（組織又は細胞系アッセイ、齧歯類において確立した感染モデル）の１以上を用いて行うことができる。
【００５２】
本発明の更なる目的は、上記で定義される抗体、抗体フラグメント、融合タンパク質又は単離されたＣＤＲのいずれかをコードする核酸である。実施例は、このような配列、特に、ＤＤＦ−ＲｕＶ１及びＤＤＦ−ＲｕＶ２の完全な可変領域（配列番号１、６、８、及び１３）をコードするものとして提供する。核酸は、配列番号１、配列番号６、配列番号８、及び／又は配列番号１３と少なくとも９０％同一性を有していなくてはならない。
【００５３】
このような配列、特に、特定のＣＤＲに関連したもの含まれる配列（図２及び３）は、場合によりプロモーターに連結されたベクター及び発現カセットに含まれ、又はｐＤＤ系ファージミドにクローニングされ得る。この特定のタイプのベクターは、ｃｐ３又はｃｐ８ファージコートタンパク質のいずれかとの融合タンパク質としてそれらの発現を可能にし、結果として、このようなファージミドを含み、それらの表面上で本発明のＦａｂを発現する組換えファージを生産することができる。このようにして、本発明のタンパク質を発現するファージミドベクターを含む組換えファージは、ＲｕＶ感染を検出及び／又は中和するための手段として使用可能である。
【００５４】
本発明の配列がクローニングされ、対応する組換えファージによって特徴付けられたｐＤＤ系ファージミドがベクターに（部分的に又は全体として）移され得るＤＮＡ配列を含み、そこでは、元々のＦａｂ、又はそれらから誘導されるタンパク質配列は、宿主細胞内で組換えタンパク質として適切に発現され得る（ｐＤＬａｃ−ＦＬＡＧｈｉｓシステムを用いた実施例に示される）。
【００５５】
ファージディスプレイ技術を用いて単離される免疫グロブリン可変鎖（特にヒト免疫グロブリン可変鎖）の場合、重要な修飾は、好ましいアイソタイプ及び定常領域を有する完全な免疫グロブリンタンパク質へ選択されたＦａｂ又はｓｃＦＶの変換である。このようにして、完全なヒト抗体が望まれる場合、発現ベクターは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ及びＩｇＥ定常領域からなる群から選択される重鎖定常領域をさらに含まなければならない。この種の修飾は、例えば、ファージディスプレイライブラリー由来の一本鎖Ｆｖ又はＦａｂから構築される全てのアイソタイプの完全なヒトモノクローナル抗体を生じ、哺乳動物細胞又は昆虫細胞において発現を可能にする。文献（Ｐｅｒｓｉｃ Ｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｇｕｔｔｉｅｒｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２００３）に広く記載されているように、ベクターは、抗体を発現するために具体的に設計され、所望のアイソタイプ（例えば、ヒトＩｇＧガンマ１）の定常（Ｆｃ）領域へのこの配列の融合を可能にする。
【００５６】
抗体又は融合タンパク質は、原核生物（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ Ｈ ａｎｄ Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ Ｋ，２００５；Ｖｅｎｔｕｒｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２００２）、植物（Ｍａ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２００５）、又は真核細胞において組換えタンパク質として発現することができ、それらは、一時的又は安定に形質転換した細胞として高レベルの発現を可能にする（Ｄｉｎｎｉｓ Ｄ ａｎｄ Ｊａｍｅｓ Ｄ，２００５）。これは、特に、抗体の特徴がより厳しい機能的及び／又はインビボアッセイを用いて実行しなければならない場合に要求される。
【００５７】
文献は、記事及び書籍の章（”Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”，ｖｏｌ．２６６，ｅｄ．Ｃｌａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｌｏｗｍａｎ Ｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，２００４；”Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，ｅｄ．Ｂｕｒｔｏｎ Ｄ ｅｔ ａｌ．，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，２００１；Ｃｏｒｉｓｄｅｏ Ｓ ａｎｄ Ｗａｎｇ Ｂ，２００４；Ｂｅｎｈａｒ Ｉ，２００１）に概説されるように、原核宿主細胞において、Ｆａｂ又は抗体フラグメントについての同様のフォーマットとしてタンパク質を発現するための異なるストラテジーを提供する。
【００５８】
タンパク質、特に抗体が、真核宿主細胞（特に、哺乳動物細胞株）において発現される場合、異なるベクター及び発現系は、トランスフェクトされた細胞株の安定なプールを生じるように設計されている（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｔ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｂｉａｎｃｈｉ Ａ ａｎｄ ＭｃＧｒｅｗ Ｊ，２００３）。高レベルの、最適化された、安定な組換え抗体の発現は、細胞培養条件の最適化（Ｇｒｕｎｂｅｒｇ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｙｏｏｎ Ｓ ｅｔ ａｌ．，２００４）、より高レベルの抗体生産及び分泌を有するクローンの選択又は操作（Ｂｏｈｍ Ｅ ｅｔ ａｌ．， ２００４； Ｂｕｔｌｅｒ Ｍ， ２００５）によって達成される（Ｓｃｈｌａｔｔｅｒ Ｓ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
【００５９】
対象とする配列（例えば、重鎖及び軽鎖の関連する可変領域）をコードする核酸配列は、ベクターの発現カセット、又は区別されるベクターの発現カセットに適切にクローニングされなければならず、この場合、それらは、適切な調節配列（例えば、プロモーター、転写ターミーネーター）に操作可能に連結される。発現カセットには、プロモーター、リボソーム結合部位（必要に応じて）、開始コドン、リーダー／分泌配列が含まれ、それらは、したがって、所望のタンパク質をコードするＤＮＡを誘導体スルファターゼ得るモノ又はビシストロン転写物の発現を誘導することができる。
【００６０】
ベクターは、構造的に活性であるか又は誘導可能であるように選択される転写開始／末端調節配列の調節下で、原核又は真核宿主細胞において本発明のタンパク質の発現を可能にしなければならない。このようなタンパク質を生産するための方法には、タンパク質発現に適切である条件下で、それらのコーディング配列を含む発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞を培養し、宿主細胞培養物からタンパク質を回収することが含まれる。本発明の核酸を含む宿主細胞は、原核又は真核宿主細胞であってもよく、所望の組換えタンパク質の分泌を可能にする。次に、このような細胞に実質的に富んでいる細胞株は、単離され、安定な細胞株を提供することができる。
【００６１】
これらの核酸、組換えファージ、宿主細胞を生じ、共通の組換えＤＮＡ技術を適用することによって本発明のタンパク質を生産するために使用することができる。要約すると、所望のＤＮＡ配列は、制限酵素を用いたファージミドの消化によって抽出されるか、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための鋳型、重鎖及び軽鎖の完全な可変領域又はそれらの一部だけ（例えばＨＣＤＲ３）を特異的に増幅するＰＣＲプライマーとして元々のファージミドを用いて増幅することができる。次に、このようなＤＮＡフラグメントは、組換えタンパク質のクローニング法及び生産法についての多数の書籍及び概説に記載されるように、原核又は真核宿主細胞内に更なる修飾及び／又は発現のためにより適したベクターに移すことができ、シリーズのいくつかのタイトルであるオックスフォード大学プレスによって公開されている“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”（ “ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ”，１９９５；“ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ４：Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ”，１９９６；”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”，１９９９；”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，２００１）が含まれる。
【００６２】
提示され、選択されたタンパク質配列をコードするＤＮＡ配列は、適切なエピソーム又は非相同的若しくは相同的統合ベクターに挿入されると、任意の適切な手段（形質転換、トランスフェクション、コンジュゲーション、原形質融合、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、直接的なマイクロインジェクションなど）によって適切な宿主細胞に導入可能である。特定のプラスミド又はウイルスベクターを選択する際の重要な因子には、ベクターを含む受領細胞が認識され、ベクターを含まない受領細胞から選択される容易性；特定の細胞において望まれるベクターのコピー数；異なる種の宿主細胞間でベクターを「シャトル」することができることが望まれるかどうかが含まれる。
【００６３】
真核宿主（例えば、酵母、昆虫又は哺乳動物細胞）については、異なる転写及び翻訳調節配列が使用されてもよく、これは、宿主の性質に依存する。それらは、ウイルス起源、例えば、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、シミアンウイルスなどから誘導されてもよく、この場合、調節シグナルは、高レベルの発現を有する特定の遺伝子と関連付けられる。実施例は、ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーターなどである。転写初期調節シグナルが選択されてもよく、一時的（又は構造的）抑制及び活性、結果として、遺伝子発現の調節を可能にする。更なるクローニング工程において、抗体又は融合タンパク質をコードする配列が適用され、ＤＮＡ及びタンパク質レベルの両方でのみＤＮＡレベルの特定の修飾について他のベクターに再度クローニングすることができる。これらの変化は、例えば、コドン使用頻度及び制限部位が特定のベクター及び宿主細胞を用いた組換えタンパク質をクローニングし、発現するのに最も適しているＤＮＡ配列を選択するためのソフトウェアを用いて測定することができる（Ｒｏｄｉ Ｄ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｇｒｏｔｅ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｃａｒｔｏｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２００７）。また、タンパク質配列は、所望の抗体フォーマット（Ｓｃｆｖ、Ｆａｂ、完全なヒト抗体など）、又は１以上の内部アミノ酸の挿入、置換、若しくは欠失に関連して付加することができる。
【００６４】
また、これらの技術は、抗体の治療的特性の更なる構造及び機能的特徴付け及び最適化のために使用され（Ｋｉｍ Ｓら，２００５）、あるいは、それらの安定なインビボでの送達を可能にするベクターを生じさせるために使用可能である（Ｆａｎｇ Ｊら，２００５）。例えば、また、組換え抗体は、可変領域に融合されるべき特定のＦｃ領域を選択することによって（Ｆｕｒｅｂｒｉｎｇ Ｃら，２００２；Ｌｏｇｔｅｎｂｅｒｇ Ｔ，２００７）、組換え一本鎖抗体フラグメントを生じさせることによって（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ Ｌら，１９９６）、安定化ペプチド配列を融合することによって（ＷＯ０１／４９７１３）、又は放射化合物若しくはポリマーを化学的に修飾された残基に添加することによって（Ｃｈａｐｍａｎ Ａら，１９９９）、構造及び／又は活性のレベルで調節可能である。
【００６５】
導入されたＤＮＡによって安定に形質転換された細胞は、発現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする１以上のマーカーを導入することによっても選択することができる。また、マーカーは、栄養要求宿主への光合成、殺生物耐性、例えば抗生物質、又は重金属、例えば銅などを与えてもよく、必要に応じて、開裂可能であり、又は抑制されてもよい。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるべきＤＮＡ遺伝子配列に直接的に連結されるか、又は同時トランスフェクションによって同じ細胞に導入されてもよい。また、追加の転写調節因子は、最適発現に必要であってもよい。
【００６６】
宿主細胞は、原核又は真核のいずれかであってもよい。原核宿主細胞の中では、好ましいものは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＥ．ｃｏｌｉである。真核宿主細胞の中では、好ましいものは、酵母、昆虫細胞（バキュロウイルス系発現システムを使用）、又は哺乳動物細胞、例えばヒト、サル、昆虫（バキュロウイルス系発現システムを使用）及びチャイニーズ・ハムスター・オバレイ（ＣＨＯ）細胞であり、これは、それらが、正しいフォールディング又は正しい位置でグリコシル化のある種の形態を提供するためである。また、酵母細胞は、グリコシル化を含む翻訳後ペプチド修飾を実行することができる。強力なプロモーター配列、酵母における所望のタンパク質の生産のために利用可能な高コピー数のプラスミドを利用する多数の組換えＤＮＡストラテジーが存在する。酵母は、クローニングされた哺乳動物遺伝子産物においてリーダー配列を認識し、リーダー配列（即ち、プレペプチド）を有するペプチドを分泌する。
【００６７】
組換えポリペプチドの長期、高収率な生産に関して、安定な発現が好ましい。例えば、対象とするポリペプチドを安定に発現する細胞株は、同じであるか又は別個のベクターに、複製のウイルス起源及び／又は内因性発現要素、及び選択可能なマーカー遺伝子を含んでもよい。ベクターの導入後、細胞は、それらが選択培地にスイッチされる前に強化培地において１〜２日間増殖させることができる。選択可能なマーカーの目的は、選択への耐性を付与することであり、その存在は、誘導される配列を首尾よく発現する細胞の増殖及び回収を可能にする。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、細胞型に適切な組織培養技術を用いて増殖可能である。次に、このような細胞において実質的に富んだ細胞株が単離され、安定な細胞を提供することができる。宿主細胞は、組換えタンパク質の発現レベルに基づいてさらに選択可能である。
【００６８】
ＲｕＶを結合及び中和可能である抗体、抗体フラグメント、生物活性ペプチド、融合タンパク質、上記定義された任意の他の化合物は、細胞培養物又は合成調製物からの組換えタンパク質としてそれらを精製可能にする十分に確立した技術（即ち、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳動など）を用いて提供することができる。これらの調製物は、組換えタンパク質の十分な量（ミクログラムからミリグラムの範囲）を提供して、ＲｕＶに関連した予防、診断、及び治療用途のためにより広範囲な特徴付け及び評価を行わなければならない。
【００６９】
抗体精製の方法は、カラム内に含まれる固相化したゲルマトリックス（Ｎｉｓｎｅｖｉｔｃｈ Ｍ ａｎｄ Ｆｉｒｅｒ Ｍ，２００１；Ｈｕｓｅ Ｋ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｈｏｒｅｎｓｔｅｉｎ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００３）、特に、基質、例えばプロテインＡ、プロテインＧ、または合成基質に対する抗体の一般的な親和に基づいて（Ｖｅｒｄｏｌｉｖａ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｒｏｑｕｅ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００４）、並びに抗原又はエピトープに基づくアフィニティークロマトグラフィー（Ｍｕｒｒａｙ Ａ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｊｅｎｓｅｎ Ｌ ｅｔ ａｌ．，２００４）を利用することができる。洗浄後、タンパク質は、ｐＨ又はイオン強度の変化によってゲルから溶出される。あるいは、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を用いることができる。溶出は、タンパク質精製に一般に使用される水−アセトニトリル系溶媒を用いて実行可能である。
【００７０】
組換えタンパク質の調製物は、インビトロ又はインビボアッセイ（生化学、組織又は細胞系アッセイ、齧歯類において確立した疾患モデル、親和性測定のための生物物理学的方法、エピトープマッピングなど）において、特に、ＲｕＶ病因及び免疫学を兼有するための文献に開示されたものの１以上を用いて、例えば、国際的な健康協定（ＷＨＯ２００５；ＷＨＯ２００６）に従って定義される野生型及び参照ＲｕＶ菌株を用いて試験することができる。
【００７１】
ＲｕＶを結合及び中和することができるものとして上記で定義された抗体、抗体フラグメント、生物活性ペプチド、融合タンパク質、及び任意の他の化合物は、ＲｕＶ感染を検出、治療、阻害、予防、及び／又は改善するために使用することができる。この目的で、このような化合物は、ＲｕＶ感染の医療管理のための診断、治療、又は予防用組成物を調製するために使用することができる。
【００７２】
これらの組成物は、ヒトＤＤＦ−ＲｕＶ１及びＤＤＦ−ＲｕＶ２の配列及び活性に基づいて上記で定義された抗体、抗体フラグメント、融合タンパク質、生物活性ペプチド、任意の他の化合物を含んでもよい。組成物は、異なるＲｕＶ中和抗体又は抗体フラグメント、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）調製物、及び／又は抗ウイルス化合物をさらに含んでもよい。異なるＲｕＶ中和抗体又は抗体フラグメントは、異なる中和エピトープ、例えば文献に既に記載されているものによって特徴付けられなければならない。実際には、ぶんけんは、多くの例を示し、そこでは、ウイルス又はヒト標的に指向される２以上の抗体が医薬組成物に組み合わせられる場合、得られる組成物は、単なる相加効果ではなく、特定の相乗効果に起因して、改善された治療効果を有してもよい（Ｌｏｇｔｅｎｂｅｒｇ Ｔ，２００７）。
【００７３】
医薬組成物は、場合により、任意の医薬として許容されるビヒクル又は担体を含んでもよい。これらの組成物は、任意の付加的な治療薬又は予防薬、例えば、ワクチン、静脈内免疫グロブリン調製物、又は抗ウイルス化合物をさらに含んでもよい（又は一緒に投与されてもよい）。また、最近の文献は、ヒトモノクローナル抗体は、この静脈内免疫グロブリン調製物に補足する（可能であれば、置換する）ために用いられ、このような医薬組成物の頻度及び／又は投薬量を減少させる機会を与えることができる（Ｂａｙｒｙ Ｊら，２００７）。
【００７４】
任意のタンパク質（例えば、抗体、抗体フラグメント、融合タンパク質、生物活性ペプチド）、上記で定義される核酸を含む組成物は、ＲｕＶに関連した診断、治療、又は予防の目的のある個体に投与することができる。これらの組成物は、ＲｕＶビリオンを標的化することによって、治療される患者内のウイルスの繁殖を阻害し、潜在的には、集団におけるウイルス感染の発生をブロックすることができる治療的化合物（特に、治療用抗体又は治療用抗体フラグメント）を提供するＲｕＶ特異的受動免疫のための手段として投与することができる。
【００７５】
特定の使用に依存して、組成物は、長期間又は短期間、ヒト対象（幼児、妊娠女性、年配の個体、又はＲｕＶに感染し、又はＲｕＶ感染した個体との接触、入院、又は免疫抑制／化学療法的治療に起因してＲｕＶに危険であると考えられる任意の他の個体）に化合物を提供されなければならない。この目的で、組成物は、筋内、静脈内、皮下、局所、粘膜、噴霧器、吸引、点眼、非／生分解性マトリックス材料中、又はミクロビーズなどの微粒子薬物送達システムを用いることにより投与することができる。
【００７６】
医薬組成物は、特に、眼内、ウイルス血症に関連した皮膚疹でのウイルスの存在があれば、眼内又は局所投与のために、十分な期間、その化合物が活性を発揮することができる化合物の治療的又は予防的な有効量を対象に提供しなければならない。抗体又は抗体フラグメントを含む組成物が、創傷、皮膚、粘膜、又は角膜に局所投与される場合に効果的であることが証明された（Ｂｒｅｒｅｔｏｎ Ｈ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｃａｓｔｌｅ Ｐ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｓｔｒｅｉｔ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｎｗａｎｅｇｂｏ Ｅ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
【００７７】
所望の効果は、ＲｕＶ感染、再活性化、及び／又は再感染を調節することによって、ＲｕＶ感染の臨床症状の少なくとも幾つかを低減させることによって、患者の状態を改善することである。例えば、組成物は、投与経路、個人の状態に依存して、約０．００５〜約５０ｍｇ／ｋｇ／体重の有効量で投与されなければならない。
【００７８】
診断的使用を有する組成物の場合において、化合物は、生物学的試料中にウイルスを検出するための臨床及び研究所において一般に確立した技術（例えば、ＥＬＩＳＡ又は他の血清学的検定）を用いて、又は投与後の少なくとも１、２、５、１０、２４時間、若しくはそれを超えてインビボで対象に投与される場合に、検出されなければならない。ＲｕＶの検出は、免疫コンピテント及び免疫不全宿主の両方の危険な集団においてＲｕＶ感染をモニターするために確立された既知の手段及び手法に代えて又は結びつけて、本発明のタンパク質を用いて実行することができる。
【００７９】
ＲｕＶ又はＲｕＶに関連した疾患の治療、予防、又は診断のための方法は、上記で定義されるタンパク質又は核酸の投与を含むことが可能である。この方法は、異なるＲｕＶ中和抗体又は抗体フラグメント、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）調製物、及び／又は抗ウイルス化合物の投与をさらに含んでもよい。
【００８０】
臨床開発及び使用は、抗体薬物動態及び薬理学の特徴付け（Ｌｏｂｏ Ｅら，２００４）、臨床前及び臨床安全データ（Ｔａｂｒｉｚｉ Ｍ及びＲｉｓｋｏｓ Ｌ，２００７）、並びにヒトにおける治療的及びインビボでの診断的使用のために治療的組換え抗体の商業生産スケール調合及び分析的特徴付けのための正式な公的要求（Ｈａｒｒｉｓ Ｒら，２００４）に基づくべきである。
【００８１】
ここで、本発明は、下記の実施例によって記載されるが、多少なりとも、本発明を制限するものとして解釈されてはならない。
【実施例】
【００８２】
実施例１：ＥＬＩＳＡにおけるＲｕＶタンパク質抽出物に結合するヒトＦａｂの発現及び分泌
材料＆方法
ライブラリー構築
ヒトＩｇＧ１の重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡは、文献（Ｂｕｒｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８；”Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｂｕｒｔｏｎ ＤＲ ｅｔ ａｌ．，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，２００１）に従って、ＲｕＶ血清陽性反応の個体から得たリンパ球から得られた。ファージライブラリーは、ＰＣＴ特許出願ＷＯ０７／００７１５４に記載される技術に従って、ｐＤＤベクターと適合するクローニングカセットを用いて構築された。Ｆａｂは、ＤＤカセット内にクローニングされ、ライブラリーの組換えファージの表面に発現された。ｐＤＤに基づくＦａｂライブラリーのパンニングを介したヒトＦａｂの選択、陽性クローンの配列決定は、文献（Ｂｕｒｉｏｎｉ Ｒら，１９９８）に記載されるように行った。
【００８３】
Ｆａｂの特異的なＣＤＲは、ＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴ（Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ Ｖら，２００４）、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって提供されるもの、ＦＡＳＴＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｆａｓｔａ３３／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を用いて検出可能なものなどのヒト抗体のタンパク質配列を含む他のデータベースによって提供される予測及び配列整列を比較することによって特定された。
【００８４】
細胞培養の細胞からのタンパク質抽出物の精製
ＶＥＲＯ細胞（ＡＴＣＣ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＣＣＬ−８１）は、単層として増殖するサル線維芽細胞株であり、通常、ＲｕＶを含むヒトウイルスを試験し、繁殖させるために使用される。ＲｕＶに対する中和抗体は、ＶＥＲＯ細胞を用いて特徴付けられている（Ｃｏｒｄｏｂａ Ｐら，２０００ｂ）。
【００８５】
ＲｕＶ臨床単離物（Ｈ２）を用いて感染させたＶＥＲＯ細胞は、ファージディスプレイライブラリーをパンニングし、ＥＬＩＳＡにおいてＦａｂを試験するためのＲｕＶ特異的材料の調製のために使用した。ＶＥＲＯ細胞は、１０％の不活化されたウシ胎児血清（ＦＢＳ）、５０μｇ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び２ｍＭのＬ−グルタミンを含む修飾されてイーグル培地において維持される。
【００８６】
細胞（ＲｕＶ感染又は未感染ＶＥＲＯ）を回収し、２５０ｍｌの溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；０．０２％アジ化ナトリウム；０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）に再懸濁させ、氷上で２０分間インキュベートし、次に、１２０００ｒｐｍで２分間、４℃で遠心分離した。得られた上清のタンパク質濃縮物は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて２重に測定し、既知濃度でウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の連続希釈に関してレポートした（０ｍｇ／ｍｌ＝ブランク〜２．０００ｍｇ／ｍｌ＝最大値）。全ての試料の吸光度は、分光計セットを用いて５４０ｎｍで測定した。
【００８７】
タンパク質抽出物を用いたパンニング及びＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡのためのタンパク質コーティングは、下記の抗原：ＶＥＲｏ細胞の溶解物、ＲｕＶ感染又は未感染（臨床単離物Ｈ２）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて９６ウェルプレートで行った。各試料は、カーボネートバッファー（１ウェルあたり２５μｌの最終体積に全タンパク質の１００ナノグラム）で希釈し、プレートを一晩、４℃でインキュベートした。蒸留水で洗浄後、プレートを１％ＢＳＡを含むＰＢＳにおいて１時間３７℃でインキュベートすることによってブロックした。
【００８８】
ＥＬＩＳＡは、文献（Ｂｕｇｌｉ Ｆら，２００１）に開示されているプロトコールを用いて下記のＦａｂ：ＤＤＦ−ＲｕＶ１、ＤＤＦ−ＲｕＶ２、およびｅ１３７、Ｃ型肝炎ウイルスに特異的な無関係なＦａｂを含む未希釈の試料４０μｌを用いて行った。Ｆａｂは、二重のウェルで試験した。各Ｆａｂを用いて、１時間３７℃でインキュベートし、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで５回洗浄後、４０μｌのヤギ抗ヒトＦａｂ、ペルオキシダーゼ結合体（Ｓｉｇｍａ；Ｃａｔ ｎｏ．Ａ０２９３）を添加し、１時間３７℃でインキュベートした。プレート洗浄は上述のように繰り返し、酵素反応は、各ウェルに４０μｌの基質（ＴＭＢ基質キット；Ｐｉｅｒｃｅ）を添加することによって発色させた。ＥＬＩＳＡ反応は、１５分間３７℃で発色させた。酵素火星は、停止溶液（Ｈ2ＳＯ4）の添加によって停止させ、分光計セットを用いて、４５０ナノメートルで吸光度を測定した。
【００８９】
ＥＬＩＳＡ及び中和アッセイのためのＦａｂ調製
プロトコールは、ｐＤＤ又は他のファージミドを用いた文献（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９；Ｂｕｒｉｏｎｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８； Ｂｕｇｌｉ Ｆ ｅｔ ａｌ．，２００１；ＷＯ０７／００７１５４）に記載されるのと同じであった。
【００９０】
要約すると、ライブラリーの個々のＥ．ｃｏｌｉクローンは、抗生物質を含み、ＩＰＴＧを補足されたＳｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ（ＳＢ；３．５％バクト−トリプトン、２％酵母抽出物、０．５％ＮａＣｌ）培地２００ｍｌで増殖させ、回収し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。溶解は、調節されたパルスを用いた４℃での超音波処理によって、ペリプラスム空間に限定された。ペリプラスム抽出物中のＦａｂは、４５分間４℃でＪＡ−１０ローターで１２，０００ｒｐｍの超遠心分離によって部分的に精製した。生産物をろ過し、Ｃｅｎｔｒｉｏｎフィルターを用いて１０倍に濃縮した。
【００９１】
部分的に精製されたＦａｂの濃縮物は、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ；Ｃａｔ ｎｏ．３６９０）の表面に結合させたＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）2（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｃａｔ．ｎｏ．３１１３２）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによってペリプラスム抽出物で測定した。３７℃での１時間のインキュベーション後、脱イオン水でプレートを６回洗浄し、２％ＢＳＡを含む１７０μｌ／ウェルＰＢＳを用いてブロックした。３７℃でさらに１時間のインキュベーション後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中の各Ｆａｂの連続して３倍希釈物の５０μｌ、又は既知濃度の対照のヒトＦａｂ（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ．６００１−０１００）を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次に、プレートをＴＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ）で６回洗浄した。次に、抗体結合は、アルカリホスファターゼを結合したヤギ抗ヒト抗体（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｃａｔ．Ｎｏ．３１３１２）を５０μｌ添加することによって測定し、３７℃で１時間インキュベートした。プレート洗浄は、上述されるようにＴＰＢＳを用いて繰り返し、１００μｌのｐ−ニトロフェニルリン酸２ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに添加した。ＥＬＩＳＡ反応は、６０分間発色させ、結果は、既知の濃度で希釈した対照ヒトＦａｂに対してプロットした。全ての試料の吸光度は、５９０ｎｍで分光計セットを用いて測定した。
【００９２】
結果
組換えファージのライブラリーは、ｐＤＤ技術（ＷＯ０７／００７１５４）に従って生じさせ、ＲｕＶの臨床単離物を用いて感染させた線維芽細胞株から得たタンパク質抽出物について評価した。また、５ラウンドのパンニングは、ＲｕＶよって感染していない同じ細胞株からの対照タンパク質抽出物を用いて同ライブラリーを用いて並行して行った。
【００９３】
第３ラウンドによって、対照タンパク質抽出物に対して評価した試料のファージ力価は、１０4を下回り、一方、ＲｕＶ抽出物に対して評価した試料のファージ力価は、第４ラウンドで１０4を超え、第５ラウンドでは１０5に到達した。この値は、ＲｕＶ抗原に結合するそれらの表面Ｆａｂに発現している組換えファージにおけるライブラリーの進行的濃縮を示す。
【００９４】
パンニングの第５ラウンド後に得られた１４個のクローンは、ＥＬＩＳＡにおいて個別に試験され、陽性であることが確かめられた。選択されたクローンにおけるＨＣＤＲ３のＰＣＲ及び配列分析により、ここで命名されたＤＤＦ−ＲｕＶ１及びＤＤＦ−ＲｕＶ２のヒトＦａｂを特徴付ける２つの重鎖が同定された。ＤＤＦ−ＲｕＶ１又はＤＤＦ−ＲｕＶ２を発現している組換えファージの反応性は、ＲｕＶ特異的タンパク質抽出物、並びに無関係な抗原（ウシ血清アルブミン、未感染細胞からのタンパク質抽出物）に対して試験され、ＥＬＩＳＡフォーマットにおいてそれらの結合活性が確かめられた（図１）。また、結合の特異性は、対照のヒトＦａｂを用いて確認された。
【００９５】
これらのＦａｂの完全な重鎖及び軽鎖可変領域のＤＮＡ配列、並びにＤＤＦ−ＲｕＶ１及びＤＤＦ−ＲｕＶ２に対して、対応するＣＤＲを決定した（それぞれ、図２及び３）。これらのＦａｂはまた、タンパク質発現のためのＥ．ｃｏｌｉ系システムを用いて、更なるアッセイのための十分な組換えタンパク質を得るための他のベクターに再度クローニングされた。
【００９６】
実施例２：ＲｕＶ感染させた細胞培養物について試験されたＤＤＦ−ＲｕＶ１及びＤＤＦ−ＲｕＶ２の特性
材料＆方法
ＲｕＶ特異的ヒトＦａｂの中和アッセイ
免疫蛍光に基づくアッセイは、３７℃で７２時間のインキュベーション後には、通常、コンフルエントな単層を形成する条件下で、プレートに植菌された１０4〜１０5個のＶＥＲＯ細胞を用いて、Ｃｏｓｔｅｒの２４ウェルプレートで行った。ＲｕＶ臨床単離物であるＨ２を感染に使用した。
【００９７】
Ｆａｂは、実施例１に指示されるように部分的に精製し、維持培地に懸濁させた５０ＴＣＩＤ50（５０％組織培養感染用量）での等体積のＲｕＶ細胞不含ストックを用いて種々の濃度（０．０１、０．１、１、１０及び５０μｇ／ｍｌ）で混合した。対照は、Ｆａｂなし（ブランク対照）、又はヒトＣ型肝炎ウイルスに特異的な無関係なＦａｂ（ｅ１３７；Ｂｕｇｌｉ Ｆら，２００１）の存在で、等体積の維持培地及びウイルスから構成された。
【００９８】
３７℃でのインキュベーションの１時間後、２５０μｌのウイルス−フラグメントＦａｂ混合物又は対照混合物は、培地が除かれたウェル（２重）に植菌された。プレートを２時間３７℃でインキュベートし、中和されていないウイルスの吸着を可能にする。植菌物を除去し、１．５ｍｌの維持培地を添加した。細胞培養条件で１週間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、冷メタノール−アセトン溶液（１：２比）で１０分間、室温で固定した。固定された細胞は、３０分間、３７℃で、湿気雰囲気でＲｕＶのタンパク質Ｅ１に特異的な市販のモノクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＡＢ９２５）とともにインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、最後に、３０分間、３７℃で、湿気雰囲気で抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣ結合体（Ｓｉｇｍａ）とともにインキュベートした。スライドをＰＢＳで洗浄し、Ｅｖａｎｓ Ｂｌｕｅ色素で対比染色し、グリセロールを積層した。各Ｆａｂの中和活性は、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）によって観察される単一の蛍光を発する細胞をカウントし、対照試料の細胞（Ｆａｂ前インキュベーションなし）と比較して、ＲｕＶ陽性細胞の数の減少の割合を計算することによって測定された。
【００９９】
結果
ＤＤＦ−ＲｕＶ１及びＤＤＦ−ＲｕＶ２に関するＲｕＶ中和活性の分析は、部分的に精製したＦａｂの調製物の使用及び免疫蛍光に基づくアッセイによって行った。
【０１００】
ＲｕＶ感染細胞の減少に関するデータは、ＤＤＦ−ＲｕＶ１及びＤＤＦ−ＲｕＶ２が、ＲｕＶとともにプレインキュベートされた場合に中和活性とともに与えられることを指示する。実際に、対照（ＦａｂなしのＲｕＶまたは無関係なＦａｂとのＲｕＶ）と比較すると、これらのＲａｂの添加は、投薬量に依存して感染細胞の数を減少する（図４）。
【０１０１】
本明細書において提示された実験的証拠は、ＲｕＶ感染に関連した診断、治療、又は予防的応用のためのＤＤＦ−ＲｕＶ１及びＤＤＦ−ＲｕＶ２Ｆａｂ（又はそれらの特異的なＨＣＤＲ３に基づく代替のタンパク質配列であって、類似の性質を示す）候補化合物を作製する。
【０１０２】
ＤＤＦ−ＲｕＶ１及びＤＤＦ−ＲｕＶ２は、細菌宿主細胞における組換えタンパク質として発現することができる。特に、これらのＦａｂは、ｐＤＬａｃ−ＦＬＡＧｈｉｓベクターなどのＤＤカセット（ＰＣＴ／ＩＢ２００８／０００２６６）に存在する制限部位と適合するベクターにそれらのコーディング配列を再度クローニングすることによって発現可能である。このベクターは、ヘテロ二量体複合体を形成する適切な定常領域、重鎖のＣ末端での６−Ｈｉｓ及びＦａｇを含む可溶性Ｆａｂの発現を可能にする（図５）。このアプローチは、Ｆａｂのより直接的なクローニング、検出（例えば、ＥＬＩＳＡにおける）及び精製（例えば、固相化した金属親和性カラムに基づく手法を用い、免疫親和性精製と比較してより簡易でありよりコストが抑えられる）を可能にする。
【０１０３】
実施例３：ＲｕＶ特異的な中和エピトープを決定するためのｐＤＤに基づくペプチドライブラリーの構築及び評価
ＲｕＶ中和Ｆａｂは、パンニングのためのＲｕＶで感染させたＶＥＲＯ細胞のタンパク質抽出物を用いて、ヒトＦａｂのｐＤＤ系ライブラリーをパンニングすることによって初期に同定された。その後、ＲｕＶ特異的な中和活性は、細胞系モデルにおいて試験されたが、実際にはＤＤＦ−ＲｕＶ１及び／又はＤＤＦ−ＲｕＶ２によるウイルスエピトープは特定されなかった。
【０１０４】
類似のエピトープは、過去における異なるアプローチを用いて想定され、合成ペプチドＥＬＩＳＡ（Ｇｉｅｓｓａｕｆ Ａら，２００４）、タンパク質欠失突然変異体（Ｃｈａｙｅ Ｈら，１９９２）、マウスモノクローナル抗体のパネルを用いた競合分析（Ｇｒｅｅｎ Ｋ及びＤｏｒｓｅｔｔ Ｐ，１９８６）、又はこれらの技術の組み合わせ（Ｗｏｌｉｎｓｋｙ Ｊら，１９９３）が含まれる。
【０１０５】
この範囲で、ｐＤＤ技術は、ＷＯ０７／００７１５４における血球凝集素エピトープタグ（ＨＡｔａｇ）を利用することによって例示されるように、２つの機能性ファージコートタンパク質の１つ又は他方のいずれかのファージ表面に提示されるペプチドライブラリーを構築するために適用することができる。ｐＤＤ技術を用いて提示された非ランダム又はランダムペプチドのライブラリーは、抗体を特異的に結合するペプチドを提示するファージを選択するためにスクリーニングすることができる。ライブラリーにおいて選択されるペプチド配列モチーフは、抗体特異的なエピトープの特定を可能にする（Ｚｈｏｎｇ Ｇら，１９９７；Ｙｉｐ Ｙら，１９９９ａ）。
【０１０６】
異なるファージディスプレイフォーマットを用いて提示させたペプチド配列をスクリーニングし、比較するという重要性は、文献に示されている。第１の例では、モノクローナル抗体のエピトープは、異なる長さのペプチドを各々含み、異なるファージコートタンパク質に融合された２つのファージディスプレイライブラリーを用いて、ファージによって提示されたエピトープ（又は「ファゴトープ」）内で選択された。スクリーニングの結果は、異なるペプチド配列は、２つのファージディスプレイプラットフォームを用いて選択されたということであり、これは、ファゴトープの特徴付けが、ファージコートタンパク質における比較タイプのペプチド提示を必要とし得ることを示唆する（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ Ｋら，２００５）。同様の証拠はまた、有機（例えば、ヒトの毛髪又は皮膚）又は無機（例えば、ポリプロピレン）支持体に結合するペプチドの場合において見出された。文献（Ｓｃｈｏｌｌｅ Ｍら，２００５）に記載された方法、又はそれに従って修飾された方法などの、異なる長さを有するペプチドの市販のファージによって提示されたライブラリーをスクリーニングし、比較することによって、得られる配列が顕著に異なる（ＷＯ０７／０３５５１、ＷＯ０６／０９４０９３、ＷＯ０６／０９４０９４、ＷＯ０６／０９４０９５）。
【０１０７】
２つの異なるライブラリーは、ｐＤＤファージミド（ｐＤＤｃ）と市販のライブラリー（Ｐｈ．Ｄ．１２ファージディスプレイライブラリーキット；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，ｃａｔ，ｎｏ．Ｅ８１１０Ｓ）との組み合わせによって構築され、それは、抗体の線状又は立体的エピトープを決定するための過去においてすでに使用され（Ｌｉ Ｙら，２００７；Ｐｅｔｉｔ Ｍら，２００３）、異なる長さのペプチドライブラリーを生じるために修飾された（ＷＯ０７／０３５５１、ＷＯ０６／０９４０９３、ＷＯ０６／０９４０９４、ＷＯ０６／０９４０９５）。このライブラリーは、６４個の可能なコドンのうちほんの３２個を含む。それは、第３の位置がＴ又はＧに限定されているためであって、単一コドンを有する残基の相対的頻度を増加させ、３つの終始コドンの２つ（第３のものは適切なＥ．ｃｏｌｉ菌株において抑制され、グルタミンに翻訳され得る）を除去するためである。
【０１０８】
このライブラリーに含まれるファージミド由来の複製の二本鎖形態は、ＸｈｏＩ制限部位を含むフォワードプライマー、ＳｐｅＩ制限部位を含むリバースプライマーを用いたＰＣＲ増幅のための鋳型として使用された。第２のＰＣＲ増幅は、鋳型と同じライブラリー、ＫｐｎＩ制限部位を含むフォワードプライマー、ＥａｇＩ制限部位を含むリバースプライマーを用いて行われた（図６Ａ）。
【０１０９】
ＰＣＲ増幅に起因するＤＮＡフラグメントが消化され、各々が約１０8の力価を有し、初期には、ｃｐ３にだけ融合する、２つの異なるｐＤＤ系ペプチドライブラリーを生じるためのｐＤＤｃベクターにクローニングされた。第１のケースでは、ｐＤＤｃＸＳｍｅｒ−ｏｒｃｐ３ライブラリーは、ＸｈｏＩ及びＳｐｅＩ制限部位におけるＰＣＲ増幅産物をクローニングすることによって生じた（図６Ｂ）。第２のケースでは、ｐＤＤｃＫＥ１２ｍｅｒ−ｏｒｃｐ３ライブラリーは、中間のｐＤＤｃＫＥベクターにＰＣＲ増幅をクローニングすることによって生じさせ、それには、ＸｈｏＩ／ＳｐｅＩ部位の間のＫｐｎＩ及びＥａｇＩ制限部位、ＨＡコーディング領域の５’／３’末端を含む（図６Ｃ；ＷＯ０７／００７１５４）。
【０１１０】
クローニング部位としてＳｐｅＩの使用は、特定の効果を提供することを気づくことは重要である。それは、この制限酵素は、元々にペプチドライブラリーに存在する２つの連続コドン：スレオニンをコードするＡＣＴ、セリンをコードするＡＧＴに対応する配列（ＡＣＴＡＧＴ）内で切断するためである。他の２つの可能なフレームは、ライブラリー内で可能にしないため（即ち、Ａ及びＣは、コドンにおける第３の位置として存在しない）、ＤＤカセット内でライブラリーをクローニングするためのＳｐｅＩの利用は、ｐＤＤベクターのＳｐｅＩ部位がｐＤＤｃの場合のように同じコーディングフレームを有する場合に、低い頻度でペプチドのより短い変異体の導入を可能にする（図６Ｂ及び６Ｃ）。
【０１１１】
このようなアプローチは、ＡｌｗＮＩ（ＣＡＧＮＮＮＣＴＧを認識）、ＮｄｅＩ（ＣＡＴＡＴＧを認識）、ＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴを認識）、又はＰｖｕＩＩ（ＣＡＧＣＴＧを認識）などの類似の特性（第１塩基としてＡ又はＣ、第２塩基としてＡ又はＣ、第３塩基としてＧ又はＴ、６又は９塩基対を認識する）を有する認識部位を有する他の酵素を利用するこの種のライブラリーの変異体を生じるために使用することができる。また、類似の部位は、元々のライブラリーにおける追加の非／ランダムコドンを無作為に統合するために使用されてもよく、ライブラリーの複雑性をさらに改善する。
【０１１２】
ｃｐ３又はｃｐ８に融合したタンパク質を提示するために、２つのｐＤＤ系ペプチドライブラリーは、（例えば、ＸＬ１−ｂｌｕｅ Ｅ．ｃｏｌｉ菌株において）維持及び増幅することが必要である。ファージミドは精製され、ＢｇｌＩ（ＤＤカセットを抽出するために）で消化され、次に、ＢｇｌＩ消化されたｐＤＤｃベクターに再度連結される。連結反応は、細菌を形質転換するために使用され、その結果、２つのライブラリーが選択され、Ｚｅｏｃｉｎ耐性細菌細胞として維持された。この場合、ファージミドが増幅され得て、ヘルパーファージによる感染後に組換えファージに含まれ、単一のクローンは、所望のスクリーニング後に分析可能である。
【０１１３】
この方法では、ＤＤカセットのペプチドライブラリーがクローニングされ、対応するｐＤＤｃＸＳｍｅｒ−ｏｒｃｐ３／ｃｐ８及びｐＤＤｃＫＥ１２ｍｅｒ−ｏｒｃｐ３／ｃｐ８ライブラリーにおける２つの可能な配向のいずれか１つにスクリーニングされる（図７；ＷＯ０７／００７１５４）。次にライブラリーは、Ｅ．ｃｏｌｉで増幅され、組換えファージはパンニング実験の結果を比較することによって試験された。パンニングは、組換えファージを生じるためのヘルパーファージの使用を伴う。このファージの集団が単離され、文献に記載されるように、マイクロウェルプレートに被覆された対象の標的への結合親和性に基づいて試験することができる。対象の標的に対する３〜５つの連続的なパンニングラウンド後、特異的結合は、対照と比較されると、溶出されたファージの数の増加によって明示される。
【０１１４】
本ケースでは、２つのライブラリーは、市販の抗ＨＡｔａｇ抗体（マウスモノクローナル抗体ＨＡ．１１、クローン６Ｂ１２；Ｃｏｖａｎｃｅ）などの周知な線状エピトープを有する抗体に対して試験された。このアプローチは、ファージディスプレイプラットフォームを改善するための技術を評価するために従来使用されていた（Ｓｔｒａｔｍａｎｎ Ｔ及びＫａｎｇ Ａ，２００５；Ｖａｎｈｅｒｃｋｅ Ｔｒａ，２００５）。
【０１１５】
ライブラリーのタイトルにおける減少があるとしても（ＢｇｌＩ消化、再連結、Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換に関連する手法による）、関連した標的（抗ＨＡｔａｇモノクローナル抗体）又は負の対照（ＢＳＡ）に対するパンニングの比較は、ｐＤＤｃＸＳｍｅｒ−ｏｒｃｐ３／ｃｐ８（表Ｉ）及びｐＤＤｃＫＥ１２ｍｅｒ−ｏｒｃｐ３／ｃｐ８（表ＩＩ）ライブラリーに関して、計算されたインプット及びアウトプットについて有意な相違があることを示す。さらに、パンニングの第３ラウンドは、抗ＨＡｔａｇのアウトプットに対する１０２の特定濃縮をＢＳＡの１つと比較することを示す。
【０１１６】
ＤＤカセット及びペプチドが２つのライブラリーの各クローンに存在する配向は、制限分析によって容易に測定可能である（図７）。消化は、提示されるべき配列を有するＤＤカセットの末端近くを切断する酵素（例えば、ＸｈｏＩ又はＳｐｅＩ）と、ｐＤｄベクターの骨格にあるコートタンパク質をコードする配列の末端を切断する酵素（例えば、ｃｐ３*についてはＮｈｅＩ）とを組み合わせることによって行われる。得られる制限パターンは、コートタンパク質をコードする配列だけを含むＤＮＡフラグメント（ＤＤカセットがｃｐ３*に配向する場合）、又はＤＤカセット及びコートタンパク質をコードする配列を含むＤＮＡフラグメント（ＤＤカセットがｃｐ８*に配向する場合）を示す。
【０１１７】
ＮｈｅＩ／ＳｐｅＩ消化は、上記されるパンニング前及び／又は後に、２つのライブラリーから無作為に選択されるクローンのパネルにおいて行われた。消化から得られたＤＮＡフラグメントが電気泳動によって分離されると、約０．６ｋｂのフラグメントは、ＤＤカセットがｃｐ３*に配向される場合に検出され、約１．８ｋｂのフラグメントは、ＤＤカセットがｃｐ８*に配向される場合に検出される。この分析は、全ての状況において、ｃｐ８*配向を有するクローンの僅かな有病率を示した（図８）。
【０１１８】
ｐＤＤｃＸＳｍｅｒ−ｏｒｃｐ３／ｃｐ８及びｐＤＤｃＫＥ１２ｍｅｒ−ｏｒｃｐ３／ｃｐ８ライブラリーにおいてクローニングされたペプチドの配列は、無作為に選択されたクローンについて決定され、良好なレベルの変動、ｐＤＤｃＸＳｍｅｒ−ｏｒｃｐ３／ｃｐ８の場合には、７〜１２個のアミノ酸の範囲のより短い配列を有するペプチドの存在の両方を確実にした（図９）。同じ分析は、抗ＨＡｔａｇ抗体に対するｐＤＤｃＫＥ１２ｍｅｒ−ｏｒｃｐ３／ｃｐ８をパンニング後に得られたクローンにおいてなされ、ＨＡｔａｇ（テトラペプチドＹＰＹＤ）を含むペプチドの存在が選択されたクローンにおいて確かめられた。
【０１１９】
ライブラリーにおけるＨＡｔａｇ特異的ペプチドをコードするクローンの存在及び選択の更なる確認として、パンニング選択後に生じた細菌クローンはニトロセルロース様メンブレン上に移され、アルカリ条件で溶解された。この方法では、細菌タンパク質は、ニトロセルロースペーパーに固相化され、次に、抗ＨＡｔａｇとともにインキュベートされる。ＨＡｔａｇを提示する多量のクローンを確認する（図１０）。
【０１２０】
生物活性ペプチド（例えば、抗体、阻害剤又はプロテアーゼの認識部位を特徴付けるエピトープ、膜受容体に結合するペプチド、シグナルタンパク質、又は転写因子）が同定されるｐＤＤ系ペプチドライブラリーを生じ、パンニングするための本ストラテジーは、異なる使用又はクローニングストラテジーに適合することができる。ファージに提示されるランダムペプチドライブラリーの複雑性を改善及び評価するための条件は、文献に記載されている（Ｎｏｒｅｎ Ｋ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｒｏｄｉ Ｄ ｅｔ ａｌ．，２００２）。
【０１２１】
例えば、オリジナルなペプチドライブラリー（その長さ及び複雑性を維持することが望ましい場合）は、クローニング及び形質転換プロセスのより良好な効率を可能にし得る基準の組み合わせを満足する制限酵素の異なる組み合わせを用いてクローニングされ得る。例えば、制限酵素のＢｓｔＥＩＩ、ＭｌｕＩ、ＡｇｅＩ、ＥｃｏＲＶ、Ｓａｌｌ、ＳｎａＢＩ、及びＢｇ１ＩＩは、ｐＤＤｃベクター及びＰｈ．Ｄ．１２ライブラリーに切断するものがなく、（ＥａｇＩと比較して）メチル化不感覚である。
【０１２２】
この実施例は、複数の融合タンパク質を含むｐＤＤ系ペプチドライブラリーを提供し、各融合タンパク質は、ｐＤＤベクターのＤＤリンカーを含む配列によって連結されるウイルス表面タンパク質（ｃｐ３*又はｃｐ８*）及びランダムペプチド配列を含む。ｐＤＤベクター及びＤＤカセットの構造、機能、配列特徴は、ＷＯ０７／００７１５４において特定される。
【０１２３】
初期のペプチドライブラリーは、一般式ＮＮＫ（Ｎは任意の塩基であり、ＫはＧ又はＴである）を有するコドンを含むべきである。上述されるｐＤＤベクターにおけるコドン使用及びフレームと適合され得る部位を認識する制限酵素による消化後、ライブラリーは、元々の配列の完全又はより短い変異体として実際にクローニングされる。これらのペプチド変異体は、一般には遺伝的パッケージ、特に細菌細胞又は線状ファージの表面に提示され得る。
【０１２４】
異なる長さを有し、ｐＤＤベクターのＤＤカセット内に２つの機能性ファージコートタンパク質の１つ又は他方のいずれかと融合されたペプチドを提示するためのファージミドのライブラリーを構築する方法は、下記を含む：
ａ）少なくとも制限酵素を用いてＤＤカセット内にライブラリーをクローニングするために使用される制限部位（例えば、ＳｐｅＩ）に対応する、少なくともコドンの組み合わせを含むＤＮＡライブラリー（例えば、Ｐｈ．Ｄ．１２ペプチドライブラリー）の消化；
ｂ）得られたＤＮＡライブラリーと、少なくとも同じ制限酵素を用いて消化されたファージミド（例えば、ｐＤＤｃ）との連結；
ｃ）細菌細胞の形質転換のためのファージミドの第１ライブラリーの使用、及び細菌細胞の第１ライブラリーの生成；
ｄ）細菌細胞の第１ライブラリーからのファージミドの単離；
ｅ）ＤＤカセットのＤＤリンカーに存在する制限酵素を用いて前記ファージミドの消化；
ｆ）得られたＤＤカセットと、同じ制限酵素を用いて消化したｐＤＤベクターとの連結；
ｇ）細菌細胞の形質転換のためのファージミドの第２ライブラリーの使用、及び細菌細胞の第２ライブラリーの生成；
ｄ）細菌細胞の第１ライブラリーからのファージミドの単離。
【０１２５】
このプロセスの最後に、ＤＤカセットの調節配列、ｐＤＤベクターの１つ又は他の機能性ファージコートタンパク質（例えば、ｃｐ３*又はｃｐ８*）の配列への操作可能に連結されたｐＤＤ系ペプチドライブラリーが生じる。このようなファージミドを含む細菌細胞のライブラリーは、パンニング、又は任意の他の種のネガティブ／ポジティブ選択のために使用される組換えファージの集団を得るために、ヘルパーファージを用いて感染させることができる。
【０１２６】
このクローニングアプローチは、コートされたペプチドの長さの修飾に２つのファージコートタンパク質（ＷＯ０７／００７１５４におけるｐＤＤ技術について指示されるように）の融合を組み合わせる。この方法は、所望の標的に対してスクリーニングされ得るペプチドをコードするファージミドの新規なライブラリー、及びペプチドの新規なライブラリーを提供する。実際に、この方法に従って得られる複数のファージミドは、Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換のために使用することができる。次に、得られる細胞は、組換えファージのライブラリーを生成するためのヘルパーファージを用いて感染させ得る。
【０１２７】
ｐＤＤ系ペプチドライブラリーは、ファージによる提示されるランダムの元々の集団から選択される特定のペプチドをコードするＤＮＡ配列を増幅及び／又は配列決定するためのプライマーをさらに含むキットに（ファージミド又は細菌細胞として）含まれてもよい。
【０１２８】
ｐＤＤ系ペプチドライブラリーは、特定の生物活性を有するペプチドを選択するためにスクリーニングされ得る組換えファージを生成するか、又は特定のリガンド分子に結合するペプチドを単離及び生成するために使用可能である。インビトロでのパンニングの場合、このようなライブラリーは、エピトープマッピング（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ Ｋら，２００５；Ｚｈｏｎｇ Ｇら，１９９７；Ｙｉｐ Ｙら，１９９９ａ）、プロテアーゼ特異性のマッピング及びプロテアーゼ阻害剤の設計（Ｄｉａｍｏｎｄ Ｓ，２００８；Ｓｅｄｌａｃｅｋ Ｒ及びＣｈｅｎ Ｅ，２００５）、あるいは細胞表面の抗原のスクリーニング（Ｍｕｔｕｂｅｒｒｉａら，２００４）のために使用可能である。インビボのパンニングの場合、このようなライブラリー（並びに、ｃｐ３又はｃｐ８のいずれかと融合するだけでなく、異なる長さを有するペプチドを提示するｐＤＤｃＸＳｍｅｒ−ｏｒｃｐ３／ｃｐ８ライブラリーのような特定のもの）は、細胞外空間内、及び細胞膜上でタンパク質−リガンド相互作用の同定を可能にする（Ｆｉｎｇｅｒ Ａら，２００２；Ｙｉｐ Ｙら，１９９９ｂ）。
【０１２９】
【表１】
【０１３０】
【表２】
【０１３１】
【化１】
【０１３２】
【化２】
【０１３３】
【化３】
【０１３４】
【化４】
【０１３５】
【化５】
【０１３６】
【化６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むタンパク質。
【請求項２】
前記タンパク質が、配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記タンパク質が、配列番号７と少なくとも７０％の同一性を有する配列をさらに含む、請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記タンパク質が、抗体、抗体フラグメント、生物活性ペプチド、又は融合タンパク質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記抗体フラグメントが、可変重鎖／軽鎖ヘテロ二量体又は一本鎖フラグメント可変部である、請求項４に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記タンパク質が、風疹ウイルス（Ｒｕｂｅｌｌａ ｖｉｒｕｓ：ＲｕＶ）に結合し、中和する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項８】
前記核酸が、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか１項に記載の核酸を含む組換えファージ、原核宿主細胞、又は有核宿主動物。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質を製造するための、請求項７〜９のいずれか１項に記載の核酸、又は請求項１０に記載の組換えファージ若しくは宿主細胞の使用。
【請求項１２】
ＲｕＶ感染を検出、治療、阻害、予防及び／又は改善するための組成物を製造するための請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質の使用。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質を含む治療用、予防用、又は診断用組成物。
【請求項１４】
前記組成物が眼内又は局所投与用である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
異なるＲｕＶ中和抗体、異なるＲｕＶ中和抗体フラグメント、静注用免疫グロブリン調製物、及び／又は抗ウイルス化合物をさらに含む、請求項１３又は１４に記載の組成物。
【請求項１】
配列番号５と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むタンパク質。
【請求項２】
前記タンパク質が、配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記タンパク質が、配列番号７と少なくとも７０％の同一性を有する配列をさらに含む、請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記タンパク質が、抗体、抗体フラグメント、生物活性ペプチド、又は融合タンパク質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記抗体フラグメントが、可変重鎖／軽鎖ヘテロ二量体又は一本鎖フラグメント可変部である、請求項４に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記タンパク質が、風疹ウイルス（Ｒｕｂｅｌｌａ ｖｉｒｕｓ：ＲｕＶ）に結合し、中和する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項８】
前記核酸が、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか１項に記載の核酸を含む組換えファージ、原核宿主細胞、又は有核宿主動物。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質を製造するための、請求項７〜９のいずれか１項に記載の核酸、又は請求項１０に記載の組換えファージ若しくは宿主細胞の使用。
【請求項１２】
ＲｕＶ感染を検出、治療、阻害、予防及び／又は改善するための組成物を製造するための請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質の使用。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質を含む治療用、予防用、又は診断用組成物。
【請求項１４】
前記組成物が眼内又は局所投与用である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
異なるＲｕＶ中和抗体、異なるＲｕＶ中和抗体フラグメント、静注用免疫グロブリン調製物、及び／又は抗ウイルス化合物をさらに含む、請求項１３又は１４に記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ）】
【図８Ｂ）】
【図８Ｃ）】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ）】
【図８Ｂ）】
【図８Ｃ）】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２０１０−５１９９１６（Ｐ２０１０−５１９９１６Ａ）
【公表日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５５２１２３（Ｐ２００９−５５２１２３）
【出願日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００１７９１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１０７１８７
【国際公開日】平成２０年９月１２日（２００８．９．１２）
【出願人】（５０８１７８４７８）リボバックス バイオテクノロジーズ ソシエテ アノニム (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００１７９１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１０７１８７
【国際公開日】平成２０年９月１２日（２００８．９．１２）
【出願人】（５０８１７８４７８）リボバックス バイオテクノロジーズ ソシエテ アノニム (6)
【Ｆターム（参考）】
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