食品の殺菌方法
【課題】 クロストリジウム・ボツリヌス等の芽胞菌を効果的に殺菌し、且つ食品の味や香り、食感を損なわない食品の殺菌方法を提供する。
【解決手段】 殺菌対象となる食品中に、システイン、アラニン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、ロイシン、及びグリシンから選ばれる１種又は２種以上のアミノ酸を添加した後、５０〜６００ＭＰａの圧力で１〜２４０分間処理する高圧処理工程と、
前記高圧処理工程後、６０〜１００℃の温度で５分間以上加熱する低温殺菌処理工程と
を備えることを特徴とする食品の殺菌方法。
【解決手段】 殺菌対象となる食品中に、システイン、アラニン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、ロイシン、及びグリシンから選ばれる１種又は２種以上のアミノ酸を添加した後、５０〜６００ＭＰａの圧力で１〜２４０分間処理する高圧処理工程と、
前記高圧処理工程後、６０〜１００℃の温度で５分間以上加熱する低温殺菌処理工程と
を備えることを特徴とする食品の殺菌方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品の殺菌方法、特に食品の安全性の面で問題となる耐熱性及び耐圧性の高い芽胞を有するクロストリジウム・ボツリナム等の芽胞菌の殺菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品の高圧処理を用いた微生物の殺菌は、１００℃以上の高温加熱殺菌と比べて、食品の味や香り、食感を損なわないことが知られている。加えて、高圧処理殺菌は、加熱処理殺菌に比べてエネルギー効率もよいため、現在までに様々な高圧処理殺菌方法が検討されている。しかしながら、芽胞菌として知られる細菌は、耐圧性を有する芽胞を形成し、高圧処理単独の殺菌では、このような芽胞菌の芽胞を殺菌することは難しい。このため、例えば、高圧処理を用いて芽胞を殺菌する方法として、高圧処理と加熱処理を併用する方法（例えば、特許文献１〜３）、や、高圧処理と添加物などを併用する方法（例えば、特許文献４〜７）等が報告されている。
【０００３】
これらの高圧処理殺菌方法では、圧力に対してあまり強くない芽胞菌、無芽胞菌、カビ、酵母等を殺菌することが可能である。しかしながら、ある種の芽胞菌が形成する芽胞は、耐圧性や耐熱性が極めて高く、先に述べたような従来の高圧処理方法では十分に殺菌することができない。特に、強力な神経毒を産生することから、食品の安全性に関わる最も重要な微生物であり、食品殺菌の指標菌とされているクロストリジウム・ボツリナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）等のクロストリジウム属菌の形成する芽胞は、耐圧性が極めて強く、高圧処理を用いて殺菌することが難しい。
【０００４】
これに対して、高圧処理後にクロストリジウム・ボツリナム等のクロストリジウム属菌の芽胞の発育を抑制する添加物を用いる方法も提案されている（特許文献４）ものの、この方法では芽胞の発育を抑制するのみで殺菌には至っておらず、安全性の面で十分であるとは言えない。一方で、１０００ＭＰａ程度の高圧力処理と１００℃程度の高温での加熱処理を同時に行うことによって、これら芽胞の殺菌が可能であることが報告されている（非特許文献１）。しかしながら、このような高い圧力処理と高温での加熱処理を同時に行なえるような処理装置は、現在のところ実験用の小型装置のみであって、食品製造に実際に用いられるような大型の処理装置においては、同様の高温・高圧処理条件を再現することが困難であるとともに、実用に際してのコスト面での負担も大きい。加えて、高温・高圧で処理しているため、食品の風味や食感が落ちてしまうという問題もある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平４−９１７７０号公報
【特許文献２】特開平５−２２７９２５号公報
【特許文献３】特開２０００−３２９６５号公報
【特許文献４】特開平５−２５２９２０号公報
【特許文献５】特開平８−１８２４８６号公報
【特許文献６】特開平５−２２７９２５号公報
【特許文献７】特開平６−７０７３０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Applied And Environment Microbiology, Vol.72, No.5, p3476-3481, May 2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上に説明したように、従来の高圧殺菌処理方法では、例えば、クロストリジウム・ボツリナム等のクロストリジウム属菌が形成する熱や圧力に強い芽胞を十分に殺菌することは難しく、特にこのような芽胞が生育可能な低酸性の食品の殺菌法として用いるには安全性の面で問題があった。すなわち、本発明の解決しようとする課題は、高耐熱性、高耐圧性の芽胞菌を効果的に殺菌し、且つ食品の味や香り、食感を損なわない食品の殺菌方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らが、前記従来技術の課題に鑑みて鋭意検討を行った結果、食品中にシステイン等の特定種のアミノ酸を添加し、５０〜６００ＭＰａの圧力で高圧処理を行うことによって、高耐熱性、高耐圧性の芽胞菌を効率的に発芽させ、その後、さらに６０〜１００℃で低温殺菌処理することによって、発芽した芽胞菌を効果的に殺菌することができることを見出した。これにより、食品の味や香り、食感を損なうことなく、従来の高圧処理法では殺菌の難しかった高耐熱性、高耐圧性の芽胞菌を十分に殺菌することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明にかかる食品の殺菌方法は、殺菌対象となる食品中に、システイン、アラニン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、ロイシン、及びグリシンから選ばれる１種又は２種以上のアミノ酸を添加した後、５０〜６００ＭＰａの圧力で１〜１２０分間処理する高圧処理工程と、前記高圧処理工程後、６０〜１００℃の温度で５分間以上加熱する低温殺菌処理工程とを備えることを特徴とするものである。
【００１０】
また、前記殺菌方法において、前記アミノ酸を、食品中０．０１〜０．１５ｍｏｌ／ｌ添加することが好適である。
また、前記殺菌方法において、前記アミノ酸としてアラニン及び／又はシステインを用いることが好適である。
【００１１】
また、前記殺菌方法において、前記高圧処理工程の際、前記アミノ酸とともに、重曹を添加した後、高圧処理することが好適である。
また、前記殺菌方法において、前記重曹を、食品中０．２〜１．０ｍｏｌ／ｌ添加することが好適である。
また、前記殺菌方法において、前記アミノ酸の含有量が合計０．１５ｍｏｌ／ｌ未満の食品を殺菌対象とすることが好適である。
【００１２】
また、本発明にかかる食品の殺菌方法は、アミノ酸含有量が合計０．０１ｍｏｌ／ｌ以上の食品中に、重曹を添加した後、５０〜６００ＭＰａの圧力で１〜２４０分間処理する高圧処理工程と、前記高圧処理工程後、６０〜１００℃の温度で５分間以上加熱する低温殺菌処理工程とを備えることを特徴とするものである。
また、前記殺菌方法において、前記重曹を、食品中０．２〜１．０ｍｏｌ／ｌ添加することが好適である。
【００１３】
また、本発明にかかる殺菌方法において、食品中の芽胞菌を殺菌することが好適である。
また、前記殺菌方法において、食品中のクロストリジウム属菌を殺菌することが好適である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明にかかる食品の殺菌方法によれば、食品中にシステイン等の特定種のアミノ酸を添加した状態で、５０〜６００ＭＰａで高圧処理を行い、その後、６０〜１００℃で低温殺菌処理を行うことによって、食品の味や香り、食感を損なうことなく、従来の高圧処理法では殺菌することの難しかった高耐熱性、高耐圧性の芽胞菌を効果的に殺菌することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】０．０８Ｍアミノ酸添加、１００ＭＰａ高圧処理条件での殺菌効果試験の結果をまとめた図である（試験例１−１）。
【図２】０．０８Ｍアミノ酸添加、２００ＭＰａ高圧処理条件での殺菌効果試験の結果をまとめた図である（試験例１−２）。
【図３】０．０８Ｍアミノ酸添加、４００ＭＰａ高圧処理条件での殺菌効果試験の結果をまとめた図である（試験例１−３）。
【図４】０．０８Ｍアミノ酸添加、０．１ＭＰａ処理条件での殺菌効果試験の結果をまとめた図である（試験例１−４）。
【図５】圧力条件を各種変化させ、アミノ酸添加、高圧処理による殺菌効果試験を行なった結果をまとめた図である。
【図６】処理時間を各種変化させ、アミノ酸添加、２００ＭＰａ，４５℃高圧処理条件での殺菌効果試験を行なった結果をまとめた図である（試験例４−１）。
【図７】処理時間を各種変化させ、アミノ酸添加、２００ＭＰａ，７０℃高圧処理条件での殺菌効果試験を行なった結果をまとめた図である（試験例４−２）。
【図８】アミノ酸添加濃度を各種変化させ、２００ＭＰａ，４５℃，１２０分間高圧処理条件での殺菌効果試験を行なった結果をまとめた図である（試験例５−１）。
【図９】アミノ酸添加濃度を各種変化させ、２００ＭＰａ，７０℃，１５分間高圧処理条件での殺菌効果試験を行なった結果をまとめた図である（試験例５−２）。
【図１０】アミノ酸とともに重曹を添加し、１００ＭＰａ，７０℃、１５分間高圧処理条件での殺菌効果試験を行なった結果をまとめた図である（試験例６−１）。
【図１１】アミノ酸とともに重曹を添加し、２００ＭＰａ，７０℃、１５分間高圧処理条件での殺菌効果試験を行なった結果をまとめた図である（試験例６−２）。
【図１２】重曹添加濃度を各種変化させ、１００ＭＰａ，７０℃、１５分間高圧処理条件での殺菌効果試験を行なった結果をまとめた図である。
【図１３】ハヤシライス中に重曹を添加し、１００ＭＰａ，７０℃、１５分間高圧処理条件での殺菌効果試験を行なった結果をまとめた図である（試験例８−１）。
【図１４】ハヤシライス中に重曹を添加し、２００ＭＰａ，７０℃、１５分間高圧処理条件での殺菌効果試験を行なった結果をまとめた図である（試験例８−２）。
【図１５】ゴボウ中にアミノ酸及び重曹を添加し、１００ＭＰａ，７０℃、１５分間高圧処理条件での殺菌効果試験を行なった結果をまとめた図である（試験例８−３）。
【図１６】ゴボウ中にアミノ酸及び重曹を添加し、２００ＭＰａ，７０℃、１５分間高圧処理条件での殺菌効果試験を行なった結果をまとめた図である（試験例８−４）。
【図１７】アミノ酸及び重曹添加後、高圧処理及び加熱処理によるクロストリジウム・ボツリナム（６２Ａ：Ａ型毒産生株）の殺菌効果試験の結果をまとめた図である（試験例９−１）。
【図１８】アミノ酸及び重曹添加後、高圧処理及び加熱処理によるクロストリジウム・ボツリナム（２１３Ｂ：Ｂ型毒産生株）の殺菌効果試験の結果をまとめた図である（試験例９−２）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、従来の高圧処理法では十分に殺菌することのできなかった芽胞菌、特に食品の安全性の面で問題となるとともに、耐熱性及び耐圧性の非常に高い芽胞を有するクロストリジウム・ボツリナム等のクロストリジウム属菌に関し、特にその芽胞の発芽に着目してなされたものである。すなわち、クロストリジウム・ボツリナム等のクロストリジウム属菌が形成する芽胞は、耐熱性及び耐圧性が非常に高いものの、芽胞そのままの状態では増殖することはなく、代謝も非常に小さい。しかしながら、生育に適した環境になると芽胞が発芽し、通常の代謝増殖能を有する栄養細胞となる。ここで、芽胞の状態では耐熱性及び耐圧性が高いために殺菌処理が非常に難しいものの、発芽した栄養細胞の状態であれば比較的低温で加熱することによって殺菌することができる。したがって、芽胞菌が形成した芽胞を効率よく発芽させることができれば、低温加熱処理によって芽胞菌を十分に殺菌することが可能となる。
【００１７】
本発明の殺菌方法では、システイン等の特定種のアミノ酸を添加した状態で、高圧処理を行うことによって、高耐熱性、高耐圧性の芽胞菌が形成する芽胞を効率よく発芽させることができる。さらにその後、比較的低温で加熱処理を行うことによって、発芽した芽胞菌を効果的に殺菌することができる。これにより、従来の高圧処理法では殺菌が非常に困難であった高耐熱性、高耐圧性の芽胞菌を十分に殺菌することができ、また、高温での加熱処理を行わないため、食品の味や香り、食感を損なうことがない。
【００１８】
このため、本発明にかかる食品の殺菌方法は、殺菌対象となる食品中に、システイン、アラニン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、ロイシン、及びグリシンから選ばれる１種又は２種以上のアミノ酸を添加した後、５０〜６００ＭＰａの圧力で１〜１２０分間処理する高圧処理工程と、前記高圧処理工程後、６０〜１００℃の温度で５分間以上加熱する低温殺菌処理工程とを備えることを特徴としている。
【００１９】
本発明の殺菌方法においては、特に芽胞菌を含む微生物による汚染が問題となり、且つ高圧処理可能な食品が対象となる。本発明の殺菌方法の対象となる食品としては、特に限定されるものではないが、例えば、液状食品、半流動食品等がある。液状食品としては、清涼飲料水、炭酸飲料、栄養ドリンク、コンソメスープ、ミネストローネ、味噌汁、お吸い物等の粘性のない液体を含む食品が挙げられる。また、半流動食品としては、カレー、シチュー、おかゆ、あんかけ、ゼリー、フルーツソース等の粘性のある液体を含む食品が挙げられる。一方で、固形食品の場合には、通常、食品の内部までアミノ酸を均一に浸透させることは難しく、内部まで十分な殺菌効果を得ることは難しいものの、外表面のみであれば殺菌効果が得られるため、この範囲内であれば、本発明の殺菌方法を適用することができる。
【００２０】
なお、殺菌対象となる食品のｐＨは５．０〜９．０の範囲であることが望ましい。この範囲を逸脱すると、すなわち、低ｐＨ又は高ｐＨ環境では芽胞の発芽が生じ得ず、著しく殺菌効果に劣る場合がある。また、食品の水分活性は０．９４以上にあることが望ましい。これよりも水分活性が低いと、低ｐＨ又は高ｐＨの場合と同様に、芽胞の発芽が生じない環境条件となり、殺菌効果が得られない場合がある。
【００２１】
〈高圧処理工程〉
本発明の殺菌方法においては、高圧処理に先立って、殺菌対象となる食品中に特定種のアミノ酸を添加する。なお、特定種のアミノ酸は食品中で均一になるように添加・混合する必要がある。アミノ酸としては、システイン、アラニン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、ロイシン、又はグリシンのいずれかのアミノ酸を適宜選択して使用することができる。また、これらのアミノ酸の２種以上を組み合わせて用いても構わない。食品中に添加するアミノ酸の量は、食品中、０．０１〜０．１５ｍｏｌ／ｌであることが好ましい。アミノ酸の添加量が、食品中０．０１ｍｏｌ／ｌよりも少ないと、高圧処理を行っても芽胞を効率的に発芽させることができず、十分な殺菌効果が得られない場合があり、一方で、食品中０．１５ｍｏｌ／ｌよりも多く添加しても、これ以上の殺菌効果の向上はみられず、むしろ食品の風味等に悪影響を及ぼす場合がある。なお、アミノ酸の種類によって殺菌効果に差があり、効果的に殺菌可能な順に、システイン、アラニン、メチオニン、フェニルアラニン、ロイシン、セリン、グリシンとなる。なお、殺菌対象とする食品中にすでにアミノ酸が０．１５ｍｏｌ／ｌ以上含まれている場合には、さらにアミノ酸を添加しても殺菌効果がそれ以上改善されない場合がある。このため、本発明においては、特にアミノ酸０．１５ｍｏｌ／ｌ未満の食品を殺菌対象とした場合に、有利な殺菌改善効果が得られる。
【００２２】
つづいて、上記特定種のアミノ酸を添加した食品を高圧処理する。高圧処理は、５０〜６００ＭＰａの圧力で１〜１２０分間行う。より好ましくは、１００〜６００ＭＰａの圧力で１０〜１２０分間高圧処理を行う。高圧処理時の圧力が５０ＭＰａより小さいと、芽胞の発芽が十分でなく、殺菌効果が不十分となる場合がある。一方で、圧力が高すぎても発芽が抑制される傾向にあり、６００ＭＰａを超える圧力で処理した場合、芽胞の発芽が抑制されて、殺菌効果が不十分となる場合があることに加え、現在市販のされている食品加工用の高圧処理装置の多くが限界圧力６００ＭＰａであり、これ以上の圧力処理は現実的でない。また、処理時間は、１分間未満であると、芽胞の発芽が十分でなく、殺菌効果が不十分となる場合があり、一方で、１２０分間を超えて処理しても、これ以上の発芽効果は得られない一方で、処理が過剰となり、食品の味や香り、食感を損なう恐れがある。
【００２３】
また、高圧処理時の温度は４０〜８０℃とすることが望ましい。４０℃未満では、芽胞菌が発芽し難い場合があり、一方で、８０℃を超えると、熱による食品へのダメージが大きく、食品の味や香り、食感が劣化するほか、装置にもダメージを与え、エネルギーロスが大きくなる。高圧処理時の温度は、殺菌対象となる食品の量、種類、粘度などによって適宜決定することができる。また、高圧処理を行う前に、湯煎機など加温装置を用いて、予め食品を高圧処理の温度まで加温しておくことが望ましい。加温は食品の中心温度が目的の温度に達するまで行う。高圧処理装置としては、上記の圧力及び温度条件を達成できる装置であれば、いずれのものを用いてもよい。
【００２４】
なお、本発明の殺菌方法においては、上記特定種のアミノ酸を添加した状態で、高圧処理を行うことが特に重要である。すなわち、アミノ酸を添加した状態で、高圧処理を行なうことによって、クロストリジウム属菌のような高耐熱性、高耐圧性の芽胞菌を効率よく発芽させることができるのであって、アミノ酸添加単独、あるいは高圧処理単独では、芽胞菌を十分に発芽させることはできない。また、高圧処理した後にアミノ酸を添加した場合であっても、芽胞を効率的に発芽することができないため、殺菌が不十分となる。
【００２５】
また、本発明の殺菌方法においては、殺菌対象となる食品に対し、上記特定種のアミノ酸に加えて、さらに重曹（炭酸水素ナトリウム）を添加することが好適である。アミノ酸に加え、さらに重層を添加することによって、アミノ酸を単独で使用した場合と比較して、さらに殺菌効果が改善される。食品中に添加する重曹の量は、食品中、０．２〜１．０ｍｏｌ／ｌであることが好ましい。重曹の添加量が、食品中０．２ｍｏｌ／ｌよりも少ないと、殺菌効果が改善されない場合があり、一方で、食品中１．０ｍｏｌ／ｌよりも多く添加すると、むしろ食品の風味等に悪影響を及ぼす場合がある。
【００２６】
なお、殺菌対象とする食品中にアミノ酸が０．０１ｍｏｌ／ｌ以上含まれている場合であっても、さらに重層を添加して高圧処理を行なうことによって、殺菌効果が改善される。このため、アミノ酸を０．０１ｍｏｌ／ｌ以上含む食品を殺菌対象である場合に、重曹を添加した上で、以上と同様にして高圧処理を行なうことによって、優れた殺菌効果が得られ、このような殺菌方法についても本発明の範疇である。
【００２７】
〈低温殺菌処理工程〉
つづく低温殺菌処理工程では、前記高圧処理工程後の食品を６０〜１００℃で、５分間以上加熱する。より好ましくは、７０〜９５℃で、５〜３０分間加熱処理を行う。６０〜１００℃の温度で加熱することによって、前記高圧処理工程により発芽した芽胞菌を十分に殺菌することができ、これに加えてカビや酵母、無芽胞菌等についても殺菌することができる。なお、加熱する温度や時間は、殺菌対象となる食品の量、種類、粘度等によって適宜決定される。温度が６０℃よりも低い、あるいは加熱時間が５分より短いと、発芽した芽胞菌を十分に殺菌することができない場合がある。一方で、１００℃を超える温度で加熱処理した場合、熱による食品へのダメージが大きく、食品の味や香り、食感が劣化してしまう。
【００２８】
また、低温殺菌処理工程の後、食品を適切な貯蔵温度まで速やかに冷却することによって保存性をより向上させることができる。あるいは、製造上の都合等により、高圧処理工程の後、低温殺菌処理工程を行うまでに時間が必要な場合は、高圧処理工程後に食品を冷却し、数時間〜１日程度冷蔵した後、低温殺菌処理工程を行っても、ほぼ同様の殺菌効果が得られる。
【００２９】
なお、本発明の殺菌方法において、殺菌対象となる食品は、予め容器に充填した状態で前記高圧処理工程及び低温殺菌処理工程を行ってもよく、あるいは全工程を終了後、殺菌済みの食品を殺菌済みの容器に無菌的に充填して製品としてもよい。なお、通常の場合、食品を容器に充填した状態で、前記高圧処理工程及び低温殺菌処理工程を行うことが、製造上望ましい。すなわち、殺菌対象となる食品を容器に充填し、上記特定種のアミノ酸を容器中に添加・混合した後、封入する。そして、この食品を封入した容器に対して、前記高圧処理工程及び低温殺菌処理工程を行う。
【００３０】
予め食品を容器に充填した状態で、前記高圧処理工程及び低温殺菌処理工程を行う場合、食品を充填する容器は、高圧処理可能な容器である必要がある。高圧処理可能な容器とは、すなわち、外部からかけた圧力が容器を介して間接的に内部の食品に作用する必要があり、且つ圧力によって穴が開いたり、壊れたり、溶けたりしない容器である。また、高圧処理につづいて低温殺菌処理を行うため、加熱により容器内の食品へと熱が伝わる必要があり、且つ加熱によって溶けたり、穴が開いたり、壊れたりしない必要がある。このような容器として、具体的には、加圧による体積変化が許容可能な缶等の金属容器、あるいはプラスチックカップ、パウチ等の軟包装容器が挙げられる。また、長期間の保存を可能とするためには、ガスや光に対するバリア性を有する容器が望ましい。
【実施例１】
【００３１】
以下、本発明にかかる食品の殺菌方法の実施例を挙げてさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
最初に本実施例において用いた試験条件および試験方法について説明する。
【００３２】
〈供試菌株〉
供試菌株として、強力な毒素を産生することから、食品の安全性に関わる最も重要な微生物であり、極めて強い耐圧性を持つ嫌気性芽胞菌であるクロストリジウム・ボツリナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）の加熱殺菌実験における代替菌として使用され、且つ強い耐圧性を持つ嫌気性芽胞菌であり、腐敗菌の一種でもあるクロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）を用いた。
【００３３】
〈供試菌液の調製〉
クロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ ＮＢＲＣ１４２９３）は、５ｍｌのＴＰ培地（５％ Ｔｒｉｐｔｉｃａｓｅ ｐｅｐｔｏｎｅ、 ０．５％ Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ、０．１２５％リン酸水素二カリウムｐＨ７．５）に接種し、３５℃で１晩かけて培養した（第一培養菌液）。その後、第一培養菌液１ｍｌを９ｍｌの新しいＴＰ培地に移し、４時間培養した（第二培養菌液）。続いて、第二培養菌液１０ｍｌを９０ｍｌの新しいＴＰ培地に移し、４時間培養した（第三培養菌液）。最後に、第三培養菌液１００ｍｌを９００ｍｌの新しいＴＰ培地に移し、２日間培養した（第四培養菌液）。培養はすべて嫌気条件下で行った。最後の２日間だけ、エージレス（ＦＸ、三菱ガス化学株式会社、東京）を用いて脱酸素した。その他は、ガス（１０％水素＋１０％二酸化炭素＋８０％窒素）置換を行った。第四培養菌液は、芽胞形成していることを顕微鏡で確認した後に、遠心分離（４℃で１２０００ｒｐｍ、１０分間）して菌を沈殿させ、上清を捨て滅菌蒸留水を３０ｍｌ加えて洗浄した。洗浄は、５回繰り返した。洗浄後、１５ｍｌ遠沈管に菌液を５ｍｌずつ分注し、−１６℃で冷凍保存した。菌液は、３０℃の温浴中に１０分間浸して解凍して１００μｌのＰＣＲチューブに分注し、８０℃、１０分間加熱して栄養細胞を死滅させてから４℃まで冷却させ、再び−１６℃のフリーザーに入れ凍結保存し、使用した。
【００３４】
〈試験方法〉
１ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）をフレキシブルパウチに入れ、上記で作製したクロストリジウム・スポロゲネスの菌液を１０μｌ入れ、さらにアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、又はバリンのうち一種類を０．０８ｍｏｌ／ｌの濃度になるように添加し、空気が入らないようにヒートシールし、下記に示す各種処理条件で処理を実施した。
上記処理後の各処理パウチから、クロストリジウム・スポロゲネス入りの溶液を分取し、０．８５％生理食塩水で適宜希釈し、希釈溶液と寒天を除いたクロストリジア測定用培地（日水製薬株式会社、東京）を試験管に１：１で混合し、アルミキャップを乗せ、嫌気条件下で４日間、３５℃培養した。菌数は５本最確数法で測定した。
また、以上のようにして測定した処理後の菌数と初発の菌数について、ｌｏｇ（Ｎ［処理後菌数］／Ｎ０［初発菌数］）を算出し、殺菌効果とした。
【００３５】
〈処理条件〉
以下の条件での処理を実施した。
試験例１−１：各種アミノ酸を０．０８ｍｏｌ／ｌとなるように添加し、１００ＭＰａ、４５℃で１２０分間高圧処理後、８０℃、１０分加熱処理
試験例１−２：各種アミノ酸を０．０８ｍｏｌ／ｌとなるように添加し、２００ＭＰａ、４５℃で１２０分間高圧処理後、８０℃、１０分加熱処理
試験例１−３：各種アミノ酸を０．０８ｍｏｌ／ｌとなるように添加し、４００ＭＰａ、４５℃で１２０分間高圧処理後、８０℃、１０分加熱処理
試験例１−４：各種アミノ酸を０．０８ｍｏｌ／ｌとなるように添加し、０．１ＭＰａ、４５℃で１２０分間高圧処理後、８０℃、１０分加熱処理
なお、上記試験例１−１〜１−４については、比較のため、アミノ酸無添加の条件で同様の試験を行なった。
【００３６】
〈試験結果〉
試験例１−１〜１−４の試験結果を下記表１及び図１〜４にそれぞれ示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
表１及び図１〜４に示すように、アミノ酸を添加せずに高圧処理、低温加熱処理を行った条件では、いずれも菌数は１桁以上減少しなかったが、０．０８Ｍのシステイン、アラニン、セリン、メチオニン、フェニルアラニン、グリシン、又はロイシンを添加して高圧処理、低温加熱処理を行なった試験例１−１〜１−３の条件では、菌数が１桁以上減少した。より具体的には、システインで４桁以上、アラニン、セリン、メチオニンで３桁以上、フェニルアラニン、グリシン、ロイシンで２桁以上まで減少した。一方で、高圧処理を行なわなかった試験例１−４の条件では、アミノ酸の添加の有無に関わらず生残数の減少は見られなかった。８０℃，１０分間の低温加熱処理では胞子は死滅しないことから、アミノ酸と高圧処理が相乗的に発芽を促し、つづく低温加熱処理によって発芽した栄養細胞が殺菌されたものと考えられる。また、１００〜４００ＭＰａで高圧処理、低温加熱処理した試験例１−１〜１−３のうち、２００ＭＰａで処理した試験例１−２の場合において最も高い殺菌効果が得られた。
【実施例２】
【００３９】
つづいて、上記試験において特に殺菌改善効果の見られたアミノ酸４種（アラニン、グリシン、システイン、及びセリン）を添加した上で、高圧処理中の温度を変化させて同様の試験を行うことによって、高圧処理中の最適温度について検討した。
〈試験方法〉
上記実施例１と同様にして、クロストリジウム・スポロゲネス菌液を緩衝液とともに封入したパウチに、上記各種アミノ酸（アラニン、グリシン、システイン、セリンのうち１種類）をそれぞれ０．０８ｍｏｌ／ｌとなるように添加し、温度２０〜７０℃（２０，４５，７０℃）、圧力１００〜２００ＭＰａ（１００Ｐａ，２００Ｐａ）の条件で１２０分間高圧処理後、８０℃、１０分間低温加熱処理した。
なお、比較試験として、低圧処理条件（０．１ＭＰａ、２０〜７０℃、１２０分処理）、及びアミノ酸無添加処理条件で上記同様の試験を行った。
〈試験結果〉
上記各温度、各圧力条件で処理した場合の殺菌効果の試験結果を表２に示す。
【００４０】
【表２】
【００４１】
表２に示すように、２０℃の条件で高圧処理した場合、上記４種類のアミノ酸を添加しても殺菌効果は小さく、生残菌数の減少は１〜２桁程度であった。４５℃で高圧処理を行なった場合、アミノ酸添加による殺菌効果の改善が顕著にみられ、特にアラニン、システインを添加して１００〜２００ＭＰａの条件で高圧処理した場合、生残菌数は３〜５桁減少した。７０℃高圧処理の場合、アミノ酸添加によるの殺菌改善効果はさらに向上しており、特に２００ＭＰａ処理条件では生残菌数が５桁以上減少した。
【実施例３】
【００４２】
つづいて、高圧処理工程における圧力を変化させて同様の試験を行うことによって、好適な処理圧力について検討した。
〈試験方法〉
上記実施例１と同様にして、クロストリジウム・スポロゲネス菌液を緩衝液とともに封入したパウチに、アミノ酸３種類（アラニン、グリシン、システイン）をそれぞれ０．０８ｍｏｌ／ｌの濃度になるように添加し、圧力２５〜４００ＭＰａ（２５，５０，１００，２００，４００，５００，６００ＭＰａ）、温度７０℃の条件で１２０分間高圧処理後、８０℃で１０分間加熱処理した。
〈試験結果〉
上記各圧力条件で処理した場合の殺菌効果の試験結果を表３及び図５に示す。
【００４３】
【表３】
【００４４】
上記表３及び図５に示すように、圧力が大きくなるとともに、低温加熱処理後の生菌数が減少した。システインを添加した場合、５０ＭＰａ以上で明らかな殺菌効果が得られ、５０ＭＰａでは約３桁、１００〜６００ＭＰａでは５桁以上の減少がみられた。アラニン、グリシンを添加した場合、５０ＭＰａでは効果がなかったものの、アラニンでは１００ＭＰａ以上で５桁以上、グリシンでは２００ＭＰａ以上で５桁以上の殺菌効果が得られた。
【実施例４】
【００４５】
さらに、高圧処理工程の時間を変化させて同様の試験を行うことによって、好適な処理時間について検討した。
〈試験方法〉
試験例４−１：上記実施例１と同様にして、クロストリジウム・スポロゲネス菌液を緩衝液とともに封入したパウチにアミノ酸４種類（アラニン、グリシン、システイン、セリン）をそれぞれ０．０８ｍｏｌ／ｌの濃度になるように添加し、圧力２００ＭＰａ、温度４５℃の条件で、３０〜１２０分間（３０，６０，１２０分間）高圧処理後、８０℃、１０分間加熱処理した。
試験例４−２：上記試験同様にクロストリジウム・スポロゲネス菌液及びアミノ酸４種を添加したパウチを、圧力２００ＭＰａ、温度７０℃の条件で、１０〜１２０分間（１０，１５，３０，６０，１２０分間）高圧処理後、８０℃、１０分間加熱処理した。
〈試験結果〉
上記試験例４−１の試験結果を表４及び図６に、上記試験例４−２の試験結果を表５及び図７に示す。
【００４６】
【表４】
【００４７】
【表５】
【００４８】
上記表４及び図６に示すように、２００ＭＰａ，４５℃で高圧処理した場合、高圧処理時間が長くなるほど、処理後の生菌数が減少した。システインを添加した場合、６０分後には約４桁減少した。また、アラニン、セリンを添加した場合、１２０分後には４桁以上減少した。グリシンを添加した場合、６０分後に約３桁減少した。
さらに、上記表５及び図７に示すように、２００ＭＰａ，７０℃で高圧処理した場合、２００ＭＰａ，４５℃で高圧処理した場合と比べて、極めて短時間で生菌数が減少した。アラニン、システイン、セリンを添加した場合、３０分後には約５桁の減少が見られた。また、グリシンを添加した場合、６０分後で約５桁の減少が見られた。
【実施例５】
【００４９】
さらに、高圧処理工程におけるアミノ酸濃度を変化させて同様の試験を行うことによって、好適な処理濃度について検討した。
〈試験方法〉
試験例５−１：上記実施例１と同様にして、クロストリジウム・スポロゲネス菌液を緩衝液とともに封入したパウチに、上記実施例１において効果の認められた７種類のアミノ酸（アラニン、セリン、グリシン、メチオニン、ロイシン、フェニルアラニン、システイン）を、それぞれ０．００１〜０．０８ｍｏｌ／ｌになるように添加し、圧力２００ＭＰａ，温度４５℃で１２０分間高圧処理後、８０℃、１０分間低温加熱処理した。
試験例５−２：上記試験と同様にクロストリジウム・スポロゲネス菌液にアミノ酸７種を各種濃度で添加したパウチを、圧力２００ＭＰａ，温度７０℃で１５分間高圧処理後、８０℃、１０分間低温加熱処理した。
〈試験結果〉
上記試験例５−１の試験結果を表６及び図８に、上記試験例５−２の試験結果を表７及び図９に示す。
【００５０】
【表６】
【００５１】
【表７】
【００５２】
上記表６及び図８に示すように、２００ＭＰａ，４５℃で１２０分間高圧処理した場合、０．０１〜０．０２ｍｏｌ／ｌまではアミノ酸濃度の増加とともに殺菌効果が向上した。なお、これよりも高い濃度添加した場合であっても殺菌効果はほとんど変わらず、また、低下することもなかった。
また、上記表７及び図９に示すように、２００ＭＰａ、７０℃で１０分間高圧処理した場合も、２００ＭＰａ，４５℃で１２０分間高圧処理した場合と同様に、０．０１〜０．０２ｍｏｌ／ｌより高い濃度では効果はほとんど変わらなかった。以上の結果から、アミノ酸の添加濃度は、０．０１〜０．０２ｍｏｌ／ｌであることが望ましいと考えられる。
【実施例６】
【００５３】
つづいて、アミノ酸に加えて、さらに重曹（炭酸水素ナトリウム）を同時に添加して高圧処理を行なうことによって、アミノ酸と重曹との相乗効果について検討した。
〈試験方法〉
試験例６−１：上記実施例１と同様にして、クロストリジウム・スポロゲネス菌液を緩衝液とともに封入したパウチに、（１）グリシン０．０８ｍｏｌ／ｌ、（２）グリシン０．０８ｍｏｌ／ｌ及び重曹０．４ ｍｏｌ／ｌ、又は（３）重曹０．４ｍｏｌ／ｌを添加した後、１００ＭＰａ，７０℃で１５分間高圧処理後、８０℃、１０分間低温加熱処理した。なお、（１）については、重曹０．４ｍｏｌ／ｌと同等のｐＨ（ｐＨ８．４）に調整した。
試験例６−２：上記試験同様に、クロストリジウム・スポロゲネス菌液に、（１）〜（３）の条件で０．０８ｍｏｌ／ｌグリシン及び／又０．４ｍｏｌ／ｌ重曹を添加し、圧力２００ＭＰａ，温度７０℃で１５分間高圧処理後、８０℃、１０分間低温加熱処理した。
〈試験結果〉
上記試験例６−１の試験結果を表８及び図１０に、上記試験例６−２の試験結果を表９及び図１１に示す。
【００５４】
【表８】
【００５５】
【表９】
【００５６】
上記表８及び図１０に示すように、１００ＭＰａ、７０℃で１５分間高圧処理した場合、（１）グリシン単独では殺菌効果があまり得られず、また、（３）重曹単独ではまったく殺菌効果は得られなかったものも、（２）両者を併用することで、１〜２桁菌数が減少することがわかった。また、（１）グリシン単独添加条件においては、０．４Ｍ重曹添加の場合と同程度のｐＨ８．４へと調整しているにもかかわらず、胞子の発芽が起こらなかったことから、重曹の併用による発芽促進効果は、単純にｐＨの調整によるものではないことが理解される。
他方、上記表９及び図１１に示すように、２００ＭＰａ、７０℃で１５分間高圧処理した場合、（３）重曹単独添加では１桁、（１）グリシン単独添加では３桁程度の減少がみられたのに対し、（２）両者の併用により、菌数は４〜５桁以上減少した。以上の結果から、グリシンと重曹とを組み合わせることで、高圧処理−低温加熱処理の殺菌効果が相乗的に促されていることが明らかとなった。
【実施例７】
【００５７】
さらに、高圧処理工程における重曹の濃度を変化させて同様の試験を行うことによって、好適な処理濃度について検討した。
〈試験方法〉
上記実施例１と同様にして、クロストリジウム・スポロゲネス菌液を緩衝液とともに封入したパウチに、０．０８ｍｏｌ／ｌグリシンに加え、（１）重曹０．４ｍｏｌ／ｌ，（２）重曹０．２ｍｏｌ／ｌ，（３）重曹０．１ｍｏｌ／ｌ，（４）重曹０．０１ｍｏｌ／ｌを添加し、１００ＭＰａ、７０℃で１５分間高圧処理後、８０℃、１０分間低温加熱処理した。
〈試験結果〉
上記各濃度条件で処理した場合の殺菌効果の試験結果を表１０及び図１２に示す。
【００５８】
【表１０】
【００５９】
上記表１０及び図１２に示すように、０．０８ｍｏｌ／ｌのグリシンに加えて、０．０１ ｍｏｌ／ｌ又は０．１ ｍｏｌ／ｌの重曹を添加した場合、殺菌効果は改善しなかったものの、０．２ｍｏｌ／ｌ以上の濃度で重曹を添加することによって、１桁以上の殺菌効果が得られた。
【実施例８】
【００６０】
つづいて、遊離アミノ酸を多く含む食品に重曹を添加、あるいはアミノ酸含有量の比較的少ない食品中にアミノ酸と重曹とを同時に添加して高圧処理を行なうことによって、食品中での殺菌効果について検討した。
〈試験方法〉
試験例８−１：ハヤシライス（２００ＭＰａ高圧処理）
（１）重曹添加区では、フレキシブルパウチにハヤシライス１ｍｌを入れ、重曹を０．４ｍｏｌ／ｌの濃度となるように添加し、クロストリジウム・スポロゲネス胞子を１０μｌ接種してヒートシールし、２００ＭＰａ、７０℃で１５分間高圧処理後、８０℃、１０分間加熱処理した。（２）重曹非添加区では、フレキシブルパウチにハヤシライス１ｍｌを入れ、重曹を添加した時と同様のｐＨ８．４に調製し、クロストリジウム・スポロゲネス胞子を１０μｌ接種してヒートシールし、２００ＭＰａ、７０℃で１５分間高圧処理後、８０℃、１０分間加熱処理した。
試験例８−２：ハヤシライス（１００ＭＰａ高圧処理）
上記試験例８−１と同様の条件で、１００ＭＰａ、７０℃で１５分間高圧処理後、８０℃、１０分間加熱処理した。
【００６１】
試験例８−３：ゴボウ（２００ＭＰａ高圧処理）
（１）アミノ酸添加区では、クロストリジウム・スポロゲネス胞子液（５．４×１０５ｓｐｏｒｅｓ／ｍｌ）に１ｇのゴボウを浸した後、ゴボウの周りにいる微生物を滅菌蒸留水で洗浄し、風乾した後、アラニンを０．０８ｍｏｌ／ｌの濃度になるように添加し、重曹を添加した時と同様のｐＨ８．４に調製した浸漬液に漬け、２００ＭＰａ、７０℃で１５分間高圧処理後、８０℃、１０分間加熱処理した。（２）重曹及びアミノ酸添加区では、クロストリジウム・スポロゲネス胞子液（５．４×１０５ｓｐｏｒｅｓ／ｍｌ）に１ｇのゴボウを浸した後、ゴボウの周りにいる微生物を滅菌蒸留水で洗浄し、風乾した後、重曹を０．４ｍｏｌ／ｌ及びアラニンを０．０８ｍｏｌ／ｌの濃度になるように添加した浸漬液に漬け、２００ＭＰａ、７０℃で１５分間高圧処理後、８０℃、１０分間加熱処理した。（３）重曹添加区では、クロストリジウム・スポロゲネス胞子液（５．４×１０５ｓｐｏｒｅｓ／ｍｌ）に１ｇのゴボウを浸した後、ゴボウの周りにいる微生物を滅菌蒸留水で洗浄し、風乾した後、重曹を０．４ｍｏｌ／ｌの濃度になるように添加した浸漬液に漬け、２００ＭＰａ、７０℃で１５分間高圧処理後、８０℃、１０分間加熱処理した。
試験例８−４：ゴボウ（１００ＭＰａ高圧処理）
上記試験例８−３と同様の条件で、１００ＭＰａ、７０℃で１５分間高圧処理後、８０℃、１０分間加熱処理した。
【００６２】
〈試験結果〉
上記試験例８−１，２の試験結果を表１１及び図１３，１４に、上記試験例８−３，４の試験結果を表１２及び図１５，１６に示す。
【００６３】
【表１１】
【００６４】
【表１２】
【００６５】
表１１及び図１３，１４に示すように、遊離アミノ酸を多く含む食品であるハヤシライスを２００ＭＰａ、７０℃で１５分間高圧処理した場合、重曹を添加することによって４桁以上の殺菌効果が得られた。なお、（２）重曹非添加の３桁と比べても（１）重曹添加によって殺菌効果が改善されていることが確認された。また、１００ＭＰａ，７０℃で１５分間の条件では、（２）重曹非添加の場合は殺菌効果が得られなかったのに対し、（１）重曹添加により１〜２桁の殺菌効果が得られた。
また、表１２及び図１５，１６に示すように、アミノ酸含有量の比較的少ないゴボウを２００ＭＰａ、７０℃で１５分間高圧処理した場合、（３）重曹単独では殺菌効果はほとんど得られていないものの、（１）アラニンを単独添加、あるいは（２）アラニンと重曹との両者を添加すると、生菌数は２桁以上減少し、検出限界以下となった。一方で、１００ＭＰａ、７０℃で１５分間高圧処理した場合、（３）重曹単独又は（１）アラニン単独の添加では効果がなく、（２）アラニンと重曹との併用によって２桁の殺菌効果が得られた。
【実施例９】
【００６６】
〈供試菌株〉
クロストリジウム・ボツリナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）２種を用いた。
〈供試菌液の調製〉
クロストリジウム・ボツリナム（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ６２Ａ（Ａ型毒素産生株）及び２１３Ｂ（Ｂ型毒素産生株）を、ＴＰ培地にて３０℃，１日培養後、室温で３日さらに培養した。胞子の形成は位相差顕微鏡にて確認後、滅菌蒸留水で５回洗浄した。
【００６７】
〈試験方法〉
試験例９−１：Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ６２Ａ（Ａ型毒素産生株）
１ｍｌの処理液（ｐＨ７．０）をフレキシブルパウチに入れ、さらに上記で作成したクロストリジウム・ボツリナム（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ６２Ａ（Ａ型毒素産生株））の菌液１０μｌを入れ、、空気が入らないようにヒートシールし、下記に示す各種処理条件で処理を実施した。
（１）アミノ酸添加区では、アラニンを０．０８ｍｏｌ／ｌの濃度になるように添加し、ｐＨ７．０に調製した上、２００ＭＰａ、７０℃、１５分間高圧処理後、８０℃、１０分間加熱処理した。
（２）重曹及びアミノ酸添加区では、重曹を０．４ｍｏｌ／ｌ及びアラニンを０．０８ｍｏｌ／ｌの濃度になるように添加し、２００ＭＰａ、７０℃で１５分間高圧処理後、８０℃、１０分間低温加熱処理した。
（３）重曹添加区では、重曹を０．４ｍｏｌ／ｌの濃度になるように添加し、２００ＭＰａ、７０℃で１５分間高圧処理後、８０℃、１０分間低温加熱処理した。
（４）アミノ酸・重曹非添加添加区では、アミノ酸及び重曹を添加せず、ｐＨを７．０に調整し、２００ＭＰａ、７０℃で１５分間高圧処理後、８０℃、１０分間低温加熱処理した。
【００６８】
試験例９−２：Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ２１３Ｂ（Ｂ型毒素産生株）
上記試験例９−１と同様の条件で、クロストリジウム・ボツリナム２１３Ｂ（Ｂ型毒素産生株）を用いて、その殺菌効果を調べた。
【００６９】
〈試験結果〉
上記試験例９−１の試験結果を表１３及び図１７に、上記試験例９−２の試験結果を表１４及び図１８に示す。
【００７０】
【表１３】
【００７１】
【表１４】
【００７２】
表１３及び図１７に示すように、クロストリジウム・ボツリナムの６２Ａ株を用いた場合、（２）アラニンと重曹とをともに添加すると１桁の殺菌効果があったものの、他の処理区では有意な殺菌効果が認められなかった。一方で、表１４及び図１８に示すように、クロストリジウム・ボツリナムの２１３Ｂ株を用いた場合では、（４）アミノ酸のみを添加したｐＨ７．０のリン酸緩衝液においても３桁程度の殺菌効果が認められ、さらに（２）アラニンと重曹との両者を添加することによって殺菌効果がさらに改善され、生残菌数が約５桁減少した。これらの結果から、Ｃ.ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓだけでなく、Ｃ. ｂｏｔｕｌｉｎｕｍに対しても、アミノ酸と重曹とを併用することによって、高圧処理−低温加熱処理による殺菌効果が相乗的に促されることが明らかとなった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品の殺菌方法、特に食品の安全性の面で問題となる耐熱性及び耐圧性の高い芽胞を有するクロストリジウム・ボツリナム等の芽胞菌の殺菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品の高圧処理を用いた微生物の殺菌は、１００℃以上の高温加熱殺菌と比べて、食品の味や香り、食感を損なわないことが知られている。加えて、高圧処理殺菌は、加熱処理殺菌に比べてエネルギー効率もよいため、現在までに様々な高圧処理殺菌方法が検討されている。しかしながら、芽胞菌として知られる細菌は、耐圧性を有する芽胞を形成し、高圧処理単独の殺菌では、このような芽胞菌の芽胞を殺菌することは難しい。このため、例えば、高圧処理を用いて芽胞を殺菌する方法として、高圧処理と加熱処理を併用する方法（例えば、特許文献１〜３）、や、高圧処理と添加物などを併用する方法（例えば、特許文献４〜７）等が報告されている。
【０００３】
これらの高圧処理殺菌方法では、圧力に対してあまり強くない芽胞菌、無芽胞菌、カビ、酵母等を殺菌することが可能である。しかしながら、ある種の芽胞菌が形成する芽胞は、耐圧性や耐熱性が極めて高く、先に述べたような従来の高圧処理方法では十分に殺菌することができない。特に、強力な神経毒を産生することから、食品の安全性に関わる最も重要な微生物であり、食品殺菌の指標菌とされているクロストリジウム・ボツリナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）等のクロストリジウム属菌の形成する芽胞は、耐圧性が極めて強く、高圧処理を用いて殺菌することが難しい。
【０００４】
これに対して、高圧処理後にクロストリジウム・ボツリナム等のクロストリジウム属菌の芽胞の発育を抑制する添加物を用いる方法も提案されている（特許文献４）ものの、この方法では芽胞の発育を抑制するのみで殺菌には至っておらず、安全性の面で十分であるとは言えない。一方で、１０００ＭＰａ程度の高圧力処理と１００℃程度の高温での加熱処理を同時に行うことによって、これら芽胞の殺菌が可能であることが報告されている（非特許文献１）。しかしながら、このような高い圧力処理と高温での加熱処理を同時に行なえるような処理装置は、現在のところ実験用の小型装置のみであって、食品製造に実際に用いられるような大型の処理装置においては、同様の高温・高圧処理条件を再現することが困難であるとともに、実用に際してのコスト面での負担も大きい。加えて、高温・高圧で処理しているため、食品の風味や食感が落ちてしまうという問題もある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平４−９１７７０号公報
【特許文献２】特開平５−２２７９２５号公報
【特許文献３】特開２０００−３２９６５号公報
【特許文献４】特開平５−２５２９２０号公報
【特許文献５】特開平８−１８２４８６号公報
【特許文献６】特開平５−２２７９２５号公報
【特許文献７】特開平６−７０７３０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Applied And Environment Microbiology, Vol.72, No.5, p3476-3481, May 2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上に説明したように、従来の高圧殺菌処理方法では、例えば、クロストリジウム・ボツリナム等のクロストリジウム属菌が形成する熱や圧力に強い芽胞を十分に殺菌することは難しく、特にこのような芽胞が生育可能な低酸性の食品の殺菌法として用いるには安全性の面で問題があった。すなわち、本発明の解決しようとする課題は、高耐熱性、高耐圧性の芽胞菌を効果的に殺菌し、且つ食品の味や香り、食感を損なわない食品の殺菌方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らが、前記従来技術の課題に鑑みて鋭意検討を行った結果、食品中にシステイン等の特定種のアミノ酸を添加し、５０〜６００ＭＰａの圧力で高圧処理を行うことによって、高耐熱性、高耐圧性の芽胞菌を効率的に発芽させ、その後、さらに６０〜１００℃で低温殺菌処理することによって、発芽した芽胞菌を効果的に殺菌することができることを見出した。これにより、食品の味や香り、食感を損なうことなく、従来の高圧処理法では殺菌の難しかった高耐熱性、高耐圧性の芽胞菌を十分に殺菌することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明にかかる食品の殺菌方法は、殺菌対象となる食品中に、システイン、アラニン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、ロイシン、及びグリシンから選ばれる１種又は２種以上のアミノ酸を添加した後、５０〜６００ＭＰａの圧力で１〜１２０分間処理する高圧処理工程と、前記高圧処理工程後、６０〜１００℃の温度で５分間以上加熱する低温殺菌処理工程とを備えることを特徴とするものである。
【００１０】
また、前記殺菌方法において、前記アミノ酸を、食品中０．０１〜０．１５ｍｏｌ／ｌ添加することが好適である。
また、前記殺菌方法において、前記アミノ酸としてアラニン及び／又はシステインを用いることが好適である。
【００１１】
また、前記殺菌方法において、前記高圧処理工程の際、前記アミノ酸とともに、重曹を添加した後、高圧処理することが好適である。
また、前記殺菌方法において、前記重曹を、食品中０．２〜１．０ｍｏｌ／ｌ添加することが好適である。
また、前記殺菌方法において、前記アミノ酸の含有量が合計０．１５ｍｏｌ／ｌ未満の食品を殺菌対象とすることが好適である。
【００１２】
また、本発明にかかる食品の殺菌方法は、アミノ酸含有量が合計０．０１ｍｏｌ／ｌ以上の食品中に、重曹を添加した後、５０〜６００ＭＰａの圧力で１〜２４０分間処理する高圧処理工程と、前記高圧処理工程後、６０〜１００℃の温度で５分間以上加熱する低温殺菌処理工程とを備えることを特徴とするものである。
また、前記殺菌方法において、前記重曹を、食品中０．２〜１．０ｍｏｌ／ｌ添加することが好適である。
【００１３】
また、本発明にかかる殺菌方法において、食品中の芽胞菌を殺菌することが好適である。
また、前記殺菌方法において、食品中のクロストリジウム属菌を殺菌することが好適である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明にかかる食品の殺菌方法によれば、食品中にシステイン等の特定種のアミノ酸を添加した状態で、５０〜６００ＭＰａで高圧処理を行い、その後、６０〜１００℃で低温殺菌処理を行うことによって、食品の味や香り、食感を損なうことなく、従来の高圧処理法では殺菌することの難しかった高耐熱性、高耐圧性の芽胞菌を効果的に殺菌することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】０．０８Ｍアミノ酸添加、１００ＭＰａ高圧処理条件での殺菌効果試験の結果をまとめた図である（試験例１−１）。
【図２】０．０８Ｍアミノ酸添加、２００ＭＰａ高圧処理条件での殺菌効果試験の結果をまとめた図である（試験例１−２）。
【図３】０．０８Ｍアミノ酸添加、４００ＭＰａ高圧処理条件での殺菌効果試験の結果をまとめた図である（試験例１−３）。
【図４】０．０８Ｍアミノ酸添加、０．１ＭＰａ処理条件での殺菌効果試験の結果をまとめた図である（試験例１−４）。
【図５】圧力条件を各種変化させ、アミノ酸添加、高圧処理による殺菌効果試験を行なった結果をまとめた図である。
【図６】処理時間を各種変化させ、アミノ酸添加、２００ＭＰａ，４５℃高圧処理条件での殺菌効果試験を行なった結果をまとめた図である（試験例４−１）。
【図７】処理時間を各種変化させ、アミノ酸添加、２００ＭＰａ，７０℃高圧処理条件での殺菌効果試験を行なった結果をまとめた図である（試験例４−２）。
【図８】アミノ酸添加濃度を各種変化させ、２００ＭＰａ，４５℃，１２０分間高圧処理条件での殺菌効果試験を行なった結果をまとめた図である（試験例５−１）。
【図９】アミノ酸添加濃度を各種変化させ、２００ＭＰａ，７０℃，１５分間高圧処理条件での殺菌効果試験を行なった結果をまとめた図である（試験例５−２）。
【図１０】アミノ酸とともに重曹を添加し、１００ＭＰａ，７０℃、１５分間高圧処理条件での殺菌効果試験を行なった結果をまとめた図である（試験例６−１）。
【図１１】アミノ酸とともに重曹を添加し、２００ＭＰａ，７０℃、１５分間高圧処理条件での殺菌効果試験を行なった結果をまとめた図である（試験例６−２）。
【図１２】重曹添加濃度を各種変化させ、１００ＭＰａ，７０℃、１５分間高圧処理条件での殺菌効果試験を行なった結果をまとめた図である。
【図１３】ハヤシライス中に重曹を添加し、１００ＭＰａ，７０℃、１５分間高圧処理条件での殺菌効果試験を行なった結果をまとめた図である（試験例８−１）。
【図１４】ハヤシライス中に重曹を添加し、２００ＭＰａ，７０℃、１５分間高圧処理条件での殺菌効果試験を行なった結果をまとめた図である（試験例８−２）。
【図１５】ゴボウ中にアミノ酸及び重曹を添加し、１００ＭＰａ，７０℃、１５分間高圧処理条件での殺菌効果試験を行なった結果をまとめた図である（試験例８−３）。
【図１６】ゴボウ中にアミノ酸及び重曹を添加し、２００ＭＰａ，７０℃、１５分間高圧処理条件での殺菌効果試験を行なった結果をまとめた図である（試験例８−４）。
【図１７】アミノ酸及び重曹添加後、高圧処理及び加熱処理によるクロストリジウム・ボツリナム（６２Ａ：Ａ型毒産生株）の殺菌効果試験の結果をまとめた図である（試験例９−１）。
【図１８】アミノ酸及び重曹添加後、高圧処理及び加熱処理によるクロストリジウム・ボツリナム（２１３Ｂ：Ｂ型毒産生株）の殺菌効果試験の結果をまとめた図である（試験例９−２）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、従来の高圧処理法では十分に殺菌することのできなかった芽胞菌、特に食品の安全性の面で問題となるとともに、耐熱性及び耐圧性の非常に高い芽胞を有するクロストリジウム・ボツリナム等のクロストリジウム属菌に関し、特にその芽胞の発芽に着目してなされたものである。すなわち、クロストリジウム・ボツリナム等のクロストリジウム属菌が形成する芽胞は、耐熱性及び耐圧性が非常に高いものの、芽胞そのままの状態では増殖することはなく、代謝も非常に小さい。しかしながら、生育に適した環境になると芽胞が発芽し、通常の代謝増殖能を有する栄養細胞となる。ここで、芽胞の状態では耐熱性及び耐圧性が高いために殺菌処理が非常に難しいものの、発芽した栄養細胞の状態であれば比較的低温で加熱することによって殺菌することができる。したがって、芽胞菌が形成した芽胞を効率よく発芽させることができれば、低温加熱処理によって芽胞菌を十分に殺菌することが可能となる。
【００１７】
本発明の殺菌方法では、システイン等の特定種のアミノ酸を添加した状態で、高圧処理を行うことによって、高耐熱性、高耐圧性の芽胞菌が形成する芽胞を効率よく発芽させることができる。さらにその後、比較的低温で加熱処理を行うことによって、発芽した芽胞菌を効果的に殺菌することができる。これにより、従来の高圧処理法では殺菌が非常に困難であった高耐熱性、高耐圧性の芽胞菌を十分に殺菌することができ、また、高温での加熱処理を行わないため、食品の味や香り、食感を損なうことがない。
【００１８】
このため、本発明にかかる食品の殺菌方法は、殺菌対象となる食品中に、システイン、アラニン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、ロイシン、及びグリシンから選ばれる１種又は２種以上のアミノ酸を添加した後、５０〜６００ＭＰａの圧力で１〜１２０分間処理する高圧処理工程と、前記高圧処理工程後、６０〜１００℃の温度で５分間以上加熱する低温殺菌処理工程とを備えることを特徴としている。
【００１９】
本発明の殺菌方法においては、特に芽胞菌を含む微生物による汚染が問題となり、且つ高圧処理可能な食品が対象となる。本発明の殺菌方法の対象となる食品としては、特に限定されるものではないが、例えば、液状食品、半流動食品等がある。液状食品としては、清涼飲料水、炭酸飲料、栄養ドリンク、コンソメスープ、ミネストローネ、味噌汁、お吸い物等の粘性のない液体を含む食品が挙げられる。また、半流動食品としては、カレー、シチュー、おかゆ、あんかけ、ゼリー、フルーツソース等の粘性のある液体を含む食品が挙げられる。一方で、固形食品の場合には、通常、食品の内部までアミノ酸を均一に浸透させることは難しく、内部まで十分な殺菌効果を得ることは難しいものの、外表面のみであれば殺菌効果が得られるため、この範囲内であれば、本発明の殺菌方法を適用することができる。
【００２０】
なお、殺菌対象となる食品のｐＨは５．０〜９．０の範囲であることが望ましい。この範囲を逸脱すると、すなわち、低ｐＨ又は高ｐＨ環境では芽胞の発芽が生じ得ず、著しく殺菌効果に劣る場合がある。また、食品の水分活性は０．９４以上にあることが望ましい。これよりも水分活性が低いと、低ｐＨ又は高ｐＨの場合と同様に、芽胞の発芽が生じない環境条件となり、殺菌効果が得られない場合がある。
【００２１】
〈高圧処理工程〉
本発明の殺菌方法においては、高圧処理に先立って、殺菌対象となる食品中に特定種のアミノ酸を添加する。なお、特定種のアミノ酸は食品中で均一になるように添加・混合する必要がある。アミノ酸としては、システイン、アラニン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、ロイシン、又はグリシンのいずれかのアミノ酸を適宜選択して使用することができる。また、これらのアミノ酸の２種以上を組み合わせて用いても構わない。食品中に添加するアミノ酸の量は、食品中、０．０１〜０．１５ｍｏｌ／ｌであることが好ましい。アミノ酸の添加量が、食品中０．０１ｍｏｌ／ｌよりも少ないと、高圧処理を行っても芽胞を効率的に発芽させることができず、十分な殺菌効果が得られない場合があり、一方で、食品中０．１５ｍｏｌ／ｌよりも多く添加しても、これ以上の殺菌効果の向上はみられず、むしろ食品の風味等に悪影響を及ぼす場合がある。なお、アミノ酸の種類によって殺菌効果に差があり、効果的に殺菌可能な順に、システイン、アラニン、メチオニン、フェニルアラニン、ロイシン、セリン、グリシンとなる。なお、殺菌対象とする食品中にすでにアミノ酸が０．１５ｍｏｌ／ｌ以上含まれている場合には、さらにアミノ酸を添加しても殺菌効果がそれ以上改善されない場合がある。このため、本発明においては、特にアミノ酸０．１５ｍｏｌ／ｌ未満の食品を殺菌対象とした場合に、有利な殺菌改善効果が得られる。
【００２２】
つづいて、上記特定種のアミノ酸を添加した食品を高圧処理する。高圧処理は、５０〜６００ＭＰａの圧力で１〜１２０分間行う。より好ましくは、１００〜６００ＭＰａの圧力で１０〜１２０分間高圧処理を行う。高圧処理時の圧力が５０ＭＰａより小さいと、芽胞の発芽が十分でなく、殺菌効果が不十分となる場合がある。一方で、圧力が高すぎても発芽が抑制される傾向にあり、６００ＭＰａを超える圧力で処理した場合、芽胞の発芽が抑制されて、殺菌効果が不十分となる場合があることに加え、現在市販のされている食品加工用の高圧処理装置の多くが限界圧力６００ＭＰａであり、これ以上の圧力処理は現実的でない。また、処理時間は、１分間未満であると、芽胞の発芽が十分でなく、殺菌効果が不十分となる場合があり、一方で、１２０分間を超えて処理しても、これ以上の発芽効果は得られない一方で、処理が過剰となり、食品の味や香り、食感を損なう恐れがある。
【００２３】
また、高圧処理時の温度は４０〜８０℃とすることが望ましい。４０℃未満では、芽胞菌が発芽し難い場合があり、一方で、８０℃を超えると、熱による食品へのダメージが大きく、食品の味や香り、食感が劣化するほか、装置にもダメージを与え、エネルギーロスが大きくなる。高圧処理時の温度は、殺菌対象となる食品の量、種類、粘度などによって適宜決定することができる。また、高圧処理を行う前に、湯煎機など加温装置を用いて、予め食品を高圧処理の温度まで加温しておくことが望ましい。加温は食品の中心温度が目的の温度に達するまで行う。高圧処理装置としては、上記の圧力及び温度条件を達成できる装置であれば、いずれのものを用いてもよい。
【００２４】
なお、本発明の殺菌方法においては、上記特定種のアミノ酸を添加した状態で、高圧処理を行うことが特に重要である。すなわち、アミノ酸を添加した状態で、高圧処理を行なうことによって、クロストリジウム属菌のような高耐熱性、高耐圧性の芽胞菌を効率よく発芽させることができるのであって、アミノ酸添加単独、あるいは高圧処理単独では、芽胞菌を十分に発芽させることはできない。また、高圧処理した後にアミノ酸を添加した場合であっても、芽胞を効率的に発芽することができないため、殺菌が不十分となる。
【００２５】
また、本発明の殺菌方法においては、殺菌対象となる食品に対し、上記特定種のアミノ酸に加えて、さらに重曹（炭酸水素ナトリウム）を添加することが好適である。アミノ酸に加え、さらに重層を添加することによって、アミノ酸を単独で使用した場合と比較して、さらに殺菌効果が改善される。食品中に添加する重曹の量は、食品中、０．２〜１．０ｍｏｌ／ｌであることが好ましい。重曹の添加量が、食品中０．２ｍｏｌ／ｌよりも少ないと、殺菌効果が改善されない場合があり、一方で、食品中１．０ｍｏｌ／ｌよりも多く添加すると、むしろ食品の風味等に悪影響を及ぼす場合がある。
【００２６】
なお、殺菌対象とする食品中にアミノ酸が０．０１ｍｏｌ／ｌ以上含まれている場合であっても、さらに重層を添加して高圧処理を行なうことによって、殺菌効果が改善される。このため、アミノ酸を０．０１ｍｏｌ／ｌ以上含む食品を殺菌対象である場合に、重曹を添加した上で、以上と同様にして高圧処理を行なうことによって、優れた殺菌効果が得られ、このような殺菌方法についても本発明の範疇である。
【００２７】
〈低温殺菌処理工程〉
つづく低温殺菌処理工程では、前記高圧処理工程後の食品を６０〜１００℃で、５分間以上加熱する。より好ましくは、７０〜９５℃で、５〜３０分間加熱処理を行う。６０〜１００℃の温度で加熱することによって、前記高圧処理工程により発芽した芽胞菌を十分に殺菌することができ、これに加えてカビや酵母、無芽胞菌等についても殺菌することができる。なお、加熱する温度や時間は、殺菌対象となる食品の量、種類、粘度等によって適宜決定される。温度が６０℃よりも低い、あるいは加熱時間が５分より短いと、発芽した芽胞菌を十分に殺菌することができない場合がある。一方で、１００℃を超える温度で加熱処理した場合、熱による食品へのダメージが大きく、食品の味や香り、食感が劣化してしまう。
【００２８】
また、低温殺菌処理工程の後、食品を適切な貯蔵温度まで速やかに冷却することによって保存性をより向上させることができる。あるいは、製造上の都合等により、高圧処理工程の後、低温殺菌処理工程を行うまでに時間が必要な場合は、高圧処理工程後に食品を冷却し、数時間〜１日程度冷蔵した後、低温殺菌処理工程を行っても、ほぼ同様の殺菌効果が得られる。
【００２９】
なお、本発明の殺菌方法において、殺菌対象となる食品は、予め容器に充填した状態で前記高圧処理工程及び低温殺菌処理工程を行ってもよく、あるいは全工程を終了後、殺菌済みの食品を殺菌済みの容器に無菌的に充填して製品としてもよい。なお、通常の場合、食品を容器に充填した状態で、前記高圧処理工程及び低温殺菌処理工程を行うことが、製造上望ましい。すなわち、殺菌対象となる食品を容器に充填し、上記特定種のアミノ酸を容器中に添加・混合した後、封入する。そして、この食品を封入した容器に対して、前記高圧処理工程及び低温殺菌処理工程を行う。
【００３０】
予め食品を容器に充填した状態で、前記高圧処理工程及び低温殺菌処理工程を行う場合、食品を充填する容器は、高圧処理可能な容器である必要がある。高圧処理可能な容器とは、すなわち、外部からかけた圧力が容器を介して間接的に内部の食品に作用する必要があり、且つ圧力によって穴が開いたり、壊れたり、溶けたりしない容器である。また、高圧処理につづいて低温殺菌処理を行うため、加熱により容器内の食品へと熱が伝わる必要があり、且つ加熱によって溶けたり、穴が開いたり、壊れたりしない必要がある。このような容器として、具体的には、加圧による体積変化が許容可能な缶等の金属容器、あるいはプラスチックカップ、パウチ等の軟包装容器が挙げられる。また、長期間の保存を可能とするためには、ガスや光に対するバリア性を有する容器が望ましい。
【実施例１】
【００３１】
以下、本発明にかかる食品の殺菌方法の実施例を挙げてさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
最初に本実施例において用いた試験条件および試験方法について説明する。
【００３２】
〈供試菌株〉
供試菌株として、強力な毒素を産生することから、食品の安全性に関わる最も重要な微生物であり、極めて強い耐圧性を持つ嫌気性芽胞菌であるクロストリジウム・ボツリナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）の加熱殺菌実験における代替菌として使用され、且つ強い耐圧性を持つ嫌気性芽胞菌であり、腐敗菌の一種でもあるクロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）を用いた。
【００３３】
〈供試菌液の調製〉
クロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ ＮＢＲＣ１４２９３）は、５ｍｌのＴＰ培地（５％ Ｔｒｉｐｔｉｃａｓｅ ｐｅｐｔｏｎｅ、 ０．５％ Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ、０．１２５％リン酸水素二カリウムｐＨ７．５）に接種し、３５℃で１晩かけて培養した（第一培養菌液）。その後、第一培養菌液１ｍｌを９ｍｌの新しいＴＰ培地に移し、４時間培養した（第二培養菌液）。続いて、第二培養菌液１０ｍｌを９０ｍｌの新しいＴＰ培地に移し、４時間培養した（第三培養菌液）。最後に、第三培養菌液１００ｍｌを９００ｍｌの新しいＴＰ培地に移し、２日間培養した（第四培養菌液）。培養はすべて嫌気条件下で行った。最後の２日間だけ、エージレス（ＦＸ、三菱ガス化学株式会社、東京）を用いて脱酸素した。その他は、ガス（１０％水素＋１０％二酸化炭素＋８０％窒素）置換を行った。第四培養菌液は、芽胞形成していることを顕微鏡で確認した後に、遠心分離（４℃で１２０００ｒｐｍ、１０分間）して菌を沈殿させ、上清を捨て滅菌蒸留水を３０ｍｌ加えて洗浄した。洗浄は、５回繰り返した。洗浄後、１５ｍｌ遠沈管に菌液を５ｍｌずつ分注し、−１６℃で冷凍保存した。菌液は、３０℃の温浴中に１０分間浸して解凍して１００μｌのＰＣＲチューブに分注し、８０℃、１０分間加熱して栄養細胞を死滅させてから４℃まで冷却させ、再び−１６℃のフリーザーに入れ凍結保存し、使用した。
【００３４】
〈試験方法〉
１ｍｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）をフレキシブルパウチに入れ、上記で作製したクロストリジウム・スポロゲネスの菌液を１０μｌ入れ、さらにアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、又はバリンのうち一種類を０．０８ｍｏｌ／ｌの濃度になるように添加し、空気が入らないようにヒートシールし、下記に示す各種処理条件で処理を実施した。
上記処理後の各処理パウチから、クロストリジウム・スポロゲネス入りの溶液を分取し、０．８５％生理食塩水で適宜希釈し、希釈溶液と寒天を除いたクロストリジア測定用培地（日水製薬株式会社、東京）を試験管に１：１で混合し、アルミキャップを乗せ、嫌気条件下で４日間、３５℃培養した。菌数は５本最確数法で測定した。
また、以上のようにして測定した処理後の菌数と初発の菌数について、ｌｏｇ（Ｎ［処理後菌数］／Ｎ０［初発菌数］）を算出し、殺菌効果とした。
【００３５】
〈処理条件〉
以下の条件での処理を実施した。
試験例１−１：各種アミノ酸を０．０８ｍｏｌ／ｌとなるように添加し、１００ＭＰａ、４５℃で１２０分間高圧処理後、８０℃、１０分加熱処理
試験例１−２：各種アミノ酸を０．０８ｍｏｌ／ｌとなるように添加し、２００ＭＰａ、４５℃で１２０分間高圧処理後、８０℃、１０分加熱処理
試験例１−３：各種アミノ酸を０．０８ｍｏｌ／ｌとなるように添加し、４００ＭＰａ、４５℃で１２０分間高圧処理後、８０℃、１０分加熱処理
試験例１−４：各種アミノ酸を０．０８ｍｏｌ／ｌとなるように添加し、０．１ＭＰａ、４５℃で１２０分間高圧処理後、８０℃、１０分加熱処理
なお、上記試験例１−１〜１−４については、比較のため、アミノ酸無添加の条件で同様の試験を行なった。
【００３６】
〈試験結果〉
試験例１−１〜１−４の試験結果を下記表１及び図１〜４にそれぞれ示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
表１及び図１〜４に示すように、アミノ酸を添加せずに高圧処理、低温加熱処理を行った条件では、いずれも菌数は１桁以上減少しなかったが、０．０８Ｍのシステイン、アラニン、セリン、メチオニン、フェニルアラニン、グリシン、又はロイシンを添加して高圧処理、低温加熱処理を行なった試験例１−１〜１−３の条件では、菌数が１桁以上減少した。より具体的には、システインで４桁以上、アラニン、セリン、メチオニンで３桁以上、フェニルアラニン、グリシン、ロイシンで２桁以上まで減少した。一方で、高圧処理を行なわなかった試験例１−４の条件では、アミノ酸の添加の有無に関わらず生残数の減少は見られなかった。８０℃，１０分間の低温加熱処理では胞子は死滅しないことから、アミノ酸と高圧処理が相乗的に発芽を促し、つづく低温加熱処理によって発芽した栄養細胞が殺菌されたものと考えられる。また、１００〜４００ＭＰａで高圧処理、低温加熱処理した試験例１−１〜１−３のうち、２００ＭＰａで処理した試験例１−２の場合において最も高い殺菌効果が得られた。
【実施例２】
【００３９】
つづいて、上記試験において特に殺菌改善効果の見られたアミノ酸４種（アラニン、グリシン、システイン、及びセリン）を添加した上で、高圧処理中の温度を変化させて同様の試験を行うことによって、高圧処理中の最適温度について検討した。
〈試験方法〉
上記実施例１と同様にして、クロストリジウム・スポロゲネス菌液を緩衝液とともに封入したパウチに、上記各種アミノ酸（アラニン、グリシン、システイン、セリンのうち１種類）をそれぞれ０．０８ｍｏｌ／ｌとなるように添加し、温度２０〜７０℃（２０，４５，７０℃）、圧力１００〜２００ＭＰａ（１００Ｐａ，２００Ｐａ）の条件で１２０分間高圧処理後、８０℃、１０分間低温加熱処理した。
なお、比較試験として、低圧処理条件（０．１ＭＰａ、２０〜７０℃、１２０分処理）、及びアミノ酸無添加処理条件で上記同様の試験を行った。
〈試験結果〉
上記各温度、各圧力条件で処理した場合の殺菌効果の試験結果を表２に示す。
【００４０】
【表２】
【００４１】
表２に示すように、２０℃の条件で高圧処理した場合、上記４種類のアミノ酸を添加しても殺菌効果は小さく、生残菌数の減少は１〜２桁程度であった。４５℃で高圧処理を行なった場合、アミノ酸添加による殺菌効果の改善が顕著にみられ、特にアラニン、システインを添加して１００〜２００ＭＰａの条件で高圧処理した場合、生残菌数は３〜５桁減少した。７０℃高圧処理の場合、アミノ酸添加によるの殺菌改善効果はさらに向上しており、特に２００ＭＰａ処理条件では生残菌数が５桁以上減少した。
【実施例３】
【００４２】
つづいて、高圧処理工程における圧力を変化させて同様の試験を行うことによって、好適な処理圧力について検討した。
〈試験方法〉
上記実施例１と同様にして、クロストリジウム・スポロゲネス菌液を緩衝液とともに封入したパウチに、アミノ酸３種類（アラニン、グリシン、システイン）をそれぞれ０．０８ｍｏｌ／ｌの濃度になるように添加し、圧力２５〜４００ＭＰａ（２５，５０，１００，２００，４００，５００，６００ＭＰａ）、温度７０℃の条件で１２０分間高圧処理後、８０℃で１０分間加熱処理した。
〈試験結果〉
上記各圧力条件で処理した場合の殺菌効果の試験結果を表３及び図５に示す。
【００４３】
【表３】
【００４４】
上記表３及び図５に示すように、圧力が大きくなるとともに、低温加熱処理後の生菌数が減少した。システインを添加した場合、５０ＭＰａ以上で明らかな殺菌効果が得られ、５０ＭＰａでは約３桁、１００〜６００ＭＰａでは５桁以上の減少がみられた。アラニン、グリシンを添加した場合、５０ＭＰａでは効果がなかったものの、アラニンでは１００ＭＰａ以上で５桁以上、グリシンでは２００ＭＰａ以上で５桁以上の殺菌効果が得られた。
【実施例４】
【００４５】
さらに、高圧処理工程の時間を変化させて同様の試験を行うことによって、好適な処理時間について検討した。
〈試験方法〉
試験例４−１：上記実施例１と同様にして、クロストリジウム・スポロゲネス菌液を緩衝液とともに封入したパウチにアミノ酸４種類（アラニン、グリシン、システイン、セリン）をそれぞれ０．０８ｍｏｌ／ｌの濃度になるように添加し、圧力２００ＭＰａ、温度４５℃の条件で、３０〜１２０分間（３０，６０，１２０分間）高圧処理後、８０℃、１０分間加熱処理した。
試験例４−２：上記試験同様にクロストリジウム・スポロゲネス菌液及びアミノ酸４種を添加したパウチを、圧力２００ＭＰａ、温度７０℃の条件で、１０〜１２０分間（１０，１５，３０，６０，１２０分間）高圧処理後、８０℃、１０分間加熱処理した。
〈試験結果〉
上記試験例４−１の試験結果を表４及び図６に、上記試験例４−２の試験結果を表５及び図７に示す。
【００４６】
【表４】
【００４７】
【表５】
【００４８】
上記表４及び図６に示すように、２００ＭＰａ，４５℃で高圧処理した場合、高圧処理時間が長くなるほど、処理後の生菌数が減少した。システインを添加した場合、６０分後には約４桁減少した。また、アラニン、セリンを添加した場合、１２０分後には４桁以上減少した。グリシンを添加した場合、６０分後に約３桁減少した。
さらに、上記表５及び図７に示すように、２００ＭＰａ，７０℃で高圧処理した場合、２００ＭＰａ，４５℃で高圧処理した場合と比べて、極めて短時間で生菌数が減少した。アラニン、システイン、セリンを添加した場合、３０分後には約５桁の減少が見られた。また、グリシンを添加した場合、６０分後で約５桁の減少が見られた。
【実施例５】
【００４９】
さらに、高圧処理工程におけるアミノ酸濃度を変化させて同様の試験を行うことによって、好適な処理濃度について検討した。
〈試験方法〉
試験例５−１：上記実施例１と同様にして、クロストリジウム・スポロゲネス菌液を緩衝液とともに封入したパウチに、上記実施例１において効果の認められた７種類のアミノ酸（アラニン、セリン、グリシン、メチオニン、ロイシン、フェニルアラニン、システイン）を、それぞれ０．００１〜０．０８ｍｏｌ／ｌになるように添加し、圧力２００ＭＰａ，温度４５℃で１２０分間高圧処理後、８０℃、１０分間低温加熱処理した。
試験例５−２：上記試験と同様にクロストリジウム・スポロゲネス菌液にアミノ酸７種を各種濃度で添加したパウチを、圧力２００ＭＰａ，温度７０℃で１５分間高圧処理後、８０℃、１０分間低温加熱処理した。
〈試験結果〉
上記試験例５−１の試験結果を表６及び図８に、上記試験例５−２の試験結果を表７及び図９に示す。
【００５０】
【表６】
【００５１】
【表７】
【００５２】
上記表６及び図８に示すように、２００ＭＰａ，４５℃で１２０分間高圧処理した場合、０．０１〜０．０２ｍｏｌ／ｌまではアミノ酸濃度の増加とともに殺菌効果が向上した。なお、これよりも高い濃度添加した場合であっても殺菌効果はほとんど変わらず、また、低下することもなかった。
また、上記表７及び図９に示すように、２００ＭＰａ、７０℃で１０分間高圧処理した場合も、２００ＭＰａ，４５℃で１２０分間高圧処理した場合と同様に、０．０１〜０．０２ｍｏｌ／ｌより高い濃度では効果はほとんど変わらなかった。以上の結果から、アミノ酸の添加濃度は、０．０１〜０．０２ｍｏｌ／ｌであることが望ましいと考えられる。
【実施例６】
【００５３】
つづいて、アミノ酸に加えて、さらに重曹（炭酸水素ナトリウム）を同時に添加して高圧処理を行なうことによって、アミノ酸と重曹との相乗効果について検討した。
〈試験方法〉
試験例６−１：上記実施例１と同様にして、クロストリジウム・スポロゲネス菌液を緩衝液とともに封入したパウチに、（１）グリシン０．０８ｍｏｌ／ｌ、（２）グリシン０．０８ｍｏｌ／ｌ及び重曹０．４ ｍｏｌ／ｌ、又は（３）重曹０．４ｍｏｌ／ｌを添加した後、１００ＭＰａ，７０℃で１５分間高圧処理後、８０℃、１０分間低温加熱処理した。なお、（１）については、重曹０．４ｍｏｌ／ｌと同等のｐＨ（ｐＨ８．４）に調整した。
試験例６−２：上記試験同様に、クロストリジウム・スポロゲネス菌液に、（１）〜（３）の条件で０．０８ｍｏｌ／ｌグリシン及び／又０．４ｍｏｌ／ｌ重曹を添加し、圧力２００ＭＰａ，温度７０℃で１５分間高圧処理後、８０℃、１０分間低温加熱処理した。
〈試験結果〉
上記試験例６−１の試験結果を表８及び図１０に、上記試験例６−２の試験結果を表９及び図１１に示す。
【００５４】
【表８】
【００５５】
【表９】
【００５６】
上記表８及び図１０に示すように、１００ＭＰａ、７０℃で１５分間高圧処理した場合、（１）グリシン単独では殺菌効果があまり得られず、また、（３）重曹単独ではまったく殺菌効果は得られなかったものも、（２）両者を併用することで、１〜２桁菌数が減少することがわかった。また、（１）グリシン単独添加条件においては、０．４Ｍ重曹添加の場合と同程度のｐＨ８．４へと調整しているにもかかわらず、胞子の発芽が起こらなかったことから、重曹の併用による発芽促進効果は、単純にｐＨの調整によるものではないことが理解される。
他方、上記表９及び図１１に示すように、２００ＭＰａ、７０℃で１５分間高圧処理した場合、（３）重曹単独添加では１桁、（１）グリシン単独添加では３桁程度の減少がみられたのに対し、（２）両者の併用により、菌数は４〜５桁以上減少した。以上の結果から、グリシンと重曹とを組み合わせることで、高圧処理−低温加熱処理の殺菌効果が相乗的に促されていることが明らかとなった。
【実施例７】
【００５７】
さらに、高圧処理工程における重曹の濃度を変化させて同様の試験を行うことによって、好適な処理濃度について検討した。
〈試験方法〉
上記実施例１と同様にして、クロストリジウム・スポロゲネス菌液を緩衝液とともに封入したパウチに、０．０８ｍｏｌ／ｌグリシンに加え、（１）重曹０．４ｍｏｌ／ｌ，（２）重曹０．２ｍｏｌ／ｌ，（３）重曹０．１ｍｏｌ／ｌ，（４）重曹０．０１ｍｏｌ／ｌを添加し、１００ＭＰａ、７０℃で１５分間高圧処理後、８０℃、１０分間低温加熱処理した。
〈試験結果〉
上記各濃度条件で処理した場合の殺菌効果の試験結果を表１０及び図１２に示す。
【００５８】
【表１０】
【００５９】
上記表１０及び図１２に示すように、０．０８ｍｏｌ／ｌのグリシンに加えて、０．０１ ｍｏｌ／ｌ又は０．１ ｍｏｌ／ｌの重曹を添加した場合、殺菌効果は改善しなかったものの、０．２ｍｏｌ／ｌ以上の濃度で重曹を添加することによって、１桁以上の殺菌効果が得られた。
【実施例８】
【００６０】
つづいて、遊離アミノ酸を多く含む食品に重曹を添加、あるいはアミノ酸含有量の比較的少ない食品中にアミノ酸と重曹とを同時に添加して高圧処理を行なうことによって、食品中での殺菌効果について検討した。
〈試験方法〉
試験例８−１：ハヤシライス（２００ＭＰａ高圧処理）
（１）重曹添加区では、フレキシブルパウチにハヤシライス１ｍｌを入れ、重曹を０．４ｍｏｌ／ｌの濃度となるように添加し、クロストリジウム・スポロゲネス胞子を１０μｌ接種してヒートシールし、２００ＭＰａ、７０℃で１５分間高圧処理後、８０℃、１０分間加熱処理した。（２）重曹非添加区では、フレキシブルパウチにハヤシライス１ｍｌを入れ、重曹を添加した時と同様のｐＨ８．４に調製し、クロストリジウム・スポロゲネス胞子を１０μｌ接種してヒートシールし、２００ＭＰａ、７０℃で１５分間高圧処理後、８０℃、１０分間加熱処理した。
試験例８−２：ハヤシライス（１００ＭＰａ高圧処理）
上記試験例８−１と同様の条件で、１００ＭＰａ、７０℃で１５分間高圧処理後、８０℃、１０分間加熱処理した。
【００６１】
試験例８−３：ゴボウ（２００ＭＰａ高圧処理）
（１）アミノ酸添加区では、クロストリジウム・スポロゲネス胞子液（５．４×１０５ｓｐｏｒｅｓ／ｍｌ）に１ｇのゴボウを浸した後、ゴボウの周りにいる微生物を滅菌蒸留水で洗浄し、風乾した後、アラニンを０．０８ｍｏｌ／ｌの濃度になるように添加し、重曹を添加した時と同様のｐＨ８．４に調製した浸漬液に漬け、２００ＭＰａ、７０℃で１５分間高圧処理後、８０℃、１０分間加熱処理した。（２）重曹及びアミノ酸添加区では、クロストリジウム・スポロゲネス胞子液（５．４×１０５ｓｐｏｒｅｓ／ｍｌ）に１ｇのゴボウを浸した後、ゴボウの周りにいる微生物を滅菌蒸留水で洗浄し、風乾した後、重曹を０．４ｍｏｌ／ｌ及びアラニンを０．０８ｍｏｌ／ｌの濃度になるように添加した浸漬液に漬け、２００ＭＰａ、７０℃で１５分間高圧処理後、８０℃、１０分間加熱処理した。（３）重曹添加区では、クロストリジウム・スポロゲネス胞子液（５．４×１０５ｓｐｏｒｅｓ／ｍｌ）に１ｇのゴボウを浸した後、ゴボウの周りにいる微生物を滅菌蒸留水で洗浄し、風乾した後、重曹を０．４ｍｏｌ／ｌの濃度になるように添加した浸漬液に漬け、２００ＭＰａ、７０℃で１５分間高圧処理後、８０℃、１０分間加熱処理した。
試験例８−４：ゴボウ（１００ＭＰａ高圧処理）
上記試験例８−３と同様の条件で、１００ＭＰａ、７０℃で１５分間高圧処理後、８０℃、１０分間加熱処理した。
【００６２】
〈試験結果〉
上記試験例８−１，２の試験結果を表１１及び図１３，１４に、上記試験例８−３，４の試験結果を表１２及び図１５，１６に示す。
【００６３】
【表１１】
【００６４】
【表１２】
【００６５】
表１１及び図１３，１４に示すように、遊離アミノ酸を多く含む食品であるハヤシライスを２００ＭＰａ、７０℃で１５分間高圧処理した場合、重曹を添加することによって４桁以上の殺菌効果が得られた。なお、（２）重曹非添加の３桁と比べても（１）重曹添加によって殺菌効果が改善されていることが確認された。また、１００ＭＰａ，７０℃で１５分間の条件では、（２）重曹非添加の場合は殺菌効果が得られなかったのに対し、（１）重曹添加により１〜２桁の殺菌効果が得られた。
また、表１２及び図１５，１６に示すように、アミノ酸含有量の比較的少ないゴボウを２００ＭＰａ、７０℃で１５分間高圧処理した場合、（３）重曹単独では殺菌効果はほとんど得られていないものの、（１）アラニンを単独添加、あるいは（２）アラニンと重曹との両者を添加すると、生菌数は２桁以上減少し、検出限界以下となった。一方で、１００ＭＰａ、７０℃で１５分間高圧処理した場合、（３）重曹単独又は（１）アラニン単独の添加では効果がなく、（２）アラニンと重曹との併用によって２桁の殺菌効果が得られた。
【実施例９】
【００６６】
〈供試菌株〉
クロストリジウム・ボツリナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）２種を用いた。
〈供試菌液の調製〉
クロストリジウム・ボツリナム（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ６２Ａ（Ａ型毒素産生株）及び２１３Ｂ（Ｂ型毒素産生株）を、ＴＰ培地にて３０℃，１日培養後、室温で３日さらに培養した。胞子の形成は位相差顕微鏡にて確認後、滅菌蒸留水で５回洗浄した。
【００６７】
〈試験方法〉
試験例９−１：Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ６２Ａ（Ａ型毒素産生株）
１ｍｌの処理液（ｐＨ７．０）をフレキシブルパウチに入れ、さらに上記で作成したクロストリジウム・ボツリナム（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ６２Ａ（Ａ型毒素産生株））の菌液１０μｌを入れ、、空気が入らないようにヒートシールし、下記に示す各種処理条件で処理を実施した。
（１）アミノ酸添加区では、アラニンを０．０８ｍｏｌ／ｌの濃度になるように添加し、ｐＨ７．０に調製した上、２００ＭＰａ、７０℃、１５分間高圧処理後、８０℃、１０分間加熱処理した。
（２）重曹及びアミノ酸添加区では、重曹を０．４ｍｏｌ／ｌ及びアラニンを０．０８ｍｏｌ／ｌの濃度になるように添加し、２００ＭＰａ、７０℃で１５分間高圧処理後、８０℃、１０分間低温加熱処理した。
（３）重曹添加区では、重曹を０．４ｍｏｌ／ｌの濃度になるように添加し、２００ＭＰａ、７０℃で１５分間高圧処理後、８０℃、１０分間低温加熱処理した。
（４）アミノ酸・重曹非添加添加区では、アミノ酸及び重曹を添加せず、ｐＨを７．０に調整し、２００ＭＰａ、７０℃で１５分間高圧処理後、８０℃、１０分間低温加熱処理した。
【００６８】
試験例９−２：Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ２１３Ｂ（Ｂ型毒素産生株）
上記試験例９−１と同様の条件で、クロストリジウム・ボツリナム２１３Ｂ（Ｂ型毒素産生株）を用いて、その殺菌効果を調べた。
【００６９】
〈試験結果〉
上記試験例９−１の試験結果を表１３及び図１７に、上記試験例９−２の試験結果を表１４及び図１８に示す。
【００７０】
【表１３】
【００７１】
【表１４】
【００７２】
表１３及び図１７に示すように、クロストリジウム・ボツリナムの６２Ａ株を用いた場合、（２）アラニンと重曹とをともに添加すると１桁の殺菌効果があったものの、他の処理区では有意な殺菌効果が認められなかった。一方で、表１４及び図１８に示すように、クロストリジウム・ボツリナムの２１３Ｂ株を用いた場合では、（４）アミノ酸のみを添加したｐＨ７．０のリン酸緩衝液においても３桁程度の殺菌効果が認められ、さらに（２）アラニンと重曹との両者を添加することによって殺菌効果がさらに改善され、生残菌数が約５桁減少した。これらの結果から、Ｃ.ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓだけでなく、Ｃ. ｂｏｔｕｌｉｎｕｍに対しても、アミノ酸と重曹とを併用することによって、高圧処理−低温加熱処理による殺菌効果が相乗的に促されることが明らかとなった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
殺菌対象となる食品中に、システイン、アラニン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、ロイシン、及びグリシンから選ばれる１種又は２種以上のアミノ酸を添加した後、５０〜６００ＭＰａの圧力で１〜１２０分間処理する高圧処理工程と、
前記高圧処理工程後、６０〜１００℃の温度で５分間以上加熱する低温殺菌処理工程と
を備えることを特徴とする食品の殺菌方法。
【請求項２】
請求項１に記載の殺菌方法において、前記アミノ酸を、食品中０．０１〜０．１５ｍｏｌ／ｌ添加することを特徴とする食品の殺菌方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の殺菌方法において、前記アミノ酸として、システイン及び／又はアラニンを用いることを特徴とする食品の殺菌方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の殺菌方法において、前記高圧処理工程の際、前記アミノ酸とともに、重曹を添加した後、高圧処理することを特徴とする食品の殺菌方法。
【請求項５】
請求項４に記載の殺菌方法において、前記重曹を、食品中０．２〜１．０ｍｏｌ／ｌ添加することを特徴とする食品の殺菌方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の殺菌方法において、アミノ酸の含有量が合計０．１５ｍｏｌ／ｌ未満の食品を殺菌対象とすることを特徴とする食品の殺菌方法。
【請求項７】
アミノ酸含有量が合計０．０１ｍｏｌ／ｌ以上の食品中に、重曹を添加した後、１００〜６００ＭＰａの圧力で１〜２４０分間処理する高圧処理工程と、
前記高圧処理工程後、６０〜１００℃の温度で５分間以上加熱する低温殺菌処理工程と
を備えることを特徴とする食品の殺菌方法。
【請求項８】
請求項７に記載の殺菌方法において、前記重曹を、食品中０．２〜１．０ｍｏｌ／ｌ添加することを特徴とする食品の殺菌方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載の殺菌方法において、食品中の芽胞菌を殺菌することを特徴とする食品の殺菌方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の殺菌方法において、食品中のクロストリジウム属菌を殺菌することを特徴とする食品の殺菌方法。
【請求項１】
殺菌対象となる食品中に、システイン、アラニン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、ロイシン、及びグリシンから選ばれる１種又は２種以上のアミノ酸を添加した後、５０〜６００ＭＰａの圧力で１〜１２０分間処理する高圧処理工程と、
前記高圧処理工程後、６０〜１００℃の温度で５分間以上加熱する低温殺菌処理工程と
を備えることを特徴とする食品の殺菌方法。
【請求項２】
請求項１に記載の殺菌方法において、前記アミノ酸を、食品中０．０１〜０．１５ｍｏｌ／ｌ添加することを特徴とする食品の殺菌方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の殺菌方法において、前記アミノ酸として、システイン及び／又はアラニンを用いることを特徴とする食品の殺菌方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の殺菌方法において、前記高圧処理工程の際、前記アミノ酸とともに、重曹を添加した後、高圧処理することを特徴とする食品の殺菌方法。
【請求項５】
請求項４に記載の殺菌方法において、前記重曹を、食品中０．２〜１．０ｍｏｌ／ｌ添加することを特徴とする食品の殺菌方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の殺菌方法において、アミノ酸の含有量が合計０．１５ｍｏｌ／ｌ未満の食品を殺菌対象とすることを特徴とする食品の殺菌方法。
【請求項７】
アミノ酸含有量が合計０．０１ｍｏｌ／ｌ以上の食品中に、重曹を添加した後、１００〜６００ＭＰａの圧力で１〜２４０分間処理する高圧処理工程と、
前記高圧処理工程後、６０〜１００℃の温度で５分間以上加熱する低温殺菌処理工程と
を備えることを特徴とする食品の殺菌方法。
【請求項８】
請求項７に記載の殺菌方法において、前記重曹を、食品中０．２〜１．０ｍｏｌ／ｌ添加することを特徴とする食品の殺菌方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載の殺菌方法において、食品中の芽胞菌を殺菌することを特徴とする食品の殺菌方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の殺菌方法において、食品中のクロストリジウム属菌を殺菌することを特徴とする食品の殺菌方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公開番号】特開２０１２−７５３３８（Ｐ２０１２−７５３３８Ａ）
【公開日】平成２４年４月１９日（２０１２．４．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２２０６９３（Ｐ２０１０−２２０６９３）
【出願日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【出願人】（０００２０８４５５）大和製罐株式会社 (309)
【出願人】（５０５１１１９８２）学校法人 新潟科学技術学園 新潟薬科大学 (7)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年４月１９日（２０１２．４．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【出願人】（０００２０８４５５）大和製罐株式会社 (309)
【出願人】（５０５１１１９８２）学校法人 新潟科学技術学園 新潟薬科大学 (7)
【Ｆターム（参考）】
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