食品の酵素漂白における使用向け新規酵素
【課題】白色度の向上した食品を調製するための方法における使用に好適な、カロアーゼ０１−０５に係る新規ポリペプチド又はそのいずれかの任意の機能的等価物、食品の少なくとも一部の白色度を向上させるための酵素の使用、酵素が使用される食品を調製するための方法及び得られる食品に関する。
【解決手段】ホウライタケ属のニオイヒメホウライタケ由来であって、食品の少なくとも一部の白色度の向上をもたらす単離ポリペプチド。該ポリペプチドをアスペルギルス・ニガー等の宿主細胞を用いて生産する方法。該ポリペプチドがカロテノイドの開裂能を有する方法。
【解決手段】ホウライタケ属のニオイヒメホウライタケ由来であって、食品の少なくとも一部の白色度の向上をもたらす単離ポリペプチド。該ポリペプチドをアスペルギルス・ニガー等の宿主細胞を用いて生産する方法。該ポリペプチドがカロテノイドの開裂能を有する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、白色度の向上した食品を調製するための方法における使用に好適な新規酵素、食品の少なくとも一部の白色度を向上させるための酵素の使用、酵素が使用される食品を調製するための方法及び得られる食品に関する。
【０００２】
ある種類の食品、例えば、乳製品、例えばチーズ、乳清、バター、及び粉乳において、及び穀粉原料製品、例えばパン及び麺類においては、食品の少なくとも一部は白色が望ましいものと見なされる。
【０００３】
しかしながら、かかる食品の原材料又は中間製品は色素を含むことがあり、それによって食品が淡白色〜黄色になり得る。かかる色素の例はカロテノイド（カロテン及びキサントフィル）及びフラボンである。
【０００４】
例えば精白パンにおいては、白い内相が望ましい特性と見なされる。カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、リパーゼ及び／又はリポキシゲナーゼなどの酵素を使用することによって、より白い内相が得られ得る（例えば、Ｐ．ゲリナス（Ｐ．Ｇｅｌｉｎａｓ）らによる「Ｏｘｉｄｏ−ｒｅｄｕｃｔａｓｅｓ ａｎｄ Ｌｉｐａｓｅｓ ａｓ Ｄｏｕｇｈ−Ｂｌｅａｃｈｉｎｇ Ａｇｅｎｔ」、Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍ、７５（６）、８１０〜８１４頁（１９９８年）を参照）。以上の酵素は全て、内相に対し漂白効果を有する。現在、製パン業では主に、リポキシゲナーゼを含有する酵素活性大豆粉が使用される。大豆粉中のリポキシゲナーゼは小麦粉色素の漂白能を有し、これはフリーラジカル及び脂肪酸の酸化中にリポキシゲナーゼにより形成される他の活性酸素種の作用の結果である。この反応は共酸化と呼ばれる。大豆粉には、３種のリポキシゲナーゼ、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３が存在し、Ｌ２及びＬ３が最良の漂白活性を有する（Ｗ．グロシュ（Ｗ．Ｇｒｏｓｃｈ）、Ｇ．ラスカウイ（Ｇ．Ｌａｓｋａｗｙ）及びＦ．ウェバー（Ｆ．Ｗｅｂｅｒ）、Ｊ．アグリック（Ｊ．Ａｇｒｉｃ）、Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ ２４（１９７６年）、４５６頁）。大豆粉はリポキシゲナーゼのみならず漂白効果に必要な脂肪酸も含有し、結果として漂白効果の改善をもたらす。
【０００５】
リポキシゲナーゼ源としての大豆の使用に関連する難点は、今日ほとんどの大豆が遺伝子操作（ＧＭＯ）されているという現実である。世界的に顧客は非ＧＭＯ由来パン改良添加剤を好むため、大豆リポキシゲナーゼの代替品の必要性は高い。大豆由来リポキシゲナーゼＬ２及びＬ３以外の既知の酵素は、大豆由来リポキシゲナーゼほど良好には機能しないという難点を有する。実際には、所望の白色度を得るため、これらの酵素は補因子又は他の酵素と組み合わされて所望の水準の内相の白色度を達成することとなる。ペルオキシダーゼは、不飽和化合物、例えば不飽和脂肪酸の酸化を酸素分子によって非酵素的に触媒する。（Ｃ．Ｅ．エリクソン（Ｃ．Ｅ．Ｅｒｉｋｓｓｏｎ）ら ＪＡＯＳ４８（１９７１年）４４２頁）。これらの酸化脂肪酸はラジカルを生成し、おそらくはこれが小麦粉色素と反応して、リポキシゲナーゼ反応産物と同様の方法で製品の有色度をより低くする。
【０００６】
本発明の目的は、食品の少なくとも一部の白色度の向上した食品の調製に好適な新規酵素を提供することである。
【０００７】
意外なことに、本発明に係る漂白酵素は、色素を結果として白色度の向上をもたらす形態に直接的に変換する能力を有することが発見された。これらの酵素は色素に対し様々な方法で直接的な漂白効果を及ぼすことができる。例えば、これらは色素中の不飽和結合を例えば水素化を介して飽和させることにより色素を直接的に変換でき、又はこれらは色素を直接的に開裂して分解産物を形成することができる。直接的という用語は、これらの酵素が色素に対し基質それ自体として作用することを意味する。変換を達成するための補因子の使用は特に排除されるものではない。
【０００８】
さらには、本発明に係る漂白ポリペプチドは、色素を直接的に開裂する能力を有する（いわゆる開裂酵素である）ことが発見された。本発明に係る好適な開裂酵素は、カロテノイド（カロテン及びキサントフィル）及びフラボンの開裂能を有する酵素である。カロテノイドは２つの異なる方法、中央及びエキセントリックで開裂され得る。カロテノイドの中央開裂は結果としてレチノイド（Ｃ２０化合物）の形成をもたらす。エキセントリック開裂は、例えばアブシジン酸などの、より多様な化合物群を生じ得る。カロテノイドの中央開裂能を有する酵素は、例えば欧州特許出願公開第１０３１６２３Ａ号明細書及びＪ．リンティッヒ（Ｊ．Ｌｉｎｔｉｇ）及びＫ．フォークト（Ｋ．Ｖｏｇｔ）（２０００年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５、１１９１５頁に記載されるとおり、例えばβ−カロテン１５，１５’−モノオキシゲナーゼ（ＥＣ１．１４．９９．３６）である。この酵素は以前はβ−カロテン１５，１５’−ジオキシゲナーゼ＝ＥＣ１．１３．１１．２１として知られていた。
【０００９】
中央開裂能を有する酵素の使用のさらなる利点は、レチノイドの形成である。レチノイドは視覚における必須成分である。β−カロテンは２個のレチナール分子に開裂される。このレチナールは、ビタミンＡとしても知られるレチノールに改変され得る。カロテノイドのエキセントリック開裂能を有する酵素の例は、９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼ（例えば、Ｘ．チン（Ｘ．Ｑｉｎ）及びＪ．Ａ．Ｄ．ジバルト（Ｊ．Ａ．Ｄ．Ｚｅｅｖａａｒｔ）（１９９９年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ、９６、１５３５４頁）及びβ−カロテン９’，１０’−ジオキシゲナーゼ（例えば、キーファー（Ｋｉｅｆｅｒ）ら（２００１年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７、１４１１０頁）である。
【００１０】
本目的は、本発明に記載されるとおりの新規酵素により達成される。
【００１１】
第１の態様において、本発明は、漂白活性と
１）配列番号０８〜１２のいずれか１つに従う単離ポリペプチド又はその任意の機能的等価物、
２）配列番号０１〜０７のいずれか１つに従うポリヌクレオチド又はその任意の機能的等価物又は前記ポリヌクレオチドを含んでなるベクター又はその任意の機能的等価物を然るべき宿主細胞、例えばアスペルギルス・ニガー中で発現させることにより得られる単離ポリペプチド、及び
３）配列番号１３〜１７の少なくとも１つを含んでなるポリペプチド
からなる群より選択される１つ又は複数の特性とを有する単離ポリペプチドに関する。
【００１２】
用語「漂白活性を有するポリペプチド」は本所及び以下ではβ−カロテン分解能を有するポリペプチド又は食品の漂白能を有するポリペプチドとして定義される。β−カロテン分解は、例えば本特許出願の「材料及び方法」の節に開示されるとおりの方法の少なくとも１つ、例えばＺｏｒｎに従う方法又はＡｚｉｚに従う方法により計測され得る。好ましくは、本発明に係るポリペプチドはＡｚｉｚ及びＺｏｒｎの双方のアッセイにおいて漂白活性を示す。食品の漂白能は、調査されるポリペプチドがその調製に使用される製品Ａの白色度を、調査されるポリペプチドがその製品中に使用されなかった点において唯一製品Ａと異なる製品Ｂの白色度と、例えば視覚的に、又は既知の反射計測によって比較することにより測定され得、調査されるポリペプチドが漂白活性を有する場合には、製品Ａのｂ値は製品Ｂのｂ値と比べ０により近くなるであろう。
【００１３】
さらにより好ましくは、本発明に係るポリペプチドはＺｏｒｎに従い測定されるときβ−カロテン分解能を有するとともにこれは反射計測によってｂ値の計測により測定されるとき食品の漂白能を有する。最も好ましくは、本発明に係るポリペプチドは、例えばパンの内相など、漂白される食品が一様でない表面構造を有し、ひいては反射計測法が信頼性に欠ける場合に、Ｚｏｒｎに従い測定されるときβ−カロテン分解能を有する。
【００１４】
好ましい実施形態において、本発明は精製されたポリペプチドを提供する。本発明に係るポリペプチドは本発明に係るポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを含む。特に、配列番号０８〜１２に従うポリペプチド又はその任意の機能的等価物が好ましい。
【００１５】
本発明に係るポリペプチドを含んでなる融合タンパク質もまた本発明の範囲内である。本発明はまた、本発明に係るポリペプチドの作製方法も提供する。
【００１６】
誤解を避けるため、配列番号０１〜０７は、配列番号０１、配列番号０２、配列番号０３、配列番号０４、配列番号０５、配列番号０６、及び配列番号０７を含むＤＮＡ配列群を参照し、配列番号０８〜１２は、配列番号０８、配列番号０９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２を含むタンパク質配列群を参照し、及び配列番号１３〜１８は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７を含むタンパク質配列群を参照するものとする。さらに、配列番号０８〜１２を有するポリペプチドについては、用語カロアーゼ０１、カロアーゼ０２、カロアーゼ０３、カロアーゼ０４、カロアーゼ０５（群全体として「カロアーゼ０１−０５」と称される）がそれぞれ使用される。
【００１７】
第２の態様において、本発明は、好ましくは高度にストリンジェントな条件下で配列番号０１〜０７のいずれか１つに従う配列とハイブリダイズされるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを提供する。結果的に、本発明は、配列番号０１〜０７に従う配列と約５５％、好ましくは６５％、より好ましくは７０％、さらにより好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％相同な核酸を提供する。
【００１８】
より好ましい実施形態において本発明は、真菌類、好ましくは糸状菌類、特にホウライタケ属が好ましく、例えばニオイヒメホウライタケから得られる単離ポリヌクレオチドを提供する。
【００１９】
一実施形態において、本発明は、配列番号０８〜１２に示されるとおりのアミノ酸又はその任意の機能的等価物を伴うポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる単離ポリヌクレオチドを提供する。
【００２０】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、配列番号０８〜１２に従うポリペプチド又はその任意の機能的等価物の少なくとも１つの機能ドメインをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
【００２１】
好ましい実施形態において、本発明は、配列番号０１〜０７に従う漂白酵素遺伝子を提供する。別の好ましい実施形態において、本発明は、そのアミノ酸配列が配列番号０８〜１２に示される漂白酵素又はその任意のポリペプチドの変異体又は断片をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００２２】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、本発明に係るポリペプチドをコードするコード配列を含んでなるポリヌクレオチドを提供し、好ましくは配列番号０１〜０７のポリヌクレオチド配列である。
【００２３】
第３の態様において、本発明はまた、本発明に係るポリヌクレオチド配列及び本発明に従いＤＮＡを増幅又は検出するために使用され得るプライマー、プローブ及び断片を含んでなるベクターにも関する。
【００２４】
好ましい実施形態において、提供されるベクターでは、本発明に係るポリヌクレオチド配列が、細菌類又は糸状菌類、好ましくはホウライタケ属、例えばニオイヒメホウライタケ、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えばＡ・ニガー又はＡ・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）などの好適な宿主細胞中におけるコードされたアミノ酸配列の発現に好適な調節配列と機能的に連結される。本発明はまた、本発明に係るポリヌクレオチド及びベクターを調製するための方法も提供する。
【００２５】
第４の態様において、本発明はまた、本発明に係る非相同又は相同ポリヌクレオチドを含有する、組換え産生された宿主細胞にも関する。
【００２６】
別の実施形態において、本発明は組換え宿主細胞を提供し、ここでは本発明に係るペルオキシダーゼの発現が有意に増加するか、又はペルオキシダーゼの活性が増加する。
【００２７】
別の実施形態において本発明は、本発明に係る非相同又は相同ＤＮＡを含有する組換え産生された宿主細胞を提供するとともに、ここで宿主細胞は本発明に係る機能性ペルオキシダーゼの産生能を有し、好ましくは本発明に係るペルオキシダーゼの過剰発現能を有する細胞、例えば本発明に係る遺伝子のコピー数の増加を含んでなるアスペルギルス株である。
【００２８】
第５の態様において、本発明はまた、好ましくは本明細書に記載されるとおりの、任意の工業プロセスにおける本発明に係る漂白ポリペプチドの使用にも関する。
【００２９】
［本発明に係るポリペプチド］
本発明は、配列番号０８〜１２のいずれか１つに従うアミノ酸配列、ならびに配列番号０１〜０７のポリヌクレオチドを然るべき宿主中で発現することにより得られるアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドを提供する。また、上記のポリペプチドの機能的等価物を含んでなるペプチド又はポリペプチドも本発明の範囲内に含まれる。上記のポリペプチドはまとめて用語「本発明に係るポリペプチド」に含まれる。
【００３０】
用語「ペプチド」及び「オリゴペプチド」は本所及び以下では同義語と見なされる（一般的に認識されるとおり）とともに各用語は、文脈上ペプチジル結合により結合される少なくとも２個のアミノ酸の鎖を示すことが要求されるとき、同義的に使用され得る。単語「ポリペプチド」は本明細書では８個以上のアミノ酸残基を含有する鎖に使用される。本明細書の全てのオリゴペプチド及びポリペプチドの式又は配列は、左から右に、及びアミノ末端からカルボキシ末端の方向に記載される。本明細書で使用されるアミノ酸の１文字コードは当該技術分野において一般的に知られているとともにサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州、１９８９年）に参照され得る。
【００３１】
「単離された」ポリペプチド又はタンパク質は、その天然環境から取り出されたポリペプチド又はタンパク質を意図する。例えば、宿主細胞中で発現する組換え産生されたポリペプチド及びタンパク質は、任意の好適な技術、例えば、スミス（Ｓｍｉｔｈ）及びジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）、Ｇｅｎｅ ６７：３１〜４０頁（１９８８年）に開示される一段階精製法により実質的に精製されている天然又は組換えポリペプチドであるため、本発明の目的上単離されていると見なされる。
【００３２】
本発明に係るカロアーゼ０１−０５漂白酵素、又はその機能的等価物は、組換え細胞培養物から、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法により回収及び精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製に用いられる。
【００３３】
本発明のポリペプチドは、自然に精製された産物、化学合成法による産物、及び組換え技術により、例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫及び哺乳動物細胞を含む、原核生物又は真核生物宿主から産生される産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に応じて、本発明のポリペプチドはグリコシル化されてもよく、又は非グリコシル化であってもよい。加えて、本発明のポリペプチドはまた、ある場合には宿主介在プロセスの結果として、初期修飾されたメチオニン残基を含み得る。
【００３４】
［機能的等価物］
用語「機能的等価物」及び「機能変異体」は本明細書では同義的に使用される。カロアーゼ０１−０５ＤＮＡの機能的等価物は、本明細書に定義されるとおりのカロアーゼ０１−０５ニオイヒメホウライタケ漂白酵素の少なくとも１個と少なくとも同等又はより良好な漂白活性を呈するポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡ断片である。本発明に係るカロアーゼ０１−０５ポリペプチドの機能的等価物は、本明細書に定義されるとおりのカロアーゼ０１−０５ニオイヒメホウライタケ漂白酵素の少なくとも１つと少なくとも同等又はより良好な漂白活性を呈するポリペプチドである。
【００３５】
タンパク質又はポリペプチドの機能的等価物は、配列番号０８〜１２のいずれか１つの１個又は複数のアミノ酸の保存的置換のみ、又はその任意の非必須アミノ酸の置換、挿入又は欠失を含み得る。従って、非必須アミノ酸は、生物学的機能を実質的に変化させることなく配列番号０８〜１２のいずれか１つにおいて変更し得る残基である。例えば、本発明のカロアーゼ０１−０５タンパク質間で保存されるアミノ酸残基は、特に変化を受け入れにくいと予想される。さらには、本発明に係るカロアーゼ０１−０５タンパク質間で保存されるアミノ酸及び他のペルオキシダーゼが変化を受け入れやすいとは思われない。
【００３６】
用語「保存的置換」は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられるような置換を意味することを意図している。これらのファミリーは当該技術分野において周知であるとともに、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン及びヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を伴うアミノ酸が挙げられる。
【００３７】
核酸の機能的等価物は典型的には、サイレント突然変異又はコードされたポリペプチドの生物学的機能を変化させない突然変異を含み得る。従って、本発明は、特定の生物活性に必須でないアミノ酸残基の変更を含むカロアーゼ０１−０５タンパク質をコードする核酸分子を提供する。アミノ酸配列が配列番号０８〜１２のいずれの１つとも異なる、かかるカロアーゼ０１−０５タンパク質は、少なくとも１種の生物活性をさらに保持する。一実施形態において、単離核酸分子はタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなり、ここでタンパク質は、配列番号０８〜１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列と実質的に少なくとも約５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上相同なアミノ酸配列を含んでなる。
【００３８】
例えば、表現型上サイレントなアミノ酸置換を生じさせるための方法に関する指針がボウイ・Ｊ．Ｕ．（Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６〜１３１０頁（１９９０年）に提供され、ここで著者は、アミノ酸配列の変化に対する許容度を研究するうえで２つの手法があることを指摘している。第１の方法は、進化の過程に依存し、ここで突然変異は自然選択により受け入れられるか、拒絶されるかのいずれかである。第２の手法は遺伝子工学を使用してクローニングされた遺伝子の特異的な位置でアミノ酸変化を導入するとともに機能性を保持する配列を選択又はスクリーニングして同定する。著者が述べるとおり、これらの研究は、タンパク質が驚くほどアミノ酸置換を許容することを明らかにしている。著者はさらに、タンパク質の特定の位置でどの変化が許容的である可能性が高いかについて指摘する。例えば、最も内部のアミノ酸残基が非極性側鎖を必要とする一方、表面側鎖の特徴は一般的にほとんど保存されない。他のかかる表現型上サイレントな置換は、ボウイ（Ｂｏｗｉｅ）ら、上記、及び当該文献中に引用される参考文献に記載される。
【００３９】
配列番号０８〜１２のいずれか１つに従うタンパク質と相同なカロアーゼ０１−０５タンパク質をコードする単離核酸分子が、１つ又は複数のヌクレオチド置換、付加又は欠失を配列番号０１〜０７に従うコードヌクレオチド配列に導入することにより作成されることで、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失又は挿入がコードされたタンパク質に導入され得る。かかる突然変異は、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ介在性突然変異誘発などの標準的な技術により導入されてもよい。
【００４０】
用語「機能的等価物」はまた、ニオイヒメホウライタケカロアーゼ０１−０５タンパク質のオルソログも包含する。ニオイヒメホウライタケカロアーゼ０１−０５タンパク質のオルソログは、他の株又は種から単離され得るとともに類似又は同一の生物活性を有するタンパク質である。かかるオルソログは、配列番号０８〜１２のいずれか１つと実質的に相同なアミノ酸配列を含んでなるものとして容易に同定され得る。
【００４１】
本明細書に定義されるとおり、用語「実質的に相同」が参照する第１のアミノ酸又はヌクレオチド配列は、第２のアミノ酸又はヌクレオチド配列と同一又は等価な（例えば、類似した側鎖を伴う）アミノ酸又はヌクレオチドを十分に、又は最小数含有し、これにより第１及び第２のアミノ酸又はヌクレオチド配列は共通ドメインを有する。例えば、約５５％、好ましくは６５％、より好ましくは７０％、さらにより好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％もしくはそれ以上の同一性を有する共通ドメインを含有するアミノ酸又はヌクレオチド配列が、本明細書において十分に同一であるとして定義される。
【００４２】
また、他のカロアーゼ０１−０５ファミリーメンバー、従って配列番号０１〜０７と異なるヌクレオチド配列を有するものをコードする核酸も、本発明の範囲内である。さらに、異なる種由来の、従って配列番号０１〜０７と異なるヌクレオチド配列を有するカロアーゼ０１−０５タンパク質をコードする核酸が本発明の範囲内である。
【００４３】
変異体（例えば、天然対立遺伝子変異体）に相当する核酸分子及び本発明のカロアーゼ０１−０５ＤＮＡの相同体は、本明細書に開示されるカロアーゼ０１−０５核酸とのそれらの相同性に基づき、本明細書に開示されるＤＮＡ又はその好適な断片を使用して、好ましくは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標準的なハイブリダイゼーション技術に従うハイブリダイゼーションプローブとして単離され得る。
【００４４】
カロアーゼ０１−０５配列の天然対立遺伝子変異体に加え、当業者は、突然変異により配列番号０１〜０７のヌクレオチド配列に変化が導入されることにより、カロアーゼ０１−０５タンパク質の機能を実質的に変質させることなく、カロアーゼ０１−０５タンパク質のアミノ酸配列に変化がもたらされ得ることを認識するであろう。
【００４５】
本発明の別の態様において、改良型カロアーゼ０１−０５タンパク質が提供される。改良型カロアーゼ０１−０５タンパク質は、少なくとも１種の生物活性が改良されるタンパク質である。かかるタンパク質は、飽和突然変異誘発などにより、カロアーゼ０１−０５コード配列の全部又は一部にわたり無作為に突然変異を導入することにより得られ得るとともに、結果として得られる変異体は組換え発現させたうえ生物活性についてスクリーニングされ得る。例えば、当該技術分野では、ペルオキシダーゼの酵素活性を計測するための標準アッセイが提供されているとともに、ひいては改良型タンパク質が容易に選択され得る。
【００４６】
好ましい実施形態においてカロアーゼ０１−０５タンパク質は、それぞれ配列番号０８〜１２のいずれか１つに従うアミノ酸配列を有する。別の実施形態において、カロアーゼ０１−０５ポリペプチドは、それぞれ配列番号０８〜１２に従うアミノ酸配列と実質的に相同であるとともにそれぞれ配列番号０８〜１２に従うポリペプチドの少なくとも１種の生物活性を保持し、さらには自然変動又は上述されるとおりの突然変異誘発に起因してアミノ酸配列が異なる。
【００４７】
さらに好ましい実施形態において、カロアーゼ０１−０５タンパク質は、好ましくは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号０１〜０７に従う核酸とハイブリダイズ可能な単離核酸断片によりコードされるアミノ酸配列を有する。
【００４８】
従って、カロアーゼ０１−０５タンパク質は、配列番号０８〜１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも約５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上相同なアミノ酸配列を含んでなるとともに配列番号０８〜１２のいずれか１つに従うポリペプチドの少なくとも１種の機能的活性を保持するタンパク質である。
【００４９】
本発明の別の態様において、本ポリペプチドは配列番号１３〜１７に示される配列の少なくとも１つを含んでなる。好ましくは、本発明に係るポリペプチドは配列番号１３〜１７に示される配列の少なくとも２つを含んでなる。最も好ましくは、本ポリペプチドは配列番号１３〜１７に示される配列の全てを含んでなる。
【００５０】
本発明に係るタンパク質の機能的等価物はまた、例えば、本発明のタンパク質の変異体、例えば切断変異体の組み合わせライブラリをペルオキシダーゼ活性についてスクリーニングすることによっても同定され得る。一実施形態において、変異体の多様化ライブラリは核酸レベルでの組み合わせ突然変異誘発により生成される。変異体の多様化ライブラリは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的にライゲートすることにより産生され、これにより有望なタンパク質配列の縮重セットが個別のポリペプチドとして、又は代替的により大きな融合タンパク質のセットとして（例えば、ファージディスプレイ用）発現可能となり得る。本発明のポリペプチドの有望な変異体のライブラリを縮重オリゴヌクレオチド配列から産生するために、様々な方法が使用され得る。縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法は当該技術分野において周知である（例えば、ナラング（Ｎａｒａｎｇ）（１９８３年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３頁；イタクラ（Ｉｔａｋｕｒａ）ら（１９８４年）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３頁；イタクラ（Ｉｔａｋｕｒａ）ら（１９８４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６頁；イケ（Ｉｋｅ）ら（１９８３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１１：４７７頁を参照のこと）。
【００５１】
加えて、本発明のポリペプチドのコード配列の断片のライブラリが使用され多様なポリペプチド集団が生成されることで、続く変異体の選択がスクリーニングされ得る。例えば、コード配列断片のライブラリは、ニッキングが１分子につき約１回のみ生じる条件下で当該コード配列の二重鎖ＰＣＲ断片をヌクレアーゼにより処置し、二重鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを再生して異なるニッキング産物由来のセンス／アンチセンス対を含み得る二重鎖ＤＮＡを形成し、再編成された二重鎖からＳ１ヌクレアーゼで処置することにより一本鎖部分を取り出し、及び結果として得られる断片ライブラリを発現ベクターにライゲートすることにより生成され得る。この方法により、様々な大きさの当該タンパク質のＮ末端及び内部断片をコードする発現ライブラリが導き出され得る。
【００５２】
切断体の点突然変異により作製される組み合わせライブラリの遺伝子産物をスクリーニングするための、及び選択的な特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするためのいくつかの技術が当該技術分野において周知である。大規模な遺伝子ライブラリのスクリーニング向けの、ハイスループット解析に適した最も広範に使用されている技術は典型的には、遺伝子ライブラリを複製可能な発現ベクターにクローニングするステップ、結果として得られるベクターのライブラリで然るべき細胞を形質転換するステップ、及び所望の活性の検出により産物の検出された遺伝子をコードするベクターの単離が促進される条件下で組み合わせ遺伝子を発現するステップを含む。ライブラリにおける機能的変異の頻度を高める技術である、再帰的アンサンブル突然変異誘発（ＲＥＭ）がスクリーニングアッセイと組み合わせて使用されることにより、本発明のタンパク質の変異体が同定され得る（アーキン（Ａｒｋｉｎ）及びユルバン（Ｙｏｕｒｖａｎ）（１９９２年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７８１１−７８１５頁；デルグレーブ（Ｄｅｌｇｒａｖｅ）ら（１９９３年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６（３）：３２７〜３３１頁）。
【００５３】
カロアーゼ０１についての配列番号０１又は０２、カロアーゼ０２についての配列番号０３又は０４、カロアーゼ０３についての配列番号０５、カロアーゼ０４についての配列番号０６及びカロアーゼ０５についての配列番号０７にそれぞれ示されるカロアーゼ０１−０５遺伝子配列に加え、カロアーゼタンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらし得るＤＮＡ配列多型が所与の集団中に存在し得ることは、当業者には明らかであろう。かかる遺伝子多型は異なる集団由来の細胞中又は自然の対立遺伝子変異に起因する集団内に存在し得る。対立遺伝子変異体はまた、機能的等価物も含み得る。
【００５４】
本発明に係るポリヌクレオチドの断片はまた、機能的ポリペプチドをコードしないポリヌクレオチドを含んでなってもよい。かかるポリヌクレオチドはＰＣＲ反応用のプローブ又はプライマーとして機能し得る。
【００５５】
本発明に係る核酸は、それらのコードするポリペプチドが機能的か非機能的かに関わらず、ハイブリダイゼーションプローブ又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして使用され得る。カロアーゼ０１−０５活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用には、とりわけ、（１）カロアーゼ０１−０５タンパク質をコードする遺伝子、又はその対立遺伝子変異体の、ｃＤＮＡライブラリ、例えばニオイヒメホウライタケ以外の生物からの単離、（２）ベルマ（Ｖｅｒｍａ）ら「Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９８８年）に記載されるとおりの、カロアーゼ０１−０５遺伝子の正確な染色体位置を提供するための分裂中期染色体スプレッドとのインサイチュハイブリダイゼーション（例えばＦＩＳＨ）、（３）特異的組織及び／又は細胞中でのカロアーゼ０１−０５ｍＲＮＡの発現を検出するためのノーザンブロット分析、及び４）診断ツールとして使用して所与の生物学的（例えば、組織）試料中でカロアーゼ０１−０５プローブとハイブリダイズ可能な核酸の存在を分析できるプローブ及びプライマーが含まれる。
【００５６】
カロアーゼ０１−０５遺伝子の機能的等価物を得る方法もまた本発明に包含される。かかる方法は、配列番号０８〜１２のいずれか１つに従う配列の全部もしくは一部又はその任意の変異体をコードする単離核酸を含む標識プローブを得るステップ、核酸断片ライブラリを標識プローブにより、ライブラリ中の核酸断片とのプローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件下でスクリーニングすることにより核酸二重鎖を形成するステップ、及び任意の標識二重鎖中で完全長遺伝子配列を核酸断片から調製してカロアーゼ０１−０５遺伝子に関連する遺伝子を得るステップを伴う。
【００５７】
一実施形態において、本発明のカロアーゼ０１−０５核酸は、それぞれカロアーゼ０１についての配列番号０１又は０２、カロアーゼ０２についての配列番号０３又は０４、カロアーゼ０３についての配列番号０５、カロアーゼ０４についての配列番号０６及びカロアーゼ０５についての配列番号０７に示される核酸配列又はその任意の相補体と、少なくとも５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上相同である。
【００５８】
別の好ましい実施形態において本発明のカロアーゼ０１−０５ポリペプチドは、それぞれ配列番号０８〜１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上相同である。
【００５９】
［ポリヌクレオチド］
本発明は、配列番号０８〜１２に従うアミノ酸配列又はその任意の機能的等価物を有する、カロアーゼ０１−０５と仮称される漂白酵素（ペルオキシダーゼ）をコードするポリヌクレオチドを提供する。カロアーゼ０１−０５をコードする遺伝子の配列は、ニオイヒメホウライタケから得られるｃＤＮＡを増幅することにより決定された。カロアーゼ０１及びカロアーゼ０２をそれぞれコードする配列番号０２及び配列番号０４を有する配列は、取り上げられる遺伝子の最適化バージョンであり、コドン最適化が行われている。コドン最適化は当業者に周知の方法に従い使用され得るとともに特に宿主細胞中での遺伝子の発現の改良に好適である。本発明は、カロアーゼ０１−０５ペルオキシダーゼをコードする遺伝子を含んでなるポリヌクレオチド配列を提供する。従って、本発明は、配列番号０１〜０７に従うヌクレオチド配列又はその任意の機能的等価物を含んでなる単離ポリヌクレオチドに関する。ニオイヒメホウライタケの配列番号０１〜０７が漂白活性を有するという発見は、特に配列は既知の漂白酵素との相同性が極めて低いことから、極めて驚くべきものであった。
【００６０】
より詳細には、本発明は、ストリンジェントな条件下で、好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、配列番号０１〜０７に従うポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能な単離ポリヌクレオチドに関する。有利には、かかるポリヌクレオチドは、真菌類、好ましくは糸状菌類、特にニオイヒメホウライタケから得られ得る。より具体的には、本発明は、配列番号０１〜０７に従うヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチドに関する。
【００６１】
本所及び以下で使用されるとき、用語「遺伝子」及び「組換え遺伝子」は、染色体ＤＮＡから単離され得る核酸分子を参照し、これはタンパク質、例えばニオイヒメホウライタケ漂白酵素をコードするオープンリーディングフレームを含む。遺伝子は、コード配列、非コード配列、イントロン及び調節配列を含み得る。さらに、遺伝子は本明細書に定義されるとおりの単離核酸分子を参照する。
【００６２】
配列番号０１〜０７のヌクレオチド配列を有する核酸分子又はその機能的等価物などの本発明の核酸分子は、標準的な分子生物学的技術及び本明細書に提供される配列情報を使用して単離され得る。例えば、配列番号０１〜０７の核酸配列の全部又は一部をハイブリダイゼーションプローブとして使用することにより、標準的なハイブリダイゼーション及びクローン技術を使用して（例えば、サムブルック・Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッチ・Ｅ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．）、及びマニアチス・Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州、１９８９年に記載されるとおり）本発明に係る核酸分子が単離され得る。
【００６３】
さらに、配列番号０１〜０７の全部又は一部を包含する核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって配列番号０１〜０７に含まれる配列情報に基づき設計される合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して単離され得る。
【００６４】
本発明の核酸は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又は代替的にゲノムＤＮＡを鋳型として、及び然るべきオリゴヌクレオチドプライマーを使用して標準的なＰＣＲ増幅技術に従い増幅され得る。そのように増幅される核酸は然るべきベクターにクローニングされ得るとともにＤＮＡ配列解析により特性化され得る。
【００６５】
さらには、本発明に係るヌクレオチド配列に対応する、又はそれとハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドが標準的な合成技術により、例えば自動ＤＮＡ合成機を使用して調製され得る。
【００６６】
好ましい実施形態において、本発明の単離核酸分子は、配列番号０１〜０７に示されるヌクレオチド配列を含んでなる。このＤＮＡは、配列番号０８〜１２にそれぞれ従うニオイヒメホウライタケカロアーゼ０１−０５ポリペプチドをコードする配列を含んでなる。
【００６７】
別の好ましい実施形態において、本発明の単離核酸分子は、配列番号０１〜０７に示されるヌクレオチド配列の相補体又はそれらのヌクレオチド配列の機能的等価物である核酸分子を含んでなる。
【００６８】
別のヌクレオチド配列と相補的な核酸分子は、他のヌクレオチド配列と十分に相補的であるため他のヌクレオチド配列とハイブリダイズでき、それにより安定な二重鎖を形成する核酸分子である。
【００６９】
本発明の一態様は、本発明のポリペプチド又は生物学的に活性な断片又はドメインなどのその機能的等価物をコードする単離核酸分子、ならびにハイブリダイゼーションプローブとして使用され、核酸分子の増幅又は突然変異用のＰＣＲプライマーとして使用するのに好適な本発明のポリペプチドをコードする核酸分子及びかかる核酸分子の断片を同定するのに十分な核酸分子に関する。
【００７０】
「単離ポリヌクレオチド」又は「単離核酸」は、由来する生物体の天然ゲノム中では直ちに連続する（一方は５’末端上で、及び一方は３’末端上で）コード配列の双方と直ちに連続しないＤＮＡ又はＲＮＡである。従って、一実施形態において、単離核酸は、コード配列に直ちに連続する５’非コード（例えば、プロモーター）配列の一部又は全部を含む。それゆえ本用語は、例えば、ベクター、自己複製プラスミド又はウイルス、又は原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれる組換えＤＮＡ、又は別個の分子（例えば、ＰＣＲ又は制限エンドヌクレアーゼ処置により産生されるｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ断片）として他の配列と無関係に存在するものを含む。これはまた、実質的に細胞物質、ウイルス性物質、又は培養培地（組換えＤＮＡ技術により産生される場合）、又は化学的前駆体又は他の化学物質（化学的に合成される場合）のない追加的なポリペプチドをコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも含む。さらに、「単離核酸断片」は、断片として天然ではなく、自然状態では存在しないであろう核酸断片である。
【００７１】
本明細書で使用されるとき、用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）及びヌクレオチド類似体を使用して生成されるＤＮＡ又はＲＮＡの類似体を含むことが意図される。核酸分子は一本鎖又は二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。核酸は、オリゴヌクレオチド類似体又は誘導体（例えば、イノシン又はホスホロチオエートヌクレオチド）を使用して合成されてもよい。かかるオリゴヌクレオチドは、例えば、変質した塩基対合能力又は増加したヌクレアーゼ耐性を有する核酸を調製するために使用され得る。
【００７２】
本発明の別の実施形態は、カロアーゼ０１−０５核酸分子に対するアンチセンスである単離核酸分子、例えば、カロアーゼ０１−０５核酸分子のコード鎖をそれぞれ提供する。本明細書に記載される核酸分子の相補鎖もまた本発明の範囲内に含まれる。
【００７３】
［配列決定エラー］
本明細書に提供されるとおりの配列情報は、誤って同定される塩基の包含要件に関してそれほど狭義に解釈されるべきではない。本明細書に開示される特異的配列は完全な遺伝子を真菌類、特にニオイヒメホウライタケから単離するために容易に使用され得、ひいてはさらなる配列解析に容易に供され、それにより配列決定エラーを同定し得る。
【００７４】
別段に指示されない限り、本明細書においてはＤＮＡ分子の配列決定により決定される全てのヌクレオチド配列が自動ＤＮＡシークエンサーを使用して決定されたとともに、本明細書で決定されるＤＮＡ分子によりコードされるポリペプチドの全てのアミノ酸配列が上記のとおり決定されたＤＮＡ配列の翻訳により予測された。それゆえ、この自動化手法により決定される任意のＤＮＡ配列について当該技術分野において周知のとおり、本明細書で決定される任意のヌクレオチド配列はいくらかのエラーを含み得る。自動化により決定されるヌクレオチド配列は、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列と典型的には少なくとも約９０％同一であり、より典型的には少なくとも約９５％から少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、当該技術分野において周知の手動ＤＮＡ配列決定法を含む他の手法によってより正確に決定され得る。同様に当該技術分野において周知のとおり、実際の配列と比較される決定されたヌクレオチド配列中の単一の挿入又は欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳においてフレームシフトを引き起こすであろうため、決定されたヌクレオチド配列によりコードされる予測されたアミノ酸配列は配列決定されたＤＮＡ分子により実際にコードされるアミノ酸配列と完全に異なり、かかる挿入点又は欠失点が始端となるであろう。
【００７５】
当業者は、そのような誤って同定された塩基を同定する能力を有するとともにかかるエラーをどのように修正するかについて知っている。
【００７６】
［核酸断片、プローブ及びプライマー］
本発明に係る核酸分子は、配列番号０１〜０７に示される核酸配列の部分又は断片のみを含んでなってもよく、例えばその断片はプローブ又はプライマーとして使用され得るか、又はカロアーゼ０１−０５タンパク質の一部をコードする断片であり得る。カロアーゼ０１−０５遺伝子及びｃＤＮＡのクローニングから決定されるヌクレオチド配列は、他のカロアーゼ０１−０５ファミリーメンバー、ならびに他の種由来のカロアーゼ０１−０５相同体の同定及び／又はクローニングにおける使用向けに設計されるプローブ及びプライマーの生成を可能にする。プローブ／プライマーは典型的には、好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、配列番号０１〜０７に示されるヌクレオチド配列又はその任意の機能的等価物の、少なくとも約１２又は１５個、好ましくは約１８又は２０個、好ましくは約２２又は２５個、より好ましくは約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、又は７５個もしくはそれ以上連続するヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を典型的に含んでなる、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含んでなる。
【００７７】
カロアーゼ０１−０５ヌクレオチド配列に基づくプローブは、例えば他の生物体内で同一又は相同のタンパク質をコードする転写産物又はゲノムカロアーゼ０１−０５配列を検出するために使用され得る。好ましい実施形態において、プローブはさらにそれに結合する標識群を含んでなり、例えば標識群は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、又は酵素補因子であり得る。かかるプローブはまた、カロアーゼ０１−０５タンパク質を発現する細胞を同定するための診断テストキットの一部としても使用され得る。
【００７８】
［同一性及び相同性］
用語「相同性」又は「パーセント同一性」は本明細書において同義的に使用される。本発明の目的上、本明細書の定義では、２本のアミノ酸配列又は２本の核酸配列のパーセント同一性を決定するため、配列は最適比較用に整列される（例えば、第２のアミノ又は核酸配列との最適アラインメントのため第１のアミノ酸の配列又は核酸配列中にギャップが導入され得る）。次に対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第１の配列内の位置が第２の配列内の対応する位置と同一のアミノ酸残基又はヌクレオチドにより占有される場合、分子は当該位置において同一である。２本の配列間のパーセント同一性は、配列により共有される同一位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一位置の数／位置の総数（すなわち、重複位置）×１００）。好ましくは、２本の配列は同じ長さである。
【００７９】
当業者は、２本の配列間の相同性を決定するため数種の異なるコンピュータプログラムが利用可能であるという事実を承知しているであろう。例えば、２本の配列間の配列の比較及びパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。好ましい実施形態において、２本のアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍ／ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｉａｎ／で入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）及びウンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３頁（１９７０年））のアルゴリズムを使用して決定され、いずれもＢｌｏｓｓｏｍ６２行列又はＰＡＭ２５０行列、及びギャップ加重について１６、１４、１２、１０、８、６、又は４を、及び長さ加重について１、２、３、４、５、又は６を使用する。当業者は、これらの種々のパラメータの全てがいくらか異なる結果を与え得るが、２本の配列の全体的なパーセンテージ同一性は異なるアルゴリズムを使用してもそれほど変化しないことを理解するであろう。
【００８０】
さらに別の実施形態において、２本のヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して決定され、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列、及びギャップ加重について４０、５０、６０、７０、又は８０を、及び長さ加重について１、２、３、４、５、又は６を使用する。別の実施形態において、２本のアミノ酸又はヌクレオチド配列のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）（ｈｔｔｐ：／／ｖｅｇａ．ｉｇｈ．ｃｎｒｓ．ｆｒ／ｂｉｎ／ａｌｉｇｎ−ｇｕｅｓｓ．ｃｇｉで入手可能）に組み込まれているＥ．メイヤーズ（Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ）及びＷ．ミラー（Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ）（ＣＡＢＩＯＳ、４：ｌｌ−１７頁（１９８９年）のアルゴリズムを使用して決定され、ＰＡＭ１２０加重残基表、ギャップ長ペナルティは１２及びギャップペナルティは４を使用する。
【００８１】
本発明の核酸及びタンパク質配列はさらに、公開データベースに対し検索を実行して、例えば、他のファミリーメンバー又は関連配列を同定するための、「問い合わせ配列」として使用され得る。かかる検索は、アルチュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０頁のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実行され得る。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索がＮＢＬＡＳＴプログラムにより、スコア＝１００、ワード長＝１２で実行されることにより本発明のカロアーゼ０１−０５核酸分子と相同なヌクレオチド配列が得られ得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索がＸＢＬＡＳＴプログラムにより、スコア＝５０、ワード長＝３で実行されることにより本発明のカロアーゼ０１−０５タンパク質分子と相同なアミノ酸配列が得られ得る。比較用のギャップ付きアラインメントを得るため、アルチュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９〜３４０２頁に記載されるとおり、ギャップ付きＢＬＡＳＴが利用され得る。ＢＬＡＳＴ及びギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータが使用され得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を参照されたい。
【００８２】
［ハイブリダイゼーション］
本明細書で使用されるとき、用語「ハイブリダイズする」はハイブリダイゼーション及び洗浄についての条件を記載することが意図され、その条件下では互いに少なくとも約５５％、少なくとも約４０％、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約８５％〜９０％、より好ましくは少なくとも９５％相同なヌクレオチド配列が典型的には互いにハイブリダイズされたまま残る。
【００８３】
かかるハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例は、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５℃でのハイブリダイゼーションに続き、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃、好ましくは５５℃、好ましくは６０℃及びさらにより好ましくは６５℃での１回又は複数回の洗浄である。
【００８４】
高度にストリンジェントな条件としては、例えば、６８℃で５×ＳＳＣ／５×デンハルト溶液／１．０％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション及び０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、室温での洗浄が挙げられる。あるいは、洗浄は４２℃で実施されてもよい。
【００８５】
当業者は、どの条件がストリンジェント及び高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に該当するかは周知であろう。かかる条件に関するさらなる指針は、例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９年、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州；及びオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（編）、１９９５年、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州）など、当該技術分野において容易に入手可能である。
【００８６】
当然ながら、ポリＡ配列（ｍＲＮＡの３’末端ポリ（Ａ）トラクトなど）、又はＴ（又はＵ）残基の相補的伸長部とのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部と特異的にハイブリダイズするために使用される本発明のポリヌクレオチドには含まれないであろうが、これはかかるポリヌクレオチドがポリ（Ａ）伸長部又はその相補体（例えば、実質的に任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）を含む任意の核酸分子とハイブリダイズするであろうためである。
【００８７】
［他の生物体からの完全長ＤＮＡの入手］
典型的な手法においては、他の生物体、例えば糸状菌類、特にホウライタケ属菌種から構築されるｃＤＮＡライブラリがスクリーニングされ得る。
【００８８】
例えば、ホウライタケ株は相同なカロアーゼ０１−０５ポリヌクレオチドについてノーザンブロット分析によりスクリーニングされ得る。本発明に係るポリヌクレオチドと相同な転写産物が検出されると、当業者に周知の標準的技術を利用して、然るべき株から単離されるＲＮＡからｃＤＮＡライブラリが構築され得る。あるいは、本発明に係るカロアーゼ０１−０５ポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能なプローブを使用して、全ゲノムＤＮＡライブラリがスクリーニングされ得る。
【００８９】
相同な遺伝子配列は、例えば、本明細書に教示されるとおりのヌクレオチド配列に基づき設計される２個の縮重オリゴヌクレオチドプライマープールを使用してＰＣＲを実施することにより単離され得る。
【００９０】
反応用鋳型は、本発明に係るポリヌクレオチドを発現することが既知の、又は疑わしい株から調製されるｍＲＮＡの逆転写により得られるｃＤＮＡであり得る。ＰＣＲ産物がサブクローニング及び配列決定されることで増幅された配列は新規カロアーゼ０１−０５核酸配列、又はそれらの機能的等価物の配列に相当することが保証され得る。
【００９１】
次にＰＣＲ断片が使用され完全長ｃＤＮＡクローンが様々な周知の方法により単離され得る。例えば、増幅断片が標識されるとともに使用され、バクテリオファージ又はコスミドｃＤＮＡライブラリがスクリーニングされ得る。あるいは、標識された断片が使用され、ゲノムライブラリがスクリーニングされ得る。
【００９２】
ＰＣＲ技術はまた、完全長ｃＤＮＡ配列を他の生物体から単離するためにも使用され得る。例えば、ＲＮＡは標準的手順に従い然るべき細胞又は組織源から単離され得る。逆転写反応が、初回の鎖合成のプライミング用増幅断片の５’最末端に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用してＲＮＡ上で実施され得る。
【００９３】
結果として得られるＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは次に、標準的な末端トランスフェラーゼ反応を使用して「テール付き」にされ得（例えば、グアニンにより）、ハイブリッドはＲＮアーゼＨで消化され得、及び次に第２の鎖合成が予備刺激され得る（例えば、ポリＣプライマーにより）。従って、増幅断片の上流のｃＤＮＡ配列は容易に単離され得る。有用なクローニング戦略のレビューについては、例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、上記；及びオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、上記を参照されたい。
【００９４】
［ベクター］
本発明の別の態様は、カロアーゼ０１−０５タンパク質又はそれらの機能的等価物をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書で使用されるとき、用語「ベクター」は、それが連結している別の核酸の輸送能を有する核酸分子を参照する。ある種類のベクターは「プラスミド」であり、これは追加的なＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二重鎖ＤＮＡループを参照する。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ここでは追加的なＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲートされ得る。特定のベクターはそれが導入される宿主細胞内での自己複製能を有する（例えば、細菌性複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれるとともに、それにより宿主ゲノムと共に複製される。そのうえ、特定のベクターはそれらが操作可能に連結される遺伝子の発現の誘導能を有する。本明細書においてかかるベクターは「発現ベクター」と称される。一般的に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはプラスミドの形態であることが多い。用語「プラスミド」及び「ベクター」が本明細書において同義的に使用され得るのは、プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるためである。しかしながら、本発明は、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）などの、等価な機能を供する他の形態の発現ベクターを含むことも意図される。
【００９５】
本発明の組換え発現ベクターは、本発明の核酸を宿主細胞中での核酸の発現に好適な形態で含んでなり、これは組換え発現ベクターが、発現に使用される宿主細胞に基づき選択される、発現される核酸配列に操作可能に連結される１本又は複数の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクターの範囲内で、「操作可能に連結される」は、当該ヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現（例えば、インビトロ転写／翻訳系内での、又はベクターが宿主細胞中に導入される場合には宿主細胞内での）を可能にするような方法で調節配列に連結されることを意味するように意図される。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。かかる調節配列は、例えば、ゲーデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）、「Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、サン・ディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、カリフォルニア州（１９９０年）に記載される。調節配列としては、多くの種類の宿主細胞内でヌクレオチド配列の構成的発現を誘導するもの、及び特定の宿主細胞内でのみヌクレオチド配列の発現を誘導するもの（例えば組織特異的調節配列）が挙げられる。当業者には、発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等の要因に依存し得ることが理解されるであろう。本発明の発現ベクターが宿主細胞に導入されることにより、本明細書に記載されるとおりの核酸（例えばカロアーゼ０１−０５タンパク質、カロアーゼ０１−０５タンパク質の変異型、それらの断片、変異体又は機能的等価物、融合タンパク質等）によりコードされるタンパク質又はペプチドが産生され得る。
【００９６】
本発明の組換え発現ベクターは、カロアーゼ０１−０５タンパク質の原核生物又は真核生物細胞中での発現用に設計され得る。例えば、カロアーゼ０１−０５タンパク質は真菌細胞、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用して）、酵母細胞又は哺乳動物細胞内で発現し得る。好適な宿主細胞が、ゲーデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）、「Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、サン・ディエゴ、カリフォルニア州（１９９０年）においてさらに考察されている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えばＴ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを使用してインビトロで転写及び翻訳され得る。
【００９７】
本発明において有用な発現ベクターとしては、染色体由来、エピソーム由来及びウイルス由来ベクター、例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体要素、ウイルス、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス及びレトロウイルスなどに由来するベクター、及びそれらの組み合わせに由来するベクター、例えば、コスミド及びファージミドなど、プラスミド及びバクテリオファージ遺伝要素に由来するものなどが挙げられる。
【００９８】
ＤＮＡインサートは、いくつか例を挙げれば、λファージＰＬプロモーター、大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐ及びｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター及びレトロウイルスＬＴＲのプロモーターなどの、然るべきプロモーターに操作可能に連結されるべきである。他の好適なプロモーターは当業者に周知であろう。特定の実施形態において、プロモーターは、原核生物又は糸状菌類中でのペルオキシダーゼの高い発現レベルの誘導能を有することが好ましい。かかるプロモーターは当該技術分野において周知である。発現コンストラクトは転写開始、終結のための部位を、及び、転写領域において、翻訳のためのリボソーム結合部位を含み得る。コンストラクトにより発現する成熟転写産物のコード部分は、始端に翻訳開始ＡＵＧを、及び翻訳されるポリペプチドの末端に適切に位置する終止コドンを含むであろう。
【００９９】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換又はトランスフェクション技術を介して原核生物又は真核生物細胞に導入され得る。本明細書で使用されるとき、用語「形質転換」及び「トランスフェクション」は、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、形質導入、感染、リポフェクション、陽イオン性脂質媒介トランスフェクション又は電気穿孔を含む、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための当該技術分野で認知されている様々な技術を参照することが意図される。宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトするための好適な方法は、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州、１９８９年）、デイビス（Ｄａｖｉｓ）ら、「Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８６年）及び他の実験マニュアルに見られる。
【０１００】
哺乳動物細胞の安定的なトランスフェクションについて、使用される発現ベクター及びトランスフェクション技術によっては、細胞の小さな画分のみがそれらのゲノムに外来ＤＮＡを組み込み得ることが知られている。これらの組み込み体を同定及び選択するため、一般的に選択可能なマーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が当該遺伝子とともに宿主細胞に導入される。好ましい選択可能なマーカーとしては、Ｇ４１８、ハイグロマイシン及びメトトレキサートなどの薬剤に耐性を与えるものが挙げられる。選択可能なマーカーをコードする核酸はカロアーゼ０１−０５タンパク質をコードするものと同じベクター上の宿主細胞に導入され得るか、又は別個のベクターに導入され得る。導入された核酸を安定的にトランスフェクトされる細胞は薬剤選択により同定され得る（例えば、導入された選択可能なマーカー遺伝子を有する細胞は生存するであろう一方、他の細胞は死滅する）。
【０１０１】
原核生物中でのタンパク質の発現は、融合又は非融合タンパク質のいずれの発現も誘導する構成的又は誘導性プロモーターを含むベクターを伴い大腸菌中で行われることが多い。融合ベクターはそこでコードされるタンパク質、例えば組換えタンパク質のアミノ末端に数多くのアミノ酸を付加する。かかる融合ベクターは典型的には３つの目的を果たす：１）組換えタンパク質の発現を増加させる、２）組換えタンパク質の溶解度を上昇させる、及び３）親和性精製においてリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を補助する。多くの場合、融合発現ベクターにおいては、タンパク質分解切断部位が融合部分と組換えタンパク質との接合部に導入されることにより融合タンパク質の精製後の、組換えタンパク質の融合部分からの分離が可能となる。かかる酵素、及びそれらの同種認識配列としては、因子Ｘａ、トロンビン及びエンテロキナーゼが挙げられる。
【０１０２】
指摘されるとおり、発現ベクターは好ましくは選択可能なマーカーを含む。かかるマーカーとしては、真核生物細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクターゼ又はネオマイシン耐性及び大腸菌及び他の細菌中の培養物についてはテトラサイクリン又はアンピシリン耐性が挙げられる。然るべき宿主の代表例としては、大腸菌、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）及びネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などの細菌細胞、酵母などの真菌細胞；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２及びスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９などの昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ及びＢｏｗｅｓメラノーマなどの動物細胞、及び植物細胞が挙げられる。上述の宿主細胞についての然るべき培養の培地及び条件は当該技術分野において周知である。
【０１０３】
細菌における使用に好ましいベクターには、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）から入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０及びＰＱＥ−９、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から入手可能なｐＢＳベクター、ファージスクリプトベクター、ブルースクリプトベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、及びファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５がある。好ましい真核生物のベクターには、ストラタジーンから入手可能なＰＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＺＴ１及びｐＳＧ、及びファーマシアから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬがある。他の好適なベクターは当業者には直ちに明らかであろう。
【０１０４】
本発明において使用するための既知の細菌プロモーターとしては、大腸菌ｌａｃＩ及びｌａｃＺプロモーター、Ｔ３及びＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、λＰＲ、ＰＬプロモーター及びｔｒｐプロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）のものなど、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター、及びマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターなどのメタロチオネインプロモーターが挙げられる。
【０１０５】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡのより高等な真核生物による転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加し得る。エンハンサーは、ＤＮＡのシス作用要素であり、通常約１０〜３００ｂｐが所与の宿主細胞型においてプロモーターの転写活性を増加させるよう作用する。エンハンサーの例としては、ｂｐ１００〜２７０における複製起点の後期側に位置するＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
【０１０６】
翻訳されたタンパク質の小胞体内腔、細胞膜周辺腔又は細胞外環境への分泌について、然るべき分泌シグナルが発現ポリペプチドに組み込まれ得る。シグナルはポリペプチドにとって内在的であってもよく、又は異種シグナルであってもよい。
【０１０７】
ポリペプチドは、融合タンパク質などの改変された形態で発現し得るとともに、分泌シグナルのみならず、追加的な非相同機能領域も含み得る。従って、例えば、追加的なアミノ酸の領域において、特別に変化したアミノ酸がポリペプチドのＮ末端に付加されることにより、精製中又はそれに続く出荷及び保管中の宿主細胞内における安定性及び持続性が改善され得る。また、ペプチド部分がポリペプチドに付加されることにより、精製が促進され得る。
【０１０８】
［宿主細胞］
別の実施形態において、本発明は、細胞、例えば、本発明により包含される核酸を含有する形質転換宿主細胞又は組換え宿主細胞を特徴とする。「形質転換細胞」又は「組換え細胞」は、組換えＤＮＡ技術によってその細胞に（又はその祖先に）本発明に係る核酸が導入された細胞である。例えば、細菌、真菌類、酵母など、原核生物及び真核生物の双方の細胞が含まれる。
【０１０９】
好適な宿主細胞の例は、ミクロシスティス（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ）属、ムラサキシメジ（Ｌｅｐｉｓｔａ）属、例えばハタシメジ（Ｌ．ｉｒｉｎａ）、チャダイゴケ（Ｃｙａｔｈｕｓ）属、例えばハゲチャダイゴケ（Ｃ．ｐａｌｌｉｄｕｓ）、マンネンタケ（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）属、例えばコフキサルノコシカケ（Ｇ．ａｐｐｌａｎａｔｕｍ）、ヤニタケ（Ｉｓｃｈｎｏｄｅｒｍａ）属、例えばＩ．ベンゾイナム（Ｉ．ｂｅｎｚｏｉｎｕｍ）、ホウライタケ属、例えばニオイヒメホウライタケ、シロアミタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）属、例えばカワラタケ（Ｔ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）のシロアミタケ（Ｔ．ｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、例えばＣ．ラウレンチイ（Ｃ．ｌａｕｒｅｎｔｉｉ）、ヒポミケス（Ｈｙｐｏｍｙｃｅｓ）属、例えばＨ．オドラツス（Ｈ．ｏｄｏｒａｔｕｓ）又はファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）属、例えばＰ．ロドジマ（Ｐ．ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）、ファネロキエート（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属、例えばＰ．クリソスポリウム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、レンチヌラ（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ）属、例えばシイタケ（Ｌ．ｅｄｏｄｅｓ）、ヒトヨタケ（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）属、例えばウシグソヒトヨタケ（Ｃ．ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、キカイガラタケ（Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍ）属、例えばキチリメンタケ（Ｇ．ｔｒａｂｅｕｍ）、オフィオストマ（Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ）属、例えばＯ．ピリフェラム（Ｏ．ｐｉｌｉｆｅｒｕｍ）、アスペルギルス属、例えばＡ．ニガー、Ａ・オリゼ、Ａ．ニデュラン（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、サーモミセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）属、例えばＴ．ラヌギノーサ（Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、スポロトリカム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、例えばＳ．サーモフィル（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ）、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、例えばＡ．プルランス（（Ａ．ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、アモルホーテカ（Ａｍｏｒｐｈｏｔｈｅｃａ）属、例えばＡ．レシナエ（Ａ．ｒｅｓｉｎａｅ）、ロイコスポリジウム（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、例えばＬ．スコチイ（Ｌ．ｓｃｏｔｔｉｉ）、クスダマカビ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ）属、例えばＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）である。
【０１１０】
特に好ましくは、特にアスペルギルス属−例えばアスペルギルス・オリゼ又はアスペルギルス・ニガー−及びホウライタケ属−例えばニオイヒメホウライタケ−といった糸状菌類由来の細胞又はピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、−例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ）−などの酵母由来の細胞又は細菌由来の細胞である。
【０１１１】
挿入された配列の発現を調節する、又は遺伝子産物を特異的な所望の様式で修飾及び処理する宿主細胞が選択され得る。タンパク質産物のかかる修飾（例えばグリコシル化）及びプロセシング（例えば切断）はタンパク質の最適な機能性を促進し得る。
【０１１２】
様々な宿主細胞は、翻訳後プロセシングならびにタンパク質及び遺伝子産物の修飾についての特性及び特異的機序を有する。分子生物学及び／又は微生物学の当業者によく知られている然るべき細胞系又は宿主系が選択されることにより、発現させる外来タンパク質の所望の及び妥当な修飾及びプロセシングを確実なものとし得る。この目的上、一次転写産物の適正なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化、及びリン酸化のための細胞機構を有する真核生物宿主細胞が使用され得る。かかる宿主細胞は当該技術分野において周知である。
【０１１３】
宿主細胞としてはまた、限定はされないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８などの哺乳動物細胞系、及び脈絡叢細胞系が挙げられる。所望であれば、本発明に係るポリペプチドは安定的にトランスフェクトされた細胞系により産生され得る。哺乳動物細胞の安定的なトランスフェクションに好適な数多くのベクターが一般に利用可能であり、かかる細胞系を構築するための方法もまた、例えば、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（上記）において公知である。
【０１１４】
［本発明に係るポリペプチドの工業プロセスにおける使用］
本発明の別の態様は、本発明に係るポリペプチド又はその機能的等価物（これ以降、漂白酵素と称される）の、例えば洗剤、酵素ストーンウォッシュ加工又は食品製造、例えばパン製品又は乳製品などの工業プロセスにおける使用を含んでなる。
【０１１５】
本発明に係るポリペプチドは酵素調製物として使用されてもよく、又は前記酵素の産生能を有する微生物によりインサイチュで産生されてもよい。酵素調製物は様々な供給源、例えば植物、動物及び微生物に由来し得る。好ましくは酵素調製物は微生物に由来し、これは微生物によって工業規模で制御された方式により酵素を得ることが可能となるためである。微生物に由来する酵素調製物は選択された微生物株の古典的発酵処理により、又は本発明に係るポリペプチドを過剰発現する微生物の発酵により得られ得る。微生物は、細菌、真菌又は酵母であってもよい。非古典的発酵のための宿主細胞として好適な微生物の例については、宿主細胞に関する上記の一節が参照される。
【０１１６】
酵素調製物はまた、他の好適な酵素、例えばオキシドレダクターゼ、アミラーゼ、脂肪分解酵素、加水分解酵素なども含んでなり得る。意外なことに、特にオキシドレダクターゼ、例えばヘキソースオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、マルトース酸化酵素又はグルコースオキシダーゼの組み合わせが本発明に係る漂白酵素の酵素活性に相乗効果を有することが発見された。オキシドレダクターゼは、微生物を含む種々の供給源から得られ得る。好ましくは真菌源由来、例えば糸状菌類由来のオキシドレダクターゼが使用される。好適なオキシドレダクターゼは、例えばアスペルギルス・ニガーなどのアスペルギルス種から得られるグルコースオキシダーゼである。従って本発明はまた、本発明に係るポリペプチドの新規酵素の、オキシドレダクターゼとの組み合わせにも関する。
【０１１７】
この効果は、本発明に係る酵素調製物が使用される適用において、オキシドレダクターゼが活性となる基質が存在する場合にはさらに亢進される。これが存在しない場合、これはまた処理に添加され得るであろう。かかる基質の例は、ヘキソースオキシダーゼ又はグルコースオキシダーゼの使用時のグルコースの添加である。従って本発明はまた、本発明に係るポリペプチド及びオキシドレダクターゼならびにオキシドレダクターゼ用の基質を含んでなる酵素調製物を含んでなる新規組成物にも関する。
【０１１８】
本発明はさらに、新規酵素の組み合わせ及び新規組成物の、以下に記載される本発明に係る食品の製造工程における使用に関する。
【０１１９】
意外なことに、本発明に係るポリペプチド又はその機能的等価物が使用されることにより食品の少なくとも一部の白色度が向上することが発見された。好ましくは、本発明に係る漂白ポリペプチドは以下の食品製造工程において使用される。食品の中間形態が色素を含んでなる食品の製造工程は、少なくとも１種の本発明に係るポリペプチドを、前記酵素がその製造中に添加されない食品と比較して食品の少なくとも一部の白色度を向上させるうえで有効な量で添加するステップを含んでなる。
【０１２０】
食品の中間形態は本明細書において、食品の最終形態を得る前の製造工程中に生じる任意の形態と定義される。中間形態は、使用される個々の原材料及び／又はそれらの混合物及び／又は添加剤を伴う混合物及び／又は加工助剤、又はそれに続くそれらの加工形態を含んでなり得る。
【０１２１】
本発明に係るポリペプチドは有効量で添加される。当業者はこの有効量を、酵素投入量を変えることにより、及び最終食品の色素の分解及び／又は白色度の向上を計測することにより容易に決定できる。酵素がβ−カロテンの変換能を有する場合、酵素の有効量は、β分解単位（例えばＡｚｉｚ又はＺｏｒｎ単位−「材料及び方法」を参照）に関して表現され得る。
【０１２２】
食品は、小麦粉などの植物源である少なくとも１種の原材料から作製され得る。小麦粉は、例えば、焼き上げたパンの内相の着色の原因となるカロテノイド（カロテン及びキサントフィル）及びフラボンなどの色素を含有することが知られている。あるいは、これらの色素は、例えば乳など、植物原材料以外の供給源に由来し得る。カロテノイドの例は、カロテン骨格を伴う、特にβ−カロテン又はカプサンチン骨格、より詳細にはα及びβ−カロテン、ルテイン、リコピン、アンテラキサンチン、カプサンチン、ゼアキサンチン、ビオラキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、ルテオキサンチン、ネオキサンチン、及びそれぞれのアポカロテノイドを伴うさらなる物質である。
【０１２３】
本発明に係るプロセスに好ましい食品は、ベークドパン及び小麦粉及び／又は他の穀類原料の粉末から焼き上げた他の製品である。
【０１２４】
例えば、ベークド食パンについて、中間形態としては、例えば小麦粉、それと他のパン成分との、例えば水、塩、酵母及びパン改良組成物などとの初期混合物、混合生地、練り生地、発酵生地及び部分的に焼いた生地が含まれる。酵素がβ−カロテンの変換能を有する場合、酵素は小麦粉及び／又は他の穀類原料の粉末に対し、又は他のパン成分との任意の初期混合物に対し、穀粉１ｋｇ当たり１〜５０００Ｚｏｒｎ単位、好ましくは穀粉１ｋｇ当たり５〜１０００Ｚｏｒｎ単位、より好ましくは穀粉１ｋｇ当たり１０〜５００Ｚｏｒｎ単位及び最も好ましくは穀粉１ｋｇ当たり２５〜２５０Ｚｏｒｎ単位となるような量で添加される。酵素はまた、他の生地及び／又は当該技術分野において周知のパン改良加工助剤、例えば当該技術分野において周知の１種又は複数種の酵素（例えば、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、抗老化マルトジェニックα−アミラーゼなどのデンプン分解酵素、リパーゼ、ホスホリパーゼ、ガラクトリパーゼなどの脂肪分解酵素、グルコースオキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ラッカーゼ、ピラノースオキシダーゼ、炭水化物オキシダーゼなどの酸化酵素、キシラナーゼ、アラビノフラノシダーゼなどのヘミセルロース分解酵素、エンドグルカナーゼ（セルラーゼなど）、セロビオヒドロラーゼ、プロテアーゼなどのセルロース分解酵素及び／又は還元剤及び酸化剤（例えばアスコルビン酸、グルタチオン）、乳化剤（例えばＤＡＴＥＭ）等の当該技術分野において周知の化学的加工助剤等とのパン改良剤混合物と共に、又はその一部として添加されてもよい。
【０１２５】
一部の種類の麺類においては、白い製品が望ましいと見なされる。例えば、麺類について、中間形態としては、例えば小麦粉、水、塩、及び他の麺成分とのその初期混合物、混合生地及び、生麺、乾燥麺、茹で麺、蒸し麺及び／又は揚げ麺であり得る最終麺製品が含まれる。
【０１２６】
食品はまた、乳製品であり得る。乳製品とは、乾燥固体ベースで少なくとも１０重量％、好ましくは少なくとも３０重量％、より好ましくは少なくとも５０重量％、なおより好ましくは少なくとも７０重量％又は最も好ましくは少なくとも８０重量％の乳、好ましくはウシの乳由来成分を含有する製品を意味する。乳由来成分は、例えば脂肪、タンパク質、例えば乳清チーズカード及びカゼイン等である。乳、特にウシの乳は、カロテノイド、例えばβ−カロテンなどの着色化合物を天然で含有し得る。
【０１２７】
白色は、例えばチーズ、バター油、粉乳又は乳清製品において重要な役割を果たす。例えばフェタ（Ｆｅｔａ）、モツァレラ（Ｍｏｚｚａｒｅｌｌａ）、リコッタ（Ｒｉｃｏｔｔａ）及びブルーチーズ、例えばデンマークブルー（Ｄａｎｉｓｈ Ｂｌｕｅ）、ロックフォール（Ｒｏｑｕｅｆｏｒｔ）又はゴルゴンゾーラ（Ｇｏｒｇｏｎｚｏｌａ）などのチーズにおいて、白色は望ましいものと考えられる。ヤギ又はヒツジ由来の乳が少なくとも部分的にウシの乳に置き換えられるチーズにおいて、チーズの白色は、ウシの乳中に存在するβ−カロテンによって問題となり得る。
【０１２８】
アナトー又はβ−カロテンのような一部のチーズ天然着色剤が食品用着色剤として使用される。しかしながら、この着色剤もまた、乳清中に存在し得る。この乳清が、例えば粉ミルクなどにさらに加工される場合、乳清製品の着色が望ましくないことがある。食品用ソフトチーズについて、中間製品としては、例えば乳、及びチーズカードが含まれる。
【０１２９】
製品の白色度の計測は、視覚的に、又は反射計測、例えば走査により行われ得る。反射計測において色は３個のパラメータ、すなわちＬ値（黒＝０〜白＝１００）、ａ値（緑＝−６０〜赤＝＋６０）及びｂ値（青＝−６０〜黄＝＋６０）により定量化される。カロテノイドの場合、製造された製品のｂ値は好ましくは可能な限り０に近く、好ましくは１０〜０の間、より好ましくは５〜０の間、及びさらにより好ましくは１未満及び最も好ましくは０．５未満である。さらなる態様において、本発明は、これ以前に本明細書に記載されるとおりの本発明の方法により得られる食品を提供する。これらの食品は、中間製品における色素の変換能を有する１種又は複数種の酵素の添加を含まない製造工程により得られる食品との比較において、少なくとも一部分の有意な白色度の向上を特徴とする。
【０１３０】
さらなる態様において、本発明は、色素の変換能を有することにより、食品、例えば小麦粉原料又は乳由来の製品を漂白する酵素の使用を提供する。意外なことに、これらの酵素が家庭用洗剤における染み除去剤として有利に使用され得ることが発見された。特に、本酵素は、着色の染み、例えば草の染み、コーヒー及び紅茶の染みを、綿織物及び合成繊維（例えばポリエステル）の双方から除去するうえで極めて有効であることが証明された。さらには、本酵素はまた、酵素ストーンブリーチ加工においても、例えばブルージーンズのインジゴ染料を所望のレベルに漂白することにより使用され得るであろう。
【０１３１】
［材料及び方法］
［β−カロテンの変換の計測］
［Ａｚｉｚによるβ−カロテン分解の計測］
酵素活性は、Ａ．ベン・アジズ（Ａ．Ｂｅｎ Ａｚｉｚ）（１９７１年）、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０、１４４５頁に従いβ−カロテン変換活性として測定され得る。本明細書において１酵素単位は、１分間当たりに１マイクログラムのβ−カロテンを変換する酵素の量として定義される（さらには、Ａｚｉｚ単位と称される）。
【０１３２】
［Ｚｏｒｎによるβ−カロテン分解の計測］
酵素活性はまた、ゾーン（Ｚｏｒｎ）ら（２００３年）、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６２：３３１−３３６頁に従いβ−カロテン変換活性として測定され得る。本明細書において１酵素単位は、１分間当たりに１マイクロモルのβ−カロテンを変換する酵素の量として定義される（さらには、Ｚｏｒｎ単位と称される）。アッセイは次のとおり行われる：試料を含有する１．５ｍｌの酵素がキュベット中において２７℃で５分間、予備インキュベートされた後、１００μｌのβ−カロテン原液（詳しくは以下を参照）が添加された。必要に応じて、濃縮された培養上清がｐＨ５．５のクエン酸／リン酸緩衝液（この緩衝液は、４３ｍｌの０．１Ｍクエン酸を５６ｍｌの０．２ＭのＮａ２ＰＯ４溶液と混合することにより調製された）で希釈された。吸光度の低下が温度制御された細胞ホルダー内で分光光度計を使用して１５分間にわたり４５０ｎｍ及び２７℃でモニタされた。曲線の直線性が調べられ、及び酵素活性が曲線の直線部分から次式
酵素活性［ｍＵ／ｍｌ］＝（ΔＥ×Ｖｔ）×１０６／（Ｖｓ×ｄ×ε）
に従い計算された（式中、Ｕ＝上記に定義される酵素活性単位、ΔＥ＝１分間当たりの４５０ｎｍでの吸光度の低下、Ｖｔ＝キュベットの総容積（ｍｌ）、Ｖｓ＝キュベット中の試料容積（ｍｌ）、ε＝β−カロテンの吸光係数（９５，０００Ｍ−１・ｃｍ−１である）、ｄ＝キュベットの厚さ（ｃｍ）である）。
【０１３３】
Ａｚｉｚ酵素単位は、Ａｚｉｚ単位をβ−カロテンの分子量＝５３６．８５で除することによりＺｏｒｎ単位に変換され得る。
【０１３４】
［β−カロテン原液の調製］
β−カロテン原液は次のとおり調製される：５ｍｇのβ−カロテン及び５００ｍｇのツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０が５０ｍＬのジクロロメタン中に溶解された。ジクロロメタンはロータリーエバポレータ内で４０℃及び８００ｍｂａｒで蒸発させた。ほぼ全てのジクロロメタンが蒸発したとき、３０ｍｌの水が添加され、及び残留ジクロロメタンがロータリーエバポレータ及び最後に窒素気流内で除去された。結果として得られた溶液がろ過され、目盛付きフラスコ内で５０ｍｌまで水で充填された。溶液は冷温で（冷蔵庫）保存される必要があり、数日間に限り安定である。
【０１３５】
［食品の漂白］
内相又は生地からのカロテノイドの抽出後に、ゲリナス（Ｇｅｌｉｎａｓ）、Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍ．７５、８１０−１８４頁（１９９８年）により指示されるとおり漂白度が測定された。ゲリナス（Ｇｅｌｉｎａｓ）（１９９８年）により指示されるとおり、パンの内相からの総脂質抽出を介してカロテノイドが測定された。
【０１３６】
食品の白色度は、視覚的ならびに反射計測の双方により測定され得る。目視検査は、漂白酵素が添加されている食品を漂白酵素が添加されていない対照と比較することにより実施され得る。反射計測は、カラースキャナ（ヒューレット・パッカード・スキャンジェットＡＤＦ（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ Ｓｃａｎｊｅｔ ＡＤＦ））上で食品を走査することにより実施され得る。これらのデータは、プログラムＬａｂＳＭＡＲＴ（ＬａｂＳＭＡＲＴ、ＬＬＣ、Ｌｏｇａｎ Ｕｔａｈ、米国）を使用して分析され得る。
【０１３７】
［実施例１］
［ニオイヒメホウライタケから得られるβ−カロテン変換酵素の培養及び活性の測定］
ニオイヒメホウライタケから得られるβ−カロテン変換酵素カロアーゼ１及びカロアーゼ２の培養及び活性の測定が、ゾーン（Ｚｏｒｎ）ら（２００３年）により記載されるとおり行われた。本明細書に、ニオイヒメホウライタケのカルチャーコレクションからの菌糸体（Ｃｅｎｔｒａａｌ Ｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ−Ｕｔｒｅｃｈｔ、オランダから寄託番号ＣＢＳ１３７．８３により入手可能）を使用して乳化β−カロテンを補給された寒天プレートが接種された。プレートのインキュベーションが２４℃で１４日間実施された。１００ｍｌの標準栄養液（ＳＮＬ、これは３０ｇ／リットルのグルコース・Ｈ２Ｏ；４．５ｇ／リットルのアスパラギン・Ｈ２Ｏ；１．５ｇ／リットルのＫＨ２ＰＯ４；０．５ｇ／リットルのＭｇＳＯ４；３．０ｇ／リットルの酵母抽出物；５ｍｇ／ｌのＣｕＳＯ４＊５ａｑ、８０ｍｇ／ｌのＦｅＣ１３＊６ａｑ、９０ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ４＊７ａｑ、３０ｍｇ／ｌのＭｎＳＯ４＊１ａｑ及び４０ｍｇ／ｌのＥＤＴＡを含有する１ｍｌ／リットルの滅菌微量元素溶液（滅菌前にｐＨは１ＮのＮａＯＨで６．０に調整された）を含有する）を含有する３００ｍｌの振盪フラスコに菌糸体が接種され、及び１５０ｒｐｍの振盪インキュベータ内において２４℃で７日間インキュベートされた。前培養物が微生物汚染の不在について調べられ、Ｕｌｔｒａ Ｔｕｒｒａｘによりホモジナイズされ、及び主培養物を接種するために使用された（５００ｍｌの三角フラスコ中２５０ｍＬ）。２日目より毎日２ｍｌの試料が取り出され、遠心分離により菌糸体が除去されたうえ分光光度アッセイにおいて活性が計測された。４日間の培養後、β分解活性は無細胞上清１リットル当たり約０．３Ｚｏｒｎ単位であった。
【０１３８】
［実施例２］
［ニオイヒメホウライタケから得られるβ−カロテン変換酵素カロアーゼ１及びカロアーゼ２の活性に対するＨ２Ｏ２の効果］
１０マイクロリットルの２０ｍＭ過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の効果が、上記に記載されるとおりのインビトロアッセイのβ−カロテン分解アッセイにおいて測定される。カロアーゼ１及びカロアーゼ２を含有するニオイヒメホウライタケの濃縮培養上清が使用された。β−カロテン分解活性はＨ２Ｏ２の存在下で４．３から１０．９ｍＵに増加した。熱失活した酵素が使用されたときには、β−カロテン分解は一切観測されなかった。これは、Ｈ２Ｏ２がβ−カロテン分解酵素によりβ−カロテン分解活性を刺激することを明確に実証したものである。
【０１３９】
［実施例３］
［ニオイヒメホウライタケから得られるカロアーゼ１及びカロアーゼ２の活性に対するアスペルギルス・ニガーグルコースオキシダーゼ（ＧＯＸ）の効果］
５０マイクロリットルのニオイヒメホウライタケの濃縮培養上清が１２９０マイクロリットルの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）と混合された。１６０マイクロリットルの５００ｍＭグルコース溶液が添加され、及び混合物が５分間、セ氏２７度で調整された。アスペルギルス・ニガーグルコースオキシダーゼはフルカ（Ｆｌｕｋａ）から入手された。０〜２マイクロリットルのグルコースオキシダーゼ原液（１００Ｕ／ｍｌ、０〜２００ｍＵのＧＯＸの活性に相当する）及び１００マイクロリットルのβ−カロテン溶液（「材料及び方法」に記載されるとおりに調製）の添加により反応が開始された。４５０ｎｍでの吸光度の低下が１０分間、セ氏２７度で記録された（表１）。
【０１４０】
【表１】
【０１４１】
第２の一連の実験においては、グルコースの濃度を変化させた一方、グルコースオキシダーゼ活性の量は一定に保たれた。従って、５０マイクロリットルのニオイヒメホウライタケの濃縮培養上清が１４３４〜１２９０マイクロリットルの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）と混合され、１６〜１６０マイクロリットルの５００ｍＭグルコース溶液が添加された（表２）。混合物は５分間、セ氏２７度に保たれたうえ、０〜１マイクロリットルのＧＯＸ（０又は１００ｍＵの活性に相当する）及び１００マイクロリットルのβ−カロテン溶液の添加により反応が開始された。
【０１４２】
【表２】
【０１４３】
ブランク（５０ｍＭのグルコース、１００ｍＵのＧＯＸ、培養上清の添加なし）においてはβ−カロテンの分解は観測されなかった。
【０１４４】
これらの実験から、グルコースの存在下におけるＧＯＸの存在がニオイヒメホウライタケの濃縮上清によりβ−カロテン分解を強力に刺激することは明らかである。
【０１４５】
［実施例４及び比較例Ａ、Ｂ及びＣ］
［パプ製パン試験法］
標準的な製パン工程においてパップローフが、２００ｇの小麦粉（１６０ｇの小麦粉（Ｋｏｌｉｂｒｉ（登録商標）−Ｍｅｎｅｂａ、オランダ）及び４０グラムの小麦粉（Ｉｂｉｓ（登録商標）−Ｍｅｎｅｂａ、オランダ）の混合物）、１．４ｇのＦｅｒｍｉｐａｎ（登録商標）ドライイースト（ＤＳＭ Ｂａｋｅｒｙ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ、Ｄｅｌｆｔ、オランダ）、４ｇの塩、５０ｐｐｍのアスコルビン酸、４ｐｐｍの真菌α−アミラーゼＢａｋｅｚｙｍｅ（登録商標）Ｐ５００（ＤＳＭ Ｆｏｏｄ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ、Ｄｅｌｆｔ、オランダ）、６０ｐｐｍの真菌ヘミセルラーゼＢａｋｅｚｙｍｅ（登録商標）ＨＳ２０００（ＤＳＭ Ｆｏｏｄ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ、Ｄｅｌｆｔ、オランダ）及び表３に示されるとおりの量のβ−カロテン分解酵素及び１１６ｍｌの水から、ピンミキサー中で６分間、及び１５秒間、調製された。生地温度は２８℃であった。混合の直後、生地は１５０ｇずつ２個に分割され、丸められ、及び３０℃のホイロ室内で４５分間寝かされ、成形及び型詰めされた。３０℃で７０分間の最終ホイロの後、生地は２２５℃で２０分間焼き上げられた。
【０１４６】
密閉された箱内に室温で２４時間保管された後、焼き上がったパンの内相の品質及び色がパン製造者により評価された；表４に示されるとおりカロテノイドの量がパン内相の抽出後に測定された。
【０１４７】
【表３】
【０１４８】
【表４】
【０１４９】
表４から、本発明に係る漂白酵素を生地に添加することにより、カロテノイドが分解され、結果としてより白い内相をもたらすと結論づけられ得る。本発明に係る方法の有効性は大豆酵素リポキシゲナーゼ２の使用時より良好であるとともに、酵素活性大豆粉の使用時と少なくとも同等か、又はそれより良好である。
【０１５０】
［実施例５］
［ミニチーズの調製］
シャキール−ウル−レーマン（Ｓｈａｋｅｅｌ−Ｕｒ−Ｒｅｈｍａｎ）ら（「Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ ｏｆ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｃｈｅｅｓｅｓ ｉｎ Ｌａｉｔ」、７８（１９９８年）、６０７〜６２０頁）により記載されるとおり、小型チーズが製造された。ウシの生乳が３０分間６３℃で加熱することにより低温殺菌された。低温殺菌された乳は広口プラスチック製遠心分離ボトル（ボトル１本につき２００ｍＬ）に移され、３１℃に冷却された。続いて、０．７２ｍｌの出発培養物ＤＳ ５ＬＴ１（ＤＳＭ Ｇｉｓｔ Ｂ．Ｖ．、Ｄｅｌｆｔ、オランダ）が遠心分離ボトル内の２００ｍｌの各低温殺菌乳に添加され、乳は２０分間熟成された。次に、ＣａＣｌ２（熟成乳２００ｍＬにつき１３２μＬの１ｍｏｌ・Ｌ−１溶液）が添加された後、凝固剤が添加された（１ｍｌにつき０．０４ＩＭＣＵ）。カロアーゼ０１及びカロアーゼ０２の使用が関わる実験の場合、この酵素は凝固剤と同時に添加される。
【０１５１】
乳溶液を４０〜５０分間３１℃で保置して凝塊を形成させた。凝塊は、型から１ｃｍの間隔をとって伸張ワイヤのカッターにより手で切断された。２分間ヒーリングさせた後、１０分間静かに攪拌する。その後、カード／乳清混合物を連続的に攪拌しながら温度を３９℃まで３０分間にわたり徐々に上昇させた。ｐＨが６．２に達したとき、カード／乳清混合物は室温で６０分間、１，７００ｇで遠心分離された。乳清が排出され、カードは水槽中３６℃で保置された。チーズは１５分毎に逆さに返されｐＨを５．２〜５．３に低下させた後、室温で１，７００ｇ、２０分間遠心分離された。さらなる乳清の排出後、チーズの漂白度が走査により測定された。漂白酵素カロアーゼ０１及びカロアーゼ０２を使用した結果、より白いチーズがもたらされた。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、白色度の向上した食品を調製するための方法における使用に好適な新規酵素、食品の少なくとも一部の白色度を向上させるための酵素の使用、酵素が使用される食品を調製するための方法及び得られる食品に関する。
【０００２】
ある種類の食品、例えば、乳製品、例えばチーズ、乳清、バター、及び粉乳において、及び穀粉原料製品、例えばパン及び麺類においては、食品の少なくとも一部は白色が望ましいものと見なされる。
【０００３】
しかしながら、かかる食品の原材料又は中間製品は色素を含むことがあり、それによって食品が淡白色〜黄色になり得る。かかる色素の例はカロテノイド（カロテン及びキサントフィル）及びフラボンである。
【０００４】
例えば精白パンにおいては、白い内相が望ましい特性と見なされる。カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、リパーゼ及び／又はリポキシゲナーゼなどの酵素を使用することによって、より白い内相が得られ得る（例えば、Ｐ．ゲリナス（Ｐ．Ｇｅｌｉｎａｓ）らによる「Ｏｘｉｄｏ−ｒｅｄｕｃｔａｓｅｓ ａｎｄ Ｌｉｐａｓｅｓ ａｓ Ｄｏｕｇｈ−Ｂｌｅａｃｈｉｎｇ Ａｇｅｎｔ」、Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍ、７５（６）、８１０〜８１４頁（１９９８年）を参照）。以上の酵素は全て、内相に対し漂白効果を有する。現在、製パン業では主に、リポキシゲナーゼを含有する酵素活性大豆粉が使用される。大豆粉中のリポキシゲナーゼは小麦粉色素の漂白能を有し、これはフリーラジカル及び脂肪酸の酸化中にリポキシゲナーゼにより形成される他の活性酸素種の作用の結果である。この反応は共酸化と呼ばれる。大豆粉には、３種のリポキシゲナーゼ、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３が存在し、Ｌ２及びＬ３が最良の漂白活性を有する（Ｗ．グロシュ（Ｗ．Ｇｒｏｓｃｈ）、Ｇ．ラスカウイ（Ｇ．Ｌａｓｋａｗｙ）及びＦ．ウェバー（Ｆ．Ｗｅｂｅｒ）、Ｊ．アグリック（Ｊ．Ａｇｒｉｃ）、Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ ２４（１９７６年）、４５６頁）。大豆粉はリポキシゲナーゼのみならず漂白効果に必要な脂肪酸も含有し、結果として漂白効果の改善をもたらす。
【０００５】
リポキシゲナーゼ源としての大豆の使用に関連する難点は、今日ほとんどの大豆が遺伝子操作（ＧＭＯ）されているという現実である。世界的に顧客は非ＧＭＯ由来パン改良添加剤を好むため、大豆リポキシゲナーゼの代替品の必要性は高い。大豆由来リポキシゲナーゼＬ２及びＬ３以外の既知の酵素は、大豆由来リポキシゲナーゼほど良好には機能しないという難点を有する。実際には、所望の白色度を得るため、これらの酵素は補因子又は他の酵素と組み合わされて所望の水準の内相の白色度を達成することとなる。ペルオキシダーゼは、不飽和化合物、例えば不飽和脂肪酸の酸化を酸素分子によって非酵素的に触媒する。（Ｃ．Ｅ．エリクソン（Ｃ．Ｅ．Ｅｒｉｋｓｓｏｎ）ら ＪＡＯＳ４８（１９７１年）４４２頁）。これらの酸化脂肪酸はラジカルを生成し、おそらくはこれが小麦粉色素と反応して、リポキシゲナーゼ反応産物と同様の方法で製品の有色度をより低くする。
【０００６】
本発明の目的は、食品の少なくとも一部の白色度の向上した食品の調製に好適な新規酵素を提供することである。
【０００７】
意外なことに、本発明に係る漂白酵素は、色素を結果として白色度の向上をもたらす形態に直接的に変換する能力を有することが発見された。これらの酵素は色素に対し様々な方法で直接的な漂白効果を及ぼすことができる。例えば、これらは色素中の不飽和結合を例えば水素化を介して飽和させることにより色素を直接的に変換でき、又はこれらは色素を直接的に開裂して分解産物を形成することができる。直接的という用語は、これらの酵素が色素に対し基質それ自体として作用することを意味する。変換を達成するための補因子の使用は特に排除されるものではない。
【０００８】
さらには、本発明に係る漂白ポリペプチドは、色素を直接的に開裂する能力を有する（いわゆる開裂酵素である）ことが発見された。本発明に係る好適な開裂酵素は、カロテノイド（カロテン及びキサントフィル）及びフラボンの開裂能を有する酵素である。カロテノイドは２つの異なる方法、中央及びエキセントリックで開裂され得る。カロテノイドの中央開裂は結果としてレチノイド（Ｃ２０化合物）の形成をもたらす。エキセントリック開裂は、例えばアブシジン酸などの、より多様な化合物群を生じ得る。カロテノイドの中央開裂能を有する酵素は、例えば欧州特許出願公開第１０３１６２３Ａ号明細書及びＪ．リンティッヒ（Ｊ．Ｌｉｎｔｉｇ）及びＫ．フォークト（Ｋ．Ｖｏｇｔ）（２０００年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５、１１９１５頁に記載されるとおり、例えばβ−カロテン１５，１５’−モノオキシゲナーゼ（ＥＣ１．１４．９９．３６）である。この酵素は以前はβ−カロテン１５，１５’−ジオキシゲナーゼ＝ＥＣ１．１３．１１．２１として知られていた。
【０００９】
中央開裂能を有する酵素の使用のさらなる利点は、レチノイドの形成である。レチノイドは視覚における必須成分である。β−カロテンは２個のレチナール分子に開裂される。このレチナールは、ビタミンＡとしても知られるレチノールに改変され得る。カロテノイドのエキセントリック開裂能を有する酵素の例は、９−シス−エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼ（例えば、Ｘ．チン（Ｘ．Ｑｉｎ）及びＪ．Ａ．Ｄ．ジバルト（Ｊ．Ａ．Ｄ．Ｚｅｅｖａａｒｔ）（１９９９年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ、９６、１５３５４頁）及びβ−カロテン９’，１０’−ジオキシゲナーゼ（例えば、キーファー（Ｋｉｅｆｅｒ）ら（２００１年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７、１４１１０頁）である。
【００１０】
本目的は、本発明に記載されるとおりの新規酵素により達成される。
【００１１】
第１の態様において、本発明は、漂白活性と
１）配列番号０８〜１２のいずれか１つに従う単離ポリペプチド又はその任意の機能的等価物、
２）配列番号０１〜０７のいずれか１つに従うポリヌクレオチド又はその任意の機能的等価物又は前記ポリヌクレオチドを含んでなるベクター又はその任意の機能的等価物を然るべき宿主細胞、例えばアスペルギルス・ニガー中で発現させることにより得られる単離ポリペプチド、及び
３）配列番号１３〜１７の少なくとも１つを含んでなるポリペプチド
からなる群より選択される１つ又は複数の特性とを有する単離ポリペプチドに関する。
【００１２】
用語「漂白活性を有するポリペプチド」は本所及び以下ではβ−カロテン分解能を有するポリペプチド又は食品の漂白能を有するポリペプチドとして定義される。β−カロテン分解は、例えば本特許出願の「材料及び方法」の節に開示されるとおりの方法の少なくとも１つ、例えばＺｏｒｎに従う方法又はＡｚｉｚに従う方法により計測され得る。好ましくは、本発明に係るポリペプチドはＡｚｉｚ及びＺｏｒｎの双方のアッセイにおいて漂白活性を示す。食品の漂白能は、調査されるポリペプチドがその調製に使用される製品Ａの白色度を、調査されるポリペプチドがその製品中に使用されなかった点において唯一製品Ａと異なる製品Ｂの白色度と、例えば視覚的に、又は既知の反射計測によって比較することにより測定され得、調査されるポリペプチドが漂白活性を有する場合には、製品Ａのｂ値は製品Ｂのｂ値と比べ０により近くなるであろう。
【００１３】
さらにより好ましくは、本発明に係るポリペプチドはＺｏｒｎに従い測定されるときβ−カロテン分解能を有するとともにこれは反射計測によってｂ値の計測により測定されるとき食品の漂白能を有する。最も好ましくは、本発明に係るポリペプチドは、例えばパンの内相など、漂白される食品が一様でない表面構造を有し、ひいては反射計測法が信頼性に欠ける場合に、Ｚｏｒｎに従い測定されるときβ−カロテン分解能を有する。
【００１４】
好ましい実施形態において、本発明は精製されたポリペプチドを提供する。本発明に係るポリペプチドは本発明に係るポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを含む。特に、配列番号０８〜１２に従うポリペプチド又はその任意の機能的等価物が好ましい。
【００１５】
本発明に係るポリペプチドを含んでなる融合タンパク質もまた本発明の範囲内である。本発明はまた、本発明に係るポリペプチドの作製方法も提供する。
【００１６】
誤解を避けるため、配列番号０１〜０７は、配列番号０１、配列番号０２、配列番号０３、配列番号０４、配列番号０５、配列番号０６、及び配列番号０７を含むＤＮＡ配列群を参照し、配列番号０８〜１２は、配列番号０８、配列番号０９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２を含むタンパク質配列群を参照し、及び配列番号１３〜１８は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６及び配列番号１７を含むタンパク質配列群を参照するものとする。さらに、配列番号０８〜１２を有するポリペプチドについては、用語カロアーゼ０１、カロアーゼ０２、カロアーゼ０３、カロアーゼ０４、カロアーゼ０５（群全体として「カロアーゼ０１−０５」と称される）がそれぞれ使用される。
【００１７】
第２の態様において、本発明は、好ましくは高度にストリンジェントな条件下で配列番号０１〜０７のいずれか１つに従う配列とハイブリダイズされるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを提供する。結果的に、本発明は、配列番号０１〜０７に従う配列と約５５％、好ましくは６５％、より好ましくは７０％、さらにより好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％相同な核酸を提供する。
【００１８】
より好ましい実施形態において本発明は、真菌類、好ましくは糸状菌類、特にホウライタケ属が好ましく、例えばニオイヒメホウライタケから得られる単離ポリヌクレオチドを提供する。
【００１９】
一実施形態において、本発明は、配列番号０８〜１２に示されるとおりのアミノ酸又はその任意の機能的等価物を伴うポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる単離ポリヌクレオチドを提供する。
【００２０】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、配列番号０８〜１２に従うポリペプチド又はその任意の機能的等価物の少なくとも１つの機能ドメインをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
【００２１】
好ましい実施形態において、本発明は、配列番号０１〜０７に従う漂白酵素遺伝子を提供する。別の好ましい実施形態において、本発明は、そのアミノ酸配列が配列番号０８〜１２に示される漂白酵素又はその任意のポリペプチドの変異体又は断片をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００２２】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、本発明に係るポリペプチドをコードするコード配列を含んでなるポリヌクレオチドを提供し、好ましくは配列番号０１〜０７のポリヌクレオチド配列である。
【００２３】
第３の態様において、本発明はまた、本発明に係るポリヌクレオチド配列及び本発明に従いＤＮＡを増幅又は検出するために使用され得るプライマー、プローブ及び断片を含んでなるベクターにも関する。
【００２４】
好ましい実施形態において、提供されるベクターでは、本発明に係るポリヌクレオチド配列が、細菌類又は糸状菌類、好ましくはホウライタケ属、例えばニオイヒメホウライタケ、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えばＡ・ニガー又はＡ・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）などの好適な宿主細胞中におけるコードされたアミノ酸配列の発現に好適な調節配列と機能的に連結される。本発明はまた、本発明に係るポリヌクレオチド及びベクターを調製するための方法も提供する。
【００２５】
第４の態様において、本発明はまた、本発明に係る非相同又は相同ポリヌクレオチドを含有する、組換え産生された宿主細胞にも関する。
【００２６】
別の実施形態において、本発明は組換え宿主細胞を提供し、ここでは本発明に係るペルオキシダーゼの発現が有意に増加するか、又はペルオキシダーゼの活性が増加する。
【００２７】
別の実施形態において本発明は、本発明に係る非相同又は相同ＤＮＡを含有する組換え産生された宿主細胞を提供するとともに、ここで宿主細胞は本発明に係る機能性ペルオキシダーゼの産生能を有し、好ましくは本発明に係るペルオキシダーゼの過剰発現能を有する細胞、例えば本発明に係る遺伝子のコピー数の増加を含んでなるアスペルギルス株である。
【００２８】
第５の態様において、本発明はまた、好ましくは本明細書に記載されるとおりの、任意の工業プロセスにおける本発明に係る漂白ポリペプチドの使用にも関する。
【００２９】
［本発明に係るポリペプチド］
本発明は、配列番号０８〜１２のいずれか１つに従うアミノ酸配列、ならびに配列番号０１〜０７のポリヌクレオチドを然るべき宿主中で発現することにより得られるアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドを提供する。また、上記のポリペプチドの機能的等価物を含んでなるペプチド又はポリペプチドも本発明の範囲内に含まれる。上記のポリペプチドはまとめて用語「本発明に係るポリペプチド」に含まれる。
【００３０】
用語「ペプチド」及び「オリゴペプチド」は本所及び以下では同義語と見なされる（一般的に認識されるとおり）とともに各用語は、文脈上ペプチジル結合により結合される少なくとも２個のアミノ酸の鎖を示すことが要求されるとき、同義的に使用され得る。単語「ポリペプチド」は本明細書では８個以上のアミノ酸残基を含有する鎖に使用される。本明細書の全てのオリゴペプチド及びポリペプチドの式又は配列は、左から右に、及びアミノ末端からカルボキシ末端の方向に記載される。本明細書で使用されるアミノ酸の１文字コードは当該技術分野において一般的に知られているとともにサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州、１９８９年）に参照され得る。
【００３１】
「単離された」ポリペプチド又はタンパク質は、その天然環境から取り出されたポリペプチド又はタンパク質を意図する。例えば、宿主細胞中で発現する組換え産生されたポリペプチド及びタンパク質は、任意の好適な技術、例えば、スミス（Ｓｍｉｔｈ）及びジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）、Ｇｅｎｅ ６７：３１〜４０頁（１９８８年）に開示される一段階精製法により実質的に精製されている天然又は組換えポリペプチドであるため、本発明の目的上単離されていると見なされる。
【００３２】
本発明に係るカロアーゼ０１−０５漂白酵素、又はその機能的等価物は、組換え細胞培養物から、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法により回収及び精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製に用いられる。
【００３３】
本発明のポリペプチドは、自然に精製された産物、化学合成法による産物、及び組換え技術により、例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫及び哺乳動物細胞を含む、原核生物又は真核生物宿主から産生される産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に応じて、本発明のポリペプチドはグリコシル化されてもよく、又は非グリコシル化であってもよい。加えて、本発明のポリペプチドはまた、ある場合には宿主介在プロセスの結果として、初期修飾されたメチオニン残基を含み得る。
【００３４】
［機能的等価物］
用語「機能的等価物」及び「機能変異体」は本明細書では同義的に使用される。カロアーゼ０１−０５ＤＮＡの機能的等価物は、本明細書に定義されるとおりのカロアーゼ０１−０５ニオイヒメホウライタケ漂白酵素の少なくとも１個と少なくとも同等又はより良好な漂白活性を呈するポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡ断片である。本発明に係るカロアーゼ０１−０５ポリペプチドの機能的等価物は、本明細書に定義されるとおりのカロアーゼ０１−０５ニオイヒメホウライタケ漂白酵素の少なくとも１つと少なくとも同等又はより良好な漂白活性を呈するポリペプチドである。
【００３５】
タンパク質又はポリペプチドの機能的等価物は、配列番号０８〜１２のいずれか１つの１個又は複数のアミノ酸の保存的置換のみ、又はその任意の非必須アミノ酸の置換、挿入又は欠失を含み得る。従って、非必須アミノ酸は、生物学的機能を実質的に変化させることなく配列番号０８〜１２のいずれか１つにおいて変更し得る残基である。例えば、本発明のカロアーゼ０１−０５タンパク質間で保存されるアミノ酸残基は、特に変化を受け入れにくいと予想される。さらには、本発明に係るカロアーゼ０１−０５タンパク質間で保存されるアミノ酸及び他のペルオキシダーゼが変化を受け入れやすいとは思われない。
【００３６】
用語「保存的置換」は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられるような置換を意味することを意図している。これらのファミリーは当該技術分野において周知であるとともに、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン及びヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を伴うアミノ酸が挙げられる。
【００３７】
核酸の機能的等価物は典型的には、サイレント突然変異又はコードされたポリペプチドの生物学的機能を変化させない突然変異を含み得る。従って、本発明は、特定の生物活性に必須でないアミノ酸残基の変更を含むカロアーゼ０１−０５タンパク質をコードする核酸分子を提供する。アミノ酸配列が配列番号０８〜１２のいずれの１つとも異なる、かかるカロアーゼ０１−０５タンパク質は、少なくとも１種の生物活性をさらに保持する。一実施形態において、単離核酸分子はタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなり、ここでタンパク質は、配列番号０８〜１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列と実質的に少なくとも約５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上相同なアミノ酸配列を含んでなる。
【００３８】
例えば、表現型上サイレントなアミノ酸置換を生じさせるための方法に関する指針がボウイ・Ｊ．Ｕ．（Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６〜１３１０頁（１９９０年）に提供され、ここで著者は、アミノ酸配列の変化に対する許容度を研究するうえで２つの手法があることを指摘している。第１の方法は、進化の過程に依存し、ここで突然変異は自然選択により受け入れられるか、拒絶されるかのいずれかである。第２の手法は遺伝子工学を使用してクローニングされた遺伝子の特異的な位置でアミノ酸変化を導入するとともに機能性を保持する配列を選択又はスクリーニングして同定する。著者が述べるとおり、これらの研究は、タンパク質が驚くほどアミノ酸置換を許容することを明らかにしている。著者はさらに、タンパク質の特定の位置でどの変化が許容的である可能性が高いかについて指摘する。例えば、最も内部のアミノ酸残基が非極性側鎖を必要とする一方、表面側鎖の特徴は一般的にほとんど保存されない。他のかかる表現型上サイレントな置換は、ボウイ（Ｂｏｗｉｅ）ら、上記、及び当該文献中に引用される参考文献に記載される。
【００３９】
配列番号０８〜１２のいずれか１つに従うタンパク質と相同なカロアーゼ０１−０５タンパク質をコードする単離核酸分子が、１つ又は複数のヌクレオチド置換、付加又は欠失を配列番号０１〜０７に従うコードヌクレオチド配列に導入することにより作成されることで、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失又は挿入がコードされたタンパク質に導入され得る。かかる突然変異は、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ介在性突然変異誘発などの標準的な技術により導入されてもよい。
【００４０】
用語「機能的等価物」はまた、ニオイヒメホウライタケカロアーゼ０１−０５タンパク質のオルソログも包含する。ニオイヒメホウライタケカロアーゼ０１−０５タンパク質のオルソログは、他の株又は種から単離され得るとともに類似又は同一の生物活性を有するタンパク質である。かかるオルソログは、配列番号０８〜１２のいずれか１つと実質的に相同なアミノ酸配列を含んでなるものとして容易に同定され得る。
【００４１】
本明細書に定義されるとおり、用語「実質的に相同」が参照する第１のアミノ酸又はヌクレオチド配列は、第２のアミノ酸又はヌクレオチド配列と同一又は等価な（例えば、類似した側鎖を伴う）アミノ酸又はヌクレオチドを十分に、又は最小数含有し、これにより第１及び第２のアミノ酸又はヌクレオチド配列は共通ドメインを有する。例えば、約５５％、好ましくは６５％、より好ましくは７０％、さらにより好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％もしくはそれ以上の同一性を有する共通ドメインを含有するアミノ酸又はヌクレオチド配列が、本明細書において十分に同一であるとして定義される。
【００４２】
また、他のカロアーゼ０１−０５ファミリーメンバー、従って配列番号０１〜０７と異なるヌクレオチド配列を有するものをコードする核酸も、本発明の範囲内である。さらに、異なる種由来の、従って配列番号０１〜０７と異なるヌクレオチド配列を有するカロアーゼ０１−０５タンパク質をコードする核酸が本発明の範囲内である。
【００４３】
変異体（例えば、天然対立遺伝子変異体）に相当する核酸分子及び本発明のカロアーゼ０１−０５ＤＮＡの相同体は、本明細書に開示されるカロアーゼ０１−０５核酸とのそれらの相同性に基づき、本明細書に開示されるＤＮＡ又はその好適な断片を使用して、好ましくは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標準的なハイブリダイゼーション技術に従うハイブリダイゼーションプローブとして単離され得る。
【００４４】
カロアーゼ０１−０５配列の天然対立遺伝子変異体に加え、当業者は、突然変異により配列番号０１〜０７のヌクレオチド配列に変化が導入されることにより、カロアーゼ０１−０５タンパク質の機能を実質的に変質させることなく、カロアーゼ０１−０５タンパク質のアミノ酸配列に変化がもたらされ得ることを認識するであろう。
【００４５】
本発明の別の態様において、改良型カロアーゼ０１−０５タンパク質が提供される。改良型カロアーゼ０１−０５タンパク質は、少なくとも１種の生物活性が改良されるタンパク質である。かかるタンパク質は、飽和突然変異誘発などにより、カロアーゼ０１−０５コード配列の全部又は一部にわたり無作為に突然変異を導入することにより得られ得るとともに、結果として得られる変異体は組換え発現させたうえ生物活性についてスクリーニングされ得る。例えば、当該技術分野では、ペルオキシダーゼの酵素活性を計測するための標準アッセイが提供されているとともに、ひいては改良型タンパク質が容易に選択され得る。
【００４６】
好ましい実施形態においてカロアーゼ０１−０５タンパク質は、それぞれ配列番号０８〜１２のいずれか１つに従うアミノ酸配列を有する。別の実施形態において、カロアーゼ０１−０５ポリペプチドは、それぞれ配列番号０８〜１２に従うアミノ酸配列と実質的に相同であるとともにそれぞれ配列番号０８〜１２に従うポリペプチドの少なくとも１種の生物活性を保持し、さらには自然変動又は上述されるとおりの突然変異誘発に起因してアミノ酸配列が異なる。
【００４７】
さらに好ましい実施形態において、カロアーゼ０１−０５タンパク質は、好ましくは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号０１〜０７に従う核酸とハイブリダイズ可能な単離核酸断片によりコードされるアミノ酸配列を有する。
【００４８】
従って、カロアーゼ０１−０５タンパク質は、配列番号０８〜１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも約５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上相同なアミノ酸配列を含んでなるとともに配列番号０８〜１２のいずれか１つに従うポリペプチドの少なくとも１種の機能的活性を保持するタンパク質である。
【００４９】
本発明の別の態様において、本ポリペプチドは配列番号１３〜１７に示される配列の少なくとも１つを含んでなる。好ましくは、本発明に係るポリペプチドは配列番号１３〜１７に示される配列の少なくとも２つを含んでなる。最も好ましくは、本ポリペプチドは配列番号１３〜１７に示される配列の全てを含んでなる。
【００５０】
本発明に係るタンパク質の機能的等価物はまた、例えば、本発明のタンパク質の変異体、例えば切断変異体の組み合わせライブラリをペルオキシダーゼ活性についてスクリーニングすることによっても同定され得る。一実施形態において、変異体の多様化ライブラリは核酸レベルでの組み合わせ突然変異誘発により生成される。変異体の多様化ライブラリは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的にライゲートすることにより産生され、これにより有望なタンパク質配列の縮重セットが個別のポリペプチドとして、又は代替的により大きな融合タンパク質のセットとして（例えば、ファージディスプレイ用）発現可能となり得る。本発明のポリペプチドの有望な変異体のライブラリを縮重オリゴヌクレオチド配列から産生するために、様々な方法が使用され得る。縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法は当該技術分野において周知である（例えば、ナラング（Ｎａｒａｎｇ）（１９８３年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３頁；イタクラ（Ｉｔａｋｕｒａ）ら（１９８４年）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３頁；イタクラ（Ｉｔａｋｕｒａ）ら（１９８４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６頁；イケ（Ｉｋｅ）ら（１９８３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１１：４７７頁を参照のこと）。
【００５１】
加えて、本発明のポリペプチドのコード配列の断片のライブラリが使用され多様なポリペプチド集団が生成されることで、続く変異体の選択がスクリーニングされ得る。例えば、コード配列断片のライブラリは、ニッキングが１分子につき約１回のみ生じる条件下で当該コード配列の二重鎖ＰＣＲ断片をヌクレアーゼにより処置し、二重鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを再生して異なるニッキング産物由来のセンス／アンチセンス対を含み得る二重鎖ＤＮＡを形成し、再編成された二重鎖からＳ１ヌクレアーゼで処置することにより一本鎖部分を取り出し、及び結果として得られる断片ライブラリを発現ベクターにライゲートすることにより生成され得る。この方法により、様々な大きさの当該タンパク質のＮ末端及び内部断片をコードする発現ライブラリが導き出され得る。
【００５２】
切断体の点突然変異により作製される組み合わせライブラリの遺伝子産物をスクリーニングするための、及び選択的な特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするためのいくつかの技術が当該技術分野において周知である。大規模な遺伝子ライブラリのスクリーニング向けの、ハイスループット解析に適した最も広範に使用されている技術は典型的には、遺伝子ライブラリを複製可能な発現ベクターにクローニングするステップ、結果として得られるベクターのライブラリで然るべき細胞を形質転換するステップ、及び所望の活性の検出により産物の検出された遺伝子をコードするベクターの単離が促進される条件下で組み合わせ遺伝子を発現するステップを含む。ライブラリにおける機能的変異の頻度を高める技術である、再帰的アンサンブル突然変異誘発（ＲＥＭ）がスクリーニングアッセイと組み合わせて使用されることにより、本発明のタンパク質の変異体が同定され得る（アーキン（Ａｒｋｉｎ）及びユルバン（Ｙｏｕｒｖａｎ）（１９９２年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７８１１−７８１５頁；デルグレーブ（Ｄｅｌｇｒａｖｅ）ら（１９９３年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６（３）：３２７〜３３１頁）。
【００５３】
カロアーゼ０１についての配列番号０１又は０２、カロアーゼ０２についての配列番号０３又は０４、カロアーゼ０３についての配列番号０５、カロアーゼ０４についての配列番号０６及びカロアーゼ０５についての配列番号０７にそれぞれ示されるカロアーゼ０１−０５遺伝子配列に加え、カロアーゼタンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらし得るＤＮＡ配列多型が所与の集団中に存在し得ることは、当業者には明らかであろう。かかる遺伝子多型は異なる集団由来の細胞中又は自然の対立遺伝子変異に起因する集団内に存在し得る。対立遺伝子変異体はまた、機能的等価物も含み得る。
【００５４】
本発明に係るポリヌクレオチドの断片はまた、機能的ポリペプチドをコードしないポリヌクレオチドを含んでなってもよい。かかるポリヌクレオチドはＰＣＲ反応用のプローブ又はプライマーとして機能し得る。
【００５５】
本発明に係る核酸は、それらのコードするポリペプチドが機能的か非機能的かに関わらず、ハイブリダイゼーションプローブ又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして使用され得る。カロアーゼ０１−０５活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用には、とりわけ、（１）カロアーゼ０１−０５タンパク質をコードする遺伝子、又はその対立遺伝子変異体の、ｃＤＮＡライブラリ、例えばニオイヒメホウライタケ以外の生物からの単離、（２）ベルマ（Ｖｅｒｍａ）ら「Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９８８年）に記載されるとおりの、カロアーゼ０１−０５遺伝子の正確な染色体位置を提供するための分裂中期染色体スプレッドとのインサイチュハイブリダイゼーション（例えばＦＩＳＨ）、（３）特異的組織及び／又は細胞中でのカロアーゼ０１−０５ｍＲＮＡの発現を検出するためのノーザンブロット分析、及び４）診断ツールとして使用して所与の生物学的（例えば、組織）試料中でカロアーゼ０１−０５プローブとハイブリダイズ可能な核酸の存在を分析できるプローブ及びプライマーが含まれる。
【００５６】
カロアーゼ０１−０５遺伝子の機能的等価物を得る方法もまた本発明に包含される。かかる方法は、配列番号０８〜１２のいずれか１つに従う配列の全部もしくは一部又はその任意の変異体をコードする単離核酸を含む標識プローブを得るステップ、核酸断片ライブラリを標識プローブにより、ライブラリ中の核酸断片とのプローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件下でスクリーニングすることにより核酸二重鎖を形成するステップ、及び任意の標識二重鎖中で完全長遺伝子配列を核酸断片から調製してカロアーゼ０１−０５遺伝子に関連する遺伝子を得るステップを伴う。
【００５７】
一実施形態において、本発明のカロアーゼ０１−０５核酸は、それぞれカロアーゼ０１についての配列番号０１又は０２、カロアーゼ０２についての配列番号０３又は０４、カロアーゼ０３についての配列番号０５、カロアーゼ０４についての配列番号０６及びカロアーゼ０５についての配列番号０７に示される核酸配列又はその任意の相補体と、少なくとも５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上相同である。
【００５８】
別の好ましい実施形態において本発明のカロアーゼ０１−０５ポリペプチドは、それぞれ配列番号０８〜１２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列と、少なくとも５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上相同である。
【００５９】
［ポリヌクレオチド］
本発明は、配列番号０８〜１２に従うアミノ酸配列又はその任意の機能的等価物を有する、カロアーゼ０１−０５と仮称される漂白酵素（ペルオキシダーゼ）をコードするポリヌクレオチドを提供する。カロアーゼ０１−０５をコードする遺伝子の配列は、ニオイヒメホウライタケから得られるｃＤＮＡを増幅することにより決定された。カロアーゼ０１及びカロアーゼ０２をそれぞれコードする配列番号０２及び配列番号０４を有する配列は、取り上げられる遺伝子の最適化バージョンであり、コドン最適化が行われている。コドン最適化は当業者に周知の方法に従い使用され得るとともに特に宿主細胞中での遺伝子の発現の改良に好適である。本発明は、カロアーゼ０１−０５ペルオキシダーゼをコードする遺伝子を含んでなるポリヌクレオチド配列を提供する。従って、本発明は、配列番号０１〜０７に従うヌクレオチド配列又はその任意の機能的等価物を含んでなる単離ポリヌクレオチドに関する。ニオイヒメホウライタケの配列番号０１〜０７が漂白活性を有するという発見は、特に配列は既知の漂白酵素との相同性が極めて低いことから、極めて驚くべきものであった。
【００６０】
より詳細には、本発明は、ストリンジェントな条件下で、好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、配列番号０１〜０７に従うポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能な単離ポリヌクレオチドに関する。有利には、かかるポリヌクレオチドは、真菌類、好ましくは糸状菌類、特にニオイヒメホウライタケから得られ得る。より具体的には、本発明は、配列番号０１〜０７に従うヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチドに関する。
【００６１】
本所及び以下で使用されるとき、用語「遺伝子」及び「組換え遺伝子」は、染色体ＤＮＡから単離され得る核酸分子を参照し、これはタンパク質、例えばニオイヒメホウライタケ漂白酵素をコードするオープンリーディングフレームを含む。遺伝子は、コード配列、非コード配列、イントロン及び調節配列を含み得る。さらに、遺伝子は本明細書に定義されるとおりの単離核酸分子を参照する。
【００６２】
配列番号０１〜０７のヌクレオチド配列を有する核酸分子又はその機能的等価物などの本発明の核酸分子は、標準的な分子生物学的技術及び本明細書に提供される配列情報を使用して単離され得る。例えば、配列番号０１〜０７の核酸配列の全部又は一部をハイブリダイゼーションプローブとして使用することにより、標準的なハイブリダイゼーション及びクローン技術を使用して（例えば、サムブルック・Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッチ・Ｅ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．）、及びマニアチス・Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州、１９８９年に記載されるとおり）本発明に係る核酸分子が単離され得る。
【００６３】
さらに、配列番号０１〜０７の全部又は一部を包含する核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって配列番号０１〜０７に含まれる配列情報に基づき設計される合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して単離され得る。
【００６４】
本発明の核酸は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又は代替的にゲノムＤＮＡを鋳型として、及び然るべきオリゴヌクレオチドプライマーを使用して標準的なＰＣＲ増幅技術に従い増幅され得る。そのように増幅される核酸は然るべきベクターにクローニングされ得るとともにＤＮＡ配列解析により特性化され得る。
【００６５】
さらには、本発明に係るヌクレオチド配列に対応する、又はそれとハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドが標準的な合成技術により、例えば自動ＤＮＡ合成機を使用して調製され得る。
【００６６】
好ましい実施形態において、本発明の単離核酸分子は、配列番号０１〜０７に示されるヌクレオチド配列を含んでなる。このＤＮＡは、配列番号０８〜１２にそれぞれ従うニオイヒメホウライタケカロアーゼ０１−０５ポリペプチドをコードする配列を含んでなる。
【００６７】
別の好ましい実施形態において、本発明の単離核酸分子は、配列番号０１〜０７に示されるヌクレオチド配列の相補体又はそれらのヌクレオチド配列の機能的等価物である核酸分子を含んでなる。
【００６８】
別のヌクレオチド配列と相補的な核酸分子は、他のヌクレオチド配列と十分に相補的であるため他のヌクレオチド配列とハイブリダイズでき、それにより安定な二重鎖を形成する核酸分子である。
【００６９】
本発明の一態様は、本発明のポリペプチド又は生物学的に活性な断片又はドメインなどのその機能的等価物をコードする単離核酸分子、ならびにハイブリダイゼーションプローブとして使用され、核酸分子の増幅又は突然変異用のＰＣＲプライマーとして使用するのに好適な本発明のポリペプチドをコードする核酸分子及びかかる核酸分子の断片を同定するのに十分な核酸分子に関する。
【００７０】
「単離ポリヌクレオチド」又は「単離核酸」は、由来する生物体の天然ゲノム中では直ちに連続する（一方は５’末端上で、及び一方は３’末端上で）コード配列の双方と直ちに連続しないＤＮＡ又はＲＮＡである。従って、一実施形態において、単離核酸は、コード配列に直ちに連続する５’非コード（例えば、プロモーター）配列の一部又は全部を含む。それゆえ本用語は、例えば、ベクター、自己複製プラスミド又はウイルス、又は原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれる組換えＤＮＡ、又は別個の分子（例えば、ＰＣＲ又は制限エンドヌクレアーゼ処置により産生されるｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ断片）として他の配列と無関係に存在するものを含む。これはまた、実質的に細胞物質、ウイルス性物質、又は培養培地（組換えＤＮＡ技術により産生される場合）、又は化学的前駆体又は他の化学物質（化学的に合成される場合）のない追加的なポリペプチドをコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも含む。さらに、「単離核酸断片」は、断片として天然ではなく、自然状態では存在しないであろう核酸断片である。
【００７１】
本明細書で使用されるとき、用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）及びヌクレオチド類似体を使用して生成されるＤＮＡ又はＲＮＡの類似体を含むことが意図される。核酸分子は一本鎖又は二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。核酸は、オリゴヌクレオチド類似体又は誘導体（例えば、イノシン又はホスホロチオエートヌクレオチド）を使用して合成されてもよい。かかるオリゴヌクレオチドは、例えば、変質した塩基対合能力又は増加したヌクレアーゼ耐性を有する核酸を調製するために使用され得る。
【００７２】
本発明の別の実施形態は、カロアーゼ０１−０５核酸分子に対するアンチセンスである単離核酸分子、例えば、カロアーゼ０１−０５核酸分子のコード鎖をそれぞれ提供する。本明細書に記載される核酸分子の相補鎖もまた本発明の範囲内に含まれる。
【００７３】
［配列決定エラー］
本明細書に提供されるとおりの配列情報は、誤って同定される塩基の包含要件に関してそれほど狭義に解釈されるべきではない。本明細書に開示される特異的配列は完全な遺伝子を真菌類、特にニオイヒメホウライタケから単離するために容易に使用され得、ひいてはさらなる配列解析に容易に供され、それにより配列決定エラーを同定し得る。
【００７４】
別段に指示されない限り、本明細書においてはＤＮＡ分子の配列決定により決定される全てのヌクレオチド配列が自動ＤＮＡシークエンサーを使用して決定されたとともに、本明細書で決定されるＤＮＡ分子によりコードされるポリペプチドの全てのアミノ酸配列が上記のとおり決定されたＤＮＡ配列の翻訳により予測された。それゆえ、この自動化手法により決定される任意のＤＮＡ配列について当該技術分野において周知のとおり、本明細書で決定される任意のヌクレオチド配列はいくらかのエラーを含み得る。自動化により決定されるヌクレオチド配列は、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列と典型的には少なくとも約９０％同一であり、より典型的には少なくとも約９５％から少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、当該技術分野において周知の手動ＤＮＡ配列決定法を含む他の手法によってより正確に決定され得る。同様に当該技術分野において周知のとおり、実際の配列と比較される決定されたヌクレオチド配列中の単一の挿入又は欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳においてフレームシフトを引き起こすであろうため、決定されたヌクレオチド配列によりコードされる予測されたアミノ酸配列は配列決定されたＤＮＡ分子により実際にコードされるアミノ酸配列と完全に異なり、かかる挿入点又は欠失点が始端となるであろう。
【００７５】
当業者は、そのような誤って同定された塩基を同定する能力を有するとともにかかるエラーをどのように修正するかについて知っている。
【００７６】
［核酸断片、プローブ及びプライマー］
本発明に係る核酸分子は、配列番号０１〜０７に示される核酸配列の部分又は断片のみを含んでなってもよく、例えばその断片はプローブ又はプライマーとして使用され得るか、又はカロアーゼ０１−０５タンパク質の一部をコードする断片であり得る。カロアーゼ０１−０５遺伝子及びｃＤＮＡのクローニングから決定されるヌクレオチド配列は、他のカロアーゼ０１−０５ファミリーメンバー、ならびに他の種由来のカロアーゼ０１−０５相同体の同定及び／又はクローニングにおける使用向けに設計されるプローブ及びプライマーの生成を可能にする。プローブ／プライマーは典型的には、好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、配列番号０１〜０７に示されるヌクレオチド配列又はその任意の機能的等価物の、少なくとも約１２又は１５個、好ましくは約１８又は２０個、好ましくは約２２又は２５個、より好ましくは約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、又は７５個もしくはそれ以上連続するヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を典型的に含んでなる、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含んでなる。
【００７７】
カロアーゼ０１−０５ヌクレオチド配列に基づくプローブは、例えば他の生物体内で同一又は相同のタンパク質をコードする転写産物又はゲノムカロアーゼ０１−０５配列を検出するために使用され得る。好ましい実施形態において、プローブはさらにそれに結合する標識群を含んでなり、例えば標識群は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、又は酵素補因子であり得る。かかるプローブはまた、カロアーゼ０１−０５タンパク質を発現する細胞を同定するための診断テストキットの一部としても使用され得る。
【００７８】
［同一性及び相同性］
用語「相同性」又は「パーセント同一性」は本明細書において同義的に使用される。本発明の目的上、本明細書の定義では、２本のアミノ酸配列又は２本の核酸配列のパーセント同一性を決定するため、配列は最適比較用に整列される（例えば、第２のアミノ又は核酸配列との最適アラインメントのため第１のアミノ酸の配列又は核酸配列中にギャップが導入され得る）。次に対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第１の配列内の位置が第２の配列内の対応する位置と同一のアミノ酸残基又はヌクレオチドにより占有される場合、分子は当該位置において同一である。２本の配列間のパーセント同一性は、配列により共有される同一位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一位置の数／位置の総数（すなわち、重複位置）×１００）。好ましくは、２本の配列は同じ長さである。
【００７９】
当業者は、２本の配列間の相同性を決定するため数種の異なるコンピュータプログラムが利用可能であるという事実を承知しているであろう。例えば、２本の配列間の配列の比較及びパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。好ましい実施形態において、２本のアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍ／ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｉａｎ／で入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）及びウンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３頁（１９７０年））のアルゴリズムを使用して決定され、いずれもＢｌｏｓｓｏｍ６２行列又はＰＡＭ２５０行列、及びギャップ加重について１６、１４、１２、１０、８、６、又は４を、及び長さ加重について１、２、３、４、５、又は６を使用する。当業者は、これらの種々のパラメータの全てがいくらか異なる結果を与え得るが、２本の配列の全体的なパーセンテージ同一性は異なるアルゴリズムを使用してもそれほど変化しないことを理解するであろう。
【００８０】
さらに別の実施形態において、２本のヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して決定され、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列、及びギャップ加重について４０、５０、６０、７０、又は８０を、及び長さ加重について１、２、３、４、５、又は６を使用する。別の実施形態において、２本のアミノ酸又はヌクレオチド配列のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）（ｈｔｔｐ：／／ｖｅｇａ．ｉｇｈ．ｃｎｒｓ．ｆｒ／ｂｉｎ／ａｌｉｇｎ−ｇｕｅｓｓ．ｃｇｉで入手可能）に組み込まれているＥ．メイヤーズ（Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ）及びＷ．ミラー（Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ）（ＣＡＢＩＯＳ、４：ｌｌ−１７頁（１９８９年）のアルゴリズムを使用して決定され、ＰＡＭ１２０加重残基表、ギャップ長ペナルティは１２及びギャップペナルティは４を使用する。
【００８１】
本発明の核酸及びタンパク質配列はさらに、公開データベースに対し検索を実行して、例えば、他のファミリーメンバー又は関連配列を同定するための、「問い合わせ配列」として使用され得る。かかる検索は、アルチュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０頁のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実行され得る。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索がＮＢＬＡＳＴプログラムにより、スコア＝１００、ワード長＝１２で実行されることにより本発明のカロアーゼ０１−０５核酸分子と相同なヌクレオチド配列が得られ得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索がＸＢＬＡＳＴプログラムにより、スコア＝５０、ワード長＝３で実行されることにより本発明のカロアーゼ０１−０５タンパク質分子と相同なアミノ酸配列が得られ得る。比較用のギャップ付きアラインメントを得るため、アルチュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９〜３４０２頁に記載されるとおり、ギャップ付きＢＬＡＳＴが利用され得る。ＢＬＡＳＴ及びギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータが使用され得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を参照されたい。
【００８２】
［ハイブリダイゼーション］
本明細書で使用されるとき、用語「ハイブリダイズする」はハイブリダイゼーション及び洗浄についての条件を記載することが意図され、その条件下では互いに少なくとも約５５％、少なくとも約４０％、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約８５％〜９０％、より好ましくは少なくとも９５％相同なヌクレオチド配列が典型的には互いにハイブリダイズされたまま残る。
【００８３】
かかるハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例は、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５℃でのハイブリダイゼーションに続き、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃、好ましくは５５℃、好ましくは６０℃及びさらにより好ましくは６５℃での１回又は複数回の洗浄である。
【００８４】
高度にストリンジェントな条件としては、例えば、６８℃で５×ＳＳＣ／５×デンハルト溶液／１．０％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション及び０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、室温での洗浄が挙げられる。あるいは、洗浄は４２℃で実施されてもよい。
【００８５】
当業者は、どの条件がストリンジェント及び高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に該当するかは周知であろう。かかる条件に関するさらなる指針は、例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９年、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州；及びオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（編）、１９９５年、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州）など、当該技術分野において容易に入手可能である。
【００８６】
当然ながら、ポリＡ配列（ｍＲＮＡの３’末端ポリ（Ａ）トラクトなど）、又はＴ（又はＵ）残基の相補的伸長部とのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部と特異的にハイブリダイズするために使用される本発明のポリヌクレオチドには含まれないであろうが、これはかかるポリヌクレオチドがポリ（Ａ）伸長部又はその相補体（例えば、実質的に任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）を含む任意の核酸分子とハイブリダイズするであろうためである。
【００８７】
［他の生物体からの完全長ＤＮＡの入手］
典型的な手法においては、他の生物体、例えば糸状菌類、特にホウライタケ属菌種から構築されるｃＤＮＡライブラリがスクリーニングされ得る。
【００８８】
例えば、ホウライタケ株は相同なカロアーゼ０１−０５ポリヌクレオチドについてノーザンブロット分析によりスクリーニングされ得る。本発明に係るポリヌクレオチドと相同な転写産物が検出されると、当業者に周知の標準的技術を利用して、然るべき株から単離されるＲＮＡからｃＤＮＡライブラリが構築され得る。あるいは、本発明に係るカロアーゼ０１−０５ポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能なプローブを使用して、全ゲノムＤＮＡライブラリがスクリーニングされ得る。
【００８９】
相同な遺伝子配列は、例えば、本明細書に教示されるとおりのヌクレオチド配列に基づき設計される２個の縮重オリゴヌクレオチドプライマープールを使用してＰＣＲを実施することにより単離され得る。
【００９０】
反応用鋳型は、本発明に係るポリヌクレオチドを発現することが既知の、又は疑わしい株から調製されるｍＲＮＡの逆転写により得られるｃＤＮＡであり得る。ＰＣＲ産物がサブクローニング及び配列決定されることで増幅された配列は新規カロアーゼ０１−０５核酸配列、又はそれらの機能的等価物の配列に相当することが保証され得る。
【００９１】
次にＰＣＲ断片が使用され完全長ｃＤＮＡクローンが様々な周知の方法により単離され得る。例えば、増幅断片が標識されるとともに使用され、バクテリオファージ又はコスミドｃＤＮＡライブラリがスクリーニングされ得る。あるいは、標識された断片が使用され、ゲノムライブラリがスクリーニングされ得る。
【００９２】
ＰＣＲ技術はまた、完全長ｃＤＮＡ配列を他の生物体から単離するためにも使用され得る。例えば、ＲＮＡは標準的手順に従い然るべき細胞又は組織源から単離され得る。逆転写反応が、初回の鎖合成のプライミング用増幅断片の５’最末端に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用してＲＮＡ上で実施され得る。
【００９３】
結果として得られるＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは次に、標準的な末端トランスフェラーゼ反応を使用して「テール付き」にされ得（例えば、グアニンにより）、ハイブリッドはＲＮアーゼＨで消化され得、及び次に第２の鎖合成が予備刺激され得る（例えば、ポリＣプライマーにより）。従って、増幅断片の上流のｃＤＮＡ配列は容易に単離され得る。有用なクローニング戦略のレビューについては、例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、上記；及びオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、上記を参照されたい。
【００９４】
［ベクター］
本発明の別の態様は、カロアーゼ０１−０５タンパク質又はそれらの機能的等価物をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書で使用されるとき、用語「ベクター」は、それが連結している別の核酸の輸送能を有する核酸分子を参照する。ある種類のベクターは「プラスミド」であり、これは追加的なＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二重鎖ＤＮＡループを参照する。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ここでは追加的なＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲートされ得る。特定のベクターはそれが導入される宿主細胞内での自己複製能を有する（例えば、細菌性複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれるとともに、それにより宿主ゲノムと共に複製される。そのうえ、特定のベクターはそれらが操作可能に連結される遺伝子の発現の誘導能を有する。本明細書においてかかるベクターは「発現ベクター」と称される。一般的に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはプラスミドの形態であることが多い。用語「プラスミド」及び「ベクター」が本明細書において同義的に使用され得るのは、プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるためである。しかしながら、本発明は、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）などの、等価な機能を供する他の形態の発現ベクターを含むことも意図される。
【００９５】
本発明の組換え発現ベクターは、本発明の核酸を宿主細胞中での核酸の発現に好適な形態で含んでなり、これは組換え発現ベクターが、発現に使用される宿主細胞に基づき選択される、発現される核酸配列に操作可能に連結される１本又は複数の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクターの範囲内で、「操作可能に連結される」は、当該ヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現（例えば、インビトロ転写／翻訳系内での、又はベクターが宿主細胞中に導入される場合には宿主細胞内での）を可能にするような方法で調節配列に連結されることを意味するように意図される。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。かかる調節配列は、例えば、ゲーデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）、「Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、サン・ディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、カリフォルニア州（１９９０年）に記載される。調節配列としては、多くの種類の宿主細胞内でヌクレオチド配列の構成的発現を誘導するもの、及び特定の宿主細胞内でのみヌクレオチド配列の発現を誘導するもの（例えば組織特異的調節配列）が挙げられる。当業者には、発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等の要因に依存し得ることが理解されるであろう。本発明の発現ベクターが宿主細胞に導入されることにより、本明細書に記載されるとおりの核酸（例えばカロアーゼ０１−０５タンパク質、カロアーゼ０１−０５タンパク質の変異型、それらの断片、変異体又は機能的等価物、融合タンパク質等）によりコードされるタンパク質又はペプチドが産生され得る。
【００９６】
本発明の組換え発現ベクターは、カロアーゼ０１−０５タンパク質の原核生物又は真核生物細胞中での発現用に設計され得る。例えば、カロアーゼ０１−０５タンパク質は真菌細胞、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用して）、酵母細胞又は哺乳動物細胞内で発現し得る。好適な宿主細胞が、ゲーデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）、「Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、サン・ディエゴ、カリフォルニア州（１９９０年）においてさらに考察されている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えばＴ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを使用してインビトロで転写及び翻訳され得る。
【００９７】
本発明において有用な発現ベクターとしては、染色体由来、エピソーム由来及びウイルス由来ベクター、例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体要素、ウイルス、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス及びレトロウイルスなどに由来するベクター、及びそれらの組み合わせに由来するベクター、例えば、コスミド及びファージミドなど、プラスミド及びバクテリオファージ遺伝要素に由来するものなどが挙げられる。
【００９８】
ＤＮＡインサートは、いくつか例を挙げれば、λファージＰＬプロモーター、大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐ及びｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター及びレトロウイルスＬＴＲのプロモーターなどの、然るべきプロモーターに操作可能に連結されるべきである。他の好適なプロモーターは当業者に周知であろう。特定の実施形態において、プロモーターは、原核生物又は糸状菌類中でのペルオキシダーゼの高い発現レベルの誘導能を有することが好ましい。かかるプロモーターは当該技術分野において周知である。発現コンストラクトは転写開始、終結のための部位を、及び、転写領域において、翻訳のためのリボソーム結合部位を含み得る。コンストラクトにより発現する成熟転写産物のコード部分は、始端に翻訳開始ＡＵＧを、及び翻訳されるポリペプチドの末端に適切に位置する終止コドンを含むであろう。
【００９９】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換又はトランスフェクション技術を介して原核生物又は真核生物細胞に導入され得る。本明細書で使用されるとき、用語「形質転換」及び「トランスフェクション」は、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、形質導入、感染、リポフェクション、陽イオン性脂質媒介トランスフェクション又は電気穿孔を含む、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための当該技術分野で認知されている様々な技術を参照することが意図される。宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトするための好適な方法は、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州、１９８９年）、デイビス（Ｄａｖｉｓ）ら、「Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８６年）及び他の実験マニュアルに見られる。
【０１００】
哺乳動物細胞の安定的なトランスフェクションについて、使用される発現ベクター及びトランスフェクション技術によっては、細胞の小さな画分のみがそれらのゲノムに外来ＤＮＡを組み込み得ることが知られている。これらの組み込み体を同定及び選択するため、一般的に選択可能なマーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が当該遺伝子とともに宿主細胞に導入される。好ましい選択可能なマーカーとしては、Ｇ４１８、ハイグロマイシン及びメトトレキサートなどの薬剤に耐性を与えるものが挙げられる。選択可能なマーカーをコードする核酸はカロアーゼ０１−０５タンパク質をコードするものと同じベクター上の宿主細胞に導入され得るか、又は別個のベクターに導入され得る。導入された核酸を安定的にトランスフェクトされる細胞は薬剤選択により同定され得る（例えば、導入された選択可能なマーカー遺伝子を有する細胞は生存するであろう一方、他の細胞は死滅する）。
【０１０１】
原核生物中でのタンパク質の発現は、融合又は非融合タンパク質のいずれの発現も誘導する構成的又は誘導性プロモーターを含むベクターを伴い大腸菌中で行われることが多い。融合ベクターはそこでコードされるタンパク質、例えば組換えタンパク質のアミノ末端に数多くのアミノ酸を付加する。かかる融合ベクターは典型的には３つの目的を果たす：１）組換えタンパク質の発現を増加させる、２）組換えタンパク質の溶解度を上昇させる、及び３）親和性精製においてリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を補助する。多くの場合、融合発現ベクターにおいては、タンパク質分解切断部位が融合部分と組換えタンパク質との接合部に導入されることにより融合タンパク質の精製後の、組換えタンパク質の融合部分からの分離が可能となる。かかる酵素、及びそれらの同種認識配列としては、因子Ｘａ、トロンビン及びエンテロキナーゼが挙げられる。
【０１０２】
指摘されるとおり、発現ベクターは好ましくは選択可能なマーカーを含む。かかるマーカーとしては、真核生物細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクターゼ又はネオマイシン耐性及び大腸菌及び他の細菌中の培養物についてはテトラサイクリン又はアンピシリン耐性が挙げられる。然るべき宿主の代表例としては、大腸菌、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）及びネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などの細菌細胞、酵母などの真菌細胞；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２及びスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９などの昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ及びＢｏｗｅｓメラノーマなどの動物細胞、及び植物細胞が挙げられる。上述の宿主細胞についての然るべき培養の培地及び条件は当該技術分野において周知である。
【０１０３】
細菌における使用に好ましいベクターには、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）から入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０及びＰＱＥ−９、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から入手可能なｐＢＳベクター、ファージスクリプトベクター、ブルースクリプトベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、及びファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５がある。好ましい真核生物のベクターには、ストラタジーンから入手可能なＰＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＺＴ１及びｐＳＧ、及びファーマシアから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬがある。他の好適なベクターは当業者には直ちに明らかであろう。
【０１０４】
本発明において使用するための既知の細菌プロモーターとしては、大腸菌ｌａｃＩ及びｌａｃＺプロモーター、Ｔ３及びＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、λＰＲ、ＰＬプロモーター及びｔｒｐプロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）のものなど、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター、及びマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターなどのメタロチオネインプロモーターが挙げられる。
【０１０５】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡのより高等な真核生物による転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加し得る。エンハンサーは、ＤＮＡのシス作用要素であり、通常約１０〜３００ｂｐが所与の宿主細胞型においてプロモーターの転写活性を増加させるよう作用する。エンハンサーの例としては、ｂｐ１００〜２７０における複製起点の後期側に位置するＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
【０１０６】
翻訳されたタンパク質の小胞体内腔、細胞膜周辺腔又は細胞外環境への分泌について、然るべき分泌シグナルが発現ポリペプチドに組み込まれ得る。シグナルはポリペプチドにとって内在的であってもよく、又は異種シグナルであってもよい。
【０１０７】
ポリペプチドは、融合タンパク質などの改変された形態で発現し得るとともに、分泌シグナルのみならず、追加的な非相同機能領域も含み得る。従って、例えば、追加的なアミノ酸の領域において、特別に変化したアミノ酸がポリペプチドのＮ末端に付加されることにより、精製中又はそれに続く出荷及び保管中の宿主細胞内における安定性及び持続性が改善され得る。また、ペプチド部分がポリペプチドに付加されることにより、精製が促進され得る。
【０１０８】
［宿主細胞］
別の実施形態において、本発明は、細胞、例えば、本発明により包含される核酸を含有する形質転換宿主細胞又は組換え宿主細胞を特徴とする。「形質転換細胞」又は「組換え細胞」は、組換えＤＮＡ技術によってその細胞に（又はその祖先に）本発明に係る核酸が導入された細胞である。例えば、細菌、真菌類、酵母など、原核生物及び真核生物の双方の細胞が含まれる。
【０１０９】
好適な宿主細胞の例は、ミクロシスティス（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ）属、ムラサキシメジ（Ｌｅｐｉｓｔａ）属、例えばハタシメジ（Ｌ．ｉｒｉｎａ）、チャダイゴケ（Ｃｙａｔｈｕｓ）属、例えばハゲチャダイゴケ（Ｃ．ｐａｌｌｉｄｕｓ）、マンネンタケ（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）属、例えばコフキサルノコシカケ（Ｇ．ａｐｐｌａｎａｔｕｍ）、ヤニタケ（Ｉｓｃｈｎｏｄｅｒｍａ）属、例えばＩ．ベンゾイナム（Ｉ．ｂｅｎｚｏｉｎｕｍ）、ホウライタケ属、例えばニオイヒメホウライタケ、シロアミタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）属、例えばカワラタケ（Ｔ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）のシロアミタケ（Ｔ．ｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、例えばＣ．ラウレンチイ（Ｃ．ｌａｕｒｅｎｔｉｉ）、ヒポミケス（Ｈｙｐｏｍｙｃｅｓ）属、例えばＨ．オドラツス（Ｈ．ｏｄｏｒａｔｕｓ）又はファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）属、例えばＰ．ロドジマ（Ｐ．ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）、ファネロキエート（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属、例えばＰ．クリソスポリウム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、レンチヌラ（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ）属、例えばシイタケ（Ｌ．ｅｄｏｄｅｓ）、ヒトヨタケ（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）属、例えばウシグソヒトヨタケ（Ｃ．ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、キカイガラタケ（Ｇｌｏｅｏｐｈｙｌｌｕｍ）属、例えばキチリメンタケ（Ｇ．ｔｒａｂｅｕｍ）、オフィオストマ（Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ）属、例えばＯ．ピリフェラム（Ｏ．ｐｉｌｉｆｅｒｕｍ）、アスペルギルス属、例えばＡ．ニガー、Ａ・オリゼ、Ａ．ニデュラン（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、サーモミセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）属、例えばＴ．ラヌギノーサ（Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、スポロトリカム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、例えばＳ．サーモフィル（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ）、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、例えばＡ．プルランス（（Ａ．ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、アモルホーテカ（Ａｍｏｒｐｈｏｔｈｅｃａ）属、例えばＡ．レシナエ（Ａ．ｒｅｓｉｎａｅ）、ロイコスポリジウム（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、例えばＬ．スコチイ（Ｌ．ｓｃｏｔｔｉｉ）、クスダマカビ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ）属、例えばＣ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）である。
【０１１０】
特に好ましくは、特にアスペルギルス属−例えばアスペルギルス・オリゼ又はアスペルギルス・ニガー−及びホウライタケ属−例えばニオイヒメホウライタケ−といった糸状菌類由来の細胞又はピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、−例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ）−などの酵母由来の細胞又は細菌由来の細胞である。
【０１１１】
挿入された配列の発現を調節する、又は遺伝子産物を特異的な所望の様式で修飾及び処理する宿主細胞が選択され得る。タンパク質産物のかかる修飾（例えばグリコシル化）及びプロセシング（例えば切断）はタンパク質の最適な機能性を促進し得る。
【０１１２】
様々な宿主細胞は、翻訳後プロセシングならびにタンパク質及び遺伝子産物の修飾についての特性及び特異的機序を有する。分子生物学及び／又は微生物学の当業者によく知られている然るべき細胞系又は宿主系が選択されることにより、発現させる外来タンパク質の所望の及び妥当な修飾及びプロセシングを確実なものとし得る。この目的上、一次転写産物の適正なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化、及びリン酸化のための細胞機構を有する真核生物宿主細胞が使用され得る。かかる宿主細胞は当該技術分野において周知である。
【０１１３】
宿主細胞としてはまた、限定はされないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８などの哺乳動物細胞系、及び脈絡叢細胞系が挙げられる。所望であれば、本発明に係るポリペプチドは安定的にトランスフェクトされた細胞系により産生され得る。哺乳動物細胞の安定的なトランスフェクションに好適な数多くのベクターが一般に利用可能であり、かかる細胞系を構築するための方法もまた、例えば、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（上記）において公知である。
【０１１４】
［本発明に係るポリペプチドの工業プロセスにおける使用］
本発明の別の態様は、本発明に係るポリペプチド又はその機能的等価物（これ以降、漂白酵素と称される）の、例えば洗剤、酵素ストーンウォッシュ加工又は食品製造、例えばパン製品又は乳製品などの工業プロセスにおける使用を含んでなる。
【０１１５】
本発明に係るポリペプチドは酵素調製物として使用されてもよく、又は前記酵素の産生能を有する微生物によりインサイチュで産生されてもよい。酵素調製物は様々な供給源、例えば植物、動物及び微生物に由来し得る。好ましくは酵素調製物は微生物に由来し、これは微生物によって工業規模で制御された方式により酵素を得ることが可能となるためである。微生物に由来する酵素調製物は選択された微生物株の古典的発酵処理により、又は本発明に係るポリペプチドを過剰発現する微生物の発酵により得られ得る。微生物は、細菌、真菌又は酵母であってもよい。非古典的発酵のための宿主細胞として好適な微生物の例については、宿主細胞に関する上記の一節が参照される。
【０１１６】
酵素調製物はまた、他の好適な酵素、例えばオキシドレダクターゼ、アミラーゼ、脂肪分解酵素、加水分解酵素なども含んでなり得る。意外なことに、特にオキシドレダクターゼ、例えばヘキソースオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、マルトース酸化酵素又はグルコースオキシダーゼの組み合わせが本発明に係る漂白酵素の酵素活性に相乗効果を有することが発見された。オキシドレダクターゼは、微生物を含む種々の供給源から得られ得る。好ましくは真菌源由来、例えば糸状菌類由来のオキシドレダクターゼが使用される。好適なオキシドレダクターゼは、例えばアスペルギルス・ニガーなどのアスペルギルス種から得られるグルコースオキシダーゼである。従って本発明はまた、本発明に係るポリペプチドの新規酵素の、オキシドレダクターゼとの組み合わせにも関する。
【０１１７】
この効果は、本発明に係る酵素調製物が使用される適用において、オキシドレダクターゼが活性となる基質が存在する場合にはさらに亢進される。これが存在しない場合、これはまた処理に添加され得るであろう。かかる基質の例は、ヘキソースオキシダーゼ又はグルコースオキシダーゼの使用時のグルコースの添加である。従って本発明はまた、本発明に係るポリペプチド及びオキシドレダクターゼならびにオキシドレダクターゼ用の基質を含んでなる酵素調製物を含んでなる新規組成物にも関する。
【０１１８】
本発明はさらに、新規酵素の組み合わせ及び新規組成物の、以下に記載される本発明に係る食品の製造工程における使用に関する。
【０１１９】
意外なことに、本発明に係るポリペプチド又はその機能的等価物が使用されることにより食品の少なくとも一部の白色度が向上することが発見された。好ましくは、本発明に係る漂白ポリペプチドは以下の食品製造工程において使用される。食品の中間形態が色素を含んでなる食品の製造工程は、少なくとも１種の本発明に係るポリペプチドを、前記酵素がその製造中に添加されない食品と比較して食品の少なくとも一部の白色度を向上させるうえで有効な量で添加するステップを含んでなる。
【０１２０】
食品の中間形態は本明細書において、食品の最終形態を得る前の製造工程中に生じる任意の形態と定義される。中間形態は、使用される個々の原材料及び／又はそれらの混合物及び／又は添加剤を伴う混合物及び／又は加工助剤、又はそれに続くそれらの加工形態を含んでなり得る。
【０１２１】
本発明に係るポリペプチドは有効量で添加される。当業者はこの有効量を、酵素投入量を変えることにより、及び最終食品の色素の分解及び／又は白色度の向上を計測することにより容易に決定できる。酵素がβ−カロテンの変換能を有する場合、酵素の有効量は、β分解単位（例えばＡｚｉｚ又はＺｏｒｎ単位−「材料及び方法」を参照）に関して表現され得る。
【０１２２】
食品は、小麦粉などの植物源である少なくとも１種の原材料から作製され得る。小麦粉は、例えば、焼き上げたパンの内相の着色の原因となるカロテノイド（カロテン及びキサントフィル）及びフラボンなどの色素を含有することが知られている。あるいは、これらの色素は、例えば乳など、植物原材料以外の供給源に由来し得る。カロテノイドの例は、カロテン骨格を伴う、特にβ−カロテン又はカプサンチン骨格、より詳細にはα及びβ−カロテン、ルテイン、リコピン、アンテラキサンチン、カプサンチン、ゼアキサンチン、ビオラキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、ルテオキサンチン、ネオキサンチン、及びそれぞれのアポカロテノイドを伴うさらなる物質である。
【０１２３】
本発明に係るプロセスに好ましい食品は、ベークドパン及び小麦粉及び／又は他の穀類原料の粉末から焼き上げた他の製品である。
【０１２４】
例えば、ベークド食パンについて、中間形態としては、例えば小麦粉、それと他のパン成分との、例えば水、塩、酵母及びパン改良組成物などとの初期混合物、混合生地、練り生地、発酵生地及び部分的に焼いた生地が含まれる。酵素がβ−カロテンの変換能を有する場合、酵素は小麦粉及び／又は他の穀類原料の粉末に対し、又は他のパン成分との任意の初期混合物に対し、穀粉１ｋｇ当たり１〜５０００Ｚｏｒｎ単位、好ましくは穀粉１ｋｇ当たり５〜１０００Ｚｏｒｎ単位、より好ましくは穀粉１ｋｇ当たり１０〜５００Ｚｏｒｎ単位及び最も好ましくは穀粉１ｋｇ当たり２５〜２５０Ｚｏｒｎ単位となるような量で添加される。酵素はまた、他の生地及び／又は当該技術分野において周知のパン改良加工助剤、例えば当該技術分野において周知の１種又は複数種の酵素（例えば、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、抗老化マルトジェニックα−アミラーゼなどのデンプン分解酵素、リパーゼ、ホスホリパーゼ、ガラクトリパーゼなどの脂肪分解酵素、グルコースオキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ラッカーゼ、ピラノースオキシダーゼ、炭水化物オキシダーゼなどの酸化酵素、キシラナーゼ、アラビノフラノシダーゼなどのヘミセルロース分解酵素、エンドグルカナーゼ（セルラーゼなど）、セロビオヒドロラーゼ、プロテアーゼなどのセルロース分解酵素及び／又は還元剤及び酸化剤（例えばアスコルビン酸、グルタチオン）、乳化剤（例えばＤＡＴＥＭ）等の当該技術分野において周知の化学的加工助剤等とのパン改良剤混合物と共に、又はその一部として添加されてもよい。
【０１２５】
一部の種類の麺類においては、白い製品が望ましいと見なされる。例えば、麺類について、中間形態としては、例えば小麦粉、水、塩、及び他の麺成分とのその初期混合物、混合生地及び、生麺、乾燥麺、茹で麺、蒸し麺及び／又は揚げ麺であり得る最終麺製品が含まれる。
【０１２６】
食品はまた、乳製品であり得る。乳製品とは、乾燥固体ベースで少なくとも１０重量％、好ましくは少なくとも３０重量％、より好ましくは少なくとも５０重量％、なおより好ましくは少なくとも７０重量％又は最も好ましくは少なくとも８０重量％の乳、好ましくはウシの乳由来成分を含有する製品を意味する。乳由来成分は、例えば脂肪、タンパク質、例えば乳清チーズカード及びカゼイン等である。乳、特にウシの乳は、カロテノイド、例えばβ−カロテンなどの着色化合物を天然で含有し得る。
【０１２７】
白色は、例えばチーズ、バター油、粉乳又は乳清製品において重要な役割を果たす。例えばフェタ（Ｆｅｔａ）、モツァレラ（Ｍｏｚｚａｒｅｌｌａ）、リコッタ（Ｒｉｃｏｔｔａ）及びブルーチーズ、例えばデンマークブルー（Ｄａｎｉｓｈ Ｂｌｕｅ）、ロックフォール（Ｒｏｑｕｅｆｏｒｔ）又はゴルゴンゾーラ（Ｇｏｒｇｏｎｚｏｌａ）などのチーズにおいて、白色は望ましいものと考えられる。ヤギ又はヒツジ由来の乳が少なくとも部分的にウシの乳に置き換えられるチーズにおいて、チーズの白色は、ウシの乳中に存在するβ−カロテンによって問題となり得る。
【０１２８】
アナトー又はβ−カロテンのような一部のチーズ天然着色剤が食品用着色剤として使用される。しかしながら、この着色剤もまた、乳清中に存在し得る。この乳清が、例えば粉ミルクなどにさらに加工される場合、乳清製品の着色が望ましくないことがある。食品用ソフトチーズについて、中間製品としては、例えば乳、及びチーズカードが含まれる。
【０１２９】
製品の白色度の計測は、視覚的に、又は反射計測、例えば走査により行われ得る。反射計測において色は３個のパラメータ、すなわちＬ値（黒＝０〜白＝１００）、ａ値（緑＝−６０〜赤＝＋６０）及びｂ値（青＝−６０〜黄＝＋６０）により定量化される。カロテノイドの場合、製造された製品のｂ値は好ましくは可能な限り０に近く、好ましくは１０〜０の間、より好ましくは５〜０の間、及びさらにより好ましくは１未満及び最も好ましくは０．５未満である。さらなる態様において、本発明は、これ以前に本明細書に記載されるとおりの本発明の方法により得られる食品を提供する。これらの食品は、中間製品における色素の変換能を有する１種又は複数種の酵素の添加を含まない製造工程により得られる食品との比較において、少なくとも一部分の有意な白色度の向上を特徴とする。
【０１３０】
さらなる態様において、本発明は、色素の変換能を有することにより、食品、例えば小麦粉原料又は乳由来の製品を漂白する酵素の使用を提供する。意外なことに、これらの酵素が家庭用洗剤における染み除去剤として有利に使用され得ることが発見された。特に、本酵素は、着色の染み、例えば草の染み、コーヒー及び紅茶の染みを、綿織物及び合成繊維（例えばポリエステル）の双方から除去するうえで極めて有効であることが証明された。さらには、本酵素はまた、酵素ストーンブリーチ加工においても、例えばブルージーンズのインジゴ染料を所望のレベルに漂白することにより使用され得るであろう。
【０１３１】
［材料及び方法］
［β−カロテンの変換の計測］
［Ａｚｉｚによるβ−カロテン分解の計測］
酵素活性は、Ａ．ベン・アジズ（Ａ．Ｂｅｎ Ａｚｉｚ）（１９７１年）、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０、１４４５頁に従いβ−カロテン変換活性として測定され得る。本明細書において１酵素単位は、１分間当たりに１マイクログラムのβ−カロテンを変換する酵素の量として定義される（さらには、Ａｚｉｚ単位と称される）。
【０１３２】
［Ｚｏｒｎによるβ−カロテン分解の計測］
酵素活性はまた、ゾーン（Ｚｏｒｎ）ら（２００３年）、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６２：３３１−３３６頁に従いβ−カロテン変換活性として測定され得る。本明細書において１酵素単位は、１分間当たりに１マイクロモルのβ−カロテンを変換する酵素の量として定義される（さらには、Ｚｏｒｎ単位と称される）。アッセイは次のとおり行われる：試料を含有する１．５ｍｌの酵素がキュベット中において２７℃で５分間、予備インキュベートされた後、１００μｌのβ−カロテン原液（詳しくは以下を参照）が添加された。必要に応じて、濃縮された培養上清がｐＨ５．５のクエン酸／リン酸緩衝液（この緩衝液は、４３ｍｌの０．１Ｍクエン酸を５６ｍｌの０．２ＭのＮａ２ＰＯ４溶液と混合することにより調製された）で希釈された。吸光度の低下が温度制御された細胞ホルダー内で分光光度計を使用して１５分間にわたり４５０ｎｍ及び２７℃でモニタされた。曲線の直線性が調べられ、及び酵素活性が曲線の直線部分から次式
酵素活性［ｍＵ／ｍｌ］＝（ΔＥ×Ｖｔ）×１０６／（Ｖｓ×ｄ×ε）
に従い計算された（式中、Ｕ＝上記に定義される酵素活性単位、ΔＥ＝１分間当たりの４５０ｎｍでの吸光度の低下、Ｖｔ＝キュベットの総容積（ｍｌ）、Ｖｓ＝キュベット中の試料容積（ｍｌ）、ε＝β−カロテンの吸光係数（９５，０００Ｍ−１・ｃｍ−１である）、ｄ＝キュベットの厚さ（ｃｍ）である）。
【０１３３】
Ａｚｉｚ酵素単位は、Ａｚｉｚ単位をβ−カロテンの分子量＝５３６．８５で除することによりＺｏｒｎ単位に変換され得る。
【０１３４】
［β−カロテン原液の調製］
β−カロテン原液は次のとおり調製される：５ｍｇのβ−カロテン及び５００ｍｇのツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０が５０ｍＬのジクロロメタン中に溶解された。ジクロロメタンはロータリーエバポレータ内で４０℃及び８００ｍｂａｒで蒸発させた。ほぼ全てのジクロロメタンが蒸発したとき、３０ｍｌの水が添加され、及び残留ジクロロメタンがロータリーエバポレータ及び最後に窒素気流内で除去された。結果として得られた溶液がろ過され、目盛付きフラスコ内で５０ｍｌまで水で充填された。溶液は冷温で（冷蔵庫）保存される必要があり、数日間に限り安定である。
【０１３５】
［食品の漂白］
内相又は生地からのカロテノイドの抽出後に、ゲリナス（Ｇｅｌｉｎａｓ）、Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍ．７５、８１０−１８４頁（１９９８年）により指示されるとおり漂白度が測定された。ゲリナス（Ｇｅｌｉｎａｓ）（１９９８年）により指示されるとおり、パンの内相からの総脂質抽出を介してカロテノイドが測定された。
【０１３６】
食品の白色度は、視覚的ならびに反射計測の双方により測定され得る。目視検査は、漂白酵素が添加されている食品を漂白酵素が添加されていない対照と比較することにより実施され得る。反射計測は、カラースキャナ（ヒューレット・パッカード・スキャンジェットＡＤＦ（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ Ｓｃａｎｊｅｔ ＡＤＦ））上で食品を走査することにより実施され得る。これらのデータは、プログラムＬａｂＳＭＡＲＴ（ＬａｂＳＭＡＲＴ、ＬＬＣ、Ｌｏｇａｎ Ｕｔａｈ、米国）を使用して分析され得る。
【０１３７】
［実施例１］
［ニオイヒメホウライタケから得られるβ−カロテン変換酵素の培養及び活性の測定］
ニオイヒメホウライタケから得られるβ−カロテン変換酵素カロアーゼ１及びカロアーゼ２の培養及び活性の測定が、ゾーン（Ｚｏｒｎ）ら（２００３年）により記載されるとおり行われた。本明細書に、ニオイヒメホウライタケのカルチャーコレクションからの菌糸体（Ｃｅｎｔｒａａｌ Ｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ−Ｕｔｒｅｃｈｔ、オランダから寄託番号ＣＢＳ１３７．８３により入手可能）を使用して乳化β−カロテンを補給された寒天プレートが接種された。プレートのインキュベーションが２４℃で１４日間実施された。１００ｍｌの標準栄養液（ＳＮＬ、これは３０ｇ／リットルのグルコース・Ｈ２Ｏ；４．５ｇ／リットルのアスパラギン・Ｈ２Ｏ；１．５ｇ／リットルのＫＨ２ＰＯ４；０．５ｇ／リットルのＭｇＳＯ４；３．０ｇ／リットルの酵母抽出物；５ｍｇ／ｌのＣｕＳＯ４＊５ａｑ、８０ｍｇ／ｌのＦｅＣ１３＊６ａｑ、９０ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ４＊７ａｑ、３０ｍｇ／ｌのＭｎＳＯ４＊１ａｑ及び４０ｍｇ／ｌのＥＤＴＡを含有する１ｍｌ／リットルの滅菌微量元素溶液（滅菌前にｐＨは１ＮのＮａＯＨで６．０に調整された）を含有する）を含有する３００ｍｌの振盪フラスコに菌糸体が接種され、及び１５０ｒｐｍの振盪インキュベータ内において２４℃で７日間インキュベートされた。前培養物が微生物汚染の不在について調べられ、Ｕｌｔｒａ Ｔｕｒｒａｘによりホモジナイズされ、及び主培養物を接種するために使用された（５００ｍｌの三角フラスコ中２５０ｍＬ）。２日目より毎日２ｍｌの試料が取り出され、遠心分離により菌糸体が除去されたうえ分光光度アッセイにおいて活性が計測された。４日間の培養後、β分解活性は無細胞上清１リットル当たり約０．３Ｚｏｒｎ単位であった。
【０１３８】
［実施例２］
［ニオイヒメホウライタケから得られるβ−カロテン変換酵素カロアーゼ１及びカロアーゼ２の活性に対するＨ２Ｏ２の効果］
１０マイクロリットルの２０ｍＭ過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の効果が、上記に記載されるとおりのインビトロアッセイのβ−カロテン分解アッセイにおいて測定される。カロアーゼ１及びカロアーゼ２を含有するニオイヒメホウライタケの濃縮培養上清が使用された。β−カロテン分解活性はＨ２Ｏ２の存在下で４．３から１０．９ｍＵに増加した。熱失活した酵素が使用されたときには、β−カロテン分解は一切観測されなかった。これは、Ｈ２Ｏ２がβ−カロテン分解酵素によりβ−カロテン分解活性を刺激することを明確に実証したものである。
【０１３９】
［実施例３］
［ニオイヒメホウライタケから得られるカロアーゼ１及びカロアーゼ２の活性に対するアスペルギルス・ニガーグルコースオキシダーゼ（ＧＯＸ）の効果］
５０マイクロリットルのニオイヒメホウライタケの濃縮培養上清が１２９０マイクロリットルの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）と混合された。１６０マイクロリットルの５００ｍＭグルコース溶液が添加され、及び混合物が５分間、セ氏２７度で調整された。アスペルギルス・ニガーグルコースオキシダーゼはフルカ（Ｆｌｕｋａ）から入手された。０〜２マイクロリットルのグルコースオキシダーゼ原液（１００Ｕ／ｍｌ、０〜２００ｍＵのＧＯＸの活性に相当する）及び１００マイクロリットルのβ−カロテン溶液（「材料及び方法」に記載されるとおりに調製）の添加により反応が開始された。４５０ｎｍでの吸光度の低下が１０分間、セ氏２７度で記録された（表１）。
【０１４０】
【表１】
【０１４１】
第２の一連の実験においては、グルコースの濃度を変化させた一方、グルコースオキシダーゼ活性の量は一定に保たれた。従って、５０マイクロリットルのニオイヒメホウライタケの濃縮培養上清が１４３４〜１２９０マイクロリットルの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）と混合され、１６〜１６０マイクロリットルの５００ｍＭグルコース溶液が添加された（表２）。混合物は５分間、セ氏２７度に保たれたうえ、０〜１マイクロリットルのＧＯＸ（０又は１００ｍＵの活性に相当する）及び１００マイクロリットルのβ−カロテン溶液の添加により反応が開始された。
【０１４２】
【表２】
【０１４３】
ブランク（５０ｍＭのグルコース、１００ｍＵのＧＯＸ、培養上清の添加なし）においてはβ−カロテンの分解は観測されなかった。
【０１４４】
これらの実験から、グルコースの存在下におけるＧＯＸの存在がニオイヒメホウライタケの濃縮上清によりβ−カロテン分解を強力に刺激することは明らかである。
【０１４５】
［実施例４及び比較例Ａ、Ｂ及びＣ］
［パプ製パン試験法］
標準的な製パン工程においてパップローフが、２００ｇの小麦粉（１６０ｇの小麦粉（Ｋｏｌｉｂｒｉ（登録商標）−Ｍｅｎｅｂａ、オランダ）及び４０グラムの小麦粉（Ｉｂｉｓ（登録商標）−Ｍｅｎｅｂａ、オランダ）の混合物）、１．４ｇのＦｅｒｍｉｐａｎ（登録商標）ドライイースト（ＤＳＭ Ｂａｋｅｒｙ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ、Ｄｅｌｆｔ、オランダ）、４ｇの塩、５０ｐｐｍのアスコルビン酸、４ｐｐｍの真菌α−アミラーゼＢａｋｅｚｙｍｅ（登録商標）Ｐ５００（ＤＳＭ Ｆｏｏｄ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ、Ｄｅｌｆｔ、オランダ）、６０ｐｐｍの真菌ヘミセルラーゼＢａｋｅｚｙｍｅ（登録商標）ＨＳ２０００（ＤＳＭ Ｆｏｏｄ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ、Ｄｅｌｆｔ、オランダ）及び表３に示されるとおりの量のβ−カロテン分解酵素及び１１６ｍｌの水から、ピンミキサー中で６分間、及び１５秒間、調製された。生地温度は２８℃であった。混合の直後、生地は１５０ｇずつ２個に分割され、丸められ、及び３０℃のホイロ室内で４５分間寝かされ、成形及び型詰めされた。３０℃で７０分間の最終ホイロの後、生地は２２５℃で２０分間焼き上げられた。
【０１４６】
密閉された箱内に室温で２４時間保管された後、焼き上がったパンの内相の品質及び色がパン製造者により評価された；表４に示されるとおりカロテノイドの量がパン内相の抽出後に測定された。
【０１４７】
【表３】
【０１４８】
【表４】
【０１４９】
表４から、本発明に係る漂白酵素を生地に添加することにより、カロテノイドが分解され、結果としてより白い内相をもたらすと結論づけられ得る。本発明に係る方法の有効性は大豆酵素リポキシゲナーゼ２の使用時より良好であるとともに、酵素活性大豆粉の使用時と少なくとも同等か、又はそれより良好である。
【０１５０】
［実施例５］
［ミニチーズの調製］
シャキール−ウル−レーマン（Ｓｈａｋｅｅｌ−Ｕｒ−Ｒｅｈｍａｎ）ら（「Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ ｏｆ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｃｈｅｅｓｅｓ ｉｎ Ｌａｉｔ」、７８（１９９８年）、６０７〜６２０頁）により記載されるとおり、小型チーズが製造された。ウシの生乳が３０分間６３℃で加熱することにより低温殺菌された。低温殺菌された乳は広口プラスチック製遠心分離ボトル（ボトル１本につき２００ｍＬ）に移され、３１℃に冷却された。続いて、０．７２ｍｌの出発培養物ＤＳ ５ＬＴ１（ＤＳＭ Ｇｉｓｔ Ｂ．Ｖ．、Ｄｅｌｆｔ、オランダ）が遠心分離ボトル内の２００ｍｌの各低温殺菌乳に添加され、乳は２０分間熟成された。次に、ＣａＣｌ２（熟成乳２００ｍＬにつき１３２μＬの１ｍｏｌ・Ｌ−１溶液）が添加された後、凝固剤が添加された（１ｍｌにつき０．０４ＩＭＣＵ）。カロアーゼ０１及びカロアーゼ０２の使用が関わる実験の場合、この酵素は凝固剤と同時に添加される。
【０１５１】
乳溶液を４０〜５０分間３１℃で保置して凝塊を形成させた。凝塊は、型から１ｃｍの間隔をとって伸張ワイヤのカッターにより手で切断された。２分間ヒーリングさせた後、１０分間静かに攪拌する。その後、カード／乳清混合物を連続的に攪拌しながら温度を３９℃まで３０分間にわたり徐々に上昇させた。ｐＨが６．２に達したとき、カード／乳清混合物は室温で６０分間、１，７００ｇで遠心分離された。乳清が排出され、カードは水槽中３６℃で保置された。チーズは１５分毎に逆さに返されｐＨを５．２〜５．３に低下させた後、室温で１，７００ｇ、２０分間遠心分離された。さらなる乳清の排出後、チーズの漂白度が走査により測定された。漂白酵素カロアーゼ０１及びカロアーゼ０２を使用した結果、より白いチーズがもたらされた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
漂白活性と、
ａ．配列番号０８〜１２のいずれか１つに従う単離ポリペプチド又はその任意の機能的等価物、
ｂ．配列番号０１〜０７のいずれか１つに従うポリヌクレオチド又はその任意の機能的等価物又は前記ポリヌクレオチドを含んでなるベクター又はその任意の機能的等価物を、然るべき宿主細胞、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）中で発現させることにより得られる単離ポリペプチド、及び
ｃ．配列番号１３〜１７の少なくとも１つを含んでなるポリペプチド
からなる群より選択される１つ又は複数の特性とを有する単離ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号０８〜１２に従う請求項１に記載の単離ポリペプチド又は、配列番号８〜１２と少なくとも５５％相同なその任意の機能的等価物。
【請求項３】
配列番号０８〜１２に従う請求項１に記載の単離ポリペプチド又は、配列番号８〜１２と少なくとも６５％相同なその任意の機能的等価物。
【請求項４】
ニオイヒメホウライタケ（Ｍａｒａｓｍｉｕｓ ｓｃｏｒｏｄｏｎｉｕｓ）から得られる請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
【請求項５】
配列番号０１〜０７に従うポリヌクレオチド又はその機能的等価物とハイブリダイズ可能な単離ポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号０１〜０７に従うポリヌクレオチド又はその機能的等価物と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な請求項５に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項７】
真菌類、好ましくは糸状菌類から得られる請求項５又は６に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項８】
ホウライタケ（Ｍａｒａｓｍｉｕｓ）属、好ましくはニオイヒメホウライタケから得られる請求項７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
配列番号０８〜１２に従うポリペプチド又はその機能的等価物の少なくとも１つの機能ドメインをコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号０１〜０７に従うヌクレオチド配列又はその機能的等価物を含んでなる単離ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号０１〜０７に従う単離ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項５〜１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を含んでなるベクター。
【請求項１４】
請求項５〜１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列が、好適な宿主細胞中での前記ポリヌクレオチド配列の発現に好適な調節配列と操作可能に連結される、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
前記好適な宿主細胞が糸状菌類又は細菌類である、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
請求項５〜１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のベクターを作製するための方法であって、前記ポリヌクレオチド又は前記ベクターで形質転換される宿主細胞を培養するステップ及び前記ポリヌクレオチド又は前記ベクターを前記宿主細胞から単離するステップを含んでなる、方法。
【請求項１７】
請求項５〜１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のベクターを然るべき宿主細胞中で発現させることにより得られる単離ポリペプチド。
【請求項１８】
カロアーゼ０１−０５ポリペプチドの機能ドメインを含んでなる組換え漂白酵素。
【請求項１９】
請求項１〜４又は１７のいずれか一項に記載のポリペプチドを作製するための方法であって、好適な宿主細胞を請求項５〜１２のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド又は請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のベクターで形質転換するステップ、前記細胞を前記ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で培養するステップ及び場合によりコードされたポリペプチドを前記細胞又は培養培地から精製するステップを含んでなる、方法。
【請求項２０】
請求項５〜１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のベクターを含んでなる組換え宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１〜４又は１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを発現する組換え宿主細胞。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが使用されない食品と比較して食品の少なくとも一部の白色度が向上する、請求項１〜４又は１７のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項２３】
その中間形態が色素を含んでなる食品を製造するための方法であって、請求項１〜４又は１７のいずれか一項に記載の少なくとも１種のポリペプチドを、結果としてその製造中に前記ポリペプチドが添加されない食品と比較して結果として前記食品の少なくとも一部の白色度の向上をもたらす形態に前記色素を直接的に変換するうえで有効な量で添加するステップを含んでなる、方法。
【請求項２４】
前記食品が穀粉、好ましくは小麦粉から製造される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記食品が乳製品である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記色素がカロテノイドである、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記酵素が、微生物に由来するか、又は前記酵素の産生能を有する微生物によりインサイチュで産生される酵素調製物として添加される、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記酵素が、細菌、真菌又は酵母に由来するか、又はそれらによりインサイチュで産生される酵素調製物として添加される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記真菌がホウライタケ属、好ましくはニオイヒメホウライタケに属する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記食品の製造中に追加的にオキシドレダクターゼが添加される、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２３〜３０のいずれか一項に記載の方法により得られる食品。
【請求項３２】
色素を結果として食品の少なくとも一部の白色度の向上をもたらす形態に直接的に変換する請求項１〜４又は１７のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項３３】
洗剤のための、又は酵素ストーンブリーチ加工における請求項１〜４又は１７のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１】
漂白活性と、
ａ．配列番号０８〜１２のいずれか１つに従う単離ポリペプチド又はその任意の機能的等価物、
ｂ．配列番号０１〜０７のいずれか１つに従うポリヌクレオチド又はその任意の機能的等価物又は前記ポリヌクレオチドを含んでなるベクター又はその任意の機能的等価物を、然るべき宿主細胞、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）中で発現させることにより得られる単離ポリペプチド、及び
ｃ．配列番号１３〜１７の少なくとも１つを含んでなるポリペプチド
からなる群より選択される１つ又は複数の特性とを有する単離ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号０８〜１２に従う請求項１に記載の単離ポリペプチド又は、配列番号８〜１２と少なくとも５５％相同なその任意の機能的等価物。
【請求項３】
配列番号０８〜１２に従う請求項１に記載の単離ポリペプチド又は、配列番号８〜１２と少なくとも６５％相同なその任意の機能的等価物。
【請求項４】
ニオイヒメホウライタケ（Ｍａｒａｓｍｉｕｓ ｓｃｏｒｏｄｏｎｉｕｓ）から得られる請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
【請求項５】
配列番号０１〜０７に従うポリヌクレオチド又はその機能的等価物とハイブリダイズ可能な単離ポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号０１〜０７に従うポリヌクレオチド又はその機能的等価物と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な請求項５に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項７】
真菌類、好ましくは糸状菌類から得られる請求項５又は６に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項８】
ホウライタケ（Ｍａｒａｓｍｉｕｓ）属、好ましくはニオイヒメホウライタケから得られる請求項７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
配列番号０８〜１２に従うポリペプチド又はその機能的等価物の少なくとも１つの機能ドメインをコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号０１〜０７に従うヌクレオチド配列又はその機能的等価物を含んでなる単離ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号０１〜０７に従う単離ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項５〜１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を含んでなるベクター。
【請求項１４】
請求項５〜１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列が、好適な宿主細胞中での前記ポリヌクレオチド配列の発現に好適な調節配列と操作可能に連結される、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
前記好適な宿主細胞が糸状菌類又は細菌類である、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
請求項５〜１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のベクターを作製するための方法であって、前記ポリヌクレオチド又は前記ベクターで形質転換される宿主細胞を培養するステップ及び前記ポリヌクレオチド又は前記ベクターを前記宿主細胞から単離するステップを含んでなる、方法。
【請求項１７】
請求項５〜１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のベクターを然るべき宿主細胞中で発現させることにより得られる単離ポリペプチド。
【請求項１８】
カロアーゼ０１−０５ポリペプチドの機能ドメインを含んでなる組換え漂白酵素。
【請求項１９】
請求項１〜４又は１７のいずれか一項に記載のポリペプチドを作製するための方法であって、好適な宿主細胞を請求項５〜１２のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド又は請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のベクターで形質転換するステップ、前記細胞を前記ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で培養するステップ及び場合によりコードされたポリペプチドを前記細胞又は培養培地から精製するステップを含んでなる、方法。
【請求項２０】
請求項５〜１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のベクターを含んでなる組換え宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１〜４又は１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを発現する組換え宿主細胞。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが使用されない食品と比較して食品の少なくとも一部の白色度が向上する、請求項１〜４又は１７のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項２３】
その中間形態が色素を含んでなる食品を製造するための方法であって、請求項１〜４又は１７のいずれか一項に記載の少なくとも１種のポリペプチドを、結果としてその製造中に前記ポリペプチドが添加されない食品と比較して結果として前記食品の少なくとも一部の白色度の向上をもたらす形態に前記色素を直接的に変換するうえで有効な量で添加するステップを含んでなる、方法。
【請求項２４】
前記食品が穀粉、好ましくは小麦粉から製造される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記食品が乳製品である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記色素がカロテノイドである、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記酵素が、微生物に由来するか、又は前記酵素の産生能を有する微生物によりインサイチュで産生される酵素調製物として添加される、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記酵素が、細菌、真菌又は酵母に由来するか、又はそれらによりインサイチュで産生される酵素調製物として添加される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記真菌がホウライタケ属、好ましくはニオイヒメホウライタケに属する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記食品の製造中に追加的にオキシドレダクターゼが添加される、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２３〜３０のいずれか一項に記載の方法により得られる食品。
【請求項３２】
色素を結果として食品の少なくとも一部の白色度の向上をもたらす形態に直接的に変換する請求項１〜４又は１７のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項３３】
洗剤のための、又は酵素ストーンブリーチ加工における請求項１〜４又は１７のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【公開番号】特開２０１３−９９３４４（Ｐ２０１３−９９３４４Ａ）
【公開日】平成２５年５月２３日（２０１３．５．２３）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１３−３４４６（Ｐ２０１３−３４４６）
【出願日】平成２５年１月１１日（２０１３．１．１１）
【分割の表示】特願２００８−５２０８７５（Ｐ２００８−５２０８７５）の分割
【原出願日】平成１８年７月１２日（２００６．７．１２）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月２３日（２０１３．５．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１３−３４４６（Ｐ２０１３−３４４６）
【出願日】平成２５年１月１１日（２０１３．１．１１）
【分割の表示】特願２００８−５２０８７５（Ｐ２００８−５２０８７５）の分割
【原出願日】平成１８年７月１２日（２００６．７．１２）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
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