食道癌の予後予測方法
【課題】
食道癌患者の予後を予測する方法、治療選択のための情報を提供する方法、及び、食道癌患者の予後予測用試薬を提供する。
【解決手段】
本発明は、食道癌患者から得られた試料中のバイオマーカの発現を検出することを含み、当該バイオマーカの過剰発現又は発現減少から食道癌の予後を予測するものである。当該バイオマーカは、好ましくはトランスグルタミナーゼ３である。
食道癌患者の予後を予測する方法、治療選択のための情報を提供する方法、及び、食道癌患者の予後予測用試薬を提供する。
【解決手段】
本発明は、食道癌患者から得られた試料中のバイオマーカの発現を検出することを含み、当該バイオマーカの過剰発現又は発現減少から食道癌の予後を予測するものである。当該バイオマーカは、好ましくはトランスグルタミナーゼ３である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食道癌患者の予後を予測に関する遺伝子医学の分野、特に腫瘍遺伝子発現情報に基づく予後予測方法に関する。より詳細には、本発明は、標的とされるタンパク質レベル又はｍＲＮＡレベルの異常を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食道癌は、世界において８番目に多い癌であり、癌による死亡原因の６番目の癌である（非特許文献１及び２参照）。近年の放射線療法及び化学療法を組み合わせた外科的技術発達にも関わらず、特に筋層への浸潤やリンパ節転移を起こした進行癌においては早期再発が珍しくなく、５年生存率は未だに約４０％未満である（非特許文献３〜５参照）。臨床においては、食道癌患者へのアジュバント及びネオアジュバント化学療法が生存期間を改善しているとの報告もある（非特許文献６参照）。しかし、これらの臨床試験の対象となった患者の多くは深刻な副作用を経験しており、また、治療薬が癌細胞に対してほとんど効果がないか又は全く効果がない例も見受けられる。これまで、全ての食道癌患者についてこのような治療法を適用した場合には、手術のみで完治することが可能な患者まで不要で有害な併用療法を受けなければならないという問題があった。
【０００３】
手術や化学−放射線療法等の治療法に対する患者の反応は、例えそれらの患者が同じ臨床ステージであったとしても、幅広く異なるものであり、既存の診断方法では予測することが不可能であった。食道癌患者の効果的な治療管理において障害となっていることの一つには、疾病の経過を予測することに限界があることが挙げられる。例えば、従来、医師は、より積極的な外科的治療及び／又は放射線照射及び化学療法等の治療効果により利益を得ることができる患者を選択することができなかった。よって、リスクの階層化は、治療による死亡の可能性を回避し、又は、疾患の更なる進行を阻止するため、決定的に重要な事項と考えられている。
【０００４】
複数の遺伝子及びタンパク質の置換が食道癌と関与することが報告されている（非特許文献７）。これらの置換は、バイオマーカと考えることができ、癌を診断し、進行状況を把握し、疾患の進行や治療への反応を監視することに利用できる可能性がある。しかしながら、それらのうち多くは感度が低く、又は、偽陽性率が高いという問題があった。また、これらのバイオマーカは癌の主として癌の存在の指標となることを目的として研究されたものであり、癌の将来、即ち予後について予測させるものではない。従って、治療戦略を最適化し、臨床結果を改善するための新規な癌の予測方法が求められていた。
【０００５】
トランスグルタミナーゼ３は、タンパク質のポリアミンを結合することによりタンパク質の架橋結合を形成する酵素であり、表皮や毛包の細胞外皮の後期に働くことが知られている。食道癌との関係においては、トランスグルタミナーゼ３のｍＲＮＡレベルが食道癌組織において減少しているとの報告がある（非特許文献８）。また、トランスグルタミナーゼ３のタンパク質レベルの発現と食道癌との関係についても報告がある（非特許文献９）。しかし、本報告においては、癌の予後の指標となり得るリンパ節転移とトランスグルタミナーゼ３の発現には相関がないことが示されており、トランスグルタミナーゼ３は食道癌の存在の指標とはなるものの、予後予測のための指標とはならないと考えられていた。なお、上記文献の引用は、上記記載がいずれも関連する先行技術であると認めることを意図するものではない。これらの文献の日付に関する記述及び内容に関する表現は、出願人が入手可能な情報に基づいたものであり、これらの文献の日付又は内容の正確さについて承認するものではなく、また、これらの文献に記載されたいかなる理論又は仮説によっても制限されることを意図するものではない。
【非特許文献１】Parkin DM, Pisani P, Ferlay J. Estimates ofthe worldwide incidence of 25 major cancers in 1990. Int J Cancer1999;80:827-41.
【非特許文献２】Pisani P, Parkin DM, Bray F, Ferlay J.Estimates of the worldwide mortality from 25 cancers in 1990. Int J Cancer1999;83:18-29.
【非特許文献３】Ilson DH. Oesophageal cancer: newdevelopments in systemic therapy. Cancer Treat Rev 2003;29:525-32.
【非特許文献４】Enzinger PC, Mayer RJ. Esophageal cancer. N Engl J Med2003;349:2241-52.
【非特許文献５】Mariette C, Balon JM, Piessen G, Fabre S,Van Seuningen I, Triboulet JP. Pattern of recurrence following completeresection of esophageal carcinoma and factors predictive of recurrent disease.Cancer 2003;97:1616-23.
【非特許文献６】Shinoda M, Hatooka S, Mori S, Mitsudomi T.Clinical aspects of multimodality therapy for resectable locoregionalesophageal cancer. Ann Thorac Cardiovasc Surg 2006;12:234-41.
【非特許文献７】Vallbohmer D, Lenz HJ. Predictive andprognostic molecular markers in outcome of esophageal cancer. Dis Esophagus2006;19:425-32.
【非特許文献８】Chen et al., Int. J. Cancer: 88, 862-865 (2000)
【非特許文献９】World journal of Gastroenterology: 12 (24) 3929-3932
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、食道癌の予後を予測する方法（又は予後を予測するための情報を提供する方法）、食道癌患者の治療方法を選択するための情報を提供する方法、又は、食道癌治療薬のスクリーニング方法、並びに、当該方法に使用するキットを提供し、患者にとってより利益のある治療戦略を選択するための情報及び新薬開発に有用な情報を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
広範囲にわたるｍＲＮＡ発現の研究は、アレイを基礎とした方法を用いて、食道癌の発癌及び進行に関係ある遺伝子クラスタを同定している。しかし、新規治療戦略のために実際に利用可能なバイオマーカや、分子標的となる遺伝子は未だに見出されていない。このことから、この方法によるバイオマーカの探索に限界があるとも考えられている。細胞に含まれるタンパク質は遺伝子の機能的な翻訳物であり、癌細胞の悪性表現型を直接支配している。しかし、ＤＮＡ配列及びＲＮＡ量の測定に関する研究においては、癌の進行において発生するリン酸化、糖鎖付加又はタンパク質分解から生じる翻訳後の異常を予測することはできなかった。
【０００８】
本発明者らは、多数の臨床検体について、高感度の蛍光色素を用いて二次元電気泳動を行い、その結果を基に、プロテオミクス情報及び臨床病理情報を統合した結果、トランスグルタミナーゼ３が食道癌の予後と相関が強いことを見出した。
【０００９】
本発明の方法は、身体試料（特に、生体生検）中のバイオマーカの少なくとも１つの発現を検出することを含み、ここでバイオマーカの発現又は発現量は食道癌の予後を示すものである。本発明のバイオマーカの未発現又は発現減少は、食道癌の予後不良を示す。よって、本発明の方法は、食道癌患者を予後良好な患者と予後不良な患者に振り分けることができる。また、本発明の方法は、食道癌患者から予後良好な患者を選択することが可能であることから、予後良好な患者の不要な治療方法の適用による不利益を避けることができる。同時に、本発明の方法は、食道癌患者から予後不良な患者を選択することが可能であることから、予後不良な患者に必要な治療方法を適用することにより、治療しないことによる疾病の進行を回避することができる。更に、本発明のバイオマーカは、食道癌治療薬（特に、予後の改善を目的とした治療薬）の効果の指標として使用することができる。従って、本発明のバイオマーカは、食道癌治療薬のスクリーニングに使用することができる。また、本発明のバイオマーカは、食道癌患者の病状や進行（特には、転移、悪性化等の予後に関わる病状や進行）をモニターするために使用することができる。
【００１０】
本発明は、食道癌の予後を予測するためのバイオマーカに関する。ある態様において、本発明は、食道癌患者の予後を予測する方法（又は予後を予測するための情報を提供する方法）であって：
（ａ）該患者由来の試料中のトランスグルタミナーゼ３の発現を検出すること；及び、
（ｂ）測定されたトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと該患者の予後との関連付けをすることを含む方法に関する。好ましくは、前記測定されたトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと食道癌の予後との関連付けをすることにおいてトランスグルタミナーゼ３の未発現若しくは発現低下が該患者の予後不良を示す。
【００１１】
具体的な態様において、本発明は、食道癌患者の予後を予測するための方法又は予後を予測するための情報を提供する方法であって、以下の工程：
（ａ）該患者由来の試料を調整する工程；
（ｂ）少なくとも１つの抗体若しくはその断片又は核酸に該試料を接触させる工程、ここで、該抗体若しくはその断片はトランスグルタミナーゼ３タンパク質に特異的に結合する抗体若しくはその断片であり、該核酸はトランスグルタミナーゼ３ｍＲＮＡに特異的に結合する核酸である；
（ｃ）トランスグルタミナーゼ３タンパク質又はｍＲＮＡへの該抗体若しくはその断片又は該核酸の結合を検出してトランスグルタミナーゼ３タンパク質又はｍＲＮＡの発現レベルを測定する工程；及び、
（ｄ）トランスグルタミナーゼ３タンパク質又はｍＲＮＡの発現レベルから食道癌患者の予後を予測する工程、ここで、トランスグルタミナーゼ３タンパク質の未発現若しくは発現低下が食道癌患者の予後不良を示す、を含む方法に関する。
また、例えば、本発明の食道癌患者の予後を予測するための方法又は予後を予測するための情報を提供する方法は、食道癌患者であってリンパ節転移が存在する（好ましくは２個以上のリンパ節転移が存在する）患者を対象として行うことができる。
【００１２】
別の態様において、本発明は、食道癌患者の治療方法を選択するための情報を提供する方法であって、
（ａ）該患者由来の試料中のトランスグルタミナーゼ３の発現を検出すること；及び、
（ｂ）測定されたトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと該患者の治療方法との関連付けを含む方法に関する。好ましくは、測定されたトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと該患者の治療方法との関連付けにおいて、トランスグルタミナーゼ３の未発現若しくは発現低下は、該患者が強化化学療法又は放射線療法の対象患者であることを示す。
また、例えば、本発明の食道癌患者の治療方法を選択するための情報を提供する方法は、食道癌患者であってリンパ節転移が存在する（好ましくは２個以上のリンパ節転移が存在する）患者を対象として行うことができる。
【００１３】
更に別の態様において、本発明は、食道癌の状態又は進行をモニターする方法又は食道癌の状態又は進行をモニターするための情報を提供する方法に関する。例えば、本発明は、食道癌の状態又は進行をモニターする方法又は食道癌の状態又は進行をモニターするための情報を提供する方法であって、
（ａ）患者由来の試料中のトランスグルタミナーゼ３の発現を検出すること；及び、
（ｂ）測定されたトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと該患者の食道癌の状態又は進行との関連付けを含む方法に関する。好ましくは、測定されたトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと該患者の食道癌の状態又は進行との関連付けにおいて、トランスグルタミナーゼ３の未発現若しくは発現低下は、該患者の食道癌の状態が不良であること、進行していることを示し、及び／又は、トランスグルタミナーゼ３の発現若しくは発現上昇は、該患者の食道癌の状態が良好であること、進行していないことを示す。
また、例えば、本発明の食道癌の状態又は進行をモニターする方法又は食道癌の状態又は進行をモニターするための情報を提供する方法は、食道癌患者であってリンパ節転移が存在する（好ましくは２個以上のリンパ節転移が存在する）患者を対象として行うことができる。
【００１４】
また、別の態様において、本発明は、食道癌治療薬のスクリーニング方法に関する。例えば、本発明は、食道癌治療薬のスクリーニング方法であって、以下（ｉ）から（ｉｉｉ）から選択される１の方法：
（ｉ）以下の工程：
（ａ）食道癌細胞を調整する工程；
（ｂ）被験薬を当該食道癌細胞に接触させる工程；
（ｂ）トランスグルタミナーゼ３のｍＲＮＡ量又はタンパク質量を測定する工程；
（ｃ）トランスグルタミナーゼ３の測定値からトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを計算する工程；
（ｄ）被験薬を接触させた食道癌細胞と接触させなかった食道癌細胞におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを比較する工程；及び、
（ｅ）被験薬を接触させなかった食道癌細胞におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと比較して、被験薬を接触させた食道癌細胞におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルが上昇した場合に当該被験薬が食道癌の予後改善効果があると判定する工程、
を含む方法；
（ｉｉ）以下の工程：
（ａ）食道癌モデル細胞を調整する工程；
（ｂ）被験薬を当該モデル動物に投与する工程；
（ｃ）当該モデル動物におけるトランスグルタミナーゼ３のｍＲＮＡ量又はタンパク質量を測定する工程；
（ｄ）トランスグルタミナーゼ３の測定値からトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを計算する工程；
（ｅ）被験薬を投与した食道癌モデル動物と投与しなかった食道癌モデル動物におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを比較する工程；及び、
（ｆ）被験薬を投与しなかった食道癌モデル動物におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと比較して、被験薬を投与した食道癌モデル動物におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルが上昇した場合に当該被験薬が食道癌の予後改善効果があると判定する工程；
を含む方法；あるいは、
（ｉｉｉ）以下の工程：
（ａ）被験薬を食道癌患者に投与する工程；
（ｂ）当該食道癌患者におけるトランスグルタミナーゼ３のｍＲＮＡ量又はタンパク質量を測定する工程；
（ｃ）トランスグルタミナーゼ３の測定値からトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを計算する工程；
（ｄ）被験薬を投与した食道癌患者と投与しなかった食道癌患者におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを比較する工程；及び、
（ｅ）被験薬を投与しなかった食道癌患者におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと比較して、被験薬を投与した食道癌患者におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルが上昇した場合に当該被験薬が食道癌の予後改善効果があると判定する工程；
を含む方法、に関する。
【００１５】
また別の態様において、本発明は、食道癌患者の予後を予測し、食道癌患者の治療方法を選択するための情報を提供し、食道癌の状態又は進行をモニターし、及び／又は、食道癌治療薬をスクリーニングするためのバイオマーカに関する。具体的には、本発明のバイオマーカはトランスグルタミナーゼ３である。
【００１６】
また、本発明は、以下（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択されるいずれか１つを備えるキット：
（ｉ）トランスグルタミナーゼ３タンパク質と特異的に結合する抗体又はその断片；
（ｉｉ）トランスグルタミナーゼ３遺伝子の一部と特異的に結合するプライマー及びトランスグルタミナーゼ３遺伝子と相補的な核酸；又は
（ｉｉｉ）トランスグルタミナーゼ３遺伝子の一部と相補的な配列及び消光プローブの一部と相補的な配列を有するフラップ、トランスグルタミナーゼ３遺伝子の一部と相補的な配列を備えるインベーダープローブ、三重鎖特異的ＤＮＡ分解酵素、及び、消光プローブを備える蛍光標識ユニバーサルプローブ、に関する。また別の態様において、本発明は、食道癌患者の予後を予測し（若しくは予後を予測するための情報を提供し）、食道癌患者の治療方法を選択するための情報を提供し、食道癌の状態又は進行をモニターし、又は、食道癌治療薬をスクリーニングするためのキットであって、以下（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択されるいずれか１つを備えるキット：
（ｉ）トランスグルタミナーゼ３タンパク質と特異的に結合する抗体又はその断片；
（ｉｉ）トランスグルタミナーゼ３遺伝子の一部と特異的に結合するプライマー及びトランスグルタミナーゼ３遺伝子と相補的な核酸；又は
（ｉｉｉ）トランスグルタミナーゼ３遺伝子の一部と相補的な配列及び消光プローブの一部と相補的な配列を有するフラップ、トランスグルタミナーゼ３遺伝子の一部と相補的な配列を備えるインベーダープローブ、三重鎖特異的ＤＮＡ分解酵素、及び、消光プローブを備える蛍光標識ユニバーサルプローブ、に関する。
【００１７】
上記記載の本発明の予後を予測するための方法若しくは予後を予測するための情報を提供する方法、食道癌患者の治療方法を選択するための情報を提供する方法、食道癌の状態又は進行をモニターする方法若しくは食道癌の状態又は進行をモニターするための情報を提供する方法、又は、食道癌治療薬のスクリーニング方法は、適宜既知の方法と組み合わせて用いることができる。例えば、リンパ節転移は患者の予後に関する重要な指標であることが知られていることから、リンパ節転移を検出する工程又はリンパ節転移に関する情報を入手する工程を本発明の方法に加えることにより、リンパ節転移と本発明のバイオマーカの検出を組み合わせて用いることができる。具体的には、リンパ節転移の検出又はリンパ節転移に関する情報により、リンパ節転移が存在しない又は少ない（１個）予後良好であることが明らかである患者群を除いた患者群について本発明のバイオマーカを検出することにより、リンパ節転移のみでは予後の良否が予測できない患者群について予後を予測に関連する情報を得ることができる。また、本発明の予後予測方法は、対象をリンパ節転移が存在する（好ましくは、リンパ節転移が２個以上存在する）患者とすることもできる。
【００１８】
本明細書において、「食道癌」は、食道に存在する癌であれば特に限定されず、食道の粘膜上皮細胞が癌化した扁平上皮癌及び食道腺が癌化した腺癌を包含する。
【００１９】
本明細書において、「予後」とは、食道癌が外科的治療等による腫瘍増殖の抑制、軽減後に辿る経過又は結末（例えば、転移の有無、生死等）を意味する。本明細書において、予後とは、例えば、外科的治療等による腫瘍増殖の抑制、軽減後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５又は２０年あるいはそれ以上の時点における生死であってもよい。予後は、トランスグルタミナーゼ３（予後指標）を調べることにより予測される。予後の予測は、トランスグルタミナーゼ３の存在／不存在又は上昇／減少により患者の予後が良好又は不良であるか否か又はその確率を判定することにより行うことができる。本明細書において、「予後の判定」及び「予後の評価」の文言は、予後の予測と同意義語として用いられる。
【００２０】
本明細書において「予後良好」とは、患者の外科的治療等による腫瘍増殖の抑制、軽減後の容態が長期間（例えば、３、５、６、７、８、９、１０、１５又は２０年間あるいはそれ以上）致命的とならないことを意味し、生存、非転移、非回帰、又は、非再発を意味していてもよい。例えば、予後良好とは、少なくとも３年、特には少なくとも５年の間に（好ましくは、転移又は再発を伴うことなく）生存することを意味してもよい。また、予後良好の状態として、最も好ましい状態は長期の無疾患の生存であるが、本発明において、予後良好とは、転移等何らかの疾患が確認されていてもその悪性度が低く、生存可能な状態を含むこともできる。
【００２１】
本明細書において「予後不良」とは、患者の外科的治療等による腫瘍増殖の抑制、軽減後の容態が短期間（例えば、１、２、３、４、５年間あるいはそれ以下）致命的となることを意味し、死亡、転移、回帰、又は、再発を意味していてもよい。例えば、予後不良とは、少なくとも３年、特には少なくとも５年の間に再発、転移又は死亡することを意味してもよい。
【００２２】
トランスグルタミナーゼ３(Transglutaminase 3)は、ＴＧａｓｅＥ、又は、ＴＧＥとしても知られるタンパク質であり、表皮分化の最終段階において、インヴォルクリン、ロリクリン、及び、スモールパラクリンリッチタンパク質等の構造タンパク質をクロスリンクすることにより、皮膚のケラチノサイトにおける角化膜形成に関与していることが知られている。全長のトランスグルタミナーゼ３タンパク質（前駆体）は、６９３アミノ酸からなるタンパク質である（スイスプロット アクセッション Ｎｏ．Ｑ０８１８８）。配列番号１は、トランスグルタミナーゼ３の遺伝子配列を示し、配列番号２は、トランスグルタミナーゼ３のアミノ酸配列を示す。
【発明の効果】
【００２３】
本発明のバイオマーカは、これまで的確に予後を予測できなかった食道癌の予後予測バイオマーカとして有用である。即ち、本発明の方法により、食道癌の予後を判定するための情報を得ることができる。特に、本発明のバイオマーカは、これまで予後予測因子として報告されていた食道癌の壁深達度や肉眼的所見と比較して、非常に優れた予後予測因子である。本発明の予後予測因子は、食道癌患者の治療方針選択のための情報を提供することができ、それにより、多くの食道癌患者が恩恵を受けることが期待されるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明のバイオマーカは、食道癌患者の予後の指標となることから、食道癌の予後予測方法、食道癌患者の治療方法を選択するための情報を提供する方法、及び、食道癌の状態又は進行をモニターする方法に使用することができる。
【００２５】
本発明の食道癌患者の予後を予測するための情報を提供する方法は、以下の工程：
（ａ）該患者由来の試料中のトランスグルタミナーゼ３の発現の検出をすること；及び、
（ｂ）測定されたトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと該患者の予後との関連付けをすること、ここで、トランスグルタミナーゼ３の未発現若しくは発現減少が前記食道癌患者の予後不良を示す、により行うことができる。
【００２６】
より具体的には、本発明の食道癌患者の予後を予測するための情報を提供する方法は、以下の工程：
（ａ）該患者由来の試料を調整する工程；
（ｂ）少なくとも１つの抗体若しくはその断片又は核酸に該試料を接触させる工程、ここで、該抗体若しくはその断片はトランスグルタミナーゼ３タンパク質に特異的に結合する抗体若しくはその断片であり、該核酸はトランスグルタミナーゼ３ｍＲＮＡに特異的に結合する核酸である；
（ｃ）トランスグルタミナーゼ３タンパク質又はｍＲＮＡへの該抗体若しくはその断片又は該核酸の結合を検出してトランスグルタミナーゼ３タンパク質又はｍＲＮＡの発現レベルを測定する工程；及び、
（ｄ）トランスグルタミナーゼ３タンパク質又はｍＲＮＡの発現レベルから食道癌患者の予後を予測する工程、ここで、トランスグルタミナーゼ３タンパク質の未発現若しくは発現低下が食道癌患者の予後不良を示す、により行うことができる。
【００２７】
食道癌患者の治療方法を選択するための情報を提供する方法は、以下の工程：
（ａ）該患者由来の試料中のトランスグルタミナーゼ３の発現の検出をすること；及び、
（ｂ）測定されたトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと該患者の治療方法との関連付けをすることこと、ここで、トランスグルタミナーゼ３の未発現若しくは発現低下が、該患者が強化化学療法の対象患者であることを示す、により行うことができる。
【００２８】
更に、本発明の食道癌の状態又は進行をモニターする方法は、以下の工程：
（ａ）患者由来の試料中のトランスグルタミナーゼ３の発現を検出すること；及び、
（ｂ）測定されたトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと該患者の食道癌の状態又は進行との関連付けをすること、ここで、トランスグルタミナーゼ３の未発現若しくは発現低下は、該患者の食道癌の状態が不良であること、進行していることを示し、及び／又は、トランスグルタミナーゼ３の発現若しくは発現上昇は、該患者の食道癌の状態が良好であること、進行していないことを示す、により行うことができる。
【００２９】
また、本発明のバイオマーカは、患者の予後の指標となることから、食道癌治療薬のスクリーニングにおいて、患者の予後の改善の指標として用いることができる。例えば、食道癌細胞に被験薬を添加し、食道癌モデル動物に被験薬を投与し、又は、食道癌患者に被験薬を投与し、一定時間後の本発明のバイオマーカの発現量を測定することにより、当該治療薬が食道癌の予後を改善するものであるか否かを判定することができる。より具体的には、添加又は投与により、トランスグルタミナーゼ３が発現若しくは発現上昇する被験薬を、食道癌の予後を改善する治療薬として選別することができる。よって、本発明は食道癌治療薬（又は予後改善薬）のスクリーニング方法を提供するものである。
【００３０】
本発明の食道癌治療薬のスクリーニングは、例えば以下の工程：
（ａ）食道癌細胞を調整する工程；
（ｂ）被験薬を当該食道癌細胞に接触させる工程；
（ｂ）トランスグルタミナーゼ３のｍＲＮＡ量又はタンパク質量を測定する工程；
（ｃ）トランスグルタミナーゼ３の測定値からトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを計算する工程；
（ｄ）被験薬を接触させた食道癌細胞と接触させなかった食道癌細胞におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを比較する工程；及び、
（ｅ）被験薬を接触させなかった食道癌細胞におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと比較して、被験薬を接触させた食道癌細胞におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルが上昇した場合に当該被験薬が食道癌の予後改善効果があると判定する工程；
により行うことができる。
【００３１】
本発明の食道癌治療薬のスクリーニングは、例えば以下の工程：
（ａ）食道癌モデル細胞を調整する工程；
（ｂ）被験薬を当該モデル動物に投与する工程；
（ｂ）当該モデル動物におけるトランスグルタミナーゼ３のｍＲＮＡ量又はタンパク質量を測定する工程；
（ｃ）トランスグルタミナーゼ３の測定値からトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを計算する工程；
（ｄ）被験薬を投与した食道癌モデル動物と投与しなかった食道癌モデル動物におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを比較する工程；及び、
（ｅ）被験薬を接触させなかった食道癌細胞におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと比較して、被験薬を接触させた食道癌細胞におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルが上昇した場合に当該被験薬が食道癌の予後改善効果があると判定する工程；
により行うことができる。
【００３２】
本発明の食道癌治療薬のスクリーニングは、例えば以下の工程：
（ａ）被験薬を食道癌患者に投与する工程；
（ｂ）当該食道癌患者におけるトランスグルタミナーゼ３のｍＲＮＡ量又はタンパク質量を測定する工程；
（ｃ）トランスグルタミナーゼ３の測定値からトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを計算する工程；
（ｄ）被験薬を投与した食道癌患者と投与しなかった食道癌患者におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを比較する工程；及び、
（ｅ）被験薬を投与しなかった食道癌患者におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと比較して、被験薬を投与した食道癌患者におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルが上昇した場合に当該被験薬が食道癌の予後改善効果があると判定する工程により行うことができる。
【００３３】
本発明の方法において使用する患者由来の試料としては、バイオマーカの発現を検出することができる試料であれば特に限定されず、例えば、組織（特には食道癌組織）、細胞、体液（例えば、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、漿液、髄液、関節液、眼房水、涙液、唾液等）を使用することができる。また、本発明の方法において使用する患者由来の試料は、測定試験に先立ち前処理されたものであってもよいし、患者から採取した試料をそのまま使用してもよい。
【００３４】
本発明のバイオマーカの発現は、タンパク質又は核酸のレベルで検査することができる。タンパク質レベルで検査する場合には、バイオマーカに特異的に結合する物質を利用して検出することができ、例えば、抗体又はその断片を用いて、免疫学的に検査する方法（例えば、ＥＬＩＳＡ（Catty, Raykundalia, 1989）、ラジオイムノアッセイ（Catty,
Murphy, 1989）、免疫組織化学染色、ウエスタンブロット、免疫沈降、免疫蛍光、フローサイトメトリー）が含まれる。また、核酸レベルで検査する場合には、ハイブリダイゼーション及び核酸増幅等の手法（例えば、ＡＲＭＳ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）法、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ＰＣＲ）法、Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法、ドット・ブロット・ハイブリダイゼーション法、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、Ｉｎ ｓｉｔｕ ＲＴ−ＰＣＲ法、ＰＣＲ−ＳＳＯ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）法、ＰＣＲ−ＳＳＰ法、ＡＭＰＦＬＰ（Ａｍｐｌｉｆｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、ＭＶＲ−ＰＣＲ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、インベーダー（登録商標）法）が含まれる。発現の測定は、発現の有無、検出の可否、発現量又は発現濃度の大小、過剰発現の有無、発現減少の有無等を測定すること包含する。
【００３５】
トランスグルタミナーゼ３をタンパク質レベルで検査する場合、トランスグルタミナーゼ３を認識する抗体又はその断片と試料中のトランスグルタミナーゼ３との結合を測定することにより行うができる。このような方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ（Catty, Raykundalia, 1989）、ラジオイムノアッセイ（Catty,
Murphy, 1989）、免疫組織化学染色、ウエスタンブロット、免疫沈降、免疫蛍光、フローサイトメトリー等を挙げることができる。本発明の診断薬の検体としては、例えば、生検として被験者から採取した組織試料または液体を使用することができる。使用される生検は、本発明の免疫学的測定の対象となるものであれば特に限定はなく、例えば、組織、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、漿液、髄液、関節液、眼房水、涙液、唾液またはそれらの分画物若しくは処理物を挙げることができ、好ましくは食道癌組織又は血液（血漿又は血清を含む）である。本発明の診断キットによる分析は、定性的、定量的または半定量的に行うことができる。
【００３６】
本発明の方法において使用する本発明のバイオマーカと特異的に結合する抗体又はその断片は、本発明のバイオマーカと結合する限りその構造、大きさ、イムノグロブリンクラス、由来等を問わない。また、本発明の方法で使用する抗体又はその断片は、モノクローナルであってもよいし、ポリクローナルであってもよい。抗体の断片とは、抗体の一部分（部分断片）又は抗体の一部分を含むペプチドであって、抗体の抗原への結合作用を保持するもののことである。このような抗体の断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）若しくはこれらの重合体、二量体化Ｖ領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、又は、ＣＤＲを含むペプチドを挙げることができる。ここで、ＣＤＲとは、Ｋａｂａｔら（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”,Ｋａｂａｔ,Ｅ.ら, Ｕ.Ｓ. Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ, １９８３）又はＣｈｏｔｈｉａら（Ｃｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ, Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.,１９６,９０１−９１７,１９８７）の定義によるものである。また、本発明は、本発明のキットが包含する抗体又はその断片のアミノ酸配列をコードする単離された核酸、当該核酸を包含するベクター、当該ベクターを保有する細胞も包含する。
【００３７】
抗体は、当業者によく知られた方法により得ることができる。例えば、トランスグルタミナーゼ３の全部若しくはその一部を有するポリペプチド、又は、それらをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ哺乳動物細胞用発現ベクター等を調製しこれを抗原とする。この抗原を用て動物を免疫後、免疫した動物から得られた免疫細胞と、ミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを得、当該ハイブリドーマの培養物から抗体を採取する。最後に採取した抗体を、抗原に用いた本発明のバイオマーカやその一部に一致するポリペプチドを利用した抗原特異精製を行うことにより本発明のバイオマーカのモノクローナル抗体を得ることができる。また、ポリクローナル抗体を作成する場合、上記と同様の抗原を動物を免疫し、免疫した動物から血液を採取し、この血液から血清を分離し、この血清に対して上記抗原を利用した抗原特異精製を行うことにより得ることができる。得られた抗体を酵素処理又は得られた抗体の配列情報を利用することにより、抗体の断片を得ることができる。
【００３８】
抗体又はその断片への標識の結合は当分野において一般的な方法により行うことができる。例えば、タンパク質又はペプチドを蛍光標識する場合、タンパク質又はペプチドをリン酸緩衝液で洗浄した後、ＤＭＳＯ、緩衝液等で調整した色素を加え、混合した後室温で１０分間静置することにより結合させることができる。また、市販の標識キットとして、ビオチン標識キット（Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、アルカリフォスファターゼ標識用キット（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、ペルオキシダーゼ標識キット（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｒｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｒｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２：株式会社同仁化学研究所）、フィコビリプロテイン標識キット（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ、Ｂ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｂ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ、Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、蛍光標識キット（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ５５５ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ６４７ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２：株式会社同仁化学研究所）、ＤｙＬｉｇｈｔ５４７、ＤｙＬｉｇｈｔ６４７（テクノケミカル株式会社）、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）抗体標識キット、Ｑｄｏｔ（登録商標）抗体標識キット（インビトロゲン社）、ＥＺ−Ｌａｂｅｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（フナコシ株式会社）等を用いて標識することもできる。また、標識した抗体又はその断片の検出は、適宜標識に適した機器を使用することにより行うことができる。
【００３９】
トランスグルタミナーゼ３をｍＲＮＡレベルで検査する場合、適宜設計したプライマーを用いて、ＰＣＲを利用した公知の方法に基づくことができる。このような方法としては、例えば、ＡＲＭＳ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）法、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ＰＣＲ）法、Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法を挙げることができる。また、増幅された核酸は、当該核酸と相補的な核酸を使用して、ドット・ブロット・ハイブリダイゼーション法、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、Ｉｎ ｓｉｔｕ ＲＴ−ＰＣＲ法、ＰＣＲ−ＳＳＯ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）法、ＰＣＲ−ＳＳＰ法、ＡＭＰＦＬＰ（Ａｍｐｌｉｆｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、ＭＶＲ−ＰＣＲ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法により検出することができる。本発明の方法による分析は、定性的、定量的または半定量的に行うことができる。
【００４０】
例えば、本発明の方法は、以下の工程：
（ａ）患者由来の試料を調整する工程；
（ｂ）トランスグルタミナーゼ３遺伝子を増幅させる工程：
（ｃ）核酸の増幅量を検出し、トランスグルタミナーゼ３遺伝子の発現レベルを測定する工程；並びに、
（ｄ）トランスグルタミナーゼ３遺伝子の発現レベルから前記食道癌患者の予後を予測する工程、ここで、トランスグルタミナーゼ３の未発現若しくは発現減少が前記食道癌患者の予後不良を示す、により行うことができる。
【００４１】
本発明の方法で使用する核酸は、化学合成により、又は、所望の核酸を含む遺伝子を生体材料から調整し、所望の核酸を増幅するよう設計したプライマーを用いて増幅することにより得ることができる。また、本発明の方法に使用するプライマーは、本明細書の開示及び公知の情報を基に、当業者周知の方法により適宜設計し、化学合成により得ることができる。
【００４２】
更に、別の態様において、トランスグルタミナーゼ３をｍＲＮＡレベルで検査する場合、例えば、インベーダー（登録商標）法として知られる方法（例えば、Kwiatkowski, R. W. et al.: "Clinical, genetic, and
pharmacogenetic applications of the Invader assay." Mol. Diagn., 4:
353-364, 1999参照）を用いて行うことができる。
例えば、本方法は、以下の工程：
（ａ）患者由来の試料を調整する工程；
（ｂ）以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載の核酸に該試料を接触させて、アレルプローブと相補的なＤＮＡに三重鎖を形成させる工程：
（ｉ）トランスグルタミナーゼ３遺伝子の一部と相補的な配列及び消光プローブの一部と相補的な配列（フラップ）を備えるアレル特異的プローブ、
（ｉｉ）トランスグルタミナーゼ３遺伝子の一部と相補的な配列を備えるインベーダープローブ；
（ｃ）（ｂ）により得られた核酸試料に、三重鎖特異的ＤＮＡ分解酵素を接触させて三重鎖を形成した核酸からフラップを遊離させる工程；
（ｄ）遊離されたフラップを、それぞれ当該フラップと相補的な配列及び消光プローブを備える蛍光標識ユニバーサルプローブと接触させる工程；
（ｅ）（ｄ）により得られた核酸試料に、三重鎖特異的ＤＮＡ分解酵素を接触させて蛍光標識を遊離させ、蛍光を発色させる工程；並びに、
（ｆ）発色した蛍光を検出することにより、トランスグルタミナーゼ３遺伝子の発現レベルを測定する工程、
（ｇ）測定されたトランスグルタミナーゼ３遺伝子の発現レベルから前記食道癌患者の食道癌患者の予後を予測し（若しくは予後を予測するための情報を提供し）、食道癌患者の治療方法を選択するための情報を提供し、食道癌の状態又は進行をモニターし、又は、食道癌治療薬をスクリーニングする工程、ここで、トランスグルタミナーゼ３の未発現若しくは発現減少が前記食道癌患者の予後不良や状態の悪化又は癌の進行を示す、により行うことができる。
【００４３】
本明細書において、患者の予後を判定するために、測定されたバイオマーカの発現レベルと患者の予後と関係において用いられる「関連付けをする」という用語は、被験者におけるバイオマーカの存在又はレベルを、予後が不良であった患者又は予後が不良であろうことが知られている患者、あるいは、予後が不良ではなかった患者又は予後が不良ではないと信じられている患者におけるバイオマーカの発現レベルと比較することを意味する。または、関連付けは、被験者におけるバイオマーカの存在又はレベルを、食道癌を発症していない健常人におけるバイオマーカの発現レベルと比較することであってもよい。例えば、対象患者のバイオマーカのレベルが、予後が不良であった患者群又は予後が不良であろうことが知られている患者群及び予後が不良ではなかった患者群又は予後が不良ではないと信じられている患者群のバイオマーカのレベルと比較して、予後が不良であった患者群又は予後が不良であろうことが知られている患者群における当該バイオマーカのレベルに近いか又は当該レベル群より形成される当該バイオマーカのレベル値の範囲内に属する値である場合には、当該患者の予後は不良であると予測することができる。比較対象となる患者におけるバイオマーカのレベルは、例えば、本発明の開示により、又は、既に予後が判明している患者由来の試料におけるバイオマーカのレベルを測定することにより、あるいは、他の予後指標による評価と組み合わせて評価することにより知ることができる。本発明のバイオマーカのレベルを利用して、患者が死亡、再発又は転移する可能性を判定することができる。予後因子と予後との関連付けは、統計的分析により行うことができる。統計学的有意性は、２以上の集団を比較し、信頼区間及び／又はｐ値を決定することにより決定される（Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiely & Sons,
NewYord, 1983）。本発明の信頼区間は、例えば、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又は９９．９９％であってもよい。また、本発明のｐ値は、例えば、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００２又は０．０００１であってもよい。
【００４４】
例えば、本発明のバイオマーカは、その存在／不存在により患者の予後と関連付けることができる。また、別の例として、本発明のバイオマーカはその発現レベルの上昇／減少により、患者の予後と関連付けることができる。例えば、発現レベルの上昇／減少は、食道癌組織における発現量の上昇／減少を指標とすることができる。この場合、本発明のバイオマーカについて予後指標としての発現量の閾値レベルを設定し、患者由来の試料におけるバイオマーカのレベルは、閾値レベルと比較することにより関連付けてもよい。また、発現レベルの上昇／減少は、食道癌組織における発現領域の拡大／縮小を指標とすることもできる。例えば、本発明のバイオマーカについて予後指標としての発現領域の閾値レベルを設定し、患者由来の試料におけるバイオマーカのレベルは、閾値レベルと比較することにより関連付けてもよい。このような閾値レベルは、例えば、感度が、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は、９８％以上となるように設定することができる。また、閾値レベルは、特異度が、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は、９８％以上となるように設定することができる。例えば、発現レベルの上昇／減少について、食道癌組織における発現領域の拡大／縮小を指標とした場合、本発明のバイオマーカの閾値レベルは、１％〜３０％（好ましくは、５％〜１５％）の間で設定することができ、例えば、約１０％である。前記において、「約」は、±１０％（好ましくは、±１％）を意味する。
【００４５】
予後の判定は、それにより患者の状態の経過又は転帰を予測する方法を意味し、状態の経過又は転帰を１００％の正確さで予測可能であることを意味するものではない。予後の判定は、ある経過又は転帰が起こる可能性が増大しているか否かを意味するものであり、当該経過又は転帰が起こらない場合を基準として起こりやすいことを意味するものではない。即ち、予後の判定結果は、本発明のバイオマーカのレベルが減少している患者において、そのような特徴を示さない患者に比較して、ある特定の経過又は転帰がより生じやすいということを意味する。
【００４６】
食道癌は、手術、放射線療法、化学療法又はこれらの組み合わせによる治療戦略により管理される。本発明の方法及びキットを利用することにより、食道癌患者に適した治療戦略決定要因を提供することができる。本発明において、バイオマーカの発現と治療方法との「関連付けをする」とは、被験者におけるバイオマーカの存在又はレベルを、予後が不良であった患者又は予後が不良であろうことが知られている患者、あるいは、予後が不良ではなかった患者又は予後が不良ではないと信じられている患者におけるバイオマーカの発現レベルと比較をし、予測された患者の予後に適するとされる治療方法が提示されることを意味する。例えば、治療方法は、判定される予後との関係において予め決められていてもよい。高リスク患者に対する積極的な化学療法は回帰の危険性を低減させる可能性が指摘されている。本発明の方法は、予後良好である患者と予後不良の患者と区別し、積極的な治療戦略を必要とし、予後良好と判定された患者と比較して再発リスクが高い等の予後不良の患者を抽出する場合に有用である。一方で、予後不良の患者と比較して予後良好と判定された患者は、より緩和された治療戦略を選択する利益を被ることができる。
【００４７】
例えば、バイオマーカの発現と治療方法との関連付けは、上記方法に準じて、被験者におけるバイオマーカの存在又はレベルを、予後が不良であった患者又は予後が不良であろうことが知られている患者、あるいは、予後が不良ではなかった患者又は予後が不良ではないと信じられている患者におけるバイオマーカの発現レベルと比較をし、予後不良と判定された患者が強化化学療法又は放射線療法の対象患者であり、予後良好と判定された患者が強化化学療法又は放射線療法の対象患者ではないことを示すように行われてもよい。強化化学療法とは、化学療法剤（抗癌剤）の投与量、投与頻度、投与種類等を増大させることによる治療法のことである。強化化学療法又は放射線療法としては、例えば、術後に５−ＦＵとシスプラチンの併用（例えば、５−ＦＵ８００ｍｇ／ｍ２を１〜５日間持続点滴し、シスプラチン８０ｍｇ／ｍ２を３〜４週間あけて投与する併用療法）等による術後補助化学療法若しくは根治的化学放射線療法、又は、術前のシスプラチン投与若しくは化学放射線療法が挙げられる。その他、強化化学療法に用いられる薬剤としては、オキサリプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン等のプラチナ製剤；タキソール（登録商標）等のタキサン系抗がん剤；ゲフィチニブ（gefitinib）、エルロチニブ（erlotinib）等のチロシンキナーゼ阻害剤；セツキシマブ（cetuximab）、マツズマブ（matuzumab）、パニツムマブ（panitumumab）等の抗ＥＧＦＲ抗体等を挙げることができる。
【００４８】
本発明の食道癌の状態又は進行をモニターする方法における、測定されたトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと該患者の食道癌の状態又は進行との関連付けは、上記予後との関連付けに準じて行うことができる。本発明の食道癌の状態又は進行をモニターする方法においては、バイオマーカのレベルを利用して、患者が死亡、再発又は転移する可能性の変化を判定することができる。特に、継時的にバイオマーカを測定することにより、患者の予後予測の変化を知ることができる。このようなモニターは、定期的に行われることが好ましく、例えば、１週間に１回、２週間に１回、月１回、２月に１回、３月に１回、６月に１回、１年に１回、２年に１回、３年に１回、５年に１回、又は、１０年に１回行うことができ、患者の経過の良否に応じて適宜設定することができる。
【００４９】
一の態様において、本発明のキットは、トランスグルタミナーゼ３と特異的に結合する抗体若しくはその断片、又は、トランスグルタミナーゼ３ｍＲＮＡ又はその一部と特異的に結合する核酸を含む。例えば、本発明のキットは、ＥＬＩＳＡ（Catty, Raykundalia, 1989）又はイムノクロマト用のキットであってもよい。別の態様において、本発明のキットは、トランスグルタミナーゼ３遺伝子又はｍＲＮＡの一部と特異的に結合するプライマーを含む。例えば、本発明のキットは、ＲＴ−ＰＣＲ用のキットであってもよい。本発明のキットに包含されるトランスグルタミナーゼ３と特異的に結合する抗体若しくはその断片、又は、トランスグルタミナーゼ３ｍＲＮＡ又はその一部と特異的に結合する核酸は、上述の方法により得ることができる。
【００５０】
一の態様において、本明細書に記載の予測キットは、インベーダー（登録商標）法に適したキットとすることができる。たとえば、本発明の予測キットは、トランスグルタミナーゼ３遺伝子の一部と相補的な配列及び消光プローブの一部と相補的な配列（フラップ）、トランスグルタミナーゼ３遺伝子の一部と相補的な配列を備えるインベーダープローブ、三重鎖特異的ＤＮＡ分解酵素、及び、消光プローブを備える蛍光標識ユニバーサルプローブを備えることができる。上記フラップは、各アレル特異的プローブ間で異なっていることが好ましい。上記蛍光標識は、当業者周知のプローブを適宜選択することができ、各蛍光標識ユニバーサルプローブ間で異なっていることが好ましい。例えば、蛍光標識として、ＦＡＭ及びＶＩＣを使用することができる。
【実施例】
【００５１】
以下、本発明をより詳細に説明するため実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。
【００５２】
１．患者及び臨床情報
臨床状態のバックグラウンドを標準化するため、患者群としては、病理学的にＴ３Ｎ０−１Ｍ０の腫瘍があり、術前又は術後の化学療法又は放射線療法を受けておらず、新たに胸部食道扁平上皮癌と診断され、手術後少なくとも５年間経過観察された患者を対象とした。腫瘍細胞及びそれに隣接した正常粘膜細胞は、国立がんセンターにおいて１９９８年から２００２年の間に切除された５００症例のうち８０症例から収集した。１０ｍｍ３以下の量の２又は３の組織断片が各症例から得られた。対応する正常粘膜組織も同様にして得られた。切除組織は、液体窒素中でスナップ冷凍（snap frozen）後、測定に使用するまで−８０℃で保管した。なお、本研究に関しては、国立がんセンターの倫理委員会により承認されており、患者から書面でのインフォームドコンセントが得られている。６３例においてリンパ節転移が認められた（７８％）。リンパ節転移数と予後との関係を表１に示す。また、リンパ節転移の数に対する生存曲線を図１に示す。これらの結果から、リンパ節転移と患者の予後との間に相関があることが確認された。
【００５３】
【表１】
【００５４】
２．２Ｄ−ＤＩＧＥによるタンパク発現プロファイリング
最初に、非常に異なる生存期間を示す２群の患者間について、２Ｄ−ＤＩＧＥでタンパク質発現プロファイルを比較することにより、術後の予後に関連するタンパク質スポットを同定した。このうち一群は、５年間疾患の兆候は見られなかった３７人の患者からなる予後良好群であり、他の一群は、２年以内に当該疾患が原因で死亡した２８人の患者からなる予後不良群である。
【００５５】
【表２】
【００５６】
２−１．レーザーマイクロダイセクション及びタンパク質抽出
レーザーマイクロダイセクションを使用して非腫瘍細胞を除去し、腫瘍細胞群のみを集めて後のプロテオーム解析に使用した（Ｋｏｎｄｏ Ｔ， Ｈｉｒｏｈａｓｈｉ Ｓ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅｓ （ＣｙＤｙｅ ＤＩＧＥ Ｆｌｕｏｒ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｄｙｅｓ） ｔｏ ｌａｓｅｒ ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ （２Ｄ−ＤＩＧＥ） ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２００６；１：２９４０−５６）。即ち、本方法は以下の工程により行った。冷凍サンプルは、ＯＣＴコンパウンド（サクラファインテックジャパン株式会社）に包理し、クライオスタット（ライカ ＣＭ３０５０Ｓ、ライカマイクロシステムズ株式会社）を用いて８μｍ切片を作製し、ヘマトキシリン及びエオジン染色をして病理学的診断を行った。厚み８μｍの隣接部切片を、組織粘着液（０．１％ポリ−Ｌ−リジン、シグマアルドリッチ社）で前処理を施した薄いポリエチレン膜上に乗せた。組織断片は必ずマイヤーヘマトキシリン（Mayer Hematoxylin）で染色した。全ての染色工程は氷上で行った。マイヤーヘマトキシリン染色断片をレーザーマイクロダイセクションに使用した（ライカ レーザー マイクロダイセクション バージョン ３．１．０．０、ライカマイクロシステムズ株式会社）。腫瘍細胞の非壊死組織からの回収は、サンプル中への浸潤した炎症性細胞、間質細胞及び血管成分のコンタミネーションを避けながら、パルス紫外線レーザービームを使用して行った。比較的形態学的に正常な食道上皮検体であって、癌組織から少なくとも５ｃｍ離れた位置に存在するものを、５８人中５３人の患者から採取した。エオジン染色は２Ｄ−ＤＩＧＥの妨げとなるため、ヘマトキシリン及びエオジンで染色した断片は診断を確認するために使用し、残りの断片はプロテオミクス解析用にヘマトキシリンのみで染色した。マイクロダイセクション中にヘマトキシリン染色組織から回収された１ｍｍ２の顕微切断領域に相当するタンパク質を、各２Ｄ−ＤＩＧＥゲルに使用した。
【００５７】
２−２．２Ｄ−ＰＡＧＥ蛍光ラベルタンパク質サンプルの調整及びイメージの取得
顕微切断組織はすぐに尿素溶解バッファ（６Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、３％ＣＨＡＰＳ、及び、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で処理した。２Ｄ−ＤＩＧＥゲル当たり、顕微切断組織の範囲として１ｍｍ２を使用した。タンパク質のラベル化は以前報告した方法に準じて行った（Ｋｏｎｄｏ Ｔ， Ｈｉｒｏｈａｓｈｉ Ｓ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅｓ （ＣｙＤｙｅ ＤＩＧＥ Ｆｌｕｏｒ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｄｙｅｓ） ｔｏ ｌａｓｅｒ ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ （２Ｄ−ＤＩＧＥ） ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２００６；１：２９４０−５６）。即ち、本方法は以下の工程により行った。３ｍｍ２の顕微切断組織を５０ｍＬの４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）尿素溶解バッファ中で培養した。その後、タンパク質検体は、８ｎｍｏｌ トリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ；シグマアルドリッチ社）中３７℃で６０分間処理することにより還元し、１２ｎｍｏｌ Ｃｙ５（ＣｙＤｙｅ ＤＩＧＥ Ｆｌｕｏｒ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｄｙｅ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて３７℃で３０分間処理することにより蛍光ラベルを施した。ラベル化反応は、ＤＴＴ及びＰｈａｒｍａｌｙｔｅ（ｐＨ４−７、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）含有尿素溶解バッファを、それぞれ最終濃度が６５ｍＭ及び２．０％となるように添加して終了させた。内部標準検体として全ての個々のタンパク質検体を混合し、Ｃｙ３蛍光染色（ＣｙＤｙｅ ＤＩＧＥ Ｆｌｕｏｒ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｄｙｅ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）でラベルした。ラベル化反応終了後、１ｍｍ２のレーザー顕微切断領域に該当する個々のＣｙ５ラベル化検体を等量のＣｙ３ラベル化内部標準検体と混合し、３５ｍＭ ＤＴＴ及び１．０％Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）含有尿素溶解バッファを検体当たりの終量が４２０ｍＬとなるよう添加した。
【００５８】
蛍光標識２次元ディファレンス電気泳動（２ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：２Ｄ−ＤＩＧＥ）は、当業者周知の方法により行った。一次元目の分離は、２４ｃｍ長、ｐＩレンジ４〜７の固定化ｐＨ勾配ポリアクリルアミドゲル（ＩＰＧ（immobilized pH gradient） Ｄｒｙ Ｓｔｒｉｐ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて行った。二次元目の分離は、３８ｃｍ長のラージフォーマットゲル（株式会社バイオクラフト）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて行った。ゲルは、レーザースキャナ（Tyhoon Trio、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いて適切な波長でスキャンした。二次元電気泳動解析ソフトウェア（Progenesis PG240、ノンリニアダイナミックス（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｌｔｄ.））を用いて、全てのスポットについて、Ｃｙ５のイメージ強度を、同一ゲル内のＣｙ３のイメージ強度により正規化し、ゲル間の相違を補正した。システムの再現性は、同一サンプルについて個別に２回行った分離から得られたタンパク質プロファイルを比較することにより検証した。
【００５９】
処理前のデータ分析として、各実験で得られた強度データそのもののｌｏｇ２変換し、Ｚスコアに変換して強度データ分布を標準化した。標準化したデータについて、ユークリッド距離とＵＰＧＭＡ法により階層的クラスタ分析を行い、プロテオームの全体的な特徴を確認した。２群間において異なる発現を示すスポットを同定するため、各スポットについてＺ−テストを行った。得られたｐ値リストは、複数のテストによりある程度の擬陽性を含んでいた。そこで、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ， Ｙ．， ａｎｄ Ｈｏｃｈｂｅｒｇ， Ｙ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ. Ｓｅｒｉｅｓ Ｂ （Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ），Ｖｏｌ．５７， Ｎｏ．１ （１９９５）， ２８９−３００）を用いて、偽の発見率（ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ：ＦＤＲ）を評価し、その結果、ＦＤＲが０．０５未満のスポットを選択した。正常組織と腫瘍との比較においては、上記ＦＤＲ基準の他、群平均の発現比が少なくとも４倍以上であるスポットを選択した。
【００６０】
２Ｄ−ＤＩＧＥにより、１検体当たり３６２３タンパク質スポットの発現プロファイルが得られた。タンパク質発現の全体的な類似性に基づき検体を腫瘍組織と正常上皮組織の２群に分けた。腫瘍と正常組織間では多数の違いが見られた。組織間で明らかに顕著な差（ＦＤＲ＜０．００１及び差が４倍より大きいもの）を示した２００のタンパク質スポットのうち、３３スポットが腫瘍組織において発現上昇が明らかであり、他の１６７スポットは発現減少が明らかであった。これらの２００タンパク質スポットについて、マススペクトルによる分析により同定した。
【００６１】
２−３．質量分析法によるタンパク質の同定
ゲル内消化及び質量分析によるタンパク質の同定は、発明者らの以前の報告に従って行った（Ｋｏｎｄｏ Ｔ， Ｈｉｒｏｈａｓｈｉ Ｓ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅｓ （ＣｙＤｙｅ ＤＩＧＥ Ｆｌｕｏｒ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｄｙｅｓ） ｔｏ ｌａｓｅｒ ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ （２Ｄ−ＤＩＧＥ） ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２００６；１：２９４０−５６）。即ち、本方法は以下の工程により行った。標的タンパク質スポットは、自動スポット回収装置（ＰｒｏＨｕｎｔｅｒ、アズワン株式会社）を使用して９６穴ＰＣＲプレートに回収した。ゲルプラグは、メタノール、炭酸アンモニウム及びアセトノトリル三回洗浄し、乾燥後、ＴＰＣＫ処理トリプシンで一晩処理を行った。ゲルをアセトニトリルで処理することにより、ゲルからペプチドを抽出した。ゲル内消化により得られたトリプシンペプチドを、ナノスケールマイクロキャピラリＲＰ ＬＣ−ＥＳＩ ＭＳ／ＭＳによる解析にかけた。マイクロフローＨＰＬＣ用のパラダイムＭＳ４ ＨＰＬＣデュアルソルベントデリバリーシステム（Ｍｉｃｈｒｏｍ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ社）、ＨＴＳ ＰＡＬ オートサンプラ（ＣＴＣ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ社）、及び、ナノ−ＥＳＩ（ＮＳＩ）ソース（エーエムアール株式会社）搭載フィニガンＬＴＱリニアＩＴマススペクトロメータ（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ社）を用いて、タンパク質の同定を行った（Ｋｏｎｄｏ Ｔ， Ｈｉｒｏｈａｓｈｉ Ｓ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅｓ （ＣｙＤｙｅ ＤＩＧＥ Ｆｌｕｏｒ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｄｙｅｓ） ｔｏ ｌａｓｅｒ ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ （２Ｄ−ＤＩＧＥ） ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２００６；１：２９４０−５６）。消化されたペプチド混合物は、マイクロキャピラリＲＰ Ｍａｇｉｃ Ｃ１８カラム（３ｍｍ、２００Ａ、５０６０．２ｍｍ ｉ．ｄ．；Ｍｉｃｈｒｏｍ）上で分離した。ペプチドは、１０から８０％の直線勾配のバッファＢ（１０％水（ｖ／ｖ）及び０．１％ギ酸（ｖ／ｖ）含有アセトニトリル）を含有するバッファＡ（２％アセトニトリル（ｖ／ｖ）及び０．１％ギ酸（ｖ／ｖ）含有水）で１０分間溶出した。
【００６２】
ＨＰＬＣからの溶出物は、ＮＳＩ針を通じて１．０〜１．２ｍＬ／分の速度でマススペクトロメータに入れた（ＦｏｒｔｉｓＴｉｐ、有限会社オムニセパロ適塾）。１．８ｋＶの電圧でキャピラリは２００℃に加熱した。シース（ｓｈｅａｔｈ）及び補助ガス（ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｇａｓ）は使用しなかった。マススペクトロメータは、データ依存的収集モードに設定し、Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウェア（バージョン２．０、ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ）の自動制御下でｍ／ｚ４５０−１８００のマスレンジの収集が自動的にＭＳ／ＭＳ収集に切り替わるようにした。全ＭＳスキャンの結果は、サーベイスキャンで最も豊富に検出された３つのイオンについて活性化振幅パラメータを３５％にセットし、分離幅ｍ／Ｚ２．０としたＭＳ／ＭＳ試験により得られた。データは、３０秒の排除期間及び排除マス幅が−１．０及び＋２．０Ｄａであるダイナミックマス排除枠により取得した。
【００６３】
得られたデータは、装置と共に提供されているＥｘｔｒａｃｔＭＳソフトウェア ヴァージョン２．１１（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ社）を用いて、ペプチドマスレンジを４５０から６００Ｄａ、ＭＳ／ＭＳ最小ピークを２５としてｄｔａフォーマット（ピークリストファイル）に変換し、ＭＡＳＣＯＴ（登録商標）サーチを行った。ＭＡＳＣＯＴ（登録商標）（バージョン２．１、マトリックスサイエンス社）サーチは、スイスプロット（Ｓｐｒｏｔ＿４７．８ ｆａｓｔａ ファイル、１２８６７配列）及びＮＣＢＩ（ＮＣＢＩｎｒ＿２００５０４２２ ｆａｓｔａ ファイル、１３１４４７配列）の重複のないタンパク質配列データベース中の配列のうちホモサピエンスサブセットに対して行った。以下のサーチパラメータを全てのＭＡＳＣＯＴ（登録商標）サーチに使用した：２つのトリプシン分解物の欠落を許容範囲とし、メチオニン残基の可変修飾（酸化、＋１６Ｄａ）、並びに、ＭＳデータにおける±２．０Ｄａ及びＭＳ／ＭＳデータにおける±１．０Ｄａを最大誤差許容範囲とした。特徴的な配列を有する２以上の顕著に適合したペプチドを含むタンパク質（ｐ＜０．０５、本実験におけるサーチパラメータ下において、ＭＡＳＣＯＴイオンスコアがスイスプロットデータベースに対して３４以上及びＮＣＢＩデータベースに対して４２以上と同等である）について統計的に検討し、タンパク質同定の信頼性を評価した。加えて、同定されたペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルを手動で調べた。
【００６４】
腫瘍検体において、予後良好及び予後不良群は、当該検体の全体的なタンパク質発現像に基づいてそれぞれのグループに分類されることはなかった。また、これらの２群間において顕著に異なる強度を示すスポットは見出されなかった。そこで、患者のリンパ節転移による階層化を行った。重要な臨床予後予測因子であるリンパ節転移数に従い、リンパ節転移が無いか１つのみである全ての２５人の患者を予後良好群とした。これらの患者は臨床情報のみに基づいてその予後を予測することができるため、２個以上のリンパ節転移を有する患者に分析対象を限定した。予後良好群の患者３４人中、９人がリンパ節転移を２個以上有し、予後不良群の２４人は全員がリンパ節転移を２個以上有していた。リンパ節転移と予後との関係は、上記表１に記載のとおりである。２個以上のリンパ節転移を有する合計３３人の患者について、予後良好群と予後不良群とのスポットの比較を行ったところ、２２のタンパク質スポットが、異なる予後を示す二群間で顕著に異なる強度を示すことを見出した（ＦＤＲ＜０．０５)。２２スポットの位置を図２に示す。
【００６５】
マススペクトルによるタンパク質同定により、２２個のタンパク質スポットが１８個の互いに異なる遺伝子産物に関連することが見出された。１８個の同定されたタンパク質のうち、トランスグルタミナーゼ３（ＴＧＭ３）スポットが、２２タンパクスポットリストの中で３回現れ、予後不良群において発現低下していることが明らかとなった。
【００６６】
２−４．パスウェイ分析
タンパク質発現パターンのパスウェイ解析は、メタコア（ＭｅｔａＣｏｒｅ）ソフトウェア分析ツール（ＧｅｎｅＧｏ，Ｉｎｃ社）を使用して行った。メタコア（ＭｅｔａＣｏｒｅ）は、プロテオームデータセットを使用し、既知の分子間相互作用、機能、及び、疾病との相互関係を含む手入力で管理されたデータベースに基づいてネットワークを同定する。パスウェイは、インプットリストと同じ大きさのランダムセットのタンパク質が特定のマッピングを偶然生じる可能性により同定した。
【００６７】
メタコアを用いたパスウェイ解析において１８個中１７個の蛋白質がパスウェイ解析図に組み込まれた。それによるとＳＴＡＴ１、ｐ５３、ＨＮＦ４がパスウェイ上重要な蛋白のようであった。ＴＧＭ３はＳＴＡＴ１、ｐ５３の下流に位置するＳｐ１という重要な転写因子により直接、調節されていた。このことから、ＴＧＭ３は生命現象に重要な遺伝子産物であると考えられる。パスウェイ分析の結果を図３に示す。
【００６８】
３．免疫組織化学染色及び組織アレイ
２Ｄ−ＤＩＧＥの結果を評価するため、中間の予後を示した１５人の患者について免疫組織化学的染色を行った。Ｄａｋｏ ＲＥＡＬ ＥｎＶｉｓｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＤＡＫＯ社）を使用して、製造者の指示文書に従い、メタノール固定パラフィン埋め込み組織断片について、トランスグルタミナーゼ３の免疫組織化学染色を行った。抗原性を回復させるため、断片は脱パラフィン化し、脱水した後、３ｍＬ/Ｌ Ｈ２Ｏ２含有メタノールにより３０分間処理することで、内在性パーオキシダーゼ活性を除去しブロックした。断片は１０ｍＭクエン酸塩バッファ（ｐＨ６．０）中、１２１℃で、１０分間オートクレーブした。第一抗体としては、ラビットポリクローナル、モノ−スペシフィック抗トランスグルタミナーゼ３抗体（ＨＰＡ００４７２８、Ａｔｌａｓ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社）を１：１００希釈で使用した。染色は、臨床データで用いられる盲検の方法で、２人の別々の観察者が観察した。トランスグルタミナーゼ３の染色は、腫瘍細胞細胞質及び細胞核の一部並びに正常食道上皮において観察された。内部標準として使用した正常食道上皮は染色陽性であった。１０％以上の腫瘍細胞が抗トランスグルタミナーゼ３抗体による染色が陽性である症例はトランスグルタミナーゼ３陽性とし、トランスグルタミナーゼ陽性腫瘍細胞が１０％以下である症例をトランスグルタミナーゼ３陰性とした。腫瘍が組織学的に異なるグレードからなるばあいには、染色評価は主要な区分領域について行った。組織アレイは５９の正常組織及び３２３の腫瘍組織を含んでいた。
【００６９】
４．統計学的分析
食道癌患者７６症例について、階層的クラスタ手法を、Expressionist software（ジーンデータ（Genedata））を用いて行った。
統計的計算は、Stat View Version 5.0 statistical package（ＳＡＳインスティチュート（SAS Institute Inc,））を用いて行った。生存期間は、診断時から最後の追跡調査時（又は死亡時）と定義した。生存率は、カプラン−マイヤー法（Kaplan-Meier methodology）により評価した。生存と他の変数との関係は、カテゴリ変数のログランク検定、及び、コックスの比例ハザード分析に基づく連続型変数のスコア検定により調べた。多変量モデルは、コックス回帰を用いて一変量レベルにおいて顕著な変数と適合させた。生存曲線の変化に基づき、予後変数のカットオフ値を定めた。
【００７０】
カプラン−マイヤー法により作成したトランスグルタミナーゼ３に関する生存曲線を図４に示す。トランスグルタミナーゼ３の発現の有無が統計学的に有意な数値（Ｐ＝０．００３３）を示した。
【００７１】
以上の結果から、本研究により得られた、トランスグルタミナーゼ３は、食道癌診断時における予後予測バイオマーカとして有用であり、食道癌診断時の生検組織中のこれらのバイオマーカの発現の有無又は発現量を測定することにより、食道癌患者の予後を予測し、的確な治療法を選択することができると考えられる。食道癌では、診断目的で必ず生検を行うため、本検査に使用する生検材料は患者に新たな負担をかけることなく採取できる。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明の食道癌診断時における予後予測因子（トランスグルタミナーゼ３）は、食道癌患者の予後を予測し、的確な治療法を選択するマーカとして有用である。このようなバイオマーカ（又は臨床検査）はかつて存在しなかったことから、本発明により多くの食道癌患者が恩恵を受けることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】リンパ節転移の数に対する食道癌の生存曲線を示す。縦軸は生存率を表し、横軸は術後の経過期間を表す。
【図２】予後良好食道癌及び予後不良食道癌におけるスポットの比較を示す。縦軸は、分子量を表し、横軸は等電点を表す。図中印をつけたものは、異なる予後を示す二群間で顕著に異なる強度を示すスポットを表す。
【図３】パスウェイ解析の結果を示す図である。
【図４】トランスグルタミナーゼ発現量に対する食道癌の生存曲線を示す。縦軸は生存率を表し、横軸は術後の経過期間を表す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食道癌患者の予後を予測に関する遺伝子医学の分野、特に腫瘍遺伝子発現情報に基づく予後予測方法に関する。より詳細には、本発明は、標的とされるタンパク質レベル又はｍＲＮＡレベルの異常を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食道癌は、世界において８番目に多い癌であり、癌による死亡原因の６番目の癌である（非特許文献１及び２参照）。近年の放射線療法及び化学療法を組み合わせた外科的技術発達にも関わらず、特に筋層への浸潤やリンパ節転移を起こした進行癌においては早期再発が珍しくなく、５年生存率は未だに約４０％未満である（非特許文献３〜５参照）。臨床においては、食道癌患者へのアジュバント及びネオアジュバント化学療法が生存期間を改善しているとの報告もある（非特許文献６参照）。しかし、これらの臨床試験の対象となった患者の多くは深刻な副作用を経験しており、また、治療薬が癌細胞に対してほとんど効果がないか又は全く効果がない例も見受けられる。これまで、全ての食道癌患者についてこのような治療法を適用した場合には、手術のみで完治することが可能な患者まで不要で有害な併用療法を受けなければならないという問題があった。
【０００３】
手術や化学−放射線療法等の治療法に対する患者の反応は、例えそれらの患者が同じ臨床ステージであったとしても、幅広く異なるものであり、既存の診断方法では予測することが不可能であった。食道癌患者の効果的な治療管理において障害となっていることの一つには、疾病の経過を予測することに限界があることが挙げられる。例えば、従来、医師は、より積極的な外科的治療及び／又は放射線照射及び化学療法等の治療効果により利益を得ることができる患者を選択することができなかった。よって、リスクの階層化は、治療による死亡の可能性を回避し、又は、疾患の更なる進行を阻止するため、決定的に重要な事項と考えられている。
【０００４】
複数の遺伝子及びタンパク質の置換が食道癌と関与することが報告されている（非特許文献７）。これらの置換は、バイオマーカと考えることができ、癌を診断し、進行状況を把握し、疾患の進行や治療への反応を監視することに利用できる可能性がある。しかしながら、それらのうち多くは感度が低く、又は、偽陽性率が高いという問題があった。また、これらのバイオマーカは癌の主として癌の存在の指標となることを目的として研究されたものであり、癌の将来、即ち予後について予測させるものではない。従って、治療戦略を最適化し、臨床結果を改善するための新規な癌の予測方法が求められていた。
【０００５】
トランスグルタミナーゼ３は、タンパク質のポリアミンを結合することによりタンパク質の架橋結合を形成する酵素であり、表皮や毛包の細胞外皮の後期に働くことが知られている。食道癌との関係においては、トランスグルタミナーゼ３のｍＲＮＡレベルが食道癌組織において減少しているとの報告がある（非特許文献８）。また、トランスグルタミナーゼ３のタンパク質レベルの発現と食道癌との関係についても報告がある（非特許文献９）。しかし、本報告においては、癌の予後の指標となり得るリンパ節転移とトランスグルタミナーゼ３の発現には相関がないことが示されており、トランスグルタミナーゼ３は食道癌の存在の指標とはなるものの、予後予測のための指標とはならないと考えられていた。なお、上記文献の引用は、上記記載がいずれも関連する先行技術であると認めることを意図するものではない。これらの文献の日付に関する記述及び内容に関する表現は、出願人が入手可能な情報に基づいたものであり、これらの文献の日付又は内容の正確さについて承認するものではなく、また、これらの文献に記載されたいかなる理論又は仮説によっても制限されることを意図するものではない。
【非特許文献１】Parkin DM, Pisani P, Ferlay J. Estimates ofthe worldwide incidence of 25 major cancers in 1990. Int J Cancer1999;80:827-41.
【非特許文献２】Pisani P, Parkin DM, Bray F, Ferlay J.Estimates of the worldwide mortality from 25 cancers in 1990. Int J Cancer1999;83:18-29.
【非特許文献３】Ilson DH. Oesophageal cancer: newdevelopments in systemic therapy. Cancer Treat Rev 2003;29:525-32.
【非特許文献４】Enzinger PC, Mayer RJ. Esophageal cancer. N Engl J Med2003;349:2241-52.
【非特許文献５】Mariette C, Balon JM, Piessen G, Fabre S,Van Seuningen I, Triboulet JP. Pattern of recurrence following completeresection of esophageal carcinoma and factors predictive of recurrent disease.Cancer 2003;97:1616-23.
【非特許文献６】Shinoda M, Hatooka S, Mori S, Mitsudomi T.Clinical aspects of multimodality therapy for resectable locoregionalesophageal cancer. Ann Thorac Cardiovasc Surg 2006;12:234-41.
【非特許文献７】Vallbohmer D, Lenz HJ. Predictive andprognostic molecular markers in outcome of esophageal cancer. Dis Esophagus2006;19:425-32.
【非特許文献８】Chen et al., Int. J. Cancer: 88, 862-865 (2000)
【非特許文献９】World journal of Gastroenterology: 12 (24) 3929-3932
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、食道癌の予後を予測する方法（又は予後を予測するための情報を提供する方法）、食道癌患者の治療方法を選択するための情報を提供する方法、又は、食道癌治療薬のスクリーニング方法、並びに、当該方法に使用するキットを提供し、患者にとってより利益のある治療戦略を選択するための情報及び新薬開発に有用な情報を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
広範囲にわたるｍＲＮＡ発現の研究は、アレイを基礎とした方法を用いて、食道癌の発癌及び進行に関係ある遺伝子クラスタを同定している。しかし、新規治療戦略のために実際に利用可能なバイオマーカや、分子標的となる遺伝子は未だに見出されていない。このことから、この方法によるバイオマーカの探索に限界があるとも考えられている。細胞に含まれるタンパク質は遺伝子の機能的な翻訳物であり、癌細胞の悪性表現型を直接支配している。しかし、ＤＮＡ配列及びＲＮＡ量の測定に関する研究においては、癌の進行において発生するリン酸化、糖鎖付加又はタンパク質分解から生じる翻訳後の異常を予測することはできなかった。
【０００８】
本発明者らは、多数の臨床検体について、高感度の蛍光色素を用いて二次元電気泳動を行い、その結果を基に、プロテオミクス情報及び臨床病理情報を統合した結果、トランスグルタミナーゼ３が食道癌の予後と相関が強いことを見出した。
【０００９】
本発明の方法は、身体試料（特に、生体生検）中のバイオマーカの少なくとも１つの発現を検出することを含み、ここでバイオマーカの発現又は発現量は食道癌の予後を示すものである。本発明のバイオマーカの未発現又は発現減少は、食道癌の予後不良を示す。よって、本発明の方法は、食道癌患者を予後良好な患者と予後不良な患者に振り分けることができる。また、本発明の方法は、食道癌患者から予後良好な患者を選択することが可能であることから、予後良好な患者の不要な治療方法の適用による不利益を避けることができる。同時に、本発明の方法は、食道癌患者から予後不良な患者を選択することが可能であることから、予後不良な患者に必要な治療方法を適用することにより、治療しないことによる疾病の進行を回避することができる。更に、本発明のバイオマーカは、食道癌治療薬（特に、予後の改善を目的とした治療薬）の効果の指標として使用することができる。従って、本発明のバイオマーカは、食道癌治療薬のスクリーニングに使用することができる。また、本発明のバイオマーカは、食道癌患者の病状や進行（特には、転移、悪性化等の予後に関わる病状や進行）をモニターするために使用することができる。
【００１０】
本発明は、食道癌の予後を予測するためのバイオマーカに関する。ある態様において、本発明は、食道癌患者の予後を予測する方法（又は予後を予測するための情報を提供する方法）であって：
（ａ）該患者由来の試料中のトランスグルタミナーゼ３の発現を検出すること；及び、
（ｂ）測定されたトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと該患者の予後との関連付けをすることを含む方法に関する。好ましくは、前記測定されたトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと食道癌の予後との関連付けをすることにおいてトランスグルタミナーゼ３の未発現若しくは発現低下が該患者の予後不良を示す。
【００１１】
具体的な態様において、本発明は、食道癌患者の予後を予測するための方法又は予後を予測するための情報を提供する方法であって、以下の工程：
（ａ）該患者由来の試料を調整する工程；
（ｂ）少なくとも１つの抗体若しくはその断片又は核酸に該試料を接触させる工程、ここで、該抗体若しくはその断片はトランスグルタミナーゼ３タンパク質に特異的に結合する抗体若しくはその断片であり、該核酸はトランスグルタミナーゼ３ｍＲＮＡに特異的に結合する核酸である；
（ｃ）トランスグルタミナーゼ３タンパク質又はｍＲＮＡへの該抗体若しくはその断片又は該核酸の結合を検出してトランスグルタミナーゼ３タンパク質又はｍＲＮＡの発現レベルを測定する工程；及び、
（ｄ）トランスグルタミナーゼ３タンパク質又はｍＲＮＡの発現レベルから食道癌患者の予後を予測する工程、ここで、トランスグルタミナーゼ３タンパク質の未発現若しくは発現低下が食道癌患者の予後不良を示す、を含む方法に関する。
また、例えば、本発明の食道癌患者の予後を予測するための方法又は予後を予測するための情報を提供する方法は、食道癌患者であってリンパ節転移が存在する（好ましくは２個以上のリンパ節転移が存在する）患者を対象として行うことができる。
【００１２】
別の態様において、本発明は、食道癌患者の治療方法を選択するための情報を提供する方法であって、
（ａ）該患者由来の試料中のトランスグルタミナーゼ３の発現を検出すること；及び、
（ｂ）測定されたトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと該患者の治療方法との関連付けを含む方法に関する。好ましくは、測定されたトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと該患者の治療方法との関連付けにおいて、トランスグルタミナーゼ３の未発現若しくは発現低下は、該患者が強化化学療法又は放射線療法の対象患者であることを示す。
また、例えば、本発明の食道癌患者の治療方法を選択するための情報を提供する方法は、食道癌患者であってリンパ節転移が存在する（好ましくは２個以上のリンパ節転移が存在する）患者を対象として行うことができる。
【００１３】
更に別の態様において、本発明は、食道癌の状態又は進行をモニターする方法又は食道癌の状態又は進行をモニターするための情報を提供する方法に関する。例えば、本発明は、食道癌の状態又は進行をモニターする方法又は食道癌の状態又は進行をモニターするための情報を提供する方法であって、
（ａ）患者由来の試料中のトランスグルタミナーゼ３の発現を検出すること；及び、
（ｂ）測定されたトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと該患者の食道癌の状態又は進行との関連付けを含む方法に関する。好ましくは、測定されたトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと該患者の食道癌の状態又は進行との関連付けにおいて、トランスグルタミナーゼ３の未発現若しくは発現低下は、該患者の食道癌の状態が不良であること、進行していることを示し、及び／又は、トランスグルタミナーゼ３の発現若しくは発現上昇は、該患者の食道癌の状態が良好であること、進行していないことを示す。
また、例えば、本発明の食道癌の状態又は進行をモニターする方法又は食道癌の状態又は進行をモニターするための情報を提供する方法は、食道癌患者であってリンパ節転移が存在する（好ましくは２個以上のリンパ節転移が存在する）患者を対象として行うことができる。
【００１４】
また、別の態様において、本発明は、食道癌治療薬のスクリーニング方法に関する。例えば、本発明は、食道癌治療薬のスクリーニング方法であって、以下（ｉ）から（ｉｉｉ）から選択される１の方法：
（ｉ）以下の工程：
（ａ）食道癌細胞を調整する工程；
（ｂ）被験薬を当該食道癌細胞に接触させる工程；
（ｂ）トランスグルタミナーゼ３のｍＲＮＡ量又はタンパク質量を測定する工程；
（ｃ）トランスグルタミナーゼ３の測定値からトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを計算する工程；
（ｄ）被験薬を接触させた食道癌細胞と接触させなかった食道癌細胞におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを比較する工程；及び、
（ｅ）被験薬を接触させなかった食道癌細胞におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと比較して、被験薬を接触させた食道癌細胞におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルが上昇した場合に当該被験薬が食道癌の予後改善効果があると判定する工程、
を含む方法；
（ｉｉ）以下の工程：
（ａ）食道癌モデル細胞を調整する工程；
（ｂ）被験薬を当該モデル動物に投与する工程；
（ｃ）当該モデル動物におけるトランスグルタミナーゼ３のｍＲＮＡ量又はタンパク質量を測定する工程；
（ｄ）トランスグルタミナーゼ３の測定値からトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを計算する工程；
（ｅ）被験薬を投与した食道癌モデル動物と投与しなかった食道癌モデル動物におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを比較する工程；及び、
（ｆ）被験薬を投与しなかった食道癌モデル動物におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと比較して、被験薬を投与した食道癌モデル動物におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルが上昇した場合に当該被験薬が食道癌の予後改善効果があると判定する工程；
を含む方法；あるいは、
（ｉｉｉ）以下の工程：
（ａ）被験薬を食道癌患者に投与する工程；
（ｂ）当該食道癌患者におけるトランスグルタミナーゼ３のｍＲＮＡ量又はタンパク質量を測定する工程；
（ｃ）トランスグルタミナーゼ３の測定値からトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを計算する工程；
（ｄ）被験薬を投与した食道癌患者と投与しなかった食道癌患者におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを比較する工程；及び、
（ｅ）被験薬を投与しなかった食道癌患者におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと比較して、被験薬を投与した食道癌患者におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルが上昇した場合に当該被験薬が食道癌の予後改善効果があると判定する工程；
を含む方法、に関する。
【００１５】
また別の態様において、本発明は、食道癌患者の予後を予測し、食道癌患者の治療方法を選択するための情報を提供し、食道癌の状態又は進行をモニターし、及び／又は、食道癌治療薬をスクリーニングするためのバイオマーカに関する。具体的には、本発明のバイオマーカはトランスグルタミナーゼ３である。
【００１６】
また、本発明は、以下（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択されるいずれか１つを備えるキット：
（ｉ）トランスグルタミナーゼ３タンパク質と特異的に結合する抗体又はその断片；
（ｉｉ）トランスグルタミナーゼ３遺伝子の一部と特異的に結合するプライマー及びトランスグルタミナーゼ３遺伝子と相補的な核酸；又は
（ｉｉｉ）トランスグルタミナーゼ３遺伝子の一部と相補的な配列及び消光プローブの一部と相補的な配列を有するフラップ、トランスグルタミナーゼ３遺伝子の一部と相補的な配列を備えるインベーダープローブ、三重鎖特異的ＤＮＡ分解酵素、及び、消光プローブを備える蛍光標識ユニバーサルプローブ、に関する。また別の態様において、本発明は、食道癌患者の予後を予測し（若しくは予後を予測するための情報を提供し）、食道癌患者の治療方法を選択するための情報を提供し、食道癌の状態又は進行をモニターし、又は、食道癌治療薬をスクリーニングするためのキットであって、以下（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択されるいずれか１つを備えるキット：
（ｉ）トランスグルタミナーゼ３タンパク質と特異的に結合する抗体又はその断片；
（ｉｉ）トランスグルタミナーゼ３遺伝子の一部と特異的に結合するプライマー及びトランスグルタミナーゼ３遺伝子と相補的な核酸；又は
（ｉｉｉ）トランスグルタミナーゼ３遺伝子の一部と相補的な配列及び消光プローブの一部と相補的な配列を有するフラップ、トランスグルタミナーゼ３遺伝子の一部と相補的な配列を備えるインベーダープローブ、三重鎖特異的ＤＮＡ分解酵素、及び、消光プローブを備える蛍光標識ユニバーサルプローブ、に関する。
【００１７】
上記記載の本発明の予後を予測するための方法若しくは予後を予測するための情報を提供する方法、食道癌患者の治療方法を選択するための情報を提供する方法、食道癌の状態又は進行をモニターする方法若しくは食道癌の状態又は進行をモニターするための情報を提供する方法、又は、食道癌治療薬のスクリーニング方法は、適宜既知の方法と組み合わせて用いることができる。例えば、リンパ節転移は患者の予後に関する重要な指標であることが知られていることから、リンパ節転移を検出する工程又はリンパ節転移に関する情報を入手する工程を本発明の方法に加えることにより、リンパ節転移と本発明のバイオマーカの検出を組み合わせて用いることができる。具体的には、リンパ節転移の検出又はリンパ節転移に関する情報により、リンパ節転移が存在しない又は少ない（１個）予後良好であることが明らかである患者群を除いた患者群について本発明のバイオマーカを検出することにより、リンパ節転移のみでは予後の良否が予測できない患者群について予後を予測に関連する情報を得ることができる。また、本発明の予後予測方法は、対象をリンパ節転移が存在する（好ましくは、リンパ節転移が２個以上存在する）患者とすることもできる。
【００１８】
本明細書において、「食道癌」は、食道に存在する癌であれば特に限定されず、食道の粘膜上皮細胞が癌化した扁平上皮癌及び食道腺が癌化した腺癌を包含する。
【００１９】
本明細書において、「予後」とは、食道癌が外科的治療等による腫瘍増殖の抑制、軽減後に辿る経過又は結末（例えば、転移の有無、生死等）を意味する。本明細書において、予後とは、例えば、外科的治療等による腫瘍増殖の抑制、軽減後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５又は２０年あるいはそれ以上の時点における生死であってもよい。予後は、トランスグルタミナーゼ３（予後指標）を調べることにより予測される。予後の予測は、トランスグルタミナーゼ３の存在／不存在又は上昇／減少により患者の予後が良好又は不良であるか否か又はその確率を判定することにより行うことができる。本明細書において、「予後の判定」及び「予後の評価」の文言は、予後の予測と同意義語として用いられる。
【００２０】
本明細書において「予後良好」とは、患者の外科的治療等による腫瘍増殖の抑制、軽減後の容態が長期間（例えば、３、５、６、７、８、９、１０、１５又は２０年間あるいはそれ以上）致命的とならないことを意味し、生存、非転移、非回帰、又は、非再発を意味していてもよい。例えば、予後良好とは、少なくとも３年、特には少なくとも５年の間に（好ましくは、転移又は再発を伴うことなく）生存することを意味してもよい。また、予後良好の状態として、最も好ましい状態は長期の無疾患の生存であるが、本発明において、予後良好とは、転移等何らかの疾患が確認されていてもその悪性度が低く、生存可能な状態を含むこともできる。
【００２１】
本明細書において「予後不良」とは、患者の外科的治療等による腫瘍増殖の抑制、軽減後の容態が短期間（例えば、１、２、３、４、５年間あるいはそれ以下）致命的となることを意味し、死亡、転移、回帰、又は、再発を意味していてもよい。例えば、予後不良とは、少なくとも３年、特には少なくとも５年の間に再発、転移又は死亡することを意味してもよい。
【００２２】
トランスグルタミナーゼ３(Transglutaminase 3)は、ＴＧａｓｅＥ、又は、ＴＧＥとしても知られるタンパク質であり、表皮分化の最終段階において、インヴォルクリン、ロリクリン、及び、スモールパラクリンリッチタンパク質等の構造タンパク質をクロスリンクすることにより、皮膚のケラチノサイトにおける角化膜形成に関与していることが知られている。全長のトランスグルタミナーゼ３タンパク質（前駆体）は、６９３アミノ酸からなるタンパク質である（スイスプロット アクセッション Ｎｏ．Ｑ０８１８８）。配列番号１は、トランスグルタミナーゼ３の遺伝子配列を示し、配列番号２は、トランスグルタミナーゼ３のアミノ酸配列を示す。
【発明の効果】
【００２３】
本発明のバイオマーカは、これまで的確に予後を予測できなかった食道癌の予後予測バイオマーカとして有用である。即ち、本発明の方法により、食道癌の予後を判定するための情報を得ることができる。特に、本発明のバイオマーカは、これまで予後予測因子として報告されていた食道癌の壁深達度や肉眼的所見と比較して、非常に優れた予後予測因子である。本発明の予後予測因子は、食道癌患者の治療方針選択のための情報を提供することができ、それにより、多くの食道癌患者が恩恵を受けることが期待されるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明のバイオマーカは、食道癌患者の予後の指標となることから、食道癌の予後予測方法、食道癌患者の治療方法を選択するための情報を提供する方法、及び、食道癌の状態又は進行をモニターする方法に使用することができる。
【００２５】
本発明の食道癌患者の予後を予測するための情報を提供する方法は、以下の工程：
（ａ）該患者由来の試料中のトランスグルタミナーゼ３の発現の検出をすること；及び、
（ｂ）測定されたトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと該患者の予後との関連付けをすること、ここで、トランスグルタミナーゼ３の未発現若しくは発現減少が前記食道癌患者の予後不良を示す、により行うことができる。
【００２６】
より具体的には、本発明の食道癌患者の予後を予測するための情報を提供する方法は、以下の工程：
（ａ）該患者由来の試料を調整する工程；
（ｂ）少なくとも１つの抗体若しくはその断片又は核酸に該試料を接触させる工程、ここで、該抗体若しくはその断片はトランスグルタミナーゼ３タンパク質に特異的に結合する抗体若しくはその断片であり、該核酸はトランスグルタミナーゼ３ｍＲＮＡに特異的に結合する核酸である；
（ｃ）トランスグルタミナーゼ３タンパク質又はｍＲＮＡへの該抗体若しくはその断片又は該核酸の結合を検出してトランスグルタミナーゼ３タンパク質又はｍＲＮＡの発現レベルを測定する工程；及び、
（ｄ）トランスグルタミナーゼ３タンパク質又はｍＲＮＡの発現レベルから食道癌患者の予後を予測する工程、ここで、トランスグルタミナーゼ３タンパク質の未発現若しくは発現低下が食道癌患者の予後不良を示す、により行うことができる。
【００２７】
食道癌患者の治療方法を選択するための情報を提供する方法は、以下の工程：
（ａ）該患者由来の試料中のトランスグルタミナーゼ３の発現の検出をすること；及び、
（ｂ）測定されたトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと該患者の治療方法との関連付けをすることこと、ここで、トランスグルタミナーゼ３の未発現若しくは発現低下が、該患者が強化化学療法の対象患者であることを示す、により行うことができる。
【００２８】
更に、本発明の食道癌の状態又は進行をモニターする方法は、以下の工程：
（ａ）患者由来の試料中のトランスグルタミナーゼ３の発現を検出すること；及び、
（ｂ）測定されたトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと該患者の食道癌の状態又は進行との関連付けをすること、ここで、トランスグルタミナーゼ３の未発現若しくは発現低下は、該患者の食道癌の状態が不良であること、進行していることを示し、及び／又は、トランスグルタミナーゼ３の発現若しくは発現上昇は、該患者の食道癌の状態が良好であること、進行していないことを示す、により行うことができる。
【００２９】
また、本発明のバイオマーカは、患者の予後の指標となることから、食道癌治療薬のスクリーニングにおいて、患者の予後の改善の指標として用いることができる。例えば、食道癌細胞に被験薬を添加し、食道癌モデル動物に被験薬を投与し、又は、食道癌患者に被験薬を投与し、一定時間後の本発明のバイオマーカの発現量を測定することにより、当該治療薬が食道癌の予後を改善するものであるか否かを判定することができる。より具体的には、添加又は投与により、トランスグルタミナーゼ３が発現若しくは発現上昇する被験薬を、食道癌の予後を改善する治療薬として選別することができる。よって、本発明は食道癌治療薬（又は予後改善薬）のスクリーニング方法を提供するものである。
【００３０】
本発明の食道癌治療薬のスクリーニングは、例えば以下の工程：
（ａ）食道癌細胞を調整する工程；
（ｂ）被験薬を当該食道癌細胞に接触させる工程；
（ｂ）トランスグルタミナーゼ３のｍＲＮＡ量又はタンパク質量を測定する工程；
（ｃ）トランスグルタミナーゼ３の測定値からトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを計算する工程；
（ｄ）被験薬を接触させた食道癌細胞と接触させなかった食道癌細胞におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを比較する工程；及び、
（ｅ）被験薬を接触させなかった食道癌細胞におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと比較して、被験薬を接触させた食道癌細胞におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルが上昇した場合に当該被験薬が食道癌の予後改善効果があると判定する工程；
により行うことができる。
【００３１】
本発明の食道癌治療薬のスクリーニングは、例えば以下の工程：
（ａ）食道癌モデル細胞を調整する工程；
（ｂ）被験薬を当該モデル動物に投与する工程；
（ｂ）当該モデル動物におけるトランスグルタミナーゼ３のｍＲＮＡ量又はタンパク質量を測定する工程；
（ｃ）トランスグルタミナーゼ３の測定値からトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを計算する工程；
（ｄ）被験薬を投与した食道癌モデル動物と投与しなかった食道癌モデル動物におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを比較する工程；及び、
（ｅ）被験薬を接触させなかった食道癌細胞におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと比較して、被験薬を接触させた食道癌細胞におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルが上昇した場合に当該被験薬が食道癌の予後改善効果があると判定する工程；
により行うことができる。
【００３２】
本発明の食道癌治療薬のスクリーニングは、例えば以下の工程：
（ａ）被験薬を食道癌患者に投与する工程；
（ｂ）当該食道癌患者におけるトランスグルタミナーゼ３のｍＲＮＡ量又はタンパク質量を測定する工程；
（ｃ）トランスグルタミナーゼ３の測定値からトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを計算する工程；
（ｄ）被験薬を投与した食道癌患者と投与しなかった食道癌患者におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを比較する工程；及び、
（ｅ）被験薬を投与しなかった食道癌患者におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと比較して、被験薬を投与した食道癌患者におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルが上昇した場合に当該被験薬が食道癌の予後改善効果があると判定する工程により行うことができる。
【００３３】
本発明の方法において使用する患者由来の試料としては、バイオマーカの発現を検出することができる試料であれば特に限定されず、例えば、組織（特には食道癌組織）、細胞、体液（例えば、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、漿液、髄液、関節液、眼房水、涙液、唾液等）を使用することができる。また、本発明の方法において使用する患者由来の試料は、測定試験に先立ち前処理されたものであってもよいし、患者から採取した試料をそのまま使用してもよい。
【００３４】
本発明のバイオマーカの発現は、タンパク質又は核酸のレベルで検査することができる。タンパク質レベルで検査する場合には、バイオマーカに特異的に結合する物質を利用して検出することができ、例えば、抗体又はその断片を用いて、免疫学的に検査する方法（例えば、ＥＬＩＳＡ（Catty, Raykundalia, 1989）、ラジオイムノアッセイ（Catty,
Murphy, 1989）、免疫組織化学染色、ウエスタンブロット、免疫沈降、免疫蛍光、フローサイトメトリー）が含まれる。また、核酸レベルで検査する場合には、ハイブリダイゼーション及び核酸増幅等の手法（例えば、ＡＲＭＳ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）法、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ＰＣＲ）法、Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法、ドット・ブロット・ハイブリダイゼーション法、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、Ｉｎ ｓｉｔｕ ＲＴ−ＰＣＲ法、ＰＣＲ−ＳＳＯ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）法、ＰＣＲ−ＳＳＰ法、ＡＭＰＦＬＰ（Ａｍｐｌｉｆｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、ＭＶＲ−ＰＣＲ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、インベーダー（登録商標）法）が含まれる。発現の測定は、発現の有無、検出の可否、発現量又は発現濃度の大小、過剰発現の有無、発現減少の有無等を測定すること包含する。
【００３５】
トランスグルタミナーゼ３をタンパク質レベルで検査する場合、トランスグルタミナーゼ３を認識する抗体又はその断片と試料中のトランスグルタミナーゼ３との結合を測定することにより行うができる。このような方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ（Catty, Raykundalia, 1989）、ラジオイムノアッセイ（Catty,
Murphy, 1989）、免疫組織化学染色、ウエスタンブロット、免疫沈降、免疫蛍光、フローサイトメトリー等を挙げることができる。本発明の診断薬の検体としては、例えば、生検として被験者から採取した組織試料または液体を使用することができる。使用される生検は、本発明の免疫学的測定の対象となるものであれば特に限定はなく、例えば、組織、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、漿液、髄液、関節液、眼房水、涙液、唾液またはそれらの分画物若しくは処理物を挙げることができ、好ましくは食道癌組織又は血液（血漿又は血清を含む）である。本発明の診断キットによる分析は、定性的、定量的または半定量的に行うことができる。
【００３６】
本発明の方法において使用する本発明のバイオマーカと特異的に結合する抗体又はその断片は、本発明のバイオマーカと結合する限りその構造、大きさ、イムノグロブリンクラス、由来等を問わない。また、本発明の方法で使用する抗体又はその断片は、モノクローナルであってもよいし、ポリクローナルであってもよい。抗体の断片とは、抗体の一部分（部分断片）又は抗体の一部分を含むペプチドであって、抗体の抗原への結合作用を保持するもののことである。このような抗体の断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）若しくはこれらの重合体、二量体化Ｖ領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、又は、ＣＤＲを含むペプチドを挙げることができる。ここで、ＣＤＲとは、Ｋａｂａｔら（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”,Ｋａｂａｔ,Ｅ.ら, Ｕ.Ｓ. Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ, １９８３）又はＣｈｏｔｈｉａら（Ｃｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ, Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.,１９６,９０１−９１７,１９８７）の定義によるものである。また、本発明は、本発明のキットが包含する抗体又はその断片のアミノ酸配列をコードする単離された核酸、当該核酸を包含するベクター、当該ベクターを保有する細胞も包含する。
【００３７】
抗体は、当業者によく知られた方法により得ることができる。例えば、トランスグルタミナーゼ３の全部若しくはその一部を有するポリペプチド、又は、それらをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ哺乳動物細胞用発現ベクター等を調製しこれを抗原とする。この抗原を用て動物を免疫後、免疫した動物から得られた免疫細胞と、ミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを得、当該ハイブリドーマの培養物から抗体を採取する。最後に採取した抗体を、抗原に用いた本発明のバイオマーカやその一部に一致するポリペプチドを利用した抗原特異精製を行うことにより本発明のバイオマーカのモノクローナル抗体を得ることができる。また、ポリクローナル抗体を作成する場合、上記と同様の抗原を動物を免疫し、免疫した動物から血液を採取し、この血液から血清を分離し、この血清に対して上記抗原を利用した抗原特異精製を行うことにより得ることができる。得られた抗体を酵素処理又は得られた抗体の配列情報を利用することにより、抗体の断片を得ることができる。
【００３８】
抗体又はその断片への標識の結合は当分野において一般的な方法により行うことができる。例えば、タンパク質又はペプチドを蛍光標識する場合、タンパク質又はペプチドをリン酸緩衝液で洗浄した後、ＤＭＳＯ、緩衝液等で調整した色素を加え、混合した後室温で１０分間静置することにより結合させることができる。また、市販の標識キットとして、ビオチン標識キット（Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、アルカリフォスファターゼ標識用キット（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、ペルオキシダーゼ標識キット（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｒｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｒｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２：株式会社同仁化学研究所）、フィコビリプロテイン標識キット（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ、Ｂ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｂ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ、Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、蛍光標識キット（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ５５５ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ６４７ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２：株式会社同仁化学研究所）、ＤｙＬｉｇｈｔ５４７、ＤｙＬｉｇｈｔ６４７（テクノケミカル株式会社）、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）抗体標識キット、Ｑｄｏｔ（登録商標）抗体標識キット（インビトロゲン社）、ＥＺ−Ｌａｂｅｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（フナコシ株式会社）等を用いて標識することもできる。また、標識した抗体又はその断片の検出は、適宜標識に適した機器を使用することにより行うことができる。
【００３９】
トランスグルタミナーゼ３をｍＲＮＡレベルで検査する場合、適宜設計したプライマーを用いて、ＰＣＲを利用した公知の方法に基づくことができる。このような方法としては、例えば、ＡＲＭＳ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）法、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ＰＣＲ）法、Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法を挙げることができる。また、増幅された核酸は、当該核酸と相補的な核酸を使用して、ドット・ブロット・ハイブリダイゼーション法、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、Ｉｎ ｓｉｔｕ ＲＴ−ＰＣＲ法、ＰＣＲ−ＳＳＯ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）法、ＰＣＲ−ＳＳＰ法、ＡＭＰＦＬＰ（Ａｍｐｌｉｆｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、ＭＶＲ−ＰＣＲ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法により検出することができる。本発明の方法による分析は、定性的、定量的または半定量的に行うことができる。
【００４０】
例えば、本発明の方法は、以下の工程：
（ａ）患者由来の試料を調整する工程；
（ｂ）トランスグルタミナーゼ３遺伝子を増幅させる工程：
（ｃ）核酸の増幅量を検出し、トランスグルタミナーゼ３遺伝子の発現レベルを測定する工程；並びに、
（ｄ）トランスグルタミナーゼ３遺伝子の発現レベルから前記食道癌患者の予後を予測する工程、ここで、トランスグルタミナーゼ３の未発現若しくは発現減少が前記食道癌患者の予後不良を示す、により行うことができる。
【００４１】
本発明の方法で使用する核酸は、化学合成により、又は、所望の核酸を含む遺伝子を生体材料から調整し、所望の核酸を増幅するよう設計したプライマーを用いて増幅することにより得ることができる。また、本発明の方法に使用するプライマーは、本明細書の開示及び公知の情報を基に、当業者周知の方法により適宜設計し、化学合成により得ることができる。
【００４２】
更に、別の態様において、トランスグルタミナーゼ３をｍＲＮＡレベルで検査する場合、例えば、インベーダー（登録商標）法として知られる方法（例えば、Kwiatkowski, R. W. et al.: "Clinical, genetic, and
pharmacogenetic applications of the Invader assay." Mol. Diagn., 4:
353-364, 1999参照）を用いて行うことができる。
例えば、本方法は、以下の工程：
（ａ）患者由来の試料を調整する工程；
（ｂ）以下の（ｉ）及び（ｉｉ）に記載の核酸に該試料を接触させて、アレルプローブと相補的なＤＮＡに三重鎖を形成させる工程：
（ｉ）トランスグルタミナーゼ３遺伝子の一部と相補的な配列及び消光プローブの一部と相補的な配列（フラップ）を備えるアレル特異的プローブ、
（ｉｉ）トランスグルタミナーゼ３遺伝子の一部と相補的な配列を備えるインベーダープローブ；
（ｃ）（ｂ）により得られた核酸試料に、三重鎖特異的ＤＮＡ分解酵素を接触させて三重鎖を形成した核酸からフラップを遊離させる工程；
（ｄ）遊離されたフラップを、それぞれ当該フラップと相補的な配列及び消光プローブを備える蛍光標識ユニバーサルプローブと接触させる工程；
（ｅ）（ｄ）により得られた核酸試料に、三重鎖特異的ＤＮＡ分解酵素を接触させて蛍光標識を遊離させ、蛍光を発色させる工程；並びに、
（ｆ）発色した蛍光を検出することにより、トランスグルタミナーゼ３遺伝子の発現レベルを測定する工程、
（ｇ）測定されたトランスグルタミナーゼ３遺伝子の発現レベルから前記食道癌患者の食道癌患者の予後を予測し（若しくは予後を予測するための情報を提供し）、食道癌患者の治療方法を選択するための情報を提供し、食道癌の状態又は進行をモニターし、又は、食道癌治療薬をスクリーニングする工程、ここで、トランスグルタミナーゼ３の未発現若しくは発現減少が前記食道癌患者の予後不良や状態の悪化又は癌の進行を示す、により行うことができる。
【００４３】
本明細書において、患者の予後を判定するために、測定されたバイオマーカの発現レベルと患者の予後と関係において用いられる「関連付けをする」という用語は、被験者におけるバイオマーカの存在又はレベルを、予後が不良であった患者又は予後が不良であろうことが知られている患者、あるいは、予後が不良ではなかった患者又は予後が不良ではないと信じられている患者におけるバイオマーカの発現レベルと比較することを意味する。または、関連付けは、被験者におけるバイオマーカの存在又はレベルを、食道癌を発症していない健常人におけるバイオマーカの発現レベルと比較することであってもよい。例えば、対象患者のバイオマーカのレベルが、予後が不良であった患者群又は予後が不良であろうことが知られている患者群及び予後が不良ではなかった患者群又は予後が不良ではないと信じられている患者群のバイオマーカのレベルと比較して、予後が不良であった患者群又は予後が不良であろうことが知られている患者群における当該バイオマーカのレベルに近いか又は当該レベル群より形成される当該バイオマーカのレベル値の範囲内に属する値である場合には、当該患者の予後は不良であると予測することができる。比較対象となる患者におけるバイオマーカのレベルは、例えば、本発明の開示により、又は、既に予後が判明している患者由来の試料におけるバイオマーカのレベルを測定することにより、あるいは、他の予後指標による評価と組み合わせて評価することにより知ることができる。本発明のバイオマーカのレベルを利用して、患者が死亡、再発又は転移する可能性を判定することができる。予後因子と予後との関連付けは、統計的分析により行うことができる。統計学的有意性は、２以上の集団を比較し、信頼区間及び／又はｐ値を決定することにより決定される（Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiely & Sons,
NewYord, 1983）。本発明の信頼区間は、例えば、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又は９９．９９％であってもよい。また、本発明のｐ値は、例えば、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００２又は０．０００１であってもよい。
【００４４】
例えば、本発明のバイオマーカは、その存在／不存在により患者の予後と関連付けることができる。また、別の例として、本発明のバイオマーカはその発現レベルの上昇／減少により、患者の予後と関連付けることができる。例えば、発現レベルの上昇／減少は、食道癌組織における発現量の上昇／減少を指標とすることができる。この場合、本発明のバイオマーカについて予後指標としての発現量の閾値レベルを設定し、患者由来の試料におけるバイオマーカのレベルは、閾値レベルと比較することにより関連付けてもよい。また、発現レベルの上昇／減少は、食道癌組織における発現領域の拡大／縮小を指標とすることもできる。例えば、本発明のバイオマーカについて予後指標としての発現領域の閾値レベルを設定し、患者由来の試料におけるバイオマーカのレベルは、閾値レベルと比較することにより関連付けてもよい。このような閾値レベルは、例えば、感度が、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は、９８％以上となるように設定することができる。また、閾値レベルは、特異度が、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は、９８％以上となるように設定することができる。例えば、発現レベルの上昇／減少について、食道癌組織における発現領域の拡大／縮小を指標とした場合、本発明のバイオマーカの閾値レベルは、１％〜３０％（好ましくは、５％〜１５％）の間で設定することができ、例えば、約１０％である。前記において、「約」は、±１０％（好ましくは、±１％）を意味する。
【００４５】
予後の判定は、それにより患者の状態の経過又は転帰を予測する方法を意味し、状態の経過又は転帰を１００％の正確さで予測可能であることを意味するものではない。予後の判定は、ある経過又は転帰が起こる可能性が増大しているか否かを意味するものであり、当該経過又は転帰が起こらない場合を基準として起こりやすいことを意味するものではない。即ち、予後の判定結果は、本発明のバイオマーカのレベルが減少している患者において、そのような特徴を示さない患者に比較して、ある特定の経過又は転帰がより生じやすいということを意味する。
【００４６】
食道癌は、手術、放射線療法、化学療法又はこれらの組み合わせによる治療戦略により管理される。本発明の方法及びキットを利用することにより、食道癌患者に適した治療戦略決定要因を提供することができる。本発明において、バイオマーカの発現と治療方法との「関連付けをする」とは、被験者におけるバイオマーカの存在又はレベルを、予後が不良であった患者又は予後が不良であろうことが知られている患者、あるいは、予後が不良ではなかった患者又は予後が不良ではないと信じられている患者におけるバイオマーカの発現レベルと比較をし、予測された患者の予後に適するとされる治療方法が提示されることを意味する。例えば、治療方法は、判定される予後との関係において予め決められていてもよい。高リスク患者に対する積極的な化学療法は回帰の危険性を低減させる可能性が指摘されている。本発明の方法は、予後良好である患者と予後不良の患者と区別し、積極的な治療戦略を必要とし、予後良好と判定された患者と比較して再発リスクが高い等の予後不良の患者を抽出する場合に有用である。一方で、予後不良の患者と比較して予後良好と判定された患者は、より緩和された治療戦略を選択する利益を被ることができる。
【００４７】
例えば、バイオマーカの発現と治療方法との関連付けは、上記方法に準じて、被験者におけるバイオマーカの存在又はレベルを、予後が不良であった患者又は予後が不良であろうことが知られている患者、あるいは、予後が不良ではなかった患者又は予後が不良ではないと信じられている患者におけるバイオマーカの発現レベルと比較をし、予後不良と判定された患者が強化化学療法又は放射線療法の対象患者であり、予後良好と判定された患者が強化化学療法又は放射線療法の対象患者ではないことを示すように行われてもよい。強化化学療法とは、化学療法剤（抗癌剤）の投与量、投与頻度、投与種類等を増大させることによる治療法のことである。強化化学療法又は放射線療法としては、例えば、術後に５−ＦＵとシスプラチンの併用（例えば、５−ＦＵ８００ｍｇ／ｍ２を１〜５日間持続点滴し、シスプラチン８０ｍｇ／ｍ２を３〜４週間あけて投与する併用療法）等による術後補助化学療法若しくは根治的化学放射線療法、又は、術前のシスプラチン投与若しくは化学放射線療法が挙げられる。その他、強化化学療法に用いられる薬剤としては、オキサリプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン等のプラチナ製剤；タキソール（登録商標）等のタキサン系抗がん剤；ゲフィチニブ（gefitinib）、エルロチニブ（erlotinib）等のチロシンキナーゼ阻害剤；セツキシマブ（cetuximab）、マツズマブ（matuzumab）、パニツムマブ（panitumumab）等の抗ＥＧＦＲ抗体等を挙げることができる。
【００４８】
本発明の食道癌の状態又は進行をモニターする方法における、測定されたトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと該患者の食道癌の状態又は進行との関連付けは、上記予後との関連付けに準じて行うことができる。本発明の食道癌の状態又は進行をモニターする方法においては、バイオマーカのレベルを利用して、患者が死亡、再発又は転移する可能性の変化を判定することができる。特に、継時的にバイオマーカを測定することにより、患者の予後予測の変化を知ることができる。このようなモニターは、定期的に行われることが好ましく、例えば、１週間に１回、２週間に１回、月１回、２月に１回、３月に１回、６月に１回、１年に１回、２年に１回、３年に１回、５年に１回、又は、１０年に１回行うことができ、患者の経過の良否に応じて適宜設定することができる。
【００４９】
一の態様において、本発明のキットは、トランスグルタミナーゼ３と特異的に結合する抗体若しくはその断片、又は、トランスグルタミナーゼ３ｍＲＮＡ又はその一部と特異的に結合する核酸を含む。例えば、本発明のキットは、ＥＬＩＳＡ（Catty, Raykundalia, 1989）又はイムノクロマト用のキットであってもよい。別の態様において、本発明のキットは、トランスグルタミナーゼ３遺伝子又はｍＲＮＡの一部と特異的に結合するプライマーを含む。例えば、本発明のキットは、ＲＴ−ＰＣＲ用のキットであってもよい。本発明のキットに包含されるトランスグルタミナーゼ３と特異的に結合する抗体若しくはその断片、又は、トランスグルタミナーゼ３ｍＲＮＡ又はその一部と特異的に結合する核酸は、上述の方法により得ることができる。
【００５０】
一の態様において、本明細書に記載の予測キットは、インベーダー（登録商標）法に適したキットとすることができる。たとえば、本発明の予測キットは、トランスグルタミナーゼ３遺伝子の一部と相補的な配列及び消光プローブの一部と相補的な配列（フラップ）、トランスグルタミナーゼ３遺伝子の一部と相補的な配列を備えるインベーダープローブ、三重鎖特異的ＤＮＡ分解酵素、及び、消光プローブを備える蛍光標識ユニバーサルプローブを備えることができる。上記フラップは、各アレル特異的プローブ間で異なっていることが好ましい。上記蛍光標識は、当業者周知のプローブを適宜選択することができ、各蛍光標識ユニバーサルプローブ間で異なっていることが好ましい。例えば、蛍光標識として、ＦＡＭ及びＶＩＣを使用することができる。
【実施例】
【００５１】
以下、本発明をより詳細に説明するため実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。
【００５２】
１．患者及び臨床情報
臨床状態のバックグラウンドを標準化するため、患者群としては、病理学的にＴ３Ｎ０−１Ｍ０の腫瘍があり、術前又は術後の化学療法又は放射線療法を受けておらず、新たに胸部食道扁平上皮癌と診断され、手術後少なくとも５年間経過観察された患者を対象とした。腫瘍細胞及びそれに隣接した正常粘膜細胞は、国立がんセンターにおいて１９９８年から２００２年の間に切除された５００症例のうち８０症例から収集した。１０ｍｍ３以下の量の２又は３の組織断片が各症例から得られた。対応する正常粘膜組織も同様にして得られた。切除組織は、液体窒素中でスナップ冷凍（snap frozen）後、測定に使用するまで−８０℃で保管した。なお、本研究に関しては、国立がんセンターの倫理委員会により承認されており、患者から書面でのインフォームドコンセントが得られている。６３例においてリンパ節転移が認められた（７８％）。リンパ節転移数と予後との関係を表１に示す。また、リンパ節転移の数に対する生存曲線を図１に示す。これらの結果から、リンパ節転移と患者の予後との間に相関があることが確認された。
【００５３】
【表１】
【００５４】
２．２Ｄ−ＤＩＧＥによるタンパク発現プロファイリング
最初に、非常に異なる生存期間を示す２群の患者間について、２Ｄ−ＤＩＧＥでタンパク質発現プロファイルを比較することにより、術後の予後に関連するタンパク質スポットを同定した。このうち一群は、５年間疾患の兆候は見られなかった３７人の患者からなる予後良好群であり、他の一群は、２年以内に当該疾患が原因で死亡した２８人の患者からなる予後不良群である。
【００５５】
【表２】
【００５６】
２−１．レーザーマイクロダイセクション及びタンパク質抽出
レーザーマイクロダイセクションを使用して非腫瘍細胞を除去し、腫瘍細胞群のみを集めて後のプロテオーム解析に使用した（Ｋｏｎｄｏ Ｔ， Ｈｉｒｏｈａｓｈｉ Ｓ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅｓ （ＣｙＤｙｅ ＤＩＧＥ Ｆｌｕｏｒ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｄｙｅｓ） ｔｏ ｌａｓｅｒ ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ （２Ｄ−ＤＩＧＥ） ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２００６；１：２９４０−５６）。即ち、本方法は以下の工程により行った。冷凍サンプルは、ＯＣＴコンパウンド（サクラファインテックジャパン株式会社）に包理し、クライオスタット（ライカ ＣＭ３０５０Ｓ、ライカマイクロシステムズ株式会社）を用いて８μｍ切片を作製し、ヘマトキシリン及びエオジン染色をして病理学的診断を行った。厚み８μｍの隣接部切片を、組織粘着液（０．１％ポリ−Ｌ−リジン、シグマアルドリッチ社）で前処理を施した薄いポリエチレン膜上に乗せた。組織断片は必ずマイヤーヘマトキシリン（Mayer Hematoxylin）で染色した。全ての染色工程は氷上で行った。マイヤーヘマトキシリン染色断片をレーザーマイクロダイセクションに使用した（ライカ レーザー マイクロダイセクション バージョン ３．１．０．０、ライカマイクロシステムズ株式会社）。腫瘍細胞の非壊死組織からの回収は、サンプル中への浸潤した炎症性細胞、間質細胞及び血管成分のコンタミネーションを避けながら、パルス紫外線レーザービームを使用して行った。比較的形態学的に正常な食道上皮検体であって、癌組織から少なくとも５ｃｍ離れた位置に存在するものを、５８人中５３人の患者から採取した。エオジン染色は２Ｄ−ＤＩＧＥの妨げとなるため、ヘマトキシリン及びエオジンで染色した断片は診断を確認するために使用し、残りの断片はプロテオミクス解析用にヘマトキシリンのみで染色した。マイクロダイセクション中にヘマトキシリン染色組織から回収された１ｍｍ２の顕微切断領域に相当するタンパク質を、各２Ｄ−ＤＩＧＥゲルに使用した。
【００５７】
２−２．２Ｄ−ＰＡＧＥ蛍光ラベルタンパク質サンプルの調整及びイメージの取得
顕微切断組織はすぐに尿素溶解バッファ（６Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、３％ＣＨＡＰＳ、及び、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で処理した。２Ｄ−ＤＩＧＥゲル当たり、顕微切断組織の範囲として１ｍｍ２を使用した。タンパク質のラベル化は以前報告した方法に準じて行った（Ｋｏｎｄｏ Ｔ， Ｈｉｒｏｈａｓｈｉ Ｓ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅｓ （ＣｙＤｙｅ ＤＩＧＥ Ｆｌｕｏｒ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｄｙｅｓ） ｔｏ ｌａｓｅｒ ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ （２Ｄ−ＤＩＧＥ） ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２００６；１：２９４０−５６）。即ち、本方法は以下の工程により行った。３ｍｍ２の顕微切断組織を５０ｍＬの４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）尿素溶解バッファ中で培養した。その後、タンパク質検体は、８ｎｍｏｌ トリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ；シグマアルドリッチ社）中３７℃で６０分間処理することにより還元し、１２ｎｍｏｌ Ｃｙ５（ＣｙＤｙｅ ＤＩＧＥ Ｆｌｕｏｒ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｄｙｅ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて３７℃で３０分間処理することにより蛍光ラベルを施した。ラベル化反応は、ＤＴＴ及びＰｈａｒｍａｌｙｔｅ（ｐＨ４−７、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）含有尿素溶解バッファを、それぞれ最終濃度が６５ｍＭ及び２．０％となるように添加して終了させた。内部標準検体として全ての個々のタンパク質検体を混合し、Ｃｙ３蛍光染色（ＣｙＤｙｅ ＤＩＧＥ Ｆｌｕｏｒ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｄｙｅ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）でラベルした。ラベル化反応終了後、１ｍｍ２のレーザー顕微切断領域に該当する個々のＣｙ５ラベル化検体を等量のＣｙ３ラベル化内部標準検体と混合し、３５ｍＭ ＤＴＴ及び１．０％Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）含有尿素溶解バッファを検体当たりの終量が４２０ｍＬとなるよう添加した。
【００５８】
蛍光標識２次元ディファレンス電気泳動（２ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：２Ｄ−ＤＩＧＥ）は、当業者周知の方法により行った。一次元目の分離は、２４ｃｍ長、ｐＩレンジ４〜７の固定化ｐＨ勾配ポリアクリルアミドゲル（ＩＰＧ（immobilized pH gradient） Ｄｒｙ Ｓｔｒｉｐ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて行った。二次元目の分離は、３８ｃｍ長のラージフォーマットゲル（株式会社バイオクラフト）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて行った。ゲルは、レーザースキャナ（Tyhoon Trio、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いて適切な波長でスキャンした。二次元電気泳動解析ソフトウェア（Progenesis PG240、ノンリニアダイナミックス（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｌｔｄ.））を用いて、全てのスポットについて、Ｃｙ５のイメージ強度を、同一ゲル内のＣｙ３のイメージ強度により正規化し、ゲル間の相違を補正した。システムの再現性は、同一サンプルについて個別に２回行った分離から得られたタンパク質プロファイルを比較することにより検証した。
【００５９】
処理前のデータ分析として、各実験で得られた強度データそのもののｌｏｇ２変換し、Ｚスコアに変換して強度データ分布を標準化した。標準化したデータについて、ユークリッド距離とＵＰＧＭＡ法により階層的クラスタ分析を行い、プロテオームの全体的な特徴を確認した。２群間において異なる発現を示すスポットを同定するため、各スポットについてＺ−テストを行った。得られたｐ値リストは、複数のテストによりある程度の擬陽性を含んでいた。そこで、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ， Ｙ．， ａｎｄ Ｈｏｃｈｂｅｒｇ， Ｙ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ. Ｓｅｒｉｅｓ Ｂ （Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ），Ｖｏｌ．５７， Ｎｏ．１ （１９９５）， ２８９−３００）を用いて、偽の発見率（ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ：ＦＤＲ）を評価し、その結果、ＦＤＲが０．０５未満のスポットを選択した。正常組織と腫瘍との比較においては、上記ＦＤＲ基準の他、群平均の発現比が少なくとも４倍以上であるスポットを選択した。
【００６０】
２Ｄ−ＤＩＧＥにより、１検体当たり３６２３タンパク質スポットの発現プロファイルが得られた。タンパク質発現の全体的な類似性に基づき検体を腫瘍組織と正常上皮組織の２群に分けた。腫瘍と正常組織間では多数の違いが見られた。組織間で明らかに顕著な差（ＦＤＲ＜０．００１及び差が４倍より大きいもの）を示した２００のタンパク質スポットのうち、３３スポットが腫瘍組織において発現上昇が明らかであり、他の１６７スポットは発現減少が明らかであった。これらの２００タンパク質スポットについて、マススペクトルによる分析により同定した。
【００６１】
２−３．質量分析法によるタンパク質の同定
ゲル内消化及び質量分析によるタンパク質の同定は、発明者らの以前の報告に従って行った（Ｋｏｎｄｏ Ｔ， Ｈｉｒｏｈａｓｈｉ Ｓ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅｓ （ＣｙＤｙｅ ＤＩＧＥ Ｆｌｕｏｒ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｄｙｅｓ） ｔｏ ｌａｓｅｒ ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ （２Ｄ−ＤＩＧＥ） ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２００６；１：２９４０−５６）。即ち、本方法は以下の工程により行った。標的タンパク質スポットは、自動スポット回収装置（ＰｒｏＨｕｎｔｅｒ、アズワン株式会社）を使用して９６穴ＰＣＲプレートに回収した。ゲルプラグは、メタノール、炭酸アンモニウム及びアセトノトリル三回洗浄し、乾燥後、ＴＰＣＫ処理トリプシンで一晩処理を行った。ゲルをアセトニトリルで処理することにより、ゲルからペプチドを抽出した。ゲル内消化により得られたトリプシンペプチドを、ナノスケールマイクロキャピラリＲＰ ＬＣ−ＥＳＩ ＭＳ／ＭＳによる解析にかけた。マイクロフローＨＰＬＣ用のパラダイムＭＳ４ ＨＰＬＣデュアルソルベントデリバリーシステム（Ｍｉｃｈｒｏｍ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ社）、ＨＴＳ ＰＡＬ オートサンプラ（ＣＴＣ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ社）、及び、ナノ−ＥＳＩ（ＮＳＩ）ソース（エーエムアール株式会社）搭載フィニガンＬＴＱリニアＩＴマススペクトロメータ（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ社）を用いて、タンパク質の同定を行った（Ｋｏｎｄｏ Ｔ， Ｈｉｒｏｈａｓｈｉ Ｓ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅｓ （ＣｙＤｙｅ ＤＩＧＥ Ｆｌｕｏｒ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｄｙｅｓ） ｔｏ ｌａｓｅｒ ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ （２Ｄ−ＤＩＧＥ） ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２００６；１：２９４０−５６）。消化されたペプチド混合物は、マイクロキャピラリＲＰ Ｍａｇｉｃ Ｃ１８カラム（３ｍｍ、２００Ａ、５０６０．２ｍｍ ｉ．ｄ．；Ｍｉｃｈｒｏｍ）上で分離した。ペプチドは、１０から８０％の直線勾配のバッファＢ（１０％水（ｖ／ｖ）及び０．１％ギ酸（ｖ／ｖ）含有アセトニトリル）を含有するバッファＡ（２％アセトニトリル（ｖ／ｖ）及び０．１％ギ酸（ｖ／ｖ）含有水）で１０分間溶出した。
【００６２】
ＨＰＬＣからの溶出物は、ＮＳＩ針を通じて１．０〜１．２ｍＬ／分の速度でマススペクトロメータに入れた（ＦｏｒｔｉｓＴｉｐ、有限会社オムニセパロ適塾）。１．８ｋＶの電圧でキャピラリは２００℃に加熱した。シース（ｓｈｅａｔｈ）及び補助ガス（ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｇａｓ）は使用しなかった。マススペクトロメータは、データ依存的収集モードに設定し、Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウェア（バージョン２．０、ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ）の自動制御下でｍ／ｚ４５０−１８００のマスレンジの収集が自動的にＭＳ／ＭＳ収集に切り替わるようにした。全ＭＳスキャンの結果は、サーベイスキャンで最も豊富に検出された３つのイオンについて活性化振幅パラメータを３５％にセットし、分離幅ｍ／Ｚ２．０としたＭＳ／ＭＳ試験により得られた。データは、３０秒の排除期間及び排除マス幅が−１．０及び＋２．０Ｄａであるダイナミックマス排除枠により取得した。
【００６３】
得られたデータは、装置と共に提供されているＥｘｔｒａｃｔＭＳソフトウェア ヴァージョン２．１１（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ社）を用いて、ペプチドマスレンジを４５０から６００Ｄａ、ＭＳ／ＭＳ最小ピークを２５としてｄｔａフォーマット（ピークリストファイル）に変換し、ＭＡＳＣＯＴ（登録商標）サーチを行った。ＭＡＳＣＯＴ（登録商標）（バージョン２．１、マトリックスサイエンス社）サーチは、スイスプロット（Ｓｐｒｏｔ＿４７．８ ｆａｓｔａ ファイル、１２８６７配列）及びＮＣＢＩ（ＮＣＢＩｎｒ＿２００５０４２２ ｆａｓｔａ ファイル、１３１４４７配列）の重複のないタンパク質配列データベース中の配列のうちホモサピエンスサブセットに対して行った。以下のサーチパラメータを全てのＭＡＳＣＯＴ（登録商標）サーチに使用した：２つのトリプシン分解物の欠落を許容範囲とし、メチオニン残基の可変修飾（酸化、＋１６Ｄａ）、並びに、ＭＳデータにおける±２．０Ｄａ及びＭＳ／ＭＳデータにおける±１．０Ｄａを最大誤差許容範囲とした。特徴的な配列を有する２以上の顕著に適合したペプチドを含むタンパク質（ｐ＜０．０５、本実験におけるサーチパラメータ下において、ＭＡＳＣＯＴイオンスコアがスイスプロットデータベースに対して３４以上及びＮＣＢＩデータベースに対して４２以上と同等である）について統計的に検討し、タンパク質同定の信頼性を評価した。加えて、同定されたペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルを手動で調べた。
【００６４】
腫瘍検体において、予後良好及び予後不良群は、当該検体の全体的なタンパク質発現像に基づいてそれぞれのグループに分類されることはなかった。また、これらの２群間において顕著に異なる強度を示すスポットは見出されなかった。そこで、患者のリンパ節転移による階層化を行った。重要な臨床予後予測因子であるリンパ節転移数に従い、リンパ節転移が無いか１つのみである全ての２５人の患者を予後良好群とした。これらの患者は臨床情報のみに基づいてその予後を予測することができるため、２個以上のリンパ節転移を有する患者に分析対象を限定した。予後良好群の患者３４人中、９人がリンパ節転移を２個以上有し、予後不良群の２４人は全員がリンパ節転移を２個以上有していた。リンパ節転移と予後との関係は、上記表１に記載のとおりである。２個以上のリンパ節転移を有する合計３３人の患者について、予後良好群と予後不良群とのスポットの比較を行ったところ、２２のタンパク質スポットが、異なる予後を示す二群間で顕著に異なる強度を示すことを見出した（ＦＤＲ＜０．０５)。２２スポットの位置を図２に示す。
【００６５】
マススペクトルによるタンパク質同定により、２２個のタンパク質スポットが１８個の互いに異なる遺伝子産物に関連することが見出された。１８個の同定されたタンパク質のうち、トランスグルタミナーゼ３（ＴＧＭ３）スポットが、２２タンパクスポットリストの中で３回現れ、予後不良群において発現低下していることが明らかとなった。
【００６６】
２−４．パスウェイ分析
タンパク質発現パターンのパスウェイ解析は、メタコア（ＭｅｔａＣｏｒｅ）ソフトウェア分析ツール（ＧｅｎｅＧｏ，Ｉｎｃ社）を使用して行った。メタコア（ＭｅｔａＣｏｒｅ）は、プロテオームデータセットを使用し、既知の分子間相互作用、機能、及び、疾病との相互関係を含む手入力で管理されたデータベースに基づいてネットワークを同定する。パスウェイは、インプットリストと同じ大きさのランダムセットのタンパク質が特定のマッピングを偶然生じる可能性により同定した。
【００６７】
メタコアを用いたパスウェイ解析において１８個中１７個の蛋白質がパスウェイ解析図に組み込まれた。それによるとＳＴＡＴ１、ｐ５３、ＨＮＦ４がパスウェイ上重要な蛋白のようであった。ＴＧＭ３はＳＴＡＴ１、ｐ５３の下流に位置するＳｐ１という重要な転写因子により直接、調節されていた。このことから、ＴＧＭ３は生命現象に重要な遺伝子産物であると考えられる。パスウェイ分析の結果を図３に示す。
【００６８】
３．免疫組織化学染色及び組織アレイ
２Ｄ−ＤＩＧＥの結果を評価するため、中間の予後を示した１５人の患者について免疫組織化学的染色を行った。Ｄａｋｏ ＲＥＡＬ ＥｎＶｉｓｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＤＡＫＯ社）を使用して、製造者の指示文書に従い、メタノール固定パラフィン埋め込み組織断片について、トランスグルタミナーゼ３の免疫組織化学染色を行った。抗原性を回復させるため、断片は脱パラフィン化し、脱水した後、３ｍＬ/Ｌ Ｈ２Ｏ２含有メタノールにより３０分間処理することで、内在性パーオキシダーゼ活性を除去しブロックした。断片は１０ｍＭクエン酸塩バッファ（ｐＨ６．０）中、１２１℃で、１０分間オートクレーブした。第一抗体としては、ラビットポリクローナル、モノ−スペシフィック抗トランスグルタミナーゼ３抗体（ＨＰＡ００４７２８、Ａｔｌａｓ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社）を１：１００希釈で使用した。染色は、臨床データで用いられる盲検の方法で、２人の別々の観察者が観察した。トランスグルタミナーゼ３の染色は、腫瘍細胞細胞質及び細胞核の一部並びに正常食道上皮において観察された。内部標準として使用した正常食道上皮は染色陽性であった。１０％以上の腫瘍細胞が抗トランスグルタミナーゼ３抗体による染色が陽性である症例はトランスグルタミナーゼ３陽性とし、トランスグルタミナーゼ陽性腫瘍細胞が１０％以下である症例をトランスグルタミナーゼ３陰性とした。腫瘍が組織学的に異なるグレードからなるばあいには、染色評価は主要な区分領域について行った。組織アレイは５９の正常組織及び３２３の腫瘍組織を含んでいた。
【００６９】
４．統計学的分析
食道癌患者７６症例について、階層的クラスタ手法を、Expressionist software（ジーンデータ（Genedata））を用いて行った。
統計的計算は、Stat View Version 5.0 statistical package（ＳＡＳインスティチュート（SAS Institute Inc,））を用いて行った。生存期間は、診断時から最後の追跡調査時（又は死亡時）と定義した。生存率は、カプラン−マイヤー法（Kaplan-Meier methodology）により評価した。生存と他の変数との関係は、カテゴリ変数のログランク検定、及び、コックスの比例ハザード分析に基づく連続型変数のスコア検定により調べた。多変量モデルは、コックス回帰を用いて一変量レベルにおいて顕著な変数と適合させた。生存曲線の変化に基づき、予後変数のカットオフ値を定めた。
【００７０】
カプラン−マイヤー法により作成したトランスグルタミナーゼ３に関する生存曲線を図４に示す。トランスグルタミナーゼ３の発現の有無が統計学的に有意な数値（Ｐ＝０．００３３）を示した。
【００７１】
以上の結果から、本研究により得られた、トランスグルタミナーゼ３は、食道癌診断時における予後予測バイオマーカとして有用であり、食道癌診断時の生検組織中のこれらのバイオマーカの発現の有無又は発現量を測定することにより、食道癌患者の予後を予測し、的確な治療法を選択することができると考えられる。食道癌では、診断目的で必ず生検を行うため、本検査に使用する生検材料は患者に新たな負担をかけることなく採取できる。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明の食道癌診断時における予後予測因子（トランスグルタミナーゼ３）は、食道癌患者の予後を予測し、的確な治療法を選択するマーカとして有用である。このようなバイオマーカ（又は臨床検査）はかつて存在しなかったことから、本発明により多くの食道癌患者が恩恵を受けることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】リンパ節転移の数に対する食道癌の生存曲線を示す。縦軸は生存率を表し、横軸は術後の経過期間を表す。
【図２】予後良好食道癌及び予後不良食道癌におけるスポットの比較を示す。縦軸は、分子量を表し、横軸は等電点を表す。図中印をつけたものは、異なる予後を示す二群間で顕著に異なる強度を示すスポットを表す。
【図３】パスウェイ解析の結果を示す図である。
【図４】トランスグルタミナーゼ発現量に対する食道癌の生存曲線を示す。縦軸は生存率を表し、横軸は術後の経過期間を表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
食道癌患者の予後を予測するための情報を提供する方法であって：
（ａ）該患者由来の試料中のトランスグルタミナーゼ３の発現の検出をすること；及び、
（ｂ）測定されたトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと該患者の予後との関連付けをすることを含む方法。
【請求項２】
測定されたトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと食道癌の予後との関連付けにおいて、トランスグルタミナーゼ３の未発現若しくは発現低下が該患者の予後不良を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
トランスグルタミナーゼ３の発現の検出が、免疫学的分析、核酸ハイブリダイゼーション、又は、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行うことを含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
患者由来の試料が、食道癌患者から採取された癌組織である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
食道癌患者の予後を予測するための情報を提供する方法であって、以下の工程：
（ａ）該患者由来の試料を調整する工程；
（ｂ）少なくとも１つの抗体若しくはその断片又は核酸に該試料を接触させる工程、ここで、該抗体若しくはその断片はトランスグルタミナーゼ３タンパク質に特異的に結合する抗体若しくはその断片であり、該核酸はトランスグルタミナーゼ３ｍＲＮＡに特異的に結合する核酸である；
（ｃ）トランスグルタミナーゼ３タンパク質又はｍＲＮＡへの該抗体若しくはその断片又は該核酸の結合を検出してトランスグルタミナーゼ３タンパク質又はｍＲＮＡの発現レベルを測定する工程；及び、
（ｄ）トランスグルタミナーゼ３タンパク質又はｍＲＮＡの発現レベルから食道癌患者の予後を予測する工程、ここで、トランスグルタミナーゼ３タンパク質の未発現若しくは発現低下が食道癌患者の予後不良を示す、を含む方法。
【請求項６】
食道癌患者の治療方法を選択するための情報を提供する方法であって、
（ａ）該患者由来の試料中のトランスグルタミナーゼ３の発現の検出をすること；及び、
（ｂ）測定されたトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと該患者の治療方法との関連付けをすることを含む方法。
【請求項７】
測定されたトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと該患者の治療方法との関連付けにおいて、トランスグルタミナーゼ３の未発現若しくは発現低下が、該患者が強化化学療法の対象患者であることを示す、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
食道癌の状態又は進行をモニターする方法であって、
（ａ）患者由来の試料中のトランスグルタミナーゼ３の発現を検出すること；及び、
（ｂ）測定されたトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと該患者の食道癌の状態又は進行との関連付けをすること、ここで、トランスグルタミナーゼ３の未発現若しくは発現低下は、該患者の食道癌の状態が不良であること、進行していることを示し、及び／又は、トランスグルタミナーゼ３の発現若しくは発現上昇は、該患者の食道癌の状態が良好であること、進行していないことを示す、を含む方法。
【請求項９】
食道癌治療薬のスクリーニング方法であって、以下（ｉ）から（ｉｉｉ）から選択される１の方法：
（ｉ）以下の工程：
（ａ）食道癌細胞を調整する工程；
（ｂ）被験薬を当該食道癌細胞に接触させる工程；
（ｂ）トランスグルタミナーゼ３のｍＲＮＡ量又はタンパク質量を測定する工程；
（ｃ）トランスグルタミナーゼ３の測定値からトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを計算する工程；
（ｄ）被験薬を接触させた食道癌細胞と接触させなかった食道癌細胞におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを比較する工程；及び、
（ｅ）被験薬を接触させなかった食道癌細胞におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと比較して、被験薬を接触させた食道癌細胞におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルが上昇した場合に当該被験薬が食道癌の予後改善効果があると判定する工程、
を含む方法；
（ｉｉ）以下の工程：
（ａ）食道癌モデル細胞を調整する工程；
（ｂ）被験薬を当該モデル動物に投与する工程；
（ｃ）当該モデル動物におけるトランスグルタミナーゼ３のｍＲＮＡ量又はタンパク質量を測定する工程；
（ｄ）トランスグルタミナーゼ３の測定値からトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを計算する工程；
（ｅ）被験薬を投与した食道癌モデル動物と投与しなかった食道癌モデル動物におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを比較する工程；及び、
（ｆ）被験薬を投与しなかった食道癌モデル動物におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと比較して、被験薬を投与した食道癌モデル動物におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルが上昇した場合に当該被験薬が食道癌の予後改善効果があると判定する工程；
を含む方法；あるいは、
（ｉｉｉ）以下の工程：
（ａ）被験薬を食道癌患者に投与する工程；
（ｂ）当該食道癌患者におけるトランスグルタミナーゼ３のｍＲＮＡ量又はタンパク質量を測定する工程；
（ｃ）トランスグルタミナーゼ３の測定値からトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを計算する工程；
（ｄ）被験薬を投与した食道癌患者と投与しなかった食道癌患者におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを比較する工程；及び、
（ｅ）被験薬を投与しなかった食道癌患者におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと比較して、被験薬を投与した食道癌患者におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルが上昇した場合に当該被験薬が食道癌の予後改善効果があると判定する工程；
を含む方法。
【請求項１０】
食道癌患者の予後を予測するためのキット、食道癌患者の治療方法を選択するための情報を提供するためのキット、又は、食道癌治療薬のスクリーニング用キットであって、以下（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択されるいずれか１つを備えるキット：
（ｉ）トランスグルタミナーゼ３タンパク質と特異的に結合する抗体又はその断片；
（ｉｉ）トランスグルタミナーゼ３遺伝子の一部と特異的に結合するプライマー及びトランスグルタミナーゼ３遺伝子と相補的な核酸；又は
（ｉｉｉ）トランスグルタミナーゼ３遺伝子の一部と相補的な配列及び消光プローブの一部と相補的な配列を有するフラップ、トランスグルタミナーゼ３遺伝子の一部と相補的な配列を備えるインベーダープローブ、三重鎖特異的ＤＮＡ分解酵素、及び、消光プローブを備える蛍光標識ユニバーサルプローブ。
【請求項１】
食道癌患者の予後を予測するための情報を提供する方法であって：
（ａ）該患者由来の試料中のトランスグルタミナーゼ３の発現の検出をすること；及び、
（ｂ）測定されたトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと該患者の予後との関連付けをすることを含む方法。
【請求項２】
測定されたトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと食道癌の予後との関連付けにおいて、トランスグルタミナーゼ３の未発現若しくは発現低下が該患者の予後不良を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
トランスグルタミナーゼ３の発現の検出が、免疫学的分析、核酸ハイブリダイゼーション、又は、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行うことを含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
患者由来の試料が、食道癌患者から採取された癌組織である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
食道癌患者の予後を予測するための情報を提供する方法であって、以下の工程：
（ａ）該患者由来の試料を調整する工程；
（ｂ）少なくとも１つの抗体若しくはその断片又は核酸に該試料を接触させる工程、ここで、該抗体若しくはその断片はトランスグルタミナーゼ３タンパク質に特異的に結合する抗体若しくはその断片であり、該核酸はトランスグルタミナーゼ３ｍＲＮＡに特異的に結合する核酸である；
（ｃ）トランスグルタミナーゼ３タンパク質又はｍＲＮＡへの該抗体若しくはその断片又は該核酸の結合を検出してトランスグルタミナーゼ３タンパク質又はｍＲＮＡの発現レベルを測定する工程；及び、
（ｄ）トランスグルタミナーゼ３タンパク質又はｍＲＮＡの発現レベルから食道癌患者の予後を予測する工程、ここで、トランスグルタミナーゼ３タンパク質の未発現若しくは発現低下が食道癌患者の予後不良を示す、を含む方法。
【請求項６】
食道癌患者の治療方法を選択するための情報を提供する方法であって、
（ａ）該患者由来の試料中のトランスグルタミナーゼ３の発現の検出をすること；及び、
（ｂ）測定されたトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと該患者の治療方法との関連付けをすることを含む方法。
【請求項７】
測定されたトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと該患者の治療方法との関連付けにおいて、トランスグルタミナーゼ３の未発現若しくは発現低下が、該患者が強化化学療法の対象患者であることを示す、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
食道癌の状態又は進行をモニターする方法であって、
（ａ）患者由来の試料中のトランスグルタミナーゼ３の発現を検出すること；及び、
（ｂ）測定されたトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと該患者の食道癌の状態又は進行との関連付けをすること、ここで、トランスグルタミナーゼ３の未発現若しくは発現低下は、該患者の食道癌の状態が不良であること、進行していることを示し、及び／又は、トランスグルタミナーゼ３の発現若しくは発現上昇は、該患者の食道癌の状態が良好であること、進行していないことを示す、を含む方法。
【請求項９】
食道癌治療薬のスクリーニング方法であって、以下（ｉ）から（ｉｉｉ）から選択される１の方法：
（ｉ）以下の工程：
（ａ）食道癌細胞を調整する工程；
（ｂ）被験薬を当該食道癌細胞に接触させる工程；
（ｂ）トランスグルタミナーゼ３のｍＲＮＡ量又はタンパク質量を測定する工程；
（ｃ）トランスグルタミナーゼ３の測定値からトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを計算する工程；
（ｄ）被験薬を接触させた食道癌細胞と接触させなかった食道癌細胞におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを比較する工程；及び、
（ｅ）被験薬を接触させなかった食道癌細胞におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと比較して、被験薬を接触させた食道癌細胞におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルが上昇した場合に当該被験薬が食道癌の予後改善効果があると判定する工程、
を含む方法；
（ｉｉ）以下の工程：
（ａ）食道癌モデル細胞を調整する工程；
（ｂ）被験薬を当該モデル動物に投与する工程；
（ｃ）当該モデル動物におけるトランスグルタミナーゼ３のｍＲＮＡ量又はタンパク質量を測定する工程；
（ｄ）トランスグルタミナーゼ３の測定値からトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを計算する工程；
（ｅ）被験薬を投与した食道癌モデル動物と投与しなかった食道癌モデル動物におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを比較する工程；及び、
（ｆ）被験薬を投与しなかった食道癌モデル動物におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと比較して、被験薬を投与した食道癌モデル動物におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルが上昇した場合に当該被験薬が食道癌の予後改善効果があると判定する工程；
を含む方法；あるいは、
（ｉｉｉ）以下の工程：
（ａ）被験薬を食道癌患者に投与する工程；
（ｂ）当該食道癌患者におけるトランスグルタミナーゼ３のｍＲＮＡ量又はタンパク質量を測定する工程；
（ｃ）トランスグルタミナーゼ３の測定値からトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを計算する工程；
（ｄ）被験薬を投与した食道癌患者と投与しなかった食道癌患者におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルを比較する工程；及び、
（ｅ）被験薬を投与しなかった食道癌患者におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルと比較して、被験薬を投与した食道癌患者におけるトランスグルタミナーゼ３の発現レベルが上昇した場合に当該被験薬が食道癌の予後改善効果があると判定する工程；
を含む方法。
【請求項１０】
食道癌患者の予後を予測するためのキット、食道癌患者の治療方法を選択するための情報を提供するためのキット、又は、食道癌治療薬のスクリーニング用キットであって、以下（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択されるいずれか１つを備えるキット：
（ｉ）トランスグルタミナーゼ３タンパク質と特異的に結合する抗体又はその断片；
（ｉｉ）トランスグルタミナーゼ３遺伝子の一部と特異的に結合するプライマー及びトランスグルタミナーゼ３遺伝子と相補的な核酸；又は
（ｉｉｉ）トランスグルタミナーゼ３遺伝子の一部と相補的な配列及び消光プローブの一部と相補的な配列を有するフラップ、トランスグルタミナーゼ３遺伝子の一部と相補的な配列を備えるインベーダープローブ、三重鎖特異的ＤＮＡ分解酵素、及び、消光プローブを備える蛍光標識ユニバーサルプローブ。
【図１】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−１０７３０６（Ｐ２０１０−１０７３０６Ａ）
【公開日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２７８５５４（Ｐ２００８−２７８５５４）
【出願日】平成２０年１０月２９日（２００８．１０．２９）
【出願人】（３９９０８１２１３）インフォコム株式会社 (19)
【出願人】（５９０００１４５２）国立がんセンター総長 (80)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月１３日（２０１０．５．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月２９日（２００８．１０．２９）
【出願人】（３９９０８１２１３）インフォコム株式会社 (19)
【出願人】（５９０００１４５２）国立がんセンター総長 (80)
【Ｆターム（参考）】
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