骨および軟組織欠損および障害の診断および処置のためのＢＭＰ−１プロコラーゲンＣ−プロテイナーゼ
【課題】組織欠損および障害を診断し、処置するためのＢＭＰ−１のイソ型を含む組成物および方法を提供する。
【解決手段】個体の慢性腎不全を診断するために個体からの血液試料を試験する方法であって：ＢＭＰ−１イソ型であるＢＭＰ−１−３、およびＢＭＰ−１−５の試料中の存在を確定する。ＢＭＰ−１イソ型を含む、個体の虚血性急性腎不全を治療するための医薬組成物。１種以上のＢＭＰ−１イソ型に特異的な１種以上の抗体分子を含む、個体の腎臓に対する虚血／再潅流傷害を処置するための医薬組成物。
【解決手段】個体の慢性腎不全を診断するために個体からの血液試料を試験する方法であって：ＢＭＰ−１イソ型であるＢＭＰ−１−３、およびＢＭＰ−１−５の試料中の存在を確定する。ＢＭＰ−１イソ型を含む、個体の虚血性急性腎不全を治療するための医薬組成物。１種以上のＢＭＰ−１イソ型に特異的な１種以上の抗体分子を含む、個体の腎臓に対する虚血／再潅流傷害を処置するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願
本出願は２００６年７月２１日に出願された、米国仮出願第６０／８３２，３２５号に対する優先権を主張する。
技術分野
本発明は、組織欠損および障害の診断および再生の分野に属する。とりわけ、本発明は組織欠損および障害を診断し、処置するためのＢＭＰ−１のイソ型を含む組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
骨形態形成性タンパク質（ＢＭＰ）は、骨から精製され、特徴を解析されている（Ｓａｍｐａｔｈ ａｎｄ Ｒｅｄｄｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：７５９９（１９８１）骨‐誘導（骨形成性、骨誘導性）分子である。“骨形態形成性タンパク質”、“ＢＭＰ”および“モルフォゲン（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎ）”という用語は同義語で、タンパク質の形質転換成長因子‐β（ＴＧＦ‐β）スーパーファミリーの特有のサブクラス（すなわち、ＢＭＰファミリー）のメンバーを表す（たとえば、Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａＩ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５７：２９４−３０８（２００１）；Ｒｅｄｄｉ，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ．，８３−Ａ（Ｓｕｐｐ．１）：ＳＩ−Ｓ６（２００１）；米国特許第４，９６８，５９０号；第５，０１１，６９１号；第５，６７４，８４４号；第６，３３３，３１２号を参照されたい）。そのようなＢＭＰはすべてシグナルペプチド、プロドメイン、およびカルボキシ‐末端（成熟）ドメインを有する。カルボキシ‐末端ドメインはＢＭＰモノマーの成熟型であり、システインノットを形成する７つのシステインによって特徴付けられる高度に保存された領域を含む（たとえば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ｅｔ ａＩ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：８７８−８８３（１９９６）を参照されたい）。ＢＭＰは本来タンパク質精製法を使用して、哺乳動物骨から単離された（たとえばＵｒｉｓｔ ｅｔ ａＩ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１７３：１９４−１９９（１９８３）；Ｕｒｉｓｔ ｅｔ ａＩ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：３７１−３７５（１９８７）；Ｓａｍｐａｔｈ ｅｔ ａ１．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７１０９−７１１３（１９８７）；米国特許第５，４９６，５５２号を参照されたい）。しかし、ＢＭＰは腎臓、肝臓、脳、筋肉、歯、および腸のような多様な他の哺乳動物組織および器官において検出されるか、または単離されている。多くのＢＭＰ（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３を含む）はまた、骨形成の標準異所性アッセイにおいて証明されるように、軟骨および骨形成を刺激する（たとえば、Ｓａｍｐａｔｈ ａｎｄ Ｒｅｄｄｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：６５９１−６５９５（１９８３）を参照されたい）。従って、そのような真正ＢＭＰはまた、たとえそれらが軟組織再生を同じ様に促進してよいとしても“骨形成性”と表される。
【０００３】
通常ＢＭＰ−１と表されるタンパク質は、骨形成性、組織再生タンパク質のＢＭＰファミリーの真のメンバーではない。ＢＭＰ−１は本来高度に精製されたＢＭＰウシ骨抽出物から単離され、本来皮下（異所性）骨形成アッセイにおいてｉｎ ｖｉｖｏで軟骨形成を誘発することが報告された（Ｗｏｚｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：１５２８（１９８８））。しかし、ＢＭＰ−１は他のＢＭＰと顕著なアミノ酸配列相同性を共有せず、ＢＭＰ−１は他のＢＭＰに見いだされる特徴的なシグナルペプチド、プロドメイン、カルボキシ‐末端（成熟ドメイン）、またはシステインノットも提示しない。実際、ＢＭＰ−１は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）内のコラーゲンの適切なアセンブリーに必須な酵素であるプロコラーゲンＣ−プロテイナーゼと同一であることが示された（Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７１：３６０−３６２（１９９６））。ＴＧＦ−βファミリー内のＢＭＰ−１の誤った事態は、初めの骨形成のバイオアッセイにおける欠陥に起因し（Ｗｏｚｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，前記）、そこではバイオアッセイで観察された軟骨は不溶な骨マトリックスを汚染している古い成長プレート軟骨であったと考えられ、それが新規に形成された組織であると誤って確定された（Ｒｅｄｄｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７１：４６３（１９９６）を参照されたい）。本明細書で示されるように、真正骨形成性ＢＭＰとは異なり、ＢＭＰ−１−１イソ型は標準異所性骨形成アッセイにおいて軟骨または骨形成を誘導しない。
【０００４】
ＢＭＰ−１遺伝子はショウジョウバエ遺伝子ｔｏｌｌｏｉｄ（ＴＬＤ）に関連し、該遺伝子はＴＧＦ−β様モルフォゲンを活性化するｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＤＰＰ）遺伝子の能力に基づいてＤＰＰ遺伝子によって制御されるパターニングに関与する。ＢＭＰ−１タンパク質は現在、パターン形成のカスケード中の形態形成の重要な制御点であることが知られている（Ｇｅ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ，Ｂｉｒｔｈ Ｄｅｆｅｃｔ Ｒｅｓ．，７８：４７−６８（２００６））。
【０００５】
ＢＭＰ−１は広範な種において見いだされるメタロプロテイナーゼの小さなサブグループの典型である。哺乳動物では、４種のＢＭＰ−１／ＴＬＤ‐関連（またはＢＭＰ−１／ＴＬＤ‐様）メタロプロテイナーゼがある。ＢＭＰ−１をコードする遺伝子はまた、オルタナティブスプライシングされたｍＲＮＡによってコードされる第２の、より長いプロテイナーゼをコードする。本質的にＴＬＤに同一のドメイン構造のために、このプロテイナーゼは哺乳動物Ｔｏｌｌｏｉｄ（ｍＴＬＤ）と命名された（Ｔａｋａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：３２５７２−３２５７８（１９９４））。その上、哺乳動物Ｔｏｌｌｏｉｄ‐様１および２（ｍＴＬＬ１およびｍＴＬＬ２）と命名された２種の遺伝的に別個の哺乳動物ＢＭＰ−１／ＴＬＤ‐関連プロテイナーゼがある。ＢＭＰ−１／ＴＬＤ‐様プロテイナーゼのプロドメインはサブチリシン（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）‐様プロタンパク質コンベルターゼ（ＳＰＣ）によってタンパク質分解により除去され（Ｌｅｉｇｈｔｏｎ ａｎｄ Ｋａｄｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８：１８４７８−１８４８４（２００３））、これらのプロテイナーゼの完全な活性を獲得しなければならない。ＢＭＰ−１／ＴＬＤ‐様プロテイナーゼのプロドメインの役割は、潜在型でＢＭＰ−１／ＴＬＤ‐様プロテイナーゼを維持することにあるように見える（Ｍａｒｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，９１：４１７−４２６（１９９７）；Ｓｉｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３９：３２３１−３２３９（２０００）；Ｌｅｉｇｈｔｏｎ ａｎｄ Ｋａｄｌｅｒ，前記）。
【０００６】
ＢＭＰ−１／ＴＬＤ‐関連メタロプロテイナーゼは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の形成に関連したいくつかの細胞外タンパク質のタンパク質分解による成熟に関与する。これらには、種々のコラーゲン、低分子ロイシン‐リッチプロテオグリカン、ＳＩＢＬＩＮＧタンパク質、および酵素リシルオキシダーゼ、ラミニン‐５、および基底膜プロテオグリカンパールカン由来の抗‐血管新生因子が挙げられる（Ｉｏｚｚｏ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６：６４６−６５６（２００５）；Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ，Ｔｏｐ．Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．，２４７：１４９−１８３（２００５）；Ｇｅ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ Ｂｉｒｔｈ Ｄｅｆｅｃｔ Ｒｅｓ．，前記）。ＢＭＰ−１はまた、細胞外マトリックスからＢＭＰを遊離すること、またはＢＭＰ−４、ＢＭＰ−１１およびＧＤＦ−８のような潜在型ＴＧＦ−βファミリーメンバーを活性化することに関連する（Ｗｏｌｆｍａｎ ｅｔ ａＩ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：１５８４２−１５８４６（２００３）；Ｇｅ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２５：５８４６−５８５８（２００５））。
【０００７】
ＢＭＰ−１の第１に発見された形状はＢＭＰ−１−１と命名され、そしてスプライス変異体ＲＮＡ転写物によってコードされる他のＢＭＰ−１イソ型は転写レベルで記載され、順番の添え字を付けて：ＢＭＰ−１−２、ＢＭＰ−１−３、ＢＭＰ−１−４、ＢＭＰ−１−５、ＢＭＰ−１−６、およびＢＭＰ−１−７と命名されている（Ｌｉ ｅｔ ａＩ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：５１２７−５１３１（１９９６）；Ｗｏｚｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：１５２８（１９８８）；Ｊａｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，７６：１４１（１９９８）；Ｔａｋａｈａｒａ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：３２５７２（１９９４）；Ｈｉｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．，５：１６（２００４）。予期されるように、スプライス変異体ＲＮＡ転写物によってコードされるＢＭＰ−１イソ型は、リーダーペプチド、プロ領域、およびプロテアーゼ（触媒）領域を含むいくつかのドメインを共有する。初めのＢＭＰ−１、すなわち、ＢＭＰ−１−１だけが骨からの単離後にタンパク質レベルで以前に確証されている。ＢＭＰ−１−２および他のＢＭＰ−１イソ型は、スプライス変異体転写物のヌクレオチド配列から推定されたが、タンパク質レベルでは記載されていない。
【０００８】
文献におけるＢＭＰ−１−１の同一性の修正にもかかわらず、このタンパク質または他のＢＭＰ−１イソ型がいずれか治療的に妥当な役割を有するかどうかはまだ解明されないままである。
【発明の概要】
【０００９】
発明の概要
本発明は、個体の血液中におけるＢＭＰ−１の循環に関連する発見に基づいた、診断および処置の新規な方法を提供する。個体の循環血における特有のイソ型の他と異なる出現は、現在特有の骨欠損または軟組織の障害に関連付けられている。従って、急性骨折、慢性腎不全、進行性骨化性線維形成異常、骨形成不全、急性膵炎、および肝硬変のような特有の障害の早期の診断の場合、現在簡単な血液試験を使用して血液試料中の１種以上のＢＭＰ−１イソ型の存在を検出することが可能である。その上、本明細書に開示された発見は、特有の骨欠損を患う個体における骨形成性骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）の効果を高める新規な処置方法の開発を導いている（以下の実施例１４を参照されたい）。
【００１０】
本発明の一態様は、個体の血液中のＢＭＰ−１イソ型のプロファイルを確定すること、および該プロファイルを種々の欠損および障害に関連したＢＭＰ−１イソ型の標準血液プロファイルと比較することを含む、個体の骨または軟組織における欠損または障害を診断する方法を含む。健康な個体ならびに種々の骨および軟組織障害の処置を受けている個体のプールされた血液に基づいた、そのような標準血液プロファイルは表１（以下）に提示される。
【００１１】
本発明の診断方法は、好都合には１種以上のＢＭＰ−１イソ型に結合することが可能なディテクター分子を使用して行われる。適切なそのようなディテクター分子には、抗体分子（ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびにＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ′）２フラグメントなどのような抗体の結合フラグメント）およびアプタマー（すなわち、特有のタンパク質に特定の結合親和性を有する核酸分子）が挙げられる。
【００１２】
従って、本発明の診断方法の特有の態様では、個体の血液イソ型プロファイルは、１種以上のディテクター分子を使用して１種以上のＢＭＰ−１イソ型の存在に関して個体の血液試料をアッセイするために作製される。循環するＢＭＰ−１イソ型、またはいずれかの循環するイソ型の完全な不在は、本明細書では特有の障害を示すことになることが証明される。血液試料からこれらの欠損または障害を検出する能力は、障害のずっと初期の経過中に陽性の診断が達成されうるため、好都合である。たとえば、急性膵炎は循環するＢＭＰ−１−７の存在から検出されてもよく、疾患のいっそう明白な症状が現れる前に診断されてもよい。同様に、容易には検出できない（または高価なＸ‐線なしには検出できない）ごくわずかのひびまたは亀裂のような急性骨折は、血液試験、およびＢＭＰ−１イソ型の完全な不在を観察することを使用して初めに推定されてもよい。特有の態様では、抗体分子または１種以上のＢＭＰ−１イソ型に特異的なアプタマーのようなディテクター分子をアッセイに使用して、血液試料中における１種以上のＢＭＰ−１イソ型の存在が検出され、そして本明細書ではある種のイソ型の存在（またはイソ型の完全な不在）がそのような存在（または不在）に関連した障害を示す。
【００１３】
本発明の診断法にとって好ましいディテクター分子はモノクローナル抗体分子である。本明細書での使用に適切な抗‐ＢＭＰ−１イソ型抗体分子は、イムノグロブリン、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ′）２分子、１本鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、二重のｓｃＦｖ分子、単一ドメイン抗体分子（ｄＡｂ）、Ｆｄ分子、ディアボディー分子、該抗体分子のいずれかを含む融合タンパク質、または１種以上の前述の分子の組み合わせであってもよい。
【００１４】
本発明に従った特定の方法では、個体の血液試料中のＢＭＰ−１イソ型であるＢＭＰ−１−１、ＢＭＰ−１−３、ＢＭＰ−１−５、およびＢＭＰ−１−７の存在を確定するために試料を試験することを含む、個体の肝硬変を診断するための方法が提供され、ここで試料中の該ＢＭＰ−１イソ型の不在は個体の肝硬変を示す。
【００１５】
本発明の別の特定の態様は、個体由来の血液試料中のＢＭＰ−１イソ型であるＢＭＰ−１−１、ＢＭＰ−１−３、ＢＭＰ−１−５、およびＢＭＰ−１−７の存在を確定するために試料を試験することを含む、個体の急性骨折を診断するための方法であり、ここで試料中の該ＢＭＰ−１イソ型の不在は個体の急性骨折を示す。
【００１６】
本発明の付加的な態様は、個体の血液試料中のＢＭＰ−１イソ型であるＢＭＰ−１−７の存在を確定するために試料を試験することを含む、個体の急性膵炎を診断するための方法であり、ここで個体の循環血における該ＢＭＰ−１イソ型の存在は個体の急性膵炎を示す。
【００１７】
本発明の付加的な態様は、個体の血液試料中のＢＭＰ−１イソ型であるＢＭＰ−１−３およびＭＰ−１−５の存在を確定するために試料を試験することを含む、個体の慢性腎不全を診断するための方法であり、ここで個体の循環血における両方の該ＢＭＰ−１イソ型の存在は個体の慢性腎不全を示す。
【００１８】
本明細書に開示された特有の好都合な方法は、個体の血液試料中のＢＭＰ−１イソ型ＢＭＰ−１−３の存在を確定するために試料を試験することを含む、個体の進行性骨化性線維形成異常を診断するための方法であり、ここで健康な個体の該イソ型のレベルと比較した同じＢＭＰ−１イソ型のレベル上昇（たとえば少なくとも５倍）は個体の進行性骨化性線維形成異常を示す。
【００１９】
本発明の別の特有の好都合な態様は、個体の血液試料中のＢＭＰ−１イソ型であるＢＭＰ−１−３の存在を確定するために試料を試験することを含む、個体の骨形成不全を診断するための方法であり、ここで健康な個体の該イソ型のレベルと比較した同じＢＭＰ−１イソ型のレベル上昇（たとえば少なくとも５倍）は個体における骨形成不全を示す。
【００２０】
本発明の付加的な態様は、個体の骨または軟組織における欠損または障害に対して個体を処置する方法であって：
（ａ）以下：
（ｉ）血液中のＢＭＰ−１イソ型のプロファイルを確定すること、および
（ｉｉ）プロファイルを種々の欠損または障害に関連したＢＭＰ−１イソ型の標準血液プロファイルと比較することを含むステップにより、個体の骨または軟組織における欠損または障害を診断すること、
（ｂ）診断された欠損または障害に対して骨形成性ＢＭＰの処置効果を高めるために有効な量の少なくとも１種のＢＭＰ−１イソ型を個体に投与すること、または診断された欠損または障害の進行における１種以上のＢＭＰ−１イソ型の効果を阻害するために有効な量の、１種以上の該ＢＭＰ−１イソ型に対して特異的な１種以上の抗体分子を個体に投与することを含む。
【００２１】
前述の方法の診断ステップ（ａ）は、患者の血液ＢＭＰ−１イソ型プロファイルを、たとえば、以下の表１に示された標準血液イソ型関連表と比較することによって実行されてもよい。前述の方法の治療ステップ（ｂ）は治療薬の全身または局所投与により達成されてもよい。骨欠損の処置では、とりわけ欠損部分への局所投与が好ましい。たとえば、本明細書ではＢＭＰ−１イソ型ＢＭＰ−１−１の局所投与は、ｉｎ ｖｉｖｏの骨折モデルにおいて骨修復を促進することが示される。（たとえば、以下の実施例１２および１４を参照されたい。）ＢＭＰ−１イソ型および／またはＢＭＰ−１−７のような真正、骨形成性ＢＭＰの局所投与が、好都合には骨欠損に対するそれらの薬剤の局所送達のためのキャリア／マトリックスとしての全血凝血物を使用させることになってもよい。全血‐由来凝血物デバイスは、物理的に安定な（自己‐サポート）ゲルの硬度を持つ治療薬を提供し、それが次に骨の再架橋が所望される骨端に、または骨断片間のギャップに容易に提供される。
【００２２】
前述の診断方法の特有の態様では、検出ステップはそれぞれ配列番号：１、配列番号：２または４、配列番号：６、および配列番号：７で示されるアミノ酸配列を有する、ＢＭＰ−１−１、ＢＭＰ−１−３、ＢＭＰ−１−５、およびＢＭＰ−１−７の１種以上を検出すること、または該アミノ酸配列のエピトープまたは検出可能なフラグメント（例えば、トリプシン消化されたフラグメント）を検出することを指向することになる。
【００２３】
特有の態様では、本発明は：塩化カルシウムのようなカルシウムイオン（Ｃａ＋＋）を提供する物質；少なくとも１種のＢＭＰ−１イソ型および場合により少なくとも１種の骨形成性ＢＭＰ；ならびに場合によりフィブリンおよびトロンビンを含む組成物を全血のアリコート中で一緒に混合することにより調製される、個体の骨欠損を処置するための骨形成性全血‐由来凝血物デバイス（ＷＢＣＤ）を提供する。混合物は物理的に安定なゲルの硬度を有する凝血物が形成されるまでインキュベーションされ、その後凝血物は骨再架橋または修復が所望される部位にマトリックスとして容易に適用される。そのような物理的に安定なゲルは好ましくは均質で、凝集力があり、シリンジで吸収可能であり、注射可能であり、そして展性があるもの（ｍａｌｌｅａｂｌｅ）である。凝血物の硬度は、治療的ＢＭＰ（存在する場合）およびＢＭＰ−１イソ型を伴う混合物が、修復されることになる骨欠損に隣接した適所に留まっていることを確実にする。
【００２４】
凝血物の成分の割合は変化してもよいが、カルシウムイオン物質の量は、カルシウムイオン濃度が先に述べた所望する特徴を有する凝血物ゲルを提供する量であるべきである。凝血物中のカルシウムイオンの好ましい濃度は１〜２．５ｍＭの範囲に入ることになる。塩化カルシウムは好ましい外因性Ｃａ＋＋‐供給物質である。塩化カルシウムが本発明のＷＢＣＤにおいて使用される場合、濃度は好都合には５〜１５ｍＭの範囲にある。
【００２５】
本発明に従った凝血物中のＢＭＰ−１イソ型の量は、好都合には１〜５００μｇ／ｍＬ、好ましくは２〜２００μｇ／ｍＬ、より好ましくは５〜２０μｇ／ｍＬの範囲にあるが、より少ないか、またはより多い量が使用されてもよく；ＢＭＰ−１イソ型の存在が真正、骨形成性ＢＭＰの活性を局所的に触媒すること；たとえば骨欠損を修復することおよび骨折を再架橋することに役立つことは本明細書に開示される基本的な発見である。従って、（細胞外マトリックスから活性化されるか、または外因性に供給されるかのいずれかの、たとえば、全血‐由来凝血物デバイスの要素としての）ＢＭＰの骨形成活性を高めるために有効なＢＭＰ−１イソ型のいずれの量が使用されてもよい。同様に、１種以上のＢＭＰが本発明に従った凝血物デバイスの要素として使用される場合、量は好都合には５０〜５００μｇ／ｍＬ、好ましくは１００〜２００μｇ／ｍＬの範囲に入るように調整されてもよい。しかし、ＢＭＰ−１イソ型要素の場合と同じように、より少ないか、またはより多い量が企図され、そして意図された骨欠損部位において骨形成を促進するために有効ないずれの量のＢＭＰが使用されてもよい。あるいは、凝血物中で使用されるＢＭＰ−１イソ型またはＢＭＰの量は、使用されることになる凝血物の量を考慮して、個体の全重量に基づきイソ型またはＢＭＰの全用量を提供するように調整されてもよい。たとえば、２〜２００μｇ／ｋｇ、好ましくは５〜２０μｇ／ｋｇ、より好ましくは８〜１２μｇ／ｋｇ患者体重を提供するＢＭＰ−１イソ型の量が使用されてもよく；そしてたとえば、１〜１０００μｇ／ｋｇ、好ましくは２〜５００μｇ／ｋｇ、より好ましくは５０〜２００μｇ／ｋｇ、最も好ましくは１００μｇ／ｋｇ患者体重を提供するＢＭＰの量が使用されてもよい。ＷＢＣＤにおける使用のための成分の量を確定することにおいて、成分の量または容積が凝血物ゲルの所望する特徴に有害に影響を与えるほど多い（または少ない）はずがないことは理解されるであろう。
【００２６】
従って、本発明の特定の態様では、個体において骨欠損を処置するための骨形成性全血‐由来凝血物デバイス（ＷＢＣＤ）が以下：
（ａ）（ｉ）全血、
（ｉｉ）２〜２００μｇ／ｍＬの少なくとも１種のＢＭＰ−１イソ型、
（ｉｉｉ）５〜１５ミリモル／Ｌ塩化カルシウム、
（ｉｖ）場合により、５〜１０ｍｇ／ｍＬフィブリンおよび０．５〜５ｍｇ／ｍＬトロンビンを含む混合物を一緒に混合すること；および
（ｂ）物理的に安定なゲルが形成されるまでステップ（ａ）の混合物をインキュベーションすること；を含むステップにより調製される。
【００２７】
所望する場合、ある量、好ましくは５０〜５００μｇ／ｍＬの範囲のＢＭＰが前述の態様の（ａ）の混合物に添加されて、本明細書に開示されたＢＭＰ−１イソ型およびＢＭＰの組み合わせの相乗効果を活用してもよい。
【００２８】
カルシウムイオンを提供するための多くの適切な物質が知られている。塩化カルシウムが好ましい。
本明細書に記載されるＷＢＣＤにおいて有用なフィブリン‐トロンビン混合物は、フィブリンとトロンビンをＷＢＣＤの他の成分と単に混合することにより作製されてもよい。あるいは、フィブリンとトロンビンは混合物として予め混合されているか、または購入され、その後混合物が他の成分に添加されてもよい。ＷＢＣＤにおいて有用なフィブリン‐トロンビン混合物には、“フィブリンのり”または“フィブリンシーラント”として当該技術分野で公知のものが挙げられる。フィブリン‐トロンビン混合物、フィブリンのり、およびフィブリンシーラントの市販の調製物は容易に入手可能である。本明細書に記載されたＷＢＣＤを調製することに使用されるフィブリンとトロンビンは薬剤的に受容できる性質からなり、多くの個体において通常免疫反応を引き起こすことになる、際立った免疫原性の供給源ではない。
【００２９】
外因性に提供されたフィブリン‐トロンビン混合物は、先に述べたようにカルシウムイオンによって凝血物ゲルに提供される１種以上の特性を高めてもよい。その上、フィブリン‐トロンビン混合物を使用してＷＢＣＤのＢＭＰ−１イソ型（および付加的なＢＭＰ）要素を捕らえることもできる。そのような活性成分のそのような捕捉はＷＢＣＤによる保持を高め、それによってＷＢＣＤおよびＷＢＣＤが適応されている局所欠損部位からの活性成分の移動速度を減少させる。好ましくは、本明細書に記載のＷＢＣＤに使用される外因性に提供されたフィブリン‐トロンビン混合物は、５ｍｇ／ｍＬから１０ｍｇ／ｍＬまでの範囲でフィブリンを提供し、そして０．５ｍｇ／ｍＬから５ｍｇ／ｍＬの範囲でトロンビンを提供する。
【００３０】
本発明に従った骨形成性ＷＢＣＤを調製することにおいて、全血は最も好ましくは個体から採取された自家全血である。従って、ＷＢＣＤは、使用直前に、手術室での骨修復手術における使用のために調製されること、およびＷＢＣＤを作製するために患者自身の全血を使用することが企図される。このことは、特有の患者への適用のためにドナー血液のタイピングおよびクロスマッチの必要性を回避する明白な利点を有する。それにもかかわらず、たとえば、患者が既に顕著な量の血液を失っている可能性がある、またはすでに輸血をうけている可能性がある場合のように、状況によってはクロスマッチした全血が使用されてもよいことが認識される。そのような状況では、ＷＢＣＤにおけるクロスマッチした全血の使用は、クロスマッチした全血を使用するいずれの輸血にも伴う血清疾患と同じか、または類似のリスクがある。
【００３１】
特有の態様では、本発明に従った骨形成性ＷＢＣＤは初めにいずれかのフィブリン／トロンビン組成物、カルシウムイオン物質、およびＢＭＰ−１イソ型ならびに場合によりＢＭＰを組み合わせて第１の混合物を形成し、その後第１の混合物に全血を添加して第２の混合物を形成し、そして物理的に安定な（自己‐支持）ゲルが形成されるまで第２の混合物をインキュベーションすることによって調製されてもよい。
【００３２】
別の態様では、全血以外のＷＢＣＤの調製に必要なすべての要素は便利に、そして好都合にキットに集められてもよい。キットは、それが必要な時点において、手術室内で開封され、患者から得られた自家血を使用してＷＢＣＤを形成するために使用されてもよい。そのようなキットは、たとえば以下のような品目を含むことができる：
（ａ）１種以上の凍結乾燥したＢＭＰ−１イソ型を含むバイアル、
（ｂ）凍結乾燥したＢＭＰ−１イソ型を溶解するためのバッファー、
（ｃ）バッファー中の凍結乾燥したＢＭＰ−１イソ型を溶解するためのシリンジ、
（ｄ）患者の血液を集めるための採血管（Ｖａｃｃｕｔａｉｎｅｒ）、
（ｅ）１Ｍ塩化カルシウムの滅菌溶液、
（ｆ）フィブリン‐トロンビン混合物、
（ｇ）全血を溶解したＢＭＰ−１イソ型および他の成分と混合するための容器、
（ｈ）開放骨修復手術中に骨末端に骨形成性凝血物を適用するために適したスパーテルまたはシリンジ（またはそれらの両方）、および
（ｉ）骨欠損への適用に適した物理的に安定なゲルを形成するための、１種以上のＢＭＰ−１イソ型、塩化カルシウム、および場合によりフィブリンおよびトロンビンを含む混合物と混合した全血からなるＷＢＣＤの調製および使用のための説明書。
【００３３】
本明細書に開示された発見は、ＢＭＰ−１イソ型の発見された役割および循環血におけるそれらの存在に基づいた、骨欠損および軟組織障害の治療に対する新規な研究方法を提供する。
【００３４】
特有の態様では、腎損傷の診断後個体にＢＭＰ−１イソ型を全身的に投与することを含む、個体の虚血性急性腎不全を処置する方法が提供される。（以下の実施例８を参照されたい）。関連する態様では、１種以上のＢＭＰ−１イソ型に特異的な１種以上の抗体分子を個体に全身的に投与することを含む、個体の慢性腎不全を処置する方法が提供される。（以下の実施例９を参照されたい）。この方法の特有の態様では、抗体分子はＢＭＰ−１イソ型に特異的な抗体分子、ＢＭＰ−１−３イソ型に特異的な抗体分子、またはそのような抗体分子の組み合わせである。
【００３５】
本発明の付加的な態様は、個体の虚血／再潅流損傷を阻害するために有効な量で１種以上のＢＭＰ−１イソ型に特異的な１種以上の抗体分子を個体に投与することを含む、個体における腎臓の虚血／再潅流障害を処置する方法を提供する。特有の態様では、１種以上のＢＭＰ−１イソ型を認識する１種以上の抗体分子は、虚血／再潅流事象の前に個体に全身的に投与される。とりわけ、ＢＭＰ−１−１に結合する抗体分子、ＢＭＰ−１−３に結合する抗体分子、またはそのような抗体分子の組み合わせが個体に投与されてもよい。
【００３６】
本発明はまた、発生する凝血塊（ｃｌｏｔ）を溶解するために有効な量で、胸部または腹部手術前に個体にＢＭＰ−１イソ型を投与することを含む、手術中に発生する可能性がある凝血塊を溶解するために個体を前処理する方法を提供する。
【００３７】
本発明の付加的な態様は、治療的有効量の、ＢＭＰ−１イソ型に特異的な少なくとも１種の抗体分子を個体に投与することを含む、個体の急性膵炎を処置する方法を提供する。とりわけこの態様では、抗‐ＢＭＰ−１−７抗体分子が使用されてもよい。
【００３８】
本発明の付加的な態様は、膵炎を患う個体に、炎症過程の急性相後に膵臓再生を促進するために有効な量で、ある量のＢＭＰ−１イソ型を投与することを含む、個体の膵炎を処置する方法を提供する。とりわけ、この態様では、ＢＭＰ−１−７イソ型が投与されてもよい。
【００３９】
循環するＢＭＰ−１イソ型の我々の調査の過程において、我々はまた胎盤ｃＤＮＡライブラリーから、以前に報告されていないＢＭＰ−１イソ型ＢＭＰ−１−３の変異体をコードするポリヌクレオチドを単離した。このイソ型のコーディング配列は配列番号：５に示され；この変異体イソ型のアミノ酸配列は配列番号：４に示される。単離された胎盤のｃＤＮＡから発現されるＢＭＰ−１−３イソ型は、以前に報告されたＢＭＰ−１−３イソ型（配列番号：２）に比較して若干の付加的な特性を提示する。（以下の実施例５を参照されたい。）従って、本発明の付加的な側面は、配列番号：４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供することである。そのようなポリヌクレオチドの１つは配列番号：５の配列を有する。
【００４０】
最も広範な側面において、本発明は個体の骨または軟組織における欠損または障害を診断するために、該個体の循環血液における１種以上のＢＭＰ−１イソ型の存在を試験するｉｎ ｖｉｔｒｏ診断法において特にＢＭＰ−１イソ型を結合するディテクター分子の使用に関する。好ましい態様では、そのようなディテクター分子は抗体分子またはアプタマーである。好都合なことに、そのようなディテクター分子は検出可能に標識される。
【００４１】
本発明は、その治療的側面において、骨欠損の処置のための医薬品の大規模製造におけるＢＭＰ−１イソ型の使用を提供する。その上、本発明は本明細書に記載される軟組織傷害の処置のための医薬品の大規模製造においてＢＭＰ−１イソ型に結合する抗体分子の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】虚血性急性腎不全に供されたラットの血液中のクレアチニン濃度（ｍｇ／ｍＬ）対時間（日）のグラフを示す。斜線の棒は虚血事象後の示された時間における対照群のラット（虚血、無処置）の血液中のクレアチニンレベルを示す。点刻模様の棒は虚血前およびその５日後に、ＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−１−３に対する抗体で全身的に処置されたラットの血液中のクレアチニンレベルを示す。アステリスクは抗体により処置された動物と無処置対照群の動物間のクレアチニンレベル間の有意な差（Ｐ＜０．０１）を表す。結果は、損傷前に投与された場合、ＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−１−３の中和抗体の全身投与が虚血／再潅流急性腎不全のラットにおける腎臓機能の損失を妨げたことを示唆する。詳細は以下の実施例７を参照されたい。
【図２】先の図１および以下の実施例７に記載された虚血／再潅流急性腎不全に供されたラットの腎臓組織の組織学的切片を示す。パネル２Ａは、抗体処置をしない（生理食塩水ベヒクル、ｐＨ７．２だけ）急性虚血／再潅流損傷にさらされた対照群ラットの腎臓組織の代表的な組織学的切片を示す。パネル２Ａでは、腎臓組織の構造完全性の顕著な損失が明らかである。パネル２Ｂは急性虚血／再潅流前およびその５日後に、ＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−１−３に対する抗体を全身投与された予防的治療群のラットの腎臓組織の代表的な組織学的切片を示す。パネル２Ｂの組織は、パネル２Ａに表された無処置組織に比較した、腎臓構造の顕著な保存を表す。詳細は、以下の実施例７を参照されたい。
【図３】以下の実施例８に記載された虚血性急性腎不全損傷後のラットの生存率の時間経過（日）のグラフを示す。菱形（◆、“対照”）は虚血／再潅流損傷後に治療を受けなかった陰性対照群のラットの生存を示す。四角（■、“ＢＭＰ−７”）は、腎臓における虚血／再潅流損傷の処置のための公知の治療薬であるＢＭＰ−７を与えられた陽性対照群のラットの生存を示す。三角（▲、“ＢＭＰ−１”）は損傷後にＢＭＰ−１−１を与えられたラットの生存を示す。ばつ印（ｘ、“ＢＭＰ−１ Ａｂ”）は損傷後にＢＭＰ−１−１に対する抗体を与えられたラットの生存を示す。結果は損傷後のＢＭＰ−１−１イソ型の投与が虚血／再潅流急性腎不全のラットの生存率を増したことを表す。詳細は実施例８を参照されたい。
【図４】ＢＭＰ−１−１（骨４Ａおよび４Ｄ）、ＢＭＰ−７（骨４Ｂ、４Ｃ、および４Ｅ）、およびＢＭＰ−１−１に対する抗体（骨４Ｆ）により全身的に処置されたラットの８週間後の大腿骨骨折を示す。ラットへのＢＭＰ−７の全身投与に比較して、ラットへのＢＭＰ−１−１の全身投与により骨折の治癒が早められた。ＢＭＰ−１−１中和抗体の全身投与は、骨折部位におけるＢＭＰ−１−１活性の阻害により骨折治癒を遅延させた。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは以下の実施例１４に記載のように、ＢＭＰ−１イソ型またはＢＭＰ−７無しに、全血‐由来凝血物デバイス（ＷＢＣＤ）だけにより局所的に処置された対照群のウサギの代表的な骨における６週間後の尺骨欠損を示す。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは以下の実施例１４に記載のように、ＢＭＰ−１−１を含むＷＢＣＤにより局所的に処置されたウサギの代表的な骨における６週間後の尺骨欠損を示す。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは以下の実施例１４に記載のように、ＢＭＰ−７を含むＷＢＣＤにより局所的に処置されたウサギの代表的な骨における６週間後の尺骨欠損を示す。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは以下の実施例１４に記載のように、ＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−７を含むＷＢＣＤにより局所的に処置されたウサギの代表的な骨における６週間後の尺骨欠損を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
発明の詳細な説明
本発明が十分に理解されるように、以下の用語が定義される。
本明細書で使用され、理解される“抗体”または“抗体分子”は、天然に、合成により、または半合成により生産されたかどうかにかかわらず、タンパク質分子もしくはその一部、またはいずれか他の分子である特定の結合メンバーを表し、そしてそれはイムノグロブリン可変軽鎖領域またはそのドメイン（ＶＬ）もしくは一部、イムノグロブリン可変重鎖領域またはそのドメイン（ＶＨ）もしくは一部によって形成される抗原結合ドメインを有する。“抗体”という用語はまた、イムノグロブリンの抗原‐結合ドメインに同一であるか、または相同な抗原‐結合ドメインを有するいずれかのポリペプチドまたはタンパク質分子を包含する。抗体は、“ポリクローナル”、すなわち、抗原の異なる部位に結合する抗原‐結合分子の集団、または抗原の１カ所だけに結合する同一の抗原‐結合分子の集団であってもよい。本明細書で使用され、理解される抗体分子の例としては、公知のクラスのイムノグロブリン（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ）のいずれかおよびそれらのイソ型；ＦａｂまたはＦ（ａｂ′）２分子のような、抗原結合ドメインを含むイムノグロブリンフラグメント；１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）分子；二重ｓｃＦｖ分子；単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）分子；Ｆｄ分子；ディアボディー分子；およびそのような分子を含む融合タンパク質を含む。ディアボディーは２つのディアボディーモノマーの会合によって形成され、そしてそれは２つの完全な抗原結合ドメインを含むダイマ−を形成し、ここでそれぞれの結合ドメインはそれ自体２つのモノマーそれぞれに由来する領域の分子間会合によって形成される（たとえば、Ｈｏｌ１ｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい）。そのような抗体分子の使用は、当該技術分野で利用可能な非常に多数の抗体検出システムおよびフォーマットを提供し、それらは、全血、血漿、血清、および種々の組織抽出物を含む混合物中の特有のＢＭＰ−１イソ型を選択的に検出するために適用されてもよい。ＢＭＰ−１イソ型を検出するための抗体分子を使用するフォーマットの例としては、イムノブロッティング（たとえばウェスタンブロット、ドットブロット）、免疫沈降、アフィニティー法、イムノチップなどが挙げられるが、それらに限定されない。当該技術分野で公知の多様な方法のいずれかが利用されて、特定のＢＭＰ−１イソ型、または少なくとも１つのエピトープ（抗体結合部位）を含む該ＢＭＰ−１イソ型の一部に対する抗体分子が産生されてもよい。
【００４４】
“循環する（ｃｉｒｃｕｌａｔｅ）”および“循環する（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ）”は個体の血管系を通って移動するか、または別のやり方で運ばれるどんなものも説明する。
【００４５】
“障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）”および“疾患（ｄｉｓｅａｓｅ）”という用語は同義語であり、原因または病原体にかかわらず、いずれかの病的状況を表す。組織における“欠損”は異常な、または欠陥のある組織増殖の部位を表す。“疾患”または“障害”は１種以上の組織における１種以上の“欠損”によって特徴付けられてもよい。
【００４６】
本明細書で使用する “処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）”および“処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）”という用語は、疾患または障害の１種以上の症状または徴候を緩和する、疾患または障害の進行を阻害する、疾患または障害の進行を阻止するかまたは、進行を無効にする（退行を引き起こす）、または疾患または障害の開始を妨害するいずれかの処方を表す。処置には、予防を含み、そして疾患または障害の治癒を含むが、それが不可欠ではない。
【００４７】
“治療的有効量”は、状態の進行を全体的に、または部分的に阻害する、障害の１種以上の症状を少なくとも部分的に緩和する、または別の化合物（たとえば骨形成性ＢＭＰ）の治療的な、または別の有益な効果を高めるか、または触媒する化合物（たとえば、治療的に使用される場合のＢＭＰ−１イソ型またはＢＭＰ−１イソ型結合分子）の量である。治療的有効量は、予防的に有効な量でもありうる。治療的に有効である量は患者のサイズおよび性、処置されることになる状態、状態の重症度および求められる結果に依存することになる。一定の患者にとって、治療的有効量は当業者に公知の方法によって決定されうる。
【００４８】
本明細書に開示される種々のポリペプチドを記載するために使用される場合、“単離された”という用語は天然の環境の要素から確定され、そして分離および／または回収されているポリペプチドを意味する。天然の環境の汚染要素は、ポリペプチドの診断的または処置的使用を典型的に妨害することになる材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含んでいてもよい。ポリペプチドの天然の環境の少なくとも１つの要素が存在しないことになるため、単離されたポリペプチドは、ポリペプチドを発現するように操作された組換え細胞内のｉｎ ｓｉｔｕにおけるポリペプチドを含む。しかし、通常、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製ステップによって調製されることになる。“単離されたポリヌクレオチド”または単離されたポリペプチドをコードする核酸は、そのような核酸の天然の供給源、たとえばヒトゲノム中で通常会合している少なくとも１種の汚染物質の核酸分子から確定され、そして分離される核酸分子である。単離されたポリヌクレオチドは天然において見いだされる形状または配置以外の状態である。従って、特定のポリペプチドをコードする核酸分子は天然の細胞に存在するため、単離されたポリヌクレオチドは、そのような特定のポリペプチドをコードする核酸分子と識別される。しかし、単離されたポリヌクレオチドは、細胞に含まれ、通常はポリペプチドを発現する、ポリペプチドをコードする核酸分子を含むが、たとえば天然の細胞とは異なるクロモソームの位置にある核酸分子は含まない。
【００４９】
“ゲル”は半固体のゼリー様材料を意味する。
凝血物ゲルに適用される“均質”は、凝血塊の集塊を連結する非均質線維性ネットワークとは対照的に、凝血物ゲルが均質な硬度を有することを意味する。
【００５０】
凝血物ゲルを説明するために本明細書で使用される“シリンジで吸引可能な（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｌｅ）”は、針を詰まらせずに、または粉々に砕けて集塊にならずに、１８〜２３ゲージまでの範囲の針を持つシリンジに凝血物ゲルが吸引されうることを意味する。
【００５１】
凝血物ゲルを説明するために本明細書で使用される“注射可能な（ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ）”は、凝血物ゲルがシリンジの開口部を通って、または１８〜２３ゲージまでの範囲の針を通って、開口部または針を詰まらせずに、そして粉々に砕けて集塊にならずに、シリンジから押し出されうることを意味する。
【００５２】
凝血物ゲルを記載するために本明細書で使用される“適応性のある”は、骨欠損を充填するか、または覆うために、凝血物ゲルが成型、または形成されうることを意味する。適応性のある凝血物ゲルは自立していて（または物理的に安定で）、形成された型を実質的に保持することになる。
【００５３】
１種以上の指定された成分またはステップを“含む”と本明細書で記載される組成物または方法は制約がなく、指定された成分またはステップは必須であるが、他の成分またはステップが該組成物または方法の範囲内で添加されてもよいことを意味する。冗長であることを回避するために、１種以上の指定された成分またはステップ“を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”（または“ｗｈｉｃｈ ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”）と本明細書で記載されるいずれかの組成物または方法はまた、同じ指定された成分またはステップ“から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）”（または“ｗｈｉｃｈ ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ”）、対応する、いっそう限定された、組成物または方法を記載し、該組成物または方法は指定された必須の成分またはステップを含み、そしてまた組成物または方法の基本的および新規な特徴に著しく影響を与えない、付加的な成分またはステップを含んでいてもよいことを意味することが理解される。また、１種以上の指定された成分またはステップ“を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”または“から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ”）と本明細書で記載されるいずれかの組成物または方法は、いずれか他の不特定の成分またはステップを除外して、指定された成分またはステップ“からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）”（または“ｗｈｉｃｈ ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ”）、対応する、いっそう限定的で、閉鎖的な組成物または方法を説明することが理解される。本明細書に開示されたいずれかの組成物または方法では、いずれか指定の必須の成分またはステップの、公知の、または開示された等価物がその成分またはステップと取って代わってもよい。
【００５４】
特記しない限り、他の用語の意味は、医学、生化学、分子生物学、および組織再生の分野を含む、当業者によって理解され、そして使用されるものと同じである。
本発明は、成体個体（ヒトまたは他の哺乳動物）の血液中のＢＭＰ−１イソ型が個体の組織の状態（ｓｔａｔｅ）または状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）の生物学的マーカー（バイオマーカー）として有用であるという発見に基づく。とりわけ、成体個体の血液中の１種以上のＢＭＰ−１イソ型の存在または不在、すなわちＢＭＰ−１血液プロファイルは、個体の健康状態または骨および種々の軟組織の特有の病的状態を示す。メタロプロテイナーゼプロコラーゲンＣ−プロテイナーゼ（ＢＭＰ−１プロコラーゲンＣ−プロテイナーゼとも呼ばれる）と同一であるＢＭＰ−１−１は、本来骨マトリックス中に発見された。しかし、ＢＭＰ−１−１イソ型は健康な成体個体にも、種々の疾患患者の中にも血中に循環していることが見いだされない。以前に、ＢＭＰ−１−１以外のイソ型の存在は組織ＲＮＡ転写物のレベルにおいてだけ推測された。
【００５５】
以下の表１は、正常な健康状態およびいくつかの障害、すなわち、急性骨折、慢性腎不全、進行性骨化性線維形成異常（ＦＯＰ）、骨形成不全（ＩＯ）、急性膵炎、および肝硬変に関連して循環するＢＭＰ−１イソ型のプロファイルを提供する。表１の診断プロファイルを生み出した研究の記載は実施例６（以下）に提供される。
【００５６】
【表１】
【００５７】
個体から得られた血液は、たとえばイソ型特異的抗体または他のイソ型ディテクター分子を使用して、種々のＢＭＰ−１イソ型の存在を容易に分析されうる。その上、血液試料中のＢＭＰ−１イソ型のプロファイルは、示された病的状態のいずれかを診断するための表１のプロファイルと比較されうる。
【００５８】
表１は、血液循環するＢＭＰ−１イソ型が広域スペクトルの疾患の生物学的マーカー（すなわちバイオマーカー）として有用であることを示す。表１の病状を診断するＢＭＰ−１イソ型血液プロファイルの使用は、そのようなプロファイルが生み出される機序の理解に依存しない。それにもかかわらず、種々の疾患を診断する都合のよい方法を提供する以外に、本明細書に提示されたデータとの密接な関係が存在する。とりわけ、本明細書に提示されたデータは、単一遺伝子、ＢＭＰ−１の多様な生成物である循環酵素の存在を初めて証明する。その上、いずれか特有の機序または操作の理論に束縛されることを望まずに、表１のデータは、それぞれの組織または器官が特有の真正ＢＭＰ（たとえば、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６）を遊離すると推定されていた、真正骨形成性ＢＭＰの作用の長く保持されてきたモデルを消散させた。対照的に、表１に示すように、健康な個体ではＢＭＰ−１−３イソ型だけが循環し、真正骨形成性ＢＭＰは健康な個体の血液中に見いだされていない（以下の実施例１を参照されたい）。その上、本明細書に示すように、８０％もの静脈内投与されたＢＭＰ−１−３がラットの骨折した大腿骨の同所性部位に局在することになり、無処置対照動物に比較して、骨治癒の速度が促進される（以下の実施例７を参照されたい）。さらに、ＥＣＭに富むラット頭蓋冠の培養物では、外因性に提供されたＢＭＰ−１−３が培地中への真正骨形成性ＢＭＰ−４およびＢＭＰ−７の遊離を促進する（以下の実施例９を参照されたい。これらのデータは、循環するＢＭＰ−１イソ型が、ＥＣＭ（真正骨形成性ＢＭＰ分子の貯蔵場所である（たとえばＭａｒｔｉｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｃｙｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｌ．，１：２３−３６（２００６）を参照されたい））の重要なプロセッシング酵素として触媒的に働き、１種以上の真正骨形成性ＢＭＰの局所遊離をもたらすという、本明細書で示された組織修復モデルといっそう一致する。骨修復において、たとえば、ＢＭＰ−１イソ型に触媒された真正ＢＭＰの遊離は局所的に働き、その後骨折した骨端の再架橋中の仮骨形成中の骨再生および修復を促進する。
【００５９】
表１に示すように、いくつかの病的状態、すなわち、急性骨折、急性膵炎、および肝硬変は血液からのＢＭＰ−１−３イソ型の消失によって特徴付けられる。ＢＭＰ−１−３の他に、ＢＭＰ−１−５イソ型も個体の血液中に存在する場合、イソ型プロファイルは慢性腎不全（ＣＲＦ）の診断に役立つ。ＢＭＰ−１−３が正常な個体よりかなり高い濃度（すなわち、少なくとも正常レベルの５倍）で血液中に見いだされる場合、イソ型プロファイルはＦＯＰまたはＯＩの徴候を示す。ＢＭＰ−７が存在する唯一のイソ型である場合、プロファイルは急性膵炎の徴候を示す。
【００６０】
軟組織器官に関しては、血液中のＢＭＰ−１−３の不在は、ＢＭＰ−１−３が実質組織に蓄積し、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のプロセッシングを促進し、それが今度は線維形成を刺激する状態を示唆してもよい。表１の軟組織の病状の一般的な特徴は、組織の進行する線維形成であり、それが処置されないと器官不全を導きうる。そのような線維形成は肝硬変および急性膵炎の特徴を示す。従って、血液プロファイルがＢＭＰ−１−３の不在を示唆し、そして骨折、慢性腎不全、ＦＯＰ、またはＯＩの証拠がない場合、表１は肝臓または膵臓のような実質器官の特定された病状の診断を導く。そのような状況では、医療専門家はそのような器官の病状の付加的な試験を実施するように警告される。従って、そのような付加的な試験は、線維形成増加を導くコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、および他の細胞外分子の蓄積に関する標準試験を実施することによって明白であるような線維形成増加を１種以上の実質器官が提示するかどうかを確定することを含んでいてもよい。
【００６１】
表１の場合、急性膵炎患者の血清は、疾患の初期のステージ、すなわち膵臓のアミラーゼおよびリパーゼのような膵臓酵素の活発な血清上昇の前に集められた。驚くべきことに、これらの患者の血液は、タンパク質レベルで以前に検出されていなかった（すなわち、ｍＲＮＡ転写物の検出から推定される理論的なＢＭＰ変異体というよりむしろ発現されたタンパク質としての）ＢＭＰ−１−７イソ型を含んでいた。ＢＭＰ−１−７の血液中における出現は膵臓の急性損傷の初期の診断マーカーとして有用である。
【００６２】
ＢＭＰ−１−３およびＢＭＰ−１−５イソ型は、透析中の慢性腎不全患者に見いだされ、障害におけるこれらのイソ型の特定の役割、たとえば、腎臓骨ジストロフィーと呼ばれる骨の線維形成プロセスにおける関与を暗示する。ＢＭＰ−１−５イソ型はまた、慢性腎不全ラットの循環中に検出されていて、疾患の重症度を反映している。我々による、患者の血液中におけるＢＭＰ−１−５の検出はまた、タンパク質レベルでのＢＭＰ−１−５イソ型の初めての証明である。
【００６３】
表１のプロファイルに従って、患者の血液中を循環するＢＭＰ−１イソ型がないことを示唆するＢＭＰ−１イソ型プロファイルは、個体が急性骨折を有する、および／または肝硬変を有することの証拠である。これらの状態の両方が線維形成を含む。そのような線維形成は急性骨折の治癒における仮骨形成の一部として有益であってもよいが、軟組織では、線維形成は破壊的であり、肝硬変に特徴的である。
【００６４】
循環するＢＭＰ−１イソ型プロファイルを確定することは、個体が組織欠損または疾患の症状を提示する場合だけでなく、たとえば年に１回の健康診断の一部としてのように、担当の医療専門家によって実施される日常的な血液試験の一部として使用されてもよい。当該技術分野で公知の、多様な方法および組成物のいずれかを使用して個体から得られた血液試料中で、ＢＭＰ−１イソ型は容易に検出される。そのような方法には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、トリプシン消化したＢＭＰ−１イソ型のペプチドの質量分析（ＭＳ）、およびアフィニティー法、とりわけ他のイソ型を除外して、特有のＢＭＰ−１イソ型に特に結合するアフィニティー分子を利用するものが挙げられるが、それらに限定されない。そのようなアフィニティー分子には抗体分子およびアプタマーが挙げられるが、それらに限定されない。当該技術分野で利用可能な多様なアッセイフォーマットがあり、それらは抗体分子を利用して個体の血液中に存在する標的タンパク質を検出または単離しうるため、それぞれのＢＭＰ−１イソ型に特異的な抗体分子がとりわけ好ましい。そのようなフォーマットには、濾紙（たとえば、ニトロセルロース、酢酸セルロース）、マイクロタイタープレート、ポリマー粒子（たとえば、アガロース、ポリアクリルアミド）、シリコンチップなどが挙げられるが、それらに限定されない。個体の血液からＢＭＰ−１イソ型を検出するか、または単離するために使用されるいずれか特有の方法の場合、全血の血漿または血清部分からそのような検出または単離をすることが好ましくてもよいことが理解される。
【００６５】
本明細書で記載される組換えＢＭＰ−１イソ型はクローニングされ、真核および原核宿主細胞に発現された。そのような組換え細胞を利用して、本明細書で記載される方法において使用するために十分な量のイソ型を生産してもよい。本明細書で論じられるそれぞれのＢＭＰ−１イソ型の特定のコーディング配列は公知であり、コードされたアミノ酸配列は推定されている。たとえば、ＥＭＢＬ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ ｗｅｂ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｌ）を参照されたい。便宜上、ＢＭＰ−１−１のアミノ酸配列は本明細書では配列番号：１として含まれる。ＢＭＰ−１イソ型ＢＭＰ−１−３のアミノ酸配列は配列番号：２で示され、ＢＭＰ−１−３をコードするｃＤＮＡ配列は配列番号：３で示される。ＢＭＰ−１イソ型ＢＭＰ−１−５のアミノ酸配列は配列番号：６で示される。ＢＭＰ−１イソ型ＢＭＰ−１−７のアミノ酸配列は配列番号：７で示される。ヒト胎盤に由来し、以前に知られたＢＭＰ−１−３の形状とは異なる特性を有するＢＭＰ−１−３の新規な変異体型が発見されていて、それは配列番号：４のアミノ酸配列、および配列番号：５のコーディング配列を有する。
【００６６】
ＢＭＰ−１イソ型およびそのペプチドは当該技術分野で利用可能な標準組換え、合成、または半合成法によって生産されてもよい。また、ＢＭＰ−１イソ型およびそのペプチドを使用し、当該技術分野で利用可能な標準方法を使用して、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体分子を含む種々のアフィニティー分子を生産してもよい。
【００６７】
配列番号：１、２、４、６および７のイソ型をコードするヌクレオチド配列のすべてまたは一部は、ベクター、プライマー、ハイブリダイゼーションのための核酸プローブなどのような多様な核酸分子のいずれかの核酸配列に組み込まれてもよい。そのような組換え核酸分子を使用して、関心のあるＢＭＰ−１イソ型をコードする核酸分子をクローニングし、ＢＭＰ−１イソ型ヌクレオチド配列を（たとえば種々のハイブリダイゼーション法により）同定または検出し、および／または関心のあるＢＭＰ−１イソ型をコードする核酸分子を増幅（たとえばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロトコルを使用して）してもよい。核酸分子は（たとえば自動核酸シンセサイザーを使用して）化学的に合成され、ＰＣＲにより生産され、および／または当該技術分野で公知の種々の組換え核酸法により生産されてもよい。核酸分子を、当該技術分野で公知の種々の改変、たとえば、ホスホジエステル結合をチオール結合に置き換えることにより合成し、種々のヌクレアーゼおよび化学物質による開裂に抵抗する分子を提供してもよい。ＢＭＰ−１イソ型のすべてまたは一部をコードする特定のヌクレオチド配列（ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡ）を検出する方法は当該技術分野で公知であり、サザンブロット（ＤＮＡおよびｃＤＮＡの場合）、ノーザンブロット（ＲＮＡの場合）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、ドットブロット、コロニーブロット、およびＤＮＡまたはＲＮＡ分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を含むが、それらに限定されない。本明細書に記載される核酸分子は、セルロース‐含有紙（たとえば、ニトロセルロース、酢酸セルロース）、ナイロン、プラスチックマイクロタイターディッシュのウェル、ポリマー粒子（たとえばアガロース粒子、アクリルアミド粒子）およびシリコンチップを含むが、それらに限定されない多様な表面のいずれかに、標準方法により固定されてもよい。
【００６８】
表１のプロファイルはまた、欠損および障害を処置する薬物発見および新規な方法にとって可能性のある標的を暗示する。たとえば、先に述べたように、ＢＭＰ−１イソ型は線維形成を促進する重要な酵素として関係している。線維形成疾患を処置する好ましい方法は、組織線維形成に関連するＢＭＰ−１イソ型に対する抗体を患者に投与することを含む。そのような線維形成疾患には、線維形成腎臓疾患、肝硬変、急性膵炎、およびＦＯＰが挙げられるが、それらに限定されない。たとえば、慢性腎不全および透析処置中の患者を処置する方法では、ＢＭＰ−１イソ型に対する抗体が患者に投与されて、腎不全を遅らせ、そして腎臓骨ジストロフィーの発症を妨害してもよく、そのような腎臓骨ジストロフィーは再生プロセスを阻害するもろい骨および線維形成骨髄を導く。ＦＯＰ患者では、ＦＯＰ患者の特徴的な“第２の骨格”を発生させるための線維形成プロセスに依存する異所性骨化を妨害するか阻害するために、抗体分子を投与してＢＭＰ−１イソ型を阻害してもよい。好ましくは、本明細書で記載される方法において有用な抗体分子は、非常に低い免疫原性を有するか、または最も好ましくは免疫原性が全くない抗体分子であり、そのため、抗体分子を不活性化することになる患者の免疫反応を引き起こさずに、抗体分子が複数用量で患者に投与されてもよい。また、ＢＭＰ−１イソ型を阻害するか、または不活性化するための抗体のような治療薬の投与が、骨折の正常な治癒中の仮骨形成における線維形成に依存する骨折の治癒も阻害してよいことが理解される。従って、患者に存在する可能性があるいずれかの骨折が治癒されるまで、または患者におけるいずれかの骨折の治癒より、ＢＭＰ−１イソ型を阻害するか、または不活性化するためのいっそう重大な処置の必要性が勝るという場合を除いては、本明細書に記載のＢＭＰ−１イソ型を阻害するための治療が推奨されないことは、医療専門家によって認識されることになる。
【００６９】
本発明の処置の別の方法は、特有のＢＭＰ−１イソ型を欠く患者に、組織修復を促進しうるか、または疾患を妨害しうる組換えＢＭＰ−１イソ型を投与することを含む。本明細書に示すように、ＢＭＰ−１−３は循環から消失し、急性骨折の同所性部位に局在する。
【００７０】
ＢＭＰ−１イソ型が全身的に（以下の実施例７を参照されたい）、または局所的に（以下の実施例８を参照されたい）投与されるかどうかにかかわらず、疾患の急性形状を維持している個体への組換えＢＭＰ−１−１の投与は骨修復を促進しうる。ＢＭＰ−１イソ型の投与はまた、胸部または腹部手術のような、主要な開放性手術中の虚血性急性腎不全後の患者に発生しうる血液凝血塊を溶解するために治療的に利用されてもよい。そのような事例では、手術中に形成される可能性がある凝血塊を溶解するための予防的治療として、好ましくは、ＢＭＰ−１イソ型は手術前に投与される。
【００７１】
急性膵炎の患者では、ＢＭＰ−７イソ型の阻害を予防的に使用して、疾患の進行を妨げるか、または阻害してもよいのに対して、炎症プロセスの急性相後のＢＭＰ−７の全身投与を使用して膵臓再生を促進してもよい。ＢＭＰ−１イソ型の二重機能がラットの急性腎不全において示され、その場合腎臓虚血前に注射されたＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−１−３抗体は腎臓機能を維持したが、虚血後のＢＭＰ−１−１イソ型の全身投与は著しくラットの生存を高めた（以下の実施例１１を参照されたい）。従って、急性虚血性疾患におけるＢＭＰ−１−１イソ型の二重機能は、２種の処置方法、すなわち予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）（予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｉｔｉｃ））処置および治療的（再生的）処置を暗示する。従って、急性腎臓虚血性疾患を妨げる方法は１種以上のＢＭＰ−１イソ型に対する抗体、たとえば循環するＢＭＰ−１−３イソ型に対する抗体、および循環するＢＭＰ−１−１イソ型に対する抗体を個体に（たとえば非経口的に）投与し、線維形成を妨げるか、または線維形成の実質的な進行を妨げることを含んでいてもよい。対照的に、急性虚血性腎臓疾患を処置する方法は、１種以上の組換えＢＭＰ−１イソ型を個体に（たとえば非経口的に）投与し、疾患の亜急性ステージにおける腎臓のより好ましい再生を支持することを含んでいてもよい。慢性腎不全を処置する方法は、１種以上のＢＭＰ−１イソ型に対する抗体（たとえばＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−１−３に対する抗体）を個体に（たとえば非経口的に）投与し、線維形成および疾患の進行を阻害することを含んでいてもよい。医療専門家は個体の腎臓の状態を査定して、個体が急性虚血のリスクを持ち、それゆえ予防的処置（たとえば、ＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−１−３イソ型を阻害するための抗体分子）の候補であるかどうか、または個体がすでに重篤な急性虚血性腎臓疾患を患っていて、治療的（再生的）処置（ＢＭＰ−１イソ型の投与）の候補であるかどうかを決定しうる。
【００７２】
本明細書で記載される発見の重要な側面（以下の実施例を参照されたい）は、先行技術の教示および前提とは異なり、ＢＭＰファミリー（たとえば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７など）の骨形成性ＢＭＰは、全身的に投与して、骨折または骨疾患の局所的修復のための治療的処置を提供するべきではないということである。なぜなら、血管壁におけるいずれかの免疫不全が局所的に骨形成性ＢＭＰを遊離し、それによって潜在的に局所軟組織の骨化を誘導する可能性があるからである。そのような血管の免疫不全は注射部位、打撲傷、および外傷において容易に発生し、そこでは局所的に利用可能な幹細胞と骨形成性ＢＭＰの組み合わせが結果的に軟組織の望ましくない骨化を生じうる。対照的に、ＢＭＰ−１−３またはＢＭＰ−１−１のようなＢＭＰ−１イソ型が全身的に投与され、局所骨折部位において細胞外マトリックスから骨形成性ＢＭＰを遊離してもよい。ＢＭＰ−１−１およびそのイソ型は真正ＢＭＰではないが、酵素である。
【００７３】
ＢＭＰ−１イソ型は、骨折または個体における（たとえば、種々の代謝的骨障害で発生するような）不適切な骨成長が特徴である骨のような、骨欠損を処置するための全血‐由来凝血物デバイス（ＷＢＣＤ）中の活性成分として利用されてもよい。１種以上のＢＭＰ−１イソ型（たとえば、ＢＭＰ−１−１、ＢＭＰ−１−３）を含む、そのようなＷＢＣＤが、骨折または不適切な骨成長によって特徴付けられる他の欠損部位に移植または注射されて、骨再生を促進してもよい。１種以上のＢＭＰ送達のために調製されたＷＢＣＤは、これと同時に出願され、本発明の譲渡人に譲渡された、同時係属中の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／＿＿に詳細に記載される。上記出願の開示はここに参照として援用される。ＢＭＰ−１イソ型が、ＥＭＣ由来の（または外因性供給源から導入された）真正骨形成性ＢＭＰを触媒し、骨修復活性を高めるという本発明の一部としての発見は、少なくとも１種のＢＭＰ−１イソ型または少なくとも１種のＢＭＰ−１イソ型と少なくとも１種の骨形成性ＢＭＰの組み合わせを含む、改善されたＷＢＣＤを本明細書で記載する基礎を提供する。
【００７４】
従って、好ましい態様では、本発明は以下：
（ａ）全血；
（ｂ）１〜５００μｇ／ｍＬ、好ましくは２〜２００μｇ／ｍＬ、いっそう好ましくは５〜２０μｇ／ｍＬの量のＢＭＰ−１イソ型、および場合により５０〜５００μｇ／ｍＬの量の真正ＢＭＰ；
（ｃ）１〜２．５ｍＭの濃度でカルシウムイオン（Ｃａ＋＋）を供給する外因性物質；
および
（ｄ）場合により、５〜１０ｍｇ／ｍＬフィブリンおよび０．５〜５ｍｇ／ｍＬトロンビンの混合物；を含む、骨折、または個体における不適切な骨成長が特徴である他の骨欠損を処置するための、骨形成性ＢＭＰを提供する。
【００７５】
本明細書で記載される全血‐由来凝血物デバイスは好ましくは以下：
（ａ）（１）全血、
（２）１〜５００μｇ／ｍＬ、好ましくは２〜２００μｇ／ｍＬ、いっそう好ましくは５〜２０μｇ／ｍＬの少なくとも１種のＢＭＰ−１イソ型、
（３）５〜１５ミリモル／Ｌ塩化カルシウム、
および
（４）場合により、５〜１０ｍｇ／ｍＬフィブリンおよび０．５〜５ｍｇ／ｍＬトロンビンの混合物を一緒に混合すること；
（ｂ）物理的に安定な（すなわち、非流体、自己‐支持、粘着性）凝血物ゲルが形成されるまでステップ（ａ）の混合物をインキュベーションすること；を含むステップにより調製される。
【００７６】
先の態様では、１種以上の真正骨形成性ＢＭＰが、好ましくは５０〜５００μｇ／ｍＬの量で混合ステップ（ａ）に添加されてもよい。
好ましい態様では、凝血物デバイスは、初めにフィブリン‐トロンビン混合物、カルシウムイオン、およびＢＭＰ−１イソ型またはＢＭＰ要素を組み合わせて第１の混合物を形成し；続いて成分の濃度が先に示された範囲内に収まり、そして機械的に安定なゲル硬度の凝血物が形成されるまで上記の第１混合物を全血と組み合わせることによって調製される。
【００７７】
好ましくは、本明細書で記載されるＷＢＣＤの調製において使用される全血は、ＷＢＣＤを与えられることになる個体から採取された自家全血である。なぜなら、自家全血は免疫原性でない、すなわち、非‐自己として受容者の免疫システムによって拒絶されないからである。それにもかかわらず、たとえば、患者が既に顕著な量の血液を失っている可能性があるか、またはすでに輸血をうけている可能性がある場合のように、状況によってはクロスマッチした全血が使用されてもよいことは認識される。そのような状況では、ＷＢＣＤにおけるクロスマッチした全血の使用は、クロスマッチした全血を使用するどんな輸血にも関連する血清疾患と同じか、または類似のリスクを導入する。
【００７８】
本発明はまた、骨欠損を処置するための１種以上のＢＭＰ−１イソ型を含む骨形成性全血‐由来凝血物デバイス（ＷＢＣＤ）を調製するためのキットを提供する。たとえば、好ましい態様では、そのようなキットは以下のものから構成されてもよい：
（ａ）凍結乾燥したＢＭＰ−１イソ型を含むバイアル、
（ｂ）凍結乾燥したＢＭＰ−１イソ型粉末を溶解するためのバッファー、
（ｃ）バッファー中の凍結乾燥したＢＭＰ−１イソ型を溶解するためのシリンジと針、
（ｄ）患者の血液を集めるための採血管（Ｖａｃｃｕｔａｉｎｅｒ）、
（ｅ）１Ｍ塩化カルシウムの滅菌溶液、
（ｆ）フィブリン‐トロンビン混合物、
（ｇ）溶解したＢＭＰ−１イソ型と全血を混合するための容器、
（ｈ）開放骨修復手術中に骨末端に骨形成性凝血物を適用するためのスパーテルまたはシリンジ（針あり、または針なし）および
（ｉ）自家またはクロスマッチした全血を使用した、ＢＭＰ−１イソ型を含むＷＢＣＤの調製および使用のための説明書。
実施例
実施例１．へパリンセファロースアフィニティークロマトグラフィーによる、ヒト血漿からの真正骨形成性ＢＭＰではない、ＢＭＰ−１イソ型の精製、および液体クロマトグラフィー‐質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を使用したタンパク質同定。
【００７９】
この研究は本来、いずれかの骨形成性ＢＭＰがヒト血漿から検出され、そして単離されるかどうかを確定するために行われた。
血漿採集
健康な成人（年齢２１〜５０歳）５０人の血液試料は１：９の抗凝固剤対血液比（ｖ／ｖ）を形成するように３．８％クエン酸ナトリウムを含むシリンジ中に採取された。血漿は遠心分離（１５分間、３０００ｘｇ）により得られ、それぞれの成体血漿試料のアリコートを使用して、プールされる血漿保存物が作製された。アリコート試料は分析まで−８０℃で保存された。
アフィニティーカラム精製
プールされたヒト血漿（８０ｍｌ）は１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）で２倍に希釈され、予め１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）で平衡化された５ｍｌヘパリンセファロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に加えられた。結合タンパク質は１．０Ｍおよび２．０Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）によりカラムから溶出された。
硫酸アンモニウム沈殿
飽和硫酸アンモニウム（ＳＡＳ）はボルテックス上で混合しながら、最終濃度３５％（ｗ／ｖ）になるまでタンパク質溶離液に滴下して加えられた。試料は氷上で１０分間保たれ、１２，０００ｘｇで５分間遠心分離された。上清は捨てられ、ペレットはその後のドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析のために調製された。
精製したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析
ペレットはＬａｅｍｍｌｉの方法に従って、１０％ゲルを使用した標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上を流した。電気泳動後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの一部分はニトロセルロースに移され、他は直接クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）により染色された。ニトロセルロース膜は初めにＢＭＰ−７に特異的なマウスモノクローナル抗体（Ｇｅｎｅｒａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）と一緒にインキュベーションされ、一晩４℃に保たれた。アルカリ性ホスファターゼ結合ヤギ抗マウス抗体は室温で１時間、二次抗体として使用された。膜は５ｍｌの発色性基質により染色された。ゲルの他の部分は標準染色手順（４５％メタノール、１０％酢酸中０．１％ＣＢＢ、室温で３０分間）のもとでクーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）により染色された。
【００８０】
ゲルはＣＢＢによる染色により明らかなそれぞれのタンパク質バンドに対応する切片に切断された。ゲル切片は、Ｏｌｓｅｎ ａｎｄ Ｍａｎｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１：１３４１７−１３４２２（２００４）、Ｇｒｇｕｒｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，２０：３１１−３１９（２００７）により改変）により記述されたナノエレクトロスプレーＬＣ−ＭＳインターフェースを使用し、ＨＰＬＣおよび質量分析（ＭＳ）によりそれぞれのタンパク質バンドから遊離されたトリプシン消化ペプチドを分析する方法を使用して加工処理され、それぞれの切片にどんなタンパク質が存在するかを確定した。この研究に特に関連するこの方法のステップの側面は以下に示される。
インゲル（ｉｎ−ｇｅｌ）トリプシン消化プロトコル
ゲルのバンドはＣＢＢ染色されたゲルから切り出され、トリプシン消化された。手短に述べると、ゲル片は８分間１００μｌのアセトニトリルにより収縮させた。液体は除去され、ゲル片は１２分間１００μｌの炭酸水素アンモニウムにより再膨潤させ、その後ＳｐｅｅｄＶａｃ中で１０分間乾燥させた。ジニトロスレイトール（ＤＴＴ、１００μｌ）が添加され、５７℃で４５分間インキュベーションした。ゲル片は５７℃で８分間１００μｌのアセトニトリルにより収縮させ、回転分離して、液体を除去した。ヨードアセタミド（１００μｌ）がそれぞれのゲル片に添加され、攪拌せずに暗所中、室温で４５分間インキュベーションた。トリプシン（１０μｌ）がゲル片毎に添加された。その後ゲル片は回転分離し、１０分間再膨潤させた。試料はサーモミキサー中、３７℃で一晩インキュベーションした。
ペプチド抽出プロトコル
試料は３７℃サーモミキサーから除去された。アセトニトリル、水、およびギ酸を含む溶液（５０μｌ）が添加された。試料は１５分間超音波処理された。上清は保存チューブに移され、５０μｌのアセトニトリルが添加された。抽出物はＳｐｅｅｄＶａｃ中、真空下で完全に乾燥するまで（約４０分間）乾燥させた。ペプチドは水、メタノール、およびギ酸を含む溶液１０μｌで再溶解された。試料は５分間超音波処理され、分析まで−２０℃で保存された。
質量分析
トリプシン消化されたペプチドは以下のように、液体クロマトグラフィー‐質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により分析された。Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ナノフローＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）はナノエレクトロスプレーＬＣ−ＭＳインターフェース（Ｐｒｏｘｅｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｏｄｅｎｓｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して７−テスラＬＴＱ−ＦＴ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に結合した。ペプチドは手製の７５μｍＣ１８ＨＰＬＣカラム上で分離され、正イオンモードにおいてオンザフライ（ｏｎ−ｔｈｅ−ｆｌｙ）で質量分析された。それぞれの測定サイクルは、フル質量分析（ＭＳ）スキャン、続いて選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）スキャン、ＭＳ／ＭＳ、および３つの最も強いイオンのＭＳ／ＭＳ／ＭＳスキャンから構成された。これは２ｐｐｍの典型的なペプチド質量精度、ならびにＭＳ／ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ／ＭＳフラグメントイオンからの付加的な配列情報を提供した。得られたスペクトルは重心を決められ、Ｍａｓｃｏｔ ｓｅａｒｃｈ ｅｎｇｉｎｅ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してＮＣＢＩｎｒデータベースに対して検索した。検索はトリプシン消化特異性、固定した修飾としてのカルボキシアミドメチル化、および可変性修飾としての酸化されたメチオニンにより行われた。ＭＳおよびＭＳ／ＭＳスペクトルに対して、それぞれ５ｐｐｍおよび０．６Ｄａの質量許容誤差が使用された。
結果
ＬＳ−ＭＳおよびイムノブロッティング分析は１２個のトリプシン消化されたペプチドを明らかにし、それらはＮＣＢＩｎｒデータベースと比較された。１２ペプチドは公知の骨形成性ＢＭＰのどれにも属さないが、ＢＭＰ−１−３の前駆体のスプライスイソ型３（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ１３４９７−２；配列番号：２）、すなわちプロコラーゲンＣ−プロテイナーゼに属することが見いだされた。１２ペプチドそれぞれのアミノ酸配列は以下の通りである：
ＧＧＧＰＱＡＩＳＩＧＫ（配列番号：２のアミノ酸１９３−２０３）、
ＨＶＳＩＶＲ（配列番号：２のアミノ酸２３３−２３８）、
ＧＤＩＡＱＡＲ（配列番号：２のアミノ酸３０８−３１４）、
ＩＳＶＴＰＧＥＫ（配列番号：２のアミノ酸３５２−３５９）、
ＬＰＥＰＩＶＳＴＤＳＲ（配列番号：２のアミノ酸４０１−４１１）、
ＤＧＨＳＥＳＳＴＬＩＧＲＹＣＧＹＥＫＰＤＤＩＫ（配列番号：２のアミノ酸４９７−５１９）、
ＦＶＳＤＧＳＩＮＫ（配列番号：２のアミノ酸５２９−５３７）、
ＣＳＣＤＰＧＹＥＬＡＰＤＫ（配列番号：２のアミノ酸５７２−５８４）、
１５ ＳＧＬＴＡＤＳＫ（配列番号：２のアミノ酸６５３−６６０）、
ＫＰＥＰＶＬＡＴＧＳＲ（配列番号：２のアミノ酸８２６−８３６）、
ＦＹＳＤＮＳＶＱＲ（配列番号：２のアミノ酸８４１−８４９）、
ＦＨＳＤＤＴＩＴＫ（配列番号：２のアミノ酸９５８−９６６）。
【００８１】
１２ペプチドは１９０の組み合わせ合同Ｍａｓｃｏｔスコアを有し、そしてそれは１０−１９の確率のランダムな（誤った）同定を提示する。ＮＣＢＩｎｒデータベース中の他のタンパク質で同じセットのペプチドに匹敵するものはなかった。真正骨形成性ＢＭＰタンパク質は、ＬＳ−ＭＳまたはイムノブロッティングにより１００ｋＤａおよび３５ｋＤａの分子量において検出されなかった。
【００８２】
結果は、真正骨形成性ＢＭＰは健康な成人の血液中には通常循環しないが、ＢＭＰ−１−３、すなわちプロコラーゲンＣ−プロテイナーゼは正常なヒト血液の可溶性タンパク質要素であることを示唆する。
実施例２．ヘパリンセファロースアフィニティークロマトグラフィーおよびその後の質量分析（ＭＳ）を使用したタンパク質同定により確定されたヒト血漿または２４時間尿ラット試料から、骨形成性ＢＭＰが単離されるはずがない。
血漿採集
１７人の健康な成人（２１〜５０歳）の血液試料は１：９の抗凝固剤対血液比（ｖ／ｖ）を形成するように３．８％クエン酸ナトリウムを含むシリンジ中に採取された。血漿は遠心分離（１５分間、３０００ｘｇ）により得られ、それぞれの成人試料のアリコートを使用して、プールされる血漿保存物が作製された。アリコート試料は分析まで−８０℃で保存された。
尿採集
健康なラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、５ヶ月齢、Ｈａｒｌａｎ Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ，Ｂｏｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の２４時間尿試料は代謝ケージ中で集められた。精製前に、尿はＷｈａｔｍａｎｎ濾紙（大きいポアサイズ）を通して濾過し、大きな粒子を除去した。試料は研究されるまで−８０℃で保存された。
血漿試料のアフィニティーカラム精製
プールされたヒト血漿（３５ｍｌ）は１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）で２倍に希釈され、予め１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）で平衡化された５ｍｌヘパリンセファロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に加えられた。結合タンパク質は１．０Ｍおよび２．０Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）によりカラムから溶出された。
尿ラット試料のアフィニティーカラム精製
２４時間尿ラット試料（２０ｍｌ）は１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）で２倍に希釈され、予め１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）で平衡化された１ｍｌヘパリンセファロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に加えられた。結合タンパク質は１．０Ｍおよび２．０Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）により溶出された。
硫酸アンモニウム沈殿
飽和硫酸アンモニウム（ＳＡＳ）はボルテックス上で、最終濃度３５％（ｗ／ｖ）になるまでタンパク質溶離液に滴下して加えられた。試料は氷上で１０分間保たれ、１２，０００ｘｇで５分間遠心分離された。上清は捨てられ、ペレットはその後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために調製された。ペレットはＳＤＳ−ＰＡＧＥ上を流し、ゲル上のタンパク質は以下に記載のように分析した。
精製したタンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウェスタンブロット分析
ペレットは下記のＬａｅｍｍｌｉの方法に従って、１０％ゲルを使用して標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上を流した。電気泳動後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの一部分はニトロセルロースに移され、他は直接ＣＢＢにより染色された。ニトロセルロース膜は初めにＢＭＰ−７に特異的なマウスモノクローナル抗体（Ｇｅｎｅｒａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）と一緒にインキュベーションし、一晩４℃に保たれた。アルカリ性ホスファターゼ結合‐ヤギ抗マウスが室温で１時間、二次抗体として使用された。膜は５ｍｌの発色性基質により染色された。ゲルの他の部分は標準染色手順（４５％メタノール、１０％酢酸中０．１％ＣＢＢ；室温で３０分間）のもとでＣＢＢにより染色された。
【００８３】
ゲルはＣＢＢによる染色により明らかになったそれぞれのタンパク質バンドに対応する切片に切断された。ゲル切片はその後加工処理され、上記のトリプシン消化ペプチドを分析する方法を使用して、それぞれの切片にどのタンパク質が存在するかを確定した。特にこの研究に関連するこの方法のステップの側面は以下に示される。
インゲルトリプシン消化プロトコル
ＣＢＢで染色されたゲル上のバンドの分子量位置を、ニトロセルロース膜上のそれらの位置と比較し、尿試料の３９ｋＤａ、３５ｋＤａ、および５０ｋＤａのバンド、および血漿試料の３９ｋＤａおよび３５ｋＤａのバンドがＣＢＢ染色されたゲルから切り出された。ゲル片は８分間１００μｌのアセトニトリルにより収縮させた。液体は除去され、ゲル片は１２分間１００μｌの炭酸水素アンモニウムにより再膨潤させ、その後ＳｐｅｅｄＶａｃ中で１０分間乾燥させた。ＤＴＴ、１００μｌが添加され、５７℃で４５分間インキュベーションされた。ゲル片は５７℃で８分間１００μｌのアセトニトリルにより収縮させ、回転分離し、液体を除去した。ヨードアセタミド（１００μｌ）がそれぞれのゲル片に添加され、攪拌せずに暗所中、室温で４５分間インキュベーションされた。トリプシン（１０μｌ）がゲル片毎に添加された。その後ゲル片は回転分離し、１０分間再膨潤させた。試料はサーモミキサー中、３７℃で一晩インキュベーションされた。
ペプチド抽出プロトコル
試料は３７℃サーモミキサーから除去された。アセトニトリル、水、およびギ酸を含む溶液（５０μｌ）が添加された。試料は１５分間超音波処理された。上清は保存チューブに移され、アセトニトリル５０μｌが添加された。抽出物はＳｐｅｅｄＶａｃ中、完全に乾燥するまで（約４０分間）乾燥させた。ペプチドは水、メタノール、およびギ酸を含む溶液１０μｌで再溶解した。試料は５分間超音波処理され、分析まで−２０℃で保存された。
質量分析（ＭＳ）
トリプシン消化されたペプチドは以下のように、液体クロマトグラフィー‐質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により分析した。Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ナノフローＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）はナノ‐エレクトロスプレーＬＣ−ＭＳインターフェース（Ｐｒｏｘｅｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｏｄｅｎｓｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して７−テスラＬＴＱ−ＦＴ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に結合した。ペプチドは手製の７５μｍＣ１８ＨＰＬＣカラム上で分離され、正イオンモードにおいてオンザフライで質量分析された。それぞれの測定サイクルは、フルＭＳスキャン、続いて選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）スキャン、ＭＳ／ＭＳ、および３つの最も強いイオンのＭＳ／ＭＳ／ＭＳスキャンから構成された。これは２ｐｐｍの典型的なペプチド質量精度、ならびにＭＳ／ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ／ＭＳフラグメントイオンからの付加的な配列情報を生み出した。
【００８４】
得られたスペクトルは重心を決められ、Ｍａｓｃｏｔ ｓｅａｒｃｈ ｅｎｇｉｎｅ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してＮＣＢＩｎｒデータベースに対して検索した。検索はトリプシン消化特異性、固定した修飾としてのカルボキシアミドメチル化、および可変性修飾としての酸化されたメチオニンにより行われた。ＭＳおよびＭＳ／ＭＳスペクトルに対して、それぞれ５ｐｐｍおよび０．６Ｄａの質量許容誤差が使用された。
結果
正常な健康個体由来の精製された血清の全分子範囲から、またはラットの尿から単離されたいずれのタンパク質においても、質量分析により、またはウェスタンブロッティングにより真正、骨形成性ＢＭＰは全く検出されなかった。
実施例３．凍結乾燥ヒト血液試料のヌードマウスへの、および自家ラット凍結乾燥血液試料のラットへの移植による異所性骨形成の欠如
血漿採集
血液（５０ｍｌ）は１０人の健康なヒト個体から集められた。血液は遠心分離して細胞を除去し、血清は分析まで−２０℃で保存された。自家血（５ｍｌ）は２週間に５回の間隔で６ヶ月齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから集められた。試料は遠心分離され、血清は分析まで−２０℃で保存された。
ヌードマウスおよびラットへの移植
１００ｍｇの凍結乾燥したヒト血液と２００ｍｇの脱塩したラット骨マトリックス（ＤＢＭ）を混合することによって骨ペレットが１つ形成され、ヌードマウスの背部分に移植された。さらに、２０ｍｇのラットの凍結乾燥した自家血は１００ｍｇのＤＢＭと混合し、血液が採取されたラットと同じラットの脇の下の皮下に移植された。ペレットは移植３週間後に除去され、組織検査のために固定され、加工処理された。
結果
ヌードマウスの皮下に移植された試験血液試料は骨形成に関して陰性であり、血液がマウスおよびラットに異所性骨形成を誘導しうる量の真正骨形成性ＢＭＰを含まないことを示唆した。
実施例４．組換えヒトＢＭＰ−７とは異なり、全身投与されたＢＭＰ−１−１は異所性骨形成アッセイにおいて骨形成を誘導しない。
【００８５】
脱塩された骨マトリックスからなる骨ペレット（１００μｇ）は先に記載（Ｓｉｍｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１：１３５１４（２００６））のように２０匹の成体Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの脇の下の皮下（異所性部位）に移植された。次に１０匹のラットは移植後２〜７日まで２０μｇの組換えヒトＢＭＰ−７を静脈内注射され、一方別の１０匹のラットは類似のスケジュールで組換えヒトＢＭＰ−１−１を移植された。移植２週間後ペレットは除去され、組織評価のために加工処理された。
結果
ＢＭＰ−７を注射されたラットのペレットでは、移植されたＤＢＭへのＢＭＰ−７の結合および先に記載（Ｓｉｍｉｃ ｅｔ ａｌ，上記）の軟骨内骨形成カスケードの誘導を含む機序により軟骨および骨が形成された。対照的に、ＢＭＰ−１−１を全身処置されたラットのペレットでは、軟骨または骨は全く検出されず、ＢＭＰ−１−１が異所性部位では骨を誘導できないことを示唆した。
実施例５．ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー由来のＢＭＰ−イソ型をコードするｃＤＮＡのクローニングおよび配列解析
ＢＭＰ−１−１、ＢＭＰ−１−３、ＢＭＰ−１−４、およびＢＭＰ−１−７のコーディング配列を含むｃＤＮＡは、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）組換えクローニングおよび発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーからクローニングされた。クローンの正確さは標準コロニーＰＣＲおよび制限酵素分析によって確証された。
【００８６】
ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド塩基配列が確定され、対応するアミノ酸配列が推定された。８３ｋＤａＢＭＰ−１−１のアミノ酸配列は配列番号：１に示される。ＢＭＰ−１−３イソ型をコードするｃＤＮＡクローンのヌクレオチド塩基配列は配列番号：３に示され、１１１ｋＤａＢＭＰ−１−３イソ型の対応するアミノ酸配列は配列番号：２に示される。９１ｋＤａＢＭＰ−１−７イソ型のアミノ酸配列は配列番号：７に示される。
【００８７】
この研究においてＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−１−７イソ型のｃＤＮＡクローンに関して確定されたヌクレオチド塩基および対応するアミノ酸配列はＥＭＢＬおよびＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースに存在するものと同一であることが見いだされた。しかし、本明細書で確定されたＢＭＰ−１−３クローンのｃＤＮＡ配列は１ヌクレオチド塩基がＥＭＢＬデータベースのそれとは異なる。とりわけ、ＥＭＢＬ参照配列（配列番号：３）は１４８７位にチミン（Ｔ）塩基を有するが、クローニングされたＢＭＰ−１−３ｃＤＮＡ（配列番号：５）はアデニン（Ａ）を有し、それが今度はＥＭＢＬ配列のＣＴＧ（ロイシン）から我々によって単離されたＢＭＰ−１−３ｃＤＮＡ配列中のＣＡＧ（グルタミン）へのコドン変化を生じる。従って、ＢＭＰ−１−３のＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースのアミノ酸配列（配列番号：２）は４９３位にロイシン残基を含むが、単離されたｃＤＮＡクローンによってコードされる胎盤ＢＭＰ−１−３タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：４）は４９３位にグルタミンを含む。
【００８８】
単離されたｃＤＮＡクローンの胎盤ＢＭＰ−１−３タンパク質に部位特異的変異誘発が実施され、報告された配列（配列番号：３）の塩基１４７８を転換させた、すなわちアデニン（Ａ）からチミン（Ｔ）に交換した。これは発現すると配列番号：２のアミノ酸配列を有する“変換された”ＢＭＰ−１−３タンパク質を生じた。
結果
ライブラリーから単離されたｃＤＮＡクローンから発現される場合、配列番号：４のアミノ酸配列を有する胎盤ＢＭＰ−１−３タンパク質、およびＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースに報告されたアミノ酸配列（配列番号：２）を有する“変換された”ＢＭＰ−１−３タンパク質は共にプロコラーゲンＩ、ＩＩ、およびＩＩＩ型をｉｎ ｖｉｔｒｏで加工処理することにおいて活性であり、“変換された”ＢＭＰ−１−３タンパク質はより低い濃度において活性が高かった。しかし、単離されたｃＤＮＡクローンから発現された胎盤ＢＭＰ−１−３はカルモジュリンおよびＩＶ型コラーゲンを加工処理し、それらの特性は“変換された”ＢＭＰ−１−３タンパク質により示されなかった。従って、クローニングされた胎盤ライブラリーのｃＤＮＡから発現されるＢＭＰ−１−３イソ型は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースにおいて報告されたＢＭＰ−１−３タンパク質とアミノ酸配列および機能的酵素特性の点で異なる。
実施例６．いくつかの特定のＢＭＰ−１イソ型はヒトの異なる疾患の血液中を循環する。
血漿採集
血液試料は、１０人の健康な成人、それぞれが急性膵炎、肝硬変、急性骨折、透析中の慢性腎不全を含む疾患と診断され、それらに対して処置を受けている１０人の患者、およびまれな骨疾患、すなわち進行性骨化性線維形成異常（ＦＯＰ）および骨形成不全（ＯＩ）の４人の患者から採取された。血液試料は１：９の抗凝固剤対血液比（ｖ／ｖ）を形成するように、３．８％クエン酸ナトリウムを含むシリンジ中に採取された。血漿は遠心分離（１５分間、３０００ｘｇ）により得られ、それぞれの血液試料のアリコートを使用してプールされる血漿保存物が作製され、それらは列挙された正常または病的事例のそれぞれを表す。アリコート試料は分析まで−８０℃で保存された。
アフィニティーカラム精製
それぞれの患者群由来のプールされたヒト血漿８０ｍｌは１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）で２倍に希釈され、予め１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）で平衡化された５ｍｌのヘパリンセファロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に加えられた。結合タンパク質は１．０Ｍおよび２．０Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）によりカラムから溶出された。
硫酸アンモニウム沈殿
飽和硫酸アンモニウム（ＳＡＳ）はボルテックス上で、最終濃度３５％（ｗ／ｖ）になるまでタンパク質溶離液に滴下して加えられた。試料は氷上で１０分間保たれ、１２，０００ｘｇで５分間遠心分離された。上清は捨てられ、ペレットはその後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために調製された。
精製したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析
ペレットはＬａｅｍｍｌｉの方法に従って１０％ゲルの標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上を流した。電気泳動後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの一部分はニトロセルロースに移され、他は直接クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）により染色された。
【００８９】
ニトロセルロース膜は初めにＢＭＰ−１カルボキシル末端ドメインに特異的なウサギモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と一緒にインキュベーションされ、一晩４℃に保たれた。アルカリ性ホスファターゼ結合抗ウサギ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＳＡＤ）は室温で１時間、二次抗体として使用された。膜は５ｍｌの発色性基質により染色された。
【００９０】
ゲルの他の部分は標準染色手順（４５％メタノール、１０％酢酸中０．１％ＣＢＢ；室温で３０分間）のもとで染色された。
ゲルはＣＢＢによる染色により明らかなそれぞれのタンパク質バンドに対応する切片に切断された。ゲル片はその後加工処理され、上記のトリプシン消化ペプチドを分析する方法を使用して、それぞれの切片にどんなタンパク質が存在するかを確定した。特にこの研究に関連するこの方法のステップの側面は以下に示される。
インゲルトリプシン消化プロトコル
ゲル片は５７℃で８分間１００μｌのアセトニトリルにより収縮させ、回転分離して、液体を除去した。ゲル片は１２分間１００μｌの炭酸水素アンモニウムにより再膨潤させ、その後ＳｐｅｅｄＶａｃ中で１０分間乾燥させた。ＤＴＴ（１００μｌ）が添加され、５７℃で４５分間インキュベーションされた。ヨードアセタミド（１００μｌ）がそれぞれのゲル片に添加され、攪拌せずに暗所中、室温で４５分間インキュベーションされた。トリプシン（１０μｌ）がゲル片毎に添加され、回転分離して、ゲル片を１０分間再膨潤させた。試料はサーモミキサー中、３７℃で一晩インキュベーションした。
ペプチド抽出プロトコル
試料は３７℃サーモミキサーから除去された。アセトニトリル、水、およびギ酸を含む溶液（５０μｌ）が添加された。試料は１５分間超音波処理された。上清は保存チューブに移され、アセトニトリル（５０μｌ）が添加された。抽出物はＳｐｅｅｄＶａｃ中で完全に乾燥するまで（約４０分間）乾燥させた。ペプチドは水、メタノール、およびギ酸を含む溶液１０μｌで再溶解された。試料は５分間超音波処理され、分析まで−２０℃で保存された。
質量分析
トリプシン消化されたペプチドは以下のように、液体クロマトグラフィー‐質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により分析した。Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ナノフローＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）はナノエレクトロスプレーＬＣ−ＭＳインターフェース（Ｐｒｏｘｅｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｏｄｅｎｓｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して７−テスラＬＴＱ−ＦＴ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に結合した。ペプチドは手製の７５μｍＣ１８ＨＰＬＣカラム上で分離され、正イオンモードにおいてオンザフライで質量分析された。それぞれの測定サイクルは、フルＭＳスキャン、続いて選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）スキャン、ＭＳ／ＭＳ、および３つの最も強いイオンのＭＳ／ＭＳ／ＭＳスキャンから構成された。これは２ｐｐｍの典型的なペプチド質量精度、ならびにＭＳ／ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ／ＭＳフラグメントイオンからの付加的な配列情報を生み出した。
【００９１】
得られたスペクトルは重心を決められ、Ｍａｓｃｏｔ ｓｅａｒｃｈ ｅｎｇｉｎｅ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してＮＣＢＩｎｒデータベースに対して検索した。検索はトリプシン特異性、固定した修飾としてのカルボキシアミドメチル化、および可変性修飾としての酸化されたメチオニンにより行われた。ＭＳおよびＭＳ／ＭＳスペクトルに関して、それぞれ５ｐｐｍおよび０．６Ｄａの質量許容誤差が使用された。
結果
この研究の結果は表１（上記）に示され、そしてそれは通常の健康状態および示された障害に関連する、循環ＢＭＰ−１イソ型のプロファイルを提供する。結果は、ＢＭＰ−１−３イソ型が通常は健康な個体の血液中に存在するが、急性骨折、肝硬変、および急性膵炎の患者における循環からは消失することを示唆する。驚くべきことに、ＦＯＰおよびＯＩ患者ではＢＭＰ−１−３イソ型が依然として存在するが、健康な個体の血液中に観察されるレベルの１０倍より多く存在することが認められた。
【００９２】
急性骨折患者の循環からのＢＭＰ−１−３イソ型の消失は、骨折した骨端の再架橋中の仮骨形成中の骨再生および修復において、ＥＣＭタンパク質を加工処理することにおけるＢＭＰ−１イソ型の潜在的機能を確証する。肝硬変患者の循環からのＢＭＰ−１−３の消失は、肝臓の線維形成変化に関連したプロセスにおける関与を暗示する。急性膵炎では、疾患の病態生理に関与するいくつかのＥＣＭ分子がＥＣＭ分子のプロセッシングにＢＭＰ−１−３を必要とする。
【００９３】
急性膵炎患者の血清は疾患の初期段階、すなわち、膵臓アミラーゼおよびリパーゼのような膵臓酵素の血清における活発な上昇の前に集められた。驚くべきことに、これらの患者の血液は、タンパク質レベルで以前に検出されていないＢＭＰ−１−７イソ型を含んでいた。
【００９４】
ＢＭＰ−１−５イソ型は透析中の慢性腎不全患者においてだけ見いだされ、このことは、たとえば腎性骨ジストロフィーと呼ばれる骨における線維形成プロセスにおける関与のような、この酵素イソ型の特定の機能を暗示する。興味深いことに、これはまた、タンパク質レベルでのＢＭＰ−１−５イソ型の最初の証明である。以前、ＢＭＰ−１−５イソ型は組織ｍＲＮＡ転写物のレベルにおいてだけ推測されていた。
【００９５】
循環中におけるＢＭＰ−１−３イソ型の存在はＧｅｎｅｒａによって開発された特異的ＢＭＰ−１−３抗体を使用したウェスタンブロットによってさらに確証された（データは示されない）。
実施例７．虚血／再潅流前に循環するＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−１−３を阻害することによるラットの虚血性急性腎不全における腎臓機能の保護。
動物
体重約３５０〜４００ｇの雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットは室内で飼育され、水および餌は自由に与えられた。
虚血／再潅流モデル
ラットは１００ｍｇ／ｋｇケタミン、１０ｍｇ／ｋｇキシラジン、および１ｍｇ／ｋｇアセプロマジンで（筋肉内、ｉｍ）麻酔され、３７℃に保たれた加温テーブルに置かれた。正中線切開が行われ、両方の腎茎部は６０分間クランプで留められた。クランプの除去後、予め温められた通常の生理食塩水５ｍｌが腹膜腔に点滴され、切開は縫合された。全部で２４匹の動物が２種の異なる実験群に割り当てられた：
グループ１．対照群（ｎ＝１２）；処置しない虚血／再潅流モデル（生理食塩水ベヒクル、ｐＨ７．２だけを投与）
グループ２．抗体処置群（ｎ＝１２）；虚血／再潅流モデル＋虚血／再潅流前および虚血／再潅流後５日間、１６μｇの抗‐ＢＭＰ−１−１抗体（ｃ＝１μｇ／μｌ）および１６μｇの抗‐ＢＭＰ−１−３抗体（ｃ＝１μｇ／μｌ）。
【００９６】
血液試料は閉塞前および再潅流後０、２４、７２、９６、１２０、および１６８時間に得られた。血漿は遠心分離によって分けられ、腎臓機能パラメータが測定された。ラットは再潅流後７日目に屠殺され、腎臓は組織構造分析のために摘出された。治療は予防的様式で、クランピング２時間前、次にクランプから開放後５日間適用された。
腎臓機能の査定
血液試料（０．５ｍｌ）は虚血後０、２４、７２、９６、１２０、および１６８時間において眼窩静脈叢から得られた。先に記載のように（Ｖｕｋｉｃｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０２：２０２−２１４（１９９８））、血清クレアチニンはＪａｆｆｅ法（アルカリ性ピクリン酸）により測定され、そして血中尿素窒素（ＢＵＮ）は酵素的グルタメートデヒドロゲナーゼ‐ＵＶ手順により測定された。累積的生存率は対照および実験ラットの両方に関して観察され、記録された。
腎臓の形態
組織構造検査のために腎臓は２％パラホルムアルデヒドで固定され、７μｍパラフィン片が切り出され、ヘマトキシリンエオジンで染色された。尿細管拡張および／または萎縮、間質性線維症および炎症性細胞浸潤物として定義される尿細管間質損傷、ならびに腎糸球体傷害は先に記載（Ｖｕｋｉｃｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，同上）の以下の基準に従って、０〜４までの半定量的スケールを使用して等級付けされた：０＝無変化；１＝試料の１〜２５％を含む限局性変化；２＝試料の２６〜５０％に影響を与える変化；３＝試料の５１〜７５％を含む変化；および４＝試料の７５％より多くに影響を与える病変。２人の独立した観察者が盲検により組織構造の研究を行った。
結果
無処理対照群のラット（グループ１、抗体処置をしない）および処置群のラット（グループ２、ＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−１−３に対する抗体）由来の血液中のクレアチニンレベルは図１に示される。対照ラットでは、手順後生き延びた動物において、両腎臓の６０分間クランピング、続く再潅流後に、クレアチニン（図１、斜線の付いた棒）およびＢＵＮ（示されない）は急に上昇し、虚血後２４時間（１日）および７２時間（３日）において高いままであり、その後７日目に正常化した。虚血前および虚血後５日間ＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−１−３に対する抗体が投与された（グループ２）場合、クレアチニン（図１、縞模様の棒）およびＢＵＮ（示されない）値は低いままであった。生存率は対照群のラットで３５％、虚血前および虚血後５日間ＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−１−３に対する抗体で処置されたラットでは５５％であった。組織構造スライド（図２）で観察されるように、抗体処置をしないで、虚血／再潅流に曝された対照群ラットの腎臓は、腎臓面積の７５％を越えて構造完全性を失い、近位および遠位尿細管が拡張し、尿細管上皮を失い、そして全腎臓面積の約３０％が壊死に起因する線維形成治癒を経験していた（図２、パネル２Ａを参照されたい）。対照的に、虚血／再潅流損傷前にＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−１−３に対する抗体を与えられたラット腎臓組織の切片は腎臓構造の際立った保存を示した（図２、パネル２Ｂを参照されたい）。
【００９７】
これらの結果は、他の状況では虚血／再潅流事象の結果として発生することになる腎臓構造に対する傷害の重症度が、虚血／再潅流事象の前にＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−１−３に対する中和抗体の全身投与の処方によって妨げられうることを示す。
実施例８．ラットにおける虚血性急性腎不全後のＢＭＰ−１イソ型の全身投与により高められた生存。
動物
体重約３００ｇ〜４００ｇの雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットは室内で飼育され、水と餌は自由に与えられた。
虚血／再潅流モデル
ラットは１００ｍｇ／ｋｇケタミン、１０ｍｇ／ｋｇキシラジン、および１ｍｇ／ｋｇアセプロマジンで（ｉｍ）麻酔され、３７℃に保たれた加温テーブルに置かれた。正中線切開を行い、両方の腎茎部は６０分間クランプで留められた。クランプの除去後、予め温められた通常の生理食塩水５ｍｌが腹膜腔に点滴され、切開は縫合された。全部で２４匹の動物が４種の異なる実験群に割り当てられた：
グループ１．陰性対照群（ｎ＝１２）；処置しない虚血／再潅流モデル。
【００９８】
グループ２．陽性対照群（（“ＢＭＰ−７”）（ｎ＝８）；１００μｇ／ｋｇのＢＭＰ−７を５日間。
グループ３．ＢＭＰ−１−１処置群（“ＢＭＰ−１−１”）（ｎ＝８）；４μｇのＢＭＰ−１−１（ｃ＝０．２μｇ／ｋｇ）を５日間。
【００９９】
グループ４．ＢＭＰ−１−１抗体処置群（“ＢＭＰ−１ Ａｂ”）（ｎ＝８）；クランプ開放後（虚血／再潅流事象後）１６μｇの抗ＢＭＰ−１−１抗体（ｃ＝１μｇ／μｌ））を５日間。
【０１００】
血液試料は閉塞前および再潅流後０、２４、７２、９６、１２０、および１６８時間に得られた。血漿は遠心分離によって分けられた。これらの試料は腎臓機能パラメータ測定のために使用された。ラットは再潅流後７日目に屠殺され、腎臓は組織構造分析のために摘出された。処置はクランピング後、およびその後５日間適用された。
腎臓機能の査定
血液試料（０．５ｍｌ）は虚血後０、２４、７２、９６、１２０、および１６８時間において眼窩静脈叢から得られた。先に記載のように、血清クレアチニンはＪａｆｆｅ法（アルカリ性ピクリン酸）により測定され、血中尿素窒素（ＢＵＮ）は酵素的グルタメートデヒドロゲナーゼ‐ＵＶ手順により測定された。累積的生存率は対照および実験ラットの両方に対して観察され、記録された。
結果
種々の処置群のラットの生存は図３に示される。陰性対照群（グループ１、無処置）では、両腎臓の６０分間クランピング、続く再潅流後に、クレアチニンおよびＢＵＮのレベルは急に上昇し（示されない）、６０％より多い動物が生き延びられなかった（図３を参照されたい、◆のデータ点）。再潅流後すぐのＢＭＰ−１−１の投与（“ＢＭＰ−１−１”群）は死亡率を著しく減少させ、無処置の陰性対照群の４０％生存率と比較して８０％の生存率を維持した（図３を参照されたい、▲のデータ点）。
【０１０１】
ＢＭＰ−１−１処置ラットでは、血清クレアチニンレベルは２および３日目では高いが、４日目に急に減少し（データは示さない）、そのことはおそらく血栓形成部分における細胞外マトリックスの迅速なプロセッシングおよび壊死後線維形成組織の蓄積のために顕著な壊死を妨げる構造要素の比較的速やかな回復に起因する。クランプ除去後のＢＭＰ−１−１抗体（“ＢＭＰ−１ Ａｂ”）の５日間投与（図３を参照されたい、ｘ印データ点）は高い死亡率を妨げることにおいて有効ではなかった（すなわち、無処置対照群でも見られるように、７日目において４０％もの低い生存率）。
【０１０２】
この実験結果は、虚血性急性腎不全後の組換えＢＭＰ−１イソ型の投与が腎臓に対する構造傷害を減らすことおよび影響を受けた個体の生存率を増すことに有効であることを示唆する。
実施例９．ＢＭＰ−１イソ型を阻害することによるラット慢性腎不全（ＣＲＦ）の進行の遅延。
動物
体重約３００ｇ〜４００ｇの雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットは室内で飼育され、水と餌は自由に与えられた。
ＣＲＦの５／６腎臓切除（Ｎｘ）モデル
ラットは１００ｍｇ／ｋｇケタミン、１０ｍｇ／ｋｇキシラジン、および１ｍｇ／ｋｇアセプロマジン（ｉｍ）で麻酔され、３７℃に保たれた加温テーブルに置かれた。正中線切開が行われ、両方の腎茎部は６０分間クランプで留められた。左腎臓が除去され、ラットは１週間回復期間を与えられた。その後、右腎臓塊の５／６が除去され、ラットは２週間回復期間を与えられた。全部で８８匹の動物が４種の異なる実験群に割り当てられた：
グループ１．対照群（ｎ＝１２）；生理的ベヒクル溶液を与えられた５／６Ｎｘラット。
【０１０３】
グループ２．ＢＭＰ−１−１抗体群（ｎ＝１２）；Ｎｘ＋１２週間、週に１度１６μｇのＢＭＰ−１−１抗体（ｃ＝１μｇ／μｌ）。
グループ３．ＢＭＰ−１−３抗体群（ｎ＝１２）；Ｎｘ＋１２週間、週に１度１６μｇのＢＭＰ−１−３抗体（ｃ＝１μｇ／μｌ）。
【０１０４】
グループ４．ＢＭＰ−１−１＋ＢＭＰ−１−３抗体群（ｎ＝１２）；Ｎｘ＋１２週間、週に１度１６μｇのＢＭＰ−１−１抗体（ｃ＝１μｇ／μｌ）および１２週間、週に１度１６μｇのＢＭＰ−１−３抗体（ｃ＝１μｇ／μｌ）。
【０１０５】
血液試料は手術前、および実験期間中週に１回得た。ラットは、右腎臓塊の除去後１２週間目に屠殺された。処置は１２週間、週に１回静脈内（ｉｖ）に適用された。
腎臓機能の査定
血液試料（０．５ｍｌ）は眼窩静脈叢から週に１回得られた。血清クレアチニンはＪａｆｆｅ法（アルカリ性ピクリン酸）により測定され、血中尿素窒素（ＢＵＮ）は先に記載（Ｖｕｋｉｃｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，同上）のように、酵素的グルタメートデヒドロゲナーゼ‐ＵＶ手順により測定された。累積的生存率は対照および実験ラットの両方に対して観察され、記録された。
腎臓形態
組織構造検査のために腎臓は２％パラホルムアルデヒドで固定され、７μｍパラフィン片が切り出され、ヘマトキシリンエオジンで染色された。腎臓傷害は（Ｂｏｒｏｖｅｃｋｉ ｅｔ ａＩ．，Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｂｏｎｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ，Ｖｕｋｉｃｅｖｉｃ Ｓ．ａｎｄ Ｓａｍｐａｔｈ Ｋ．Ｔ．編，２００２）に記載のように等級付けられた。手短に述べると、自動コンピュータプログラムを使用して、糸球体、尿細管の構造、および間質線維形成の量が腎臓部分で測定された。測定されたパラメータは、正常な糸球体の数と傷害を受けた糸球体の数の対比として、および線維形成により変化した腎臓部分の割合として表現された。
結果
１２週間の処置後、ベヒクル溶液だけを与えられた対照ラット（グループ１）は３００ｍＥｑ／Ｌより多いクレアチニン値を有した。単一抗体、すなわちＢＭＰ−１−１に対する抗体（グループ２）もしくはＢＭＰ−１−３に対する抗体（グループ３）により、または両方の抗体の組み合わせにより処置された動物は、対照ラットに比較して有意に低い血清クレアチニン値を有した。とりわけ、抗‐ＢＭＰ−１−１抗体（グループ２）または抗‐ＢＭＰ−１−３抗体（グループ３）により処置されたラットは対照ラットよりそれぞれ３６％、および３９％低い血清クレアチニン値を有した。抗‐ＢＭＰ−１−１および抗‐ＢＭＰ−１−３抗体両方の組み合わせにより処置されたラットでは、血清クレアチニン値は対照ラットより５４％低かった。両方の抗体の組み合わせにより処置された動物では（グループ４）では、線維形成面積は対照ラットに比較して５７％減少したが、抗‐ＢＭＰ−１−１抗体だけ（グループ２）、または抗‐ＢＭＰ−１−３抗体だけで処置されたラットでは、線維形成面積はそれぞれ２３％および１６％減少した。その上、線維形成面積は、陽性対照であるＢＭＰ−７により処置されたラットに比較して両方の抗体の組み合わせにより処置されたラットでは４３％減少した。
【０１０６】
これらの結果は、慢性腎不全（ＣＲＦ）のモデルでは、ＢＭＰ−１−１とＢＭＰ−１−３の阻害が、糸球体の構造完全性を維持し、線維形成組織の蓄積を妨害し、そうしてＣＲＦ後１２週間に約５０％の腎臓機能を改善することによって疾患の進行を遅延させたことを示唆する。これはヒトの寿命を約１２０ヶ月または約１０年増すことに関連する。
実施例１０．全身投与されたＢＭＰ−１−１による骨折修復の促進および同所性骨折におけるＢＭＰ−１−１の局在。
動物および実験プロトコル
５４匹のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雌ラットがこの研究で使用された。動物は体重約３００グラム（ｇ）であった。それらは研究中、標準条件（２４℃、１２時間／１２時間明暗周期）下、２０ｘ３２ｘ２０ｃｍケージで飼育され、水およびペレット状の市販の餌（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ， Ｂｏｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を自由摂取させた。ラットは３種の処置群および２種の対照群に分けられた。
【０１０７】
グループ１．対照ラット（１０）は外科的に生み出された骨折後、Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒワイアで処置され、その後ベヒクル溶液（生理食塩水、ｐＨ７．２）だけで全身処置された。
【０１０８】
グループ２．ラットは１週間ＢＭＰ−１−１（１０μｇ／ｋｇ）で処置された。１０匹のラットは大腿骨骨折後、Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒワイアで処置され、その後ＢＭＰ−１−１を静脈内に処置された。
【０１０９】
グループ３．ラットは３週間ＢＭＰ−１−１（１０μｇ／ｋｇ）で処置された。１０匹のラットは大腿骨骨折後、Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒワイアで処置され、その後ＢＭＰ−１−１を静脈内に処置された。
【０１１０】
グループ４．ラットは５週間ＢＭＰ−１−１（１０μｇ／ｋｇ）で処置された。１０匹のラットは大腿骨骨折後、Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒワイアで処置され、その後ＢＭＰ−１−１を静脈内に処置した。
【０１１１】
グループ５．陽性対照。１０匹のラットは大腿骨骨折後、Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒワイアで処置され、その後１００μｇ／ｋｇのＢＭＰ−７を５週間、全身的に注射された。
麻酔されたラットは下肢の毛を剃り、消毒することにより手術の準備をされた。中央の膝蓋骨周辺の切開により、膝蓋骨は側面から関節を外され、大腿骨顆が曝された。Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒワイア（直径１．１ｍｍ、長さ２．７ｃｍ）は顆間ノッチを通って骨髄内管状構造に通された。Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒワイアは膝関節に突き出ず、膝蓋骨の動きも妨害しなかった。膝関節を閉じた後、ピンで留めた右大腿骨の骨幹中央はＢｏｎａｒｅｎｓ ａｎｄ Ｅｉｎｈｏｒｎ（Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．，９７：１０１（１９８４）に記載のように、曲げ力を適用することにより折られた。手術後すぐに放射線写真が得られ、骨幹中央の骨折だけがこの研究に含まれるように、近位または遠位骨折を起こしたラットはこの実験から排除された。
【０１１２】
すべての動物は処置７週間後に屠殺された。放射線写真は手術後１および７週間目に２つの面：ＡＰ（前後）およびＬＬ（側面（ｌａｔｅｒｏ−ｌａｔｅｒａｌ））から撮られた。
１２５Ｉ‐標識ＢＭＰ−１−１（１２５Ｉ‐ＢＭＰ−１−１）の生体内分布および薬物動態学
組換えヒトＢＭＰ−１−１は改変したラクトペルオキシダーゼ法を使用して、５ｍＣｉのキャリア‐フリーＮａ１２５Ｉにより放射ヨウ素化された。ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラムでのゲル濾過を使用して遊離ヨウ化物と放射ヨウ素化されたＢＭＰ−１−１（１２５ＩＢＭＰ−１−１）が分離された。カラムは０．２％Ｔｗｅｅｎ−８０および０．１％卵白アルブミンを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．５で溶出した。この研究で使用された１２５Ｉ‐ＢＭＰ−１−１調製物の比活性は０．２７３ｍＣｉ／ｍｇであった。ラット（ｎ＝１０）は用量レベル１０μｇ／ｋｇ、活性２０μＣｉの１２５Ｉ‐ＢＭＰ−１−１を単回注射された。注射容量は５００μｌであった。動物は注射後３０分、１、３、６および２４時間に屠殺された。組織は取り除かれ、重さを量られ、放射活性はガンマカウンターで測定された。ある期間の組織による１２５Ｉ‐ＢＭＰ−１の相対取り込みは１２５Ｉ‐ＢＭＰ−１ナノグラム（ｎｇ）／グラム（ｇ）組織湿重量として表された。実験はまた、５匹のラットにおいて、大腿骨の外科的骨切り術後５日目の急性骨折大腿骨により実施された。
ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏでのＤＸＡによる骨塩密度（ＢＭＤ）測定
２週間のインタバルで（１０週間の間）、動物は二重エネルギーＸ線吸収法（ＤＸＡ；Ｈｏｌｏｇｉｃ ＱＤＲ−４０００，Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）による骨密度測定をスキャンされた。実験の終わりに、動物は麻酔され、体重測定され、安楽死させられた。右大腿骨は取り除かれ、７０％エタノールで固定され、Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｓｃａｎソフトウェアを備えたＤＸＡによる骨塩含有量（ＢＭＣ）およびＢＭＤの確定に使用された。スキャン領域サイズは５．０８ｘ１．９０２ｃｍであり、解像度は０．０２５４ｘ０．０１２７であり、そしてスピードは７．２５ｍｍ／ｓであった。スキャン画像が骨面積、骨塩含有量、および全骨の骨密度に対して分析された。
ＰＱＣＴ
単離された大腿骨は、ソフトウェアバージョン５．４０の付いた末梢骨定量的コンピュータトモグラフィー（ＰＱＣＴ）Ｘ線装置（Ｓｔｒａｔｅｃ ＸＣＴ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍ；Ｎｏｒｌａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｒｔ Ａｔｋｉｎｓｏｎ，ＷＩ）によりスキャンされた。容積、密度、および総骨面積、骨梁、および皮質領域が確定された。
マイクロＣＴ
マイクロコンピュータトモグラフィー（マイクロＣＴ）装置（μＣＴ４０）およびこれらの実験で使用される分析ソフトウェアはＳＣＡＮＣＯ Ｍｅｄｉｃａｌ ＡＧ（Ｂａｓｓｅｒｓｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から得られた。右大腿骨は背腹方向にそれぞれ１３μｍの厚さの２５０切片をスキャンした。骨の三次元再構築は三角形分割アルゴリズムを使用して実施された。骨梁容積（ＢＶ、ｍｍ３）、骨梁数（Ｔｂ．Ｎ、１／ｍｍ）、骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ、μｍ）、および骨梁離断性（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）（Ｔｂ．Ｓｐ．μｍ）はＨｉｌｄｅｂｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．（Ｃｏｍｐ．Ｍｅｔｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．，１：１５（１９９９）により記載された方法を使用して３‐次元（３Ｄ）画像上で直接測定した。骨梁骨パターン因子（ＴＢＰｆ）および構造モデルインデックス（ＳＭＩ）は提供されたソフトウェアを使用してマイクロＣＴ装置により計算した。
組織構造
大腿骨は組織構造分析のために取り除かれ、パラフィンに包埋され、１０μｍの切片に切り出されて、ヘマラウン（ｈｅｍａｌａｕｎ）‐エオジンおよびトルイジンブルーにより染色された。
結果
放射性標識されたＢＭＰ−１−１は健康なラットおよび大腿骨骨折ラットに静脈内注射された。健康な動物では、放射性ＢＭＰ−１−１は主に肝臓（２３％）、骨（３１％）、および筋肉（９％）に蓄積した。骨折ラットでは、注射されたＢＭＰ−１−１の８０％は骨折部位に蓄積した。
【０１１３】
ＢＭＰ−１−１を１週間毎日静脈内注射されたラットは、４３％加速された骨再生を示し、その値は先に記載（Ｐａｒａｌｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：６７３６（２００３））のように、骨修復のスコアリングシステムに基づいて計算された。形成された仮骨は１週間ＢＭＰ−１を処置されたラットでは４３％大きく、３〜５週間ＢＭＰ−１を処置されたラットでは６３％および７１％増大した。骨治癒は、ラット大腿骨の３つまたは４つの皮質の完全な再架橋により明らかなように、１または５週間ＢＭＰ−１で処置されたラットではそれぞれ４０〜８０％加速された。
【０１１４】
ｉｎ ｖｉｖｏ骨塩密度測定は、形成された仮骨における塩蓄積増加を示したが、ＰＱＣＴ分析は骨折した大腿骨上の塩蓄積増加を示した。マイクロＣＴ測定は外科的骨切り術後７週間目に、骨折再生中に新規に形成された骨梁の蓄積増加を示した。
【０１１５】
ラットにおけるこの急性大腿骨骨折の研究のこれらの結果は、ほとんど大部分（たとえば約８０％）の全身投与されたＢＭＰ−１が骨折の同所性部位に局在すること、および全身投与されたＢＭＰ−１−１はそのような急性大腿骨骨折の治癒促進に有効であることを総合的に示唆する。
実施例１１．大腿骨骨折ラットに全身投与されたＢＭＰ−１−１
先の実施例１０に類似の手順を利用して、ラットの大腿骨骨折の治癒に関する、ＢＭＰ−１−１イソ型、ＢＭＰ−７およびＢＭＰ−１−１イソ型に対する抗体の全身投与の効果を比較する研究が行われた。
【０１１６】
骨折後４週間目に、ＢＭＰ−１イソ型を全身処置されたラットの骨折部位における仮骨は、無処置対照ラットのそれより約２０％大きく、ＢＭＰ−７で全身処置されたラットより９０％大きかった。
【０１１７】
骨折後８週間目の結果は図４に示される。骨折部分は図４Ａ〜４Ｆの大腿骨写真のそれぞれにおいて丸で囲まれる。大腿骨骨折ラットへのＢＭＰ−１−１の全身投与は、ＢＭＰ−７の全身投与に比較して治癒が促進された。骨折線はほとんど消失していて、皮質骨はＢＭＰ−１−１を全身処置されたラットでは再架橋されていた（図４の骨４Ａおよび４Ｄを参照されたい）が、ＢＭＰ−７で全身処置されたラットでは骨折線は依然として肉眼で見られた（図４の骨４Ｂ、４Ｃ、および４Ｅを参照されたい）。ＢＭＰ−１−１に対する中和抗体の全身投与は骨折治癒を遅延させた（図４の骨４Ｆを参照されたい）。
【０１１８】
結果は、ＢＭＰ−１イソ型の全身投与は骨欠損処置のための有効な方法であることを示唆する。
実施例１２．大腿骨骨折ラットに局所投与されたＢＭＰ−１−１
骨折の動物モデル
２４匹の３ヶ月齢Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄ラット（３５０ｇ）は大腿骨骨折後、Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒワイアで処置された。ラットは以下の３種の処置群に分けられた：
グループ１．対照ラット（８）はベヒクル溶液（生理食塩水；ＢＭＰ−１−１もＢＭＰ−７も含まない）だけを含む全（自家）血‐由来凝血物デバイスにより処置された。
【０１１９】
グループ２．ラットはＢＭＰ−１（１０μｇ／ｋｇのＢＭＰ−１−１）を含む全血‐由来凝血物デバイスにより局所的に処置された。
グループ３．ＢＭＰ−７（１０μｇ／ｋｇ）を含む全血‐由来凝血物デバイスにより処置された。
【０１２０】
すべての動物は手術後７週間目に屠殺された。放射線写真は１、４および７週間目に２つの面、すなわちＡＰ（前後）およびＬＬ（側面（ｌａｔｅｒｏ−ｌａｔｅｒａｌ））から撮られた。
【０１２１】
麻酔されたラットは下肢の毛を剃り、消毒することにより手術の準備をされた。中央の膝蓋骨周辺の切開により、膝蓋骨は側面から関節を外され、大腿骨顆が曝された。Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒワイア（直径１．１ｍｍ、長さ２．７ｃｍ）は顆間ノッチを通って骨髄内管状構造に通された。Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒワイアは膝関節に突き出ず、膝蓋骨の動きも妨害しなかった。膝関節を閉じた後、ピンで留めた右大腿骨の骨幹中央はＢｏｎａｒｅｎｓ ａｎｄ Ｅｉｎｈｏｒｎ（Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．，９７：１０１（１９８４））に記載のように、曲げ力を適用することにより折られた。手術後すぐに放射線写真が得られ、骨幹中央の骨折だけがこの研究に含まれるように、近位または遠位骨折を起こしたラットはこの実験から排除された。
ＢＭＰ−１を含む全血‐由来凝血物デバイスの調製
骨折を処置するための全血‐由来凝血物デバイス（ＷＢＣＤ）がラット大腿骨の骨折を処置するために調製された。手短に述べると、１ｍｌの自家全血がそれぞれのラットの眼窩叢から採取された。次に全血はトロンビン‐フィブリン試薬、１Ｍ外因性塩化カルシウム、および示された量のＢＭＰ−１−１またはＢＭＰ−７と合わせ、その後室温で３０〜４５分間インキュベーションし、対応する自家血を提供したラットの骨折した大腿骨への移植前の凝血物形成を可能にした。
生化学的試験
両側の大腿骨は、先に記載（Ｓｉｍｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１：１３４７２（２００６））の３点曲げ試験を含む、生化学的試験のために取り除かれた。反対側の健康な骨が陽性対照として使用された。皮質骨と骨梁の両方の生化学的特徴測定のための３点曲げ試験および圧子圧入試験が使用された。
結果
Ｘ線放射線写真分析は、手術後４週間において対照としてベヒクル溶液（ＢＭＰ−１−１、およびＢＭＰ−７を全く含まない）だけを含むＷＢＣＤで処置されたラットでは、０．６±０．０３皮質が治癒したが、手術後７週間において１．８±０．４の皮質が治癒したことを示した。仮骨面積は４週間で２４．３±７．８ｍｍ２であり、７週間では１８．７±６．４ｍｍ２であった。
【０１２２】
全血‐由来凝血物デバイス＋ＢＭＰ−１−１で処置されたラットでは、４週間で１．３±０．５（ｔ−検定、対照に対してＰ＞０．０１）皮質が治癒し、一方７週間では２．９±０．９（ｔ−検定、Ｐ＞０．０１）皮質が治癒した。仮骨面積は１３．４±４．７ｍｍ２（ｔ−検定、対照に対してＰ＞０．０１）であり、７週間ではそれは７．６±３．８ｍｍ２（ｔ−検定、対照に対してＰ＞０．０５）であった。
【０１２３】
ＷＢＣＤ＋ＢＭＰ−７で処置されたラットでは、４週間で１．７±０．７（ｔ−検定、対照に対してＰ＞０．０１およびＢＭＰ−１に対してＰ＞０．１）の皮質が治癒したが、７週間では３．２±１．４（ｔ−検定、対照に対してＰ＞０．０１およびＢＭＰ−１に対してＰ＞０．１）の皮質が治癒した。仮骨面積は１１．３±３．９ｍｍ２（ｔ−検定、対照に対してＰ＞０．０１およびＢＭＰ−１に対してＰ＞０．１）であり、７週間ではそれは６．７±２．９ｍｍ２（ｔ−検定、対照に対してＰ＞０．０５およびＢＭＰ−１に対してＰ＞０．１）であった。
【０１２４】
これらの結果は、大腿骨骨折修復のモデルの同所性部位（欠損部位）において局所投与されたＢＭＰ−１−１は、対照ラットに比較して骨折治癒を有意に促進したことを示唆する。驚くべきことに、組成物中でＢＭＰ−７がＷＢＣＤと一緒に使用された場合、大腿骨は対照ラットより早く治癒するが、ＥＣＭプロセッシング酵素であるＢＭＰ−１−１で処置された動物とは差がなかった。ＢＭＰ−７は、商業的に、キャリアとしてのウシコラーゲンと一緒に使用される。骨修復の類似のモデルにおいて単独で移植されたウシコラーゲンは無処置対照ラットと比較して骨修復を阻害する。
生化学的試験
３点曲げ試験は、ＢＭＰ−１−１処置大腿骨は全血‐由来凝血物デバイスだけ（ＢＭＰ−１−１なし）により処置された対照大腿骨に比較して、再骨折するには有意に大きな最大荷重が必要であることを示唆した（以下の表２を参照されたい）。向かい側の脚の大腿骨（反対側大腿骨）と比較して、ＢＭＰ−１−１により処置された骨は再骨折を引き起こすために必要な荷重は２６％少なかったが；対照骨が再骨折するために必要な荷重は正常な反対側骨より５１％少なかった（表２を参照されたい）。
【０１２５】
ＢＭＰ−７で処置された骨を破壊するために必要な最大荷重はＢＭＰ−１−１により処置されたものと統計的に差がなかった。これらの結果は、ＢＭＰ−１−１がラットモデルにおける急性骨折の骨修復および再生を促進すること、および全血‐由来凝血物デバイスと一緒に使用される場合、それはＢＭＰ−７と同様に効果的であることを総合的に示唆する放射線写真による発見を確証した。骨梁の圧子圧入試験は、ＢＭＰ−１−１処置骨は対照動物より骨梁がいっそう多かったことを示唆する（表３を参照されたい）。
【０１２６】
【表２】
【０１２７】
【表３】
【０１２８】
実施例１３．ＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−１−３により処置された、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養したラット頭蓋冠移植片培養物の培地へのＢＭＰ−４およびＢＭＰ−７の遊離
１８日齢のラット胎児は妊娠ラットから得られ、それらの頭蓋冠は単離され、消毒され、等しいサイズに合わせ、先に記載（Ｖｕｋｉｃｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８７９３（１９８９））のように、骨特異的培地を含む培養物中に配置された。そのような頭蓋冠移植片培養物は骨細胞および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を生じる。培養４８時間後に、移植された頭蓋冠は３日間毎日、１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−１−１または１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−１−３により処置された。培地は毎日集められ、−２０℃で保存され、４日目にヘパリンカラムで精製された。ヘパリンカラムで精製後、タンパク質濃度が決定され、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、およびＢＭＰ−７が先に記載（Ｓｉｍｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８６：１３４７２（２００６））のように、イムノブロッティングにより検出された。
【０１２９】
結果は、対照培養物の培地では検出可能な量の真正骨形成性ＢＭＰは全く見いだされず、一方、ＢＭＰ−１−１で処置された頭蓋冠の培地ではＢＭＰ−４の成熟ドメインが検出されたがＢＭＰ−２、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７は検出されなかったことを示唆した。これらの結果は、ＢＭＰ−１−１が骨細胞、および保存される真正ＢＭＰ分子の保存場所としての役割を果たすと考えられるＥＣＭに富む胎児頭蓋冠からなる培養移植片からのＢＭＰ−４の遊離に効果を有することを示唆する（Ｍａｒｔｉｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｃｙｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｌ．，１：２３（２００６）も参照されたい）。ＢＭＰ−４に加え、ＢＭＰ−１−３で処置された培養物培地ではＢＭＰ−７が検出され、ＢＭＰ−１−３がＢＭＰ−１−１より多くの真正ＢＭＰを遊離することを示唆する。
実施例１４．ＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−７により局所的に処置されたウサギにおける骨欠損治癒の相乗的促進
動物
尺骨分節‐欠損モデルを使用して、成体雄Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅウサギ（体重３ｋｇ〜４ｋｇ）における骨治癒が評価された。移植片は、異なる量の組換えヒト成熟ＢＭＰ−１−１および組換えヒト成熟ＢＭＰ−７が添加された、キャリアとしての血液凝血物（Ｇｅｎｅｒａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から構成された。これらの動物は凝血物移植片だけを与えられた動物（陰性対照）と比較された。ウサギは手術前１週間、駆虫薬で処置された。動物はまた、手術前および手術後１０日間エンロフロキサシンを筋肉内注射により投与された。
【０１３０】
麻酔および鎮痛下のウサギを用い、前肢１本は毛を剃られ、滅菌的に用意されて、布で覆われた。約２．５センチメートルの長さで側面から切開され、尺骨を覆う組織が切断された。振動鋸により尺骨の中心に、１．５センチメートルの分節性骨膜欠損が作製された。橈骨は物理的安定性に対して完全なまま残され、内部または外部固定デバイスは全く使用されなかった。生理食塩水で十分に洗浄して骨破片および漏れ出た骨髄細胞を除去した後、移植片は適所に注意深く詰められて欠損を充填した。その後凝血物に血清が載せられた。軟組織は移植片を含むように層状に重ねて、慎重に閉じられた。動物は、耐荷重活動、水、およびウサギ用の餌を完全に許可された。
ＷＢＣＤ調製
血液試料は、手術１日前にウサギ片縁耳静脈から抗凝固物質を使用せずに１．５ｍＬ用量を試験管に集められた。ＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−７はそれぞれ１４μｇおよび１００μｇの量で血液に添加された。血液試料は４℃に放置し、凝固させた。翌日、試料は８０００ｘｇ、５分間遠心分離された。液体部分（血清）は除去され、保存され、凝血物は使用のために準備された。
【０１３１】
ウサギは以下に挙げたグループの１つに分けられ、欠損は以下のように処置された：
グループ１．ＢＭＰまたはＢＭＰ−１イソ型無しに全血凝血物デバイス（ＷＢＣＤ）だけで処置された対照ウサギ（ｎ＝８）。
【０１３２】
グループ２．１４μｇ／１．５ｍＬのＢＭＰ−１−１を含むＷＢＣＤで処置されたウサギ。
グループ３．１００μｇ／１．５ｍＬのＢＭＰ−７を含むＷＢＣＤで処置されたウサギ。
【０１３３】
グループ４．１４μｇ／１．５ｍＬのＢＭＰ−１−１＋１００μｇのＢＭＰ−７／１．５ｍＬを含むＷＢＣＤで処置されたウサギ。
結果
結果は図５〜８に示される。２週間に１度のＸ線による追跡調査から観察されるように、ウサギ尺骨欠損はＷＢＣＤだけ（ＢＭＰ−１−１、およびＢＭＰ−７を全く含まない）で処置された対照ウサギでは治癒しなかった。対照グループの６週間後の代表的な骨において治癒されない欠損は図５Ａおよび５Ｂ（同じ骨の２つの写真）に示される。
【０１３４】
ＢＭＰ−１−１を含むＷＢＣＤで局所的に処置されたウサギ（グループ２）の代表的な骨における６週間後の結果は、図６Ａおよび６Ｂに示される。ＢＭＰ−７を含むＷＢＣＤにより局所的に処置されたウサギ（グループ３）の代表的な骨における６週間後の結果は、図７Ａおよび７Ｂに示される。ＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−７を含むＷＢＣＤにより局所的に処置されたウサギ（グループ３）の代表的な骨における６週間後の結果は、図８Ａおよび８Ｂに示される。ＢＭＰ−７を含むＷＢＣＤで処置されたウサギ（グループ３）は手術後８週間で骨欠損が再架橋されるが、ＢＭＰ−１−１を含むＷＢＣＤ（グループ２）で処置されたウサギは２週間で早くも初期の骨形成、そして手術後８週間で進行した治癒を示した。しかし、ＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−７両方の組み合わせを有するＷＢＣＤにより局所的に処置されたウサギ（グループ４）は、欠損の完全な再架橋、および新規な皮質の形成を伴う尺骨の相乗的治癒を有し、６週間で早くも新規に形成された骨が顕著にリモデリングされた（図８Ａおよび８Ｂを参照されたい）。
【０１３５】
これらの結果は骨折の同所性部位に局所的に適用されたＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−７は相乗的に作用して骨再生を促進することを示唆する。
上記のテキスト中に引用されるすべての特許、出願および刊行物は参照として本明細書に援用される。
【０１３６】
発明の開示または以下の特許請求の範囲から逸脱しない、本明細書に記載の発明の他のバリエーションおよび態様は今や当業者には明らかであろう。
【技術分野】
【０００１】
関連する出願
本出願は２００６年７月２１日に出願された、米国仮出願第６０／８３２，３２５号に対する優先権を主張する。
技術分野
本発明は、組織欠損および障害の診断および再生の分野に属する。とりわけ、本発明は組織欠損および障害を診断し、処置するためのＢＭＰ−１のイソ型を含む組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
骨形態形成性タンパク質（ＢＭＰ）は、骨から精製され、特徴を解析されている（Ｓａｍｐａｔｈ ａｎｄ Ｒｅｄｄｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：７５９９（１９８１）骨‐誘導（骨形成性、骨誘導性）分子である。“骨形態形成性タンパク質”、“ＢＭＰ”および“モルフォゲン（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎ）”という用語は同義語で、タンパク質の形質転換成長因子‐β（ＴＧＦ‐β）スーパーファミリーの特有のサブクラス（すなわち、ＢＭＰファミリー）のメンバーを表す（たとえば、Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａＩ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５７：２９４−３０８（２００１）；Ｒｅｄｄｉ，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ．，８３−Ａ（Ｓｕｐｐ．１）：ＳＩ−Ｓ６（２００１）；米国特許第４，９６８，５９０号；第５，０１１，６９１号；第５，６７４，８４４号；第６，３３３，３１２号を参照されたい）。そのようなＢＭＰはすべてシグナルペプチド、プロドメイン、およびカルボキシ‐末端（成熟）ドメインを有する。カルボキシ‐末端ドメインはＢＭＰモノマーの成熟型であり、システインノットを形成する７つのシステインによって特徴付けられる高度に保存された領域を含む（たとえば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ｅｔ ａＩ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：８７８−８８３（１９９６）を参照されたい）。ＢＭＰは本来タンパク質精製法を使用して、哺乳動物骨から単離された（たとえばＵｒｉｓｔ ｅｔ ａＩ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１７３：１９４−１９９（１９８３）；Ｕｒｉｓｔ ｅｔ ａＩ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：３７１−３７５（１９８７）；Ｓａｍｐａｔｈ ｅｔ ａ１．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７１０９−７１１３（１９８７）；米国特許第５，４９６，５５２号を参照されたい）。しかし、ＢＭＰは腎臓、肝臓、脳、筋肉、歯、および腸のような多様な他の哺乳動物組織および器官において検出されるか、または単離されている。多くのＢＭＰ（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３を含む）はまた、骨形成の標準異所性アッセイにおいて証明されるように、軟骨および骨形成を刺激する（たとえば、Ｓａｍｐａｔｈ ａｎｄ Ｒｅｄｄｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：６５９１−６５９５（１９８３）を参照されたい）。従って、そのような真正ＢＭＰはまた、たとえそれらが軟組織再生を同じ様に促進してよいとしても“骨形成性”と表される。
【０００３】
通常ＢＭＰ−１と表されるタンパク質は、骨形成性、組織再生タンパク質のＢＭＰファミリーの真のメンバーではない。ＢＭＰ−１は本来高度に精製されたＢＭＰウシ骨抽出物から単離され、本来皮下（異所性）骨形成アッセイにおいてｉｎ ｖｉｖｏで軟骨形成を誘発することが報告された（Ｗｏｚｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：１５２８（１９８８））。しかし、ＢＭＰ−１は他のＢＭＰと顕著なアミノ酸配列相同性を共有せず、ＢＭＰ−１は他のＢＭＰに見いだされる特徴的なシグナルペプチド、プロドメイン、カルボキシ‐末端（成熟ドメイン）、またはシステインノットも提示しない。実際、ＢＭＰ−１は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）内のコラーゲンの適切なアセンブリーに必須な酵素であるプロコラーゲンＣ−プロテイナーゼと同一であることが示された（Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７１：３６０−３６２（１９９６））。ＴＧＦ−βファミリー内のＢＭＰ−１の誤った事態は、初めの骨形成のバイオアッセイにおける欠陥に起因し（Ｗｏｚｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，前記）、そこではバイオアッセイで観察された軟骨は不溶な骨マトリックスを汚染している古い成長プレート軟骨であったと考えられ、それが新規に形成された組織であると誤って確定された（Ｒｅｄｄｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７１：４６３（１９９６）を参照されたい）。本明細書で示されるように、真正骨形成性ＢＭＰとは異なり、ＢＭＰ−１−１イソ型は標準異所性骨形成アッセイにおいて軟骨または骨形成を誘導しない。
【０００４】
ＢＭＰ−１遺伝子はショウジョウバエ遺伝子ｔｏｌｌｏｉｄ（ＴＬＤ）に関連し、該遺伝子はＴＧＦ−β様モルフォゲンを活性化するｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＤＰＰ）遺伝子の能力に基づいてＤＰＰ遺伝子によって制御されるパターニングに関与する。ＢＭＰ−１タンパク質は現在、パターン形成のカスケード中の形態形成の重要な制御点であることが知られている（Ｇｅ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ，Ｂｉｒｔｈ Ｄｅｆｅｃｔ Ｒｅｓ．，７８：４７−６８（２００６））。
【０００５】
ＢＭＰ−１は広範な種において見いだされるメタロプロテイナーゼの小さなサブグループの典型である。哺乳動物では、４種のＢＭＰ−１／ＴＬＤ‐関連（またはＢＭＰ−１／ＴＬＤ‐様）メタロプロテイナーゼがある。ＢＭＰ−１をコードする遺伝子はまた、オルタナティブスプライシングされたｍＲＮＡによってコードされる第２の、より長いプロテイナーゼをコードする。本質的にＴＬＤに同一のドメイン構造のために、このプロテイナーゼは哺乳動物Ｔｏｌｌｏｉｄ（ｍＴＬＤ）と命名された（Ｔａｋａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：３２５７２−３２５７８（１９９４））。その上、哺乳動物Ｔｏｌｌｏｉｄ‐様１および２（ｍＴＬＬ１およびｍＴＬＬ２）と命名された２種の遺伝的に別個の哺乳動物ＢＭＰ−１／ＴＬＤ‐関連プロテイナーゼがある。ＢＭＰ−１／ＴＬＤ‐様プロテイナーゼのプロドメインはサブチリシン（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）‐様プロタンパク質コンベルターゼ（ＳＰＣ）によってタンパク質分解により除去され（Ｌｅｉｇｈｔｏｎ ａｎｄ Ｋａｄｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８：１８４７８−１８４８４（２００３））、これらのプロテイナーゼの完全な活性を獲得しなければならない。ＢＭＰ−１／ＴＬＤ‐様プロテイナーゼのプロドメインの役割は、潜在型でＢＭＰ−１／ＴＬＤ‐様プロテイナーゼを維持することにあるように見える（Ｍａｒｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，９１：４１７−４２６（１９９７）；Ｓｉｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３９：３２３１−３２３９（２０００）；Ｌｅｉｇｈｔｏｎ ａｎｄ Ｋａｄｌｅｒ，前記）。
【０００６】
ＢＭＰ−１／ＴＬＤ‐関連メタロプロテイナーゼは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の形成に関連したいくつかの細胞外タンパク質のタンパク質分解による成熟に関与する。これらには、種々のコラーゲン、低分子ロイシン‐リッチプロテオグリカン、ＳＩＢＬＩＮＧタンパク質、および酵素リシルオキシダーゼ、ラミニン‐５、および基底膜プロテオグリカンパールカン由来の抗‐血管新生因子が挙げられる（Ｉｏｚｚｏ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６：６４６−６５６（２００５）；Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ，Ｔｏｐ．Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．，２４７：１４９−１８３（２００５）；Ｇｅ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ Ｂｉｒｔｈ Ｄｅｆｅｃｔ Ｒｅｓ．，前記）。ＢＭＰ−１はまた、細胞外マトリックスからＢＭＰを遊離すること、またはＢＭＰ−４、ＢＭＰ−１１およびＧＤＦ−８のような潜在型ＴＧＦ−βファミリーメンバーを活性化することに関連する（Ｗｏｌｆｍａｎ ｅｔ ａＩ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：１５８４２−１５８４６（２００３）；Ｇｅ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２５：５８４６−５８５８（２００５））。
【０００７】
ＢＭＰ−１の第１に発見された形状はＢＭＰ−１−１と命名され、そしてスプライス変異体ＲＮＡ転写物によってコードされる他のＢＭＰ−１イソ型は転写レベルで記載され、順番の添え字を付けて：ＢＭＰ−１−２、ＢＭＰ−１−３、ＢＭＰ−１−４、ＢＭＰ−１−５、ＢＭＰ−１−６、およびＢＭＰ−１−７と命名されている（Ｌｉ ｅｔ ａＩ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：５１２７−５１３１（１９９６）；Ｗｏｚｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：１５２８（１９８８）；Ｊａｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，７６：１４１（１９９８）；Ｔａｋａｈａｒａ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：３２５７２（１９９４）；Ｈｉｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．，５：１６（２００４）。予期されるように、スプライス変異体ＲＮＡ転写物によってコードされるＢＭＰ−１イソ型は、リーダーペプチド、プロ領域、およびプロテアーゼ（触媒）領域を含むいくつかのドメインを共有する。初めのＢＭＰ−１、すなわち、ＢＭＰ−１−１だけが骨からの単離後にタンパク質レベルで以前に確証されている。ＢＭＰ−１−２および他のＢＭＰ−１イソ型は、スプライス変異体転写物のヌクレオチド配列から推定されたが、タンパク質レベルでは記載されていない。
【０００８】
文献におけるＢＭＰ−１−１の同一性の修正にもかかわらず、このタンパク質または他のＢＭＰ−１イソ型がいずれか治療的に妥当な役割を有するかどうかはまだ解明されないままである。
【発明の概要】
【０００９】
発明の概要
本発明は、個体の血液中におけるＢＭＰ−１の循環に関連する発見に基づいた、診断および処置の新規な方法を提供する。個体の循環血における特有のイソ型の他と異なる出現は、現在特有の骨欠損または軟組織の障害に関連付けられている。従って、急性骨折、慢性腎不全、進行性骨化性線維形成異常、骨形成不全、急性膵炎、および肝硬変のような特有の障害の早期の診断の場合、現在簡単な血液試験を使用して血液試料中の１種以上のＢＭＰ−１イソ型の存在を検出することが可能である。その上、本明細書に開示された発見は、特有の骨欠損を患う個体における骨形成性骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）の効果を高める新規な処置方法の開発を導いている（以下の実施例１４を参照されたい）。
【００１０】
本発明の一態様は、個体の血液中のＢＭＰ−１イソ型のプロファイルを確定すること、および該プロファイルを種々の欠損および障害に関連したＢＭＰ−１イソ型の標準血液プロファイルと比較することを含む、個体の骨または軟組織における欠損または障害を診断する方法を含む。健康な個体ならびに種々の骨および軟組織障害の処置を受けている個体のプールされた血液に基づいた、そのような標準血液プロファイルは表１（以下）に提示される。
【００１１】
本発明の診断方法は、好都合には１種以上のＢＭＰ−１イソ型に結合することが可能なディテクター分子を使用して行われる。適切なそのようなディテクター分子には、抗体分子（ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびにＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ′）２フラグメントなどのような抗体の結合フラグメント）およびアプタマー（すなわち、特有のタンパク質に特定の結合親和性を有する核酸分子）が挙げられる。
【００１２】
従って、本発明の診断方法の特有の態様では、個体の血液イソ型プロファイルは、１種以上のディテクター分子を使用して１種以上のＢＭＰ−１イソ型の存在に関して個体の血液試料をアッセイするために作製される。循環するＢＭＰ−１イソ型、またはいずれかの循環するイソ型の完全な不在は、本明細書では特有の障害を示すことになることが証明される。血液試料からこれらの欠損または障害を検出する能力は、障害のずっと初期の経過中に陽性の診断が達成されうるため、好都合である。たとえば、急性膵炎は循環するＢＭＰ−１−７の存在から検出されてもよく、疾患のいっそう明白な症状が現れる前に診断されてもよい。同様に、容易には検出できない（または高価なＸ‐線なしには検出できない）ごくわずかのひびまたは亀裂のような急性骨折は、血液試験、およびＢＭＰ−１イソ型の完全な不在を観察することを使用して初めに推定されてもよい。特有の態様では、抗体分子または１種以上のＢＭＰ−１イソ型に特異的なアプタマーのようなディテクター分子をアッセイに使用して、血液試料中における１種以上のＢＭＰ−１イソ型の存在が検出され、そして本明細書ではある種のイソ型の存在（またはイソ型の完全な不在）がそのような存在（または不在）に関連した障害を示す。
【００１３】
本発明の診断法にとって好ましいディテクター分子はモノクローナル抗体分子である。本明細書での使用に適切な抗‐ＢＭＰ−１イソ型抗体分子は、イムノグロブリン、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ′）２分子、１本鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、二重のｓｃＦｖ分子、単一ドメイン抗体分子（ｄＡｂ）、Ｆｄ分子、ディアボディー分子、該抗体分子のいずれかを含む融合タンパク質、または１種以上の前述の分子の組み合わせであってもよい。
【００１４】
本発明に従った特定の方法では、個体の血液試料中のＢＭＰ−１イソ型であるＢＭＰ−１−１、ＢＭＰ−１−３、ＢＭＰ−１−５、およびＢＭＰ−１−７の存在を確定するために試料を試験することを含む、個体の肝硬変を診断するための方法が提供され、ここで試料中の該ＢＭＰ−１イソ型の不在は個体の肝硬変を示す。
【００１５】
本発明の別の特定の態様は、個体由来の血液試料中のＢＭＰ−１イソ型であるＢＭＰ−１−１、ＢＭＰ−１−３、ＢＭＰ−１−５、およびＢＭＰ−１−７の存在を確定するために試料を試験することを含む、個体の急性骨折を診断するための方法であり、ここで試料中の該ＢＭＰ−１イソ型の不在は個体の急性骨折を示す。
【００１６】
本発明の付加的な態様は、個体の血液試料中のＢＭＰ−１イソ型であるＢＭＰ−１−７の存在を確定するために試料を試験することを含む、個体の急性膵炎を診断するための方法であり、ここで個体の循環血における該ＢＭＰ−１イソ型の存在は個体の急性膵炎を示す。
【００１７】
本発明の付加的な態様は、個体の血液試料中のＢＭＰ−１イソ型であるＢＭＰ−１−３およびＭＰ−１−５の存在を確定するために試料を試験することを含む、個体の慢性腎不全を診断するための方法であり、ここで個体の循環血における両方の該ＢＭＰ−１イソ型の存在は個体の慢性腎不全を示す。
【００１８】
本明細書に開示された特有の好都合な方法は、個体の血液試料中のＢＭＰ−１イソ型ＢＭＰ−１−３の存在を確定するために試料を試験することを含む、個体の進行性骨化性線維形成異常を診断するための方法であり、ここで健康な個体の該イソ型のレベルと比較した同じＢＭＰ−１イソ型のレベル上昇（たとえば少なくとも５倍）は個体の進行性骨化性線維形成異常を示す。
【００１９】
本発明の別の特有の好都合な態様は、個体の血液試料中のＢＭＰ−１イソ型であるＢＭＰ−１−３の存在を確定するために試料を試験することを含む、個体の骨形成不全を診断するための方法であり、ここで健康な個体の該イソ型のレベルと比較した同じＢＭＰ−１イソ型のレベル上昇（たとえば少なくとも５倍）は個体における骨形成不全を示す。
【００２０】
本発明の付加的な態様は、個体の骨または軟組織における欠損または障害に対して個体を処置する方法であって：
（ａ）以下：
（ｉ）血液中のＢＭＰ−１イソ型のプロファイルを確定すること、および
（ｉｉ）プロファイルを種々の欠損または障害に関連したＢＭＰ−１イソ型の標準血液プロファイルと比較することを含むステップにより、個体の骨または軟組織における欠損または障害を診断すること、
（ｂ）診断された欠損または障害に対して骨形成性ＢＭＰの処置効果を高めるために有効な量の少なくとも１種のＢＭＰ−１イソ型を個体に投与すること、または診断された欠損または障害の進行における１種以上のＢＭＰ−１イソ型の効果を阻害するために有効な量の、１種以上の該ＢＭＰ−１イソ型に対して特異的な１種以上の抗体分子を個体に投与することを含む。
【００２１】
前述の方法の診断ステップ（ａ）は、患者の血液ＢＭＰ−１イソ型プロファイルを、たとえば、以下の表１に示された標準血液イソ型関連表と比較することによって実行されてもよい。前述の方法の治療ステップ（ｂ）は治療薬の全身または局所投与により達成されてもよい。骨欠損の処置では、とりわけ欠損部分への局所投与が好ましい。たとえば、本明細書ではＢＭＰ−１イソ型ＢＭＰ−１−１の局所投与は、ｉｎ ｖｉｖｏの骨折モデルにおいて骨修復を促進することが示される。（たとえば、以下の実施例１２および１４を参照されたい。）ＢＭＰ−１イソ型および／またはＢＭＰ−１−７のような真正、骨形成性ＢＭＰの局所投与が、好都合には骨欠損に対するそれらの薬剤の局所送達のためのキャリア／マトリックスとしての全血凝血物を使用させることになってもよい。全血‐由来凝血物デバイスは、物理的に安定な（自己‐サポート）ゲルの硬度を持つ治療薬を提供し、それが次に骨の再架橋が所望される骨端に、または骨断片間のギャップに容易に提供される。
【００２２】
前述の診断方法の特有の態様では、検出ステップはそれぞれ配列番号：１、配列番号：２または４、配列番号：６、および配列番号：７で示されるアミノ酸配列を有する、ＢＭＰ−１−１、ＢＭＰ−１−３、ＢＭＰ−１−５、およびＢＭＰ−１−７の１種以上を検出すること、または該アミノ酸配列のエピトープまたは検出可能なフラグメント（例えば、トリプシン消化されたフラグメント）を検出することを指向することになる。
【００２３】
特有の態様では、本発明は：塩化カルシウムのようなカルシウムイオン（Ｃａ＋＋）を提供する物質；少なくとも１種のＢＭＰ−１イソ型および場合により少なくとも１種の骨形成性ＢＭＰ；ならびに場合によりフィブリンおよびトロンビンを含む組成物を全血のアリコート中で一緒に混合することにより調製される、個体の骨欠損を処置するための骨形成性全血‐由来凝血物デバイス（ＷＢＣＤ）を提供する。混合物は物理的に安定なゲルの硬度を有する凝血物が形成されるまでインキュベーションされ、その後凝血物は骨再架橋または修復が所望される部位にマトリックスとして容易に適用される。そのような物理的に安定なゲルは好ましくは均質で、凝集力があり、シリンジで吸収可能であり、注射可能であり、そして展性があるもの（ｍａｌｌｅａｂｌｅ）である。凝血物の硬度は、治療的ＢＭＰ（存在する場合）およびＢＭＰ−１イソ型を伴う混合物が、修復されることになる骨欠損に隣接した適所に留まっていることを確実にする。
【００２４】
凝血物の成分の割合は変化してもよいが、カルシウムイオン物質の量は、カルシウムイオン濃度が先に述べた所望する特徴を有する凝血物ゲルを提供する量であるべきである。凝血物中のカルシウムイオンの好ましい濃度は１〜２．５ｍＭの範囲に入ることになる。塩化カルシウムは好ましい外因性Ｃａ＋＋‐供給物質である。塩化カルシウムが本発明のＷＢＣＤにおいて使用される場合、濃度は好都合には５〜１５ｍＭの範囲にある。
【００２５】
本発明に従った凝血物中のＢＭＰ−１イソ型の量は、好都合には１〜５００μｇ／ｍＬ、好ましくは２〜２００μｇ／ｍＬ、より好ましくは５〜２０μｇ／ｍＬの範囲にあるが、より少ないか、またはより多い量が使用されてもよく；ＢＭＰ−１イソ型の存在が真正、骨形成性ＢＭＰの活性を局所的に触媒すること；たとえば骨欠損を修復することおよび骨折を再架橋することに役立つことは本明細書に開示される基本的な発見である。従って、（細胞外マトリックスから活性化されるか、または外因性に供給されるかのいずれかの、たとえば、全血‐由来凝血物デバイスの要素としての）ＢＭＰの骨形成活性を高めるために有効なＢＭＰ−１イソ型のいずれの量が使用されてもよい。同様に、１種以上のＢＭＰが本発明に従った凝血物デバイスの要素として使用される場合、量は好都合には５０〜５００μｇ／ｍＬ、好ましくは１００〜２００μｇ／ｍＬの範囲に入るように調整されてもよい。しかし、ＢＭＰ−１イソ型要素の場合と同じように、より少ないか、またはより多い量が企図され、そして意図された骨欠損部位において骨形成を促進するために有効ないずれの量のＢＭＰが使用されてもよい。あるいは、凝血物中で使用されるＢＭＰ−１イソ型またはＢＭＰの量は、使用されることになる凝血物の量を考慮して、個体の全重量に基づきイソ型またはＢＭＰの全用量を提供するように調整されてもよい。たとえば、２〜２００μｇ／ｋｇ、好ましくは５〜２０μｇ／ｋｇ、より好ましくは８〜１２μｇ／ｋｇ患者体重を提供するＢＭＰ−１イソ型の量が使用されてもよく；そしてたとえば、１〜１０００μｇ／ｋｇ、好ましくは２〜５００μｇ／ｋｇ、より好ましくは５０〜２００μｇ／ｋｇ、最も好ましくは１００μｇ／ｋｇ患者体重を提供するＢＭＰの量が使用されてもよい。ＷＢＣＤにおける使用のための成分の量を確定することにおいて、成分の量または容積が凝血物ゲルの所望する特徴に有害に影響を与えるほど多い（または少ない）はずがないことは理解されるであろう。
【００２６】
従って、本発明の特定の態様では、個体において骨欠損を処置するための骨形成性全血‐由来凝血物デバイス（ＷＢＣＤ）が以下：
（ａ）（ｉ）全血、
（ｉｉ）２〜２００μｇ／ｍＬの少なくとも１種のＢＭＰ−１イソ型、
（ｉｉｉ）５〜１５ミリモル／Ｌ塩化カルシウム、
（ｉｖ）場合により、５〜１０ｍｇ／ｍＬフィブリンおよび０．５〜５ｍｇ／ｍＬトロンビンを含む混合物を一緒に混合すること；および
（ｂ）物理的に安定なゲルが形成されるまでステップ（ａ）の混合物をインキュベーションすること；を含むステップにより調製される。
【００２７】
所望する場合、ある量、好ましくは５０〜５００μｇ／ｍＬの範囲のＢＭＰが前述の態様の（ａ）の混合物に添加されて、本明細書に開示されたＢＭＰ−１イソ型およびＢＭＰの組み合わせの相乗効果を活用してもよい。
【００２８】
カルシウムイオンを提供するための多くの適切な物質が知られている。塩化カルシウムが好ましい。
本明細書に記載されるＷＢＣＤにおいて有用なフィブリン‐トロンビン混合物は、フィブリンとトロンビンをＷＢＣＤの他の成分と単に混合することにより作製されてもよい。あるいは、フィブリンとトロンビンは混合物として予め混合されているか、または購入され、その後混合物が他の成分に添加されてもよい。ＷＢＣＤにおいて有用なフィブリン‐トロンビン混合物には、“フィブリンのり”または“フィブリンシーラント”として当該技術分野で公知のものが挙げられる。フィブリン‐トロンビン混合物、フィブリンのり、およびフィブリンシーラントの市販の調製物は容易に入手可能である。本明細書に記載されたＷＢＣＤを調製することに使用されるフィブリンとトロンビンは薬剤的に受容できる性質からなり、多くの個体において通常免疫反応を引き起こすことになる、際立った免疫原性の供給源ではない。
【００２９】
外因性に提供されたフィブリン‐トロンビン混合物は、先に述べたようにカルシウムイオンによって凝血物ゲルに提供される１種以上の特性を高めてもよい。その上、フィブリン‐トロンビン混合物を使用してＷＢＣＤのＢＭＰ−１イソ型（および付加的なＢＭＰ）要素を捕らえることもできる。そのような活性成分のそのような捕捉はＷＢＣＤによる保持を高め、それによってＷＢＣＤおよびＷＢＣＤが適応されている局所欠損部位からの活性成分の移動速度を減少させる。好ましくは、本明細書に記載のＷＢＣＤに使用される外因性に提供されたフィブリン‐トロンビン混合物は、５ｍｇ／ｍＬから１０ｍｇ／ｍＬまでの範囲でフィブリンを提供し、そして０．５ｍｇ／ｍＬから５ｍｇ／ｍＬの範囲でトロンビンを提供する。
【００３０】
本発明に従った骨形成性ＷＢＣＤを調製することにおいて、全血は最も好ましくは個体から採取された自家全血である。従って、ＷＢＣＤは、使用直前に、手術室での骨修復手術における使用のために調製されること、およびＷＢＣＤを作製するために患者自身の全血を使用することが企図される。このことは、特有の患者への適用のためにドナー血液のタイピングおよびクロスマッチの必要性を回避する明白な利点を有する。それにもかかわらず、たとえば、患者が既に顕著な量の血液を失っている可能性がある、またはすでに輸血をうけている可能性がある場合のように、状況によってはクロスマッチした全血が使用されてもよいことが認識される。そのような状況では、ＷＢＣＤにおけるクロスマッチした全血の使用は、クロスマッチした全血を使用するいずれの輸血にも伴う血清疾患と同じか、または類似のリスクがある。
【００３１】
特有の態様では、本発明に従った骨形成性ＷＢＣＤは初めにいずれかのフィブリン／トロンビン組成物、カルシウムイオン物質、およびＢＭＰ−１イソ型ならびに場合によりＢＭＰを組み合わせて第１の混合物を形成し、その後第１の混合物に全血を添加して第２の混合物を形成し、そして物理的に安定な（自己‐支持）ゲルが形成されるまで第２の混合物をインキュベーションすることによって調製されてもよい。
【００３２】
別の態様では、全血以外のＷＢＣＤの調製に必要なすべての要素は便利に、そして好都合にキットに集められてもよい。キットは、それが必要な時点において、手術室内で開封され、患者から得られた自家血を使用してＷＢＣＤを形成するために使用されてもよい。そのようなキットは、たとえば以下のような品目を含むことができる：
（ａ）１種以上の凍結乾燥したＢＭＰ−１イソ型を含むバイアル、
（ｂ）凍結乾燥したＢＭＰ−１イソ型を溶解するためのバッファー、
（ｃ）バッファー中の凍結乾燥したＢＭＰ−１イソ型を溶解するためのシリンジ、
（ｄ）患者の血液を集めるための採血管（Ｖａｃｃｕｔａｉｎｅｒ）、
（ｅ）１Ｍ塩化カルシウムの滅菌溶液、
（ｆ）フィブリン‐トロンビン混合物、
（ｇ）全血を溶解したＢＭＰ−１イソ型および他の成分と混合するための容器、
（ｈ）開放骨修復手術中に骨末端に骨形成性凝血物を適用するために適したスパーテルまたはシリンジ（またはそれらの両方）、および
（ｉ）骨欠損への適用に適した物理的に安定なゲルを形成するための、１種以上のＢＭＰ−１イソ型、塩化カルシウム、および場合によりフィブリンおよびトロンビンを含む混合物と混合した全血からなるＷＢＣＤの調製および使用のための説明書。
【００３３】
本明細書に開示された発見は、ＢＭＰ−１イソ型の発見された役割および循環血におけるそれらの存在に基づいた、骨欠損および軟組織障害の治療に対する新規な研究方法を提供する。
【００３４】
特有の態様では、腎損傷の診断後個体にＢＭＰ−１イソ型を全身的に投与することを含む、個体の虚血性急性腎不全を処置する方法が提供される。（以下の実施例８を参照されたい）。関連する態様では、１種以上のＢＭＰ−１イソ型に特異的な１種以上の抗体分子を個体に全身的に投与することを含む、個体の慢性腎不全を処置する方法が提供される。（以下の実施例９を参照されたい）。この方法の特有の態様では、抗体分子はＢＭＰ−１イソ型に特異的な抗体分子、ＢＭＰ−１−３イソ型に特異的な抗体分子、またはそのような抗体分子の組み合わせである。
【００３５】
本発明の付加的な態様は、個体の虚血／再潅流損傷を阻害するために有効な量で１種以上のＢＭＰ−１イソ型に特異的な１種以上の抗体分子を個体に投与することを含む、個体における腎臓の虚血／再潅流障害を処置する方法を提供する。特有の態様では、１種以上のＢＭＰ−１イソ型を認識する１種以上の抗体分子は、虚血／再潅流事象の前に個体に全身的に投与される。とりわけ、ＢＭＰ−１−１に結合する抗体分子、ＢＭＰ−１−３に結合する抗体分子、またはそのような抗体分子の組み合わせが個体に投与されてもよい。
【００３６】
本発明はまた、発生する凝血塊（ｃｌｏｔ）を溶解するために有効な量で、胸部または腹部手術前に個体にＢＭＰ−１イソ型を投与することを含む、手術中に発生する可能性がある凝血塊を溶解するために個体を前処理する方法を提供する。
【００３７】
本発明の付加的な態様は、治療的有効量の、ＢＭＰ−１イソ型に特異的な少なくとも１種の抗体分子を個体に投与することを含む、個体の急性膵炎を処置する方法を提供する。とりわけこの態様では、抗‐ＢＭＰ−１−７抗体分子が使用されてもよい。
【００３８】
本発明の付加的な態様は、膵炎を患う個体に、炎症過程の急性相後に膵臓再生を促進するために有効な量で、ある量のＢＭＰ−１イソ型を投与することを含む、個体の膵炎を処置する方法を提供する。とりわけ、この態様では、ＢＭＰ−１−７イソ型が投与されてもよい。
【００３９】
循環するＢＭＰ−１イソ型の我々の調査の過程において、我々はまた胎盤ｃＤＮＡライブラリーから、以前に報告されていないＢＭＰ−１イソ型ＢＭＰ−１−３の変異体をコードするポリヌクレオチドを単離した。このイソ型のコーディング配列は配列番号：５に示され；この変異体イソ型のアミノ酸配列は配列番号：４に示される。単離された胎盤のｃＤＮＡから発現されるＢＭＰ−１−３イソ型は、以前に報告されたＢＭＰ−１−３イソ型（配列番号：２）に比較して若干の付加的な特性を提示する。（以下の実施例５を参照されたい。）従って、本発明の付加的な側面は、配列番号：４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供することである。そのようなポリヌクレオチドの１つは配列番号：５の配列を有する。
【００４０】
最も広範な側面において、本発明は個体の骨または軟組織における欠損または障害を診断するために、該個体の循環血液における１種以上のＢＭＰ−１イソ型の存在を試験するｉｎ ｖｉｔｒｏ診断法において特にＢＭＰ−１イソ型を結合するディテクター分子の使用に関する。好ましい態様では、そのようなディテクター分子は抗体分子またはアプタマーである。好都合なことに、そのようなディテクター分子は検出可能に標識される。
【００４１】
本発明は、その治療的側面において、骨欠損の処置のための医薬品の大規模製造におけるＢＭＰ−１イソ型の使用を提供する。その上、本発明は本明細書に記載される軟組織傷害の処置のための医薬品の大規模製造においてＢＭＰ−１イソ型に結合する抗体分子の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】虚血性急性腎不全に供されたラットの血液中のクレアチニン濃度（ｍｇ／ｍＬ）対時間（日）のグラフを示す。斜線の棒は虚血事象後の示された時間における対照群のラット（虚血、無処置）の血液中のクレアチニンレベルを示す。点刻模様の棒は虚血前およびその５日後に、ＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−１−３に対する抗体で全身的に処置されたラットの血液中のクレアチニンレベルを示す。アステリスクは抗体により処置された動物と無処置対照群の動物間のクレアチニンレベル間の有意な差（Ｐ＜０．０１）を表す。結果は、損傷前に投与された場合、ＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−１−３の中和抗体の全身投与が虚血／再潅流急性腎不全のラットにおける腎臓機能の損失を妨げたことを示唆する。詳細は以下の実施例７を参照されたい。
【図２】先の図１および以下の実施例７に記載された虚血／再潅流急性腎不全に供されたラットの腎臓組織の組織学的切片を示す。パネル２Ａは、抗体処置をしない（生理食塩水ベヒクル、ｐＨ７．２だけ）急性虚血／再潅流損傷にさらされた対照群ラットの腎臓組織の代表的な組織学的切片を示す。パネル２Ａでは、腎臓組織の構造完全性の顕著な損失が明らかである。パネル２Ｂは急性虚血／再潅流前およびその５日後に、ＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−１−３に対する抗体を全身投与された予防的治療群のラットの腎臓組織の代表的な組織学的切片を示す。パネル２Ｂの組織は、パネル２Ａに表された無処置組織に比較した、腎臓構造の顕著な保存を表す。詳細は、以下の実施例７を参照されたい。
【図３】以下の実施例８に記載された虚血性急性腎不全損傷後のラットの生存率の時間経過（日）のグラフを示す。菱形（◆、“対照”）は虚血／再潅流損傷後に治療を受けなかった陰性対照群のラットの生存を示す。四角（■、“ＢＭＰ−７”）は、腎臓における虚血／再潅流損傷の処置のための公知の治療薬であるＢＭＰ−７を与えられた陽性対照群のラットの生存を示す。三角（▲、“ＢＭＰ−１”）は損傷後にＢＭＰ−１−１を与えられたラットの生存を示す。ばつ印（ｘ、“ＢＭＰ−１ Ａｂ”）は損傷後にＢＭＰ−１−１に対する抗体を与えられたラットの生存を示す。結果は損傷後のＢＭＰ−１−１イソ型の投与が虚血／再潅流急性腎不全のラットの生存率を増したことを表す。詳細は実施例８を参照されたい。
【図４】ＢＭＰ−１−１（骨４Ａおよび４Ｄ）、ＢＭＰ−７（骨４Ｂ、４Ｃ、および４Ｅ）、およびＢＭＰ−１−１に対する抗体（骨４Ｆ）により全身的に処置されたラットの８週間後の大腿骨骨折を示す。ラットへのＢＭＰ−７の全身投与に比較して、ラットへのＢＭＰ−１−１の全身投与により骨折の治癒が早められた。ＢＭＰ−１−１中和抗体の全身投与は、骨折部位におけるＢＭＰ−１−１活性の阻害により骨折治癒を遅延させた。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは以下の実施例１４に記載のように、ＢＭＰ−１イソ型またはＢＭＰ−７無しに、全血‐由来凝血物デバイス（ＷＢＣＤ）だけにより局所的に処置された対照群のウサギの代表的な骨における６週間後の尺骨欠損を示す。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは以下の実施例１４に記載のように、ＢＭＰ−１−１を含むＷＢＣＤにより局所的に処置されたウサギの代表的な骨における６週間後の尺骨欠損を示す。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは以下の実施例１４に記載のように、ＢＭＰ−７を含むＷＢＣＤにより局所的に処置されたウサギの代表的な骨における６週間後の尺骨欠損を示す。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは以下の実施例１４に記載のように、ＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−７を含むＷＢＣＤにより局所的に処置されたウサギの代表的な骨における６週間後の尺骨欠損を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
発明の詳細な説明
本発明が十分に理解されるように、以下の用語が定義される。
本明細書で使用され、理解される“抗体”または“抗体分子”は、天然に、合成により、または半合成により生産されたかどうかにかかわらず、タンパク質分子もしくはその一部、またはいずれか他の分子である特定の結合メンバーを表し、そしてそれはイムノグロブリン可変軽鎖領域またはそのドメイン（ＶＬ）もしくは一部、イムノグロブリン可変重鎖領域またはそのドメイン（ＶＨ）もしくは一部によって形成される抗原結合ドメインを有する。“抗体”という用語はまた、イムノグロブリンの抗原‐結合ドメインに同一であるか、または相同な抗原‐結合ドメインを有するいずれかのポリペプチドまたはタンパク質分子を包含する。抗体は、“ポリクローナル”、すなわち、抗原の異なる部位に結合する抗原‐結合分子の集団、または抗原の１カ所だけに結合する同一の抗原‐結合分子の集団であってもよい。本明細書で使用され、理解される抗体分子の例としては、公知のクラスのイムノグロブリン（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ）のいずれかおよびそれらのイソ型；ＦａｂまたはＦ（ａｂ′）２分子のような、抗原結合ドメインを含むイムノグロブリンフラグメント；１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）分子；二重ｓｃＦｖ分子；単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）分子；Ｆｄ分子；ディアボディー分子；およびそのような分子を含む融合タンパク質を含む。ディアボディーは２つのディアボディーモノマーの会合によって形成され、そしてそれは２つの完全な抗原結合ドメインを含むダイマ−を形成し、ここでそれぞれの結合ドメインはそれ自体２つのモノマーそれぞれに由来する領域の分子間会合によって形成される（たとえば、Ｈｏｌ１ｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい）。そのような抗体分子の使用は、当該技術分野で利用可能な非常に多数の抗体検出システムおよびフォーマットを提供し、それらは、全血、血漿、血清、および種々の組織抽出物を含む混合物中の特有のＢＭＰ−１イソ型を選択的に検出するために適用されてもよい。ＢＭＰ−１イソ型を検出するための抗体分子を使用するフォーマットの例としては、イムノブロッティング（たとえばウェスタンブロット、ドットブロット）、免疫沈降、アフィニティー法、イムノチップなどが挙げられるが、それらに限定されない。当該技術分野で公知の多様な方法のいずれかが利用されて、特定のＢＭＰ−１イソ型、または少なくとも１つのエピトープ（抗体結合部位）を含む該ＢＭＰ−１イソ型の一部に対する抗体分子が産生されてもよい。
【００４４】
“循環する（ｃｉｒｃｕｌａｔｅ）”および“循環する（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ）”は個体の血管系を通って移動するか、または別のやり方で運ばれるどんなものも説明する。
【００４５】
“障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）”および“疾患（ｄｉｓｅａｓｅ）”という用語は同義語であり、原因または病原体にかかわらず、いずれかの病的状況を表す。組織における“欠損”は異常な、または欠陥のある組織増殖の部位を表す。“疾患”または“障害”は１種以上の組織における１種以上の“欠損”によって特徴付けられてもよい。
【００４６】
本明細書で使用する “処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）”および“処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）”という用語は、疾患または障害の１種以上の症状または徴候を緩和する、疾患または障害の進行を阻害する、疾患または障害の進行を阻止するかまたは、進行を無効にする（退行を引き起こす）、または疾患または障害の開始を妨害するいずれかの処方を表す。処置には、予防を含み、そして疾患または障害の治癒を含むが、それが不可欠ではない。
【００４７】
“治療的有効量”は、状態の進行を全体的に、または部分的に阻害する、障害の１種以上の症状を少なくとも部分的に緩和する、または別の化合物（たとえば骨形成性ＢＭＰ）の治療的な、または別の有益な効果を高めるか、または触媒する化合物（たとえば、治療的に使用される場合のＢＭＰ−１イソ型またはＢＭＰ−１イソ型結合分子）の量である。治療的有効量は、予防的に有効な量でもありうる。治療的に有効である量は患者のサイズおよび性、処置されることになる状態、状態の重症度および求められる結果に依存することになる。一定の患者にとって、治療的有効量は当業者に公知の方法によって決定されうる。
【００４８】
本明細書に開示される種々のポリペプチドを記載するために使用される場合、“単離された”という用語は天然の環境の要素から確定され、そして分離および／または回収されているポリペプチドを意味する。天然の環境の汚染要素は、ポリペプチドの診断的または処置的使用を典型的に妨害することになる材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含んでいてもよい。ポリペプチドの天然の環境の少なくとも１つの要素が存在しないことになるため、単離されたポリペプチドは、ポリペプチドを発現するように操作された組換え細胞内のｉｎ ｓｉｔｕにおけるポリペプチドを含む。しかし、通常、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製ステップによって調製されることになる。“単離されたポリヌクレオチド”または単離されたポリペプチドをコードする核酸は、そのような核酸の天然の供給源、たとえばヒトゲノム中で通常会合している少なくとも１種の汚染物質の核酸分子から確定され、そして分離される核酸分子である。単離されたポリヌクレオチドは天然において見いだされる形状または配置以外の状態である。従って、特定のポリペプチドをコードする核酸分子は天然の細胞に存在するため、単離されたポリヌクレオチドは、そのような特定のポリペプチドをコードする核酸分子と識別される。しかし、単離されたポリヌクレオチドは、細胞に含まれ、通常はポリペプチドを発現する、ポリペプチドをコードする核酸分子を含むが、たとえば天然の細胞とは異なるクロモソームの位置にある核酸分子は含まない。
【００４９】
“ゲル”は半固体のゼリー様材料を意味する。
凝血物ゲルに適用される“均質”は、凝血塊の集塊を連結する非均質線維性ネットワークとは対照的に、凝血物ゲルが均質な硬度を有することを意味する。
【００５０】
凝血物ゲルを説明するために本明細書で使用される“シリンジで吸引可能な（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｌｅ）”は、針を詰まらせずに、または粉々に砕けて集塊にならずに、１８〜２３ゲージまでの範囲の針を持つシリンジに凝血物ゲルが吸引されうることを意味する。
【００５１】
凝血物ゲルを説明するために本明細書で使用される“注射可能な（ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ）”は、凝血物ゲルがシリンジの開口部を通って、または１８〜２３ゲージまでの範囲の針を通って、開口部または針を詰まらせずに、そして粉々に砕けて集塊にならずに、シリンジから押し出されうることを意味する。
【００５２】
凝血物ゲルを記載するために本明細書で使用される“適応性のある”は、骨欠損を充填するか、または覆うために、凝血物ゲルが成型、または形成されうることを意味する。適応性のある凝血物ゲルは自立していて（または物理的に安定で）、形成された型を実質的に保持することになる。
【００５３】
１種以上の指定された成分またはステップを“含む”と本明細書で記載される組成物または方法は制約がなく、指定された成分またはステップは必須であるが、他の成分またはステップが該組成物または方法の範囲内で添加されてもよいことを意味する。冗長であることを回避するために、１種以上の指定された成分またはステップ“を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”（または“ｗｈｉｃｈ ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”）と本明細書で記載されるいずれかの組成物または方法はまた、同じ指定された成分またはステップ“から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）”（または“ｗｈｉｃｈ ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ”）、対応する、いっそう限定された、組成物または方法を記載し、該組成物または方法は指定された必須の成分またはステップを含み、そしてまた組成物または方法の基本的および新規な特徴に著しく影響を与えない、付加的な成分またはステップを含んでいてもよいことを意味することが理解される。また、１種以上の指定された成分またはステップ“を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”または“から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ”）と本明細書で記載されるいずれかの組成物または方法は、いずれか他の不特定の成分またはステップを除外して、指定された成分またはステップ“からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）”（または“ｗｈｉｃｈ ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ”）、対応する、いっそう限定的で、閉鎖的な組成物または方法を説明することが理解される。本明細書に開示されたいずれかの組成物または方法では、いずれか指定の必須の成分またはステップの、公知の、または開示された等価物がその成分またはステップと取って代わってもよい。
【００５４】
特記しない限り、他の用語の意味は、医学、生化学、分子生物学、および組織再生の分野を含む、当業者によって理解され、そして使用されるものと同じである。
本発明は、成体個体（ヒトまたは他の哺乳動物）の血液中のＢＭＰ−１イソ型が個体の組織の状態（ｓｔａｔｅ）または状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）の生物学的マーカー（バイオマーカー）として有用であるという発見に基づく。とりわけ、成体個体の血液中の１種以上のＢＭＰ−１イソ型の存在または不在、すなわちＢＭＰ−１血液プロファイルは、個体の健康状態または骨および種々の軟組織の特有の病的状態を示す。メタロプロテイナーゼプロコラーゲンＣ−プロテイナーゼ（ＢＭＰ−１プロコラーゲンＣ−プロテイナーゼとも呼ばれる）と同一であるＢＭＰ−１−１は、本来骨マトリックス中に発見された。しかし、ＢＭＰ−１−１イソ型は健康な成体個体にも、種々の疾患患者の中にも血中に循環していることが見いだされない。以前に、ＢＭＰ−１−１以外のイソ型の存在は組織ＲＮＡ転写物のレベルにおいてだけ推測された。
【００５５】
以下の表１は、正常な健康状態およびいくつかの障害、すなわち、急性骨折、慢性腎不全、進行性骨化性線維形成異常（ＦＯＰ）、骨形成不全（ＩＯ）、急性膵炎、および肝硬変に関連して循環するＢＭＰ−１イソ型のプロファイルを提供する。表１の診断プロファイルを生み出した研究の記載は実施例６（以下）に提供される。
【００５６】
【表１】
【００５７】
個体から得られた血液は、たとえばイソ型特異的抗体または他のイソ型ディテクター分子を使用して、種々のＢＭＰ−１イソ型の存在を容易に分析されうる。その上、血液試料中のＢＭＰ−１イソ型のプロファイルは、示された病的状態のいずれかを診断するための表１のプロファイルと比較されうる。
【００５８】
表１は、血液循環するＢＭＰ−１イソ型が広域スペクトルの疾患の生物学的マーカー（すなわちバイオマーカー）として有用であることを示す。表１の病状を診断するＢＭＰ−１イソ型血液プロファイルの使用は、そのようなプロファイルが生み出される機序の理解に依存しない。それにもかかわらず、種々の疾患を診断する都合のよい方法を提供する以外に、本明細書に提示されたデータとの密接な関係が存在する。とりわけ、本明細書に提示されたデータは、単一遺伝子、ＢＭＰ−１の多様な生成物である循環酵素の存在を初めて証明する。その上、いずれか特有の機序または操作の理論に束縛されることを望まずに、表１のデータは、それぞれの組織または器官が特有の真正ＢＭＰ（たとえば、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６）を遊離すると推定されていた、真正骨形成性ＢＭＰの作用の長く保持されてきたモデルを消散させた。対照的に、表１に示すように、健康な個体ではＢＭＰ−１−３イソ型だけが循環し、真正骨形成性ＢＭＰは健康な個体の血液中に見いだされていない（以下の実施例１を参照されたい）。その上、本明細書に示すように、８０％もの静脈内投与されたＢＭＰ−１−３がラットの骨折した大腿骨の同所性部位に局在することになり、無処置対照動物に比較して、骨治癒の速度が促進される（以下の実施例７を参照されたい）。さらに、ＥＣＭに富むラット頭蓋冠の培養物では、外因性に提供されたＢＭＰ−１−３が培地中への真正骨形成性ＢＭＰ−４およびＢＭＰ−７の遊離を促進する（以下の実施例９を参照されたい。これらのデータは、循環するＢＭＰ−１イソ型が、ＥＣＭ（真正骨形成性ＢＭＰ分子の貯蔵場所である（たとえばＭａｒｔｉｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｃｙｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｌ．，１：２３−３６（２００６）を参照されたい））の重要なプロセッシング酵素として触媒的に働き、１種以上の真正骨形成性ＢＭＰの局所遊離をもたらすという、本明細書で示された組織修復モデルといっそう一致する。骨修復において、たとえば、ＢＭＰ−１イソ型に触媒された真正ＢＭＰの遊離は局所的に働き、その後骨折した骨端の再架橋中の仮骨形成中の骨再生および修復を促進する。
【００５９】
表１に示すように、いくつかの病的状態、すなわち、急性骨折、急性膵炎、および肝硬変は血液からのＢＭＰ−１−３イソ型の消失によって特徴付けられる。ＢＭＰ−１−３の他に、ＢＭＰ−１−５イソ型も個体の血液中に存在する場合、イソ型プロファイルは慢性腎不全（ＣＲＦ）の診断に役立つ。ＢＭＰ−１−３が正常な個体よりかなり高い濃度（すなわち、少なくとも正常レベルの５倍）で血液中に見いだされる場合、イソ型プロファイルはＦＯＰまたはＯＩの徴候を示す。ＢＭＰ−７が存在する唯一のイソ型である場合、プロファイルは急性膵炎の徴候を示す。
【００６０】
軟組織器官に関しては、血液中のＢＭＰ−１−３の不在は、ＢＭＰ−１−３が実質組織に蓄積し、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のプロセッシングを促進し、それが今度は線維形成を刺激する状態を示唆してもよい。表１の軟組織の病状の一般的な特徴は、組織の進行する線維形成であり、それが処置されないと器官不全を導きうる。そのような線維形成は肝硬変および急性膵炎の特徴を示す。従って、血液プロファイルがＢＭＰ−１−３の不在を示唆し、そして骨折、慢性腎不全、ＦＯＰ、またはＯＩの証拠がない場合、表１は肝臓または膵臓のような実質器官の特定された病状の診断を導く。そのような状況では、医療専門家はそのような器官の病状の付加的な試験を実施するように警告される。従って、そのような付加的な試験は、線維形成増加を導くコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、および他の細胞外分子の蓄積に関する標準試験を実施することによって明白であるような線維形成増加を１種以上の実質器官が提示するかどうかを確定することを含んでいてもよい。
【００６１】
表１の場合、急性膵炎患者の血清は、疾患の初期のステージ、すなわち膵臓のアミラーゼおよびリパーゼのような膵臓酵素の活発な血清上昇の前に集められた。驚くべきことに、これらの患者の血液は、タンパク質レベルで以前に検出されていなかった（すなわち、ｍＲＮＡ転写物の検出から推定される理論的なＢＭＰ変異体というよりむしろ発現されたタンパク質としての）ＢＭＰ−１−７イソ型を含んでいた。ＢＭＰ−１−７の血液中における出現は膵臓の急性損傷の初期の診断マーカーとして有用である。
【００６２】
ＢＭＰ−１−３およびＢＭＰ−１−５イソ型は、透析中の慢性腎不全患者に見いだされ、障害におけるこれらのイソ型の特定の役割、たとえば、腎臓骨ジストロフィーと呼ばれる骨の線維形成プロセスにおける関与を暗示する。ＢＭＰ−１−５イソ型はまた、慢性腎不全ラットの循環中に検出されていて、疾患の重症度を反映している。我々による、患者の血液中におけるＢＭＰ−１−５の検出はまた、タンパク質レベルでのＢＭＰ−１−５イソ型の初めての証明である。
【００６３】
表１のプロファイルに従って、患者の血液中を循環するＢＭＰ−１イソ型がないことを示唆するＢＭＰ−１イソ型プロファイルは、個体が急性骨折を有する、および／または肝硬変を有することの証拠である。これらの状態の両方が線維形成を含む。そのような線維形成は急性骨折の治癒における仮骨形成の一部として有益であってもよいが、軟組織では、線維形成は破壊的であり、肝硬変に特徴的である。
【００６４】
循環するＢＭＰ−１イソ型プロファイルを確定することは、個体が組織欠損または疾患の症状を提示する場合だけでなく、たとえば年に１回の健康診断の一部としてのように、担当の医療専門家によって実施される日常的な血液試験の一部として使用されてもよい。当該技術分野で公知の、多様な方法および組成物のいずれかを使用して個体から得られた血液試料中で、ＢＭＰ−１イソ型は容易に検出される。そのような方法には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、トリプシン消化したＢＭＰ−１イソ型のペプチドの質量分析（ＭＳ）、およびアフィニティー法、とりわけ他のイソ型を除外して、特有のＢＭＰ−１イソ型に特に結合するアフィニティー分子を利用するものが挙げられるが、それらに限定されない。そのようなアフィニティー分子には抗体分子およびアプタマーが挙げられるが、それらに限定されない。当該技術分野で利用可能な多様なアッセイフォーマットがあり、それらは抗体分子を利用して個体の血液中に存在する標的タンパク質を検出または単離しうるため、それぞれのＢＭＰ−１イソ型に特異的な抗体分子がとりわけ好ましい。そのようなフォーマットには、濾紙（たとえば、ニトロセルロース、酢酸セルロース）、マイクロタイタープレート、ポリマー粒子（たとえば、アガロース、ポリアクリルアミド）、シリコンチップなどが挙げられるが、それらに限定されない。個体の血液からＢＭＰ−１イソ型を検出するか、または単離するために使用されるいずれか特有の方法の場合、全血の血漿または血清部分からそのような検出または単離をすることが好ましくてもよいことが理解される。
【００６５】
本明細書で記載される組換えＢＭＰ−１イソ型はクローニングされ、真核および原核宿主細胞に発現された。そのような組換え細胞を利用して、本明細書で記載される方法において使用するために十分な量のイソ型を生産してもよい。本明細書で論じられるそれぞれのＢＭＰ−１イソ型の特定のコーディング配列は公知であり、コードされたアミノ酸配列は推定されている。たとえば、ＥＭＢＬ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ ｗｅｂ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｌ）を参照されたい。便宜上、ＢＭＰ−１−１のアミノ酸配列は本明細書では配列番号：１として含まれる。ＢＭＰ−１イソ型ＢＭＰ−１−３のアミノ酸配列は配列番号：２で示され、ＢＭＰ−１−３をコードするｃＤＮＡ配列は配列番号：３で示される。ＢＭＰ−１イソ型ＢＭＰ−１−５のアミノ酸配列は配列番号：６で示される。ＢＭＰ−１イソ型ＢＭＰ−１−７のアミノ酸配列は配列番号：７で示される。ヒト胎盤に由来し、以前に知られたＢＭＰ−１−３の形状とは異なる特性を有するＢＭＰ−１−３の新規な変異体型が発見されていて、それは配列番号：４のアミノ酸配列、および配列番号：５のコーディング配列を有する。
【００６６】
ＢＭＰ−１イソ型およびそのペプチドは当該技術分野で利用可能な標準組換え、合成、または半合成法によって生産されてもよい。また、ＢＭＰ−１イソ型およびそのペプチドを使用し、当該技術分野で利用可能な標準方法を使用して、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体分子を含む種々のアフィニティー分子を生産してもよい。
【００６７】
配列番号：１、２、４、６および７のイソ型をコードするヌクレオチド配列のすべてまたは一部は、ベクター、プライマー、ハイブリダイゼーションのための核酸プローブなどのような多様な核酸分子のいずれかの核酸配列に組み込まれてもよい。そのような組換え核酸分子を使用して、関心のあるＢＭＰ−１イソ型をコードする核酸分子をクローニングし、ＢＭＰ−１イソ型ヌクレオチド配列を（たとえば種々のハイブリダイゼーション法により）同定または検出し、および／または関心のあるＢＭＰ−１イソ型をコードする核酸分子を増幅（たとえばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロトコルを使用して）してもよい。核酸分子は（たとえば自動核酸シンセサイザーを使用して）化学的に合成され、ＰＣＲにより生産され、および／または当該技術分野で公知の種々の組換え核酸法により生産されてもよい。核酸分子を、当該技術分野で公知の種々の改変、たとえば、ホスホジエステル結合をチオール結合に置き換えることにより合成し、種々のヌクレアーゼおよび化学物質による開裂に抵抗する分子を提供してもよい。ＢＭＰ−１イソ型のすべてまたは一部をコードする特定のヌクレオチド配列（ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡ）を検出する方法は当該技術分野で公知であり、サザンブロット（ＤＮＡおよびｃＤＮＡの場合）、ノーザンブロット（ＲＮＡの場合）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、ドットブロット、コロニーブロット、およびＤＮＡまたはＲＮＡ分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を含むが、それらに限定されない。本明細書に記載される核酸分子は、セルロース‐含有紙（たとえば、ニトロセルロース、酢酸セルロース）、ナイロン、プラスチックマイクロタイターディッシュのウェル、ポリマー粒子（たとえばアガロース粒子、アクリルアミド粒子）およびシリコンチップを含むが、それらに限定されない多様な表面のいずれかに、標準方法により固定されてもよい。
【００６８】
表１のプロファイルはまた、欠損および障害を処置する薬物発見および新規な方法にとって可能性のある標的を暗示する。たとえば、先に述べたように、ＢＭＰ−１イソ型は線維形成を促進する重要な酵素として関係している。線維形成疾患を処置する好ましい方法は、組織線維形成に関連するＢＭＰ−１イソ型に対する抗体を患者に投与することを含む。そのような線維形成疾患には、線維形成腎臓疾患、肝硬変、急性膵炎、およびＦＯＰが挙げられるが、それらに限定されない。たとえば、慢性腎不全および透析処置中の患者を処置する方法では、ＢＭＰ−１イソ型に対する抗体が患者に投与されて、腎不全を遅らせ、そして腎臓骨ジストロフィーの発症を妨害してもよく、そのような腎臓骨ジストロフィーは再生プロセスを阻害するもろい骨および線維形成骨髄を導く。ＦＯＰ患者では、ＦＯＰ患者の特徴的な“第２の骨格”を発生させるための線維形成プロセスに依存する異所性骨化を妨害するか阻害するために、抗体分子を投与してＢＭＰ−１イソ型を阻害してもよい。好ましくは、本明細書で記載される方法において有用な抗体分子は、非常に低い免疫原性を有するか、または最も好ましくは免疫原性が全くない抗体分子であり、そのため、抗体分子を不活性化することになる患者の免疫反応を引き起こさずに、抗体分子が複数用量で患者に投与されてもよい。また、ＢＭＰ−１イソ型を阻害するか、または不活性化するための抗体のような治療薬の投与が、骨折の正常な治癒中の仮骨形成における線維形成に依存する骨折の治癒も阻害してよいことが理解される。従って、患者に存在する可能性があるいずれかの骨折が治癒されるまで、または患者におけるいずれかの骨折の治癒より、ＢＭＰ−１イソ型を阻害するか、または不活性化するためのいっそう重大な処置の必要性が勝るという場合を除いては、本明細書に記載のＢＭＰ−１イソ型を阻害するための治療が推奨されないことは、医療専門家によって認識されることになる。
【００６９】
本発明の処置の別の方法は、特有のＢＭＰ−１イソ型を欠く患者に、組織修復を促進しうるか、または疾患を妨害しうる組換えＢＭＰ−１イソ型を投与することを含む。本明細書に示すように、ＢＭＰ−１−３は循環から消失し、急性骨折の同所性部位に局在する。
【００７０】
ＢＭＰ−１イソ型が全身的に（以下の実施例７を参照されたい）、または局所的に（以下の実施例８を参照されたい）投与されるかどうかにかかわらず、疾患の急性形状を維持している個体への組換えＢＭＰ−１−１の投与は骨修復を促進しうる。ＢＭＰ−１イソ型の投与はまた、胸部または腹部手術のような、主要な開放性手術中の虚血性急性腎不全後の患者に発生しうる血液凝血塊を溶解するために治療的に利用されてもよい。そのような事例では、手術中に形成される可能性がある凝血塊を溶解するための予防的治療として、好ましくは、ＢＭＰ−１イソ型は手術前に投与される。
【００７１】
急性膵炎の患者では、ＢＭＰ−７イソ型の阻害を予防的に使用して、疾患の進行を妨げるか、または阻害してもよいのに対して、炎症プロセスの急性相後のＢＭＰ−７の全身投与を使用して膵臓再生を促進してもよい。ＢＭＰ−１イソ型の二重機能がラットの急性腎不全において示され、その場合腎臓虚血前に注射されたＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−１−３抗体は腎臓機能を維持したが、虚血後のＢＭＰ−１−１イソ型の全身投与は著しくラットの生存を高めた（以下の実施例１１を参照されたい）。従って、急性虚血性疾患におけるＢＭＰ−１−１イソ型の二重機能は、２種の処置方法、すなわち予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）（予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｉｔｉｃ））処置および治療的（再生的）処置を暗示する。従って、急性腎臓虚血性疾患を妨げる方法は１種以上のＢＭＰ−１イソ型に対する抗体、たとえば循環するＢＭＰ−１−３イソ型に対する抗体、および循環するＢＭＰ−１−１イソ型に対する抗体を個体に（たとえば非経口的に）投与し、線維形成を妨げるか、または線維形成の実質的な進行を妨げることを含んでいてもよい。対照的に、急性虚血性腎臓疾患を処置する方法は、１種以上の組換えＢＭＰ−１イソ型を個体に（たとえば非経口的に）投与し、疾患の亜急性ステージにおける腎臓のより好ましい再生を支持することを含んでいてもよい。慢性腎不全を処置する方法は、１種以上のＢＭＰ−１イソ型に対する抗体（たとえばＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−１−３に対する抗体）を個体に（たとえば非経口的に）投与し、線維形成および疾患の進行を阻害することを含んでいてもよい。医療専門家は個体の腎臓の状態を査定して、個体が急性虚血のリスクを持ち、それゆえ予防的処置（たとえば、ＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−１−３イソ型を阻害するための抗体分子）の候補であるかどうか、または個体がすでに重篤な急性虚血性腎臓疾患を患っていて、治療的（再生的）処置（ＢＭＰ−１イソ型の投与）の候補であるかどうかを決定しうる。
【００７２】
本明細書で記載される発見の重要な側面（以下の実施例を参照されたい）は、先行技術の教示および前提とは異なり、ＢＭＰファミリー（たとえば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７など）の骨形成性ＢＭＰは、全身的に投与して、骨折または骨疾患の局所的修復のための治療的処置を提供するべきではないということである。なぜなら、血管壁におけるいずれかの免疫不全が局所的に骨形成性ＢＭＰを遊離し、それによって潜在的に局所軟組織の骨化を誘導する可能性があるからである。そのような血管の免疫不全は注射部位、打撲傷、および外傷において容易に発生し、そこでは局所的に利用可能な幹細胞と骨形成性ＢＭＰの組み合わせが結果的に軟組織の望ましくない骨化を生じうる。対照的に、ＢＭＰ−１−３またはＢＭＰ−１−１のようなＢＭＰ−１イソ型が全身的に投与され、局所骨折部位において細胞外マトリックスから骨形成性ＢＭＰを遊離してもよい。ＢＭＰ−１−１およびそのイソ型は真正ＢＭＰではないが、酵素である。
【００７３】
ＢＭＰ−１イソ型は、骨折または個体における（たとえば、種々の代謝的骨障害で発生するような）不適切な骨成長が特徴である骨のような、骨欠損を処置するための全血‐由来凝血物デバイス（ＷＢＣＤ）中の活性成分として利用されてもよい。１種以上のＢＭＰ−１イソ型（たとえば、ＢＭＰ−１−１、ＢＭＰ−１−３）を含む、そのようなＷＢＣＤが、骨折または不適切な骨成長によって特徴付けられる他の欠損部位に移植または注射されて、骨再生を促進してもよい。１種以上のＢＭＰ送達のために調製されたＷＢＣＤは、これと同時に出願され、本発明の譲渡人に譲渡された、同時係属中の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／＿＿に詳細に記載される。上記出願の開示はここに参照として援用される。ＢＭＰ−１イソ型が、ＥＭＣ由来の（または外因性供給源から導入された）真正骨形成性ＢＭＰを触媒し、骨修復活性を高めるという本発明の一部としての発見は、少なくとも１種のＢＭＰ−１イソ型または少なくとも１種のＢＭＰ−１イソ型と少なくとも１種の骨形成性ＢＭＰの組み合わせを含む、改善されたＷＢＣＤを本明細書で記載する基礎を提供する。
【００７４】
従って、好ましい態様では、本発明は以下：
（ａ）全血；
（ｂ）１〜５００μｇ／ｍＬ、好ましくは２〜２００μｇ／ｍＬ、いっそう好ましくは５〜２０μｇ／ｍＬの量のＢＭＰ−１イソ型、および場合により５０〜５００μｇ／ｍＬの量の真正ＢＭＰ；
（ｃ）１〜２．５ｍＭの濃度でカルシウムイオン（Ｃａ＋＋）を供給する外因性物質；
および
（ｄ）場合により、５〜１０ｍｇ／ｍＬフィブリンおよび０．５〜５ｍｇ／ｍＬトロンビンの混合物；を含む、骨折、または個体における不適切な骨成長が特徴である他の骨欠損を処置するための、骨形成性ＢＭＰを提供する。
【００７５】
本明細書で記載される全血‐由来凝血物デバイスは好ましくは以下：
（ａ）（１）全血、
（２）１〜５００μｇ／ｍＬ、好ましくは２〜２００μｇ／ｍＬ、いっそう好ましくは５〜２０μｇ／ｍＬの少なくとも１種のＢＭＰ−１イソ型、
（３）５〜１５ミリモル／Ｌ塩化カルシウム、
および
（４）場合により、５〜１０ｍｇ／ｍＬフィブリンおよび０．５〜５ｍｇ／ｍＬトロンビンの混合物を一緒に混合すること；
（ｂ）物理的に安定な（すなわち、非流体、自己‐支持、粘着性）凝血物ゲルが形成されるまでステップ（ａ）の混合物をインキュベーションすること；を含むステップにより調製される。
【００７６】
先の態様では、１種以上の真正骨形成性ＢＭＰが、好ましくは５０〜５００μｇ／ｍＬの量で混合ステップ（ａ）に添加されてもよい。
好ましい態様では、凝血物デバイスは、初めにフィブリン‐トロンビン混合物、カルシウムイオン、およびＢＭＰ−１イソ型またはＢＭＰ要素を組み合わせて第１の混合物を形成し；続いて成分の濃度が先に示された範囲内に収まり、そして機械的に安定なゲル硬度の凝血物が形成されるまで上記の第１混合物を全血と組み合わせることによって調製される。
【００７７】
好ましくは、本明細書で記載されるＷＢＣＤの調製において使用される全血は、ＷＢＣＤを与えられることになる個体から採取された自家全血である。なぜなら、自家全血は免疫原性でない、すなわち、非‐自己として受容者の免疫システムによって拒絶されないからである。それにもかかわらず、たとえば、患者が既に顕著な量の血液を失っている可能性があるか、またはすでに輸血をうけている可能性がある場合のように、状況によってはクロスマッチした全血が使用されてもよいことは認識される。そのような状況では、ＷＢＣＤにおけるクロスマッチした全血の使用は、クロスマッチした全血を使用するどんな輸血にも関連する血清疾患と同じか、または類似のリスクを導入する。
【００７８】
本発明はまた、骨欠損を処置するための１種以上のＢＭＰ−１イソ型を含む骨形成性全血‐由来凝血物デバイス（ＷＢＣＤ）を調製するためのキットを提供する。たとえば、好ましい態様では、そのようなキットは以下のものから構成されてもよい：
（ａ）凍結乾燥したＢＭＰ−１イソ型を含むバイアル、
（ｂ）凍結乾燥したＢＭＰ−１イソ型粉末を溶解するためのバッファー、
（ｃ）バッファー中の凍結乾燥したＢＭＰ−１イソ型を溶解するためのシリンジと針、
（ｄ）患者の血液を集めるための採血管（Ｖａｃｃｕｔａｉｎｅｒ）、
（ｅ）１Ｍ塩化カルシウムの滅菌溶液、
（ｆ）フィブリン‐トロンビン混合物、
（ｇ）溶解したＢＭＰ−１イソ型と全血を混合するための容器、
（ｈ）開放骨修復手術中に骨末端に骨形成性凝血物を適用するためのスパーテルまたはシリンジ（針あり、または針なし）および
（ｉ）自家またはクロスマッチした全血を使用した、ＢＭＰ−１イソ型を含むＷＢＣＤの調製および使用のための説明書。
実施例
実施例１．へパリンセファロースアフィニティークロマトグラフィーによる、ヒト血漿からの真正骨形成性ＢＭＰではない、ＢＭＰ−１イソ型の精製、および液体クロマトグラフィー‐質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を使用したタンパク質同定。
【００７９】
この研究は本来、いずれかの骨形成性ＢＭＰがヒト血漿から検出され、そして単離されるかどうかを確定するために行われた。
血漿採集
健康な成人（年齢２１〜５０歳）５０人の血液試料は１：９の抗凝固剤対血液比（ｖ／ｖ）を形成するように３．８％クエン酸ナトリウムを含むシリンジ中に採取された。血漿は遠心分離（１５分間、３０００ｘｇ）により得られ、それぞれの成体血漿試料のアリコートを使用して、プールされる血漿保存物が作製された。アリコート試料は分析まで−８０℃で保存された。
アフィニティーカラム精製
プールされたヒト血漿（８０ｍｌ）は１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）で２倍に希釈され、予め１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）で平衡化された５ｍｌヘパリンセファロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に加えられた。結合タンパク質は１．０Ｍおよび２．０Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）によりカラムから溶出された。
硫酸アンモニウム沈殿
飽和硫酸アンモニウム（ＳＡＳ）はボルテックス上で混合しながら、最終濃度３５％（ｗ／ｖ）になるまでタンパク質溶離液に滴下して加えられた。試料は氷上で１０分間保たれ、１２，０００ｘｇで５分間遠心分離された。上清は捨てられ、ペレットはその後のドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析のために調製された。
精製したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析
ペレットはＬａｅｍｍｌｉの方法に従って、１０％ゲルを使用した標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上を流した。電気泳動後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの一部分はニトロセルロースに移され、他は直接クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）により染色された。ニトロセルロース膜は初めにＢＭＰ−７に特異的なマウスモノクローナル抗体（Ｇｅｎｅｒａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）と一緒にインキュベーションされ、一晩４℃に保たれた。アルカリ性ホスファターゼ結合ヤギ抗マウス抗体は室温で１時間、二次抗体として使用された。膜は５ｍｌの発色性基質により染色された。ゲルの他の部分は標準染色手順（４５％メタノール、１０％酢酸中０．１％ＣＢＢ、室温で３０分間）のもとでクーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）により染色された。
【００８０】
ゲルはＣＢＢによる染色により明らかなそれぞれのタンパク質バンドに対応する切片に切断された。ゲル切片は、Ｏｌｓｅｎ ａｎｄ Ｍａｎｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１：１３４１７−１３４２２（２００４）、Ｇｒｇｕｒｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，２０：３１１−３１９（２００７）により改変）により記述されたナノエレクトロスプレーＬＣ−ＭＳインターフェースを使用し、ＨＰＬＣおよび質量分析（ＭＳ）によりそれぞれのタンパク質バンドから遊離されたトリプシン消化ペプチドを分析する方法を使用して加工処理され、それぞれの切片にどんなタンパク質が存在するかを確定した。この研究に特に関連するこの方法のステップの側面は以下に示される。
インゲル（ｉｎ−ｇｅｌ）トリプシン消化プロトコル
ゲルのバンドはＣＢＢ染色されたゲルから切り出され、トリプシン消化された。手短に述べると、ゲル片は８分間１００μｌのアセトニトリルにより収縮させた。液体は除去され、ゲル片は１２分間１００μｌの炭酸水素アンモニウムにより再膨潤させ、その後ＳｐｅｅｄＶａｃ中で１０分間乾燥させた。ジニトロスレイトール（ＤＴＴ、１００μｌ）が添加され、５７℃で４５分間インキュベーションした。ゲル片は５７℃で８分間１００μｌのアセトニトリルにより収縮させ、回転分離して、液体を除去した。ヨードアセタミド（１００μｌ）がそれぞれのゲル片に添加され、攪拌せずに暗所中、室温で４５分間インキュベーションた。トリプシン（１０μｌ）がゲル片毎に添加された。その後ゲル片は回転分離し、１０分間再膨潤させた。試料はサーモミキサー中、３７℃で一晩インキュベーションした。
ペプチド抽出プロトコル
試料は３７℃サーモミキサーから除去された。アセトニトリル、水、およびギ酸を含む溶液（５０μｌ）が添加された。試料は１５分間超音波処理された。上清は保存チューブに移され、５０μｌのアセトニトリルが添加された。抽出物はＳｐｅｅｄＶａｃ中、真空下で完全に乾燥するまで（約４０分間）乾燥させた。ペプチドは水、メタノール、およびギ酸を含む溶液１０μｌで再溶解された。試料は５分間超音波処理され、分析まで−２０℃で保存された。
質量分析
トリプシン消化されたペプチドは以下のように、液体クロマトグラフィー‐質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により分析された。Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ナノフローＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）はナノエレクトロスプレーＬＣ−ＭＳインターフェース（Ｐｒｏｘｅｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｏｄｅｎｓｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して７−テスラＬＴＱ−ＦＴ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に結合した。ペプチドは手製の７５μｍＣ１８ＨＰＬＣカラム上で分離され、正イオンモードにおいてオンザフライ（ｏｎ−ｔｈｅ−ｆｌｙ）で質量分析された。それぞれの測定サイクルは、フル質量分析（ＭＳ）スキャン、続いて選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）スキャン、ＭＳ／ＭＳ、および３つの最も強いイオンのＭＳ／ＭＳ／ＭＳスキャンから構成された。これは２ｐｐｍの典型的なペプチド質量精度、ならびにＭＳ／ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ／ＭＳフラグメントイオンからの付加的な配列情報を提供した。得られたスペクトルは重心を決められ、Ｍａｓｃｏｔ ｓｅａｒｃｈ ｅｎｇｉｎｅ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してＮＣＢＩｎｒデータベースに対して検索した。検索はトリプシン消化特異性、固定した修飾としてのカルボキシアミドメチル化、および可変性修飾としての酸化されたメチオニンにより行われた。ＭＳおよびＭＳ／ＭＳスペクトルに対して、それぞれ５ｐｐｍおよび０．６Ｄａの質量許容誤差が使用された。
結果
ＬＳ−ＭＳおよびイムノブロッティング分析は１２個のトリプシン消化されたペプチドを明らかにし、それらはＮＣＢＩｎｒデータベースと比較された。１２ペプチドは公知の骨形成性ＢＭＰのどれにも属さないが、ＢＭＰ−１−３の前駆体のスプライスイソ型３（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ１３４９７−２；配列番号：２）、すなわちプロコラーゲンＣ−プロテイナーゼに属することが見いだされた。１２ペプチドそれぞれのアミノ酸配列は以下の通りである：
ＧＧＧＰＱＡＩＳＩＧＫ（配列番号：２のアミノ酸１９３−２０３）、
ＨＶＳＩＶＲ（配列番号：２のアミノ酸２３３−２３８）、
ＧＤＩＡＱＡＲ（配列番号：２のアミノ酸３０８−３１４）、
ＩＳＶＴＰＧＥＫ（配列番号：２のアミノ酸３５２−３５９）、
ＬＰＥＰＩＶＳＴＤＳＲ（配列番号：２のアミノ酸４０１−４１１）、
ＤＧＨＳＥＳＳＴＬＩＧＲＹＣＧＹＥＫＰＤＤＩＫ（配列番号：２のアミノ酸４９７−５１９）、
ＦＶＳＤＧＳＩＮＫ（配列番号：２のアミノ酸５２９−５３７）、
ＣＳＣＤＰＧＹＥＬＡＰＤＫ（配列番号：２のアミノ酸５７２−５８４）、
１５ ＳＧＬＴＡＤＳＫ（配列番号：２のアミノ酸６５３−６６０）、
ＫＰＥＰＶＬＡＴＧＳＲ（配列番号：２のアミノ酸８２６−８３６）、
ＦＹＳＤＮＳＶＱＲ（配列番号：２のアミノ酸８４１−８４９）、
ＦＨＳＤＤＴＩＴＫ（配列番号：２のアミノ酸９５８−９６６）。
【００８１】
１２ペプチドは１９０の組み合わせ合同Ｍａｓｃｏｔスコアを有し、そしてそれは１０−１９の確率のランダムな（誤った）同定を提示する。ＮＣＢＩｎｒデータベース中の他のタンパク質で同じセットのペプチドに匹敵するものはなかった。真正骨形成性ＢＭＰタンパク質は、ＬＳ−ＭＳまたはイムノブロッティングにより１００ｋＤａおよび３５ｋＤａの分子量において検出されなかった。
【００８２】
結果は、真正骨形成性ＢＭＰは健康な成人の血液中には通常循環しないが、ＢＭＰ−１−３、すなわちプロコラーゲンＣ−プロテイナーゼは正常なヒト血液の可溶性タンパク質要素であることを示唆する。
実施例２．ヘパリンセファロースアフィニティークロマトグラフィーおよびその後の質量分析（ＭＳ）を使用したタンパク質同定により確定されたヒト血漿または２４時間尿ラット試料から、骨形成性ＢＭＰが単離されるはずがない。
血漿採集
１７人の健康な成人（２１〜５０歳）の血液試料は１：９の抗凝固剤対血液比（ｖ／ｖ）を形成するように３．８％クエン酸ナトリウムを含むシリンジ中に採取された。血漿は遠心分離（１５分間、３０００ｘｇ）により得られ、それぞれの成人試料のアリコートを使用して、プールされる血漿保存物が作製された。アリコート試料は分析まで−８０℃で保存された。
尿採集
健康なラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、５ヶ月齢、Ｈａｒｌａｎ Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ，Ｂｏｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の２４時間尿試料は代謝ケージ中で集められた。精製前に、尿はＷｈａｔｍａｎｎ濾紙（大きいポアサイズ）を通して濾過し、大きな粒子を除去した。試料は研究されるまで−８０℃で保存された。
血漿試料のアフィニティーカラム精製
プールされたヒト血漿（３５ｍｌ）は１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）で２倍に希釈され、予め１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）で平衡化された５ｍｌヘパリンセファロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に加えられた。結合タンパク質は１．０Ｍおよび２．０Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）によりカラムから溶出された。
尿ラット試料のアフィニティーカラム精製
２４時間尿ラット試料（２０ｍｌ）は１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）で２倍に希釈され、予め１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）で平衡化された１ｍｌヘパリンセファロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に加えられた。結合タンパク質は１．０Ｍおよび２．０Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）により溶出された。
硫酸アンモニウム沈殿
飽和硫酸アンモニウム（ＳＡＳ）はボルテックス上で、最終濃度３５％（ｗ／ｖ）になるまでタンパク質溶離液に滴下して加えられた。試料は氷上で１０分間保たれ、１２，０００ｘｇで５分間遠心分離された。上清は捨てられ、ペレットはその後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために調製された。ペレットはＳＤＳ−ＰＡＧＥ上を流し、ゲル上のタンパク質は以下に記載のように分析した。
精製したタンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウェスタンブロット分析
ペレットは下記のＬａｅｍｍｌｉの方法に従って、１０％ゲルを使用して標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上を流した。電気泳動後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの一部分はニトロセルロースに移され、他は直接ＣＢＢにより染色された。ニトロセルロース膜は初めにＢＭＰ−７に特異的なマウスモノクローナル抗体（Ｇｅｎｅｒａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）と一緒にインキュベーションし、一晩４℃に保たれた。アルカリ性ホスファターゼ結合‐ヤギ抗マウスが室温で１時間、二次抗体として使用された。膜は５ｍｌの発色性基質により染色された。ゲルの他の部分は標準染色手順（４５％メタノール、１０％酢酸中０．１％ＣＢＢ；室温で３０分間）のもとでＣＢＢにより染色された。
【００８３】
ゲルはＣＢＢによる染色により明らかになったそれぞれのタンパク質バンドに対応する切片に切断された。ゲル切片はその後加工処理され、上記のトリプシン消化ペプチドを分析する方法を使用して、それぞれの切片にどのタンパク質が存在するかを確定した。特にこの研究に関連するこの方法のステップの側面は以下に示される。
インゲルトリプシン消化プロトコル
ＣＢＢで染色されたゲル上のバンドの分子量位置を、ニトロセルロース膜上のそれらの位置と比較し、尿試料の３９ｋＤａ、３５ｋＤａ、および５０ｋＤａのバンド、および血漿試料の３９ｋＤａおよび３５ｋＤａのバンドがＣＢＢ染色されたゲルから切り出された。ゲル片は８分間１００μｌのアセトニトリルにより収縮させた。液体は除去され、ゲル片は１２分間１００μｌの炭酸水素アンモニウムにより再膨潤させ、その後ＳｐｅｅｄＶａｃ中で１０分間乾燥させた。ＤＴＴ、１００μｌが添加され、５７℃で４５分間インキュベーションされた。ゲル片は５７℃で８分間１００μｌのアセトニトリルにより収縮させ、回転分離し、液体を除去した。ヨードアセタミド（１００μｌ）がそれぞれのゲル片に添加され、攪拌せずに暗所中、室温で４５分間インキュベーションされた。トリプシン（１０μｌ）がゲル片毎に添加された。その後ゲル片は回転分離し、１０分間再膨潤させた。試料はサーモミキサー中、３７℃で一晩インキュベーションされた。
ペプチド抽出プロトコル
試料は３７℃サーモミキサーから除去された。アセトニトリル、水、およびギ酸を含む溶液（５０μｌ）が添加された。試料は１５分間超音波処理された。上清は保存チューブに移され、アセトニトリル５０μｌが添加された。抽出物はＳｐｅｅｄＶａｃ中、完全に乾燥するまで（約４０分間）乾燥させた。ペプチドは水、メタノール、およびギ酸を含む溶液１０μｌで再溶解した。試料は５分間超音波処理され、分析まで−２０℃で保存された。
質量分析（ＭＳ）
トリプシン消化されたペプチドは以下のように、液体クロマトグラフィー‐質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により分析した。Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ナノフローＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）はナノ‐エレクトロスプレーＬＣ−ＭＳインターフェース（Ｐｒｏｘｅｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｏｄｅｎｓｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して７−テスラＬＴＱ−ＦＴ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に結合した。ペプチドは手製の７５μｍＣ１８ＨＰＬＣカラム上で分離され、正イオンモードにおいてオンザフライで質量分析された。それぞれの測定サイクルは、フルＭＳスキャン、続いて選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）スキャン、ＭＳ／ＭＳ、および３つの最も強いイオンのＭＳ／ＭＳ／ＭＳスキャンから構成された。これは２ｐｐｍの典型的なペプチド質量精度、ならびにＭＳ／ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ／ＭＳフラグメントイオンからの付加的な配列情報を生み出した。
【００８４】
得られたスペクトルは重心を決められ、Ｍａｓｃｏｔ ｓｅａｒｃｈ ｅｎｇｉｎｅ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してＮＣＢＩｎｒデータベースに対して検索した。検索はトリプシン消化特異性、固定した修飾としてのカルボキシアミドメチル化、および可変性修飾としての酸化されたメチオニンにより行われた。ＭＳおよびＭＳ／ＭＳスペクトルに対して、それぞれ５ｐｐｍおよび０．６Ｄａの質量許容誤差が使用された。
結果
正常な健康個体由来の精製された血清の全分子範囲から、またはラットの尿から単離されたいずれのタンパク質においても、質量分析により、またはウェスタンブロッティングにより真正、骨形成性ＢＭＰは全く検出されなかった。
実施例３．凍結乾燥ヒト血液試料のヌードマウスへの、および自家ラット凍結乾燥血液試料のラットへの移植による異所性骨形成の欠如
血漿採集
血液（５０ｍｌ）は１０人の健康なヒト個体から集められた。血液は遠心分離して細胞を除去し、血清は分析まで−２０℃で保存された。自家血（５ｍｌ）は２週間に５回の間隔で６ヶ月齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから集められた。試料は遠心分離され、血清は分析まで−２０℃で保存された。
ヌードマウスおよびラットへの移植
１００ｍｇの凍結乾燥したヒト血液と２００ｍｇの脱塩したラット骨マトリックス（ＤＢＭ）を混合することによって骨ペレットが１つ形成され、ヌードマウスの背部分に移植された。さらに、２０ｍｇのラットの凍結乾燥した自家血は１００ｍｇのＤＢＭと混合し、血液が採取されたラットと同じラットの脇の下の皮下に移植された。ペレットは移植３週間後に除去され、組織検査のために固定され、加工処理された。
結果
ヌードマウスの皮下に移植された試験血液試料は骨形成に関して陰性であり、血液がマウスおよびラットに異所性骨形成を誘導しうる量の真正骨形成性ＢＭＰを含まないことを示唆した。
実施例４．組換えヒトＢＭＰ−７とは異なり、全身投与されたＢＭＰ−１−１は異所性骨形成アッセイにおいて骨形成を誘導しない。
【００８５】
脱塩された骨マトリックスからなる骨ペレット（１００μｇ）は先に記載（Ｓｉｍｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１：１３５１４（２００６））のように２０匹の成体Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの脇の下の皮下（異所性部位）に移植された。次に１０匹のラットは移植後２〜７日まで２０μｇの組換えヒトＢＭＰ−７を静脈内注射され、一方別の１０匹のラットは類似のスケジュールで組換えヒトＢＭＰ−１−１を移植された。移植２週間後ペレットは除去され、組織評価のために加工処理された。
結果
ＢＭＰ−７を注射されたラットのペレットでは、移植されたＤＢＭへのＢＭＰ−７の結合および先に記載（Ｓｉｍｉｃ ｅｔ ａｌ，上記）の軟骨内骨形成カスケードの誘導を含む機序により軟骨および骨が形成された。対照的に、ＢＭＰ−１−１を全身処置されたラットのペレットでは、軟骨または骨は全く検出されず、ＢＭＰ−１−１が異所性部位では骨を誘導できないことを示唆した。
実施例５．ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー由来のＢＭＰ−イソ型をコードするｃＤＮＡのクローニングおよび配列解析
ＢＭＰ−１−１、ＢＭＰ−１−３、ＢＭＰ−１−４、およびＢＭＰ−１−７のコーディング配列を含むｃＤＮＡは、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）組換えクローニングおよび発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーからクローニングされた。クローンの正確さは標準コロニーＰＣＲおよび制限酵素分析によって確証された。
【００８６】
ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド塩基配列が確定され、対応するアミノ酸配列が推定された。８３ｋＤａＢＭＰ−１−１のアミノ酸配列は配列番号：１に示される。ＢＭＰ−１−３イソ型をコードするｃＤＮＡクローンのヌクレオチド塩基配列は配列番号：３に示され、１１１ｋＤａＢＭＰ−１−３イソ型の対応するアミノ酸配列は配列番号：２に示される。９１ｋＤａＢＭＰ−１−７イソ型のアミノ酸配列は配列番号：７に示される。
【００８７】
この研究においてＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−１−７イソ型のｃＤＮＡクローンに関して確定されたヌクレオチド塩基および対応するアミノ酸配列はＥＭＢＬおよびＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースに存在するものと同一であることが見いだされた。しかし、本明細書で確定されたＢＭＰ−１−３クローンのｃＤＮＡ配列は１ヌクレオチド塩基がＥＭＢＬデータベースのそれとは異なる。とりわけ、ＥＭＢＬ参照配列（配列番号：３）は１４８７位にチミン（Ｔ）塩基を有するが、クローニングされたＢＭＰ−１−３ｃＤＮＡ（配列番号：５）はアデニン（Ａ）を有し、それが今度はＥＭＢＬ配列のＣＴＧ（ロイシン）から我々によって単離されたＢＭＰ−１−３ｃＤＮＡ配列中のＣＡＧ（グルタミン）へのコドン変化を生じる。従って、ＢＭＰ−１−３のＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースのアミノ酸配列（配列番号：２）は４９３位にロイシン残基を含むが、単離されたｃＤＮＡクローンによってコードされる胎盤ＢＭＰ−１−３タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：４）は４９３位にグルタミンを含む。
【００８８】
単離されたｃＤＮＡクローンの胎盤ＢＭＰ−１−３タンパク質に部位特異的変異誘発が実施され、報告された配列（配列番号：３）の塩基１４７８を転換させた、すなわちアデニン（Ａ）からチミン（Ｔ）に交換した。これは発現すると配列番号：２のアミノ酸配列を有する“変換された”ＢＭＰ−１−３タンパク質を生じた。
結果
ライブラリーから単離されたｃＤＮＡクローンから発現される場合、配列番号：４のアミノ酸配列を有する胎盤ＢＭＰ−１−３タンパク質、およびＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースに報告されたアミノ酸配列（配列番号：２）を有する“変換された”ＢＭＰ−１−３タンパク質は共にプロコラーゲンＩ、ＩＩ、およびＩＩＩ型をｉｎ ｖｉｔｒｏで加工処理することにおいて活性であり、“変換された”ＢＭＰ−１−３タンパク質はより低い濃度において活性が高かった。しかし、単離されたｃＤＮＡクローンから発現された胎盤ＢＭＰ−１−３はカルモジュリンおよびＩＶ型コラーゲンを加工処理し、それらの特性は“変換された”ＢＭＰ−１−３タンパク質により示されなかった。従って、クローニングされた胎盤ライブラリーのｃＤＮＡから発現されるＢＭＰ−１−３イソ型は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースにおいて報告されたＢＭＰ−１−３タンパク質とアミノ酸配列および機能的酵素特性の点で異なる。
実施例６．いくつかの特定のＢＭＰ−１イソ型はヒトの異なる疾患の血液中を循環する。
血漿採集
血液試料は、１０人の健康な成人、それぞれが急性膵炎、肝硬変、急性骨折、透析中の慢性腎不全を含む疾患と診断され、それらに対して処置を受けている１０人の患者、およびまれな骨疾患、すなわち進行性骨化性線維形成異常（ＦＯＰ）および骨形成不全（ＯＩ）の４人の患者から採取された。血液試料は１：９の抗凝固剤対血液比（ｖ／ｖ）を形成するように、３．８％クエン酸ナトリウムを含むシリンジ中に採取された。血漿は遠心分離（１５分間、３０００ｘｇ）により得られ、それぞれの血液試料のアリコートを使用してプールされる血漿保存物が作製され、それらは列挙された正常または病的事例のそれぞれを表す。アリコート試料は分析まで−８０℃で保存された。
アフィニティーカラム精製
それぞれの患者群由来のプールされたヒト血漿８０ｍｌは１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）で２倍に希釈され、予め１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）で平衡化された５ｍｌのヘパリンセファロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に加えられた。結合タンパク質は１．０Ｍおよび２．０Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）によりカラムから溶出された。
硫酸アンモニウム沈殿
飽和硫酸アンモニウム（ＳＡＳ）はボルテックス上で、最終濃度３５％（ｗ／ｖ）になるまでタンパク質溶離液に滴下して加えられた。試料は氷上で１０分間保たれ、１２，０００ｘｇで５分間遠心分離された。上清は捨てられ、ペレットはその後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために調製された。
精製したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析
ペレットはＬａｅｍｍｌｉの方法に従って１０％ゲルの標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上を流した。電気泳動後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの一部分はニトロセルロースに移され、他は直接クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）により染色された。
【００８９】
ニトロセルロース膜は初めにＢＭＰ−１カルボキシル末端ドメインに特異的なウサギモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と一緒にインキュベーションされ、一晩４℃に保たれた。アルカリ性ホスファターゼ結合抗ウサギ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＳＡＤ）は室温で１時間、二次抗体として使用された。膜は５ｍｌの発色性基質により染色された。
【００９０】
ゲルの他の部分は標準染色手順（４５％メタノール、１０％酢酸中０．１％ＣＢＢ；室温で３０分間）のもとで染色された。
ゲルはＣＢＢによる染色により明らかなそれぞれのタンパク質バンドに対応する切片に切断された。ゲル片はその後加工処理され、上記のトリプシン消化ペプチドを分析する方法を使用して、それぞれの切片にどんなタンパク質が存在するかを確定した。特にこの研究に関連するこの方法のステップの側面は以下に示される。
インゲルトリプシン消化プロトコル
ゲル片は５７℃で８分間１００μｌのアセトニトリルにより収縮させ、回転分離して、液体を除去した。ゲル片は１２分間１００μｌの炭酸水素アンモニウムにより再膨潤させ、その後ＳｐｅｅｄＶａｃ中で１０分間乾燥させた。ＤＴＴ（１００μｌ）が添加され、５７℃で４５分間インキュベーションされた。ヨードアセタミド（１００μｌ）がそれぞれのゲル片に添加され、攪拌せずに暗所中、室温で４５分間インキュベーションされた。トリプシン（１０μｌ）がゲル片毎に添加され、回転分離して、ゲル片を１０分間再膨潤させた。試料はサーモミキサー中、３７℃で一晩インキュベーションした。
ペプチド抽出プロトコル
試料は３７℃サーモミキサーから除去された。アセトニトリル、水、およびギ酸を含む溶液（５０μｌ）が添加された。試料は１５分間超音波処理された。上清は保存チューブに移され、アセトニトリル（５０μｌ）が添加された。抽出物はＳｐｅｅｄＶａｃ中で完全に乾燥するまで（約４０分間）乾燥させた。ペプチドは水、メタノール、およびギ酸を含む溶液１０μｌで再溶解された。試料は５分間超音波処理され、分析まで−２０℃で保存された。
質量分析
トリプシン消化されたペプチドは以下のように、液体クロマトグラフィー‐質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により分析した。Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ナノフローＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）はナノエレクトロスプレーＬＣ−ＭＳインターフェース（Ｐｒｏｘｅｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｏｄｅｎｓｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して７−テスラＬＴＱ−ＦＴ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に結合した。ペプチドは手製の７５μｍＣ１８ＨＰＬＣカラム上で分離され、正イオンモードにおいてオンザフライで質量分析された。それぞれの測定サイクルは、フルＭＳスキャン、続いて選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）スキャン、ＭＳ／ＭＳ、および３つの最も強いイオンのＭＳ／ＭＳ／ＭＳスキャンから構成された。これは２ｐｐｍの典型的なペプチド質量精度、ならびにＭＳ／ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ／ＭＳフラグメントイオンからの付加的な配列情報を生み出した。
【００９１】
得られたスペクトルは重心を決められ、Ｍａｓｃｏｔ ｓｅａｒｃｈ ｅｎｇｉｎｅ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してＮＣＢＩｎｒデータベースに対して検索した。検索はトリプシン特異性、固定した修飾としてのカルボキシアミドメチル化、および可変性修飾としての酸化されたメチオニンにより行われた。ＭＳおよびＭＳ／ＭＳスペクトルに関して、それぞれ５ｐｐｍおよび０．６Ｄａの質量許容誤差が使用された。
結果
この研究の結果は表１（上記）に示され、そしてそれは通常の健康状態および示された障害に関連する、循環ＢＭＰ−１イソ型のプロファイルを提供する。結果は、ＢＭＰ−１−３イソ型が通常は健康な個体の血液中に存在するが、急性骨折、肝硬変、および急性膵炎の患者における循環からは消失することを示唆する。驚くべきことに、ＦＯＰおよびＯＩ患者ではＢＭＰ−１−３イソ型が依然として存在するが、健康な個体の血液中に観察されるレベルの１０倍より多く存在することが認められた。
【００９２】
急性骨折患者の循環からのＢＭＰ−１−３イソ型の消失は、骨折した骨端の再架橋中の仮骨形成中の骨再生および修復において、ＥＣＭタンパク質を加工処理することにおけるＢＭＰ−１イソ型の潜在的機能を確証する。肝硬変患者の循環からのＢＭＰ−１−３の消失は、肝臓の線維形成変化に関連したプロセスにおける関与を暗示する。急性膵炎では、疾患の病態生理に関与するいくつかのＥＣＭ分子がＥＣＭ分子のプロセッシングにＢＭＰ−１−３を必要とする。
【００９３】
急性膵炎患者の血清は疾患の初期段階、すなわち、膵臓アミラーゼおよびリパーゼのような膵臓酵素の血清における活発な上昇の前に集められた。驚くべきことに、これらの患者の血液は、タンパク質レベルで以前に検出されていないＢＭＰ−１−７イソ型を含んでいた。
【００９４】
ＢＭＰ−１−５イソ型は透析中の慢性腎不全患者においてだけ見いだされ、このことは、たとえば腎性骨ジストロフィーと呼ばれる骨における線維形成プロセスにおける関与のような、この酵素イソ型の特定の機能を暗示する。興味深いことに、これはまた、タンパク質レベルでのＢＭＰ−１−５イソ型の最初の証明である。以前、ＢＭＰ−１−５イソ型は組織ｍＲＮＡ転写物のレベルにおいてだけ推測されていた。
【００９５】
循環中におけるＢＭＰ−１−３イソ型の存在はＧｅｎｅｒａによって開発された特異的ＢＭＰ−１−３抗体を使用したウェスタンブロットによってさらに確証された（データは示されない）。
実施例７．虚血／再潅流前に循環するＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−１−３を阻害することによるラットの虚血性急性腎不全における腎臓機能の保護。
動物
体重約３５０〜４００ｇの雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットは室内で飼育され、水および餌は自由に与えられた。
虚血／再潅流モデル
ラットは１００ｍｇ／ｋｇケタミン、１０ｍｇ／ｋｇキシラジン、および１ｍｇ／ｋｇアセプロマジンで（筋肉内、ｉｍ）麻酔され、３７℃に保たれた加温テーブルに置かれた。正中線切開が行われ、両方の腎茎部は６０分間クランプで留められた。クランプの除去後、予め温められた通常の生理食塩水５ｍｌが腹膜腔に点滴され、切開は縫合された。全部で２４匹の動物が２種の異なる実験群に割り当てられた：
グループ１．対照群（ｎ＝１２）；処置しない虚血／再潅流モデル（生理食塩水ベヒクル、ｐＨ７．２だけを投与）
グループ２．抗体処置群（ｎ＝１２）；虚血／再潅流モデル＋虚血／再潅流前および虚血／再潅流後５日間、１６μｇの抗‐ＢＭＰ−１−１抗体（ｃ＝１μｇ／μｌ）および１６μｇの抗‐ＢＭＰ−１−３抗体（ｃ＝１μｇ／μｌ）。
【００９６】
血液試料は閉塞前および再潅流後０、２４、７２、９６、１２０、および１６８時間に得られた。血漿は遠心分離によって分けられ、腎臓機能パラメータが測定された。ラットは再潅流後７日目に屠殺され、腎臓は組織構造分析のために摘出された。治療は予防的様式で、クランピング２時間前、次にクランプから開放後５日間適用された。
腎臓機能の査定
血液試料（０．５ｍｌ）は虚血後０、２４、７２、９６、１２０、および１６８時間において眼窩静脈叢から得られた。先に記載のように（Ｖｕｋｉｃｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０２：２０２−２１４（１９９８））、血清クレアチニンはＪａｆｆｅ法（アルカリ性ピクリン酸）により測定され、そして血中尿素窒素（ＢＵＮ）は酵素的グルタメートデヒドロゲナーゼ‐ＵＶ手順により測定された。累積的生存率は対照および実験ラットの両方に関して観察され、記録された。
腎臓の形態
組織構造検査のために腎臓は２％パラホルムアルデヒドで固定され、７μｍパラフィン片が切り出され、ヘマトキシリンエオジンで染色された。尿細管拡張および／または萎縮、間質性線維症および炎症性細胞浸潤物として定義される尿細管間質損傷、ならびに腎糸球体傷害は先に記載（Ｖｕｋｉｃｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，同上）の以下の基準に従って、０〜４までの半定量的スケールを使用して等級付けされた：０＝無変化；１＝試料の１〜２５％を含む限局性変化；２＝試料の２６〜５０％に影響を与える変化；３＝試料の５１〜７５％を含む変化；および４＝試料の７５％より多くに影響を与える病変。２人の独立した観察者が盲検により組織構造の研究を行った。
結果
無処理対照群のラット（グループ１、抗体処置をしない）および処置群のラット（グループ２、ＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−１−３に対する抗体）由来の血液中のクレアチニンレベルは図１に示される。対照ラットでは、手順後生き延びた動物において、両腎臓の６０分間クランピング、続く再潅流後に、クレアチニン（図１、斜線の付いた棒）およびＢＵＮ（示されない）は急に上昇し、虚血後２４時間（１日）および７２時間（３日）において高いままであり、その後７日目に正常化した。虚血前および虚血後５日間ＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−１−３に対する抗体が投与された（グループ２）場合、クレアチニン（図１、縞模様の棒）およびＢＵＮ（示されない）値は低いままであった。生存率は対照群のラットで３５％、虚血前および虚血後５日間ＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−１−３に対する抗体で処置されたラットでは５５％であった。組織構造スライド（図２）で観察されるように、抗体処置をしないで、虚血／再潅流に曝された対照群ラットの腎臓は、腎臓面積の７５％を越えて構造完全性を失い、近位および遠位尿細管が拡張し、尿細管上皮を失い、そして全腎臓面積の約３０％が壊死に起因する線維形成治癒を経験していた（図２、パネル２Ａを参照されたい）。対照的に、虚血／再潅流損傷前にＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−１−３に対する抗体を与えられたラット腎臓組織の切片は腎臓構造の際立った保存を示した（図２、パネル２Ｂを参照されたい）。
【００９７】
これらの結果は、他の状況では虚血／再潅流事象の結果として発生することになる腎臓構造に対する傷害の重症度が、虚血／再潅流事象の前にＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−１−３に対する中和抗体の全身投与の処方によって妨げられうることを示す。
実施例８．ラットにおける虚血性急性腎不全後のＢＭＰ−１イソ型の全身投与により高められた生存。
動物
体重約３００ｇ〜４００ｇの雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットは室内で飼育され、水と餌は自由に与えられた。
虚血／再潅流モデル
ラットは１００ｍｇ／ｋｇケタミン、１０ｍｇ／ｋｇキシラジン、および１ｍｇ／ｋｇアセプロマジンで（ｉｍ）麻酔され、３７℃に保たれた加温テーブルに置かれた。正中線切開を行い、両方の腎茎部は６０分間クランプで留められた。クランプの除去後、予め温められた通常の生理食塩水５ｍｌが腹膜腔に点滴され、切開は縫合された。全部で２４匹の動物が４種の異なる実験群に割り当てられた：
グループ１．陰性対照群（ｎ＝１２）；処置しない虚血／再潅流モデル。
【００９８】
グループ２．陽性対照群（（“ＢＭＰ−７”）（ｎ＝８）；１００μｇ／ｋｇのＢＭＰ−７を５日間。
グループ３．ＢＭＰ−１−１処置群（“ＢＭＰ−１−１”）（ｎ＝８）；４μｇのＢＭＰ−１−１（ｃ＝０．２μｇ／ｋｇ）を５日間。
【００９９】
グループ４．ＢＭＰ−１−１抗体処置群（“ＢＭＰ−１ Ａｂ”）（ｎ＝８）；クランプ開放後（虚血／再潅流事象後）１６μｇの抗ＢＭＰ−１−１抗体（ｃ＝１μｇ／μｌ））を５日間。
【０１００】
血液試料は閉塞前および再潅流後０、２４、７２、９６、１２０、および１６８時間に得られた。血漿は遠心分離によって分けられた。これらの試料は腎臓機能パラメータ測定のために使用された。ラットは再潅流後７日目に屠殺され、腎臓は組織構造分析のために摘出された。処置はクランピング後、およびその後５日間適用された。
腎臓機能の査定
血液試料（０．５ｍｌ）は虚血後０、２４、７２、９６、１２０、および１６８時間において眼窩静脈叢から得られた。先に記載のように、血清クレアチニンはＪａｆｆｅ法（アルカリ性ピクリン酸）により測定され、血中尿素窒素（ＢＵＮ）は酵素的グルタメートデヒドロゲナーゼ‐ＵＶ手順により測定された。累積的生存率は対照および実験ラットの両方に対して観察され、記録された。
結果
種々の処置群のラットの生存は図３に示される。陰性対照群（グループ１、無処置）では、両腎臓の６０分間クランピング、続く再潅流後に、クレアチニンおよびＢＵＮのレベルは急に上昇し（示されない）、６０％より多い動物が生き延びられなかった（図３を参照されたい、◆のデータ点）。再潅流後すぐのＢＭＰ−１−１の投与（“ＢＭＰ−１−１”群）は死亡率を著しく減少させ、無処置の陰性対照群の４０％生存率と比較して８０％の生存率を維持した（図３を参照されたい、▲のデータ点）。
【０１０１】
ＢＭＰ−１−１処置ラットでは、血清クレアチニンレベルは２および３日目では高いが、４日目に急に減少し（データは示さない）、そのことはおそらく血栓形成部分における細胞外マトリックスの迅速なプロセッシングおよび壊死後線維形成組織の蓄積のために顕著な壊死を妨げる構造要素の比較的速やかな回復に起因する。クランプ除去後のＢＭＰ−１−１抗体（“ＢＭＰ−１ Ａｂ”）の５日間投与（図３を参照されたい、ｘ印データ点）は高い死亡率を妨げることにおいて有効ではなかった（すなわち、無処置対照群でも見られるように、７日目において４０％もの低い生存率）。
【０１０２】
この実験結果は、虚血性急性腎不全後の組換えＢＭＰ−１イソ型の投与が腎臓に対する構造傷害を減らすことおよび影響を受けた個体の生存率を増すことに有効であることを示唆する。
実施例９．ＢＭＰ−１イソ型を阻害することによるラット慢性腎不全（ＣＲＦ）の進行の遅延。
動物
体重約３００ｇ〜４００ｇの雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットは室内で飼育され、水と餌は自由に与えられた。
ＣＲＦの５／６腎臓切除（Ｎｘ）モデル
ラットは１００ｍｇ／ｋｇケタミン、１０ｍｇ／ｋｇキシラジン、および１ｍｇ／ｋｇアセプロマジン（ｉｍ）で麻酔され、３７℃に保たれた加温テーブルに置かれた。正中線切開が行われ、両方の腎茎部は６０分間クランプで留められた。左腎臓が除去され、ラットは１週間回復期間を与えられた。その後、右腎臓塊の５／６が除去され、ラットは２週間回復期間を与えられた。全部で８８匹の動物が４種の異なる実験群に割り当てられた：
グループ１．対照群（ｎ＝１２）；生理的ベヒクル溶液を与えられた５／６Ｎｘラット。
【０１０３】
グループ２．ＢＭＰ−１−１抗体群（ｎ＝１２）；Ｎｘ＋１２週間、週に１度１６μｇのＢＭＰ−１−１抗体（ｃ＝１μｇ／μｌ）。
グループ３．ＢＭＰ−１−３抗体群（ｎ＝１２）；Ｎｘ＋１２週間、週に１度１６μｇのＢＭＰ−１−３抗体（ｃ＝１μｇ／μｌ）。
【０１０４】
グループ４．ＢＭＰ−１−１＋ＢＭＰ−１−３抗体群（ｎ＝１２）；Ｎｘ＋１２週間、週に１度１６μｇのＢＭＰ−１−１抗体（ｃ＝１μｇ／μｌ）および１２週間、週に１度１６μｇのＢＭＰ−１−３抗体（ｃ＝１μｇ／μｌ）。
【０１０５】
血液試料は手術前、および実験期間中週に１回得た。ラットは、右腎臓塊の除去後１２週間目に屠殺された。処置は１２週間、週に１回静脈内（ｉｖ）に適用された。
腎臓機能の査定
血液試料（０．５ｍｌ）は眼窩静脈叢から週に１回得られた。血清クレアチニンはＪａｆｆｅ法（アルカリ性ピクリン酸）により測定され、血中尿素窒素（ＢＵＮ）は先に記載（Ｖｕｋｉｃｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，同上）のように、酵素的グルタメートデヒドロゲナーゼ‐ＵＶ手順により測定された。累積的生存率は対照および実験ラットの両方に対して観察され、記録された。
腎臓形態
組織構造検査のために腎臓は２％パラホルムアルデヒドで固定され、７μｍパラフィン片が切り出され、ヘマトキシリンエオジンで染色された。腎臓傷害は（Ｂｏｒｏｖｅｃｋｉ ｅｔ ａＩ．，Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｂｏｎｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ，Ｖｕｋｉｃｅｖｉｃ Ｓ．ａｎｄ Ｓａｍｐａｔｈ Ｋ．Ｔ．編，２００２）に記載のように等級付けられた。手短に述べると、自動コンピュータプログラムを使用して、糸球体、尿細管の構造、および間質線維形成の量が腎臓部分で測定された。測定されたパラメータは、正常な糸球体の数と傷害を受けた糸球体の数の対比として、および線維形成により変化した腎臓部分の割合として表現された。
結果
１２週間の処置後、ベヒクル溶液だけを与えられた対照ラット（グループ１）は３００ｍＥｑ／Ｌより多いクレアチニン値を有した。単一抗体、すなわちＢＭＰ−１−１に対する抗体（グループ２）もしくはＢＭＰ−１−３に対する抗体（グループ３）により、または両方の抗体の組み合わせにより処置された動物は、対照ラットに比較して有意に低い血清クレアチニン値を有した。とりわけ、抗‐ＢＭＰ−１−１抗体（グループ２）または抗‐ＢＭＰ−１−３抗体（グループ３）により処置されたラットは対照ラットよりそれぞれ３６％、および３９％低い血清クレアチニン値を有した。抗‐ＢＭＰ−１−１および抗‐ＢＭＰ−１−３抗体両方の組み合わせにより処置されたラットでは、血清クレアチニン値は対照ラットより５４％低かった。両方の抗体の組み合わせにより処置された動物では（グループ４）では、線維形成面積は対照ラットに比較して５７％減少したが、抗‐ＢＭＰ−１−１抗体だけ（グループ２）、または抗‐ＢＭＰ−１−３抗体だけで処置されたラットでは、線維形成面積はそれぞれ２３％および１６％減少した。その上、線維形成面積は、陽性対照であるＢＭＰ−７により処置されたラットに比較して両方の抗体の組み合わせにより処置されたラットでは４３％減少した。
【０１０６】
これらの結果は、慢性腎不全（ＣＲＦ）のモデルでは、ＢＭＰ−１−１とＢＭＰ−１−３の阻害が、糸球体の構造完全性を維持し、線維形成組織の蓄積を妨害し、そうしてＣＲＦ後１２週間に約５０％の腎臓機能を改善することによって疾患の進行を遅延させたことを示唆する。これはヒトの寿命を約１２０ヶ月または約１０年増すことに関連する。
実施例１０．全身投与されたＢＭＰ−１−１による骨折修復の促進および同所性骨折におけるＢＭＰ−１−１の局在。
動物および実験プロトコル
５４匹のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雌ラットがこの研究で使用された。動物は体重約３００グラム（ｇ）であった。それらは研究中、標準条件（２４℃、１２時間／１２時間明暗周期）下、２０ｘ３２ｘ２０ｃｍケージで飼育され、水およびペレット状の市販の餌（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ， Ｂｏｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を自由摂取させた。ラットは３種の処置群および２種の対照群に分けられた。
【０１０７】
グループ１．対照ラット（１０）は外科的に生み出された骨折後、Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒワイアで処置され、その後ベヒクル溶液（生理食塩水、ｐＨ７．２）だけで全身処置された。
【０１０８】
グループ２．ラットは１週間ＢＭＰ−１−１（１０μｇ／ｋｇ）で処置された。１０匹のラットは大腿骨骨折後、Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒワイアで処置され、その後ＢＭＰ−１−１を静脈内に処置された。
【０１０９】
グループ３．ラットは３週間ＢＭＰ−１−１（１０μｇ／ｋｇ）で処置された。１０匹のラットは大腿骨骨折後、Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒワイアで処置され、その後ＢＭＰ−１−１を静脈内に処置された。
【０１１０】
グループ４．ラットは５週間ＢＭＰ−１−１（１０μｇ／ｋｇ）で処置された。１０匹のラットは大腿骨骨折後、Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒワイアで処置され、その後ＢＭＰ−１−１を静脈内に処置した。
【０１１１】
グループ５．陽性対照。１０匹のラットは大腿骨骨折後、Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒワイアで処置され、その後１００μｇ／ｋｇのＢＭＰ−７を５週間、全身的に注射された。
麻酔されたラットは下肢の毛を剃り、消毒することにより手術の準備をされた。中央の膝蓋骨周辺の切開により、膝蓋骨は側面から関節を外され、大腿骨顆が曝された。Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒワイア（直径１．１ｍｍ、長さ２．７ｃｍ）は顆間ノッチを通って骨髄内管状構造に通された。Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒワイアは膝関節に突き出ず、膝蓋骨の動きも妨害しなかった。膝関節を閉じた後、ピンで留めた右大腿骨の骨幹中央はＢｏｎａｒｅｎｓ ａｎｄ Ｅｉｎｈｏｒｎ（Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．，９７：１０１（１９８４）に記載のように、曲げ力を適用することにより折られた。手術後すぐに放射線写真が得られ、骨幹中央の骨折だけがこの研究に含まれるように、近位または遠位骨折を起こしたラットはこの実験から排除された。
【０１１２】
すべての動物は処置７週間後に屠殺された。放射線写真は手術後１および７週間目に２つの面：ＡＰ（前後）およびＬＬ（側面（ｌａｔｅｒｏ−ｌａｔｅｒａｌ））から撮られた。
１２５Ｉ‐標識ＢＭＰ−１−１（１２５Ｉ‐ＢＭＰ−１−１）の生体内分布および薬物動態学
組換えヒトＢＭＰ−１−１は改変したラクトペルオキシダーゼ法を使用して、５ｍＣｉのキャリア‐フリーＮａ１２５Ｉにより放射ヨウ素化された。ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラムでのゲル濾過を使用して遊離ヨウ化物と放射ヨウ素化されたＢＭＰ−１−１（１２５ＩＢＭＰ−１−１）が分離された。カラムは０．２％Ｔｗｅｅｎ−８０および０．１％卵白アルブミンを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．５で溶出した。この研究で使用された１２５Ｉ‐ＢＭＰ−１−１調製物の比活性は０．２７３ｍＣｉ／ｍｇであった。ラット（ｎ＝１０）は用量レベル１０μｇ／ｋｇ、活性２０μＣｉの１２５Ｉ‐ＢＭＰ−１−１を単回注射された。注射容量は５００μｌであった。動物は注射後３０分、１、３、６および２４時間に屠殺された。組織は取り除かれ、重さを量られ、放射活性はガンマカウンターで測定された。ある期間の組織による１２５Ｉ‐ＢＭＰ−１の相対取り込みは１２５Ｉ‐ＢＭＰ−１ナノグラム（ｎｇ）／グラム（ｇ）組織湿重量として表された。実験はまた、５匹のラットにおいて、大腿骨の外科的骨切り術後５日目の急性骨折大腿骨により実施された。
ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏでのＤＸＡによる骨塩密度（ＢＭＤ）測定
２週間のインタバルで（１０週間の間）、動物は二重エネルギーＸ線吸収法（ＤＸＡ；Ｈｏｌｏｇｉｃ ＱＤＲ−４０００，Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）による骨密度測定をスキャンされた。実験の終わりに、動物は麻酔され、体重測定され、安楽死させられた。右大腿骨は取り除かれ、７０％エタノールで固定され、Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｓｃａｎソフトウェアを備えたＤＸＡによる骨塩含有量（ＢＭＣ）およびＢＭＤの確定に使用された。スキャン領域サイズは５．０８ｘ１．９０２ｃｍであり、解像度は０．０２５４ｘ０．０１２７であり、そしてスピードは７．２５ｍｍ／ｓであった。スキャン画像が骨面積、骨塩含有量、および全骨の骨密度に対して分析された。
ＰＱＣＴ
単離された大腿骨は、ソフトウェアバージョン５．４０の付いた末梢骨定量的コンピュータトモグラフィー（ＰＱＣＴ）Ｘ線装置（Ｓｔｒａｔｅｃ ＸＣＴ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍ；Ｎｏｒｌａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｒｔ Ａｔｋｉｎｓｏｎ，ＷＩ）によりスキャンされた。容積、密度、および総骨面積、骨梁、および皮質領域が確定された。
マイクロＣＴ
マイクロコンピュータトモグラフィー（マイクロＣＴ）装置（μＣＴ４０）およびこれらの実験で使用される分析ソフトウェアはＳＣＡＮＣＯ Ｍｅｄｉｃａｌ ＡＧ（Ｂａｓｓｅｒｓｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から得られた。右大腿骨は背腹方向にそれぞれ１３μｍの厚さの２５０切片をスキャンした。骨の三次元再構築は三角形分割アルゴリズムを使用して実施された。骨梁容積（ＢＶ、ｍｍ３）、骨梁数（Ｔｂ．Ｎ、１／ｍｍ）、骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ、μｍ）、および骨梁離断性（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）（Ｔｂ．Ｓｐ．μｍ）はＨｉｌｄｅｂｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．（Ｃｏｍｐ．Ｍｅｔｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．，１：１５（１９９９）により記載された方法を使用して３‐次元（３Ｄ）画像上で直接測定した。骨梁骨パターン因子（ＴＢＰｆ）および構造モデルインデックス（ＳＭＩ）は提供されたソフトウェアを使用してマイクロＣＴ装置により計算した。
組織構造
大腿骨は組織構造分析のために取り除かれ、パラフィンに包埋され、１０μｍの切片に切り出されて、ヘマラウン（ｈｅｍａｌａｕｎ）‐エオジンおよびトルイジンブルーにより染色された。
結果
放射性標識されたＢＭＰ−１−１は健康なラットおよび大腿骨骨折ラットに静脈内注射された。健康な動物では、放射性ＢＭＰ−１−１は主に肝臓（２３％）、骨（３１％）、および筋肉（９％）に蓄積した。骨折ラットでは、注射されたＢＭＰ−１−１の８０％は骨折部位に蓄積した。
【０１１３】
ＢＭＰ−１−１を１週間毎日静脈内注射されたラットは、４３％加速された骨再生を示し、その値は先に記載（Ｐａｒａｌｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：６７３６（２００３））のように、骨修復のスコアリングシステムに基づいて計算された。形成された仮骨は１週間ＢＭＰ−１を処置されたラットでは４３％大きく、３〜５週間ＢＭＰ−１を処置されたラットでは６３％および７１％増大した。骨治癒は、ラット大腿骨の３つまたは４つの皮質の完全な再架橋により明らかなように、１または５週間ＢＭＰ−１で処置されたラットではそれぞれ４０〜８０％加速された。
【０１１４】
ｉｎ ｖｉｖｏ骨塩密度測定は、形成された仮骨における塩蓄積増加を示したが、ＰＱＣＴ分析は骨折した大腿骨上の塩蓄積増加を示した。マイクロＣＴ測定は外科的骨切り術後７週間目に、骨折再生中に新規に形成された骨梁の蓄積増加を示した。
【０１１５】
ラットにおけるこの急性大腿骨骨折の研究のこれらの結果は、ほとんど大部分（たとえば約８０％）の全身投与されたＢＭＰ−１が骨折の同所性部位に局在すること、および全身投与されたＢＭＰ−１−１はそのような急性大腿骨骨折の治癒促進に有効であることを総合的に示唆する。
実施例１１．大腿骨骨折ラットに全身投与されたＢＭＰ−１−１
先の実施例１０に類似の手順を利用して、ラットの大腿骨骨折の治癒に関する、ＢＭＰ−１−１イソ型、ＢＭＰ−７およびＢＭＰ−１−１イソ型に対する抗体の全身投与の効果を比較する研究が行われた。
【０１１６】
骨折後４週間目に、ＢＭＰ−１イソ型を全身処置されたラットの骨折部位における仮骨は、無処置対照ラットのそれより約２０％大きく、ＢＭＰ−７で全身処置されたラットより９０％大きかった。
【０１１７】
骨折後８週間目の結果は図４に示される。骨折部分は図４Ａ〜４Ｆの大腿骨写真のそれぞれにおいて丸で囲まれる。大腿骨骨折ラットへのＢＭＰ−１−１の全身投与は、ＢＭＰ−７の全身投与に比較して治癒が促進された。骨折線はほとんど消失していて、皮質骨はＢＭＰ−１−１を全身処置されたラットでは再架橋されていた（図４の骨４Ａおよび４Ｄを参照されたい）が、ＢＭＰ−７で全身処置されたラットでは骨折線は依然として肉眼で見られた（図４の骨４Ｂ、４Ｃ、および４Ｅを参照されたい）。ＢＭＰ−１−１に対する中和抗体の全身投与は骨折治癒を遅延させた（図４の骨４Ｆを参照されたい）。
【０１１８】
結果は、ＢＭＰ−１イソ型の全身投与は骨欠損処置のための有効な方法であることを示唆する。
実施例１２．大腿骨骨折ラットに局所投与されたＢＭＰ−１−１
骨折の動物モデル
２４匹の３ヶ月齢Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄ラット（３５０ｇ）は大腿骨骨折後、Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒワイアで処置された。ラットは以下の３種の処置群に分けられた：
グループ１．対照ラット（８）はベヒクル溶液（生理食塩水；ＢＭＰ−１−１もＢＭＰ−７も含まない）だけを含む全（自家）血‐由来凝血物デバイスにより処置された。
【０１１９】
グループ２．ラットはＢＭＰ−１（１０μｇ／ｋｇのＢＭＰ−１−１）を含む全血‐由来凝血物デバイスにより局所的に処置された。
グループ３．ＢＭＰ−７（１０μｇ／ｋｇ）を含む全血‐由来凝血物デバイスにより処置された。
【０１２０】
すべての動物は手術後７週間目に屠殺された。放射線写真は１、４および７週間目に２つの面、すなわちＡＰ（前後）およびＬＬ（側面（ｌａｔｅｒｏ−ｌａｔｅｒａｌ））から撮られた。
【０１２１】
麻酔されたラットは下肢の毛を剃り、消毒することにより手術の準備をされた。中央の膝蓋骨周辺の切開により、膝蓋骨は側面から関節を外され、大腿骨顆が曝された。Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒワイア（直径１．１ｍｍ、長さ２．７ｃｍ）は顆間ノッチを通って骨髄内管状構造に通された。Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒワイアは膝関節に突き出ず、膝蓋骨の動きも妨害しなかった。膝関節を閉じた後、ピンで留めた右大腿骨の骨幹中央はＢｏｎａｒｅｎｓ ａｎｄ Ｅｉｎｈｏｒｎ（Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．，９７：１０１（１９８４））に記載のように、曲げ力を適用することにより折られた。手術後すぐに放射線写真が得られ、骨幹中央の骨折だけがこの研究に含まれるように、近位または遠位骨折を起こしたラットはこの実験から排除された。
ＢＭＰ−１を含む全血‐由来凝血物デバイスの調製
骨折を処置するための全血‐由来凝血物デバイス（ＷＢＣＤ）がラット大腿骨の骨折を処置するために調製された。手短に述べると、１ｍｌの自家全血がそれぞれのラットの眼窩叢から採取された。次に全血はトロンビン‐フィブリン試薬、１Ｍ外因性塩化カルシウム、および示された量のＢＭＰ−１−１またはＢＭＰ−７と合わせ、その後室温で３０〜４５分間インキュベーションし、対応する自家血を提供したラットの骨折した大腿骨への移植前の凝血物形成を可能にした。
生化学的試験
両側の大腿骨は、先に記載（Ｓｉｍｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１：１３４７２（２００６））の３点曲げ試験を含む、生化学的試験のために取り除かれた。反対側の健康な骨が陽性対照として使用された。皮質骨と骨梁の両方の生化学的特徴測定のための３点曲げ試験および圧子圧入試験が使用された。
結果
Ｘ線放射線写真分析は、手術後４週間において対照としてベヒクル溶液（ＢＭＰ−１−１、およびＢＭＰ−７を全く含まない）だけを含むＷＢＣＤで処置されたラットでは、０．６±０．０３皮質が治癒したが、手術後７週間において１．８±０．４の皮質が治癒したことを示した。仮骨面積は４週間で２４．３±７．８ｍｍ２であり、７週間では１８．７±６．４ｍｍ２であった。
【０１２２】
全血‐由来凝血物デバイス＋ＢＭＰ−１−１で処置されたラットでは、４週間で１．３±０．５（ｔ−検定、対照に対してＰ＞０．０１）皮質が治癒し、一方７週間では２．９±０．９（ｔ−検定、Ｐ＞０．０１）皮質が治癒した。仮骨面積は１３．４±４．７ｍｍ２（ｔ−検定、対照に対してＰ＞０．０１）であり、７週間ではそれは７．６±３．８ｍｍ２（ｔ−検定、対照に対してＰ＞０．０５）であった。
【０１２３】
ＷＢＣＤ＋ＢＭＰ−７で処置されたラットでは、４週間で１．７±０．７（ｔ−検定、対照に対してＰ＞０．０１およびＢＭＰ−１に対してＰ＞０．１）の皮質が治癒したが、７週間では３．２±１．４（ｔ−検定、対照に対してＰ＞０．０１およびＢＭＰ−１に対してＰ＞０．１）の皮質が治癒した。仮骨面積は１１．３±３．９ｍｍ２（ｔ−検定、対照に対してＰ＞０．０１およびＢＭＰ−１に対してＰ＞０．１）であり、７週間ではそれは６．７±２．９ｍｍ２（ｔ−検定、対照に対してＰ＞０．０５およびＢＭＰ−１に対してＰ＞０．１）であった。
【０１２４】
これらの結果は、大腿骨骨折修復のモデルの同所性部位（欠損部位）において局所投与されたＢＭＰ−１−１は、対照ラットに比較して骨折治癒を有意に促進したことを示唆する。驚くべきことに、組成物中でＢＭＰ−７がＷＢＣＤと一緒に使用された場合、大腿骨は対照ラットより早く治癒するが、ＥＣＭプロセッシング酵素であるＢＭＰ−１−１で処置された動物とは差がなかった。ＢＭＰ−７は、商業的に、キャリアとしてのウシコラーゲンと一緒に使用される。骨修復の類似のモデルにおいて単独で移植されたウシコラーゲンは無処置対照ラットと比較して骨修復を阻害する。
生化学的試験
３点曲げ試験は、ＢＭＰ−１−１処置大腿骨は全血‐由来凝血物デバイスだけ（ＢＭＰ−１−１なし）により処置された対照大腿骨に比較して、再骨折するには有意に大きな最大荷重が必要であることを示唆した（以下の表２を参照されたい）。向かい側の脚の大腿骨（反対側大腿骨）と比較して、ＢＭＰ−１−１により処置された骨は再骨折を引き起こすために必要な荷重は２６％少なかったが；対照骨が再骨折するために必要な荷重は正常な反対側骨より５１％少なかった（表２を参照されたい）。
【０１２５】
ＢＭＰ−７で処置された骨を破壊するために必要な最大荷重はＢＭＰ−１−１により処置されたものと統計的に差がなかった。これらの結果は、ＢＭＰ−１−１がラットモデルにおける急性骨折の骨修復および再生を促進すること、および全血‐由来凝血物デバイスと一緒に使用される場合、それはＢＭＰ−７と同様に効果的であることを総合的に示唆する放射線写真による発見を確証した。骨梁の圧子圧入試験は、ＢＭＰ−１−１処置骨は対照動物より骨梁がいっそう多かったことを示唆する（表３を参照されたい）。
【０１２６】
【表２】
【０１２７】
【表３】
【０１２８】
実施例１３．ＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−１−３により処置された、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養したラット頭蓋冠移植片培養物の培地へのＢＭＰ−４およびＢＭＰ−７の遊離
１８日齢のラット胎児は妊娠ラットから得られ、それらの頭蓋冠は単離され、消毒され、等しいサイズに合わせ、先に記載（Ｖｕｋｉｃｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８７９３（１９８９））のように、骨特異的培地を含む培養物中に配置された。そのような頭蓋冠移植片培養物は骨細胞および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を生じる。培養４８時間後に、移植された頭蓋冠は３日間毎日、１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−１−１または１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−１−３により処置された。培地は毎日集められ、−２０℃で保存され、４日目にヘパリンカラムで精製された。ヘパリンカラムで精製後、タンパク質濃度が決定され、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、およびＢＭＰ−７が先に記載（Ｓｉｍｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８６：１３４７２（２００６））のように、イムノブロッティングにより検出された。
【０１２９】
結果は、対照培養物の培地では検出可能な量の真正骨形成性ＢＭＰは全く見いだされず、一方、ＢＭＰ−１−１で処置された頭蓋冠の培地ではＢＭＰ−４の成熟ドメインが検出されたがＢＭＰ−２、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７は検出されなかったことを示唆した。これらの結果は、ＢＭＰ−１−１が骨細胞、および保存される真正ＢＭＰ分子の保存場所としての役割を果たすと考えられるＥＣＭに富む胎児頭蓋冠からなる培養移植片からのＢＭＰ−４の遊離に効果を有することを示唆する（Ｍａｒｔｉｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｃｙｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｌ．，１：２３（２００６）も参照されたい）。ＢＭＰ−４に加え、ＢＭＰ−１−３で処置された培養物培地ではＢＭＰ−７が検出され、ＢＭＰ−１−３がＢＭＰ−１−１より多くの真正ＢＭＰを遊離することを示唆する。
実施例１４．ＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−７により局所的に処置されたウサギにおける骨欠損治癒の相乗的促進
動物
尺骨分節‐欠損モデルを使用して、成体雄Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅウサギ（体重３ｋｇ〜４ｋｇ）における骨治癒が評価された。移植片は、異なる量の組換えヒト成熟ＢＭＰ−１−１および組換えヒト成熟ＢＭＰ−７が添加された、キャリアとしての血液凝血物（Ｇｅｎｅｒａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から構成された。これらの動物は凝血物移植片だけを与えられた動物（陰性対照）と比較された。ウサギは手術前１週間、駆虫薬で処置された。動物はまた、手術前および手術後１０日間エンロフロキサシンを筋肉内注射により投与された。
【０１３０】
麻酔および鎮痛下のウサギを用い、前肢１本は毛を剃られ、滅菌的に用意されて、布で覆われた。約２．５センチメートルの長さで側面から切開され、尺骨を覆う組織が切断された。振動鋸により尺骨の中心に、１．５センチメートルの分節性骨膜欠損が作製された。橈骨は物理的安定性に対して完全なまま残され、内部または外部固定デバイスは全く使用されなかった。生理食塩水で十分に洗浄して骨破片および漏れ出た骨髄細胞を除去した後、移植片は適所に注意深く詰められて欠損を充填した。その後凝血物に血清が載せられた。軟組織は移植片を含むように層状に重ねて、慎重に閉じられた。動物は、耐荷重活動、水、およびウサギ用の餌を完全に許可された。
ＷＢＣＤ調製
血液試料は、手術１日前にウサギ片縁耳静脈から抗凝固物質を使用せずに１．５ｍＬ用量を試験管に集められた。ＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−７はそれぞれ１４μｇおよび１００μｇの量で血液に添加された。血液試料は４℃に放置し、凝固させた。翌日、試料は８０００ｘｇ、５分間遠心分離された。液体部分（血清）は除去され、保存され、凝血物は使用のために準備された。
【０１３１】
ウサギは以下に挙げたグループの１つに分けられ、欠損は以下のように処置された：
グループ１．ＢＭＰまたはＢＭＰ−１イソ型無しに全血凝血物デバイス（ＷＢＣＤ）だけで処置された対照ウサギ（ｎ＝８）。
【０１３２】
グループ２．１４μｇ／１．５ｍＬのＢＭＰ−１−１を含むＷＢＣＤで処置されたウサギ。
グループ３．１００μｇ／１．５ｍＬのＢＭＰ−７を含むＷＢＣＤで処置されたウサギ。
【０１３３】
グループ４．１４μｇ／１．５ｍＬのＢＭＰ−１−１＋１００μｇのＢＭＰ−７／１．５ｍＬを含むＷＢＣＤで処置されたウサギ。
結果
結果は図５〜８に示される。２週間に１度のＸ線による追跡調査から観察されるように、ウサギ尺骨欠損はＷＢＣＤだけ（ＢＭＰ−１−１、およびＢＭＰ−７を全く含まない）で処置された対照ウサギでは治癒しなかった。対照グループの６週間後の代表的な骨において治癒されない欠損は図５Ａおよび５Ｂ（同じ骨の２つの写真）に示される。
【０１３４】
ＢＭＰ−１−１を含むＷＢＣＤで局所的に処置されたウサギ（グループ２）の代表的な骨における６週間後の結果は、図６Ａおよび６Ｂに示される。ＢＭＰ−７を含むＷＢＣＤにより局所的に処置されたウサギ（グループ３）の代表的な骨における６週間後の結果は、図７Ａおよび７Ｂに示される。ＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−７を含むＷＢＣＤにより局所的に処置されたウサギ（グループ３）の代表的な骨における６週間後の結果は、図８Ａおよび８Ｂに示される。ＢＭＰ−７を含むＷＢＣＤで処置されたウサギ（グループ３）は手術後８週間で骨欠損が再架橋されるが、ＢＭＰ−１−１を含むＷＢＣＤ（グループ２）で処置されたウサギは２週間で早くも初期の骨形成、そして手術後８週間で進行した治癒を示した。しかし、ＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−７両方の組み合わせを有するＷＢＣＤにより局所的に処置されたウサギ（グループ４）は、欠損の完全な再架橋、および新規な皮質の形成を伴う尺骨の相乗的治癒を有し、６週間で早くも新規に形成された骨が顕著にリモデリングされた（図８Ａおよび８Ｂを参照されたい）。
【０１３５】
これらの結果は骨折の同所性部位に局所的に適用されたＢＭＰ−１−１およびＢＭＰ−７は相乗的に作用して骨再生を促進することを示唆する。
上記のテキスト中に引用されるすべての特許、出願および刊行物は参照として本明細書に援用される。
【０１３６】
発明の開示または以下の特許請求の範囲から逸脱しない、本明細書に記載の発明の他のバリエーションおよび態様は今や当業者には明らかであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体の慢性腎不全を診断するために個体からの血液試料を試験する方法であって：ＢＭＰ−１イソ型であるＢＭＰ−１−３、およびＢＭＰ−１−５の試料中の存在を確定するために個体の血液試料を試験することを含み、ここで個体の循環血における両方の該ＢＭＰ−１イソ型の存在が個体の慢性腎不全を示す、方法。
【請求項２】
個体の急性膵炎を診断するために個体からの血液試料を試験する方法であって：ＢＭＰ−１イソ型であるＢＭＰ−１−７の試料中の存在を確定するために個体の血液試料を試験することを含み、ここで個体の循環血における両方の該ＢＭＰ−１イソ型の存在が個体の急性膵炎を示す、方法。
【請求項３】
ＢＭＰ−１イソ型を含む、個体の虚血性急性腎不全を治療するための医薬組成物であって、ここで該医薬組成物は腎損傷の診断後に個体に全身的に投与される、医薬組成物。
【請求項４】
個体における虚血／再潅流損傷を阻害するために有効な量の、１種以上のＢＭＰ−１イソ型に特異的な１種以上の抗体分子を含む、個体の腎臓に対する虚血／再潅流傷害を処置するための医薬組成物。
【請求項５】
虚血／再潅流事象の前に、１種以上のＢＭＰ−１イソ型に対する１種以上の抗体分子が個体に全身的に投与される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ＢＭＰ−１−１に対する抗体分子、ＢＭＰ−１−３に対する抗体分子、またはそのような抗体分子の組み合わせが個体に投与される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項７】
以下：
（ａ）全血
（ｂ）ＢＭＰ−１イソ型
（ｃ）外因性塩化カルシウム
（ｄ）場合により、外因性のフィブリン及びトロンビンの混合物、ならびに
（ｅ）場合により、骨形成性ＢＭＰ
を含む、個体の骨欠損を処置するための骨形成性全血由来凝血物デバイス（ＷＢＣＤ）であって、
ここで、外因性塩化カルシウムは、均質で、凝集力があり、シリンジで吸収可能であり、注射可能であり、そして展性がある（ｍａｌｌｅａｂｌｅ）凝血物ゲルであって、骨欠損部位において該欠損を充填するかまたは該欠損の骨端を再架橋するために新しい骨の成長を促進するのに十分な時間にわたって存在を維持することが可能な凝血物ゲルを提供するのに有効な量で存在する、骨形成性全血由来凝血物デバイス（ＷＢＣＤ）。
【請求項８】
全血が個体から採取された自家全血であるか、または個体とクロスマッチされた全血である、請求項７に記載の骨形成性ＷＢＣＤ。
【請求項９】
フィブリン−トロンビン混合物が、存在するときは、塩化カルシウムおよびＢＭＰ−１イソ型と結合して第一の混合物を形成し、これに対して全血が添加されて第二の混合物が形成され、そしてここで第二の混合物が、物理的に安定なゲルが形成されるまでインキュベーションされる、請求項７に記載の骨形成性ＷＢＣＤ。
【請求項１０】
ＢＭＰ−１イソ型が、ＢＭＰ−１−１、ＢＭＰ−１−３、およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項７に記載のＷＢＣＤ。
【請求項１１】
ＢＭＰ−１イソ型がＢＭＰ−１−３である、請求項１０に記載のＷＢＣＤ。
【請求項１２】
ＢＭＰ−１−３が、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載のＷＢＣＤ。
【請求項１３】
ＢＭＰ−１イソ型が１〜５００μｇ／ｍＬの量で存在する、請求項７に記載のＷＢＣＤ。
【請求項１４】
ＢＭＰ−１イソ型が２〜２００μｇ／ｍＬの量で存在する、請求項１３に記載のＷＢＣＤ。
【請求項１５】
ＢＭＰ−１イソ型が５〜２０μｇ／ｍＬの量で存在する、請求項１４に記載のＷＢＣＤ。
【請求項１６】
外因性塩化カルシウムが５〜１５ｍＭの濃度で存在する、請求項７に記載のＷＢＣＤ。
【請求項１７】
フィブリン−トロンビン混合物が存在するときは、フィブリンの濃度が５〜１０ｍｇ／ｍＬである、請求項７に記載のＷＢＣＤ。
【請求項１８】
フィブリン−トロンビン混合物が存在するときは、フィブリンの濃度が０.５〜５ｍｇ／ｍＬである、請求項７に記載のＷＢＣＤ。
【請求項１９】
骨形成性ＢＭＰが、存在するときは、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項７に記載のＷＢＣＤ。
【請求項２０】
以下：
（ａ）１種以上の凍結乾燥されたＢＭＰ−１イソ型を含むバイアル、
（ｂ）凍結乾燥された１種以上のＢＭＰ−１イソ型を溶解するためのバッファー、
（ｃ）バッファー中の凍結乾燥された１種以上のＢＭＰ−１イソ型を溶解するためのシリンジ、
（ｄ）患者の血液を集めるための採血管（Ｖａｃｃｕｔａｉｎｅｒ）、
（ｅ）１Ｍ塩化カルシウムの滅菌溶液、
（ｆ）フィブリン‐トロンビン混合物、
（ｇ）溶解された１種以上のＢＭＰ−１イソ型および他の成分と全血を混合するための容器、
（ｈ）開放骨修復手術中に骨末端に骨形成性凝血物を適用するために適したスパーテルまたはシリンジ、および
（ｉ）骨欠損への適用に適した物理的に安定なゲルを形成するための、１種以上のＢＭＰ−１イソ型、塩化カルシウム、および場合によりフィブリンおよびトロンビンを含む混合物と混合した全血からなるＷＢＣＤの調製法および使用のための説明書であって、ここで該物理的に安定なゲルは均質で、凝集力があり、シリンジで吸収可能であり、注射可能であり、そして展性がある（ｍａｌｌｅａｂｌｅ）凝血物ゲルである
を含む、骨形成性全血‐由来凝血物デバイス（ＷＢＣＤ）を調製するためのキット。
【請求項２１】
ＢＭＰ−１イソ型が、ＢＭＰ−１−１、ＢＭＰ−１−３、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
さらに骨形成性ＢＭＰを含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項２３】
骨形成性ＢＭＰが、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
配列番号４のアミノ酸配列を有する単離されたＢＭＰ−１イソ型。
【請求項２５】
配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２６】
配列番号５のヌクレオチド配列を有する、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１】
個体の慢性腎不全を診断するために個体からの血液試料を試験する方法であって：ＢＭＰ−１イソ型であるＢＭＰ−１−３、およびＢＭＰ−１−５の試料中の存在を確定するために個体の血液試料を試験することを含み、ここで個体の循環血における両方の該ＢＭＰ−１イソ型の存在が個体の慢性腎不全を示す、方法。
【請求項２】
個体の急性膵炎を診断するために個体からの血液試料を試験する方法であって：ＢＭＰ−１イソ型であるＢＭＰ−１−７の試料中の存在を確定するために個体の血液試料を試験することを含み、ここで個体の循環血における両方の該ＢＭＰ−１イソ型の存在が個体の急性膵炎を示す、方法。
【請求項３】
ＢＭＰ−１イソ型を含む、個体の虚血性急性腎不全を治療するための医薬組成物であって、ここで該医薬組成物は腎損傷の診断後に個体に全身的に投与される、医薬組成物。
【請求項４】
個体における虚血／再潅流損傷を阻害するために有効な量の、１種以上のＢＭＰ−１イソ型に特異的な１種以上の抗体分子を含む、個体の腎臓に対する虚血／再潅流傷害を処置するための医薬組成物。
【請求項５】
虚血／再潅流事象の前に、１種以上のＢＭＰ−１イソ型に対する１種以上の抗体分子が個体に全身的に投与される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ＢＭＰ−１−１に対する抗体分子、ＢＭＰ−１−３に対する抗体分子、またはそのような抗体分子の組み合わせが個体に投与される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項７】
以下：
（ａ）全血
（ｂ）ＢＭＰ−１イソ型
（ｃ）外因性塩化カルシウム
（ｄ）場合により、外因性のフィブリン及びトロンビンの混合物、ならびに
（ｅ）場合により、骨形成性ＢＭＰ
を含む、個体の骨欠損を処置するための骨形成性全血由来凝血物デバイス（ＷＢＣＤ）であって、
ここで、外因性塩化カルシウムは、均質で、凝集力があり、シリンジで吸収可能であり、注射可能であり、そして展性がある（ｍａｌｌｅａｂｌｅ）凝血物ゲルであって、骨欠損部位において該欠損を充填するかまたは該欠損の骨端を再架橋するために新しい骨の成長を促進するのに十分な時間にわたって存在を維持することが可能な凝血物ゲルを提供するのに有効な量で存在する、骨形成性全血由来凝血物デバイス（ＷＢＣＤ）。
【請求項８】
全血が個体から採取された自家全血であるか、または個体とクロスマッチされた全血である、請求項７に記載の骨形成性ＷＢＣＤ。
【請求項９】
フィブリン−トロンビン混合物が、存在するときは、塩化カルシウムおよびＢＭＰ−１イソ型と結合して第一の混合物を形成し、これに対して全血が添加されて第二の混合物が形成され、そしてここで第二の混合物が、物理的に安定なゲルが形成されるまでインキュベーションされる、請求項７に記載の骨形成性ＷＢＣＤ。
【請求項１０】
ＢＭＰ−１イソ型が、ＢＭＰ−１−１、ＢＭＰ−１−３、およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項７に記載のＷＢＣＤ。
【請求項１１】
ＢＭＰ−１イソ型がＢＭＰ−１−３である、請求項１０に記載のＷＢＣＤ。
【請求項１２】
ＢＭＰ−１−３が、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載のＷＢＣＤ。
【請求項１３】
ＢＭＰ−１イソ型が１〜５００μｇ／ｍＬの量で存在する、請求項７に記載のＷＢＣＤ。
【請求項１４】
ＢＭＰ−１イソ型が２〜２００μｇ／ｍＬの量で存在する、請求項１３に記載のＷＢＣＤ。
【請求項１５】
ＢＭＰ−１イソ型が５〜２０μｇ／ｍＬの量で存在する、請求項１４に記載のＷＢＣＤ。
【請求項１６】
外因性塩化カルシウムが５〜１５ｍＭの濃度で存在する、請求項７に記載のＷＢＣＤ。
【請求項１７】
フィブリン−トロンビン混合物が存在するときは、フィブリンの濃度が５〜１０ｍｇ／ｍＬである、請求項７に記載のＷＢＣＤ。
【請求項１８】
フィブリン−トロンビン混合物が存在するときは、フィブリンの濃度が０.５〜５ｍｇ／ｍＬである、請求項７に記載のＷＢＣＤ。
【請求項１９】
骨形成性ＢＭＰが、存在するときは、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項７に記載のＷＢＣＤ。
【請求項２０】
以下：
（ａ）１種以上の凍結乾燥されたＢＭＰ−１イソ型を含むバイアル、
（ｂ）凍結乾燥された１種以上のＢＭＰ−１イソ型を溶解するためのバッファー、
（ｃ）バッファー中の凍結乾燥された１種以上のＢＭＰ−１イソ型を溶解するためのシリンジ、
（ｄ）患者の血液を集めるための採血管（Ｖａｃｃｕｔａｉｎｅｒ）、
（ｅ）１Ｍ塩化カルシウムの滅菌溶液、
（ｆ）フィブリン‐トロンビン混合物、
（ｇ）溶解された１種以上のＢＭＰ−１イソ型および他の成分と全血を混合するための容器、
（ｈ）開放骨修復手術中に骨末端に骨形成性凝血物を適用するために適したスパーテルまたはシリンジ、および
（ｉ）骨欠損への適用に適した物理的に安定なゲルを形成するための、１種以上のＢＭＰ−１イソ型、塩化カルシウム、および場合によりフィブリンおよびトロンビンを含む混合物と混合した全血からなるＷＢＣＤの調製法および使用のための説明書であって、ここで該物理的に安定なゲルは均質で、凝集力があり、シリンジで吸収可能であり、注射可能であり、そして展性がある（ｍａｌｌｅａｂｌｅ）凝血物ゲルである
を含む、骨形成性全血‐由来凝血物デバイス（ＷＢＣＤ）を調製するためのキット。
【請求項２１】
ＢＭＰ−１イソ型が、ＢＭＰ−１−１、ＢＭＰ−１−３、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
さらに骨形成性ＢＭＰを含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項２３】
骨形成性ＢＭＰが、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
配列番号４のアミノ酸配列を有する単離されたＢＭＰ−１イソ型。
【請求項２５】
配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２６】
配列番号５のヌクレオチド配列を有する、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１２−２１１９０１（Ｐ２０１２−２１１９０１Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−９２０１２（Ｐ２０１２−９２０１２）
【出願日】平成２４年４月１３日（２０１２．４．１３）
【分割の表示】特願２００９−５２０８６４（Ｐ２００９−５２０８６４）の分割
【原出願日】平成１９年７月２３日（２００７．７．２３）
【出願人】（５０９０２０２５１）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年４月１３日（２０１２．４．１３）
【分割の表示】特願２００９−５２０８６４（Ｐ２００９−５２０８６４）の分割
【原出願日】平成１９年７月２３日（２００７．７．２３）
【出願人】（５０９０２０２５１）
【Ｆターム（参考）】
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