骨の移植、エンジニアリングおよび再生を目的としたフカン類の使用
本発明は、骨移植、エンジニアリングおよび再生を目的とする５０００および１０００００ｇ／ｍｏｌの間の重量平均モル質量のフカン類の使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨の移植、エンジニアリングおよび再生を目的とした、５０００および１０００００ｇ／ｍｏｌの間の重量平均モル質量を有するフカン類の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
フカン類は、硫酸化多糖族である(ＢｅｒｔｅａｕおよびＭｕｌｌｏｙ、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、１３巻、６号、２９Ｒ〜４０Ｒ頁、２００３年（非特許文献１）参照)。フカン類は、主要なフコース単位の硫酸塩富化鎖（ホモフカン類）と、フコース、ガラクトース、キシロースおよびグルクロン酸単位から構成される低硫酸化鎖（キシロフコグルクロナン類）から成る多糖類である。フカン類は、藻類、特に褐藻類（ｐｈｅｏｐｈｙｃｅａ、褐藻綱）から、または、海洋無脊椎動物類から抽出することができる。フカン類は、いったん抽出されると、一般に、５０００００ｇ／ｍｏｌを超える重量平均モル質量を有する。５０００および１０００００ｇ／ｍｏｌの重量平均モル質量を有するフカン類を得るために、フカン類の解重合のための多数の技術が存在する（欧州特許第０４０３３７７号（特許文献１）参照）。フカン類の多数の治療的用途が記載されている：抗凝固剤（欧州特許第０４０３３７７号（特許文献１）参照）、歯周病および真皮病巣の治療（国際公開第９９／３２０９９号公報（特許文献２）参照)、抗血栓剤（国際公開第０１／１５６５号公報（特許文献３）参照）、関節炎および骨関節炎の治療（国際公開第０３／０１８０３３号公報（特許文献４）参照）である。
【０００３】
骨質損失の充填は、骨関節疾患および外傷（骨腫瘍、外傷後遺症、変性疾患）で多く見られる問題である。理想的な骨置換材料の詳細は、特に、１）レシピエントへの感染リスクを伴わない良好な忍容性；２）その場での骨構造への一体化；３）移植部位での応力を支持するのに十分な機械的特性を有する良質の骨新生許容能を含む。これらの材料の中でも、天然または合成生体材料が、骨移植片の代用物になる。これらの材料に望ましい特性は、骨伝導性、即ち前記材料との接触時の骨再建誘導能、および／または、骨誘導性、即ち骨外部位でも骨形成を刺激する能力である。数件の研究アプローチ（Ｈｅｙｍａｎｎら、Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ ｓｕｒｇｅｒｙ、２００１年；８７巻、８〜１７頁（非特許文献２）参照）は、生体材料の骨形成特性を改善することに向かう傾向にある。骨形成能を有する細胞外マトリクスタンパク質もしくは増殖因子との当該生体材料の組合せは、一方の研究路線である。これらの増殖因子類は、生体材料に組み入れられ、生体内で放出され、それによって、生体材料内で骨形成を増強することができる。リン酸カルシウム（ＣａＰ）セラミックも、薬効物質（抗がん剤、抗生物質など）の送達システムとして考えられている。骨形成細胞、即ち骨組織を構成することができる細胞の、骨代用物との組合せは、別の主要な研究路線である。この「ハイブリッド」の組合せは、第１に充填代用物、第２に自己由来骨形成細胞源を必要とする。これらの細胞は、骨芽細胞が単離される骨外植片に由来することができる。しかし、この方法では、少量の骨形成細胞が得ることができるにすぎない。骨形成細胞は、生体外および生体内での分化が可能な骨髄の骨前駆細胞に由来することもできる。この点で、全骨髄細胞か間質細胞のみを使用することができる。骨髄の前駆細胞から分化骨芽細胞クローンを得ることもできる。ラットにおいて、骨部位に注入された骨髄細胞は、独力で、調整骨欠損部に充填することができる。骨髄細胞がＣａＰセラミックと結合すると、セラミックは骨伝導性を獲得することができる。事実、動物で実施された多数の研究は、自己由来骨髄細胞とともにインキュベートされ、その後、骨外部位に埋め込まれたセラミック内部での骨化を実証している。さらに、骨髄細胞は、骨部位での生体材料の一体化を増強する。当該骨髄細胞は、骨再生の速さと質を促進する。
【０００４】
国際公開第０２／０２０５１号公報（特許文献５）は、骨治癒における、菌種Ｖｉｂｒｉｏ ｄｉａｂｏｌｉｃｕｓによって排泄される多糖の使用を記載している。当該多糖は、人工骨コーティングまたは骨伝導性充填材の調製に使用されることができる。国際公開第０２／０２０５１号公報（特許文献５）の教示によれば、高分子量（１００００００ｇ／ｍｏｌ程度）を有するフカン類は、骨治癒に効果を示さない。
【特許文献１】欧州特許第０４０３３７７号
【特許文献２】国際公開第９９／３２０９９号公報
【特許文献３】国際公開第０１／１５６５号公報
【特許文献４】国際公開第０３／０１８０３３号公報
【特許文献５】国際公開第０２／０２０５１号公報
【非特許文献１】ＢｅｒｔｅａｕおよびＭｕｌｌｏｙ、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、１３巻、６号、２９Ｒ〜４０Ｒ頁、２００３年
【非特許文献２】Ｈｅｙｍａｎｎら、Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ ｓｕｒｇｅｒｙ、２００１年；８７巻、８〜１７頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
骨再建に関する先行技術の不十分さおよび欠点を考慮して、本発明者らは、骨伝導特性が改善された骨代用物を提供する目標を自らに課した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
驚くべきことに、本発明者らは、この目標が、特定の族の多糖、即ち、５０００および１０００００ｇ／ｍｏｌの間の重量平均モル質量を有するフカン類を使って達成可能であることを発見した。これらのフカン類は、骨芽細胞類の遊走および増殖を、また、新骨細胞外マトリクスの合成およびその石灰化も、促進および加速することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の主題は、生体材料と、５０００および１０００００ｇ／ｍｏｌの間、特に１００００および４００００ｇ／ｍｏｌの間の重量平均モル質量のフカン類とを含む骨代用物である。
【０００８】
本発明で使用されるフカン類は、Ｍ１およびＭ２の間の重量平均モル質量を有し、当該重量平均モル質量Ｍ１およびＭ２は互いに独立して選択され、Ｍ１は、５０００、１００００、１５０００、２００００および２５０００ｇ／ｍｏｌの数値から選択され、Ｍ２は、４００００、６００００、８００００、９００００および１０００００ｇ／ｍｏｌの数値から選択される。
【０００９】
好ましくは、フカン類は褐藻から得られる。当業者は、本発明で使用されるフカン類の入手に通常の技術を使用することができる。使用可能な技術の一例として、前述（欧州特許第０４０３３７７号参照）のような高分子量フカン類の制御溶解とその後のゲルクロマトグラフィーでの精製による、または、前述（欧州特許第０８４６１２９号または国際公開第９７／０８２０６号公報）のような高分子量フカン類のラジカル解重合による技術に言及することができ、当業者であれば、操作条件を容易に適合させ、所望の重量平均モル質量を得られよう。
【００１０】
用語「生体材料」は、機能または器官の置換に用いられる任意の材料を指すことを意図する。当該生体材料は、医療用具に使用され、また、組織、器官もしくは機能を置換または治療することを目的とするいずれかの生体材料である。
【００１１】
典型的には、本発明による骨代用物を調製するためには、当業者は、骨エンジニアリングに汎用されるどの生体材料も使用することができる。例として、当該生体材料は、チタン、コラーゲン、除タンパクおよび／または脱灰骨、サンゴ、リン酸カルシウムセラミック、ヒドロキシアパタイト、ベータ−リン酸三カルシウムおよび生体活性ガラス類から成る群より選択される１種類以上の材料を含むことができる。
【００１２】
有利なことに、本発明による骨代用物は、線維芽細胞増殖因子類（ＦＧＦ類）、トランスフォーミング増殖因子類（ＴＧＦ類）、インスリン増殖因子類Ｉ（ＩＧＦ類）、血小板由来増殖因子類（ＰＤＧＦ類）、骨形成タンパク質類（ＢＭＰ類）および血管内皮細胞増殖因子類（ＶＥＧＦ類）を含む群より選択される１種以上の増殖因子類も含むことができる。
【００１３】
好ましくは、本発明による骨代用物は、ＢＭＰ類、ＦＧＦ類、ＴＧＦ−ベータおよびＶＥＧＦ類から成る群より選択される１種以上の増殖因子類も含むことができる。
【００１４】
有利なことに、本発明による骨代用物は、インターロイキン１、インターロイキン６、インターロイキン４、腫瘍壊死因子アルファ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子およびマクロファージコロニー刺激因子から成る群より選択される１種以上のサイトカイン類も含むことができる。
【００１５】
典型的には、本発明による骨代用物の生体材料の表面は、フカン類を含むコーティングを有する。
【００１６】
当業者は、フカン類を含むコーティングによる生体材料表面の被覆に通常の技術を使用することができる。例として、当業者は、当該生体材料表面にフカン類を移植することができる。
【００１７】
本発明による骨代用物の生体材料は、フカン類を含浸されることもできる。
【００１８】
有利なことに、本発明による骨代用物は、骨髄由来、骨外植片類由来または骨膜外植片類由来の骨形成細胞類から成る群より選択される細胞類も含むことができる。
【００１９】
そのような骨代用物を調製するために、当業者は、所望の細胞類と共に骨代用物のコロニー形成を実施することができる。
【００２０】
１つの実施形態によれば、本発明は、骨髄、骨または骨膜に由来する骨形成細胞類から成る群より選択される細胞型用であって、５０００および１０００００ｇ／ｍｏｌの間、特に１００００〜４００００ｇ／ｍｏｌの間の重量平均モル質量のフカン類を含む培養培地に関する。
【００２１】
典型的には、本発明による培養培地は、線維芽細胞増殖因子類（ＦＧＦ類）、トランスフォーミング増殖因子類（ＴＧＦ類）、インスリン増殖因子類Ｉ（ＩＧＦ類）、血小板由来増殖因子類（ＰＧＦ類）、骨形成タンパク質類（ＢＭＰ類）および血管内皮細胞増殖因子類（ＶＥＧＦ類）から成る群より選択される１種類以上の増殖因子類も含むことができる。
【００２２】
１つの実施形態によれば、本発明は、骨髄、骨または骨膜に由来する骨形成細胞類の培養のために、５０００および１０００００ｇ／ｍｏｌの間、特に１００００および４００００ｇ／ｍｏｌの間の重量平均モル質量のフカン類を使用することに関する。
【００２３】
１つの実施形態によれば、本発明は、骨髄、骨または骨膜に由来する骨形成細胞類の群から選択される細胞類の培養方法に関し、前記細胞類が上記の培養培地中で培養されることを特徴とする。
【００２４】
１つの実施形態によれば、本発明は、骨髄、骨または骨膜に由来する骨形成細胞類の培養方法に関し、前記細胞類が上記の骨代用物上で培養されることを特徴とする。
【００２５】
１つの実施形態によれば、本発明は、骨再生に対する活性を有する医療用具の製造のために、５０００および１０００００ｇ／ｍｏｌの間、特に１００００および４００００ｇ／ｍｏｌの間の重量平均モル質量のフカン類を使用することに関する。
【００２６】
典型的には、そのような医療用具は、骨の再生を促進し、例えば、病変、事故または外科処置による病巣後に起こる組織欠損を充填するために、整形外科手術、歯周手術および形成外科手術で使用することができる。
【００２７】
そのような医療用具は、例えば、骨修復もしくは充填材として、骨移植片として、人工骨として、または、歯科もしくは骨関節インプラントとして使用することができる。
【００２８】
そのような医療用具は、例えば、骨粗鬆症などの骨病変の治療に使用することができる。
【００２９】
そのような医療用具は、例えば、フカン類を、好ましくは水和型で、例えばヒドロゲルの形態で、単独で、または、線維芽細胞増殖因子類（ＦＧＦ類）、トランスフォーミング増殖因子類（ＴＧＦ類）、インスリン増殖因子類Ｉ（ＩＧＦ類）、血小板由来増殖因子類（ＰＤＧＦ類）、骨形成タンパク質類（ＢＭＰ類）および血管内皮細胞増殖因子類（ＶＥＧＦ類）から成る群より選択される１種類以上の増殖因子類との組合せとして含むことができる。
【００３０】
フカン類を増殖因子と組合せることで、骨再生速度の増加が可能となる。
【００３１】
好ましくは、本発明による医療用具は、水和型のフカン類と、ＢＭＰ類、ＦＧＦ類、ＴＧＦ−ベータおよびＶＥＧＦ類の群から選択される１種類以上の増殖因子類とを含む。
【００３２】
典型的には、本発明による医療用具は、本発明による骨代用物を含むことができる。
【００３３】
全引用文献の内容は、本詳細な説明の一部と見なすこととする。
【００３４】
以下の例を使用して、本発明をさらに明確に以下に説明する。これらの例は、本発明の主題の例示として提示するにすぎず、いずれも、制約を設けるものではない。
【実施例】
【００３５】
［材料および方法］
＜フカン類の入手＞
本発明で使用するフカン類は、既述の方法（Ｂｌａｃｋら、Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ．、３巻、１２２〜１２９頁、１９５２年に準拠、または、Ｎｉｓｈｉｎｏら、Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ．、１８６巻，１１９〜１２９頁、１９８９年に準拠）に従ってＰｈｅｏｐｈｙｃｅａｅ、即ち褐藻類（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍ）から抽出する。使用する低分子量フカン類（ＬＭＷＦ）は、既述の方法によって入手する。即ち、制御された加水分解とそれに続く透過性ゲルでの分取分画法もしくはサイズ排除(欧州特許第０４０３３７７号、または、ラジカル解重合（欧州特許第０８４６１２９号および欧州特許第１２０７８９１号）によって得られる。
【００３６】
＜骨芽細胞の入手＞
ヒト骨芽細胞は、骨折整復術中の手術ブロックで回収した骨折片に由来する。骨サンプルは、血液の細胞成分が除去されるまで、ＰＢＳで洗浄する。骨栓を３〜４ｍｍの立方体に切断した後、培養皿に静置する。培養培地（ＤＭＥＭ ４０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）フンギゾン（２μｇ／ｍｌ））１滴を各外植片に配置し、培養皿のプラスチックに付着させる。次いで、当該培養皿をインキュベーター（３７℃、空気（９５％）／ＣＯ２（５％））に１〜２時間入れる。次いで、２０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培養培地で当該外植片を覆う。この培地は、３日置きに交換する。細胞は、外植片から遊走し、培養６日目以降、培養皿にコロニーを形成し、４週間の培養後、集密が達成され、次いで、培養皿から外植片を取り出す。
【００３７】
＜二次元骨芽細胞培養＞
初代継代培養の集密骨芽細胞を２４穴皿に細胞１００００個／ｍｌの割合で接種した後、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補った１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地中で２４時間インキュベートする。細胞の付着、伝播後、培養培地をフカン類（１０μｇ／ｍｌ）含有もしくは非含有の１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地に取り替える。次いで、これらの培養培地を３日置きに交換する。培養２１日目に、骨芽細胞分化を完了させるために、β−グリセロホスフェート（１０ｍＭ）とアスコルビン酸２−リン酸塩（２５ｍＭ）を添加する。培養８、１５、３０および４５日後、マトリクスメタロプロテアーゼの分泌を検討するため、培養上清を取り出す。細胞は、細胞カウンティングのためにトリプシン処理するか、無水エタノール（−２０℃）で固定する。固定によって、その後、形態および免疫細胞化学検査が可能になる。
【００３８】
＜細胞培養用生体材料の調製＞
生体材料は、骨梁間隙の清浄化と非コラーゲンタンパク質の除去によって得られるウシ由来の海綿骨網である。生体材料は、予め小断片に切断し（２ｍｍ×２ｍｍ）、これらの断片を無水エタノール中に４８時間放置した後、３７℃（空気／５％ＣＯ２）の培養インキュベーター内、ＤＭＥＭ中で２４時間インキュベートする。骨生体材料は、培養培地中、フカン類（５０μｇ／ｍｌ）の存在下または不在下で再水和させる。
【００３９】
＜骨生体材料中の骨芽細胞の培養＞
フカン類を含浸可能または含浸不可能な骨生体材料を含有する２４穴培養皿（細胞２００００個／穴）に正常ヒト骨芽細胞を接種する。これらの移植片を、ＤＭＥＭ、ウシ胎仔血清（１０％）、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）およびトランスフェリン（５μｇ／ｍｌ）から成る「石灰化」培養培地中で維持する。実験期間中、この培養培地は、３日置きに取り替える。培養１０または３０日後、このように得られる移植片を培養皿から取り出し、固定し、組織検査および走査電子顕微鏡検査用に調製する。
【００４０】
＜細胞のＧＩＥＭＳＡ染色＞
この染色法は、核および細胞質の可視化を可能にする。固定後、細胞を前濾過ＧＩＥＭＳＡ染料（Ｍｅｒｃｋ）で２分間被覆する。過剰の染料は、蒸留水で連続洗浄することによって除去する。
【００４１】
＜Ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ反応＞
この反応は、培養物中のミネラル沈着物の可視化を可能にする。これらの沈着物は、黒色部分として現れる。固定後の二次元培養物を蒸留水で洗浄し、次いで、硝酸銀溶液（５％）中で３０分間インキュベートする。当該材料は、蒸留水による洗浄後、日光に曝露する。
【００４２】
＜その場でのアルカリホスファターゼ活性の可視化＞
前記細胞を、ＰＢＳで洗浄した後、緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（０．０５Ｍ）、ｐＨ＝９．５、ＭｇＳＯ４（０．１％）、ナフチルリン酸塩（０．１％）、ファーストレッド（０．１％))中、周囲温度で１時間インキュベートする。上清を除去し、各穴を蒸留水で２〜３回洗浄する。アルカリホスファターゼ活性陽性部分は、褐色に見える。
【００４３】
＜Ｉ型コラーゲンの免疫検出＞
細胞もしくは骨生体材料切片を、ＰＢＳで洗浄し、次に、ＣＨ３ＯＨ（８０％）／Ｈ２Ｏ２（２０％）溶液中で１０分間インキュベートし、内在パーオキシダーゼを不活性化する。穴もしくは切片をＰＢＳで洗浄し、次いで、非特異的抗原部位をブロックする（０．１％スキムミルク、１０分）。洗浄後、当該材料をマウス抗ヒトコラーゲンＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、１／４０ｔｈ）とともに１時間インキュベートする。洗浄後、当該材料は、さらに、マウスＩｇＧ（１／６０ｔｈ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）に対するパーオキシダーゼ標識ヤギ抗体とともにインキュベートする。洗浄後、３，３’−ジアミノベンジデン四塩酸塩（Ｓｉｇｍａ）との反応（１５分、暗所）によって、Ｉ型コラーゲン含有部分のパーオキシダーゼ活性を検出する。
【００４４】
＜走査電子顕微鏡検査＞
１０および３０日目に、骨生体材料を４％パラホルムアルデヒドで固定する。生体材料は、ＰＢＳで洗浄し、２％四酸化オスミウムで４５分間後固定した後、カコジル酸ナトリウム浴で３回連続洗浄し、次いで、エタノール溶液から無水エタノールまでを使って脱水する。装置中、臨界点で、液体ＣＯ２によるアルコールの置換を実施する。走査電子顕微鏡検査によるサンプルの至適観察に必要な表面伝導層を得るために、真空下、陰極スプレー法によってサンプル表面の金被覆を実施する。
【００４５】
［結果］
＜二次元培養＞
骨外植片由来細胞は、培養でその真の骨芽細胞表現型を獲得する前骨芽細胞であると考えられる。この最終分化は、増殖期、マトリクス合成期、ならびに、最後に成熟および石灰化期に相当する数期後に起こる。増殖期の終了は、集密後、三次元細胞外マトリクス中の成熟骨芽細胞から成る小結節の出現を特徴とする。Ｉ型コラーゲンの合成は、これらの小結節が形成される時点で最大に達し、次いで、急速に減少する。成熟期は、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）の発現増加を特徴とし、当該発現は、石灰化期開始時に最高点に達する。次いで、骨芽細胞の最終分化とともに、ＡＰの発現が減少する。
【００４６】
＜二次元培養物中での骨芽細胞の増殖＞
培養培地へのフカン類の添加は、骨芽細胞の増殖を顕著に刺激する（３０日目に＋４５％、４５日目に＋６０％、図１参照）。
【００４７】
＜アルカリホスファターゼ＞
培養物中の骨芽細胞によるアルカリホスファターゼ（ＡＰ）の発現速度論によって、分化経路に沿った当該細胞の進行を評価することができる。培養物中のアルカリホスファターゼの出現は、骨芽細胞分化の開始を特徴付けているが、成熟骨芽細胞は、この酵素をもはや発現しない。
【００４８】
対照培養物中のＡＰの発現は、培養１５日以降に認められ（図２ａ）、４５日目に最大となる（図２ｄ）。この発現は、フカン類（１０μｇ／ｍＬ）の存在下でインキュベートした培養物中でははるかに早まる（図３ａ、３ｂ、３ｃ参照）。事実、フカン類の存在下では、ＡＰの発現は、８日間の培養以降に認められ（図３ａ）、１５日後に最大に達し（図３ｂ）、３０日目に観察した培養物中で明らかに減少した（図３ｃ）。フカン類存在下での培養４５日後には、ＡＰ発現は、もはや観察できない。それは、ミネラル沈着物が、事実上、培養皿全体を覆っているからである。
【００４９】
＜Ｉ型コラーゲンのＶｏｎ Ｋｏｓｓａ反応および免疫検出＞
Ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ反応は、培養物中の骨芽細胞が分泌する細胞外マトリクスの石灰化状態の評価を可能にする（図４）。４５日目の対照培養物中に、若干の石灰化小結節が検出される（図４ｃ）が、これらの同小結節は、フカン類存在培養物中では、３０日以降に認められる（図４ｂ）。培養４５日目では、多糖とともにインキュベートした骨芽細胞が発現する細胞外マトリクスは、事実上、完全に石灰化される（図４ｄ）。
【００５０】
４５日後、対照培養物またはフカン類とともにインキュベートした培養物の細胞外マトリクス中にＩ型コラーゲンの存在が検出される（図５）。対照培養物中のこの線維状コラーゲン沈着物は、非石灰化網もしくはほぼ非石灰化網を形成し、細胞伸長に密接に関連する（図５ａ)。フカン類処理培養物中のＩ型コラーゲンの検出は、Ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ反応後に認められるミネラル沈着物に相当する稠密沈着物を伴うコラーゲン網を示す（図５ｂ）。
【００５１】
＜ゼラチナーゼＡ（ＭＭＰ−２）およびコラゲナーゼ３（ＭＭＰ−１３）の発現＞
培養物中の骨芽細胞は、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−１３を発現する。ＭＭＰ−２は、特に、培養開始時に発現されるが、ＭＭＰ−１３は、分化終了時に骨芽細胞によって発現される。当該培養物へのフカン類の添加は、骨芽細胞によるゼラチナーゼＡの発現を明らかに減少させるが、ＭＭＰ−１３の誘導発現は、骨芽細胞系における当該細胞の分化促進の表れである。
【００５２】
［結論］
培養培地へのフカン類の添加は、骨芽細胞系の分化を促進する。
【００５３】
＜三次元培養＞
［走査電子顕微鏡検査］
走査電子顕微鏡検査は、生体材料の高分子構造、さらに、骨芽細胞によるそのコロニー形成の観察することを可能にする。
【００５４】
＜無細胞生体材料＞
骨芽細胞を接種しない生体材料を観察すると、フカン類前処理が、骨生体材料の限外構造を変化させないことを示している(図６ａ、６ｂ)。
【００５５】
＜骨芽細胞接種生体材料＞
培養１０日目、細胞は、フカン類を含浸した、または、含浸しない生体材料の表面に付着する。これらの細胞は、平坦な細胞体を有し、これが、コラーゲン網に付着し、ここから、細長い仮足が伸び、細胞外マトリクスへの付着を完成することができる（図７）。
【００５６】
３０日間の培養後、対照生体材料と、フカン類を含む生体材料の細胞充実度は、１０日後に観察されるものよりもはるかに高く、これは、実際にコラーゲンマトリクス内部での骨芽細胞の増殖を意味する（図８）。さらに、培養３０日目には、フカン類を含む生体材料の細胞密度（図８ｂ）は、未処理生体材料で観察されるものよりもはるかに高い（図８ａ）。事実、フカン類なしでは、骨芽細胞（図８ａ）は、当該生体材料の全体積を占有せず、当該生体材料の細孔が見える。フカン類含浸後、生体材料は、高い細胞密度を示し、細孔は、大部分、細胞によって塞がれている（図８ｂ）。骨芽細胞は、これらの細孔深くにコロニーを形成し、その縁の両側に架橋を形成する（図９）。
【００５７】
細胞と接触するフィラメント状細胞外物質の存在が認められる。これは、骨芽細胞による原線維状細胞外マトリクスの分泌に相当する。さらに、骨芽細胞およびフィラメント状細胞外マトリクスと接触する球状細胞外物質の存在が認められる（図１０ｂ）。これは、石灰化マトリクスに相当する。
【００５８】
［結論］
骨生体材料のフカン類含浸は、細胞付着を変化させない。
【００５９】
骨生体材料のフカン類含浸は、骨芽細胞増殖を刺激する。
【００６０】
骨生体材料のフカン類含浸は、骨芽細胞が分泌する細胞外マトリクスの石灰化を促進する。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、フカン類の存在下および不在下における、時間の関数としての骨芽細胞数の変化を示す。
【図２】図２ａ、２ｂ、２ｃおよび２ｄは、アルカリホスファターゼ活性が検出される骨芽細胞の対照培養物の写真を表し、図２ａ、２ｂ、２ｃおよび２ｄは、それぞれ、培養８、１５、３０および４５日後に撮影された写真を表す。
【図３】図３ａ、３ｂ、３ｃは、１０μｇ／ｍｌのフカン類の存在下で実施された骨芽細胞培養物の写真を表し、最終的に、培養物中の細胞にアルカリホスファターゼ活性が検出され、図３ａ、３ｂおよび３ｃは、それぞれ、培養８、１５および３０日後に撮影された写真を表す。
【図４】図４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄは、骨芽細胞の対照培養物（図４ａおよび４ｃ）、１０μｇ／ｍｌのフカン類の存在下で実施された骨芽細胞培養物（図４ｂおよび４ｄ）の写真を表し、培養物中の細胞の固定後、最終的に実施されたＶｏｎ Ｋｏｓｓａ反応によってミネラル沈着物が可視化されており、図４ａおよび４ｂは、培養３０日後に撮影された写真を表しており、図４ｃおよび４ｄは、培養４５日後に撮影された写真を表す。
【図５】図５ａ、５ｂは、骨芽細胞の対照培養物（図５ａ）、１０μｇ／ｍｌのフカン類存在下の骨芽細胞培養物（図５ｂ）の写真を表し、培養４５日後、培養物中の細胞に対してＩ型コラーゲンの免疫検出が実施される。
【図６】図６ａおよび６ｂは、対照無細胞生体材料（図６ａ）またはフカン類含浸無細胞生体材料（図６ｂ）の走査電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）によって得られた画像を表す。
【図７】図７ａおよび７ｂは、対照生体材料（図７ａ）またはフカン類を含浸させ、そこで骨芽細胞を１０日間培養した生体材料（図７ｂ）の走査電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）によって得られた画像を表す。
【図８】図８ａおよび８ｂは、対照生体材料（図８ａ）またはフカン類を含浸させ、そこで骨芽細胞を３０日間培養した生体材料（図８ｂ）の走査電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）によって得られた画像を表す。
【図９】図９は、フカン類を含浸させ、そこで骨芽細胞を３０日間培養した生体材料の深さを示す画像を示す。
【図１０】図１０ａおよび１０ｂは、対照生体材料（図１０ａ）またはフカン類を含浸させ、そこで骨芽細胞を１０日間培養し、当該細胞によって分泌された細胞外マトリクスを示す生体材料（図１０ｂ）の走査電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）によって得られた画像を表す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨の移植、エンジニアリングおよび再生を目的とした、５０００および１０００００ｇ／ｍｏｌの間の重量平均モル質量を有するフカン類の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
フカン類は、硫酸化多糖族である(ＢｅｒｔｅａｕおよびＭｕｌｌｏｙ、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、１３巻、６号、２９Ｒ〜４０Ｒ頁、２００３年（非特許文献１）参照)。フカン類は、主要なフコース単位の硫酸塩富化鎖（ホモフカン類）と、フコース、ガラクトース、キシロースおよびグルクロン酸単位から構成される低硫酸化鎖（キシロフコグルクロナン類）から成る多糖類である。フカン類は、藻類、特に褐藻類（ｐｈｅｏｐｈｙｃｅａ、褐藻綱）から、または、海洋無脊椎動物類から抽出することができる。フカン類は、いったん抽出されると、一般に、５０００００ｇ／ｍｏｌを超える重量平均モル質量を有する。５０００および１０００００ｇ／ｍｏｌの重量平均モル質量を有するフカン類を得るために、フカン類の解重合のための多数の技術が存在する（欧州特許第０４０３３７７号（特許文献１）参照）。フカン類の多数の治療的用途が記載されている：抗凝固剤（欧州特許第０４０３３７７号（特許文献１）参照）、歯周病および真皮病巣の治療（国際公開第９９／３２０９９号公報（特許文献２）参照)、抗血栓剤（国際公開第０１／１５６５号公報（特許文献３）参照）、関節炎および骨関節炎の治療（国際公開第０３／０１８０３３号公報（特許文献４）参照）である。
【０００３】
骨質損失の充填は、骨関節疾患および外傷（骨腫瘍、外傷後遺症、変性疾患）で多く見られる問題である。理想的な骨置換材料の詳細は、特に、１）レシピエントへの感染リスクを伴わない良好な忍容性；２）その場での骨構造への一体化；３）移植部位での応力を支持するのに十分な機械的特性を有する良質の骨新生許容能を含む。これらの材料の中でも、天然または合成生体材料が、骨移植片の代用物になる。これらの材料に望ましい特性は、骨伝導性、即ち前記材料との接触時の骨再建誘導能、および／または、骨誘導性、即ち骨外部位でも骨形成を刺激する能力である。数件の研究アプローチ（Ｈｅｙｍａｎｎら、Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ ｓｕｒｇｅｒｙ、２００１年；８７巻、８〜１７頁（非特許文献２）参照）は、生体材料の骨形成特性を改善することに向かう傾向にある。骨形成能を有する細胞外マトリクスタンパク質もしくは増殖因子との当該生体材料の組合せは、一方の研究路線である。これらの増殖因子類は、生体材料に組み入れられ、生体内で放出され、それによって、生体材料内で骨形成を増強することができる。リン酸カルシウム（ＣａＰ）セラミックも、薬効物質（抗がん剤、抗生物質など）の送達システムとして考えられている。骨形成細胞、即ち骨組織を構成することができる細胞の、骨代用物との組合せは、別の主要な研究路線である。この「ハイブリッド」の組合せは、第１に充填代用物、第２に自己由来骨形成細胞源を必要とする。これらの細胞は、骨芽細胞が単離される骨外植片に由来することができる。しかし、この方法では、少量の骨形成細胞が得ることができるにすぎない。骨形成細胞は、生体外および生体内での分化が可能な骨髄の骨前駆細胞に由来することもできる。この点で、全骨髄細胞か間質細胞のみを使用することができる。骨髄の前駆細胞から分化骨芽細胞クローンを得ることもできる。ラットにおいて、骨部位に注入された骨髄細胞は、独力で、調整骨欠損部に充填することができる。骨髄細胞がＣａＰセラミックと結合すると、セラミックは骨伝導性を獲得することができる。事実、動物で実施された多数の研究は、自己由来骨髄細胞とともにインキュベートされ、その後、骨外部位に埋め込まれたセラミック内部での骨化を実証している。さらに、骨髄細胞は、骨部位での生体材料の一体化を増強する。当該骨髄細胞は、骨再生の速さと質を促進する。
【０００４】
国際公開第０２／０２０５１号公報（特許文献５）は、骨治癒における、菌種Ｖｉｂｒｉｏ ｄｉａｂｏｌｉｃｕｓによって排泄される多糖の使用を記載している。当該多糖は、人工骨コーティングまたは骨伝導性充填材の調製に使用されることができる。国際公開第０２／０２０５１号公報（特許文献５）の教示によれば、高分子量（１００００００ｇ／ｍｏｌ程度）を有するフカン類は、骨治癒に効果を示さない。
【特許文献１】欧州特許第０４０３３７７号
【特許文献２】国際公開第９９／３２０９９号公報
【特許文献３】国際公開第０１／１５６５号公報
【特許文献４】国際公開第０３／０１８０３３号公報
【特許文献５】国際公開第０２／０２０５１号公報
【非特許文献１】ＢｅｒｔｅａｕおよびＭｕｌｌｏｙ、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、１３巻、６号、２９Ｒ〜４０Ｒ頁、２００３年
【非特許文献２】Ｈｅｙｍａｎｎら、Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ ｓｕｒｇｅｒｙ、２００１年；８７巻、８〜１７頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
骨再建に関する先行技術の不十分さおよび欠点を考慮して、本発明者らは、骨伝導特性が改善された骨代用物を提供する目標を自らに課した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
驚くべきことに、本発明者らは、この目標が、特定の族の多糖、即ち、５０００および１０００００ｇ／ｍｏｌの間の重量平均モル質量を有するフカン類を使って達成可能であることを発見した。これらのフカン類は、骨芽細胞類の遊走および増殖を、また、新骨細胞外マトリクスの合成およびその石灰化も、促進および加速することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の主題は、生体材料と、５０００および１０００００ｇ／ｍｏｌの間、特に１００００および４００００ｇ／ｍｏｌの間の重量平均モル質量のフカン類とを含む骨代用物である。
【０００８】
本発明で使用されるフカン類は、Ｍ１およびＭ２の間の重量平均モル質量を有し、当該重量平均モル質量Ｍ１およびＭ２は互いに独立して選択され、Ｍ１は、５０００、１００００、１５０００、２００００および２５０００ｇ／ｍｏｌの数値から選択され、Ｍ２は、４００００、６００００、８００００、９００００および１０００００ｇ／ｍｏｌの数値から選択される。
【０００９】
好ましくは、フカン類は褐藻から得られる。当業者は、本発明で使用されるフカン類の入手に通常の技術を使用することができる。使用可能な技術の一例として、前述（欧州特許第０４０３３７７号参照）のような高分子量フカン類の制御溶解とその後のゲルクロマトグラフィーでの精製による、または、前述（欧州特許第０８４６１２９号または国際公開第９７／０８２０６号公報）のような高分子量フカン類のラジカル解重合による技術に言及することができ、当業者であれば、操作条件を容易に適合させ、所望の重量平均モル質量を得られよう。
【００１０】
用語「生体材料」は、機能または器官の置換に用いられる任意の材料を指すことを意図する。当該生体材料は、医療用具に使用され、また、組織、器官もしくは機能を置換または治療することを目的とするいずれかの生体材料である。
【００１１】
典型的には、本発明による骨代用物を調製するためには、当業者は、骨エンジニアリングに汎用されるどの生体材料も使用することができる。例として、当該生体材料は、チタン、コラーゲン、除タンパクおよび／または脱灰骨、サンゴ、リン酸カルシウムセラミック、ヒドロキシアパタイト、ベータ−リン酸三カルシウムおよび生体活性ガラス類から成る群より選択される１種類以上の材料を含むことができる。
【００１２】
有利なことに、本発明による骨代用物は、線維芽細胞増殖因子類（ＦＧＦ類）、トランスフォーミング増殖因子類（ＴＧＦ類）、インスリン増殖因子類Ｉ（ＩＧＦ類）、血小板由来増殖因子類（ＰＤＧＦ類）、骨形成タンパク質類（ＢＭＰ類）および血管内皮細胞増殖因子類（ＶＥＧＦ類）を含む群より選択される１種以上の増殖因子類も含むことができる。
【００１３】
好ましくは、本発明による骨代用物は、ＢＭＰ類、ＦＧＦ類、ＴＧＦ−ベータおよびＶＥＧＦ類から成る群より選択される１種以上の増殖因子類も含むことができる。
【００１４】
有利なことに、本発明による骨代用物は、インターロイキン１、インターロイキン６、インターロイキン４、腫瘍壊死因子アルファ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子およびマクロファージコロニー刺激因子から成る群より選択される１種以上のサイトカイン類も含むことができる。
【００１５】
典型的には、本発明による骨代用物の生体材料の表面は、フカン類を含むコーティングを有する。
【００１６】
当業者は、フカン類を含むコーティングによる生体材料表面の被覆に通常の技術を使用することができる。例として、当業者は、当該生体材料表面にフカン類を移植することができる。
【００１７】
本発明による骨代用物の生体材料は、フカン類を含浸されることもできる。
【００１８】
有利なことに、本発明による骨代用物は、骨髄由来、骨外植片類由来または骨膜外植片類由来の骨形成細胞類から成る群より選択される細胞類も含むことができる。
【００１９】
そのような骨代用物を調製するために、当業者は、所望の細胞類と共に骨代用物のコロニー形成を実施することができる。
【００２０】
１つの実施形態によれば、本発明は、骨髄、骨または骨膜に由来する骨形成細胞類から成る群より選択される細胞型用であって、５０００および１０００００ｇ／ｍｏｌの間、特に１００００〜４００００ｇ／ｍｏｌの間の重量平均モル質量のフカン類を含む培養培地に関する。
【００２１】
典型的には、本発明による培養培地は、線維芽細胞増殖因子類（ＦＧＦ類）、トランスフォーミング増殖因子類（ＴＧＦ類）、インスリン増殖因子類Ｉ（ＩＧＦ類）、血小板由来増殖因子類（ＰＧＦ類）、骨形成タンパク質類（ＢＭＰ類）および血管内皮細胞増殖因子類（ＶＥＧＦ類）から成る群より選択される１種類以上の増殖因子類も含むことができる。
【００２２】
１つの実施形態によれば、本発明は、骨髄、骨または骨膜に由来する骨形成細胞類の培養のために、５０００および１０００００ｇ／ｍｏｌの間、特に１００００および４００００ｇ／ｍｏｌの間の重量平均モル質量のフカン類を使用することに関する。
【００２３】
１つの実施形態によれば、本発明は、骨髄、骨または骨膜に由来する骨形成細胞類の群から選択される細胞類の培養方法に関し、前記細胞類が上記の培養培地中で培養されることを特徴とする。
【００２４】
１つの実施形態によれば、本発明は、骨髄、骨または骨膜に由来する骨形成細胞類の培養方法に関し、前記細胞類が上記の骨代用物上で培養されることを特徴とする。
【００２５】
１つの実施形態によれば、本発明は、骨再生に対する活性を有する医療用具の製造のために、５０００および１０００００ｇ／ｍｏｌの間、特に１００００および４００００ｇ／ｍｏｌの間の重量平均モル質量のフカン類を使用することに関する。
【００２６】
典型的には、そのような医療用具は、骨の再生を促進し、例えば、病変、事故または外科処置による病巣後に起こる組織欠損を充填するために、整形外科手術、歯周手術および形成外科手術で使用することができる。
【００２７】
そのような医療用具は、例えば、骨修復もしくは充填材として、骨移植片として、人工骨として、または、歯科もしくは骨関節インプラントとして使用することができる。
【００２８】
そのような医療用具は、例えば、骨粗鬆症などの骨病変の治療に使用することができる。
【００２９】
そのような医療用具は、例えば、フカン類を、好ましくは水和型で、例えばヒドロゲルの形態で、単独で、または、線維芽細胞増殖因子類（ＦＧＦ類）、トランスフォーミング増殖因子類（ＴＧＦ類）、インスリン増殖因子類Ｉ（ＩＧＦ類）、血小板由来増殖因子類（ＰＤＧＦ類）、骨形成タンパク質類（ＢＭＰ類）および血管内皮細胞増殖因子類（ＶＥＧＦ類）から成る群より選択される１種類以上の増殖因子類との組合せとして含むことができる。
【００３０】
フカン類を増殖因子と組合せることで、骨再生速度の増加が可能となる。
【００３１】
好ましくは、本発明による医療用具は、水和型のフカン類と、ＢＭＰ類、ＦＧＦ類、ＴＧＦ−ベータおよびＶＥＧＦ類の群から選択される１種類以上の増殖因子類とを含む。
【００３２】
典型的には、本発明による医療用具は、本発明による骨代用物を含むことができる。
【００３３】
全引用文献の内容は、本詳細な説明の一部と見なすこととする。
【００３４】
以下の例を使用して、本発明をさらに明確に以下に説明する。これらの例は、本発明の主題の例示として提示するにすぎず、いずれも、制約を設けるものではない。
【実施例】
【００３５】
［材料および方法］
＜フカン類の入手＞
本発明で使用するフカン類は、既述の方法（Ｂｌａｃｋら、Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ．、３巻、１２２〜１２９頁、１９５２年に準拠、または、Ｎｉｓｈｉｎｏら、Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ．、１８６巻，１１９〜１２９頁、１９８９年に準拠）に従ってＰｈｅｏｐｈｙｃｅａｅ、即ち褐藻類（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ ｎｏｄｏｓｕｍ）から抽出する。使用する低分子量フカン類（ＬＭＷＦ）は、既述の方法によって入手する。即ち、制御された加水分解とそれに続く透過性ゲルでの分取分画法もしくはサイズ排除(欧州特許第０４０３３７７号、または、ラジカル解重合（欧州特許第０８４６１２９号および欧州特許第１２０７８９１号）によって得られる。
【００３６】
＜骨芽細胞の入手＞
ヒト骨芽細胞は、骨折整復術中の手術ブロックで回収した骨折片に由来する。骨サンプルは、血液の細胞成分が除去されるまで、ＰＢＳで洗浄する。骨栓を３〜４ｍｍの立方体に切断した後、培養皿に静置する。培養培地（ＤＭＥＭ ４０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）フンギゾン（２μｇ／ｍｌ））１滴を各外植片に配置し、培養皿のプラスチックに付着させる。次いで、当該培養皿をインキュベーター（３７℃、空気（９５％）／ＣＯ２（５％））に１〜２時間入れる。次いで、２０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培養培地で当該外植片を覆う。この培地は、３日置きに交換する。細胞は、外植片から遊走し、培養６日目以降、培養皿にコロニーを形成し、４週間の培養後、集密が達成され、次いで、培養皿から外植片を取り出す。
【００３７】
＜二次元骨芽細胞培養＞
初代継代培養の集密骨芽細胞を２４穴皿に細胞１００００個／ｍｌの割合で接種した後、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補った１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地中で２４時間インキュベートする。細胞の付着、伝播後、培養培地をフカン類（１０μｇ／ｍｌ）含有もしくは非含有の１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地に取り替える。次いで、これらの培養培地を３日置きに交換する。培養２１日目に、骨芽細胞分化を完了させるために、β−グリセロホスフェート（１０ｍＭ）とアスコルビン酸２−リン酸塩（２５ｍＭ）を添加する。培養８、１５、３０および４５日後、マトリクスメタロプロテアーゼの分泌を検討するため、培養上清を取り出す。細胞は、細胞カウンティングのためにトリプシン処理するか、無水エタノール（−２０℃）で固定する。固定によって、その後、形態および免疫細胞化学検査が可能になる。
【００３８】
＜細胞培養用生体材料の調製＞
生体材料は、骨梁間隙の清浄化と非コラーゲンタンパク質の除去によって得られるウシ由来の海綿骨網である。生体材料は、予め小断片に切断し（２ｍｍ×２ｍｍ）、これらの断片を無水エタノール中に４８時間放置した後、３７℃（空気／５％ＣＯ２）の培養インキュベーター内、ＤＭＥＭ中で２４時間インキュベートする。骨生体材料は、培養培地中、フカン類（５０μｇ／ｍｌ）の存在下または不在下で再水和させる。
【００３９】
＜骨生体材料中の骨芽細胞の培養＞
フカン類を含浸可能または含浸不可能な骨生体材料を含有する２４穴培養皿（細胞２００００個／穴）に正常ヒト骨芽細胞を接種する。これらの移植片を、ＤＭＥＭ、ウシ胎仔血清（１０％）、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）およびトランスフェリン（５μｇ／ｍｌ）から成る「石灰化」培養培地中で維持する。実験期間中、この培養培地は、３日置きに取り替える。培養１０または３０日後、このように得られる移植片を培養皿から取り出し、固定し、組織検査および走査電子顕微鏡検査用に調製する。
【００４０】
＜細胞のＧＩＥＭＳＡ染色＞
この染色法は、核および細胞質の可視化を可能にする。固定後、細胞を前濾過ＧＩＥＭＳＡ染料（Ｍｅｒｃｋ）で２分間被覆する。過剰の染料は、蒸留水で連続洗浄することによって除去する。
【００４１】
＜Ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ反応＞
この反応は、培養物中のミネラル沈着物の可視化を可能にする。これらの沈着物は、黒色部分として現れる。固定後の二次元培養物を蒸留水で洗浄し、次いで、硝酸銀溶液（５％）中で３０分間インキュベートする。当該材料は、蒸留水による洗浄後、日光に曝露する。
【００４２】
＜その場でのアルカリホスファターゼ活性の可視化＞
前記細胞を、ＰＢＳで洗浄した後、緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（０．０５Ｍ）、ｐＨ＝９．５、ＭｇＳＯ４（０．１％）、ナフチルリン酸塩（０．１％）、ファーストレッド（０．１％))中、周囲温度で１時間インキュベートする。上清を除去し、各穴を蒸留水で２〜３回洗浄する。アルカリホスファターゼ活性陽性部分は、褐色に見える。
【００４３】
＜Ｉ型コラーゲンの免疫検出＞
細胞もしくは骨生体材料切片を、ＰＢＳで洗浄し、次に、ＣＨ３ＯＨ（８０％）／Ｈ２Ｏ２（２０％）溶液中で１０分間インキュベートし、内在パーオキシダーゼを不活性化する。穴もしくは切片をＰＢＳで洗浄し、次いで、非特異的抗原部位をブロックする（０．１％スキムミルク、１０分）。洗浄後、当該材料をマウス抗ヒトコラーゲンＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、１／４０ｔｈ）とともに１時間インキュベートする。洗浄後、当該材料は、さらに、マウスＩｇＧ（１／６０ｔｈ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）に対するパーオキシダーゼ標識ヤギ抗体とともにインキュベートする。洗浄後、３，３’−ジアミノベンジデン四塩酸塩（Ｓｉｇｍａ）との反応（１５分、暗所）によって、Ｉ型コラーゲン含有部分のパーオキシダーゼ活性を検出する。
【００４４】
＜走査電子顕微鏡検査＞
１０および３０日目に、骨生体材料を４％パラホルムアルデヒドで固定する。生体材料は、ＰＢＳで洗浄し、２％四酸化オスミウムで４５分間後固定した後、カコジル酸ナトリウム浴で３回連続洗浄し、次いで、エタノール溶液から無水エタノールまでを使って脱水する。装置中、臨界点で、液体ＣＯ２によるアルコールの置換を実施する。走査電子顕微鏡検査によるサンプルの至適観察に必要な表面伝導層を得るために、真空下、陰極スプレー法によってサンプル表面の金被覆を実施する。
【００４５】
［結果］
＜二次元培養＞
骨外植片由来細胞は、培養でその真の骨芽細胞表現型を獲得する前骨芽細胞であると考えられる。この最終分化は、増殖期、マトリクス合成期、ならびに、最後に成熟および石灰化期に相当する数期後に起こる。増殖期の終了は、集密後、三次元細胞外マトリクス中の成熟骨芽細胞から成る小結節の出現を特徴とする。Ｉ型コラーゲンの合成は、これらの小結節が形成される時点で最大に達し、次いで、急速に減少する。成熟期は、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）の発現増加を特徴とし、当該発現は、石灰化期開始時に最高点に達する。次いで、骨芽細胞の最終分化とともに、ＡＰの発現が減少する。
【００４６】
＜二次元培養物中での骨芽細胞の増殖＞
培養培地へのフカン類の添加は、骨芽細胞の増殖を顕著に刺激する（３０日目に＋４５％、４５日目に＋６０％、図１参照）。
【００４７】
＜アルカリホスファターゼ＞
培養物中の骨芽細胞によるアルカリホスファターゼ（ＡＰ）の発現速度論によって、分化経路に沿った当該細胞の進行を評価することができる。培養物中のアルカリホスファターゼの出現は、骨芽細胞分化の開始を特徴付けているが、成熟骨芽細胞は、この酵素をもはや発現しない。
【００４８】
対照培養物中のＡＰの発現は、培養１５日以降に認められ（図２ａ）、４５日目に最大となる（図２ｄ）。この発現は、フカン類（１０μｇ／ｍＬ）の存在下でインキュベートした培養物中でははるかに早まる（図３ａ、３ｂ、３ｃ参照）。事実、フカン類の存在下では、ＡＰの発現は、８日間の培養以降に認められ（図３ａ）、１５日後に最大に達し（図３ｂ）、３０日目に観察した培養物中で明らかに減少した（図３ｃ）。フカン類存在下での培養４５日後には、ＡＰ発現は、もはや観察できない。それは、ミネラル沈着物が、事実上、培養皿全体を覆っているからである。
【００４９】
＜Ｉ型コラーゲンのＶｏｎ Ｋｏｓｓａ反応および免疫検出＞
Ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ反応は、培養物中の骨芽細胞が分泌する細胞外マトリクスの石灰化状態の評価を可能にする（図４）。４５日目の対照培養物中に、若干の石灰化小結節が検出される（図４ｃ）が、これらの同小結節は、フカン類存在培養物中では、３０日以降に認められる（図４ｂ）。培養４５日目では、多糖とともにインキュベートした骨芽細胞が発現する細胞外マトリクスは、事実上、完全に石灰化される（図４ｄ）。
【００５０】
４５日後、対照培養物またはフカン類とともにインキュベートした培養物の細胞外マトリクス中にＩ型コラーゲンの存在が検出される（図５）。対照培養物中のこの線維状コラーゲン沈着物は、非石灰化網もしくはほぼ非石灰化網を形成し、細胞伸長に密接に関連する（図５ａ)。フカン類処理培養物中のＩ型コラーゲンの検出は、Ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ反応後に認められるミネラル沈着物に相当する稠密沈着物を伴うコラーゲン網を示す（図５ｂ）。
【００５１】
＜ゼラチナーゼＡ（ＭＭＰ−２）およびコラゲナーゼ３（ＭＭＰ−１３）の発現＞
培養物中の骨芽細胞は、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−１３を発現する。ＭＭＰ−２は、特に、培養開始時に発現されるが、ＭＭＰ−１３は、分化終了時に骨芽細胞によって発現される。当該培養物へのフカン類の添加は、骨芽細胞によるゼラチナーゼＡの発現を明らかに減少させるが、ＭＭＰ−１３の誘導発現は、骨芽細胞系における当該細胞の分化促進の表れである。
【００５２】
［結論］
培養培地へのフカン類の添加は、骨芽細胞系の分化を促進する。
【００５３】
＜三次元培養＞
［走査電子顕微鏡検査］
走査電子顕微鏡検査は、生体材料の高分子構造、さらに、骨芽細胞によるそのコロニー形成の観察することを可能にする。
【００５４】
＜無細胞生体材料＞
骨芽細胞を接種しない生体材料を観察すると、フカン類前処理が、骨生体材料の限外構造を変化させないことを示している(図６ａ、６ｂ)。
【００５５】
＜骨芽細胞接種生体材料＞
培養１０日目、細胞は、フカン類を含浸した、または、含浸しない生体材料の表面に付着する。これらの細胞は、平坦な細胞体を有し、これが、コラーゲン網に付着し、ここから、細長い仮足が伸び、細胞外マトリクスへの付着を完成することができる（図７）。
【００５６】
３０日間の培養後、対照生体材料と、フカン類を含む生体材料の細胞充実度は、１０日後に観察されるものよりもはるかに高く、これは、実際にコラーゲンマトリクス内部での骨芽細胞の増殖を意味する（図８）。さらに、培養３０日目には、フカン類を含む生体材料の細胞密度（図８ｂ）は、未処理生体材料で観察されるものよりもはるかに高い（図８ａ）。事実、フカン類なしでは、骨芽細胞（図８ａ）は、当該生体材料の全体積を占有せず、当該生体材料の細孔が見える。フカン類含浸後、生体材料は、高い細胞密度を示し、細孔は、大部分、細胞によって塞がれている（図８ｂ）。骨芽細胞は、これらの細孔深くにコロニーを形成し、その縁の両側に架橋を形成する（図９）。
【００５７】
細胞と接触するフィラメント状細胞外物質の存在が認められる。これは、骨芽細胞による原線維状細胞外マトリクスの分泌に相当する。さらに、骨芽細胞およびフィラメント状細胞外マトリクスと接触する球状細胞外物質の存在が認められる（図１０ｂ）。これは、石灰化マトリクスに相当する。
【００５８】
［結論］
骨生体材料のフカン類含浸は、細胞付着を変化させない。
【００５９】
骨生体材料のフカン類含浸は、骨芽細胞増殖を刺激する。
【００６０】
骨生体材料のフカン類含浸は、骨芽細胞が分泌する細胞外マトリクスの石灰化を促進する。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、フカン類の存在下および不在下における、時間の関数としての骨芽細胞数の変化を示す。
【図２】図２ａ、２ｂ、２ｃおよび２ｄは、アルカリホスファターゼ活性が検出される骨芽細胞の対照培養物の写真を表し、図２ａ、２ｂ、２ｃおよび２ｄは、それぞれ、培養８、１５、３０および４５日後に撮影された写真を表す。
【図３】図３ａ、３ｂ、３ｃは、１０μｇ／ｍｌのフカン類の存在下で実施された骨芽細胞培養物の写真を表し、最終的に、培養物中の細胞にアルカリホスファターゼ活性が検出され、図３ａ、３ｂおよび３ｃは、それぞれ、培養８、１５および３０日後に撮影された写真を表す。
【図４】図４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄは、骨芽細胞の対照培養物（図４ａおよび４ｃ）、１０μｇ／ｍｌのフカン類の存在下で実施された骨芽細胞培養物（図４ｂおよび４ｄ）の写真を表し、培養物中の細胞の固定後、最終的に実施されたＶｏｎ Ｋｏｓｓａ反応によってミネラル沈着物が可視化されており、図４ａおよび４ｂは、培養３０日後に撮影された写真を表しており、図４ｃおよび４ｄは、培養４５日後に撮影された写真を表す。
【図５】図５ａ、５ｂは、骨芽細胞の対照培養物（図５ａ）、１０μｇ／ｍｌのフカン類存在下の骨芽細胞培養物（図５ｂ）の写真を表し、培養４５日後、培養物中の細胞に対してＩ型コラーゲンの免疫検出が実施される。
【図６】図６ａおよび６ｂは、対照無細胞生体材料（図６ａ）またはフカン類含浸無細胞生体材料（図６ｂ）の走査電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）によって得られた画像を表す。
【図７】図７ａおよび７ｂは、対照生体材料（図７ａ）またはフカン類を含浸させ、そこで骨芽細胞を１０日間培養した生体材料（図７ｂ）の走査電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）によって得られた画像を表す。
【図８】図８ａおよび８ｂは、対照生体材料（図８ａ）またはフカン類を含浸させ、そこで骨芽細胞を３０日間培養した生体材料（図８ｂ）の走査電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）によって得られた画像を表す。
【図９】図９は、フカン類を含浸させ、そこで骨芽細胞を３０日間培養した生体材料の深さを示す画像を示す。
【図１０】図１０ａおよび１０ｂは、対照生体材料（図１０ａ）またはフカン類を含浸させ、そこで骨芽細胞を１０日間培養し、当該細胞によって分泌された細胞外マトリクスを示す生体材料（図１０ｂ）の走査電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）によって得られた画像を表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５０００および１０００００ｇ／ｍｏｌの間、特に１００００および４００００ｇ／ｍｏｌの間の重量平均モル質量を有するフカン類を含み、骨再生活性を有する骨代用物。
【請求項２】
前記フカン類が褐藻から得られることを特徴とする請求項１に記載の骨代用物。
【請求項３】
生体材料を含む請求項１および２のいずれか一項に記載の骨代用物。
【請求項４】
前記生体材料が、チタン、コラーゲン、除タンパクおよび／または脱灰骨、サンゴ、リン酸カルシウムセラミック、ヒドロキシアパタイト、ベータ−リン酸三カルシウムおよび生体活性ガラス類から成る群より選択される１種類以上の材料を含むことを特徴とする請求項１ないし３のいずれか一項に記載の骨代用物。
【請求項５】
線維芽細胞増殖因子類（ＦＧＦ類）、トランスフォーミング増殖因子類（ＴＧＦ類）、インスリン増殖因子類Ｉ（ＩＧＦ類）、血小板由来増殖因子類（ＰＤＧＦ類）、骨形成タンパク質類（ＢＭＰ類）および血管内皮細胞増殖因子類（ＶＥＧＦ類）から成る群より選択される１種類以上の増殖因子類も含むことを特徴とする請求項１ないし４のいずれか一項に記載の骨代用物。
【請求項６】
インターロイキン１、インターロイキン４、インターロイキン６、腫瘍壊死因子アルファ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子およびマクロファージコロニー刺激因子から成る群より選択される１種類以上のサイトカイン類も含むことを特徴とする請求項１ないし５のいずれか一項に記載の骨代用物。
【請求項７】
前記生体材料の表面が前記フカン類を含むコーティングを有することを特徴とする請求項１ないし６のいずれか一項に記載の骨代用物。
【請求項８】
前記生体材料に前記フカン類を含浸させることを特徴とする請求項１ないし７のいずれか一項に記載の骨代用物。
【請求項９】
骨髄、骨または骨膜に由来する骨形成細胞類も含むことを特徴とする請求項１ないし８のいずれか一項に記載の骨代用物。
【請求項１０】
前記生体材料の表面を、前記フカン類を含むコーティングで覆うことを特徴とする請求項７に記載の骨代用物の調製方法。
【請求項１１】
前記生体材料に前記フカン類を含浸させることを特徴とする請求項８に記載の骨代用物の調製方法。
【請求項１２】
骨髄、骨または骨膜に由来する骨形成細胞類と共に請求項１ないし８のいずれか一項に記載の骨代用物のコロニー形成を実施することを特徴とする請求項９に記載の骨代用物の調製方法。
【請求項１３】
骨髄、骨または骨膜に由来する前記骨形成細胞類を、５０００および１０００００ｇ／ｍｏｌの間、特に１００００および４００００ｇ／ｍｏｌの間の重量平均モル質量のフカン類を含む培養培地中で培養することを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
５０００および１０００００ｇ／ｍｏｌの間、特に１００００および４００００ｇ／ｍｏｌの間の重量平均モル質量のフカン類を含み、骨髄、骨または骨膜に由来する骨形成細胞類から成る群より選択される細胞型用の培養培地。
【請求項１５】
線維芽細胞増殖因子類（ＦＧＦ類）、トランスフォーミング増殖因子類（ＴＧＦ類）、インスリン増殖因子類Ｉ（ＩＧＦ類）、血小板由来増殖因子類（ＰＤＧＦ類）、骨形成タンパク質類（ＢＭＰ類）および血管内皮細胞増殖因子類（ＶＥＧＦ類）から成る群より選択される１種類以上の増殖因子類も含むことを特徴とする請求項１４に記載の培養培地。
【請求項１６】
細胞を請求項１５または１６に記載の培養培地中で培養することを特徴とする、骨髄、骨または骨膜に由来する骨形成細胞類の群から選択される細胞の培養方法。
【請求項１７】
細胞を請求項１ないし９のいずれか一項に記載の骨代用物上で培養することを特徴とする骨髄、骨または骨膜に由来する骨形成細胞類の群から選択される細胞の培養方法。
【請求項１８】
５０００および１０００００ｇ／ｍｏｌの間、特に１００００および４００００ｇ／ｍｏｌの間の重量平均モル質量のフカン類を含み、骨再生活性を有する医療用具。
【請求項１９】
線維芽細胞増殖因子類（ＦＧＦ類）、トランスフォーミング増殖因子類（ＴＧＦ類）、インスリン増殖因子類Ｉ（ＩＧＦ類）、血小板由来増殖因子類（ＰＤＧＦ類）、骨形成タンパク質類（ＢＭＰ類）および血管内皮細胞増殖因子類（ＶＥＧＦ類）から成る群より選択される１種類以上の増殖因子類を含む請求項１８に記載の医療用具。
【請求項２０】
請求項１ないし９の一項に記載の骨代用物を含む請求項１８または請求項１９に記載の医療用具。
【請求項１】
５０００および１０００００ｇ／ｍｏｌの間、特に１００００および４００００ｇ／ｍｏｌの間の重量平均モル質量を有するフカン類を含み、骨再生活性を有する骨代用物。
【請求項２】
前記フカン類が褐藻から得られることを特徴とする請求項１に記載の骨代用物。
【請求項３】
生体材料を含む請求項１および２のいずれか一項に記載の骨代用物。
【請求項４】
前記生体材料が、チタン、コラーゲン、除タンパクおよび／または脱灰骨、サンゴ、リン酸カルシウムセラミック、ヒドロキシアパタイト、ベータ−リン酸三カルシウムおよび生体活性ガラス類から成る群より選択される１種類以上の材料を含むことを特徴とする請求項１ないし３のいずれか一項に記載の骨代用物。
【請求項５】
線維芽細胞増殖因子類（ＦＧＦ類）、トランスフォーミング増殖因子類（ＴＧＦ類）、インスリン増殖因子類Ｉ（ＩＧＦ類）、血小板由来増殖因子類（ＰＤＧＦ類）、骨形成タンパク質類（ＢＭＰ類）および血管内皮細胞増殖因子類（ＶＥＧＦ類）から成る群より選択される１種類以上の増殖因子類も含むことを特徴とする請求項１ないし４のいずれか一項に記載の骨代用物。
【請求項６】
インターロイキン１、インターロイキン４、インターロイキン６、腫瘍壊死因子アルファ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子およびマクロファージコロニー刺激因子から成る群より選択される１種類以上のサイトカイン類も含むことを特徴とする請求項１ないし５のいずれか一項に記載の骨代用物。
【請求項７】
前記生体材料の表面が前記フカン類を含むコーティングを有することを特徴とする請求項１ないし６のいずれか一項に記載の骨代用物。
【請求項８】
前記生体材料に前記フカン類を含浸させることを特徴とする請求項１ないし７のいずれか一項に記載の骨代用物。
【請求項９】
骨髄、骨または骨膜に由来する骨形成細胞類も含むことを特徴とする請求項１ないし８のいずれか一項に記載の骨代用物。
【請求項１０】
前記生体材料の表面を、前記フカン類を含むコーティングで覆うことを特徴とする請求項７に記載の骨代用物の調製方法。
【請求項１１】
前記生体材料に前記フカン類を含浸させることを特徴とする請求項８に記載の骨代用物の調製方法。
【請求項１２】
骨髄、骨または骨膜に由来する骨形成細胞類と共に請求項１ないし８のいずれか一項に記載の骨代用物のコロニー形成を実施することを特徴とする請求項９に記載の骨代用物の調製方法。
【請求項１３】
骨髄、骨または骨膜に由来する前記骨形成細胞類を、５０００および１０００００ｇ／ｍｏｌの間、特に１００００および４００００ｇ／ｍｏｌの間の重量平均モル質量のフカン類を含む培養培地中で培養することを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
５０００および１０００００ｇ／ｍｏｌの間、特に１００００および４００００ｇ／ｍｏｌの間の重量平均モル質量のフカン類を含み、骨髄、骨または骨膜に由来する骨形成細胞類から成る群より選択される細胞型用の培養培地。
【請求項１５】
線維芽細胞増殖因子類（ＦＧＦ類）、トランスフォーミング増殖因子類（ＴＧＦ類）、インスリン増殖因子類Ｉ（ＩＧＦ類）、血小板由来増殖因子類（ＰＤＧＦ類）、骨形成タンパク質類（ＢＭＰ類）および血管内皮細胞増殖因子類（ＶＥＧＦ類）から成る群より選択される１種類以上の増殖因子類も含むことを特徴とする請求項１４に記載の培養培地。
【請求項１６】
細胞を請求項１５または１６に記載の培養培地中で培養することを特徴とする、骨髄、骨または骨膜に由来する骨形成細胞類の群から選択される細胞の培養方法。
【請求項１７】
細胞を請求項１ないし９のいずれか一項に記載の骨代用物上で培養することを特徴とする骨髄、骨または骨膜に由来する骨形成細胞類の群から選択される細胞の培養方法。
【請求項１８】
５０００および１０００００ｇ／ｍｏｌの間、特に１００００および４００００ｇ／ｍｏｌの間の重量平均モル質量のフカン類を含み、骨再生活性を有する医療用具。
【請求項１９】
線維芽細胞増殖因子類（ＦＧＦ類）、トランスフォーミング増殖因子類（ＴＧＦ類）、インスリン増殖因子類Ｉ（ＩＧＦ類）、血小板由来増殖因子類（ＰＤＧＦ類）、骨形成タンパク質類（ＢＭＰ類）および血管内皮細胞増殖因子類（ＶＥＧＦ類）から成る群より選択される１種類以上の増殖因子類を含む請求項１８に記載の医療用具。
【請求項２０】
請求項１ないし９の一項に記載の骨代用物を含む請求項１８または請求項１９に記載の医療用具。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００９−５２７３０６（Ｐ２００９−５２７３０６Ａ）
【公表日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５５８３４（Ｐ２００８−５５５８３４）
【出願日】平成１９年２月２１日（２００７．２．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００７／０００３１０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９６５１９
【国際公開日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【出願人】（５０３４００４５５）ユニベルシテ・ルネ・デカルト・パリ ５ (6)
【出願人】（５０８２５５０５６）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月２１日（２００７．２．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００７／０００３１０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９６５１９
【国際公開日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【出願人】（５０３４００４５５）ユニベルシテ・ルネ・デカルト・パリ ５ (6)
【出願人】（５０８２５５０５６）
【Ｆターム（参考）】
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