骨及び軟骨形成タンパク質を含有する医薬品及び医療器具

【課題】生体内で強い炎症などの副作用を引き起こさず、骨芽細胞が存在するところでのみ作動し、軟骨形成を伴い自然治癒と同じ経過で骨形成を速やかに誘導する医薬の提供。
【解決手段】本発明は、炎症を起こさずに骨を処置するための、ＮＥＬＬ１を含む骨治療剤を提供することによって上記課題を解決した。本発明は、病巣掻爬もしくは切除後の骨欠損補填、骨折の治癒遷延、偽関節、仮骨延長術、人工関節置換術、脊椎固定術、軟骨移植、顎裂骨移植、外傷による骨欠損部補填、開頭術後骨欠損補填、歯槽提形成術、上顎洞底挙上術、歯槽骨再生、人工歯根周囲の顎骨再生等において用いられる。

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【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症を起こさずに骨を処置するための、ＮＥＬＬ１を含む骨治療剤。
【請求項２】
前記骨は、治癒するのに軟骨内骨化の誘導を必要とするものである、請求項１に記載の骨治療剤。
【請求項３】
前記骨は、治癒するのに軟骨内骨化の誘導を必要とする疾患、障害または状態を有する、請求項１に記載の骨治療剤。
【請求項４】
病巣掻爬もしくは切除後の骨欠損補填、骨折の治癒遷延、偽関節、仮骨延長術、人工関節置換術、脊椎固定術、軟骨移植、顎裂骨移植、外傷による骨欠損部補填、開頭術後骨欠損補填、歯槽提形成術、上顎洞底挙上術、歯槽骨再生または人工歯根周囲の顎骨再生において使用するための、請求項１に記載の骨治療剤。
【請求項５】
前記骨は、頭頂骨、側頭骨、蝶形骨、上顎骨、下顎骨、上腕骨、りょう骨、尺骨、手骨、鎖骨、胸骨、肋骨、寛骨、仙骨、尾骨、髄、大腿骨、膝蓋骨、腓骨、脛骨および足骨からなる群より選択される、請求項１に記載の骨治療剤。
【請求項６】
前記ＮＥＬＬ１が、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号２）の残基１７〜８１０、マウスＮＥＬＬ１（配列番号４）の残基２２〜８１０、ラットＮＥＬＬ１（配列番号６）の残基２２〜８１０およびツメガエルＮＥＬＬ１（配列番号１３）の成熟配列からなる群より選択されるアミノ酸配列またはその改変体を含む、請求項１に記載の骨治療剤。
【請求項７】
前記ＮＥＬＬ１が、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号２）の残基１７〜８１０、マウスＮＥＬＬ１（配列番号４）の残基２２〜８１０、ラットＮＥＬＬ１（配列番号６）の残基２２〜８１０およびツメガエルＮＥＬＬ１（配列番号１３）の成熟配列からなる群より選択されるアミノ酸配列またはその改変体と、Ｃ末端にタグ（配列番号９）とを含むポリペプチドである、請求項１に記載の骨治療剤。
【請求項８】
前記ＮＥＬＬ１が、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号２）の残基１７〜８１０と、Ｃ末端にタグとを含むポリペプチドである、請求項１に記載の骨治療剤。
【請求項９】
ＮＥＬＬ１と薬学的に許容可能なキャリアとを含む、炎症を起こさずに骨を処置するための骨治療器具。
【請求項１０】
前記キャリアが、コラーゲンスポンジ、コラーゲンゲル、コラーゲン硬化物、アテロコラーゲン、ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム、オクタカルシウムホスフェイト、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、チタンメッシュ、タンパク添加性チタン合金、合成スキャホールドペプチド、キチン、キチン化合物、およびポリ乳酸−ポリエチレングリコールからなる群より選択される、請求項９に記載の骨治療器具。
【請求項１１】
炎症を起こさずに骨を処置するための方法であって、骨処置を必要とする被験体にＮＥＬＬ１を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１２】
前記投与は、前記処置を必要とする部位にＮＥＬＬ１を含む骨治療剤を移植することによって達成される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記処置を必要とする部位は、頭頂骨、側頭骨、蝶形骨、上顎骨、下顎骨、上腕骨、骨、尺骨、手骨、鎖骨、胸骨、肋骨、寛骨、仙骨、尾骨、髄、大腿骨、膝蓋骨、腓骨、脛骨および足骨からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＮＥＬＬ１は、薬学的に許容可能なキャリアとともに投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記キャリアは、コラーゲンスポンジ、コラーゲンゲル、コラーゲン硬化物、アテロコラーゲン、ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム、オクタカルシウムホスフェイト、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、チタンメッシュ、タンパク添加性チタン合金、合成スキャホールドペプチド、キチン、キチン化合物、およびポリ乳酸−ポリエチレングリコールからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＮＥＬＬ１は、骨欠損体積１平方ミリメートルあたり、０．００１μｇ〜３００μｇ（１．６μｇ〜５０ｇ／ｋｇ体重）以下で前記被験体に投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記骨は、治癒するのに軟骨内骨化の誘導を必要とするものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記処置は、治癒するのに軟骨内骨化の誘導を必要とする疾患、障害または状態に対するものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記処置は、病巣掻爬もしくは切除後の骨欠損補填、骨折の治癒遷延、偽関節、仮骨延長術、人工関節置換術、脊椎固定術、軟骨移植、顎裂骨移植、外傷による骨欠損部補填、開頭術後骨欠損補填、歯槽提形成術、上顎洞底挙上術、歯槽骨再生または人工歯根周囲の顎骨再生に対するものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
ＮＥＬＬ１を生産する方法であって、該方法は、
Ａ）ＮＥＬＬ１およびシグナル配列をコードする核酸をインフレームで作動可能に連結した核酸構築物を提供する工程；
Ｂ）該核酸構築物を細胞に導入する工程；
Ｃ）ＮＥＬＬ１を発現する条件下に、該細胞を配置する工程；および
Ｄ）発現された該ＮＥＬＬ１を回収する工程
を包含する、方法。
【請求項２１】
前記ＮＥＬＬ１をコードする核酸が、前記ＮＥＬＬ１が、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号２）の残基１７〜８１０、マウスＮＥＬＬ１（配列番号４）の残基２２〜８１０、ラットＮＥＬＬ１（配列番号６）の残基２２〜８１０およびツメガエルＮＥＬＬ１（配列番号１３）の成熟配列からなる群より選択されるアミノ酸配列またはその改変体をコードする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＮＥＬＬ１をコードする核酸が、前記ＮＥＬＬ１が、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号２）の残基１７〜８１０、マウスＮＥＬＬ１（配列番号４）の残基２２〜８１０、ラットＮＥＬＬ１（配列番号６）の残基２２〜８１０およびツメガエルＮＥＬＬ１（配列番号１３）の成熟配列を含むポリペプチドをコードする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＮＥＬＬ１をコードする核酸が、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号２）の残基１７〜８１０と、Ｃ末端にタグとを含むポリペプチドをコードする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＮＥＬＬ１をコードする核酸が、配列番号１（ヒトＮＥＬＬ１ＤＮＡ）の塩基１８３〜２５６４、配列番号３（マウスＮＥＬＬ１ＤＮＡ）の塩基１０３〜２４７２、配列番号５（ラットＮＥＬＬ１ＤＮＡ）の塩基１２２〜２４９１および配列番号１２（ツメガエルＮＥＬＬ１ＤＮＡ）の成熟配列からなる群より選択される核酸を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＮＥＬＬ１をコードする核酸が、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号１）の残基１７〜８１０である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ由来の細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来の細胞、チャイニーズハムスター卵巣由来の細胞およびヒト胎児腎臓由来の細胞からなる群より選択される細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞が、昆虫細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞が、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ由来の細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞が、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ由来のＢＴＩＴｎ−５Ｂ１−４の細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
さらに、Ｅ）前記回収したＮＥＬＬ１を精製する工程を包含する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｅ）工程は、
Ｅ−ｉ）前記回収されたＮＥＬＬ１を、Ｎｉレジンアフィニティカラムにかける工程；および
Ｅ−ｉｉ）１００ｍＭ〜１．５Ｍのイミダゾールで溶出する工程
を包含する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記Ｅ−ｉｉ）工程において、前記イミダゾールが、１００ｎＭ〜５００ｍＭの濃度である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記シグナル配列が、前記ＮＥＬＬ１に対して内因性である、請求項２０に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＮＥＬＬ１およびシグナル配列をコードする核酸は、配列番号１の塩基１３５〜２５６４、配列番号３の塩基４０〜２４７２および配列番号５の塩基５９〜２４９１からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項３５】
ａ）Ｖ５タグ、ヒスチジンタグ、内因性シグナルペプチドをコードする核酸配列（配列番号１のヌクレオチド１３５〜２５６４、配列番号３のヌクレオチド４０〜２４７２または配列番号５のヌクレオチド５９〜２４９１）を含むＮＥＬＬ１（ｈＮＥＬＬ１）ｃＤＮＡを含む核酸構築物を提供する工程；
ｂ）該核酸構築物によりＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ由来のＢＴＩＴｎ−５Ｂ１−４の細胞にトランスフェクトする工程；
ｃ）ＮＥＬＬ１を発現することができる条件下で、該Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ由来のＢＴＩＴｎ−５Ｂ１−４の細胞を培養する工程；
ｄ）該Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ由来のＢＴＩＴｎ−５Ｂ１−４の細胞から分泌されたＮＥＬＬ１を含む培養上清を回収する工程；
ｅ）回収されたＮＥＬＬ１を、Ｎｉレジンアフィニティカラムにかけ、５００ｍＭイミダゾールで溶出することにより、回収された該培養上清から該ＮＥＬＬ１を精製する工程
を包含する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
炎症を起こさずに骨形成を促進する因子をスクリーニングする方法であって、
Ａ）候補化合物を提供する工程；
Ｂ）該候補化合物についてＭＡＰキナーゼの活性化能を検出する工程；
Ｃ）該候補化合物について、Ｓｍａｄの活性化能を検出する工程；
Ｄ）該候補化合物から、ＭＡＰキナーゼを活性化し、かつＳｍａｄを活性化しない化合物を炎症を起こさずに骨形成を促進する因子として選択する工程
を包含する、方法。
【請求項３７】
炎症を起こさずに骨形成を促進する因子の候補化合物を生産する方法であって、
Ａ）候補化合物を提供する工程；
Ｂ）該候補化合物についてＭＡＰキナーゼの活性化能を検出する工程；
Ｃ）該候補化合物について、Ｓｍａｄの活性化能を検出する工程；
Ｄ）該候補化合物から、ＭＡＰキナーゼを活性化し、かつＳｍａｄを活性化しない化合物を炎症を起こさずに骨形成を促進する因子の候補化合物として選択する工程を包含する、方法。
【請求項３８】
炎症を起こさずに骨を処置するための骨治療剤の製造のための、ＮＥＬＬ１の使用。
【請求項３９】
炎症を起こさずに骨を処置するための、ＮＥＬＬ１を含む骨治療処方物であって、該ＮＥＬＬ１は、骨欠損体積１平方ミリメートルあたり、０．００１μｇ〜３００μｇ（１．６μｇ〜５０ｇ／ｋｇ体重）以下で投与される、骨治療処方物。

【図２Ａ】