骨形成タンパク質の変異タンパク質及びその使用
【課題】骨形成タンパク質の変異タンパク質、それをコードする核酸、このような骨形成変異タンパク質の製造方法、このような変異タンパク質を含む組成物、好ましくは薬剤組成物、及びこのような変異タンパク質の、医薬の製造のための使用。
【解決手段】骨形成タンパク質の変異タンパク質に関すし、この変異タンパク質は、骨形成タンパク質の野生型と比較して、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当するアミノ酸位置にアミノ酸置換を含む。本発明の課題は、Ｉ型及びＩＩ型セリンキナーゼ受容体鎖媒介性作用の点で、骨形成タンパク質の野生型と競合しないが、依然として、ノギンタンパク質ファミリー、ＤＡＮタンパク質ファミリー及びコーディンタンパク質ファミリー等のモジュレータータンパク質と相互作用能を有する。
【解決手段】骨形成タンパク質の変異タンパク質に関すし、この変異タンパク質は、骨形成タンパク質の野生型と比較して、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当するアミノ酸位置にアミノ酸置換を含む。本発明の課題は、Ｉ型及びＩＩ型セリンキナーゼ受容体鎖媒介性作用の点で、骨形成タンパク質の野生型と競合しないが、依然として、ノギンタンパク質ファミリー、ＤＡＮタンパク質ファミリー及びコーディンタンパク質ファミリー等のモジュレータータンパク質と相互作用能を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨形成タンパク質の変異タンパク質、それをコードする核酸、このような骨形成変異タンパク質の製造方法、このような変異タンパク質を含む組成物、好ましくは薬剤組成物、及びこのような変異タンパク質の、医薬の製造のための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の変異タンパク質は、骨形成タンパク質の変異タンパク質である。骨形成タンパク質は、本明細書ではＢＭＰ−２様タンパク質とも呼ばれ、ＴＧＦ−βスーパーファミリーを形成する２つの主要な群の一方である。ＢＭＰ−２様タンパク質とは別に、このＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するもう一方の群のタンパク質はＴＧＦ−β−アクチン様タンパク質である。ＴＧＦ−βスーパーファミリーの２つの群は、その結合機構が異なっている。一般に、ポリペプチド成長因子と構造的に関連しているＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーは、細胞増殖、細胞株の運命決定、分化、移動性、接着及び細胞死をはじめとする細胞過程に関与している。こういった因子は、時間及び組織特異的パターンに従って発現され、真核生物ではほとんどすべての組織の発達、止血及び修復にとって重要である。これらの因子はまた、細胞の活性を規定する細胞内シグナルの重要な部分を占めている。
【０００３】
ＴＧＦ−βのシグナル伝達経路は、ごく最近解明された。ＴＧＦ−βのシグナル伝達には、細胞表面の受容体セリンキナーゼ及びその基質、すなわち、ＳＭＡＤタンパク質が関与しており、このタンパク質は、リン酸化されると核へ移動する。リン酸化されたＳＭＡＤタンパク質は、ＤＮＡ結合パートナーと共同して標的遺伝子の転写を活性化する。ＴＧＦ−β及びＴＧＦ−βスーパーファミリーのその他のメンバーの多機能活性は、種々の受容体とＳＭＡＤタンパク質とＤＮＡ結合タンパク質との相互作用に基づいていると思われる。このシグナル伝達経路の何らかの混乱が、哺乳類、特に人間におけるいくつかの疾患の理由である。ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーはいくつかの構造的特徴を共有しているが、このメンバー間の相同性はかなり限定的である場合もある。例えば、すべてのタンパク質は二量体であり、通常、ホモ二量体、すなわち、２つの同一の単量体からなるものである。また、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーは、２つの異なる種類のセリンキナーゼ受容体鎖、すなわち、Ｉ型鎖及びＩＩ型鎖からなる細胞受容体を用いる。
【０００４】
Ｉ型鎖は細胞質ＧＳボックスとセリンキナーゼとを含み、Ｉ型鎖がＢＲＩＡ、ＢＲＩＢ又はＡＲＩである場合には、ＳＭＡＤ−１及びＳＭＡＤ−５シグナルタンパク質を活性化する。ＩＩ型鎖は、ＧＳボックスセグメントのリン酸化によってＩ型受容体セリンキナーゼを活性化する。Ｉ型及びＩＩ型鎖双方の小さな受容体エクトドメインは、それぞれ約１２０〜１５０個のアミノ酸を含むが、かなり限定的な相同性しか共有していない。それにもかかわらず、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのすべての既知受容体鎖の１つの共通の特徴として、４つの保存されたジスルフィド架橋があり、さらなるジスルフィド架橋及びいくつかのアミノ酸の位置はＩ型又はＩＩ型受容体タンパク質のいずれかに特徴的であるようである。ＢＭＰ−２様タンパク質とＩ型鎖との結合は、ＢＭＰ−２様タンパク質のリスト（ｗｒｉｓｔ）エピトープを介して起こり、ＩＩ型鎖との結合は、ＢＭＰ−２様タンパク質の「ナックル（ｋｎｕｃｋｌｅ）」エピトープを介して起こる。これらの骨形成タンパク質とそれぞれの受容体鎖との結合は、細胞質膜で逐次的に起こり、特定の配列は骨形成タンパク質と個々の受容体鎖との親和性に応じて変わる。例えば、溶解ＢＭＰ−２は、その高親和性Ｉ型鎖、すなわち、ＢＭＰＲ−ＩＡ、ＢＭＰＲ−ＩＢとまず結合し、おそらくはＡｃｔＲ−Ｉとも結合し、続いて、低親和性ＩＩ型受容体鎖と会合して活性な受容体複合体を形成する。この会合は細胞質膜で起こる。
【０００５】
ＢＭＰ−２のリスト又はナックルエピトープ中のいくつかのアミノ酸置換によって、不活性なＢＭＰ−２変異タンパク質となり、これは対応する受容体をもはや活性化することができない。ＢＭＰ−２［Ａ３４Ｄ］などのナックルエピトープ中にアミノ酸置換を有する不活性な変異タンパク質は、それでも、野生型ＢＭＰ−２と同様にＩ型鎖と結合できる。しかし、Ｉ型及びＩＩ型鎖の双方を含む、活性な受容体複合体を形成するための膜におけるＩＩ型鎖の会合には支障を来たす。したがって、この種の変異タンパク質は、Ｉ型鎖に対して野生型ＢＭＰ−２と競合しているので、ＢＭＰ−２の阻害剤として作用する。
【０００６】
骨形成タンパク質及び、詳しくは、ＢＭＰ−２様タンパク質は、Ｉ型鎖及びＩＩ型鎖を含む受容体が関係しているシグナル伝達経路に関与していることとは別に、モジュレータータンパク質の群と相互作用する。これらのモジュレータータンパク質は、同様にある種のシグナル伝達経路に関与している。ＢＭＰ−２様タンパク質と相互作用するモジュレータータンパク質は、中でも、ノギンタンパク質ファミリー、ＤＡＮタンパク質ファミリー及びコーディンタンパク質ファミリーのメンバーを含んでなる。これらのモジュレータータンパク質は、当技術分野では公知であり、例えば、Avsian-Kretchmer,O.及びHsueh, A.J. (2004)「Comparative genomicanalysis of the eight-membered ring cystine knot containingbone morphogeneticprotein antagonists.」、Mol Endocrinol、18巻、1〜12頁に記載されており、これにはＢＭＰ−モジュレータータンパク質、より詳しくは、シスチンノット含有ＢＭＰモジュレータータンパク質が記載されている。例えば、ノギンを含むノギンファミリーは、Canalis, E.、Economides, A. N.及びGazzerro, E. (2003)、「Bonemorphogeneticproteins, their antagonists, and the skeleton.」Endocr Rev巻、24、218〜235頁によって記載されており、中でも、コーディン、ベントロピン、ＣＴＧＦ、ＣＹＲ６１、クロスベインレス（Ｃｒｏｓｓｖｅｉｎｌｅｓｓ）、プロコラーゲンＩＩＡを含むコーディンファミリーは、例えば、Bork, P. (1993)「The modular architecture ofa new family of growth regulators related to connective tissue growth factor.」、FEBS Lett、327巻、125〜130頁、Brigstock, D. R.、Goldschmeding, R.、Katsube,K. I.、Lam, S. C.、Lau, L. F.、Lyons, K.、Naus, C.、Perbal,B.、Riser, B.、Takigawa, M.及びYeger, H. (2003)「Proposal for a unified CCNnomenclature.」Mol Pathol、56巻、127〜128頁並びにGarciaAbreu, J.、Coffinier, C.、Larrain,J.、Oelgeschlager, M.及びDeRobertis, E. M.(2002)「Chordin-like CR domains and theregulationofevolutionarily conserved extracellular signaling systems.」、Gene、287巻、39〜47頁並びに例えば、Ｃｅｒ１、セルベルス（Ｃｅｒｂｅｒｕｓ）、Ｄａｎ、Ｄｔｅ、グレムリン（Ｇｒｅｍｌｉｎ）、ＰＲＤＣ、スクレロスチン（Ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）を含むＤＡＮファミリーは、例えば、Pearce, J.J.、Penny, G.及びRossant, J.(1999)「Amousecerberus/Dan-related gene family.」Dev Biol、209巻、98〜110頁並びにBalemans,W.及びVan Hul, W.(2002)「Extracellular regulation of BMP signaling in vertebrates: a cocktailof modulators.」Dev Biol、250巻、231〜250頁に記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の基礎をなす課題は、Ｉ型及びＩＩ型セリンキナーゼ受容体鎖媒介性作用の点で、それぞれの骨形成タンパク質の野生型と競合しないが、依然として、ノギンタンパク質ファミリー、ＤＡＮタンパク質ファミリー及びコーディンタンパク質ファミリーのものなどのモジュレータータンパク質と相互作用するのには適している、骨形成タンパク質、詳しくはＢＭＰ−２様タンパク質の変異タンパク質を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によれば、この課題は独立請求項の対象によって解決される。好ましい実施形態は従属請求項から選びとることができる。
【０００９】
本発明によれば、この課題は、第１の態様で、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当するアミノ酸位置に骨形成タンパク質の野生型と比較してアミノ酸置換を含む、骨形成タンパク質の変異タンパク質によって解決される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】（Ａ）ＢＭＰ−２及びＢＲＩＡＥＣの複合体構造のリボン図を示す図である。（Ｂ） ＢＭＰ−２及びＢＲＩＡＥＣの接触面について、受容体ＢＲＩＡがｙ軸の回りに１８０°回転している“明白な”眺望における表面表示を示す図である。（Ｃ） ＢＭＰ−２及びＢＲＩＡＥＣの接触面の表面表示を示す図である。
【図２】ＢＭＰ−２−ＢＲＩＡ相互作用の接触面中の拡大表示を示す図である。
【図３】（Ａ）ＢＭＰ−２ Ｌ５１Ｐの結晶構造を示す、プレヘリックスループセグメントの立体像を示す図である。
【図４】ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−２変異タンパク質に反応してＡＴＤＣ５（Ａ）及びＣ２Ｃ１２（Ｂ）細胞で測定されたアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性の誘導として表されるＢＭＰ−２プロリン変異タンパク質の生物活性を示す図である。
【図５】ＢＭＰ−２プロリン変異タンパク質Ｌ５１Ｐによるノギン阻害の解除を示す図である。
【図６】ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置のアミノ酸残基をロイシンから好ましくはプロリンに交換し、本発明の変異タンパク質の好ましい実施形態を形成したＢＭＰ−２様タンパク質のアラインメントを示す図である。
【図７】ＢＭＰプロリン変異タンパク質と（Ａ）ＢＲＩＡＥＣ、（Ｂ）ＢＲＩＢＥＣ又は（Ｃ）アクチビン受容体ＩＩエクトドメイン間の相互作用、並びに（Ｄ）ＢＭＰ−２とＢＲＩＡＥＣ変異タンパク質間の相互作用のセンサーグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍｓ）、を示す図であって、すべてのリガンドは、１２０ｎＭ濃度で存在しており、センサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍｓ）は、アナライトであるＢＭＰ−２の濃度を飽和するために算出されたレゾナンスユニット（ＲＵ）を１００％として設定することによって標準化した。
【図８】ＢＭＰ−２野生型とＢＭＰ−２ Ｌ５１Ｐの間の構造の相違を示す図であって、両構造のＣα−原子がスーパーインポーズされ、中間の距離が示され、プレヘリックスループの領域は灰色で強調表示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
一実施形態では、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置のアミノ酸は、骨形成タンパク質の野生型ではロイシンであり、変異タンパク質では好ましくはプロリンである。
【００１２】
一実施形態では、骨形成タンパク質は、ｈＢＭＰ−２、ｈＢＭＰ−４、ｈＢＭＰ−５、ｈＢＭＰ−６、ｈＢＭＰ−７、ｈＢＭＰ−８、ｈＧＤＦ−５、ｍＧＤＦ−６、ｍＧＤＦ−７、ｈＢＭＰ−１０及びｈＧＤＦ−２を含んでなる群から選択される。
【００１３】
一実施形態では、
骨形成タンパク質は、ｈＢＭＰ−２であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置はアミノ酸位置５１であり、
骨形成タンパク質は、ｈＢＭＰ−４であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置はアミノ酸位置５３であり、
骨形成タンパク質は、ｈＢＭＰ−５であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置はアミノ酸位置６８であり、
骨形成タンパク質は、ｈＢＭＰ−６であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置はアミノ酸位置６８であり、
骨形成タンパク質は、ｈＢＭＰ−７であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置はアミノ酸位置７５であり、
骨形成タンパク質は、ｈＢＭＰ−８であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置はアミノ酸位置７５であり、
骨形成タンパク質は、ｈＧＤＦ−５であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置がアミノ酸位置５６であり、
骨形成タンパク質は、ｍＧＤＦ−６であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置がアミノ酸位置５６であり、
骨形成タンパク質は、ｍＧＤＦ−７であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置はアミノ酸位置８２であり、
骨形成タンパク質は、ｈＢＭＰ−１０であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置はアミノ酸位置４４であり、
骨形成タンパク質は、ｈＧＤＦ−２であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置はアミノ酸位置４５である。
【００１４】
一実施形態では、野生型の
ｈＢＭＰ−２は、配列番号１のアミノ酸配列を含み、
ｈＢＭＰ−４は、配列番号３のアミノ酸配列を含み、
ｈＢＭＰ−５は、配列番号５のアミノ酸配列を含み、
ｈＢＭＰ−６は、配列番号７のアミノ酸配列を含み、
ｈＢＭＰ−７は、配列番号９のアミノ酸配列を含み、
ｈＢＭＰ−８は、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、
ｈＧＤＦ−５は、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、
ｍＧＤＦ−６は、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、
ｍＧＤＦ−７は、配列番号１７のアミノ酸配列を含み、
ｈＢＭＰ−１０は、配列番号１９のアミノ酸配列を含み、
ｈＧＤＦ−２は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
【００１５】
好ましい一実施形態では、野生型の
ｈＢＭＰ−２は、配列番号２の核酸によってコードされており、
ｈＢＭＰ−４は、配列番号４の核酸によってコードされており、
ｈＢＭＰ−５は、配列番号６の核酸によってコードされており、
ｈＢＭＰ−６は、配列番号８の核酸によってコードされており、
ｈＢＭＰ−７は、配列番号１０の核酸によってコードされており、
ｈＢＭＰ−８は、配列番号１２の核酸によってコードされており、
ｈＧＤＦ−５は、配列番号１４の核酸によってコードされており、
ｍＧＤＦ−６は、配列番号１６の核酸によってコードされており、
ｍＧＤＦ−７は、配列番号１８の核酸によってコードされており、
ｈＢＭＰ−１０は、配列番号２０の核酸によってコードされており、
ｈＧＤＦ−２は、配列番号２２の核酸によってコードされている。
【００１６】
本発明によれば、この課題は、第２の態様で、第１の骨形成タンパク質受容体と結合しておらず、かつ、ノギンタンパク質ファミリー、ＤＡＮタンパク質ファミリー、コーディンタンパク質ファミリー及びシステインノット含有ＢＭＰモジュレータータンパク質を含んでなる群から選択される少なくとも１種のモジュレータータンパク質と結合している、骨形成変異タンパク質によって解決される。
【００１７】
本発明によれば、この課題は、第３の態様で、骨形成変異タンパク質によって解決され、この骨形成変異タンパク質は、好ましくは第２の骨形成タンパク質受容体と相互作用するプレヘリックスループ構造を含む、本発明の第１及び第２の態様の実施形態であることが好ましい。第２の骨形成タンパク質受容体の用語は、この種の受容体と、本明細書で第１の骨形成タンパク質受容体と呼ばれる別の受容体を区別するために用いられると理解されなくてはならない。この技術用語は、本明細書で参照するためだけに取り入れられており、タンパク質及び変異タンパク質の結合をそれぞれ暗に示すものではない。その程度において、タンパク質及び変異タンパク質の結合は、それぞれ、単一の骨形成タンパク質受容体とのみ起こることが好ましい。このような単一の骨形成タンパク質受容体は、第１の骨形成タンパク質受容体又は第２の骨形成タンパク質受容体のいずれかであり得る。
【００１８】
第２及び第３の態様に従う一実施形態では、第１及び／又は第２の骨形成タンパク質受容体がＢＲＩＡ又はＢＲＩＢである、請求項７及び８に記載の骨形成変異タンパク質。
【００１９】
第２及び第３の態様に従う一実施形態では、相互作用はアミノ酸残基、好ましくは、ＢＲＩＡのＧｌｎ８６又はＢＲＩＢのＧｌｎ６７アミノ酸残基に関連している。
【００２０】
本発明によれば、この課題は、第４の態様で、骨形成変異タンパク質によって解決され、この骨形成変異タンパク質は、好ましい実施形態では、第１、第２及び第３の態様に従う骨形成タンパク質であり、第２の骨形成タンパク質受容体との相互作用を有するプレヘリックスループ構造を含み、骨形成変異タンパク質のプレヘリックスループ構造と第２の骨形成タンパク質受容体との相互作用が、野生型骨形成タンパク質のプレヘリックスループ構造と第２の骨形成タンパク質受容体との相互作用とは異なる。
【００２１】
いずれかの態様に従う一実施形態では、異なる相互作用又は変化は、屈折データ、好ましくは、少なくとも約２．７Åの分解能まで室温で得られているような屈折データで表される。
【００２２】
いずれかの態様に従う一実施形態では、プレヘリックスループ構造が、骨形成タンパク質の野生型と比較して変異している。
【００２３】
好ましい一実施形態では、野生型ＢＭＰ−２の位置５１のロイシンに相当するアミノ酸が変異している。
【００２４】
もう１つの好ましい実施形態では、ヒトＢＭＰ−２の位置５１のロイシンに相当するアミノ酸がプロリンに変異している。
【００２５】
いずれかの態様に従う一実施形態では、骨形成変異タンパク質は、ｈＢＭＰ−２、ｈＢＭＰ−４、ｈＢＭＰ−５、ｈＢＭＰ−６、ｈＢＭＰ−７、ｈＢＭＰ−８、ｈＧＤＦ−５、ｍＧＤＦ−６、ｍＧＤＦ−７、ｈＢＭＰ−１０及びｈＧＤＦ−２を含んでなる群から選択される骨形成タンパク質の変異タンパク質である。
【００２６】
好ましい一実施形態では、骨形成タンパク質はＢＭＰ−２又はプロ−ＢＭＰ−２である。
【００２７】
本発明によれば、この課題は、第５の態様で、配列番号２３〜３３のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む骨形成タンパク質によって解決される。
【００２８】
一実施形態では、骨形成変異タンパク質は、本発明のいずれかの態様に記載の骨形成変異タンパク質である。
【００２９】
本発明によれば、この課題は、第６の態様で、本発明のいずれかの態様に従う、骨形成タンパク質及び骨形成変異タンパク質をそれぞれコードする核酸、並びに／又はその相補鎖によって解決される。
【００３０】
本発明によれば、この課題は、第７の態様で、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０及び２２の核酸配列を含む核酸、好ましくは、本発明のいずれかの態様に従う骨形成変異タンパク質をコードする核酸、並びに／又はその相補鎖によって解決される。
【００３１】
本発明によれば、この課題は、第８の態様で、本発明のいずれかの態様に従う骨形成変異タンパク質をコードする核酸であって、より好ましくは、ストリンジェントな条件下で、遺伝暗号の縮重がなければ、第６及び第７の態様に従う核酸とハイブリダイズする核酸によって解決される。
【００３２】
本発明によれば、この課題は、第９の態様で、第６、第７及び第８の態様に従う核酸を含むベクターであって、好ましくは発現ベクターであるベクターによって解決される。
【００３３】
本発明によれば、この課題は、第１０の態様で、第６、第７及び第８の態様に従う核酸及び／又は本発明の第１０の態様に従うベクターを含む細胞、好ましくは、哺乳類細胞によって解決される。
【００３４】
本発明によれば、この課題は、第１１の態様で、本発明の第１０の態様に従う細胞を含む、宿主生物、好ましくは、哺乳類宿主生物、より好ましくは、非ヒト宿主生物によって解決される。
【００３５】
本発明によれば、この課題は、第１２の態様で、
ａ）請求項２５に記載の細胞を培養ブロスで培養するステップと、
ｂ）細胞から、及び／又は培養ブロスから骨形成変異タンパク質を調製するステップと、
を含む、本発明の第１〜第５のいずれかの態様に従う骨形成変異タンパク質の製造方法によって解決される。
【００３６】
本発明によれば、この課題は、第１３の態様で、本発明の第１〜第５のいずれかの態様に従う骨形成変異タンパク質と特異的に結合しているモノクローナル抗体によって解決される。
【００３７】
本発明によれば、この課題は、第１４の態様で、本発明の第１〜第５のいずれかの態様に従う変異タンパク質及び／又は本発明の第６〜第８のいずれかの態様に従う核酸を含む組成物によって解決される。
【００３８】
本発明によれば、この課題は、第１５の態様で、本発明の第１〜第５のいずれかの態様に従う変異タンパク質又は第６〜第８のいずれかの態様に従う核酸と、製薬上許容される担体とを含む薬剤組成物によって解決される。
【００３９】
本発明によれば、この課題は、第１６の態様で、医薬を製造するための、本発明の第１〜第５のいずれかの態様に従う骨形成変異タンパク質及び／又は第６〜第８のいずれかの態様に従う核酸の使用によって解決される。
【００４０】
一実施形態では、医薬は、線維性疾患、創傷治癒、過剰血管新生、血管疾患、骨折及び骨粗しょう症を含んでなる群から選択される疾患の治療用及び／又は予防用のものである。
【００４１】
好ましい一実施形態では、線維性疾患は、腎線維症、肝硬変、肺線維症及び慢性炎症、好ましくは、喘息を伴う慢性炎症を含んでなる群から選択される。
【００４２】
もう１つの実施形態では、創傷治癒はケロイド、瘢痕形成及び腹膜の閉塞と関連している。
【００４３】
さらなる一実施形態では、過剰血管新生は、網膜症、動脈硬化症及び／又は腫瘍と関連しているか、又は網膜症、動脈硬化症及び／又は腫瘍を伴う。
【００４４】
いっそうさらなる実施形態では、骨折は難治性骨折である。
【００４５】
もう１つの実施形態では、疾患は骨粗しょう症である。
【００４６】
本発明によれば、この課題は、第１７の態様で、形態形成タンパク質、好ましくは、本発明の第１〜第５のいずれかの態様に従う形態形成変異タンパク質の、ＢＭＰ相互作用タンパク質に対する阻害剤としての使用によって解決される。
【００４７】
一実施形態では、ＢＭＰ相互作用タンパク質は、ノギンタンパク質ファミリー、ＤＡＮタンパク質ファミリー及びコーディンタンパク質ファミリーを含んでなる群から選択される。
【００４８】
本発明者らは、驚くべきことに、本発明の変異タンパク質が、ノギンファミリー、ＤＡＮファミリー及びコーディンタンパク質ファミリーのものなどのモジュレータータンパク質の活性を阻害できる一方で、少なくとも１個のアミノ酸を置換することによって生じる骨形成タンパク質に対応する受容体、より詳しくは、ＢＭＰ−２様タンパク質受容体、とは相互作用しないことを見出した。本発明の変異タンパク質はこれらの特徴を有するため、それらはいずれかの生物に適用することができ、この場合、前記モジュレータータンパク質が調節され、好ましくは、阻害され、ひいては、前記モジュレータータンパク質によって発揮される阻害が消滅するか減少することになり、その一方で、前記受容体鎖によって媒介される、骨形成タンパク質に関連しているその他の生物活性はもはや存在しない。骨形成タンパク質の変異タンパク質のこういった設計は、この種の骨形成タンパク質の、望ましくない受容体媒介性作用を引き起こすことなく、モジュレータータンパク質が関連しているか媒介する疾患の治療又は予防に使用できる限りにおいて、明らかに有利である。その程度において、本発明の変異タンパク質は“受容体非感受性（ｒｅｃｅｐｔｏｒｄｅａｄ）”である。
【００４９】
また、本発明者らは驚くべきことに、骨形成変異タンパク質のこの特有の特徴は、野生型の骨形成タンパク質中のプレヘリックスループ構造を変更することによって作出できることを見出した。本明細書においては、そうでないことが示されない場合は、骨形成タンパク質は、ＢＭＰ−２様タンパク質であることが好ましい。プレヘリックスループ構造は、好ましくは骨形成変異タンパク質の構造であり、これは、二次構造表示でヘリックスの前のループであることが好ましい。ループは４〜１０個、好ましくは６〜８個、より好ましくは、６個のアミノ酸残基を含むことが好ましい。ヒトＢＭＰ−２タンパク質のアミノ酸配列を例にとると、プレヘリックスループ構造はアミノ酸位置４８〜アミノ酸位置５３に広がっている。本明細書では、好ましい実施形態では、プレヘリックスループは、いずれかのループであって、より好ましくはヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置４８〜５３に相当するいずれかのアミノ酸配列であり、より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列である。プレヘリックスループ構造は、好ましくは、本明細書においてＩ型骨形成タンパク質受容体と呼ばれる骨形成タンパク質受容体との相互作用を媒介していることが好ましい。Ｉ型骨形成タンパク質受容体はＢＲＩＡであることがいっそうより好ましい。ＢＲＩＡＥＣは、ＢＭＰＲ−ＩＡの細胞外ドメインであり、以下に記載されている（Kirsch, T.、Sebald, W.、Dreyer, M.K.(2000) Nat Struct Biol、7、492〜496参照）。ＢＲＩＢＥＣは、ＢＭＰＲ−ＩＢの細胞外ドメインである。ＡＲＩＥＣは、ＡｃｔＲ−Ｉの細胞外ドメインである。
【００５０】
本発明の変異タンパク質は、骨形成タンパク質の野生型と比較して、構造、好ましくは二次構造及び三次構造の変化のために、Ｉ型骨形成タンパク質受容体ともはや相互作用できない。本明細書において用いられるのに好ましい変化とは、対応する骨形成タンパク質の野生型と前記Ｉ型形成タンパク質受容体との相互作用を参照することによって検出可能なものである。より詳しくは、Ｉ型骨形成タンパク質受容体がＢＲＩＡＥＣである場合には、本発明の変異タンパク質によって最も影響を受けるアミノ酸はＧｌｎ８６であるようである。
【００５１】
また、本発明の骨形成変異タンパク質はプレヘリックスループ構造を含み、これがＢＲＩＡＥＣなどのＩ型骨形成タンパク質受容体との相互作用を媒介しており、この相互作用は骨形成タンパク質の野生型のプレヘリックスループ構造とＩ型骨形成タンパク質受容体との相互作用とは異なっている。これらの誘導された変化のいずれか又は変異タンパク質とそれぞれの第２の骨形成タンパク質受容体との間の異なる相互作用パターンは、骨形成タンパク質の野生型の対応する構造又は相互作用と比較して検出される。前記Ｉ型骨形成タンパク質受容体と変異タンパク質のいずれか又は双方のこのような変化は、屈折データを得ることによってモニターできることが好ましい。より好ましい実施形態では、このような屈折データは少なくとも約２．７Åの分解能まで室温で得られる。
【００５２】
好ましい実施形態では、骨形成タンパク質は、ＢＭＰ−２である。ＢＭＰ−２は当技術分野では公知であり、本明細書に記載される配列番号１のアミノ酸配列を含むことが好ましく、配列番号２の核酸配列を含む核酸によってコードされることが好ましい。
【００５３】
より詳しくは、本発明者らはまた、本発明の変異タンパク質の特有の特徴は、プレヘリックスループ構造でのアミノ酸置換、より詳しくは、骨形成タンパク質のアミノ酸位置、好ましくはヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当するＢＭＰ−２様タンパク質のアミノ酸位置、さらに好ましくは、配列番号１のＢＭＰ−２のアミノ酸位置でのアミノ酸置換、すなわち変異、によって付与されるということも発見した。より詳細には、変異タンパク質中で変異されているそれぞれのアミノ酸は、対応する骨形成タンパク質の野生型においてはロイシンである。より好ましくは、その交換はロイシン残基からプロリン残基である。骨形成タンパク質、特に、ＢＭＰ−２様タンパク質の高い相同性、ひいては類似の二次及び三次構造のために、特定の位置が同様に活性であり、この群の骨形成タンパク質の種々のメンバー内でそれぞれ関連があり、その結果、変化、すなわち、アミノ酸置換は、前記骨形成タンパク質のいずれにおいても有効であり、したがって、それぞれの変異タンパク質は前記で概説した特徴を示す。骨形成タンパク質はｈＢＭＰ−２、ｈＢＭＰ−４、ｈＢＭＰ−５、ｈＢＭＰ−６、ｈＢＭＰ−７、ｈＢＭＰ−８、ｈＧＤＦ−５、ｍＧＤＦ−６、ｍＧＤＦ−７、ｈＢＭＰ−１０及びｈＧＤＦ−２であることがより好ましく、これらは当技術分野ではそれ自体公知であり、これらのすべては同じようにＢＲＩＡＥＣと結合する。しかし、対応する変異タンパク質、すなわち、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当するそれらの位置にアミノ酸置換を有する変異タンパク質、にそれらを変えるそれぞれの変異によって、それらを先行技術から区別している。前記の骨形成タンパク質の野生型配列は本明細書では配列番号１（ｈＢＭＰ−２）、配列番号３（ｈＢＭＰ−４）、配列番号５（ｈＢＭＰ−５）、配列番号７（ｈＢＭＰ−６）、配列番号９（ｈＢＭＰ−７）、配列番号１１（ｈＢＭＰ−８）、配列番号１３（ｈＧＤＦ−５）、配列番号１５（ｍＧＤＦ−６）、配列番号１７（ｍＧＤＦ−７）、配列番号１９（ｈＢＭＰ−１０）及び配列番号２１（ｈＧＤＦ−２）として開示されており、本発明の前記骨形成タンパク質の変異タンパク質の対応するアミノ酸配列は、野生型と比較して前記の単一のアミノ酸位置で異なっており、前記アミノ酸配列は配列番号２３（ｈＢＭＰ−２）、配列番号２４（ｈＢＭＰ−４）、配列番号２５（ｈＢＭＰ−５）、配列番号２６（ｈＢＭＰ−６）、配列番号２７（ｈＢＭＰ−７）、配列番号２８（ｈＢＭＰ−８）、配列番号２９（ｈＧＤＦ−５）、配列番号３０（ｍＧＤＦ−６）、配列番号３１（ｍＧＤＦ−７）、配列番号３２（ｈＢＭＰ−１０）及び配列番号３３（ｈＧＤＦ−２）のものである。より詳しくは、前記のヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１は、ｈＢＭＰ−４の場合には位置５３、ｈＢＭＰ−５の場合には位置６８、ｈＢＭＰ−６の場合には位置６８、ｈＢＭＰ−７の場合には位置７５、ｈＢＭＰ−８の場合には位置７５、ｈＧＤＦ−５の場合には位置５６、ｍＧＤＦ−６の場合には位置５６、ｍＧＤＦ−７の場合には位置８２、ｈＢＭＰ−１０の場合には位置４４及びｈＧＤＦ−２の場合には位置４５に相当する。
【００５４】
本明細書において、本明細書に開示される、骨形成タンパク質及びひいては、単一のアミノ酸置換でのみ異なっていることが好ましい対応する変異タンパク質は、プレプロ型で存在する場合も、プロ型で存在する場合も、成熟タンパク質として存在する場合もある。この基本設計は、すべての骨形成タンパク質にもともと備わっているものである。例えば、ＢＭＰ−２の場合には、プレプロ型は全部で３９６個のアミノ酸を含む。プレ配列はシグナルペプチドとして働き、新生ポリペプチド鎖の小胞体への輸送に関与している。輸送された後、タンパク質はその未変性コンホメーションに折り畳まれ、その際ジスルフィド架橋が形成される。ＢＭＰ−２のプロ型は、位置２０〜位置３９６のアミノ酸すべてを含む。したがって、プロ配列はＢＭＰ−２のヒトプレプロ型の位置２０（Ｇｌｙ）〜アミノ酸位置２８２（Ａｒｇ）までのアミノ酸を含む。最後に、成熟ＢＭＰ−２はプレプロ型のアミノ酸２８３〜３９６を含む。成熟型は本明細書では配列番号１として表されている。
【００５５】
本発明の骨形成タンパク質及びその対応する変異タンパク質は、プレプロ型、プロ型、又は成熟型で存在し、いずれかのシグナルペプチドが、プレ配列として、好ましくは、骨形成タンパク質のプレ配列として作用し、いずれの骨形成タンパク質のいずれのプロ配列であれば、特定の骨形成タンパク質のプロ配列として使用できるということは本発明の範囲内であるが、成熟骨形成変異タンパク質のＮ末端に結合しているプロ配列が、ｉｎ ｖｉｖｏでそれぞれの骨形成タンパク質のＮ末端に結合するプロ配列に相当することがより好ましい。同じことがプレ配列にも当てはまる。
【００５６】
本明細書において、用語「骨形成タンパク質」及び「骨形成変異タンパク質」とはそれぞれ、その相同分子種も含むものとして好ましく使用される。本明細書において、相同分子種とは、参照タンパク質（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）として、同様の遺伝的機能及び生理学的機能を果たす別の生物由来のタンパク質である。また、より好ましい実施形態では、用語「骨形成タンパク質」及び「骨形成変異タンパク質」は、いずれかの末端切断型タンパク質及び変異タンパク質をそれぞれ含む。このような末端切断型タンパク質及び変異タンパク質は、少なくとも１個のアミノ酸残基を欠いており、Ｎ末端又はＣ末端のいずれかで少なくとも１個のアミノ酸残基を欠いていることが好ましい。したがって、本発明の骨形成変異タンパク質は、前記で概説された特徴、すなわち、「受容体非感受性」であり、かつ、少なくとも１種のモジュレータータンパク質、好ましくは、ノギンタンパク質ファミリー、ＤＡＮタンパク質ファミリー及び／又はコーディンタンパク質ファミリーのメンバーと相互作用するのに依然として適している限りは、末端切断型変異タンパク質である。
【００５７】
変異タンパク質はさらに修飾され、このような修飾はリン酸化、ペグ化及びグリコシル化を含んでなる群から選択されることが好ましいということもまた本発明の範囲内である。
【００５８】
本発明の核酸は、いずれもがＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの誘導体、例えば、ＬＮＡ若しくはＰＮＡ、として存在し得ることを理解されなくてはならない。それぞれの核酸は、一本鎖又は部分的な二本鎖若しくは完全な二本鎖のいずれかとして存在することも本発明の範囲内である。最後に、用語「核酸配列」は、例えば、配列識別子に従う配列によって、単独で又は本質的な相補的鎖であるもう一方の鎖と組み合わせて特定されるような核酸の補完物を含むことも本発明の範囲内である。
【００５９】
本明細書において、用語「核酸」とは、また、本明細書に記載される核酸のいずれの断片も含み、このような断片のいずれもが、約１９〜３０の長さの連続するヌクレオチドを含むことが好ましく、１９〜２５の長さがより好ましく、２１〜２２の長さが最も好ましい。核酸のこの種の断片は、二本鎖構造として存在することがいっそうより好ましい。
【００６０】
本発明によれば、核酸はまた、本明細書に開示される核酸の何らかのその他の形とハイブリダイズする核酸であってもよく、このようなハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件で起きることが好ましい。このようなストリンジェントな条件は、中でも、Sambrook, J.、Fritsch, E.F.及びManiatis, T. (1989) Molecular Cloning. A.Laboratory Manual、第2版、9.47〜9.55頁、Cold Spring Harbour Laboratory Pressに記載されている。
【００６１】
本明細書に記載される、骨形成タンパク質の野生型配列又はその変異タンパク質の配列のいずれかを発端として、骨形成タンパク質の野生型とその変異タンパク質とを区別できる核酸を設計することが可能であることは、当業者に認められよう。このような区別はハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを高めることによって可能となることが好ましい。
【００６２】
本明細書に開示される特定の配列だけでなく、種々の配列、より好ましくは、核酸配列も、それらが本発明の変異タンパク質をコードするのに適している限りは本発明に含まれるということも当業者に認められよう。このような配列は遺伝暗号を用いて導くことができ、事実上、遺伝暗号の冗長性によって生じるこのような配列のいずれの順列も本発明の範囲内にある。ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１にそれぞれ相当する、骨形成タンパク質及び変異タンパク質の位置が、ロイシンではなくプロリンであることが本発明の変異タンパク質の特徴となっており、この特定のアミノ酸置換については、それぞれのコドンがＣＣＵ、ＣＣＣ、ＣＣＡ又はＣＣＧであると認められよう。
【００６３】
本発明のベクターは、本明細書に開示されるいずれかの断片を含み、本明細書に開示されるいずれかの核酸を含む。ベクターは発現ベクターであることが好ましい。このような発現ベクターは、通常、プロモーター又はプロモーター様構造と、場合によっては、このようなプロモーター及びその他の制御エレメントによって制御されるような、ベクターにクローニングされている核酸の発現を制御するのに適しているさらなるエレメントを含む。発現ベクターは原核生物の発現ベクターか、真核生物の発現ベクターかそれぞれのシャトルベクターであることが好ましい。この種の発現ベクターの個々の設計は当業者には公知である。
【００６４】
本発明の細胞は、原核細胞か真核細胞のいずれかである。原核細胞としては、原則として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はＳ．カルノサス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）が本発明の骨形成変異タンパク質をコードする核酸、又はその断片若しくは誘導体の発現に用いられる。
【００６５】
本明細書において、真核細胞は、酵母細胞又は哺乳類細胞であることが好ましい。哺乳類細胞はマウス、ラット、モルモット、ブタ、サル又はヒト由来の細胞であることがより好ましい。
【００６６】
本明細書において、宿主生物は本発明のいずれかの細胞又は多細胞生物であることが好ましい。このような多細胞生物は好ましくは、哺乳類であることが好ましく、非ヒト哺乳類であることがより好ましい。好ましい非ヒト哺乳類はマウス、ラット、モルモット、ヒツジ、ウサギ及びブタを含んでなる群から選択される。
【００６７】
本発明の骨形成変異タンパク質を製造するための本発明の方法では、本発明の細胞は培養されていることが好ましい。このような培養は培養ブロスで行われることが好ましい。培養ブロスは発酵ブロス又は、培養に適し、かつ、より好ましくは培養される細胞の増殖に適しているいずれかのその他の溶液、であることが好ましい。培養ブロスは当業者には公知である。培養及び／又は細胞の増殖において、本発明の変異タンパク質は、培養ブロスから調製されることが好ましい。培養ブロスからの調製は、本明細書に記載されているように、本発明の変異タンパク質を細胞内に含ませるか又は細胞に結合させてその細胞からの調製すること、又は培養ブロスからの本発明の変異タンパク質を単離若しくは調製すること、を含む。本発明の変異タンパク質の調製又は単離方法は当業者には公知である。
【００６８】
さらなる態様では、本発明は、本発明の変異タンパク質に対するモノクローナル抗体と関連している。抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。抗体、好ましくは、本発明の骨形成変異タンパク質と特異的に結合するモノクローナル抗体、を調製することが可能であることは、当業者に認められよう。
【００６９】
用語「特異的な結合」とは、抗体が、変異タンパク質に対してと同程度に、又は以下に示すように、変異タンパク質に対して同じ結合特性で、骨形成タンパク質の野生型とは結合しておらず、対応する骨形成タンパク質の野生型と比較した変異タンパク質の結合定数が、少なくとも２倍異なっている、好ましくは少なくとも５倍、最も好ましくは少なくとも１０倍異なることを意味している。
【００７０】
さらなる態様では、本発明は、本発明の変異タンパク質又は本発明の核酸のいずれかを含む組成物に関連している。このような組成物は、タンパク質及び／又は核酸だけでなく、担体を含み得る。このような担体は固相、水相及び脂質相を含んでなる群から選択されることが好ましい。本明細書において、脂質相は核酸及び変異タンパク質とそれぞれ複合体を形成しているか、核酸及び変異タンパク質をそれぞれ包含している脂質又は脂質組成物であることが好ましい。脂質組成物は、その程度において当業者に公知のリポソームであることが好ましい。水相は水及び水性バッファー溶液及びヒアルロン酸を含んでなる群から選択されることが好ましい。固相は、リン酸三カルシウム、ポリラクチド、コラーゲン及び不溶性コラーゲン骨マトリックスであることが好ましい。
【００７１】
さらなる態様では、本発明は薬剤組成物に関連している。このような薬剤組成物は、本発明の変異タンパク質又は本発明の核酸あるいは双方と、さらに製薬上許容される担体とを含む。製薬上許容される担体は液体又は固体担体のいずれかであることが好ましい。適した液体担体としては、中でも、水、水溶液、より好ましくは、バッファー又は脂質若しくは脂質組成物がある。好ましい固体担体は、中でも、糖、セルロース及びデンプンを含む。当業者、好ましくは、製剤の技術分野の当業者であれば、さらなる製薬上許容される担体及び担体物質をそれぞれ承知しているものと認められる。好ましい実施形態では、薬剤組成物はさらなる製薬上活性な薬剤を含む。
【００７２】
さらなる態様では、本発明は、医薬の製造のための本発明の骨形成変異タンパク質及び／又は本発明の核酸の使用に関する。
【００７３】
本発明者らの驚くべき発見に基づいて、すなわち、骨形成タンパク質、より詳しくは、本発明のＢＭＰ−２様タンパク質の変異タンパク質は、骨形成タンパク質のような受容体媒介性作用を示さず、すなわち「受容体非感受性」であるが、依然として、それぞれの骨形成タンパク質の野生型が、相互作用するモジュレータータンパク質と相互作用することは当業者に認められる。その程度において、本発明の変異タンパク質及びそれをコードする核酸は、骨形成タンパク質の公知の望ましくない作用が生じるという危険に出くわすことなくそれらを必要とする患者に適用でき、このことは、その阻害活性を阻害するモジュレータータンパク質と相互作用する利益よりも上回る。例えば、ＢＭＰ−２の望ましくない活性の中には、腫瘍成長を促進することがある。このために、先行技術における、いずれかの変異タンパク質をも含む骨形成タンパク質の医学的使用は、骨再生などの局所投与に制限されてきた。しかし、骨形成タンパク質の活性であるそのような作用、詳しくは、その受容体との相互作用によって媒介されるもの、を欠いている本発明の変異タンパク質は、このクラスの製薬上活性を有する化合物の医学的な適用を全く初めて可能にするものである。
【００７４】
本発明のさらなる態様は、本発明の医薬を使用できる、本明細書に記載された疾患のいずれかを患っているか、又はそれが進行する状態にある患者の治療方法に関している。このような方法は、変異タンパク質又はそれをコードする核酸の患者への投与を含む。患者は哺乳類であることが好ましく、ヒトであることがより好ましい。
【００７５】
本発明の変異タンパク質の作用様式のために、それらは種々の疾患、すなわち、本発明の骨形成タンパク質とこれに対応する変異タンパク質との間の影響を受けない相互作用、及びいずれかのモジュレータータンパク質、を提供することによって治療又は予防できる疾患、に容易に用いることができる。モジュレータータンパク質は当技術分野では公知であり、シスチンノット含有骨形成タンパク質、より詳しくは、シスチンノット含有ＢＭＰモジュレータータンパク質、ノギンファミリー、コーディンファミリー及びＤＡＮファミリーを含んでなる群から選択されることが好ましい。シスチンノット含有ＢＭＰモジュレータータンパク質は、例えば、Avsian-Kretchmer,O.及びHsueh, A. J. (2004)Comparative genomic analysis of theeight-membered ring cystine knot-containingbone morphogenetic proteinantagonists. Mol Endocrinol、18巻、1〜12頁に記載されている。例えば、ノギンを含むノギンファミリーは、Canalis, E.、Economides, A. N.及びGazzerro,E.によって(2003) Bonemorphogeneticproteins, their antagonists, and the skeleton. Endocr Rev、24巻、218〜235頁に記載されており、中でもコーディン、ベントロプチン、ＣＴＧＦ、ＣＹＲ６１、クロスベインレス、プロコラーゲンＩＩＡを含むコーディンファミリーは、例えば、Bork, P. (1993) The modular architecture of anew family of growthregulators related to connective tissue growth factor.FEBS Lett、327巻、125〜130頁、Brigstock, D. R.、Goldschmeding,R.、Katsube, K. I.、Lam, S. C.、Lau, L. F.、Lyons, K.、Naus, C.、Perbal, B.、Riser,B.、Takigawa, M.及びYeger, H.(2003)Proposal for a unified CCN nomenclature. Mol Pathol、56巻、127〜128頁及びGarcia Abreu, J.、Coffinier, C.、Larrain, J.、Oelgeschlager, M.及びDe Robertis, E.M.(2002) Chordin-like CR domains and theregulation ofevolutionarily conserved extracellular signaling systems. Gene、287巻、39〜47頁に記載されており、例えば、Ｃｅｒ１、セルベルス、Ｄａｎ、Ｄｔｅ、グレムリン、ＰＲＤＣ、スクレロスチン（Ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）を含むＤＡＮファミリーは、例えば、Pearce, J.J.、Penny, G.及びRossant, J. (1999) A mouse cerberus/Dan-related genefamily. Dev Biol、209巻、98〜110頁及びBalemans, W.及びVan Hul, W.(2002)Extracellular regulation of BMP singaling in vertebrates: a cocktailofmodulators. Dev Biol、250巻、231〜250頁に記載されている。これらのモジュレータータンパク質は、偏っている場合、特にそれ自身が阻害されない場合に、ｉｎ ｖｉｖｏプロセスに対する阻害作用を有し、その結果、何らかの疾患又は病的状態をもたらす傾向がある細胞における経路及び事象に対して阻害又は刺激作用を有することがわかっている。したがって、いずれの理論にも拘束されようとは思わないが、本発明の変異タンパク質は、依然として前記モジュレータータンパク質と相互作用し、これによりモジュレータータンパク質によって刺激され、さもなければ阻害されるプロセスを許容するそれらの修飾作用をも阻害でき、モジュレータータンパク質単独の存在下で観察される程度と比較して、あらゆるレベルで、又は高いレベルで、又は低いレベルで実施され得る。
【００７６】
本発明の、変異タンパク質及びそれをコードする核酸によって治療できる特に好ましい疾患としては、線維性疾患がある。本発明に従って治療できる特に好ましい疾患としては、腎線維症、肝硬変、肺線維症及び慢性炎症があり、喘息を伴う慢性炎症がより好ましく、したがって、喘息の治療も本発明に含まれる。
【００７７】
再度、いずれの理論にも拘束されようとは思わないが、コーディン−ファミリーに属するＣＴＧＦは、ＢＭＰ−２と、ひいては本発明の変異タンパク質と相互作用する。ＣＴＧＦはＴＧＦ−βのプロ線維活性を媒介している。より詳しくは、ＴＧＦ−βは、細胞外マトリックスのタンパク質の産生を刺激しており、この種のタンパク質の分解を阻害する。すなわち、このプロセスは組織の治癒に不可欠なものである。しかし、炎症性疾患、より詳しくは、慢性炎症などの慢性疾患の場合には、ＴＧＦ−β活性が豊富であり、ひいては組織線維症、特に、過剰組織線維症をもたらす（Branton, M. H.及びKopp, J. B.(1999)TGF-betaand fibrosis. Microbes Infect、1巻、1349〜1365頁）。したがって、これら種々の線維性疾患は本発明の変異タンパク質の投与によって阻害できる。
【００７８】
本発明に従って治療できるさらなる種類の疾患には、創傷治癒がある。この医学的状態、すなわち、創傷治癒の形はケロイド、瘢痕形成及び腹膜の閉塞であることがより好ましい。本発明に従って治療できる特定の群の患者は、好ましくは、視力に影響を及ぼす極度の瘢痕形成が同時に起きる緑内障手術を受けるか受けたことがある患者である。再度、いずれの論理的根拠にも拘束されようとは思わないが、過増殖性瘢痕形成はＣＴＧＦ及びＣＹＲ６１によって媒介されるようであり（Branton, M. H.及びKopp, J. B.(1999)TGF-betaand fibrosis.Microbes Infect、1巻、1349〜1365頁）、その結果、これらのモジュレータータンパク質の本発明の変異タンパク質による阻害は、瘢痕形成を避けるための、ひいては、個々の状態及び疾患をそれぞれ治療するための適した手段である。
【００７９】
本発明によって治療されるもう１つの疾患又は状態は、過剰血管新生である。より詳しくは、用語「過剰血管新生」とは、過剰血管新生によって引き起こされるか、過剰血管新生と関連しているか、又は過剰血管新生を伴う、いずれの疾患も含む。この種の疾患は腫瘍、網膜症及び動脈硬化症であることが好ましい。その程度において、本発明はまた、腫瘍、網膜症の治療のための本発明の変異タンパク質の使用に関する。腫瘍は、固形癌であることが好ましい。また、血管疾患、例えば、好ましくは、動脈硬化症は、本発明によって治療できる。再度、いずれの理論にも拘束されようとは思わないが、固形癌は、１〜３ｍｍ３という体積を超えて成長する場合には十分な血管新生が必要であるようである。十分な血液供給は、腫瘍の増殖及び進行の際の律速ステップである。本発明者らの現時点での理解によれば、ＣＹＲ６１は腫瘍の脈管形成に関与している。より詳しくは、ＣＹＲ６１及びＣＴＧＦはそれぞれ、脈管形成性進行及び線維形成性進行に関与しており、それらは進行性血管閉塞に関与していると理解される（Brigstock, D. R. (2002) Regulation of angiogenesis and endothelialcell function by connective tissue growth factor(CTGF) and cysteine-rich 61(CYR61)、Angiogenesis、5巻、153〜165頁）。したがって、前記標的分子、すなわち、ＣＹＲ６１及びＣＴＧＦと相互作用することによって、本発明の変異タンパク質はそれぞれの疾患の予防及び治療に適している。
【００８０】
それぞれ、本発明に従って治療できる、さらなる疾患及び状態としては、骨折、好ましくは、難治性骨折がある。再度、いずれの理論にも拘束されようとは思わないが、ノギン及びＣＴＧＦは、骨折の治癒に関与しているＢＭＰ調節性タンパク質であるようである。より詳しくは、ノギン及びＣＴＧＦは、骨形成を阻害し、終結させる（Yoshimura, Y.ら、(2001)、Colocalization of noggin and bone morphogenetic protein-4duringfracture healing、J Bone Miner Res、16巻、876〜884頁）。したがって、例えば、前記標的の相互作用パートナーとの競合阻害によって、本発明の変異タンパク質はこの状態の治療に影響を及ぼす。
【００８１】
骨粗しょう症は、本発明に従って治療できるもう１つの疾患である。再度、いずれの理論にも拘束されようとは思わないが、この疾患に関連して、標的はスクレロスチンであるように思われる。スクレロスチンは、生物における骨形成プロセスを阻害する。スクレロスチン遺伝子（ＳＯＳＴ）の不活性化を受けている人は、骨密度の持続的増加を示し、これは標準値の３倍にも達する場合がある。その程度において、スクレロスチンを阻害する化合物はいずれも、骨密度の低下に付随している状態、例えば、骨粗しょう症などの治療のための手段として適している（Balemans, W.及び Van Hul, W.(2002)、Extracellular regulation of BMP signaling invertebrates: a cocktailof modulators, Dev Biol、250巻、231〜250頁）。その程度において、本発明の変異タンパク質がスクレロスチンと相互作用し、ひいては、この化合物を阻害するという事実を踏まえると、それらはこの種の疾患及び状態、より好ましくは、骨粗しょう症の治療にそれぞれ適している。
【００８２】
本発明を図及び実施例によってさらに説明するが、そこからはさらなる特徴、実施形態及び利点が得られる。
【００８３】
実施例１：材料及び方法
（タンパク質の調製）
ＢＭＰ−２変異タンパク質及びＢＭＰ受容体エクトドメインタンパク質の調製を、先に記載された通りに実施した（Ｋｉｒｓｃｈら、２０００ｂ；Ｒｕｐｐｅｒｔら、１９９６）。ＢＭＰ−２又はＢＲＩＡＥＣの変異体は、組換えＰＣＲによって得た（Ｋｉｒｓｃｈら、２０００ａ）。結晶化に用いたＢＭＰ−２野生型及び変異タンパク質タンパク質は、ＥＭＤ ＳＯ３−カラム（Ｍｅｒｃｋ）を用いる陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、プールした画分を水に対して透析し、凍結乾燥した。ＥＳＩ ＦＴ−ＣＲ質量分析及び分析用逆相ＨＰＬＣによってタンパク質の均質性を調べた。リフォールディングしたＢＭＰ−２変異タンパク質の結合活性を、ＢＩＡコア方法を用いるＢＭＰＩ型及びＩＩ型受容体の結合親和性の測定によって評価した。構造解析のためのＢＭＰ−２ＢＲＩＡＥＣ複合体の調製は公開されている通りに実施した（Ｋｉｒｓｃｈら、２０００ｂ）。
【００８４】
（タンパク質の結晶化）
結晶化のために、ＢＭＰ−２ Ｄ５３Ｐ及びＢＭＰ−２ Ｌ５１Ｐを、それぞれ５ｍｇ／ｍｌ及び８ｍｇ／ｍｌの濃度で水に溶解した。ＢＭＰ−２ Ｌ５１Ｐは、室温で、１５％ｔ−ブタノール、０．１Ｍ硫酸リチウム及び０．１Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ５．０から水滴蒸気拡散法によって結晶化した。ＢＭＰ−２−ＢＲＩＡＥＣの複合体の結晶化は、基本的には公開された様に実施した（Ｋｉｒｓｃｈら、２０００ｂ）が、１００Ｋで測定するための結晶は、グルコースを抗凍結剤として用いる共結晶化によって得た。データ収集のための高品質結晶は、１１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度において、１０℃で、０．７５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１ＭイミダゾールｐＨ７．０及び３０％グルコースから成長させた。
【００８５】
（Ｘ線データ収集）
ＢＭＰ−２−ＢＲＩＡＥＣという複合体のデータは、Ｓｗｉｓｓ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ（Ｐａｕｌ Ｓｃｈｅｒｒｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、スイス）のビームラインＸ０６ＳＡ ＰＸを用いて、１００Ｋでの単結晶から得た。結晶を９０°回転させて（フレームあたり１°）２つのデータセットを測定し、１°に対して１０秒曝露した高分解能セットからは１．９Åという最高分解能を得て、１°あたり１秒の曝露時間で記録することによって低分解能データを得た。データはソフトウェアＭＯＳＦＬＭバージョン６．２．１を用いて加工し、完全なものにし（Ｌｅｓｌｉｅ、１９９２）、２つのデータセットをマージし（オーバーラップ：低分解能については２０〜５．０Å、高分解能については２０〜１．９Å）、ソフトウェアＳＣＡＬＡ ＣＣＰ４バージョン４．２．１（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ、１９９４；Ｅｖａｎｓ、１９９３）を用いてスケーリングし、加工統計データの要約を表Ａ付録に示す。ＢＭＰ−２変異タンパク質Ｌ５１Ｐの回析データは、Ｒｉｇａｋｕ ＲＵ−３００（５０ ｋＶ、１００ｍＡ、０．３ｍｍフィラメント）、Ｏｓｍｉｃ ＣｏｎｆｏｃａｌＢｌｕｅ ｏｐｔｉｃｓ及びＲｉｇａｋｕ Ｒ−ＡＸＩＳ ＩＶ＋＋イメージプレートシステムからなるｈｏｍｅ−ｓｏｕｒｃｅで室温で得た。曝露時間は、０．５°回転あたり５分に設定し、結晶は２．５Åまで回析した。放射線損傷を最小化ために獲得戦略をソフトウェアＣｒｙｓｔａｌＣｌｅａｒ（Ｒｉｇａｋｕ）を用いて決定したが、相応な完全性を実現するために、２種の結晶からデータを集め、ソフトウェアＭＯＳＦＬＭ及びＳＣＡＬＡを用いてマージし、スケーリングした（Ｅｖａｎｓ、１９９３；Ｌｅｓｌｉｅ、１９９２）。
【００８６】
（構造決定）
ＢＭＰ−２−ＢＲＩＡＥＣという複合体の構造を、低分解能構造（ＰＤＢエントリー１ＥＳ７）を出発モデルとして用いてリファインメントした。ＢＭＰ−２−ＢＲＩＡＥＣ複合体を、空間群Ｐ６５で結晶化し、これは非対称単位にＢＭＰ−２二量体と２つのＢＲＩＡＥＣ分子を保持していた。容器定数のわずかな変化のために、回転及び翻訳検索とそれに続く剛体リファインメントからなる分子置換ステップを、ソフトウェアＣＮＳ１．１を用いて実施した（Ｂｒｕｎｇｅｒら、１９９８）。リファインメントのためにプログラムＲＥＦＭＡＣ５（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖら、１９９７）を続いて用い、それに続いてソフトウェアＱＵＡＮＴＡ２０００（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）を用いて座標を手動で再建した。分解能を２０〜１．９Åという最終分解能範囲まで徐々に高めた。データの異方性を明らかにするために、各鎖、すなわち、ＢＭＰ−２単量体及び各ＢＲＩＡＥＣ分子に対して１つのＴＬＳグループを定義した（Ｗｉｎｎら、２００１）。リファインメントの進行は、５％の反射を含む試験データセットを用いる相互検証によってモニターした（Ｂｒｕｎｇｅｒ、１９９２）。複合体構造は、基本的には対称であるので、本発明者らは非結晶学的対称拘束を用いることを試みたが、続くリファインメントステップでは、ＲｆｒｅｅをＮＣＳ拘束を破らずに低下させることができなかった。したがって、ＮＣＳ拘束はリファインメントを通じて用いなかった。最終ラウンドのリファインメントでは、ｆｏｂｓ−ｆｃａｌｃ相違電子密度マップを用いて１８５の水分子を同定した。最終最小化サイクルによって、Ｒ−因子は２０．７、Ｒｆｒｅｅに対しては２２．９となった。ＢＭＰ−２ Ｌ５１Ｐの構造分析はＢＭＰ−２−ＢＲＩＡＥＣ複合体のプロトコールに従ったが、焼き鈍し法及びエネルギー最小化のためにＣＮＳ １．１を用いた。ＢＭＰ−２野生型（ＰＤＢエントリー３ＢＭＰ）の構造を出発モデルとして用いた。モデルの手動での再建は、σＡ加重した２ｆｏｂｓ−ｆｃａｌｃ及びｆｏｂｓ−ｆｃａｌｃ電子密度マップを基にし、最終ラウンドのリファインメントでは、１３の水及び２つのＭＰＤ分子を加えた。ＢＭＰ−２ Ｌ５１Ｐの最終構造のＲ−因子は、２１．５であり、Ｒｆｒｅｅに対しては２３．５である。
【００８７】
（相互作用分析）
タンパク質をビオチン化し、ストレプトアビジンコートしたセンサーチップＣＭ５に固定化した（Ｋｉｒｓｃｈら、２０００ａ）。ＢＲＩＡ、ＢＲＩＢ及びＡＲＩＩの細胞外ドメインを記載された通りに調製した（Ｋｉｒｓｃｈら、２０００ａ）。ノギン／Ｆｃ、コーディン及びグレムリンをＲ＆Ｄシステム（Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ−Ｎｏｒｄｅｎｓｔａｄｔ）から得た。分析物との相互作用をＢＩＡコア２０００システムで測定した（Ｋｉｒｓｃｈら、２０００ａ）。センサーグラム（Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ ２．０）の評価から複合体形成（ｋｏｎ）及び解離（ｋｏｆｆ）の速度定数が得られた。６〜１２回の測定から平均値を得、平均標準偏差はｋｏｆｆについては３５％及びｋｏｎについては１２％であった。見掛けの解離定数ＫＤはＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出するか、平衡結合の線量依存性を評価することによるかのいずれかとした。特別の条件を適用して、ＢＭＰ−２結合後に遊離ノギンを再生しなくてはならなかった。残存する複合体は、１Ｍ塩化ナトリウム及び６Ｍ尿素の存在下で酸性ｐＨ３でのみ解離することができた。幸にも、タンパク質は、センサーに固定されたタンパク質Ａにノギン−Ｆｃ融合タンパク質を固定するのに使用する独立した単一サイクルの実験によって確立される厳しい処理の後にも天然の結合特性を保持していた。
【００８８】
（細胞株における生物活性）
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性は、血清を欠乏させたＡＴＤＣ５（Ｒｉｋｅｎ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ、細胞番号ＲＣＢ０５６５）及びＣ２Ｃ１２（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１７７２）細胞で測定した（Ｋｉｒｓｃｈら、２０００ａ）。
【００８９】
実施例２：ＢＭＰ−２−ＢＲＩＡＥＣ複合体における水素結合パターン
ＢＭＰ−２−ＢＲＩＡＥＣ複合体の高分解能構造は、非対称単位に２つのＢＲＩＡエクトドメインと結合している１つの完全なＢＭＰ−２二量体を含んでいる（図１Ａ）。厳しい非結晶学的対称性を適用することに失敗したということは、リガンド−受容体複合体の対称性は完全ではないということを示すものである。しかし、２つのセグメント（ＢＭＰ−２二量体と１つのＢＲＩＡＥＣ分子）間の相違は小さく、すべての原子についてｒ．ｍ．ｓ．偏差は０．９Åであり、すべてのＣα−原子については０．４Åである。詳細な分析により、２つのＢＭＰ−２／ＢＲＩＡＥＣ接触面の構造は同一であることが示される。非結晶学的対称性に関連する分子間のすべての相違は、結晶格子における充填環境の相違によるものである。これらのセグメントにおいて高温因子は、すべての相違は骨格柔軟性によるものであり得るということを示唆する。したがって、対称性に関連しているタンパク質セグメントにおける構造変動は、個々の分子間の実際の相違には反映されないだけでなく、あり得る高次構造並びにＢＭＰ−２及びＢＲＩＡポリペプチド鎖間の動力学を反映しない。
【００９０】
ＢＭＰ−２／ＢＲＩＡ接触面は成長因子／受容体接触面の新規パラダイムを表す。ＢＭＰ−２の結合エピトープは、高度に疎水性であり、２３１０Å２という全部の埋もれた表面のほぼ６０％が疎水性残基で作られている（図１ｂ）。ヒト成長ホルモン（ｄｅ Ｖｏｓら、１９９２）、インターロイキン−４（Ｈａｇｅら、１９９９）、エリスロポエチン（Ｓｙｅｄら、１９９８）又はインターロイキン−６（Ｂｏｕｌａｎｇｅｒら、２００３）のようなその他の成長因子の結合エピトープと比較すると、このレベルの疎水性はかなり高い。アクチビン受容体ＩＩエクトドメインに結合しているＢＭＰ−７の複合体構造（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、２００３）、ＴＧＦ−β受容体ＩＩとの複合体中のＴＧＦ−β３（Ｈａｒｔら、２００２）及びアクチビン受容体ＩＩＢと結合しているアクチビンＡ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、２００３）に示されるように、極端に疎水性接触面は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーに特徴的であるようである。対照的に、ＢＲＩＡＥＣの結合エピトープは、結合接触面に広がる極性及び電荷を有する残基の広がりのためにあまり疎水性ではない（３０％）（図１Ｂ）。
【００９１】
ＢＭＰ−２−ＢＲＩＡＥＣ複合体のリファインメントされた構造の１．９Åというより高い分解能によって、低分解能でこれまでの構造に可能であったようなより詳細な分析が可能となる。各ＢＭＰ−２／受容体接触面において、プログラムＨＢＰＬＵＳ（ＭｃＤｏｎａｌｄ及びＴｈｏｒｎｔｏｎ、１９９４）によって１０の分子間水素結合（Ｈ−結合）が同定される（表１）。ＢＭＰ−２は５個の、その受容体は４個の主鎖原子を水素結合に提供している。Ｈ−結合に携わっている原子を、表１に表されるように２つの構造エレメントにまとめる：リガンドＢＭＰ−２では、残基Ｐｈｅ４９〜Ａｓｎ５９からなるプレヘリックスループ、受容体ＢＲＩＡでは、短いα−ヘリックス及びフランキング配列（Ａｓｐ８４〜Ａｒｇ９７）。２つの水素結合、ＢＭＰ−２ Ａｓｐ５３（Ｎ）−ＢＲＩＡＥＣＣｙｓ７７（Ｏ）及びＢＭＰ−２ Ｓｅｒ６９（Ｏ）−ＢＲＩＡＥＣ Ｇｌｎ９４（Ｎ）が、主鎖原子の間でのみ形成され、２つの水素結合は、側鎖間でのみ生じ、４つの混合水素結合は側鎖と主鎖原子とを含む（表１）。１０の水素結合のうち８は、正真正銘の水素結合に対して予測されるような（Ｘｕら、１９９７）ドナー−アクセプター距離（２．８±０．１４Å）、φ結合角（１３７±１１°）を有する。しかし、結合パラメータの幾何学的評価に純粋に基づいた個々の水素結合の強さの分類はこの複合体には可能ではないようである。
【００９２】
【表１】
【００９３】
カッコ内の数字は、ドナー−アクセプター原子の距離及び非結晶学的対称性で関連している二次接触面の角度を表す。
ａ）斜線をつけた行中のＨ−結合は、前記の幾何統計データから排除した。
ｂ）Ｎ−Ｏ−Ｃはドナー−アクセプター原子であり；統計データ（Ｘｕら、１９９７）から、この角度は、ＭＣ−ＭＣ水素結合については１４９°±１５°並びにＳＣ−ＭＣ及びＳＣ−ＳＣ Ｈ−結合については１２９°±１８°である。
ｃ）ＭＣ（主鎖）及びＳＣ（側鎖）ドナー／アクセプター原子
ｄ）ＢＭＰ−２（イタリック体）及びＢＲＩＡ（太字）における分析したＨ結合を乱す置換。
【００９４】
接触面構造から機能的に重要なＨ−結合を予測できるかどうかを調査するために、残基部分の接近可能性を算出した（図１Ｃ）。複合体におけるこの残基の接近可能性は、コアに向かった、又は接触面の表面に向かった残基の位置と関連がある（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ及びＪａｎｉｎ、２００２）。１０個の界面のＨ−結合のうち８個は、表面に位置する残基の間に生じる。受容体Ｇｌｎ８６とＢＭＰ−２主鎖のＬｅｕ５１アミド及びカルボニルをつなぐ２個のＨ−結合だけが、複合体形成の際に完全に埋もれる（図１Ｃ）。したがって、この相互作用は、結合のホットスポットを表す可能性があるが（Ｂｏｇａｎ及びＴｈｏｒｎ、１９９８）、その他のＨ−結合及び疎水性相互作用は、結合親和性には寄与していないか、ほんのわずかしか寄与していない可能性がある。
【００９５】
接触面における水分子の調査によって、結合エピトープの脱溶媒和がその他のタンパク質−タンパク質接触面と比較してかなり効果的であるということが明らかになっている。複合体形成の際、各リガンド−受容体接触面には４個の水分子しか完全に埋もれない。これらの埋もれた水分子の低温因子（すなわち、これらの埋もれた水分子の値は、４０〜５０Å２の範囲であり、近接するタンパク質原子が３２Å２というＢ因子を有する）は、外部の水との交換が遅いものであり得ることを示唆する。驚くべきことに、これらの水分子は、ホットスポットＢＲＩＡＥＣ Ｇｌｎ８６に近接している。３個の水分子は、側鎖アミド窒素原子に近いＢＲＩＡＥＣ Ｇｌｎ８６の「膜遠位側」に位置している。これらの水素結合している水分子は、ＢＲＩＡＥＣ Ｌｙｓ９７との接触面の大きな割れ目を埋めており、この窪みへの入口を塞いでいる。単一で単離された水分子が、ＢＲＩＡＥＣ Ｇｌｎ８６の側鎖カルボニル酸素原子の隣の窪んだ空間に位置している。この窪みはＢＭＰ−２の残基Ｐｈｅ４９及びＰｒｏ５０によって外側から塞がれている。ＢＭＰ−２結合の際の受容体Ｇｌｎ８６の不完全な脱溶媒和は、疎水性環境における強力な水素結合の形成を支持している可能性がある。
【００９６】
実施例３：水素結合の突然変異解析
ＢＭＰ−２及び２種のアミノ酸置換を含むＢＲＩＡＥＣ変異タンパク質を用いる相互作用分析によって、結合親和性にとっての水素結合の重要性を解析した。第１に、アラニン置換を導入して、側鎖結合を乱した（実施例２の表１参照）。ＢＭＰ−２ Ｗ２８Ａ変異タンパク質は単離できなかったので、Ｔｒｐ２８を、その側鎖も水素結合能を欠いているフェニルアラニンで置換した。（１個の電荷を有する残基の置換をＢＭＰ−２ Ｓ６９Ｒ変異タンパク質で行った）。第２に、プロリン置換を導入して、主鎖アミド基による水素結合を消滅させた。
【００９７】
表２に表されるように、固定化した受容体ＢＲＩＡＥＣを用いるＢＭＰ−２変異タンパク質の相互作用解析によって、置換Ｗ２８Ｆ、Ｄ５３Ａ及びＹ１０３Ａは結合親和性に対して小さな作用しか有していないことが示された。Ｓ６９Ｒ変異タンパク質に電荷を有する残基を挿入した後に結合親和性のわずかに大きな低下（１７倍）が観察された。際立ったことに、Ｌ５１Ｐ及びＤ５３Ｐ置換は著しく低い親和性をもたらす。ＢＲＩＡＥＣとＬ５１Ｐの間の見掛けの解離定数ＫＤは、ＢＭＰ−２のものより７１００倍よりも高く、Ｄ５３Ｐについては５３倍高かった（表２及び図７）。両変異タンパク質とも、ＢＲＩＢ受容体に対する親和性の同様の低下を有し、このことはＢＭＰ−２の同様の決定基が２つのＩ型受容体の結合に用いられていることを示す。このことは、２つのプロリン変異タンパク質において乱された主鎖水素結合は主要な結合決定基であるが、Ｗ２８、Ｄ５３、Ｓ６９及びＹ１０３という側鎖結合はＢＲＩＡ受容体との結合にはあまり重要なものでないということを示している。
【００９８】
ＩＩ型受容体ＡＲＩＩに対するプロリン変異タンパク質の親和性は、野生型と比較して変わらない（表２）。ＩＩ型受容体アクチビン受容体ＩＩＢとＢＭＰ受容体ＩＩとの相互作用についても同じことが観察されている（データは示していない）。このことにより、置換されたプロリンによる局所構造の変化は、ＩＩ型受容体結合の並列するエピトープ（ナックルエピトープ）には伝わっていないので、変異タンパク質の全体構造は変わっていないということが確認される。
【００９９】
【表２】
【０１００】
ＢＲＩＡ受容体の結合決定基を同定するために、３種のエクトドメイン変異タンパク質を調製した。受容体Ｑ９４Ｐ変異タンパク質では、野生型ではＢＭＰ−２ Ｓｅｒ６９骨格カルボニルに水素結合を供与する骨格窒素アミドが乱されている。受容体Ｑ８６Ａ変異タンパク質は、野生型ではＢＭＰ−２ Ｌ５１骨格アミド及びカルボニルとＨ結合を形成する側鎖カルボキシアミド基を欠いている（図２）。Ｓ９０Ａ置換によって水素結合をＢＭＰ２ Ｖａｌ２６骨格カルボニルに供与するセリンヒドロキシル基が消滅する。すべての受容体変異タンパク質は野生型エクトドメインと同様に大腸菌で発現された後に高度に精製され得る。バイオセンサーに固定化した場合、受容体Ｑ９４Ｐ変異タンパク質は、野生型エクトドメインと比較して親和性が３倍しか低下しないでＢＭＰ−２と結合したが（表２）、このことは、変異タンパク質中で失われた主鎖／主鎖結合は結合にはわずかにしか寄与していないということを示す。Ｓ９０Ａ変異タンパク質において親和性の同様の小さな変化が観察されている。
【０１０１】
しかし、受容体Ｑ８６Ａ置換は、ＢＭＰ−２相互作用の際に８６倍増加したＫＤをもたらした。しかし、ＢＭＰ−２ Ｌ５１Ｐ変異タンパク質は、影響を受けるＨ−結合が主要な結合決定基に相当するということをすでに実証していたので（前記参照）、親和性のこのような大きな低下は予測されたものであった。最も重要なことは、関与しているドナー及びアクセプター群の残基部分の接近可能性を分析することによって推測されるホットスポットと突然変異解析によって同定されたホットスポットとが一致することである（図１Ｃ）。受容体Ｑ８６Ａ変異タンパク質における親和性の喪失は、ＢＭＰ−２ Ｌ５１Ｐ変異タンパク質におけるものよりは深刻なものではない（表２）。受容体中の隣接側鎖、例えば、Ｌｙｓ７９又はＧｌｕ８１又はＡｓｐ８９が、失われたＧｌｎ８６のカルボキサミド基を部分的に補っている可能性がある（図１ｂ）。他方、ＢＭＰ−２ Ｌ５１Ｐに導入されたプロリンは、立体障害を引き起こすか、例えば、ＢＭＰ−２ Ａｓｐ５３骨格アミドと受容体Ｃｙｓ７７カルボニルの間の局所的な構造転位によって隣接する結合を阻害し、それによって置換の作用をさらに悪化させる（図２）。
【０１０２】
実施例４：プロリンＢＭＰ−２変異タンパク質Ｌ５１Ｐの構造
ＢＭＰ−２ Ｌ５１Ｐの結合親和性の大きな低下を、ＢＲＩＡＥＣ Ｑ８６Ａに対して観察されたものと比較することによって、結合親和性の喪失は、単一の水素結合の喪失だけに起因するわけではない可能性があることが示唆される。さらに、結合エピトープにおける大きな構造変化がタンパク質相互作用を乱す可能性がある。したがって、ＢＭＰ−２ Ｌ５１Ｐ及びまたＤ５３Ｐ変異タンパク質を結晶化試験に付した。ＢＭＰ−２ Ｌ５１Ｐは野生型ＢＭＰ−２と同一条件下で結晶化でき、同一の結晶パラメータ、例えば、野生型ＢＭＰ−２の結晶について観察されたものと同一の空間群、Ｒ３２、及びほぼ同一の容器定数を有していた。明らかに、プロリン残基はＬｅｕ５１の代わりに受け入れられ、その疎水性側鎖がＢＭＰ−２のタンパク質コア中に向かっている。変異タンパク質Ｄ５３Ｐは、そのような条件下では結晶化せず、Ｄ５３Ｐの結晶は、エタノール又は２−メチル−２，４−ペンタジオールのいずれかから成長し、極めて低い分解能までしか回析せず、さらには分析しなかった。
【０１０３】
ＢＭＰ−２ Ｌ５１Ｐの回析データは室温で２．７Åという分解能まで得た。突然変異部位は別として、ＢＭＰ−２野生型とＬ５１Ｐの構造は基本的に同一であり、表３に表される構造決定法の誤差限度内にあり、すべてのＣα原子位置のｒ．ｍ．ｓ．偏差は０．６Åである。残基Ｐｒｏ４８〜Ｈｉｓ５４を含み、位置５１の突然変異部位も保持するプレヘリックスループに明確な変化が観察される。残基Ｐｒｏ４８、Ｐｈｅ４９、Ｐｒｏ５０、Ｌｅｕ／Ｐｒｏ５１、Ａｌａ５２及びＨｉｓ５４について、野生型と変異タンパク質のＣα位置間の距離は１Åを越え、最大の相違はＡｌａ５２のＣαについての１．８Åである（表３）。両構造、ＢＭＰ−２野生型とＬ５１Ｐの全体的な位置の誤差は、σＡプロットから算出されるように約０．４であるので、プレヘリックスループの高次構造の変化は小さいが有意なものと考えられる。
【０１０４】
【表３】
【０１０５】
この変化は野生型のロイシンのものと比較したプロリン残基の骨格の形状の変化によるものであり得る。しかし、結合していない高次構造及び結合している高次構造におけるＢＭＰ−２の構造を比較すると、Ｃα位置間の相違はＢＭＰ−２野生型と変異タンパク質Ｌ５１Ｐ間で観察されるものと同じ大きさであり、このことは、プレヘリックスループの高次構造は前もって形成されているものでも、固定されているものでもなく、複合体形成の際に受容体表面に適応するということを示す。
【０１０６】
Ｐｒｏ５１の側鎖は野生型ＢＭＰ−２中のＬｅｕ５１と同様の方向を向いており、このことは疎水性コアのパッキングは突然変異によって影響を受けないということを示す。さらに、Ｌｅｕ５１からプロリンへの交換は、残基５１の骨格カルボニルの方向を変えず、それゆえに、ＢＲＩＡ Ｇｌｎ８６と残基５１との１個の水素結合が依然として複合体に形成され得る（図２、３Ａ）。突然変異によって、結合していないタンパク質に導入された、かなり小さい構造の相違を考慮すると、結合親和性の大きな変化は不可解なものに思われる。
【０１０７】
Ｌ５１ＰとＢＭＰ−２−ＢＲＩＡＥＣという複合体の構造の重ね合わせにより、プロリン残基の環が、ＢＭＰ−２ Ｌｅｕ５１アミドとＢＲＩＡＥＣ Ｇｌｎ８６の側鎖カルボニルの間の水素結合に用いられていた容積を元は占めていることが示される（図３Ａ）。プロリン環の大きな空間要求が、ＢＭＰ−２Ｐｒｏ５１の側鎖とＢＲＩＡＥＣ Ｇｌｎ８６の間に立体障害を引き起こす（図３Ａ）。Ｐｒｏ５１を受け入れるには、その側鎖はさらに押し戻される必要がある。基本的に環の方向にアミド窒素を固定する堅い環構造であるために、もし環構造が押し戻されると、これは、Ｐｒｏ５０の骨格カルボニルがＢＲＩＡＥＣ Ｇｌｎ８６の側鎖の方向に移動するφ骨格ねじれ角の回りの回転に相当する。結果として、１つの立体障害を除去することによって、別の１つが引き起こされることとなり、これによって、おそらくは、突然変異Ｌ５１Ｐによる結合エネルギーの大きな喪失が説明される。
【０１０８】
実施例５：プロリン変異タンパク質及び生物活性
ＢＭＰ−２プロリン変異タンパク質の生物活性は、Ｃ２Ｃ１２細胞及びわずかにより感受性の高いＡＴＤＣ５細胞株を用いて、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性の用量依存的誘導によって決定した。最大応答の５０％（ＥＤ５０）をもたらす野生型ＢＭＰ−２の用量は、Ｃ２Ｃ１２細胞では２５ｎＭであった。ＡＴＤＣ５細胞を用いた場合、ＥＤ５０は８ｎＭであり、このことはこれらの細胞の高い反応性を示す。対照的に、ＢＭＰ−２ Ｌ５１Ｐには、Ｃ２Ｃ１２（＞１６００ｎＭ）又はＡＴＤＣ５細胞（＞１５００ｎＭ）で測定可能な生物活性はない。ＢＭＰ−２ Ｄ５３Ｐ変異タンパク質は、Ｃ２Ｃ１２及びＡＴＤＣ５細胞に対して、３３０ｎＭ及び１４０ｎＭというＥＤ５０値をそれぞれ示す。これらの値は、野生型ＢＭＰ−２のＥＤ５０値と比較して約１３〜１７倍高い。したがって、２種のＢＭＰ−２プロリン変異タンパク質におけるＢＲＩＡ受容体親和性の異なる低下は生物活性の喪失と平行している（図４）。
【０１０９】
ＢＭＰ−２ Ｌｅｕ５１のプロリン置換は、Ｉ型受容体との相互作用にのみ影響を及ぼしており、他方でＩＩ型受容体の親和性は変わっていないので、Ｌ５１Ｐ変異タンパク質は、主としてドミナントネガティブ阻害剤として機能している可能性がある。しかし、これは、２５０ｎＭまでの濃度の変異タンパク質を、２０ｎＭ ＢＭＰ−２で刺激した細胞に適用した場合には観察されなかった（データは示していない）。相対的に、ＡＴＤＣ５細胞における定常ＡＬＰ活性は、アンタゴニストＢＭＰ−２ Ａ３４Ｄ変異タンパク質によって阻害される（Ｋｉｒｓｃｈら、２０００ａ）が、Ｌ５１Ｐによっては阻害されない（図４Ａ）。
【０１１０】
実施例６：結合タンパク質のアンタゴニストとしてのプロリン変異タンパク質
ＢＭＰ−２ Ｌ５１ＰがＢＲＩＡＥＣと結合しないことは、その他の結合タンパク質との相互作用もプロリン置換によって影響を受け得るかどうかという疑問を提起した。特に注目されるものは、ＢＭＰと高親和性で結合し、ＢＭＰ−７との複合体中のその構造が最近決定された（Ｇｒｏｐｐｅら、２００２）ノギンである。もう１つの重要な結合タンパク質はコーディンであり、これはＢＭＰ−２と２つのシステインリッチドメインによって相互作用する。さらにもう１つの種類の結合タンパク質は、いわゆるＤＮＡドメインによってＢＭＰ−２と相互作用するグレムリンに相当する。３種のタンパク質の各々を、バイオセンサーの表面に固定し、表４に表されるようにＢＭＰ−２変異タンパク質相互作用について分析した。
【０１１１】
【表４】
【０１１２】
ノギンとの複合体についての２種のＢＭＰ−２プロリン変異タンパク質の解離定数ＫＤはＢＭＰ−２野生型のものと同様であり、０．５〜２．５ｎＭの範囲であった。したがって、ノギンのＮ末端アミノ酸がＢＭＰ−２ Ｌｅｕ５１（ＢＭＰ−７ Ｌｅｕ７５）及びＡｓｐ５３（ＢＭＰ−７ Ｓｅｒ７７、プレヘリックスループ）に対応するＢＭＰ−７領域と接触していることが示され、ノギンはＢＭＰ−２とのＢＲＩＡ結合を妨げるという事実があるにもかかわらず、ＢＭＰ−２ Ｌｅｕ５１及びＡｓｐ５３はノギンに対する主要な結合決定基ではない。
【０１１３】
コーディンドメインＣＲ１及びＣＲ３並びにグレムリンに対するＢＭＰ−２の親和性は、ノギンに対してよりも１０〜３０倍低い（表４）。ＢＭＰ−２野生型又は２種のプロリン変異タンパク質に対しても再度、同様の解離定数ＫＤが認められ、このことは、これらのタンパク質の結合がプロリン置換によって影響を受けないことを示す。したがって、両結合タンパク質に対するＢＭＰ−２エピトープはＢＲＩＡ受容体に対するものとは異なる。
【０１１４】
実施例７：プロリン変異タンパク質Ｌ５１Ｐは、Ｃ２Ｃ１２細胞においてノギン阻害を解除する
ＢＭＰ−２は飢餓前骨髄芽球性細胞株Ｃ２Ｃ１２において、アルカリホスファターゼの発現を誘導する。このＢＭＰ応答は、等モル濃度のノギン−Ｆｃ融合タンパク質によってバックグラウンドレベルまで阻害される（図５）。ノギンによるＢＭＰ−２活性の阻害は、Ｌ５１Ｐ変異タンパク質によって用量依存的に解除される。ほぼ等モル濃度の変異タンパク質Ｌ５１Ｐとノギンで、ノギンの阻害作用は、８０％よりも多くまで中和される。このことは、受容体非感受性Ｌ５１Ｐ変異タンパク質はノギンタンパク質の効率的な阻害剤に相当するということを示す。この結果は、ＢＭＰ−２ Ｌ５１Ｐ置換後のＩ型受容体結合の混乱とノギン結合の保持を示す物理的結合研究と一致する。
【０１１５】
参照文献
不要な参照を避けるために、本明細書に記載した参照文献の包括的な一覧を以下に示す。これらの参照文献のいずれの開示内容も参照により本明細書に組み込まれると理解されなくてはならない。
【０１１６】
Balemans, W. and Van Hul, W. (2002)Extracellularregulation of BMP signaling in vertebrates: a cocktail ofmodulators. Dev Biol,250, 231-250.
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【０１１７】
本明細書に開示した本発明の特徴、特許請求の範囲及び／又は図面は、個別に、及びいずれかの組合せでの双方で、種々の形の本発明を理解する材料であり得る。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨形成タンパク質の変異タンパク質、それをコードする核酸、このような骨形成変異タンパク質の製造方法、このような変異タンパク質を含む組成物、好ましくは薬剤組成物、及びこのような変異タンパク質の、医薬の製造のための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の変異タンパク質は、骨形成タンパク質の変異タンパク質である。骨形成タンパク質は、本明細書ではＢＭＰ−２様タンパク質とも呼ばれ、ＴＧＦ−βスーパーファミリーを形成する２つの主要な群の一方である。ＢＭＰ−２様タンパク質とは別に、このＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するもう一方の群のタンパク質はＴＧＦ−β−アクチン様タンパク質である。ＴＧＦ−βスーパーファミリーの２つの群は、その結合機構が異なっている。一般に、ポリペプチド成長因子と構造的に関連しているＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーは、細胞増殖、細胞株の運命決定、分化、移動性、接着及び細胞死をはじめとする細胞過程に関与している。こういった因子は、時間及び組織特異的パターンに従って発現され、真核生物ではほとんどすべての組織の発達、止血及び修復にとって重要である。これらの因子はまた、細胞の活性を規定する細胞内シグナルの重要な部分を占めている。
【０００３】
ＴＧＦ−βのシグナル伝達経路は、ごく最近解明された。ＴＧＦ−βのシグナル伝達には、細胞表面の受容体セリンキナーゼ及びその基質、すなわち、ＳＭＡＤタンパク質が関与しており、このタンパク質は、リン酸化されると核へ移動する。リン酸化されたＳＭＡＤタンパク質は、ＤＮＡ結合パートナーと共同して標的遺伝子の転写を活性化する。ＴＧＦ−β及びＴＧＦ−βスーパーファミリーのその他のメンバーの多機能活性は、種々の受容体とＳＭＡＤタンパク質とＤＮＡ結合タンパク質との相互作用に基づいていると思われる。このシグナル伝達経路の何らかの混乱が、哺乳類、特に人間におけるいくつかの疾患の理由である。ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーはいくつかの構造的特徴を共有しているが、このメンバー間の相同性はかなり限定的である場合もある。例えば、すべてのタンパク質は二量体であり、通常、ホモ二量体、すなわち、２つの同一の単量体からなるものである。また、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーは、２つの異なる種類のセリンキナーゼ受容体鎖、すなわち、Ｉ型鎖及びＩＩ型鎖からなる細胞受容体を用いる。
【０００４】
Ｉ型鎖は細胞質ＧＳボックスとセリンキナーゼとを含み、Ｉ型鎖がＢＲＩＡ、ＢＲＩＢ又はＡＲＩである場合には、ＳＭＡＤ−１及びＳＭＡＤ−５シグナルタンパク質を活性化する。ＩＩ型鎖は、ＧＳボックスセグメントのリン酸化によってＩ型受容体セリンキナーゼを活性化する。Ｉ型及びＩＩ型鎖双方の小さな受容体エクトドメインは、それぞれ約１２０〜１５０個のアミノ酸を含むが、かなり限定的な相同性しか共有していない。それにもかかわらず、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのすべての既知受容体鎖の１つの共通の特徴として、４つの保存されたジスルフィド架橋があり、さらなるジスルフィド架橋及びいくつかのアミノ酸の位置はＩ型又はＩＩ型受容体タンパク質のいずれかに特徴的であるようである。ＢＭＰ−２様タンパク質とＩ型鎖との結合は、ＢＭＰ−２様タンパク質のリスト（ｗｒｉｓｔ）エピトープを介して起こり、ＩＩ型鎖との結合は、ＢＭＰ−２様タンパク質の「ナックル（ｋｎｕｃｋｌｅ）」エピトープを介して起こる。これらの骨形成タンパク質とそれぞれの受容体鎖との結合は、細胞質膜で逐次的に起こり、特定の配列は骨形成タンパク質と個々の受容体鎖との親和性に応じて変わる。例えば、溶解ＢＭＰ−２は、その高親和性Ｉ型鎖、すなわち、ＢＭＰＲ−ＩＡ、ＢＭＰＲ−ＩＢとまず結合し、おそらくはＡｃｔＲ−Ｉとも結合し、続いて、低親和性ＩＩ型受容体鎖と会合して活性な受容体複合体を形成する。この会合は細胞質膜で起こる。
【０００５】
ＢＭＰ−２のリスト又はナックルエピトープ中のいくつかのアミノ酸置換によって、不活性なＢＭＰ−２変異タンパク質となり、これは対応する受容体をもはや活性化することができない。ＢＭＰ−２［Ａ３４Ｄ］などのナックルエピトープ中にアミノ酸置換を有する不活性な変異タンパク質は、それでも、野生型ＢＭＰ−２と同様にＩ型鎖と結合できる。しかし、Ｉ型及びＩＩ型鎖の双方を含む、活性な受容体複合体を形成するための膜におけるＩＩ型鎖の会合には支障を来たす。したがって、この種の変異タンパク質は、Ｉ型鎖に対して野生型ＢＭＰ−２と競合しているので、ＢＭＰ−２の阻害剤として作用する。
【０００６】
骨形成タンパク質及び、詳しくは、ＢＭＰ−２様タンパク質は、Ｉ型鎖及びＩＩ型鎖を含む受容体が関係しているシグナル伝達経路に関与していることとは別に、モジュレータータンパク質の群と相互作用する。これらのモジュレータータンパク質は、同様にある種のシグナル伝達経路に関与している。ＢＭＰ−２様タンパク質と相互作用するモジュレータータンパク質は、中でも、ノギンタンパク質ファミリー、ＤＡＮタンパク質ファミリー及びコーディンタンパク質ファミリーのメンバーを含んでなる。これらのモジュレータータンパク質は、当技術分野では公知であり、例えば、Avsian-Kretchmer,O.及びHsueh, A.J. (2004)「Comparative genomicanalysis of the eight-membered ring cystine knot containingbone morphogeneticprotein antagonists.」、Mol Endocrinol、18巻、1〜12頁に記載されており、これにはＢＭＰ−モジュレータータンパク質、より詳しくは、シスチンノット含有ＢＭＰモジュレータータンパク質が記載されている。例えば、ノギンを含むノギンファミリーは、Canalis, E.、Economides, A. N.及びGazzerro, E. (2003)、「Bonemorphogeneticproteins, their antagonists, and the skeleton.」Endocr Rev巻、24、218〜235頁によって記載されており、中でも、コーディン、ベントロピン、ＣＴＧＦ、ＣＹＲ６１、クロスベインレス（Ｃｒｏｓｓｖｅｉｎｌｅｓｓ）、プロコラーゲンＩＩＡを含むコーディンファミリーは、例えば、Bork, P. (1993)「The modular architecture ofa new family of growth regulators related to connective tissue growth factor.」、FEBS Lett、327巻、125〜130頁、Brigstock, D. R.、Goldschmeding, R.、Katsube,K. I.、Lam, S. C.、Lau, L. F.、Lyons, K.、Naus, C.、Perbal,B.、Riser, B.、Takigawa, M.及びYeger, H. (2003)「Proposal for a unified CCNnomenclature.」Mol Pathol、56巻、127〜128頁並びにGarciaAbreu, J.、Coffinier, C.、Larrain,J.、Oelgeschlager, M.及びDeRobertis, E. M.(2002)「Chordin-like CR domains and theregulationofevolutionarily conserved extracellular signaling systems.」、Gene、287巻、39〜47頁並びに例えば、Ｃｅｒ１、セルベルス（Ｃｅｒｂｅｒｕｓ）、Ｄａｎ、Ｄｔｅ、グレムリン（Ｇｒｅｍｌｉｎ）、ＰＲＤＣ、スクレロスチン（Ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）を含むＤＡＮファミリーは、例えば、Pearce, J.J.、Penny, G.及びRossant, J.(1999)「Amousecerberus/Dan-related gene family.」Dev Biol、209巻、98〜110頁並びにBalemans,W.及びVan Hul, W.(2002)「Extracellular regulation of BMP signaling in vertebrates: a cocktailof modulators.」Dev Biol、250巻、231〜250頁に記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の基礎をなす課題は、Ｉ型及びＩＩ型セリンキナーゼ受容体鎖媒介性作用の点で、それぞれの骨形成タンパク質の野生型と競合しないが、依然として、ノギンタンパク質ファミリー、ＤＡＮタンパク質ファミリー及びコーディンタンパク質ファミリーのものなどのモジュレータータンパク質と相互作用するのには適している、骨形成タンパク質、詳しくはＢＭＰ−２様タンパク質の変異タンパク質を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によれば、この課題は独立請求項の対象によって解決される。好ましい実施形態は従属請求項から選びとることができる。
【０００９】
本発明によれば、この課題は、第１の態様で、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当するアミノ酸位置に骨形成タンパク質の野生型と比較してアミノ酸置換を含む、骨形成タンパク質の変異タンパク質によって解決される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】（Ａ）ＢＭＰ−２及びＢＲＩＡＥＣの複合体構造のリボン図を示す図である。（Ｂ） ＢＭＰ−２及びＢＲＩＡＥＣの接触面について、受容体ＢＲＩＡがｙ軸の回りに１８０°回転している“明白な”眺望における表面表示を示す図である。（Ｃ） ＢＭＰ−２及びＢＲＩＡＥＣの接触面の表面表示を示す図である。
【図２】ＢＭＰ−２−ＢＲＩＡ相互作用の接触面中の拡大表示を示す図である。
【図３】（Ａ）ＢＭＰ−２ Ｌ５１Ｐの結晶構造を示す、プレヘリックスループセグメントの立体像を示す図である。
【図４】ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−２変異タンパク質に反応してＡＴＤＣ５（Ａ）及びＣ２Ｃ１２（Ｂ）細胞で測定されたアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性の誘導として表されるＢＭＰ−２プロリン変異タンパク質の生物活性を示す図である。
【図５】ＢＭＰ−２プロリン変異タンパク質Ｌ５１Ｐによるノギン阻害の解除を示す図である。
【図６】ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置のアミノ酸残基をロイシンから好ましくはプロリンに交換し、本発明の変異タンパク質の好ましい実施形態を形成したＢＭＰ−２様タンパク質のアラインメントを示す図である。
【図７】ＢＭＰプロリン変異タンパク質と（Ａ）ＢＲＩＡＥＣ、（Ｂ）ＢＲＩＢＥＣ又は（Ｃ）アクチビン受容体ＩＩエクトドメイン間の相互作用、並びに（Ｄ）ＢＭＰ−２とＢＲＩＡＥＣ変異タンパク質間の相互作用のセンサーグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍｓ）、を示す図であって、すべてのリガンドは、１２０ｎＭ濃度で存在しており、センサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍｓ）は、アナライトであるＢＭＰ−２の濃度を飽和するために算出されたレゾナンスユニット（ＲＵ）を１００％として設定することによって標準化した。
【図８】ＢＭＰ−２野生型とＢＭＰ−２ Ｌ５１Ｐの間の構造の相違を示す図であって、両構造のＣα−原子がスーパーインポーズされ、中間の距離が示され、プレヘリックスループの領域は灰色で強調表示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
一実施形態では、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置のアミノ酸は、骨形成タンパク質の野生型ではロイシンであり、変異タンパク質では好ましくはプロリンである。
【００１２】
一実施形態では、骨形成タンパク質は、ｈＢＭＰ−２、ｈＢＭＰ−４、ｈＢＭＰ−５、ｈＢＭＰ−６、ｈＢＭＰ−７、ｈＢＭＰ−８、ｈＧＤＦ−５、ｍＧＤＦ−６、ｍＧＤＦ−７、ｈＢＭＰ−１０及びｈＧＤＦ−２を含んでなる群から選択される。
【００１３】
一実施形態では、
骨形成タンパク質は、ｈＢＭＰ−２であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置はアミノ酸位置５１であり、
骨形成タンパク質は、ｈＢＭＰ−４であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置はアミノ酸位置５３であり、
骨形成タンパク質は、ｈＢＭＰ−５であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置はアミノ酸位置６８であり、
骨形成タンパク質は、ｈＢＭＰ−６であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置はアミノ酸位置６８であり、
骨形成タンパク質は、ｈＢＭＰ−７であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置はアミノ酸位置７５であり、
骨形成タンパク質は、ｈＢＭＰ−８であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置はアミノ酸位置７５であり、
骨形成タンパク質は、ｈＧＤＦ−５であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置がアミノ酸位置５６であり、
骨形成タンパク質は、ｍＧＤＦ−６であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置がアミノ酸位置５６であり、
骨形成タンパク質は、ｍＧＤＦ−７であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置はアミノ酸位置８２であり、
骨形成タンパク質は、ｈＢＭＰ−１０であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置はアミノ酸位置４４であり、
骨形成タンパク質は、ｈＧＤＦ−２であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置はアミノ酸位置４５である。
【００１４】
一実施形態では、野生型の
ｈＢＭＰ−２は、配列番号１のアミノ酸配列を含み、
ｈＢＭＰ−４は、配列番号３のアミノ酸配列を含み、
ｈＢＭＰ−５は、配列番号５のアミノ酸配列を含み、
ｈＢＭＰ−６は、配列番号７のアミノ酸配列を含み、
ｈＢＭＰ−７は、配列番号９のアミノ酸配列を含み、
ｈＢＭＰ−８は、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、
ｈＧＤＦ−５は、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、
ｍＧＤＦ−６は、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、
ｍＧＤＦ−７は、配列番号１７のアミノ酸配列を含み、
ｈＢＭＰ−１０は、配列番号１９のアミノ酸配列を含み、
ｈＧＤＦ−２は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
【００１５】
好ましい一実施形態では、野生型の
ｈＢＭＰ−２は、配列番号２の核酸によってコードされており、
ｈＢＭＰ−４は、配列番号４の核酸によってコードされており、
ｈＢＭＰ−５は、配列番号６の核酸によってコードされており、
ｈＢＭＰ−６は、配列番号８の核酸によってコードされており、
ｈＢＭＰ−７は、配列番号１０の核酸によってコードされており、
ｈＢＭＰ−８は、配列番号１２の核酸によってコードされており、
ｈＧＤＦ−５は、配列番号１４の核酸によってコードされており、
ｍＧＤＦ−６は、配列番号１６の核酸によってコードされており、
ｍＧＤＦ−７は、配列番号１８の核酸によってコードされており、
ｈＢＭＰ−１０は、配列番号２０の核酸によってコードされており、
ｈＧＤＦ−２は、配列番号２２の核酸によってコードされている。
【００１６】
本発明によれば、この課題は、第２の態様で、第１の骨形成タンパク質受容体と結合しておらず、かつ、ノギンタンパク質ファミリー、ＤＡＮタンパク質ファミリー、コーディンタンパク質ファミリー及びシステインノット含有ＢＭＰモジュレータータンパク質を含んでなる群から選択される少なくとも１種のモジュレータータンパク質と結合している、骨形成変異タンパク質によって解決される。
【００１７】
本発明によれば、この課題は、第３の態様で、骨形成変異タンパク質によって解決され、この骨形成変異タンパク質は、好ましくは第２の骨形成タンパク質受容体と相互作用するプレヘリックスループ構造を含む、本発明の第１及び第２の態様の実施形態であることが好ましい。第２の骨形成タンパク質受容体の用語は、この種の受容体と、本明細書で第１の骨形成タンパク質受容体と呼ばれる別の受容体を区別するために用いられると理解されなくてはならない。この技術用語は、本明細書で参照するためだけに取り入れられており、タンパク質及び変異タンパク質の結合をそれぞれ暗に示すものではない。その程度において、タンパク質及び変異タンパク質の結合は、それぞれ、単一の骨形成タンパク質受容体とのみ起こることが好ましい。このような単一の骨形成タンパク質受容体は、第１の骨形成タンパク質受容体又は第２の骨形成タンパク質受容体のいずれかであり得る。
【００１８】
第２及び第３の態様に従う一実施形態では、第１及び／又は第２の骨形成タンパク質受容体がＢＲＩＡ又はＢＲＩＢである、請求項７及び８に記載の骨形成変異タンパク質。
【００１９】
第２及び第３の態様に従う一実施形態では、相互作用はアミノ酸残基、好ましくは、ＢＲＩＡのＧｌｎ８６又はＢＲＩＢのＧｌｎ６７アミノ酸残基に関連している。
【００２０】
本発明によれば、この課題は、第４の態様で、骨形成変異タンパク質によって解決され、この骨形成変異タンパク質は、好ましい実施形態では、第１、第２及び第３の態様に従う骨形成タンパク質であり、第２の骨形成タンパク質受容体との相互作用を有するプレヘリックスループ構造を含み、骨形成変異タンパク質のプレヘリックスループ構造と第２の骨形成タンパク質受容体との相互作用が、野生型骨形成タンパク質のプレヘリックスループ構造と第２の骨形成タンパク質受容体との相互作用とは異なる。
【００２１】
いずれかの態様に従う一実施形態では、異なる相互作用又は変化は、屈折データ、好ましくは、少なくとも約２．７Åの分解能まで室温で得られているような屈折データで表される。
【００２２】
いずれかの態様に従う一実施形態では、プレヘリックスループ構造が、骨形成タンパク質の野生型と比較して変異している。
【００２３】
好ましい一実施形態では、野生型ＢＭＰ−２の位置５１のロイシンに相当するアミノ酸が変異している。
【００２４】
もう１つの好ましい実施形態では、ヒトＢＭＰ−２の位置５１のロイシンに相当するアミノ酸がプロリンに変異している。
【００２５】
いずれかの態様に従う一実施形態では、骨形成変異タンパク質は、ｈＢＭＰ−２、ｈＢＭＰ−４、ｈＢＭＰ−５、ｈＢＭＰ−６、ｈＢＭＰ−７、ｈＢＭＰ−８、ｈＧＤＦ−５、ｍＧＤＦ−６、ｍＧＤＦ−７、ｈＢＭＰ−１０及びｈＧＤＦ−２を含んでなる群から選択される骨形成タンパク質の変異タンパク質である。
【００２６】
好ましい一実施形態では、骨形成タンパク質はＢＭＰ−２又はプロ−ＢＭＰ−２である。
【００２７】
本発明によれば、この課題は、第５の態様で、配列番号２３〜３３のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む骨形成タンパク質によって解決される。
【００２８】
一実施形態では、骨形成変異タンパク質は、本発明のいずれかの態様に記載の骨形成変異タンパク質である。
【００２９】
本発明によれば、この課題は、第６の態様で、本発明のいずれかの態様に従う、骨形成タンパク質及び骨形成変異タンパク質をそれぞれコードする核酸、並びに／又はその相補鎖によって解決される。
【００３０】
本発明によれば、この課題は、第７の態様で、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０及び２２の核酸配列を含む核酸、好ましくは、本発明のいずれかの態様に従う骨形成変異タンパク質をコードする核酸、並びに／又はその相補鎖によって解決される。
【００３１】
本発明によれば、この課題は、第８の態様で、本発明のいずれかの態様に従う骨形成変異タンパク質をコードする核酸であって、より好ましくは、ストリンジェントな条件下で、遺伝暗号の縮重がなければ、第６及び第７の態様に従う核酸とハイブリダイズする核酸によって解決される。
【００３２】
本発明によれば、この課題は、第９の態様で、第６、第７及び第８の態様に従う核酸を含むベクターであって、好ましくは発現ベクターであるベクターによって解決される。
【００３３】
本発明によれば、この課題は、第１０の態様で、第６、第７及び第８の態様に従う核酸及び／又は本発明の第１０の態様に従うベクターを含む細胞、好ましくは、哺乳類細胞によって解決される。
【００３４】
本発明によれば、この課題は、第１１の態様で、本発明の第１０の態様に従う細胞を含む、宿主生物、好ましくは、哺乳類宿主生物、より好ましくは、非ヒト宿主生物によって解決される。
【００３５】
本発明によれば、この課題は、第１２の態様で、
ａ）請求項２５に記載の細胞を培養ブロスで培養するステップと、
ｂ）細胞から、及び／又は培養ブロスから骨形成変異タンパク質を調製するステップと、
を含む、本発明の第１〜第５のいずれかの態様に従う骨形成変異タンパク質の製造方法によって解決される。
【００３６】
本発明によれば、この課題は、第１３の態様で、本発明の第１〜第５のいずれかの態様に従う骨形成変異タンパク質と特異的に結合しているモノクローナル抗体によって解決される。
【００３７】
本発明によれば、この課題は、第１４の態様で、本発明の第１〜第５のいずれかの態様に従う変異タンパク質及び／又は本発明の第６〜第８のいずれかの態様に従う核酸を含む組成物によって解決される。
【００３８】
本発明によれば、この課題は、第１５の態様で、本発明の第１〜第５のいずれかの態様に従う変異タンパク質又は第６〜第８のいずれかの態様に従う核酸と、製薬上許容される担体とを含む薬剤組成物によって解決される。
【００３９】
本発明によれば、この課題は、第１６の態様で、医薬を製造するための、本発明の第１〜第５のいずれかの態様に従う骨形成変異タンパク質及び／又は第６〜第８のいずれかの態様に従う核酸の使用によって解決される。
【００４０】
一実施形態では、医薬は、線維性疾患、創傷治癒、過剰血管新生、血管疾患、骨折及び骨粗しょう症を含んでなる群から選択される疾患の治療用及び／又は予防用のものである。
【００４１】
好ましい一実施形態では、線維性疾患は、腎線維症、肝硬変、肺線維症及び慢性炎症、好ましくは、喘息を伴う慢性炎症を含んでなる群から選択される。
【００４２】
もう１つの実施形態では、創傷治癒はケロイド、瘢痕形成及び腹膜の閉塞と関連している。
【００４３】
さらなる一実施形態では、過剰血管新生は、網膜症、動脈硬化症及び／又は腫瘍と関連しているか、又は網膜症、動脈硬化症及び／又は腫瘍を伴う。
【００４４】
いっそうさらなる実施形態では、骨折は難治性骨折である。
【００４５】
もう１つの実施形態では、疾患は骨粗しょう症である。
【００４６】
本発明によれば、この課題は、第１７の態様で、形態形成タンパク質、好ましくは、本発明の第１〜第５のいずれかの態様に従う形態形成変異タンパク質の、ＢＭＰ相互作用タンパク質に対する阻害剤としての使用によって解決される。
【００４７】
一実施形態では、ＢＭＰ相互作用タンパク質は、ノギンタンパク質ファミリー、ＤＡＮタンパク質ファミリー及びコーディンタンパク質ファミリーを含んでなる群から選択される。
【００４８】
本発明者らは、驚くべきことに、本発明の変異タンパク質が、ノギンファミリー、ＤＡＮファミリー及びコーディンタンパク質ファミリーのものなどのモジュレータータンパク質の活性を阻害できる一方で、少なくとも１個のアミノ酸を置換することによって生じる骨形成タンパク質に対応する受容体、より詳しくは、ＢＭＰ−２様タンパク質受容体、とは相互作用しないことを見出した。本発明の変異タンパク質はこれらの特徴を有するため、それらはいずれかの生物に適用することができ、この場合、前記モジュレータータンパク質が調節され、好ましくは、阻害され、ひいては、前記モジュレータータンパク質によって発揮される阻害が消滅するか減少することになり、その一方で、前記受容体鎖によって媒介される、骨形成タンパク質に関連しているその他の生物活性はもはや存在しない。骨形成タンパク質の変異タンパク質のこういった設計は、この種の骨形成タンパク質の、望ましくない受容体媒介性作用を引き起こすことなく、モジュレータータンパク質が関連しているか媒介する疾患の治療又は予防に使用できる限りにおいて、明らかに有利である。その程度において、本発明の変異タンパク質は“受容体非感受性（ｒｅｃｅｐｔｏｒｄｅａｄ）”である。
【００４９】
また、本発明者らは驚くべきことに、骨形成変異タンパク質のこの特有の特徴は、野生型の骨形成タンパク質中のプレヘリックスループ構造を変更することによって作出できることを見出した。本明細書においては、そうでないことが示されない場合は、骨形成タンパク質は、ＢＭＰ−２様タンパク質であることが好ましい。プレヘリックスループ構造は、好ましくは骨形成変異タンパク質の構造であり、これは、二次構造表示でヘリックスの前のループであることが好ましい。ループは４〜１０個、好ましくは６〜８個、より好ましくは、６個のアミノ酸残基を含むことが好ましい。ヒトＢＭＰ−２タンパク質のアミノ酸配列を例にとると、プレヘリックスループ構造はアミノ酸位置４８〜アミノ酸位置５３に広がっている。本明細書では、好ましい実施形態では、プレヘリックスループは、いずれかのループであって、より好ましくはヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置４８〜５３に相当するいずれかのアミノ酸配列であり、より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列である。プレヘリックスループ構造は、好ましくは、本明細書においてＩ型骨形成タンパク質受容体と呼ばれる骨形成タンパク質受容体との相互作用を媒介していることが好ましい。Ｉ型骨形成タンパク質受容体はＢＲＩＡであることがいっそうより好ましい。ＢＲＩＡＥＣは、ＢＭＰＲ−ＩＡの細胞外ドメインであり、以下に記載されている（Kirsch, T.、Sebald, W.、Dreyer, M.K.(2000) Nat Struct Biol、7、492〜496参照）。ＢＲＩＢＥＣは、ＢＭＰＲ−ＩＢの細胞外ドメインである。ＡＲＩＥＣは、ＡｃｔＲ−Ｉの細胞外ドメインである。
【００５０】
本発明の変異タンパク質は、骨形成タンパク質の野生型と比較して、構造、好ましくは二次構造及び三次構造の変化のために、Ｉ型骨形成タンパク質受容体ともはや相互作用できない。本明細書において用いられるのに好ましい変化とは、対応する骨形成タンパク質の野生型と前記Ｉ型形成タンパク質受容体との相互作用を参照することによって検出可能なものである。より詳しくは、Ｉ型骨形成タンパク質受容体がＢＲＩＡＥＣである場合には、本発明の変異タンパク質によって最も影響を受けるアミノ酸はＧｌｎ８６であるようである。
【００５１】
また、本発明の骨形成変異タンパク質はプレヘリックスループ構造を含み、これがＢＲＩＡＥＣなどのＩ型骨形成タンパク質受容体との相互作用を媒介しており、この相互作用は骨形成タンパク質の野生型のプレヘリックスループ構造とＩ型骨形成タンパク質受容体との相互作用とは異なっている。これらの誘導された変化のいずれか又は変異タンパク質とそれぞれの第２の骨形成タンパク質受容体との間の異なる相互作用パターンは、骨形成タンパク質の野生型の対応する構造又は相互作用と比較して検出される。前記Ｉ型骨形成タンパク質受容体と変異タンパク質のいずれか又は双方のこのような変化は、屈折データを得ることによってモニターできることが好ましい。より好ましい実施形態では、このような屈折データは少なくとも約２．７Åの分解能まで室温で得られる。
【００５２】
好ましい実施形態では、骨形成タンパク質は、ＢＭＰ−２である。ＢＭＰ−２は当技術分野では公知であり、本明細書に記載される配列番号１のアミノ酸配列を含むことが好ましく、配列番号２の核酸配列を含む核酸によってコードされることが好ましい。
【００５３】
より詳しくは、本発明者らはまた、本発明の変異タンパク質の特有の特徴は、プレヘリックスループ構造でのアミノ酸置換、より詳しくは、骨形成タンパク質のアミノ酸位置、好ましくはヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当するＢＭＰ−２様タンパク質のアミノ酸位置、さらに好ましくは、配列番号１のＢＭＰ−２のアミノ酸位置でのアミノ酸置換、すなわち変異、によって付与されるということも発見した。より詳細には、変異タンパク質中で変異されているそれぞれのアミノ酸は、対応する骨形成タンパク質の野生型においてはロイシンである。より好ましくは、その交換はロイシン残基からプロリン残基である。骨形成タンパク質、特に、ＢＭＰ−２様タンパク質の高い相同性、ひいては類似の二次及び三次構造のために、特定の位置が同様に活性であり、この群の骨形成タンパク質の種々のメンバー内でそれぞれ関連があり、その結果、変化、すなわち、アミノ酸置換は、前記骨形成タンパク質のいずれにおいても有効であり、したがって、それぞれの変異タンパク質は前記で概説した特徴を示す。骨形成タンパク質はｈＢＭＰ−２、ｈＢＭＰ−４、ｈＢＭＰ−５、ｈＢＭＰ−６、ｈＢＭＰ−７、ｈＢＭＰ−８、ｈＧＤＦ−５、ｍＧＤＦ−６、ｍＧＤＦ−７、ｈＢＭＰ−１０及びｈＧＤＦ−２であることがより好ましく、これらは当技術分野ではそれ自体公知であり、これらのすべては同じようにＢＲＩＡＥＣと結合する。しかし、対応する変異タンパク質、すなわち、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当するそれらの位置にアミノ酸置換を有する変異タンパク質、にそれらを変えるそれぞれの変異によって、それらを先行技術から区別している。前記の骨形成タンパク質の野生型配列は本明細書では配列番号１（ｈＢＭＰ−２）、配列番号３（ｈＢＭＰ−４）、配列番号５（ｈＢＭＰ−５）、配列番号７（ｈＢＭＰ−６）、配列番号９（ｈＢＭＰ−７）、配列番号１１（ｈＢＭＰ−８）、配列番号１３（ｈＧＤＦ−５）、配列番号１５（ｍＧＤＦ−６）、配列番号１７（ｍＧＤＦ−７）、配列番号１９（ｈＢＭＰ−１０）及び配列番号２１（ｈＧＤＦ−２）として開示されており、本発明の前記骨形成タンパク質の変異タンパク質の対応するアミノ酸配列は、野生型と比較して前記の単一のアミノ酸位置で異なっており、前記アミノ酸配列は配列番号２３（ｈＢＭＰ−２）、配列番号２４（ｈＢＭＰ−４）、配列番号２５（ｈＢＭＰ−５）、配列番号２６（ｈＢＭＰ−６）、配列番号２７（ｈＢＭＰ−７）、配列番号２８（ｈＢＭＰ−８）、配列番号２９（ｈＧＤＦ−５）、配列番号３０（ｍＧＤＦ−６）、配列番号３１（ｍＧＤＦ−７）、配列番号３２（ｈＢＭＰ−１０）及び配列番号３３（ｈＧＤＦ−２）のものである。より詳しくは、前記のヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１は、ｈＢＭＰ−４の場合には位置５３、ｈＢＭＰ−５の場合には位置６８、ｈＢＭＰ−６の場合には位置６８、ｈＢＭＰ−７の場合には位置７５、ｈＢＭＰ−８の場合には位置７５、ｈＧＤＦ−５の場合には位置５６、ｍＧＤＦ−６の場合には位置５６、ｍＧＤＦ−７の場合には位置８２、ｈＢＭＰ−１０の場合には位置４４及びｈＧＤＦ−２の場合には位置４５に相当する。
【００５４】
本明細書において、本明細書に開示される、骨形成タンパク質及びひいては、単一のアミノ酸置換でのみ異なっていることが好ましい対応する変異タンパク質は、プレプロ型で存在する場合も、プロ型で存在する場合も、成熟タンパク質として存在する場合もある。この基本設計は、すべての骨形成タンパク質にもともと備わっているものである。例えば、ＢＭＰ−２の場合には、プレプロ型は全部で３９６個のアミノ酸を含む。プレ配列はシグナルペプチドとして働き、新生ポリペプチド鎖の小胞体への輸送に関与している。輸送された後、タンパク質はその未変性コンホメーションに折り畳まれ、その際ジスルフィド架橋が形成される。ＢＭＰ−２のプロ型は、位置２０〜位置３９６のアミノ酸すべてを含む。したがって、プロ配列はＢＭＰ−２のヒトプレプロ型の位置２０（Ｇｌｙ）〜アミノ酸位置２８２（Ａｒｇ）までのアミノ酸を含む。最後に、成熟ＢＭＰ−２はプレプロ型のアミノ酸２８３〜３９６を含む。成熟型は本明細書では配列番号１として表されている。
【００５５】
本発明の骨形成タンパク質及びその対応する変異タンパク質は、プレプロ型、プロ型、又は成熟型で存在し、いずれかのシグナルペプチドが、プレ配列として、好ましくは、骨形成タンパク質のプレ配列として作用し、いずれの骨形成タンパク質のいずれのプロ配列であれば、特定の骨形成タンパク質のプロ配列として使用できるということは本発明の範囲内であるが、成熟骨形成変異タンパク質のＮ末端に結合しているプロ配列が、ｉｎ ｖｉｖｏでそれぞれの骨形成タンパク質のＮ末端に結合するプロ配列に相当することがより好ましい。同じことがプレ配列にも当てはまる。
【００５６】
本明細書において、用語「骨形成タンパク質」及び「骨形成変異タンパク質」とはそれぞれ、その相同分子種も含むものとして好ましく使用される。本明細書において、相同分子種とは、参照タンパク質（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）として、同様の遺伝的機能及び生理学的機能を果たす別の生物由来のタンパク質である。また、より好ましい実施形態では、用語「骨形成タンパク質」及び「骨形成変異タンパク質」は、いずれかの末端切断型タンパク質及び変異タンパク質をそれぞれ含む。このような末端切断型タンパク質及び変異タンパク質は、少なくとも１個のアミノ酸残基を欠いており、Ｎ末端又はＣ末端のいずれかで少なくとも１個のアミノ酸残基を欠いていることが好ましい。したがって、本発明の骨形成変異タンパク質は、前記で概説された特徴、すなわち、「受容体非感受性」であり、かつ、少なくとも１種のモジュレータータンパク質、好ましくは、ノギンタンパク質ファミリー、ＤＡＮタンパク質ファミリー及び／又はコーディンタンパク質ファミリーのメンバーと相互作用するのに依然として適している限りは、末端切断型変異タンパク質である。
【００５７】
変異タンパク質はさらに修飾され、このような修飾はリン酸化、ペグ化及びグリコシル化を含んでなる群から選択されることが好ましいということもまた本発明の範囲内である。
【００５８】
本発明の核酸は、いずれもがＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの誘導体、例えば、ＬＮＡ若しくはＰＮＡ、として存在し得ることを理解されなくてはならない。それぞれの核酸は、一本鎖又は部分的な二本鎖若しくは完全な二本鎖のいずれかとして存在することも本発明の範囲内である。最後に、用語「核酸配列」は、例えば、配列識別子に従う配列によって、単独で又は本質的な相補的鎖であるもう一方の鎖と組み合わせて特定されるような核酸の補完物を含むことも本発明の範囲内である。
【００５９】
本明細書において、用語「核酸」とは、また、本明細書に記載される核酸のいずれの断片も含み、このような断片のいずれもが、約１９〜３０の長さの連続するヌクレオチドを含むことが好ましく、１９〜２５の長さがより好ましく、２１〜２２の長さが最も好ましい。核酸のこの種の断片は、二本鎖構造として存在することがいっそうより好ましい。
【００６０】
本発明によれば、核酸はまた、本明細書に開示される核酸の何らかのその他の形とハイブリダイズする核酸であってもよく、このようなハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件で起きることが好ましい。このようなストリンジェントな条件は、中でも、Sambrook, J.、Fritsch, E.F.及びManiatis, T. (1989) Molecular Cloning. A.Laboratory Manual、第2版、9.47〜9.55頁、Cold Spring Harbour Laboratory Pressに記載されている。
【００６１】
本明細書に記載される、骨形成タンパク質の野生型配列又はその変異タンパク質の配列のいずれかを発端として、骨形成タンパク質の野生型とその変異タンパク質とを区別できる核酸を設計することが可能であることは、当業者に認められよう。このような区別はハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを高めることによって可能となることが好ましい。
【００６２】
本明細書に開示される特定の配列だけでなく、種々の配列、より好ましくは、核酸配列も、それらが本発明の変異タンパク質をコードするのに適している限りは本発明に含まれるということも当業者に認められよう。このような配列は遺伝暗号を用いて導くことができ、事実上、遺伝暗号の冗長性によって生じるこのような配列のいずれの順列も本発明の範囲内にある。ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１にそれぞれ相当する、骨形成タンパク質及び変異タンパク質の位置が、ロイシンではなくプロリンであることが本発明の変異タンパク質の特徴となっており、この特定のアミノ酸置換については、それぞれのコドンがＣＣＵ、ＣＣＣ、ＣＣＡ又はＣＣＧであると認められよう。
【００６３】
本発明のベクターは、本明細書に開示されるいずれかの断片を含み、本明細書に開示されるいずれかの核酸を含む。ベクターは発現ベクターであることが好ましい。このような発現ベクターは、通常、プロモーター又はプロモーター様構造と、場合によっては、このようなプロモーター及びその他の制御エレメントによって制御されるような、ベクターにクローニングされている核酸の発現を制御するのに適しているさらなるエレメントを含む。発現ベクターは原核生物の発現ベクターか、真核生物の発現ベクターかそれぞれのシャトルベクターであることが好ましい。この種の発現ベクターの個々の設計は当業者には公知である。
【００６４】
本発明の細胞は、原核細胞か真核細胞のいずれかである。原核細胞としては、原則として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はＳ．カルノサス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）が本発明の骨形成変異タンパク質をコードする核酸、又はその断片若しくは誘導体の発現に用いられる。
【００６５】
本明細書において、真核細胞は、酵母細胞又は哺乳類細胞であることが好ましい。哺乳類細胞はマウス、ラット、モルモット、ブタ、サル又はヒト由来の細胞であることがより好ましい。
【００６６】
本明細書において、宿主生物は本発明のいずれかの細胞又は多細胞生物であることが好ましい。このような多細胞生物は好ましくは、哺乳類であることが好ましく、非ヒト哺乳類であることがより好ましい。好ましい非ヒト哺乳類はマウス、ラット、モルモット、ヒツジ、ウサギ及びブタを含んでなる群から選択される。
【００６７】
本発明の骨形成変異タンパク質を製造するための本発明の方法では、本発明の細胞は培養されていることが好ましい。このような培養は培養ブロスで行われることが好ましい。培養ブロスは発酵ブロス又は、培養に適し、かつ、より好ましくは培養される細胞の増殖に適しているいずれかのその他の溶液、であることが好ましい。培養ブロスは当業者には公知である。培養及び／又は細胞の増殖において、本発明の変異タンパク質は、培養ブロスから調製されることが好ましい。培養ブロスからの調製は、本明細書に記載されているように、本発明の変異タンパク質を細胞内に含ませるか又は細胞に結合させてその細胞からの調製すること、又は培養ブロスからの本発明の変異タンパク質を単離若しくは調製すること、を含む。本発明の変異タンパク質の調製又は単離方法は当業者には公知である。
【００６８】
さらなる態様では、本発明は、本発明の変異タンパク質に対するモノクローナル抗体と関連している。抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。抗体、好ましくは、本発明の骨形成変異タンパク質と特異的に結合するモノクローナル抗体、を調製することが可能であることは、当業者に認められよう。
【００６９】
用語「特異的な結合」とは、抗体が、変異タンパク質に対してと同程度に、又は以下に示すように、変異タンパク質に対して同じ結合特性で、骨形成タンパク質の野生型とは結合しておらず、対応する骨形成タンパク質の野生型と比較した変異タンパク質の結合定数が、少なくとも２倍異なっている、好ましくは少なくとも５倍、最も好ましくは少なくとも１０倍異なることを意味している。
【００７０】
さらなる態様では、本発明は、本発明の変異タンパク質又は本発明の核酸のいずれかを含む組成物に関連している。このような組成物は、タンパク質及び／又は核酸だけでなく、担体を含み得る。このような担体は固相、水相及び脂質相を含んでなる群から選択されることが好ましい。本明細書において、脂質相は核酸及び変異タンパク質とそれぞれ複合体を形成しているか、核酸及び変異タンパク質をそれぞれ包含している脂質又は脂質組成物であることが好ましい。脂質組成物は、その程度において当業者に公知のリポソームであることが好ましい。水相は水及び水性バッファー溶液及びヒアルロン酸を含んでなる群から選択されることが好ましい。固相は、リン酸三カルシウム、ポリラクチド、コラーゲン及び不溶性コラーゲン骨マトリックスであることが好ましい。
【００７１】
さらなる態様では、本発明は薬剤組成物に関連している。このような薬剤組成物は、本発明の変異タンパク質又は本発明の核酸あるいは双方と、さらに製薬上許容される担体とを含む。製薬上許容される担体は液体又は固体担体のいずれかであることが好ましい。適した液体担体としては、中でも、水、水溶液、より好ましくは、バッファー又は脂質若しくは脂質組成物がある。好ましい固体担体は、中でも、糖、セルロース及びデンプンを含む。当業者、好ましくは、製剤の技術分野の当業者であれば、さらなる製薬上許容される担体及び担体物質をそれぞれ承知しているものと認められる。好ましい実施形態では、薬剤組成物はさらなる製薬上活性な薬剤を含む。
【００７２】
さらなる態様では、本発明は、医薬の製造のための本発明の骨形成変異タンパク質及び／又は本発明の核酸の使用に関する。
【００７３】
本発明者らの驚くべき発見に基づいて、すなわち、骨形成タンパク質、より詳しくは、本発明のＢＭＰ−２様タンパク質の変異タンパク質は、骨形成タンパク質のような受容体媒介性作用を示さず、すなわち「受容体非感受性」であるが、依然として、それぞれの骨形成タンパク質の野生型が、相互作用するモジュレータータンパク質と相互作用することは当業者に認められる。その程度において、本発明の変異タンパク質及びそれをコードする核酸は、骨形成タンパク質の公知の望ましくない作用が生じるという危険に出くわすことなくそれらを必要とする患者に適用でき、このことは、その阻害活性を阻害するモジュレータータンパク質と相互作用する利益よりも上回る。例えば、ＢＭＰ−２の望ましくない活性の中には、腫瘍成長を促進することがある。このために、先行技術における、いずれかの変異タンパク質をも含む骨形成タンパク質の医学的使用は、骨再生などの局所投与に制限されてきた。しかし、骨形成タンパク質の活性であるそのような作用、詳しくは、その受容体との相互作用によって媒介されるもの、を欠いている本発明の変異タンパク質は、このクラスの製薬上活性を有する化合物の医学的な適用を全く初めて可能にするものである。
【００７４】
本発明のさらなる態様は、本発明の医薬を使用できる、本明細書に記載された疾患のいずれかを患っているか、又はそれが進行する状態にある患者の治療方法に関している。このような方法は、変異タンパク質又はそれをコードする核酸の患者への投与を含む。患者は哺乳類であることが好ましく、ヒトであることがより好ましい。
【００７５】
本発明の変異タンパク質の作用様式のために、それらは種々の疾患、すなわち、本発明の骨形成タンパク質とこれに対応する変異タンパク質との間の影響を受けない相互作用、及びいずれかのモジュレータータンパク質、を提供することによって治療又は予防できる疾患、に容易に用いることができる。モジュレータータンパク質は当技術分野では公知であり、シスチンノット含有骨形成タンパク質、より詳しくは、シスチンノット含有ＢＭＰモジュレータータンパク質、ノギンファミリー、コーディンファミリー及びＤＡＮファミリーを含んでなる群から選択されることが好ましい。シスチンノット含有ＢＭＰモジュレータータンパク質は、例えば、Avsian-Kretchmer,O.及びHsueh, A. J. (2004)Comparative genomic analysis of theeight-membered ring cystine knot-containingbone morphogenetic proteinantagonists. Mol Endocrinol、18巻、1〜12頁に記載されている。例えば、ノギンを含むノギンファミリーは、Canalis, E.、Economides, A. N.及びGazzerro,E.によって(2003) Bonemorphogeneticproteins, their antagonists, and the skeleton. Endocr Rev、24巻、218〜235頁に記載されており、中でもコーディン、ベントロプチン、ＣＴＧＦ、ＣＹＲ６１、クロスベインレス、プロコラーゲンＩＩＡを含むコーディンファミリーは、例えば、Bork, P. (1993) The modular architecture of anew family of growthregulators related to connective tissue growth factor.FEBS Lett、327巻、125〜130頁、Brigstock, D. R.、Goldschmeding,R.、Katsube, K. I.、Lam, S. C.、Lau, L. F.、Lyons, K.、Naus, C.、Perbal, B.、Riser,B.、Takigawa, M.及びYeger, H.(2003)Proposal for a unified CCN nomenclature. Mol Pathol、56巻、127〜128頁及びGarcia Abreu, J.、Coffinier, C.、Larrain, J.、Oelgeschlager, M.及びDe Robertis, E.M.(2002) Chordin-like CR domains and theregulation ofevolutionarily conserved extracellular signaling systems. Gene、287巻、39〜47頁に記載されており、例えば、Ｃｅｒ１、セルベルス、Ｄａｎ、Ｄｔｅ、グレムリン、ＰＲＤＣ、スクレロスチン（Ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）を含むＤＡＮファミリーは、例えば、Pearce, J.J.、Penny, G.及びRossant, J. (1999) A mouse cerberus/Dan-related genefamily. Dev Biol、209巻、98〜110頁及びBalemans, W.及びVan Hul, W.(2002)Extracellular regulation of BMP singaling in vertebrates: a cocktailofmodulators. Dev Biol、250巻、231〜250頁に記載されている。これらのモジュレータータンパク質は、偏っている場合、特にそれ自身が阻害されない場合に、ｉｎ ｖｉｖｏプロセスに対する阻害作用を有し、その結果、何らかの疾患又は病的状態をもたらす傾向がある細胞における経路及び事象に対して阻害又は刺激作用を有することがわかっている。したがって、いずれの理論にも拘束されようとは思わないが、本発明の変異タンパク質は、依然として前記モジュレータータンパク質と相互作用し、これによりモジュレータータンパク質によって刺激され、さもなければ阻害されるプロセスを許容するそれらの修飾作用をも阻害でき、モジュレータータンパク質単独の存在下で観察される程度と比較して、あらゆるレベルで、又は高いレベルで、又は低いレベルで実施され得る。
【００７６】
本発明の、変異タンパク質及びそれをコードする核酸によって治療できる特に好ましい疾患としては、線維性疾患がある。本発明に従って治療できる特に好ましい疾患としては、腎線維症、肝硬変、肺線維症及び慢性炎症があり、喘息を伴う慢性炎症がより好ましく、したがって、喘息の治療も本発明に含まれる。
【００７７】
再度、いずれの理論にも拘束されようとは思わないが、コーディン−ファミリーに属するＣＴＧＦは、ＢＭＰ−２と、ひいては本発明の変異タンパク質と相互作用する。ＣＴＧＦはＴＧＦ−βのプロ線維活性を媒介している。より詳しくは、ＴＧＦ−βは、細胞外マトリックスのタンパク質の産生を刺激しており、この種のタンパク質の分解を阻害する。すなわち、このプロセスは組織の治癒に不可欠なものである。しかし、炎症性疾患、より詳しくは、慢性炎症などの慢性疾患の場合には、ＴＧＦ−β活性が豊富であり、ひいては組織線維症、特に、過剰組織線維症をもたらす（Branton, M. H.及びKopp, J. B.(1999)TGF-betaand fibrosis. Microbes Infect、1巻、1349〜1365頁）。したがって、これら種々の線維性疾患は本発明の変異タンパク質の投与によって阻害できる。
【００７８】
本発明に従って治療できるさらなる種類の疾患には、創傷治癒がある。この医学的状態、すなわち、創傷治癒の形はケロイド、瘢痕形成及び腹膜の閉塞であることがより好ましい。本発明に従って治療できる特定の群の患者は、好ましくは、視力に影響を及ぼす極度の瘢痕形成が同時に起きる緑内障手術を受けるか受けたことがある患者である。再度、いずれの論理的根拠にも拘束されようとは思わないが、過増殖性瘢痕形成はＣＴＧＦ及びＣＹＲ６１によって媒介されるようであり（Branton, M. H.及びKopp, J. B.(1999)TGF-betaand fibrosis.Microbes Infect、1巻、1349〜1365頁）、その結果、これらのモジュレータータンパク質の本発明の変異タンパク質による阻害は、瘢痕形成を避けるための、ひいては、個々の状態及び疾患をそれぞれ治療するための適した手段である。
【００７９】
本発明によって治療されるもう１つの疾患又は状態は、過剰血管新生である。より詳しくは、用語「過剰血管新生」とは、過剰血管新生によって引き起こされるか、過剰血管新生と関連しているか、又は過剰血管新生を伴う、いずれの疾患も含む。この種の疾患は腫瘍、網膜症及び動脈硬化症であることが好ましい。その程度において、本発明はまた、腫瘍、網膜症の治療のための本発明の変異タンパク質の使用に関する。腫瘍は、固形癌であることが好ましい。また、血管疾患、例えば、好ましくは、動脈硬化症は、本発明によって治療できる。再度、いずれの理論にも拘束されようとは思わないが、固形癌は、１〜３ｍｍ３という体積を超えて成長する場合には十分な血管新生が必要であるようである。十分な血液供給は、腫瘍の増殖及び進行の際の律速ステップである。本発明者らの現時点での理解によれば、ＣＹＲ６１は腫瘍の脈管形成に関与している。より詳しくは、ＣＹＲ６１及びＣＴＧＦはそれぞれ、脈管形成性進行及び線維形成性進行に関与しており、それらは進行性血管閉塞に関与していると理解される（Brigstock, D. R. (2002) Regulation of angiogenesis and endothelialcell function by connective tissue growth factor(CTGF) and cysteine-rich 61(CYR61)、Angiogenesis、5巻、153〜165頁）。したがって、前記標的分子、すなわち、ＣＹＲ６１及びＣＴＧＦと相互作用することによって、本発明の変異タンパク質はそれぞれの疾患の予防及び治療に適している。
【００８０】
それぞれ、本発明に従って治療できる、さらなる疾患及び状態としては、骨折、好ましくは、難治性骨折がある。再度、いずれの理論にも拘束されようとは思わないが、ノギン及びＣＴＧＦは、骨折の治癒に関与しているＢＭＰ調節性タンパク質であるようである。より詳しくは、ノギン及びＣＴＧＦは、骨形成を阻害し、終結させる（Yoshimura, Y.ら、(2001)、Colocalization of noggin and bone morphogenetic protein-4duringfracture healing、J Bone Miner Res、16巻、876〜884頁）。したがって、例えば、前記標的の相互作用パートナーとの競合阻害によって、本発明の変異タンパク質はこの状態の治療に影響を及ぼす。
【００８１】
骨粗しょう症は、本発明に従って治療できるもう１つの疾患である。再度、いずれの理論にも拘束されようとは思わないが、この疾患に関連して、標的はスクレロスチンであるように思われる。スクレロスチンは、生物における骨形成プロセスを阻害する。スクレロスチン遺伝子（ＳＯＳＴ）の不活性化を受けている人は、骨密度の持続的増加を示し、これは標準値の３倍にも達する場合がある。その程度において、スクレロスチンを阻害する化合物はいずれも、骨密度の低下に付随している状態、例えば、骨粗しょう症などの治療のための手段として適している（Balemans, W.及び Van Hul, W.(2002)、Extracellular regulation of BMP signaling invertebrates: a cocktailof modulators, Dev Biol、250巻、231〜250頁）。その程度において、本発明の変異タンパク質がスクレロスチンと相互作用し、ひいては、この化合物を阻害するという事実を踏まえると、それらはこの種の疾患及び状態、より好ましくは、骨粗しょう症の治療にそれぞれ適している。
【００８２】
本発明を図及び実施例によってさらに説明するが、そこからはさらなる特徴、実施形態及び利点が得られる。
【００８３】
実施例１：材料及び方法
（タンパク質の調製）
ＢＭＰ−２変異タンパク質及びＢＭＰ受容体エクトドメインタンパク質の調製を、先に記載された通りに実施した（Ｋｉｒｓｃｈら、２０００ｂ；Ｒｕｐｐｅｒｔら、１９９６）。ＢＭＰ−２又はＢＲＩＡＥＣの変異体は、組換えＰＣＲによって得た（Ｋｉｒｓｃｈら、２０００ａ）。結晶化に用いたＢＭＰ−２野生型及び変異タンパク質タンパク質は、ＥＭＤ ＳＯ３−カラム（Ｍｅｒｃｋ）を用いる陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、プールした画分を水に対して透析し、凍結乾燥した。ＥＳＩ ＦＴ−ＣＲ質量分析及び分析用逆相ＨＰＬＣによってタンパク質の均質性を調べた。リフォールディングしたＢＭＰ−２変異タンパク質の結合活性を、ＢＩＡコア方法を用いるＢＭＰＩ型及びＩＩ型受容体の結合親和性の測定によって評価した。構造解析のためのＢＭＰ−２ＢＲＩＡＥＣ複合体の調製は公開されている通りに実施した（Ｋｉｒｓｃｈら、２０００ｂ）。
【００８４】
（タンパク質の結晶化）
結晶化のために、ＢＭＰ−２ Ｄ５３Ｐ及びＢＭＰ−２ Ｌ５１Ｐを、それぞれ５ｍｇ／ｍｌ及び８ｍｇ／ｍｌの濃度で水に溶解した。ＢＭＰ−２ Ｌ５１Ｐは、室温で、１５％ｔ−ブタノール、０．１Ｍ硫酸リチウム及び０．１Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ５．０から水滴蒸気拡散法によって結晶化した。ＢＭＰ−２−ＢＲＩＡＥＣの複合体の結晶化は、基本的には公開された様に実施した（Ｋｉｒｓｃｈら、２０００ｂ）が、１００Ｋで測定するための結晶は、グルコースを抗凍結剤として用いる共結晶化によって得た。データ収集のための高品質結晶は、１１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度において、１０℃で、０．７５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１ＭイミダゾールｐＨ７．０及び３０％グルコースから成長させた。
【００８５】
（Ｘ線データ収集）
ＢＭＰ−２−ＢＲＩＡＥＣという複合体のデータは、Ｓｗｉｓｓ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ（Ｐａｕｌ Ｓｃｈｅｒｒｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、スイス）のビームラインＸ０６ＳＡ ＰＸを用いて、１００Ｋでの単結晶から得た。結晶を９０°回転させて（フレームあたり１°）２つのデータセットを測定し、１°に対して１０秒曝露した高分解能セットからは１．９Åという最高分解能を得て、１°あたり１秒の曝露時間で記録することによって低分解能データを得た。データはソフトウェアＭＯＳＦＬＭバージョン６．２．１を用いて加工し、完全なものにし（Ｌｅｓｌｉｅ、１９９２）、２つのデータセットをマージし（オーバーラップ：低分解能については２０〜５．０Å、高分解能については２０〜１．９Å）、ソフトウェアＳＣＡＬＡ ＣＣＰ４バージョン４．２．１（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ、１９９４；Ｅｖａｎｓ、１９９３）を用いてスケーリングし、加工統計データの要約を表Ａ付録に示す。ＢＭＰ−２変異タンパク質Ｌ５１Ｐの回析データは、Ｒｉｇａｋｕ ＲＵ−３００（５０ ｋＶ、１００ｍＡ、０．３ｍｍフィラメント）、Ｏｓｍｉｃ ＣｏｎｆｏｃａｌＢｌｕｅ ｏｐｔｉｃｓ及びＲｉｇａｋｕ Ｒ−ＡＸＩＳ ＩＶ＋＋イメージプレートシステムからなるｈｏｍｅ−ｓｏｕｒｃｅで室温で得た。曝露時間は、０．５°回転あたり５分に設定し、結晶は２．５Åまで回析した。放射線損傷を最小化ために獲得戦略をソフトウェアＣｒｙｓｔａｌＣｌｅａｒ（Ｒｉｇａｋｕ）を用いて決定したが、相応な完全性を実現するために、２種の結晶からデータを集め、ソフトウェアＭＯＳＦＬＭ及びＳＣＡＬＡを用いてマージし、スケーリングした（Ｅｖａｎｓ、１９９３；Ｌｅｓｌｉｅ、１９９２）。
【００８６】
（構造決定）
ＢＭＰ−２−ＢＲＩＡＥＣという複合体の構造を、低分解能構造（ＰＤＢエントリー１ＥＳ７）を出発モデルとして用いてリファインメントした。ＢＭＰ−２−ＢＲＩＡＥＣ複合体を、空間群Ｐ６５で結晶化し、これは非対称単位にＢＭＰ−２二量体と２つのＢＲＩＡＥＣ分子を保持していた。容器定数のわずかな変化のために、回転及び翻訳検索とそれに続く剛体リファインメントからなる分子置換ステップを、ソフトウェアＣＮＳ１．１を用いて実施した（Ｂｒｕｎｇｅｒら、１９９８）。リファインメントのためにプログラムＲＥＦＭＡＣ５（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖら、１９９７）を続いて用い、それに続いてソフトウェアＱＵＡＮＴＡ２０００（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）を用いて座標を手動で再建した。分解能を２０〜１．９Åという最終分解能範囲まで徐々に高めた。データの異方性を明らかにするために、各鎖、すなわち、ＢＭＰ−２単量体及び各ＢＲＩＡＥＣ分子に対して１つのＴＬＳグループを定義した（Ｗｉｎｎら、２００１）。リファインメントの進行は、５％の反射を含む試験データセットを用いる相互検証によってモニターした（Ｂｒｕｎｇｅｒ、１９９２）。複合体構造は、基本的には対称であるので、本発明者らは非結晶学的対称拘束を用いることを試みたが、続くリファインメントステップでは、ＲｆｒｅｅをＮＣＳ拘束を破らずに低下させることができなかった。したがって、ＮＣＳ拘束はリファインメントを通じて用いなかった。最終ラウンドのリファインメントでは、ｆｏｂｓ−ｆｃａｌｃ相違電子密度マップを用いて１８５の水分子を同定した。最終最小化サイクルによって、Ｒ−因子は２０．７、Ｒｆｒｅｅに対しては２２．９となった。ＢＭＰ−２ Ｌ５１Ｐの構造分析はＢＭＰ−２−ＢＲＩＡＥＣ複合体のプロトコールに従ったが、焼き鈍し法及びエネルギー最小化のためにＣＮＳ １．１を用いた。ＢＭＰ−２野生型（ＰＤＢエントリー３ＢＭＰ）の構造を出発モデルとして用いた。モデルの手動での再建は、σＡ加重した２ｆｏｂｓ−ｆｃａｌｃ及びｆｏｂｓ−ｆｃａｌｃ電子密度マップを基にし、最終ラウンドのリファインメントでは、１３の水及び２つのＭＰＤ分子を加えた。ＢＭＰ−２ Ｌ５１Ｐの最終構造のＲ−因子は、２１．５であり、Ｒｆｒｅｅに対しては２３．５である。
【００８７】
（相互作用分析）
タンパク質をビオチン化し、ストレプトアビジンコートしたセンサーチップＣＭ５に固定化した（Ｋｉｒｓｃｈら、２０００ａ）。ＢＲＩＡ、ＢＲＩＢ及びＡＲＩＩの細胞外ドメインを記載された通りに調製した（Ｋｉｒｓｃｈら、２０００ａ）。ノギン／Ｆｃ、コーディン及びグレムリンをＲ＆Ｄシステム（Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ−Ｎｏｒｄｅｎｓｔａｄｔ）から得た。分析物との相互作用をＢＩＡコア２０００システムで測定した（Ｋｉｒｓｃｈら、２０００ａ）。センサーグラム（Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ ２．０）の評価から複合体形成（ｋｏｎ）及び解離（ｋｏｆｆ）の速度定数が得られた。６〜１２回の測定から平均値を得、平均標準偏差はｋｏｆｆについては３５％及びｋｏｎについては１２％であった。見掛けの解離定数ＫＤはＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出するか、平衡結合の線量依存性を評価することによるかのいずれかとした。特別の条件を適用して、ＢＭＰ−２結合後に遊離ノギンを再生しなくてはならなかった。残存する複合体は、１Ｍ塩化ナトリウム及び６Ｍ尿素の存在下で酸性ｐＨ３でのみ解離することができた。幸にも、タンパク質は、センサーに固定されたタンパク質Ａにノギン−Ｆｃ融合タンパク質を固定するのに使用する独立した単一サイクルの実験によって確立される厳しい処理の後にも天然の結合特性を保持していた。
【００８８】
（細胞株における生物活性）
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性は、血清を欠乏させたＡＴＤＣ５（Ｒｉｋｅｎ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ、細胞番号ＲＣＢ０５６５）及びＣ２Ｃ１２（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１７７２）細胞で測定した（Ｋｉｒｓｃｈら、２０００ａ）。
【００８９】
実施例２：ＢＭＰ−２−ＢＲＩＡＥＣ複合体における水素結合パターン
ＢＭＰ−２−ＢＲＩＡＥＣ複合体の高分解能構造は、非対称単位に２つのＢＲＩＡエクトドメインと結合している１つの完全なＢＭＰ−２二量体を含んでいる（図１Ａ）。厳しい非結晶学的対称性を適用することに失敗したということは、リガンド−受容体複合体の対称性は完全ではないということを示すものである。しかし、２つのセグメント（ＢＭＰ−２二量体と１つのＢＲＩＡＥＣ分子）間の相違は小さく、すべての原子についてｒ．ｍ．ｓ．偏差は０．９Åであり、すべてのＣα−原子については０．４Åである。詳細な分析により、２つのＢＭＰ−２／ＢＲＩＡＥＣ接触面の構造は同一であることが示される。非結晶学的対称性に関連する分子間のすべての相違は、結晶格子における充填環境の相違によるものである。これらのセグメントにおいて高温因子は、すべての相違は骨格柔軟性によるものであり得るということを示唆する。したがって、対称性に関連しているタンパク質セグメントにおける構造変動は、個々の分子間の実際の相違には反映されないだけでなく、あり得る高次構造並びにＢＭＰ−２及びＢＲＩＡポリペプチド鎖間の動力学を反映しない。
【００９０】
ＢＭＰ−２／ＢＲＩＡ接触面は成長因子／受容体接触面の新規パラダイムを表す。ＢＭＰ−２の結合エピトープは、高度に疎水性であり、２３１０Å２という全部の埋もれた表面のほぼ６０％が疎水性残基で作られている（図１ｂ）。ヒト成長ホルモン（ｄｅ Ｖｏｓら、１９９２）、インターロイキン−４（Ｈａｇｅら、１９９９）、エリスロポエチン（Ｓｙｅｄら、１９９８）又はインターロイキン−６（Ｂｏｕｌａｎｇｅｒら、２００３）のようなその他の成長因子の結合エピトープと比較すると、このレベルの疎水性はかなり高い。アクチビン受容体ＩＩエクトドメインに結合しているＢＭＰ−７の複合体構造（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、２００３）、ＴＧＦ−β受容体ＩＩとの複合体中のＴＧＦ−β３（Ｈａｒｔら、２００２）及びアクチビン受容体ＩＩＢと結合しているアクチビンＡ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、２００３）に示されるように、極端に疎水性接触面は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーに特徴的であるようである。対照的に、ＢＲＩＡＥＣの結合エピトープは、結合接触面に広がる極性及び電荷を有する残基の広がりのためにあまり疎水性ではない（３０％）（図１Ｂ）。
【００９１】
ＢＭＰ−２−ＢＲＩＡＥＣ複合体のリファインメントされた構造の１．９Åというより高い分解能によって、低分解能でこれまでの構造に可能であったようなより詳細な分析が可能となる。各ＢＭＰ−２／受容体接触面において、プログラムＨＢＰＬＵＳ（ＭｃＤｏｎａｌｄ及びＴｈｏｒｎｔｏｎ、１９９４）によって１０の分子間水素結合（Ｈ−結合）が同定される（表１）。ＢＭＰ−２は５個の、その受容体は４個の主鎖原子を水素結合に提供している。Ｈ−結合に携わっている原子を、表１に表されるように２つの構造エレメントにまとめる：リガンドＢＭＰ−２では、残基Ｐｈｅ４９〜Ａｓｎ５９からなるプレヘリックスループ、受容体ＢＲＩＡでは、短いα−ヘリックス及びフランキング配列（Ａｓｐ８４〜Ａｒｇ９７）。２つの水素結合、ＢＭＰ−２ Ａｓｐ５３（Ｎ）−ＢＲＩＡＥＣＣｙｓ７７（Ｏ）及びＢＭＰ−２ Ｓｅｒ６９（Ｏ）−ＢＲＩＡＥＣ Ｇｌｎ９４（Ｎ）が、主鎖原子の間でのみ形成され、２つの水素結合は、側鎖間でのみ生じ、４つの混合水素結合は側鎖と主鎖原子とを含む（表１）。１０の水素結合のうち８は、正真正銘の水素結合に対して予測されるような（Ｘｕら、１９９７）ドナー−アクセプター距離（２．８±０．１４Å）、φ結合角（１３７±１１°）を有する。しかし、結合パラメータの幾何学的評価に純粋に基づいた個々の水素結合の強さの分類はこの複合体には可能ではないようである。
【００９２】
【表１】
【００９３】
カッコ内の数字は、ドナー−アクセプター原子の距離及び非結晶学的対称性で関連している二次接触面の角度を表す。
ａ）斜線をつけた行中のＨ−結合は、前記の幾何統計データから排除した。
ｂ）Ｎ−Ｏ−Ｃはドナー−アクセプター原子であり；統計データ（Ｘｕら、１９９７）から、この角度は、ＭＣ−ＭＣ水素結合については１４９°±１５°並びにＳＣ−ＭＣ及びＳＣ−ＳＣ Ｈ−結合については１２９°±１８°である。
ｃ）ＭＣ（主鎖）及びＳＣ（側鎖）ドナー／アクセプター原子
ｄ）ＢＭＰ−２（イタリック体）及びＢＲＩＡ（太字）における分析したＨ結合を乱す置換。
【００９４】
接触面構造から機能的に重要なＨ−結合を予測できるかどうかを調査するために、残基部分の接近可能性を算出した（図１Ｃ）。複合体におけるこの残基の接近可能性は、コアに向かった、又は接触面の表面に向かった残基の位置と関連がある（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ及びＪａｎｉｎ、２００２）。１０個の界面のＨ−結合のうち８個は、表面に位置する残基の間に生じる。受容体Ｇｌｎ８６とＢＭＰ−２主鎖のＬｅｕ５１アミド及びカルボニルをつなぐ２個のＨ−結合だけが、複合体形成の際に完全に埋もれる（図１Ｃ）。したがって、この相互作用は、結合のホットスポットを表す可能性があるが（Ｂｏｇａｎ及びＴｈｏｒｎ、１９９８）、その他のＨ−結合及び疎水性相互作用は、結合親和性には寄与していないか、ほんのわずかしか寄与していない可能性がある。
【００９５】
接触面における水分子の調査によって、結合エピトープの脱溶媒和がその他のタンパク質−タンパク質接触面と比較してかなり効果的であるということが明らかになっている。複合体形成の際、各リガンド−受容体接触面には４個の水分子しか完全に埋もれない。これらの埋もれた水分子の低温因子（すなわち、これらの埋もれた水分子の値は、４０〜５０Å２の範囲であり、近接するタンパク質原子が３２Å２というＢ因子を有する）は、外部の水との交換が遅いものであり得ることを示唆する。驚くべきことに、これらの水分子は、ホットスポットＢＲＩＡＥＣ Ｇｌｎ８６に近接している。３個の水分子は、側鎖アミド窒素原子に近いＢＲＩＡＥＣ Ｇｌｎ８６の「膜遠位側」に位置している。これらの水素結合している水分子は、ＢＲＩＡＥＣ Ｌｙｓ９７との接触面の大きな割れ目を埋めており、この窪みへの入口を塞いでいる。単一で単離された水分子が、ＢＲＩＡＥＣ Ｇｌｎ８６の側鎖カルボニル酸素原子の隣の窪んだ空間に位置している。この窪みはＢＭＰ−２の残基Ｐｈｅ４９及びＰｒｏ５０によって外側から塞がれている。ＢＭＰ−２結合の際の受容体Ｇｌｎ８６の不完全な脱溶媒和は、疎水性環境における強力な水素結合の形成を支持している可能性がある。
【００９６】
実施例３：水素結合の突然変異解析
ＢＭＰ−２及び２種のアミノ酸置換を含むＢＲＩＡＥＣ変異タンパク質を用いる相互作用分析によって、結合親和性にとっての水素結合の重要性を解析した。第１に、アラニン置換を導入して、側鎖結合を乱した（実施例２の表１参照）。ＢＭＰ−２ Ｗ２８Ａ変異タンパク質は単離できなかったので、Ｔｒｐ２８を、その側鎖も水素結合能を欠いているフェニルアラニンで置換した。（１個の電荷を有する残基の置換をＢＭＰ−２ Ｓ６９Ｒ変異タンパク質で行った）。第２に、プロリン置換を導入して、主鎖アミド基による水素結合を消滅させた。
【００９７】
表２に表されるように、固定化した受容体ＢＲＩＡＥＣを用いるＢＭＰ−２変異タンパク質の相互作用解析によって、置換Ｗ２８Ｆ、Ｄ５３Ａ及びＹ１０３Ａは結合親和性に対して小さな作用しか有していないことが示された。Ｓ６９Ｒ変異タンパク質に電荷を有する残基を挿入した後に結合親和性のわずかに大きな低下（１７倍）が観察された。際立ったことに、Ｌ５１Ｐ及びＤ５３Ｐ置換は著しく低い親和性をもたらす。ＢＲＩＡＥＣとＬ５１Ｐの間の見掛けの解離定数ＫＤは、ＢＭＰ−２のものより７１００倍よりも高く、Ｄ５３Ｐについては５３倍高かった（表２及び図７）。両変異タンパク質とも、ＢＲＩＢ受容体に対する親和性の同様の低下を有し、このことはＢＭＰ−２の同様の決定基が２つのＩ型受容体の結合に用いられていることを示す。このことは、２つのプロリン変異タンパク質において乱された主鎖水素結合は主要な結合決定基であるが、Ｗ２８、Ｄ５３、Ｓ６９及びＹ１０３という側鎖結合はＢＲＩＡ受容体との結合にはあまり重要なものでないということを示している。
【００９８】
ＩＩ型受容体ＡＲＩＩに対するプロリン変異タンパク質の親和性は、野生型と比較して変わらない（表２）。ＩＩ型受容体アクチビン受容体ＩＩＢとＢＭＰ受容体ＩＩとの相互作用についても同じことが観察されている（データは示していない）。このことにより、置換されたプロリンによる局所構造の変化は、ＩＩ型受容体結合の並列するエピトープ（ナックルエピトープ）には伝わっていないので、変異タンパク質の全体構造は変わっていないということが確認される。
【００９９】
【表２】
【０１００】
ＢＲＩＡ受容体の結合決定基を同定するために、３種のエクトドメイン変異タンパク質を調製した。受容体Ｑ９４Ｐ変異タンパク質では、野生型ではＢＭＰ−２ Ｓｅｒ６９骨格カルボニルに水素結合を供与する骨格窒素アミドが乱されている。受容体Ｑ８６Ａ変異タンパク質は、野生型ではＢＭＰ−２ Ｌ５１骨格アミド及びカルボニルとＨ結合を形成する側鎖カルボキシアミド基を欠いている（図２）。Ｓ９０Ａ置換によって水素結合をＢＭＰ２ Ｖａｌ２６骨格カルボニルに供与するセリンヒドロキシル基が消滅する。すべての受容体変異タンパク質は野生型エクトドメインと同様に大腸菌で発現された後に高度に精製され得る。バイオセンサーに固定化した場合、受容体Ｑ９４Ｐ変異タンパク質は、野生型エクトドメインと比較して親和性が３倍しか低下しないでＢＭＰ−２と結合したが（表２）、このことは、変異タンパク質中で失われた主鎖／主鎖結合は結合にはわずかにしか寄与していないということを示す。Ｓ９０Ａ変異タンパク質において親和性の同様の小さな変化が観察されている。
【０１０１】
しかし、受容体Ｑ８６Ａ置換は、ＢＭＰ−２相互作用の際に８６倍増加したＫＤをもたらした。しかし、ＢＭＰ−２ Ｌ５１Ｐ変異タンパク質は、影響を受けるＨ−結合が主要な結合決定基に相当するということをすでに実証していたので（前記参照）、親和性のこのような大きな低下は予測されたものであった。最も重要なことは、関与しているドナー及びアクセプター群の残基部分の接近可能性を分析することによって推測されるホットスポットと突然変異解析によって同定されたホットスポットとが一致することである（図１Ｃ）。受容体Ｑ８６Ａ変異タンパク質における親和性の喪失は、ＢＭＰ−２ Ｌ５１Ｐ変異タンパク質におけるものよりは深刻なものではない（表２）。受容体中の隣接側鎖、例えば、Ｌｙｓ７９又はＧｌｕ８１又はＡｓｐ８９が、失われたＧｌｎ８６のカルボキサミド基を部分的に補っている可能性がある（図１ｂ）。他方、ＢＭＰ−２ Ｌ５１Ｐに導入されたプロリンは、立体障害を引き起こすか、例えば、ＢＭＰ−２ Ａｓｐ５３骨格アミドと受容体Ｃｙｓ７７カルボニルの間の局所的な構造転位によって隣接する結合を阻害し、それによって置換の作用をさらに悪化させる（図２）。
【０１０２】
実施例４：プロリンＢＭＰ−２変異タンパク質Ｌ５１Ｐの構造
ＢＭＰ−２ Ｌ５１Ｐの結合親和性の大きな低下を、ＢＲＩＡＥＣ Ｑ８６Ａに対して観察されたものと比較することによって、結合親和性の喪失は、単一の水素結合の喪失だけに起因するわけではない可能性があることが示唆される。さらに、結合エピトープにおける大きな構造変化がタンパク質相互作用を乱す可能性がある。したがって、ＢＭＰ−２ Ｌ５１Ｐ及びまたＤ５３Ｐ変異タンパク質を結晶化試験に付した。ＢＭＰ−２ Ｌ５１Ｐは野生型ＢＭＰ−２と同一条件下で結晶化でき、同一の結晶パラメータ、例えば、野生型ＢＭＰ−２の結晶について観察されたものと同一の空間群、Ｒ３２、及びほぼ同一の容器定数を有していた。明らかに、プロリン残基はＬｅｕ５１の代わりに受け入れられ、その疎水性側鎖がＢＭＰ−２のタンパク質コア中に向かっている。変異タンパク質Ｄ５３Ｐは、そのような条件下では結晶化せず、Ｄ５３Ｐの結晶は、エタノール又は２−メチル−２，４−ペンタジオールのいずれかから成長し、極めて低い分解能までしか回析せず、さらには分析しなかった。
【０１０３】
ＢＭＰ−２ Ｌ５１Ｐの回析データは室温で２．７Åという分解能まで得た。突然変異部位は別として、ＢＭＰ−２野生型とＬ５１Ｐの構造は基本的に同一であり、表３に表される構造決定法の誤差限度内にあり、すべてのＣα原子位置のｒ．ｍ．ｓ．偏差は０．６Åである。残基Ｐｒｏ４８〜Ｈｉｓ５４を含み、位置５１の突然変異部位も保持するプレヘリックスループに明確な変化が観察される。残基Ｐｒｏ４８、Ｐｈｅ４９、Ｐｒｏ５０、Ｌｅｕ／Ｐｒｏ５１、Ａｌａ５２及びＨｉｓ５４について、野生型と変異タンパク質のＣα位置間の距離は１Åを越え、最大の相違はＡｌａ５２のＣαについての１．８Åである（表３）。両構造、ＢＭＰ−２野生型とＬ５１Ｐの全体的な位置の誤差は、σＡプロットから算出されるように約０．４であるので、プレヘリックスループの高次構造の変化は小さいが有意なものと考えられる。
【０１０４】
【表３】
【０１０５】
この変化は野生型のロイシンのものと比較したプロリン残基の骨格の形状の変化によるものであり得る。しかし、結合していない高次構造及び結合している高次構造におけるＢＭＰ−２の構造を比較すると、Ｃα位置間の相違はＢＭＰ−２野生型と変異タンパク質Ｌ５１Ｐ間で観察されるものと同じ大きさであり、このことは、プレヘリックスループの高次構造は前もって形成されているものでも、固定されているものでもなく、複合体形成の際に受容体表面に適応するということを示す。
【０１０６】
Ｐｒｏ５１の側鎖は野生型ＢＭＰ−２中のＬｅｕ５１と同様の方向を向いており、このことは疎水性コアのパッキングは突然変異によって影響を受けないということを示す。さらに、Ｌｅｕ５１からプロリンへの交換は、残基５１の骨格カルボニルの方向を変えず、それゆえに、ＢＲＩＡ Ｇｌｎ８６と残基５１との１個の水素結合が依然として複合体に形成され得る（図２、３Ａ）。突然変異によって、結合していないタンパク質に導入された、かなり小さい構造の相違を考慮すると、結合親和性の大きな変化は不可解なものに思われる。
【０１０７】
Ｌ５１ＰとＢＭＰ−２−ＢＲＩＡＥＣという複合体の構造の重ね合わせにより、プロリン残基の環が、ＢＭＰ−２ Ｌｅｕ５１アミドとＢＲＩＡＥＣ Ｇｌｎ８６の側鎖カルボニルの間の水素結合に用いられていた容積を元は占めていることが示される（図３Ａ）。プロリン環の大きな空間要求が、ＢＭＰ−２Ｐｒｏ５１の側鎖とＢＲＩＡＥＣ Ｇｌｎ８６の間に立体障害を引き起こす（図３Ａ）。Ｐｒｏ５１を受け入れるには、その側鎖はさらに押し戻される必要がある。基本的に環の方向にアミド窒素を固定する堅い環構造であるために、もし環構造が押し戻されると、これは、Ｐｒｏ５０の骨格カルボニルがＢＲＩＡＥＣ Ｇｌｎ８６の側鎖の方向に移動するφ骨格ねじれ角の回りの回転に相当する。結果として、１つの立体障害を除去することによって、別の１つが引き起こされることとなり、これによって、おそらくは、突然変異Ｌ５１Ｐによる結合エネルギーの大きな喪失が説明される。
【０１０８】
実施例５：プロリン変異タンパク質及び生物活性
ＢＭＰ−２プロリン変異タンパク質の生物活性は、Ｃ２Ｃ１２細胞及びわずかにより感受性の高いＡＴＤＣ５細胞株を用いて、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性の用量依存的誘導によって決定した。最大応答の５０％（ＥＤ５０）をもたらす野生型ＢＭＰ−２の用量は、Ｃ２Ｃ１２細胞では２５ｎＭであった。ＡＴＤＣ５細胞を用いた場合、ＥＤ５０は８ｎＭであり、このことはこれらの細胞の高い反応性を示す。対照的に、ＢＭＰ−２ Ｌ５１Ｐには、Ｃ２Ｃ１２（＞１６００ｎＭ）又はＡＴＤＣ５細胞（＞１５００ｎＭ）で測定可能な生物活性はない。ＢＭＰ−２ Ｄ５３Ｐ変異タンパク質は、Ｃ２Ｃ１２及びＡＴＤＣ５細胞に対して、３３０ｎＭ及び１４０ｎＭというＥＤ５０値をそれぞれ示す。これらの値は、野生型ＢＭＰ−２のＥＤ５０値と比較して約１３〜１７倍高い。したがって、２種のＢＭＰ−２プロリン変異タンパク質におけるＢＲＩＡ受容体親和性の異なる低下は生物活性の喪失と平行している（図４）。
【０１０９】
ＢＭＰ−２ Ｌｅｕ５１のプロリン置換は、Ｉ型受容体との相互作用にのみ影響を及ぼしており、他方でＩＩ型受容体の親和性は変わっていないので、Ｌ５１Ｐ変異タンパク質は、主としてドミナントネガティブ阻害剤として機能している可能性がある。しかし、これは、２５０ｎＭまでの濃度の変異タンパク質を、２０ｎＭ ＢＭＰ−２で刺激した細胞に適用した場合には観察されなかった（データは示していない）。相対的に、ＡＴＤＣ５細胞における定常ＡＬＰ活性は、アンタゴニストＢＭＰ−２ Ａ３４Ｄ変異タンパク質によって阻害される（Ｋｉｒｓｃｈら、２０００ａ）が、Ｌ５１Ｐによっては阻害されない（図４Ａ）。
【０１１０】
実施例６：結合タンパク質のアンタゴニストとしてのプロリン変異タンパク質
ＢＭＰ−２ Ｌ５１ＰがＢＲＩＡＥＣと結合しないことは、その他の結合タンパク質との相互作用もプロリン置換によって影響を受け得るかどうかという疑問を提起した。特に注目されるものは、ＢＭＰと高親和性で結合し、ＢＭＰ−７との複合体中のその構造が最近決定された（Ｇｒｏｐｐｅら、２００２）ノギンである。もう１つの重要な結合タンパク質はコーディンであり、これはＢＭＰ−２と２つのシステインリッチドメインによって相互作用する。さらにもう１つの種類の結合タンパク質は、いわゆるＤＮＡドメインによってＢＭＰ−２と相互作用するグレムリンに相当する。３種のタンパク質の各々を、バイオセンサーの表面に固定し、表４に表されるようにＢＭＰ−２変異タンパク質相互作用について分析した。
【０１１１】
【表４】
【０１１２】
ノギンとの複合体についての２種のＢＭＰ−２プロリン変異タンパク質の解離定数ＫＤはＢＭＰ−２野生型のものと同様であり、０．５〜２．５ｎＭの範囲であった。したがって、ノギンのＮ末端アミノ酸がＢＭＰ−２ Ｌｅｕ５１（ＢＭＰ−７ Ｌｅｕ７５）及びＡｓｐ５３（ＢＭＰ−７ Ｓｅｒ７７、プレヘリックスループ）に対応するＢＭＰ−７領域と接触していることが示され、ノギンはＢＭＰ−２とのＢＲＩＡ結合を妨げるという事実があるにもかかわらず、ＢＭＰ−２ Ｌｅｕ５１及びＡｓｐ５３はノギンに対する主要な結合決定基ではない。
【０１１３】
コーディンドメインＣＲ１及びＣＲ３並びにグレムリンに対するＢＭＰ−２の親和性は、ノギンに対してよりも１０〜３０倍低い（表４）。ＢＭＰ−２野生型又は２種のプロリン変異タンパク質に対しても再度、同様の解離定数ＫＤが認められ、このことは、これらのタンパク質の結合がプロリン置換によって影響を受けないことを示す。したがって、両結合タンパク質に対するＢＭＰ−２エピトープはＢＲＩＡ受容体に対するものとは異なる。
【０１１４】
実施例７：プロリン変異タンパク質Ｌ５１Ｐは、Ｃ２Ｃ１２細胞においてノギン阻害を解除する
ＢＭＰ−２は飢餓前骨髄芽球性細胞株Ｃ２Ｃ１２において、アルカリホスファターゼの発現を誘導する。このＢＭＰ応答は、等モル濃度のノギン−Ｆｃ融合タンパク質によってバックグラウンドレベルまで阻害される（図５）。ノギンによるＢＭＰ−２活性の阻害は、Ｌ５１Ｐ変異タンパク質によって用量依存的に解除される。ほぼ等モル濃度の変異タンパク質Ｌ５１Ｐとノギンで、ノギンの阻害作用は、８０％よりも多くまで中和される。このことは、受容体非感受性Ｌ５１Ｐ変異タンパク質はノギンタンパク質の効率的な阻害剤に相当するということを示す。この結果は、ＢＭＰ−２ Ｌ５１Ｐ置換後のＩ型受容体結合の混乱とノギン結合の保持を示す物理的結合研究と一致する。
【０１１５】
参照文献
不要な参照を避けるために、本明細書に記載した参照文献の包括的な一覧を以下に示す。これらの参照文献のいずれの開示内容も参照により本明細書に組み込まれると理解されなくてはならない。
【０１１６】
Balemans, W. and Van Hul, W. (2002)Extracellularregulation of BMP signaling in vertebrates: a cocktail ofmodulators. Dev Biol,250, 231-250.
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【０１１７】
本明細書に開示した本発明の特徴、特許請求の範囲及び／又は図面は、個別に、及びいずれかの組合せでの双方で、種々の形の本発明を理解する材料であり得る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨形成タンパク質の変異タンパク質であって、前記変異タンパク質は、骨形成タンパク質の野生型と比較して、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当するアミノ酸位置にアミノ酸置換を含む、変異タンパク質。
【請求項２】
前記ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置のアミノ酸は、前記骨形成タンパク質の野生型ではロイシンであり、前記変異タンパク質ではプロリンであることが好ましい、請求項１記載の変異タンパク質。
【請求項３】
前記骨形成タンパク質は、ｈＢＭＰ−２、ｈＢＭＰ−４、ｈＢＭＰ−５、ｈＢＭＰ−６、ｈＢＭＰ−７、ｈＢＭＰ−８、ｈＧＤＦ−５、ｍＧＤＦ−６、ｍＧＤＦ−７、ｈＢＭＰ−１０及びｈＧＤＦ−２を含んでなる群から選択される、請求項１及び２記載の変異タンパク質。
【請求項４】
前記骨形成タンパク質は、ｈＢＭＰ−２であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置は、アミノ酸位置５１であり、
前記骨形成タンパク質は、ｈＢＭＰ−４であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置は、アミノ酸位置５３であり、
骨形成タンパク質は、ｈＢＭＰ−５であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置は、アミノ酸位置６８であり、
骨形成タンパク質は、ｈＢＭＰ−６であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置は、アミノ酸位置６８であり、
骨形成タンパク質は、ｈＢＭＰ−７であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置は、アミノ酸位置７５であり、
骨形成タンパク質は、ｈＢＭＰ−８であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置は、アミノ酸位置７５であり、
骨形成タンパク質は、ｈＧＤＦ−５であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置は、アミノ酸位置５６であり、
骨形成タンパク質は、ｍＧＤＦ−６であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置は、アミノ酸位置５６であり、
骨形成タンパク質は、ｍＧＤＦ−７であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置は、アミノ酸位置８２であり、
骨形成タンパク質は、ｈＢＭＰ−１０であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置は、アミノ酸位置４４であり、
骨形成タンパク質は、ｈＧＤＦ−２であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置は、アミノ酸位置４５である、
請求項１〜３のいずれか一項記載の変異タンパク質。
【請求項５】
ｈＢＭＰ−２の野生型は、配列番号１のアミノ酸配列を含み、
ｈＢＭＰ−４の野生型は、配列番号３のアミノ酸配列を含み、
ｈＢＭＰ−５の野生型は、配列番号５のアミノ酸配列を含み、
ｈＢＭＰ−６の野生型は、配列番号７のアミノ酸配列を含み、
ｈＢＭＰ−７の野生型は、配列番号９のアミノ酸配列を含み、
ｈＢＭＰ−８の野生型は、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、
ｈＧＤＦ−５の野生型は、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、
ｍＧＤＦ−６の野生型は、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、
ｍＧＤＦ−７の野生型は、配列番号１７のアミノ酸配列を含み、
ｈＢＭＰ−１０の野生型は、配列番号１９のアミノ酸配列を含み、
ｈＧＤＦ−２の野生型は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む、
請求項１〜４のいずれか一項記載の変異タンパク質。
【請求項６】
ｈＢＭＰ−２の野生型は、配列番号２の核酸によってコードされており、
ｈＢＭＰ−４の野生型は、配列番号４の核酸によってコードされており、
ｈＢＭＰ−５の野生型は、配列番号６の核酸によってコードされており、
ｈＢＭＰ−６の野生型は、配列番号８の核酸によってコードされており、
ｈＢＭＰ−７の野生型は、配列番号１０の核酸によってコードされており、
ｈＢＭＰ−８の野生型は、配列番号１２の核酸によってコードされており、
ｈＧＤＦ−５の野生型は、配列番号１４の核酸によってコードされており、
ｍＧＤＦ−６の野生型は、配列番号１６の核酸によってコードされており、
ｍＧＤＦ−７の野生型は、配列番号１８の核酸によってコードされており、
ｈＢＭＰ−１０の野生型は、配列番号２０の核酸によってコードされており、
ｈＧＤＦ−２の野生型は、配列番号２２の核酸によってコードされている、
請求項５記載の変異タンパク質。
【請求項７】
前記変異タンパク質は、第１の骨形成タンパク質受容体に結合していないが、少なくとも１種のモジュレータータンパク質と結合しており、
前記モジュレータータンパク質は、ノギンタンパク質ファミリー、ＤＡＮタンパク質ファミリー、コーディンタンパク質ファミリー及びシステインノット含有ＢＭＰモジュレータータンパク質、を含んでなる群から選択される、
骨形成変異タンパク質。
【請求項８】
第２の骨形成タンパク質受容体と相互作用するプレヘリックスループ構造を含む、好ましくは請求項１記載の、骨形成変異タンパク質。
【請求項９】
前記第１及び／又は第２の骨形成タンパク質受容体は、ＢＲＩＡ又はＢＲＩＢである、請求項７及び８記載の骨形成変異タンパク質。
【請求項１０】
前記相互作用は、アミノ酸残基、好ましくは、ＢＲＩＡのＧｌｎ８６又はＢＲＩＢのＧｌｎ６７アミノ酸残基に関連している、請求項８及び９記載の骨形成変異タンパク質。
【請求項１１】
第２の骨形成タンパク質受容体と相互作用するプレヘリックスループ構造を含み、前記骨形成変異タンパク質のプレヘリックスループ構造と、前記第２の骨形成タンパク質受容体との相互作用は、野生型骨形成タンパク質のプレヘリックスループ構造と、前記第２の骨形成タンパク質受容体との相互作用とは異なる、好ましくは請求項６〜１０のいずれか一項記載の骨形成変異タンパク質。
【請求項１２】
異なる相互作用又は変化は、屈折データ、好ましくは、少なくとも約２．７Åの分解能まで室温で得られている屈折データ、で表される、請求項８〜１１のいずれか一項記載の骨形成変異タンパク質。
【請求項１３】
前記プレヘリックスループ構造は、骨形成タンパク質の野生型と比較して変異している、請求項７〜１２のいずれか一項記載の骨形成変異タンパク質。
【請求項１４】
前記野生型ＢＭＰ−２の位置５１のロイシンに相当するアミノ酸は、変異している、請求項１３記載の骨形成変異タンパク質。
【請求項１５】
ヒトＢＭＰ−２の位置５１のロイシンに相当するアミノ酸は、プロリンに変異している、請求項１３又は１４記載の骨形成変異タンパク質。
【請求項１６】
ｈＢＭＰ−２、ｈＢＭＰ−４、ｈＢＭＰ−５、ｈＢＭＰ−６、ｈＢＭＰ−７、ｈＢＭＰ−８、ｈＧＤＦ−５、ｍＧＤＦ−６、ｍＧＤＦ−７、ｈＢＭＰ−１０及びｈＧＤＦ−２を含んでなる群から選択される骨形成タンパク質の変異タンパク質である、請求項７〜１５のいずれか一項記載の骨形成変異タンパク質。
【請求項１７】
ＢＭＰ−２又はプロ−ＢＭＰ−２である、請求項１６記載の骨形成変異タンパク質。
【請求項１８】
配列番号２３〜３３のいずれかのアミノ酸配列を含む、骨形成タンパク質。
【請求項１９】
請求項７〜１８のいずれか一項記載の骨形成変異タンパク質である、請求項１８記載の骨形成変異タンパク質。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項記載の骨形成変異タンパク質をコードする核酸及び／又はその相補鎖。
【請求項２１】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０及び２２の核酸配列を含む核酸であって、好ましくは、請求項１〜１９のいずれか一項記載の骨形成変異タンパク質をコードする核酸、及び／又はその相補鎖。
【請求項２２】
前記核酸は、遺伝暗号の縮重がなければ、請求項２０又は２１記載の核酸とハイブリダイズし、より好ましくは、ストリンジェントな条件下で請求項２０又は２１記載の核酸とハイブリダイズする、請求項１〜１９のいずれか一項記載の骨形成変異タンパク質をコードする核酸。
【請求項２３】
ベクターは、発現ベクターであることが好ましい、請求項２０〜２２のいずれか一項記載の核酸を含むベクター。
【請求項２４】
請求項２０〜２２のいずれか一項記載の核酸、及び／又は請求項２３記載のベクター、を含む細胞、好ましくは、哺乳類細胞。
【請求項２５】
請求項２４記載の細胞を含む宿主生物、好ましくは哺乳類宿主生物、より好ましくは非ヒト宿主生物。
【請求項２６】
請求項１〜１９のいずれか一項記載の骨形成変異タンパク質の製造方法であって、
ａ）培養ブロスで請求項２５記載の細胞を培養するステップと、
ｂ）前記細胞から、及び／又は前記培養ブロスから、前記骨形成変異タンパク質を調製するステップと、
を含む方法。
【請求項２７】
請求項１〜１９のいずれか一項記載の骨形成変異タンパク質と特異的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項２８】
請求項１〜１９のいずれか一項記載の変異タンパク質及び／又は請求項２０〜２２のいずれか一項記載の核酸、を含む組成物。
【請求項２９】
請求項１〜１９のいずれか一項記載の変異タンパク質又は請求項２０〜２２のいずれか一項記載の核酸と、製薬上許容される担体とを含む薬剤組成物。
【請求項３０】
請求項１〜１９のいずれか一項記載の骨形成変異タンパク質及び／又は請求項２０〜２２のいずれか一項記載の核酸、の医薬の製造のための使用。
【請求項３１】
前記医薬は、線維性疾患、創傷治癒、過剰血管新生、血管疾患、骨折及び骨粗しょう症を含んでなる群から選択される疾患の治療用及び／又は予防用である、請求項３０記載の使用。
【請求項３２】
前記線維性疾患は、腎線維症、肝硬変、肺線維症及び慢性炎症、好ましくは、喘息を伴う慢性炎症を含んでなる群から選択される、請求項３１記載の使用。
【請求項３３】
前記創傷治癒は、ケロイド、瘢痕形成及び腹膜の閉塞と関連している、請求項３１記載の使用。
【請求項３４】
前記過剰血管新生は、網膜症、動脈硬化症及び／又は腫瘍と関連しているか、又は網膜症、動脈硬化症及び／又は腫瘍を伴う、請求項３１に記載使用。
【請求項３５】
前記骨折は、難治性骨折である、請求項３１記載の使用。
【請求項３６】
前記疾患は、骨粗しょう症である、請求項３１記載の使用。
【請求項３７】
ＢＭＰ相互作用タンパク質に対する阻害剤としての、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の形態形成変異タンパク質の使用。
【請求項３８】
前記ＢＭＰ相互作用タンパク質は、ノギンタンパク質ファミリー、ＤＡＮタンパク質ファミリー及びコーディンタンパク質ファミリーを含んでなる群から選択される、請求項３７記載の使用。
【請求項１】
骨形成タンパク質の変異タンパク質であって、前記変異タンパク質は、骨形成タンパク質の野生型と比較して、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当するアミノ酸位置にアミノ酸置換を含む、変異タンパク質。
【請求項２】
前記ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置のアミノ酸は、前記骨形成タンパク質の野生型ではロイシンであり、前記変異タンパク質ではプロリンであることが好ましい、請求項１記載の変異タンパク質。
【請求項３】
前記骨形成タンパク質は、ｈＢＭＰ−２、ｈＢＭＰ−４、ｈＢＭＰ−５、ｈＢＭＰ−６、ｈＢＭＰ−７、ｈＢＭＰ−８、ｈＧＤＦ−５、ｍＧＤＦ−６、ｍＧＤＦ−７、ｈＢＭＰ−１０及びｈＧＤＦ−２を含んでなる群から選択される、請求項１及び２記載の変異タンパク質。
【請求項４】
前記骨形成タンパク質は、ｈＢＭＰ−２であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置は、アミノ酸位置５１であり、
前記骨形成タンパク質は、ｈＢＭＰ−４であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置は、アミノ酸位置５３であり、
骨形成タンパク質は、ｈＢＭＰ−５であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置は、アミノ酸位置６８であり、
骨形成タンパク質は、ｈＢＭＰ−６であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置は、アミノ酸位置６８であり、
骨形成タンパク質は、ｈＢＭＰ−７であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置は、アミノ酸位置７５であり、
骨形成タンパク質は、ｈＢＭＰ−８であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置は、アミノ酸位置７５であり、
骨形成タンパク質は、ｈＧＤＦ−５であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置は、アミノ酸位置５６であり、
骨形成タンパク質は、ｍＧＤＦ−６であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置は、アミノ酸位置５６であり、
骨形成タンパク質は、ｍＧＤＦ−７であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置は、アミノ酸位置８２であり、
骨形成タンパク質は、ｈＢＭＰ−１０であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置は、アミノ酸位置４４であり、
骨形成タンパク質は、ｈＧＤＦ−２であり、ヒトＢＭＰ−２のアミノ酸位置５１に相当する位置は、アミノ酸位置４５である、
請求項１〜３のいずれか一項記載の変異タンパク質。
【請求項５】
ｈＢＭＰ−２の野生型は、配列番号１のアミノ酸配列を含み、
ｈＢＭＰ−４の野生型は、配列番号３のアミノ酸配列を含み、
ｈＢＭＰ−５の野生型は、配列番号５のアミノ酸配列を含み、
ｈＢＭＰ−６の野生型は、配列番号７のアミノ酸配列を含み、
ｈＢＭＰ−７の野生型は、配列番号９のアミノ酸配列を含み、
ｈＢＭＰ−８の野生型は、配列番号１１のアミノ酸配列を含み、
ｈＧＤＦ−５の野生型は、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、
ｍＧＤＦ−６の野生型は、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、
ｍＧＤＦ−７の野生型は、配列番号１７のアミノ酸配列を含み、
ｈＢＭＰ−１０の野生型は、配列番号１９のアミノ酸配列を含み、
ｈＧＤＦ−２の野生型は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む、
請求項１〜４のいずれか一項記載の変異タンパク質。
【請求項６】
ｈＢＭＰ−２の野生型は、配列番号２の核酸によってコードされており、
ｈＢＭＰ−４の野生型は、配列番号４の核酸によってコードされており、
ｈＢＭＰ−５の野生型は、配列番号６の核酸によってコードされており、
ｈＢＭＰ−６の野生型は、配列番号８の核酸によってコードされており、
ｈＢＭＰ−７の野生型は、配列番号１０の核酸によってコードされており、
ｈＢＭＰ−８の野生型は、配列番号１２の核酸によってコードされており、
ｈＧＤＦ−５の野生型は、配列番号１４の核酸によってコードされており、
ｍＧＤＦ−６の野生型は、配列番号１６の核酸によってコードされており、
ｍＧＤＦ−７の野生型は、配列番号１８の核酸によってコードされており、
ｈＢＭＰ−１０の野生型は、配列番号２０の核酸によってコードされており、
ｈＧＤＦ−２の野生型は、配列番号２２の核酸によってコードされている、
請求項５記載の変異タンパク質。
【請求項７】
前記変異タンパク質は、第１の骨形成タンパク質受容体に結合していないが、少なくとも１種のモジュレータータンパク質と結合しており、
前記モジュレータータンパク質は、ノギンタンパク質ファミリー、ＤＡＮタンパク質ファミリー、コーディンタンパク質ファミリー及びシステインノット含有ＢＭＰモジュレータータンパク質、を含んでなる群から選択される、
骨形成変異タンパク質。
【請求項８】
第２の骨形成タンパク質受容体と相互作用するプレヘリックスループ構造を含む、好ましくは請求項１記載の、骨形成変異タンパク質。
【請求項９】
前記第１及び／又は第２の骨形成タンパク質受容体は、ＢＲＩＡ又はＢＲＩＢである、請求項７及び８記載の骨形成変異タンパク質。
【請求項１０】
前記相互作用は、アミノ酸残基、好ましくは、ＢＲＩＡのＧｌｎ８６又はＢＲＩＢのＧｌｎ６７アミノ酸残基に関連している、請求項８及び９記載の骨形成変異タンパク質。
【請求項１１】
第２の骨形成タンパク質受容体と相互作用するプレヘリックスループ構造を含み、前記骨形成変異タンパク質のプレヘリックスループ構造と、前記第２の骨形成タンパク質受容体との相互作用は、野生型骨形成タンパク質のプレヘリックスループ構造と、前記第２の骨形成タンパク質受容体との相互作用とは異なる、好ましくは請求項６〜１０のいずれか一項記載の骨形成変異タンパク質。
【請求項１２】
異なる相互作用又は変化は、屈折データ、好ましくは、少なくとも約２．７Åの分解能まで室温で得られている屈折データ、で表される、請求項８〜１１のいずれか一項記載の骨形成変異タンパク質。
【請求項１３】
前記プレヘリックスループ構造は、骨形成タンパク質の野生型と比較して変異している、請求項７〜１２のいずれか一項記載の骨形成変異タンパク質。
【請求項１４】
前記野生型ＢＭＰ−２の位置５１のロイシンに相当するアミノ酸は、変異している、請求項１３記載の骨形成変異タンパク質。
【請求項１５】
ヒトＢＭＰ−２の位置５１のロイシンに相当するアミノ酸は、プロリンに変異している、請求項１３又は１４記載の骨形成変異タンパク質。
【請求項１６】
ｈＢＭＰ−２、ｈＢＭＰ−４、ｈＢＭＰ−５、ｈＢＭＰ−６、ｈＢＭＰ−７、ｈＢＭＰ−８、ｈＧＤＦ−５、ｍＧＤＦ−６、ｍＧＤＦ−７、ｈＢＭＰ−１０及びｈＧＤＦ−２を含んでなる群から選択される骨形成タンパク質の変異タンパク質である、請求項７〜１５のいずれか一項記載の骨形成変異タンパク質。
【請求項１７】
ＢＭＰ−２又はプロ−ＢＭＰ−２である、請求項１６記載の骨形成変異タンパク質。
【請求項１８】
配列番号２３〜３３のいずれかのアミノ酸配列を含む、骨形成タンパク質。
【請求項１９】
請求項７〜１８のいずれか一項記載の骨形成変異タンパク質である、請求項１８記載の骨形成変異タンパク質。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項記載の骨形成変異タンパク質をコードする核酸及び／又はその相補鎖。
【請求項２１】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０及び２２の核酸配列を含む核酸であって、好ましくは、請求項１〜１９のいずれか一項記載の骨形成変異タンパク質をコードする核酸、及び／又はその相補鎖。
【請求項２２】
前記核酸は、遺伝暗号の縮重がなければ、請求項２０又は２１記載の核酸とハイブリダイズし、より好ましくは、ストリンジェントな条件下で請求項２０又は２１記載の核酸とハイブリダイズする、請求項１〜１９のいずれか一項記載の骨形成変異タンパク質をコードする核酸。
【請求項２３】
ベクターは、発現ベクターであることが好ましい、請求項２０〜２２のいずれか一項記載の核酸を含むベクター。
【請求項２４】
請求項２０〜２２のいずれか一項記載の核酸、及び／又は請求項２３記載のベクター、を含む細胞、好ましくは、哺乳類細胞。
【請求項２５】
請求項２４記載の細胞を含む宿主生物、好ましくは哺乳類宿主生物、より好ましくは非ヒト宿主生物。
【請求項２６】
請求項１〜１９のいずれか一項記載の骨形成変異タンパク質の製造方法であって、
ａ）培養ブロスで請求項２５記載の細胞を培養するステップと、
ｂ）前記細胞から、及び／又は前記培養ブロスから、前記骨形成変異タンパク質を調製するステップと、
を含む方法。
【請求項２７】
請求項１〜１９のいずれか一項記載の骨形成変異タンパク質と特異的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項２８】
請求項１〜１９のいずれか一項記載の変異タンパク質及び／又は請求項２０〜２２のいずれか一項記載の核酸、を含む組成物。
【請求項２９】
請求項１〜１９のいずれか一項記載の変異タンパク質又は請求項２０〜２２のいずれか一項記載の核酸と、製薬上許容される担体とを含む薬剤組成物。
【請求項３０】
請求項１〜１９のいずれか一項記載の骨形成変異タンパク質及び／又は請求項２０〜２２のいずれか一項記載の核酸、の医薬の製造のための使用。
【請求項３１】
前記医薬は、線維性疾患、創傷治癒、過剰血管新生、血管疾患、骨折及び骨粗しょう症を含んでなる群から選択される疾患の治療用及び／又は予防用である、請求項３０記載の使用。
【請求項３２】
前記線維性疾患は、腎線維症、肝硬変、肺線維症及び慢性炎症、好ましくは、喘息を伴う慢性炎症を含んでなる群から選択される、請求項３１記載の使用。
【請求項３３】
前記創傷治癒は、ケロイド、瘢痕形成及び腹膜の閉塞と関連している、請求項３１記載の使用。
【請求項３４】
前記過剰血管新生は、網膜症、動脈硬化症及び／又は腫瘍と関連しているか、又は網膜症、動脈硬化症及び／又は腫瘍を伴う、請求項３１に記載使用。
【請求項３５】
前記骨折は、難治性骨折である、請求項３１記載の使用。
【請求項３６】
前記疾患は、骨粗しょう症である、請求項３１記載の使用。
【請求項３７】
ＢＭＰ相互作用タンパク質に対する阻害剤としての、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の形態形成変異タンパク質の使用。
【請求項３８】
前記ＢＭＰ相互作用タンパク質は、ノギンタンパク質ファミリー、ＤＡＮタンパク質ファミリー及びコーディンタンパク質ファミリーを含んでなる群から選択される、請求項３７記載の使用。
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１】
【図２】
【公開番号】特開２０１２−２３５７８４（Ｐ２０１２−２３５７８４Ａ）
【公開日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−１５２８６６（Ｐ２０１２−１５２８６６）
【出願日】平成２４年７月６日（２０１２．７．６）
【分割の表示】特願２００７−５０１２３６（Ｐ２００７−５０１２３６）の分割
【原出願日】平成１７年３月４日（２００５．３．４）
【出願人】（５０６２９９９９５）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１５２８６６（Ｐ２０１２−１５２８６６）
【出願日】平成２４年７月６日（２０１２．７．６）
【分割の表示】特願２００７−５０１２３６（Ｐ２００７−５０１２３６）の分割
【原出願日】平成１７年３月４日（２００５．３．４）
【出願人】（５０６２９９９９５）
【Ｆターム（参考）】
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