骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子、及びＷｎｔ遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出する方法
【課題】本発明の目的は、脱毛症と遺伝子におけるエピジェネティックな変化との関係を解明し、脱毛症の予防や治療、脱毛症リスクの判定、脱毛症治療及び／又は予防薬の薬剤応答性判定のための手段を提供することにある。
【解決手段】生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子、及びＷｎｔ遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出する方法；被験者の生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子、及びＷｎｔ遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を判定して、前記被験者の脱毛症の発症リスクを予測、或いは前記被験者の骨形成タンパク質促進剤、エフリン促進剤、及びＷｎｔ促進剤に対する応答性を判定する方法；前記各方法に用いられるプライマーセット、キット
【解決手段】生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子、及びＷｎｔ遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出する方法；被験者の生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子、及びＷｎｔ遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を判定して、前記被験者の脱毛症の発症リスクを予測、或いは前記被験者の骨形成タンパク質促進剤、エフリン促進剤、及びＷｎｔ促進剤に対する応答性を判定する方法；前記各方法に用いられるプライマーセット、キット
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子、及びＷｎｔ遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脱毛症の発症メカニズムの研究の過程で、脱毛症発症者の毛包では骨形成タンパク質（ＢＭＰ、Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ）のファミリーに属するＢＭＰ２やＢＭＰ５が増加し、毛髪のケラチンの生合成を促進する効果を有することが明らかにされている（特許文献１（特開２００５−２０６８号公報）)。ＢＭＰ２やＢＭＰ５のように、発毛を促す因子、又は脱毛において減少する因子（発毛因子）が存在することが解明されてきた。
【０００３】
また、ＢＭＰの受容体は複数の種類があるが、そのうち骨形成タンパク質受容体１Ａ型（ＢＭＰＲ１Ａ）に関して、ＢＭＰＲ１Ａノックアウトマウスは、四肢の体毛が減少することが知られている（非特許文献１（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００４Ａｐｒ；１３１（８）：１８２５−３３））。
【０００４】
エフリン受容体ファミリーはエフリンと結合し、発生段階の制御や細胞の恒常性維持を行っていることが報告されている。エフリン受容体ファミリーのうちＥｐｈＡ４は、ヒトの９番染色体上の８６８５６６８から８７７６４４５に位置し、下流のシグナルはＳｒｃキナーゼやＲｈｏＡファミリーＧＴＰａｓｅにより伝達される。ＥｐｈＡ４は脱毛症患者由来毛乳頭細胞での発現低下が明らかにされているＧＰＩ膜結合型タンパク質Ｅｐｈｒｉｎ−Ａ３の受容体である（非特許文献２（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，３６，２５−３２））。また、ＥｐｈＡ４は毛包において発現していることが確認されている。
【０００５】
Ｗｎｔタンパク質は腫瘍形成、細胞運命、パターン形成の調節などのいくつかの発生上の過程に関与する一連のタンパク質である。ＷｎｔはＦｚ受容体を介し、β−ｃａｔｅｎｉｎの核内移行を促すことで転写調節を行う。Ｗｎｔタンパク質の一つであるＷｎｔ１０の遺伝子は、１２番染色体上の４９３５９１２３から４９３６５５４３に位置する。Ｗｎｔ１０ｂは毛包の形成及び発達に関与することが明らかにされている（非特許文献３（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．３４２，２８−３５，２００６））。
【０００６】
一方、様々な疾患原因のひとつとして、ＤＮＡのメチル化を代表とするエピジェネティックな変化が明らかになりつつある。例えば特許文献２（特表２００４−５２９６３０号公報）には、生体試料の遺伝子のシトシンのメチル化レベルから、前立腺癌などの診断及び治療のための遺伝子パネルが得られることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−２０６８号公報
【特許文献２】特表２００４−５２９６３０号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００４Ａｐｒ；１３１（８）：１８２５−３３
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，３６，２５−３２
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．３４２，２８−３５，２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら脱毛症とエピジェネティクスとの関係についてこれまで検討された例はなかった。本発明の目的は、脱毛症と遺伝子におけるエピジェネティックな変化との関係を解明し、脱毛症の予防や治療、脱毛症リスクの判定、脱毛症治療及び／又は予防薬の薬剤応答性判定のための手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上述の目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子、及びＷｎｔ遺伝子中のメチル化領域のメチル化度に、個体間で相違があることを見出した。具体的には、脱毛症リスクの高いヒトの生体試料では骨形成タンパク質受容体遺伝子の特定の領域、エフリン受容体遺伝子、及びＷｎｔ遺伝子のメチル化度が高く、一方、脱毛症リスクが低いヒトの生体試料では前記メチル化度が低いことを見出した。また前記骨形成タンパク質受容体遺伝子の特定の領域とは別の特定の領域では、脱毛症リスクの高いヒトの生体試料ではメチル化度が低く、脱毛症リスクが低いヒトの生体試料ではメチル化度が高いことを見出した。また脱毛症の発症には関わらず、加齢によっても骨形成タンパク質受容体遺伝子のメチル化が亢進されることが示唆された。骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子、及びＷｎｔ遺伝子において、メチル化度が脱毛と関係していることについては、これまで知られていなかった。
【００１１】
以上のことから、毛根由来ゲノムの骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子、又はＷｎｔ遺伝子のメチル化度を測定することで、毛髪提供者の脱毛症リスクの判断、脱毛症治療及び／又は予防剤に対する応答性などの判断に応用できる技術を提供し得ることを見出し、本発明に到達した。
【００１２】
本発明は、以下の〔１〕〜〔２５〕を提供するものである。
〔１〕生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子及びＷｎｔ遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出する方法。
〔２〕 前記生体試料は、抜去毛である、上記〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記生体試料は、毛根を含む抜去毛である、上記〔１〕に記載の方法。
〔４〕前記骨形成タンパク質受容体遺伝子が、骨形成タンパク質受容体１Ａ型遺伝子である、上記〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔５〕前記骨形成タンパク質受容体遺伝子中のメチル化領域が、下記の（Ａ−１）〜（Ａ−１８）のいずれかの塩基配列の領域である、上記〔４〕に記載の方法。
（Ａ−１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列
（Ａ−２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列の全部又は一部からなる塩基配列
（Ａ−３）配列表の配列番号２に記載の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列
（Ａ−４）配列表の配列番号２に記載の塩基配列の全部又は一部からなる塩基配列
（Ａ−５）配列表の配列番号３に記載の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列
（Ａ−６）配列表の配列番号３に記載の塩基配列の全部又は一部からなる塩基配列
（Ａ−７）配列表の配列番号８に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ａ−８）配列表の配列番号８に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
（Ａ−９）配列表の配列番号９に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ａ−１０）配列表の配列番号９に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
（Ａ−１１）配列表の配列番号１０に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ａ−１２）配列表の配列番号１０に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
（Ａ−１３）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ａ−１４）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
（Ａ−１５）配列表の配列番号１２に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ａ−１６）配列表の配列番号１２に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
（Ａ−１７）配列表の配列番号１３に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ａ−１８）配列表の配列番号１３に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
〔６〕前記エフリン受容体遺伝子が、ＥｐｈＡ４遺伝子である上記〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔７〕前記メチル化領域が、下記の（Ｃ−１）〜（Ｃ−６）のいずれかの塩基配列の領域である、上記〔６〕に記載の方法。
（Ｃ−１）配列表の配列番号１４に記載の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列
（Ｃ−２）配列表の配列番号１４に記載の塩基配列の全部又は一部からなる塩基配列
（Ｃ−３）配列表の配列番号１５に記載の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列
（Ｃ−４）配列表の配列番号１５に記載の塩基配列の全部又は一部からなる塩基配列
（Ｃ−５）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列
（Ｃ−６）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列の全部又は一部からなる塩基配列
〔８〕前記Ｗｎｔ遺伝子が、Ｗｎｔ１０ｂ遺伝子である上記〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔９〕前記メチル化領域が、下記の（Ｅ−１）〜（Ｅ−６）のいずれかの塩基配列の領域である、上記〔８〕に記載の方法。
（Ｅ−１）配列表の配列番号１７に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ｅ−２）配列表の配列番号１７に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
（Ｅ−３）配列表の配列番号１８に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ｅ−４）配列表の配列番号１８に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
（Ｅ−５）配列表の配列番号１９に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ｅ−６）配列表の配列番号１９に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
〔１０〕前記メチル化領域を、メチル化されている塩基を認識するプライマー及び／又はメチル化されていない塩基を認識するプライマーを用いて増幅させてから、メチル化度を判定する、上記〔１〕〜上記〔９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１１〕前記プライマーが、以下の（Ｂ−１）〜（Ｂ−８）から選ばれるポリヌクレオチドである、上記〔１０〕に記載の方法。
（Ｂ−１）配列表の配列番号４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｂ−２）配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ−３）配列表の配列番号５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｂ−４）配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ−５）配列表の配列番号６に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｂ−６）配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ−７）配列表の配列番号７に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｂ−８）配列表の配列番号７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
〔１２〕前記プライマーが、以下の（Ｄ−１）〜（Ｄ−８）から選ばれるポリヌクレオチドである、上記〔１０〕に記載の方法。
（Ｄ−１）配列表の配列番号２０に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｄ−２）配列表の配列番号２０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｄ−３）配列表の配列番号２１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｄ−４）配列表の配列番号２１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｄ−５）配列表の配列番号２２に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｄ−６）配列表の配列番号２２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｄ−７）配列表の配列番号２３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｄ−８）配列表の配列番号２３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
〔１３〕前記プライマーが、以下の（Ｆ−１）〜（Ｆ−８）から選ばれるポリヌクレオチドである、上記〔１０〕に記載の方法。
（Ｆ−１）配列表の配列番号２４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｆ−２）配列表の配列番号２４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｆ−３）配列表の配列番号２５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｆ−４）配列表の配列番号２５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｆ−５）配列表の配列番号２６に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｆ−６）配列表の配列番号２６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｆ−７）配列表の配列番号２７に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｆ−８）配列表の配列番号２７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
〔１４〕前記メチル化領域をプライマーにより増幅させてから、増幅産物をシーケンシングしてメチル化度を判定する、上記〔１〕〜上記〔９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１５〕前記プライマーが、以下の（Ｇ−１）〜（Ｇ−１６）から選ばれるポリヌクレオチドである、上記〔１４〕に記載の方法。
（Ｇ−１）配列表の配列番号２８に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−２）配列表の配列番号２８に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−３）配列表の配列番号２９に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−４）配列表の配列番号２９に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−５）配列表の配列番号３０に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−６）配列表の配列番号３０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−７）配列表の配列番号３１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−８）配列表の配列番号３１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−９）配列表の配列番号３２に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−１０）配列表の配列番号３２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−１１）配列表の配列番号３３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−１２）配列表の配列番号３３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−１３）配列表の配列番号３４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−１４）配列表の配列番号３４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−１５）配列表の配列番号３５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−１６）配列表の配列番号３５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
〔１６〕被験者から採取された生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子及びＷｎｔ遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出し、健常者の生体試料の前記メチル化領域のメチル化度と差がある場合には、前記被験者の脱毛症の発症リスクが高いと判定する、前記被験者の脱毛症の発症リスクを予測する方法。
〔１７〕被験者から採取された生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子及びＷｎｔ遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出し、健常者の生体試料の前記メチル化領域のメチル化度と差がある場合には、前記被験者の脱毛症治療及び／又は予防剤に対する応答性が高いと判定する、前記被験者の脱毛症治療及び／又は予防剤に対する応答性を予測する方法。
〔１８〕前記脱毛症治療及び／又は予防剤が、骨形成タンパク質促進剤、エフリン促進剤、Ｗｎｔ促進剤である、上記〔１７〕に記載の方法。
〔１９〕前記骨形成タンパク質促進剤及びエフリン促進剤が、６−ベンジルアミノプリンであることを特徴とする、上記〔１８〕記載の方法。
〔２０〕骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子及びＷｎｔ遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子のメチル化領域中のメチル化されている塩基を認識するプライマー及び／又はメチル化されていない塩基を認識するプライマーを含む、生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子、及びＷｎｔ遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出するためのプライマーセット。
〔２１〕前記プライマーが、下記の（Ｂ−１）〜（Ｂ−８）、（Ｄ−１）〜（Ｄ−８）、及び（Ｆ−１）〜（Ｆ−８）から選ばれる１又は２以上のプライマーである、上記〔２０〕に記載のプライマーセット。
（Ｂ−１）配列表の配列番号４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｂ−２）配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ−３）配列表の配列番号５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｂ−４）配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ−５）配列表の配列番号６に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｂ−６）配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ−７）配列表の配列番号７に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｂ−８）配列表の配列番号７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｄ−１）配列表の配列番号２０に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｄ−２）配列表の配列番号２０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｄ−３）配列表の配列番号２１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｄ−４）配列表の配列番号２１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｄ−５）配列表の配列番号２２に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｄ−６）配列表の配列番号２２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｄ−７）配列表の配列番号２３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｄ−８）配列表の配列番号２３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｆ−１）配列表の配列番号２４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｆ−２）配列表の配列番号２４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｆ−３）配列表の配列番号２５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｆ−４）配列表の配列番号２５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｆ−５）配列表の配列番号２６に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｆ−６）配列表の配列番号２６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｆ−７）配列表の配列番号２７に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｆ−８）配列表の配列番号２７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
〔２２〕上記〔２０〕又は上記〔２１〕に記載のプライマーを含む、生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子及びＷｎｔ遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出するために使用されるキット、試薬又は検出システム。
〔２３〕前記メチル化領域中メチル化領域を増幅するためのプライマーを含む、生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出するためのプライマーセット。
〔２４〕前記プライマーが、下記の（Ｇ−１）〜（Ｇ−１６）から選ばれる１又は２以上のプライマーである、上記〔２３〕に記載のプライマーセット。
（Ｇ−１）配列表の配列番号２８に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−２）配列表の配列番号２８に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−３）配列表の配列番号２９に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−４）配列表の配列番号２９に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−５）配列表の配列番号３０に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−６）配列表の配列番号３０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−７）配列表の配列番号３１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−８）配列表の配列番号３１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−９）配列表の配列番号３２に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−１０）配列表の配列番号３２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−１１）配列表の配列番号３３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−１２）配列表の配列番号３３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−１３）配列表の配列番号３４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−１４）配列表の配列番号３４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−１５）配列表の配列番号３５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−１６）配列表の配列番号３５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
〔２５〕上記〔２３〕又は上記〔２４〕に記載のプライマーを含む、生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出するために使用されるキット、試薬又は検出システム。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子、及びＷｎｔ遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出する方法が提供され、該方法は、脱毛症の発症リスクの予測や、脱毛症治療及び／又は予防薬に対する応答性の判定への応用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、実施例１の提供者Ａのメチル化増幅の結果を示す図である。
【図２】図２は、実施例１の提供者Ｂのメチル化増幅の結果を示す図である。
【図３】図３は、実施例１の提供者Ｃのメチル化増幅の結果を示す図である。
【図４】図４は、実施例１のコントロールゲノムのメチル化増幅の結果を示す図である。
【図５】図５は、実施例１の提供者Ａの非メチル化増幅の結果を示す図である。
【図６】図６は、実施例１の提供者Ｂの非メチル化増幅の結果を示す図である。
【図７】図７は、実施例１の提供者Ｃの非メチル化増幅の結果を示す図である。
【図８】図８は、実施例１のコントロールゲノムの非メチル化増幅の結果を示す図である。
【図９】図９は、実施例２の解析条件１〜５の増幅領域の配置を示す図である。
【図１０】図１０は、実施例３の提供者ＦのＥｐｈＡ４メチル化増幅の結果を示す図である。
【図１１】図１１は、実施例３の提供者ＦのＥｐｈＡ４非メチル化増幅の結果を示す図である。
【図１２】図１２は、実施例３の提供者ＧのＥｐｈＡ４メチル化増幅の結果を示す図である。
【図１３】図１３は、実施例３の提供者ＧのＥｐｈＡ４非メチル化増幅の結果を示す図である。
【図１４】図１４は、実施例３のＥｐｈＡ４のコントロールＤＮＡのメチル化増幅の結果を示す図である。
【図１５】図１５は、実施例３のＥｐｈＡ４のコントロールＤＮＡの非メチル化増幅の結果を示す図である。
【図１６】図１６は、実施例３の提供者ＦのＷｎｔ１０ｂメチル化増幅の結果を示す図である。
【図１７】図１７は、実施例３の提供者ＦのＷｎｔ１０ｂ非メチル化増幅の結果を示す図である。
【図１８】図１８は、実施例３の提供者ＧのＷｎｔ１０ｂメチル化増幅の結果を示す図である。
【図１９】図１９は、実施例３の提供者ＧのＷｎｔ１０ｂ非メチル化増幅の結果を示す図である。
【図２０】図２０は、実施例３のＷｎｔ１０ｂのコントロールＤＮＡのメチル化増幅の結果を示す図である。
【図２１】図２１は、実施例３のＷｎｔ１０ｂのコントロールＤＮＡの非メチル化増幅の結果を示す図である。
【図２２】図２２は、実施例３の提供者Ｆのβ−ｃａｔｅｎｉｎメチル化増幅の結果を示す図である。
【図２３】図２３は、実施例３の提供者Ｆのβ−ｃａｔｅｎｉｎ非メチル化増幅の結果を示す図である。
【図２４】図２４は、実施例３の提供者Ｇのβ−ｃａｔｅｎｉｎメチル化増幅の結果を示す図である。
【図２５】図２５は、実施例３の提供者Ｇのβ−ｃａｔｅｎｉｎ非メチル化増幅の結果を示す図である。
【図２６】図２６は、実施例３のβ−ｃａｔｅｎｉｎのコントロールＤＮＡのメチル化増幅の結果を示す図である。
【図２７】図２７は、実施例３のβ−ｃａｔｅｎｉｎのコントロールＤＮＡの非メチル化増幅の結果を示す図である。
【図２８】図２８は、実施例３にて増幅した領域に対応するゲノム配列とプライマーの設計領域を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の方法においては、生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子及びＷｎｔ遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出する。
【００１６】
生体試料とは、ヒト又はヒト以外の哺乳動物の身体から分離された試料を意味する。生体試料の例としては、抜去毛、血液、尿などが例示されるが、このうち抜去毛が好ましい。抜去毛とは、ヒト又はヒト以外の哺乳動物の身体から抜去（分離）された試料を意味する。身体の部位は特に限定されないが、通常は頭部である。ヒト又はヒト以外の哺乳動物が脱毛症を発症しているか否か、脱毛症のリスクがあるか否かについても特には問わない。脱毛症としては、男性型脱毛症、老人性脱毛症、薬剤に起因する脱毛症、皮膚損傷に起因する脱毛症、びまん性脱毛症（女性に多い）、皮脂の過酸化に起因する脱毛症などがある。
【００１７】
生体試料が抜去毛の場合、ヒト又はヒト以外の哺乳動物の個体の１本の毛髪であればよいが、２本以上であってもよい。通常は、５〜５０本である。２本以上の毛髪の場合は、通常は同じ個体から抜去された毛髪である。
【００１８】
毛髪は、毛根（皮膚の中に埋もれている部分）、毛包（毛根を包む鞘状の部分）、毛球（毛包の下部の球状の部分）、毛幹（皮膚の表面に出た部分）などの部位から構成される。生体試料としての抜去毛はこれらのうち１又は２以上の毛髪の部位を含むものであってもよいが、毛根を含むことが好ましい。
【００１９】
抜去毛の長さは特には限定されないが、取り扱い上の理由などにより、短く裁断されたもの（例えば５ｍｍ前後）であってもよい。また、衛生上の理由などにより、エタノールなどアルコールで洗浄しておいてもよい。
【００２０】
本発明においてメチル過度の検出対象となる遺伝子は、骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子及びＷｎｔ遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子である。
【００２１】
骨形成タンパク質受容体遺伝子とは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の受容体（ＢＭＰＲ）をコードする遺伝子を意味する。ＢＭＰＲには１型（１Ａ型、１Ｂ型）、２型などのファミリーがあるが、本発明においては１Ａ型（ＢＭＰＲ１Ａ）が好ましい。ＢＭＰＲ１Ａ遺伝子の塩基配列は、核酸データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されており、アクセス番号はＮＭ＿００４３２９である。
【００２２】
エフリン受容体遺伝子とは、エフリンの受容体（Ｅｐｈ）をコードする遺伝子を意味する。ＥｐｈはサブクラスＡ（ＥｐｈＡ）及びＢ（ＥｐｈＢ）に分類され、サブクラスＡは９種類（ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＡ１０）、サブクラスＢは５種類（ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、ＥｐｈＢ６）が知られている。本発明においては、ＥｐｈＡ４が好ましい。ＥｐｈＡ４遺伝子の塩基配列は、核酸データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されており、アクセス番号はＮＭ＿００４４３８である。
【００２３】
Ｗｎｔ遺伝子は、Ｗｎｔタンパク質をコードする遺伝子である。Ｗｎｔタンパク質は、分泌性のタンパク質群であり、発生において、体軸形成、パターン形成、細胞の運命決定や運動性の制御、細胞増殖や組織における極性支配、神経新生などを含む多様な役割を果たす。Ｗｎｔタンパク質はＷｎｔ２Ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ５Ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７Ｂ、Ｗｎｔ８Ａ、Ｗｎｔ８Ｂ、Ｗｎｔ１０Ａ、Ｗｎｔ１０Ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１４、Ｗｎｔ１４Ｂ／Ｗｎｔ１５等が知られている。本発明においてはＷｎｔ１０ｂが好ましい。 Ｗｎｔ１０ｂ遺伝子の塩基配列は、核酸データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されており、アクセス番号はＮＭ＿００３３９４である。
【００２４】
本発明においては、骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子及びＷｎｔ遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出する。メチル化度とは、メチル化の発生の度合いを意味し、メチル化された塩基の量、メチル化された塩基の数、メチル化された塩基の部位などにより表される。メチル化された塩基とは、メチル化修飾のなされた塩基（通常はシトシン）を意味する。メチル化度の検出は、メチル化度の定量、判定、検体間での比較と言い換えることも可能である。
【００２５】
本発明においてメチル化度が「高い」とは、メチル化された塩基の量が多いことを意味し、メチル化度が「低い」とは、メチル化された塩基の量が少ないことを示す。量の多少は、異なる抜去毛試料間、或いは市販のコントロールとの間で、メチル化度を比較することにより、相対的に決定されうる。
【００２６】
遺伝子中のメチル化領域とは、塩基のメチル化が生じ得る領域を意味し、通常は遺伝子内のＣｐＧアイランド（ＣｐＧサイト）を含む領域である。
【００２７】
メチル化領域の長さは特に制限はないが、通常は５塩基以上、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１００塩基以上である。上限も特に制限はないが、通常は３０００塩基以下、好ましくは２５００塩基以下、より好ましくは２１００塩基以下である。メチル化領域は、各遺伝子の一部又は全部であればよい。メチル化領域が各遺伝子の一部である場合には、通常、上述のようにＣｐＧアイランドを１つ以上含む領域が選抜される。該領域におけるＣｐＧアイランドの存在頻度は特に制限されないが、より高いことが好ましく、具体的には、１％以上、好ましくは２％以上、より好ましくは５％以上、さらにより好ましくは１０％以上であることが好ましい。また、メチル化領域は、後述するようにメチル化度の検出にあたりメチル化領域を増幅する方法を採用する場合、プライマーが設計しやすい（例えば、非特異的な増幅が起こり難い、プライマー同士の増幅やダイマーが形成されにくい、など）領域であることが好ましい。
【００２８】
ＢＭＰＲ１Ａ遺伝子の場合のメチル化領域の好ましい例としては、以下の領域が挙げられる。なお、以下の塩基番号は、ＢＭＰＲ１Ａ遺伝子の転写開始点を０とした場合の番号である。
（Ａ−１）上流−９６７ｂから−８４６ｂまでの１２１ｂ（配列表の配列番号１参照）の全部又は一部を含む領域
（Ａ−２）前記塩基配列（配列表の配列番号１参照）の全部又は一部からなる領域
（Ａ−３）上流−１０００ｂから転写開始点０までの１０００ｂ（配列表の配列番号２参照）の全部又は一部を含む領域
（Ａ−４）前記塩基配列（配列表の配列番号２参照）の全部又は一部からなる領域
（Ａ−５）上流−２０００ｂから転写開始点０までの２０００ｂ（配列表の配列番号３参照）の全部又は一部を含む領域
（Ａ−６）前記塩基配列（配列表の配列番号３参照）の全部又は一部からなる領域
（Ａ−７）上流−１，１０６ｂから−７２３ｂまでの３８４ｂ（配列表の配列番号８参照）の全部又は一部を含む領域
（Ａ−８）前記塩基配列（配列表の配列番号８参照）の全部又は一部からなる領域
（Ａ−９）上流−２４９ｂから＋６６ｂまでの３１５ｂ（配列表の配列番号９参照）の全部又は一部を含む領域
（Ａ−１０）前記塩基配列（配列表の配列番号９参照）の全部一部からなる領域
（Ａ−１１）上流−７４３ｂから−５７８ｂまでの１６６ｂ（配列表の配列番号１０参照）の全部又は一部を含む領域
（Ａ−１２）前記塩基配列（配列表の配列番号１０参照）の全部又は一部からなる領域
（Ａ−１３）下流＋６７ｂから＋３３３ｂまでの２６７ｂ（配列表の配列番号１１参照）の全部又は一部を含む領域
（Ａ−１４）前記塩基配列（配列表の配列番号１１参照）の全部又は一部からなる領域
（Ａ−１５）上流−１１０６ｂから＋３３３ｂまでの１，４３９ｂ（配列表の配列番号１２参照）の全部又は一部を含む領域
（Ａ−１６）前記塩基配列（配列表の配列番号１２参照）の全部又は一部からなる領域
（Ａ−１７）上流−２０００ｂから＋３３３ｂまでの２，３３３ｂ（配列表の配列番号１３参照）の全部又は一部を含む領域
（Ａ−１８）前記塩基配列（配列表の配列番号１３参照）の全部又は一部からなる領域
【００２９】
（Ａ−１）〜（Ａ−１８）の領域のうち、（Ａ−１）〜（Ａ−１６）の領域が好ましく、（Ａ−１）〜（Ａ−４）及び（Ａ−７）〜（Ａ−１６）の領域がより好ましく、（Ａ−１）〜（Ａ−４）及び（Ａ−７）〜（Ａ−１４）の領域がさらに好ましく、（Ａ−１）、（Ａ−２）、（Ａ−７）〜（Ａ−１４）の領域がさらにより好ましい。（Ａ−１）〜（Ａ−１８）の領域は、それぞれ、或いは組み合わせて、脱毛症リスクの遺伝子マーカーとして有用である。
【００３０】
ＥｐｈＡ４遺伝子の場合のメチル化領域の好ましい例としては、、バイサルファイト処理前のＥｐｈＡ４遺伝子のうち、以下の領域が挙げられる。なお、以下の塩基番号は、Ｅｐｈ４Ａ遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧのＡを１とした場合の番号である。
（Ｃ−１）上流−１２７ｂから＋７５ｂまでの２０２ｂ（配列表の配列番号１４参照）の全部又は一部を含む領域
（Ｃ−２）前記塩基配列（配列表の配列番号１４参照）の全部又は一部からなる領域
（Ｃ−３）上流−８００ｂから＋２００ｂまでの１０００ｂ（配列表の配列番号１５参照）の全部又は一部を含む領域
（Ｃ−４）前記塩基配列（配列表の配列番号１５参照）の全部又は一部からなる領域
（Ｃ−５）上流−１８００ｂから＋２００ｂまでの２０００ｂ（配列表の配列番号１６参照）の全部又は一部を含む領域
（Ｃ−６）前記塩基配列（配列表の配列番号１６参照）の全部又は一部からなる領域
（Ｃ−１）〜（Ｃ−６）の領域のうち、（Ｃ−１）〜（Ｃ−４）の領域が好ましく、（Ｃ−１）〜（Ｃ−２）の領域がより好ましい。（Ｃ−１）〜（Ｃ−６）の領域は、それぞれ、或いは組み合わせて、脱毛症リスクの遺伝子マーカーとして有用である。
【００３１】
Ｗｎｔ１０ｂ遺伝子の場合のメチル化領域の好ましい例としては、バイサルファイト処理前のＷｎｔ１０ｂ遺伝子のうち、以下の領域が挙げられる。なお、以下の塩基番号は、Ｗｎｔ１０ｂ遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧのＡを１とした場合の番号である。
（Ｅ−１）上流−２９５ｂから−１９０ｂまでの１０６ｂ（配列表の配列番号１７参照）の全部又は一部を含む領域
（Ｅ−２）前記塩基配列（配列表の配列番号１７参照）の全部又は一部からなる領域
（Ｅ−３）上流−１２３１ｂ（ＵＴＲ始点）から−１ｂまでの１２３１ｂ（配列表の配列番号１８参照）の全部又は一部を含む領域
（Ｅ−４）前記塩基配列（配列表の配列番号１８参照）の全部又は一部からなる領域
（Ｅ−５）上流−２０００から−１までの２０００ｂ（配列表の配列番号１９参照）の全部又は一部を含む領域
（Ｅ−６）前記塩基配列（配列表の配列番号１９参照）の全部又は一部からなる領域
（Ｅ−１）〜（Ｅ−６）の領域のうち、（Ｅ−１）〜（Ｅ−４）の領域が好ましく、（Ｅ−１）〜（Ｅ−２）の領域がより好ましい。（Ｅ−１）〜（Ｅ−６）の領域は、それぞれ、或いは組み合わせて、脱毛症リスクの遺伝子マーカーとして有用である。
【００３２】
メチル化度の検出の方法は特に限定されないが、バイサルファイト処理によることができる。バイサルファイト処理とは、生体試料のゲノムＤＮＡをバイサルファイト（亜硫酸水素塩）で処理することを意味する。バイサルファイト処理により、ＤＮＡ中の非メチル化シトシンはウラシルに変換され、メチル化シトシンは変換されずに維持される。よって、前記のバイサルファイト処理を行う場合のメチル化度の検出は、元の遺伝子と比較してウラシル（シーケンス反応上ではチミンとして表現されることもある）に置換されているか否かを判定することで、行い得る。すなわち、バイサルファイト処理後の試料のシトシンとウラシル（チミン）の量の、処理前の試料のそれらとの相違を調べることにより、メチル化度を検出できる。
【００３３】
バイサルファイト処理は、例えば、市販のキット（例えばＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｇｏｌｄ Ｋｉｔ（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ，Ｄ５００５））を用いて、キットに添付の説明書に記載の条件に従って進め得る。
【００３４】
また、生体試料のゲノムＤＮＡのうちメチル化領域を増幅する方法も例示され、前記バイサルファイト処理と組み合わせることが好ましい。
【００３５】
増幅の方法としては、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法が例示される。好ましい態様の一つとしては、メチル化及び非メチル化されている塩基を特異的にＰＣＲ法により増幅してメチル化の様子を解析する方法（メチル化特異的ＰＣＲ法、ＭＳＰ法）が好ましい。上記メチル化領域のうち、（Ａ−１）、（Ａ−２）、（Ｃ−１）、（Ｃ−２）、（Ｅ−１）及び（Ｅ−２）の解析にはＭＳＰ法を利用することが好ましい。
【００３６】
ＭＳＰ法を用いる場合、増幅に用いるプライマー（プライマーセット）は、メチル化領域を増幅可能なように設計され得る。すなわち例えば、メチル化領域の５´末端側の部分の塩基配列と３´末端側の部分の塩基配列、さらにこれらの部分に相補的な塩基配列にハイブリダイズできるような塩基配列を適宜設計することができる。このうち、メチル化されている塩基を認識するプライマー（メチル化プライマー）及び／又はメチル化されていない塩基を認識するプライマー（非メチル化プライマー）を用いることが好ましく、これら両方を用いることがより好ましい。メチル化プライマーを用いて増幅すると、メチル化されている塩基を含む領域を増幅することができ、非メチル化プライマーを用いて増幅すると、メチル化されていない塩基を含む領域を増幅することができるので、それぞれのプライマーによる増幅量をハイブリダイゼーションなどにより容易に確認することができる。
【００３７】
メチル化プライマーは、メチル化領域を含む領域の少なくとも一部の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を含むものとして設計され得る。非メチル化プライマーは、メチル化領域を含む領域に含まれるＣｐＧサイト中のシトシンをウラシル（又はチミン）に置き換えた配列又はこれに相補的な塩基配列を含むものとして設計され得る。プライマーの長さは特には限定されないが、通常は８〜５０塩基、好ましくは１０〜４０塩基、より好ましくは１５〜３０塩基である。
【００３８】
ＭＳＰ法におけるプライマーの好ましい例としては以下のものが挙げられる：配列表の配列番号４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｂ−１）；配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｂ−２）；配列表の配列番号５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｂ−３）；配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｂ−４）；配列表の配列番号６に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｂ−５）；配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｂ−６）；配列表の配列番号７に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｂ−７）；配列表の配列番号７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｂ−８）。前記ポリヌクレオチドのうち、（Ｂ−１）、（Ｂ−２）、（Ｂ−３）及び（Ｂ−４）はメチル化プライマーであり、（Ｂ−５）、（Ｂ−６）、（Ｂ−７）及び（Ｂ−８）は非メチル化プライマーである。（Ｂ−１）〜（Ｂ−８）のプライマーは、前記した配列番号１に記載の塩基配列を含む領域（Ａ−１）、又は配列番号１に記載の塩基配列からなる領域（Ａ−２）の増幅に用いられ得る。すなわち、（Ｂ−１）〜（Ｂ−８）のプライマーは、配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１〜２３番目の領域、及び塩基番号９７〜１２１番目の領域にアニールし得る。
【００３９】
また、ＭＳＰ法におけるプライマーの好ましい例としては以下のものが挙げられる：配列表の配列番号２０に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｄ−１）；配列表の配列番号２０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｄ−２）；配列表の配列番号２１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｄ−３）；配列表の配列番号２１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｄ−４）；配列表の配列番号２２に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｄ−５）；配列表の配列番号２２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｄ−６）；配列表の配列番号２３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｄ−７）；配列表の配列番号２３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｄ−８）。前記ポリヌクレオチドのうち、（Ｄ−１）、（Ｄ−２）、（Ｄ−３）及び（Ｄ−４）は非メチル化プライマーであり、（Ｄ−５）、（Ｄ−６）、（Ｄ−７）及び（Ｄ−８）はメチル化プライマーである。（Ｄ−５）〜（Ｄ−８）のプライマーは、前記した配列番号１４に記載の塩基配列を含む領域（Ｃ−１）、又は配列番号１４に記載の塩基配列からなる領域（Ｃ−２）の増幅に用いられ得る。すなわち、（Ｄ−５）〜（Ｄ−８）のプライマーは、配列番号１４に記載の塩基配列のうち塩基番号１〜２０番目の領域、及び塩基番号１７８〜２０２番目の領域にアニールし得る。また、（Ｄ−１）〜（Ｄ−４）のプライマーは、配列番号４３に記載の塩基配列（ＥｐｈＡ４の翻訳開始コドンＡを１としたときの、上流−１２７〜＋７３までの２００ｂ）のうち塩基番号１〜２０番目の領域、及び塩基番号１７４〜２００番目の領域にアニールし得る（図２８）。
【００４０】
さらに、ＭＳＰ法におけるプライマーの好ましい例としては、以下のものが挙げられる：配列表の配列番号２４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｆ−１）；配列表の配列番号２４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｆ−２）；配列表の配列番２５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｆ−３）；配列表の配列番号２５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｆ−４）；配列表の配列番号２６に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｆ−５）；配列表の配列番号２６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｆ−６）；配列表の配列番号２７に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｆ−７）；配列表の配列番号２７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｆ−８）。前記ポリヌクレオチドのうち、（Ｆ−１）、（Ｆ−２）、（Ｆ−３）及び（Ｆ−４）は非メチル化プライマーであり、（Ｆ−５）、（Ｆ−６）、（Ｆ−７）及び（Ｆ−８）はメチル化プライマーである。（Ｆ−１）〜（Ｆ−８）のプライマーは、前記した配列番号１７に記載の塩基配列を含む領域（Ｅ−１）、又は配列番号１７に記載の塩基配列からなる領域（Ｅ−２）の増幅に用いられ得る。すなわち、（Ｆ−１）〜（Ｆ−４）のプライマーは、配列番号１７に記載の塩基配列の塩基番号１〜３０番目の領域、及び塩基番号９０〜１０６番目の領域にアニールし得る。（Ｆ−１）〜（Ｆ−４）のプライマーは、配列番号４２に記載の塩基配列（Ｗｎｔ１０ｂ（ＮＭ＿００３３９４）の翻訳開始コドンのＡを１とした場合の上流−２９７ｂから−１８４ｂまでの１１４ｂ）の塩基番号１〜３３番目の領域、及び塩基番号９１〜１１４番目の領域にアニールし得る（図２８）。
【００４１】
一方、生体試料のゲノムＤＮＡのうちメチル化領域を増幅する方法としては、上述のＭＳＰ法と並んで本発明におけるメチル化解析の好ましい態様の一つである。バイサルファイトシーケンス法とは、バイサルファイト処理がなされたゲノムＤＮＡのうちメチル化領域を含む領域を、通常のＰＣＲにより増幅し、増幅産物のシーケンスを行い、得られるシーケンスデータ中のメチル化部位を解析する方法である。上記メチル化領域のうち、（Ａ−７）〜（Ａ−１４）の解析には、バイサルファイトシーケンス法によることが好ましい。
【００４２】
バイサルファイトシーケンス法に用いるプライマーの別の好ましい例としては、以下のものが挙げられる：配列表の配列番号２８に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｇ−１）；配列表の配列番号２８に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｇ−２）；配列表の配列番号２９に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｇ−３）；配列表の配列番号２９に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｇ−４）配列表の配列番号３０に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｇ−５）；配列表の配列番号３０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｇ−６）；配列表の配列番号３１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｇ−７）；配列表の配列番号３１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｇ−８）；配列表の配列番号３２に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｇ−９）；配列表の配列番号３２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｇ−１０）；配列表の配列番号３３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｇ−１１）；配列表の配列番号３３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｇ−１２）；配列表の配列番号３４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｇ−１３）；配列表の配列番号３４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｇ−１４）；配列表の配列番号３５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｇ−１５）；配列表の配列番号３５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｇ−１６）。（Ｇ−１）〜（Ｇ−４）のプライマーは、前記した配列番号８に記載の塩基配列を含む領域（Ａ−７）、又は配列番号８に記載の塩基配列からなる領域（Ａ−８）の増幅に用いられ得る。（Ｇ−５）〜（Ｇ−８）のプライマーは、前記した配列番号９に記載の塩基配列を含む領域（Ａ−９）、又は配列番号９に記載の塩基配列からなる領域（Ａ−１０）の増幅に用いられ得る。（Ｇ−９）〜（Ｇ−１２）のプライマーは、前記した配列番号１０に記載の塩基配列を含む領域（Ａ−１１）、又は配列番号１０に記載の塩基配列からなる領域（Ａ−１２）の増幅に用いられ得る。（Ｇ−１３）〜（Ｇ−１６）のプライマーは、前記した配列番号１１に記載の塩基配列を含む領域（Ａ−１１）、又は配列番号１０に記載の塩基配列からなる領域（Ａ−１２）の増幅に用いられ得る。
【００４３】
上記（Ｂ−１）〜（Ｂ−８）、（Ｄ−１）〜（Ｄ−８）、（Ｆ−１）〜（Ｆ−８）、（Ｇ−１）〜（Ｇ−１６）のプライマーには、前記メチル化領域を増幅可能な範囲での改変を加えたもの、すなわち例えば、数塩基程度（例えば１〜３塩基、好ましくは１塩基程度）の欠失、付加、置換、挿入等をしたものも含まれる。
【００４４】
生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子及びＷｎｔ遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出するにあたり、通常は前処理として、生体試料のゲノムＤＮＡを抽出する。抽出法は常法によることができ、市販キット（例えばＩＳＯＨＡＩＲ（ニッポンジーン、３１９−０３４０１））を用いて、前記キットの説明書に記載の条件に従って行い得る。ゲノムＤＮＡについては、必要に応じて、制限酵素による断片化、精製（タンパク質の除去）など、遺伝子解析の際の一般的な前処理を行い得る。制限酵素は適切なもの（例えばＢａｍＨＩ）を適宜選択して用い得る。精製は、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール、エタノールなどの溶媒で抽出して行うことができる。
【００４５】
メチル化度の解析にあたり、公開ウェブサイトＱＵＭＡ（Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｏｏｌ ｆｏｒ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ，ｈｔｔｐ：／／ｑｕｍａ．ｃｄｂ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ｔｏｐ／ｉｎｄｅｘ＿ｊ．ｈｔｍｌ）等の解析サイトを利用してもよい。また、ゲル電気泳動後に染色し、バンドの発光強度を比較してもよい。
【００４６】
なお、メチル化度の検出の方法は、上述したバイサルファイト法やメチル化領域の増幅に限定されず、メチル化領域の塩基配列のシークエンサーによる決定、制限酵素の特異的認識配列を利用したＣＯＢＲＡ（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）法などによってもよい。
【００４７】
本発明の方法は、脱毛症の発症リスクの予測に用いることができる。すなわち、被験動物（ヒト又はヒト以外の哺乳動物）の生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子及びＷｎｔ遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出し、健常者の生体試料の前記メチル化度と差がある場合には、前記被験者の脱毛症の発症リスクが高いと判定することができる。
【００４８】
脱毛症の発症リスクの予測とは、まだ脱毛症を発症していない被験者が、将来脱毛症を発症するリスクを有しているか否かを予測することを意味する。健常者の生体試料の前記メチル化度との間で「差がある」とは、被験者のメチル化度を分子に、健常者のメチル化度を分母にして両者の比を算出した場合に、その比が０．８以下、ないしは１．２以上となる場合において差があることを意味する。上記比は、０．７以下ないしは１．３以上であることが好ましく、０．６以下ないしは１．４以上であることがより好ましい。メチル化領域が（Ａ−１）、（Ａ−２）、（Ａ−７）〜（Ａ−１０）、（Ｃ−１）、（Ｃ−２）、（Ｅ−１）及び（Ｅ−２）の場合には、被験者について測定されたメチル化度が、健常者のメチル化度よりも高い場合には脱毛症の発症リスクが高いと予測され、メチル化度が低い場合には脱毛症の発症リスクが低いと予測される。メチル化領域が（Ａ−１１）〜（Ａ−１４）の場合には、被験者について測定されたメチル化度が、健常者の同様のメチル化領域のメチル化度よりも低い場合には脱毛症の発症リスクが高いと予測され、高い場合には脱毛症の発症リスクが低いと予測される。なお、被験者が高齢（例えば４０代以上）の場合には、低年齢の場合よりも、健常者との比較においてメチル化度に差がある傾向にあるので、脱毛症の発症リスクの予測の際には、被験者の年齢をある程度考慮する必要がある。
【００４９】
脱毛症の発症リスク予測における被験者は特に限定されないが、目的を考慮すると、脱毛症をまだ発症していないヒト（通常は男性）が適当である。健常者とは、脱毛症の兆候がないヒト（性別は問わない）が適当である。加齢により遺伝子のメチル化が亢進される可能性があり、中でもＢＭＰＲ１Ａ遺伝子においてその傾向が強いため、健常者は高齢者でない（例えば３０代以下、好ましくは２０代以下）であることが好ましい。健常者のメチル化領域のメチル化度は、予め測定しておくことが好ましい。
【００５０】
また、本発明の方法は、脱毛症治療及び／又は予防薬、中でも骨形成タンパク質促進剤（ＢＭＰ促進剤：ＢＭＰの産生を促進する成分）、エフリン促進剤（エフリンの産生を促進する成分）、及びＷｎｔ促進剤（Ｗｎｔの産生を促進する成分）に対する応答性の判定に用いることができる。すなわち、被験者に脱毛症治療及び／又は予防薬を投与し、毛髪試料を採取し、前記毛髪試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子及びＷｎｔ遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出し、健常者の生体試料の前記メチル化領域のメチル化度と差がある場合には、前記被験者の前記脱毛症治療及び／又は予防薬に対する応答性があると判定することができる。メチル化領域が上記（Ａ−１）、（Ａ−２）、（Ａ−７）〜（Ａ−１０）の場合には、被験者について測定されたメチル化度が、健常者のメチル化度よりも高い場合には、ＢＭＰ促進剤に対する応答性が高い（ＢＭＰ促進剤を投与した場合の治療効果が期待される）と判定され、メチル化度が低い場合には、ＢＭＰ促進剤に対する応答性が低い（ＢＭＰ促進剤を投与した場合にも治療効果が期待されない）と判定される。メチル化領域が（Ａ−１１）〜（Ａ−１４）の場合には、被験者について測定されたメチル化度が、健常者の同様のメチル化領域のメチル化度よりも低い場合には、ＢＭＰ促進剤に対する応答性が高いと予測され、高い場合にはＢＭＰ促進剤に対する応答性が低いと予測される。メチル化領域が上記（Ｃ−１）、（Ｃ−２）の場合には、被験者について測定されたメチル化度が、健常者のメチル化度よりも高い場合には、エフリン促進剤に対する応答性が高い（エフリン促進剤を投与した場合の治療効果が期待される）と判定され、メチル化度が低い場合には、エフリン促進剤に対する応答性が低い（エフリン促進剤を投与した場合にも治療効果が期待されない）と判定される。
【００５１】
薬剤応答性の判定における被験者は特に限定されないが、脱毛症の兆候があるヒト、脱毛症を発症しているヒト、或いは脱毛症を近い将来発症すると予測されるヒトが適当であり、通常は男性である。健常者とは、脱毛症の兆候がないヒト（性別は問わない）が適当である。加齢により遺伝子のメチル化が亢進される可能性があり、中でもＢＭＰＲ１Ａ遺伝子においてその傾向が強いため、健常者は高齢者でない（例えば３０代以下、好ましくは２０代以下）であることが好ましい。健常者のメチル化領域のメチル化度は、予め測定しておくことが好ましい。
【００５２】
脱毛症治療及び／又は予防薬としてはＢＭＰ促進剤、エフリン促進剤、及びＷｎｔ促進剤が好ましいが、これに限定されず、本メチル化領域の脱メチル化剤などが例示される。ＢＭＰ促進剤については、ＢＭＰＲ遺伝子の被験者のメチル化度が健常者のメチル化度と差がある場合、発毛因子であるＢＭＰ遺伝子とのシグナル伝達が阻害されている可能性があり、その治療にはＢＭＰ促進剤が効果を奏するものと推測される。エフリン促進剤については、エフリン受容体遺伝子のメチル化度が高い場合、発毛因子であるエフリン遺伝子とのシグナル伝達が阻害されている可能性があり、その治療にはエフリン促進剤が効果を奏するものと推測される。ＢＭＰ促進剤及びエフリン促進剤としては、６−ベンジルアミノプリンが例示される。
【００５３】
前述した、骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子、及びＷｎｔ遺伝子のメチル化領域中のメチル化されている塩基を認識するプライマー（メチル化プライマー）及び／又はメチル化されていない塩基を認識するプライマー（非メチル化プライマー）及び／又はメチル化領域のメチル化度を検出するためのプライマー、好ましくは（Ｂ−１）〜（Ｂ−８）、（Ｄ−１）〜（Ｄ−８）、（Ｆ−１）〜（Ｆ−８）から選ばれる１又は２以上のプライマーは、生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子、及びＷｎｔ遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出するために使用されるキット、試薬又は検出システムに含まれる一つとしても有用である。また、骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子、及びＷｎｔ遺伝子のメチル化領域を増幅するプライマー、好ましくは（Ｇ−１）〜（Ｇ−１６）から選ばれる１又は２以上のプライマーは、生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子、及びＷｎｔ遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出するために使用されるキット、試薬又は検出システムに含まれる一つとしても有用である。係るキット、試薬又は検出システムは、脱毛症の発症リスクの予測や、骨形成タンパク質促進剤、エフリン促進剤、及びＷｎｔ促進剤に対する応答性の予測のために用いることができる。係るキット、試薬又は検出システムは、必要に応じて、容器、酵素、その他検出のために用いる各種試薬等を含んでいてもよい。
【実施例】
【００５４】
実施例１
（１）ゲノムＤＮＡの抽出
ゲノム提供者Ａ（２０代男性、男性型脱毛症進行者）、Ｂ（２０代男性、脱毛症の兆候なし）及びＣ（４０代男性、脱毛症の兆候なし）の３名の頭部から毛髪５本を抜き、エタノールにて洗浄した。毛髪のうち毛根約２ｃｍを５ｍｍ程度に裁断し、ＩＳＯＨＡＩＲ（ニッポンジーン、３１９−０３４０１）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。詳細な操作は、ＩＳＯＨＡＩＲ添付のプロトコールに従った。
【００５５】
得られたゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩにて断片化し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール、エタノールにて精製した。２６０ｎｍの吸光度の値からＤＮＡ濃度を測定し、２００ｎｇの断片化ゲノムＤＮＡを対象に、バイサルファイト処理（非メチル化シトシンをウラシルに変換する処理）を行った。バイサルファイト処理は、ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｇｏｌｄ Ｋｉｔ（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ，Ｄ５００５）を用い、詳細な操作は添付のプロトコールに従った。
【００５６】
（２）メチル化／非メチル化特異的ＰＣＲ
ＢＭＰＲ１Ａ遺伝子（ＮＭ＿００４３２９）の転写開始点を０とし、上流−９６７ｂより−８４６ｂまでの領域（配列番号１参照）を増幅できるようなプライマーを設計した。上記領域はＣｐＧアイランドを一部に含んでいる。プライマーとしては、ＣｐＧアイランドのメチル化シトシンを認識するプライマー（メチル化プライマー）と、メチル化されていないシトシンを認識するプライマー（非メチル化プライマー）を、それぞれ設計した。プライマーの塩基配列を表１に示す。表１中、太字は上記領域のＣｐＧアイランドに相当する部分を、傍点は同領域のメチル化シトシンに相当する部分を意味する。
【００５７】
【表１】
【００５８】
本プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。具体的には、メチル化プライマー及び非メチル化プライマーのそれぞれについて、以下の組成のＰＣＲ反応液を調製し、９５℃、３０秒間の熱処理後、熱変性（９４℃、３０秒）→アニーリング（メチル化プライマー：５７．４℃、非メチル化プライマー：５６．０℃、いずれも３０秒）→伸長（７２℃、３０秒）の３ステップを、メチル化プライマーを用いた場合は３５回、非メチル化プライマーを用いた場合は３０回繰り返した。なお、メチル化プライマーを用いたＰＣＲ反応をメチル化増幅、非メチル化プライマーを用いたＰＣＲ反応を非メチル化増幅とする。
【００５９】
またメチル化／非メチル化特異的な増幅が行われているかどうかを確認する目的で、メチル化／非メチル化コントロールゲノム（ＥｐｉＴｅｃｔ ＰＣＲ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＤＮＡ，ＱＩＡＧＥＮ，５９６９５）を用いて同様にＰＣＲを行った。
【００６０】
ＰＣＲ反応液組成
ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ＨＳ（タカラバイオ、ＲＲ００６Ａ） ０．１μＬ
１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ） ２ μＬ
ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（タカラバイオ） １．６μＬ
プライマー（１０ｐｍｏｌ ｅａｃｈ／μＬ） ０．８μＬ
ゲノムＤＮＡ（（１）にて調製） ２．５μＬ
蒸留水（ＤＷ） １３μＬ
（合計 ２０μＬ）
【００６１】
ＰＣＲ後の増幅産物を、２．５％アガロースゲルに電気泳動し、ゲルスター（タカラバイオ）溶液中でＤＮＡを染色した。ＵＶ照射により発光するバンドの強度を比較分析した。結果を表２及び図１〜図８に示す。なお、表２に示すバンド強度は、バンドの発光強度をゲル解析ソフトＬａｂｗｏｒｋｓにより数値化したものである。
【００６２】
メチル化増幅、非メチル化増幅のいずれの場合にも、バンド強度に個人差が認められた。具体的には、２０代男性同士（被験者Ａと被験者Ｂ）の比較では、脱毛症進行者である被験者Ａにおいて、メチル化増幅ではバンドが観察され非メチル化増幅ではバンドがほとんど見えなかったことから（図１、図５、表２）、メチル化の傾向が強く同時に非メチル化が弱い傾向であった。一方、脱毛症が認められなかった被験者Ｂと被験者Ｃの比較では、メチル化増幅では被験者Ｃにおいて増幅産物のバンドが多少ではあるが観察されたが（図３）、被験者ＢではＢ１のレーンで薄いバンドが観察されたのみで、Ｂ２のレーンでは観察されなかった（図２）。これに対し、非メチル化増幅では被験者Ｃよりも被験者Ｂにおいて比較的はっきりとしたバンドが観察された（図６、図７）。このことから、脱毛症が認められない者同士の比較では、加齢によりメチル化の傾向が強く、非メチル化の傾向が弱いことが判明した。
【００６３】
【表２】
【００６４】
実施例２
（１）ゲノムＤＮＡの抽出
ゲノム提供者Ｄ（２０代男性、男性型脱毛症進行者）及びＥ（２０代男性、脱毛症の兆候なし）の頭部から毛髪５本を抜き、エタノールにて洗浄した。毛髪のうち毛根約２ｃｍを５ｍｍ程度に裁断し、ＩＳＯＨＡＩＲ（ニッポンジーン、３１９−０３４０１）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。詳細な操作は、ＩＳＯＨＡＩＲ添付のプロトコールに従った。
【００６５】
得られたゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩにて断片化し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール、エタノールにて精製した。２６０ｎｍの吸光度の値からＤＮＡ濃度を測定し、２００ｎｇの断片化ゲノムＤＮＡを対象に、バイサルファイト処理（非メチル化シトシンをウラシルに変換する処理）を行った。バイサルファイト処理は、ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｇｏｌｄ Ｋｉｔ（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ，Ｄ５００５）を用い、詳細な操作は添付のプロトコールに従った。
【００６６】
（２）バイサルファイトシーケンス法
ＢＭＰＲ１Ａ（ＮＭ＿００４３２９）の転写開始点を０とし、上流−１，２００ｂから＋４００ｂまでの領域を対象としたバイサルファイトシーケンス条件を５つ設定した（図９）。各条件に対応するプライマーを設計した。バイサルファイトシーケンス条件の詳細及びプライマーの配列を表３に示す。
【００６７】
【表３】
【００６８】
バイサルファイトシーケンスは、（２−１）ＰＣＲ、（２−２）クローニング、（２−３）シーケンス及び（２−４）データ解析の順に実施した。
【００６９】
（２−１）ＰＣＲ
表１に示すプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。具体的には、以下の組成のＰＣＲ反応液を調製し、９５℃、３０秒間の熱処理後、熱変性（９４℃、３０秒）→アニーリング（５７℃〜６５℃）→伸長（７２℃、３０秒）の３ステップを４０回繰り返した。
【００７０】
〔ＰＣＲ反応液組成〕
ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ＨＳ（タカラバイオ、ＲＲ００６Ａ） ０．２μＬ
１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ、ＲＲ００６Ａ） ６ μＬ
ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（タカラバイオ、ＲＲ００６Ａ） ４．８μＬ
センスプライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ） ３ μＬ
アンチセンスプライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ） ３ μＬ
ゲノムＤＮＡ（（１）にて調製） ２ μＬ
ＤＷ（蒸留水） ４１ μＬ
（合計 ６０ μＬ）
【００７１】
（２−２）クローニング
（ａ）ＤＮＡ精製
（２−１）で得られたＰＣＲ産物を２．５％アガロース（タカラバイオ、５００３）電気泳動し、ゲルスター（タカラバイオ、Ｆ０５３５）で染色した後、目的のバンドを切り出した。これを細かく裁断し、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｐｒｅｐ Ｆｒｅｅｚｅ’Ｎ Ｓｑｕｅｅｚｅ ＤＮＡ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（ＢＩＯＲＡＤ、７３２−６１６６）のフィルターカップに充填した。−２０℃に５分間以上放置し、室温にて１３，０００×ｇ、３分間遠心分離した。フィルターカップを通過して溶出したＤＮＡ溶液に、１００％エタノールを２．５倍量、３Ｍ酢酸ナトリウムを１／１０倍量添加し、−８０℃に１５分間放置した。１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、得られた白色ペレットを７０％エタノールで洗浄後、１７μＬの蒸留水（以下、ＤＷと言う）に溶解した。
【００７２】
（ｂ）ライゲーション
（ａ）で精製したＤＮＡ溶液の全量を用いて、ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応は、Ｍｉｇｈｔｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｅｔ（Ｂｌｕｎｔ ＥｎｄＩ）（タカラバイオ、６０２７）を用いて行った。精製ＤＮＡ溶液（１７μＬ）に１０×Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｎａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを２μＬ、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｎａｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘを１μＬ添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。この反応液にＤＷを８０μＬ添加して全量１００μＬとした後、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１、ｖ／ｖ）（ＧＩＢＣＯ，１５５９３−０３１）を１００μＬ添加して、混合した。室温で１２，０００ｒｐｍ、５分間遠心操作を行い、ＤＮＡを含む上層を採取した。
【００７３】
１００％エタノールを２．５倍量、３Ｍ酢酸ナトリウムを１／１０倍量添加し、−８０℃に１５分間放置した。１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、得られた白色ペレットを７０％エタノールで洗浄後、１０μＬのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０、ナカライテスク、３２７３９−３１）に溶解した。
【００７４】
（ｃ）トランスフォーメーション
（ｂ）で得られたＤＮＡ溶液５μＬに、ｐＵＣ１１８ ＨｉｎｃＩＩ／ＢＡＰを１μＬ加え、混合した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘを６μＬ加え混合した後、１６℃で１時間インキュベートした。この６μＬを、５０μＬのＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ（タカラバイオ、９０５２）に加え、穏やかに混合した後、氷中で３０分間放置した。その後４２℃で４５秒間インキュベートし、氷中２分間放置した。そこに、あらかじめ３７℃に保温しておいたＳＯＣ培地を４４４μＬ添加し、３７℃で１時間振とうした。アンピシリン（Ｓｉｇｍａ、Ａ９３９３）を５０μｇ／ｍＬ含むＬＢ寒天培地（９０ｍｍ ｄｉｓｈ）に３０μＬ播種し、３７℃で一昼夜培養した。得られたコロニーについてコロニーＰＣＲを実施し、インサートの確認を行った。
【００７５】
（ｄ）プラスミド抽出
プラスミドの抽出は、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，２７１０６）を用いて行った。コロニーＰＣＲにてインサートが確認されたコロニーを、アンピシリンを５０μｇ／ｍＬ含む２．５ｍＬ ＬＢ培地に加え、３７℃で一昼夜振とう培養した。得られた菌液を６，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、上清を除去して、菌ペレットを得た。ここに２５０μＬのＢｕｆｆｅｒ Ｐ１を加えて懸濁の後、２ｍＬマイクロチューブに移した。２５０μＬのＢｕｆｆｅｒ Ｐ２を加え、４〜６回転倒混和し、３５０μＬのＢｕｆｆｅｒ Ｎ３を加えて、さらに４〜６回転倒混和した。１３，０００ｒｐｍにて１０分間遠心操作し、白色ペレットを除いた上清をＱＩＡｐｒｅｐスピンカラムにアプライした。１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、カラム透過液を除去した。
【００７６】
ここに５００μＬのＢｕｆｆｅｒ ＰＢを添加し、遠心分離して透過液を除去した。さらにカラムに７５０μＬのＢｕｆｆｅｒ ＰＥを加え、遠心分離して透過液を除去した。残留しているバッファーを除去するため、再度遠心操作を行った後、カラムを１．５ｍＬコレクションチューブに移した。Ｂｕｆｆｅｒ ＥＢを５０μＬ加え、１分間放置した後、遠心分離にてカラムより溶出してきた液をプラスミド溶液として回収した。このプラスミド溶液に、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール精製、エタノール精製を行い、２０μＬのＤＷに溶解して、その後のシーケンスに用いた。
【００７７】
（２−３）シーケンス
（２−２）で得られたプラスミドについて、インサート（解析対象領域）のシーケンスを行った。シーケンスにはタカラバイオのプレミックスシーケンスを利用した。シーケンス用プライマーには、Ｍ１３ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍ４（５’−ＧＴＴＴＴ ＣＣＣＡＧ ＴＣＡＣＧ ＡＣ−３’、配列番号４４）を用いた。全量１５μＬに、プラスミドＤＮＡが約３００〜６００ｎｇ、プライマーが７．５ｐｍｏｌ含まれるように調整し、タカラバイオに送付した。
【００７８】
（２−４）データ解析
（２−３）で得られたシーケンス結果の解析は、バイサルファイトシーケンスデータの解析が容易に行える公開ウェブサイトＱＵＭＡ（Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｏｏｌ ｆｏｒ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ，ｈｔｔｐ：／／ｑｕｍａ．ｃｄｂ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ｔｏｐ／ｉｎｄｅｘ＿ｊ．ｈｔｍｌ）を利用した。各サンプル２４個前後のクローンのシーケンス結果を用いて解析を行ったが、解析対象として不適切な配列である場合は、解析対象から除外した。その際の判断基準は、（１）バイサルファイト処理による未変換Ｃが５以下であること、（２）バイサルファイト処理による変換Ｃが９５％以上であること、（３）ミスマッチ配列が１０以下であること、及び（４）配列同一性が９０％以上であること、とした。
【００７９】
結果を表４に示す。
【００８０】
【表４】
【００８１】
解析対象領域１及び４では、被験者Ｄ（脱毛症兆候者）で被験者Ｅ（脱毛症の兆候なし）よりもメチル化度が高かった。一方、解析領域２及び５では、被験者Ｄ（脱毛兆候者）で被験者Ｅ（脱毛症の兆候なし）よりメチル化度が低かった。一方、解析対象領域３では、被験者同士での差は見出せなかった。
【００８２】
実施例３
（１）ゲノムＤＮＡの抽出
ゲノム提供者Ｆ（２０代男性、男性型脱毛兆候者）、Ｇ（２０代男性、脱毛症の兆候なし）の頭部から毛髪５本を抜き、エタノールにて洗浄した。毛根約２ｃｍを５ｍｍ程度に裁断し、ＩＳＯＨＡＩＲ（ニッポンジーン、３１９−０３４０１）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。詳細な操作は、ＩＳＯＨＡＩＲ添付のプロトコルに従った。
【００８３】
得られたゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩにて断片化し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール、エタノールにて精製した。２６０ｎｍの吸光度の値からＤＮＡ濃度を測定し、２００ｎｇの断片化ゲノムＤＮＡを対象に、バイサルファイト処理（非メチル化シトシンをウラシルに変換する処理）を行った。バイサルファイト処理は、ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｇｏｌｄ Ｋｉｔ（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ，Ｄ５００５）を用い、詳細な操作は添付のプロトコールに従った。
【００８４】
（２）メチル化／非メチル化特異的ＰＣＲ
ＥｐｈＡ４（ＮＭ＿００４４３８）の翻訳開始コドンＡを１とした場合の、上流−１２７から＋７５までを増幅するプライマーを設計した。プライマーには本領域のＣｐＧ領域を含み、このＣｐＧ領域のメチル化シトシンを認識するメチル化プライマーと、メチル化されていないシトシンを認識する非メチル化プライマーをそれぞれ設計した（図２８）。図２８の下線部分は各プライマーに対応する配列領域を示す。プライマーの配列を表５に示す。
【００８５】
また、Ｗｎｔ１０ｂ（ＮＭ＿００３３９４）の翻訳開始コドンＡを１とした場合の、上流−２９５から−１９０までを増幅するプライマーを設計した。プライマーには本領域のＣｐＧ領域を含み、このＣｐＧ領域のメチル化シトシンを認識するメチル化プライマーと、メチル化されていないシトシンを認識する非メチル化プライマーをそれぞれ設計した。プライマーの配列を表５に示す。
さらに、コントロールとしてのβ−ｃａｔｅｎｉｎの解析用に、ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ（ＮＭ＿００１０９８２０９）の翻訳開始コドンＡを１とした場合の、−８１３ｂから−７０５ｂまでを対象としたプライマーを設計した。
【００８６】
【表５】
【００８７】
本プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。具体的には以下の組成のＰＣＲ反応液を調製し、９４℃、５分間の熱処理後、熱変性（９４℃、１５秒）→アニーリング（ＥｐｈＡ４ 非メチル化プライマー：５１℃、メチル化プライマー：５６℃ Ｗｎｔ１０ｂ 非メチル化プライマー：６０℃、メチル化プライマー：５８℃、いずれも３０秒）→伸長（７２℃、１５秒）の３ステップを４０回繰り返した。
【００８８】
〔ＰＣＲ反応液組成〕
酵素（ＴＡＫＡＲＡ ＥｘＴａｑ ＨＳ：タカラバイオ、又はＨｓ ＳｔａｒＴａｑ ｐｌｕｓ：ＱＩＡＧＥＮ） ０．１μＬ
１０×ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｆ ２ μＬ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ １．６μＬ
プライマー Ｆｏｒｗａｒｄ（０．５６ ｐｍｏｌ／μＬ） ６．５μＬ
プライマー Ｒｅｖｅｒｓｅ（０．５６ｐｍｏｌ／μＬ） ６．５μＬ
バイサルファイト処理ＤＮＡ（（１）にて調製） ０．３μＬ
滅菌水 １０．５μＬ
（合計 ２０ μＬ）
【００８９】
またメチル化／非メチル化特異的な増幅が行われているかどうかを確認する目的で、メチル化／非メチル化コントロールゲノム（ＥｐｉＴｅｃｔ ＰＣＲ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＤＮＡ，ＱＩＡＧＥＮ，５９６９５）を用いて同様にＰＣＲを行った。
【００９０】
ＰＣＲ後の増幅産物を、２．５％アガロースゲルに電気泳動し、ゲルスター（タカラバイオ）溶液中でＤＮＡを染色した。ＵＶ照射により発光するバンドの強度を比較分析した。ＥｐｈＡ４のメチル化解析結果を表６及び図１０〜図１５に、それぞれ示す。Ｗｎｔ１０ｂのメチル化解析結果を表７及び図１６〜図２１に、それぞれ示す。またβ−ｃａｔｅｎｉｎのメチル化解析の結果を表８及び図２２〜図２７に、それぞれ示す。
【００９１】
ＥｐｈＡ４、Ｗｎｔ１０ｂ両方共に、被験者Ｆ（脱毛症兆候あり）において、被験者Ｇ（脱毛症兆候なし）よりもメチル化度が高いことが明らかになった。一方で発毛因子のひとつであるβ−ｃａｔｅｎｉｎのメチル化状態は、被験者Ｆ及びＧともに完全な非メチル化状態であることが明らかとなった。
【００９２】
【表６】
【００９３】
【表７】
【００９４】
【表８】
【符号の説明】
【００９５】
図４と８中のＭとＵは、それぞれ、メチル化コントロールゲノムを鋳型とした場合の増幅産物、非メチル化コントロールゲノムを鋳型とした場合の増幅産物の結果を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００９６】
配列番号１〜３及び８〜１３：骨形成タンパク質受容体遺伝子のメチル化領域の塩基配列の例
配列番号４〜７：骨形成タンパク質受容体遺伝子のメチル化及び非メチル化プライマーの塩基配列の例
配列番号１４〜１６：エフリン受容体遺伝子のメチル化領域の塩基配列の例
配列番号１７〜１９：Ｗｎｔ遺伝子のメチル化領域の塩基配列の例
配列番号２０〜２３：エフリン受容体遺伝子のメチル化及び非メチル化プライマーの例
配列番号２４〜２７：Ｗｎｔ遺伝子のメチル化及び非メチル化プライマーの例
配列番号２８〜３５：骨形成タンパク質受容体遺伝子のバイサルファイトシーケンス用プライマーの塩基配列の例
配列番号３６〜３７：実施例２で用いた骨形成タンパク質受容体遺伝子のバイサルファイトシーケンス用プライマーの塩基配列の例
配列番号３８〜４１：実施例３で用いたβ−カテニンのメチル化及び非メチル化プライマーの例
配列番号４２：Ｗｎｔ遺伝子の非メチル化プライマーによる増幅領域の例
配列番号４３：エフリン受容体遺伝子の非メチル化領域の塩基配列の例
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子、及びＷｎｔ遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脱毛症の発症メカニズムの研究の過程で、脱毛症発症者の毛包では骨形成タンパク質（ＢＭＰ、Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ）のファミリーに属するＢＭＰ２やＢＭＰ５が増加し、毛髪のケラチンの生合成を促進する効果を有することが明らかにされている（特許文献１（特開２００５−２０６８号公報）)。ＢＭＰ２やＢＭＰ５のように、発毛を促す因子、又は脱毛において減少する因子（発毛因子）が存在することが解明されてきた。
【０００３】
また、ＢＭＰの受容体は複数の種類があるが、そのうち骨形成タンパク質受容体１Ａ型（ＢＭＰＲ１Ａ）に関して、ＢＭＰＲ１Ａノックアウトマウスは、四肢の体毛が減少することが知られている（非特許文献１（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００４Ａｐｒ；１３１（８）：１８２５−３３））。
【０００４】
エフリン受容体ファミリーはエフリンと結合し、発生段階の制御や細胞の恒常性維持を行っていることが報告されている。エフリン受容体ファミリーのうちＥｐｈＡ４は、ヒトの９番染色体上の８６８５６６８から８７７６４４５に位置し、下流のシグナルはＳｒｃキナーゼやＲｈｏＡファミリーＧＴＰａｓｅにより伝達される。ＥｐｈＡ４は脱毛症患者由来毛乳頭細胞での発現低下が明らかにされているＧＰＩ膜結合型タンパク質Ｅｐｈｒｉｎ−Ａ３の受容体である（非特許文献２（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，３６，２５−３２））。また、ＥｐｈＡ４は毛包において発現していることが確認されている。
【０００５】
Ｗｎｔタンパク質は腫瘍形成、細胞運命、パターン形成の調節などのいくつかの発生上の過程に関与する一連のタンパク質である。ＷｎｔはＦｚ受容体を介し、β−ｃａｔｅｎｉｎの核内移行を促すことで転写調節を行う。Ｗｎｔタンパク質の一つであるＷｎｔ１０の遺伝子は、１２番染色体上の４９３５９１２３から４９３６５５４３に位置する。Ｗｎｔ１０ｂは毛包の形成及び発達に関与することが明らかにされている（非特許文献３（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．３４２，２８−３５，２００６））。
【０００６】
一方、様々な疾患原因のひとつとして、ＤＮＡのメチル化を代表とするエピジェネティックな変化が明らかになりつつある。例えば特許文献２（特表２００４−５２９６３０号公報）には、生体試料の遺伝子のシトシンのメチル化レベルから、前立腺癌などの診断及び治療のための遺伝子パネルが得られることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−２０６８号公報
【特許文献２】特表２００４−５２９６３０号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００４Ａｐｒ；１３１（８）：１８２５−３３
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，３６，２５−３２
【非特許文献３】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．３４２，２８−３５，２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら脱毛症とエピジェネティクスとの関係についてこれまで検討された例はなかった。本発明の目的は、脱毛症と遺伝子におけるエピジェネティックな変化との関係を解明し、脱毛症の予防や治療、脱毛症リスクの判定、脱毛症治療及び／又は予防薬の薬剤応答性判定のための手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上述の目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子、及びＷｎｔ遺伝子中のメチル化領域のメチル化度に、個体間で相違があることを見出した。具体的には、脱毛症リスクの高いヒトの生体試料では骨形成タンパク質受容体遺伝子の特定の領域、エフリン受容体遺伝子、及びＷｎｔ遺伝子のメチル化度が高く、一方、脱毛症リスクが低いヒトの生体試料では前記メチル化度が低いことを見出した。また前記骨形成タンパク質受容体遺伝子の特定の領域とは別の特定の領域では、脱毛症リスクの高いヒトの生体試料ではメチル化度が低く、脱毛症リスクが低いヒトの生体試料ではメチル化度が高いことを見出した。また脱毛症の発症には関わらず、加齢によっても骨形成タンパク質受容体遺伝子のメチル化が亢進されることが示唆された。骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子、及びＷｎｔ遺伝子において、メチル化度が脱毛と関係していることについては、これまで知られていなかった。
【００１１】
以上のことから、毛根由来ゲノムの骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子、又はＷｎｔ遺伝子のメチル化度を測定することで、毛髪提供者の脱毛症リスクの判断、脱毛症治療及び／又は予防剤に対する応答性などの判断に応用できる技術を提供し得ることを見出し、本発明に到達した。
【００１２】
本発明は、以下の〔１〕〜〔２５〕を提供するものである。
〔１〕生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子及びＷｎｔ遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出する方法。
〔２〕 前記生体試料は、抜去毛である、上記〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記生体試料は、毛根を含む抜去毛である、上記〔１〕に記載の方法。
〔４〕前記骨形成タンパク質受容体遺伝子が、骨形成タンパク質受容体１Ａ型遺伝子である、上記〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔５〕前記骨形成タンパク質受容体遺伝子中のメチル化領域が、下記の（Ａ−１）〜（Ａ−１８）のいずれかの塩基配列の領域である、上記〔４〕に記載の方法。
（Ａ−１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列
（Ａ−２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列の全部又は一部からなる塩基配列
（Ａ−３）配列表の配列番号２に記載の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列
（Ａ−４）配列表の配列番号２に記載の塩基配列の全部又は一部からなる塩基配列
（Ａ−５）配列表の配列番号３に記載の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列
（Ａ−６）配列表の配列番号３に記載の塩基配列の全部又は一部からなる塩基配列
（Ａ−７）配列表の配列番号８に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ａ−８）配列表の配列番号８に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
（Ａ−９）配列表の配列番号９に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ａ−１０）配列表の配列番号９に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
（Ａ−１１）配列表の配列番号１０に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ａ−１２）配列表の配列番号１０に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
（Ａ−１３）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ａ−１４）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
（Ａ−１５）配列表の配列番号１２に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ａ−１６）配列表の配列番号１２に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
（Ａ−１７）配列表の配列番号１３に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ａ−１８）配列表の配列番号１３に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
〔６〕前記エフリン受容体遺伝子が、ＥｐｈＡ４遺伝子である上記〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔７〕前記メチル化領域が、下記の（Ｃ−１）〜（Ｃ−６）のいずれかの塩基配列の領域である、上記〔６〕に記載の方法。
（Ｃ−１）配列表の配列番号１４に記載の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列
（Ｃ−２）配列表の配列番号１４に記載の塩基配列の全部又は一部からなる塩基配列
（Ｃ−３）配列表の配列番号１５に記載の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列
（Ｃ−４）配列表の配列番号１５に記載の塩基配列の全部又は一部からなる塩基配列
（Ｃ−５）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列
（Ｃ−６）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列の全部又は一部からなる塩基配列
〔８〕前記Ｗｎｔ遺伝子が、Ｗｎｔ１０ｂ遺伝子である上記〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔９〕前記メチル化領域が、下記の（Ｅ−１）〜（Ｅ−６）のいずれかの塩基配列の領域である、上記〔８〕に記載の方法。
（Ｅ−１）配列表の配列番号１７に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ｅ−２）配列表の配列番号１７に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
（Ｅ−３）配列表の配列番号１８に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ｅ−４）配列表の配列番号１８に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
（Ｅ−５）配列表の配列番号１９に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ｅ−６）配列表の配列番号１９に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
〔１０〕前記メチル化領域を、メチル化されている塩基を認識するプライマー及び／又はメチル化されていない塩基を認識するプライマーを用いて増幅させてから、メチル化度を判定する、上記〔１〕〜上記〔９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１１〕前記プライマーが、以下の（Ｂ−１）〜（Ｂ−８）から選ばれるポリヌクレオチドである、上記〔１０〕に記載の方法。
（Ｂ−１）配列表の配列番号４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｂ−２）配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ−３）配列表の配列番号５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｂ−４）配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ−５）配列表の配列番号６に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｂ−６）配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ−７）配列表の配列番号７に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｂ−８）配列表の配列番号７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
〔１２〕前記プライマーが、以下の（Ｄ−１）〜（Ｄ−８）から選ばれるポリヌクレオチドである、上記〔１０〕に記載の方法。
（Ｄ−１）配列表の配列番号２０に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｄ−２）配列表の配列番号２０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｄ−３）配列表の配列番号２１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｄ−４）配列表の配列番号２１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｄ−５）配列表の配列番号２２に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｄ−６）配列表の配列番号２２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｄ−７）配列表の配列番号２３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｄ−８）配列表の配列番号２３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
〔１３〕前記プライマーが、以下の（Ｆ−１）〜（Ｆ−８）から選ばれるポリヌクレオチドである、上記〔１０〕に記載の方法。
（Ｆ−１）配列表の配列番号２４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｆ−２）配列表の配列番号２４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｆ−３）配列表の配列番号２５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｆ−４）配列表の配列番号２５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｆ−５）配列表の配列番号２６に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｆ−６）配列表の配列番号２６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｆ−７）配列表の配列番号２７に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｆ−８）配列表の配列番号２７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
〔１４〕前記メチル化領域をプライマーにより増幅させてから、増幅産物をシーケンシングしてメチル化度を判定する、上記〔１〕〜上記〔９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１５〕前記プライマーが、以下の（Ｇ−１）〜（Ｇ−１６）から選ばれるポリヌクレオチドである、上記〔１４〕に記載の方法。
（Ｇ−１）配列表の配列番号２８に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−２）配列表の配列番号２８に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−３）配列表の配列番号２９に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−４）配列表の配列番号２９に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−５）配列表の配列番号３０に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−６）配列表の配列番号３０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−７）配列表の配列番号３１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−８）配列表の配列番号３１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−９）配列表の配列番号３２に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−１０）配列表の配列番号３２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−１１）配列表の配列番号３３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−１２）配列表の配列番号３３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−１３）配列表の配列番号３４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−１４）配列表の配列番号３４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−１５）配列表の配列番号３５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−１６）配列表の配列番号３５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
〔１６〕被験者から採取された生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子及びＷｎｔ遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出し、健常者の生体試料の前記メチル化領域のメチル化度と差がある場合には、前記被験者の脱毛症の発症リスクが高いと判定する、前記被験者の脱毛症の発症リスクを予測する方法。
〔１７〕被験者から採取された生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子及びＷｎｔ遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出し、健常者の生体試料の前記メチル化領域のメチル化度と差がある場合には、前記被験者の脱毛症治療及び／又は予防剤に対する応答性が高いと判定する、前記被験者の脱毛症治療及び／又は予防剤に対する応答性を予測する方法。
〔１８〕前記脱毛症治療及び／又は予防剤が、骨形成タンパク質促進剤、エフリン促進剤、Ｗｎｔ促進剤である、上記〔１７〕に記載の方法。
〔１９〕前記骨形成タンパク質促進剤及びエフリン促進剤が、６−ベンジルアミノプリンであることを特徴とする、上記〔１８〕記載の方法。
〔２０〕骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子及びＷｎｔ遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子のメチル化領域中のメチル化されている塩基を認識するプライマー及び／又はメチル化されていない塩基を認識するプライマーを含む、生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子、及びＷｎｔ遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出するためのプライマーセット。
〔２１〕前記プライマーが、下記の（Ｂ−１）〜（Ｂ−８）、（Ｄ−１）〜（Ｄ−８）、及び（Ｆ−１）〜（Ｆ−８）から選ばれる１又は２以上のプライマーである、上記〔２０〕に記載のプライマーセット。
（Ｂ−１）配列表の配列番号４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｂ−２）配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ−３）配列表の配列番号５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｂ−４）配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ−５）配列表の配列番号６に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｂ−６）配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ−７）配列表の配列番号７に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｂ−８）配列表の配列番号７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｄ−１）配列表の配列番号２０に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｄ−２）配列表の配列番号２０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｄ−３）配列表の配列番号２１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｄ−４）配列表の配列番号２１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｄ−５）配列表の配列番号２２に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｄ−６）配列表の配列番号２２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｄ−７）配列表の配列番号２３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｄ−８）配列表の配列番号２３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｆ−１）配列表の配列番号２４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｆ−２）配列表の配列番号２４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｆ−３）配列表の配列番号２５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｆ−４）配列表の配列番号２５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｆ−５）配列表の配列番号２６に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｆ−６）配列表の配列番号２６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｆ−７）配列表の配列番号２７に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｆ−８）配列表の配列番号２７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
〔２２〕上記〔２０〕又は上記〔２１〕に記載のプライマーを含む、生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子及びＷｎｔ遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出するために使用されるキット、試薬又は検出システム。
〔２３〕前記メチル化領域中メチル化領域を増幅するためのプライマーを含む、生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出するためのプライマーセット。
〔２４〕前記プライマーが、下記の（Ｇ−１）〜（Ｇ−１６）から選ばれる１又は２以上のプライマーである、上記〔２３〕に記載のプライマーセット。
（Ｇ−１）配列表の配列番号２８に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−２）配列表の配列番号２８に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−３）配列表の配列番号２９に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−４）配列表の配列番号２９に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−５）配列表の配列番号３０に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−６）配列表の配列番号３０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−７）配列表の配列番号３１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−８）配列表の配列番号３１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−９）配列表の配列番号３２に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−１０）配列表の配列番号３２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−１１）配列表の配列番号３３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−１２）配列表の配列番号３３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−１３）配列表の配列番号３４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−１４）配列表の配列番号３４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−１５）配列表の配列番号３５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−１６）配列表の配列番号３５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
〔２５〕上記〔２３〕又は上記〔２４〕に記載のプライマーを含む、生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出するために使用されるキット、試薬又は検出システム。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子、及びＷｎｔ遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出する方法が提供され、該方法は、脱毛症の発症リスクの予測や、脱毛症治療及び／又は予防薬に対する応答性の判定への応用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、実施例１の提供者Ａのメチル化増幅の結果を示す図である。
【図２】図２は、実施例１の提供者Ｂのメチル化増幅の結果を示す図である。
【図３】図３は、実施例１の提供者Ｃのメチル化増幅の結果を示す図である。
【図４】図４は、実施例１のコントロールゲノムのメチル化増幅の結果を示す図である。
【図５】図５は、実施例１の提供者Ａの非メチル化増幅の結果を示す図である。
【図６】図６は、実施例１の提供者Ｂの非メチル化増幅の結果を示す図である。
【図７】図７は、実施例１の提供者Ｃの非メチル化増幅の結果を示す図である。
【図８】図８は、実施例１のコントロールゲノムの非メチル化増幅の結果を示す図である。
【図９】図９は、実施例２の解析条件１〜５の増幅領域の配置を示す図である。
【図１０】図１０は、実施例３の提供者ＦのＥｐｈＡ４メチル化増幅の結果を示す図である。
【図１１】図１１は、実施例３の提供者ＦのＥｐｈＡ４非メチル化増幅の結果を示す図である。
【図１２】図１２は、実施例３の提供者ＧのＥｐｈＡ４メチル化増幅の結果を示す図である。
【図１３】図１３は、実施例３の提供者ＧのＥｐｈＡ４非メチル化増幅の結果を示す図である。
【図１４】図１４は、実施例３のＥｐｈＡ４のコントロールＤＮＡのメチル化増幅の結果を示す図である。
【図１５】図１５は、実施例３のＥｐｈＡ４のコントロールＤＮＡの非メチル化増幅の結果を示す図である。
【図１６】図１６は、実施例３の提供者ＦのＷｎｔ１０ｂメチル化増幅の結果を示す図である。
【図１７】図１７は、実施例３の提供者ＦのＷｎｔ１０ｂ非メチル化増幅の結果を示す図である。
【図１８】図１８は、実施例３の提供者ＧのＷｎｔ１０ｂメチル化増幅の結果を示す図である。
【図１９】図１９は、実施例３の提供者ＧのＷｎｔ１０ｂ非メチル化増幅の結果を示す図である。
【図２０】図２０は、実施例３のＷｎｔ１０ｂのコントロールＤＮＡのメチル化増幅の結果を示す図である。
【図２１】図２１は、実施例３のＷｎｔ１０ｂのコントロールＤＮＡの非メチル化増幅の結果を示す図である。
【図２２】図２２は、実施例３の提供者Ｆのβ−ｃａｔｅｎｉｎメチル化増幅の結果を示す図である。
【図２３】図２３は、実施例３の提供者Ｆのβ−ｃａｔｅｎｉｎ非メチル化増幅の結果を示す図である。
【図２４】図２４は、実施例３の提供者Ｇのβ−ｃａｔｅｎｉｎメチル化増幅の結果を示す図である。
【図２５】図２５は、実施例３の提供者Ｇのβ−ｃａｔｅｎｉｎ非メチル化増幅の結果を示す図である。
【図２６】図２６は、実施例３のβ−ｃａｔｅｎｉｎのコントロールＤＮＡのメチル化増幅の結果を示す図である。
【図２７】図２７は、実施例３のβ−ｃａｔｅｎｉｎのコントロールＤＮＡの非メチル化増幅の結果を示す図である。
【図２８】図２８は、実施例３にて増幅した領域に対応するゲノム配列とプライマーの設計領域を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の方法においては、生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子及びＷｎｔ遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出する。
【００１６】
生体試料とは、ヒト又はヒト以外の哺乳動物の身体から分離された試料を意味する。生体試料の例としては、抜去毛、血液、尿などが例示されるが、このうち抜去毛が好ましい。抜去毛とは、ヒト又はヒト以外の哺乳動物の身体から抜去（分離）された試料を意味する。身体の部位は特に限定されないが、通常は頭部である。ヒト又はヒト以外の哺乳動物が脱毛症を発症しているか否か、脱毛症のリスクがあるか否かについても特には問わない。脱毛症としては、男性型脱毛症、老人性脱毛症、薬剤に起因する脱毛症、皮膚損傷に起因する脱毛症、びまん性脱毛症（女性に多い）、皮脂の過酸化に起因する脱毛症などがある。
【００１７】
生体試料が抜去毛の場合、ヒト又はヒト以外の哺乳動物の個体の１本の毛髪であればよいが、２本以上であってもよい。通常は、５〜５０本である。２本以上の毛髪の場合は、通常は同じ個体から抜去された毛髪である。
【００１８】
毛髪は、毛根（皮膚の中に埋もれている部分）、毛包（毛根を包む鞘状の部分）、毛球（毛包の下部の球状の部分）、毛幹（皮膚の表面に出た部分）などの部位から構成される。生体試料としての抜去毛はこれらのうち１又は２以上の毛髪の部位を含むものであってもよいが、毛根を含むことが好ましい。
【００１９】
抜去毛の長さは特には限定されないが、取り扱い上の理由などにより、短く裁断されたもの（例えば５ｍｍ前後）であってもよい。また、衛生上の理由などにより、エタノールなどアルコールで洗浄しておいてもよい。
【００２０】
本発明においてメチル過度の検出対象となる遺伝子は、骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子及びＷｎｔ遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子である。
【００２１】
骨形成タンパク質受容体遺伝子とは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の受容体（ＢＭＰＲ）をコードする遺伝子を意味する。ＢＭＰＲには１型（１Ａ型、１Ｂ型）、２型などのファミリーがあるが、本発明においては１Ａ型（ＢＭＰＲ１Ａ）が好ましい。ＢＭＰＲ１Ａ遺伝子の塩基配列は、核酸データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されており、アクセス番号はＮＭ＿００４３２９である。
【００２２】
エフリン受容体遺伝子とは、エフリンの受容体（Ｅｐｈ）をコードする遺伝子を意味する。ＥｐｈはサブクラスＡ（ＥｐｈＡ）及びＢ（ＥｐｈＢ）に分類され、サブクラスＡは９種類（ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＡ１０）、サブクラスＢは５種類（ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、ＥｐｈＢ６）が知られている。本発明においては、ＥｐｈＡ４が好ましい。ＥｐｈＡ４遺伝子の塩基配列は、核酸データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されており、アクセス番号はＮＭ＿００４４３８である。
【００２３】
Ｗｎｔ遺伝子は、Ｗｎｔタンパク質をコードする遺伝子である。Ｗｎｔタンパク質は、分泌性のタンパク質群であり、発生において、体軸形成、パターン形成、細胞の運命決定や運動性の制御、細胞増殖や組織における極性支配、神経新生などを含む多様な役割を果たす。Ｗｎｔタンパク質はＷｎｔ２Ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ５Ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７Ｂ、Ｗｎｔ８Ａ、Ｗｎｔ８Ｂ、Ｗｎｔ１０Ａ、Ｗｎｔ１０Ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１４、Ｗｎｔ１４Ｂ／Ｗｎｔ１５等が知られている。本発明においてはＷｎｔ１０ｂが好ましい。 Ｗｎｔ１０ｂ遺伝子の塩基配列は、核酸データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されており、アクセス番号はＮＭ＿００３３９４である。
【００２４】
本発明においては、骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子及びＷｎｔ遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出する。メチル化度とは、メチル化の発生の度合いを意味し、メチル化された塩基の量、メチル化された塩基の数、メチル化された塩基の部位などにより表される。メチル化された塩基とは、メチル化修飾のなされた塩基（通常はシトシン）を意味する。メチル化度の検出は、メチル化度の定量、判定、検体間での比較と言い換えることも可能である。
【００２５】
本発明においてメチル化度が「高い」とは、メチル化された塩基の量が多いことを意味し、メチル化度が「低い」とは、メチル化された塩基の量が少ないことを示す。量の多少は、異なる抜去毛試料間、或いは市販のコントロールとの間で、メチル化度を比較することにより、相対的に決定されうる。
【００２６】
遺伝子中のメチル化領域とは、塩基のメチル化が生じ得る領域を意味し、通常は遺伝子内のＣｐＧアイランド（ＣｐＧサイト）を含む領域である。
【００２７】
メチル化領域の長さは特に制限はないが、通常は５塩基以上、例えば１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１００塩基以上である。上限も特に制限はないが、通常は３０００塩基以下、好ましくは２５００塩基以下、より好ましくは２１００塩基以下である。メチル化領域は、各遺伝子の一部又は全部であればよい。メチル化領域が各遺伝子の一部である場合には、通常、上述のようにＣｐＧアイランドを１つ以上含む領域が選抜される。該領域におけるＣｐＧアイランドの存在頻度は特に制限されないが、より高いことが好ましく、具体的には、１％以上、好ましくは２％以上、より好ましくは５％以上、さらにより好ましくは１０％以上であることが好ましい。また、メチル化領域は、後述するようにメチル化度の検出にあたりメチル化領域を増幅する方法を採用する場合、プライマーが設計しやすい（例えば、非特異的な増幅が起こり難い、プライマー同士の増幅やダイマーが形成されにくい、など）領域であることが好ましい。
【００２８】
ＢＭＰＲ１Ａ遺伝子の場合のメチル化領域の好ましい例としては、以下の領域が挙げられる。なお、以下の塩基番号は、ＢＭＰＲ１Ａ遺伝子の転写開始点を０とした場合の番号である。
（Ａ−１）上流−９６７ｂから−８４６ｂまでの１２１ｂ（配列表の配列番号１参照）の全部又は一部を含む領域
（Ａ−２）前記塩基配列（配列表の配列番号１参照）の全部又は一部からなる領域
（Ａ−３）上流−１０００ｂから転写開始点０までの１０００ｂ（配列表の配列番号２参照）の全部又は一部を含む領域
（Ａ−４）前記塩基配列（配列表の配列番号２参照）の全部又は一部からなる領域
（Ａ−５）上流−２０００ｂから転写開始点０までの２０００ｂ（配列表の配列番号３参照）の全部又は一部を含む領域
（Ａ−６）前記塩基配列（配列表の配列番号３参照）の全部又は一部からなる領域
（Ａ−７）上流−１，１０６ｂから−７２３ｂまでの３８４ｂ（配列表の配列番号８参照）の全部又は一部を含む領域
（Ａ−８）前記塩基配列（配列表の配列番号８参照）の全部又は一部からなる領域
（Ａ−９）上流−２４９ｂから＋６６ｂまでの３１５ｂ（配列表の配列番号９参照）の全部又は一部を含む領域
（Ａ−１０）前記塩基配列（配列表の配列番号９参照）の全部一部からなる領域
（Ａ−１１）上流−７４３ｂから−５７８ｂまでの１６６ｂ（配列表の配列番号１０参照）の全部又は一部を含む領域
（Ａ−１２）前記塩基配列（配列表の配列番号１０参照）の全部又は一部からなる領域
（Ａ−１３）下流＋６７ｂから＋３３３ｂまでの２６７ｂ（配列表の配列番号１１参照）の全部又は一部を含む領域
（Ａ−１４）前記塩基配列（配列表の配列番号１１参照）の全部又は一部からなる領域
（Ａ−１５）上流−１１０６ｂから＋３３３ｂまでの１，４３９ｂ（配列表の配列番号１２参照）の全部又は一部を含む領域
（Ａ−１６）前記塩基配列（配列表の配列番号１２参照）の全部又は一部からなる領域
（Ａ−１７）上流−２０００ｂから＋３３３ｂまでの２，３３３ｂ（配列表の配列番号１３参照）の全部又は一部を含む領域
（Ａ−１８）前記塩基配列（配列表の配列番号１３参照）の全部又は一部からなる領域
【００２９】
（Ａ−１）〜（Ａ−１８）の領域のうち、（Ａ−１）〜（Ａ−１６）の領域が好ましく、（Ａ−１）〜（Ａ−４）及び（Ａ−７）〜（Ａ−１６）の領域がより好ましく、（Ａ−１）〜（Ａ−４）及び（Ａ−７）〜（Ａ−１４）の領域がさらに好ましく、（Ａ−１）、（Ａ−２）、（Ａ−７）〜（Ａ−１４）の領域がさらにより好ましい。（Ａ−１）〜（Ａ−１８）の領域は、それぞれ、或いは組み合わせて、脱毛症リスクの遺伝子マーカーとして有用である。
【００３０】
ＥｐｈＡ４遺伝子の場合のメチル化領域の好ましい例としては、、バイサルファイト処理前のＥｐｈＡ４遺伝子のうち、以下の領域が挙げられる。なお、以下の塩基番号は、Ｅｐｈ４Ａ遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧのＡを１とした場合の番号である。
（Ｃ−１）上流−１２７ｂから＋７５ｂまでの２０２ｂ（配列表の配列番号１４参照）の全部又は一部を含む領域
（Ｃ−２）前記塩基配列（配列表の配列番号１４参照）の全部又は一部からなる領域
（Ｃ−３）上流−８００ｂから＋２００ｂまでの１０００ｂ（配列表の配列番号１５参照）の全部又は一部を含む領域
（Ｃ−４）前記塩基配列（配列表の配列番号１５参照）の全部又は一部からなる領域
（Ｃ−５）上流−１８００ｂから＋２００ｂまでの２０００ｂ（配列表の配列番号１６参照）の全部又は一部を含む領域
（Ｃ−６）前記塩基配列（配列表の配列番号１６参照）の全部又は一部からなる領域
（Ｃ−１）〜（Ｃ−６）の領域のうち、（Ｃ−１）〜（Ｃ−４）の領域が好ましく、（Ｃ−１）〜（Ｃ−２）の領域がより好ましい。（Ｃ−１）〜（Ｃ−６）の領域は、それぞれ、或いは組み合わせて、脱毛症リスクの遺伝子マーカーとして有用である。
【００３１】
Ｗｎｔ１０ｂ遺伝子の場合のメチル化領域の好ましい例としては、バイサルファイト処理前のＷｎｔ１０ｂ遺伝子のうち、以下の領域が挙げられる。なお、以下の塩基番号は、Ｗｎｔ１０ｂ遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧのＡを１とした場合の番号である。
（Ｅ−１）上流−２９５ｂから−１９０ｂまでの１０６ｂ（配列表の配列番号１７参照）の全部又は一部を含む領域
（Ｅ−２）前記塩基配列（配列表の配列番号１７参照）の全部又は一部からなる領域
（Ｅ−３）上流−１２３１ｂ（ＵＴＲ始点）から−１ｂまでの１２３１ｂ（配列表の配列番号１８参照）の全部又は一部を含む領域
（Ｅ−４）前記塩基配列（配列表の配列番号１８参照）の全部又は一部からなる領域
（Ｅ−５）上流−２０００から−１までの２０００ｂ（配列表の配列番号１９参照）の全部又は一部を含む領域
（Ｅ−６）前記塩基配列（配列表の配列番号１９参照）の全部又は一部からなる領域
（Ｅ−１）〜（Ｅ−６）の領域のうち、（Ｅ−１）〜（Ｅ−４）の領域が好ましく、（Ｅ−１）〜（Ｅ−２）の領域がより好ましい。（Ｅ−１）〜（Ｅ−６）の領域は、それぞれ、或いは組み合わせて、脱毛症リスクの遺伝子マーカーとして有用である。
【００３２】
メチル化度の検出の方法は特に限定されないが、バイサルファイト処理によることができる。バイサルファイト処理とは、生体試料のゲノムＤＮＡをバイサルファイト（亜硫酸水素塩）で処理することを意味する。バイサルファイト処理により、ＤＮＡ中の非メチル化シトシンはウラシルに変換され、メチル化シトシンは変換されずに維持される。よって、前記のバイサルファイト処理を行う場合のメチル化度の検出は、元の遺伝子と比較してウラシル（シーケンス反応上ではチミンとして表現されることもある）に置換されているか否かを判定することで、行い得る。すなわち、バイサルファイト処理後の試料のシトシンとウラシル（チミン）の量の、処理前の試料のそれらとの相違を調べることにより、メチル化度を検出できる。
【００３３】
バイサルファイト処理は、例えば、市販のキット（例えばＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｇｏｌｄ Ｋｉｔ（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ，Ｄ５００５））を用いて、キットに添付の説明書に記載の条件に従って進め得る。
【００３４】
また、生体試料のゲノムＤＮＡのうちメチル化領域を増幅する方法も例示され、前記バイサルファイト処理と組み合わせることが好ましい。
【００３５】
増幅の方法としては、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法が例示される。好ましい態様の一つとしては、メチル化及び非メチル化されている塩基を特異的にＰＣＲ法により増幅してメチル化の様子を解析する方法（メチル化特異的ＰＣＲ法、ＭＳＰ法）が好ましい。上記メチル化領域のうち、（Ａ−１）、（Ａ−２）、（Ｃ−１）、（Ｃ−２）、（Ｅ−１）及び（Ｅ−２）の解析にはＭＳＰ法を利用することが好ましい。
【００３６】
ＭＳＰ法を用いる場合、増幅に用いるプライマー（プライマーセット）は、メチル化領域を増幅可能なように設計され得る。すなわち例えば、メチル化領域の５´末端側の部分の塩基配列と３´末端側の部分の塩基配列、さらにこれらの部分に相補的な塩基配列にハイブリダイズできるような塩基配列を適宜設計することができる。このうち、メチル化されている塩基を認識するプライマー（メチル化プライマー）及び／又はメチル化されていない塩基を認識するプライマー（非メチル化プライマー）を用いることが好ましく、これら両方を用いることがより好ましい。メチル化プライマーを用いて増幅すると、メチル化されている塩基を含む領域を増幅することができ、非メチル化プライマーを用いて増幅すると、メチル化されていない塩基を含む領域を増幅することができるので、それぞれのプライマーによる増幅量をハイブリダイゼーションなどにより容易に確認することができる。
【００３７】
メチル化プライマーは、メチル化領域を含む領域の少なくとも一部の塩基配列又はこれに相補的な塩基配列を含むものとして設計され得る。非メチル化プライマーは、メチル化領域を含む領域に含まれるＣｐＧサイト中のシトシンをウラシル（又はチミン）に置き換えた配列又はこれに相補的な塩基配列を含むものとして設計され得る。プライマーの長さは特には限定されないが、通常は８〜５０塩基、好ましくは１０〜４０塩基、より好ましくは１５〜３０塩基である。
【００３８】
ＭＳＰ法におけるプライマーの好ましい例としては以下のものが挙げられる：配列表の配列番号４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｂ−１）；配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｂ−２）；配列表の配列番号５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｂ−３）；配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｂ−４）；配列表の配列番号６に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｂ−５）；配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｂ−６）；配列表の配列番号７に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｂ−７）；配列表の配列番号７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｂ−８）。前記ポリヌクレオチドのうち、（Ｂ−１）、（Ｂ−２）、（Ｂ−３）及び（Ｂ−４）はメチル化プライマーであり、（Ｂ−５）、（Ｂ−６）、（Ｂ−７）及び（Ｂ−８）は非メチル化プライマーである。（Ｂ−１）〜（Ｂ−８）のプライマーは、前記した配列番号１に記載の塩基配列を含む領域（Ａ−１）、又は配列番号１に記載の塩基配列からなる領域（Ａ−２）の増幅に用いられ得る。すなわち、（Ｂ−１）〜（Ｂ−８）のプライマーは、配列番号１に記載の塩基配列のうち塩基番号１〜２３番目の領域、及び塩基番号９７〜１２１番目の領域にアニールし得る。
【００３９】
また、ＭＳＰ法におけるプライマーの好ましい例としては以下のものが挙げられる：配列表の配列番号２０に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｄ−１）；配列表の配列番号２０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｄ−２）；配列表の配列番号２１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｄ−３）；配列表の配列番号２１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｄ−４）；配列表の配列番号２２に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｄ−５）；配列表の配列番号２２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｄ−６）；配列表の配列番号２３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｄ−７）；配列表の配列番号２３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｄ−８）。前記ポリヌクレオチドのうち、（Ｄ−１）、（Ｄ−２）、（Ｄ−３）及び（Ｄ−４）は非メチル化プライマーであり、（Ｄ−５）、（Ｄ−６）、（Ｄ−７）及び（Ｄ−８）はメチル化プライマーである。（Ｄ−５）〜（Ｄ−８）のプライマーは、前記した配列番号１４に記載の塩基配列を含む領域（Ｃ−１）、又は配列番号１４に記載の塩基配列からなる領域（Ｃ−２）の増幅に用いられ得る。すなわち、（Ｄ−５）〜（Ｄ−８）のプライマーは、配列番号１４に記載の塩基配列のうち塩基番号１〜２０番目の領域、及び塩基番号１７８〜２０２番目の領域にアニールし得る。また、（Ｄ−１）〜（Ｄ−４）のプライマーは、配列番号４３に記載の塩基配列（ＥｐｈＡ４の翻訳開始コドンＡを１としたときの、上流−１２７〜＋７３までの２００ｂ）のうち塩基番号１〜２０番目の領域、及び塩基番号１７４〜２００番目の領域にアニールし得る（図２８）。
【００４０】
さらに、ＭＳＰ法におけるプライマーの好ましい例としては、以下のものが挙げられる：配列表の配列番号２４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｆ−１）；配列表の配列番号２４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｆ−２）；配列表の配列番２５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｆ−３）；配列表の配列番号２５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｆ−４）；配列表の配列番号２６に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｆ−５）；配列表の配列番号２６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｆ−６）；配列表の配列番号２７に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｆ−７）；配列表の配列番号２７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｆ−８）。前記ポリヌクレオチドのうち、（Ｆ−１）、（Ｆ−２）、（Ｆ−３）及び（Ｆ−４）は非メチル化プライマーであり、（Ｆ−５）、（Ｆ−６）、（Ｆ−７）及び（Ｆ−８）はメチル化プライマーである。（Ｆ−１）〜（Ｆ−８）のプライマーは、前記した配列番号１７に記載の塩基配列を含む領域（Ｅ−１）、又は配列番号１７に記載の塩基配列からなる領域（Ｅ−２）の増幅に用いられ得る。すなわち、（Ｆ−１）〜（Ｆ−４）のプライマーは、配列番号１７に記載の塩基配列の塩基番号１〜３０番目の領域、及び塩基番号９０〜１０６番目の領域にアニールし得る。（Ｆ−１）〜（Ｆ−４）のプライマーは、配列番号４２に記載の塩基配列（Ｗｎｔ１０ｂ（ＮＭ＿００３３９４）の翻訳開始コドンのＡを１とした場合の上流−２９７ｂから−１８４ｂまでの１１４ｂ）の塩基番号１〜３３番目の領域、及び塩基番号９１〜１１４番目の領域にアニールし得る（図２８）。
【００４１】
一方、生体試料のゲノムＤＮＡのうちメチル化領域を増幅する方法としては、上述のＭＳＰ法と並んで本発明におけるメチル化解析の好ましい態様の一つである。バイサルファイトシーケンス法とは、バイサルファイト処理がなされたゲノムＤＮＡのうちメチル化領域を含む領域を、通常のＰＣＲにより増幅し、増幅産物のシーケンスを行い、得られるシーケンスデータ中のメチル化部位を解析する方法である。上記メチル化領域のうち、（Ａ−７）〜（Ａ−１４）の解析には、バイサルファイトシーケンス法によることが好ましい。
【００４２】
バイサルファイトシーケンス法に用いるプライマーの別の好ましい例としては、以下のものが挙げられる：配列表の配列番号２８に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｇ−１）；配列表の配列番号２８に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｇ−２）；配列表の配列番号２９に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｇ−３）；配列表の配列番号２９に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｇ−４）配列表の配列番号３０に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｇ−５）；配列表の配列番号３０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｇ−６）；配列表の配列番号３１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｇ−７）；配列表の配列番号３１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｇ−８）；配列表の配列番号３２に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｇ−９）；配列表の配列番号３２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｇ−１０）；配列表の配列番号３３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｇ−１１）；配列表の配列番号３３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｇ−１２）；配列表の配列番号３４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｇ−１３）；配列表の配列番号３４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｇ−１４）；配列表の配列番号３５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド（Ｇ−１５）；配列表の配列番号３５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｇ−１６）。（Ｇ−１）〜（Ｇ−４）のプライマーは、前記した配列番号８に記載の塩基配列を含む領域（Ａ−７）、又は配列番号８に記載の塩基配列からなる領域（Ａ−８）の増幅に用いられ得る。（Ｇ−５）〜（Ｇ−８）のプライマーは、前記した配列番号９に記載の塩基配列を含む領域（Ａ−９）、又は配列番号９に記載の塩基配列からなる領域（Ａ−１０）の増幅に用いられ得る。（Ｇ−９）〜（Ｇ−１２）のプライマーは、前記した配列番号１０に記載の塩基配列を含む領域（Ａ−１１）、又は配列番号１０に記載の塩基配列からなる領域（Ａ−１２）の増幅に用いられ得る。（Ｇ−１３）〜（Ｇ−１６）のプライマーは、前記した配列番号１１に記載の塩基配列を含む領域（Ａ−１１）、又は配列番号１０に記載の塩基配列からなる領域（Ａ−１２）の増幅に用いられ得る。
【００４３】
上記（Ｂ−１）〜（Ｂ−８）、（Ｄ−１）〜（Ｄ−８）、（Ｆ−１）〜（Ｆ−８）、（Ｇ−１）〜（Ｇ−１６）のプライマーには、前記メチル化領域を増幅可能な範囲での改変を加えたもの、すなわち例えば、数塩基程度（例えば１〜３塩基、好ましくは１塩基程度）の欠失、付加、置換、挿入等をしたものも含まれる。
【００４４】
生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子及びＷｎｔ遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出するにあたり、通常は前処理として、生体試料のゲノムＤＮＡを抽出する。抽出法は常法によることができ、市販キット（例えばＩＳＯＨＡＩＲ（ニッポンジーン、３１９−０３４０１））を用いて、前記キットの説明書に記載の条件に従って行い得る。ゲノムＤＮＡについては、必要に応じて、制限酵素による断片化、精製（タンパク質の除去）など、遺伝子解析の際の一般的な前処理を行い得る。制限酵素は適切なもの（例えばＢａｍＨＩ）を適宜選択して用い得る。精製は、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール、エタノールなどの溶媒で抽出して行うことができる。
【００４５】
メチル化度の解析にあたり、公開ウェブサイトＱＵＭＡ（Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｏｏｌ ｆｏｒ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ，ｈｔｔｐ：／／ｑｕｍａ．ｃｄｂ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ｔｏｐ／ｉｎｄｅｘ＿ｊ．ｈｔｍｌ）等の解析サイトを利用してもよい。また、ゲル電気泳動後に染色し、バンドの発光強度を比較してもよい。
【００４６】
なお、メチル化度の検出の方法は、上述したバイサルファイト法やメチル化領域の増幅に限定されず、メチル化領域の塩基配列のシークエンサーによる決定、制限酵素の特異的認識配列を利用したＣＯＢＲＡ（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）法などによってもよい。
【００４７】
本発明の方法は、脱毛症の発症リスクの予測に用いることができる。すなわち、被験動物（ヒト又はヒト以外の哺乳動物）の生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子及びＷｎｔ遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出し、健常者の生体試料の前記メチル化度と差がある場合には、前記被験者の脱毛症の発症リスクが高いと判定することができる。
【００４８】
脱毛症の発症リスクの予測とは、まだ脱毛症を発症していない被験者が、将来脱毛症を発症するリスクを有しているか否かを予測することを意味する。健常者の生体試料の前記メチル化度との間で「差がある」とは、被験者のメチル化度を分子に、健常者のメチル化度を分母にして両者の比を算出した場合に、その比が０．８以下、ないしは１．２以上となる場合において差があることを意味する。上記比は、０．７以下ないしは１．３以上であることが好ましく、０．６以下ないしは１．４以上であることがより好ましい。メチル化領域が（Ａ−１）、（Ａ−２）、（Ａ−７）〜（Ａ−１０）、（Ｃ−１）、（Ｃ−２）、（Ｅ−１）及び（Ｅ−２）の場合には、被験者について測定されたメチル化度が、健常者のメチル化度よりも高い場合には脱毛症の発症リスクが高いと予測され、メチル化度が低い場合には脱毛症の発症リスクが低いと予測される。メチル化領域が（Ａ−１１）〜（Ａ−１４）の場合には、被験者について測定されたメチル化度が、健常者の同様のメチル化領域のメチル化度よりも低い場合には脱毛症の発症リスクが高いと予測され、高い場合には脱毛症の発症リスクが低いと予測される。なお、被験者が高齢（例えば４０代以上）の場合には、低年齢の場合よりも、健常者との比較においてメチル化度に差がある傾向にあるので、脱毛症の発症リスクの予測の際には、被験者の年齢をある程度考慮する必要がある。
【００４９】
脱毛症の発症リスク予測における被験者は特に限定されないが、目的を考慮すると、脱毛症をまだ発症していないヒト（通常は男性）が適当である。健常者とは、脱毛症の兆候がないヒト（性別は問わない）が適当である。加齢により遺伝子のメチル化が亢進される可能性があり、中でもＢＭＰＲ１Ａ遺伝子においてその傾向が強いため、健常者は高齢者でない（例えば３０代以下、好ましくは２０代以下）であることが好ましい。健常者のメチル化領域のメチル化度は、予め測定しておくことが好ましい。
【００５０】
また、本発明の方法は、脱毛症治療及び／又は予防薬、中でも骨形成タンパク質促進剤（ＢＭＰ促進剤：ＢＭＰの産生を促進する成分）、エフリン促進剤（エフリンの産生を促進する成分）、及びＷｎｔ促進剤（Ｗｎｔの産生を促進する成分）に対する応答性の判定に用いることができる。すなわち、被験者に脱毛症治療及び／又は予防薬を投与し、毛髪試料を採取し、前記毛髪試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子及びＷｎｔ遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出し、健常者の生体試料の前記メチル化領域のメチル化度と差がある場合には、前記被験者の前記脱毛症治療及び／又は予防薬に対する応答性があると判定することができる。メチル化領域が上記（Ａ−１）、（Ａ−２）、（Ａ−７）〜（Ａ−１０）の場合には、被験者について測定されたメチル化度が、健常者のメチル化度よりも高い場合には、ＢＭＰ促進剤に対する応答性が高い（ＢＭＰ促進剤を投与した場合の治療効果が期待される）と判定され、メチル化度が低い場合には、ＢＭＰ促進剤に対する応答性が低い（ＢＭＰ促進剤を投与した場合にも治療効果が期待されない）と判定される。メチル化領域が（Ａ−１１）〜（Ａ−１４）の場合には、被験者について測定されたメチル化度が、健常者の同様のメチル化領域のメチル化度よりも低い場合には、ＢＭＰ促進剤に対する応答性が高いと予測され、高い場合にはＢＭＰ促進剤に対する応答性が低いと予測される。メチル化領域が上記（Ｃ−１）、（Ｃ−２）の場合には、被験者について測定されたメチル化度が、健常者のメチル化度よりも高い場合には、エフリン促進剤に対する応答性が高い（エフリン促進剤を投与した場合の治療効果が期待される）と判定され、メチル化度が低い場合には、エフリン促進剤に対する応答性が低い（エフリン促進剤を投与した場合にも治療効果が期待されない）と判定される。
【００５１】
薬剤応答性の判定における被験者は特に限定されないが、脱毛症の兆候があるヒト、脱毛症を発症しているヒト、或いは脱毛症を近い将来発症すると予測されるヒトが適当であり、通常は男性である。健常者とは、脱毛症の兆候がないヒト（性別は問わない）が適当である。加齢により遺伝子のメチル化が亢進される可能性があり、中でもＢＭＰＲ１Ａ遺伝子においてその傾向が強いため、健常者は高齢者でない（例えば３０代以下、好ましくは２０代以下）であることが好ましい。健常者のメチル化領域のメチル化度は、予め測定しておくことが好ましい。
【００５２】
脱毛症治療及び／又は予防薬としてはＢＭＰ促進剤、エフリン促進剤、及びＷｎｔ促進剤が好ましいが、これに限定されず、本メチル化領域の脱メチル化剤などが例示される。ＢＭＰ促進剤については、ＢＭＰＲ遺伝子の被験者のメチル化度が健常者のメチル化度と差がある場合、発毛因子であるＢＭＰ遺伝子とのシグナル伝達が阻害されている可能性があり、その治療にはＢＭＰ促進剤が効果を奏するものと推測される。エフリン促進剤については、エフリン受容体遺伝子のメチル化度が高い場合、発毛因子であるエフリン遺伝子とのシグナル伝達が阻害されている可能性があり、その治療にはエフリン促進剤が効果を奏するものと推測される。ＢＭＰ促進剤及びエフリン促進剤としては、６−ベンジルアミノプリンが例示される。
【００５３】
前述した、骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子、及びＷｎｔ遺伝子のメチル化領域中のメチル化されている塩基を認識するプライマー（メチル化プライマー）及び／又はメチル化されていない塩基を認識するプライマー（非メチル化プライマー）及び／又はメチル化領域のメチル化度を検出するためのプライマー、好ましくは（Ｂ−１）〜（Ｂ−８）、（Ｄ−１）〜（Ｄ−８）、（Ｆ−１）〜（Ｆ−８）から選ばれる１又は２以上のプライマーは、生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子、及びＷｎｔ遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出するために使用されるキット、試薬又は検出システムに含まれる一つとしても有用である。また、骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子、及びＷｎｔ遺伝子のメチル化領域を増幅するプライマー、好ましくは（Ｇ−１）〜（Ｇ−１６）から選ばれる１又は２以上のプライマーは、生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子、及びＷｎｔ遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出するために使用されるキット、試薬又は検出システムに含まれる一つとしても有用である。係るキット、試薬又は検出システムは、脱毛症の発症リスクの予測や、骨形成タンパク質促進剤、エフリン促進剤、及びＷｎｔ促進剤に対する応答性の予測のために用いることができる。係るキット、試薬又は検出システムは、必要に応じて、容器、酵素、その他検出のために用いる各種試薬等を含んでいてもよい。
【実施例】
【００５４】
実施例１
（１）ゲノムＤＮＡの抽出
ゲノム提供者Ａ（２０代男性、男性型脱毛症進行者）、Ｂ（２０代男性、脱毛症の兆候なし）及びＣ（４０代男性、脱毛症の兆候なし）の３名の頭部から毛髪５本を抜き、エタノールにて洗浄した。毛髪のうち毛根約２ｃｍを５ｍｍ程度に裁断し、ＩＳＯＨＡＩＲ（ニッポンジーン、３１９−０３４０１）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。詳細な操作は、ＩＳＯＨＡＩＲ添付のプロトコールに従った。
【００５５】
得られたゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩにて断片化し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール、エタノールにて精製した。２６０ｎｍの吸光度の値からＤＮＡ濃度を測定し、２００ｎｇの断片化ゲノムＤＮＡを対象に、バイサルファイト処理（非メチル化シトシンをウラシルに変換する処理）を行った。バイサルファイト処理は、ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｇｏｌｄ Ｋｉｔ（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ，Ｄ５００５）を用い、詳細な操作は添付のプロトコールに従った。
【００５６】
（２）メチル化／非メチル化特異的ＰＣＲ
ＢＭＰＲ１Ａ遺伝子（ＮＭ＿００４３２９）の転写開始点を０とし、上流−９６７ｂより−８４６ｂまでの領域（配列番号１参照）を増幅できるようなプライマーを設計した。上記領域はＣｐＧアイランドを一部に含んでいる。プライマーとしては、ＣｐＧアイランドのメチル化シトシンを認識するプライマー（メチル化プライマー）と、メチル化されていないシトシンを認識するプライマー（非メチル化プライマー）を、それぞれ設計した。プライマーの塩基配列を表１に示す。表１中、太字は上記領域のＣｐＧアイランドに相当する部分を、傍点は同領域のメチル化シトシンに相当する部分を意味する。
【００５７】
【表１】
【００５８】
本プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。具体的には、メチル化プライマー及び非メチル化プライマーのそれぞれについて、以下の組成のＰＣＲ反応液を調製し、９５℃、３０秒間の熱処理後、熱変性（９４℃、３０秒）→アニーリング（メチル化プライマー：５７．４℃、非メチル化プライマー：５６．０℃、いずれも３０秒）→伸長（７２℃、３０秒）の３ステップを、メチル化プライマーを用いた場合は３５回、非メチル化プライマーを用いた場合は３０回繰り返した。なお、メチル化プライマーを用いたＰＣＲ反応をメチル化増幅、非メチル化プライマーを用いたＰＣＲ反応を非メチル化増幅とする。
【００５９】
またメチル化／非メチル化特異的な増幅が行われているかどうかを確認する目的で、メチル化／非メチル化コントロールゲノム（ＥｐｉＴｅｃｔ ＰＣＲ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＤＮＡ，ＱＩＡＧＥＮ，５９６９５）を用いて同様にＰＣＲを行った。
【００６０】
ＰＣＲ反応液組成
ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ＨＳ（タカラバイオ、ＲＲ００６Ａ） ０．１μＬ
１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ） ２ μＬ
ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（タカラバイオ） １．６μＬ
プライマー（１０ｐｍｏｌ ｅａｃｈ／μＬ） ０．８μＬ
ゲノムＤＮＡ（（１）にて調製） ２．５μＬ
蒸留水（ＤＷ） １３μＬ
（合計 ２０μＬ）
【００６１】
ＰＣＲ後の増幅産物を、２．５％アガロースゲルに電気泳動し、ゲルスター（タカラバイオ）溶液中でＤＮＡを染色した。ＵＶ照射により発光するバンドの強度を比較分析した。結果を表２及び図１〜図８に示す。なお、表２に示すバンド強度は、バンドの発光強度をゲル解析ソフトＬａｂｗｏｒｋｓにより数値化したものである。
【００６２】
メチル化増幅、非メチル化増幅のいずれの場合にも、バンド強度に個人差が認められた。具体的には、２０代男性同士（被験者Ａと被験者Ｂ）の比較では、脱毛症進行者である被験者Ａにおいて、メチル化増幅ではバンドが観察され非メチル化増幅ではバンドがほとんど見えなかったことから（図１、図５、表２）、メチル化の傾向が強く同時に非メチル化が弱い傾向であった。一方、脱毛症が認められなかった被験者Ｂと被験者Ｃの比較では、メチル化増幅では被験者Ｃにおいて増幅産物のバンドが多少ではあるが観察されたが（図３）、被験者ＢではＢ１のレーンで薄いバンドが観察されたのみで、Ｂ２のレーンでは観察されなかった（図２）。これに対し、非メチル化増幅では被験者Ｃよりも被験者Ｂにおいて比較的はっきりとしたバンドが観察された（図６、図７）。このことから、脱毛症が認められない者同士の比較では、加齢によりメチル化の傾向が強く、非メチル化の傾向が弱いことが判明した。
【００６３】
【表２】
【００６４】
実施例２
（１）ゲノムＤＮＡの抽出
ゲノム提供者Ｄ（２０代男性、男性型脱毛症進行者）及びＥ（２０代男性、脱毛症の兆候なし）の頭部から毛髪５本を抜き、エタノールにて洗浄した。毛髪のうち毛根約２ｃｍを５ｍｍ程度に裁断し、ＩＳＯＨＡＩＲ（ニッポンジーン、３１９−０３４０１）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。詳細な操作は、ＩＳＯＨＡＩＲ添付のプロトコールに従った。
【００６５】
得られたゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩにて断片化し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール、エタノールにて精製した。２６０ｎｍの吸光度の値からＤＮＡ濃度を測定し、２００ｎｇの断片化ゲノムＤＮＡを対象に、バイサルファイト処理（非メチル化シトシンをウラシルに変換する処理）を行った。バイサルファイト処理は、ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｇｏｌｄ Ｋｉｔ（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ，Ｄ５００５）を用い、詳細な操作は添付のプロトコールに従った。
【００６６】
（２）バイサルファイトシーケンス法
ＢＭＰＲ１Ａ（ＮＭ＿００４３２９）の転写開始点を０とし、上流−１，２００ｂから＋４００ｂまでの領域を対象としたバイサルファイトシーケンス条件を５つ設定した（図９）。各条件に対応するプライマーを設計した。バイサルファイトシーケンス条件の詳細及びプライマーの配列を表３に示す。
【００６７】
【表３】
【００６８】
バイサルファイトシーケンスは、（２−１）ＰＣＲ、（２−２）クローニング、（２−３）シーケンス及び（２−４）データ解析の順に実施した。
【００６９】
（２−１）ＰＣＲ
表１に示すプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。具体的には、以下の組成のＰＣＲ反応液を調製し、９５℃、３０秒間の熱処理後、熱変性（９４℃、３０秒）→アニーリング（５７℃〜６５℃）→伸長（７２℃、３０秒）の３ステップを４０回繰り返した。
【００７０】
〔ＰＣＲ反応液組成〕
ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ＨＳ（タカラバイオ、ＲＲ００６Ａ） ０．２μＬ
１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ、ＲＲ００６Ａ） ６ μＬ
ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（タカラバイオ、ＲＲ００６Ａ） ４．８μＬ
センスプライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ） ３ μＬ
アンチセンスプライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ） ３ μＬ
ゲノムＤＮＡ（（１）にて調製） ２ μＬ
ＤＷ（蒸留水） ４１ μＬ
（合計 ６０ μＬ）
【００７１】
（２−２）クローニング
（ａ）ＤＮＡ精製
（２−１）で得られたＰＣＲ産物を２．５％アガロース（タカラバイオ、５００３）電気泳動し、ゲルスター（タカラバイオ、Ｆ０５３５）で染色した後、目的のバンドを切り出した。これを細かく裁断し、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｐｒｅｐ Ｆｒｅｅｚｅ’Ｎ Ｓｑｕｅｅｚｅ ＤＮＡ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（ＢＩＯＲＡＤ、７３２−６１６６）のフィルターカップに充填した。−２０℃に５分間以上放置し、室温にて１３，０００×ｇ、３分間遠心分離した。フィルターカップを通過して溶出したＤＮＡ溶液に、１００％エタノールを２．５倍量、３Ｍ酢酸ナトリウムを１／１０倍量添加し、−８０℃に１５分間放置した。１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、得られた白色ペレットを７０％エタノールで洗浄後、１７μＬの蒸留水（以下、ＤＷと言う）に溶解した。
【００７２】
（ｂ）ライゲーション
（ａ）で精製したＤＮＡ溶液の全量を用いて、ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応は、Ｍｉｇｈｔｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｅｔ（Ｂｌｕｎｔ ＥｎｄＩ）（タカラバイオ、６０２７）を用いて行った。精製ＤＮＡ溶液（１７μＬ）に１０×Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｎａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを２μＬ、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｎａｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘを１μＬ添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。この反応液にＤＷを８０μＬ添加して全量１００μＬとした後、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１、ｖ／ｖ）（ＧＩＢＣＯ，１５５９３−０３１）を１００μＬ添加して、混合した。室温で１２，０００ｒｐｍ、５分間遠心操作を行い、ＤＮＡを含む上層を採取した。
【００７３】
１００％エタノールを２．５倍量、３Ｍ酢酸ナトリウムを１／１０倍量添加し、−８０℃に１５分間放置した。１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、得られた白色ペレットを７０％エタノールで洗浄後、１０μＬのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０、ナカライテスク、３２７３９−３１）に溶解した。
【００７４】
（ｃ）トランスフォーメーション
（ｂ）で得られたＤＮＡ溶液５μＬに、ｐＵＣ１１８ ＨｉｎｃＩＩ／ＢＡＰを１μＬ加え、混合した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘを６μＬ加え混合した後、１６℃で１時間インキュベートした。この６μＬを、５０μＬのＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ（タカラバイオ、９０５２）に加え、穏やかに混合した後、氷中で３０分間放置した。その後４２℃で４５秒間インキュベートし、氷中２分間放置した。そこに、あらかじめ３７℃に保温しておいたＳＯＣ培地を４４４μＬ添加し、３７℃で１時間振とうした。アンピシリン（Ｓｉｇｍａ、Ａ９３９３）を５０μｇ／ｍＬ含むＬＢ寒天培地（９０ｍｍ ｄｉｓｈ）に３０μＬ播種し、３７℃で一昼夜培養した。得られたコロニーについてコロニーＰＣＲを実施し、インサートの確認を行った。
【００７５】
（ｄ）プラスミド抽出
プラスミドの抽出は、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，２７１０６）を用いて行った。コロニーＰＣＲにてインサートが確認されたコロニーを、アンピシリンを５０μｇ／ｍＬ含む２．５ｍＬ ＬＢ培地に加え、３７℃で一昼夜振とう培養した。得られた菌液を６，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、上清を除去して、菌ペレットを得た。ここに２５０μＬのＢｕｆｆｅｒ Ｐ１を加えて懸濁の後、２ｍＬマイクロチューブに移した。２５０μＬのＢｕｆｆｅｒ Ｐ２を加え、４〜６回転倒混和し、３５０μＬのＢｕｆｆｅｒ Ｎ３を加えて、さらに４〜６回転倒混和した。１３，０００ｒｐｍにて１０分間遠心操作し、白色ペレットを除いた上清をＱＩＡｐｒｅｐスピンカラムにアプライした。１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、カラム透過液を除去した。
【００７６】
ここに５００μＬのＢｕｆｆｅｒ ＰＢを添加し、遠心分離して透過液を除去した。さらにカラムに７５０μＬのＢｕｆｆｅｒ ＰＥを加え、遠心分離して透過液を除去した。残留しているバッファーを除去するため、再度遠心操作を行った後、カラムを１．５ｍＬコレクションチューブに移した。Ｂｕｆｆｅｒ ＥＢを５０μＬ加え、１分間放置した後、遠心分離にてカラムより溶出してきた液をプラスミド溶液として回収した。このプラスミド溶液に、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール精製、エタノール精製を行い、２０μＬのＤＷに溶解して、その後のシーケンスに用いた。
【００７７】
（２−３）シーケンス
（２−２）で得られたプラスミドについて、インサート（解析対象領域）のシーケンスを行った。シーケンスにはタカラバイオのプレミックスシーケンスを利用した。シーケンス用プライマーには、Ｍ１３ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍ４（５’−ＧＴＴＴＴ ＣＣＣＡＧ ＴＣＡＣＧ ＡＣ−３’、配列番号４４）を用いた。全量１５μＬに、プラスミドＤＮＡが約３００〜６００ｎｇ、プライマーが７．５ｐｍｏｌ含まれるように調整し、タカラバイオに送付した。
【００７８】
（２−４）データ解析
（２−３）で得られたシーケンス結果の解析は、バイサルファイトシーケンスデータの解析が容易に行える公開ウェブサイトＱＵＭＡ（Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｏｏｌ ｆｏｒ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ，ｈｔｔｐ：／／ｑｕｍａ．ｃｄｂ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ｔｏｐ／ｉｎｄｅｘ＿ｊ．ｈｔｍｌ）を利用した。各サンプル２４個前後のクローンのシーケンス結果を用いて解析を行ったが、解析対象として不適切な配列である場合は、解析対象から除外した。その際の判断基準は、（１）バイサルファイト処理による未変換Ｃが５以下であること、（２）バイサルファイト処理による変換Ｃが９５％以上であること、（３）ミスマッチ配列が１０以下であること、及び（４）配列同一性が９０％以上であること、とした。
【００７９】
結果を表４に示す。
【００８０】
【表４】
【００８１】
解析対象領域１及び４では、被験者Ｄ（脱毛症兆候者）で被験者Ｅ（脱毛症の兆候なし）よりもメチル化度が高かった。一方、解析領域２及び５では、被験者Ｄ（脱毛兆候者）で被験者Ｅ（脱毛症の兆候なし）よりメチル化度が低かった。一方、解析対象領域３では、被験者同士での差は見出せなかった。
【００８２】
実施例３
（１）ゲノムＤＮＡの抽出
ゲノム提供者Ｆ（２０代男性、男性型脱毛兆候者）、Ｇ（２０代男性、脱毛症の兆候なし）の頭部から毛髪５本を抜き、エタノールにて洗浄した。毛根約２ｃｍを５ｍｍ程度に裁断し、ＩＳＯＨＡＩＲ（ニッポンジーン、３１９−０３４０１）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。詳細な操作は、ＩＳＯＨＡＩＲ添付のプロトコルに従った。
【００８３】
得られたゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩにて断片化し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール、エタノールにて精製した。２６０ｎｍの吸光度の値からＤＮＡ濃度を測定し、２００ｎｇの断片化ゲノムＤＮＡを対象に、バイサルファイト処理（非メチル化シトシンをウラシルに変換する処理）を行った。バイサルファイト処理は、ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｇｏｌｄ Ｋｉｔ（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ，Ｄ５００５）を用い、詳細な操作は添付のプロトコールに従った。
【００８４】
（２）メチル化／非メチル化特異的ＰＣＲ
ＥｐｈＡ４（ＮＭ＿００４４３８）の翻訳開始コドンＡを１とした場合の、上流−１２７から＋７５までを増幅するプライマーを設計した。プライマーには本領域のＣｐＧ領域を含み、このＣｐＧ領域のメチル化シトシンを認識するメチル化プライマーと、メチル化されていないシトシンを認識する非メチル化プライマーをそれぞれ設計した（図２８）。図２８の下線部分は各プライマーに対応する配列領域を示す。プライマーの配列を表５に示す。
【００８５】
また、Ｗｎｔ１０ｂ（ＮＭ＿００３３９４）の翻訳開始コドンＡを１とした場合の、上流−２９５から−１９０までを増幅するプライマーを設計した。プライマーには本領域のＣｐＧ領域を含み、このＣｐＧ領域のメチル化シトシンを認識するメチル化プライマーと、メチル化されていないシトシンを認識する非メチル化プライマーをそれぞれ設計した。プライマーの配列を表５に示す。
さらに、コントロールとしてのβ−ｃａｔｅｎｉｎの解析用に、ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ（ＮＭ＿００１０９８２０９）の翻訳開始コドンＡを１とした場合の、−８１３ｂから−７０５ｂまでを対象としたプライマーを設計した。
【００８６】
【表５】
【００８７】
本プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。具体的には以下の組成のＰＣＲ反応液を調製し、９４℃、５分間の熱処理後、熱変性（９４℃、１５秒）→アニーリング（ＥｐｈＡ４ 非メチル化プライマー：５１℃、メチル化プライマー：５６℃ Ｗｎｔ１０ｂ 非メチル化プライマー：６０℃、メチル化プライマー：５８℃、いずれも３０秒）→伸長（７２℃、１５秒）の３ステップを４０回繰り返した。
【００８８】
〔ＰＣＲ反応液組成〕
酵素（ＴＡＫＡＲＡ ＥｘＴａｑ ＨＳ：タカラバイオ、又はＨｓ ＳｔａｒＴａｑ ｐｌｕｓ：ＱＩＡＧＥＮ） ０．１μＬ
１０×ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｆ ２ μＬ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ １．６μＬ
プライマー Ｆｏｒｗａｒｄ（０．５６ ｐｍｏｌ／μＬ） ６．５μＬ
プライマー Ｒｅｖｅｒｓｅ（０．５６ｐｍｏｌ／μＬ） ６．５μＬ
バイサルファイト処理ＤＮＡ（（１）にて調製） ０．３μＬ
滅菌水 １０．５μＬ
（合計 ２０ μＬ）
【００８９】
またメチル化／非メチル化特異的な増幅が行われているかどうかを確認する目的で、メチル化／非メチル化コントロールゲノム（ＥｐｉＴｅｃｔ ＰＣＲ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＤＮＡ，ＱＩＡＧＥＮ，５９６９５）を用いて同様にＰＣＲを行った。
【００９０】
ＰＣＲ後の増幅産物を、２．５％アガロースゲルに電気泳動し、ゲルスター（タカラバイオ）溶液中でＤＮＡを染色した。ＵＶ照射により発光するバンドの強度を比較分析した。ＥｐｈＡ４のメチル化解析結果を表６及び図１０〜図１５に、それぞれ示す。Ｗｎｔ１０ｂのメチル化解析結果を表７及び図１６〜図２１に、それぞれ示す。またβ−ｃａｔｅｎｉｎのメチル化解析の結果を表８及び図２２〜図２７に、それぞれ示す。
【００９１】
ＥｐｈＡ４、Ｗｎｔ１０ｂ両方共に、被験者Ｆ（脱毛症兆候あり）において、被験者Ｇ（脱毛症兆候なし）よりもメチル化度が高いことが明らかになった。一方で発毛因子のひとつであるβ−ｃａｔｅｎｉｎのメチル化状態は、被験者Ｆ及びＧともに完全な非メチル化状態であることが明らかとなった。
【００９２】
【表６】
【００９３】
【表７】
【００９４】
【表８】
【符号の説明】
【００９５】
図４と８中のＭとＵは、それぞれ、メチル化コントロールゲノムを鋳型とした場合の増幅産物、非メチル化コントロールゲノムを鋳型とした場合の増幅産物の結果を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００９６】
配列番号１〜３及び８〜１３：骨形成タンパク質受容体遺伝子のメチル化領域の塩基配列の例
配列番号４〜７：骨形成タンパク質受容体遺伝子のメチル化及び非メチル化プライマーの塩基配列の例
配列番号１４〜１６：エフリン受容体遺伝子のメチル化領域の塩基配列の例
配列番号１７〜１９：Ｗｎｔ遺伝子のメチル化領域の塩基配列の例
配列番号２０〜２３：エフリン受容体遺伝子のメチル化及び非メチル化プライマーの例
配列番号２４〜２７：Ｗｎｔ遺伝子のメチル化及び非メチル化プライマーの例
配列番号２８〜３５：骨形成タンパク質受容体遺伝子のバイサルファイトシーケンス用プライマーの塩基配列の例
配列番号３６〜３７：実施例２で用いた骨形成タンパク質受容体遺伝子のバイサルファイトシーケンス用プライマーの塩基配列の例
配列番号３８〜４１：実施例３で用いたβ−カテニンのメチル化及び非メチル化プライマーの例
配列番号４２：Ｗｎｔ遺伝子の非メチル化プライマーによる増幅領域の例
配列番号４３：エフリン受容体遺伝子の非メチル化領域の塩基配列の例
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子及びＷｎｔ遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出する方法。
【請求項２】
前記生体試料は、抜去毛である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抜去毛は、毛根を含む抜去毛である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記骨形成タンパク質受容体遺伝子が、骨形成タンパク質受容体１Ａ型遺伝子である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記骨形成タンパク質受容体遺伝子中のメチル化領域が、下記の（Ａ−１）〜（Ａ−１８）のいずれかの塩基配列の領域である、請求項４に記載の方法。
（Ａ−１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列
（Ａ−２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列の全部又は一部からなる塩基配列
（Ａ−３）配列表の配列番号２に記載の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列
（Ａ−４）配列表の配列番号２に記載の塩基配列の全部又は一部からなる塩基配列
（Ａ−５）配列表の配列番号３に記載の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列
（Ａ−６）配列表の配列番号３に記載の塩基配列の全部又は一部からなる塩基配列
（Ａ−７）配列表の配列番号８に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ａ−８）配列表の配列番号８に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
（Ａ−９）配列表の配列番号９に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ａ−１０）配列表の配列番号９に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
（Ａ−１１）配列表の配列番号１０に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ａ−１２）配列表の配列番号１０に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
（Ａ−１３）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ａ−１４）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
（Ａ−１５）配列表の配列番号１２に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ａ−１６）配列表の配列番号１２に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
（Ａ−１７）配列表の配列番号１３に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ａ−１８）配列表の配列番号１３に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
【請求項６】
前記エフリン受容体遺伝子が、ＥｐｈＡ４遺伝子である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記メチル化領域が、下記の（Ｃ−１）〜（Ｃ−６）のいずれかの塩基配列の領域である、請求項６に記載の方法。
（Ｃ−１）配列表の配列番号１４に記載の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列
（Ｃ−２）配列表の配列番号１４に記載の塩基配列の全部又は一部からなる塩基配列
（Ｃ−３）配列表の配列番号１５に記載の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列
（Ｃ−４）配列表の配列番号１５に記載の塩基配列の全部又は一部からなる塩基配列
（Ｃ−５）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列
（Ｃ−６）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列の全部又は一部からなる塩基配列
【請求項８】
前記Ｗｎｔ遺伝子が、Ｗｎｔ１０ｂ遺伝子である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記メチル化領域が、下記の（Ｅ−１）〜（Ｅ−６）のいずれかの塩基配列の領域である、請求項８に記載の方法。
（Ｅ−１）配列表の配列番号１７に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ｅ−２）配列表の配列番号１７に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
（Ｅ−３）配列表の配列番号１８に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ｅ−４）配列表の配列番号１８に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
（Ｅ−５）配列表の配列番号１９に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ｅ−６）配列表の配列番号１９に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
【請求項１０】
前記メチル化領域を、メチル化されている塩基を認識するプライマー及び／又はメチル化されていない塩基を認識するプライマーを用いて増幅させてから、メチル化度を判定する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記プライマーが、以下の（Ｂ−１）〜（Ｂ−８）から選ばれるポリヌクレオチドである、請求項１０に記載の方法。
（Ｂ−１）配列表の配列番号４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｂ−２）配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ−３）配列表の配列番号５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｂ−４）配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ−５）配列表の配列番号６に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｂ−６）配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ−７）配列表の配列番号７に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｂ−８）配列表の配列番号７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
【請求項１２】
前記プライマーが、以下の（Ｄ−１）〜（Ｄ−８）から選ばれるポリヌクレオチドである、請求項１０に記載の方法。
（Ｄ−１）配列表の配列番号２０に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｄ−２）配列表の配列番号２０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｄ−３）配列表の配列番号２１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｄ−４）配列表の配列番号２１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｄ−５）配列表の配列番号２２に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｄ−６）配列表の配列番号２２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｄ−７）配列表の配列番号２３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｄ−８）配列表の配列番号２３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
【請求項１３】
前記プライマーが、以下の（Ｆ−１）〜（Ｆ−８）から選ばれるポリヌクレオチドである、請求項１０に記載の方法。
（Ｆ−１）配列表の配列番号２４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｆ−２）配列表の配列番号２４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｆ−３）配列表の配列番号２５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｆ−４）配列表の配列番号２５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｆ−５）配列表の配列番号２６に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｆ−６）配列表の配列番号２６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｆ−７）配列表の配列番号２７に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｆ−８）配列表の配列番号２７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
【請求項１４】
前記メチル化領域をプライマーにより増幅させてから、増幅産物をシーケンシングしてメチル化度を判定する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記プライマーが、以下の（Ｇ−１）〜（Ｇ−１６）から選ばれるポリヌクレオチドである、請求項１４に記載の方法。
（Ｇ−１）配列表の配列番号２８に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−２）配列表の配列番号２８に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−３）配列表の配列番号２９に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−４）配列表の配列番号２９に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−５）配列表の配列番号３０に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−６）配列表の配列番号３０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−７）配列表の配列番号３１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−８）配列表の配列番号３１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−９）配列表の配列番号３２に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−１０）配列表の配列番号３２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−１１）配列表の配列番号３３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−１２）配列表の配列番号３３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−１３）配列表の配列番号３４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−１４）配列表の配列番号３４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−１５）配列表の配列番号３５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−１６）配列表の配列番号３５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
【請求項１６】
被験者生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子及びＷｎｔ遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出し、健常者の生体試料の前記メチル化領域のメチル化度と差がある場合には、前記被験者の脱毛症の発症リスクが高いと判定する、前記被験者の脱毛症の発症リスクを予測する方法。
【請求項１７】
被験者から採取された生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子及びＷｎｔ遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出し、健常者の生体試料の前記メチル化領域のメチル化度と差がある場合には、前記被験者の脱毛症治療及び／又は予防剤に対する応答性が高いと判定する、前記被験者の脱毛症治療及び／又は予防剤に対する応答性を予測する方法。
【請求項１８】
前記脱毛症治療及び／又は予防剤が、骨形成タンパク質促進剤、エフリン促進剤、及びＷｎｔ促進剤である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記骨形成タンパク質促進剤及びエフリン促進剤が、６−ベンジルアミノプリンであることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子及びＷｎｔ遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子のメチル化領域中のメチル化されている塩基を認識するプライマー及び／又はメチル化されていない塩基を認識するプライマーを含む、生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子、及びＷｎｔ遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出するためのプライマーセット。
【請求項２１】
前記プライマーが、下記の（Ｂ−１）〜（Ｂ−８）、（Ｄ−１）〜（Ｄ−８）、及び（Ｆ−１）〜（Ｆ−８）から選ばれる１又は２以上のプライマーである、請求項２０に記載のプライマーセット。
（Ｂ−１）配列表の配列番号４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｂ−２）配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ−３）配列表の配列番号５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｂ−４）配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ−５）配列表の配列番号６に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｂ−６）配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ−７）配列表の配列番号７に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｂ−８）配列表の配列番号７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｄ−１）配列表の配列番号２０に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｄ−２）配列表の配列番号２０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｄ−３）配列表の配列番号２１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｄ−４）配列表の配列番号２１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｄ−５）配列表の配列番号２２に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｄ−６）配列表の配列番号２２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｄ−７）配列表の配列番号２３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｄ−８）配列表の配列番号２３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｆ−１）配列表の配列番号２４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｆ−２）配列表の配列番号２４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｆ−３）配列表の配列番号２５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｆ−４）配列表の配列番号２５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｆ−５）配列表の配列番号２６に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｆ−６）配列表の配列番号２６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｆ−７）配列表の配列番号２７に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｆ−８）配列表の配列番号２７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
【請求項２２】
請求項２０又は２１に記載のプライマーを含む、生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子及びＷｎｔ遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出するために使用されるキット、試薬又は検出システム。
【請求項２３】
前記メチル化領域中メチル化領域を増幅するためのプライマーを含む、生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出するためのプライマーセット。
【請求項２４】
前記プライマーが、下記の（Ｇ−１）〜（Ｇ−１６）から選ばれる１又は２以上のプライマーである、請求項２３に記載のプライマーセット。
（Ｇ−１）配列表の配列番号２８に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−２）配列表の配列番号２８に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−３）配列表の配列番号２９に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−４）配列表の配列番号２９に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−５）配列表の配列番号３０に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−６）配列表の配列番号３０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−７）配列表の配列番号３１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−８）配列表の配列番号３１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−９）配列表の配列番号３２に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−１０）配列表の配列番号３２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−１１）配列表の配列番号３３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−１２）配列表の配列番号３３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−１３）配列表の配列番号３４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−１４）配列表の配列番号３４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−１５）配列表の配列番号３５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−１６）配列表の配列番号３５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
【請求項２５】
請求項２３又は２４に記載のプライマーを含む、生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出するために使用されるキット、試薬又は検出システム。
【請求項１】
生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子及びＷｎｔ遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出する方法。
【請求項２】
前記生体試料は、抜去毛である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抜去毛は、毛根を含む抜去毛である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記骨形成タンパク質受容体遺伝子が、骨形成タンパク質受容体１Ａ型遺伝子である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記骨形成タンパク質受容体遺伝子中のメチル化領域が、下記の（Ａ−１）〜（Ａ−１８）のいずれかの塩基配列の領域である、請求項４に記載の方法。
（Ａ−１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列
（Ａ−２）配列表の配列番号１に記載の塩基配列の全部又は一部からなる塩基配列
（Ａ−３）配列表の配列番号２に記載の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列
（Ａ−４）配列表の配列番号２に記載の塩基配列の全部又は一部からなる塩基配列
（Ａ−５）配列表の配列番号３に記載の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列
（Ａ−６）配列表の配列番号３に記載の塩基配列の全部又は一部からなる塩基配列
（Ａ−７）配列表の配列番号８に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ａ−８）配列表の配列番号８に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
（Ａ−９）配列表の配列番号９に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ａ−１０）配列表の配列番号９に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
（Ａ−１１）配列表の配列番号１０に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ａ−１２）配列表の配列番号１０に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
（Ａ−１３）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ａ−１４）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
（Ａ−１５）配列表の配列番号１２に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ａ−１６）配列表の配列番号１２に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
（Ａ−１７）配列表の配列番号１３に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ａ−１８）配列表の配列番号１３に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
【請求項６】
前記エフリン受容体遺伝子が、ＥｐｈＡ４遺伝子である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記メチル化領域が、下記の（Ｃ−１）〜（Ｃ−６）のいずれかの塩基配列の領域である、請求項６に記載の方法。
（Ｃ−１）配列表の配列番号１４に記載の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列
（Ｃ−２）配列表の配列番号１４に記載の塩基配列の全部又は一部からなる塩基配列
（Ｃ−３）配列表の配列番号１５に記載の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列
（Ｃ−４）配列表の配列番号１５に記載の塩基配列の全部又は一部からなる塩基配列
（Ｃ−５）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列
（Ｃ−６）配列表の配列番号１６に記載の塩基配列の全部又は一部からなる塩基配列
【請求項８】
前記Ｗｎｔ遺伝子が、Ｗｎｔ１０ｂ遺伝子である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記メチル化領域が、下記の（Ｅ−１）〜（Ｅ−６）のいずれかの塩基配列の領域である、請求項８に記載の方法。
（Ｅ−１）配列表の配列番号１７に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ｅ−２）配列表の配列番号１７に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
（Ｅ−３）配列表の配列番号１８に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ｅ−４）配列表の配列番号１８に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
（Ｅ−５）配列表の配列番号１９に記載の塩基配列の全部又は一部を含む領域
（Ｅ−６）配列表の配列番号１９に記載の塩基配列の全部又は一部からなる領域
【請求項１０】
前記メチル化領域を、メチル化されている塩基を認識するプライマー及び／又はメチル化されていない塩基を認識するプライマーを用いて増幅させてから、メチル化度を判定する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記プライマーが、以下の（Ｂ−１）〜（Ｂ−８）から選ばれるポリヌクレオチドである、請求項１０に記載の方法。
（Ｂ−１）配列表の配列番号４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｂ−２）配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ−３）配列表の配列番号５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｂ−４）配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ−５）配列表の配列番号６に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｂ−６）配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ−７）配列表の配列番号７に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｂ−８）配列表の配列番号７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
【請求項１２】
前記プライマーが、以下の（Ｄ−１）〜（Ｄ−８）から選ばれるポリヌクレオチドである、請求項１０に記載の方法。
（Ｄ−１）配列表の配列番号２０に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｄ−２）配列表の配列番号２０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｄ−３）配列表の配列番号２１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｄ−４）配列表の配列番号２１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｄ−５）配列表の配列番号２２に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｄ−６）配列表の配列番号２２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｄ−７）配列表の配列番号２３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｄ−８）配列表の配列番号２３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
【請求項１３】
前記プライマーが、以下の（Ｆ−１）〜（Ｆ−８）から選ばれるポリヌクレオチドである、請求項１０に記載の方法。
（Ｆ−１）配列表の配列番号２４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｆ−２）配列表の配列番号２４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｆ−３）配列表の配列番号２５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｆ−４）配列表の配列番号２５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｆ−５）配列表の配列番号２６に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｆ−６）配列表の配列番号２６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｆ−７）配列表の配列番号２７に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｆ−８）配列表の配列番号２７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
【請求項１４】
前記メチル化領域をプライマーにより増幅させてから、増幅産物をシーケンシングしてメチル化度を判定する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記プライマーが、以下の（Ｇ−１）〜（Ｇ−１６）から選ばれるポリヌクレオチドである、請求項１４に記載の方法。
（Ｇ−１）配列表の配列番号２８に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−２）配列表の配列番号２８に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−３）配列表の配列番号２９に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−４）配列表の配列番号２９に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−５）配列表の配列番号３０に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−６）配列表の配列番号３０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−７）配列表の配列番号３１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−８）配列表の配列番号３１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−９）配列表の配列番号３２に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−１０）配列表の配列番号３２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−１１）配列表の配列番号３３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−１２）配列表の配列番号３３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−１３）配列表の配列番号３４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−１４）配列表の配列番号３４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−１５）配列表の配列番号３５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−１６）配列表の配列番号３５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
【請求項１６】
被験者生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子及びＷｎｔ遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出し、健常者の生体試料の前記メチル化領域のメチル化度と差がある場合には、前記被験者の脱毛症の発症リスクが高いと判定する、前記被験者の脱毛症の発症リスクを予測する方法。
【請求項１７】
被験者から採取された生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子及びＷｎｔ遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出し、健常者の生体試料の前記メチル化領域のメチル化度と差がある場合には、前記被験者の脱毛症治療及び／又は予防剤に対する応答性が高いと判定する、前記被験者の脱毛症治療及び／又は予防剤に対する応答性を予測する方法。
【請求項１８】
前記脱毛症治療及び／又は予防剤が、骨形成タンパク質促進剤、エフリン促進剤、及びＷｎｔ促進剤である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記骨形成タンパク質促進剤及びエフリン促進剤が、６−ベンジルアミノプリンであることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子及びＷｎｔ遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子のメチル化領域中のメチル化されている塩基を認識するプライマー及び／又はメチル化されていない塩基を認識するプライマーを含む、生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子、及びＷｎｔ遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出するためのプライマーセット。
【請求項２１】
前記プライマーが、下記の（Ｂ−１）〜（Ｂ−８）、（Ｄ−１）〜（Ｄ−８）、及び（Ｆ−１）〜（Ｆ−８）から選ばれる１又は２以上のプライマーである、請求項２０に記載のプライマーセット。
（Ｂ−１）配列表の配列番号４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｂ−２）配列表の配列番号４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ−３）配列表の配列番号５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｂ−４）配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ−５）配列表の配列番号６に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｂ−６）配列表の配列番号６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｂ−７）配列表の配列番号７に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｂ−８）配列表の配列番号７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｄ−１）配列表の配列番号２０に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｄ−２）配列表の配列番号２０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｄ−３）配列表の配列番号２１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｄ−４）配列表の配列番号２１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｄ−５）配列表の配列番号２２に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｄ−６）配列表の配列番号２２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｄ−７）配列表の配列番号２３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｄ−８）配列表の配列番号２３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｆ−１）配列表の配列番号２４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｆ−２）配列表の配列番号２４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｆ−３）配列表の配列番号２５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｆ−４）配列表の配列番号２５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｆ−５）配列表の配列番号２６に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｆ−６）配列表の配列番号２６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｆ−７）配列表の配列番号２７に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｆ−８）配列表の配列番号２７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
【請求項２２】
請求項２０又は２１に記載のプライマーを含む、生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子、エフリン受容体遺伝子及びＷｎｔ遺伝子から選ばれる１又は２以上の遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出するために使用されるキット、試薬又は検出システム。
【請求項２３】
前記メチル化領域中メチル化領域を増幅するためのプライマーを含む、生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出するためのプライマーセット。
【請求項２４】
前記プライマーが、下記の（Ｇ−１）〜（Ｇ−１６）から選ばれる１又は２以上のプライマーである、請求項２３に記載のプライマーセット。
（Ｇ−１）配列表の配列番号２８に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−２）配列表の配列番号２８に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−３）配列表の配列番号２９に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−４）配列表の配列番号２９に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−５）配列表の配列番号３０に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−６）配列表の配列番号３０に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−７）配列表の配列番号３１に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−８）配列表の配列番号３１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−９）配列表の配列番号３２に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−１０）配列表の配列番号３２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−１１）配列表の配列番号３３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−１２）配列表の配列番号３３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−１３）配列表の配列番号３４に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−１４）配列表の配列番号３４に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（Ｇ−１５）配列表の配列番号３５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
（Ｇ−１６）配列表の配列番号３５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド
【請求項２５】
請求項２３又は２４に記載のプライマーを含む、生体試料の骨形成タンパク質受容体遺伝子中のメチル化領域のメチル化度を検出するために使用されるキット、試薬又は検出システム。
【図９】
【図２８】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【公開番号】特開２０１１−１４７４４３（Ｐ２０１１−１４７４４３Ａ）
【公開日】平成２３年８月４日（２０１１．８．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２８５１３８（Ｐ２０１０−２８５１３８）
【出願日】平成２２年１２月２１日（２０１０．１２．２１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 日本研究皮膚科学会第３５回年次学術大会・総会 プログラム・抄録集 発行日 平成２２年１１月５日 ［研究集会名等］ 日本研究皮膚科学会第３５回年次学術大会・総会 和歌山県民文化会館 公開日 平成２２年１２月３日
【出願人】（０００００６７６９）ライオン株式会社 (1,816)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年８月４日（２０１１．８．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月２１日（２０１０．１２．２１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 日本研究皮膚科学会第３５回年次学術大会・総会 プログラム・抄録集 発行日 平成２２年１１月５日 ［研究集会名等］ 日本研究皮膚科学会第３５回年次学術大会・総会 和歌山県民文化会館 公開日 平成２２年１２月３日
【出願人】（０００００６７６９）ライオン株式会社 (1,816)
【Ｆターム（参考）】
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