骨粗鬆症予防・治療剤および破骨細胞分化抑制剤
【課題】クズ（葛；Ｐｕｅｒａｒｉａ ｌｏｂａｔａ）を栽培し、クズ茎から機能性成分（イソフラボン類等）を生産効率良く、安定的に抽出すること、ならびにその抽出物を含有する骨粗鬆症予防・治療剤および破骨細胞抑制剤を提供することを目的とする。
【解決手段】クズ栽培において、収穫量が多く、かつ機能性成分（イソフラボン類等）を多く含有する木質化した当年生茎自体またはその抽出物を有効成分として含有することを特徴とする骨粗鬆症予防・治療剤および破骨細胞分化抑制剤、ならびにそれらを配合してなる医薬品または飲食品などを提供する。
【解決手段】クズ栽培において、収穫量が多く、かつ機能性成分（イソフラボン類等）を多く含有する木質化した当年生茎自体またはその抽出物を有効成分として含有することを特徴とする骨粗鬆症予防・治療剤および破骨細胞分化抑制剤、ならびにそれらを配合してなる医薬品または飲食品などを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クズ（葛；Ｐｕｅｒａｒｉａ ｌｏｂａｔａ）の木質化した当年生茎またはその抽出物を有効成分として含有することを特徴とする骨粗鬆症予防・治療剤および破骨細胞分化抑制剤、ならびにそれらを配合してなる医薬品または飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
破骨細胞分化異常促進に伴う疾患である骨粗鬆症や関節リウマチは、現在種々の薬物療法にて治療されているが、それは長期間の治療を要するのは事実である。従って、薬物療法をサポートするものとして、副作用が少なく安全性が高く、日常的に摂取可能で、骨粗鬆症や関節リウマチ等のように長期的治療を要する症状を予防し、その進展を抑制し、さらには改善作用を有するような機能性食品も望まれている。
【０００３】
近年、予防的な観点から、ヒトの健康状態や食品機能を科学的に研究する機能性食品、特にその有効成分の研究が盛んになされている。クズの根および多年生茎にはイソフラボン類が多く含まれており、その骨粗鬆症予防・治療用途について報告されている（特許文献１、２、非特許文献１）。しかし、一年生茎にはイソフラボン類が少量しか含まれていないことが報告されている（特許文献２）。
【０００４】
一方、骨粗鬆症は、骨を分解する「破骨細胞」の働きが、骨を形成する「骨芽細胞」の働きを上まわると、骨量が減って骨に小さな穴がたくさんできてしまう症状である。その破骨細胞は、骨髄細胞から分化して生成する細胞であるため、骨髄細胞から破骨細胞への分化を抑制すれば、破骨細胞による骨吸収亢進に伴う疾患である骨粗鬆症の進展抑制・治療することが知られている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−９５９７１号公報（第４頁、図１）
【特許文献２】国際公開第２００５／１０５１２５号パンフレット（第６〜８頁、図１）
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｘ．Ｗａｎｇら、メタボリズム（Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）、５４巻、１５３６−４１頁、２００５年（図２、３）
【非特許文献２】Ｄ．Ｓｈｏｂａｃｋ、ザ ジャーナル オブ クリニカル エンドクリノロジー アンド メタボリズム（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎοｌ Ｍｅｔａｂ），９２巻、７４７−７５３頁、２００７年（第７４８頁等）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
クズを栽培し、その茎から機能性成分等（イソフラボン類等）を安定的に採集することは、飲食品および医薬品開発上重要であるが、茎は栄養分を根等の保存器官へ輸送するための輸送器官であるため、イソフラボン類等の有効成分が多く含まれている時期を決定し採集することは難しい問題であった。特許文献２には、多年生茎がイソフラボン類を多く含有し、食品素材として望ましいことが報告されている。本発明者らは、先にクズを圃場で栽培する技術を確立して（特願２００７−２５０８２号；平成１９年９月２７日出願）、クズ茎を飲食品または医薬品原材料として利用することの検討を開始した。しかし、クズの栽培を実施すると、充実した芽は株元に存在し、春の萌芽後、旺盛に生育する。ところが落葉後は養分を根の方向へ転流させるため茎の先端から枯れ始め、翌年春には再度株元から旺盛に萌芽し、枯れ残った多年茎を覆って生育する。このため多年茎として収穫できる量は非常に少ないことが判明し、飲食品または医薬品原材料とするには、生産効率等に問題があった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、その年に新芽から生育したクズの当年生茎の中でも、落葉前後の木質化した茎には、意外にもイソフラボン類が多く含まれており、かつ多年生茎と同様に強い破骨細胞分化抑制作用を有し、さらに骨吸収抑制効果があることを見出し、ならびにその年に生育した当年生茎の地上部を全て刈り取ることは、イソフラボン類含量がある程度一定の材料を安定的に収穫することが可能で、かつ茎自体の収穫量も多年生茎と比較して飛躍的に多いため生産効率も高くなることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）クズ（Ｐｕｅｒａｒｉａ ｌｏｂａｔａ）の木質化した当年生茎またはその抽出物を有効成分として含有することを特徴とする骨粗鬆症予防・治療剤；
（２）クズ（Ｐｕｅｒａｒｉａ ｌｏｂａｔａ）の木質化した当年生茎またはその抽出物を有効成分として含有することを特徴とする破骨細胞分化抑制剤；
（３）前記木質化した当年生茎が落葉前後から翌年の発芽時期前までに採集されたものである（１）または（２）記載の剤；
（４）前記木質化した当年生茎が１０月から翌年の４月に採集されたものである（１）〜（３）のいずれかに記載の剤；
（５）前記抽出物が抽出エキスあるいは粉末状物である（１）または（２）記載の剤；
（６）前記抽出物が、水、炭素数１〜４のアルコール類およびケトン類からなる群より選択される１種以上の抽出溶媒を用いて調製されることを特徴とする（１）、（２）または（５）記載の剤；
（７）前記抽出溶媒が、水、エタノール、または水とエタノールとの混合溶媒である（６）記載の剤；
（８）（１）〜（７）いずれかに記載の剤を配合してなる医薬品；
（９）（１）〜（７）いずれかに記載の剤を配合してなる飲食品；
などを提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、クズ当年生茎またはその抽出物を有効成分として含有することを特徴とする骨粗鬆症予防・治療剤および破骨細胞分化抑制剤、ならびにそれらの剤を配合してなる医薬品および飲食品を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１におけるクズの各月当年生茎および多年生茎からの抽出率を示した図である。
【図２】実施例２におけるクズの１１月、１月当年生茎および多年生茎の破骨細胞形成数とＭＴＴ活性（細胞毒性）を示し、破骨細胞分化抑制活性を示した図である。
【図３】実施例４で得られたクズ当年生茎抽出物を９０日間投与後のＯＶＸマウス群およびｓｈａｍマウス群、ならびにコントロール群の尿中デオキシピリジノリン（Ｄｐｄ）量／クレアチニン（Ｃｒ）量比を示す。
【図４】実施例４で得られたクズ当年生茎抽出物を９０日間投与後のＯＶＸマウス群およびｓｈａｍマウス群、ならびにコントロール群の骨密度を示す。図中、＋ｖｉｎｅはクズ当年生茎抽出物投与を意味する。
【図５】実施例４で得られたクズ当年生茎抽出物を９０日間投与後のＯＶＸマウス群およびｓｈａｍマウス群、ならびにコントロール群の骨強度を示す。図中、＋ｖｉｎｅはクズ当年生茎抽出物投与を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下において、本発明を詳細に説明する。本発明において、クズ（葛；Ｐｕｅｒａｒｉａ ｌｏｂａｔａ）の当年生茎とは、新たにその年に生育した茎であり翌年の発芽前までに生育した茎を言う。木質化した当年生茎とは、発芽から１年以内に生育した茎で、茎の表面が固くなり木の表面のようになっている茎を言い、茎の内部が木質化していないものも含む。本発明において好ましい木質化した当年生茎とは、落葉前後から翌年の発芽前までの木質化した茎のことである。即ち、その年に生育した茎で、１０月頃から翌年４月頃の発芽前までの茎のことであり、特に１１月から２月頃までの当年生茎が好ましい。なお、当年生茎と多年生茎との収穫量比は、大体５０〜１００対１程度である。
【００１３】
収穫した茎を水洗し必要により乾燥したものを、細断または粉砕した細断物あるいは粉末状物のものが用いられる。また、クズ茎抽出物としては、クズ茎の細断物あるいは粉末状物を水や有機溶媒、あるいはその混合物にて抽出したもの、あるいはその抽出液を濃縮して得られた濃縮物（エキス）、あるいはその濃縮物を真空乾燥、スプレー乾燥、凍結乾燥をして粉末化したものなどが用いられる。さらには、クズ茎の抽出物を活性炭による脱色操作、異なる溶媒抽出操作やクロマトグラフィー操作等にて、精製されたクズ茎成分も用いられる。
【００１４】
クズ茎の乾燥法としては、自然乾燥をはじめ、熱風乾燥法、凍結乾燥法、マイクロ波乾燥法ならびに遠赤外・近赤外乾燥法等が用いられる。
【００１５】
細断あるいは粉砕は、破砕機、ミキサーをはじめとする任意の装置を用いた任意の方法ですることが出来る。また、破砕物は、チップ、粉体など任意の形状であることができる。
【００１６】
クズ茎からの有効成分抽出手段として、溶媒抽出法と超臨界抽出法が用いられる。超臨界抽出法としては、通常、超臨界状態の二酸化炭素を使用してクズ茎から抽出することができる。
【００１７】
一方、溶媒抽出法に用いられる溶媒としては、水、ならびにアルコール類およびケトン類等の有機溶媒が用いられる。アルコール類としては、炭素数１〜４のアルコール類が好ましく、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノールおよびイソブタノール等が好ましい。ケトン類としては、アセトン、メチルエチルケトンが好ましい。これら溶媒は、単独でも２種類以上を混合して用いても良い。特に水およびエタノールを単独あるいはこれらを任意の比率で混合した混合溶媒系が安全性の点で好ましい。
【００１８】
抽出条件は任意に定めることができる。例えばクズ茎細断物または粉砕物を３〜１００倍程度の抽出溶媒に常温又は加熱下に０．５〜７２時間浸漬することにより抽出を行うことができる。抽出液は、ろ過または遠心分離により固形物を除去した後、そのまま使用しても良いが、公知の適当な方法で抽出溶媒を濃縮し、抽出エキスとして使用しても良く、または減圧乾燥、凍結乾燥あるいはスプレイドライにより粉末状物として得ることができる。
【００１９】
本発明のクズ茎抽出物は、そのままの形で摂取することは可能であるが、各種飲食品に添加してあるいは医薬組成物として使用することができる。飲食品の添加物として用いる場合は、菓子類、冷菓類、パン類、麺類および各種飲料に添加して使用することができ、または粉末状、顆粒状、カプセル状および錠剤などの形状の食品としても使用することができる。医薬品として用いる場合は、その剤形は特に限定されず、例えば、カプセル状、粉末状、顆粒状および錠剤などの医薬品・医薬部外品等の組成物として用いることができる。製剤化においては、薬剤学的に許容される他の製剤素材、例えば、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、酸化防止剤、着色剤、安定化剤などを適宜添加して調製することができる。
【００２０】
本発明の骨粗鬆症予防・治療作用および破骨細胞分化抑制作用を示すクズの当年生茎抽出物の活性成分としては、主としてプエラリン、ダイゼイン、ダイジン、マロニルダイジン、アセチルダイジン、ゲニステイン、ゲニスチン、マロニルゲニスチン、アセチルゲニスチン、グリシテイン、グリシチン、マロニルグリシチン、アセチルグリシチン、ホルモノネチン等のイソフラボン類である。クズ茎抽出物中のイソフラボン含量は、通常アグリコン換算で約４％〜３０％含まれ、プエラリンはイソフラボン含量の約１５〜６０％含まれる。また、これらイソフラボン成分の比率は、クズの根が作付けしてから何年経過しているかによっても異なる。１年目よりも２年目の方がプエラリンの含有率が多くなる傾向にある。
【００２１】
本発明のクズ茎抽出物を治療目的あるいは予防的目的の医薬として用いる場合の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的および投与される患者の年齢、体重、症状によって異なるが、成人１日当たり好ましくは０．０１〜２０００ｍｇ／ｋｇ体重（乾燥重量）であり、より好ましくは０．１〜２００ｍｇ／ｋｇ体重（乾燥重量）である。
【００２２】
一方、クズ茎またはその抽出物を飲食品として用いる場合の有効成分の摂取量は、好ましくは０・００５〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重（乾燥重量）、より好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重（乾燥重量）である。
【実施例】
【００２３】
以下に、本発明を実施例に基づいて説明する。本発明は以下の実施例によってなんら限定されるものではなく、本発明の属する技術分野における通常の変更を加えて実施することが出来ることは言うまでもない。
【００２４】
実施例１（季節変動２００６年７月〜２００７年４月）
２００６年７，９，１１月および翌年１，４月に、２００６年４月新芽発芽時期から１年以内に生育したクズ当年生茎を収穫した。なお、クズの栽培は、特願２００７−２５０８２号(平成１９年９月２７日)に示す栽培方法に従い圃場にて栽培した。これら収穫した当年生茎および対照の多年生茎を凍結乾燥した後、全量をワンダーブレンダーＷＢ−１（大阪ケミカル株式会社製）にて３０秒間破砕し粉末とした。各月当年生茎粉末１．０ｇおよび多年生茎粉末１．０ｇに、それぞれエタノール２０ｍＬを加えて、振盪器にて２５℃で４８時間振盪抽出をした後、抽出液を遠心器にて１０分間遠心分離を行った。上清をデカントし、ミリポアフィルターでろ過した。ろ液を減圧下濃縮乾固し、得られた抽出物の各イソフラボン量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で測定した。
【００２５】
得られた各月および対照サンプルの抽出率を図１に示す。また、得られた各月および対照サンプルの抽出物１００ｇあたりの各イソフラボン含有量、イソフラボン総量及びアグリコン換算量（ｇ）を表１に、さらに各サンプルの茎１００ｇあたりの各イソフラボン含有量、イソフラボン総量及びアグリコン換算総量（ｇ）を表２示す。以上の結果から、木質化した当年生茎（１１月、１月）のイソフラボン総量およびアグリコン換算総量は、多年生茎よりも若干低いが、木質化した当年生茎の収穫量が、多年生茎の収穫量のおおよそ５０〜１００倍量であることから、食品原材料として当年生茎を用いることが断然有利であることは明らかである。
【００２６】
【表１】
ＨＰＬＣの分析条件：
カラム：Ｗａｔｅｒｓ社ＳｙｍｍｅｔｒｙＣ１８ ３．５μｍ（２．１×１５０ｍｍ）
溶離液：Ａ：０．１％ギ酸入アセトニトリル１０％溶液
Ｂ：０．１％ギ酸入アセトニトリル３５％溶液
カラム温度：４０℃
流速：０．２５ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：ＵＶ検出器
【００２７】
【表２】
【００２８】
実施例２（破骨細胞分化抑制作用）
（１）試験方法
骨芽細胞様株化細胞であるＵＡＭＳ−３２細胞とマウス由来骨髄細胞の共存培養法を用いた。即ち、サンプルの破骨細胞分化抑制活性は破骨細胞（ＴＲＡＰ染色陽性）の形成した数をカウントして評価した。同時にＭＴＴ活性も測定しサンプルの細胞毒性の程度を測定した。
【００２９】
ＵＡＭＳ−３２細胞とマウス骨髄細胞を活性型ビタミンＤ３（１０−８Ｍ）およびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）（１０−６Ｍ）を含むα−ＭＥＭ培地（ａｌｐｈａ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）で培養した。２枚の９６穴プレートを用いて培養を開始し、１枚はＴＲＡＰ染色用、もう１枚はＭＴＴ活性測定用とした。実施例１と同様にして調製したサンプル（１１月、１月当年生茎および多年生茎）をＤＭＳＯに溶解し、１０ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した後、終濃度の２倍濃度になるようにα−ＭＥＭ培地で希釈し、１００μＬを培養開始時に添加した。活性型ビタミンＤ３（１０−８Ｍ）、ＰＧＥ２（１０−６Ｍ）も同様に終濃度の２倍濃度に調製し、１００μＬを培養開始時に添加した。培養開始３日目に培地交換を行った。即ち、ウェル中の２００μＬのうち１５０μＬをマイクロピペットで除去し、新たにサンプルを含む培地７５μＬと活性型ビタミンＤ３とＰＧＥ２を含む培地７５μＬを添加した。さらに６日間培養した後、一枚のプレートは、培養液を除去し、ＰＢＳで洗浄後、細胞をウェルに固定し、酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＰ）染色キットを用いて染色後、ウェル内の染色された細胞（破骨細胞）をカウントした。コントロールはサンプルを溶解しないＤＭＳＯのみを添加したものであり、コントロールを１００とした相対的破骨細胞数にてサンプルの破骨細胞分化抑制活性を評価した。もう一枚のプレートにＭＴＴ活性測定試薬（３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウム ブロマイド）を加えて反応後、吸光度を測定して、コントロールを１００として、細胞生存率を測定し細胞毒性の程度を評価した。
【００３０】
（２）試験結果
１１月、１月当年生茎および多年生茎抽出物の破骨細胞分化抑制効果および細胞毒性の試験結果を図２に示す。図２から明らかなように、１１月および１月当年生茎抽出物は、対照の多年生茎抽出物と同等の破骨細胞分化抑制作用を示した。
【００３１】
実施例３（季節変動２００７年８月〜２００８年２月）
実施例１と同様に２００７年４月頃の新芽から生育した当年生茎を８，９，１０，１１，１２月、２００８年１，２月に収穫し、実施例１と同様にして、各月当年生茎１００ｇ当たりの各イソフラボン量を算出した。結果を表３に示す。表３から明らかなように１０月以降はイソフラボン総量が多く、特に１２月および１月収穫の当年生茎は、多年生茎とほぼ同程度のイソフラボン総量を含有していることが判明した。
【００３２】
【表３】
【００３３】
実施例４（生物試験用サンプル調製）
２００８年２月に収穫した当年生茎を水洗し、自然乾燥後、細断機で平均長さ約１ｃｍに細断したクズ茎５０ｋｇに温水を加えて抽出した。抽出液を減圧濃縮後スプレイドライすると黄褐色粉末として３．７５ｋｇ得られた。得られた粉末を骨粗鬆症モデルマウスにおける試験用サンプルとした。
【００３４】
実施例５（骨粗鬆症モデルマウスにおける骨吸収抑制作用）
１１週齢の雌性ｄｄＹマウスに卵巣摘出手術（ＯＶＸ）を実施した群、ならびに偽手術（ｓｈａｍ）を実施した群を、それぞれ１週間の予備飼育後、一般状態に異常がみられなかったマウスを選択し、ＯＶＸおよびｓｈａｍそれぞれを２群に分け、計４群に分けた。
【００３５】
各々の群のマウスに、飼料は固形飼料ラボＭＲストックを、水は水道水を、自由摂取させた。ＯＶＸ群およびｓｈａｍ群に実施例４で得られた黄褐色粉末１１ｍｇ／ｋｇ（イソフラボンアグリコン換算で０．６ｍｇ／ｋｇ）の５ｍＬ／ｋｇ投与液量をゾンデにて胃内強制経口投与を行う。一方、コントロールとしてＯＶＸ群およびｓｈａｍ群には同量の蒸留水をゾンデにて経口投与した。投与期間は９０日で、投与前および９０日目に強制採尿して、デオキシピリジノリン(Ｄｐｄ)の尿中含量を、体外診断用医薬品（オステオリンクスＤＰＤ；ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）を用いてＥＬＩＳＡ法で測定した。さらにクレアチニン（Ｃｒ）量を測定し、その量比を算出した。結果は、図３に示す。
【００３６】
９０日間投与後、各群のマウスをペントバルビタールナトリウム麻酔下腹部大動脈より全採血して安楽死させ、左右大腿骨を摘出した。摘出した大腿骨は、−８０℃で保存後、海綿骨、皮質骨および全骨の密度、ならびに骨強度を、Ｃｏｍｐｕｔｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（ＣＴ）法を用いて測定した。結果は、図４および図５に示す。
【００３７】
図３に示すように、骨粗鬆症モデルマウス（ＯＶＸマウス）において、クズ当年生茎抽出物摂取群は、骨吸収マーカーであるデオキシピリジノリンの上昇を抑制し、さらに図４および５から、骨密度および骨強度は、コントロール群と比較して有意に高いことば明白であった。このことから、クズ当年生茎抽出物は、骨粗鬆症をはじめとする骨吸収性疾患の予防と治療に非常に効果的であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明により、安定的に、かつ生産効率良く収穫できるクズ当年生茎またはその抽出物を有効成分として含有することを特徴とする骨粗鬆症予防・治療剤および破骨細胞分化抑制剤、ならびにそれらの剤を配合してなる医薬品および飲食品を提供できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クズ（葛；Ｐｕｅｒａｒｉａ ｌｏｂａｔａ）の木質化した当年生茎またはその抽出物を有効成分として含有することを特徴とする骨粗鬆症予防・治療剤および破骨細胞分化抑制剤、ならびにそれらを配合してなる医薬品または飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
破骨細胞分化異常促進に伴う疾患である骨粗鬆症や関節リウマチは、現在種々の薬物療法にて治療されているが、それは長期間の治療を要するのは事実である。従って、薬物療法をサポートするものとして、副作用が少なく安全性が高く、日常的に摂取可能で、骨粗鬆症や関節リウマチ等のように長期的治療を要する症状を予防し、その進展を抑制し、さらには改善作用を有するような機能性食品も望まれている。
【０００３】
近年、予防的な観点から、ヒトの健康状態や食品機能を科学的に研究する機能性食品、特にその有効成分の研究が盛んになされている。クズの根および多年生茎にはイソフラボン類が多く含まれており、その骨粗鬆症予防・治療用途について報告されている（特許文献１、２、非特許文献１）。しかし、一年生茎にはイソフラボン類が少量しか含まれていないことが報告されている（特許文献２）。
【０００４】
一方、骨粗鬆症は、骨を分解する「破骨細胞」の働きが、骨を形成する「骨芽細胞」の働きを上まわると、骨量が減って骨に小さな穴がたくさんできてしまう症状である。その破骨細胞は、骨髄細胞から分化して生成する細胞であるため、骨髄細胞から破骨細胞への分化を抑制すれば、破骨細胞による骨吸収亢進に伴う疾患である骨粗鬆症の進展抑制・治療することが知られている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−９５９７１号公報（第４頁、図１）
【特許文献２】国際公開第２００５／１０５１２５号パンフレット（第６〜８頁、図１）
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｘ．Ｗａｎｇら、メタボリズム（Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）、５４巻、１５３６−４１頁、２００５年（図２、３）
【非特許文献２】Ｄ．Ｓｈｏｂａｃｋ、ザ ジャーナル オブ クリニカル エンドクリノロジー アンド メタボリズム（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎοｌ Ｍｅｔａｂ），９２巻、７４７−７５３頁、２００７年（第７４８頁等）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
クズを栽培し、その茎から機能性成分等（イソフラボン類等）を安定的に採集することは、飲食品および医薬品開発上重要であるが、茎は栄養分を根等の保存器官へ輸送するための輸送器官であるため、イソフラボン類等の有効成分が多く含まれている時期を決定し採集することは難しい問題であった。特許文献２には、多年生茎がイソフラボン類を多く含有し、食品素材として望ましいことが報告されている。本発明者らは、先にクズを圃場で栽培する技術を確立して（特願２００７−２５０８２号；平成１９年９月２７日出願）、クズ茎を飲食品または医薬品原材料として利用することの検討を開始した。しかし、クズの栽培を実施すると、充実した芽は株元に存在し、春の萌芽後、旺盛に生育する。ところが落葉後は養分を根の方向へ転流させるため茎の先端から枯れ始め、翌年春には再度株元から旺盛に萌芽し、枯れ残った多年茎を覆って生育する。このため多年茎として収穫できる量は非常に少ないことが判明し、飲食品または医薬品原材料とするには、生産効率等に問題があった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、その年に新芽から生育したクズの当年生茎の中でも、落葉前後の木質化した茎には、意外にもイソフラボン類が多く含まれており、かつ多年生茎と同様に強い破骨細胞分化抑制作用を有し、さらに骨吸収抑制効果があることを見出し、ならびにその年に生育した当年生茎の地上部を全て刈り取ることは、イソフラボン類含量がある程度一定の材料を安定的に収穫することが可能で、かつ茎自体の収穫量も多年生茎と比較して飛躍的に多いため生産効率も高くなることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）クズ（Ｐｕｅｒａｒｉａ ｌｏｂａｔａ）の木質化した当年生茎またはその抽出物を有効成分として含有することを特徴とする骨粗鬆症予防・治療剤；
（２）クズ（Ｐｕｅｒａｒｉａ ｌｏｂａｔａ）の木質化した当年生茎またはその抽出物を有効成分として含有することを特徴とする破骨細胞分化抑制剤；
（３）前記木質化した当年生茎が落葉前後から翌年の発芽時期前までに採集されたものである（１）または（２）記載の剤；
（４）前記木質化した当年生茎が１０月から翌年の４月に採集されたものである（１）〜（３）のいずれかに記載の剤；
（５）前記抽出物が抽出エキスあるいは粉末状物である（１）または（２）記載の剤；
（６）前記抽出物が、水、炭素数１〜４のアルコール類およびケトン類からなる群より選択される１種以上の抽出溶媒を用いて調製されることを特徴とする（１）、（２）または（５）記載の剤；
（７）前記抽出溶媒が、水、エタノール、または水とエタノールとの混合溶媒である（６）記載の剤；
（８）（１）〜（７）いずれかに記載の剤を配合してなる医薬品；
（９）（１）〜（７）いずれかに記載の剤を配合してなる飲食品；
などを提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、クズ当年生茎またはその抽出物を有効成分として含有することを特徴とする骨粗鬆症予防・治療剤および破骨細胞分化抑制剤、ならびにそれらの剤を配合してなる医薬品および飲食品を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１におけるクズの各月当年生茎および多年生茎からの抽出率を示した図である。
【図２】実施例２におけるクズの１１月、１月当年生茎および多年生茎の破骨細胞形成数とＭＴＴ活性（細胞毒性）を示し、破骨細胞分化抑制活性を示した図である。
【図３】実施例４で得られたクズ当年生茎抽出物を９０日間投与後のＯＶＸマウス群およびｓｈａｍマウス群、ならびにコントロール群の尿中デオキシピリジノリン（Ｄｐｄ）量／クレアチニン（Ｃｒ）量比を示す。
【図４】実施例４で得られたクズ当年生茎抽出物を９０日間投与後のＯＶＸマウス群およびｓｈａｍマウス群、ならびにコントロール群の骨密度を示す。図中、＋ｖｉｎｅはクズ当年生茎抽出物投与を意味する。
【図５】実施例４で得られたクズ当年生茎抽出物を９０日間投与後のＯＶＸマウス群およびｓｈａｍマウス群、ならびにコントロール群の骨強度を示す。図中、＋ｖｉｎｅはクズ当年生茎抽出物投与を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下において、本発明を詳細に説明する。本発明において、クズ（葛；Ｐｕｅｒａｒｉａ ｌｏｂａｔａ）の当年生茎とは、新たにその年に生育した茎であり翌年の発芽前までに生育した茎を言う。木質化した当年生茎とは、発芽から１年以内に生育した茎で、茎の表面が固くなり木の表面のようになっている茎を言い、茎の内部が木質化していないものも含む。本発明において好ましい木質化した当年生茎とは、落葉前後から翌年の発芽前までの木質化した茎のことである。即ち、その年に生育した茎で、１０月頃から翌年４月頃の発芽前までの茎のことであり、特に１１月から２月頃までの当年生茎が好ましい。なお、当年生茎と多年生茎との収穫量比は、大体５０〜１００対１程度である。
【００１３】
収穫した茎を水洗し必要により乾燥したものを、細断または粉砕した細断物あるいは粉末状物のものが用いられる。また、クズ茎抽出物としては、クズ茎の細断物あるいは粉末状物を水や有機溶媒、あるいはその混合物にて抽出したもの、あるいはその抽出液を濃縮して得られた濃縮物（エキス）、あるいはその濃縮物を真空乾燥、スプレー乾燥、凍結乾燥をして粉末化したものなどが用いられる。さらには、クズ茎の抽出物を活性炭による脱色操作、異なる溶媒抽出操作やクロマトグラフィー操作等にて、精製されたクズ茎成分も用いられる。
【００１４】
クズ茎の乾燥法としては、自然乾燥をはじめ、熱風乾燥法、凍結乾燥法、マイクロ波乾燥法ならびに遠赤外・近赤外乾燥法等が用いられる。
【００１５】
細断あるいは粉砕は、破砕機、ミキサーをはじめとする任意の装置を用いた任意の方法ですることが出来る。また、破砕物は、チップ、粉体など任意の形状であることができる。
【００１６】
クズ茎からの有効成分抽出手段として、溶媒抽出法と超臨界抽出法が用いられる。超臨界抽出法としては、通常、超臨界状態の二酸化炭素を使用してクズ茎から抽出することができる。
【００１７】
一方、溶媒抽出法に用いられる溶媒としては、水、ならびにアルコール類およびケトン類等の有機溶媒が用いられる。アルコール類としては、炭素数１〜４のアルコール類が好ましく、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノールおよびイソブタノール等が好ましい。ケトン類としては、アセトン、メチルエチルケトンが好ましい。これら溶媒は、単独でも２種類以上を混合して用いても良い。特に水およびエタノールを単独あるいはこれらを任意の比率で混合した混合溶媒系が安全性の点で好ましい。
【００１８】
抽出条件は任意に定めることができる。例えばクズ茎細断物または粉砕物を３〜１００倍程度の抽出溶媒に常温又は加熱下に０．５〜７２時間浸漬することにより抽出を行うことができる。抽出液は、ろ過または遠心分離により固形物を除去した後、そのまま使用しても良いが、公知の適当な方法で抽出溶媒を濃縮し、抽出エキスとして使用しても良く、または減圧乾燥、凍結乾燥あるいはスプレイドライにより粉末状物として得ることができる。
【００１９】
本発明のクズ茎抽出物は、そのままの形で摂取することは可能であるが、各種飲食品に添加してあるいは医薬組成物として使用することができる。飲食品の添加物として用いる場合は、菓子類、冷菓類、パン類、麺類および各種飲料に添加して使用することができ、または粉末状、顆粒状、カプセル状および錠剤などの形状の食品としても使用することができる。医薬品として用いる場合は、その剤形は特に限定されず、例えば、カプセル状、粉末状、顆粒状および錠剤などの医薬品・医薬部外品等の組成物として用いることができる。製剤化においては、薬剤学的に許容される他の製剤素材、例えば、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、酸化防止剤、着色剤、安定化剤などを適宜添加して調製することができる。
【００２０】
本発明の骨粗鬆症予防・治療作用および破骨細胞分化抑制作用を示すクズの当年生茎抽出物の活性成分としては、主としてプエラリン、ダイゼイン、ダイジン、マロニルダイジン、アセチルダイジン、ゲニステイン、ゲニスチン、マロニルゲニスチン、アセチルゲニスチン、グリシテイン、グリシチン、マロニルグリシチン、アセチルグリシチン、ホルモノネチン等のイソフラボン類である。クズ茎抽出物中のイソフラボン含量は、通常アグリコン換算で約４％〜３０％含まれ、プエラリンはイソフラボン含量の約１５〜６０％含まれる。また、これらイソフラボン成分の比率は、クズの根が作付けしてから何年経過しているかによっても異なる。１年目よりも２年目の方がプエラリンの含有率が多くなる傾向にある。
【００２１】
本発明のクズ茎抽出物を治療目的あるいは予防的目的の医薬として用いる場合の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的および投与される患者の年齢、体重、症状によって異なるが、成人１日当たり好ましくは０．０１〜２０００ｍｇ／ｋｇ体重（乾燥重量）であり、より好ましくは０．１〜２００ｍｇ／ｋｇ体重（乾燥重量）である。
【００２２】
一方、クズ茎またはその抽出物を飲食品として用いる場合の有効成分の摂取量は、好ましくは０・００５〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重（乾燥重量）、より好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重（乾燥重量）である。
【実施例】
【００２３】
以下に、本発明を実施例に基づいて説明する。本発明は以下の実施例によってなんら限定されるものではなく、本発明の属する技術分野における通常の変更を加えて実施することが出来ることは言うまでもない。
【００２４】
実施例１（季節変動２００６年７月〜２００７年４月）
２００６年７，９，１１月および翌年１，４月に、２００６年４月新芽発芽時期から１年以内に生育したクズ当年生茎を収穫した。なお、クズの栽培は、特願２００７−２５０８２号(平成１９年９月２７日)に示す栽培方法に従い圃場にて栽培した。これら収穫した当年生茎および対照の多年生茎を凍結乾燥した後、全量をワンダーブレンダーＷＢ−１（大阪ケミカル株式会社製）にて３０秒間破砕し粉末とした。各月当年生茎粉末１．０ｇおよび多年生茎粉末１．０ｇに、それぞれエタノール２０ｍＬを加えて、振盪器にて２５℃で４８時間振盪抽出をした後、抽出液を遠心器にて１０分間遠心分離を行った。上清をデカントし、ミリポアフィルターでろ過した。ろ液を減圧下濃縮乾固し、得られた抽出物の各イソフラボン量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で測定した。
【００２５】
得られた各月および対照サンプルの抽出率を図１に示す。また、得られた各月および対照サンプルの抽出物１００ｇあたりの各イソフラボン含有量、イソフラボン総量及びアグリコン換算量（ｇ）を表１に、さらに各サンプルの茎１００ｇあたりの各イソフラボン含有量、イソフラボン総量及びアグリコン換算総量（ｇ）を表２示す。以上の結果から、木質化した当年生茎（１１月、１月）のイソフラボン総量およびアグリコン換算総量は、多年生茎よりも若干低いが、木質化した当年生茎の収穫量が、多年生茎の収穫量のおおよそ５０〜１００倍量であることから、食品原材料として当年生茎を用いることが断然有利であることは明らかである。
【００２６】
【表１】
ＨＰＬＣの分析条件：
カラム：Ｗａｔｅｒｓ社ＳｙｍｍｅｔｒｙＣ１８ ３．５μｍ（２．１×１５０ｍｍ）
溶離液：Ａ：０．１％ギ酸入アセトニトリル１０％溶液
Ｂ：０．１％ギ酸入アセトニトリル３５％溶液
カラム温度：４０℃
流速：０．２５ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：ＵＶ検出器
【００２７】
【表２】
【００２８】
実施例２（破骨細胞分化抑制作用）
（１）試験方法
骨芽細胞様株化細胞であるＵＡＭＳ−３２細胞とマウス由来骨髄細胞の共存培養法を用いた。即ち、サンプルの破骨細胞分化抑制活性は破骨細胞（ＴＲＡＰ染色陽性）の形成した数をカウントして評価した。同時にＭＴＴ活性も測定しサンプルの細胞毒性の程度を測定した。
【００２９】
ＵＡＭＳ−３２細胞とマウス骨髄細胞を活性型ビタミンＤ３（１０−８Ｍ）およびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）（１０−６Ｍ）を含むα−ＭＥＭ培地（ａｌｐｈａ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）で培養した。２枚の９６穴プレートを用いて培養を開始し、１枚はＴＲＡＰ染色用、もう１枚はＭＴＴ活性測定用とした。実施例１と同様にして調製したサンプル（１１月、１月当年生茎および多年生茎）をＤＭＳＯに溶解し、１０ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した後、終濃度の２倍濃度になるようにα−ＭＥＭ培地で希釈し、１００μＬを培養開始時に添加した。活性型ビタミンＤ３（１０−８Ｍ）、ＰＧＥ２（１０−６Ｍ）も同様に終濃度の２倍濃度に調製し、１００μＬを培養開始時に添加した。培養開始３日目に培地交換を行った。即ち、ウェル中の２００μＬのうち１５０μＬをマイクロピペットで除去し、新たにサンプルを含む培地７５μＬと活性型ビタミンＤ３とＰＧＥ２を含む培地７５μＬを添加した。さらに６日間培養した後、一枚のプレートは、培養液を除去し、ＰＢＳで洗浄後、細胞をウェルに固定し、酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＰ）染色キットを用いて染色後、ウェル内の染色された細胞（破骨細胞）をカウントした。コントロールはサンプルを溶解しないＤＭＳＯのみを添加したものであり、コントロールを１００とした相対的破骨細胞数にてサンプルの破骨細胞分化抑制活性を評価した。もう一枚のプレートにＭＴＴ活性測定試薬（３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈテトラゾリウム ブロマイド）を加えて反応後、吸光度を測定して、コントロールを１００として、細胞生存率を測定し細胞毒性の程度を評価した。
【００３０】
（２）試験結果
１１月、１月当年生茎および多年生茎抽出物の破骨細胞分化抑制効果および細胞毒性の試験結果を図２に示す。図２から明らかなように、１１月および１月当年生茎抽出物は、対照の多年生茎抽出物と同等の破骨細胞分化抑制作用を示した。
【００３１】
実施例３（季節変動２００７年８月〜２００８年２月）
実施例１と同様に２００７年４月頃の新芽から生育した当年生茎を８，９，１０，１１，１２月、２００８年１，２月に収穫し、実施例１と同様にして、各月当年生茎１００ｇ当たりの各イソフラボン量を算出した。結果を表３に示す。表３から明らかなように１０月以降はイソフラボン総量が多く、特に１２月および１月収穫の当年生茎は、多年生茎とほぼ同程度のイソフラボン総量を含有していることが判明した。
【００３２】
【表３】
【００３３】
実施例４（生物試験用サンプル調製）
２００８年２月に収穫した当年生茎を水洗し、自然乾燥後、細断機で平均長さ約１ｃｍに細断したクズ茎５０ｋｇに温水を加えて抽出した。抽出液を減圧濃縮後スプレイドライすると黄褐色粉末として３．７５ｋｇ得られた。得られた粉末を骨粗鬆症モデルマウスにおける試験用サンプルとした。
【００３４】
実施例５（骨粗鬆症モデルマウスにおける骨吸収抑制作用）
１１週齢の雌性ｄｄＹマウスに卵巣摘出手術（ＯＶＸ）を実施した群、ならびに偽手術（ｓｈａｍ）を実施した群を、それぞれ１週間の予備飼育後、一般状態に異常がみられなかったマウスを選択し、ＯＶＸおよびｓｈａｍそれぞれを２群に分け、計４群に分けた。
【００３５】
各々の群のマウスに、飼料は固形飼料ラボＭＲストックを、水は水道水を、自由摂取させた。ＯＶＸ群およびｓｈａｍ群に実施例４で得られた黄褐色粉末１１ｍｇ／ｋｇ（イソフラボンアグリコン換算で０．６ｍｇ／ｋｇ）の５ｍＬ／ｋｇ投与液量をゾンデにて胃内強制経口投与を行う。一方、コントロールとしてＯＶＸ群およびｓｈａｍ群には同量の蒸留水をゾンデにて経口投与した。投与期間は９０日で、投与前および９０日目に強制採尿して、デオキシピリジノリン(Ｄｐｄ)の尿中含量を、体外診断用医薬品（オステオリンクスＤＰＤ；ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）を用いてＥＬＩＳＡ法で測定した。さらにクレアチニン（Ｃｒ）量を測定し、その量比を算出した。結果は、図３に示す。
【００３６】
９０日間投与後、各群のマウスをペントバルビタールナトリウム麻酔下腹部大動脈より全採血して安楽死させ、左右大腿骨を摘出した。摘出した大腿骨は、−８０℃で保存後、海綿骨、皮質骨および全骨の密度、ならびに骨強度を、Ｃｏｍｐｕｔｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（ＣＴ）法を用いて測定した。結果は、図４および図５に示す。
【００３７】
図３に示すように、骨粗鬆症モデルマウス（ＯＶＸマウス）において、クズ当年生茎抽出物摂取群は、骨吸収マーカーであるデオキシピリジノリンの上昇を抑制し、さらに図４および５から、骨密度および骨強度は、コントロール群と比較して有意に高いことば明白であった。このことから、クズ当年生茎抽出物は、骨粗鬆症をはじめとする骨吸収性疾患の予防と治療に非常に効果的であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明により、安定的に、かつ生産効率良く収穫できるクズ当年生茎またはその抽出物を有効成分として含有することを特徴とする骨粗鬆症予防・治療剤および破骨細胞分化抑制剤、ならびにそれらの剤を配合してなる医薬品および飲食品を提供できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クズ（Ｐｕｅｒａｒｉａ ｌｏｂａｔａ）の木質化した当年生茎またはその抽出物を有効成分として含有することを特徴とする骨粗鬆症予防・治療剤。
【請求項２】
クズ（Ｐｕｅｒａｒｉａ ｌｏｂａｔａ）の木質化した当年生茎またはその抽出物を有効成分として含有することを特徴とする破骨細胞分化抑制剤。
【請求項３】
前記木質化した当年生茎が落葉前後から翌年の発芽時期前までに採集されたものである請求項１または２記載の剤。
【請求項４】
前記木質化した当年生茎が１０月から翌年の４月に採集されたものである請求項１〜３いずれか１項記載の剤。
【請求項５】
前記抽出物が抽出エキスあるいは粉末状物である請求項１または２記載の剤。
【請求項６】
前記抽出物が、水、炭素数１〜４のアルコール類およびケトン類からなる群より選択される１種以上の抽出溶媒を用いて調製されることを特徴とする請求項１、２または５記載の剤。
【請求項７】
前記抽出溶媒が、水、エタノール、または水とエタノールとの混合溶媒である請求項６記載の剤。
【請求項８】
請求項１〜７いずれか１項記載の剤を配合してなる医薬品。
【請求項９】
請求項１〜７いずれか１項記載の剤を配合してなる飲食品。
【請求項１】
クズ（Ｐｕｅｒａｒｉａ ｌｏｂａｔａ）の木質化した当年生茎またはその抽出物を有効成分として含有することを特徴とする骨粗鬆症予防・治療剤。
【請求項２】
クズ（Ｐｕｅｒａｒｉａ ｌｏｂａｔａ）の木質化した当年生茎またはその抽出物を有効成分として含有することを特徴とする破骨細胞分化抑制剤。
【請求項３】
前記木質化した当年生茎が落葉前後から翌年の発芽時期前までに採集されたものである請求項１または２記載の剤。
【請求項４】
前記木質化した当年生茎が１０月から翌年の４月に採集されたものである請求項１〜３いずれか１項記載の剤。
【請求項５】
前記抽出物が抽出エキスあるいは粉末状物である請求項１または２記載の剤。
【請求項６】
前記抽出物が、水、炭素数１〜４のアルコール類およびケトン類からなる群より選択される１種以上の抽出溶媒を用いて調製されることを特徴とする請求項１、２または５記載の剤。
【請求項７】
前記抽出溶媒が、水、エタノール、または水とエタノールとの混合溶媒である請求項６記載の剤。
【請求項８】
請求項１〜７いずれか１項記載の剤を配合してなる医薬品。
【請求項９】
請求項１〜７いずれか１項記載の剤を配合してなる飲食品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−２１５６０７（Ｐ２０１０−２１５６０７Ａ）
【公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２５２５５１（Ｐ２００９−２５２５５１）
【出願日】平成２１年１１月４日（２００９．１１．４）
【出願人】（３０６０２３３３６）財団法人奈良県中小企業支援センター (18)
【出願人】（０００２２５１４２）奈良県 (42)
【出願人】（０００１２５３４７）学校法人近畿大学 (389)
【出願人】（３９１０６２１３７）田村薬品工業株式会社 (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月４日（２００９．１１．４）
【出願人】（３０６０２３３３６）財団法人奈良県中小企業支援センター (18)
【出願人】（０００２２５１４２）奈良県 (42)
【出願人】（０００１２５３４７）学校法人近畿大学 (389)
【出願人】（３９１０６２１３７）田村薬品工業株式会社 (3)
【Ｆターム（参考）】
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