骨粗鬆症感受性遺伝子、及び骨粗鬆症罹患リスクの測定方法
【課題】骨粗鬆症感受性遺伝子、骨粗鬆症の発症リスクを判定する方法、及び骨粗鬆症発症リスクを有する者に投与することを特徴とする医薬を提供する。この判定方法に使用される骨粗鬆症罹患リスク診断マーカー、プローブ、プライマー並びに試薬キットを提供する。
【解決手段】骨粗鬆症感受性遺伝子として、ヒトのＳＭＡＤ６遺伝子、ＴＧＦβＲ１遺伝子、Ｓｙｎｔａｘｉｎ１８遺伝子、ＷＤＳＯＦ１の遺伝子、ＡＤＡＭＴＳ１遺伝子、ＦＡＭ５Ｃ遺伝子近傍、ＧＰＲ９８遺伝子近傍、ＧＰＲ９８遺伝子、ＳＬＣ２５Ａ３２遺伝子、ＣＴＨＲＣ１遺伝子近傍、ＣＴＨＲＣ１遺伝子、又はＦＤＺ６遺伝子に存在する遺伝子多型。また、骨粗鬆症の発症リスクのある者を特定する手段を含む骨粗鬆症薬キット。
【解決手段】骨粗鬆症感受性遺伝子として、ヒトのＳＭＡＤ６遺伝子、ＴＧＦβＲ１遺伝子、Ｓｙｎｔａｘｉｎ１８遺伝子、ＷＤＳＯＦ１の遺伝子、ＡＤＡＭＴＳ１遺伝子、ＦＡＭ５Ｃ遺伝子近傍、ＧＰＲ９８遺伝子近傍、ＧＰＲ９８遺伝子、ＳＬＣ２５Ａ３２遺伝子、ＣＴＨＲＣ１遺伝子近傍、ＣＴＨＲＣ１遺伝子、又はＦＤＺ６遺伝子に存在する遺伝子多型。また、骨粗鬆症の発症リスクのある者を特定する手段を含む骨粗鬆症薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨密度の減少を含む疾患又は症状、例えば、骨粗鬆症の罹患リスクの測定方法に関する。より詳細には、ヒトゲノムＤＮＡを含む試料から、骨粗鬆症罹患リスクに影響を及ぼす遺伝子多型を利用した骨粗鬆症の遺伝的要因の有無を判定する方法又は遺伝子マーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢者の骨折とそれに伴う疼痛は、高齢者のＡＤＬならびにＱＯＬを大きく損なう。高齢者の骨折は骨量が低下している群において高頻度に発症することが明らかにされてきた。そこで、骨量低下を有するヒトを骨粗鬆症と診断し骨折の予防のため、低骨量のヒト、骨粗鬆症患者やその予備群に対して骨量を維持、増加させる薬剤が開発され、服用されてきている。しかしながら、高齢者の骨折者数は未だ増加しており、これは罹患者の健康と健康長寿を損ない、それに伴う医療費も増加している。
【０００３】
このことは、低骨量を早期に予知するマーカーが存在し、さらに早期に治療を行うことが重要であることを示唆するが、低骨量を早期に予知する信頼性の高いマーカーが未だ存在しない、若しくは、そのマーカーが極めて少ない。従来、遺伝子多型の同定に骨密度予測や骨粗鬆症のリスク判定のための発明として、下記のものが開示されている。
【０００４】
例えば、ヒト組織非特異型アルカリホスファターゼ（ＴＮＳＡＬＰ）遺伝子の遺伝子多型 が、ＴＮＳＡＬＰの基質親和性に影響を与えていることを実証すると共に、該遺伝子多型を検出することにより、骨密度変化を予測することができることを見いだし、同時に、骨疾患、特にヒト女性の閉経後における原発性の骨粗鬆症 が発症する可能性を予測することが可能であることを見いだした発明がある（特許文献１）。
【特許文献１】骨密度予測方法および遺伝子多型分析用試薬キット（特開２００６−６１０９０）。
【０００５】
その他には、ペルオキシソーム増殖因子−活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）における遺伝子多型、具体的には、ホモ接合体ＰＰＡＲγＰｒｏ１２アレル又はホモ接合体ＰＰＡＲγＶＮ１０２「Ｇ」アレルの存在を検出するものがある。
【特許文献２】骨粗鬆症 と、ＰＰＡＲγ中の一塩基多型との相関関係（特開２００６−１４７３８）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、従来の遺伝子多型による疾患罹患マーカーに関する発明は、他の遺伝子多型と比較することなく統計上有意であるものを骨密度が予測できる遺伝子として挙げている。そこで、本発明が解決しようとする課題は、ヒト染色体上に存在する偏りのない全ゲノムからのアプローチにより統計学上信頼度の高い遺伝子多型を抽出して、これらの遺伝子多型情報を利用した、骨密度の減少を含む疾患又は症状、例えば、骨粗鬆症の罹患リスクに関する信頼性の高い測定方法、骨粗鬆症の罹患診断マーカー、骨粗鬆症の罹患診断キット、及び特定の遺伝子型を有する患者を治療するため骨粗鬆症治療薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、骨粗鬆症感受性遺伝子として、ヒトＳＭＡＤ６遺伝子、ヒトＴＧＦβＲ１遺伝子、ヒトＳｙｎｔａｘｉｎ１８遺伝子、ＷＤＳＯＦ１の遺伝子、ＡＤＡＭＴＳ１遺伝子、ＦＡＭ５Ｃ遺伝子近傍、ＧＰＲ９８遺伝子近傍、ＧＰＲ９８遺伝子、ＳＬＣ２５Ａ３２遺伝子、ＣＴＨＲＣ１遺伝子近傍、ＣＴＨＲＣ１遺伝子、又はＦＤＺ６遺伝子のいずれかに存在する遺伝子多型であることを見出した。これら遺伝子多型が、骨粗鬆症の罹患リスクを判定できる遺伝子マーカーとして、非常に有用であることを実証して、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
【０００９】
ヒトＳＭＡＤ６遺伝子、ヒトＴＧＦβＲ１遺伝子、ヒトＳｙｎｔａｘｉｎ１８遺伝子、ＷＤＳＯＦ１の遺伝子、ＡＤＡＭＴＳ１遺伝子、ＦＡＭ５Ｃ遺伝子近傍、ＧＰＲ９８遺伝子近傍、ＧＰＲ９８遺伝子、ＳＬＣ２５Ａ３２遺伝子、ＣＴＨＲＣ１遺伝子近傍、ＣＴＨＲＣ１遺伝子、又はＦＤＺ６遺伝子のいずれかの遺伝子多型を同定することにより、骨粗鬆症罹患のリスクを判定する方法である。本発明において、発明に係る遺伝子はヒト由来のものであり、また、ＣＴＨＲＣ１遺伝子近傍とは、ＣＴＨＲＣ１遺伝子の近傍にある遺伝子という意味である。
【００１０】
ヒトＳＭＡＤ６遺伝子のイントロン１若しくはイントロン３、ヒトＴＧＦβＲ１遺伝子のイントロン１、ヒトＳｙｎｔａｘｉｎ１８遺伝子のイントロン１、ＷＤＳＯＦ１の遺伝子のイントロン７、イントロン１０若しくはエクソン１、エクソン２、ＡＤＡＭＴＳ１遺伝子のイントロン８、ＦＡＭ５Ｃ遺伝子近傍、又はＧＰＲ９８遺伝子近傍、ＧＰＲ９８遺伝子、ＳＬＣ２５Ａ３２遺伝子のエクソン７若しくはイントロン１、ＣＴＨＲＣ１遺伝子近傍、ＣＴＨＲＣ１遺伝子のエクソン１又はＦＤＺ６遺伝子のエクソン２若しくはエクソン４に存在するいずれかの遺伝子多型を同定することにより、骨粗鬆症罹患のリスクを判定する方法である。
【００１１】
また、下記の１６からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドからなる骨粗鬆症の罹患診断マーカー：（１）ＷＤＳＯＦ１の遺伝子のイントロン７に存在する遺伝子配列（配列番号５）であって、第８染色体における位置が９９６４５３３９番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。（２）ＷＤＳＯＦ１の遺伝子のイントロン１０に存在する遺伝子配列（配列番号６）であって、第８染色体における位置が９９６５５１３１番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。（３）ＷＤＳＯＦ１の遺伝子のエキソン１に存在する遺伝子配列（配列番号７）であって、第８染色体における位置が９９６２７７０８番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。（４）ＷＤＳＯＦ１の遺伝子のエキソン１に存在する遺伝子配列（配列番号８）であって、第８染色体における位置が９９６２７８９０番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。（５）ＷＤＳＯＦ１の遺伝子のエキソン２に存在する遺伝子配列（配列番号９）であって、第８染色体における位置が９９６３２８７９番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。（６）ＡＤＡＭＴＳ１の遺伝子のイントロン８に存在する遺伝子配列（配列番号１０）であって、第２１染色体における位置が１３３９３９９５番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。（７）ＦＡＭ５Ｃ遺伝子の近傍に存在する遺伝子配列（配列番号１１）であって、第１染色体における位置が１６１１９６９３０番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。（８）ＧＰＲ９８の遺伝子の近傍に存在する遺伝子配列（配列番号１２）であって、第５染色体における位置が８５７００６４８番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。（９）ＧＰＲ９８遺伝子のイントロン８７に存在する遺伝子配列（配列番号１３）であって、第５染色体における位置が８５６３６２２６番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。（１０）ＳＬＣ２５Ａ３２の遺伝子のエクソン７に存在する遺伝子配列（配列番号１４）であって、第８染色体における位置が９９６１２７３９番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。（１１）ＳＬＣ２５Ａ３２の遺伝子のイントロン１に存在する遺伝子配列（配列番号１５）であって、第８染色体における位置が９９６２６５９６番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。（１２）ＣＴＨＲＣ１遺伝子のエクソン４に存在する遺伝子配列（配列番号１６）であって、第８染色体における位置が９９５９５１４６番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。（１３）ＣＴＨＲＣ１遺伝子の近傍に存在する遺伝子配列（配列番号１７）であって、第８染色体における位置が９９５８２８７３番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。（１４）ＦＤＺ６の遺伝子のエクソン２に存在する遺伝子配列（配列番号１８）であって、第８染色体における位置が９９５１３３９７番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。（１５）ＦＤＺ６の遺伝子のエクソン４に存在する遺伝子配列（配列番号１９）であって、第８染色体における位置が９９５３８４１５番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。（１６）上記（１）〜（１５）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを提供するものである。
【００１２】
ヒトＷＤＳＯＦ１の遺伝子のイントロン７に存在する遺伝子配列であって、第８染色体における位置が９９６４５３３９番目の遺伝子多型と連鎖不平衡にある遺伝子多型部位を含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチドからなる骨粗鬆症の罹患診断マーカー。
【００１３】
配列番号５乃至１９のいずれかに示す遺伝子配列を有し、いずれの配列においても塩基番号２６の遺伝子多型を検出することにより骨粗鬆症の罹患リスクを判定することを特徴とする骨粗鬆症の罹患診断マーカー。
【００１４】
配列番号１乃至１９のいずれかに示す遺伝子配列を有し、いずれの配列においても塩基番号２６の遺伝子多型を検出することにより骨粗鬆症の罹患リスクを判定することを特徴するものであって、下記のいずれかの遺伝子多型であれば骨粗鬆症の罹患率が高いと判定することを特徴とする診断マーカー。（１）配列番号１の遺伝子多型が、ＡＣアレルのうちＣアレルである。（２）配列番号２の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルである。（３）配列番号３の遺伝子多型が、ＴＣアレルのうちＣアレルである。（４）配列番号４の遺伝子多型が、ＴＧアレルのうちＧアレルである。（５）配列番号５の遺伝子多型が、ＴＧアレルのうちＧアレルである。（６）配列番号６の塩遺伝子多型が、ＡＣアレルのうちＣアレルである。（７）配列番号７の遺伝子多型が、ＡＣアレルのうちＣアレルである。（８）配列番号８の遺伝子多型が、ＣＴアレルのうちＴアレルである。（９）配列番号９の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルである。（１０）配列番号１０の遺伝子多型が、ＴＣアレルのうちＣアレルである。（１１）配列番号１１の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルである。（１２）配列番号１２の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルである。（１３）配列番号１３の遺伝子多型が、ＣＴアレルのうちＣアレルである。（１４）配列番号１４の遺伝子多型が、ＣＡアレルのうちＡアレルである。（１５）配列番号１５の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルである。（１６）配列番号１６の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルＡである。（１７）配列番号１７の遺伝子多型が、ＧＡアレルのうちＡアレルである。（１８）配列番号１８の遺伝子多型が、ＣＴアレルのうちＴアレルである。（１９）配列番号１９の遺伝子多型が、ＧＴアレルのうちＴアレルである。
【００１５】
配列番号１乃至４のいずれかに示す遺伝子配列を有し、いずれの配列においても塩基番号２６の遺伝子多型を検出することにより骨粗鬆症の罹患リスクを判定することを特徴するものであって、下記のいずれかの遺伝子多型であれば骨粗鬆症の罹患率が低いと判定することを特徴とする診断マーカー。（１）配列番号１の遺伝子多型が、ＡＣアレルのうちＡアレルである。（２）配列番号２の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＡアレルである。（３）配列番号３の遺伝子多型が、ＴＣアレルのうちＴアレルである。（４）配列番号４の遺伝子多型が、ＴＧアレルのうちＴアレルである。
【００１６】
前記いずれかのオリゴヌクレオチドが支持体に固定されたマイクロアレイ。
【００１７】
前記オリゴヌクレオチド及び／又は前記記載のマイクロアレイを含む、骨粗鬆症罹患リスク判定キット。
【００１８】
下記の遺伝子型を有する患者を治療するための、骨粗鬆症治療薬または骨粗鬆症予防剤。 配列番号１乃至１９のいずれかに示す遺伝子配列を有し、いずれの配列においても塩基番号２６の遺伝子多型を検出することにより骨粗鬆症の罹患リスクを判定することを特徴するものであって、下記のいずれかの遺伝子多型であれば骨粗鬆症の罹患率が高いと判定することを特徴とする診断マーカー。（１）配列番号１の遺伝子多型が、ＡＣアレルのうちＣアレルである。（２）配列番号２の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルである。（３）配列番号３の遺伝子多型が、ＴＣアレルのうちＣアレルである。（４）配列番号４の遺伝子多型が、ＴＧアレルのうちＧアレルである。（５）配列番号５の遺伝子多型が、ＴＧアレルのうちＧアレルである。（６）配列番号６の塩遺伝子多型が、ＡＣアレルのうちＣアレルである。（７）配列番号７の遺伝子多型が、ＡＣアレルのうちＣアレルである。（８）配列番号８の遺伝子多型が、ＣＴアレルのうちＴアレルである。（９）配列番号９の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルである。（１０）配列番号１０の遺伝子多型が、ＴＣアレルのうちＣアレルである。（１１）配列番号１１の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルである。（１２）配列番号１２の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルである。（１３）配列番号１３の遺伝子多型が、ＣＴアレルのうちＣアレルである。（１４）配列番号１４の遺伝子多型が、ＣＡアレルのうちＡアレルである。（１５）配列番号１５の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルである。（１６）配列番号１６の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルＡである。（１７）配列番号１７の遺伝子多型が、ＧＡアレルのうちＡアレルである。（１８）配列番号１８の遺伝子多型が、ＣＴアレルのうちＴアレルである。（１９）配列番号１９の遺伝子多型が、ＧＴアレルのうちＴアレルである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、骨密度の減少を含む疾患又は症状、例えば、骨粗鬆症の罹患リスクの遺伝的要因の有無を判定するにあたり、非常に簡便であり且つ信頼性の高い新規判定法を提供することができる。また、上記判定方法に用い得るオリゴヌクレオチド、マイクロアレイ及び診断キットを提供することもできる。また、特定の遺伝子多型を有する患者等を治療するための、骨粗鬆症治療薬を提供することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。なお、実施形態は下記に限定されるものではない。
本発明は、骨密度の減少を含む疾患又は症状、例えば、骨粗鬆症の罹患リスクの遺伝的要因の有無を判定するための方法であり、本方法は、ヒトＳＭＡＤ６遺伝子、ヒトＴＧＦβＲ１遺伝子、ヒトＳｙｎｔａｘｉｎ１８遺伝子、ＷＤＳＯＦ１の遺伝子、ＡＤＡＭＴＳ１遺伝子、ＦＡＭ５Ｃ遺伝子近傍、ＧＰＲ９８遺伝子近傍、ＧＰＲ９８遺伝子、ＳＬＣ２５Ａ３２遺伝子、ＣＴＨＲＣ１遺伝子近傍、ＣＴＨＲＣ１遺伝子、又はＦＤＺ６遺伝子のいずれかに存在する遺伝子多型における遺伝子多型を見出し、これらの遺伝子多型に着目したものである。
【００２１】
遺伝子多型の解析方法として、疾患群と非疾患群の遺伝子情報をそれぞれ大量に収集し、両群での遺伝子多型の頻度差を見る、関連解析がある。本発明者は、この関連解析を利用して、腰椎及び全身骨骨量との相関解析を行い、骨量を規定するいくつかの遺伝子多型を同定した。これらの遺伝子多型が、骨粗鬆症の罹患リスクの遺伝的要因の有無を判定するために有用であることを見出した。
【００２２】
遺伝子多型とは、遺伝子配列中の特定の１塩基が他の塩基に置換することによる多型を意味する。インサーション／デレーション多型とは、１以上の塩基が欠失／挿入することによる多型を意味する。また、塩基配列の繰り返し数の異なることにより生じる多型（塩基繰り返し多型）には、繰り返す塩基数の違いによりマイクロサテライト多型（塩基数：２〜４塩基程度）とＶＮＴＲ （ｖａｒｉａｂｌｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ）多型（繰り返し塩基：数〜数十塩基）があり、その繰り返し塩基数が個々人によって異なっている多型を意味する。
【００２３】
ヌクレオチドは核酸を意味する。また、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドが複数結合したものであり、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むものであり、いわゆるプライマー、プローブ、及びオリゴマー断片と同意味である。
【００２４】
＜遺伝子多型情報＞
本発明の方法において好ましく利用できる遺伝子多型の情報を、下記の表１及び表２に例示列挙する（配列番号１〜１９）。表１及び表２に示される多型情報は、一塩基多型（ＳＮＰ）に関するものである。表１及び２に示される遺伝子多型の中でも、配列番号１、２、７、８、９、１６、１８及び１９の塩基配列中に示される多型が特に好ましい。また、表３は、ｒｓ７５５４５１と連鎖不平衡にある遺伝子多型を列挙している。表３にあるＳＮＰは、すべて第１５染色体にあり、染色体位置は、ＮＷ＿９２５８８４．１における位置を示している。表中の、「遺伝子多型名」とは、ゲノム上の位置におけるＳＮＰ名であり、いずれも全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を用いて確認されるアクセッション番号で示している。染色体における位置とは、特定の染色体中の位置（ＮＷ＿９２５８８４．１）を示している。表中の「配列」には５１塩基からなる塩基配列が表示されており、その２６番目にＳＮＰ部位を表示している。［Ｇ／Ｔ］とあるのは、「Ｇ」と「Ｔ」のＳＮＰであることを示している。
【００２５】
【表１】
【００２６】
【表２】
【００２７】
＜遺伝子多型の検出法＞
以下に、本発明の診断マーカーやマイクロアレイを利用した、遺伝子多型の検出法を例示する。なお、患者や被験者からの遺伝子サンプルの入手や調整方法については、実施例で後述する。
【００２８】
（１） ＰＣＲ法を用いた検出
本発明においては、ＰＣＲ法を用いた検出することもできる。ＰＣＲにより被験サンプルを増幅するには、Ｆｉｄｅｌｉｔｙの高いＤＮＡポリメラーゼ等を用いることが好ましい。プライマーは、被験サンプル中の対象ＳＮＰを増幅できるようにプライマーの任意の位置に遺伝子多型が含まれるように設計し合成する。増幅反応終了後は、増幅産物の検出を行い、多型の有無を判定する。
【００２９】
（２） 塩基配列決定法による検出
本発明においては、ジデオキシ法に基づく塩基配列決定法により本発明の多型を検出することもできる。塩基配列決定に用いるシークエンサーには、市販のＡＢＩシリーズ（アマシャムバイオサイエンス）等を用いることができる。
【００３０】
（３） マイクロアレイによる検出
マイクロアレイは、支持体上にポリヌクレオチドプローブが固定されたものであり、ＤＮＡチップ、Ｇｅｎｅ チップ、マイクロチップ、ビーズアレイなどを含む。
【００３１】
まず、被験者サンプルのＤＮＡを単離し、必要な部分をＰＣＲにより増幅し、蛍光レポーター基等により標識する。続いて、被験者サンプルのＤＮＡを標識化されたＤＮＡをアレイと共に、ハイブリダイゼーションさせるために、インキュベートする。次にこのアレイをスキャナーに差し込み、ハイブリダイゼーションパターンを検出する。ハイブリダイゼーションのデータは、プローブアレイに結合した蛍光レポーター基からの発光として採集する。標的配列と完全に一致したプローブは、標的配列と一致していない部分を有するものよりも強いシグナルを生じる。アレイ上の各プローブの配列及び位置は分かっているため、相補性によって、プローブアレイと反応させた標的ポリヌクレオチドの配列を決定することができる。
【００３２】
（４）ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法による検出
ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法は、５′末端を蛍光物質（ＦＡＭなど）で、３′末端をクエンチャー物質（ＴＡＭＲＡ など）で修飾したオリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎプローブ）をＰＣＲ反応系に加える方法である。まず、ＴａｑＭａｎプローブが鋳型ＤＮＡとハイブリダイゼーションし、その後、ＰＣＲプライマーからの伸長反応が起こる。そうすると、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５′ヌクレアーゼ活性により蛍光色素結合部分が切断されて、蛍光色素が遊離し、クエンチャーの影響を受けなくなり発色する。この蛍光を検出することで特定の多型（ＳＮＰ等）を同定し、ゲノムタイプを判定することができる。ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法で用いるアレル特異的オリゴ（ＴａｑＭａｎプローブという）は、前記遺伝子多型情報に基づいて設計することができる。
【００３３】
（５） インベーダー法による検出
インベーダー法は、塩基配列の標的部位においてオリゴヌクレオチドによる特異的な構造を作り、その構造を酵素クリベース等が認識し、切断することを利用している。ＳＮＰを検出する部位の周辺において、２種類のオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ）が重なり合った構造を作りながらハイブリダイズします。すなわち、標的部位において片方のオリゴ（インベーダーオリゴ）が、もう一方のオリゴの下に１塩基のみ侵入する。酵素クリベース等は、この侵入構造を認識し、はみ出した部位を切断し、フラップ断片を放出する。この放出されたフラップ断片を検出することで、多型を検出するができる。
【００３４】
＜骨粗鬆症罹患リスク判定キット＞
本発明において、遺伝子多型（例えばＳＮＰ）部位を含む診断マーカーは、骨粗鬆症罹患リスク判定キットに含めることができる。
【００３５】
本発明のキットは、本発明を実施するために必要な１種以上の成分を含むものである。
例えば、本発明のキットは、酵素を保存若しくは供給するためのもの、遺伝子多型検出を実施するために必要な反応成分を含むことができる。そのような成分としては、限定されるものではないが、本発明のオリゴヌクレオチド、酵素緩衝液、ｄＮＴＰ、コントロール用試薬（例えば、組織サンプル、ポジティブ及びネガティブコントロール用標的オリゴヌクレオチドなど）、標識用又は検出用試薬、固相支持体、説明書などが挙げられる。
【００３６】
本発明のキットは、上記オリゴヌクレオチドを支持体に固定したマイクロアレイとして提供することもできる。マイクロアレイは、支持体上に本発明のオリゴヌクレオチドが固定されたものであり、ＤＮＡチップ、Ｇｅｎｅチップ、マイクロチップ、ビーズアレイなどを含む。当該マイクロアレイは、上記オリゴヌクレオチドと共に本発明のキットに含まれていてもよい。
【００３７】
＜遺伝子多型情報を利用した骨粗鬆症の薬物治療＞
本発明の骨粗鬆症薬、若しくはそのキットに含まれる医薬、若しくは候補品として、（１）カルシウム製剤、（２）女性ホルモン製剤（エストロゲン）、（３）活性型ビタミンＤ３製剤、ＥＤ−７１（４）ビタミンＫ２製剤、（５）ビスフォスネート剤（エチドロネート、アレンドロネート、リセドロネート、イバンドロネート、ミノドロン酸水和物）、（６）ＳＥＲＭ（塩酸ラロキシフェン、ラソフォキシフェン、酢酸バセドキシフェン）、（７）カルシトニン製剤、（８）イプリフラボン、（９）蛋白同化ホルモン製剤（アンドロゲン、デカン酸ナンドロロン）、（１０）ヒトＰＴＨ（１−３４）（テリパラチド）皮下注射製剤、（１１）抗ＲＡＮＫＬ抗体、デノスマブ（ＡＭＧ１６２）、（１２）ラネル酸ストロチウムなどが挙げられる。本発明では、骨粗鬆症の罹患リスクについて、遺伝子多型に関する情報を開示しているが、これを利用した医薬品等として提供してもよい。具体的には、医薬品のパッケージに用量・用法に当該遺伝子多型情報を記載することや、上記の骨粗鬆症罹患リスク判定キットをこれら医薬品とともに関連付けて、パッケージとすることが挙げられる。
【００３８】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３９】
＜腰椎及び全身骨骨量と相関のある遺伝子多型の同定＞
本発明では、閉経後女性を対象として、ヒト遺伝子上に多数存在する一塩基置換遺伝子多型（ＳＮＰ）のうち代表的な約５万個に対してＧｅｎｏｔｙｐｉｎｇを行い、ＳＮＰと骨量との相関解析を行った。さらに、本解析により統計上有意であった、遺伝子多型に関しては対象者数を増やして、同様の検討を行った。
【００４０】
まず、ヒトから採取した血液検体等から、フェノール法等を用いてゲノムＤＮＡを精製する。その際、ＧＦＸ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ等の市販のゲノムＤＮＡ抽出キットや装置を用いてもよい。次に、得られたゲノムＤＮＡを鋳型として、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法によりゲノムにおける遺伝子型を決定する。ゲノム上で遺伝子多型を含む領域を増幅できるＰＣＲプライマーを１セットとゲノムＤＮＡの一塩基変異に対応するＴａｑＭａｎプローブを２種類用意する。それぞれのＴａｑＭａｎプローブはゲノム上の遺伝子多型（Ａ／Ｂ）を含む領域に相補的な配列を有している。これらのプライマーとＴａｑＭａｎプローブ、ゲノムＤＮＡを混合し、ＰＣＲを行なうことで、２種類のＳＮＰが検出する。この遺伝子多型の遺伝子型決定においてはゲノム上の各遺伝子型をＴａｑＭａｎプローブで識別して遺伝子多型を検出する事になるので、「Ａ／Ａのホモ」の場合はＡという遺伝子多型を検出するＴａｑＭａｎプローブの蛍光のみが検出され、「Ａ／Ｂのヘテロ」の場合はＡとＢの両方のＳＮＰを検出する２種類のＴａｑＭａｎプローブの蛍光が検出されることになる。本方法により遺伝子型を決定する。
【００４１】
本発明では、５５―８３歳の閉経後の女性２５３名の血液より、ゲノムＤＮＡを抽出して、遺伝子多型を調べた。抽出したゲノムＤＮＡは、上述のようにＰＣＲで増幅して用いた。調べる対象となる遺伝子は、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ社のＧｅｎｅＣｈｉｐＭａｐｐｉｎｇ１００Ｋ Ｓｅｔに含まれる約５万個のＳＮＰについて、同社ＧｅｎｅＣｈｉｐＭａｐｐｉｎｇＡｓｓａｙ法を用いて決定した。腰椎及び全身骨骨量との相関解析を行い、骨量と関係する候補遺伝子を選択した。
【００４２】
本発明において、二重エックス線吸収法（ＤＸＡ）を用いて、全身骨骨量及び腰椎の骨量測定を行った。この測定法の特徴として、２種類の異なるエネルギーのＸ線を照射し、骨と軟部組織の吸収率の差による骨密度を測定する。本測定方法は、全身骨骨量、腰椎などいずれの部位でも高い精度で、５分−１０分程度と迅速に測定でき、標準的な骨密度測定法である。測定値を体重と年齢で補正したＺスコアとして表示する。本研究に参加する被験者において、全身骨骨量の交絡要因として考えられる年齢、体重、身長について線形モデルを当てはめた。本モデルの妥当性を調べるためにモデル選択基準値ＡＩＣ（Ａｋａｉｋｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ）を採用してモデルを構築した。この結果、本被験者の全身骨骨量に対して年齢と体重が影響することが示唆され、ｔｏｔａｌｂｏｄｙ＝ −３．９５＋０．０２３×ａｇｅ＋０．０５３×ｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔ＋ｒｅｓｉｄｕａｌの線形モデルで説明することができた。Ｒｅｓｉｄｕａｌとは、年齢や体重に依存しない全身骨骨量の部分であり、遺伝的要因が含まれているものである。本発明においてＺスコアをｔｏｔａｌｂｏｄｙ−（−３．９５＋０．０２３×ａｇｅ＋０．０５３×ｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔ）として計算した。
【実施例２】
【００４３】
＜ヒトＳＭＡＤ６遺伝子のイントロン３に存在するＳＮＰ（ｒｓ７５５４５１）＞
上記の解析方法により、日本人閉経後の女性２５３名の遺伝子上に多数存在する遺伝子多型のうち、約５万ＳＮＰにおけるＧｅｎｏｔｙｐｅを決定した。その結果、ヒトＳＭＡＤ６遺伝子のイントロン３に存在するＳＮＰ（ｒｓ７５５４５１）が全身骨骨量と有意に相関することが判明した（Ｐ＝０．０００２、図１（Ａ））。各群間の有意差検定に関しては、スチューデントのｔ検定を行い、Ｐ値が０．０５未満の場合を統計上有意とした。Ｔ検定は、２つの母集団がいずれも正規分布に従うと仮定した上での、平均が等しいかどうかの検定であるが、骨量はこれに従うものであるので、本検定を採用した。さらに、本解析で有意差が見出されたＳＮＰについて、対象者数を７０３名まで増やし、相関解析を行った。その結果、当該ＳＮＰは、全身骨骨量と強い相関があることが判明した（図１（Ｂ））。表中のＴｏｔａｌ ＢＭＤは、全身骨骨量を指し、値が高いほど骨量が多いことにあるが、個々人の体重及び身長の値で補正したものである。また、カッコ内は人数を指し、「ＡＣ＋ＣＣ」とは、母方由来及び父方由来のゲノムが、「ＡＣ」又は「ＣＣ」のＳＮＰである場合を指す。さらに、ヒトＳＭＡＤ６遺伝子のイントロン３に存在するＳＮＰ（ｒｓ７５５４５１）と連鎖不平衡にある遺伝子多型を調べ、第１５染色体に存在する遺伝子多型を同定できた（表３）。これらの遺伝子多型を用いることでも、骨粗鬆症の罹患診断をすることができる。
【実施例３】
【００４４】
＜ヒトＳＭＡＤ６遺伝子のイントロン１に存在するＳＮＰ（ｒｓ１７２６４１８５）＞
ヒトＳＭＡＤ６遺伝子のイントロン１に存在するＳＮＰ（ｒｓ１７２６４１８５）が全身
骨骨量と有意に相関することが判明した（Ｐ＝０．０００２、図２）。
【実施例４】
【００４５】
＜ヒトＴＧＦβＲ１遺伝子のイントロン１に存在するＳＮＰ（ｒｓ１０５１２２６３）＞
ヒトＴＧＦβＲ１遺伝子のイントロン１に存在するＳＮＰ（ｒｓ１０５１２２６３）が全身骨骨量（Ｐ＝０．０１５４、図３（Ａ））及び腰椎骨量（Ｐ＝０．００９１、図３（Ｂ））と有意に強い相関することが判明した。この結果を見ると、ＳＮＰ（ｒｓ１０５１２２６３）は、全身骨骨量に比して、腰椎骨量に強い相関があり、診断マーカーとしてより有効なものと思われる。なお、ＴＧＦβは、骨形成因子（ｂｏｎｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＭＰ）に関連するものと考えられている。なお、ＴＧＦβＲ１１遺伝子は骨代謝において重要な役割をはたす液性因子ＴＧＦβに対する受容体として働く。またＳＭＡＤ６はＴＧＦβからＴＧＦβＲ１１を介したシグナル伝達を調節する因子である。従って、両遺伝子は骨代謝において重要な機能をはたしていると推測される。
【実施例５】
【００４６】
＜ヒトＳｙｎｔａｘｉｎ１８遺伝子のイントロン１に存在するＳＮＰ（ｒｓ６８９４８４）＞
ヒトＳｙｎｔａｘｉｎ１８遺伝子のイントロン１に存在するＳＮＰ（ｒｓ６８９４８４）が全身骨骨量（Ｐ＝０．００１４、図４）と有意に強い相関することが判明した。なお、ＴＧＦβは、骨形成因子（ｂｏｎｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＭＰ）に関連するものと考えられている。また、ｓｙｎｔａｘｉｎ１８は細胞の小胞体に存在し、細胞内物質の輸送などに関与する因子であることが明らかにされており、細胞機能における重要性が示唆されている。
【実施例６】
【００４７】
＜ヒトＷＤＳＯＦ１の遺伝子に存在するＳＮＰ（ｒｓ３１３４２９５）（ｒｓ３１３４２９６）（ｒｓ３１３４２５３）＞
全身骨骨量との相関解析を行い、骨量と関係する候補遺伝子を選択する方法は、実施例１から５までの手順と同様である。ＤＸＡ法にて測定した骨密度の値に関連する遺伝的要因を見出すものであるが、骨量の分布は年齢の増加や体重に影響を受けるので、これを補正するために、測定値を体重と年齢で補正したＺスコアとして用いた。また、スクリーニングするＳＮＰｓは、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ社のＧｅｎｅＣｈｉｐＭａｐｐｉｎｇ１００Ｋ Ｓｅｔに含まれる約５万個のＳＮＰについて、同社ＧｅｎｅＣｈｉｐＭａｐｐｉｎｇＡｓｓａｙ法を用いて決定した。
【００４８】
最初に、遺伝子多型解析の質を高めるために、一定の基準を満たした遺伝子多型について解析した。ここで、一定の基準とは、遺伝子型決定成功率（Ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ ｃａｌｌ ｒａｔｅ）が９５％、マイナーアレル頻度１０％およびＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡値０．０００１以上の３項目を満たしたものである。この基準を満たすことで、データクリーニングされたＳＮＰｓを用いることができる。遺伝子型決定成功率とは、集団における１ＳＮＰあたりの遺伝子型決定の割合であり、極端に低いマイナーアレル頻度の場合には遺伝子型決定に誤りがあることを示唆される。本実施例は、本解析から基準を満たした１５６２２ＳＮＰｓについて計測を行った。
【００４９】
上記の１５６２２ＳＮＰｓについて、被験者２５１名の全身骨骨量との関連解析を行い、その結果であるＰ値のＱＱプロットを示す（図５）。各ＳＮＰ座位において出現頻度の多いアレル（Ｍａｊｏｒ ａｌｌｅｌｅ）についてメンデルの優劣の法則（Ａ優性様式、Ｂ劣性様式）を仮定し、関連性の有無を検定したＰ値を示した。ＱＱプロットより、一様分布から逸脱したと想定されるＳＮＰを１１個（Ａ図）と９個（Ｂ図）の計２０個を選択した。
【００５０】
次いで、これら２０ＳＮＰに関して別集団の閉経後女性４９９名を対象として、既にＳＮＰ道程方法として確立している、Ｔｗｏ−ｓｔａｇｅ Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙを用いて２次スクリーニングを行った。その結果、第８染色体にあるＷＤＳＯＦ１の遺伝子に存在するＳＮＰｓが全身骨骨量と相関するものとして見出した。具体的には、ｒｓ１３７０００５（配列番号５）、ｒｓ３０９８２１４（配列番号６）、ｒｓ３１３４２９５（配列番号７）、ｒｓ３１３４２９６（配列番号８）、ｒｓ３１３４２５３（配列番号９）である。図７では、これらＷＤＳＯＦ１の遺伝子に存在するＳＮＰｓのうち、アミノ酸変化を伴うＳＮＰｓ（ｒｓ３１３４２９５、ｒｓ３１３４２９６、ｒｓ３１３４２５３）について全身骨骨量との相関を示した。表中のＴｏｔａｌ ｂｏｄｙ ＢＭＤは、全身骨骨量を指し値が高いほど骨量が多いことにあるが、個々人の体重及び身長の値で補正したものである。また、カッコ内は人数を指し、「ＡＣ＋ＣＣ」とは、母方由来及び父方由来のゲノムが「ＡＣ」又は「ＣＣ」のＳＮＰである場合を指し、「ＡＡ」とは母方由来及び父方由来のゲノムがいずれも「ＡＡ」である場合を示す。この結果から、これらのＳＮＰを指標とすることで骨量との相関が見出され、骨量に関係する疾患マーカーとなりえる。なお、本遺伝子のヒトにおける機能は不明である。以下、本実施例の手順により、ヒトＷＤＳＯＦ１の遺伝子のイントロン７に存在するＳＮＰ（ｒｓ１３７０００５）、イントロン１０に存在するＳＮＰ（ｒｓ３０９８２１４）、実施例７、８、９に説明するＳＮＰｓが同定され、その他、Ｓｍａｄ６遺伝子に存在するＳＮＰも改めて同定された。
【実施例７】
【００５１】
ＷＤＳＯＦ１の遺伝子に存在するｒｓ１３７０００５（配列番号５）について、その近傍約１５０Ｋｂｐ周辺にある連鎖不平衡にある１１個のＳＮＰｓを同定した（図６）。図６は、ある２つのＳＮＰ間の連鎖不平衡係数ｒ２を計算して、それを図示したものである。表示の数値の単位は１０−２であり、１００に近い数値であれば強い連鎖不平衡状態（相関係数±１に対応）であると示唆される。一般に、連鎖不平衡係数ｒ２が０．８以上であれば連鎖不平衡状態であり、これら１１個のうちｒｓ１３７０００と連鎖不平衡にあるＳＮＰは７個であった。その一方で今回探索した１１個の遺伝子は表４に示したように全身ならびに腰椎骨と有意に相関した。以上よりｒｓ１３７０００５周辺のＳＮＰは骨粗鬆症など骨量に関連した疾患や健康状態などのマーカーとなりえるものである。
【実施例８】
【００５２】
＜ヒトＡＤＡＭＴＳ１遺伝子に存在するＳＮＰ（ｒｓ２２９０４２）＞
本発明において、ヒトＡＤＡＭＴＳ１遺伝子に存在するＳＮＰ（ｒｓ２２９０４２）も骨量との相関が見出された（表５）。ＡＤＡＭＴＳ１遺伝子の遺伝子産物は、細胞外マトリクスに存在するａｇｇｒｅｃａｎなどと結合し蛋白分解酵素として機能することが知られており、骨や軟骨代謝において重要な役割することが示唆されている。
【実施例９】
【００５３】
＜ヒトＦＡＭ５Ｃ遺伝子近傍に存在するＳＮＰ（ｒｓ１０４９４６２２）＞
本発明において、ヒトＦＡＭ５Ｃ遺伝子近傍に存在するＳＮＰ（ｒｓ１０４９４６２２）も骨量との相関が見出された（表５）。本遺伝子に関する機能は不明である。
【実施例１０】
【００５４】
＜ヒトＧＰＲ９８遺伝子近傍ならびに遺伝子上に存在するＳＮＰ（ｒｓ１０５１４３４６）＞
本発明において、ヒトＧＰＲ９８近傍遺伝子に存在するＳＮＰ（ｒｓ１０５１４３４６）も骨量との相関が見出された。また、ＧＰＲ９８の遺伝子上イントロン８７に存在するＳＮＰ（ｒｓ１０５１４３４５）と骨量の相関を検討したところ、このＳＮＰも骨量と有意に相関した（表６）。ＧＰＲ９８遺伝子の機能は、Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓのなかで１９６７アミノ酸を有する巨大タンパク質である。脳神経において高発現しているがその機能の詳細は不明である。
【実施例１１】
【００５５】
＜ヒトＳＬＣ２５Ａ３２遺伝子に存在するＳＮＰｓ（ｒｓ２２４１７７７、ｒｓ３１３３８１７）＞
本発明において、ヒトＳＬＣ２５Ａ３２遺伝子に存在するＳＮＰ（ｒｓ２２４１７７７、ｒｓ３１３３８１７）も骨量との相関が見出された（表４）。ＳＬＣ２５Ａ３２遺伝子の機能は、ミトコンドリアに存在する葉酸のトランスポーターであり、葉酸は骨代謝に重要で、葉酸の代謝に関与する酵素ＮＴＨＦＲが骨粗鬆症の発症と関与することが知られている。
【実施例１２】
【００５６】
＜ヒトＣＴＨＲＣ１遺伝子及びヒトＣＴＨＲＣ１近傍遺伝子に存在するＳＮＰｓ（ｒｓ３０９８２３３、ｒｓ３０９８２３０）＞
本発明において、ヒトＣＴＨＲＣ１遺伝子及びヒトＣＴＨＲＣ１近傍遺伝子に存在するＳＮＰｓ（ｒｓ３０９８２３３、ｒｓ３０９８２３０）も骨量との相関が見出された（表４）。ヒトＣＴＨＲＣ１遺伝子の機能は、血管損傷時に血管において高発現する遺伝子であり、高発現したマウスは骨における基質蛋白の分泌が低下し骨が折れ易くなることが知られている。
【実施例１３】
【００５７】
＜ヒトＦＤＺ６遺伝子に存在するＳＮＰｓ（ｒｓ３７３６０４７、ｒｓ３８０８５５３）＞
本発明において、ヒトＦＤＺ６遺伝子に存在するＳＮＰｓ（ｒｓ３７３６０４７、ｒｓ３８０８５５３）も骨量との相関が見出された（表４）。ＦＤＺ６遺伝子の機能は、骨において重要な役割を果たすＷｎｔシグナルを制御する因子であることが知られている。なお、ｒｓ３８０８５５３は、３４番目のＬｅｕをＭｅｔに変化させるＳＮＰである。
【実施例１４】
【００５８】
＜連鎖不平衡にあるＳＮＰ＞
表７〜１３は、本発明で診断マーカーとなるＳＮＰに対して連鎖不平衡にあるＳＮＰであり、これらのＳＮＰについてアクッセションナンバーを示した。これらの連鎖不平衡にあるＳＮＰを用いても、診断マーカーの機能をする。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】（Ａ）ＳＭＡＤ６遺伝子のイントロン３に存在するＳＮＰ（ｒｓ７５５４５１）と全身骨骨量との相関を示すグラフ（２３７人での試験結果）。（Ｂ）ＳＭＡＤ６遺伝子のイントロン３に存在するＳＮＰ（ｒｓ７５５４５１）と全身骨骨量との相関を示すグラフ（７０３人での試験結果）。
【図２】ＳＭＡＤ６遺伝子のイントロン１に存在するＳＮＰ（ｒｓ１７２６４１８５）と全身骨骨量との相関を示すグラフ（４６３人での試験結果）。
【図３】（Ａ）ＴＧＦβＲ１遺伝子のイントロン１に存在するＳＮＰ（ｒｓ１０５１２２６３）と全身骨骨量との相関を示すグラフ（７１１人での試験結果）。（Ｂ）ＴＧＦβＲ１遺伝子のイントロン１に存在するＳＮＰ（ｒｓ１０５１２２６３）と腰椎骨量との相関を示すグラフ（７０３人での試験結果）。
【図４】Ｓｙｎｔａｘｉｎ１８遺伝子のイントロン１に存在するＳＮＰ（ｒｓ６８９４８４）と全身骨骨量との相関を示すグラフ（５５２人での試験結果）。
【図５】全身骨骨量とＳＮＰｓの相関解析を示すＰ値のＱＱプロット（Ａ）優性様式、（Ｂ）劣性様式
【図６】ヒトＷＤＳＯＦ１遺伝子上に存在する遺伝子多型間の連鎖不平衡の解析を示す図。
【図７】（Ａ）ＷＤＳＯＦ１遺伝子に存在するＳＮＰ（ｒｓ３１３４２９５）と全身骨骨量との相関を示すグラフ。（Ｂ）ＷＤＳＯＦ１遺伝子に存在するＳＮＰ（ｒｓ３１３４２９６）と全身骨骨量との相関を示すグラフ。（Ｃ）ＷＤＳＯＦ１遺伝子に存在するＳＮＰ（ｒｓ３１３４２５３）と全身骨骨量との相関を示すグラフ。
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨密度の減少を含む疾患又は症状、例えば、骨粗鬆症の罹患リスクの測定方法に関する。より詳細には、ヒトゲノムＤＮＡを含む試料から、骨粗鬆症罹患リスクに影響を及ぼす遺伝子多型を利用した骨粗鬆症の遺伝的要因の有無を判定する方法又は遺伝子マーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢者の骨折とそれに伴う疼痛は、高齢者のＡＤＬならびにＱＯＬを大きく損なう。高齢者の骨折は骨量が低下している群において高頻度に発症することが明らかにされてきた。そこで、骨量低下を有するヒトを骨粗鬆症と診断し骨折の予防のため、低骨量のヒト、骨粗鬆症患者やその予備群に対して骨量を維持、増加させる薬剤が開発され、服用されてきている。しかしながら、高齢者の骨折者数は未だ増加しており、これは罹患者の健康と健康長寿を損ない、それに伴う医療費も増加している。
【０００３】
このことは、低骨量を早期に予知するマーカーが存在し、さらに早期に治療を行うことが重要であることを示唆するが、低骨量を早期に予知する信頼性の高いマーカーが未だ存在しない、若しくは、そのマーカーが極めて少ない。従来、遺伝子多型の同定に骨密度予測や骨粗鬆症のリスク判定のための発明として、下記のものが開示されている。
【０００４】
例えば、ヒト組織非特異型アルカリホスファターゼ（ＴＮＳＡＬＰ）遺伝子の遺伝子多型 が、ＴＮＳＡＬＰの基質親和性に影響を与えていることを実証すると共に、該遺伝子多型を検出することにより、骨密度変化を予測することができることを見いだし、同時に、骨疾患、特にヒト女性の閉経後における原発性の骨粗鬆症 が発症する可能性を予測することが可能であることを見いだした発明がある（特許文献１）。
【特許文献１】骨密度予測方法および遺伝子多型分析用試薬キット（特開２００６−６１０９０）。
【０００５】
その他には、ペルオキシソーム増殖因子−活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）における遺伝子多型、具体的には、ホモ接合体ＰＰＡＲγＰｒｏ１２アレル又はホモ接合体ＰＰＡＲγＶＮ１０２「Ｇ」アレルの存在を検出するものがある。
【特許文献２】骨粗鬆症 と、ＰＰＡＲγ中の一塩基多型との相関関係（特開２００６−１４７３８）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、従来の遺伝子多型による疾患罹患マーカーに関する発明は、他の遺伝子多型と比較することなく統計上有意であるものを骨密度が予測できる遺伝子として挙げている。そこで、本発明が解決しようとする課題は、ヒト染色体上に存在する偏りのない全ゲノムからのアプローチにより統計学上信頼度の高い遺伝子多型を抽出して、これらの遺伝子多型情報を利用した、骨密度の減少を含む疾患又は症状、例えば、骨粗鬆症の罹患リスクに関する信頼性の高い測定方法、骨粗鬆症の罹患診断マーカー、骨粗鬆症の罹患診断キット、及び特定の遺伝子型を有する患者を治療するため骨粗鬆症治療薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、骨粗鬆症感受性遺伝子として、ヒトＳＭＡＤ６遺伝子、ヒトＴＧＦβＲ１遺伝子、ヒトＳｙｎｔａｘｉｎ１８遺伝子、ＷＤＳＯＦ１の遺伝子、ＡＤＡＭＴＳ１遺伝子、ＦＡＭ５Ｃ遺伝子近傍、ＧＰＲ９８遺伝子近傍、ＧＰＲ９８遺伝子、ＳＬＣ２５Ａ３２遺伝子、ＣＴＨＲＣ１遺伝子近傍、ＣＴＨＲＣ１遺伝子、又はＦＤＺ６遺伝子のいずれかに存在する遺伝子多型であることを見出した。これら遺伝子多型が、骨粗鬆症の罹患リスクを判定できる遺伝子マーカーとして、非常に有用であることを実証して、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
【０００９】
ヒトＳＭＡＤ６遺伝子、ヒトＴＧＦβＲ１遺伝子、ヒトＳｙｎｔａｘｉｎ１８遺伝子、ＷＤＳＯＦ１の遺伝子、ＡＤＡＭＴＳ１遺伝子、ＦＡＭ５Ｃ遺伝子近傍、ＧＰＲ９８遺伝子近傍、ＧＰＲ９８遺伝子、ＳＬＣ２５Ａ３２遺伝子、ＣＴＨＲＣ１遺伝子近傍、ＣＴＨＲＣ１遺伝子、又はＦＤＺ６遺伝子のいずれかの遺伝子多型を同定することにより、骨粗鬆症罹患のリスクを判定する方法である。本発明において、発明に係る遺伝子はヒト由来のものであり、また、ＣＴＨＲＣ１遺伝子近傍とは、ＣＴＨＲＣ１遺伝子の近傍にある遺伝子という意味である。
【００１０】
ヒトＳＭＡＤ６遺伝子のイントロン１若しくはイントロン３、ヒトＴＧＦβＲ１遺伝子のイントロン１、ヒトＳｙｎｔａｘｉｎ１８遺伝子のイントロン１、ＷＤＳＯＦ１の遺伝子のイントロン７、イントロン１０若しくはエクソン１、エクソン２、ＡＤＡＭＴＳ１遺伝子のイントロン８、ＦＡＭ５Ｃ遺伝子近傍、又はＧＰＲ９８遺伝子近傍、ＧＰＲ９８遺伝子、ＳＬＣ２５Ａ３２遺伝子のエクソン７若しくはイントロン１、ＣＴＨＲＣ１遺伝子近傍、ＣＴＨＲＣ１遺伝子のエクソン１又はＦＤＺ６遺伝子のエクソン２若しくはエクソン４に存在するいずれかの遺伝子多型を同定することにより、骨粗鬆症罹患のリスクを判定する方法である。
【００１１】
また、下記の１６からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドからなる骨粗鬆症の罹患診断マーカー：（１）ＷＤＳＯＦ１の遺伝子のイントロン７に存在する遺伝子配列（配列番号５）であって、第８染色体における位置が９９６４５３３９番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。（２）ＷＤＳＯＦ１の遺伝子のイントロン１０に存在する遺伝子配列（配列番号６）であって、第８染色体における位置が９９６５５１３１番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。（３）ＷＤＳＯＦ１の遺伝子のエキソン１に存在する遺伝子配列（配列番号７）であって、第８染色体における位置が９９６２７７０８番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。（４）ＷＤＳＯＦ１の遺伝子のエキソン１に存在する遺伝子配列（配列番号８）であって、第８染色体における位置が９９６２７８９０番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。（５）ＷＤＳＯＦ１の遺伝子のエキソン２に存在する遺伝子配列（配列番号９）であって、第８染色体における位置が９９６３２８７９番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。（６）ＡＤＡＭＴＳ１の遺伝子のイントロン８に存在する遺伝子配列（配列番号１０）であって、第２１染色体における位置が１３３９３９９５番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。（７）ＦＡＭ５Ｃ遺伝子の近傍に存在する遺伝子配列（配列番号１１）であって、第１染色体における位置が１６１１９６９３０番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。（８）ＧＰＲ９８の遺伝子の近傍に存在する遺伝子配列（配列番号１２）であって、第５染色体における位置が８５７００６４８番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。（９）ＧＰＲ９８遺伝子のイントロン８７に存在する遺伝子配列（配列番号１３）であって、第５染色体における位置が８５６３６２２６番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。（１０）ＳＬＣ２５Ａ３２の遺伝子のエクソン７に存在する遺伝子配列（配列番号１４）であって、第８染色体における位置が９９６１２７３９番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。（１１）ＳＬＣ２５Ａ３２の遺伝子のイントロン１に存在する遺伝子配列（配列番号１５）であって、第８染色体における位置が９９６２６５９６番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。（１２）ＣＴＨＲＣ１遺伝子のエクソン４に存在する遺伝子配列（配列番号１６）であって、第８染色体における位置が９９５９５１４６番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。（１３）ＣＴＨＲＣ１遺伝子の近傍に存在する遺伝子配列（配列番号１７）であって、第８染色体における位置が９９５８２８７３番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。（１４）ＦＤＺ６の遺伝子のエクソン２に存在する遺伝子配列（配列番号１８）であって、第８染色体における位置が９９５１３３９７番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。（１５）ＦＤＺ６の遺伝子のエクソン４に存在する遺伝子配列（配列番号１９）であって、第８染色体における位置が９９５３８４１５番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。（１６）上記（１）〜（１５）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを提供するものである。
【００１２】
ヒトＷＤＳＯＦ１の遺伝子のイントロン７に存在する遺伝子配列であって、第８染色体における位置が９９６４５３３９番目の遺伝子多型と連鎖不平衡にある遺伝子多型部位を含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチドからなる骨粗鬆症の罹患診断マーカー。
【００１３】
配列番号５乃至１９のいずれかに示す遺伝子配列を有し、いずれの配列においても塩基番号２６の遺伝子多型を検出することにより骨粗鬆症の罹患リスクを判定することを特徴とする骨粗鬆症の罹患診断マーカー。
【００１４】
配列番号１乃至１９のいずれかに示す遺伝子配列を有し、いずれの配列においても塩基番号２６の遺伝子多型を検出することにより骨粗鬆症の罹患リスクを判定することを特徴するものであって、下記のいずれかの遺伝子多型であれば骨粗鬆症の罹患率が高いと判定することを特徴とする診断マーカー。（１）配列番号１の遺伝子多型が、ＡＣアレルのうちＣアレルである。（２）配列番号２の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルである。（３）配列番号３の遺伝子多型が、ＴＣアレルのうちＣアレルである。（４）配列番号４の遺伝子多型が、ＴＧアレルのうちＧアレルである。（５）配列番号５の遺伝子多型が、ＴＧアレルのうちＧアレルである。（６）配列番号６の塩遺伝子多型が、ＡＣアレルのうちＣアレルである。（７）配列番号７の遺伝子多型が、ＡＣアレルのうちＣアレルである。（８）配列番号８の遺伝子多型が、ＣＴアレルのうちＴアレルである。（９）配列番号９の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルである。（１０）配列番号１０の遺伝子多型が、ＴＣアレルのうちＣアレルである。（１１）配列番号１１の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルである。（１２）配列番号１２の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルである。（１３）配列番号１３の遺伝子多型が、ＣＴアレルのうちＣアレルである。（１４）配列番号１４の遺伝子多型が、ＣＡアレルのうちＡアレルである。（１５）配列番号１５の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルである。（１６）配列番号１６の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルＡである。（１７）配列番号１７の遺伝子多型が、ＧＡアレルのうちＡアレルである。（１８）配列番号１８の遺伝子多型が、ＣＴアレルのうちＴアレルである。（１９）配列番号１９の遺伝子多型が、ＧＴアレルのうちＴアレルである。
【００１５】
配列番号１乃至４のいずれかに示す遺伝子配列を有し、いずれの配列においても塩基番号２６の遺伝子多型を検出することにより骨粗鬆症の罹患リスクを判定することを特徴するものであって、下記のいずれかの遺伝子多型であれば骨粗鬆症の罹患率が低いと判定することを特徴とする診断マーカー。（１）配列番号１の遺伝子多型が、ＡＣアレルのうちＡアレルである。（２）配列番号２の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＡアレルである。（３）配列番号３の遺伝子多型が、ＴＣアレルのうちＴアレルである。（４）配列番号４の遺伝子多型が、ＴＧアレルのうちＴアレルである。
【００１６】
前記いずれかのオリゴヌクレオチドが支持体に固定されたマイクロアレイ。
【００１７】
前記オリゴヌクレオチド及び／又は前記記載のマイクロアレイを含む、骨粗鬆症罹患リスク判定キット。
【００１８】
下記の遺伝子型を有する患者を治療するための、骨粗鬆症治療薬または骨粗鬆症予防剤。 配列番号１乃至１９のいずれかに示す遺伝子配列を有し、いずれの配列においても塩基番号２６の遺伝子多型を検出することにより骨粗鬆症の罹患リスクを判定することを特徴するものであって、下記のいずれかの遺伝子多型であれば骨粗鬆症の罹患率が高いと判定することを特徴とする診断マーカー。（１）配列番号１の遺伝子多型が、ＡＣアレルのうちＣアレルである。（２）配列番号２の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルである。（３）配列番号３の遺伝子多型が、ＴＣアレルのうちＣアレルである。（４）配列番号４の遺伝子多型が、ＴＧアレルのうちＧアレルである。（５）配列番号５の遺伝子多型が、ＴＧアレルのうちＧアレルである。（６）配列番号６の塩遺伝子多型が、ＡＣアレルのうちＣアレルである。（７）配列番号７の遺伝子多型が、ＡＣアレルのうちＣアレルである。（８）配列番号８の遺伝子多型が、ＣＴアレルのうちＴアレルである。（９）配列番号９の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルである。（１０）配列番号１０の遺伝子多型が、ＴＣアレルのうちＣアレルである。（１１）配列番号１１の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルである。（１２）配列番号１２の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルである。（１３）配列番号１３の遺伝子多型が、ＣＴアレルのうちＣアレルである。（１４）配列番号１４の遺伝子多型が、ＣＡアレルのうちＡアレルである。（１５）配列番号１５の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルである。（１６）配列番号１６の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルＡである。（１７）配列番号１７の遺伝子多型が、ＧＡアレルのうちＡアレルである。（１８）配列番号１８の遺伝子多型が、ＣＴアレルのうちＴアレルである。（１９）配列番号１９の遺伝子多型が、ＧＴアレルのうちＴアレルである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、骨密度の減少を含む疾患又は症状、例えば、骨粗鬆症の罹患リスクの遺伝的要因の有無を判定するにあたり、非常に簡便であり且つ信頼性の高い新規判定法を提供することができる。また、上記判定方法に用い得るオリゴヌクレオチド、マイクロアレイ及び診断キットを提供することもできる。また、特定の遺伝子多型を有する患者等を治療するための、骨粗鬆症治療薬を提供することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。なお、実施形態は下記に限定されるものではない。
本発明は、骨密度の減少を含む疾患又は症状、例えば、骨粗鬆症の罹患リスクの遺伝的要因の有無を判定するための方法であり、本方法は、ヒトＳＭＡＤ６遺伝子、ヒトＴＧＦβＲ１遺伝子、ヒトＳｙｎｔａｘｉｎ１８遺伝子、ＷＤＳＯＦ１の遺伝子、ＡＤＡＭＴＳ１遺伝子、ＦＡＭ５Ｃ遺伝子近傍、ＧＰＲ９８遺伝子近傍、ＧＰＲ９８遺伝子、ＳＬＣ２５Ａ３２遺伝子、ＣＴＨＲＣ１遺伝子近傍、ＣＴＨＲＣ１遺伝子、又はＦＤＺ６遺伝子のいずれかに存在する遺伝子多型における遺伝子多型を見出し、これらの遺伝子多型に着目したものである。
【００２１】
遺伝子多型の解析方法として、疾患群と非疾患群の遺伝子情報をそれぞれ大量に収集し、両群での遺伝子多型の頻度差を見る、関連解析がある。本発明者は、この関連解析を利用して、腰椎及び全身骨骨量との相関解析を行い、骨量を規定するいくつかの遺伝子多型を同定した。これらの遺伝子多型が、骨粗鬆症の罹患リスクの遺伝的要因の有無を判定するために有用であることを見出した。
【００２２】
遺伝子多型とは、遺伝子配列中の特定の１塩基が他の塩基に置換することによる多型を意味する。インサーション／デレーション多型とは、１以上の塩基が欠失／挿入することによる多型を意味する。また、塩基配列の繰り返し数の異なることにより生じる多型（塩基繰り返し多型）には、繰り返す塩基数の違いによりマイクロサテライト多型（塩基数：２〜４塩基程度）とＶＮＴＲ （ｖａｒｉａｂｌｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ）多型（繰り返し塩基：数〜数十塩基）があり、その繰り返し塩基数が個々人によって異なっている多型を意味する。
【００２３】
ヌクレオチドは核酸を意味する。また、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドが複数結合したものであり、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むものであり、いわゆるプライマー、プローブ、及びオリゴマー断片と同意味である。
【００２４】
＜遺伝子多型情報＞
本発明の方法において好ましく利用できる遺伝子多型の情報を、下記の表１及び表２に例示列挙する（配列番号１〜１９）。表１及び表２に示される多型情報は、一塩基多型（ＳＮＰ）に関するものである。表１及び２に示される遺伝子多型の中でも、配列番号１、２、７、８、９、１６、１８及び１９の塩基配列中に示される多型が特に好ましい。また、表３は、ｒｓ７５５４５１と連鎖不平衡にある遺伝子多型を列挙している。表３にあるＳＮＰは、すべて第１５染色体にあり、染色体位置は、ＮＷ＿９２５８８４．１における位置を示している。表中の、「遺伝子多型名」とは、ゲノム上の位置におけるＳＮＰ名であり、いずれも全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を用いて確認されるアクセッション番号で示している。染色体における位置とは、特定の染色体中の位置（ＮＷ＿９２５８８４．１）を示している。表中の「配列」には５１塩基からなる塩基配列が表示されており、その２６番目にＳＮＰ部位を表示している。［Ｇ／Ｔ］とあるのは、「Ｇ」と「Ｔ」のＳＮＰであることを示している。
【００２５】
【表１】
【００２６】
【表２】
【００２７】
＜遺伝子多型の検出法＞
以下に、本発明の診断マーカーやマイクロアレイを利用した、遺伝子多型の検出法を例示する。なお、患者や被験者からの遺伝子サンプルの入手や調整方法については、実施例で後述する。
【００２８】
（１） ＰＣＲ法を用いた検出
本発明においては、ＰＣＲ法を用いた検出することもできる。ＰＣＲにより被験サンプルを増幅するには、Ｆｉｄｅｌｉｔｙの高いＤＮＡポリメラーゼ等を用いることが好ましい。プライマーは、被験サンプル中の対象ＳＮＰを増幅できるようにプライマーの任意の位置に遺伝子多型が含まれるように設計し合成する。増幅反応終了後は、増幅産物の検出を行い、多型の有無を判定する。
【００２９】
（２） 塩基配列決定法による検出
本発明においては、ジデオキシ法に基づく塩基配列決定法により本発明の多型を検出することもできる。塩基配列決定に用いるシークエンサーには、市販のＡＢＩシリーズ（アマシャムバイオサイエンス）等を用いることができる。
【００３０】
（３） マイクロアレイによる検出
マイクロアレイは、支持体上にポリヌクレオチドプローブが固定されたものであり、ＤＮＡチップ、Ｇｅｎｅ チップ、マイクロチップ、ビーズアレイなどを含む。
【００３１】
まず、被験者サンプルのＤＮＡを単離し、必要な部分をＰＣＲにより増幅し、蛍光レポーター基等により標識する。続いて、被験者サンプルのＤＮＡを標識化されたＤＮＡをアレイと共に、ハイブリダイゼーションさせるために、インキュベートする。次にこのアレイをスキャナーに差し込み、ハイブリダイゼーションパターンを検出する。ハイブリダイゼーションのデータは、プローブアレイに結合した蛍光レポーター基からの発光として採集する。標的配列と完全に一致したプローブは、標的配列と一致していない部分を有するものよりも強いシグナルを生じる。アレイ上の各プローブの配列及び位置は分かっているため、相補性によって、プローブアレイと反応させた標的ポリヌクレオチドの配列を決定することができる。
【００３２】
（４）ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法による検出
ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法は、５′末端を蛍光物質（ＦＡＭなど）で、３′末端をクエンチャー物質（ＴＡＭＲＡ など）で修飾したオリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎプローブ）をＰＣＲ反応系に加える方法である。まず、ＴａｑＭａｎプローブが鋳型ＤＮＡとハイブリダイゼーションし、その後、ＰＣＲプライマーからの伸長反応が起こる。そうすると、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５′ヌクレアーゼ活性により蛍光色素結合部分が切断されて、蛍光色素が遊離し、クエンチャーの影響を受けなくなり発色する。この蛍光を検出することで特定の多型（ＳＮＰ等）を同定し、ゲノムタイプを判定することができる。ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法で用いるアレル特異的オリゴ（ＴａｑＭａｎプローブという）は、前記遺伝子多型情報に基づいて設計することができる。
【００３３】
（５） インベーダー法による検出
インベーダー法は、塩基配列の標的部位においてオリゴヌクレオチドによる特異的な構造を作り、その構造を酵素クリベース等が認識し、切断することを利用している。ＳＮＰを検出する部位の周辺において、２種類のオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ）が重なり合った構造を作りながらハイブリダイズします。すなわち、標的部位において片方のオリゴ（インベーダーオリゴ）が、もう一方のオリゴの下に１塩基のみ侵入する。酵素クリベース等は、この侵入構造を認識し、はみ出した部位を切断し、フラップ断片を放出する。この放出されたフラップ断片を検出することで、多型を検出するができる。
【００３４】
＜骨粗鬆症罹患リスク判定キット＞
本発明において、遺伝子多型（例えばＳＮＰ）部位を含む診断マーカーは、骨粗鬆症罹患リスク判定キットに含めることができる。
【００３５】
本発明のキットは、本発明を実施するために必要な１種以上の成分を含むものである。
例えば、本発明のキットは、酵素を保存若しくは供給するためのもの、遺伝子多型検出を実施するために必要な反応成分を含むことができる。そのような成分としては、限定されるものではないが、本発明のオリゴヌクレオチド、酵素緩衝液、ｄＮＴＰ、コントロール用試薬（例えば、組織サンプル、ポジティブ及びネガティブコントロール用標的オリゴヌクレオチドなど）、標識用又は検出用試薬、固相支持体、説明書などが挙げられる。
【００３６】
本発明のキットは、上記オリゴヌクレオチドを支持体に固定したマイクロアレイとして提供することもできる。マイクロアレイは、支持体上に本発明のオリゴヌクレオチドが固定されたものであり、ＤＮＡチップ、Ｇｅｎｅチップ、マイクロチップ、ビーズアレイなどを含む。当該マイクロアレイは、上記オリゴヌクレオチドと共に本発明のキットに含まれていてもよい。
【００３７】
＜遺伝子多型情報を利用した骨粗鬆症の薬物治療＞
本発明の骨粗鬆症薬、若しくはそのキットに含まれる医薬、若しくは候補品として、（１）カルシウム製剤、（２）女性ホルモン製剤（エストロゲン）、（３）活性型ビタミンＤ３製剤、ＥＤ−７１（４）ビタミンＫ２製剤、（５）ビスフォスネート剤（エチドロネート、アレンドロネート、リセドロネート、イバンドロネート、ミノドロン酸水和物）、（６）ＳＥＲＭ（塩酸ラロキシフェン、ラソフォキシフェン、酢酸バセドキシフェン）、（７）カルシトニン製剤、（８）イプリフラボン、（９）蛋白同化ホルモン製剤（アンドロゲン、デカン酸ナンドロロン）、（１０）ヒトＰＴＨ（１−３４）（テリパラチド）皮下注射製剤、（１１）抗ＲＡＮＫＬ抗体、デノスマブ（ＡＭＧ１６２）、（１２）ラネル酸ストロチウムなどが挙げられる。本発明では、骨粗鬆症の罹患リスクについて、遺伝子多型に関する情報を開示しているが、これを利用した医薬品等として提供してもよい。具体的には、医薬品のパッケージに用量・用法に当該遺伝子多型情報を記載することや、上記の骨粗鬆症罹患リスク判定キットをこれら医薬品とともに関連付けて、パッケージとすることが挙げられる。
【００３８】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３９】
＜腰椎及び全身骨骨量と相関のある遺伝子多型の同定＞
本発明では、閉経後女性を対象として、ヒト遺伝子上に多数存在する一塩基置換遺伝子多型（ＳＮＰ）のうち代表的な約５万個に対してＧｅｎｏｔｙｐｉｎｇを行い、ＳＮＰと骨量との相関解析を行った。さらに、本解析により統計上有意であった、遺伝子多型に関しては対象者数を増やして、同様の検討を行った。
【００４０】
まず、ヒトから採取した血液検体等から、フェノール法等を用いてゲノムＤＮＡを精製する。その際、ＧＦＸ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ等の市販のゲノムＤＮＡ抽出キットや装置を用いてもよい。次に、得られたゲノムＤＮＡを鋳型として、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法によりゲノムにおける遺伝子型を決定する。ゲノム上で遺伝子多型を含む領域を増幅できるＰＣＲプライマーを１セットとゲノムＤＮＡの一塩基変異に対応するＴａｑＭａｎプローブを２種類用意する。それぞれのＴａｑＭａｎプローブはゲノム上の遺伝子多型（Ａ／Ｂ）を含む領域に相補的な配列を有している。これらのプライマーとＴａｑＭａｎプローブ、ゲノムＤＮＡを混合し、ＰＣＲを行なうことで、２種類のＳＮＰが検出する。この遺伝子多型の遺伝子型決定においてはゲノム上の各遺伝子型をＴａｑＭａｎプローブで識別して遺伝子多型を検出する事になるので、「Ａ／Ａのホモ」の場合はＡという遺伝子多型を検出するＴａｑＭａｎプローブの蛍光のみが検出され、「Ａ／Ｂのヘテロ」の場合はＡとＢの両方のＳＮＰを検出する２種類のＴａｑＭａｎプローブの蛍光が検出されることになる。本方法により遺伝子型を決定する。
【００４１】
本発明では、５５―８３歳の閉経後の女性２５３名の血液より、ゲノムＤＮＡを抽出して、遺伝子多型を調べた。抽出したゲノムＤＮＡは、上述のようにＰＣＲで増幅して用いた。調べる対象となる遺伝子は、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ社のＧｅｎｅＣｈｉｐＭａｐｐｉｎｇ１００Ｋ Ｓｅｔに含まれる約５万個のＳＮＰについて、同社ＧｅｎｅＣｈｉｐＭａｐｐｉｎｇＡｓｓａｙ法を用いて決定した。腰椎及び全身骨骨量との相関解析を行い、骨量と関係する候補遺伝子を選択した。
【００４２】
本発明において、二重エックス線吸収法（ＤＸＡ）を用いて、全身骨骨量及び腰椎の骨量測定を行った。この測定法の特徴として、２種類の異なるエネルギーのＸ線を照射し、骨と軟部組織の吸収率の差による骨密度を測定する。本測定方法は、全身骨骨量、腰椎などいずれの部位でも高い精度で、５分−１０分程度と迅速に測定でき、標準的な骨密度測定法である。測定値を体重と年齢で補正したＺスコアとして表示する。本研究に参加する被験者において、全身骨骨量の交絡要因として考えられる年齢、体重、身長について線形モデルを当てはめた。本モデルの妥当性を調べるためにモデル選択基準値ＡＩＣ（Ａｋａｉｋｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ）を採用してモデルを構築した。この結果、本被験者の全身骨骨量に対して年齢と体重が影響することが示唆され、ｔｏｔａｌｂｏｄｙ＝ −３．９５＋０．０２３×ａｇｅ＋０．０５３×ｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔ＋ｒｅｓｉｄｕａｌの線形モデルで説明することができた。Ｒｅｓｉｄｕａｌとは、年齢や体重に依存しない全身骨骨量の部分であり、遺伝的要因が含まれているものである。本発明においてＺスコアをｔｏｔａｌｂｏｄｙ−（−３．９５＋０．０２３×ａｇｅ＋０．０５３×ｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔ）として計算した。
【実施例２】
【００４３】
＜ヒトＳＭＡＤ６遺伝子のイントロン３に存在するＳＮＰ（ｒｓ７５５４５１）＞
上記の解析方法により、日本人閉経後の女性２５３名の遺伝子上に多数存在する遺伝子多型のうち、約５万ＳＮＰにおけるＧｅｎｏｔｙｐｅを決定した。その結果、ヒトＳＭＡＤ６遺伝子のイントロン３に存在するＳＮＰ（ｒｓ７５５４５１）が全身骨骨量と有意に相関することが判明した（Ｐ＝０．０００２、図１（Ａ））。各群間の有意差検定に関しては、スチューデントのｔ検定を行い、Ｐ値が０．０５未満の場合を統計上有意とした。Ｔ検定は、２つの母集団がいずれも正規分布に従うと仮定した上での、平均が等しいかどうかの検定であるが、骨量はこれに従うものであるので、本検定を採用した。さらに、本解析で有意差が見出されたＳＮＰについて、対象者数を７０３名まで増やし、相関解析を行った。その結果、当該ＳＮＰは、全身骨骨量と強い相関があることが判明した（図１（Ｂ））。表中のＴｏｔａｌ ＢＭＤは、全身骨骨量を指し、値が高いほど骨量が多いことにあるが、個々人の体重及び身長の値で補正したものである。また、カッコ内は人数を指し、「ＡＣ＋ＣＣ」とは、母方由来及び父方由来のゲノムが、「ＡＣ」又は「ＣＣ」のＳＮＰである場合を指す。さらに、ヒトＳＭＡＤ６遺伝子のイントロン３に存在するＳＮＰ（ｒｓ７５５４５１）と連鎖不平衡にある遺伝子多型を調べ、第１５染色体に存在する遺伝子多型を同定できた（表３）。これらの遺伝子多型を用いることでも、骨粗鬆症の罹患診断をすることができる。
【実施例３】
【００４４】
＜ヒトＳＭＡＤ６遺伝子のイントロン１に存在するＳＮＰ（ｒｓ１７２６４１８５）＞
ヒトＳＭＡＤ６遺伝子のイントロン１に存在するＳＮＰ（ｒｓ１７２６４１８５）が全身
骨骨量と有意に相関することが判明した（Ｐ＝０．０００２、図２）。
【実施例４】
【００４５】
＜ヒトＴＧＦβＲ１遺伝子のイントロン１に存在するＳＮＰ（ｒｓ１０５１２２６３）＞
ヒトＴＧＦβＲ１遺伝子のイントロン１に存在するＳＮＰ（ｒｓ１０５１２２６３）が全身骨骨量（Ｐ＝０．０１５４、図３（Ａ））及び腰椎骨量（Ｐ＝０．００９１、図３（Ｂ））と有意に強い相関することが判明した。この結果を見ると、ＳＮＰ（ｒｓ１０５１２２６３）は、全身骨骨量に比して、腰椎骨量に強い相関があり、診断マーカーとしてより有効なものと思われる。なお、ＴＧＦβは、骨形成因子（ｂｏｎｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＭＰ）に関連するものと考えられている。なお、ＴＧＦβＲ１１遺伝子は骨代謝において重要な役割をはたす液性因子ＴＧＦβに対する受容体として働く。またＳＭＡＤ６はＴＧＦβからＴＧＦβＲ１１を介したシグナル伝達を調節する因子である。従って、両遺伝子は骨代謝において重要な機能をはたしていると推測される。
【実施例５】
【００４６】
＜ヒトＳｙｎｔａｘｉｎ１８遺伝子のイントロン１に存在するＳＮＰ（ｒｓ６８９４８４）＞
ヒトＳｙｎｔａｘｉｎ１８遺伝子のイントロン１に存在するＳＮＰ（ｒｓ６８９４８４）が全身骨骨量（Ｐ＝０．００１４、図４）と有意に強い相関することが判明した。なお、ＴＧＦβは、骨形成因子（ｂｏｎｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＭＰ）に関連するものと考えられている。また、ｓｙｎｔａｘｉｎ１８は細胞の小胞体に存在し、細胞内物質の輸送などに関与する因子であることが明らかにされており、細胞機能における重要性が示唆されている。
【実施例６】
【００４７】
＜ヒトＷＤＳＯＦ１の遺伝子に存在するＳＮＰ（ｒｓ３１３４２９５）（ｒｓ３１３４２９６）（ｒｓ３１３４２５３）＞
全身骨骨量との相関解析を行い、骨量と関係する候補遺伝子を選択する方法は、実施例１から５までの手順と同様である。ＤＸＡ法にて測定した骨密度の値に関連する遺伝的要因を見出すものであるが、骨量の分布は年齢の増加や体重に影響を受けるので、これを補正するために、測定値を体重と年齢で補正したＺスコアとして用いた。また、スクリーニングするＳＮＰｓは、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ社のＧｅｎｅＣｈｉｐＭａｐｐｉｎｇ１００Ｋ Ｓｅｔに含まれる約５万個のＳＮＰについて、同社ＧｅｎｅＣｈｉｐＭａｐｐｉｎｇＡｓｓａｙ法を用いて決定した。
【００４８】
最初に、遺伝子多型解析の質を高めるために、一定の基準を満たした遺伝子多型について解析した。ここで、一定の基準とは、遺伝子型決定成功率（Ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ ｃａｌｌ ｒａｔｅ）が９５％、マイナーアレル頻度１０％およびＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡値０．０００１以上の３項目を満たしたものである。この基準を満たすことで、データクリーニングされたＳＮＰｓを用いることができる。遺伝子型決定成功率とは、集団における１ＳＮＰあたりの遺伝子型決定の割合であり、極端に低いマイナーアレル頻度の場合には遺伝子型決定に誤りがあることを示唆される。本実施例は、本解析から基準を満たした１５６２２ＳＮＰｓについて計測を行った。
【００４９】
上記の１５６２２ＳＮＰｓについて、被験者２５１名の全身骨骨量との関連解析を行い、その結果であるＰ値のＱＱプロットを示す（図５）。各ＳＮＰ座位において出現頻度の多いアレル（Ｍａｊｏｒ ａｌｌｅｌｅ）についてメンデルの優劣の法則（Ａ優性様式、Ｂ劣性様式）を仮定し、関連性の有無を検定したＰ値を示した。ＱＱプロットより、一様分布から逸脱したと想定されるＳＮＰを１１個（Ａ図）と９個（Ｂ図）の計２０個を選択した。
【００５０】
次いで、これら２０ＳＮＰに関して別集団の閉経後女性４９９名を対象として、既にＳＮＰ道程方法として確立している、Ｔｗｏ−ｓｔａｇｅ Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙを用いて２次スクリーニングを行った。その結果、第８染色体にあるＷＤＳＯＦ１の遺伝子に存在するＳＮＰｓが全身骨骨量と相関するものとして見出した。具体的には、ｒｓ１３７０００５（配列番号５）、ｒｓ３０９８２１４（配列番号６）、ｒｓ３１３４２９５（配列番号７）、ｒｓ３１３４２９６（配列番号８）、ｒｓ３１３４２５３（配列番号９）である。図７では、これらＷＤＳＯＦ１の遺伝子に存在するＳＮＰｓのうち、アミノ酸変化を伴うＳＮＰｓ（ｒｓ３１３４２９５、ｒｓ３１３４２９６、ｒｓ３１３４２５３）について全身骨骨量との相関を示した。表中のＴｏｔａｌ ｂｏｄｙ ＢＭＤは、全身骨骨量を指し値が高いほど骨量が多いことにあるが、個々人の体重及び身長の値で補正したものである。また、カッコ内は人数を指し、「ＡＣ＋ＣＣ」とは、母方由来及び父方由来のゲノムが「ＡＣ」又は「ＣＣ」のＳＮＰである場合を指し、「ＡＡ」とは母方由来及び父方由来のゲノムがいずれも「ＡＡ」である場合を示す。この結果から、これらのＳＮＰを指標とすることで骨量との相関が見出され、骨量に関係する疾患マーカーとなりえる。なお、本遺伝子のヒトにおける機能は不明である。以下、本実施例の手順により、ヒトＷＤＳＯＦ１の遺伝子のイントロン７に存在するＳＮＰ（ｒｓ１３７０００５）、イントロン１０に存在するＳＮＰ（ｒｓ３０９８２１４）、実施例７、８、９に説明するＳＮＰｓが同定され、その他、Ｓｍａｄ６遺伝子に存在するＳＮＰも改めて同定された。
【実施例７】
【００５１】
ＷＤＳＯＦ１の遺伝子に存在するｒｓ１３７０００５（配列番号５）について、その近傍約１５０Ｋｂｐ周辺にある連鎖不平衡にある１１個のＳＮＰｓを同定した（図６）。図６は、ある２つのＳＮＰ間の連鎖不平衡係数ｒ２を計算して、それを図示したものである。表示の数値の単位は１０−２であり、１００に近い数値であれば強い連鎖不平衡状態（相関係数±１に対応）であると示唆される。一般に、連鎖不平衡係数ｒ２が０．８以上であれば連鎖不平衡状態であり、これら１１個のうちｒｓ１３７０００と連鎖不平衡にあるＳＮＰは７個であった。その一方で今回探索した１１個の遺伝子は表４に示したように全身ならびに腰椎骨と有意に相関した。以上よりｒｓ１３７０００５周辺のＳＮＰは骨粗鬆症など骨量に関連した疾患や健康状態などのマーカーとなりえるものである。
【実施例８】
【００５２】
＜ヒトＡＤＡＭＴＳ１遺伝子に存在するＳＮＰ（ｒｓ２２９０４２）＞
本発明において、ヒトＡＤＡＭＴＳ１遺伝子に存在するＳＮＰ（ｒｓ２２９０４２）も骨量との相関が見出された（表５）。ＡＤＡＭＴＳ１遺伝子の遺伝子産物は、細胞外マトリクスに存在するａｇｇｒｅｃａｎなどと結合し蛋白分解酵素として機能することが知られており、骨や軟骨代謝において重要な役割することが示唆されている。
【実施例９】
【００５３】
＜ヒトＦＡＭ５Ｃ遺伝子近傍に存在するＳＮＰ（ｒｓ１０４９４６２２）＞
本発明において、ヒトＦＡＭ５Ｃ遺伝子近傍に存在するＳＮＰ（ｒｓ１０４９４６２２）も骨量との相関が見出された（表５）。本遺伝子に関する機能は不明である。
【実施例１０】
【００５４】
＜ヒトＧＰＲ９８遺伝子近傍ならびに遺伝子上に存在するＳＮＰ（ｒｓ１０５１４３４６）＞
本発明において、ヒトＧＰＲ９８近傍遺伝子に存在するＳＮＰ（ｒｓ１０５１４３４６）も骨量との相関が見出された。また、ＧＰＲ９８の遺伝子上イントロン８７に存在するＳＮＰ（ｒｓ１０５１４３４５）と骨量の相関を検討したところ、このＳＮＰも骨量と有意に相関した（表６）。ＧＰＲ９８遺伝子の機能は、Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓのなかで１９６７アミノ酸を有する巨大タンパク質である。脳神経において高発現しているがその機能の詳細は不明である。
【実施例１１】
【００５５】
＜ヒトＳＬＣ２５Ａ３２遺伝子に存在するＳＮＰｓ（ｒｓ２２４１７７７、ｒｓ３１３３８１７）＞
本発明において、ヒトＳＬＣ２５Ａ３２遺伝子に存在するＳＮＰ（ｒｓ２２４１７７７、ｒｓ３１３３８１７）も骨量との相関が見出された（表４）。ＳＬＣ２５Ａ３２遺伝子の機能は、ミトコンドリアに存在する葉酸のトランスポーターであり、葉酸は骨代謝に重要で、葉酸の代謝に関与する酵素ＮＴＨＦＲが骨粗鬆症の発症と関与することが知られている。
【実施例１２】
【００５６】
＜ヒトＣＴＨＲＣ１遺伝子及びヒトＣＴＨＲＣ１近傍遺伝子に存在するＳＮＰｓ（ｒｓ３０９８２３３、ｒｓ３０９８２３０）＞
本発明において、ヒトＣＴＨＲＣ１遺伝子及びヒトＣＴＨＲＣ１近傍遺伝子に存在するＳＮＰｓ（ｒｓ３０９８２３３、ｒｓ３０９８２３０）も骨量との相関が見出された（表４）。ヒトＣＴＨＲＣ１遺伝子の機能は、血管損傷時に血管において高発現する遺伝子であり、高発現したマウスは骨における基質蛋白の分泌が低下し骨が折れ易くなることが知られている。
【実施例１３】
【００５７】
＜ヒトＦＤＺ６遺伝子に存在するＳＮＰｓ（ｒｓ３７３６０４７、ｒｓ３８０８５５３）＞
本発明において、ヒトＦＤＺ６遺伝子に存在するＳＮＰｓ（ｒｓ３７３６０４７、ｒｓ３８０８５５３）も骨量との相関が見出された（表４）。ＦＤＺ６遺伝子の機能は、骨において重要な役割を果たすＷｎｔシグナルを制御する因子であることが知られている。なお、ｒｓ３８０８５５３は、３４番目のＬｅｕをＭｅｔに変化させるＳＮＰである。
【実施例１４】
【００５８】
＜連鎖不平衡にあるＳＮＰ＞
表７〜１３は、本発明で診断マーカーとなるＳＮＰに対して連鎖不平衡にあるＳＮＰであり、これらのＳＮＰについてアクッセションナンバーを示した。これらの連鎖不平衡にあるＳＮＰを用いても、診断マーカーの機能をする。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】（Ａ）ＳＭＡＤ６遺伝子のイントロン３に存在するＳＮＰ（ｒｓ７５５４５１）と全身骨骨量との相関を示すグラフ（２３７人での試験結果）。（Ｂ）ＳＭＡＤ６遺伝子のイントロン３に存在するＳＮＰ（ｒｓ７５５４５１）と全身骨骨量との相関を示すグラフ（７０３人での試験結果）。
【図２】ＳＭＡＤ６遺伝子のイントロン１に存在するＳＮＰ（ｒｓ１７２６４１８５）と全身骨骨量との相関を示すグラフ（４６３人での試験結果）。
【図３】（Ａ）ＴＧＦβＲ１遺伝子のイントロン１に存在するＳＮＰ（ｒｓ１０５１２２６３）と全身骨骨量との相関を示すグラフ（７１１人での試験結果）。（Ｂ）ＴＧＦβＲ１遺伝子のイントロン１に存在するＳＮＰ（ｒｓ１０５１２２６３）と腰椎骨量との相関を示すグラフ（７０３人での試験結果）。
【図４】Ｓｙｎｔａｘｉｎ１８遺伝子のイントロン１に存在するＳＮＰ（ｒｓ６８９４８４）と全身骨骨量との相関を示すグラフ（５５２人での試験結果）。
【図５】全身骨骨量とＳＮＰｓの相関解析を示すＰ値のＱＱプロット（Ａ）優性様式、（Ｂ）劣性様式
【図６】ヒトＷＤＳＯＦ１遺伝子上に存在する遺伝子多型間の連鎖不平衡の解析を示す図。
【図７】（Ａ）ＷＤＳＯＦ１遺伝子に存在するＳＮＰ（ｒｓ３１３４２９５）と全身骨骨量との相関を示すグラフ。（Ｂ）ＷＤＳＯＦ１遺伝子に存在するＳＮＰ（ｒｓ３１３４２９６）と全身骨骨量との相関を示すグラフ。（Ｃ）ＷＤＳＯＦ１遺伝子に存在するＳＮＰ（ｒｓ３１３４２５３）と全身骨骨量との相関を示すグラフ。
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＷＤＳＯＦ１遺伝子、ヒトＡＤＡＭＴＳ１遺伝子、ヒトＦＡＭ５Ｃ遺伝子近傍、ヒトＧＰＲ９８遺伝子近傍、ヒトＧＰＲ９８遺伝子、ヒトＳＬＣ２５Ａ３２遺伝子、ヒトＣＴＨＲＣ１遺伝子近傍、ヒトＣＴＨＲＣ１遺伝子、又はヒトＦＤＺ６遺伝子のいずれかの遺伝子多型を同定することにより、骨粗鬆症罹患のリスクを判定する方法。
【請求項２】
ヒトＷＤＳＯＦ１遺伝子のイントロン７、イントロン１０若しくはエクソン１、エクソン２、ヒトＡＤＡＭＴＳ１遺伝子のイントロン８、ヒトＦＡＭ５Ｃ遺伝子近傍、又はヒトＧＰＲ９８遺伝子近傍、ヒトＧＰＲ９８遺伝子、ヒトＳＬＣ２５Ａ３２遺伝子のエクソン７若しくはイントロン１、ヒトＣＴＨＲＣ１遺伝子近傍、ヒトＣＴＨＲＣ１遺伝子のエクソン１又はヒトＦＤＺ６遺伝子のエクソン２若しくはエクソン４に存在するいずれかの遺伝子多型を同定することにより、骨粗鬆症罹患のリスクを判定する方法。
【請求項３】
下記の１６からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドからなる骨粗鬆症の罹患診断マーカー：
（１）ＷＤＳＯＦ１の遺伝子のイントロン７に存在する遺伝子配列（配列番号５）であって、第８染色体における位置が９９６４５３３９番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。
（２）ＷＤＳＯＦ１の遺伝子のイントロン１０に存在する遺伝子配列（配列番号６）であって、第８染色体における位置が９９６５５１３１番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。
（３）ＷＤＳＯＦ１の遺伝子のエキソン１に存在する遺伝子配列（配列番号７）であって、第８染色体における位置が９９６２７７０８番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。
（４）ＷＤＳＯＦ１の遺伝子のエキソン１に存在する遺伝子配列（配列番号８）であって、第８染色体における位置が９９６２７８９０番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。
（５）ＷＤＳＯＦ１の遺伝子のエキソン２に存在する遺伝子配列（配列番号９）であって、第８染色体における位置が９９６３２８７９番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。
（６）ＡＤＡＭＴＳ１の遺伝子のイントロン８に存在する遺伝子配列（配列番号１０）であって、第２１染色体における位置が１３３９３９９５番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。
（７）ＦＡＭ５Ｃ遺伝子の近傍に存在する遺伝子配列（配列番号１１）であって、第１染色体における位置が１６１１９６９３０番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。
（８）ＧＰＲ９８の遺伝子の近傍に存在する遺伝子配列（配列番号１２）であって、第５染色体における位置が８５７００６４８番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。
（９）ＧＰＲ９８遺伝子のイントロン８７に存在する遺伝子配列（配列番号１３）であって、第５染色体における位置が８５６３６２２６番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。
（１０）ＳＬＣ２５Ａ３２の遺伝子のエクソン７に存在する遺伝子配列（配列番号１４）であって、第８染色体における位置が９９６１２７３９番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。
（１１）ＳＬＣ２５Ａ３２の遺伝子のイントロン１に存在する遺伝子配列（配列番号１５）であって、第８染色体における位置が９９６２６５９６番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。
（１２）ＣＴＨＲＣ１遺伝子のエクソン４に存在する遺伝子配列（配列番号１６）であって、第８染色体における位置が９９５９５１４６番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。
（１３）ＣＴＨＲＣ１遺伝子の近傍に存在する遺伝子配列（配列番号１７）であって、第８染色体における位置が９９５８２８７３番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。
（１４）ＦＤＺ６の遺伝子のエクソン２に存在する遺伝子配列（配列番号１８）であって、第８染色体における位置が９９５１３３９７番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。
（１５）ＦＤＺ６の遺伝子のエクソン４に存在する遺伝子配列（配列番号１９）であって、第８染色体における位置が９９５３８４１５番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。
（１６）上記（１）〜（１５）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド。
【請求項４】
ヒトＷＤＳＯＦ１の遺伝子のイントロン７に存在する遺伝子配列であって、第８染色体における位置が９９６４５３３９番目の遺伝子多型と連鎖不平衡にある遺伝子多型部位を含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチドからなる骨粗鬆症の罹患診断マーカー。
【請求項５】
配列番号５乃至１９のいずれかに示す遺伝子配列を有し、いずれの配列においても塩基番号２６の遺伝子多型を検出することにより骨粗鬆症の罹患リスクを判定することを特徴とする骨粗鬆症の罹患診断マーカー。
【請求項６】
配列番号１乃至１９のいずれかに示す遺伝子配列を有し、いずれの配列においても塩基番号２６の遺伝子多型を検出することにより骨粗鬆症の罹患リスクを判定することを特徴するものであって、下記のいずれかの遺伝子多型であれば骨粗鬆症の罹患率が高いと判定することを特徴とする診断マーカー。
（１）配列番号１の遺伝子多型が、ＡＣアレルのうちＣアレルである。
（２）配列番号２の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルである。
（３）配列番号３の遺伝子多型が、ＴＣアレルのうちＣアレルである。
（４）配列番号４の遺伝子多型が、ＴＧアレルのうちＧアレルである。
（５）配列番号５の遺伝子多型が、ＴＧアレルのうちＧアレルである。
（６）配列番号６の塩遺伝子多型が、ＡＣアレルのうちＣアレルである。
（７）配列番号７の遺伝子多型が、ＡＣアレルのうちＣアレルである。
（８）配列番号８の遺伝子多型が、ＣＴアレルのうちＴアレルである。
（９）配列番号９の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルである。
（１０）配列番号１０の遺伝子多型が、ＴＣアレルのうちＣアレルである。
（１１）配列番号１１の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルである。
（１２）配列番号１２の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルである。
（１３）配列番号１３の遺伝子多型が、ＣＴアレルのうちＣアレルである。
（１４）配列番号１４の遺伝子多型が、ＣＡアレルのうちＡアレルである。
（１５）配列番号１５の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルである。
（１６）配列番号１６の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルＡである。
（１７）配列番号１７の遺伝子多型が、ＧＡアレルのうちＡアレルである。
（１８）配列番号１８の遺伝子多型が、ＣＴアレルのうちＴアレルである。
（１９）配列番号１９の遺伝子多型が、ＧＴアレルのうちＴアレルである。
【請求項７】
配列番号１乃至４のいずれかに示す遺伝子配列を有し、いずれの配列においても塩基番号２６の遺伝子多型を検出することにより骨粗鬆症の罹患リスクを判定することを特徴するものであって、下記のいずれかの遺伝子多型であれば骨粗鬆症の罹患率が低いと判定することを特徴とする診断マーカー。
（１）配列番号１の遺伝子多型が、ＡＣアレルのうちＡアレルである。
（２）配列番号２の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＡアレルである。
（３）配列番号３の遺伝子多型が、ＴＣアレルのうちＴアレルである。
（４）配列番号４の遺伝子多型が、ＴＧアレルのうちＴアレルである。
【請求項８】
請求項３又は４に記載のいずれかのオリゴヌクレオチドが支持体に固定されたマイクロアレイ。
【請求項９】
請求項３又は４に記載のオリゴヌクレオチド及び／又は請求項８に記載のマイクロアレイを含む、骨粗鬆症罹患リスク判定キット。
【請求項１０】
請求項６に記載の遺伝子型を有する患者を治療するための、骨粗鬆症治療薬。
【請求項１１】
請求項６に記載の遺伝子型を有するヒトの骨粗鬆症を予防するための、骨粗鬆症予防剤。
【請求項１】
ヒトＷＤＳＯＦ１遺伝子、ヒトＡＤＡＭＴＳ１遺伝子、ヒトＦＡＭ５Ｃ遺伝子近傍、ヒトＧＰＲ９８遺伝子近傍、ヒトＧＰＲ９８遺伝子、ヒトＳＬＣ２５Ａ３２遺伝子、ヒトＣＴＨＲＣ１遺伝子近傍、ヒトＣＴＨＲＣ１遺伝子、又はヒトＦＤＺ６遺伝子のいずれかの遺伝子多型を同定することにより、骨粗鬆症罹患のリスクを判定する方法。
【請求項２】
ヒトＷＤＳＯＦ１遺伝子のイントロン７、イントロン１０若しくはエクソン１、エクソン２、ヒトＡＤＡＭＴＳ１遺伝子のイントロン８、ヒトＦＡＭ５Ｃ遺伝子近傍、又はヒトＧＰＲ９８遺伝子近傍、ヒトＧＰＲ９８遺伝子、ヒトＳＬＣ２５Ａ３２遺伝子のエクソン７若しくはイントロン１、ヒトＣＴＨＲＣ１遺伝子近傍、ヒトＣＴＨＲＣ１遺伝子のエクソン１又はヒトＦＤＺ６遺伝子のエクソン２若しくはエクソン４に存在するいずれかの遺伝子多型を同定することにより、骨粗鬆症罹患のリスクを判定する方法。
【請求項３】
下記の１６からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドからなる骨粗鬆症の罹患診断マーカー：
（１）ＷＤＳＯＦ１の遺伝子のイントロン７に存在する遺伝子配列（配列番号５）であって、第８染色体における位置が９９６４５３３９番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。
（２）ＷＤＳＯＦ１の遺伝子のイントロン１０に存在する遺伝子配列（配列番号６）であって、第８染色体における位置が９９６５５１３１番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。
（３）ＷＤＳＯＦ１の遺伝子のエキソン１に存在する遺伝子配列（配列番号７）であって、第８染色体における位置が９９６２７７０８番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。
（４）ＷＤＳＯＦ１の遺伝子のエキソン１に存在する遺伝子配列（配列番号８）であって、第８染色体における位置が９９６２７８９０番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。
（５）ＷＤＳＯＦ１の遺伝子のエキソン２に存在する遺伝子配列（配列番号９）であって、第８染色体における位置が９９６３２８７９番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。
（６）ＡＤＡＭＴＳ１の遺伝子のイントロン８に存在する遺伝子配列（配列番号１０）であって、第２１染色体における位置が１３３９３９９５番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。
（７）ＦＡＭ５Ｃ遺伝子の近傍に存在する遺伝子配列（配列番号１１）であって、第１染色体における位置が１６１１９６９３０番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。
（８）ＧＰＲ９８の遺伝子の近傍に存在する遺伝子配列（配列番号１２）であって、第５染色体における位置が８５７００６４８番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。
（９）ＧＰＲ９８遺伝子のイントロン８７に存在する遺伝子配列（配列番号１３）であって、第５染色体における位置が８５６３６２２６番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。
（１０）ＳＬＣ２５Ａ３２の遺伝子のエクソン７に存在する遺伝子配列（配列番号１４）であって、第８染色体における位置が９９６１２７３９番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。
（１１）ＳＬＣ２５Ａ３２の遺伝子のイントロン１に存在する遺伝子配列（配列番号１５）であって、第８染色体における位置が９９６２６５９６番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。
（１２）ＣＴＨＲＣ１遺伝子のエクソン４に存在する遺伝子配列（配列番号１６）であって、第８染色体における位置が９９５９５１４６番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。
（１３）ＣＴＨＲＣ１遺伝子の近傍に存在する遺伝子配列（配列番号１７）であって、第８染色体における位置が９９５８２８７３番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。
（１４）ＦＤＺ６の遺伝子のエクソン２に存在する遺伝子配列（配列番号１８）であって、第８染色体における位置が９９５１３３９７番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。
（１５）ＦＤＺ６の遺伝子のエクソン４に存在する遺伝子配列（配列番号１９）であって、第８染色体における位置が９９５３８４１５番目のヌクレオチドを含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチド。
（１６）上記（１）〜（１５）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド。
【請求項４】
ヒトＷＤＳＯＦ１の遺伝子のイントロン７に存在する遺伝子配列であって、第８染色体における位置が９９６４５３３９番目の遺伝子多型と連鎖不平衡にある遺伝子多型部位を含む１８〜３００塩基からなるポリヌクレオチドからなる骨粗鬆症の罹患診断マーカー。
【請求項５】
配列番号５乃至１９のいずれかに示す遺伝子配列を有し、いずれの配列においても塩基番号２６の遺伝子多型を検出することにより骨粗鬆症の罹患リスクを判定することを特徴とする骨粗鬆症の罹患診断マーカー。
【請求項６】
配列番号１乃至１９のいずれかに示す遺伝子配列を有し、いずれの配列においても塩基番号２６の遺伝子多型を検出することにより骨粗鬆症の罹患リスクを判定することを特徴するものであって、下記のいずれかの遺伝子多型であれば骨粗鬆症の罹患率が高いと判定することを特徴とする診断マーカー。
（１）配列番号１の遺伝子多型が、ＡＣアレルのうちＣアレルである。
（２）配列番号２の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルである。
（３）配列番号３の遺伝子多型が、ＴＣアレルのうちＣアレルである。
（４）配列番号４の遺伝子多型が、ＴＧアレルのうちＧアレルである。
（５）配列番号５の遺伝子多型が、ＴＧアレルのうちＧアレルである。
（６）配列番号６の塩遺伝子多型が、ＡＣアレルのうちＣアレルである。
（７）配列番号７の遺伝子多型が、ＡＣアレルのうちＣアレルである。
（８）配列番号８の遺伝子多型が、ＣＴアレルのうちＴアレルである。
（９）配列番号９の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルである。
（１０）配列番号１０の遺伝子多型が、ＴＣアレルのうちＣアレルである。
（１１）配列番号１１の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルである。
（１２）配列番号１２の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルである。
（１３）配列番号１３の遺伝子多型が、ＣＴアレルのうちＣアレルである。
（１４）配列番号１４の遺伝子多型が、ＣＡアレルのうちＡアレルである。
（１５）配列番号１５の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルである。
（１６）配列番号１６の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＧアレルＡである。
（１７）配列番号１７の遺伝子多型が、ＧＡアレルのうちＡアレルである。
（１８）配列番号１８の遺伝子多型が、ＣＴアレルのうちＴアレルである。
（１９）配列番号１９の遺伝子多型が、ＧＴアレルのうちＴアレルである。
【請求項７】
配列番号１乃至４のいずれかに示す遺伝子配列を有し、いずれの配列においても塩基番号２６の遺伝子多型を検出することにより骨粗鬆症の罹患リスクを判定することを特徴するものであって、下記のいずれかの遺伝子多型であれば骨粗鬆症の罹患率が低いと判定することを特徴とする診断マーカー。
（１）配列番号１の遺伝子多型が、ＡＣアレルのうちＡアレルである。
（２）配列番号２の遺伝子多型が、ＡＧアレルのうちＡアレルである。
（３）配列番号３の遺伝子多型が、ＴＣアレルのうちＴアレルである。
（４）配列番号４の遺伝子多型が、ＴＧアレルのうちＴアレルである。
【請求項８】
請求項３又は４に記載のいずれかのオリゴヌクレオチドが支持体に固定されたマイクロアレイ。
【請求項９】
請求項３又は４に記載のオリゴヌクレオチド及び／又は請求項８に記載のマイクロアレイを含む、骨粗鬆症罹患リスク判定キット。
【請求項１０】
請求項６に記載の遺伝子型を有する患者を治療するための、骨粗鬆症治療薬。
【請求項１１】
請求項６に記載の遺伝子型を有するヒトの骨粗鬆症を予防するための、骨粗鬆症予防剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１０−６６（Ｐ２０１０−６６Ａ）
【公開日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１６３６７９（Ｐ２００８−１６３６７９）
【出願日】平成２０年６月２３日（２００８．６．２３）
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月２３日（２００８．６．２３）
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
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