骨芽細胞分化マーカー、骨形成促進剤及び骨形成抑制剤
【課題】骨芽細胞分化マーカー、骨形成促進剤及び骨形成抑制剤を提供する。
【解決手段】ＧＰＲ９７遺伝子（Ｇタンパク質共役型受容体の一つ）の発現量を指標とする骨芽細胞分化を検出する方法、ＧＰＲ９７発現ベクターを有効成分とする骨形成促進剤、ＧＰＲ９７遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを有効成分とする骨形成抑制剤及びＧＰＲ９７遺伝子上流領域依存的な転写活性を指標とする骨形成促進剤又は骨形成抑制剤のスクリーニング方法。
【解決手段】ＧＰＲ９７遺伝子（Ｇタンパク質共役型受容体の一つ）の発現量を指標とする骨芽細胞分化を検出する方法、ＧＰＲ９７発現ベクターを有効成分とする骨形成促進剤、ＧＰＲ９７遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを有効成分とする骨形成抑制剤及びＧＰＲ９７遺伝子上流領域依存的な転写活性を指標とする骨形成促進剤又は骨形成抑制剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨芽細胞分化マーカー、骨形成促進剤及び骨形成抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨組織は、破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞による骨形成により絶えず骨代謝され、リモデリング（再構築）されている。破骨細胞は石灰化した骨の破壊・吸収を行い、骨芽細胞はコラーゲン分泌や石灰化等の骨形成に関与する。この破骨細胞と骨芽細胞の働きのバランスが崩れることにより、骨代謝異常が発生すると考えられている。骨代謝の異常による疾患としては、骨粗鬆症、大理石骨病、骨硬化症、高カルシウム血症、骨ページェット病、腎性骨異栄養症、慢性関節リウマチ、変形性関節炎等が知られている。
【０００３】
例えば、骨粗鬆症等の骨量が減少する疾患は、骨形成の促進、骨吸収の抑制、又はこれらのバランスの改善により治療できることが期待される。すなわち、骨形成は、間葉系幹細胞から骨形成を担う骨芽細胞への分化を促進すること、破骨細胞前駆細胞からの破骨細胞への分化を抑制すること等により促進されると期待される。また、大理石骨病等の骨量が増加する疾患は、骨形成の抑制、骨吸収の促進、又はこれらのバランスの改善により治療できることが期待される。すなわち、骨形成は、間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化を抑制すること、破骨細胞前駆細胞からの破骨細胞への分化を促進すること、骨芽細胞の骨形成活性等の機能を抑制すること等により促進されると期待される。このような活性を有するホルモン、低分子物質、生理活性蛋白質等についての探索及び開発研究が、現在精力的に進められている。
【０００４】
Ｇタンパク質共役型受容体（Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＧＰＣＲ）は、７回膜貫通型ドメインを持ち、特定のリガンドが細胞外ドメインと結合すると細胞内のＧタンパク質が活性化されてセカンドメッセンジャーがシグナルを伝達する。ＧＰＣＲの活性を調節する生理活性物質は薬剤として病気の治療に使用されている例も多い。したがって、細胞内シグナル伝達の上流に位置するＧＰＣＲは、治療薬のターゲットとして有望である。
【０００５】
骨代謝において重要な役割を担うＧＰＣＲとしては、副甲状腺ホルモン受容体（ＰＴＨ１Ｒ）、カルシトニン受容体（Ｃａｌｃｒ）、プロスタグラジンＥ２受容体（ＰＧＥ２受容体、ＥＰｓ）、カルシウム受容体（ＣａＳＲ）等が知られている。また、骨代謝に関与するＧＰＣＲを標的とする骨疾患の治療及び改善を図る医薬品として、エストロゲン、カルシトニン、ＰＴＨ等が用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２００５／１００９８７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．Ｄ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）ｖｏｌ．８７；ｐ．５７５９−５７６３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＧＰＲ９７は、１９９０年にマウスでｐｒｅ−Ｂ細胞特異的に発現する遺伝子として報告されたオーファンＧＰＣＲである（非特許文献１）。ＧＰＲ９７のリガンド分子が報告されている（特許文献１）。しかしながら、ＧＰＲ９７が骨代謝に関与することは未だ報告されていない。
【０００９】
骨芽細胞分化において機能的に重要な役割を担う分子としては、ＢＭＰ等のサイトカインやＲｕｎｘ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ等の転写因子が知られている。したがって、骨芽細胞分化に必須な分子やこのような分子と機能的に関連する分子は、治療薬のターゲットとして有望である。しかしながら、Ｒｕｎｘ２等の骨芽細胞分化に必須な転写因子とＧＰＣＲとの機能的な関係については、副甲状腺ホルモン受容体及びＰＧＥ２受容体がＲｕｎｘ２の上流に位置するという報告以外にはなく、未知の部分が多く残されている。
【００１０】
骨芽細胞分化において重要な役割を担う分子とＧＰＣＲとの機能的な関係を明らかにすることは、骨芽細胞分化の分子メカニズムの解明につながり、さらには、骨芽細胞分化と密接に関連した疾患のための医薬品開発に重要な手段を提供することにつながる。したがって、本発明は、骨芽細胞分化に必須の転写因子であるＲｕｎｘ２によって遺伝子発現が制御されるＧＰＣＲについて新たな知見を得て、この知見に基づいて骨芽細胞分化マーカー、骨形成促進剤及び骨形成抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、鋭意研究した結果、ＧＰＲ９７遺伝子の発現が骨芽細胞分化に必須の転写因子であるＲｕｎｘ２によって調節されていることを見出した。さらに、本発明者らは、ＧＰＲ９７遺伝子が骨芽細胞分化に関与することを見出した。かかる知見に基づき、本発明者らは本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、ＧＰＲ９７遺伝子の発現量を指標とする、骨芽細胞分化を検出する方法を提供する。本発明によれば、ＧＰＲ９７遺伝子の発現量の増加を指標として、骨芽細胞分化のステージ進行を検出することができる。すなわち、ＧＰＲ９７遺伝子を骨芽細胞分化のマーカーとして使用することができる。
【００１３】
本発明は、ＧＰＲ９７発現ベクターを有効成分とする、骨形成促進剤を提供する。上記ＧＰＲ９７発現ベクターは、配列番号１又は３に記載の塩基配列を含有することが好ましく、また、上記ＧＰＲ９７発現ベクターは、配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有することが好ましい。
【００１４】
本発明者らの研究により、骨芽細胞分化にはＧＰＲ９７遺伝子の発現亢進が関与しており、ＧＰＲ９７遺伝子の発現を阻害することにより骨芽細胞分化が抑制されることが明らかとなった。したがって、ＧＰＲ９７発現ベクターを有効成分とする薬剤により、骨芽細胞分化の促進効果、及び、骨形成促進効果が期待できる。
【００１５】
また、本発明は、ＧＰＲ９７遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを有効成分とする、骨形成抑制剤を提供する。本発明の骨形成抑制剤は、ＧＰＲ９７遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡが、下記（ａ）又は（ｂ）のオリゴヌクレオチド対からなる二本鎖ｓｉＲＮＡであることが好ましい。
（ａ）配列番号１０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、及び、配列番号１１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、及び、配列番号１３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド。
【００１６】
本発明によれば、ＧＰＲ９７遺伝子を機能阻害することにより、骨形成を担う骨芽細胞の分化を抑制することができる。したがって、骨形成を抑制することができる。
【００１７】
本発明は、ＧＰＲ９７遺伝子の上流領域依存的な転写活性を指標とする、骨形成促進剤又は骨形成抑制剤のスクリーニング方法を提供する。また、本発明の骨形成促進剤又は骨形成抑制剤のスクリーニング方法は、（ｉ）ＧＰＲ９７遺伝子の上流領域と、当該領域の３’末端側に接続したレポーター遺伝子と、を含むレポーターコンストラクトを間葉系幹細胞に遺伝子導入する工程と、（ｉｉ）上記間葉系幹細胞に骨芽細胞分化誘導刺激を与える工程と、（ｉｉｉ）上記間葉系幹細胞に試験化合物を投与する工程と、（ｉｖ）上記試験化合物の存在下及び非存在下におけるレポーター活性を検出する工程であって、上記レポーター活性が、ＧＰＲ９７遺伝子の上流領域依存的な転写活性を示す工程と、（ｖ）上記試験化合物の存在下におけるレポーター活性が上記試験化合物の非存在下におけるレポーター活性と比べて亢進された場合に、当該試験化合物が骨形成促進剤であると判定する工程と、（ｖｉ）上記試験化合物の存在下におけるレポーター活性が上記試験化合物の非存在下におけるレポーター活性と比べて低減された場合に、当該試験化合物が骨形成抑制剤であると決定する工程と、を備えることを特徴とする。上記ＧＰＲ９７遺伝子の上流領域が、配列番号５に記載された塩基配列を含むことが好ましい。
【００１８】
本発明は、ＧＰＲ９７遺伝子を機能阻害することにより、骨形成を担う骨芽細胞の分化が抑制されるという、本発明者らの新たな知見に基づくものである。また、ＧＰＲ９７遺伝子の上流領域を介し、骨芽細胞分化に必須の転写因子Ｒｕｎｘ２によってＧＰＲ９７遺伝子の発現が調節されているという本発明者らが新たに見出した知見に基づき、ＧＰＲ９７遺伝子の上流領域依存的な転写活性をスクリーニングの指標とすることを可能としたものである。本発明のスクリーニング方法により、ＧＰＲ９７遺伝子の発現を促進的又は抑制的に制御する試験化合物を検索することにより、骨芽細胞分化を促進又は抑制する化合物、すなわち、骨形成を促進又は抑制する化合物を同定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＧＰＲ９７ ｍＲＮＡの骨芽細胞分化における発現パターンを表すグラフ。（Ａ）Ｏｓｔｅｒｉｘ ｍＲＮＡの発現量、及び、（Ｂ）ＧＰＲ９７ ｍＲＮＡの発現量。
【図２】ルシフェラーゼアッセイによるＧＰＲ９７プロモーター活性測定の結果を示すグラフ。レポーターベクターとして、（Ａ）ｐＧＬ４．１０（ネガティブコントロール）、（Ｂ）ＧＰＲ９７ｐｒｏ＿−５．７ｋベクター、（Ｃ）ＧＰＲ９７ｐｒｏ＿−４．３ｋベクター、及び、（Ｄ）Ｆ２−Ｌｕｃ（ポジティブコントロール）を用い、Ｒｕｎｘ２の存在下又は非存在下におけるプロモーター活性を測定した。
【図３】ｓｉＲＮＡを介したＧＰＲ９７の機能阻害が骨芽細胞分化に与える影響を示すグラフ。（Ａ）アルカリフォスファターゼ活性、（Ｂ）Ｏｓｔｅｒｉｘ ｍＲＮＡの発現量、及び、（Ｃ）ＧＰＲ９７ ｍＲＮＡの発現量。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００２１】
本発明で使用されるＧＰＲ９７遺伝子（ｃＤＮＡ）は、配列番号１又は３で表わされる塩基配列と同一又は実質的に同一の塩基配列を含有する遺伝子である。本発明のＧＰＲ９７遺伝子の具体例としては、配列番号１で表わされるマウス由来ＧＰＲ９７遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿１７３０３６）、又は、配列番号３で表わされるヒト由来ＧＰＲ９７遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿１７０７７６）である。配列番号１又は３で表わされる塩基配列と実質的に同一の塩基配列としては、例えば、配列番号１又は３で表わされる塩基配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列等が挙げられる。
【００２２】
本発明で使用されるＧＰＲ９７タンパク質は、配列番号２又は４で表わされるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプタータンパク質である。本発明のＧＰＲ９７タンパク質の具体例としては、配列番号２で表わされるマウス由来ＧＰＲ９７タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿７６６６２４）、又は、配列番号４で表わされるヒト由来ＧＰＲ９７タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿７４０７４６）である。配列番号２又は４で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号２又は４で表わされるアミノ酸配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列等が挙げられる。
【００２３】
（骨芽細胞分化マーカー）
本実施形態に係る骨芽細胞分化を検出する方法は、ＧＰＲ９７遺伝子の発現量を指標とする。ＧＰＲ９７遺伝子を骨芽細胞分化マーカーとして用いるものであり、ＧＰＲ９７遺伝子の発現量の増加が、骨芽細胞分化のステージ進行と相関するという本発明の知見に基づき、骨芽細胞分化を検出する。ＧＰＲ９７遺伝子の発現量が対象と比べて有意に増加した場合に、骨芽細胞分化が誘導されていると判定することができる。
【００２４】
ここで、遺伝子の発現量とは、遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの発現量及び／又はその翻訳産物であるタンパク質の発現量を指す。ｍＲＮＡの発現量の測定は、当業者にとって公知の測定系を用いて行えばよく、具体的には、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法、定量的ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ法、定量的ノザンブロッティング法、定量的リボヌクレアーゼプロテクション法などが挙げられる。タンパク質の発現量の測定は、当業者にとって公知の測定系を用いて行えばよく、例えば、定量的ウエスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法などが挙げられる。コントロールとして、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨや、ベータアクチンなどのｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現量を用い、ＧＰＲ９７遺伝子等の目的の遺伝子の発現量を標準化することができる。
【００２５】
ＧＰＲ９７ ｍＲＮＡの発現量の測定に用いるプライマー及びプローブは、ＧＰＲ９７遺伝子を特異的に増幅できるものを用いることができ、当業者にとって周知の方法により設計することができる。ＧＰＲ９７ ｍＲＮＡの発現量の測定に用いるプライマーとしては、配列番号６及び７で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット等が例示できるが、これらに限定されない。また、ＧＰＲ９７タンパク質の検出に用いる抗体、抗体断片等は当業者にとって周知の方法により調製することができる。利用可能な抗ＧＰＲ９７抗体としては、市販の抗体（ＧＰＲ９７（Ｅ−１４）、ｓｃ−１０７５８３；ＧＰＲ９７（Ｎ−１４）、ｓｃ−１０７５８６、ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）等が好適に使用できるが、これらに限定されない。
【００２６】
（骨形成促進剤）
本実施形態に係る骨形成促進剤は、ＧＰＲ９７発現ベクターを有効成分とする。ＧＰＲ９７発現ベクターは、配列番号１又は３に記載の塩基配列又は実質的に同一の塩基配列を含有する核酸を有することが好ましく、また、ＧＰＲ９７発現ベクターは、配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列又は実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する核酸を有することが好ましい。
【００２７】
発現ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスをもとに作製できる。ＭｏＭＬＶベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、ＨＩＶベクター、ＳＩＶベクター、センダイウイルスベクター等のいかなるウイルスベクターであっても良い。また、ウイルスベクターの構成タンパク質群のうち１つ以上を、異種ウイルスの構成タンパク質に置換する、もしくは、遺伝子情報を構成する塩基配列のうち一部を異種ウイルスの塩基配列に置換する、シュードタイプ型のウイルスベクターも本発明に使用できる。例えば、ＨＩＶの外皮タンパク質であるＥｎｖタンパク質を、小水痘性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ：ＶＳＶ）の外皮タンパク質であるＶＳＶ−Ｇタンパク質に置換したシュードタイプウイルスベクターが挙げられる。さらに、治療効果を持つウイルスであれば、ヒト以外の宿主域を持つウイルスもウイルスベクターとして使用可能である。ウイルス以外のベクターとしてはリン酸カルシウムと核酸の複合体、リポソーム、カチオン脂質複合体、センダイウイルスリポソーム、ポリカチオンを主鎖とする高分子キャリアー等が使用可能である。
【００２８】
さらに、ベクター中の遺伝子の発現のために用いられる発現カセットは、標的細胞内で遺伝子を発現させることができるものであれば、特に制限されることなく用いることができる。当業者はそのような発現カセットを容易に選択することができる。好ましくは、動物由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットであり、より好ましくは、哺乳類由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットであり、特に好ましくは、ヒト由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットである。発現カセットに用いられる遺伝子プロモーターは、例えばアデノウイルス、サイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、シミアンウイルス４０、ラウス肉腫ウイルス、単純ヘルペスウイルス、マウス白血病ウイルス、シンビスウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、ＪＣウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオウイルス等のウイルス由来のプロモーター、アルブミン、ＳＲα、熱ショック蛋白、エロンゲーション因子等の哺乳類由来のプロモーター、ＣＡＧプロモーター等のキメラ型プロモーター、テトラサイクリン、ステロイド等によって発現が誘導されるプロモーターを含む。
【００２９】
好適な対象としては、ヒト及び非ヒト哺乳類が挙げられ、骨形成不全の対象又はその恐れのある対象の骨形成促進を意図した予防・治療に用いられる。検体（標的細胞）は、骨芽細胞への分化能を有する間葉系幹細胞であることが好ましい。
【００３０】
（骨形成抑制剤）
本実施形態に係る骨形成抑制剤は、ＧＰＲ９７遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを有効成分とする。骨形成抑制剤は、ＧＰＲ９７遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡが、下記（ａ）又は（ｂ）のオリゴヌクレオチド対からなる二本鎖ｓｉＲＮＡであることが好ましい。
（ａ）配列番号１０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、及び、配列番号１１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、及び、配列番号１３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド。
【００３１】
好適な対象としては、ヒト及び非ヒト哺乳類が挙げられ、骨形成不全の対象又はその恐れのある対象の骨形成抑制を意図した予防・治療に用いられる。検体（標的細胞）は、骨芽細胞への分化能を有する間葉系幹細胞であることが好ましい。
【００３２】
ここで、ｓｉＲＮＡとは、ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡの略称であり、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたものか、あるいは生物体内で合成されたものか、あるいは約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の二本鎖ＲＮＡを指す。ｓｉＲＮＡの長さは、一般的には１０〜３０塩基、好ましくは約１５〜２５塩基、より好ましくは１９〜２３塩基程度である。ｓｉＲＮＡとして、５'−リン酸、３'−ＯＨの構造を有しており、３'末端は約２塩基突出しているオリゴヌクレオチド対を用いることができる。
【００３３】
ｓｉＲＮＡを細胞に投与すると、ＲＮＡｉ効果によりＧＰＲ９７の発現を特異的に抑制することができる。すなわち、ｓｉＲＮＡが細胞に導入されると、このｓｉＲＮＡに特異的なタンパク質が結合して、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ−ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成される。この複合体は、ｓｉＲＮＡと同じ配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によってｓｉＲＮＡの中央部でｍＲＮＡを切断する。上記のように、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと相同な配列を有するｍＲＮＡを分解することにより、その標的となる遺伝子（本発明においては、ＧＰＲ９７遺伝子）の発現を抑制することができる。このような現象をＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）という。ＲＮＡｉ現象は、線虫、昆虫、原虫、ヒドラ、植物、脊椎動物（哺乳動物を含む）において見られる現象である。
【００３４】
また、別の実施形態においては、上記以外のＧＰＲ９７に特異的なｓｉＲＮＡを用いてもよい。さらに、上記ｓｉＲＮＡを生成するようなｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）、ｄｓＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ）又はそれらを発現できる発現ベクターを用いることができる。ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡまたはそれらの発現ベクターを細胞に投与すると、細胞内でｓｉＲＮＡが生成する。ＲＮＡ発現ベクターのプロモーターには、Ｕ６ＲＮＡまたはＨ１ＲＮＡの転写系であるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＰｏｌＩＩＩ）のプロモーターを用いることができる。
【００３５】
さらに、別の実施形態においては、上記ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、又は、修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）であってもよい。修飾された核酸の具体例としては、核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、さらにはポリヌクレオチドアミドやオリゴヌクレオチドアミドの分解に抵抗性を有するもの等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００３６】
本発明の骨形成促進剤及び骨形成抑制剤の製剤化にあたっては、常法に従い、必要に応じて薬学的に許容される担体を添加することができる。例えば、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
【００３７】
本発明の骨形成促進剤及び骨形成抑制剤の剤型の種類としては、例えば、経口剤として錠剤、粉末剤、丸剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、軟・硬カプセル剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、舌下剤、ペースト剤等、非経口剤として注射剤、坐剤、経皮剤、軟膏剤、硬膏剤、外用液剤等が挙げられ、当業者においては投与経路や投与対象等に応じた最適の剤型を選ぶことができる。有効成分としての上記骨形成促進剤及び骨形成抑制剤は、製剤中０．１から９９．９重量％含有することができる。
【００３８】
本発明の骨形成促進剤及び骨形成抑制剤の有効成分の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、患者（６０ｋｇとして）に対して一日につき約０．１ｍｇ〜１，０００ｍｇ、好ましくは約１．０〜１００ｍｇ、より好ましくは約１．０〜５０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その一回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、患者（６０ｋｇに対して）、一日につき約０．０１から３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１から２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。しかしながら、最終的には、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、医師の判断により適宜決定することができる。
【００３９】
（骨形成促進剤又は骨形成抑制剤のスクリーニング方法）
本実施形態に係る骨形成促進剤又は骨形成抑制剤のスクリーニング方法は、ＧＰＲ９７遺伝子の上流領域依存的な転写活性を指標とする。また、本実施形態に係る骨形成抑制剤のスクリーニング方法は、遺伝子導入工程（ｉ）、骨芽細胞分化誘導工程（ｉｉ）、試験化合物投与工程（ｉｉｉ）、レポーター活性検出工程（ｉｖ）、判定工程（ｖ）及び（ｖｉ）を備えることを特徴とする。以下に、各工程について説明する。
【００４０】
本実施形態に係るスクリーニング方法の遺伝子導入工程（ｉ）は、レポーターコンストラクトを間葉系幹細胞に遺伝子導入する工程である。レポーターコンストラクトは、ＧＰＲ９７遺伝子の上流領域（プロモーター）と、当該上流領域の３’末端側に接続したレポーター遺伝子と、を含む。すなわち、レポーター遺伝子がＧＰＲ９７遺伝子の上流領域（プロモーター）の制御下で発現し得るレポーターコンストラクトを用いることができる。ＧＰＲ９７遺伝子の上流領域は、ＧＰＲ９７遺伝子の上流領域−４．３ｋｂｐ〜−５．７ｋｂｐ（配列番号５に記載された塩基配列）を含むことが好ましく、例えば、ＧＰＲ９７遺伝子の転写開始点〜−５．７ｋｂｐの領域（配列番号８に記載された塩基配列）を用いることができる。また、ＧＰＲ９７遺伝子の上流領域−４．３ｋｂｐ〜−５．７ｋｂｐを欠いた、ＧＰＲ９７遺伝子の転写開始点〜−４．３ｋｂｐの領域（配列番号９に記載された塩基配列）を、コントロールとして用いることができる。
【００４１】
レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、β−ガラクトシダーゼ等の公知のレポータータンパク質をコードする遺伝子を用いることができる。遺伝子導入の方法としては、公知の方法、例えば、リポフェクション、エレクトロポレーション、超音波による導入、アデノウイルス等を用いることができる。
【００４２】
間葉系幹細胞とは、骨芽細胞への分化能を有する細胞である。間葉系幹細胞の入手方法は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、個体の骨髄等から単離することにより得ることもできるし、又は、既にクローン化された間葉系幹細胞として各種機関から入手することもできる。このような既にクローン化された間葉系幹細胞としては、例えば、マウスの細胞として、マウスＳＴ２細胞、マウスＮＲＧ細胞等が挙げられる（それぞれ独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター（ＢＲＣ）から入手可能である）。
【００４３】
骨芽細胞分化誘導工程（ｉｉ）は、工程（ｉ）において遺伝子導入した間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化を誘導する工程であり、具体的には、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４等の骨芽細胞分化の誘導活性を有するサイトカインを培地中に投与する、又は、これらのサイトカインを含む培地により培地交換することにより間葉系幹細胞の骨芽細胞分化を誘導することができる。骨芽細胞分化誘導に要する期間は、用いる細胞や誘導の強度により変化し得るが、公知の骨芽細胞分化マーカー（Ｏｓｔｅｒｉｘ、ＲＵＮＸ２、アルカリフォスファターゼ活性、オステオポンチン、オステオカルシン等）、又は、本発明のＧＰＲ９７遺伝子の発現量を指標とした骨芽細胞分化の検出方法を用いることにより、適宜、骨芽細胞分化のステージや試験化合物の投与タイミングを決定することができる。
【００４４】
試験化合物投与工程（ｉｉｉ）は、工程（ｉｉ）において骨芽細胞分化を誘導した間葉系幹細胞に試験化合物を投与する工程である。試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿等が用いられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、生理学的に許容される金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩等が挙げられる。試験化合物の投与量、投与タイミング、投与期間等については、適宜、設定することができる。試験化合物の投与タイミングとしては、骨芽細胞分化誘導と同時、骨芽細胞分化誘導処理終了後、骨芽細胞分化誘導から数時間後〜数日後（１〜７日程度）であってもよい。また、次のレポーター活性検出工程（ｉｖ）の数時間前〜数日前（１〜３日程度）に試験化合物を投与することが好ましい。
【００４５】
レポーター活性検出工程（ｉｖ）は、試験化合物の存在下及び非存在下におけるレポーター活性を検出する工程である。レポーター活性は、ＧＰＲ９７遺伝子の上流領域依存的な転写活性を示す。レポーター活性検出のタイミングとしては、ＧＰＲ９７遺伝子の発現が亢進している期間（試験化合物の非存在下）、例えば、骨芽細胞分化誘導から数１日後〜８日後とすることができる。
【００４６】
判定工程（ｖ）及び（ｖｉ）は、試験化合物の存在下及び非存在下におけるレポーター活性の変化に基づいて、試験化合物を評価する工程であり、（ｖ）試験化合物の存在下におけるレポーター活性が前記試験化合物の非存在下におけるレポーター活性と比べて亢進された場合に、当該試験化合物が骨形成促進剤であると判定する工程と、（ｖｉ）上記試験化合物の存在下におけるレポーター活性が上記試験化合物の非存在下におけるレポーター活性と比べて低減された場合に、当該試験化合物が骨形成抑制剤であると決定する工程である。
【００４７】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物は、本発明のＧＰＲ９７の発現量を変化させる作用を有する化合物であり、具体的には、ＧＰＲ９７遺伝子の発現を抑制的に制御する化合物は、骨芽細胞分化を抑制する化合物及び／又は骨形成を抑制する化合物である。ＧＰＲ９７遺伝子の発現を促進的に制御する化合物は、骨芽細胞分化を促進する化合物及び／又は骨形成を促進する化合物である。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４９】
（実施例１：ＧＰＲ９７遺伝子上流配列におけるＲｕｎｘ２結合部位の同定）
マウス骨髄由来の間葉系幹細胞であるＳＴ２細胞を用いて、クロマチン免疫沈降法（ＣｈＩＰ）とＤＮＡ ｃｈｉｐを組み合わせたＣｈＩＰ ｏｎ ｃｈｉｐ解析により、骨芽細胞分化に必須の転写因子Ｒｕｎｘ２が結合する遺伝子領域を検索した。具体的には、以下の方法を用いた。
【００５０】
ＢＭＰ４処理による骨芽細胞分化誘導を開始してから６日目のＳＴ２細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、ＣＥＬＬ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ ＮａＣｌ，０．５％ ＮＰ−４０）を加え、セルスクレイパーで細胞を回収した。オートピペッターで細胞をピッペティングした後、終濃度１％となるように３７％ ＨＣＨＯを加え、室温１０分間攪拌した。ＰＢＳで３回洗浄後、ＳＤＳ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，１％ ＳＤＳ，ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：５０×ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｒｏｃｈｅ＃１８７３５８０））を加え、超音波でクロマチンを破壊した。遠心後、上清を回収し、ＣｈＩＰ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（０．０１％ ＳＤＳ，１．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１．２ｍＭ ＥＤＴＡ，１６．７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．１，１６７ｍＭ ＮａＣｌ）で１０倍希釈した。
【００５１】
得られたサンプルにｐｒｏｔｅｉｎＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ（５０％ ｓｌｕｒｒｙ）を加え、３０分、４℃、プレインキュベーションした後、抗Ｒｕｎｘ２抗体（Ａｎｔｉ−Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１，製品番号：Ｄ１３０−３，Ｍｅｄｉｃａｌ＆Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を結合させたｐｒｏｔｅｉｎＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ（５０％ ｓｌｕｒｒｙ）を加え、４℃で一晩インキュベーションした。ビーズをＩＰ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒで１回、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ１（０．１％ ＳＤＳ，１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，２ｍＭ ＥＤＴＡ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．１，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で２回、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ２（０．１％ＳＤＳ，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，２ｍＭ ＥＤＴＡ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．１，５００ｍＭ ＮａＣｌ）で２回、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ３（０．２５Ｍ ＬｉＣｌ，１％ ＩＧＥＰＡＬ−ＣＡ６３０，１％ デオキシコール酸ナトリウム塩，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．１)で１回、ＴＥ ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄した。その後、ビーズをＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（１％ ＳＤＳ，０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３，プロテアーゼ）に懸濁して、４２℃、２時間のインキュベーション後、更に６５℃で一晩インキュベーションした。サンプルを遠心後、上清のみ回収し、ＱＩＡ ｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＩＡＧＥＮ）を用いてＲｕｎｘ２と共に免疫沈降したＤＮＡを精製した。
【００５２】
精製ＤＮＡの濃縮率を定量ＲＴ−ＰＣＲ（ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ）で確認した。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ法によりＤＮＡを増幅し、ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＭｏｕｓｅ Ｔｉｌｉｎｇ ２．０Ｒ Ａｒｒａｙ（品番：９００８５２）へのハイブリダイゼーションに用いた。
【００５３】
（結果）
上記のＣｈＩＰ ｏｎ ｃｈｉｐ解析により、骨芽細胞方向への分化誘導を開始してから６日目のＳＴ２細胞において、ＧＰＲ９７遺伝子の上流−４．３ｋｂｐ〜−５．７ｋｂｐの領域（配列番号５）にＲｕｎｘ２が結合することが判明した。
【００５４】
（実施例２：ＧＰＲ９７ ｍＲＮＡの骨芽細胞分化における発現解析）
次に、マウスＧＰＲ９７ ｍＲＮＡの骨芽細胞分化における発現レベルを以下の方法により調べた。ｍＲＮＡの発現量の定量にはＭｘ３０００Ｐ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いた。発現量定量用のプライマーセットとして、ｍＧＰＲ９７＿ｅｘｏｎ８＿Ｓ：５’−ａｃａｇａｃｔｃｔｃａｃｔｃｇｃａｔｃｔ−３’（配列番号６）、及び、ｍＧＰＲ９７＿ｅｘｏｎ９＿ＡＳ：５’−ｇａｇｃｃａｔｇｔｇｇａｔｃｔｔａｇｇ−３’（配列番号７）を使用した。これらのプライマーの配列はマウスＧＰＲ９７ ｃＤＮＡ配列（配列番号１）をもとに設計した。
【００５５】
鋳型ｃＤＮＡとして、ＳＴ２細胞をＢＭＰ４処理有りで８日間培養し、０、１、２、４、６、８日目にＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて抽出したＲＮＡから合成したものを用いた。なお、コントロールとしてＢＭＰ４処理無しで培養したＳＴ２細胞を用いた。定量ＰＣＲの試薬はＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用した。ＰＣＲ反応液は以下の組成のものを用いた。反応条件は９５℃で１０分の後、９５℃、３０秒、５５℃、１分、７２℃、３０秒のサイクルを４０回繰り返して行った。
【００５６】
＜ＰＣＲ反応液＞
Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ
１２．５μｌ
滅菌水 ５μｌ
１μＭ ｅａｃｈ Ｐｒｉｍｅｒｓ ２．５μｌ
ｃＤＮＡ ５μｌ
ｔｏｔａｌ ２５μｌ
【００５７】
（結果）
結果を図１に示す。図１は、ＧＰＲ９７ ｍＲＮＡの骨芽細胞分化における発現パターンを表すグラフである。ＧＰＲ９７ ｍＲＮＡの発現量は、ＳＴ２細胞の骨芽細胞分化に伴い増加することが明らかとなった。したがって、骨芽細胞分化マーカーとしてＧＰＲ９７遺伝子を使用できることが分かった。
【００５８】
（実施例３：Ｒｕｎｘ２によるＧＰＲ９７遺伝子上流を介した転写解析）
骨芽細胞分化に必須の転写因子Ｒｕｎｘ２が、ＧＰＲ９７の転写を活性化し得るか否かを調べるために、ＧＰＲ９７遺伝子上流配列を用いたプロモーター解析をｐｒｏｍｅｇａのＤｕａｌ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔを使用して、以下の手法により行った。
【００５９】
ルシフェラーゼレポーターベクターには、以下の４種類を用いて転写アッセイを行った。マウスＧＰＲ９７遺伝子上流−５．７ｋｂｐ（配列番号８）、又は−４．３ｋｂｐ（配列番号９）をｐＧＬ４．１０（ｐｒｏｍｅｇａ社）にクローニングしたルシフェラーゼレポーターベクターを構築し、それぞれＧＰＲ９７ｐｒｏ＿−５．７ｋベクター及びＧＰＲ９７ｐｒｏ＿−４．３ｋベクターと命名した。ネガティブコントロールとしてｐＧＬ４．１０ベクター、ポジティブコントロールとして、Ｒｕｎｘ２により転写活性化されることが知られているＢｏｎｅ ｇａｍｍａ−ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）遺伝子の上流領域４３６ｂｐ（配列番号１４）をｐＧＬ４．１０にクローニングしたベクター（Ｆ２−Ｌｕｃ）を用いた。また、内部標準としてウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクターｐＧＬ４．７４を使用した。発現ベクターとしては、ヒトＲｕｎｘ２蛋白質発現ベクター、ヒトＰＰＡＲγ１発現ベクター、及び、ネガティブコントロールとして空の発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。
【００６０】
ＣＶ１細胞への遺伝子導入
遺伝子導入の前日にアフリカミドリザル腎臓由来のＣＶ１細胞を７×１０４細胞／ｗｅｌｌずつ播種した。培地はＤＭＥＭ（ナカライ）に１０％ＦＢＳと１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したものを用いた。種々の組み合わせのルシフェラーゼレポーターベクターと発現ベクターをＣＶ１細胞に導入した。各プラスミドを１００ｎｇ／μｌに希釈し、各発現ベクターを０．４μｇと各レポーターベクターを０．４μｇ、更にｐＧＬ４．７４を０．０４μｇの割合で５０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）に添加した。この溶液に、５０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭに２μｌのｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ｐｒｏｍｅｇａ社）を添加したものを等量混合して、室温で２０分間インキュベートした後に、１０６μｌ／ｗｅｌｌずつＣＶ１細胞の培養液に添加し、遺伝子導入を行った。３７℃、５％ＣＯ２下で２晩培養した。
【００６１】
ルシフェラーゼアッセイ
２晩培養した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１×ＰＢを１００μｌ加え、室温で２０分間インキュベートした。細胞溶解液２０μｌを９６穴プレートへ移し、プレートリーダー（ＡＲＶＯ）でルシフェラーゼ活性を測定した。
【００６２】
（結果）
結果を図２に示す。図２は、ルシフェラーゼアッセイによるＧＰＲ９７プロモーター活性測定の結果を示すグラフである。実施例１にて示されたＲｕｎｘ２の結合領域（ＧＰＲ９７遺伝子の上流−４．３ｋｂｐ〜−５．７ｋｂｐの領域：配列番号５）を含むＧＰＲ９７上流−５．７ｋｂｐを介して、Ｒｕｎｘ２による転写活性化が観察された。一方、Ｒｕｎｘ２の結合領域を欠失させたＧＰＲ９７遺伝子上流−４．３ｋｂｐを用いた場合には、Ｒｕｎｘ２による転写活性化は観察されなかった。したがって、ＧＰＲ９７遺伝子の上流−４．３ｋｂｐ〜−５．７ｋｂｐのＲｕｎｘ２結合領域依存的に、Ｒｕｎｘ２による転写調節を受けていることが分かった。また、Ｒｕｎｘ２が活性化される骨芽細胞分化段階において、ＧＰＲ９７の発現が上昇するという実施例２の知見を考え併せると、ＧＰＲ９７が骨芽細胞分化においてＲｕｎｘ２による遺伝子発現制御を受けていることが強く示唆された。
【００６３】
（実施例４：ＧＰＲ９７特異的なｓｉＲＮＡを用いた機能阻害実験）
ＧＰＲ９７特異的なｓｉＲＮＡを用いてＧＰＲ９７の機能阻害が骨芽細胞分化に与える影響を以下の手法により評価した。ＧＰＲ９７に特異的な２種類のＳｔｅａｌｔｈ ｓｅｌｅｃｔ ＲＮＡｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を購入した。ｓｉＲＮＡの配列は以下の通りである。
ＧＰＲ９７＃５２：５’−ｇｇｇｃｃｕｇｃｃｕｇｕｕｃｕｕｇｕａｇｕｕａｕｕ−３’（センス鎖、配列番号１０）及び５’−ａａｕａａｃｕａｃａａｇａａｃａｇｇｃａｇｇｃｃｃ−３’（アンチセンス鎖、配列番号１１）
ＧＰＲ９７＃５４：５’−ｇｇｕｕｃｃａｇａａａｇａｇｃｃｕｇｃｕｃｕｕｕａ−３’（センス鎖、配列番号１２）及び５’−ｕａａａｇａｇｃａｇｇｃｕｃｕｕｕｃｕｇｇａａｃｃ−３’（アンチセンス鎖、配列番号１３）
なお、ネガティブコントロールとしてＮｅｇａｔｉｖｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｔｅａｌｔｈ ＲＮＡｉ Ｍｅｄ＃２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。
【００６４】
ＳＴ２細胞へのｓｉＲＮＡ導入
マウス骨髄由来のＳＴ２細胞にＧＰＲ９７特異的なｓｉＲＮＡ（ＧＰＲ９７＃５２又はＧＰＲ９７＃５４）を導入した。遺伝子導入直前にＳＴ２細胞を１×トリプシン処理し、２〜３×１０５細胞／ｍｌに調製した。５μＭに希釈したｓｉＲＮＡ ４．８μｌをＯＰＴＩ−ＭＥＭに添加した。次に、この溶液をｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ ４μｌを等量のＯＰＴＩ−ＭＥＭに添加した溶液と混合し、室温で２０分置いた後、新しい２４穴プレートに添加し、その上から２〜３×１０５細胞／ｍｌのＳＴ２細胞を１ｍｌ添加した。６時間後、細胞の培地を１００ｎｇ／μｌのＢＭＰ４を添加したＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳに交換し、４日間培養した（骨芽細胞分化誘導）。４日後、ＳＴ２細胞からＲＮｅａｓｙを用いてＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成してＧＰＲ９７及びＯｓｔｅｒｉｘのｑＲＴ−ＰＣＲを行った。また、同時に骨形成の指標であるアルカリフォスファターゼ活性の測定も行った。
【００６５】
アルカリフォスファターゼ活性測定
ＳＴ２細胞を１０％中性緩衝ホルマリンで、室温、２０分間固定し、更に、アセトン：エタノール（１：１）混合液（−２０℃）を加え室温１分間固定した。その後、ＰＢＳで５回洗浄後、Ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＩＧＭＡ社）を添加し、遮光して室温で２分間インキュベートした。反応液を１．５ｍｌチューブに移し、反応を停止させるために０．３Ｎ ＮａＯＨを加え、４０５ｎｍの吸光度を測定した。
【００６６】
（結果）
結果を図３に示す。図３は、ｓｉＲＮＡを介したＧＰＲ９７の機能阻害が骨芽細胞分化に与える影響を示すグラフである。ＳＴ２細胞にＧＰＲ９７＃５２又はＧＰＲ９７＃５４を導入し、ＧＰＲ９７遺伝子の発現を抑制した結果、骨芽細胞分化マーカー遺伝子であるＯｓｔｅｒｉｘの発現量が減少した。したがって、ｓｉＲＮＡを介したＧＰＲ９７の機能阻害により、骨芽細胞方向への分化が抑制されることが明らかとなった。このことは、ＧＰＲ９７が骨芽細胞分化に対して促進的に作用することを示唆している。またこの結果は、実施例２において得られた骨芽細胞分化マーカーとしてＧＰＲ９７遺伝子を使用できるという知見を支持するものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨芽細胞分化マーカー、骨形成促進剤及び骨形成抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨組織は、破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞による骨形成により絶えず骨代謝され、リモデリング（再構築）されている。破骨細胞は石灰化した骨の破壊・吸収を行い、骨芽細胞はコラーゲン分泌や石灰化等の骨形成に関与する。この破骨細胞と骨芽細胞の働きのバランスが崩れることにより、骨代謝異常が発生すると考えられている。骨代謝の異常による疾患としては、骨粗鬆症、大理石骨病、骨硬化症、高カルシウム血症、骨ページェット病、腎性骨異栄養症、慢性関節リウマチ、変形性関節炎等が知られている。
【０００３】
例えば、骨粗鬆症等の骨量が減少する疾患は、骨形成の促進、骨吸収の抑制、又はこれらのバランスの改善により治療できることが期待される。すなわち、骨形成は、間葉系幹細胞から骨形成を担う骨芽細胞への分化を促進すること、破骨細胞前駆細胞からの破骨細胞への分化を抑制すること等により促進されると期待される。また、大理石骨病等の骨量が増加する疾患は、骨形成の抑制、骨吸収の促進、又はこれらのバランスの改善により治療できることが期待される。すなわち、骨形成は、間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化を抑制すること、破骨細胞前駆細胞からの破骨細胞への分化を促進すること、骨芽細胞の骨形成活性等の機能を抑制すること等により促進されると期待される。このような活性を有するホルモン、低分子物質、生理活性蛋白質等についての探索及び開発研究が、現在精力的に進められている。
【０００４】
Ｇタンパク質共役型受容体（Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＧＰＣＲ）は、７回膜貫通型ドメインを持ち、特定のリガンドが細胞外ドメインと結合すると細胞内のＧタンパク質が活性化されてセカンドメッセンジャーがシグナルを伝達する。ＧＰＣＲの活性を調節する生理活性物質は薬剤として病気の治療に使用されている例も多い。したがって、細胞内シグナル伝達の上流に位置するＧＰＣＲは、治療薬のターゲットとして有望である。
【０００５】
骨代謝において重要な役割を担うＧＰＣＲとしては、副甲状腺ホルモン受容体（ＰＴＨ１Ｒ）、カルシトニン受容体（Ｃａｌｃｒ）、プロスタグラジンＥ２受容体（ＰＧＥ２受容体、ＥＰｓ）、カルシウム受容体（ＣａＳＲ）等が知られている。また、骨代謝に関与するＧＰＣＲを標的とする骨疾患の治療及び改善を図る医薬品として、エストロゲン、カルシトニン、ＰＴＨ等が用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２００５／１００９８７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．Ｄ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）ｖｏｌ．８７；ｐ．５７５９−５７６３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＧＰＲ９７は、１９９０年にマウスでｐｒｅ−Ｂ細胞特異的に発現する遺伝子として報告されたオーファンＧＰＣＲである（非特許文献１）。ＧＰＲ９７のリガンド分子が報告されている（特許文献１）。しかしながら、ＧＰＲ９７が骨代謝に関与することは未だ報告されていない。
【０００９】
骨芽細胞分化において機能的に重要な役割を担う分子としては、ＢＭＰ等のサイトカインやＲｕｎｘ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ等の転写因子が知られている。したがって、骨芽細胞分化に必須な分子やこのような分子と機能的に関連する分子は、治療薬のターゲットとして有望である。しかしながら、Ｒｕｎｘ２等の骨芽細胞分化に必須な転写因子とＧＰＣＲとの機能的な関係については、副甲状腺ホルモン受容体及びＰＧＥ２受容体がＲｕｎｘ２の上流に位置するという報告以外にはなく、未知の部分が多く残されている。
【００１０】
骨芽細胞分化において重要な役割を担う分子とＧＰＣＲとの機能的な関係を明らかにすることは、骨芽細胞分化の分子メカニズムの解明につながり、さらには、骨芽細胞分化と密接に関連した疾患のための医薬品開発に重要な手段を提供することにつながる。したがって、本発明は、骨芽細胞分化に必須の転写因子であるＲｕｎｘ２によって遺伝子発現が制御されるＧＰＣＲについて新たな知見を得て、この知見に基づいて骨芽細胞分化マーカー、骨形成促進剤及び骨形成抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、鋭意研究した結果、ＧＰＲ９７遺伝子の発現が骨芽細胞分化に必須の転写因子であるＲｕｎｘ２によって調節されていることを見出した。さらに、本発明者らは、ＧＰＲ９７遺伝子が骨芽細胞分化に関与することを見出した。かかる知見に基づき、本発明者らは本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、ＧＰＲ９７遺伝子の発現量を指標とする、骨芽細胞分化を検出する方法を提供する。本発明によれば、ＧＰＲ９７遺伝子の発現量の増加を指標として、骨芽細胞分化のステージ進行を検出することができる。すなわち、ＧＰＲ９７遺伝子を骨芽細胞分化のマーカーとして使用することができる。
【００１３】
本発明は、ＧＰＲ９７発現ベクターを有効成分とする、骨形成促進剤を提供する。上記ＧＰＲ９７発現ベクターは、配列番号１又は３に記載の塩基配列を含有することが好ましく、また、上記ＧＰＲ９７発現ベクターは、配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有することが好ましい。
【００１４】
本発明者らの研究により、骨芽細胞分化にはＧＰＲ９７遺伝子の発現亢進が関与しており、ＧＰＲ９７遺伝子の発現を阻害することにより骨芽細胞分化が抑制されることが明らかとなった。したがって、ＧＰＲ９７発現ベクターを有効成分とする薬剤により、骨芽細胞分化の促進効果、及び、骨形成促進効果が期待できる。
【００１５】
また、本発明は、ＧＰＲ９７遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを有効成分とする、骨形成抑制剤を提供する。本発明の骨形成抑制剤は、ＧＰＲ９７遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡが、下記（ａ）又は（ｂ）のオリゴヌクレオチド対からなる二本鎖ｓｉＲＮＡであることが好ましい。
（ａ）配列番号１０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、及び、配列番号１１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、及び、配列番号１３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド。
【００１６】
本発明によれば、ＧＰＲ９７遺伝子を機能阻害することにより、骨形成を担う骨芽細胞の分化を抑制することができる。したがって、骨形成を抑制することができる。
【００１７】
本発明は、ＧＰＲ９７遺伝子の上流領域依存的な転写活性を指標とする、骨形成促進剤又は骨形成抑制剤のスクリーニング方法を提供する。また、本発明の骨形成促進剤又は骨形成抑制剤のスクリーニング方法は、（ｉ）ＧＰＲ９７遺伝子の上流領域と、当該領域の３’末端側に接続したレポーター遺伝子と、を含むレポーターコンストラクトを間葉系幹細胞に遺伝子導入する工程と、（ｉｉ）上記間葉系幹細胞に骨芽細胞分化誘導刺激を与える工程と、（ｉｉｉ）上記間葉系幹細胞に試験化合物を投与する工程と、（ｉｖ）上記試験化合物の存在下及び非存在下におけるレポーター活性を検出する工程であって、上記レポーター活性が、ＧＰＲ９７遺伝子の上流領域依存的な転写活性を示す工程と、（ｖ）上記試験化合物の存在下におけるレポーター活性が上記試験化合物の非存在下におけるレポーター活性と比べて亢進された場合に、当該試験化合物が骨形成促進剤であると判定する工程と、（ｖｉ）上記試験化合物の存在下におけるレポーター活性が上記試験化合物の非存在下におけるレポーター活性と比べて低減された場合に、当該試験化合物が骨形成抑制剤であると決定する工程と、を備えることを特徴とする。上記ＧＰＲ９７遺伝子の上流領域が、配列番号５に記載された塩基配列を含むことが好ましい。
【００１８】
本発明は、ＧＰＲ９７遺伝子を機能阻害することにより、骨形成を担う骨芽細胞の分化が抑制されるという、本発明者らの新たな知見に基づくものである。また、ＧＰＲ９７遺伝子の上流領域を介し、骨芽細胞分化に必須の転写因子Ｒｕｎｘ２によってＧＰＲ９７遺伝子の発現が調節されているという本発明者らが新たに見出した知見に基づき、ＧＰＲ９７遺伝子の上流領域依存的な転写活性をスクリーニングの指標とすることを可能としたものである。本発明のスクリーニング方法により、ＧＰＲ９７遺伝子の発現を促進的又は抑制的に制御する試験化合物を検索することにより、骨芽細胞分化を促進又は抑制する化合物、すなわち、骨形成を促進又は抑制する化合物を同定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＧＰＲ９７ ｍＲＮＡの骨芽細胞分化における発現パターンを表すグラフ。（Ａ）Ｏｓｔｅｒｉｘ ｍＲＮＡの発現量、及び、（Ｂ）ＧＰＲ９７ ｍＲＮＡの発現量。
【図２】ルシフェラーゼアッセイによるＧＰＲ９７プロモーター活性測定の結果を示すグラフ。レポーターベクターとして、（Ａ）ｐＧＬ４．１０（ネガティブコントロール）、（Ｂ）ＧＰＲ９７ｐｒｏ＿−５．７ｋベクター、（Ｃ）ＧＰＲ９７ｐｒｏ＿−４．３ｋベクター、及び、（Ｄ）Ｆ２−Ｌｕｃ（ポジティブコントロール）を用い、Ｒｕｎｘ２の存在下又は非存在下におけるプロモーター活性を測定した。
【図３】ｓｉＲＮＡを介したＧＰＲ９７の機能阻害が骨芽細胞分化に与える影響を示すグラフ。（Ａ）アルカリフォスファターゼ活性、（Ｂ）Ｏｓｔｅｒｉｘ ｍＲＮＡの発現量、及び、（Ｃ）ＧＰＲ９７ ｍＲＮＡの発現量。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００２１】
本発明で使用されるＧＰＲ９７遺伝子（ｃＤＮＡ）は、配列番号１又は３で表わされる塩基配列と同一又は実質的に同一の塩基配列を含有する遺伝子である。本発明のＧＰＲ９７遺伝子の具体例としては、配列番号１で表わされるマウス由来ＧＰＲ９７遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿１７３０３６）、又は、配列番号３で表わされるヒト由来ＧＰＲ９７遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿１７０７７６）である。配列番号１又は３で表わされる塩基配列と実質的に同一の塩基配列としては、例えば、配列番号１又は３で表わされる塩基配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列等が挙げられる。
【００２２】
本発明で使用されるＧＰＲ９７タンパク質は、配列番号２又は４で表わされるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプタータンパク質である。本発明のＧＰＲ９７タンパク質の具体例としては、配列番号２で表わされるマウス由来ＧＰＲ９７タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿７６６６２４）、又は、配列番号４で表わされるヒト由来ＧＰＲ９７タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿７４０７４６）である。配列番号２又は４で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号２又は４で表わされるアミノ酸配列と約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列等が挙げられる。
【００２３】
（骨芽細胞分化マーカー）
本実施形態に係る骨芽細胞分化を検出する方法は、ＧＰＲ９７遺伝子の発現量を指標とする。ＧＰＲ９７遺伝子を骨芽細胞分化マーカーとして用いるものであり、ＧＰＲ９７遺伝子の発現量の増加が、骨芽細胞分化のステージ進行と相関するという本発明の知見に基づき、骨芽細胞分化を検出する。ＧＰＲ９７遺伝子の発現量が対象と比べて有意に増加した場合に、骨芽細胞分化が誘導されていると判定することができる。
【００２４】
ここで、遺伝子の発現量とは、遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの発現量及び／又はその翻訳産物であるタンパク質の発現量を指す。ｍＲＮＡの発現量の測定は、当業者にとって公知の測定系を用いて行えばよく、具体的には、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法、定量的ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ法、定量的ノザンブロッティング法、定量的リボヌクレアーゼプロテクション法などが挙げられる。タンパク質の発現量の測定は、当業者にとって公知の測定系を用いて行えばよく、例えば、定量的ウエスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法などが挙げられる。コントロールとして、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨや、ベータアクチンなどのｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現量を用い、ＧＰＲ９７遺伝子等の目的の遺伝子の発現量を標準化することができる。
【００２５】
ＧＰＲ９７ ｍＲＮＡの発現量の測定に用いるプライマー及びプローブは、ＧＰＲ９７遺伝子を特異的に増幅できるものを用いることができ、当業者にとって周知の方法により設計することができる。ＧＰＲ９７ ｍＲＮＡの発現量の測定に用いるプライマーとしては、配列番号６及び７で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット等が例示できるが、これらに限定されない。また、ＧＰＲ９７タンパク質の検出に用いる抗体、抗体断片等は当業者にとって周知の方法により調製することができる。利用可能な抗ＧＰＲ９７抗体としては、市販の抗体（ＧＰＲ９７（Ｅ−１４）、ｓｃ−１０７５８３；ＧＰＲ９７（Ｎ−１４）、ｓｃ−１０７５８６、ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）等が好適に使用できるが、これらに限定されない。
【００２６】
（骨形成促進剤）
本実施形態に係る骨形成促進剤は、ＧＰＲ９７発現ベクターを有効成分とする。ＧＰＲ９７発現ベクターは、配列番号１又は３に記載の塩基配列又は実質的に同一の塩基配列を含有する核酸を有することが好ましく、また、ＧＰＲ９７発現ベクターは、配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列又は実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する核酸を有することが好ましい。
【００２７】
発現ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスをもとに作製できる。ＭｏＭＬＶベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、ＨＩＶベクター、ＳＩＶベクター、センダイウイルスベクター等のいかなるウイルスベクターであっても良い。また、ウイルスベクターの構成タンパク質群のうち１つ以上を、異種ウイルスの構成タンパク質に置換する、もしくは、遺伝子情報を構成する塩基配列のうち一部を異種ウイルスの塩基配列に置換する、シュードタイプ型のウイルスベクターも本発明に使用できる。例えば、ＨＩＶの外皮タンパク質であるＥｎｖタンパク質を、小水痘性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ：ＶＳＶ）の外皮タンパク質であるＶＳＶ−Ｇタンパク質に置換したシュードタイプウイルスベクターが挙げられる。さらに、治療効果を持つウイルスであれば、ヒト以外の宿主域を持つウイルスもウイルスベクターとして使用可能である。ウイルス以外のベクターとしてはリン酸カルシウムと核酸の複合体、リポソーム、カチオン脂質複合体、センダイウイルスリポソーム、ポリカチオンを主鎖とする高分子キャリアー等が使用可能である。
【００２８】
さらに、ベクター中の遺伝子の発現のために用いられる発現カセットは、標的細胞内で遺伝子を発現させることができるものであれば、特に制限されることなく用いることができる。当業者はそのような発現カセットを容易に選択することができる。好ましくは、動物由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットであり、より好ましくは、哺乳類由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットであり、特に好ましくは、ヒト由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現カセットである。発現カセットに用いられる遺伝子プロモーターは、例えばアデノウイルス、サイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、シミアンウイルス４０、ラウス肉腫ウイルス、単純ヘルペスウイルス、マウス白血病ウイルス、シンビスウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、インフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、ＪＣウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオウイルス等のウイルス由来のプロモーター、アルブミン、ＳＲα、熱ショック蛋白、エロンゲーション因子等の哺乳類由来のプロモーター、ＣＡＧプロモーター等のキメラ型プロモーター、テトラサイクリン、ステロイド等によって発現が誘導されるプロモーターを含む。
【００２９】
好適な対象としては、ヒト及び非ヒト哺乳類が挙げられ、骨形成不全の対象又はその恐れのある対象の骨形成促進を意図した予防・治療に用いられる。検体（標的細胞）は、骨芽細胞への分化能を有する間葉系幹細胞であることが好ましい。
【００３０】
（骨形成抑制剤）
本実施形態に係る骨形成抑制剤は、ＧＰＲ９７遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを有効成分とする。骨形成抑制剤は、ＧＰＲ９７遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡが、下記（ａ）又は（ｂ）のオリゴヌクレオチド対からなる二本鎖ｓｉＲＮＡであることが好ましい。
（ａ）配列番号１０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、及び、配列番号１１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、及び、配列番号１３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド。
【００３１】
好適な対象としては、ヒト及び非ヒト哺乳類が挙げられ、骨形成不全の対象又はその恐れのある対象の骨形成抑制を意図した予防・治療に用いられる。検体（標的細胞）は、骨芽細胞への分化能を有する間葉系幹細胞であることが好ましい。
【００３２】
ここで、ｓｉＲＮＡとは、ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡの略称であり、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたものか、あるいは生物体内で合成されたものか、あるいは約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の二本鎖ＲＮＡを指す。ｓｉＲＮＡの長さは、一般的には１０〜３０塩基、好ましくは約１５〜２５塩基、より好ましくは１９〜２３塩基程度である。ｓｉＲＮＡとして、５'−リン酸、３'−ＯＨの構造を有しており、３'末端は約２塩基突出しているオリゴヌクレオチド対を用いることができる。
【００３３】
ｓｉＲＮＡを細胞に投与すると、ＲＮＡｉ効果によりＧＰＲ９７の発現を特異的に抑制することができる。すなわち、ｓｉＲＮＡが細胞に導入されると、このｓｉＲＮＡに特異的なタンパク質が結合して、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ−ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成される。この複合体は、ｓｉＲＮＡと同じ配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によってｓｉＲＮＡの中央部でｍＲＮＡを切断する。上記のように、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと相同な配列を有するｍＲＮＡを分解することにより、その標的となる遺伝子（本発明においては、ＧＰＲ９７遺伝子）の発現を抑制することができる。このような現象をＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）という。ＲＮＡｉ現象は、線虫、昆虫、原虫、ヒドラ、植物、脊椎動物（哺乳動物を含む）において見られる現象である。
【００３４】
また、別の実施形態においては、上記以外のＧＰＲ９７に特異的なｓｉＲＮＡを用いてもよい。さらに、上記ｓｉＲＮＡを生成するようなｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）、ｄｓＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ）又はそれらを発現できる発現ベクターを用いることができる。ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡまたはそれらの発現ベクターを細胞に投与すると、細胞内でｓｉＲＮＡが生成する。ＲＮＡ発現ベクターのプロモーターには、Ｕ６ＲＮＡまたはＨ１ＲＮＡの転写系であるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＰｏｌＩＩＩ）のプロモーターを用いることができる。
【００３５】
さらに、別の実施形態においては、上記ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、又は、修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）であってもよい。修飾された核酸の具体例としては、核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、さらにはポリヌクレオチドアミドやオリゴヌクレオチドアミドの分解に抵抗性を有するもの等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００３６】
本発明の骨形成促進剤及び骨形成抑制剤の製剤化にあたっては、常法に従い、必要に応じて薬学的に許容される担体を添加することができる。例えば、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
【００３７】
本発明の骨形成促進剤及び骨形成抑制剤の剤型の種類としては、例えば、経口剤として錠剤、粉末剤、丸剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、軟・硬カプセル剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、舌下剤、ペースト剤等、非経口剤として注射剤、坐剤、経皮剤、軟膏剤、硬膏剤、外用液剤等が挙げられ、当業者においては投与経路や投与対象等に応じた最適の剤型を選ぶことができる。有効成分としての上記骨形成促進剤及び骨形成抑制剤は、製剤中０．１から９９．９重量％含有することができる。
【００３８】
本発明の骨形成促進剤及び骨形成抑制剤の有効成分の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、患者（６０ｋｇとして）に対して一日につき約０．１ｍｇ〜１，０００ｍｇ、好ましくは約１．０〜１００ｍｇ、より好ましくは約１．０〜５０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その一回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、患者（６０ｋｇに対して）、一日につき約０．０１から３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１から２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。しかしながら、最終的には、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、医師の判断により適宜決定することができる。
【００３９】
（骨形成促進剤又は骨形成抑制剤のスクリーニング方法）
本実施形態に係る骨形成促進剤又は骨形成抑制剤のスクリーニング方法は、ＧＰＲ９７遺伝子の上流領域依存的な転写活性を指標とする。また、本実施形態に係る骨形成抑制剤のスクリーニング方法は、遺伝子導入工程（ｉ）、骨芽細胞分化誘導工程（ｉｉ）、試験化合物投与工程（ｉｉｉ）、レポーター活性検出工程（ｉｖ）、判定工程（ｖ）及び（ｖｉ）を備えることを特徴とする。以下に、各工程について説明する。
【００４０】
本実施形態に係るスクリーニング方法の遺伝子導入工程（ｉ）は、レポーターコンストラクトを間葉系幹細胞に遺伝子導入する工程である。レポーターコンストラクトは、ＧＰＲ９７遺伝子の上流領域（プロモーター）と、当該上流領域の３’末端側に接続したレポーター遺伝子と、を含む。すなわち、レポーター遺伝子がＧＰＲ９７遺伝子の上流領域（プロモーター）の制御下で発現し得るレポーターコンストラクトを用いることができる。ＧＰＲ９７遺伝子の上流領域は、ＧＰＲ９７遺伝子の上流領域−４．３ｋｂｐ〜−５．７ｋｂｐ（配列番号５に記載された塩基配列）を含むことが好ましく、例えば、ＧＰＲ９７遺伝子の転写開始点〜−５．７ｋｂｐの領域（配列番号８に記載された塩基配列）を用いることができる。また、ＧＰＲ９７遺伝子の上流領域−４．３ｋｂｐ〜−５．７ｋｂｐを欠いた、ＧＰＲ９７遺伝子の転写開始点〜−４．３ｋｂｐの領域（配列番号９に記載された塩基配列）を、コントロールとして用いることができる。
【００４１】
レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、β−ガラクトシダーゼ等の公知のレポータータンパク質をコードする遺伝子を用いることができる。遺伝子導入の方法としては、公知の方法、例えば、リポフェクション、エレクトロポレーション、超音波による導入、アデノウイルス等を用いることができる。
【００４２】
間葉系幹細胞とは、骨芽細胞への分化能を有する細胞である。間葉系幹細胞の入手方法は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、個体の骨髄等から単離することにより得ることもできるし、又は、既にクローン化された間葉系幹細胞として各種機関から入手することもできる。このような既にクローン化された間葉系幹細胞としては、例えば、マウスの細胞として、マウスＳＴ２細胞、マウスＮＲＧ細胞等が挙げられる（それぞれ独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター（ＢＲＣ）から入手可能である）。
【００４３】
骨芽細胞分化誘導工程（ｉｉ）は、工程（ｉ）において遺伝子導入した間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化を誘導する工程であり、具体的には、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４等の骨芽細胞分化の誘導活性を有するサイトカインを培地中に投与する、又は、これらのサイトカインを含む培地により培地交換することにより間葉系幹細胞の骨芽細胞分化を誘導することができる。骨芽細胞分化誘導に要する期間は、用いる細胞や誘導の強度により変化し得るが、公知の骨芽細胞分化マーカー（Ｏｓｔｅｒｉｘ、ＲＵＮＸ２、アルカリフォスファターゼ活性、オステオポンチン、オステオカルシン等）、又は、本発明のＧＰＲ９７遺伝子の発現量を指標とした骨芽細胞分化の検出方法を用いることにより、適宜、骨芽細胞分化のステージや試験化合物の投与タイミングを決定することができる。
【００４４】
試験化合物投与工程（ｉｉｉ）は、工程（ｉｉ）において骨芽細胞分化を誘導した間葉系幹細胞に試験化合物を投与する工程である。試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿等が用いられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、生理学的に許容される金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩等が挙げられる。試験化合物の投与量、投与タイミング、投与期間等については、適宜、設定することができる。試験化合物の投与タイミングとしては、骨芽細胞分化誘導と同時、骨芽細胞分化誘導処理終了後、骨芽細胞分化誘導から数時間後〜数日後（１〜７日程度）であってもよい。また、次のレポーター活性検出工程（ｉｖ）の数時間前〜数日前（１〜３日程度）に試験化合物を投与することが好ましい。
【００４５】
レポーター活性検出工程（ｉｖ）は、試験化合物の存在下及び非存在下におけるレポーター活性を検出する工程である。レポーター活性は、ＧＰＲ９７遺伝子の上流領域依存的な転写活性を示す。レポーター活性検出のタイミングとしては、ＧＰＲ９７遺伝子の発現が亢進している期間（試験化合物の非存在下）、例えば、骨芽細胞分化誘導から数１日後〜８日後とすることができる。
【００４６】
判定工程（ｖ）及び（ｖｉ）は、試験化合物の存在下及び非存在下におけるレポーター活性の変化に基づいて、試験化合物を評価する工程であり、（ｖ）試験化合物の存在下におけるレポーター活性が前記試験化合物の非存在下におけるレポーター活性と比べて亢進された場合に、当該試験化合物が骨形成促進剤であると判定する工程と、（ｖｉ）上記試験化合物の存在下におけるレポーター活性が上記試験化合物の非存在下におけるレポーター活性と比べて低減された場合に、当該試験化合物が骨形成抑制剤であると決定する工程である。
【００４７】
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物は、本発明のＧＰＲ９７の発現量を変化させる作用を有する化合物であり、具体的には、ＧＰＲ９７遺伝子の発現を抑制的に制御する化合物は、骨芽細胞分化を抑制する化合物及び／又は骨形成を抑制する化合物である。ＧＰＲ９７遺伝子の発現を促進的に制御する化合物は、骨芽細胞分化を促進する化合物及び／又は骨形成を促進する化合物である。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４９】
（実施例１：ＧＰＲ９７遺伝子上流配列におけるＲｕｎｘ２結合部位の同定）
マウス骨髄由来の間葉系幹細胞であるＳＴ２細胞を用いて、クロマチン免疫沈降法（ＣｈＩＰ）とＤＮＡ ｃｈｉｐを組み合わせたＣｈＩＰ ｏｎ ｃｈｉｐ解析により、骨芽細胞分化に必須の転写因子Ｒｕｎｘ２が結合する遺伝子領域を検索した。具体的には、以下の方法を用いた。
【００５０】
ＢＭＰ４処理による骨芽細胞分化誘導を開始してから６日目のＳＴ２細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、ＣＥＬＬ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ ＮａＣｌ，０．５％ ＮＰ−４０）を加え、セルスクレイパーで細胞を回収した。オートピペッターで細胞をピッペティングした後、終濃度１％となるように３７％ ＨＣＨＯを加え、室温１０分間攪拌した。ＰＢＳで３回洗浄後、ＳＤＳ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，１％ ＳＤＳ，ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：５０×ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｒｏｃｈｅ＃１８７３５８０））を加え、超音波でクロマチンを破壊した。遠心後、上清を回収し、ＣｈＩＰ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（０．０１％ ＳＤＳ，１．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１．２ｍＭ ＥＤＴＡ，１６．７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．１，１６７ｍＭ ＮａＣｌ）で１０倍希釈した。
【００５１】
得られたサンプルにｐｒｏｔｅｉｎＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ（５０％ ｓｌｕｒｒｙ）を加え、３０分、４℃、プレインキュベーションした後、抗Ｒｕｎｘ２抗体（Ａｎｔｉ−Ｒｕｎｘ２／Ｃｂｆａ１，製品番号：Ｄ１３０−３，Ｍｅｄｉｃａｌ＆Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を結合させたｐｒｏｔｅｉｎＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ（５０％ ｓｌｕｒｒｙ）を加え、４℃で一晩インキュベーションした。ビーズをＩＰ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒで１回、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ１（０．１％ ＳＤＳ，１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，２ｍＭ ＥＤＴＡ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．１，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で２回、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ２（０．１％ＳＤＳ，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，２ｍＭ ＥＤＴＡ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．１，５００ｍＭ ＮａＣｌ）で２回、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ３（０．２５Ｍ ＬｉＣｌ，１％ ＩＧＥＰＡＬ−ＣＡ６３０，１％ デオキシコール酸ナトリウム塩，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．１)で１回、ＴＥ ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄した。その後、ビーズをＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（１％ ＳＤＳ，０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３，プロテアーゼ）に懸濁して、４２℃、２時間のインキュベーション後、更に６５℃で一晩インキュベーションした。サンプルを遠心後、上清のみ回収し、ＱＩＡ ｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＩＡＧＥＮ）を用いてＲｕｎｘ２と共に免疫沈降したＤＮＡを精製した。
【００５２】
精製ＤＮＡの濃縮率を定量ＲＴ−ＰＣＲ（ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ）で確認した。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ法によりＤＮＡを増幅し、ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＭｏｕｓｅ Ｔｉｌｉｎｇ ２．０Ｒ Ａｒｒａｙ（品番：９００８５２）へのハイブリダイゼーションに用いた。
【００５３】
（結果）
上記のＣｈＩＰ ｏｎ ｃｈｉｐ解析により、骨芽細胞方向への分化誘導を開始してから６日目のＳＴ２細胞において、ＧＰＲ９７遺伝子の上流−４．３ｋｂｐ〜−５．７ｋｂｐの領域（配列番号５）にＲｕｎｘ２が結合することが判明した。
【００５４】
（実施例２：ＧＰＲ９７ ｍＲＮＡの骨芽細胞分化における発現解析）
次に、マウスＧＰＲ９７ ｍＲＮＡの骨芽細胞分化における発現レベルを以下の方法により調べた。ｍＲＮＡの発現量の定量にはＭｘ３０００Ｐ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用いた。発現量定量用のプライマーセットとして、ｍＧＰＲ９７＿ｅｘｏｎ８＿Ｓ：５’−ａｃａｇａｃｔｃｔｃａｃｔｃｇｃａｔｃｔ−３’（配列番号６）、及び、ｍＧＰＲ９７＿ｅｘｏｎ９＿ＡＳ：５’−ｇａｇｃｃａｔｇｔｇｇａｔｃｔｔａｇｇ−３’（配列番号７）を使用した。これらのプライマーの配列はマウスＧＰＲ９７ ｃＤＮＡ配列（配列番号１）をもとに設計した。
【００５５】
鋳型ｃＤＮＡとして、ＳＴ２細胞をＢＭＰ４処理有りで８日間培養し、０、１、２、４、６、８日目にＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて抽出したＲＮＡから合成したものを用いた。なお、コントロールとしてＢＭＰ４処理無しで培養したＳＴ２細胞を用いた。定量ＰＣＲの試薬はＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用した。ＰＣＲ反応液は以下の組成のものを用いた。反応条件は９５℃で１０分の後、９５℃、３０秒、５５℃、１分、７２℃、３０秒のサイクルを４０回繰り返して行った。
【００５６】
＜ＰＣＲ反応液＞
Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ
１２．５μｌ
滅菌水 ５μｌ
１μＭ ｅａｃｈ Ｐｒｉｍｅｒｓ ２．５μｌ
ｃＤＮＡ ５μｌ
ｔｏｔａｌ ２５μｌ
【００５７】
（結果）
結果を図１に示す。図１は、ＧＰＲ９７ ｍＲＮＡの骨芽細胞分化における発現パターンを表すグラフである。ＧＰＲ９７ ｍＲＮＡの発現量は、ＳＴ２細胞の骨芽細胞分化に伴い増加することが明らかとなった。したがって、骨芽細胞分化マーカーとしてＧＰＲ９７遺伝子を使用できることが分かった。
【００５８】
（実施例３：Ｒｕｎｘ２によるＧＰＲ９７遺伝子上流を介した転写解析）
骨芽細胞分化に必須の転写因子Ｒｕｎｘ２が、ＧＰＲ９７の転写を活性化し得るか否かを調べるために、ＧＰＲ９７遺伝子上流配列を用いたプロモーター解析をｐｒｏｍｅｇａのＤｕａｌ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔを使用して、以下の手法により行った。
【００５９】
ルシフェラーゼレポーターベクターには、以下の４種類を用いて転写アッセイを行った。マウスＧＰＲ９７遺伝子上流−５．７ｋｂｐ（配列番号８）、又は−４．３ｋｂｐ（配列番号９）をｐＧＬ４．１０（ｐｒｏｍｅｇａ社）にクローニングしたルシフェラーゼレポーターベクターを構築し、それぞれＧＰＲ９７ｐｒｏ＿−５．７ｋベクター及びＧＰＲ９７ｐｒｏ＿−４．３ｋベクターと命名した。ネガティブコントロールとしてｐＧＬ４．１０ベクター、ポジティブコントロールとして、Ｒｕｎｘ２により転写活性化されることが知られているＢｏｎｅ ｇａｍｍａ−ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）遺伝子の上流領域４３６ｂｐ（配列番号１４）をｐＧＬ４．１０にクローニングしたベクター（Ｆ２−Ｌｕｃ）を用いた。また、内部標準としてウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクターｐＧＬ４．７４を使用した。発現ベクターとしては、ヒトＲｕｎｘ２蛋白質発現ベクター、ヒトＰＰＡＲγ１発現ベクター、及び、ネガティブコントロールとして空の発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。
【００６０】
ＣＶ１細胞への遺伝子導入
遺伝子導入の前日にアフリカミドリザル腎臓由来のＣＶ１細胞を７×１０４細胞／ｗｅｌｌずつ播種した。培地はＤＭＥＭ（ナカライ）に１０％ＦＢＳと１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したものを用いた。種々の組み合わせのルシフェラーゼレポーターベクターと発現ベクターをＣＶ１細胞に導入した。各プラスミドを１００ｎｇ／μｌに希釈し、各発現ベクターを０．４μｇと各レポーターベクターを０．４μｇ、更にｐＧＬ４．７４を０．０４μｇの割合で５０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）に添加した。この溶液に、５０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭに２μｌのｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ｐｒｏｍｅｇａ社）を添加したものを等量混合して、室温で２０分間インキュベートした後に、１０６μｌ／ｗｅｌｌずつＣＶ１細胞の培養液に添加し、遺伝子導入を行った。３７℃、５％ＣＯ２下で２晩培養した。
【００６１】
ルシフェラーゼアッセイ
２晩培養した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１×ＰＢを１００μｌ加え、室温で２０分間インキュベートした。細胞溶解液２０μｌを９６穴プレートへ移し、プレートリーダー（ＡＲＶＯ）でルシフェラーゼ活性を測定した。
【００６２】
（結果）
結果を図２に示す。図２は、ルシフェラーゼアッセイによるＧＰＲ９７プロモーター活性測定の結果を示すグラフである。実施例１にて示されたＲｕｎｘ２の結合領域（ＧＰＲ９７遺伝子の上流−４．３ｋｂｐ〜−５．７ｋｂｐの領域：配列番号５）を含むＧＰＲ９７上流−５．７ｋｂｐを介して、Ｒｕｎｘ２による転写活性化が観察された。一方、Ｒｕｎｘ２の結合領域を欠失させたＧＰＲ９７遺伝子上流−４．３ｋｂｐを用いた場合には、Ｒｕｎｘ２による転写活性化は観察されなかった。したがって、ＧＰＲ９７遺伝子の上流−４．３ｋｂｐ〜−５．７ｋｂｐのＲｕｎｘ２結合領域依存的に、Ｒｕｎｘ２による転写調節を受けていることが分かった。また、Ｒｕｎｘ２が活性化される骨芽細胞分化段階において、ＧＰＲ９７の発現が上昇するという実施例２の知見を考え併せると、ＧＰＲ９７が骨芽細胞分化においてＲｕｎｘ２による遺伝子発現制御を受けていることが強く示唆された。
【００６３】
（実施例４：ＧＰＲ９７特異的なｓｉＲＮＡを用いた機能阻害実験）
ＧＰＲ９７特異的なｓｉＲＮＡを用いてＧＰＲ９７の機能阻害が骨芽細胞分化に与える影響を以下の手法により評価した。ＧＰＲ９７に特異的な２種類のＳｔｅａｌｔｈ ｓｅｌｅｃｔ ＲＮＡｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を購入した。ｓｉＲＮＡの配列は以下の通りである。
ＧＰＲ９７＃５２：５’−ｇｇｇｃｃｕｇｃｃｕｇｕｕｃｕｕｇｕａｇｕｕａｕｕ−３’（センス鎖、配列番号１０）及び５’−ａａｕａａｃｕａｃａａｇａａｃａｇｇｃａｇｇｃｃｃ−３’（アンチセンス鎖、配列番号１１）
ＧＰＲ９７＃５４：５’−ｇｇｕｕｃｃａｇａａａｇａｇｃｃｕｇｃｕｃｕｕｕａ−３’（センス鎖、配列番号１２）及び５’−ｕａａａｇａｇｃａｇｇｃｕｃｕｕｕｃｕｇｇａａｃｃ−３’（アンチセンス鎖、配列番号１３）
なお、ネガティブコントロールとしてＮｅｇａｔｉｖｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｔｅａｌｔｈ ＲＮＡｉ Ｍｅｄ＃２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。
【００６４】
ＳＴ２細胞へのｓｉＲＮＡ導入
マウス骨髄由来のＳＴ２細胞にＧＰＲ９７特異的なｓｉＲＮＡ（ＧＰＲ９７＃５２又はＧＰＲ９７＃５４）を導入した。遺伝子導入直前にＳＴ２細胞を１×トリプシン処理し、２〜３×１０５細胞／ｍｌに調製した。５μＭに希釈したｓｉＲＮＡ ４．８μｌをＯＰＴＩ−ＭＥＭに添加した。次に、この溶液をｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ ４μｌを等量のＯＰＴＩ−ＭＥＭに添加した溶液と混合し、室温で２０分置いた後、新しい２４穴プレートに添加し、その上から２〜３×１０５細胞／ｍｌのＳＴ２細胞を１ｍｌ添加した。６時間後、細胞の培地を１００ｎｇ／μｌのＢＭＰ４を添加したＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳに交換し、４日間培養した（骨芽細胞分化誘導）。４日後、ＳＴ２細胞からＲＮｅａｓｙを用いてＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成してＧＰＲ９７及びＯｓｔｅｒｉｘのｑＲＴ−ＰＣＲを行った。また、同時に骨形成の指標であるアルカリフォスファターゼ活性の測定も行った。
【００６５】
アルカリフォスファターゼ活性測定
ＳＴ２細胞を１０％中性緩衝ホルマリンで、室温、２０分間固定し、更に、アセトン：エタノール（１：１）混合液（−２０℃）を加え室温１分間固定した。その後、ＰＢＳで５回洗浄後、Ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＩＧＭＡ社）を添加し、遮光して室温で２分間インキュベートした。反応液を１．５ｍｌチューブに移し、反応を停止させるために０．３Ｎ ＮａＯＨを加え、４０５ｎｍの吸光度を測定した。
【００６６】
（結果）
結果を図３に示す。図３は、ｓｉＲＮＡを介したＧＰＲ９７の機能阻害が骨芽細胞分化に与える影響を示すグラフである。ＳＴ２細胞にＧＰＲ９７＃５２又はＧＰＲ９７＃５４を導入し、ＧＰＲ９７遺伝子の発現を抑制した結果、骨芽細胞分化マーカー遺伝子であるＯｓｔｅｒｉｘの発現量が減少した。したがって、ｓｉＲＮＡを介したＧＰＲ９７の機能阻害により、骨芽細胞方向への分化が抑制されることが明らかとなった。このことは、ＧＰＲ９７が骨芽細胞分化に対して促進的に作用することを示唆している。またこの結果は、実施例２において得られた骨芽細胞分化マーカーとしてＧＰＲ９７遺伝子を使用できるという知見を支持するものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＰＲ９７遺伝子の発現量を指標とする、骨芽細胞分化を検出する方法。
【請求項２】
ＧＰＲ９７発現ベクターを有効成分とする、骨形成促進剤。
【請求項３】
前記ＧＰＲ９７発現ベクターが、配列番号１又は３に記載の塩基配列を含有する核酸を有する、請求項２に記載の骨形成促進剤。
【請求項４】
前記ＧＰＲ９７発現ベクターが、配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する核酸を有する、請求項２に記載の骨形成促進剤。
【請求項５】
ＧＰＲ９７遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを有効成分とする、骨形成抑制剤。
【請求項６】
ＧＰＲ９７遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡが、下記（ａ）又は（ｂ）のオリゴヌクレオチド対からなる二本鎖ｓｉＲＮＡである請求項５に記載の骨形成抑制剤。
（ａ）配列番号１０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、及び、配列番号１１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、及び、配列番号１３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド
【請求項７】
ＧＰＲ９７遺伝子上流領域依存的な転写活性を指標とする、骨形成促進剤又は骨形成抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
（ｉ）ＧＰＲ９７遺伝子の上流領域と、当該上流領域の３’末端側に接続したレポーター遺伝子と、を含むレポーターコンストラクトを間葉系幹細胞に遺伝子導入する工程と、
（ｉｉ）前記間葉系幹細胞に骨芽細胞分化誘導刺激を与える工程と、
（ｉｉｉ）前記間葉系幹細胞に試験化合物を投与する工程と、
（ｉｖ）前記試験化合物の存在下及び非存在下におけるレポーター活性を検出する工程であって、前記レポーター活性が、ＧＰＲ９７遺伝子の上流領域依存的な転写活性を示す工程と、
（ｖ）前記試験化合物の存在下におけるレポーター活性が前記試験化合物の非存在下におけるレポーター活性と比べて亢進された場合に、当該試験化合物が骨形成促進剤であると判定する工程と、
（ｖｉ）前記試験化合物の存在下におけるレポーター活性が前記試験化合物の非存在下におけるレポーター活性と比べて低減された場合に、当該試験化合物が骨形成抑制剤であると判定する工程と、
を備える、請求項７に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
ＧＰＲ９７遺伝子の上流領域が、配列番号５に記載された塩基配列を含む、請求項７又は８に記載のスクリーニング方法。
【請求項１】
ＧＰＲ９７遺伝子の発現量を指標とする、骨芽細胞分化を検出する方法。
【請求項２】
ＧＰＲ９７発現ベクターを有効成分とする、骨形成促進剤。
【請求項３】
前記ＧＰＲ９７発現ベクターが、配列番号１又は３に記載の塩基配列を含有する核酸を有する、請求項２に記載の骨形成促進剤。
【請求項４】
前記ＧＰＲ９７発現ベクターが、配列番号２又は４に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する核酸を有する、請求項２に記載の骨形成促進剤。
【請求項５】
ＧＰＲ９７遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを有効成分とする、骨形成抑制剤。
【請求項６】
ＧＰＲ９７遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡが、下記（ａ）又は（ｂ）のオリゴヌクレオチド対からなる二本鎖ｓｉＲＮＡである請求項５に記載の骨形成抑制剤。
（ａ）配列番号１０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、及び、配列番号１１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、及び、配列番号１３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド
【請求項７】
ＧＰＲ９７遺伝子上流領域依存的な転写活性を指標とする、骨形成促進剤又は骨形成抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
（ｉ）ＧＰＲ９７遺伝子の上流領域と、当該上流領域の３’末端側に接続したレポーター遺伝子と、を含むレポーターコンストラクトを間葉系幹細胞に遺伝子導入する工程と、
（ｉｉ）前記間葉系幹細胞に骨芽細胞分化誘導刺激を与える工程と、
（ｉｉｉ）前記間葉系幹細胞に試験化合物を投与する工程と、
（ｉｖ）前記試験化合物の存在下及び非存在下におけるレポーター活性を検出する工程であって、前記レポーター活性が、ＧＰＲ９７遺伝子の上流領域依存的な転写活性を示す工程と、
（ｖ）前記試験化合物の存在下におけるレポーター活性が前記試験化合物の非存在下におけるレポーター活性と比べて亢進された場合に、当該試験化合物が骨形成促進剤であると判定する工程と、
（ｖｉ）前記試験化合物の存在下におけるレポーター活性が前記試験化合物の非存在下におけるレポーター活性と比べて低減された場合に、当該試験化合物が骨形成抑制剤であると判定する工程と、
を備える、請求項７に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
ＧＰＲ９７遺伝子の上流領域が、配列番号５に記載された塩基配列を含む、請求項７又は８に記載のスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−２１３５８５（Ｐ２０１０−２１３５８５Ａ）
【公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−６１２０８（Ｐ２００９−６１２０８）
【出願日】平成２１年３月１３日（２００９．３．１３）
【出願人】（５０４０１３７７５）学校法人 埼玉医科大学 (39)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月１３日（２００９．３．１３）
【出願人】（５０４０１３７７５）学校法人 埼玉医科大学 (39)
【Ｆターム（参考）】
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