骨誘導タンパク質及びペプチドの細胞内送達
本発明は、タンパク質導入ドメインと骨誘導ポリペプチドを含む融合タンパク質、ならびに、このようなポリペプチドを用いて骨形成を誘導し、そしてプロテオグリカンの合成を促進する方法を、提供する。本発明はまた、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて骨形成誘導能が実証されている骨誘導ポリペプチドを、提供する。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本出願は、２００３年３月２４日に出願された米国仮出願第60/456,551の利益を主張する。
発明の属する分野
本発明は、概して、骨誘導タンパク質、及びこれらのタンパク質を細胞内に送達するための方法に、関する。より具体的には、本発明は、ＬＩＭ石灰化タンパク質（ＬＭＰ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）及びＳｍａｄタンパク質などの骨誘導タンパク質、このような骨誘導タンパク質とタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）との複合体、ＰＴＤと骨誘導タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸との複合体、ならびに、これらの複合体の細胞内への導入に、関する。
【０００２】
背景
組織再生は、疾患、外傷または外科手術に続く治癒過程の重要な要素である。疾患または外傷により、例えば骨欠損が生じる状況や、外科的手順（自家移植片もしくは同種移植片の挿入、骨架橋または骨融合など）が、骨欠損を補正するために行われる状況において、骨再生は、回復の主要な目標である。しかしながら、これは、常にまたは容易に達成される目標ではなく、そして多くの研究が、組織修復及び再生を促進するためのより新たな、そしてより効果的な方法に対して、供されている。
【０００３】
骨架橋を作ることによって関節動作を排除することは、変性脊椎及び関節障害の治療に対する一般的な整形外科的ストラテジーである。脊椎融合の失敗は、該手順を受ける患者の４５％ほどにおいて起こる可能性があり、彼らに疼痛の持続、外科手術の再施行、医療費及び全体的な治療の失敗を残す。
【０００４】
細胞内及び細胞外骨誘導タンパク質は、骨成長及び修復を促進し、そして治療に用いるための潜在的な標的となる。このようなタンパク質としては、骨形態形成タンパク質及びＬＩＭ石灰化タンパク質が挙げられる。ＢＭＰは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて骨成長を刺激することが示されており、そして、ＬＭＰ、特にＬＭＰ−１及びＬＭＰ−３は骨誘導のより上流に影響を与え、これは、ＬＭＰ−１発現の阻害が、糖質コルチコイド類またはＢＭＰ−６によって通常刺激されるであろう小結節の形成を遮断することからも明らかである。これらは、細胞表面受容体との相互作用によって作用する「細胞外」タンパク質と考えられるため、非常に高用量の骨形態形成タンパク質が、ヒトにおいて一貫した影響に達するのに必要とされる。ＢＭＰの製造費用は概して高いため、このことは、治療費用が法外に高いことを意味する可能性がある。したがって、ＢＭＰは有効性を示し、そして骨誘導に対する実行可能な療法ではあるものの、より費用効率が高く、そしておそらくさらにいっそう治療的に有効であろう代替治療法を開発することが、有益であろう。
【０００５】
ＬＭＰの細胞内環境への送達は、魅力的な治療レジメンを提供する。これは、細胞に、ＬＩＭ石灰化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドをトランスフェクトすることによって、遂行することが可能であり、あるいは、標的細胞に、ＬＭＰのヌクレオチド配列を保有するウイルスベクターを感染させることによって、行うことが可能である。しかしながら、これら各々の技術には限界がある。プラスミドのトランスフェクションでは、細胞をトランスフェクションのために単離し、次いでトランスフェクション後に植え込むことが一般に必要となる。ウイルスの送達では、ウイルスの細胞への侵入を容易にするために、適切な受容体を標的細胞の表面に配置することが、一般に必要となる。
【０００６】
骨誘導タンパク質及びペプチドの使用、特に、細胞内メカニズムによって作用するこれらのタンパク質及びペプチドの使用に対して、多大な可能性がある。必要とされるのは、有効な細胞内骨誘導タンパク質及びペプチドを細胞内に送達する方法である。
【０００７】
発明の概要
本発明は、細胞透過性の骨誘導ポリペプチドを作製する方法を提供し、該方法は、骨誘導ポリペプチドが細胞透過性ポリペプチドとの融合タンパク質の一部として発現するように配置された、細胞透過性ポリペプチドと骨誘導ポリペプチドをコードする発現コンストラクトを、適切な宿主細胞に導入することを含む。発現コンストラクトは、融合産物をコードするポリヌクレオチド配列の転写を導くように配置されたプロモーターを、一般に含有する。
【０００８】
発現コンストラクトは、精製タグをさらに含んでもよい。細胞透過性ポリペプチドは、ＨＩＶ−ＴＡＴ、ＶＰ−２２、増殖因子のシグナルペプチド配列、Ｐｅｐ−１及びショウジョウバエＡｎｔｐペプチドからなる群より選択されてもよい。骨誘導ポリペプチドは、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１及びＳｍａｄからなる群より選択されてもよい。
【０００９】
本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８、またはその組み合わせからなる群の中から選択される骨誘導ポリペプチドを、提供する。
【００１０】
本発明はまた、哺乳動物において骨形成を誘導する方法であって、タンパク質導入ドメインと少なくとも一つの骨誘導ポリペプチドとを含む、有効量の融合ポリペプチドを投与することを含む方法を提供する。融合ポリペプチドは、移植片（インプラント）として投与されてもよく、そして、少なくとも一つの多能性前駆細胞に投与されてもよく、該細胞は、骨誘導を促進するために哺乳動物に植え込まれることが可能である。
【００１１】
本発明はまた、タンパク質導入ドメインと少なくとも一つの骨誘導ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供し、タンパク質導入ドメインは、例えばＨＩＶ−ＴＡＴ、ＶＰ−２２、増殖因子のシグナルペプチド配列、Ｐｅｐ−１及びショウジョウバエＡｎｔｐペプチドによって代表される、多様なタンパク質導入、膜移行、及びその他の同様なポリペプチドの中から選択される。骨誘導ポリペプチドは、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１及びＳｍａｄからなる群より選択されてもよい。
【００１２】
哺乳動物においてプロテオグリカン合成を誘導する方法もまた、提供される。該方法は、タンパク質導入ドメインと少なくとも一つの骨誘導ポリペプチドを含む有効量の融合ポリペプチドを投与することを含む。融合ポリペプチドは、移植片として投与されてもよく、そして、少なくとも一つの多能性前駆細胞に投与されてもよい。
【００１３】
骨誘導ポリペプチドと機能可能なように連結されている膜移行ペプチドを含む、単離された融合タンパク質が、本発明によって提供される。膜移行ペプチドは、ＨＩＶ−ＴＡＴ、ＶＰ−２２、増殖因子のシグナルペプチド配列、Ｐｅｐ−１及びショウジョウバエＡｎｔｐペプチドからなる群より選択されてもよく、そして骨誘導ポリペプチドは、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１及びＳｍａｄからなる群より選択されてもよい。
【００１４】
本発明は、前駆細胞において骨芽細胞への分化を誘導する方法を提供し、該方法は、タンパク質導入ドメインと少なくとも一つの骨誘導ポリペプチドとを含む有効量の融合ポリペプチドを前駆細胞に投与することを含む。タンパク質導入ドメインは、ＨＩＶ−ＴＡＴ、ＶＰ−２２、増殖因子のシグナルペプチド配列、Ｐｅｐ−１及びショウジョウバエＡｎｔｐペプチドによって代表される群から選択されることが可能であり、そして骨誘導ポリペプチドは、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１及びＳｍａｄによって代表される群から選択されてもよい。
【００１５】
詳細な説明
本発明者は、タンパク質導入ポリペプチドと骨誘導ポリペプチドを含む融合タンパク質を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて骨の発達及び椎間板再生を促進するために効果的に用いることが可能であることを、発見した。したがって、本発明は、細胞内へ送達するための骨誘導ポリペプチド、このような骨誘導ポリペプチドとタンパク質導入配列をコードするポリヌクレオチド、ならびに、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて骨の発達及び椎間板再生を促進するのにこれらの融合タンパク質を利用する方法を、提供する。
【００１６】
以前の研究により、ＬＩＭ石灰化タンパク質のスプライスバリアント１及び３（ＬＭＰ−１及びＬＭＰ−３）は骨誘導性であるが、ＬＭＰ−２はこのような骨誘導の可能性を有するようにはみえないことが、実証された。ヒトＬＭＰ−１（ｈＬＭＰ−１）のアミノ酸配列のアミノ酸９４〜１３３に相当する４０アミノ酸配列は、ＬＭＰ−１及びＬＭＰ−３の双方に共通している。したがって、発明者は、このタンパク質のこの特有な領域自体が、骨誘導の可能性を有するのではないかと推測した。この配列の重複セグメントを含むペプチドを設計し、そして、これを用いて発明者の仮説を検証した。その結果、ＬＭＰ−１及びＬＭＰ−３由来のペプチドが、骨誘導の可能性を有することが、示唆される。これらのペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて用いた場合に、骨形成誘導能を示した。図６は、本発明の方法において、本発明の融合タンパク質の一部として細胞内に導入された場合に、骨誘導の機能性を示したペプチドを示す。
【００１７】
ＬＭＰ−１を発現している細胞を胸椎及び腰椎に植え込むと、無胸腺ラットにおいて堅固な脊椎融合がもたらされることが、発明者によって示された。本明細書において開示された結果により、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８によって提供されるペプチドなどの、ＬＭＰ−１及びＬＭＰ−３ペプチドもまた、ＬＭＰ−１について実証された骨誘導の利益を提供することが、実証される。
【００１８】
骨形態形成タンパク質が、ヒトにおいて一貫した効果を発揮するには、概して、非常に高用量が必要とされる。ＰＴＤ融合タンパク質によるＬＭＰ−１の細胞内への送達は、本明細書に記載されるように、より費用効率的な治療の選択肢を提供する。さらに、これまでの結果により、ＬＭＰ−１、及びＬＭＰ関連骨誘導ペプチドが、細胞内で作用して諸因子のカスケードを誘導し、天然の骨誘導経路を活性化することが、示唆される。
【００１９】
タンパク質導入ポリペプチドは、核酸配列または治療用タンパク質の取り込み、及びそれに続く発現を、容易にする。文献において、これらは、代替的に、そしてしばしば同義的に、細胞透過性ペプチド、タンパク質導入ドメイン、膜輸送配列及び膜移行ペプチドと称されてもよい。これらは、付属するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を、受容体とは独立に、細胞膜を介して細胞内部に輸送する働きをする。タンパク質導入ドメインを利用する融合タンパク質は、タンパク質導入ドメインと機能可能なように連結されている、１またはそれより多くのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含むことが可能である。本発明において、このような融合タンパク質は、タンパク質導入ドメインと少なくとも一つの骨誘導ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、あるいはその組み合わせを含むことが可能である。これらのペプチドを用いて、外胚葉、間葉または造血を起源とする自己、同種異系または異種の細胞あるいは組織に形質導入し、そして、新たな組織の形成を誘導または助長するためにこれをレシピエントに注入または植え込むことが可能である。本発明の方法において、このようなポリペプチドは、例えば多能性前駆（幹）細胞などの細胞を、例えばＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、アグリカン、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、バーシカン、ルミカン、フィブロモジュリン、ビグリカン及びデコリンを産生するよう誘導することが可能なタンパク質の取り込みを、容易にする。本発明のポリペプチドの有効量を、実験デザイン及び本明細書に開示した結果において示すが、しかし、本明細書にて提供される有効量の開示をもとに、当業者が決定してもよい。
【００２０】
ＬＭＰタンパク質ファミリーの一つである、ヒトＬＩＭ石灰化タンパク質−１（ｈＬＭＰ−１）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて骨石灰化の有効性を増強することができる細胞内調節タンパク質である。ヒトＬＭＰ−１は、アミノ酸スペーサーによって連結された二つの特別なジンクフィンガーから構成される特徴的な構造モチーフを有するため、このように称される。ＬＩＭ石灰化タンパク質のスプライスバリアント及びそれらの使用については、米国特許第6,300,127；6,444,803；及び6,521,750において、発明者によって記載されている。ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−２及びＬＭＰ−３の配列もまた、これらの特許において公開されている。１９９７年７月２２日に、指定されたベクターｐＣＭＶ２／ＲＬＭＰ（挿入断片１０−４クローン／ＲＬＭＰを有するベクターｐＲｃ／ＣＭＶ２である）中の、１０−４／ＲＬＭＰ（ドブネズミＬＩＭ石灰化タンパク質のｃＤＮＡ）の試料を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）（12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852）に寄託し、そして受入番号２０９１５３を割り当てられた。１９９８年３月１９日に、挿入断片ＨＬＰＭ−１ｓ（ホモサピエンスＬＩＭ石灰化タンパク質のｃＤＮＡ）を有するベクターｐＨｉｓ−Ａの試料を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託し、そして受入番号２０９６９８を割り当てられた。
【００２１】
血清型５型のアデノウイルス（Ａｄ５）は、末梢血及び骨髄由来細胞を含む多様な細胞及び組織にＬＭＰを送達するために、使用されている。（Bodenら、「Adenoviral Delivery of LMP-1 Induces Consistent Spine Fusion」、第47回年会、Orthopaedic Research Society、サンフランシスコ、カリフォルニア州（2001年））。しかしながら、Ａｄ５ウイルスは、特異的な受容体（すなわち、コクサッキーアデノウイルス受容体またはＣＡＲ）を利用するが、これは、これらの細胞において存在しないかまたは限られた量にて存在する。受容体を介したメカニズムなしにタンパク質の細胞内への送達を容易にする、細胞膜を介したタンパク質導入は、多様な種類の細胞及び組織の処理を可能にする魅力的な代替手段を、提示する。
【００２２】
ＬＭＰ及び他の骨誘導性タンパク質の作用は、脳、脊髄、末梢神経、骨、軟骨、椎間板、結合組織、腱及び靭帯などの多様な組織において、これらが治療の可能性を有することを、示唆する。ＬＭＰの、例えば多様な組織への送達は、例えばコラーゲン、コラーゲンとセラミックとの組み合わせ、脱石灰化骨基質、ならびに、天然または合成ポリマー類（エラスチン、フィブリン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、フマル酸ポリプロピレン、ポリビニルアルコール、ポリエステル類、ポリエーテル類、ポリヒドロキシル類など）、ならびに構造的移植片を含む送達システムによって、遂行されることが可能である。このような基質は、注射可能で成型可能な固形移植片、構造的移植片、またはその組み合わせであってもよい。
【００２３】
本発明者は、機能性骨誘導タンパク質を細胞内に送達し、そして骨形成及びプロテオグリカン合成を効率的に誘導するのに、ＰＴＤを用いることが可能であることを、発見した。このような細胞透過性ペプチド移入（ＣＰＰＩ）は、骨誘導タンパク質を多様な細胞種類に送達するための方法を、提供する。元来はＨＩＶ−１ ＴＡＴタンパク質に由来する１１アミノ酸ペプチドを用いて、骨誘導タンパク質を細胞内に送達することに成功した。ＴＡＴペプチドを、ｐＴＡＴ−ＨＡベクターを用いて、細菌細胞において過剰発現させることが可能である。リコンビナントヒト遺伝子を、ＴＡＴペプチド配列と目的の遺伝子産物の双方を含有する融合タンパク質を産生させるように、このベクター中に挿入することが可能である。さらに、ＰＴＤ／骨誘導ポリペプチドを、融合タンパク質の単離及び精製を容易にするために、ｐｏｌｙＨｉｓタグと連結して発現させることが可能である。ｐＴＡＴ−ＨＡベクター、及び、ＴＡＴ融合タンパク質の精製プロトコールについては、以前にNagaharaら（Nature Medicine 第4巻，1449〜1452頁、1998年12月）によって記載されている。
【００２４】
多様なＰＴＤにおいて見つけられるペプチド配列は、コクサッキー−アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）とは独立に、細胞内への侵入を容易にすることが可能であり、それによって標的細胞への導入効率を改良し、続いて、所望の効果に達するのに必要な核酸またはタンパク質の必要量を低減させる。したがって、ＰＴＤ融合タンパク質は、治療費用を低下させるのに用いられてもよい治療ツールを、提供する。
【００２５】
本発明の一つの態様において、タンパク質導入ドメインと骨誘導タンパク質との融合タンパク質が、提供される。骨誘導タンパク質としては、これに限定されるものではないが、ＬＩＭ石灰化タンパク質（ＬＭＰ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）及びＳｍａｄタンパク質が挙げられる。本明細書では、「骨誘導タンパク質」、「骨誘導ポリペプチド」及び「骨誘導ペプチド」は、骨誘導の機能性を有する、様々な長さのペプチドまたはポリペプチド、あるいは完全長タンパク質のいずれかを指すのに、同義的に用いられてもよい。
【００２６】
ＰＴＤとＬＩＭ石灰化タンパク質を含む融合タンパク質は、本発明の一つの態様として提供される。融合タンパク質は、ＰＴＤと１またはそれより多くのＬＩＭ石灰化タンパク質またはポリペプチドを含むことが可能である。有用なＬＩＭ石灰化タンパク質としては、例えば、米国特許第6,300,127；6,444,803；及び6,521,750；ならびに、係属中の米国特許出願第09/959,578（２０００年４月２８日出願）において開示されるようなＬＭＰが挙げられる。好ましくは、ＬＭＰは、ＲＬＭＰ、ＨＬＭＰ−１、ＨＬＭＰ−１ｓ、ＨＬＭＰ−２、ＨＬＭＰ−３またはそれに由来するペプチドである。これらのペプチドは、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または、配列番号８にあるようなポリペプチドを含むことが可能である。
【００２７】
ＬＩＭ石灰化タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、好ましくは、完全長の以下配列：
ｔｃｃｔｃａｔｃｃｇ ｇｇｔｃｔｔｇｃａｔ ｇａａｃｔｃｇｇｔｇ
に相補的な核酸分子と、標準的な条件下でハイブリダイズするか、または、完全長の以下配列：
ｇｃｃｃｃｃｇｃｃｃ ｇｃｔｇａｃａｇｃｇ ｃｃｃｃｇｃａａ
に相補的な核酸分子と、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか、あるいはその双方である。
【００２８】
「標準的なハイブリダイゼーション条件」は、プローブのサイズ、背景及び核酸試薬の濃度、ならびにハイブリダイゼーションの種類（ｉｎ ｓｉｔｕ、サザンブロット、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのハイブリダイゼーション（ノーザンブロット））によって変わるであろう。「標準的なハイブリダイゼーション条件」の決定は、当該技術分野における技能水準の範囲内にある。方法としては、例えば、米国特許第5,580,775（Fremeauら）、Southern, J. Mol. Biol., 98:503（1975年）、Alwineら、Meth. Enzymol., 68:220（1979年）、及び、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第２版、コールドスプリングハーバー・プレス、7.19-7.50（1989年）に記載されるものが挙げられる。
【００２９】
１セットの標準的なハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミド、５Ｘ ＳＳＰＥ（１５０ｎＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４［ｐＨ７．４］、１ｍＭ ＥＤＴＡ［ｐＨ８．０］）、５Ｘデンハート液（１００ｍｌの水につき、フィコール２０ｍｇ、ポリビニルピロリドン２０ｍｇ、及びＢＳＡ ２０ｍｇ）、１０％硫酸デキストラン、１％ＳＤＳ、及び１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ中で、４２℃にて２時間、ブロットをプレハイブリダイズすることを、含む。３２Ｐ−標識ｃＤＮＡプローブを加え、そしてさらにハイブリダイゼーションを１４時間続ける。その後、ブロットを、２Ｘ ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中で、２２℃にて２０分間、２回洗浄し、続いて、０．１Ｘ ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中で、６５℃にて１時間洗浄する。次いで、ブロットを乾燥させ、そして増感スクリーンの存在下でＸ線フイルムに５日間曝露する。
【００３０】
「高ストリンジェントな条件」下では、プローブはその標的配列と、これら二つの配列が実質的に同一であるならば、ハイブリダイズするであろう。実質的に同一の配列のみがハイブリダイズし、非同一配列がハイブリダイズしないであろう条件を決定するための技術は、当業者に公知である。
【００３１】
本明細書では、「タンパク質」の語は、ミメティック（類似体、模倣物）を含むことを意図し、そして「アミノ酸」の語は、Ｌ型アミノ酸、Ｄ型アミノ酸及び修飾アミノ酸を含むことを意図している。これらの代替品は、分子間の既知の構造類似性を用いて、当業者が作製してもよい。また、アミノ酸配列には、記載された配列のＮ末端またはＣ末端のいずれか、あるいは両方に追加のアミノ酸を含んでもよい、任意のペプチドまたはタンパク質配列を含まれることが、意図される。「骨誘導タンパク質」の語は、完全長タンパク質のみならず、バリアントまたは生物学的に活性なポリペプチド断片も含むことが、意図される。
【００３２】
一つのアミノ酸が、１より多いヌクレオチドコドンによってコードされてもよく、そしてヌクレオチド配列が、同一ペプチドをコードする代替のヌクレオチド配列を作り出すために修飾されてもよいことは、当該技術分野において周知である。したがって、本発明の代替の態様には、先に記載されたようなアミノ酸配列を含有するペプチドをコードする、代替のＤＮＡ配列が、含まれる。特許請求の範囲にあるアミノ酸配列を含有するペプチドをコードする、ＤＮＡ配列は、特許請求の範囲にある配列と、特許請求の範囲にあるアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に位置する他のアミノ酸との、任意の組み合わせをコードするＤＮＡ配列を、含む。当然のことながら、アミノ酸及び核酸配列は、追加の残基、特にＮまたはＣ末端アミノ酸、あるいは５’または３’核酸配列を含んでもよく、そして、該配列は、発現したポリペプチドまたはタンパク質に骨誘導の可能性を授与する限り、本質的には、本明細書にて開示される配列に、なお記載されてもよい。
【００３３】
追加の核酸塩基を、骨誘導ポリペプチドをコードする核酸配列の５’または３’のいずれかに加えてもよく、そして、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、多重クローニング部位、他のコードセグメント等などの他のＤＮＡ配列と、組み合わせてもよい。したがって、このようなポリヌクレオチドの全体的な長さは、かなり変わってもよい。
【００３４】
当然のことながら、ポリペプチドの「バリアント」は、天然のタンパク質とは完全に同一ではない。骨誘導ポリペプチドまたはタンパク質のバリアントは、例えば、１またはそれより多くのアミノ酸を挿入、欠失または置換することによりアミノ酸配列を変えることによって、得ることが可能である。ポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列を、例えば、置換によって修飾して、天然ポリペプチドと比べて同一または改良された質を実質的に有するポリペプチドを作り出すことが、可能である。置換は、保存的置換であってもよい。「保存的置換」とは、アミノ酸を、極性／非極性の性質、電荷またはサイズにおいて類似した側鎖を有する別のアミノ酸に置換することである。２０の必須アノミ酸は、非極性側鎖を有するもの（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン及びトリプトファン）、非荷電性極性側鎖を有するもの（メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、シスチン、チロシン、アスパラギン及びグルタミン）、酸性側鎖を有するもの（アスパラギン酸及びグルタミン酸）、及び塩基性側鎖を有するもの（リジン、アルギニン及びヒスチジン）として分類されることが可能である。保存性置換には、例えば、ＡｓｐをＧｌｕ、ＡｓｎまたはＧｌｎに；ＨｉｓをＬｙｓ、ＡｒｇまたはＰｈｅに；ＡｓｎをＧｌｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕに；及び、ＳｅｒをＣｙｓ、ＴｈｒまたはＧｌｙに置換することが含まれてもよい。例えば、アラニンは、保存的置換を行うのにしばしば用いられる。
【００３５】
当業者は、バリアントポリペプチドを、生物学的活性に影響を及ぼすために、ポリペプチド構造中の１またはそれより多くの位置において第一のアミノ酸を第二のアミノ酸に置換することによって、得ることが可能である。アミノ酸置換は、例えば、生物学的活性の増加をもたらすポリペプチドの立体構造変化を誘導する可能性がある。
【００３６】
当業者はまた、アミノ酸の親水性指数または疎水・親水性指数に基づいて、アミノ酸配列における置換を行ってもよい。したがって、本発明のバリアントアミノ酸分子は、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−２、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、あるいは、配列番号８にあるようなポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列と、１００％よりは少ないが、しかし少なくとも約５０％、そして好ましくは少なくとも約８０％〜約９０％の、アミノ酸配列相同性または同一性を有する。したがって、バリアント骨誘導ポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列は、本質的には、天然の骨誘導ポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列に相当する。本明細書では、「本質的には〜に相当する」の語は、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−２、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、あるいは、配列番号８にあるようなポリペプチドを含む骨誘導ポリペプチドまたはタンパク質によって生じる活性に類似した、生物学的活性及び酵素活性を誘発するであろうポリペプチド配列に向けたものであり、このような活性は、天然の骨誘導タンパク質の少なくとも約７０％であり、そしてより好ましくは、天然の骨誘導タンパク質活性の１００％を超える。
【００３７】
骨誘導タンパク質のバリアントには、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−２、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８を含む骨誘導タンパク質を含む、相当する骨誘導タンパク質中には存在しないアミノ酸残基が含まれてもよく、あるいは、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−２、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８を含む骨誘導タンパク質と比べて、欠失が含まれてもよい。バリアントはまた、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−２、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８を含む、相当するタンパク質と比べて、切断された「断片」であってもよく、該断片は、完全長のタンパク質またはポリペプチドのほんの一部である。
【００３８】
骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）は、タンパク質のＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーである。ＢＭＰは、異所性骨または軟骨形成を誘導することが示されている。本発明にしたがって、ＰＴＤと骨形態形成タンパク質との融合タンパク質もまた、提供される。ＢＭＰとしては、例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−３ｂ、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−８及びＧＤＦ−９が挙げられる。骨形態形成タンパク質であるＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８またはＢＭＰ−９は、本発明の方法において、特に有用である可能性がある。
【００３９】
Ｓｍａｄタンパク質は、細胞外ＴＧＦ−β関連因子の受容体からのシグナル伝達を媒介する、細胞内タンパク質である（Heldinら、”TGF-β Signalling from Cell Membrane to Nucleus through SMAD Proteins”、Nature、第390巻（1997年））。Ｓｍａｄタンパク質は、ＢＭＰがその受容体に結合することによって、活性化される（すなわち、リン酸化される）ことが可能である。活性化されると、Ｓｍａｄタンパク質は、それが遺伝子発現を調節する場所である核に移行する。ＰＴＤとＳｍａｄタンパク質との融合タンパク質もまた、本発明において提供される。Ｓｍａｄ−１、Ｓｍａｄ−２、Ｓｍａｄ−３、Ｓｍａｄ−４、Ｓｍａｄ−５、Ｓｍａｄ−６、Ｓｍａｄ−７またはＳｍａｄ−８は、本発明におけるようなタンパク質導入ドメインとの融合タンパク質として送達される場合、骨誘導を促進するのに特に有用である可能性がある。
【００４０】
本発明にしたがったタンパク質導入ドメインは、付属もしくは付随のタンパク質、ペプチドまたは核酸を細胞内部に送達するために、細胞の原形質膜を越えることが可能な、任意のペプチド、ミメティック、またはペプチドの核酸（ＰＮＡ）配列であることが可能である。発明者は、骨誘導タンパク質を、骨誘導及びプロテオグリカン合成を促進する能力を損なうことなく、細胞内に（例えば、融合タンパク質の一部分として）送達可能であることを、実証した。ＰＴＤとしては、例えば、ショウジョウバエのホメオティック転写因子であるアンテナペディア（Ａｎｔｐ）由来のポリペプチド、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）タンパク質ＶＰ２２、カポジ線維芽細胞増殖因子（Ｋ−ＦＧＦ）などの増殖因子由来シグナルペプチド配列（Linら、J. Biol. Chem.、第270巻、14255〜14258頁、1995年）、Ｋ−ＦＧＦシグナルペプチド配列由来の膜移行配列（Rojasら、Nat. Biotech.、第16巻、370〜375頁、1998年）、及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）−１転写活性化因子ＴＡＴ（Fawellら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第91巻、664〜668頁、1994年）が挙げられる。ＰＴＤについては、米国特許第5,652,122、及びSchwarzeら、「Protein Transduction: Unrestricted Delivery into all Cells」、Trends in Cell Biology、第10巻（2000年）において、開示されている。発明者は、ＨＩＶ−ＴＡＴのＰＴＤが本発明において特に有用であることを、見いだした。
【００４１】
プロモーターと機能可能なように連結されている、融合タンパク質（タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）と骨誘導タンパク質を含む）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸もまた、提供される。該核酸は、ベクター（例えば、プラスミドなどの発現ベクター）の一部であることが可能である。骨誘導タンパク質は、例えば、ＬＩＭ石灰化タンパク質、骨形態形成タンパク質、Ｓｍａｄタンパク質及び骨誘導ペプチド、ならびにそれに由来するポリペプチドを含むことが可能である。骨誘導ペプチド及びポリペプチドの例としては、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８が挙げられる。
【００４２】
骨誘導タンパク質を細胞内に送達する方法もまた、本発明によって提供される。本発明の方法において、少なくとも一つの骨誘導タンパク質を、導入によって細胞内に送達することが可能であり、ここで、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）と骨誘導タンパク質を含む融合タンパク質は、融合タンパク質が細胞内に送達されるように細胞と接触し、タンパク質導入ドメインまたは細胞透過性ペプチドによって、その送達が容易となる。
【００４３】
骨誘導タンパク質を送達可能な細胞としては、例えば、骨（すなわち、骨形成）及び非骨細胞が挙げられる。このような細胞は、例えば、軟膜細胞、幹細胞（例えば、間葉幹細胞、多能（multipotent）性及び多分化性（pluripotent）幹細胞）、椎間板細胞（disc cell）（例えば、線維輪細胞（nucleus cell）及び髄核細胞（annulus cell））、間葉細胞、造血性細胞、内皮細胞及び筋細胞を含んでもよい。幹細胞は、自己または同種異系の組織由来であることが可能である。
【００４４】
タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）と骨誘導タンパク質との融合タンパク質を導入されているかまたはこれを発現する細胞もまた、提供される。このような細胞は、これに限定されないが、軟膜細胞、幹細胞（例えば、間葉幹細胞及び多分化性（pluripotential）幹細胞）、椎間板細胞（例えば、線維輪細胞及び髄核細胞）、間葉細胞、造血性細胞、内皮細胞及び筋細胞を含んでもよい。本明細書において記載されるような、ＰＴＤと骨誘導タンパク質との融合タンパク質を含有する細胞は、哺乳動物体内に植え込まれて、骨形成を誘導することが可能である。ＬＭＰを骨誘導タンパク質として用いた骨形成誘導法については、例えば、米国特許第6,300,127に記載されている。例えば、２００２年１１月１３日に出願され、係属中の米国特許第10/292,951に記載のように、ＰＴＤと骨誘導タンパク質との融合タンパク質を含む細胞を、椎間板内に植え込んで、プロテオグリカン及び／またはコラーゲン合成を刺激してもよい。
【００４５】
ＰＴＤと、骨誘導タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸との複合体もまた、提供される。ＰＴＤ／核酸複合体を、例えば、骨形成または椎間板再生を促進するために、骨誘導タンパク質の過剰発現を導くのに用いることが可能である。ヌクレオチド配列によってコードされる骨誘導タンパク質は、これに限定されないが、ＬＭＰ、ＢＭＰ及びＳｍａｄタンパク質を含むことが可能である。ペプチドを核酸と化学的に結合させるための方法は、当該技術分野において公知である。一つのこのような方法は、米国特許第5,652,122に記載されている。核酸は、プロモーターと機能可能に連結されている骨誘導タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、発現ベクターの形であることが可能である。
【００４６】
本発明の方法を、１またはそれより多くの骨形態形成タンパク質の発現、または、２００３年３月７日に出願された同時係属中の米国特許出願第10/382,844に記載されるように、増殖因子−βタンパク質の細胞内での形質転換を誘導するのに、用いることが可能である。例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１及びその組み合わせからなる群より選択される、１またはそれより多くのタンパク質の発現は、細胞を、ＰＴＤと骨誘導タンパク質を含む融合タンパク質と本発明にしたがって接触させることにより、誘導可能である。加えて、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１及びその組み合わせからなる群より選択される、１またはそれより多くのタンパク質を過剰発現する細胞もまた、本発明にしたがって提供される。細胞は、非限定的に、幹細胞、軟膜細胞、骨髄細胞、末梢血細胞または脂肪細胞を含む、任意の体細胞であることが可能である。細胞は、自己または同種異系組織に由来する幹細胞であることが可能である。
【００４７】
腎臓においては、例えば、細胞を、本発明において記載されるようなＰＴＤ／ＬＭＰ融合ポリペプチドの投与によって刺激して、ＢＭＰ−７を産生させてもよく、あるいは、幹細胞を、ＰＴＤ／ＬＭＰ融合ポリペプチドで処理して、これにＢＭＰ−７の発現を誘導させてもよい。ひとたび腎臓に移植されるならば、そのＢＭＰ−７産生は、外因性ＢＭＰ−７の投与を介してこれまで利用可能でなかった治療効用を提供することが可能である。ＢＭＰ−７は、慢性腎障害の回復に関連した、重度に損傷した腎尿細管上皮細胞の修復を、誘導する（Zeisbergら、Nat. Med. 9:964-968、2000年）。マウスにおいて、ＢＭＰ−７を投与することによって、慢性腎疾患の一合併症である無形成骨障害の治療に成功したことが、報告されている（Lundら、J Am Soc Nephrol 15(2):359-369、2004年）。慢性腎障害及び線維症のマウス遺伝モデルにおいて、外因性ヒトリコンビナントＢＭＰ−７の投与は、腎機能及び生存性を向上させた（Zeisbergら、Am J Physiol Renal Physiol 285(6):F1060-7、2003年）。ＢＭＰ−７が、糖尿病誘導性の腎肥大を部分的に回復させることもまた、示されている（Wangら、Kidney Int 63(6):2037-2049、2003年）。Daviesらは、ＢＭＰ−７の欠損が、慢性腎不全における病態生理学的因子であると、判断した（J Am Soc Nephrol 14(6):1559-1567、2003年）。これらの試験は、ＬＭＰ−１が細胞によるＢＭＰ−７産生を誘導し、そしてＬＭＰペプチド（配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８）がＬＭＰ−１タンパク質と同じように機能するという、発明者による発見と併せて、タンパク質導入ドメインとＬＭＰ−１もしくはＬＭＰ−３タンパク質または関連ペプチドを含む融合ポリペプチドが、腎疾患の治療において有効である可能性があることを、実証する。本発明の融合ポリペプチドを用いてＢＭＰ−７の発現を誘導された幹細胞は、この目的に対して特に有用である可能性がある。
【００４８】
ＢＭＰ−４及びＢＭＰ−７もまた、ヒト骨髄腫細胞において、増殖を阻害し、そしてアポトーシスを誘導することが示されている。ＢＭＰの治療への使用は、骨髄腫の骨疾患及び骨髄腫細胞の増殖に対して、提案されている。本発明の方法は、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−３、または、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８を含むペプチドを、例えば注射、移植片、またはＰＴＤ／ＬＭＰ融合ポリペプチドで処理された幹細胞の植え込みによって投与することにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＢＭＰ−４とＢＭＰ−７双方の産生を刺激する方法を、提供する。幹細胞移植片を、植え込み型薬物送達装置などのＰＴＤ／ＬＭＰ源とともに組み合わせると、特に有効である可能性がある。
【００４９】
幹細胞または多能性前駆細胞は、骨芽細胞を作り出す細胞源を提供することが可能である。これらの細胞を、種々の分化段階において単離し、そして特定系統の経路にて分化を誘導してもよい。細胞を、骨粗鬆症または骨形成不全症などの骨疾患、ならびに非治癒骨折を治療するのに用いてもよい。核結合因子α１（Ｃｂｆａ１）は、骨形成に必要であることが実証されている。ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４及びＢＭＰ−７は、骨芽細胞の分化を誘導することが知られており、Ｃｂｆａ１の発現を亢進させる。ＢＭＰ−８及びＳｍａｄ−３は、骨芽細胞の分化中に亢進している。ＴＧＦ−β／ＢＭＰ−Ｓｍａｄのシグナル伝達の活性化は、Ｃｂｆａ１の発現及び骨芽細胞の分化を促進することが、示されている。本発明は、例えば、ヒト骨髄由来中胚葉前駆細胞などの細胞において骨芽細胞の分化を促進するために、機能性ＢＭＰ、ＬＭＰ、Ｓｍａｄタンパク質またはその組み合わせを含む融合タンパク質を提供する。適切な細胞には、例えば、Jiangら（Nature、第418巻、41〜49頁、2002年）によって記載された細胞のような、多能性細胞が含まれてもよい。適切な骨誘導タンパク質またはポリペプチド、あるいはその組み合わせの投与は、細胞を植え込む前にｅｘ ｖｉｖｏで、あるいは、植え込みまたは注射後にｉｎ ｖｉｖｏで、行うことが可能である。
【００５０】
Ｉｎ ｖｉｖｏ投与に関して、本発明の骨誘導タンパク質を、例えばＰＴＤまたは細胞透過性ペプチドによって近隣の細胞の内部に送達可能なように、標的部位に注射することが可能である。あるいは、ＰＴＤ／骨誘導ポリペプチドと組み合わせたキャリアーを含む移植片を、用いてもよい。移植片は、周囲組織に放出するためにＰＴＤ／骨誘導ポリペプチドを入れる貯蔵所を含有してもよく、あるいは、１またはそれより多くのＰＴＤ／骨誘導ポリペプチドコンストラクトを含有する溶液中に浸された多孔性の組成物を含んでもよい。ヒドロゲル、持続放出カプセルもしくは球（spheres）、リポソーム、ミクロスフェア、ナノスフェア、生分解性ポリマー、または他のこのような薬物送達システムもまた、本発明のペプチド及びタンパク質を標的細胞及び組織に送達するのに用いられてよい。例えば、米国特許第6,475,516（DiCosmoら）は、抗生物質などのリポソーム治療剤が詰め込まれたヒドロゲルを提供し、該ヒドロゲルは、移植片などの留置された医療装置の表面と共有結合している。
【００５１】
椎間板変性の特徴は、椎間板においてプロテオグリカン類、特に硫酸化グリコサミノグリカン類（ｓＧＡＧ）及びアグリカンの産生が減少することである。椎間板の主要なプロテオグリカンであるアグリカンの産生速度の減少は、椎間板変性における重要な要素である。椎間板の機能においてプロテオグリカン類は中心的な役割を果たすため、椎間板の正常なプロテオグリカン産生を回復させることは、椎間板変性のいかなる生物学的治療においても、非常に重要である可能性がある。
【００５２】
発明者は、ＬＭＰ−１の過剰発現または細胞内投与が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて椎間板細胞のプロテオグリカン産生を増加させることを実証する実験を、行った。ＬＭＰ−１の過剰発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７のｍＲＮＡの亢進を誘導する。これらのＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７を特異的に阻害するノギンは、ＡｄＬＭＰ−１によるプロテオグリカンの亢進を阻害し、このことは、ＬＭＰ−１によって誘導されるプロテオグリカンの亢進が、ＢＭＰの亢進によって媒介されることを示唆する。したがって、遺伝子治療またはタンパク質治療によるＬＭＰ−１の投与（例えば、ＰＴＤ複合体による送達）を、椎間板におけるプロテオグリカンの産生を刺激し、そして椎間板再生において治療的な役割を果たすのに用いることが可能である。
【００５３】
ＴＧＦ−β１、ＩＧＦ−１及びＥＧＦなどのサイトカイン類は、椎間板細胞の有糸分裂、及びある程度プロテオグリカン産生を刺激することが示されている。ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７などの他のサイトカイン類もまた、プロテオグリカン産生を刺激するのに有効であることが示されている。しかしながら、サイトカイン類は小さな水溶性分子であるため、これらは椎間板から急速に拡散して出て行くか、または他の調節因子によって不活化される。
ＬＩＭ石灰化タンパク質−１（ＬＭＰ−１）は、白血球及び骨芽細胞から複数の異なるＢＭＰの分泌を誘導することが知られている、細胞内調節分子である。ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−２、ＬＭＰ−３、あるいはＬＭＰ−１またはＬＭＰ−３由来骨誘導ペプチド、あるいはその組み合わせを、特にＰＴＤ／核酸複合体によって細胞内に送達することによって、ＢＭＰ産生を細胞内部から刺激することが可能である。適切な骨誘導ペプチドは、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または、配列番号８にあるようなポリペプチドを含む。
【００５４】
本発明は、以下の限定されない実施例を参照することによって、より十分に理解されるだろう。
（実施例）
ＨＩＶ−Ｔａｔのタンパク質導入ドメインとＬＭＰ−１タンパク質を含む、（Ｈｉｓ）６ＴＡＴ−ＬＭＰタンパク質複合体の合成及び使用について、以下に記載する。ｐＴＡＴ−ＨＡ−ベクターを、ワシントン大学（セントルイス、ミズーリ州）から、物質譲渡契約（material transfer agreement）に基づいて得た。
【００５５】
ｐＣＤＮＡ３．１／ｈＬＭＰ−１を以下のプライマー：
正：５’−ＣＣＡＴＧＧＡｆｌＣＣｆｌＣＡＡＡＧＴＡＧＴＧＣ−３’
逆：５’−ＣＡＧＧＧＣＧＧＧＣＧＧＣＴＧＧＴＡＧ−３’
を用いたＰＣＲの鋳型として利用することによって、ＮｃｏＩ制限酵素部位を、ｈＬＭＰ−１の５’末端に付加した。反応を、９５℃にて２分間［９５℃、３０秒間；６６℃、３０秒間；７２℃、１分間］ｘ２５、及び７２℃にて１０分間、行った。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社）中にクローニングし、そして適切なクローンを、配列決定によって同定した。
【００５６】
（Ｈｉｓ）６ＴＡＴ−ＬＭＰベクターの構築を、ＮｃｏＩ及びＣｌａＩを用いてプラスミドクローンを制限エンドヌクレアーゼ消化し、そしてその結果として得られた産物をアガロースゲル電気泳動及び電気溶出によって精製することにより、行った。ｈＬＭＰ−１の完全長配列を、ＣｌａＩ及びＥｃｏＲＩを用いてｐＣＤＮＡ３．１／ｈＬＭＰ−１ベクターを制限酵素消化し、そしてその結果として得られた産物をアガロースゲル電気泳動及び電気溶出によって精製することにより、単離した。ｐＴＡＴ−ＨＡ−ベクターもまた、ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素消化を受け、そしてその結果として得られた線状化ベクターを、アガロースゲル電気泳動及び電気溶出によって精製した。次いで、産物を、標準的な手順によって、１６℃にて一晩かけて連結させた。正しく連結された産物（５’ｈＬＭＰ−１＋３’ｈＬＭＰ−１＋線状化ｐＴＡＴ−ＨＡ−ベクター＝（Ｈｉｓ）６ＴＡＴ−ＬＭＰベクター）を、続いて行ったアガロースゲル電気泳動及び分子量決定によって、決定した。
【００５７】
連結された産物を、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞にトランスフェクトし、そして適切なクローンを制限酵素解析によって同定した。
（Ｈｉｓ）６ＴＡＴ−ＬＭＰタンパク質の合成及び回収
（Ｈｉｓ）６ＴＡＴ−ＬＭＰ融合コンストラクトの陽性クローンを含有する、適切なＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ）コロニーを、０．８ＯＤ（６００ｎｍ）まで増殖させ、そしてタンパク質産生を、１００μＭのＩＰＴＧで３７℃にて４時間誘導した。誘導された細胞を標準的な方法によって回収し、そして超音波処理（４ｘ２０秒、それぞれ２分間の休止期間を伴う、４℃）によって溶解した（２０ｍＭ ＰＯ４バッファー、ｐＨ７．２、８Ｍ尿素、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）。
【００５８】
溶解物を、遠心分離（１００００ｘｇ）によって澄明にし、そしてその結果として得られた上清を、Ｎｉ２＋セファロースアフィニティカラム（インビトロジェン社）に、重力流の条件下で載せた。カラムを洗浄し（２０ｍＭ ＰＯ４バッファー、ｐＨ６．０、８Ｍ尿素、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）、次いで、結合しているタンパク質を溶出させた（２０ｍＭ ＰＯ４バッファー、ｐＨ４．０、８Ｍ尿素、５００ｍＭ ＮａＣｌ）。
【００５９】
溶出物を、０％バッファーＢから１００％バッファーＢまでの直線勾配（バッファーＡ：２０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ１１、８Ｍ尿素；バッファーＢ：２０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ１１、８Ｍ尿素、２Ｍ塩化ナトリウム）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィ（Ｈｉｔｒａｐ Ｑ ＨＰ、５ｍＬ、ファルマシア社）にかけた（５ｍＬ／分にて４０分間）。溶出画分（５ｍＬ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット解析によって、ｈＬＭＰ−１の存在について解析した。
【００６０】
ｈＬＭＰ−１陽性画分を、疎水性相互作用クロマトグラフィ（Ｈｉｔｒａｐ（商標登録）フェニル−セファロース、５ｍＬ、ファルマシア社）にかけた。溶出（バッファーＡ：２０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ１０．５、１．５Ｍ硫酸アンモニウム；バッファーＢ：２０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ１０．５）を、０％〜１００％のバッファーＢの直線勾配で、５ｍＬ／分にて２０分間行った。溶出画分（５ｍＬ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット解析によって、ｈＬＭＰ−１の存在について解析した。（Ｈｉｓ）６ＴＡＴ−ＬＭＰ融合タンパク質に陽性の画分を、使用時まで凍結乾燥させておいた。
【００６１】
新規の骨形成のための（Ｈｉｓ）６ＴＡＴ−ＬＭＰ融合タンパク質の使用
凍結乾燥させた画分（５５ｐｇ）を、４０ｍＭ ＫＯＨ中に再懸濁した（ストック溶液；１．０μＭ）。ヒト軟膜細胞を、Viggeswarapuら、J.Bone Joint Surg.、第83(3)巻、364頁（2001年）に記載されるように調製した。これらの細胞を、アルファＭＥＭ（ギブコ社）に溶かした（Ｈｉｓ）６ＴＡＴ−ＬＭＰ融合タンパク質５μＬと混合し、そして３７℃にて３０分間インキュベートした。
【００６２】
次いで、適切な容量の、（Ｈｉｓ）６ＴＡＴ−ＬＭＰ融合タンパク質を含有するヒト軟膜細胞を、植え込み用に、多孔性コラーゲン基質に載せた。Ｉｎ ｖｉｖｏにおける新規の骨形成を実証するため、ラットへの植え込み用に、１００μＬの細胞懸濁液を、無菌ピペットによって無菌の５ｘ５ｍｍＩ型ヒトコラーゲンディスクに載せた。脊椎の融合を促進するための移植用に、同様な量の細胞懸濁液を、１０ｘ２５ｍｍシートに載せた。ディスクを、４〜５週齢の無胸腺ラット（ｒｎｕ−／ｒｎｕ−）の胸／腹部に、外科的に皮下に植え込んだ。動物を４週間後に屠殺し、この時点でディスクを切除し、７０％エタノール中で固定し、そしてＸ線撮影及び脱灰していない組織の検査（５μｍの切片を作製し、そしてゴールドナー・トリクロムで染色）によって解析した。
【００６３】
ウサギにおいて、後外側腰椎の関節固定を行い、そして、脊椎の各側が、４ｘ１０６個の導入された軟膜細胞を受け入れるように、キャリアー基質を植え込んだ（すなわち、１５％ヒドロキシアパタイト／８５％リン酸三カルシウムのコラーゲンスポンジ）。４週間後に、ウサギを屠殺し、そしてその腰椎を切除した。脊椎融合の状態を、残存する運動（融合の失敗を示唆）を検出するための、盲検化された手による運動分節の触診、Ｘ線撮影、ＣＴスキャン及び脱灰していない組織の検査によって、評価した。
【００６４】
ラットとウサギの双方において、Ｘ線撮影により、ＬＭＰ−１をトランスフェクトされたヒト軟膜細胞を含有する元々のコラーゲンディスクまたはシートの形に一致した、高レベルの石灰化骨形成が示された。石灰化骨形成は、対照において認められず、そして元々のコラーゲンディスクまたはシートは、吸収を受けているようにみえた。組織像は、ＬＭＰ−１を導入された移植片において、骨芽細胞の並んだ新たな骨梁を示したが、対照においては、骨はみられず、そしてキャリアーは部分的に再吸収された。
【００６５】
Ｉｎ ｖｉｖｏ骨形成を誘導するための骨誘導ペプチドの使用
プロトコールは、基本的には上記のとおりである。ペプチドを、４個の別々の移植片（３個はウサギ用）に、２５０μｌ／ディスク、６Ｍ／ｍｌにて載せた。移植片は、コラーゲンディスクを含んだ。移植片を、Ｈａｒｌａｎ無胸腺ラットまたはニュージーランドホワイトウサギの胸部内に置いた。試験された用量範囲は５ｎＭ、１０ｎＭ、１２．５ｎＭ、１５ｎＭ、１７．５ｎＭ、２０ｎＭ、２２．５ｎＭ及び２５ｎＭであった。結果を、図６に示す。
【００６６】
ｓＧＡＧ合成のＬＭＰ−１刺激
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから得た腰椎間板細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を、種々の用量（感染多重度０、５、１０、２５、５０）のＬＭＰ−１ヌクレオチド配列の挿入断片を含有するアデノウイルス（ＡｄＬＭＰ−１）で細胞を処理し、そしてこれを単層にて６日間培養することによって行い、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＬＭＰ−１過剰発現の影響を判定した。ＤＭＭＢ法を用いて、培地中の硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧ）を定量した。リアルタイムＰＣＲを用いて、アグリカン、過剰発現ＬＭＰ−１、ＢＭＰ−２、４、６及び７のｍＲＮＡレベルを定量した。直接ＥＬＩＳＡ法を用いて、培地中のＢＭＰ−２、４、６及び７のレベルを定量した。ＬＭＰ−１による椎間板細胞のプロテオグリカン産生亢進にＢＭＰが関与することを実証するため、ＢＭＰ−２、４、６及び７の活性を特異的に遮断する分子（ノギン）を、異なる濃度で、ＡｄＬＭＰ−１処理細胞に加えた。
【００６７】
Ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療実験を、ニュージーランドホワイトウサギにおいて行った。腰椎間板に、ＡｄＬＭＰ−１（実験用）、またはマーカー遺伝子を保有するアデノウイルス（ＡｄＬａｃＺ−対照）のいずれかを、異なる３用量（１０６、１０７及び１０８ｐｆｕ／椎間板）にて注射した。３週間後に、注射された椎間板を回収し、そして総ＬＭＰ−１（内因性）、過剰発現ＬＭＰ−１、アグリカン、ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７のｍＲＮＡレベルを測定した。
【００６８】
感染多重度（ＭＯＩ）２５のＡｄＬＭＰ−１は、最大レベルのｓＧＡＧ亢進を誘導するのに十分であった。６日間の単層培養期間が、ＡｄＬＭＰ−１処理（ＭＯＩ ２５）後に最大レベルのｓＧＡＧ亢進に達するのに必要とされた。アグリカンのｍＲＮＡは、対照と比べて２倍増加した。細胞をアルギン酸中で培養した場合、ｓＧＡＧ産生に対するＡｄＬＭＰ−１処理の効果は、３週間持続した。ＡｄＬＭＰ−１処理後６日に、ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７のｍＲＮＡレベルは、それぞれ対照の３．０±０．２及び２．８±０．３倍（ｐ＜０．０１）有意に増加した。ＢＭＰ−４及びＢＭＰ−６のｍＲＮＡレベルは、変わらなかった。培地中のＢＭＰ−２及びＢＭＰ７のタンパク質レベルは、対照と比べて有意に増加した（ｐ＜０．０１）。対照的に、ＢＭＰ−４及びＢＭＰ−６のタンパク質レベルは、上昇しなかった。３２００ｎｇ／ｍｌのノギンは、ＡｄＬＭＰ−１によるプロテオグリカンの亢進を完全に遮断した。内因性レベルのＬＭＰ−１ ｍＲＮＡが、腰髄核中に検出された。１０７ｐｆｕ／椎間板のＡｄＬＭＰ−１を注射されたｉｎ ｖｉｖｏ椎間板では、対照と比べてＬＭＰ−１、ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７のｍＲＮＡレベルが有意に上昇した。
【００６９】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットの腰椎間板細胞を用いて行った。両側スチューデントｔ検定を用いて、実験群を対照群と比較した。図中の誤差バーは、１ＳＥＭ（標準誤差）を示す。
【００７０】
ヒトＬＭＰ−１遺伝子のｃＤＮＡを保有する複製欠損性５型アデノウイルスを用いた（ＡｄＬＭＰ−１）。ＳＤ線維輪細胞を用いた単層培養実験を行い、ウイルス用量と過剰発現ＬＭＰ−１ ｍＲＮＡ発現との関連性を、ウイルスによって送達されるＬＭＰ−１ ｃＤＮＡのみに特異的なプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲ法を用いて、判定した。ＳＤ線維輪細胞を用いた単層培養実験を行い、ウイルス用量とｓＧＡＧ産生との関連を判定した。ｓＧＡＧレベルを、ＤＭＭＢ法を用いて測定した。ＡｄＬＭＰ−１の最適用量を、ｓＧＡＧの産生をプラトーレベルに導く最低用量として定めた。最適用量（２５ＭＯＩ）を用いて、経時的な実験（９日間）を行い、ｓＧＡＧの産生がプラトーレベルに達するのに必要な最短期間（６日間）を決定した。先に決定された最適ウイルス量及び時間（２５ＭＯＩのＡｄＬＭＰ−１、及び処理後６日）を用いて、ＡｄＬＭＰ−１処理された線維輪細胞のアグリカンのｍＲＮＡレベルを、対照と比較した。髄核細胞が、線維輪細胞と同じように反応することを確かめるため、ｓＧＡＧ産生及び細胞数に対するＡｄＬＭＰ−１の影響を、処理後６日に、２５ＭＯＩにて、線維輪細胞及び髄核細胞の双方について判定した。ＡｄＬＭＰ−１処理のより長期の影響を検討するため、アルギン酸中で培養されたＳＤ線維輪細胞のアルギン酸中のｓＧＡＧの蓄積を、１、２及び３週間後に判定した。すべての実験を、少なくとも２回繰り返した。
【００７１】
ＳＤ線維輪細胞を用いた単層培養実験を、ＭＯＩ ２５のＡｄＬＭＰ−１を用いて行った。簡潔に記すと、ＬＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６及びＢＭＰ−７のｍＲＮＡレベルを、ＡｄＬＭＰ−１処理後第０．５、１、３及び６日に、リアルタイムＰＣＲ解析を用いて測定した。ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６及びＢＭＰ−７のレベルを、直接ＥＬＩＳＡ法を用いて、処理後６日に培地中にて測定した。ＢＭＰ活性を遮断する影響を判定するために、ノギンを、ＡｄＬＭＰ−１処理開始時に培地に加えた。ＡｄＬＭＰ−１で処理後の、種々の濃度のノギン存在下または非存在下でのｓＧＡＧレベルの変化を、６日間の実験において測定した。
【００７２】
アグリカン、ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７に対するＬＭＰ−１投与（ＡｄＬＭＰ−１による）のｉｎ ｖｉｖｏ影響を判定するために、４例のニュージーランドホワイト（ＮＺＷ）ウサギ（３〜４ｋｇ）を用いた。前部腰椎間板Ｌ２／３、Ｌ３／４、Ｌ４／５及びＬ５／６を、左後腹膜からのアプローチを介して露出させた。１０７プラーク形成単位（plaque-forming units、pfu）の実験用ウイルス（ＡｄＬＭＰ−１）または対照ウイルス（ＡｄＧＦＰ−緑色蛍光タンパク質のｃＤＮＡを挿入断片として有する、５型アデノウイルス）のいずれかを、露出させた椎間板髄核のそれぞれに、交互に注射した（すなわち、各ウサギにおいて、二つの椎間板にはＡｄＬＭＰ−１を注射し、そして二つの椎間板にはＡｄＧＦＰを注射）。ウイルスを、３０Ｇハミルトンシリンジを介して、１０μｌのリン酸緩衝生理食塩液中にて送達することによって、投与した。３週間後に、注射された腰椎間板から得た髄核組織を回収した。２例のウサギから得た髄核組織を、対照または実験椎間板群のいずれかにプールして、さらなる解析に十分なｍＲＮＡを得た。逆転写及びリアルタイムＰＣＲを用いて、総ＬＭＰ−１、ＢＭＰ−７及びアグリカンのｍＲＮＡレベルを定量した。総ＬＭＰ−１のプライマーは、内因性及び過剰発現ＬＭＰ−１の双方を同定するように、設計された。
【００７３】
第二のｉｎ ｖｉｖｏ実証においては、種々の用量のＡｄＬＭＰ−１ウイルスを用いて、用量反応の関係性を確立した。異なる３用量（１０６、１０７、１０８ｐｆｕ）のＡｄＬＭＰ−１及び単一用量（１０７ｐｆｕ）のＡｄＧＦＰを、投与した。この実験では、それぞれの動物のすべての椎間板に、先の実験におけるような交互のウイルス種ではなく、単一用量のウイルスを注射した。８例のＮＺＷウサギ（３〜４ｋｇ）を、４つのウイルス群に２例ずつのウサギで、用いた。ウサギを３週間後に屠殺し、そして髄核を回収した。各処理群内から回収した組織をプールし、ｍＲＮＡを単離し、そしてこれを用いて対応するｃＤＮＡを作製した。リアルタイムＰＣＲを用いて、総ＬＭＰ−１、過剰発現ＬＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７及びアグリカンのｍＲＮＡレベルを定量した。
【００７４】
様々な用量（ＭＯＩ ０、１０、２５及び５０）でウイルス処理した１２時間後における、過剰発現ＬＭＰ−１のｍＲＮＡの相対量を、過剰発現ＬＭＰ−１のｍＲＮＡの最低検出可能レベル（ＡｄＬＭＰ−１ ＭＯＩ ５）を基準に正規化した。ＡｄＬＭＰ−１の用量を増加させると、過剰発現ＬＭＰ−１のｍＲＮＡに、ＭＯＩ ５と比べて統計学的に有意な増加が生じた。非処理対照群またはＡｄＬａｃＺ対照群において、検出可能なレベルの過剰発現ＬＭＰ−１のｍＲＮＡはみられず、このことは、ＡｄＬＭＰ−１が、線維輪細胞において用量相関的にＬＭＰ−１の過剰発現を誘導することを示唆した。
【００７５】
線維輪細胞の培地中ｓＧＡＧ濃度を、様々な用量のＡｄＬＭＰ−１による処理後６日に、測定した。第６日における培地中ｓＧＡＧ濃度は、培地交換からｓＧＡＧ測定までの３日間の期間中に細胞によって産生された総ｓＧＡＧの指標であり、したがって、この期間中のｓＧＡＧ産生速度の指標である。データを、処理と非処理対照間の割合として表す。ＬＭＰ−１の投与（ＭＯＩ ２５のＡｄＬＭＰ−１による）は、最も高いｓＧＡＧレベルを提供し、これは、対照の３．１±０．２倍（ｐ＜０．０１）であった。ＭＯＩ ２５またはＭＯＩ ５０で処理された細胞間では、培地中ｓＧＡＧレベルに有意な差はなかった。このＭＯＩ ２５のＡｄＬＭＰ−１の用量は、最大のｓＧＡＧ応答に達することが可能な最低用量であったため、発明者は、実験の残りに用いる用量としてＭＯＩ ２５を選択した。
【００７６】
時間経過実験を行って、ＭＯＩ ２５のＡｄＬＭＰ−１で処理後の実験の長さを変えた影響を、判定した。線維輪細胞をＬＭＰ−１（ＭＯＩ ２５のＡｄＬＭＰ−１）で処理し、そして３日間の増殖期間中のｓＧＡＧ産生を測定した。結果を、各時点におけるＤＮＡ含量によって正規化し、そして同時点の非処理対照に対する割合として表した。ｓＧＡＧレベルは、第３日に１．６±０．２（ｐ＜０．０１）に、第６日に２．９±０．１（ｐ＜０．０１）に、第９日には２．８±０．１（ｐ＜０．０１）に増加した。第６日から第９日までの間に、ｓＧＡＧレベルの増加はみられず、このことは、第６日までにプラトーレベルに達したことを示唆した。
【００７７】
ＬＭＰ−１によるアグリカン合成の誘導
アグリカンは椎間板の主なプロテオグリカンであるため、アグリカンのコアタンパク質のｍＲＮＡレベルを、ＡｄＬＭＰ−１で処理後６日に測定した。定量性リアルタイムＰＣＲ法を用い、そしてデータを非処理対照に対する割合として表した。ＡｄＬＭＰ−１処理（ＭＯＩ ２５）後に、アグリカンのｍＲＮＡレベルは、対照の２．１±０．１（ｐ＜０．０１）倍であった。ＡｄＬａｃＺ処理（ＭＯＩ ２５）後に、アグリカンのｍＲＮＡレベルは変わらず、対照の１．０±０．１６倍であった。これらの結果は、ｓＧＡＧの実験と併せて、ＬＭＰ−１が椎間板細胞のプロテオグリカン産生を刺激することを、実証した。
【００７８】
最適なＡｄＬＭＰ−１活性に必要な用量及びタイミングを培養系において確立したことから、次いで、発明者は、ＡｄＬＭＰ−１によって投与されるＬＭＰ−１が線維輪細胞及び髄核細胞に及ぼす影響を、比較した。ラット線維輪細胞及び髄核細胞を、ＭＯＩ ２５のＡｄＬＭＰ−１で処理し、そして各細胞種のｓＧＡＧ濃度を、第６日に測定した。ｓＧＡＧ濃度を、細胞数の軽微な変化を明らかにするために、ＤＮＡ含量によって正規化した。線維輪細胞及び髄核細胞種の非処理対照を比較するため、結果を、非処理対照を基準に正規化しなかった。非処理の線維輪細胞及び髄核細胞の結果は、それぞれ０．６±０．０４ ｓＧＡＧ／ＤＮＡ、及び１．０±０．１２ ｓＧＡＧ／ＤＮＡであった。この差は統計学的に有意であり（ｐ＜０．０５）、そして、非処理髄核細胞が、線維輪細胞よりも一細胞につきより多くのｓＧＡＧを産生することを、示唆した。ＡｄＬＭＰ−１処理後、線維輪細胞及び髄核細胞の結果は、それぞれ１．５±０．０８ ｓＧＡＧ／ＤＮＡ（ｐ＜０．０１）、及び２．４±０．１ ｓＧＡＧ／ＤＮＡ（ｐ＜０．０１）であった。これらの値は、そのそれぞれの非処理対照と比べて、統計学的に有意な増加を示した。非処理細胞からＡｄＬＭＰ−１処理細胞への相対的な増加は、線維輪細胞と髄核細胞との間で同様であった。第６日におけるＡｄＬＭＰ−１処理及び非処理の細胞数を、ＤＮＡ含量を測定することによって決定した。線維輪細胞のＤＮＡ含量は、非処理対照と比べて１．２倍増加したが（ｐ＜０．０１）、しかし、髄核細胞のＤＮＡ含量は、ＡｄＬＭＰ−１による影響を受けなかった。このことは、ＬＭＰ−１が、軽度であるがしかし有意な線維輪細胞数の増加を誘導するが、髄核細胞では誘導しないことを、示唆した。
【００７９】
ＬＭＰ−１の投与（ＡｄＬＭＰ−１による）がｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるｓＧＡＧ産生に及ぼす影響を、数週間の期間、試験するために、発明者は、アルギン酸培養系を用いた。アルギン酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養液中で長期間、軟骨細胞の表現型を維持するのに重要な細胞の三次元マトリックスを、提供する。単層で増殖させた線維輪細胞を、ＭＯＩ ２５のＡｄＬＭＰ−１で処理し、次いで２４時間後にアルギン酸培養液に移した。細胞を、１、２及び３週間の期間、培養した。１週間後に、ＡｄＬＭＰ−１群におけるｓＧＡＧレベルは、非処理対照の１．５±０．０６（ｐ＜０．０１）倍であった。２週間後に、ＡｄＬＭＰ−１処理群におけるｓＧＡＧレベルは、非処理対照の２．９±０．３（ｐ＜０．０１）倍に増加した。この差は、３週間後において維持され；ＡｄＬＭＰ−１処理群におけるｓＧＡＧレベルは、対照の２．９±０．１（ｐ＜０．０１）倍であった。このことは、ＡｄＬＭＰ−１が、少なくとも３週間、培養液中で、アルギン酸中のｓＧＡＧ増加を維持するのに効果的であることを、示唆した。
【００８０】
プロテオグリカン産生に対するＬＭＰ−１過剰発現の効果を実証したことから、我々は、ＬＭＰ−１の過剰発現がこの効果を誘導するメカニズムを検討した。過剰発現ＬＭＰ−１及びＢＭＰ（ＢＭＰ−２、４、６及び７）のｍＲＮＡの変化の時間経過を、測定した。これらのＢＭＰは、白血球及び骨芽細胞において、ＬＭＰ−１の過剰発現によって刺激されることが、これまでに示されていた。
【００８１】
線維輪細胞をＭＯＩ ２５のＡｄＬＭＰ−１で処理後の、過剰発現ＬＭＰ−１の時間依存的な変化を、測定した。データを、非処理対照に対する割合としてでなく、過剰発現ＬＭＰ−１の最大ｍＲＮＡレベル（第６日）の百分率として表したが、これは、対照において過剰発現ＬＭＰ−１のｍＲＮＡが検出可能でなかったためである。ＬＭＰ−１のｍＲＮＡは、処理後１２時間に検出可能であり、そして調査した最終時点（第６日）まで増加し続けた。このことは、過剰発現ＬＭＰ−１が、ＬＭＰ−１投与後早ければ１２時間後には下流の遺伝子に影響を与え得ることを、示唆した。
【００８２】
ＭＯＩ ２５のＡｄＬＭＰ−１で処理後の、ＢＭＰのｍＲＮＡレベルの時間経過も、リアルタイムＰＣＲによって測定し、そして各時点において非処理対照に対する割合として算出した。ＢＭＰ−２のｍＲＮＡは早期に亢進し、ＬＭＰ−１処理後１２時間に、統計学的に有意な（ｐ＜０．０１）増加に達した。ＢＭＰ−２のｍＲＮＡ増加は、第３日までにプラトーレベルに達した。ＢＭＰ−７のｍＲＮＡはＢＭＰ−２よりも遅れて亢進し、第３日（ｐ＜０．０１）及び第６日（ｐ＜０．０１）に、統計学的に有意な増加に達した。ＢＭＰ−４及びＢＭＰ−６のｍＲＮＡレベルには、いずれも非処理対照のものと有意な差はなかった。
【００８３】
ＬＭＰ−１のｍＲＮＡの過剰発現が、線維輪細胞においてＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７の亢進をもたらすことを確立したことから、発明者は、このｍＲＮＡ増加が、ＢＭＰタンパク質の培養液への分泌増加と相関するかどうかを検討した。ＥＬＩＳＡアッセイを、調製された培地中のＢＭＰ−２、４、６及び７タンパク質レベルを定量するために行った。単層にて培養された線維輪細胞を、ＭＯＩ ２５のＡｄＬＭＰ−１で処理した。培地を第３日に一度交換し、そして培地を第６日に解析した。したがって、被験試料は、培養最終３日間（第４〜６日）に分泌されたＢＭＰを含有した。培地中のＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７のタンパク質レベルは、それぞれ、非処理対照の３．５±０．４（ｐ＜０．０１）倍及び２．５±０．３（ｐ＜０．０５）倍であった。ＢＭＰ−４及びＢＭＰ−６のタンパク質レベルには、非処理対照のものと有意な差はなく、このことは、ｍＲＮＡについて得られた結果と一致した。
【００８４】
ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７のｍＲＮＡ及びタンパク質が、ＬＭＰ−１によって亢進したことから、発明者は、これらのＢＭＰの遮断が、ＬＭＰ−１によって誘導されるｓＧＡＧ産生増加を妨げるかどうかを、検討した。単層においてＭＯＩ ２５のＡｄＬＭＰ−１とともに培養された線維輪細胞を、ＢＭＰ阻害剤であるノギンで、培地中にて処理し、そしてｓＧＡＧレベルを第６日に測定した。ＡｄＬＭＰ−１のみで処理された細胞では、ｓＧＡＧレベルが増加したが（非処理対照の２．７±０．３倍）、３２００ｎｇ／ｍｌのノギン及びＭＯＩ ２５のＡｄＬＭＰ−１で処理された細胞では、ｓＧＡＧレベルは変わらず（非処理対照の１．１±０．１倍）、このことは、ノギンがＡｄＬＭＰ−１の影響を完全に遮断することを示唆した。ノギン（３２００ｎｇ／ｍｌ）のみで処理された細胞では、ｓＧＡＧレベルはほとんど変わらないままであり（非処理対照の０．８±０．１倍）、このことは、ノギンによる毒性的影響がないことを示唆した。ＡｄＬＭＰ−１によって誘導されるｓＧＡＧ産生に及ぼすノギンの阻害的影響は、濃度依存性であった。
【００８５】
対照の椎間板（ＡｄＧＦＰを注射された椎間板）におけるアグリカン、ＢＭＰ−７及びＬＭＰ−１のｍＲＮＡの内因性レベルを、髄核において検出した。内因性ｍＲＮＡレベルを用いて、ＡｄＬＭＰ−１を注射された椎間板におけるアグリカン、ＢＭＰ−７及びＬＭＰ−１のｍＲＮＡの増加を、算出した。
【００８６】
ＡｄＬＭＰ−１を注射された椎間板は、ＡｄＧＦＰを注射された椎間板よりも、総ＬＭＰ−１のｍＲＮＡを、８３０％高いレベルで発現した。ＡｄＬＭＰ−１によるＬＭＰ−１の投与は、対照群よりも１１００％、ＢＭＰ−７のｍＲＮＡレベルの増加（ｐ＜０．０５）をもたらした。アグリカンのｍＲＮＡレベルは、対照群よりも６６％増加した（ｐ＜０．０５）。
【００８７】
ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＬＭＰ−１及びアグリカンのｍＲＮＡの内因性レベルも、検出した。ＡｄＬＭＰ−１の用量増加と総ＬＭＰ−１のｍＲＮＡとの相関がみられた。ＡｄＬＭＰ−１によるＬＭＰ−１の投与は、１０７ｐｆｕ／椎間板の用量で最大限に、ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７のｍＲＮＡレベルを有意に増加させた（ｐ＜０．０５）。１０７ｐｆｕ／椎間板の用量のＡｄＬＭＰ−１は、対照群より５０％と（ｐ＜０．０５）、アグリカンのｍＲＮＡを最も増加させた。
【００８８】
ＬＭＰ−１の椎間板細胞への投与は、ｓＧＡＧの産生増加及びアグリカンのｍＲＮＡレベルの増加をもたらした。ＬＭＰ−１の投与は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＢＭＰ−２及びＢＭＰ７のｍＲＮＡならびにタンパク質レベルの増加をもたらし、そしてＬＭＰ−１の投与がプロテオグリカン産生亢進に及ぼす影響を、ＢＭＰ阻害剤であるノギンの投与によって遮断することが可能であった。
【００８９】
１１ヶ月齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを屠殺し、そして腰椎及び尾から得た椎間板組織を、無菌条件下で回収した。線維輪及び髄核を、別々に、解剖しそして小さい角切りにした。椎間板組織を、１００単位／ｍｌペニシリン及び１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有する、ダルベッコ変法イーグル培地及びハムＦ１２培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２；ギブコＢＲＬ社、グランドアイランド、ニューヨーク州、米国）中に入れた。椎間板組織を、培地中で、０．２％プロナーゼ（シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ州、米国）を用いて３７℃にて１時間処理し、次いで、０．０２５％コラゲナーゼ（シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ州、米国）を用いて３７℃にて６時間処理した。単離された細胞を洗浄し、そして７０ｍｍメッシュ（ファルコン社、フランクリンレイクス、ニュージャージー州、米国）を介してろ過し、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、１００単位／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン及び５０ｍｇ／ｍｌアスコルビン酸塩を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地１２ｍｌを入れた７５ｃｍ２フラスコに、加えた。細胞を、加湿された５％ＣＯ２中で３７℃にて、増殖させた。培養液を、およそ８日間、２日毎に交換した。
【００９０】
二つの異なるウイルスを用いた。ＣＭＶプロモーターによって駆動される、ヒトＬＭＰ−１ ｃＤＮＡを含有する複製欠損性５型アデノウイルス（ＡｄＬＭＰ−１）を、実験用ウイルスとして用いた。対照ウイルスは、ｌａｃＺのｃＤＮＡを含有する同様な複製欠損性５型アデノウイルスからなった。
【００９１】
椎間板細胞の初代培養物がコンフルエントになったとき、細胞を、４００，０００細胞／ウェルにて６ウェルプレートに継代培養した。３日後に、細胞を、ヒトＬＭＰ−１遺伝子またはＬａｃＺ遺伝子のいずれかのｃＤＮＡを含有するアデノウイルス（それぞれ、ＡｄＬＭＰ−１とＡｄＬａｃＺ）で、処理した。細胞数を、血球計数器を用いて対照ウェルをカウントすることによって、第０日に測定した。ウイルス用量を、感染多重度（ＭＯＩ）、すなわちプラーク形成単位（ｐｆｕ）／細胞の数として、表した。これは、本質的には、一つの椎間板細胞が曝露されたリコンビナントアデノウイルスのプラーク形成単位の数である。培養された細胞を、各実験において指定されたように、異なるＭＯＩ（０、１０、２５、５０）のＡｄＬＭＰ−１またはＡｄＬａｃＺを用いて、３００ｍｌの０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ／Ｆ−１２中で３７℃にて３０分間処理した。次いで、培養容量を、１％ＦＢＳ、１００単位／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン及び５０ｍｇ／ｍｌビタミンＣを含有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を用いて、２．０ｍｌに上昇させた。培地を、実験期間中、３日毎に交換した。
【００９２】
培養液の硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧ）含量を、１，９−ジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ）法を用いてアッセイした。培養液２ｍｌを、セントリコンＹＭ−５０遠心フィルター（ミリポア・Ｃｏ．、ベッドフォード、マサチューセッツ州、米国）を用いて、遠心分離し（５０００ｘＧで３０分間）、ｓＧＡＧを濃縮した。試料溶液（２０ｍｌ）を、９６ウェルのマイクロタイタープレート中で、２００ｍｌのＤＭＭＢ色素溶液と穏やかに混合し、そして光学濃度（ＯＤ）を、５２０ｎｍ波長フィルターにて直ちに検査した。標準曲線を、硫酸コンドロイチン（シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ州、米国）の連続希釈系列を用いて、作図した。培地中の総ｓＧＡＧを、ＤＮＡ含量によって正規化し、そして非処理対照に対する割合として表した。
【００９３】
細胞数を、各ウェルのＤＮＡ含量によって決定し、そして、先に記載したように、ＤＮＡ含量を、ヘキスト色素３３２５８（Polysciences社、Warrington、ペンシルバニア州、米国）法を用いて測定した。培養された細胞を、パパイン（１０単位／ｍｌ）に曝露することによって、プレートから除いた。次いで、培養された細胞をペレット状にし、そして６０℃にて３時間インキュベートした。２０μｌのパパイン消化物のアリコットを、２００ｍｌのヘキスト色素３３２５８溶液と、９６ウェルのフルオロプレート中で混合した。発光及び励起スペクトルを、ルミネセンス分光器ＬＳ ５０Ｂ（パーキン−エルマー社、Wellesly、マサチューセッツ州、米国）において、それぞれ４５６ｎｍ及び３６５ｎｍにて測定した。標準曲線を、子ウシ胸腺ＤＮＡ（シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ州、米国）の既知の濃度を用いて、各測定時点について作製した。
【００９４】
アルギン酸ビーズ培養は、長期培養において軟骨細胞の表現型を維持するのに有用である。この方法は、３週間の培養においてＡｄＬＭＰ−１の影響を判定するためのものである。細胞を、上記のように、単層培養において処理した。１日後に、細胞を、トリプシン処理によって剥離させ、そして培地で２回洗浄した。単離された細胞を、０．６％低粘度無菌アルギン酸塩（シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ州、米国）溶液中に、６００，０００細胞／ｍｌにて再懸濁した。アルギン酸ビーズを形成させるため、細胞を、１０ｍｌプラスチックシリンジに取り付けた２１ゲージ針を介して、１滴ずつ、０．１０２Ｍ ＣａＣｌ＋０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液中に加えた。１０分後に、新たに形成されたビーズ（およそ１２，０００細胞／ビーズを含有）を、無菌０．９％ＮａＣｌ溶液で３回、続いてＤＭＥＭ／Ｆ−１２で２回、洗浄した。線維輪細胞を含有するビーズを、１％ＦＢＳ、１００単位／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン及び５０ｍｇ／ｍｌビタミンＣを含有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で、６ウェルプレートにおいて別々に培養した。培地を、異なる期間中（１、２及び３週間）、２日毎に交換した。アルギン酸ビーズを、３５０ｍｌのクエン酸ナトリウムバッファー（５５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ−クエン酸、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に溶解した。細胞を、遠心分離によってペレット状にし、そして溶解液中のｓＧＡＧ含量を、上記のＤＭＭＢ法で測定した。細胞ペレットに残存するｓＧＡＧ含量は、懸濁液中のものと比べて、無視できるほどであった。結果を、溶解液のｓＧＡＧを用いて、非処理対照群の倍数増加として記載した。
ｍＲＮＡレベルの定量
リアルタイムＰＣＲを用いて、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７及び過剰発現ＬＭＰ−１のｍＲＮＡレベルを、定量的に測定した。遺伝子のすべてのプライマーを、アガロースゲル上で産物のサイズを決定することによって、そしてアンプリコンをＤＮＡ配列決定することによって、確認した。１８Ｓのレベルを各試料において測定し、内在性対照として用いた。
【００９５】
各試料の総ＲＮＡを、グラニジウム・チオシアネート−フェノール−クロロホルム技術を用いた単一工程の方法によって、抽出した。単離ＲＮＡの濃度を、分光光度計（ＤＵ−５００；ベックマン社、フラトン、カリフォルニア州、米国）を用いて、２６０ｎｍ波長にて測定した。ＲＮＡを、ＤＮＡ分解酵素１（アンビオン・Ｉｎｃ．、テキサス州、米国）で処理して、試料のＤＮＡ混入を除去した。逆転写を、総ＲＮＡ２ｍｇ；トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州、米国）３０Ｕ；デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアニジン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）各１ｍＭ；及び、オリゴ（ｄＴ）１５プライマー１ｍｇを用いて、４２℃にて４５分間、４０ｍｌ容量中で行った。ＰＣＲを、Ａｍｐｌｉｔａｑ（商標登録）ＤＮＡポリメラーゼを用いて、３０サイクル（９５℃、３０秒間；６２℃、３０秒間；７２℃、４５秒間）行った。ＤＮＡの混入がないことを確認するため、逆転写酵素非存在下で処理したＲＮＡ試料も、ＰＣＲにかけ：ＰＣＲ産物がないことで、ＤＮＡ混入していないと確認した。
【００９６】
リアルタイムＰＣＲは、迅速で、信頼性があり、そして再現可能な、特定のｍＲＮＡの定量性検出法であると、報告されている。ＳＹＢＲ（商標登録）グリーン・リアルタイムＰＣＲキット（Applied Biosystems社、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国）を用いたリアルタイムＰＣＲ法を用いて、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７及びアグリカンの定量性ｍＲＮＡ解析を行った。２５マイクロリットル（２５ｍｌ）の反応容量は、ｃＤＮＡ ５ｍｌ、各プライマー（ＢＭＰ−２、−４、−６、−７、及び１８Ｓ）３．７５ピコモル、及びＳＹＢＲ（商標登録）グリーン・マスターミックス（２ｘ、バイオラッド社、ヘラクレス、カリフォルニア州、米国）を含んだ。過剰発現ＬＭＰ−１及び１８ＳのｍＲＮＡレベルを定量するために、ＴａｑＭａｎ（商標登録）リアルタイムＰＣＲキット（Applied Biosystems社、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国）を用いたリアルタイムＰＣＲ法も、行った。２５マイクロリットル（２５ｍｌ）の反応容量には、ｃＤＮＡ ５ｍｌ、各プライマー３．７５ピコモル、及びＴａｑＭａｎ（商標登録）ＰＣＲマスターミックス（２ｘ、バイオラッド社、ヘラクレス、カリフォルニア州、米国）が含まれた。
【００９７】
リアルタイムＰＣＲを、ＧｅｎｅＡｍｐ（商標登録）；５７００配列検出システム（Applied Biosystems社、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国）を用いて、以下の３工程のプロトコールで行った；工程１：５０℃にて２分間、工程２：９５℃にて１０分間、及び、工程３：（９５℃にて１５秒間、６０℃にて１分間）ｘ４５サイクル。増幅の特異性を確認するため、ＰＣＲ産物を、転移曲線解析にかけた。先に記載のように、各反応のthreshold cycle（Ct）を、競合的＿ΔΔＣｔ法を用いて、１８Ｓを基準として標準化した。
【００９８】
ＢＭＰ２、４、６及び７のＥＬＩＳＡアッセイ
ＢＭＰの標準曲線を、０．０５ｍｏｌ／Ｌ重炭酸バッファーに溶解した、ヒトＢＭＰ２、４、６及び７（Genetics Institute、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）の漸増させた濃度（０．１ｎｇ／１００μＬ／ウェル〜１０００ｎｇ／１００μＬ／ウェル）を用いて、作図した。１００マイクロリットルの試料を、トリプリケートで各ウェルに加えた。４℃にて一晩インキュベートした後、プレートを、０．５％Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）添加０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩液で３回洗浄し、そして非反応部位を、１％ウシアルブミン（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州）を用いて、室温にて１時間ブロッキングした。プレートをＰＢＳＴで洗浄後に、一次抗体（１：１０００）を１００マイクロリットルにて各ウェルに分注し、そして室温にて２時間インキュベートした。ＢＭＰ２、４及び６に対するヤギポリクローナル抗体（サンタクルーズ・Ｉｎｃ、サンタクルーズ、カリフォルニア州）、ならびＢＭＰ７に対するウサギ抗体（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州）が、用いられた。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、次いで、アルカリホスファターゼ結合抗ヤギＩｇＧ及び抗ウサギＩｇＧ（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州）を用いて、室温にて１時間、それぞれインキュベートした。基質であるｐ−ニトロフェニルリン酸塩（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州）を用いて発色させ、２０分後に３Ｎ ＮａＯＨで反応を止めた。呈色を、Ｅｌｘ ８００−マイクロプレートリーダー（バイオ−テック・インスツルメント社、Winooska、バーモント州）を用いて４０５ｎｍにて吸光度差を測定することによって、定量した。
【００９９】
結果を定量化するため、線形回帰プロットを、各標準品について作製した。すべての場合において、試料濃度を、標準品と同じ吸光度の対応値に準じて、標準品の線形回帰プロットから外挿した。
【０１００】
ノギン糖タンパク質によるＢＭＰの阻害
ノギンは、ＢＭＰ−２、４、６及び７と高特異的に結合し、そしてこれらのＢＭＰがその同族受容体を活性化させることを妨げる、糖タンパク質である。マウスノギン（ノギン−ＦＣ・シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ州、米国）の形態を実験において用い、ＡｄＬＭＰ−１処理後にＢＭＰを特異的に遮断する影響を、判定した。異なるノギン濃度（１００、２００、４００、８００、１６００及び３２００ｎｇ／ｍｌ）を、ＡｄＬＭＰ−１（ＭＯＩ ２５）処理後第０日及び第３日に、細胞に載せた。第６日に、上記のＤＭＭＢ法を用いて、条件培地を、ｓＧＡＧの産生を検討するためにアッセイした。結果は、ＬＭＰ−１の影響が、ノギンの投与によって遮断され得ることを示唆し、このことは、ＬＭＰ−１活性が、これによるＢＭＰの誘導に部分的に関連することを、実証した。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】図１は、線維輪細胞をＬＭＰ−１（ＭＯＩ ２５のＡｄＬＭＰ−１）で処理後６日の、培地中ＢＭＰタンパク質レベル（量）のグラフである。ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７のタンパク質レベルは有意に増加したが、しかしＢＭＰ−４及びＢＭＰ−６のタンパク質レベルは、非処理対照細胞の培地と有意な差がなかった。各結果を、非処理細胞の値に比例した割合として表す。７試料の平均値及び標準誤差を、報告する（＊ｐ＜０．０５ ＊＊ｐ＜０．０１ ｖｓ．ＮＴ）
【図２】図２は、線維輪細胞をＬＭＰ−１（ＭＯＩ ２５のＡｄＬＭＰ−１）で処理後の、経時的なＢＭＰのｍＲＮＡレベルを示す。ＢＭＰ−２のｍＲＮＡレベルは、ＡｄＬＭＰ−１で処理後早ければ１２時間に有意に亢進し、そしてＡｄＬＭＰ−１処理後３日にプラトーに達した。ＢＭＰ−７のｍＲＮＡレベルは、ＡｄＬＭＰ−１で処理後３日に、有意に増加した。各結果を、同時点における非処理細胞の値に対する割合として表す。６試料の平均値及び標準誤差を、報告する（対応する時点について、＊＊ｐ＜０．０１ ｖｓ．ＮＴ）
【図３】図３は、リアルタイムＰＣＲによって測定された、ＬＭＰ−１（ＡｄＬＭＰ−１）で処理後の線維輪細胞中のアグリカンｍＲＮＡレベルを、グラフに描いたものである。アグリカンのｍＲＮＡレベルは、ＭＯＩ ２５のＡｄＬＭＰ−１で処理後６日に、非処理細胞と比べて有意に増加した。アグリカンのｍＲＮＡレベルは、ＡｄＬａｃＺで処理された細胞において、非処理細胞と比べて変わらなかった。各結果を、非処理細胞の値に対する割合として、表す。９試料の平均値及び標準誤差を、報告する。ＡｄＬＭＰ−１：ＭＯＩ ２５、ＡｄＬａｃＺ：ＭＯＩ ２５（＊＊ｐ＜０．０１ ｖｓ．ＮＴ）。
【図４】図４は、Ｈａｒｌａｎ無胸腺ラットにおける、ＰＴＤ／ＬＭＰ−１融合タンパク質によるＬＭＰ−１投与のパラメータ及び結果を要約した表である。
【図５】図５は、ニュージーランドホワイトウサギにおける、ＰＴＤ／ＬＭＰ−１融合タンパク質によるＬＭＰ−１投与のパラメータ及び結果を要約した表である。
【図６】図６は、Ｈａｒｌａｎ無胸腺ラット、及び示された箇所ではニュージーランドホワイトウサギにおける、ＰＴＤ／ペプチド融合タンパク質による、示された骨誘導ペプチド投与の結果を要約した表である。骨成長は、Ｘ線によって検出され、そして、示された箇所では触診も可能であった。
【発明の開示】
【０００１】
本出願は、２００３年３月２４日に出願された米国仮出願第60/456,551の利益を主張する。
発明の属する分野
本発明は、概して、骨誘導タンパク質、及びこれらのタンパク質を細胞内に送達するための方法に、関する。より具体的には、本発明は、ＬＩＭ石灰化タンパク質（ＬＭＰ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）及びＳｍａｄタンパク質などの骨誘導タンパク質、このような骨誘導タンパク質とタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）との複合体、ＰＴＤと骨誘導タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸との複合体、ならびに、これらの複合体の細胞内への導入に、関する。
【０００２】
背景
組織再生は、疾患、外傷または外科手術に続く治癒過程の重要な要素である。疾患または外傷により、例えば骨欠損が生じる状況や、外科的手順（自家移植片もしくは同種移植片の挿入、骨架橋または骨融合など）が、骨欠損を補正するために行われる状況において、骨再生は、回復の主要な目標である。しかしながら、これは、常にまたは容易に達成される目標ではなく、そして多くの研究が、組織修復及び再生を促進するためのより新たな、そしてより効果的な方法に対して、供されている。
【０００３】
骨架橋を作ることによって関節動作を排除することは、変性脊椎及び関節障害の治療に対する一般的な整形外科的ストラテジーである。脊椎融合の失敗は、該手順を受ける患者の４５％ほどにおいて起こる可能性があり、彼らに疼痛の持続、外科手術の再施行、医療費及び全体的な治療の失敗を残す。
【０００４】
細胞内及び細胞外骨誘導タンパク質は、骨成長及び修復を促進し、そして治療に用いるための潜在的な標的となる。このようなタンパク質としては、骨形態形成タンパク質及びＬＩＭ石灰化タンパク質が挙げられる。ＢＭＰは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて骨成長を刺激することが示されており、そして、ＬＭＰ、特にＬＭＰ−１及びＬＭＰ−３は骨誘導のより上流に影響を与え、これは、ＬＭＰ−１発現の阻害が、糖質コルチコイド類またはＢＭＰ−６によって通常刺激されるであろう小結節の形成を遮断することからも明らかである。これらは、細胞表面受容体との相互作用によって作用する「細胞外」タンパク質と考えられるため、非常に高用量の骨形態形成タンパク質が、ヒトにおいて一貫した影響に達するのに必要とされる。ＢＭＰの製造費用は概して高いため、このことは、治療費用が法外に高いことを意味する可能性がある。したがって、ＢＭＰは有効性を示し、そして骨誘導に対する実行可能な療法ではあるものの、より費用効率が高く、そしておそらくさらにいっそう治療的に有効であろう代替治療法を開発することが、有益であろう。
【０００５】
ＬＭＰの細胞内環境への送達は、魅力的な治療レジメンを提供する。これは、細胞に、ＬＩＭ石灰化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドをトランスフェクトすることによって、遂行することが可能であり、あるいは、標的細胞に、ＬＭＰのヌクレオチド配列を保有するウイルスベクターを感染させることによって、行うことが可能である。しかしながら、これら各々の技術には限界がある。プラスミドのトランスフェクションでは、細胞をトランスフェクションのために単離し、次いでトランスフェクション後に植え込むことが一般に必要となる。ウイルスの送達では、ウイルスの細胞への侵入を容易にするために、適切な受容体を標的細胞の表面に配置することが、一般に必要となる。
【０００６】
骨誘導タンパク質及びペプチドの使用、特に、細胞内メカニズムによって作用するこれらのタンパク質及びペプチドの使用に対して、多大な可能性がある。必要とされるのは、有効な細胞内骨誘導タンパク質及びペプチドを細胞内に送達する方法である。
【０００７】
発明の概要
本発明は、細胞透過性の骨誘導ポリペプチドを作製する方法を提供し、該方法は、骨誘導ポリペプチドが細胞透過性ポリペプチドとの融合タンパク質の一部として発現するように配置された、細胞透過性ポリペプチドと骨誘導ポリペプチドをコードする発現コンストラクトを、適切な宿主細胞に導入することを含む。発現コンストラクトは、融合産物をコードするポリヌクレオチド配列の転写を導くように配置されたプロモーターを、一般に含有する。
【０００８】
発現コンストラクトは、精製タグをさらに含んでもよい。細胞透過性ポリペプチドは、ＨＩＶ−ＴＡＴ、ＶＰ−２２、増殖因子のシグナルペプチド配列、Ｐｅｐ−１及びショウジョウバエＡｎｔｐペプチドからなる群より選択されてもよい。骨誘導ポリペプチドは、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１及びＳｍａｄからなる群より選択されてもよい。
【０００９】
本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８、またはその組み合わせからなる群の中から選択される骨誘導ポリペプチドを、提供する。
【００１０】
本発明はまた、哺乳動物において骨形成を誘導する方法であって、タンパク質導入ドメインと少なくとも一つの骨誘導ポリペプチドとを含む、有効量の融合ポリペプチドを投与することを含む方法を提供する。融合ポリペプチドは、移植片（インプラント）として投与されてもよく、そして、少なくとも一つの多能性前駆細胞に投与されてもよく、該細胞は、骨誘導を促進するために哺乳動物に植え込まれることが可能である。
【００１１】
本発明はまた、タンパク質導入ドメインと少なくとも一つの骨誘導ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供し、タンパク質導入ドメインは、例えばＨＩＶ−ＴＡＴ、ＶＰ−２２、増殖因子のシグナルペプチド配列、Ｐｅｐ−１及びショウジョウバエＡｎｔｐペプチドによって代表される、多様なタンパク質導入、膜移行、及びその他の同様なポリペプチドの中から選択される。骨誘導ポリペプチドは、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１及びＳｍａｄからなる群より選択されてもよい。
【００１２】
哺乳動物においてプロテオグリカン合成を誘導する方法もまた、提供される。該方法は、タンパク質導入ドメインと少なくとも一つの骨誘導ポリペプチドを含む有効量の融合ポリペプチドを投与することを含む。融合ポリペプチドは、移植片として投与されてもよく、そして、少なくとも一つの多能性前駆細胞に投与されてもよい。
【００１３】
骨誘導ポリペプチドと機能可能なように連結されている膜移行ペプチドを含む、単離された融合タンパク質が、本発明によって提供される。膜移行ペプチドは、ＨＩＶ−ＴＡＴ、ＶＰ−２２、増殖因子のシグナルペプチド配列、Ｐｅｐ−１及びショウジョウバエＡｎｔｐペプチドからなる群より選択されてもよく、そして骨誘導ポリペプチドは、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１及びＳｍａｄからなる群より選択されてもよい。
【００１４】
本発明は、前駆細胞において骨芽細胞への分化を誘導する方法を提供し、該方法は、タンパク質導入ドメインと少なくとも一つの骨誘導ポリペプチドとを含む有効量の融合ポリペプチドを前駆細胞に投与することを含む。タンパク質導入ドメインは、ＨＩＶ−ＴＡＴ、ＶＰ−２２、増殖因子のシグナルペプチド配列、Ｐｅｐ−１及びショウジョウバエＡｎｔｐペプチドによって代表される群から選択されることが可能であり、そして骨誘導ポリペプチドは、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１及びＳｍａｄによって代表される群から選択されてもよい。
【００１５】
詳細な説明
本発明者は、タンパク質導入ポリペプチドと骨誘導ポリペプチドを含む融合タンパク質を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて骨の発達及び椎間板再生を促進するために効果的に用いることが可能であることを、発見した。したがって、本発明は、細胞内へ送達するための骨誘導ポリペプチド、このような骨誘導ポリペプチドとタンパク質導入配列をコードするポリヌクレオチド、ならびに、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて骨の発達及び椎間板再生を促進するのにこれらの融合タンパク質を利用する方法を、提供する。
【００１６】
以前の研究により、ＬＩＭ石灰化タンパク質のスプライスバリアント１及び３（ＬＭＰ−１及びＬＭＰ−３）は骨誘導性であるが、ＬＭＰ−２はこのような骨誘導の可能性を有するようにはみえないことが、実証された。ヒトＬＭＰ−１（ｈＬＭＰ−１）のアミノ酸配列のアミノ酸９４〜１３３に相当する４０アミノ酸配列は、ＬＭＰ−１及びＬＭＰ−３の双方に共通している。したがって、発明者は、このタンパク質のこの特有な領域自体が、骨誘導の可能性を有するのではないかと推測した。この配列の重複セグメントを含むペプチドを設計し、そして、これを用いて発明者の仮説を検証した。その結果、ＬＭＰ−１及びＬＭＰ−３由来のペプチドが、骨誘導の可能性を有することが、示唆される。これらのペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて用いた場合に、骨形成誘導能を示した。図６は、本発明の方法において、本発明の融合タンパク質の一部として細胞内に導入された場合に、骨誘導の機能性を示したペプチドを示す。
【００１７】
ＬＭＰ−１を発現している細胞を胸椎及び腰椎に植え込むと、無胸腺ラットにおいて堅固な脊椎融合がもたらされることが、発明者によって示された。本明細書において開示された結果により、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８によって提供されるペプチドなどの、ＬＭＰ−１及びＬＭＰ−３ペプチドもまた、ＬＭＰ−１について実証された骨誘導の利益を提供することが、実証される。
【００１８】
骨形態形成タンパク質が、ヒトにおいて一貫した効果を発揮するには、概して、非常に高用量が必要とされる。ＰＴＤ融合タンパク質によるＬＭＰ−１の細胞内への送達は、本明細書に記載されるように、より費用効率的な治療の選択肢を提供する。さらに、これまでの結果により、ＬＭＰ−１、及びＬＭＰ関連骨誘導ペプチドが、細胞内で作用して諸因子のカスケードを誘導し、天然の骨誘導経路を活性化することが、示唆される。
【００１９】
タンパク質導入ポリペプチドは、核酸配列または治療用タンパク質の取り込み、及びそれに続く発現を、容易にする。文献において、これらは、代替的に、そしてしばしば同義的に、細胞透過性ペプチド、タンパク質導入ドメイン、膜輸送配列及び膜移行ペプチドと称されてもよい。これらは、付属するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を、受容体とは独立に、細胞膜を介して細胞内部に輸送する働きをする。タンパク質導入ドメインを利用する融合タンパク質は、タンパク質導入ドメインと機能可能なように連結されている、１またはそれより多くのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含むことが可能である。本発明において、このような融合タンパク質は、タンパク質導入ドメインと少なくとも一つの骨誘導ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、あるいはその組み合わせを含むことが可能である。これらのペプチドを用いて、外胚葉、間葉または造血を起源とする自己、同種異系または異種の細胞あるいは組織に形質導入し、そして、新たな組織の形成を誘導または助長するためにこれをレシピエントに注入または植え込むことが可能である。本発明の方法において、このようなポリペプチドは、例えば多能性前駆（幹）細胞などの細胞を、例えばＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、アグリカン、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、バーシカン、ルミカン、フィブロモジュリン、ビグリカン及びデコリンを産生するよう誘導することが可能なタンパク質の取り込みを、容易にする。本発明のポリペプチドの有効量を、実験デザイン及び本明細書に開示した結果において示すが、しかし、本明細書にて提供される有効量の開示をもとに、当業者が決定してもよい。
【００２０】
ＬＭＰタンパク質ファミリーの一つである、ヒトＬＩＭ石灰化タンパク質−１（ｈＬＭＰ−１）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて骨石灰化の有効性を増強することができる細胞内調節タンパク質である。ヒトＬＭＰ−１は、アミノ酸スペーサーによって連結された二つの特別なジンクフィンガーから構成される特徴的な構造モチーフを有するため、このように称される。ＬＩＭ石灰化タンパク質のスプライスバリアント及びそれらの使用については、米国特許第6,300,127；6,444,803；及び6,521,750において、発明者によって記載されている。ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−２及びＬＭＰ−３の配列もまた、これらの特許において公開されている。１９９７年７月２２日に、指定されたベクターｐＣＭＶ２／ＲＬＭＰ（挿入断片１０−４クローン／ＲＬＭＰを有するベクターｐＲｃ／ＣＭＶ２である）中の、１０−４／ＲＬＭＰ（ドブネズミＬＩＭ石灰化タンパク質のｃＤＮＡ）の試料を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）（12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852）に寄託し、そして受入番号２０９１５３を割り当てられた。１９９８年３月１９日に、挿入断片ＨＬＰＭ−１ｓ（ホモサピエンスＬＩＭ石灰化タンパク質のｃＤＮＡ）を有するベクターｐＨｉｓ−Ａの試料を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託し、そして受入番号２０９６９８を割り当てられた。
【００２１】
血清型５型のアデノウイルス（Ａｄ５）は、末梢血及び骨髄由来細胞を含む多様な細胞及び組織にＬＭＰを送達するために、使用されている。（Bodenら、「Adenoviral Delivery of LMP-1 Induces Consistent Spine Fusion」、第47回年会、Orthopaedic Research Society、サンフランシスコ、カリフォルニア州（2001年））。しかしながら、Ａｄ５ウイルスは、特異的な受容体（すなわち、コクサッキーアデノウイルス受容体またはＣＡＲ）を利用するが、これは、これらの細胞において存在しないかまたは限られた量にて存在する。受容体を介したメカニズムなしにタンパク質の細胞内への送達を容易にする、細胞膜を介したタンパク質導入は、多様な種類の細胞及び組織の処理を可能にする魅力的な代替手段を、提示する。
【００２２】
ＬＭＰ及び他の骨誘導性タンパク質の作用は、脳、脊髄、末梢神経、骨、軟骨、椎間板、結合組織、腱及び靭帯などの多様な組織において、これらが治療の可能性を有することを、示唆する。ＬＭＰの、例えば多様な組織への送達は、例えばコラーゲン、コラーゲンとセラミックとの組み合わせ、脱石灰化骨基質、ならびに、天然または合成ポリマー類（エラスチン、フィブリン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、フマル酸ポリプロピレン、ポリビニルアルコール、ポリエステル類、ポリエーテル類、ポリヒドロキシル類など）、ならびに構造的移植片を含む送達システムによって、遂行されることが可能である。このような基質は、注射可能で成型可能な固形移植片、構造的移植片、またはその組み合わせであってもよい。
【００２３】
本発明者は、機能性骨誘導タンパク質を細胞内に送達し、そして骨形成及びプロテオグリカン合成を効率的に誘導するのに、ＰＴＤを用いることが可能であることを、発見した。このような細胞透過性ペプチド移入（ＣＰＰＩ）は、骨誘導タンパク質を多様な細胞種類に送達するための方法を、提供する。元来はＨＩＶ−１ ＴＡＴタンパク質に由来する１１アミノ酸ペプチドを用いて、骨誘導タンパク質を細胞内に送達することに成功した。ＴＡＴペプチドを、ｐＴＡＴ−ＨＡベクターを用いて、細菌細胞において過剰発現させることが可能である。リコンビナントヒト遺伝子を、ＴＡＴペプチド配列と目的の遺伝子産物の双方を含有する融合タンパク質を産生させるように、このベクター中に挿入することが可能である。さらに、ＰＴＤ／骨誘導ポリペプチドを、融合タンパク質の単離及び精製を容易にするために、ｐｏｌｙＨｉｓタグと連結して発現させることが可能である。ｐＴＡＴ−ＨＡベクター、及び、ＴＡＴ融合タンパク質の精製プロトコールについては、以前にNagaharaら（Nature Medicine 第4巻，1449〜1452頁、1998年12月）によって記載されている。
【００２４】
多様なＰＴＤにおいて見つけられるペプチド配列は、コクサッキー−アデノウイルス受容体（ＣＡＲ）とは独立に、細胞内への侵入を容易にすることが可能であり、それによって標的細胞への導入効率を改良し、続いて、所望の効果に達するのに必要な核酸またはタンパク質の必要量を低減させる。したがって、ＰＴＤ融合タンパク質は、治療費用を低下させるのに用いられてもよい治療ツールを、提供する。
【００２５】
本発明の一つの態様において、タンパク質導入ドメインと骨誘導タンパク質との融合タンパク質が、提供される。骨誘導タンパク質としては、これに限定されるものではないが、ＬＩＭ石灰化タンパク質（ＬＭＰ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）及びＳｍａｄタンパク質が挙げられる。本明細書では、「骨誘導タンパク質」、「骨誘導ポリペプチド」及び「骨誘導ペプチド」は、骨誘導の機能性を有する、様々な長さのペプチドまたはポリペプチド、あるいは完全長タンパク質のいずれかを指すのに、同義的に用いられてもよい。
【００２６】
ＰＴＤとＬＩＭ石灰化タンパク質を含む融合タンパク質は、本発明の一つの態様として提供される。融合タンパク質は、ＰＴＤと１またはそれより多くのＬＩＭ石灰化タンパク質またはポリペプチドを含むことが可能である。有用なＬＩＭ石灰化タンパク質としては、例えば、米国特許第6,300,127；6,444,803；及び6,521,750；ならびに、係属中の米国特許出願第09/959,578（２０００年４月２８日出願）において開示されるようなＬＭＰが挙げられる。好ましくは、ＬＭＰは、ＲＬＭＰ、ＨＬＭＰ−１、ＨＬＭＰ−１ｓ、ＨＬＭＰ−２、ＨＬＭＰ−３またはそれに由来するペプチドである。これらのペプチドは、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または、配列番号８にあるようなポリペプチドを含むことが可能である。
【００２７】
ＬＩＭ石灰化タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、好ましくは、完全長の以下配列：
ｔｃｃｔｃａｔｃｃｇ ｇｇｔｃｔｔｇｃａｔ ｇａａｃｔｃｇｇｔｇ
に相補的な核酸分子と、標準的な条件下でハイブリダイズするか、または、完全長の以下配列：
ｇｃｃｃｃｃｇｃｃｃ ｇｃｔｇａｃａｇｃｇ ｃｃｃｃｇｃａａ
に相補的な核酸分子と、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか、あるいはその双方である。
【００２８】
「標準的なハイブリダイゼーション条件」は、プローブのサイズ、背景及び核酸試薬の濃度、ならびにハイブリダイゼーションの種類（ｉｎ ｓｉｔｕ、サザンブロット、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのハイブリダイゼーション（ノーザンブロット））によって変わるであろう。「標準的なハイブリダイゼーション条件」の決定は、当該技術分野における技能水準の範囲内にある。方法としては、例えば、米国特許第5,580,775（Fremeauら）、Southern, J. Mol. Biol., 98:503（1975年）、Alwineら、Meth. Enzymol., 68:220（1979年）、及び、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第２版、コールドスプリングハーバー・プレス、7.19-7.50（1989年）に記載されるものが挙げられる。
【００２９】
１セットの標準的なハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミド、５Ｘ ＳＳＰＥ（１５０ｎＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４［ｐＨ７．４］、１ｍＭ ＥＤＴＡ［ｐＨ８．０］）、５Ｘデンハート液（１００ｍｌの水につき、フィコール２０ｍｇ、ポリビニルピロリドン２０ｍｇ、及びＢＳＡ ２０ｍｇ）、１０％硫酸デキストラン、１％ＳＤＳ、及び１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ中で、４２℃にて２時間、ブロットをプレハイブリダイズすることを、含む。３２Ｐ−標識ｃＤＮＡプローブを加え、そしてさらにハイブリダイゼーションを１４時間続ける。その後、ブロットを、２Ｘ ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中で、２２℃にて２０分間、２回洗浄し、続いて、０．１Ｘ ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中で、６５℃にて１時間洗浄する。次いで、ブロットを乾燥させ、そして増感スクリーンの存在下でＸ線フイルムに５日間曝露する。
【００３０】
「高ストリンジェントな条件」下では、プローブはその標的配列と、これら二つの配列が実質的に同一であるならば、ハイブリダイズするであろう。実質的に同一の配列のみがハイブリダイズし、非同一配列がハイブリダイズしないであろう条件を決定するための技術は、当業者に公知である。
【００３１】
本明細書では、「タンパク質」の語は、ミメティック（類似体、模倣物）を含むことを意図し、そして「アミノ酸」の語は、Ｌ型アミノ酸、Ｄ型アミノ酸及び修飾アミノ酸を含むことを意図している。これらの代替品は、分子間の既知の構造類似性を用いて、当業者が作製してもよい。また、アミノ酸配列には、記載された配列のＮ末端またはＣ末端のいずれか、あるいは両方に追加のアミノ酸を含んでもよい、任意のペプチドまたはタンパク質配列を含まれることが、意図される。「骨誘導タンパク質」の語は、完全長タンパク質のみならず、バリアントまたは生物学的に活性なポリペプチド断片も含むことが、意図される。
【００３２】
一つのアミノ酸が、１より多いヌクレオチドコドンによってコードされてもよく、そしてヌクレオチド配列が、同一ペプチドをコードする代替のヌクレオチド配列を作り出すために修飾されてもよいことは、当該技術分野において周知である。したがって、本発明の代替の態様には、先に記載されたようなアミノ酸配列を含有するペプチドをコードする、代替のＤＮＡ配列が、含まれる。特許請求の範囲にあるアミノ酸配列を含有するペプチドをコードする、ＤＮＡ配列は、特許請求の範囲にある配列と、特許請求の範囲にあるアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に位置する他のアミノ酸との、任意の組み合わせをコードするＤＮＡ配列を、含む。当然のことながら、アミノ酸及び核酸配列は、追加の残基、特にＮまたはＣ末端アミノ酸、あるいは５’または３’核酸配列を含んでもよく、そして、該配列は、発現したポリペプチドまたはタンパク質に骨誘導の可能性を授与する限り、本質的には、本明細書にて開示される配列に、なお記載されてもよい。
【００３３】
追加の核酸塩基を、骨誘導ポリペプチドをコードする核酸配列の５’または３’のいずれかに加えてもよく、そして、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、多重クローニング部位、他のコードセグメント等などの他のＤＮＡ配列と、組み合わせてもよい。したがって、このようなポリヌクレオチドの全体的な長さは、かなり変わってもよい。
【００３４】
当然のことながら、ポリペプチドの「バリアント」は、天然のタンパク質とは完全に同一ではない。骨誘導ポリペプチドまたはタンパク質のバリアントは、例えば、１またはそれより多くのアミノ酸を挿入、欠失または置換することによりアミノ酸配列を変えることによって、得ることが可能である。ポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列を、例えば、置換によって修飾して、天然ポリペプチドと比べて同一または改良された質を実質的に有するポリペプチドを作り出すことが、可能である。置換は、保存的置換であってもよい。「保存的置換」とは、アミノ酸を、極性／非極性の性質、電荷またはサイズにおいて類似した側鎖を有する別のアミノ酸に置換することである。２０の必須アノミ酸は、非極性側鎖を有するもの（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン及びトリプトファン）、非荷電性極性側鎖を有するもの（メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、シスチン、チロシン、アスパラギン及びグルタミン）、酸性側鎖を有するもの（アスパラギン酸及びグルタミン酸）、及び塩基性側鎖を有するもの（リジン、アルギニン及びヒスチジン）として分類されることが可能である。保存性置換には、例えば、ＡｓｐをＧｌｕ、ＡｓｎまたはＧｌｎに；ＨｉｓをＬｙｓ、ＡｒｇまたはＰｈｅに；ＡｓｎをＧｌｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕに；及び、ＳｅｒをＣｙｓ、ＴｈｒまたはＧｌｙに置換することが含まれてもよい。例えば、アラニンは、保存的置換を行うのにしばしば用いられる。
【００３５】
当業者は、バリアントポリペプチドを、生物学的活性に影響を及ぼすために、ポリペプチド構造中の１またはそれより多くの位置において第一のアミノ酸を第二のアミノ酸に置換することによって、得ることが可能である。アミノ酸置換は、例えば、生物学的活性の増加をもたらすポリペプチドの立体構造変化を誘導する可能性がある。
【００３６】
当業者はまた、アミノ酸の親水性指数または疎水・親水性指数に基づいて、アミノ酸配列における置換を行ってもよい。したがって、本発明のバリアントアミノ酸分子は、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−２、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、あるいは、配列番号８にあるようなポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ酸配列と、１００％よりは少ないが、しかし少なくとも約５０％、そして好ましくは少なくとも約８０％〜約９０％の、アミノ酸配列相同性または同一性を有する。したがって、バリアント骨誘導ポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列は、本質的には、天然の骨誘導ポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列に相当する。本明細書では、「本質的には〜に相当する」の語は、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−２、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、あるいは、配列番号８にあるようなポリペプチドを含む骨誘導ポリペプチドまたはタンパク質によって生じる活性に類似した、生物学的活性及び酵素活性を誘発するであろうポリペプチド配列に向けたものであり、このような活性は、天然の骨誘導タンパク質の少なくとも約７０％であり、そしてより好ましくは、天然の骨誘導タンパク質活性の１００％を超える。
【００３７】
骨誘導タンパク質のバリアントには、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−２、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８を含む骨誘導タンパク質を含む、相当する骨誘導タンパク質中には存在しないアミノ酸残基が含まれてもよく、あるいは、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−２、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８を含む骨誘導タンパク質と比べて、欠失が含まれてもよい。バリアントはまた、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−２、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８を含む、相当するタンパク質と比べて、切断された「断片」であってもよく、該断片は、完全長のタンパク質またはポリペプチドのほんの一部である。
【００３８】
骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）は、タンパク質のＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーである。ＢＭＰは、異所性骨または軟骨形成を誘導することが示されている。本発明にしたがって、ＰＴＤと骨形態形成タンパク質との融合タンパク質もまた、提供される。ＢＭＰとしては、例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−３ｂ、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−８及びＧＤＦ−９が挙げられる。骨形態形成タンパク質であるＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８またはＢＭＰ−９は、本発明の方法において、特に有用である可能性がある。
【００３９】
Ｓｍａｄタンパク質は、細胞外ＴＧＦ−β関連因子の受容体からのシグナル伝達を媒介する、細胞内タンパク質である（Heldinら、”TGF-β Signalling from Cell Membrane to Nucleus through SMAD Proteins”、Nature、第390巻（1997年））。Ｓｍａｄタンパク質は、ＢＭＰがその受容体に結合することによって、活性化される（すなわち、リン酸化される）ことが可能である。活性化されると、Ｓｍａｄタンパク質は、それが遺伝子発現を調節する場所である核に移行する。ＰＴＤとＳｍａｄタンパク質との融合タンパク質もまた、本発明において提供される。Ｓｍａｄ−１、Ｓｍａｄ−２、Ｓｍａｄ−３、Ｓｍａｄ−４、Ｓｍａｄ−５、Ｓｍａｄ−６、Ｓｍａｄ−７またはＳｍａｄ−８は、本発明におけるようなタンパク質導入ドメインとの融合タンパク質として送達される場合、骨誘導を促進するのに特に有用である可能性がある。
【００４０】
本発明にしたがったタンパク質導入ドメインは、付属もしくは付随のタンパク質、ペプチドまたは核酸を細胞内部に送達するために、細胞の原形質膜を越えることが可能な、任意のペプチド、ミメティック、またはペプチドの核酸（ＰＮＡ）配列であることが可能である。発明者は、骨誘導タンパク質を、骨誘導及びプロテオグリカン合成を促進する能力を損なうことなく、細胞内に（例えば、融合タンパク質の一部分として）送達可能であることを、実証した。ＰＴＤとしては、例えば、ショウジョウバエのホメオティック転写因子であるアンテナペディア（Ａｎｔｐ）由来のポリペプチド、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）タンパク質ＶＰ２２、カポジ線維芽細胞増殖因子（Ｋ−ＦＧＦ）などの増殖因子由来シグナルペプチド配列（Linら、J. Biol. Chem.、第270巻、14255〜14258頁、1995年）、Ｋ−ＦＧＦシグナルペプチド配列由来の膜移行配列（Rojasら、Nat. Biotech.、第16巻、370〜375頁、1998年）、及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）−１転写活性化因子ＴＡＴ（Fawellら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第91巻、664〜668頁、1994年）が挙げられる。ＰＴＤについては、米国特許第5,652,122、及びSchwarzeら、「Protein Transduction: Unrestricted Delivery into all Cells」、Trends in Cell Biology、第10巻（2000年）において、開示されている。発明者は、ＨＩＶ−ＴＡＴのＰＴＤが本発明において特に有用であることを、見いだした。
【００４１】
プロモーターと機能可能なように連結されている、融合タンパク質（タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）と骨誘導タンパク質を含む）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸もまた、提供される。該核酸は、ベクター（例えば、プラスミドなどの発現ベクター）の一部であることが可能である。骨誘導タンパク質は、例えば、ＬＩＭ石灰化タンパク質、骨形態形成タンパク質、Ｓｍａｄタンパク質及び骨誘導ペプチド、ならびにそれに由来するポリペプチドを含むことが可能である。骨誘導ペプチド及びポリペプチドの例としては、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８が挙げられる。
【００４２】
骨誘導タンパク質を細胞内に送達する方法もまた、本発明によって提供される。本発明の方法において、少なくとも一つの骨誘導タンパク質を、導入によって細胞内に送達することが可能であり、ここで、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）と骨誘導タンパク質を含む融合タンパク質は、融合タンパク質が細胞内に送達されるように細胞と接触し、タンパク質導入ドメインまたは細胞透過性ペプチドによって、その送達が容易となる。
【００４３】
骨誘導タンパク質を送達可能な細胞としては、例えば、骨（すなわち、骨形成）及び非骨細胞が挙げられる。このような細胞は、例えば、軟膜細胞、幹細胞（例えば、間葉幹細胞、多能（multipotent）性及び多分化性（pluripotent）幹細胞）、椎間板細胞（disc cell）（例えば、線維輪細胞（nucleus cell）及び髄核細胞（annulus cell））、間葉細胞、造血性細胞、内皮細胞及び筋細胞を含んでもよい。幹細胞は、自己または同種異系の組織由来であることが可能である。
【００４４】
タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）と骨誘導タンパク質との融合タンパク質を導入されているかまたはこれを発現する細胞もまた、提供される。このような細胞は、これに限定されないが、軟膜細胞、幹細胞（例えば、間葉幹細胞及び多分化性（pluripotential）幹細胞）、椎間板細胞（例えば、線維輪細胞及び髄核細胞）、間葉細胞、造血性細胞、内皮細胞及び筋細胞を含んでもよい。本明細書において記載されるような、ＰＴＤと骨誘導タンパク質との融合タンパク質を含有する細胞は、哺乳動物体内に植え込まれて、骨形成を誘導することが可能である。ＬＭＰを骨誘導タンパク質として用いた骨形成誘導法については、例えば、米国特許第6,300,127に記載されている。例えば、２００２年１１月１３日に出願され、係属中の米国特許第10/292,951に記載のように、ＰＴＤと骨誘導タンパク質との融合タンパク質を含む細胞を、椎間板内に植え込んで、プロテオグリカン及び／またはコラーゲン合成を刺激してもよい。
【００４５】
ＰＴＤと、骨誘導タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸との複合体もまた、提供される。ＰＴＤ／核酸複合体を、例えば、骨形成または椎間板再生を促進するために、骨誘導タンパク質の過剰発現を導くのに用いることが可能である。ヌクレオチド配列によってコードされる骨誘導タンパク質は、これに限定されないが、ＬＭＰ、ＢＭＰ及びＳｍａｄタンパク質を含むことが可能である。ペプチドを核酸と化学的に結合させるための方法は、当該技術分野において公知である。一つのこのような方法は、米国特許第5,652,122に記載されている。核酸は、プロモーターと機能可能に連結されている骨誘導タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、発現ベクターの形であることが可能である。
【００４６】
本発明の方法を、１またはそれより多くの骨形態形成タンパク質の発現、または、２００３年３月７日に出願された同時係属中の米国特許出願第10/382,844に記載されるように、増殖因子−βタンパク質の細胞内での形質転換を誘導するのに、用いることが可能である。例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１及びその組み合わせからなる群より選択される、１またはそれより多くのタンパク質の発現は、細胞を、ＰＴＤと骨誘導タンパク質を含む融合タンパク質と本発明にしたがって接触させることにより、誘導可能である。加えて、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１及びその組み合わせからなる群より選択される、１またはそれより多くのタンパク質を過剰発現する細胞もまた、本発明にしたがって提供される。細胞は、非限定的に、幹細胞、軟膜細胞、骨髄細胞、末梢血細胞または脂肪細胞を含む、任意の体細胞であることが可能である。細胞は、自己または同種異系組織に由来する幹細胞であることが可能である。
【００４７】
腎臓においては、例えば、細胞を、本発明において記載されるようなＰＴＤ／ＬＭＰ融合ポリペプチドの投与によって刺激して、ＢＭＰ−７を産生させてもよく、あるいは、幹細胞を、ＰＴＤ／ＬＭＰ融合ポリペプチドで処理して、これにＢＭＰ−７の発現を誘導させてもよい。ひとたび腎臓に移植されるならば、そのＢＭＰ−７産生は、外因性ＢＭＰ−７の投与を介してこれまで利用可能でなかった治療効用を提供することが可能である。ＢＭＰ−７は、慢性腎障害の回復に関連した、重度に損傷した腎尿細管上皮細胞の修復を、誘導する（Zeisbergら、Nat. Med. 9:964-968、2000年）。マウスにおいて、ＢＭＰ−７を投与することによって、慢性腎疾患の一合併症である無形成骨障害の治療に成功したことが、報告されている（Lundら、J Am Soc Nephrol 15(2):359-369、2004年）。慢性腎障害及び線維症のマウス遺伝モデルにおいて、外因性ヒトリコンビナントＢＭＰ−７の投与は、腎機能及び生存性を向上させた（Zeisbergら、Am J Physiol Renal Physiol 285(6):F1060-7、2003年）。ＢＭＰ−７が、糖尿病誘導性の腎肥大を部分的に回復させることもまた、示されている（Wangら、Kidney Int 63(6):2037-2049、2003年）。Daviesらは、ＢＭＰ−７の欠損が、慢性腎不全における病態生理学的因子であると、判断した（J Am Soc Nephrol 14(6):1559-1567、2003年）。これらの試験は、ＬＭＰ−１が細胞によるＢＭＰ−７産生を誘導し、そしてＬＭＰペプチド（配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８）がＬＭＰ−１タンパク質と同じように機能するという、発明者による発見と併せて、タンパク質導入ドメインとＬＭＰ−１もしくはＬＭＰ−３タンパク質または関連ペプチドを含む融合ポリペプチドが、腎疾患の治療において有効である可能性があることを、実証する。本発明の融合ポリペプチドを用いてＢＭＰ−７の発現を誘導された幹細胞は、この目的に対して特に有用である可能性がある。
【００４８】
ＢＭＰ−４及びＢＭＰ−７もまた、ヒト骨髄腫細胞において、増殖を阻害し、そしてアポトーシスを誘導することが示されている。ＢＭＰの治療への使用は、骨髄腫の骨疾患及び骨髄腫細胞の増殖に対して、提案されている。本発明の方法は、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−３、または、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８を含むペプチドを、例えば注射、移植片、またはＰＴＤ／ＬＭＰ融合ポリペプチドで処理された幹細胞の植え込みによって投与することにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＢＭＰ−４とＢＭＰ−７双方の産生を刺激する方法を、提供する。幹細胞移植片を、植え込み型薬物送達装置などのＰＴＤ／ＬＭＰ源とともに組み合わせると、特に有効である可能性がある。
【００４９】
幹細胞または多能性前駆細胞は、骨芽細胞を作り出す細胞源を提供することが可能である。これらの細胞を、種々の分化段階において単離し、そして特定系統の経路にて分化を誘導してもよい。細胞を、骨粗鬆症または骨形成不全症などの骨疾患、ならびに非治癒骨折を治療するのに用いてもよい。核結合因子α１（Ｃｂｆａ１）は、骨形成に必要であることが実証されている。ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４及びＢＭＰ−７は、骨芽細胞の分化を誘導することが知られており、Ｃｂｆａ１の発現を亢進させる。ＢＭＰ−８及びＳｍａｄ−３は、骨芽細胞の分化中に亢進している。ＴＧＦ−β／ＢＭＰ−Ｓｍａｄのシグナル伝達の活性化は、Ｃｂｆａ１の発現及び骨芽細胞の分化を促進することが、示されている。本発明は、例えば、ヒト骨髄由来中胚葉前駆細胞などの細胞において骨芽細胞の分化を促進するために、機能性ＢＭＰ、ＬＭＰ、Ｓｍａｄタンパク質またはその組み合わせを含む融合タンパク質を提供する。適切な細胞には、例えば、Jiangら（Nature、第418巻、41〜49頁、2002年）によって記載された細胞のような、多能性細胞が含まれてもよい。適切な骨誘導タンパク質またはポリペプチド、あるいはその組み合わせの投与は、細胞を植え込む前にｅｘ ｖｉｖｏで、あるいは、植え込みまたは注射後にｉｎ ｖｉｖｏで、行うことが可能である。
【００５０】
Ｉｎ ｖｉｖｏ投与に関して、本発明の骨誘導タンパク質を、例えばＰＴＤまたは細胞透過性ペプチドによって近隣の細胞の内部に送達可能なように、標的部位に注射することが可能である。あるいは、ＰＴＤ／骨誘導ポリペプチドと組み合わせたキャリアーを含む移植片を、用いてもよい。移植片は、周囲組織に放出するためにＰＴＤ／骨誘導ポリペプチドを入れる貯蔵所を含有してもよく、あるいは、１またはそれより多くのＰＴＤ／骨誘導ポリペプチドコンストラクトを含有する溶液中に浸された多孔性の組成物を含んでもよい。ヒドロゲル、持続放出カプセルもしくは球（spheres）、リポソーム、ミクロスフェア、ナノスフェア、生分解性ポリマー、または他のこのような薬物送達システムもまた、本発明のペプチド及びタンパク質を標的細胞及び組織に送達するのに用いられてよい。例えば、米国特許第6,475,516（DiCosmoら）は、抗生物質などのリポソーム治療剤が詰め込まれたヒドロゲルを提供し、該ヒドロゲルは、移植片などの留置された医療装置の表面と共有結合している。
【００５１】
椎間板変性の特徴は、椎間板においてプロテオグリカン類、特に硫酸化グリコサミノグリカン類（ｓＧＡＧ）及びアグリカンの産生が減少することである。椎間板の主要なプロテオグリカンであるアグリカンの産生速度の減少は、椎間板変性における重要な要素である。椎間板の機能においてプロテオグリカン類は中心的な役割を果たすため、椎間板の正常なプロテオグリカン産生を回復させることは、椎間板変性のいかなる生物学的治療においても、非常に重要である可能性がある。
【００５２】
発明者は、ＬＭＰ−１の過剰発現または細胞内投与が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて椎間板細胞のプロテオグリカン産生を増加させることを実証する実験を、行った。ＬＭＰ−１の過剰発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７のｍＲＮＡの亢進を誘導する。これらのＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７を特異的に阻害するノギンは、ＡｄＬＭＰ−１によるプロテオグリカンの亢進を阻害し、このことは、ＬＭＰ−１によって誘導されるプロテオグリカンの亢進が、ＢＭＰの亢進によって媒介されることを示唆する。したがって、遺伝子治療またはタンパク質治療によるＬＭＰ−１の投与（例えば、ＰＴＤ複合体による送達）を、椎間板におけるプロテオグリカンの産生を刺激し、そして椎間板再生において治療的な役割を果たすのに用いることが可能である。
【００５３】
ＴＧＦ−β１、ＩＧＦ−１及びＥＧＦなどのサイトカイン類は、椎間板細胞の有糸分裂、及びある程度プロテオグリカン産生を刺激することが示されている。ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７などの他のサイトカイン類もまた、プロテオグリカン産生を刺激するのに有効であることが示されている。しかしながら、サイトカイン類は小さな水溶性分子であるため、これらは椎間板から急速に拡散して出て行くか、または他の調節因子によって不活化される。
ＬＩＭ石灰化タンパク質−１（ＬＭＰ−１）は、白血球及び骨芽細胞から複数の異なるＢＭＰの分泌を誘導することが知られている、細胞内調節分子である。ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−２、ＬＭＰ−３、あるいはＬＭＰ−１またはＬＭＰ−３由来骨誘導ペプチド、あるいはその組み合わせを、特にＰＴＤ／核酸複合体によって細胞内に送達することによって、ＢＭＰ産生を細胞内部から刺激することが可能である。適切な骨誘導ペプチドは、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または、配列番号８にあるようなポリペプチドを含む。
【００５４】
本発明は、以下の限定されない実施例を参照することによって、より十分に理解されるだろう。
（実施例）
ＨＩＶ−Ｔａｔのタンパク質導入ドメインとＬＭＰ−１タンパク質を含む、（Ｈｉｓ）６ＴＡＴ−ＬＭＰタンパク質複合体の合成及び使用について、以下に記載する。ｐＴＡＴ−ＨＡ−ベクターを、ワシントン大学（セントルイス、ミズーリ州）から、物質譲渡契約（material transfer agreement）に基づいて得た。
【００５５】
ｐＣＤＮＡ３．１／ｈＬＭＰ−１を以下のプライマー：
正：５’−ＣＣＡＴＧＧＡｆｌＣＣｆｌＣＡＡＡＧＴＡＧＴＧＣ−３’
逆：５’−ＣＡＧＧＧＣＧＧＧＣＧＧＣＴＧＧＴＡＧ−３’
を用いたＰＣＲの鋳型として利用することによって、ＮｃｏＩ制限酵素部位を、ｈＬＭＰ−１の５’末端に付加した。反応を、９５℃にて２分間［９５℃、３０秒間；６６℃、３０秒間；７２℃、１分間］ｘ２５、及び７２℃にて１０分間、行った。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社）中にクローニングし、そして適切なクローンを、配列決定によって同定した。
【００５６】
（Ｈｉｓ）６ＴＡＴ−ＬＭＰベクターの構築を、ＮｃｏＩ及びＣｌａＩを用いてプラスミドクローンを制限エンドヌクレアーゼ消化し、そしてその結果として得られた産物をアガロースゲル電気泳動及び電気溶出によって精製することにより、行った。ｈＬＭＰ−１の完全長配列を、ＣｌａＩ及びＥｃｏＲＩを用いてｐＣＤＮＡ３．１／ｈＬＭＰ−１ベクターを制限酵素消化し、そしてその結果として得られた産物をアガロースゲル電気泳動及び電気溶出によって精製することにより、単離した。ｐＴＡＴ−ＨＡ−ベクターもまた、ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素消化を受け、そしてその結果として得られた線状化ベクターを、アガロースゲル電気泳動及び電気溶出によって精製した。次いで、産物を、標準的な手順によって、１６℃にて一晩かけて連結させた。正しく連結された産物（５’ｈＬＭＰ−１＋３’ｈＬＭＰ−１＋線状化ｐＴＡＴ−ＨＡ−ベクター＝（Ｈｉｓ）６ＴＡＴ−ＬＭＰベクター）を、続いて行ったアガロースゲル電気泳動及び分子量決定によって、決定した。
【００５７】
連結された産物を、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞にトランスフェクトし、そして適切なクローンを制限酵素解析によって同定した。
（Ｈｉｓ）６ＴＡＴ−ＬＭＰタンパク質の合成及び回収
（Ｈｉｓ）６ＴＡＴ−ＬＭＰ融合コンストラクトの陽性クローンを含有する、適切なＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ）コロニーを、０．８ＯＤ（６００ｎｍ）まで増殖させ、そしてタンパク質産生を、１００μＭのＩＰＴＧで３７℃にて４時間誘導した。誘導された細胞を標準的な方法によって回収し、そして超音波処理（４ｘ２０秒、それぞれ２分間の休止期間を伴う、４℃）によって溶解した（２０ｍＭ ＰＯ４バッファー、ｐＨ７．２、８Ｍ尿素、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）。
【００５８】
溶解物を、遠心分離（１００００ｘｇ）によって澄明にし、そしてその結果として得られた上清を、Ｎｉ２＋セファロースアフィニティカラム（インビトロジェン社）に、重力流の条件下で載せた。カラムを洗浄し（２０ｍＭ ＰＯ４バッファー、ｐＨ６．０、８Ｍ尿素、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）、次いで、結合しているタンパク質を溶出させた（２０ｍＭ ＰＯ４バッファー、ｐＨ４．０、８Ｍ尿素、５００ｍＭ ＮａＣｌ）。
【００５９】
溶出物を、０％バッファーＢから１００％バッファーＢまでの直線勾配（バッファーＡ：２０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ１１、８Ｍ尿素；バッファーＢ：２０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ１１、８Ｍ尿素、２Ｍ塩化ナトリウム）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィ（Ｈｉｔｒａｐ Ｑ ＨＰ、５ｍＬ、ファルマシア社）にかけた（５ｍＬ／分にて４０分間）。溶出画分（５ｍＬ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット解析によって、ｈＬＭＰ−１の存在について解析した。
【００６０】
ｈＬＭＰ−１陽性画分を、疎水性相互作用クロマトグラフィ（Ｈｉｔｒａｐ（商標登録）フェニル−セファロース、５ｍＬ、ファルマシア社）にかけた。溶出（バッファーＡ：２０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ１０．５、１．５Ｍ硫酸アンモニウム；バッファーＢ：２０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ１０．５）を、０％〜１００％のバッファーＢの直線勾配で、５ｍＬ／分にて２０分間行った。溶出画分（５ｍＬ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット解析によって、ｈＬＭＰ−１の存在について解析した。（Ｈｉｓ）６ＴＡＴ−ＬＭＰ融合タンパク質に陽性の画分を、使用時まで凍結乾燥させておいた。
【００６１】
新規の骨形成のための（Ｈｉｓ）６ＴＡＴ−ＬＭＰ融合タンパク質の使用
凍結乾燥させた画分（５５ｐｇ）を、４０ｍＭ ＫＯＨ中に再懸濁した（ストック溶液；１．０μＭ）。ヒト軟膜細胞を、Viggeswarapuら、J.Bone Joint Surg.、第83(3)巻、364頁（2001年）に記載されるように調製した。これらの細胞を、アルファＭＥＭ（ギブコ社）に溶かした（Ｈｉｓ）６ＴＡＴ−ＬＭＰ融合タンパク質５μＬと混合し、そして３７℃にて３０分間インキュベートした。
【００６２】
次いで、適切な容量の、（Ｈｉｓ）６ＴＡＴ−ＬＭＰ融合タンパク質を含有するヒト軟膜細胞を、植え込み用に、多孔性コラーゲン基質に載せた。Ｉｎ ｖｉｖｏにおける新規の骨形成を実証するため、ラットへの植え込み用に、１００μＬの細胞懸濁液を、無菌ピペットによって無菌の５ｘ５ｍｍＩ型ヒトコラーゲンディスクに載せた。脊椎の融合を促進するための移植用に、同様な量の細胞懸濁液を、１０ｘ２５ｍｍシートに載せた。ディスクを、４〜５週齢の無胸腺ラット（ｒｎｕ−／ｒｎｕ−）の胸／腹部に、外科的に皮下に植え込んだ。動物を４週間後に屠殺し、この時点でディスクを切除し、７０％エタノール中で固定し、そしてＸ線撮影及び脱灰していない組織の検査（５μｍの切片を作製し、そしてゴールドナー・トリクロムで染色）によって解析した。
【００６３】
ウサギにおいて、後外側腰椎の関節固定を行い、そして、脊椎の各側が、４ｘ１０６個の導入された軟膜細胞を受け入れるように、キャリアー基質を植え込んだ（すなわち、１５％ヒドロキシアパタイト／８５％リン酸三カルシウムのコラーゲンスポンジ）。４週間後に、ウサギを屠殺し、そしてその腰椎を切除した。脊椎融合の状態を、残存する運動（融合の失敗を示唆）を検出するための、盲検化された手による運動分節の触診、Ｘ線撮影、ＣＴスキャン及び脱灰していない組織の検査によって、評価した。
【００６４】
ラットとウサギの双方において、Ｘ線撮影により、ＬＭＰ−１をトランスフェクトされたヒト軟膜細胞を含有する元々のコラーゲンディスクまたはシートの形に一致した、高レベルの石灰化骨形成が示された。石灰化骨形成は、対照において認められず、そして元々のコラーゲンディスクまたはシートは、吸収を受けているようにみえた。組織像は、ＬＭＰ−１を導入された移植片において、骨芽細胞の並んだ新たな骨梁を示したが、対照においては、骨はみられず、そしてキャリアーは部分的に再吸収された。
【００６５】
Ｉｎ ｖｉｖｏ骨形成を誘導するための骨誘導ペプチドの使用
プロトコールは、基本的には上記のとおりである。ペプチドを、４個の別々の移植片（３個はウサギ用）に、２５０μｌ／ディスク、６Ｍ／ｍｌにて載せた。移植片は、コラーゲンディスクを含んだ。移植片を、Ｈａｒｌａｎ無胸腺ラットまたはニュージーランドホワイトウサギの胸部内に置いた。試験された用量範囲は５ｎＭ、１０ｎＭ、１２．５ｎＭ、１５ｎＭ、１７．５ｎＭ、２０ｎＭ、２２．５ｎＭ及び２５ｎＭであった。結果を、図６に示す。
【００６６】
ｓＧＡＧ合成のＬＭＰ−１刺激
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから得た腰椎間板細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を、種々の用量（感染多重度０、５、１０、２５、５０）のＬＭＰ−１ヌクレオチド配列の挿入断片を含有するアデノウイルス（ＡｄＬＭＰ−１）で細胞を処理し、そしてこれを単層にて６日間培養することによって行い、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＬＭＰ−１過剰発現の影響を判定した。ＤＭＭＢ法を用いて、培地中の硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧ）を定量した。リアルタイムＰＣＲを用いて、アグリカン、過剰発現ＬＭＰ−１、ＢＭＰ−２、４、６及び７のｍＲＮＡレベルを定量した。直接ＥＬＩＳＡ法を用いて、培地中のＢＭＰ−２、４、６及び７のレベルを定量した。ＬＭＰ−１による椎間板細胞のプロテオグリカン産生亢進にＢＭＰが関与することを実証するため、ＢＭＰ−２、４、６及び７の活性を特異的に遮断する分子（ノギン）を、異なる濃度で、ＡｄＬＭＰ−１処理細胞に加えた。
【００６７】
Ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療実験を、ニュージーランドホワイトウサギにおいて行った。腰椎間板に、ＡｄＬＭＰ−１（実験用）、またはマーカー遺伝子を保有するアデノウイルス（ＡｄＬａｃＺ−対照）のいずれかを、異なる３用量（１０６、１０７及び１０８ｐｆｕ／椎間板）にて注射した。３週間後に、注射された椎間板を回収し、そして総ＬＭＰ−１（内因性）、過剰発現ＬＭＰ−１、アグリカン、ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７のｍＲＮＡレベルを測定した。
【００６８】
感染多重度（ＭＯＩ）２５のＡｄＬＭＰ−１は、最大レベルのｓＧＡＧ亢進を誘導するのに十分であった。６日間の単層培養期間が、ＡｄＬＭＰ−１処理（ＭＯＩ ２５）後に最大レベルのｓＧＡＧ亢進に達するのに必要とされた。アグリカンのｍＲＮＡは、対照と比べて２倍増加した。細胞をアルギン酸中で培養した場合、ｓＧＡＧ産生に対するＡｄＬＭＰ−１処理の効果は、３週間持続した。ＡｄＬＭＰ−１処理後６日に、ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７のｍＲＮＡレベルは、それぞれ対照の３．０±０．２及び２．８±０．３倍（ｐ＜０．０１）有意に増加した。ＢＭＰ−４及びＢＭＰ−６のｍＲＮＡレベルは、変わらなかった。培地中のＢＭＰ−２及びＢＭＰ７のタンパク質レベルは、対照と比べて有意に増加した（ｐ＜０．０１）。対照的に、ＢＭＰ−４及びＢＭＰ−６のタンパク質レベルは、上昇しなかった。３２００ｎｇ／ｍｌのノギンは、ＡｄＬＭＰ−１によるプロテオグリカンの亢進を完全に遮断した。内因性レベルのＬＭＰ−１ ｍＲＮＡが、腰髄核中に検出された。１０７ｐｆｕ／椎間板のＡｄＬＭＰ−１を注射されたｉｎ ｖｉｖｏ椎間板では、対照と比べてＬＭＰ−１、ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７のｍＲＮＡレベルが有意に上昇した。
【００６９】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットの腰椎間板細胞を用いて行った。両側スチューデントｔ検定を用いて、実験群を対照群と比較した。図中の誤差バーは、１ＳＥＭ（標準誤差）を示す。
【００７０】
ヒトＬＭＰ−１遺伝子のｃＤＮＡを保有する複製欠損性５型アデノウイルスを用いた（ＡｄＬＭＰ−１）。ＳＤ線維輪細胞を用いた単層培養実験を行い、ウイルス用量と過剰発現ＬＭＰ−１ ｍＲＮＡ発現との関連性を、ウイルスによって送達されるＬＭＰ−１ ｃＤＮＡのみに特異的なプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲ法を用いて、判定した。ＳＤ線維輪細胞を用いた単層培養実験を行い、ウイルス用量とｓＧＡＧ産生との関連を判定した。ｓＧＡＧレベルを、ＤＭＭＢ法を用いて測定した。ＡｄＬＭＰ−１の最適用量を、ｓＧＡＧの産生をプラトーレベルに導く最低用量として定めた。最適用量（２５ＭＯＩ）を用いて、経時的な実験（９日間）を行い、ｓＧＡＧの産生がプラトーレベルに達するのに必要な最短期間（６日間）を決定した。先に決定された最適ウイルス量及び時間（２５ＭＯＩのＡｄＬＭＰ−１、及び処理後６日）を用いて、ＡｄＬＭＰ−１処理された線維輪細胞のアグリカンのｍＲＮＡレベルを、対照と比較した。髄核細胞が、線維輪細胞と同じように反応することを確かめるため、ｓＧＡＧ産生及び細胞数に対するＡｄＬＭＰ−１の影響を、処理後６日に、２５ＭＯＩにて、線維輪細胞及び髄核細胞の双方について判定した。ＡｄＬＭＰ−１処理のより長期の影響を検討するため、アルギン酸中で培養されたＳＤ線維輪細胞のアルギン酸中のｓＧＡＧの蓄積を、１、２及び３週間後に判定した。すべての実験を、少なくとも２回繰り返した。
【００７１】
ＳＤ線維輪細胞を用いた単層培養実験を、ＭＯＩ ２５のＡｄＬＭＰ−１を用いて行った。簡潔に記すと、ＬＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６及びＢＭＰ−７のｍＲＮＡレベルを、ＡｄＬＭＰ−１処理後第０．５、１、３及び６日に、リアルタイムＰＣＲ解析を用いて測定した。ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６及びＢＭＰ−７のレベルを、直接ＥＬＩＳＡ法を用いて、処理後６日に培地中にて測定した。ＢＭＰ活性を遮断する影響を判定するために、ノギンを、ＡｄＬＭＰ−１処理開始時に培地に加えた。ＡｄＬＭＰ−１で処理後の、種々の濃度のノギン存在下または非存在下でのｓＧＡＧレベルの変化を、６日間の実験において測定した。
【００７２】
アグリカン、ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７に対するＬＭＰ−１投与（ＡｄＬＭＰ−１による）のｉｎ ｖｉｖｏ影響を判定するために、４例のニュージーランドホワイト（ＮＺＷ）ウサギ（３〜４ｋｇ）を用いた。前部腰椎間板Ｌ２／３、Ｌ３／４、Ｌ４／５及びＬ５／６を、左後腹膜からのアプローチを介して露出させた。１０７プラーク形成単位（plaque-forming units、pfu）の実験用ウイルス（ＡｄＬＭＰ−１）または対照ウイルス（ＡｄＧＦＰ−緑色蛍光タンパク質のｃＤＮＡを挿入断片として有する、５型アデノウイルス）のいずれかを、露出させた椎間板髄核のそれぞれに、交互に注射した（すなわち、各ウサギにおいて、二つの椎間板にはＡｄＬＭＰ−１を注射し、そして二つの椎間板にはＡｄＧＦＰを注射）。ウイルスを、３０Ｇハミルトンシリンジを介して、１０μｌのリン酸緩衝生理食塩液中にて送達することによって、投与した。３週間後に、注射された腰椎間板から得た髄核組織を回収した。２例のウサギから得た髄核組織を、対照または実験椎間板群のいずれかにプールして、さらなる解析に十分なｍＲＮＡを得た。逆転写及びリアルタイムＰＣＲを用いて、総ＬＭＰ−１、ＢＭＰ−７及びアグリカンのｍＲＮＡレベルを定量した。総ＬＭＰ−１のプライマーは、内因性及び過剰発現ＬＭＰ−１の双方を同定するように、設計された。
【００７３】
第二のｉｎ ｖｉｖｏ実証においては、種々の用量のＡｄＬＭＰ−１ウイルスを用いて、用量反応の関係性を確立した。異なる３用量（１０６、１０７、１０８ｐｆｕ）のＡｄＬＭＰ−１及び単一用量（１０７ｐｆｕ）のＡｄＧＦＰを、投与した。この実験では、それぞれの動物のすべての椎間板に、先の実験におけるような交互のウイルス種ではなく、単一用量のウイルスを注射した。８例のＮＺＷウサギ（３〜４ｋｇ）を、４つのウイルス群に２例ずつのウサギで、用いた。ウサギを３週間後に屠殺し、そして髄核を回収した。各処理群内から回収した組織をプールし、ｍＲＮＡを単離し、そしてこれを用いて対応するｃＤＮＡを作製した。リアルタイムＰＣＲを用いて、総ＬＭＰ−１、過剰発現ＬＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７及びアグリカンのｍＲＮＡレベルを定量した。
【００７４】
様々な用量（ＭＯＩ ０、１０、２５及び５０）でウイルス処理した１２時間後における、過剰発現ＬＭＰ−１のｍＲＮＡの相対量を、過剰発現ＬＭＰ−１のｍＲＮＡの最低検出可能レベル（ＡｄＬＭＰ−１ ＭＯＩ ５）を基準に正規化した。ＡｄＬＭＰ−１の用量を増加させると、過剰発現ＬＭＰ−１のｍＲＮＡに、ＭＯＩ ５と比べて統計学的に有意な増加が生じた。非処理対照群またはＡｄＬａｃＺ対照群において、検出可能なレベルの過剰発現ＬＭＰ−１のｍＲＮＡはみられず、このことは、ＡｄＬＭＰ−１が、線維輪細胞において用量相関的にＬＭＰ−１の過剰発現を誘導することを示唆した。
【００７５】
線維輪細胞の培地中ｓＧＡＧ濃度を、様々な用量のＡｄＬＭＰ−１による処理後６日に、測定した。第６日における培地中ｓＧＡＧ濃度は、培地交換からｓＧＡＧ測定までの３日間の期間中に細胞によって産生された総ｓＧＡＧの指標であり、したがって、この期間中のｓＧＡＧ産生速度の指標である。データを、処理と非処理対照間の割合として表す。ＬＭＰ−１の投与（ＭＯＩ ２５のＡｄＬＭＰ−１による）は、最も高いｓＧＡＧレベルを提供し、これは、対照の３．１±０．２倍（ｐ＜０．０１）であった。ＭＯＩ ２５またはＭＯＩ ５０で処理された細胞間では、培地中ｓＧＡＧレベルに有意な差はなかった。このＭＯＩ ２５のＡｄＬＭＰ−１の用量は、最大のｓＧＡＧ応答に達することが可能な最低用量であったため、発明者は、実験の残りに用いる用量としてＭＯＩ ２５を選択した。
【００７６】
時間経過実験を行って、ＭＯＩ ２５のＡｄＬＭＰ−１で処理後の実験の長さを変えた影響を、判定した。線維輪細胞をＬＭＰ−１（ＭＯＩ ２５のＡｄＬＭＰ−１）で処理し、そして３日間の増殖期間中のｓＧＡＧ産生を測定した。結果を、各時点におけるＤＮＡ含量によって正規化し、そして同時点の非処理対照に対する割合として表した。ｓＧＡＧレベルは、第３日に１．６±０．２（ｐ＜０．０１）に、第６日に２．９±０．１（ｐ＜０．０１）に、第９日には２．８±０．１（ｐ＜０．０１）に増加した。第６日から第９日までの間に、ｓＧＡＧレベルの増加はみられず、このことは、第６日までにプラトーレベルに達したことを示唆した。
【００７７】
ＬＭＰ−１によるアグリカン合成の誘導
アグリカンは椎間板の主なプロテオグリカンであるため、アグリカンのコアタンパク質のｍＲＮＡレベルを、ＡｄＬＭＰ−１で処理後６日に測定した。定量性リアルタイムＰＣＲ法を用い、そしてデータを非処理対照に対する割合として表した。ＡｄＬＭＰ−１処理（ＭＯＩ ２５）後に、アグリカンのｍＲＮＡレベルは、対照の２．１±０．１（ｐ＜０．０１）倍であった。ＡｄＬａｃＺ処理（ＭＯＩ ２５）後に、アグリカンのｍＲＮＡレベルは変わらず、対照の１．０±０．１６倍であった。これらの結果は、ｓＧＡＧの実験と併せて、ＬＭＰ−１が椎間板細胞のプロテオグリカン産生を刺激することを、実証した。
【００７８】
最適なＡｄＬＭＰ−１活性に必要な用量及びタイミングを培養系において確立したことから、次いで、発明者は、ＡｄＬＭＰ−１によって投与されるＬＭＰ−１が線維輪細胞及び髄核細胞に及ぼす影響を、比較した。ラット線維輪細胞及び髄核細胞を、ＭＯＩ ２５のＡｄＬＭＰ−１で処理し、そして各細胞種のｓＧＡＧ濃度を、第６日に測定した。ｓＧＡＧ濃度を、細胞数の軽微な変化を明らかにするために、ＤＮＡ含量によって正規化した。線維輪細胞及び髄核細胞種の非処理対照を比較するため、結果を、非処理対照を基準に正規化しなかった。非処理の線維輪細胞及び髄核細胞の結果は、それぞれ０．６±０．０４ ｓＧＡＧ／ＤＮＡ、及び１．０±０．１２ ｓＧＡＧ／ＤＮＡであった。この差は統計学的に有意であり（ｐ＜０．０５）、そして、非処理髄核細胞が、線維輪細胞よりも一細胞につきより多くのｓＧＡＧを産生することを、示唆した。ＡｄＬＭＰ−１処理後、線維輪細胞及び髄核細胞の結果は、それぞれ１．５±０．０８ ｓＧＡＧ／ＤＮＡ（ｐ＜０．０１）、及び２．４±０．１ ｓＧＡＧ／ＤＮＡ（ｐ＜０．０１）であった。これらの値は、そのそれぞれの非処理対照と比べて、統計学的に有意な増加を示した。非処理細胞からＡｄＬＭＰ−１処理細胞への相対的な増加は、線維輪細胞と髄核細胞との間で同様であった。第６日におけるＡｄＬＭＰ−１処理及び非処理の細胞数を、ＤＮＡ含量を測定することによって決定した。線維輪細胞のＤＮＡ含量は、非処理対照と比べて１．２倍増加したが（ｐ＜０．０１）、しかし、髄核細胞のＤＮＡ含量は、ＡｄＬＭＰ−１による影響を受けなかった。このことは、ＬＭＰ−１が、軽度であるがしかし有意な線維輪細胞数の増加を誘導するが、髄核細胞では誘導しないことを、示唆した。
【００７９】
ＬＭＰ−１の投与（ＡｄＬＭＰ−１による）がｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるｓＧＡＧ産生に及ぼす影響を、数週間の期間、試験するために、発明者は、アルギン酸培養系を用いた。アルギン酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養液中で長期間、軟骨細胞の表現型を維持するのに重要な細胞の三次元マトリックスを、提供する。単層で増殖させた線維輪細胞を、ＭＯＩ ２５のＡｄＬＭＰ−１で処理し、次いで２４時間後にアルギン酸培養液に移した。細胞を、１、２及び３週間の期間、培養した。１週間後に、ＡｄＬＭＰ−１群におけるｓＧＡＧレベルは、非処理対照の１．５±０．０６（ｐ＜０．０１）倍であった。２週間後に、ＡｄＬＭＰ−１処理群におけるｓＧＡＧレベルは、非処理対照の２．９±０．３（ｐ＜０．０１）倍に増加した。この差は、３週間後において維持され；ＡｄＬＭＰ−１処理群におけるｓＧＡＧレベルは、対照の２．９±０．１（ｐ＜０．０１）倍であった。このことは、ＡｄＬＭＰ−１が、少なくとも３週間、培養液中で、アルギン酸中のｓＧＡＧ増加を維持するのに効果的であることを、示唆した。
【００８０】
プロテオグリカン産生に対するＬＭＰ−１過剰発現の効果を実証したことから、我々は、ＬＭＰ−１の過剰発現がこの効果を誘導するメカニズムを検討した。過剰発現ＬＭＰ−１及びＢＭＰ（ＢＭＰ−２、４、６及び７）のｍＲＮＡの変化の時間経過を、測定した。これらのＢＭＰは、白血球及び骨芽細胞において、ＬＭＰ−１の過剰発現によって刺激されることが、これまでに示されていた。
【００８１】
線維輪細胞をＭＯＩ ２５のＡｄＬＭＰ−１で処理後の、過剰発現ＬＭＰ−１の時間依存的な変化を、測定した。データを、非処理対照に対する割合としてでなく、過剰発現ＬＭＰ−１の最大ｍＲＮＡレベル（第６日）の百分率として表したが、これは、対照において過剰発現ＬＭＰ−１のｍＲＮＡが検出可能でなかったためである。ＬＭＰ−１のｍＲＮＡは、処理後１２時間に検出可能であり、そして調査した最終時点（第６日）まで増加し続けた。このことは、過剰発現ＬＭＰ−１が、ＬＭＰ−１投与後早ければ１２時間後には下流の遺伝子に影響を与え得ることを、示唆した。
【００８２】
ＭＯＩ ２５のＡｄＬＭＰ−１で処理後の、ＢＭＰのｍＲＮＡレベルの時間経過も、リアルタイムＰＣＲによって測定し、そして各時点において非処理対照に対する割合として算出した。ＢＭＰ−２のｍＲＮＡは早期に亢進し、ＬＭＰ−１処理後１２時間に、統計学的に有意な（ｐ＜０．０１）増加に達した。ＢＭＰ−２のｍＲＮＡ増加は、第３日までにプラトーレベルに達した。ＢＭＰ−７のｍＲＮＡはＢＭＰ−２よりも遅れて亢進し、第３日（ｐ＜０．０１）及び第６日（ｐ＜０．０１）に、統計学的に有意な増加に達した。ＢＭＰ−４及びＢＭＰ−６のｍＲＮＡレベルには、いずれも非処理対照のものと有意な差はなかった。
【００８３】
ＬＭＰ−１のｍＲＮＡの過剰発現が、線維輪細胞においてＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７の亢進をもたらすことを確立したことから、発明者は、このｍＲＮＡ増加が、ＢＭＰタンパク質の培養液への分泌増加と相関するかどうかを検討した。ＥＬＩＳＡアッセイを、調製された培地中のＢＭＰ−２、４、６及び７タンパク質レベルを定量するために行った。単層にて培養された線維輪細胞を、ＭＯＩ ２５のＡｄＬＭＰ−１で処理した。培地を第３日に一度交換し、そして培地を第６日に解析した。したがって、被験試料は、培養最終３日間（第４〜６日）に分泌されたＢＭＰを含有した。培地中のＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７のタンパク質レベルは、それぞれ、非処理対照の３．５±０．４（ｐ＜０．０１）倍及び２．５±０．３（ｐ＜０．０５）倍であった。ＢＭＰ−４及びＢＭＰ−６のタンパク質レベルには、非処理対照のものと有意な差はなく、このことは、ｍＲＮＡについて得られた結果と一致した。
【００８４】
ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７のｍＲＮＡ及びタンパク質が、ＬＭＰ−１によって亢進したことから、発明者は、これらのＢＭＰの遮断が、ＬＭＰ−１によって誘導されるｓＧＡＧ産生増加を妨げるかどうかを、検討した。単層においてＭＯＩ ２５のＡｄＬＭＰ−１とともに培養された線維輪細胞を、ＢＭＰ阻害剤であるノギンで、培地中にて処理し、そしてｓＧＡＧレベルを第６日に測定した。ＡｄＬＭＰ−１のみで処理された細胞では、ｓＧＡＧレベルが増加したが（非処理対照の２．７±０．３倍）、３２００ｎｇ／ｍｌのノギン及びＭＯＩ ２５のＡｄＬＭＰ−１で処理された細胞では、ｓＧＡＧレベルは変わらず（非処理対照の１．１±０．１倍）、このことは、ノギンがＡｄＬＭＰ−１の影響を完全に遮断することを示唆した。ノギン（３２００ｎｇ／ｍｌ）のみで処理された細胞では、ｓＧＡＧレベルはほとんど変わらないままであり（非処理対照の０．８±０．１倍）、このことは、ノギンによる毒性的影響がないことを示唆した。ＡｄＬＭＰ−１によって誘導されるｓＧＡＧ産生に及ぼすノギンの阻害的影響は、濃度依存性であった。
【００８５】
対照の椎間板（ＡｄＧＦＰを注射された椎間板）におけるアグリカン、ＢＭＰ−７及びＬＭＰ−１のｍＲＮＡの内因性レベルを、髄核において検出した。内因性ｍＲＮＡレベルを用いて、ＡｄＬＭＰ−１を注射された椎間板におけるアグリカン、ＢＭＰ−７及びＬＭＰ−１のｍＲＮＡの増加を、算出した。
【００８６】
ＡｄＬＭＰ−１を注射された椎間板は、ＡｄＧＦＰを注射された椎間板よりも、総ＬＭＰ−１のｍＲＮＡを、８３０％高いレベルで発現した。ＡｄＬＭＰ−１によるＬＭＰ−１の投与は、対照群よりも１１００％、ＢＭＰ−７のｍＲＮＡレベルの増加（ｐ＜０．０５）をもたらした。アグリカンのｍＲＮＡレベルは、対照群よりも６６％増加した（ｐ＜０．０５）。
【００８７】
ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＬＭＰ−１及びアグリカンのｍＲＮＡの内因性レベルも、検出した。ＡｄＬＭＰ−１の用量増加と総ＬＭＰ−１のｍＲＮＡとの相関がみられた。ＡｄＬＭＰ−１によるＬＭＰ−１の投与は、１０７ｐｆｕ／椎間板の用量で最大限に、ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７のｍＲＮＡレベルを有意に増加させた（ｐ＜０．０５）。１０７ｐｆｕ／椎間板の用量のＡｄＬＭＰ−１は、対照群より５０％と（ｐ＜０．０５）、アグリカンのｍＲＮＡを最も増加させた。
【００８８】
ＬＭＰ−１の椎間板細胞への投与は、ｓＧＡＧの産生増加及びアグリカンのｍＲＮＡレベルの増加をもたらした。ＬＭＰ−１の投与は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＢＭＰ−２及びＢＭＰ７のｍＲＮＡならびにタンパク質レベルの増加をもたらし、そしてＬＭＰ−１の投与がプロテオグリカン産生亢進に及ぼす影響を、ＢＭＰ阻害剤であるノギンの投与によって遮断することが可能であった。
【００８９】
１１ヶ月齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを屠殺し、そして腰椎及び尾から得た椎間板組織を、無菌条件下で回収した。線維輪及び髄核を、別々に、解剖しそして小さい角切りにした。椎間板組織を、１００単位／ｍｌペニシリン及び１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有する、ダルベッコ変法イーグル培地及びハムＦ１２培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２；ギブコＢＲＬ社、グランドアイランド、ニューヨーク州、米国）中に入れた。椎間板組織を、培地中で、０．２％プロナーゼ（シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ州、米国）を用いて３７℃にて１時間処理し、次いで、０．０２５％コラゲナーゼ（シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ州、米国）を用いて３７℃にて６時間処理した。単離された細胞を洗浄し、そして７０ｍｍメッシュ（ファルコン社、フランクリンレイクス、ニュージャージー州、米国）を介してろ過し、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、１００単位／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン及び５０ｍｇ／ｍｌアスコルビン酸塩を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地１２ｍｌを入れた７５ｃｍ２フラスコに、加えた。細胞を、加湿された５％ＣＯ２中で３７℃にて、増殖させた。培養液を、およそ８日間、２日毎に交換した。
【００９０】
二つの異なるウイルスを用いた。ＣＭＶプロモーターによって駆動される、ヒトＬＭＰ−１ ｃＤＮＡを含有する複製欠損性５型アデノウイルス（ＡｄＬＭＰ−１）を、実験用ウイルスとして用いた。対照ウイルスは、ｌａｃＺのｃＤＮＡを含有する同様な複製欠損性５型アデノウイルスからなった。
【００９１】
椎間板細胞の初代培養物がコンフルエントになったとき、細胞を、４００，０００細胞／ウェルにて６ウェルプレートに継代培養した。３日後に、細胞を、ヒトＬＭＰ−１遺伝子またはＬａｃＺ遺伝子のいずれかのｃＤＮＡを含有するアデノウイルス（それぞれ、ＡｄＬＭＰ−１とＡｄＬａｃＺ）で、処理した。細胞数を、血球計数器を用いて対照ウェルをカウントすることによって、第０日に測定した。ウイルス用量を、感染多重度（ＭＯＩ）、すなわちプラーク形成単位（ｐｆｕ）／細胞の数として、表した。これは、本質的には、一つの椎間板細胞が曝露されたリコンビナントアデノウイルスのプラーク形成単位の数である。培養された細胞を、各実験において指定されたように、異なるＭＯＩ（０、１０、２５、５０）のＡｄＬＭＰ−１またはＡｄＬａｃＺを用いて、３００ｍｌの０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ／Ｆ−１２中で３７℃にて３０分間処理した。次いで、培養容量を、１％ＦＢＳ、１００単位／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン及び５０ｍｇ／ｍｌビタミンＣを含有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を用いて、２．０ｍｌに上昇させた。培地を、実験期間中、３日毎に交換した。
【００９２】
培養液の硫酸化グリコサミノグリカン（ｓＧＡＧ）含量を、１，９−ジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ）法を用いてアッセイした。培養液２ｍｌを、セントリコンＹＭ−５０遠心フィルター（ミリポア・Ｃｏ．、ベッドフォード、マサチューセッツ州、米国）を用いて、遠心分離し（５０００ｘＧで３０分間）、ｓＧＡＧを濃縮した。試料溶液（２０ｍｌ）を、９６ウェルのマイクロタイタープレート中で、２００ｍｌのＤＭＭＢ色素溶液と穏やかに混合し、そして光学濃度（ＯＤ）を、５２０ｎｍ波長フィルターにて直ちに検査した。標準曲線を、硫酸コンドロイチン（シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ州、米国）の連続希釈系列を用いて、作図した。培地中の総ｓＧＡＧを、ＤＮＡ含量によって正規化し、そして非処理対照に対する割合として表した。
【００９３】
細胞数を、各ウェルのＤＮＡ含量によって決定し、そして、先に記載したように、ＤＮＡ含量を、ヘキスト色素３３２５８（Polysciences社、Warrington、ペンシルバニア州、米国）法を用いて測定した。培養された細胞を、パパイン（１０単位／ｍｌ）に曝露することによって、プレートから除いた。次いで、培養された細胞をペレット状にし、そして６０℃にて３時間インキュベートした。２０μｌのパパイン消化物のアリコットを、２００ｍｌのヘキスト色素３３２５８溶液と、９６ウェルのフルオロプレート中で混合した。発光及び励起スペクトルを、ルミネセンス分光器ＬＳ ５０Ｂ（パーキン−エルマー社、Wellesly、マサチューセッツ州、米国）において、それぞれ４５６ｎｍ及び３６５ｎｍにて測定した。標準曲線を、子ウシ胸腺ＤＮＡ（シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ州、米国）の既知の濃度を用いて、各測定時点について作製した。
【００９４】
アルギン酸ビーズ培養は、長期培養において軟骨細胞の表現型を維持するのに有用である。この方法は、３週間の培養においてＡｄＬＭＰ−１の影響を判定するためのものである。細胞を、上記のように、単層培養において処理した。１日後に、細胞を、トリプシン処理によって剥離させ、そして培地で２回洗浄した。単離された細胞を、０．６％低粘度無菌アルギン酸塩（シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ州、米国）溶液中に、６００，０００細胞／ｍｌにて再懸濁した。アルギン酸ビーズを形成させるため、細胞を、１０ｍｌプラスチックシリンジに取り付けた２１ゲージ針を介して、１滴ずつ、０．１０２Ｍ ＣａＣｌ＋０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液中に加えた。１０分後に、新たに形成されたビーズ（およそ１２，０００細胞／ビーズを含有）を、無菌０．９％ＮａＣｌ溶液で３回、続いてＤＭＥＭ／Ｆ−１２で２回、洗浄した。線維輪細胞を含有するビーズを、１％ＦＢＳ、１００単位／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン及び５０ｍｇ／ｍｌビタミンＣを含有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で、６ウェルプレートにおいて別々に培養した。培地を、異なる期間中（１、２及び３週間）、２日毎に交換した。アルギン酸ビーズを、３５０ｍｌのクエン酸ナトリウムバッファー（５５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ−クエン酸、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に溶解した。細胞を、遠心分離によってペレット状にし、そして溶解液中のｓＧＡＧ含量を、上記のＤＭＭＢ法で測定した。細胞ペレットに残存するｓＧＡＧ含量は、懸濁液中のものと比べて、無視できるほどであった。結果を、溶解液のｓＧＡＧを用いて、非処理対照群の倍数増加として記載した。
ｍＲＮＡレベルの定量
リアルタイムＰＣＲを用いて、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７及び過剰発現ＬＭＰ−１のｍＲＮＡレベルを、定量的に測定した。遺伝子のすべてのプライマーを、アガロースゲル上で産物のサイズを決定することによって、そしてアンプリコンをＤＮＡ配列決定することによって、確認した。１８Ｓのレベルを各試料において測定し、内在性対照として用いた。
【００９５】
各試料の総ＲＮＡを、グラニジウム・チオシアネート−フェノール−クロロホルム技術を用いた単一工程の方法によって、抽出した。単離ＲＮＡの濃度を、分光光度計（ＤＵ−５００；ベックマン社、フラトン、カリフォルニア州、米国）を用いて、２６０ｎｍ波長にて測定した。ＲＮＡを、ＤＮＡ分解酵素１（アンビオン・Ｉｎｃ．、テキサス州、米国）で処理して、試料のＤＮＡ混入を除去した。逆転写を、総ＲＮＡ２ｍｇ；トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州、米国）３０Ｕ；デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアニジン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）各１ｍＭ；及び、オリゴ（ｄＴ）１５プライマー１ｍｇを用いて、４２℃にて４５分間、４０ｍｌ容量中で行った。ＰＣＲを、Ａｍｐｌｉｔａｑ（商標登録）ＤＮＡポリメラーゼを用いて、３０サイクル（９５℃、３０秒間；６２℃、３０秒間；７２℃、４５秒間）行った。ＤＮＡの混入がないことを確認するため、逆転写酵素非存在下で処理したＲＮＡ試料も、ＰＣＲにかけ：ＰＣＲ産物がないことで、ＤＮＡ混入していないと確認した。
【００９６】
リアルタイムＰＣＲは、迅速で、信頼性があり、そして再現可能な、特定のｍＲＮＡの定量性検出法であると、報告されている。ＳＹＢＲ（商標登録）グリーン・リアルタイムＰＣＲキット（Applied Biosystems社、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国）を用いたリアルタイムＰＣＲ法を用いて、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７及びアグリカンの定量性ｍＲＮＡ解析を行った。２５マイクロリットル（２５ｍｌ）の反応容量は、ｃＤＮＡ ５ｍｌ、各プライマー（ＢＭＰ−２、−４、−６、−７、及び１８Ｓ）３．７５ピコモル、及びＳＹＢＲ（商標登録）グリーン・マスターミックス（２ｘ、バイオラッド社、ヘラクレス、カリフォルニア州、米国）を含んだ。過剰発現ＬＭＰ−１及び１８ＳのｍＲＮＡレベルを定量するために、ＴａｑＭａｎ（商標登録）リアルタイムＰＣＲキット（Applied Biosystems社、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国）を用いたリアルタイムＰＣＲ法も、行った。２５マイクロリットル（２５ｍｌ）の反応容量には、ｃＤＮＡ ５ｍｌ、各プライマー３．７５ピコモル、及びＴａｑＭａｎ（商標登録）ＰＣＲマスターミックス（２ｘ、バイオラッド社、ヘラクレス、カリフォルニア州、米国）が含まれた。
【００９７】
リアルタイムＰＣＲを、ＧｅｎｅＡｍｐ（商標登録）；５７００配列検出システム（Applied Biosystems社、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国）を用いて、以下の３工程のプロトコールで行った；工程１：５０℃にて２分間、工程２：９５℃にて１０分間、及び、工程３：（９５℃にて１５秒間、６０℃にて１分間）ｘ４５サイクル。増幅の特異性を確認するため、ＰＣＲ産物を、転移曲線解析にかけた。先に記載のように、各反応のthreshold cycle（Ct）を、競合的＿ΔΔＣｔ法を用いて、１８Ｓを基準として標準化した。
【００９８】
ＢＭＰ２、４、６及び７のＥＬＩＳＡアッセイ
ＢＭＰの標準曲線を、０．０５ｍｏｌ／Ｌ重炭酸バッファーに溶解した、ヒトＢＭＰ２、４、６及び７（Genetics Institute、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）の漸増させた濃度（０．１ｎｇ／１００μＬ／ウェル〜１０００ｎｇ／１００μＬ／ウェル）を用いて、作図した。１００マイクロリットルの試料を、トリプリケートで各ウェルに加えた。４℃にて一晩インキュベートした後、プレートを、０．５％Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）添加０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩液で３回洗浄し、そして非反応部位を、１％ウシアルブミン（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州）を用いて、室温にて１時間ブロッキングした。プレートをＰＢＳＴで洗浄後に、一次抗体（１：１０００）を１００マイクロリットルにて各ウェルに分注し、そして室温にて２時間インキュベートした。ＢＭＰ２、４及び６に対するヤギポリクローナル抗体（サンタクルーズ・Ｉｎｃ、サンタクルーズ、カリフォルニア州）、ならびＢＭＰ７に対するウサギ抗体（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州）が、用いられた。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、次いで、アルカリホスファターゼ結合抗ヤギＩｇＧ及び抗ウサギＩｇＧ（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州）を用いて、室温にて１時間、それぞれインキュベートした。基質であるｐ−ニトロフェニルリン酸塩（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州）を用いて発色させ、２０分後に３Ｎ ＮａＯＨで反応を止めた。呈色を、Ｅｌｘ ８００−マイクロプレートリーダー（バイオ−テック・インスツルメント社、Winooska、バーモント州）を用いて４０５ｎｍにて吸光度差を測定することによって、定量した。
【００９９】
結果を定量化するため、線形回帰プロットを、各標準品について作製した。すべての場合において、試料濃度を、標準品と同じ吸光度の対応値に準じて、標準品の線形回帰プロットから外挿した。
【０１００】
ノギン糖タンパク質によるＢＭＰの阻害
ノギンは、ＢＭＰ−２、４、６及び７と高特異的に結合し、そしてこれらのＢＭＰがその同族受容体を活性化させることを妨げる、糖タンパク質である。マウスノギン（ノギン−ＦＣ・シグマケミカル社、セントルイス、ミズーリ州、米国）の形態を実験において用い、ＡｄＬＭＰ−１処理後にＢＭＰを特異的に遮断する影響を、判定した。異なるノギン濃度（１００、２００、４００、８００、１６００及び３２００ｎｇ／ｍｌ）を、ＡｄＬＭＰ−１（ＭＯＩ ２５）処理後第０日及び第３日に、細胞に載せた。第６日に、上記のＤＭＭＢ法を用いて、条件培地を、ｓＧＡＧの産生を検討するためにアッセイした。結果は、ＬＭＰ−１の影響が、ノギンの投与によって遮断され得ることを示唆し、このことは、ＬＭＰ−１活性が、これによるＢＭＰの誘導に部分的に関連することを、実証した。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】図１は、線維輪細胞をＬＭＰ−１（ＭＯＩ ２５のＡｄＬＭＰ−１）で処理後６日の、培地中ＢＭＰタンパク質レベル（量）のグラフである。ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７のタンパク質レベルは有意に増加したが、しかしＢＭＰ−４及びＢＭＰ−６のタンパク質レベルは、非処理対照細胞の培地と有意な差がなかった。各結果を、非処理細胞の値に比例した割合として表す。７試料の平均値及び標準誤差を、報告する（＊ｐ＜０．０５ ＊＊ｐ＜０．０１ ｖｓ．ＮＴ）
【図２】図２は、線維輪細胞をＬＭＰ−１（ＭＯＩ ２５のＡｄＬＭＰ−１）で処理後の、経時的なＢＭＰのｍＲＮＡレベルを示す。ＢＭＰ−２のｍＲＮＡレベルは、ＡｄＬＭＰ−１で処理後早ければ１２時間に有意に亢進し、そしてＡｄＬＭＰ−１処理後３日にプラトーに達した。ＢＭＰ−７のｍＲＮＡレベルは、ＡｄＬＭＰ−１で処理後３日に、有意に増加した。各結果を、同時点における非処理細胞の値に対する割合として表す。６試料の平均値及び標準誤差を、報告する（対応する時点について、＊＊ｐ＜０．０１ ｖｓ．ＮＴ）
【図３】図３は、リアルタイムＰＣＲによって測定された、ＬＭＰ−１（ＡｄＬＭＰ−１）で処理後の線維輪細胞中のアグリカンｍＲＮＡレベルを、グラフに描いたものである。アグリカンのｍＲＮＡレベルは、ＭＯＩ ２５のＡｄＬＭＰ−１で処理後６日に、非処理細胞と比べて有意に増加した。アグリカンのｍＲＮＡレベルは、ＡｄＬａｃＺで処理された細胞において、非処理細胞と比べて変わらなかった。各結果を、非処理細胞の値に対する割合として、表す。９試料の平均値及び標準誤差を、報告する。ＡｄＬＭＰ−１：ＭＯＩ ２５、ＡｄＬａｃＺ：ＭＯＩ ２５（＊＊ｐ＜０．０１ ｖｓ．ＮＴ）。
【図４】図４は、Ｈａｒｌａｎ無胸腺ラットにおける、ＰＴＤ／ＬＭＰ−１融合タンパク質によるＬＭＰ−１投与のパラメータ及び結果を要約した表である。
【図５】図５は、ニュージーランドホワイトウサギにおける、ＰＴＤ／ＬＭＰ−１融合タンパク質によるＬＭＰ−１投与のパラメータ及び結果を要約した表である。
【図６】図６は、Ｈａｒｌａｎ無胸腺ラット、及び示された箇所ではニュージーランドホワイトウサギにおける、ＰＴＤ／ペプチド融合タンパク質による、示された骨誘導ペプチド投与の結果を要約した表である。骨成長は、Ｘ線によって検出され、そして、示された箇所では触診も可能であった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞透過性骨誘導ポリペプチドを作製する方法であって、
ａ） 細胞透過性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと；
ｂ） 該細胞透過性ポリペプチドと機能可能に連結されている骨誘導ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、該骨誘導ポリペプチドが、該細胞透過性ポリペプチドとの融合タンパク質の一部として発現するように配置されたポリヌクレオチドと；
ｃ） 該ポリヌクレオチドの転写を導くように配置されたプロモーターと；
を含む発現コンストラクトを、適切な宿主細胞中に導入することを含む、上記方法。
【請求項２】
発現コンストラクトがさらに精製タグを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞透過性ポリペプチドが、ＨＩＶ−ＴＡＴ、ＶＰ−２２、増殖因子のシグナルペプチド配列、Ｐｅｐ−１及びショウジョウバエＡｎｔｐペプチドからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細胞透過性ポリペプチドが、ＨＩＶ−ＴＡＴタンパク質導入ドメインである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
骨誘導ポリペプチドが、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１及びＳｍａｄからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
骨誘導ポリペプチドが、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
哺乳動物において骨形成を誘導する方法であって、タンパク質導入ドメインと少なくとも一つの骨誘導ポリペプチドとを含む、有効量の融合ポリペプチドを投与することを含む、上記方法。
【請求項８】
タンパク質導入ドメインが、ＨＩＶ−ＴＡＴ、ＶＰ−２２、増殖因子のシグナルペプチド配列、Ｐｅｐ−１及びショウジョウバエＡｎｔｐペプチドからなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
タンパク質導入ドメインが、ＨＩＶ−ＴＡＴタンパク質導入ドメインである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
骨誘導ポリペプチドが、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１及びＳｍａｄからなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
骨誘導ポリペプチドが、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
融合ポリペプチドが、移植片として投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
融合ポリペプチドが、ヒドロゲルによって投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
融合ポリペプチドが、少なくとも一つの多能性前駆細胞に投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも一つの多能性前駆細胞が、哺乳動物内に植え込まれる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
タンパク質導入ドメインと少なくとも一つの骨誘導ポリペプチドとを含む融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１７】
タンパク質導入ドメインが、ＨＩＶ−ＴＡＴ、ＶＰ−２２、増殖因子のシグナルペプチド配列、Ｐｅｐ−１及びショウジョウバエＡｎｔｐペプチドからなる群より選択される、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
タンパク質導入ドメインが、ＨＩＶ−ＴＡＴタンパク質導入ドメインである、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
骨誘導ポリペプチドが、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１及びＳｍａｄからなる群より選択される、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
骨誘導ポリペプチドが、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択される、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
哺乳動物においてプロテオグリカンの合成を誘導する方法であって、タンパク質導入ドメインと少なくとも一つの骨誘導ポリペプチドとを含む有効量の融合ポリペプチドを投与することを含む、方法。
【請求項２２】
タンパク質導入ドメインが、ＨＩＶ−ＴＡＴ、ＶＰ−２２、増殖因子のシグナルペプチド配列、Ｐｅｐ−１及びショウジョウバエＡｎｔｐペプチドからなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
タンパク質導入ドメインが、ＨＩＶ−ＴＡＴタンパク質導入ドメインである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
骨誘導ポリペプチドが、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、ＢＭＰ−２、及びＢＭＰ−７からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
骨誘導ポリペプチドが、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択される、請求項２１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
融合ポリペプチドが、移植片として投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
融合ポリペプチドが、ヒドロゲルによって投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
融合ポリペプチドが、少なくとも一つの多能性前駆細胞に投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも一つの多能性前駆細胞が、哺乳動物内に植え込まれる、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
プロテオグリカンがアグリカンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
骨誘導ポリペプチドと機能可能に連結されている膜移行ペプチドを含む、単離された融合ポリペプチド。
【請求項３２】
膜移行ペプチドが、ＨＩＶ−ＴＡＴ、ＶＰ−２２、増殖因子のシグナルペプチド配列、Ｐｅｐ−１及びショウジョウバエＡｎｔｐペプチドからなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
膜移行ペプチドが、ＨＩＶ−ＴＡＴタンパク質導入ドメインである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
骨誘導ポリペプチドが、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１及びＳｍａｄからなる群より選択される、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３５】
骨誘導ポリペプチドが、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択される、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３６】
前駆細胞において骨芽細胞の分化を誘導する方法であって、タンパク質導入ドメインと少なくとも一つの骨誘導ポリペプチドとを含む有効量の融合ポリペプチドを前駆細胞に投与することを含む、上記方法。
【請求項３７】
タンパク質導入ドメインが、ＨＩＶ−ＴＡＴ、ＶＰ−２２、増殖因子のシグナルペプチド配列、Ｐｅｐ−１及びショウジョウバエＡｎｔｐペプチドからなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
タンパク質導入ドメインが、ＨＩＶ−ＴＡＴタンパク質導入ドメインである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
骨誘導ポリペプチドが、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１及びＳｍａｄからなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
骨誘導ポリペプチドが、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８、またはその組み合わせからなる群の中から選択される、骨誘導ポリペプチド。
【請求項４２】
標準的な条件下で、配列：
ｔｃｃｔｃａｔｃｃｇ ｇｇｔｃｔｔｇｃａｔ ｇａａｃｔｃｇｇｔｇ
に相補的な核酸分子とハイブリダイズする、骨誘導ポリペプチド。
【請求項４３】
高ストリンジェントな条件下で、配列：
ｇｃｃｃｃｃｇｃｃｃ ｇｃｔｇａｃａｇｃｇ ｃｃｃｃｇｃａａ
に相補的な核酸分子とハイブリダイズする、骨誘導ポリペプチド。
【請求項１】
細胞透過性骨誘導ポリペプチドを作製する方法であって、
ａ） 細胞透過性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと；
ｂ） 該細胞透過性ポリペプチドと機能可能に連結されている骨誘導ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、該骨誘導ポリペプチドが、該細胞透過性ポリペプチドとの融合タンパク質の一部として発現するように配置されたポリヌクレオチドと；
ｃ） 該ポリヌクレオチドの転写を導くように配置されたプロモーターと；
を含む発現コンストラクトを、適切な宿主細胞中に導入することを含む、上記方法。
【請求項２】
発現コンストラクトがさらに精製タグを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞透過性ポリペプチドが、ＨＩＶ−ＴＡＴ、ＶＰ−２２、増殖因子のシグナルペプチド配列、Ｐｅｐ−１及びショウジョウバエＡｎｔｐペプチドからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細胞透過性ポリペプチドが、ＨＩＶ−ＴＡＴタンパク質導入ドメインである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
骨誘導ポリペプチドが、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１及びＳｍａｄからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
骨誘導ポリペプチドが、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
哺乳動物において骨形成を誘導する方法であって、タンパク質導入ドメインと少なくとも一つの骨誘導ポリペプチドとを含む、有効量の融合ポリペプチドを投与することを含む、上記方法。
【請求項８】
タンパク質導入ドメインが、ＨＩＶ−ＴＡＴ、ＶＰ−２２、増殖因子のシグナルペプチド配列、Ｐｅｐ−１及びショウジョウバエＡｎｔｐペプチドからなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
タンパク質導入ドメインが、ＨＩＶ−ＴＡＴタンパク質導入ドメインである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
骨誘導ポリペプチドが、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１及びＳｍａｄからなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
骨誘導ポリペプチドが、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
融合ポリペプチドが、移植片として投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
融合ポリペプチドが、ヒドロゲルによって投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
融合ポリペプチドが、少なくとも一つの多能性前駆細胞に投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも一つの多能性前駆細胞が、哺乳動物内に植え込まれる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
タンパク質導入ドメインと少なくとも一つの骨誘導ポリペプチドとを含む融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１７】
タンパク質導入ドメインが、ＨＩＶ−ＴＡＴ、ＶＰ−２２、増殖因子のシグナルペプチド配列、Ｐｅｐ−１及びショウジョウバエＡｎｔｐペプチドからなる群より選択される、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
タンパク質導入ドメインが、ＨＩＶ−ＴＡＴタンパク質導入ドメインである、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
骨誘導ポリペプチドが、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１及びＳｍａｄからなる群より選択される、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
骨誘導ポリペプチドが、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択される、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
哺乳動物においてプロテオグリカンの合成を誘導する方法であって、タンパク質導入ドメインと少なくとも一つの骨誘導ポリペプチドとを含む有効量の融合ポリペプチドを投与することを含む、方法。
【請求項２２】
タンパク質導入ドメインが、ＨＩＶ−ＴＡＴ、ＶＰ−２２、増殖因子のシグナルペプチド配列、Ｐｅｐ−１及びショウジョウバエＡｎｔｐペプチドからなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
タンパク質導入ドメインが、ＨＩＶ−ＴＡＴタンパク質導入ドメインである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
骨誘導ポリペプチドが、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、ＢＭＰ−２、及びＢＭＰ−７からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
骨誘導ポリペプチドが、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択される、請求項２１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
融合ポリペプチドが、移植片として投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
融合ポリペプチドが、ヒドロゲルによって投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
融合ポリペプチドが、少なくとも一つの多能性前駆細胞に投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも一つの多能性前駆細胞が、哺乳動物内に植え込まれる、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
プロテオグリカンがアグリカンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
骨誘導ポリペプチドと機能可能に連結されている膜移行ペプチドを含む、単離された融合ポリペプチド。
【請求項３２】
膜移行ペプチドが、ＨＩＶ−ＴＡＴ、ＶＰ−２２、増殖因子のシグナルペプチド配列、Ｐｅｐ−１及びショウジョウバエＡｎｔｐペプチドからなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
膜移行ペプチドが、ＨＩＶ−ＴＡＴタンパク質導入ドメインである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
骨誘導ポリペプチドが、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１及びＳｍａｄからなる群より選択される、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３５】
骨誘導ポリペプチドが、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択される、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３６】
前駆細胞において骨芽細胞の分化を誘導する方法であって、タンパク質導入ドメインと少なくとも一つの骨誘導ポリペプチドとを含む有効量の融合ポリペプチドを前駆細胞に投与することを含む、上記方法。
【請求項３７】
タンパク質導入ドメインが、ＨＩＶ−ＴＡＴ、ＶＰ−２２、増殖因子のシグナルペプチド配列、Ｐｅｐ−１及びショウジョウバエＡｎｔｐペプチドからなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
タンパク質導入ドメインが、ＨＩＶ−ＴＡＴタンパク質導入ドメインである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
骨誘導ポリペプチドが、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１及びＳｍａｄからなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
骨誘導ポリペプチドが、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−３、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８、またはその組み合わせからなる群の中から選択される、骨誘導ポリペプチド。
【請求項４２】
標準的な条件下で、配列：
ｔｃｃｔｃａｔｃｃｇ ｇｇｔｃｔｔｇｃａｔ ｇａａｃｔｃｇｇｔｇ
に相補的な核酸分子とハイブリダイズする、骨誘導ポリペプチド。
【請求項４３】
高ストリンジェントな条件下で、配列：
ｇｃｃｃｃｃｇｃｃｃ ｇｃｔｇａｃａｇｃｇ ｃｃｃｃｇｃａａ
に相補的な核酸分子とハイブリダイズする、骨誘導ポリペプチド。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００７−５０５６２１（Ｐ２００７−５０５６２１Ａ）
【公表日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２６８６２（Ｐ２００６−５２６８６２）
【出願日】平成１６年４月１３日（２００４．４．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００９１２７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１１０５８
【国際公開日】平成１７年１１月２４日（２００５．１１．２４）
【出願人】（５０４２２８０４７）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年４月１３日（２００４．４．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００９１２７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１１０５８
【国際公開日】平成１７年１１月２４日（２００５．１１．２４）
【出願人】（５０４２２８０４７）
【Ｆターム（参考）】
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