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骨量および脂質レベルを調整するHBM変異型
説明

骨量および脂質レベルを調整するHBM変異型

【課題】動物細胞およびトランスジェニック動物中のHBM、LRP5、またはLRP6由来のHBM様ポリペプチドを発現させるために使用する方法および材料、また、HBM様ポリペプチドを発現するトランスジェニック動物を提供する。
【解決手段】特定のコード配列、オリゴヌクレオチドプライマー、およびプローブを含む核酸、タンパク質、クローニングベクター、発現ベクター、形質転換された宿主。医薬組成物の開発方法、骨発達に関与する分子の同定方法、ならびに骨発達および脂質調整に関与する疾患の診断および治療方法。好ましい実施形態では、骨粗鬆症の治療、診断、および予防方法。


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【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞中で発現された場合にHBM様表現型を示すLRP5またはLRP6中に変異を含
む核酸であって、前記HBM様表現型により骨量および/または脂質レベルが調整される
核酸。
【請求項2】
細胞中で発現された場合に表2もしくは3の少なくとも1つの変異を含むか、G171
V、A214V、A65V、M282V、G171K、G171F、G171I、G17
1Q、L200V、T201V、I202V、またはS127Vの1つの変異となるLR
P5核酸であって、被験体中での前記核酸の発現により骨量および/または脂質レベルが
調整される、LRP5核酸。
【請求項3】
細胞中で発現された場合に表2もしくは3の少なくとも1つの変異を含むか、G171
V、A214V、A65V、M282V、G171K、G171F、G171I、G17
1Q、L200V、T201V、I202V、またはS127Vの1つの変異となるLR
P6核酸であって、LRP5と等価の位置でLRP6の変異が起き、被験体中での前記核
酸の発現により骨量および/または脂質レベルが調整されることを特徴とするLRP6核
酸。
【請求項4】
プロペラ1中で少なくとも1つのアミノ酸変異をコードするLRP5核酸。
【請求項5】
前記核酸が、G171V、A214V、A65V、M282V、G171K、G171
F、G171I、G171Q、L200V、T201V、I202V、およびS127V
からなる群から選択される少なくとも1つの変異をコードする、請求項4のLRP5核酸

【請求項6】
プロペラ1中で少なくとも1つのアミノ酸変異をコードするLRP6核酸。
【請求項7】
前記核酸が、G171V、A214V、A65V、M282V、G171K、G171
F、G171I、G171Q、L200V、T201V、I202V、およびS127V
からなる群から選択される少なくとも1つの変異をLRP6中の等価の位置でコードする
、請求項6のLRP6核酸。
【請求項8】
前記変異が、LRP5中またはLRP6中の等価のドメイン中のG171V、A214
V、A65V、M282V、G171K、G171F、G171I、またはG171Qで
ある、請求項1〜7のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項9】
細胞中で発現した場合に前記ポリペプチドがWntシグナル伝達、Dkk活性、LRP
5活性、および/またはLRP6活性を調整する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の
核酸によってコードされたポリペプチド。
【請求項10】
被験体中で発現した場合に前記ポリペプチドが骨量および/または脂質レベルを調整す
る、請求項9のポリペプチド。
【請求項11】
請求項1〜8のいずれか1項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項12】
請求項11のベクターを含む細胞。
【請求項13】
癌細胞、肝細胞、または骨細胞である、請求項12の細胞。
【請求項14】
表2、G171V、A214V、A65V、M282V、G171K、G171F、G
171I、G171Q、L200V、T201V、I202V、またはS127Vの少な
くとも1つのアミノ酸変化を含む、LRP5由来のポリペプチドまたはその生物学的に活
性なフラグメント。
【請求項15】
前記タンパク質またはその生物学的に活性なフラグメントが、G171V、A214V
、A65V、M282V、G171K、G171F、G171I、G171Q、L200
V、T201V、I202V、またはS127Vの少なくとも1つのアミノ酸変化を含む
、請求項14のポリペプチドまたはその生物学的に活性なフラグメント。
【請求項16】
LRP6中の等価の位置でアミノ酸の変化が発現された場合に、表2、G171V、A
214V、A65V、M282V、G171K、G171F、G171I、G171Q、
L200V、T201V、I202V、またはS127Vの少なくとも1つのアミノ酸変
化を含む、LRP6由来のポリペプチドまたはその生物学的に活性なフラグメント。
【請求項17】
前記タンパク質またはその生物学的に活性なフラグメントが、G171V、A214V
、A65V、M282V、G171K、G171F、G171I、G171Q、L200
V、T201V、I202V、またはS127Vの少なくとも1つのアミノ酸変化を含む
、請求項16のポリペプチドまたはその生物学的に活性なフラグメント。
【請求項18】
被験体中で発現した場合にプロペラ1中に少なくとも1つのアミノ酸変異を含むHBM
様表現型を有するが、前記変異は、前記HBM様表現型を維持する第2の変異も存在する
GV171である、ポリペプチドまたは生物学的に活性なフラグメント。
【請求項19】
前記ポリペプチドが、LRP5、LRP6、またはHBM由来である、請求項18のポ
リペプチドまたは生物学的に活性なフラグメント。
【請求項20】
前記アミノ酸変化が、LRP5またはLRP6中の等価の位置のG171V、A214
V、A65V、M282V、G171K、G171F、G171I、もしくはG171Q
である、請求項14〜19のいずれか1項に記載のポリペプチドまたは生物学的に活性な
フラグメント。
【請求項21】
請求項14〜20のいずれか1項に記載のポリペプチドまたはその抗原フラグメントに
結合する、抗体またはその免疫原性フラグメント。
【請求項22】
前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、primat
ized(登録商標)抗体、ヒト抗体、または標識抗体である、請求項21の抗体またはその
免疫原性フラグメント。
【請求項23】
LRP5の208KLYWADAKLSFIHRAN223277ALYSPMDI
QVLSQER29161GLEDAAAVDFQFSKGA73234EGSLT
HPFALTLSG247249TLYWTDWQTRSIHACN264144
LFWQDLDQPRAI156194IYWPNGLTIDLEEQKLY210
34LLLFANRRDVRLVD4775GAVYWTDVSEEAIKQ89
21KLYWTDSETNRIEVA135、またはLRP6の等価のドメイン、または
その変異型を含むポリペプチドに結合する抗体。
【請求項24】
LRP5の969LILPLHGLRNVKAIDYDPLDKFIYW99398
KFIYWVDGRQNIKRAKDDGTQPFVL10131009QPFVL
TSLSQGQNPDRQPHDLSIDI10331029LSIDIYSRTLF
WTCEATNTINVHRL10531049NVHRLSGEAMGVVLRGD
RDKPRAIV10731253CGEPPTCSPDQFAC12661278
WRCDGFPECDDQSDEEGC12951316RCDGEADCQDRSD
EADC13321370CEITKPPSDDSPAH1383、またはLRP6の
等価のドメイン、またはその変異型を含むポリペプチドに結合する抗体であって、前記抗
体がLRP5、HBM、LRP6、またはその変異型のDkkへの結合を調整する抗体。
【請求項25】
(A)被験体から生体サンプルを得るステップと、
(B)前記サンプルを請求項21〜24のいずれか1項に記載の抗体または免疫原性フ
ラグメントに曝露するステップと、
(C)前記抗体が前記被験体由来の生体サンプル由来のタンパク質に結合したかどうか
を検出して、前記被験体がHBM様表現型を有するかどうかを決定するステップと
を含む、被験体のHBM様表現型の診断方法。
【請求項26】
治療有効量の請求項21〜24のいずれか1項に記載の抗体および薬学的に許容可能な
キャリアを含む、被験体の骨量および/または脂質レベルを調整するための組成物。
【請求項27】
前記抗体またはその免疫原性フラグメントが、(1)LRP5とHBM様タンパク質と
を区別すること、(2)LRP6とHBM様タンパク質とを区別すること、または(3)
HMBとHBM様タンパク質とを区別することができる、請求項21〜24のいずれか1
項に記載の抗体またはその免疫原性フラグメント。
【請求項28】
請求項1〜8のいずれか1項に記載の核酸に作動可能に連結された動物細胞および/ま
たはヒト細胞中でタンパク質発現を指示するプロモーター領域を含む核酸を含む体細胞お
よび/または生殖細胞を有するトランスジェニック動物であって、前記トランスジェニッ
ク動物が前記核酸の発現によって調整される少なくとも3つの骨パラメータを有するトラ
ンスジェニック動物。
【請求項29】
前記プロモーター領域が、CMV、RSV、SV40、およびEF−1a、CMVβb
アクチン、ヒストン、I型コラーゲン、TGFβ1、SX2、cfos/cjun、Cb
fa1、Fra/Jun、Dlx5、オステオカルシン、オステオポンチン、骨シアロタ
ンパク質、およびコラゲナーゼのプロモーター領域からなる群から選択される、請求項2
8のトランスジェニック動物。
【請求項30】
請求項9または10のポリペプチドをコードする配列を含む核酸を含む体細胞および/
または生殖細胞を有するトランスジェニック動物であって、前記核酸が動物細胞および/
またはヒト細胞中でタンパク質発現を指示する作動可能に連結されたプロモーター領域を
さらに含み、前記トランスジェニック動物が前記核酸の発現によって調整される少なくと
も3つの骨パラメータを有するトランスジェニック動物。
【請求項31】
請求項1〜8のいずれか1項に記載の核酸に作動可能に連結された動物細胞および/ま
たはヒト細胞中でタンパク質発現を指示するプロモーター領域を含む核酸を含む動物胚。
【請求項32】
請求項1〜8のいずれか1項に記載の核酸に作動可能に連結された動物細胞および/ま
たはヒト細胞中でタンパク質発現を指示するプロモーター領域を含む核酸でトランスフェ
クトした動物細胞またはヒト細胞。
【請求項33】
ヒトHBM様タンパク質を発現し、ヒトHBM様遺伝子がその子孫に受け継がれる、請
求項28のトランスジェニック動物。
【請求項34】
請求項33のトランスジェニック動物またはその子孫から産生されたトランスジェニッ
ク動物。
【請求項35】
請求項28のトランスジェニック動物から構成される第1の動物群および第2のコント
ロール動物群を含む、骨密度の調整および/または脂質レベルの調整を研究するための動
物モデル。
【請求項36】
前記トランスジェニック動物群が、ヒトHBM様タンパク質またはその生物学的に活性
なポリペプチドフラグメントをコードする核酸を含む細胞を有する、請求項35の動物モ
デル。
【請求項37】
請求項30のトランスジェニック動物から構成される第1の動物群および第2のコント
ロール動物群を含む、骨密度の調整を研究するための動物モデル。
【請求項38】
(a)請求項11のベクターで細胞をトランスフェクトするステップと、
(b)ステップ(a)のトランスフェクトした細胞を化合物に曝露するステップと、
(c)前記化合物がHBM様核酸の活性を調整するかどうかを決定するステップと
を含む、HBM様核酸の活性を調整する薬剤の同定方法。
【請求項39】
(a)請求項11のベクターで細胞をトランスフェクトするステップと、
(b)ステップ(a)のトランスフェクトした細胞を化合物に曝露するステップと、
(c)前記化合物がHBM様タンパク質の活性を調整するかどうかを決定するステップ

を含む、HBM様タンパク質の活性を調整する薬剤の同定方法。
【請求項40】
前記化合物が、ホルモン、成長因子、ペプチド、RNA、shRNA、siRNA、D
NA、無機物、ビタミン、天然産物、または合成有機化合物である、請求項39の方法。
【請求項41】
(a)細胞を請求項1〜8に記載の核酸を含む構築物でトランスフェクトするステップ
と、
(b)Wnt応答プロモーターに連結されたレポーターエレメントの発現の変化を評価
するステップと、
(c)Dkk構築物のみでトランスフェクトした細胞と比較して、レポーター遺伝子発
現が変化した化合物を、Dkk/Wnt相互作用調整化合物として同定するステップと
を含む、DkkのWntシグナル伝達経路との相互作用を調整する化合物の同定方法。
【請求項42】
前記細胞が、癌細胞、肝細胞、または骨細胞である、請求項41に記載の方法。
【請求項43】
前記細胞が、U2−OS、HOB−03−CE6、またはHEK293細胞である、請
求項42に記載の方法。
【請求項44】
前記使用されたレポーターエレメントが、TCF−ルシフェラーゼ、tk−Renil
la、またはその組み合わせである、請求項41に記載の方法。
【請求項45】
(A)被験体から生体サンプルを得るステップと、
(B)HBM表現型が得られるヌクレオチド変化の存在をアッセイするステップと
を含む、表2または3のヌクレオチド変化を含む核酸を発現する被験体の診断方法。
【請求項46】
(A)請求項32に記載の細胞を得るステップと、
(B)前記細胞を試験化合物に曝露するステップと、
(C)LRP5、LRP6、またはHBMの発現をそれぞれ測定するステップと
を含む、LRP5、LRP6、またはHBMを調整する薬剤の同定方法。
【請求項47】
前記薬剤が、骨量および/または脂質レベルをさらに調整するかどうかを決定するステ
ップをさらに含む、請求項42の薬剤の同定方法。
【請求項48】
請求項46または47の方法によって同定された薬剤。

【図4】
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【図5】
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【図6A】
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【図6B】
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【図6C】
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【図6D】
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【図6E】
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【図6F】
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【図6G】
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【図6H】
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【図6I】
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【図6J】
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【図7】
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【図8】
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【図9】
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【図10】
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【図11】
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【図12】
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【図13】
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【図14】
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【図15】
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【図16】
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【図17】
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【図18】
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【図19】
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【図20】
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【図21A】
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【図21B】
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【図21C】
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【図21D】
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【図21E】
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【図21F】
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【図22】
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【図23】
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【図24A】
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【図24B】
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【図24C】
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【図24D】
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【図25A】
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【図25B】
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【図25C】
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【図25D】
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【図26A】
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【図26B】
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【図26C】
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【図27A】
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【図27B】
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【図27C】
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【図28】
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【図29】
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【図30】
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【図31】
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【図32】
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【図33】
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【図34】
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【図35】
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【図36】
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【図37】
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【図38】
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【図39A】
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【図39B】
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【図39C】
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【図39D】
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【図40】
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【図41】
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【図42】
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【図43】
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【図44A】
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【図44B】
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【図45】
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【図46】
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【図47】
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【図48】
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【図49】
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【図50】
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【図51A】
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【図51B】
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【図51C】
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【図51D】
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【図51E】
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【図52】
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【図53A】
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【図53B】
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【図53C】
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【公開番号】特開2011−4744(P2011−4744A)
【公開日】平成23年1月13日(2011.1.13)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2010−146427(P2010−146427)
【出願日】平成22年6月28日(2010.6.28)
【分割の表示】特願2002−588919(P2002−588919)の分割
【原出願日】平成14年5月13日(2002.5.13)
【公序良俗違反の表示】
(特許庁注:以下のものは登録商標)
1.宅急便
2.UNIX
3.サランラップ
【出願人】(501419705)オシエント ファーマシューティカルズ コーポレイション (2)
【出願人】(309040701)ワイス・エルエルシー (181)
【Fターム(参考)】