【課題】動物細胞およびトランスジェニック動物中のＨＢＭ、ＬＲＰ５、またはＬＲＰ６由来のＨＢＭ様ポリペプチドを発現させるために使用する方法および材料、また、ＨＢＭ様ポリペプチドを発現するトランスジェニック動物を提供する。
【解決手段】特定のコード配列、オリゴヌクレオチドプライマー、およびプローブを含む核酸、タンパク質、クローニングベクター、発現ベクター、形質転換された宿主。医薬組成物の開発方法、骨発達に関与する分子の同定方法、ならびに骨発達および脂質調整に関与する疾患の診断および治療方法。好ましい実施形態では、骨粗鬆症の治療、診断、および予防方法。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中で発現された場合にＨＢＭ様表現型を示すＬＲＰ５またはＬＲＰ６中に変異を含
む核酸であって、前記ＨＢＭ様表現型により骨量および／または脂質レベルが調整される
核酸。
【請求項２】
細胞中で発現された場合に表２もしくは３の少なくとも１つの変異を含むか、Ｇ１７１
Ｖ、Ａ２１４Ｖ、Ａ６５Ｖ、Ｍ２８２Ｖ、Ｇ１７１Ｋ、Ｇ１７１Ｆ、Ｇ１７１Ｉ、Ｇ１７
１Ｑ、Ｌ２００Ｖ、Ｔ２０１Ｖ、Ｉ２０２Ｖ、またはＳ１２７Ｖの１つの変異となるＬＲ
Ｐ５核酸であって、被験体中での前記核酸の発現により骨量および／または脂質レベルが
調整される、ＬＲＰ５核酸。
【請求項３】
細胞中で発現された場合に表２もしくは３の少なくとも１つの変異を含むか、Ｇ１７１
Ｖ、Ａ２１４Ｖ、Ａ６５Ｖ、Ｍ２８２Ｖ、Ｇ１７１Ｋ、Ｇ１７１Ｆ、Ｇ１７１Ｉ、Ｇ１７
１Ｑ、Ｌ２００Ｖ、Ｔ２０１Ｖ、Ｉ２０２Ｖ、またはＳ１２７Ｖの１つの変異となるＬＲ
Ｐ６核酸であって、ＬＲＰ５と等価の位置でＬＲＰ６の変異が起き、被験体中での前記核
酸の発現により骨量および／または脂質レベルが調整されることを特徴とするＬＲＰ６核
酸。
【請求項４】
プロペラ１中で少なくとも１つのアミノ酸変異をコードするＬＲＰ５核酸。
【請求項５】
前記核酸が、Ｇ１７１Ｖ、Ａ２１４Ｖ、Ａ６５Ｖ、Ｍ２８２Ｖ、Ｇ１７１Ｋ、Ｇ１７１
Ｆ、Ｇ１７１Ｉ、Ｇ１７１Ｑ、Ｌ２００Ｖ、Ｔ２０１Ｖ、Ｉ２０２Ｖ、およびＳ１２７Ｖ
からなる群から選択される少なくとも１つの変異をコードする、請求項４のＬＲＰ５核酸
。
【請求項６】
プロペラ１中で少なくとも１つのアミノ酸変異をコードするＬＲＰ６核酸。
【請求項７】
前記核酸が、Ｇ１７１Ｖ、Ａ２１４Ｖ、Ａ６５Ｖ、Ｍ２８２Ｖ、Ｇ１７１Ｋ、Ｇ１７１
Ｆ、Ｇ１７１Ｉ、Ｇ１７１Ｑ、Ｌ２００Ｖ、Ｔ２０１Ｖ、Ｉ２０２Ｖ、およびＳ１２７Ｖ
からなる群から選択される少なくとも１つの変異をＬＲＰ６中の等価の位置でコードする
、請求項６のＬＲＰ６核酸。
【請求項８】
前記変異が、ＬＲＰ５中またはＬＲＰ６中の等価のドメイン中のＧ１７１Ｖ、Ａ２１４
Ｖ、Ａ６５Ｖ、Ｍ２８２Ｖ、Ｇ１７１Ｋ、Ｇ１７１Ｆ、Ｇ１７１Ｉ、またはＧ１７１Ｑで
ある、請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項９】
細胞中で発現した場合に前記ポリペプチドがＷｎｔシグナル伝達、Ｄｋｋ活性、ＬＲＰ
５活性、および／またはＬＲＰ６活性を調整する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の
核酸によってコードされたポリペプチド。
【請求項１０】
被験体中で発現した場合に前記ポリペプチドが骨量および／または脂質レベルを調整す
る、請求項９のポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１２】
請求項１１のベクターを含む細胞。
【請求項１３】
癌細胞、肝細胞、または骨細胞である、請求項１２の細胞。
【請求項１４】
表２、Ｇ１７１Ｖ、Ａ２１４Ｖ、Ａ６５Ｖ、Ｍ２８２Ｖ、Ｇ１７１Ｋ、Ｇ１７１Ｆ、Ｇ
１７１Ｉ、Ｇ１７１Ｑ、Ｌ２００Ｖ、Ｔ２０１Ｖ、Ｉ２０２Ｖ、またはＳ１２７Ｖの少な
くとも１つのアミノ酸変化を含む、ＬＲＰ５由来のポリペプチドまたはその生物学的に活
性なフラグメント。
【請求項１５】
前記タンパク質またはその生物学的に活性なフラグメントが、Ｇ１７１Ｖ、Ａ２１４Ｖ
、Ａ６５Ｖ、Ｍ２８２Ｖ、Ｇ１７１Ｋ、Ｇ１７１Ｆ、Ｇ１７１Ｉ、Ｇ１７１Ｑ、Ｌ２００
Ｖ、Ｔ２０１Ｖ、Ｉ２０２Ｖ、またはＳ１２７Ｖの少なくとも１つのアミノ酸変化を含む
、請求項１４のポリペプチドまたはその生物学的に活性なフラグメント。
【請求項１６】
ＬＲＰ６中の等価の位置でアミノ酸の変化が発現された場合に、表２、Ｇ１７１Ｖ、Ａ
２１４Ｖ、Ａ６５Ｖ、Ｍ２８２Ｖ、Ｇ１７１Ｋ、Ｇ１７１Ｆ、Ｇ１７１Ｉ、Ｇ１７１Ｑ、
Ｌ２００Ｖ、Ｔ２０１Ｖ、Ｉ２０２Ｖ、またはＳ１２７Ｖの少なくとも１つのアミノ酸変
化を含む、ＬＲＰ６由来のポリペプチドまたはその生物学的に活性なフラグメント。
【請求項１７】
前記タンパク質またはその生物学的に活性なフラグメントが、Ｇ１７１Ｖ、Ａ２１４Ｖ
、Ａ６５Ｖ、Ｍ２８２Ｖ、Ｇ１７１Ｋ、Ｇ１７１Ｆ、Ｇ１７１Ｉ、Ｇ１７１Ｑ、Ｌ２００
Ｖ、Ｔ２０１Ｖ、Ｉ２０２Ｖ、またはＳ１２７Ｖの少なくとも１つのアミノ酸変化を含む
、請求項１６のポリペプチドまたはその生物学的に活性なフラグメント。
【請求項１８】
被験体中で発現した場合にプロペラ１中に少なくとも１つのアミノ酸変異を含むＨＢＭ
様表現型を有するが、前記変異は、前記ＨＢＭ様表現型を維持する第２の変異も存在する
ＧＶ１７１である、ポリペプチドまたは生物学的に活性なフラグメント。
【請求項１９】
前記ポリペプチドが、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、またはＨＢＭ由来である、請求項１８のポ
リペプチドまたは生物学的に活性なフラグメント。
【請求項２０】
前記アミノ酸変化が、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６中の等価の位置のＧ１７１Ｖ、Ａ２１４
Ｖ、Ａ６５Ｖ、Ｍ２８２Ｖ、Ｇ１７１Ｋ、Ｇ１７１Ｆ、Ｇ１７１Ｉ、もしくはＧ１７１Ｑ
である、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは生物学的に活性な
フラグメント。
【請求項２１】
請求項１４〜２０のいずれか１項に記載のポリペプチドまたはその抗原フラグメントに
結合する、抗体またはその免疫原性フラグメント。
【請求項２２】
前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、primat
ized（登録商標）抗体、ヒト抗体、または標識抗体である、請求項２１の抗体またはその
免疫原性フラグメント。
【請求項２３】
ＬＲＰ５の^２０８ＫＬＹＷＡＤＡＫＬＳＦＩＨＲＡＮ^２２３、^２７７ＡＬＹＳＰＭＤＩ
ＱＶＬＳＱＥＲ^２９１、^６１ＧＬＥＤＡＡＡＶＤＦＱＦＳＫＧＡ^７３、^２３４ＥＧＳＬＴ
ＨＰＦＡＬＴＬＳＧ^２４７、^２４９ＴＬＹＷＴＤＷＱＴＲＳＩＨＡＣＮ^２６４、^１４４Ｖ
ＬＦＷＱＤＬＤＱＰＲＡＩ^１５６、^１９４ＩＹＷＰＮＧＬＴＩＤＬＥＥＱＫＬＹ^２１０、
^３４ＬＬＬＦＡＮＲＲＤＶＲＬＶＤ^４７、^７５ＧＡＶＹＷＴＤＶＳＥＥＡＩＫＱ^８９、^１
２１ＫＬＹＷＴＤＳＥＴＮＲＩＥＶＡ^１３５、またはＬＲＰ６の等価のドメイン、または
その変異型を含むポリペプチドに結合する抗体。
【請求項２４】
ＬＲＰ５の^９６９ＬＩＬＰＬＨＧＬＲＮＶＫＡＩＤＹＤＰＬＤＫＦＩＹＷ^９９３、^９８
９ＫＦＩＹＷＶＤＧＲＱＮＩＫＲＡＫＤＤＧＴＱＰＦＶＬ^１０１３、^１００９ＱＰＦＶＬ
ＴＳＬＳＱＧＱＮＰＤＲＱＰＨＤＬＳＩＤＩ^１０３３、^１０２９ＬＳＩＤＩＹＳＲＴＬＦ
ＷＴＣＥＡＴＮＴＩＮＶＨＲＬ^１０５３、^１０４９ＮＶＨＲＬＳＧＥＡＭＧＶＶＬＲＧＤ
ＲＤＫＰＲＡＩＶ^１０７３、^１２５３ＣＧＥＰＰＴＣＳＰＤＱＦＡＣ^１２６６、^１２７８
ＷＲＣＤＧＦＰＥＣＤＤＱＳＤＥＥＧＣ^１２９５、^１３１６ＲＣＤＧＥＡＤＣＱＤＲＳＤ
ＥＡＤＣ^１３３２、^１３７０ＣＥＩＴＫＰＰＳＤＤＳＰＡＨ^１３８３、またはＬＲＰ６の
等価のドメイン、またはその変異型を含むポリペプチドに結合する抗体であって、前記抗
体がＬＲＰ５、ＨＢＭ、ＬＲＰ６、またはその変異型のＤｋｋへの結合を調整する抗体。
【請求項２５】
（Ａ）被験体から生体サンプルを得るステップと、
（Ｂ）前記サンプルを請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の抗体または免疫原性フ
ラグメントに曝露するステップと、
（Ｃ）前記抗体が前記被験体由来の生体サンプル由来のタンパク質に結合したかどうか
を検出して、前記被験体がＨＢＭ様表現型を有するかどうかを決定するステップと
を含む、被験体のＨＢＭ様表現型の診断方法。
【請求項２６】
治療有効量の請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の抗体および薬学的に許容可能な
キャリアを含む、被験体の骨量および／または脂質レベルを調整するための組成物。
【請求項２７】
前記抗体またはその免疫原性フラグメントが、（１）ＬＲＰ５とＨＢＭ様タンパク質と
を区別すること、（２）ＬＲＰ６とＨＢＭ様タンパク質とを区別すること、または（３）
ＨＭＢとＨＢＭ様タンパク質とを区別することができる、請求項２１〜２４のいずれか１
項に記載の抗体またはその免疫原性フラグメント。
【請求項２８】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸に作動可能に連結された動物細胞および／ま
たはヒト細胞中でタンパク質発現を指示するプロモーター領域を含む核酸を含む体細胞お
よび／または生殖細胞を有するトランスジェニック動物であって、前記トランスジェニッ
ク動物が前記核酸の発現によって調整される少なくとも３つの骨パラメータを有するトラ
ンスジェニック動物。
【請求項２９】
前記プロモーター領域が、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＳＶ４０、およびＥＦ−１ａ、ＣＭＶβｂ
アクチン、ヒストン、Ｉ型コラーゲン、ＴＧＦβ１、ＳＸ２、ｃｆｏｓ／ｃｊｕｎ、Ｃｂ
ｆａ１、Ｆｒａ／Ｊｕｎ、Ｄｌｘ５、オステオカルシン、オステオポンチン、骨シアロタ
ンパク質、およびコラゲナーゼのプロモーター領域からなる群から選択される、請求項２
８のトランスジェニック動物。
【請求項３０】
請求項９または１０のポリペプチドをコードする配列を含む核酸を含む体細胞および／
または生殖細胞を有するトランスジェニック動物であって、前記核酸が動物細胞および／
またはヒト細胞中でタンパク質発現を指示する作動可能に連結されたプロモーター領域を
さらに含み、前記トランスジェニック動物が前記核酸の発現によって調整される少なくと
も３つの骨パラメータを有するトランスジェニック動物。
【請求項３１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸に作動可能に連結された動物細胞および／ま
たはヒト細胞中でタンパク質発現を指示するプロモーター領域を含む核酸を含む動物胚。
【請求項３２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸に作動可能に連結された動物細胞および／ま
たはヒト細胞中でタンパク質発現を指示するプロモーター領域を含む核酸でトランスフェ
クトした動物細胞またはヒト細胞。
【請求項３３】
ヒトＨＢＭ様タンパク質を発現し、ヒトＨＢＭ様遺伝子がその子孫に受け継がれる、請
求項２８のトランスジェニック動物。
【請求項３４】
請求項３３のトランスジェニック動物またはその子孫から産生されたトランスジェニッ
ク動物。
【請求項３５】
請求項２８のトランスジェニック動物から構成される第１の動物群および第２のコント
ロール動物群を含む、骨密度の調整および／または脂質レベルの調整を研究するための動
物モデル。
【請求項３６】
前記トランスジェニック動物群が、ヒトＨＢＭ様タンパク質またはその生物学的に活性
なポリペプチドフラグメントをコードする核酸を含む細胞を有する、請求項３５の動物モ
デル。
【請求項３７】
請求項３０のトランスジェニック動物から構成される第１の動物群および第２のコント
ロール動物群を含む、骨密度の調整を研究するための動物モデル。
【請求項３８】
（ａ）請求項１１のベクターで細胞をトランスフェクトするステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）のトランスフェクトした細胞を化合物に曝露するステップと、
（ｃ）前記化合物がＨＢＭ様核酸の活性を調整するかどうかを決定するステップと
を含む、ＨＢＭ様核酸の活性を調整する薬剤の同定方法。
【請求項３９】
（ａ）請求項１１のベクターで細胞をトランスフェクトするステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）のトランスフェクトした細胞を化合物に曝露するステップと、
（ｃ）前記化合物がＨＢＭ様タンパク質の活性を調整するかどうかを決定するステップ
と
を含む、ＨＢＭ様タンパク質の活性を調整する薬剤の同定方法。
【請求項４０】
前記化合物が、ホルモン、成長因子、ペプチド、ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、Ｄ
ＮＡ、無機物、ビタミン、天然産物、または合成有機化合物である、請求項３９の方法。
【請求項４１】
（ａ）細胞を請求項１〜８に記載の核酸を含む構築物でトランスフェクトするステップ
と、
（ｂ）Ｗｎｔ応答プロモーターに連結されたレポーターエレメントの発現の変化を評価
するステップと、
（ｃ）Ｄｋｋ構築物のみでトランスフェクトした細胞と比較して、レポーター遺伝子発
現が変化した化合物を、Ｄｋｋ／Ｗｎｔ相互作用調整化合物として同定するステップと
を含む、ＤｋｋのＷｎｔシグナル伝達経路との相互作用を調整する化合物の同定方法。
【請求項４２】
前記細胞が、癌細胞、肝細胞、または骨細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞が、Ｕ２−ＯＳ、ＨＯＢ−０３−ＣＥ６、またはＨＥＫ２９３細胞である、請
求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記使用されたレポーターエレメントが、ＴＣＦ−ルシフェラーゼ、ｔｋ−Ｒｅｎｉｌ
ｌａ、またはその組み合わせである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
（Ａ）被験体から生体サンプルを得るステップと、
（Ｂ）ＨＢＭ表現型が得られるヌクレオチド変化の存在をアッセイするステップと
を含む、表２または３のヌクレオチド変化を含む核酸を発現する被験体の診断方法。
【請求項４６】
（Ａ）請求項３２に記載の細胞を得るステップと、
（Ｂ）前記細胞を試験化合物に曝露するステップと、
（Ｃ）ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、またはＨＢＭの発現をそれぞれ測定するステップと
を含む、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、またはＨＢＭを調整する薬剤の同定方法。
【請求項４７】
前記薬剤が、骨量および／または脂質レベルをさらに調整するかどうかを決定するステ
ップをさらに含む、請求項４２の薬剤の同定方法。
【請求項４８】
請求項４６または４７の方法によって同定された薬剤。

【図４】

【図５】

【図６Ａ】

【図６Ｂ】

【図６Ｃ】

【図６Ｄ】

【図６Ｅ】

【図６Ｆ】

【図６Ｇ】

【図６Ｈ】

【図６Ｉ】

【図６Ｊ】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１Ａ】

【図２１Ｂ】

【図２１Ｃ】

【図２１Ｄ】

【図２１Ｅ】

【図２１Ｆ】

【図２２】

【図２３】

【図２４Ａ】

【図２４Ｂ】

【図２４Ｃ】

【図２４Ｄ】

【図２５Ａ】

【図２５Ｂ】

【図２５Ｃ】

【図２５Ｄ】

【図２６Ａ】

【図２６Ｂ】

【図２６Ｃ】

【図２７Ａ】

【図２７Ｂ】

【図２７Ｃ】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【図３９Ａ】

【図３９Ｂ】

【図３９Ｃ】

【図３９Ｄ】

【図４０】

【図４１】

【図４２】

【図４３】

【図４４Ａ】

【図４４Ｂ】

【図４５】

【図４６】

【図４７】

【図４８】

【図４９】

【図５０】

【図５１Ａ】

【図５１Ｂ】

【図５１Ｃ】

【図５１Ｄ】

【図５１Ｅ】

【図５２】

【図５３Ａ】

【図５３Ｂ】

【図５３Ｃ】

【公開番号】特開２０１１−４７４４（Ｐ２０１１−４７４４Ａ）
【公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１４６４２７（Ｐ２０１０−１４６４２７）
【出願日】平成２２年６月２８日（２０１０．６．２８）
【分割の表示】特願２００２−５８８９１９（Ｐ２００２−５８８９１９）の分割
【原出願日】平成１４年５月１３日（２００２．５．１３）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．宅急便
２．ＵＮＩＸ
３．サランラップ
【出願人】（５０１４１９７０５）オシエント　ファーマシューティカルズ　コーポレイション (2)
【出願人】（３０９０４０７０１）ワイス・エルエルシー (181)
【Ｆターム（参考）】