骨髄増殖性疾患に関する遺伝子変異を検出するためのプローブおよび該プローブを用いた遺伝子変異の検出方法
【課題】ＪＡＫ２遺伝子変異を迅速かつ簡便に検出するための方法を提供する。
【解決手段】被検核酸と配列番号１または２で示されるプローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成させ、連続的な温度上昇を行いながら該プローブを標識している蛍光色素の蛍光強度を測定することにより融解曲線分析を行い、温度変化に伴う前記蛍光強度の変動から前記被検核酸における前記変異の有無を決定する工程を含む、ＪＡＫ２遺伝子の変異を検出する方法。
【解決手段】被検核酸と配列番号１または２で示されるプローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成させ、連続的な温度上昇を行いながら該プローブを標識している蛍光色素の蛍光強度を測定することにより融解曲線分析を行い、温度変化に伴う前記蛍光強度の変動から前記被検核酸における前記変異の有無を決定する工程を含む、ＪＡＫ２遺伝子の変異を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慢性骨髄増殖性疾患に関する遺伝子変異を検出するためのプローブ、ならびに、該プローブを用いた遺伝子変異の検出方法および遺伝子変異を検出するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性骨髄増殖性疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ；ＣＭＰＤ）は真性赤血球増加症（Ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａ ｖｅｒａ；ＰＶ）、本態性血小板血症（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｈｅｍｉａ；ＥＴ）、慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＣＭＬ）、原発性骨髄線維症（ｐｒｉｍａｒｙ ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ；ＰＭＦ）などの総称である。これらの疾患は造血幹細胞の異常により多系統の増殖がみられるクローン性疾患である。
【０００３】
多くのＣＭＰＤ患者からは、細胞質性非受容体型チロシンキナーゼ（ＪＡＫ２）遺伝子の１８４９番目のグアニンがチミンに置換される変異（Ｖ６１７Ｆ変異、ＪＡＫ２のアミノ酸配列の６１７位のバリンがフェニルアラニンに置換される変異）が検出されており、特にＰＶ患者では９５％以上からＪＡＫ２遺伝子変異が検出されている（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００４】
ＪＡＫ２タンパク質中にはキナーゼドメイン（ＪＨ１ドメイン）とシュードキナーゼドメイン（ＪＨ２ドメイン）が存在する。ＪＨ１ドメインはキナーゼ活性を持ち、ＪＨ２ドメインはキナーゼ活性を抑制するため、通常、ＪＡＫ２タンパク質のキナーゼ活性は抑制されている（非特許文献３）。ＪＡＫ２の６１７位のアミノ酸はＪＨ２ドメイン中に位置する（非特許文献４）。予想されるＪＡＫ２タンパク質の三次元構造の解析から、第６１８位およびその周辺のアミノ酸残基がＪＨ１（キナーゼ）ドメインと相互作用しキナーゼ活性をブロックすることが示唆されている（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。
【０００５】
ＪａｍｅｓらはＪＡＫ２のＶ６１７Ｆ変異とＪＡＫ２活性化との関係を実験的に調べた。その結果、Ｖ６１７Ｆ変異によってＪＡＫ２のキナーゼ活性の自動抑制が失われ、ＪＡＫ２が活性化されていることがわかっている（非特許文献４）。
【０００６】
ＪＡＫ２変異の検出法としては、患者のＪＡＫ２遺伝子をＰＣＲによって増幅し、シークエンスによって塩基配列を解読するという方法が挙げられる（非特許文献１）。しかしこの方法では解読に半日以上を要する。また、ＰＣＲ産物をシークエンスに供する際に、指数関数的に増幅した増幅産物によるコンタミネーションが生じる可能性があり、このため誤診が発生するという懸念がある。
【０００７】
他の方法として、アレル特異的ＰＣＲ法や制限酵素断片長多型を利用した検出方法（ＲＦＬＰ法）が挙げられる（非特許文献６）。これらの方法ではシークエンス法よりは解析時間が短縮されるが、増幅産物を電気泳動で取り扱うという作業を含むため、依然として増幅産物によるコンタミネーションの可能性が残っている。
【０００８】
これらの欠点を克服する検出方法としては蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて融解曲線解析を行い、融解曲線解析の結果に基づいて変異を検出する方法が知られている（非特許文献７）。核酸プローブを用いた方法では一つの反応系の中に核酸プライマー、核酸プローブ、そして試薬類を全て混合した上で核酸増幅反応および核酸プローブのハイブリダイズを行う。そのため、増幅産物によるコンタミネーションの危険性を除去できる。しかし非特許文献７に記載の方法では蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を用いて検出しているため、検出には２本の核酸プローブが必要であり、コストがかかるという欠点がある。
【０００９】
上記検出方法の欠点を補う方法として、一本の核酸プローブを用いて融解曲線解析を行いＪＡＫ２変異を検出する方法も存在する（特許文献１）。特許文献１にはＪＡＫ２遺伝子の成熟ｍＲＮＡにおける１８４９番目の塩基がチミンに変異した変異型ＪＡＫ２遺伝子と完全に相補的な配列を有する核酸プローブがより好ましいという旨の記載がある。また、上記のような核酸プローブによる実施例も報告されている。この核酸プローブによる検出では、ＪＡＫ２遺伝子の１８４９番目がチミンに変異しているか否かを判別することが可能である。
【００１０】
しかしながら特許文献１の上記記載に従えば、該特許で推奨される核酸プローブではＪＡＫ２の第６１７位がフェニルアラニン以外のアミノ酸に変異した場合に、その変異型ＪＡＫ２と野生型ＪＡＫ２とを判別することができない。従って、ＪＡＫ２の第６１７位変異を検出するという臨床上の課題が完全に解決されているとは言えない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＷＯ２００９／０１１２９７
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｌｅｖｉｎｅ Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７，３８７−３９７，２００５
【非特許文献２】Ｋｒａｌｏｖｉｃｓ Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５２，１１７９−１１９０，２００５
【非特許文献３】Ｂａｘｔｅｒ ＥＪ．ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ ３６５，１０５４−１０６１，２００５
【非特許文献４】Ｊａｍｅｓ Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４３４，１１４４−１１４８，２００５
【非特許文献５】Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｂｌｏｏｄ １０５，４１８７−４１９０，２００５
【非特許文献６】Ｆｒａｎｔｚ Ｃ． ｅｔ ａｌ. Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ １２８，８６５−８７４，２００７
【非特許文献７】Ｌａｙ Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ．８，３３０−３３４，２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は上記従来のＪＡＫ２遺伝子変異検査における問題点を解決しようとするものであり、その目的はＪＡＫ２遺伝子の変異検出を迅速、正確、かつ安価に行うための方法及び試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは上記課題に鑑み鋭意検討した結果、ＪＡＫ２遺伝子の変異しうる塩基およびその周辺の塩基配列に特異的に結合する１本の核酸プローブを用いることにより従来技術よりも正確にＪＡＫ２遺伝子の変異を検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
【００１５】
［項１］
ＪＡＫ２遺伝子の変異を検出するためのプローブであって、配列番号１または２のいずれかに示す塩基配列からなるプローブ。
［項２］
前記プローブが、標識物質で標識化された標識化プローブである、項１に記載のプローブ。
［項３］
前記標識化プローブが、蛍光色素による標識である、項２に記載のプローブ。
［項４］
ＪＡＫ２遺伝子の変異を検出する方法であって、以下（１）〜（３）の工程を全て含む方法。
（１）被検核酸と項１〜３のいずれかに記載のプローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成させる工程
（２）前記工程（１）のあとに、連続的な温度上昇を行いながら融解曲線分析を行う工程。
（３） 温度変化に伴う融解曲線の変動から、前記被検核酸における前記変異の有無を決定する工程
［項５］
工程（１）におけるプローブが、標識物質で標識化された標識化プローブであり、該プローブの標識強度を測定することにより融解曲線分析を行う、項４に記載の方法
［項６］
前記標識化プローブが、蛍光色素による標識であり、該プローブを標識している蛍光色素の蛍光強度を測定することにより、融解曲線分析を行う、項５に記載の方法。
［項７］
工程（１）における被検核酸が、プライマー対を用いて鋳型核酸から増幅された物である、項４〜６のいずれかに記載の方法。
［項８］
核酸増幅に、１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有し、かつ、５’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼを用いる、項７に記載の方法。
［項９］
前記プライマー対が、下記（Ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーである、項７に記載の検出方法。
（Ｆ）塩基配列が配列番号３で示されるオリゴヌクレオチド
（Ｒ）塩基配列が配列番号４で示されるオリゴヌクレオチド
［項１０］
核酸増幅法によりＪＡＫ２遺伝子を増幅するためのプライマー対であって、配列番号３、配列番号４のいずれかに示す塩基配列からなる核酸プライマー対。
［項１１］
請求項４〜６のいずれかに記載のＪＡＫ２遺伝子の変異を検出する方法に用いるための変異検出キットであって、項１に記載のプローブを含む変異検出キット。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、ＪＡＫ２遺伝子のＶ６１７Ｆ変異の検査を迅速、正確かつ簡便に行うことが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例１の結果を示す図である。
【図２】実施例２の結果を示す図である。
【図３】実施例３の結果を示す図である。
【図４】実施例４の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の実施形態の一つは、ＪＡＫ２遺伝子の変異を検出するためのプローブであって、配列番号１または２のいずれかに示す塩基配列からなるプローブである。
【００１９】
ＪＡＫ２遺伝子の完全長配列（１４２７５１ｂｐ）は、例えば、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＣ＿０００００９に登録されている。ＪＡＫ２遺伝子のｍＲＮＡ（５０９７ｂｐ）は、例えば、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００４９７２に登録されており、この登録されている塩基配列の２３４３番目が、検出対象の塩基部位である。なお、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００４９７２に登録されている塩基配列において、４９５番目〜３８９３番目の領域が成熟ｍＲＮＡ（ＣＤＳ）配列であり、ＣＤＳ内の１８４９番目が、検出目的の塩基部位である。
【００２０】
本明細書において「ＪＡＫ２遺伝子の１８４９位」とはＪＡＫ２遺伝子ＣＤＳの１８４９位を指す。
【００２１】
ＮＭ＿００４９７２に登録されている塩基配列を配列番号５に示した。以下、ＪＡＫ２遺伝子の１８４９位は配列番号５の２３４３位に等しい。
【００２２】
配列番号１で示される本発明のプローブは、ＪＡＫ２遺伝子の１８４９位を含む部分領域に相補的な配列で構成されており、なおかつ１８４９位が野生型の塩基であるグアニンである場合にセンス鎖と完全な相補鎖となるように設計されていて、センス鎖における変異を確認できる。配列番号２で示される本発明のプローブも、ＪＡＫ２遺伝子の１８４９位を含む部分領域に相補的な配列で構成されており、ＪＡＫ２遺伝子のアンチセンス鎖（逆鎖）に相補的であって、アンチセンス鎖における変異を確認できる。
従って検査対象のＪＡＫ２遺伝子が野生型である場合に、該核酸プローブは検査対象のＪＡＫ２遺伝子とより結合しやすく、また融解しにくい。
【００２３】
上記の通り本発明プローブはＪＡＫ２遺伝子の１８４９位が野生型の塩基であるグアニンである場合に完全な相補鎖となるように設計されている。この塩基配列による利点として、第一に変異型ＪＡＫ２遺伝子の核酸増幅を阻害しにくいことが挙げられる。
上記の通りＪＡＫ２遺伝子と結合する核酸プローブ存在下で核酸増幅を実施した場合に、該核酸プローブが試料のＪＡＫ２遺伝子またはその増幅産物と結合し核酸増幅を阻害しうる。該核酸プローブの塩基配列が変異型ＪＡＫ２遺伝子と最も結合しやすい配列であった場合、該核酸プローブは変異型ＪＡＫ２遺伝子の核酸増幅をより阻害しやすいため、ＪＡＫ２遺伝子変異の検出には好ましくない。しかし、本発明の核酸プローブは野生型ＪＡＫ２遺伝子と最も結合しやすい配列に設計されているため、変異型ＪＡＫ２遺伝子の核酸増幅は比較的阻害しにくい。従って、ＪＡＫ２遺伝子変異の検出にはより好ましい形態である。
【００２４】
第二に本発明プローブは融解曲線解析によってＪＡＫ２遺伝子の塩基配列中に変異の有無があるかを識別することができる。
本発明プローブは野生型ＪＡＫ２遺伝子と完全に相補的な塩基配列であるため、ＪＡＫ２遺伝子の野生型と変異型とを識別することができ、該変異型は１８４９番目の塩基がグアニンからチミンになる変異には限定されない。従って本発明プローブではＪＡＫ２タンパク質のＶ６１７ＦのみならずＶ６１７Ｗ（ＪＡＫ２のアミノ酸配列の６１７位のバリンがトリプトファンに置換される変異）、Ｖ６１７Ｍ（ＪＡＫ２のアミノ酸配列の６１７位のバリンがメチオニンに置換される変異）など他の第６１７位変異についても迅速かつ簡便な検出が可能である。
【００２５】
本発明のプローブは、配列番号１または２に示される核酸配列が好ましいが、ＪＡＫ２遺伝子中の１８４９位を含む連続した１０塩基以上３０塩基以下の核酸配列またはこれに相補的な核酸配列であれば、特に限定されない。
【００２６】
本発明のプローブは、標識物質で標識化された標識化プローブであってもよい。好ましくは、蛍光色素によって標識された核酸プローブ、さらに好ましくは、末端が蛍光色素によって標識された核酸プローブを使用できる。
【００２７】
本発明のプローブは、標識物質で標識化されたプローブであることが好ましい。前記標識物質は、制限されないが、蛍光色素（蛍光団）があげられる。前記標識化プローブの具体例として、例えば、前記蛍光色素で標識され、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような現象は、一般に、蛍光消光現象と呼ばれる。この蛍光消光現象を利用したプローブとしては、中でも、一般的にグアニン消光プローブとよばれるものが好ましい。このようなプローブは、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。グアニン消光プローブとは、例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端の塩基がシトシンとなるように設計し、その末端の塩基シトシンが相補的な塩基グアニンに近づくと発光が弱くなる蛍光色素で前記末端を標識化したプローブである。本発明のプローブにおいては、例えば、蛍光消光現象を示す蛍光色素を、前記オリゴヌクレオチドの３’末端のシトシンに結合させてもよいし、前記オリゴヌクレオチドの５’末端をシトシンに設計し、これに結合させてもよい。
【００２８】
前記蛍光色素は、制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光色素としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（商標名、モレキュラープローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ(モレキュラープローブ社製)等があげられる。プローブの検出条件は、特に制限されず、使用する蛍光色素により適宜決定できるが、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅは、検出波長４５０〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５〜７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬは、検出波長５１５〜５５５ｎｍで検出できる。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。
【００２９】
本発明のプローブは、例えば、３’末端にリン酸基が付加されてもよい。後述するように、変異の有無を検出する被検核酸（標的核酸）は、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって調製することができ、この際、本発明のプローブを核酸増幅反応の反応系に共存させることができる。このような場合、プローブの３’末端にリン酸基を付加させておけば、プローブ自体が核酸増幅反応によって伸長することを十分に防止できる。また、３’末端に前述のような標識物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。
【００３０】
本発明のプローブは、前述のように、ＪＡＫ２遺伝子の変異の検出に使用することができる。この変異の検出方法は、何ら制限されず、被検核酸と前記プローブとのハイブリダイズを利用する方法であればよい。
【００３１】
本発明の実施形態の一つは、ＪＡＫ２遺伝子の変異を検出する方法であって、以下（１）〜（３）の工程を全て含むことを特徴とする方法である。
（１）被検核酸と項１〜３のいずれかに記載のプローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成させる工程
（２）前記工程（１）のあとに、連続的な温度上昇を行いながら融解曲線分析を行う工程。
（３） 温度変化に伴う融解曲線の変動から、前記被検核酸における前記変異の有無を決定する工程
【００３２】
ここで、工程１におけるプローブは、特に限定されないが、標識物質で標識化された標識化プローブであることが好ましく、蛍光色素による標識であることがさらに好ましい。該プローブの標識強度を測定することにより融解曲線分析を行うことができる。標識が蛍光色素の場合は、蛍光強度を測定することにより融解曲線分析を行うことができる。
【００３３】
本発明の変異検出方法によれば、配列番号１に示すＪＡＫ２遺伝子のｅｘｏｎ１２における７３番目の塩基（ｋ）の変異（ｇ→ｔ）を検出できる。
【００３４】
本発明における被検核酸は、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。二本鎖の場合は、例えば、被検核酸とプローブとをハイブリダイズさせてハイブリッド体を形成するために、加熱により前記二本鎖を一本鎖に解離させる工程を含むことが好ましい。
【００３５】
前記被検核酸の種類としては、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡや、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ等があげられる。また、前記被検核酸は、例えば、生体試料等の試料に含まれる核酸があげられる。前記試料中の核酸は、例えば、生体試料中に元来含まれている核酸でもよいが、例えば、変異検出の精度を向上できることから、前記生体試料中の核酸を鋳型として核酸増幅法により増幅させた増幅産物等があげられる。具体例としては、例えば、前記生体試料に元来含まれているＤＮＡを鋳型として、核酸増幅法により増幅させた増幅産物や、前記生体試料に元来含まれているＲＮＡから逆転写反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により生成させたｃＤＮＡを鋳型として、核酸増幅法により増幅させた増幅産物があげられる。これらの増幅産物を、本発明における被検核酸としてもよい。前記増幅産物の長さは、特に制限されないが、例えば、５０〜１０００塩基であり、好ましくは８０〜２００塩基である。
【００３６】
前記生体試料としては、特に制限されないが、例えば、白血球細胞等の血球試料、全血試料等があげられる。なお、本発明において、試料の採取方法、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。
【００３７】
本発明の方法で用いる融解曲線分析について説明する。例えば、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は、加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。
【００３８】
本発明において、融解曲線分析を行うための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から、２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、本発明のプローブに付加した標識のシグナルを測定することが好ましい。このため、本発明のプローブとして、前述の標識化プローブを使用することが好ましい。
前記標識化プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブがあげられる。前者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識によるシグナルをシグナル特有の条件（吸光度等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行を把握することができる。標識化プローブにおける標識化物質は、例えば、前述のとおりである。
【００３９】
前述のように、被検核酸が、鋳型核酸から核酸増幅法により増幅させた増幅産物である場合、前記工程（１）は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーのプライマー対を用いて鋳型核酸から核酸を増幅する工程を含んでも良い。言い換えれば、前記工程（１）における被検核酸は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーのプライマー対を用いて鋳型核酸から増幅された物であっても良い。
【００４０】
前記プライマー対としては、ＪＡＫ２遺伝子において本発明のプローブがハイブリダイズ可能な領域が増幅されればよく、特に制限されない。前記増幅領域は、例えば、前記プローブがハイブリダイズする領域のみでもよいし、前記ハイブリダイズ領域を含む領域であってもよい。
【００４１】
具体的には、例えば、下記（Ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーが例示できる。
（Ｆ）塩基配列が配列番号３で示されるオリゴヌクレオチド
（Ｒ）塩基配列が配列番号４で示されるオリゴヌクレオチド
【００４２】
前記核酸増幅工程に用いられる具体的な核酸増幅方法としては特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等があげられるが、ＰＣＲ法を用いることが好ましい。なお、これらの各方法において、増幅反応の条件は特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【００４３】
核酸増幅にＰＣＲ法を用いる場合、ＤＮＡポリメラーゼには、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。その理由を以下に説明する。
【００４４】
本発明プローブが含まれる反応系でＪＡＫ２遺伝子を増幅する場合、核酸増幅工程中に該核酸プローブが試料のＪＡＫ２遺伝子またはその増幅産物と結合しうる。核酸増幅工程中にＪＡＫ２遺伝子と結合した該核酸プローブは、核酸プライマーとＤＮＡポリメラーゼによる核酸増幅反応を阻害する。
【００４５】
Ｔａｑ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅなどＰｏｌＩ型のＤＮＡポリメラーゼは５’→ ３’エキソヌクレアーゼ活性を持つことが知られている。この活性のため、核酸増幅反応中に鋳型となるＪＡＫ２遺伝子と結合した核酸がある場合、該結合核酸はエキソヌクレアーゼ活性によって分解されてしまう。このため、反応系中の該核酸プローブが減少し核酸検出工程に問題が生じる可能性がある。従って、ＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼを用いて本発明を実施することは好ましくない。
【００４６】
他方、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（超好熱始原菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１由来）などα型のＤＮＡポリメラーゼは５’→ ３’エキソヌクレアーゼ活性は持たず、３’→ ５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ。従って、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いれば上記問題を解決できるのみならず、３’→ ５’エキソヌクレアーゼ活性により核酸増幅工程において高い正確性が発揮される。
【００４７】
通常、α型ＤＮＡポリメラーゼは３’→ ５’エキソヌクレアーゼ活性のため、核酸増幅速度はＰｏｌＩ型酵素と比較して低い傾向がある。しかし、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはα型ＤＮＡポリメラーゼでありながらＤＮＡ合成活性が高く１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有し伸長効率が優れている。従って、本発明の実施にはα型ＤＮＡポリメラーゼの中でも、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績製、商標）を用いることが好ましい。
【００４８】
さらに、α型ＤＮＡポリメラーゼを変異させて１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を達成させた変異型、あるいは、野生型および／または変異型の組み合わせにより当該性能を達成させたＤＮＡポリメラーゼ組成物も、本発明の実施に適したＤＮＡポリメラーゼとして用いることができる。
例えば、上記ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ以外に１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有するＤＮＡポリメラーゼとして、「ＫＯＤ ＦＸ（東洋紡績製、登録商標）」、「ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−（東洋紡績製、商標）」、「ＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡績製、登録商標）」、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製、登録商標）なども利用できる。
【００４９】
本発明において、ＤＮＡ合成活性とは鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にデオキシリボヌクレオシド５’−トリホスフェートのα−ホスフェートを共有結合せしめることにより、デオキシリボ核酸にデオキシリボヌクレオシド５’−モノホスフェートを鋳型依存的に導入する反応を触媒する活性をいう。
【００５０】
その活性測定法は、酵素活性が高い場合には、保存緩衝液でサンプルを希釈して測定を行う。本発明では、下記Ａ液２５μｌ、Ｂ液およびＣ液各５μｌおよび滅菌水１０μｌをエッペンドルフチューブに加えて攪拌混合した後、上記酵素液５μｌを加えて７５℃で１０分間反応する。その後、氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後、さらに１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマンＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで充分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件下で３０分あたり１０ｎモルのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とする。
Ａ： ４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
１６ｍＭ 塩化マグネシウム
１５ｍＭ ジチオスレイトール
１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ
Ｂ： ２μｇ／μｌ 活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ： １．５ｍＭ ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ〔 ３Ｈ〕ｄＴＴＰ）
Ｄ： ２０％ トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ： １μｇ／μｌ キャリアーＤＮＡ
【００５１】
本発明において、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性とは、ＤＮＡの３’末端領域を切除し、５’−モノヌクレオチドを遊離する活性をいう。
その活性測定法は、５０μｌの反応液（１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８ ａｔ ２５℃）， １０ｍＭ ＫＣｌ， ６ｍＭ 硫酸アンモニウム，１ｍＭ ＭｇＣｌ２， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ０．００１％ ＢＳＡ，５ μｇ トリチウムラベルされた大腸菌ＤＮＡ）を１．５ｍｌのエッペンチューブに分注し、ＤＮＡポリメラーゼを加える。７５℃で１０分間反応させた後、氷冷によって反応を停止し、次にキャリアーとして、０．１％のＢＳＡを５０μｌ加え、さらに１０％のトリクロロ酢酸、２％ピロリン酸ナトリウム溶液を１００μｌ加え混合する。氷上で１５分放置した後、１２，０００回転で１０分間遠心し沈殿を分離する。上清１００μｌの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、酸可溶性画分に遊離したヌクレオチド量を測定する。
【００５２】
次に、本発明の変異検出方法について、本発明のプローブとして、蛍光色素で標識化された標識化プローブを使用する例をあげて説明する。なお、本発明の変異検出方法は、以下の説明によって何ら制限されることはない。
【００５３】
まず、例えば全血からゲノムＤＮＡを単離する。単離は、例えば、市販のゲノムＤＮＡ単離キットを用いて行うことができる。
次に、単離したゲノムＤＮＡを含む試料に、標識化プローブとして、例えば、ＱＰｒｏｂｅを添加する。
【００５４】
前記プローブの添加のタイミングは、特に制限されず、例えば、後述する増幅反応前、増幅反応途中および増幅反応後のいずれに、増幅反応の反応系に添加してもよい。
中でも、増幅反応と、前記工程（２）とを連続的に行うことができるため、増幅反応前に添加することが好ましい。このように核酸増幅反応の前に前記プローブを添加する場合は、例えば、前述のように、その３’末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加することが好ましい。
【００５５】
前記プローブは、単離したゲノムＤＮＡを含む液体試料に添加してもよいし、溶媒中でゲノムＤＮＡと混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものがあげられる。
【００５６】
続いて、単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって、検出目的の塩基部位を含む配列を増幅させる。なお、ＰＣＲ等の条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【００５７】
ＰＣＲのプライマーの配列は、検出目的の塩基部位を含む配列を増幅できるものであれば特に制限されず、前述のように、目的の配列に応じて、従来公知の方法により適宜設計できる。プライマーの長さは、特に制限されず、一般的な長さ（例えば、１０〜３０ｍｅｒ）に設定できる。
【００５８】
本発明の検出方法に使用するプライマーセットとしては、例えば、前述の本発明のプライマーセットがあげられる。なお、本発明のプライマーセットの用途は、本発明の検出方法には制限されず、また、本発明の検出方法に使用するプライマーセットも、本発明のプライマーセットには限定されない。
【００５９】
次に、得られたＰＣＲ増幅産物の解離、および、解離により得られた一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズを行う。これは、例えば、前記反応液の温度変化によって行うことができる。
【００６０】
前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５〜９８℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。
【００６１】
また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、４０〜５０℃である。
【００６２】
ハイブリダイズ工程の反応系（反応系）における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応系において、ＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１〜１μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．１〜０．５μｍｏｌ／Ｌ、前記標識化プローブの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲が好ましく、例えば、０．００１〜１０μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．００１〜１μｍｏｌ／Ｌである。
【００６３】
そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記標識化プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、前記反応液（前記一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリッド形成体）を加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、末端のＣ塩基が標識化されたプローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００６４】
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃であり、好ましくは２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．０５〜２０℃／秒であり、好ましくは０．０８〜５℃／秒である。
【００６５】
目的の塩基部位における遺伝子型（野生型、変異型など）の決定は、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動を測定することによって行いうる。すなわち、前記プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定する。
【００６６】
具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００６７】
また、本発明においては、目的の塩基部位における遺伝子型の決定のために、前記シグナルの変動を解析してＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値として決定してもよい。
【実施例】
【００６８】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００６９】
〔実施例１：精製したヒトゲノムからのＪＡＫ２の検出〕
（１）試料の調製
既にＪＡＫ２の１８４９番目の塩基がＧＧであることが判明している精製されたヒトゲノム（ＨＭ）、１８４９番目の塩基がＴＴであることが判明している精製されたヒトゲノム（Ｈｍ）、そしてＨＭとＨｍを混合したヒトゲノム（ＨＨ）を試料とし、陰性コントロール（ＮＣ）として水を試料とした。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記ヒトゲノム試料および陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりＪＡＫ２遺伝子を検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡績社製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
【００７０】
試薬
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
核酸プライマー（配列番号３） １５００ｎＭ
核酸プライマー（配列番号４） ３００ｎＭ
核酸プローブ（配列番号１、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識） ３００ｎＭ
×１０緩衝液 １μｌ
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ
ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績製） ０．３Ｕ
試料 １μｌ
【００７１】
核酸増幅および融解曲線解析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
６０℃・３秒
６３℃・５秒
（以上５０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃〜７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
【００７２】
結果
図１は、温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図１より明らかなように、ＨＭは約６０℃、Ｈｍは約５０℃で単一のピークが検出されており、ＪＡＫ２遺伝子の１８４９番目の塩基が明確に判別できる。また、ＨＨはこれら二つのピークの両方が検出されており、１８４９番目がＧであるゲノムとＴであるゲノムとが混合された試料からは、野生型と変異型の両方の存在を検出することが可能であることを示している。
【００７３】
〔実施例２：本発明の核酸プライマーと非特許文献７に記載の核酸プライマーの比較〕
（１）試料の調製
濃度既知の精製されたヒトゲノムを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で希釈して５００コピー／μｌまたは５０コピー／μｌに調製し、試料とした。陰性コントロール（ＮＣ）として水を試料とした。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記ヒトゲノム試料および陰性コントロール（ＮＣ）にそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりＪＡＫ２遺伝子を検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡績社製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
【００７４】
試薬
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。核酸プライマーは本発明に記載のプライマー（配列番号３、配列番号４）および非特許文献７に記載のプライマー（配列番号６、配列番号７）を使用した。
［試薬組成１］
核酸プライマー（配列番号３） １５００ｎＭ
核酸プライマー（配列番号４） ３００ｎＭ
核酸プローブ（配列番号１、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識） ３００ｎＭ
×１０緩衝液 １μｌ
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ
ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績製） ０．３Ｕ
試料 １μｌ
［試薬組成２］
核酸プライマー（配列番号６） １５００ｎＭ
核酸プライマー（配列番号７） ３００ｎＭ
核酸プローブ（配列番号１、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識） ３００ｎＭ
１０× Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ ―Ｐｌｕｓ― Ｖｅｒ．２（東洋紡績社製） 1μｌ
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ
ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ
ＢＳＡ ２μｇ
ＤＭＳＯ ０．７５μｌ
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績製） ０．３Ｕ
試料 １μｌ
【００７５】
核酸増幅および融解曲線解析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
６０℃・３秒
６３℃・５秒
（以上５０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃〜７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
【００７６】
結果
図２は、温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。本発明の核酸プライマーを用いた試薬組成（試薬組成１）では、ヒトゲノム試料からのＪＡＫ２検出が行われた。しかし非特許文献７に記載のプライマーである、配列番号６および配列番号７で示される核酸プライマーを用いた試薬組成（試薬組成２）では、ヒトゲノム試料からのＪＡＫ２検出は不可能であった。
本実施例ではＰＣＲ中の核酸熱変性、アニーリング、伸長の各反応を非常に短時間で行っている。そのため核酸増幅および融解曲線解析が約３０分で完了している。図２に示したとおり、本発明の核酸プライマーでは約３０分でのＪＡＫ２遺伝子増幅および検出が可能だったが、非特許文献７に記載のプライマーでは同様の反応条件での短時間検出は不可能だった。従って、該核酸プライマーでは迅速な検出は困難であることが示唆される。
【００７７】
〔比較例１：Ｔａｑ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅとＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの比較〕
（１）試料の調製
実施例２と同じ。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
実施例２と同じ。
【００７８】
試薬
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
核酸プライマー（配列番号３） １５００ｎＭ
核酸プライマー（配列番号４） ３００ｎＭ
核酸プローブ（配列番号１、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識） ３００ｎＭ
×１０ ｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡績社製）1μｌ
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ
ＭｇＣｌ４ ４ｍＭ
ＢＳＡ ２μｇ
ＤＭＳＯ ０．７５μｌ
ｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．３Ｕ
試料 １μｌ
【００７９】
核酸増幅および融解曲線解析
実施例２と同じ。
【００８０】
結果
本比較例は実施例２からＤＮＡポリメラーゼをｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに変更して行ったものであり、核酸増幅および融解曲線解析の条件は実施例２と同一である。本比較例の結果は図３で表される。ｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用した本比較例ではＪＡＫ２の検出はできなかった。
【００８１】
〔実施例３：Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＪＡＫ２遺伝子の検出〕
（１）試料の調製
実施例２と同じ。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
実施例２と同じ。
【００８２】
試薬
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
核酸プライマー（配列番号３） １５００ｎＭ
核酸プライマー（配列番号４） ３００ｎＭ
核酸プローブ（配列番号１、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識） ３００ｎＭ
×１０ ｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡績社製）1μｌ
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ
ＭｇＣｌ４ １．５ｍＭ
ＤＭＳＯ ０．７５μｌ
ｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．３Ｕ
試料 １μｌ
【００８３】
核酸増幅および融解曲線解析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９４℃・５秒
６０℃・５秒
７２℃・１５秒
（以上５０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃〜７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
【００８４】
結果
本実施は比較例１から試薬組成および核酸増幅条件を変更したものである。ＤＮＡポリメラーゼは比較例１と同じくｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いた。本実施例の結果は図４で表される。図３と図４の比較により試薬組成及び核酸増幅条件を変更することでｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅでも検出ピークが得られることがわかる。従って、本発明の核酸プライマーおよび核酸プローブを用いたＪＡＫ２遺伝子検出はＤＮＡポリメラーゼの種類によって限定されるものではない。しかし一方で、実施例２と実施例３との比較から迅速な検出を行うにはｒＴａｑ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅよりもＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの方がより好ましいことが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明をＪＡＫ２遺伝子検査およびＪＡＫ２遺伝子検査試薬開発に適用することで、迅速、確実かつ簡便な慢性骨髄増殖性疾患関連遺伝子の変異検出を行うことができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慢性骨髄増殖性疾患に関する遺伝子変異を検出するためのプローブ、ならびに、該プローブを用いた遺伝子変異の検出方法および遺伝子変異を検出するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性骨髄増殖性疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ；ＣＭＰＤ）は真性赤血球増加症（Ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａ ｖｅｒａ；ＰＶ）、本態性血小板血症（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｈｅｍｉａ；ＥＴ）、慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＣＭＬ）、原発性骨髄線維症（ｐｒｉｍａｒｙ ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ；ＰＭＦ）などの総称である。これらの疾患は造血幹細胞の異常により多系統の増殖がみられるクローン性疾患である。
【０００３】
多くのＣＭＰＤ患者からは、細胞質性非受容体型チロシンキナーゼ（ＪＡＫ２）遺伝子の１８４９番目のグアニンがチミンに置換される変異（Ｖ６１７Ｆ変異、ＪＡＫ２のアミノ酸配列の６１７位のバリンがフェニルアラニンに置換される変異）が検出されており、特にＰＶ患者では９５％以上からＪＡＫ２遺伝子変異が検出されている（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００４】
ＪＡＫ２タンパク質中にはキナーゼドメイン（ＪＨ１ドメイン）とシュードキナーゼドメイン（ＪＨ２ドメイン）が存在する。ＪＨ１ドメインはキナーゼ活性を持ち、ＪＨ２ドメインはキナーゼ活性を抑制するため、通常、ＪＡＫ２タンパク質のキナーゼ活性は抑制されている（非特許文献３）。ＪＡＫ２の６１７位のアミノ酸はＪＨ２ドメイン中に位置する（非特許文献４）。予想されるＪＡＫ２タンパク質の三次元構造の解析から、第６１８位およびその周辺のアミノ酸残基がＪＨ１（キナーゼ）ドメインと相互作用しキナーゼ活性をブロックすることが示唆されている（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。
【０００５】
ＪａｍｅｓらはＪＡＫ２のＶ６１７Ｆ変異とＪＡＫ２活性化との関係を実験的に調べた。その結果、Ｖ６１７Ｆ変異によってＪＡＫ２のキナーゼ活性の自動抑制が失われ、ＪＡＫ２が活性化されていることがわかっている（非特許文献４）。
【０００６】
ＪＡＫ２変異の検出法としては、患者のＪＡＫ２遺伝子をＰＣＲによって増幅し、シークエンスによって塩基配列を解読するという方法が挙げられる（非特許文献１）。しかしこの方法では解読に半日以上を要する。また、ＰＣＲ産物をシークエンスに供する際に、指数関数的に増幅した増幅産物によるコンタミネーションが生じる可能性があり、このため誤診が発生するという懸念がある。
【０００７】
他の方法として、アレル特異的ＰＣＲ法や制限酵素断片長多型を利用した検出方法（ＲＦＬＰ法）が挙げられる（非特許文献６）。これらの方法ではシークエンス法よりは解析時間が短縮されるが、増幅産物を電気泳動で取り扱うという作業を含むため、依然として増幅産物によるコンタミネーションの可能性が残っている。
【０００８】
これらの欠点を克服する検出方法としては蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて融解曲線解析を行い、融解曲線解析の結果に基づいて変異を検出する方法が知られている（非特許文献７）。核酸プローブを用いた方法では一つの反応系の中に核酸プライマー、核酸プローブ、そして試薬類を全て混合した上で核酸増幅反応および核酸プローブのハイブリダイズを行う。そのため、増幅産物によるコンタミネーションの危険性を除去できる。しかし非特許文献７に記載の方法では蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を用いて検出しているため、検出には２本の核酸プローブが必要であり、コストがかかるという欠点がある。
【０００９】
上記検出方法の欠点を補う方法として、一本の核酸プローブを用いて融解曲線解析を行いＪＡＫ２変異を検出する方法も存在する（特許文献１）。特許文献１にはＪＡＫ２遺伝子の成熟ｍＲＮＡにおける１８４９番目の塩基がチミンに変異した変異型ＪＡＫ２遺伝子と完全に相補的な配列を有する核酸プローブがより好ましいという旨の記載がある。また、上記のような核酸プローブによる実施例も報告されている。この核酸プローブによる検出では、ＪＡＫ２遺伝子の１８４９番目がチミンに変異しているか否かを判別することが可能である。
【００１０】
しかしながら特許文献１の上記記載に従えば、該特許で推奨される核酸プローブではＪＡＫ２の第６１７位がフェニルアラニン以外のアミノ酸に変異した場合に、その変異型ＪＡＫ２と野生型ＪＡＫ２とを判別することができない。従って、ＪＡＫ２の第６１７位変異を検出するという臨床上の課題が完全に解決されているとは言えない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＷＯ２００９／０１１２９７
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｌｅｖｉｎｅ Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７，３８７−３９７，２００５
【非特許文献２】Ｋｒａｌｏｖｉｃｓ Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５２，１１７９−１１９０，２００５
【非特許文献３】Ｂａｘｔｅｒ ＥＪ．ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ ３６５，１０５４−１０６１，２００５
【非特許文献４】Ｊａｍｅｓ Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４３４，１１４４−１１４８，２００５
【非特許文献５】Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｂｌｏｏｄ １０５，４１８７−４１９０，２００５
【非特許文献６】Ｆｒａｎｔｚ Ｃ． ｅｔ ａｌ. Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ １２８，８６５−８７４，２００７
【非特許文献７】Ｌａｙ Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ．８，３３０−３３４，２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は上記従来のＪＡＫ２遺伝子変異検査における問題点を解決しようとするものであり、その目的はＪＡＫ２遺伝子の変異検出を迅速、正確、かつ安価に行うための方法及び試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは上記課題に鑑み鋭意検討した結果、ＪＡＫ２遺伝子の変異しうる塩基およびその周辺の塩基配列に特異的に結合する１本の核酸プローブを用いることにより従来技術よりも正確にＪＡＫ２遺伝子の変異を検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
【００１５】
［項１］
ＪＡＫ２遺伝子の変異を検出するためのプローブであって、配列番号１または２のいずれかに示す塩基配列からなるプローブ。
［項２］
前記プローブが、標識物質で標識化された標識化プローブである、項１に記載のプローブ。
［項３］
前記標識化プローブが、蛍光色素による標識である、項２に記載のプローブ。
［項４］
ＪＡＫ２遺伝子の変異を検出する方法であって、以下（１）〜（３）の工程を全て含む方法。
（１）被検核酸と項１〜３のいずれかに記載のプローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成させる工程
（２）前記工程（１）のあとに、連続的な温度上昇を行いながら融解曲線分析を行う工程。
（３） 温度変化に伴う融解曲線の変動から、前記被検核酸における前記変異の有無を決定する工程
［項５］
工程（１）におけるプローブが、標識物質で標識化された標識化プローブであり、該プローブの標識強度を測定することにより融解曲線分析を行う、項４に記載の方法
［項６］
前記標識化プローブが、蛍光色素による標識であり、該プローブを標識している蛍光色素の蛍光強度を測定することにより、融解曲線分析を行う、項５に記載の方法。
［項７］
工程（１）における被検核酸が、プライマー対を用いて鋳型核酸から増幅された物である、項４〜６のいずれかに記載の方法。
［項８］
核酸増幅に、１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有し、かつ、５’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼを用いる、項７に記載の方法。
［項９］
前記プライマー対が、下記（Ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーである、項７に記載の検出方法。
（Ｆ）塩基配列が配列番号３で示されるオリゴヌクレオチド
（Ｒ）塩基配列が配列番号４で示されるオリゴヌクレオチド
［項１０］
核酸増幅法によりＪＡＫ２遺伝子を増幅するためのプライマー対であって、配列番号３、配列番号４のいずれかに示す塩基配列からなる核酸プライマー対。
［項１１］
請求項４〜６のいずれかに記載のＪＡＫ２遺伝子の変異を検出する方法に用いるための変異検出キットであって、項１に記載のプローブを含む変異検出キット。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、ＪＡＫ２遺伝子のＶ６１７Ｆ変異の検査を迅速、正確かつ簡便に行うことが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例１の結果を示す図である。
【図２】実施例２の結果を示す図である。
【図３】実施例３の結果を示す図である。
【図４】実施例４の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の実施形態の一つは、ＪＡＫ２遺伝子の変異を検出するためのプローブであって、配列番号１または２のいずれかに示す塩基配列からなるプローブである。
【００１９】
ＪＡＫ２遺伝子の完全長配列（１４２７５１ｂｐ）は、例えば、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＣ＿０００００９に登録されている。ＪＡＫ２遺伝子のｍＲＮＡ（５０９７ｂｐ）は、例えば、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００４９７２に登録されており、この登録されている塩基配列の２３４３番目が、検出対象の塩基部位である。なお、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００４９７２に登録されている塩基配列において、４９５番目〜３８９３番目の領域が成熟ｍＲＮＡ（ＣＤＳ）配列であり、ＣＤＳ内の１８４９番目が、検出目的の塩基部位である。
【００２０】
本明細書において「ＪＡＫ２遺伝子の１８４９位」とはＪＡＫ２遺伝子ＣＤＳの１８４９位を指す。
【００２１】
ＮＭ＿００４９７２に登録されている塩基配列を配列番号５に示した。以下、ＪＡＫ２遺伝子の１８４９位は配列番号５の２３４３位に等しい。
【００２２】
配列番号１で示される本発明のプローブは、ＪＡＫ２遺伝子の１８４９位を含む部分領域に相補的な配列で構成されており、なおかつ１８４９位が野生型の塩基であるグアニンである場合にセンス鎖と完全な相補鎖となるように設計されていて、センス鎖における変異を確認できる。配列番号２で示される本発明のプローブも、ＪＡＫ２遺伝子の１８４９位を含む部分領域に相補的な配列で構成されており、ＪＡＫ２遺伝子のアンチセンス鎖（逆鎖）に相補的であって、アンチセンス鎖における変異を確認できる。
従って検査対象のＪＡＫ２遺伝子が野生型である場合に、該核酸プローブは検査対象のＪＡＫ２遺伝子とより結合しやすく、また融解しにくい。
【００２３】
上記の通り本発明プローブはＪＡＫ２遺伝子の１８４９位が野生型の塩基であるグアニンである場合に完全な相補鎖となるように設計されている。この塩基配列による利点として、第一に変異型ＪＡＫ２遺伝子の核酸増幅を阻害しにくいことが挙げられる。
上記の通りＪＡＫ２遺伝子と結合する核酸プローブ存在下で核酸増幅を実施した場合に、該核酸プローブが試料のＪＡＫ２遺伝子またはその増幅産物と結合し核酸増幅を阻害しうる。該核酸プローブの塩基配列が変異型ＪＡＫ２遺伝子と最も結合しやすい配列であった場合、該核酸プローブは変異型ＪＡＫ２遺伝子の核酸増幅をより阻害しやすいため、ＪＡＫ２遺伝子変異の検出には好ましくない。しかし、本発明の核酸プローブは野生型ＪＡＫ２遺伝子と最も結合しやすい配列に設計されているため、変異型ＪＡＫ２遺伝子の核酸増幅は比較的阻害しにくい。従って、ＪＡＫ２遺伝子変異の検出にはより好ましい形態である。
【００２４】
第二に本発明プローブは融解曲線解析によってＪＡＫ２遺伝子の塩基配列中に変異の有無があるかを識別することができる。
本発明プローブは野生型ＪＡＫ２遺伝子と完全に相補的な塩基配列であるため、ＪＡＫ２遺伝子の野生型と変異型とを識別することができ、該変異型は１８４９番目の塩基がグアニンからチミンになる変異には限定されない。従って本発明プローブではＪＡＫ２タンパク質のＶ６１７ＦのみならずＶ６１７Ｗ（ＪＡＫ２のアミノ酸配列の６１７位のバリンがトリプトファンに置換される変異）、Ｖ６１７Ｍ（ＪＡＫ２のアミノ酸配列の６１７位のバリンがメチオニンに置換される変異）など他の第６１７位変異についても迅速かつ簡便な検出が可能である。
【００２５】
本発明のプローブは、配列番号１または２に示される核酸配列が好ましいが、ＪＡＫ２遺伝子中の１８４９位を含む連続した１０塩基以上３０塩基以下の核酸配列またはこれに相補的な核酸配列であれば、特に限定されない。
【００２６】
本発明のプローブは、標識物質で標識化された標識化プローブであってもよい。好ましくは、蛍光色素によって標識された核酸プローブ、さらに好ましくは、末端が蛍光色素によって標識された核酸プローブを使用できる。
【００２７】
本発明のプローブは、標識物質で標識化されたプローブであることが好ましい。前記標識物質は、制限されないが、蛍光色素（蛍光団）があげられる。前記標識化プローブの具体例として、例えば、前記蛍光色素で標識され、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような現象は、一般に、蛍光消光現象と呼ばれる。この蛍光消光現象を利用したプローブとしては、中でも、一般的にグアニン消光プローブとよばれるものが好ましい。このようなプローブは、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。グアニン消光プローブとは、例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端の塩基がシトシンとなるように設計し、その末端の塩基シトシンが相補的な塩基グアニンに近づくと発光が弱くなる蛍光色素で前記末端を標識化したプローブである。本発明のプローブにおいては、例えば、蛍光消光現象を示す蛍光色素を、前記オリゴヌクレオチドの３’末端のシトシンに結合させてもよいし、前記オリゴヌクレオチドの５’末端をシトシンに設計し、これに結合させてもよい。
【００２８】
前記蛍光色素は、制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光色素としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（商標名、モレキュラープローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ(モレキュラープローブ社製)等があげられる。プローブの検出条件は、特に制限されず、使用する蛍光色素により適宜決定できるが、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅは、検出波長４５０〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５〜７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬは、検出波長５１５〜５５５ｎｍで検出できる。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。
【００２９】
本発明のプローブは、例えば、３’末端にリン酸基が付加されてもよい。後述するように、変異の有無を検出する被検核酸（標的核酸）は、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって調製することができ、この際、本発明のプローブを核酸増幅反応の反応系に共存させることができる。このような場合、プローブの３’末端にリン酸基を付加させておけば、プローブ自体が核酸増幅反応によって伸長することを十分に防止できる。また、３’末端に前述のような標識物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。
【００３０】
本発明のプローブは、前述のように、ＪＡＫ２遺伝子の変異の検出に使用することができる。この変異の検出方法は、何ら制限されず、被検核酸と前記プローブとのハイブリダイズを利用する方法であればよい。
【００３１】
本発明の実施形態の一つは、ＪＡＫ２遺伝子の変異を検出する方法であって、以下（１）〜（３）の工程を全て含むことを特徴とする方法である。
（１）被検核酸と項１〜３のいずれかに記載のプローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成させる工程
（２）前記工程（１）のあとに、連続的な温度上昇を行いながら融解曲線分析を行う工程。
（３） 温度変化に伴う融解曲線の変動から、前記被検核酸における前記変異の有無を決定する工程
【００３２】
ここで、工程１におけるプローブは、特に限定されないが、標識物質で標識化された標識化プローブであることが好ましく、蛍光色素による標識であることがさらに好ましい。該プローブの標識強度を測定することにより融解曲線分析を行うことができる。標識が蛍光色素の場合は、蛍光強度を測定することにより融解曲線分析を行うことができる。
【００３３】
本発明の変異検出方法によれば、配列番号１に示すＪＡＫ２遺伝子のｅｘｏｎ１２における７３番目の塩基（ｋ）の変異（ｇ→ｔ）を検出できる。
【００３４】
本発明における被検核酸は、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。二本鎖の場合は、例えば、被検核酸とプローブとをハイブリダイズさせてハイブリッド体を形成するために、加熱により前記二本鎖を一本鎖に解離させる工程を含むことが好ましい。
【００３５】
前記被検核酸の種類としては、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡや、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ等があげられる。また、前記被検核酸は、例えば、生体試料等の試料に含まれる核酸があげられる。前記試料中の核酸は、例えば、生体試料中に元来含まれている核酸でもよいが、例えば、変異検出の精度を向上できることから、前記生体試料中の核酸を鋳型として核酸増幅法により増幅させた増幅産物等があげられる。具体例としては、例えば、前記生体試料に元来含まれているＤＮＡを鋳型として、核酸増幅法により増幅させた増幅産物や、前記生体試料に元来含まれているＲＮＡから逆転写反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により生成させたｃＤＮＡを鋳型として、核酸増幅法により増幅させた増幅産物があげられる。これらの増幅産物を、本発明における被検核酸としてもよい。前記増幅産物の長さは、特に制限されないが、例えば、５０〜１０００塩基であり、好ましくは８０〜２００塩基である。
【００３６】
前記生体試料としては、特に制限されないが、例えば、白血球細胞等の血球試料、全血試料等があげられる。なお、本発明において、試料の採取方法、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。
【００３７】
本発明の方法で用いる融解曲線分析について説明する。例えば、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は、加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。
【００３８】
本発明において、融解曲線分析を行うための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から、２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、本発明のプローブに付加した標識のシグナルを測定することが好ましい。このため、本発明のプローブとして、前述の標識化プローブを使用することが好ましい。
前記標識化プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブがあげられる。前者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識によるシグナルをシグナル特有の条件（吸光度等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行を把握することができる。標識化プローブにおける標識化物質は、例えば、前述のとおりである。
【００３９】
前述のように、被検核酸が、鋳型核酸から核酸増幅法により増幅させた増幅産物である場合、前記工程（１）は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーのプライマー対を用いて鋳型核酸から核酸を増幅する工程を含んでも良い。言い換えれば、前記工程（１）における被検核酸は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーのプライマー対を用いて鋳型核酸から増幅された物であっても良い。
【００４０】
前記プライマー対としては、ＪＡＫ２遺伝子において本発明のプローブがハイブリダイズ可能な領域が増幅されればよく、特に制限されない。前記増幅領域は、例えば、前記プローブがハイブリダイズする領域のみでもよいし、前記ハイブリダイズ領域を含む領域であってもよい。
【００４１】
具体的には、例えば、下記（Ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーが例示できる。
（Ｆ）塩基配列が配列番号３で示されるオリゴヌクレオチド
（Ｒ）塩基配列が配列番号４で示されるオリゴヌクレオチド
【００４２】
前記核酸増幅工程に用いられる具体的な核酸増幅方法としては特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等があげられるが、ＰＣＲ法を用いることが好ましい。なお、これらの各方法において、増幅反応の条件は特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【００４３】
核酸増幅にＰＣＲ法を用いる場合、ＤＮＡポリメラーゼには、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。その理由を以下に説明する。
【００４４】
本発明プローブが含まれる反応系でＪＡＫ２遺伝子を増幅する場合、核酸増幅工程中に該核酸プローブが試料のＪＡＫ２遺伝子またはその増幅産物と結合しうる。核酸増幅工程中にＪＡＫ２遺伝子と結合した該核酸プローブは、核酸プライマーとＤＮＡポリメラーゼによる核酸増幅反応を阻害する。
【００４５】
Ｔａｑ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅなどＰｏｌＩ型のＤＮＡポリメラーゼは５’→ ３’エキソヌクレアーゼ活性を持つことが知られている。この活性のため、核酸増幅反応中に鋳型となるＪＡＫ２遺伝子と結合した核酸がある場合、該結合核酸はエキソヌクレアーゼ活性によって分解されてしまう。このため、反応系中の該核酸プローブが減少し核酸検出工程に問題が生じる可能性がある。従って、ＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼを用いて本発明を実施することは好ましくない。
【００４６】
他方、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（超好熱始原菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１由来）などα型のＤＮＡポリメラーゼは５’→ ３’エキソヌクレアーゼ活性は持たず、３’→ ５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ。従って、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いれば上記問題を解決できるのみならず、３’→ ５’エキソヌクレアーゼ活性により核酸増幅工程において高い正確性が発揮される。
【００４７】
通常、α型ＤＮＡポリメラーゼは３’→ ５’エキソヌクレアーゼ活性のため、核酸増幅速度はＰｏｌＩ型酵素と比較して低い傾向がある。しかし、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはα型ＤＮＡポリメラーゼでありながらＤＮＡ合成活性が高く１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有し伸長効率が優れている。従って、本発明の実施にはα型ＤＮＡポリメラーゼの中でも、ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績製、商標）を用いることが好ましい。
【００４８】
さらに、α型ＤＮＡポリメラーゼを変異させて１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を達成させた変異型、あるいは、野生型および／または変異型の組み合わせにより当該性能を達成させたＤＮＡポリメラーゼ組成物も、本発明の実施に適したＤＮＡポリメラーゼとして用いることができる。
例えば、上記ＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ以外に１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有するＤＮＡポリメラーゼとして、「ＫＯＤ ＦＸ（東洋紡績製、登録商標）」、「ＫＯＤ −Ｐｌｕｓ−（東洋紡績製、商標）」、「ＫＯＤ Ｄａｓｈ（東洋紡績製、登録商標）」、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製、登録商標）なども利用できる。
【００４９】
本発明において、ＤＮＡ合成活性とは鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にデオキシリボヌクレオシド５’−トリホスフェートのα−ホスフェートを共有結合せしめることにより、デオキシリボ核酸にデオキシリボヌクレオシド５’−モノホスフェートを鋳型依存的に導入する反応を触媒する活性をいう。
【００５０】
その活性測定法は、酵素活性が高い場合には、保存緩衝液でサンプルを希釈して測定を行う。本発明では、下記Ａ液２５μｌ、Ｂ液およびＣ液各５μｌおよび滅菌水１０μｌをエッペンドルフチューブに加えて攪拌混合した後、上記酵素液５μｌを加えて７５℃で１０分間反応する。その後、氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後、さらに１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマンＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで充分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件下で３０分あたり１０ｎモルのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とする。
Ａ： ４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
１６ｍＭ 塩化マグネシウム
１５ｍＭ ジチオスレイトール
１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ
Ｂ： ２μｇ／μｌ 活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ： １．５ｍＭ ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ〔 ３Ｈ〕ｄＴＴＰ）
Ｄ： ２０％ トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ： １μｇ／μｌ キャリアーＤＮＡ
【００５１】
本発明において、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性とは、ＤＮＡの３’末端領域を切除し、５’−モノヌクレオチドを遊離する活性をいう。
その活性測定法は、５０μｌの反応液（１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８ ａｔ ２５℃）， １０ｍＭ ＫＣｌ， ６ｍＭ 硫酸アンモニウム，１ｍＭ ＭｇＣｌ２， ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ０．００１％ ＢＳＡ，５ μｇ トリチウムラベルされた大腸菌ＤＮＡ）を１．５ｍｌのエッペンチューブに分注し、ＤＮＡポリメラーゼを加える。７５℃で１０分間反応させた後、氷冷によって反応を停止し、次にキャリアーとして、０．１％のＢＳＡを５０μｌ加え、さらに１０％のトリクロロ酢酸、２％ピロリン酸ナトリウム溶液を１００μｌ加え混合する。氷上で１５分放置した後、１２，０００回転で１０分間遠心し沈殿を分離する。上清１００μｌの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、酸可溶性画分に遊離したヌクレオチド量を測定する。
【００５２】
次に、本発明の変異検出方法について、本発明のプローブとして、蛍光色素で標識化された標識化プローブを使用する例をあげて説明する。なお、本発明の変異検出方法は、以下の説明によって何ら制限されることはない。
【００５３】
まず、例えば全血からゲノムＤＮＡを単離する。単離は、例えば、市販のゲノムＤＮＡ単離キットを用いて行うことができる。
次に、単離したゲノムＤＮＡを含む試料に、標識化プローブとして、例えば、ＱＰｒｏｂｅを添加する。
【００５４】
前記プローブの添加のタイミングは、特に制限されず、例えば、後述する増幅反応前、増幅反応途中および増幅反応後のいずれに、増幅反応の反応系に添加してもよい。
中でも、増幅反応と、前記工程（２）とを連続的に行うことができるため、増幅反応前に添加することが好ましい。このように核酸増幅反応の前に前記プローブを添加する場合は、例えば、前述のように、その３’末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加することが好ましい。
【００５５】
前記プローブは、単離したゲノムＤＮＡを含む液体試料に添加してもよいし、溶媒中でゲノムＤＮＡと混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものがあげられる。
【００５６】
続いて、単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって、検出目的の塩基部位を含む配列を増幅させる。なお、ＰＣＲ等の条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【００５７】
ＰＣＲのプライマーの配列は、検出目的の塩基部位を含む配列を増幅できるものであれば特に制限されず、前述のように、目的の配列に応じて、従来公知の方法により適宜設計できる。プライマーの長さは、特に制限されず、一般的な長さ（例えば、１０〜３０ｍｅｒ）に設定できる。
【００５８】
本発明の検出方法に使用するプライマーセットとしては、例えば、前述の本発明のプライマーセットがあげられる。なお、本発明のプライマーセットの用途は、本発明の検出方法には制限されず、また、本発明の検出方法に使用するプライマーセットも、本発明のプライマーセットには限定されない。
【００５９】
次に、得られたＰＣＲ増幅産物の解離、および、解離により得られた一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズを行う。これは、例えば、前記反応液の温度変化によって行うことができる。
【００６０】
前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５〜９８℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。
【００６１】
また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、４０〜５０℃である。
【００６２】
ハイブリダイズ工程の反応系（反応系）における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応系において、ＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１〜１μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．１〜０．５μｍｏｌ／Ｌ、前記標識化プローブの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲が好ましく、例えば、０．００１〜１０μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．００１〜１μｍｏｌ／Ｌである。
【００６３】
そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記標識化プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、前記反応液（前記一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリッド形成体）を加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、末端のＣ塩基が標識化されたプローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００６４】
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃であり、好ましくは２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．０５〜２０℃／秒であり、好ましくは０．０８〜５℃／秒である。
【００６５】
目的の塩基部位における遺伝子型（野生型、変異型など）の決定は、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動を測定することによって行いうる。すなわち、前記プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定する。
【００６６】
具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００６７】
また、本発明においては、目的の塩基部位における遺伝子型の決定のために、前記シグナルの変動を解析してＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値として決定してもよい。
【実施例】
【００６８】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００６９】
〔実施例１：精製したヒトゲノムからのＪＡＫ２の検出〕
（１）試料の調製
既にＪＡＫ２の１８４９番目の塩基がＧＧであることが判明している精製されたヒトゲノム（ＨＭ）、１８４９番目の塩基がＴＴであることが判明している精製されたヒトゲノム（Ｈｍ）、そしてＨＭとＨｍを混合したヒトゲノム（ＨＨ）を試料とし、陰性コントロール（ＮＣ）として水を試料とした。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記ヒトゲノム試料および陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりＪＡＫ２遺伝子を検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡績社製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
【００７０】
試薬
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
核酸プライマー（配列番号３） １５００ｎＭ
核酸プライマー（配列番号４） ３００ｎＭ
核酸プローブ（配列番号１、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識） ３００ｎＭ
×１０緩衝液 １μｌ
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ
ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績製） ０．３Ｕ
試料 １μｌ
【００７１】
核酸増幅および融解曲線解析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
６０℃・３秒
６３℃・５秒
（以上５０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃〜７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
【００７２】
結果
図１は、温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図１より明らかなように、ＨＭは約６０℃、Ｈｍは約５０℃で単一のピークが検出されており、ＪＡＫ２遺伝子の１８４９番目の塩基が明確に判別できる。また、ＨＨはこれら二つのピークの両方が検出されており、１８４９番目がＧであるゲノムとＴであるゲノムとが混合された試料からは、野生型と変異型の両方の存在を検出することが可能であることを示している。
【００７３】
〔実施例２：本発明の核酸プライマーと非特許文献７に記載の核酸プライマーの比較〕
（１）試料の調製
濃度既知の精製されたヒトゲノムを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で希釈して５００コピー／μｌまたは５０コピー／μｌに調製し、試料とした。陰性コントロール（ＮＣ）として水を試料とした。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
上記ヒトゲノム試料および陰性コントロール（ＮＣ）にそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりＪＡＫ２遺伝子を検出した。核酸増幅および融解曲線解析には東洋紡績社製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
【００７４】
試薬
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。核酸プライマーは本発明に記載のプライマー（配列番号３、配列番号４）および非特許文献７に記載のプライマー（配列番号６、配列番号７）を使用した。
［試薬組成１］
核酸プライマー（配列番号３） １５００ｎＭ
核酸プライマー（配列番号４） ３００ｎＭ
核酸プローブ（配列番号１、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識） ３００ｎＭ
×１０緩衝液 １μｌ
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ
ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績製） ０．３Ｕ
試料 １μｌ
［試薬組成２］
核酸プライマー（配列番号６） １５００ｎＭ
核酸プライマー（配列番号７） ３００ｎＭ
核酸プローブ（配列番号１、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識） ３００ｎＭ
１０× Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ ―Ｐｌｕｓ― Ｖｅｒ．２（東洋紡績社製） 1μｌ
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ
ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ
ＢＳＡ ２μｇ
ＤＭＳＯ ０．７５μｌ
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績製） ０．３Ｕ
試料 １μｌ
【００７５】
核酸増幅および融解曲線解析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
６０℃・３秒
６３℃・５秒
（以上５０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃〜７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
【００７６】
結果
図２は、温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。本発明の核酸プライマーを用いた試薬組成（試薬組成１）では、ヒトゲノム試料からのＪＡＫ２検出が行われた。しかし非特許文献７に記載のプライマーである、配列番号６および配列番号７で示される核酸プライマーを用いた試薬組成（試薬組成２）では、ヒトゲノム試料からのＪＡＫ２検出は不可能であった。
本実施例ではＰＣＲ中の核酸熱変性、アニーリング、伸長の各反応を非常に短時間で行っている。そのため核酸増幅および融解曲線解析が約３０分で完了している。図２に示したとおり、本発明の核酸プライマーでは約３０分でのＪＡＫ２遺伝子増幅および検出が可能だったが、非特許文献７に記載のプライマーでは同様の反応条件での短時間検出は不可能だった。従って、該核酸プライマーでは迅速な検出は困難であることが示唆される。
【００７７】
〔比較例１：Ｔａｑ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅとＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの比較〕
（１）試料の調製
実施例２と同じ。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
実施例２と同じ。
【００７８】
試薬
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
核酸プライマー（配列番号３） １５００ｎＭ
核酸プライマー（配列番号４） ３００ｎＭ
核酸プローブ（配列番号１、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識） ３００ｎＭ
×１０ ｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡績社製）1μｌ
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ
ＭｇＣｌ４ ４ｍＭ
ＢＳＡ ２μｇ
ＤＭＳＯ ０．７５μｌ
ｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．３Ｕ
試料 １μｌ
【００７９】
核酸増幅および融解曲線解析
実施例２と同じ。
【００８０】
結果
本比較例は実施例２からＤＮＡポリメラーゼをｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに変更して行ったものであり、核酸増幅および融解曲線解析の条件は実施例２と同一である。本比較例の結果は図３で表される。ｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用した本比較例ではＪＡＫ２の検出はできなかった。
【００８１】
〔実施例３：Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＪＡＫ２遺伝子の検出〕
（１）試料の調製
実施例２と同じ。
（２）核酸増幅および融解曲線解析
実施例２と同じ。
【００８２】
試薬
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
核酸プライマー（配列番号３） １５００ｎＭ
核酸プライマー（配列番号４） ３００ｎＭ
核酸プローブ（配列番号１、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識） ３００ｎＭ
×１０ ｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡績社製）1μｌ
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ
ＭｇＣｌ４ １．５ｍＭ
ＤＭＳＯ ０．７５μｌ
ｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．３Ｕ
試料 １μｌ
【００８３】
核酸増幅および融解曲線解析
９４℃・２分
（以上１サイクル）
９４℃・５秒
６０℃・５秒
７２℃・１５秒
（以上５０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃〜７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
【００８４】
結果
本実施は比較例１から試薬組成および核酸増幅条件を変更したものである。ＤＮＡポリメラーゼは比較例１と同じくｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いた。本実施例の結果は図４で表される。図３と図４の比較により試薬組成及び核酸増幅条件を変更することでｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅでも検出ピークが得られることがわかる。従って、本発明の核酸プライマーおよび核酸プローブを用いたＪＡＫ２遺伝子検出はＤＮＡポリメラーゼの種類によって限定されるものではない。しかし一方で、実施例２と実施例３との比較から迅速な検出を行うにはｒＴａｑ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅよりもＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの方がより好ましいことが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明をＪＡＫ２遺伝子検査およびＪＡＫ２遺伝子検査試薬開発に適用することで、迅速、確実かつ簡便な慢性骨髄増殖性疾患関連遺伝子の変異検出を行うことができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＪＡＫ２遺伝子の変異を検出するためのプローブであって、配列番号１または２のいずれかに示す塩基配列からなるプローブ。
【請求項２】
前記プローブが、標識物質で標識化された標識化プローブである、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
前記標識化プローブが、蛍光色素による標識である、請求項２に記載のプローブ。
【請求項４】
ＪＡＫ２遺伝子の変異を検出する方法であって、以下（１）〜（３）の工程を全て含む方法。
（１）被検核酸と請求項１〜３のいずれかに記載のプローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成させる工程
（２）前記工程（１）のあとに、連続的な温度上昇を行いながら融解曲線分析を行う工程。
（３） 温度変化に伴う融解曲線の変動から、前記被検核酸における前記変異の有無を決定する工程
【請求項５】
工程（１）におけるプローブが、標識物質で標識化された標識化プローブであり、該プローブの標識強度を測定することにより融解曲線分析を行う、請求項４に記載の方法
【請求項６】
前記標識化プローブが、蛍光色素による標識であり、該プローブを標識している蛍光色素の蛍光強度を測定することにより、融解曲線分析を行う、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程（１）における被検核酸が、プライマー対を用いて鋳型核酸から増幅された物である、請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
核酸増幅に、１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有し、かつ、５’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼを用いる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記プライマー対が、下記（Ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーである、請求項７に記載の検出方法。
（Ｆ）塩基配列が配列番号３で示されるオリゴヌクレオチド
（Ｒ）塩基配列が配列番号４で示されるオリゴヌクレオチド
【請求項１０】
核酸増幅法によりＪＡＫ２遺伝子を増幅するためのプライマー対であって、配列番号３、配列番号４のいずれかに示す塩基配列からなる核酸プライマー対。
【請求項１１】
請求項４〜６のいずれかに記載のＪＡＫ２遺伝子の変異を検出する方法に用いるための変異検出キットであって、請求項１に記載のプローブを含む変異検出キット。
【請求項１】
ＪＡＫ２遺伝子の変異を検出するためのプローブであって、配列番号１または２のいずれかに示す塩基配列からなるプローブ。
【請求項２】
前記プローブが、標識物質で標識化された標識化プローブである、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
前記標識化プローブが、蛍光色素による標識である、請求項２に記載のプローブ。
【請求項４】
ＪＡＫ２遺伝子の変異を検出する方法であって、以下（１）〜（３）の工程を全て含む方法。
（１）被検核酸と請求項１〜３のいずれかに記載のプローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成させる工程
（２）前記工程（１）のあとに、連続的な温度上昇を行いながら融解曲線分析を行う工程。
（３） 温度変化に伴う融解曲線の変動から、前記被検核酸における前記変異の有無を決定する工程
【請求項５】
工程（１）におけるプローブが、標識物質で標識化された標識化プローブであり、該プローブの標識強度を測定することにより融解曲線分析を行う、請求項４に記載の方法
【請求項６】
前記標識化プローブが、蛍光色素による標識であり、該プローブを標識している蛍光色素の蛍光強度を測定することにより、融解曲線分析を行う、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程（１）における被検核酸が、プライマー対を用いて鋳型核酸から増幅された物である、請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
核酸増幅に、１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有し、かつ、５’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼを用いる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記プライマー対が、下記（Ｆ）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（Ｒ）のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーである、請求項７に記載の検出方法。
（Ｆ）塩基配列が配列番号３で示されるオリゴヌクレオチド
（Ｒ）塩基配列が配列番号４で示されるオリゴヌクレオチド
【請求項１０】
核酸増幅法によりＪＡＫ２遺伝子を増幅するためのプライマー対であって、配列番号３、配列番号４のいずれかに示す塩基配列からなる核酸プライマー対。
【請求項１１】
請求項４〜６のいずれかに記載のＪＡＫ２遺伝子の変異を検出する方法に用いるための変異検出キットであって、請求項１に記載のプローブを含む変異検出キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１３−１７３９５（Ｐ２０１３−１７３９５Ａ）
【公開日】平成２５年１月３１日（２０１３．１．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１５０７６４（Ｐ２０１１−１５０７６４）
【出願日】平成２３年７月７日（２０１１．７．７）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年１月３１日（２０１３．１．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年７月７日（２０１１．７．７）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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