骨髄由来細胞の培養基材と培養方法及び培養骨髄由来細胞
【課題】培養基材表面と骨髄由来細胞間の接着力を制御し、高い培養（増殖）性と、培養後の低温処理による高い剥離性を有する骨髄由来細胞の培養基材、骨髄由来細胞の培養方法、及び培養骨髄由来細胞を提供する。
【解決手段】
骨髄由来細胞を培養するための細胞培養基材であって、メトキシエチルアクリレート（ａ）の重合体（Ａ）と、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料（Ｃ）とを含有することを特徴とする骨髄由来細胞培養用細胞培養基材により上記課題を解決した。
【解決手段】
骨髄由来細胞を培養するための細胞培養基材であって、メトキシエチルアクリレート（ａ）の重合体（Ａ）と、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料（Ｃ）とを含有することを特徴とする骨髄由来細胞培養用細胞培養基材により上記課題を解決した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨髄由来細胞を培養するための細胞培養基材であって、水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）の重合体（Ａ）と無機材料（Ｃ）とを含有する細胞培養基材、骨髄由来細胞の培養方法、及びそれによって得られる培養骨髄由来細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、動物組織等の細胞培養基材としては、主にプラスチック（例えばポリスチレン）製容器が使用されてきた。これら容器は、細胞培養を有効に行うために、その表面にプラズマ処理や、シリコンや細胞接着因子等のコーティングなどの表面処理が施されている。これら細胞培養容器の培養性が細胞の種類により異なる。例えば骨髄由来間葉系細胞の場合、細胞の増殖が非常に遅く、特に培地中に血清を入れない場合、細胞が殆ど増殖しない。一方、増殖できる細胞例えば線維芽細胞などについては、培養（増殖）した細胞が容器表面に接着しており、細胞を単離・回収するためには、トリプシン等のタンパク質加水分解酵素や化学薬品、物理的操作を用いて、容器表面から剥離する必要があった。このような酵素や化学薬品、物理的操作により細胞を剥離する操作は、細胞と基材の結合部分が切断されるだけではなく、細胞同士の結合も切断されるため、細胞を増殖している形状（例えばシート状）のままで取り出すことができなかったり、細胞の基底タンパクがダメージを受けたりして、予期せぬ細胞の性質変化を引き起こす可能性があった。
【０００３】
近年、細胞培養容器の表面にポリＮ−置換（メタ）アクリルアミドのような下限臨界溶解温度（LCST）を有するポリマーを極薄く被覆した基材を使用して、細胞培養温度ではポリマーが疎水性状態を示し細胞がポリマーに接着し、培養後にポリマーを低温処理して親水性状態にすることにより、細胞とポリマーとの接着性を低下させ、細胞を加水分解酵素や化学薬品を使用せずに基材から細胞をシート状に剥離する技術が報告されている（例えば特許文献１及び２、非特許文献１参照）。
【０００４】
しかし、このような培養基材は放射線（例えばγ線）滅菌処理を行うと、LCSTを有するポリマーの温度応答性が大きく低下してしまい、本来の細胞の剥離しやすさが無くなる問題があった。
【０００５】
一方、（メタ）アクリル酸エステル系モノマー（ａ）を含むモノマーの重合体（Ｐ）と、水膨潤性粘土鉱物（Ｂ）とが三次元網目を形成してなる有機無機複合体粒子（Ｘ）の分散液を乾燥してなる有機無機複合体（Ｘ）の乾燥皮膜を表面に有する細胞培養基材が開示されている（例えば特許文献３参照）。
【０００６】
しかし、上記従来文献においては、骨髄由来細胞の培養及び剥離方法に関する具体的手段は開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特公平６−１０４０６１
【特許文献２】特開平５−１９２１３８
【特許文献３】特許第４４３０１２４
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】大和雅之、岡野光夫「ナノバイオテクノロジーの最前線」第６章、Ｐ．３４０−Ｐ．３４７、シーエムシー出版（２００３年出版）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明が解決しようとする課題は、培養基材表面と骨髄由来細胞間の接着力を制御し、高い培養（増殖）性と、培養後の低温処理による高い剥離性を有する骨髄由来細胞の培養基材、骨髄由来細胞の培養方法、及び培養骨髄由来細胞を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）の重合体（Ａ）と、無機材料（Ｃ）とを含有する細胞培養基材、及び水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）の重合体（Ａ）と、Ｎ−置換（メタ）アクリルアミドの重合体（Ｂ）と、無機材料（Ｃ）とを含有する細胞培養基材の上では、骨髄由来細胞が優れた増殖性を有し、また、上記培養基材を用いた場合、基材表面と細胞間の接着力を低く維持しながら、骨髄由来細胞を培養することができ、更に、培養後低温処理により、骨髄由来細胞を基材表面から容易に剥離できる、骨髄由来細胞の培養方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明は、骨髄由来細胞を培養するための細胞培養基材であって、
水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）の重合体（Ａ）と、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料（Ｃ）とを含有することを特徴とする骨髄由来細胞培養用細胞培養基材を提供する。
【００１２】
また、本発明は、更に、Ｎ−置換（メタ）アクリルアミドの重合体（Ｂ）を含有する上記の骨髄由来細胞培養用細胞培養基材を提供する。
【００１３】
また、本発明は、水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）の重合体（Ａ）と、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料（Ｃ）とを含有する細胞培養基材の上で、骨髄由来細胞を培養し、次いで培養細胞を基材から剥離することを特徴とする骨髄由来細胞の培養方法であって、
前記重合体（Ａ）と、前記無機材料（Ｃ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））が、０．０３〜０．７の範囲にある骨髄由来細胞の培養方法を提供する。
【００１４】
また、本発明は、前記細胞培養基材が、更に、Ｎ−置換（メタ）アクリルアミドの重合体（Ｂ）を含有する骨髄由来細胞の培養方法を提供する。
【００１５】
本方法では、前記重合体（Ａ）と重合体（Ｂ）との質量比（（Ｂ）／（Ａ））が、０．０１〜０．７の範囲にあることが好ましい。
【００１６】
また、本発明は、前記培養方法で製造された骨髄由来細胞を提供する。
【００１７】
本発明の細胞培養基材の最大の特徴は、上記無機材料（Ｃ）の構成部分が骨髄由来細胞の増殖を担い、水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）の重合体（Ａ）が細胞に対して低接着性を付与し、更に、Ｎ−置換（メタ）アクリルアミドの重合体（Ｂ）は温度変化による骨髄由来細胞の剥離を担うことにある。それぞれの部分を骨髄由来細胞の増殖、剥離の状況に応じてそれぞれ単独に調節できることにある。例えば、培養時（３７℃）、骨髄由来細胞が培養表面との間弱い接着性を維持しながら、高い増殖能で増殖し、培養終了後、温度を３０℃以下に下げることにより（例えば室温）、重合体（B）の部分がより高い親水性を示し、培養表面と細胞間の接着力が更に弱くなり、細胞が容易に剥離することができる。また、水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）の重合体（Ａ）と細胞との間の接着性が十分に弱い場合、重合体（Ｂ）を配合しなくても、培地の低温処理で、両者間の接着性が更に弱くなり、骨髄由来細胞を容易に剥離・回収することができる（実施例１、９を参照）。ここでいう骨髄由来細胞とは、ヒトまたはその他の動物の骨髄由来の細胞および不死化骨髄由来細胞のことをいう。
【００１８】
本発明の細胞培養基材のもう一つの特徴は、培養時動物由来の血清を使用しなくても、骨髄由来細胞に対し、高い増殖性を有し、また、培養後、薬剤（タンパク質分解酵素）を使用することなく、低温処理のみで、培養細胞を容易に基材表面から剥離し、細胞にダメージを与えずに、高い収率で細胞を回収することができることにある。
【００１９】
重合体（Ａ）は主にイオン結合や水素結合などにより無機材料（Ｃ）と相互作用し結合している。この結合力は強く、容易にポリマーと無機材料（Ｃ）を引き離すことはできない。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の骨髄由来細胞の培養方法は、細胞と培養表面の間に弱い接着力を維持しながら、高い増殖能を有し、培養した細胞を、薬剤（トリプシン等）を使用することなく、細胞を容易に培養基材表面から剥離、回収できる特徴を有する。
【００２１】
また、本培養方法に用いられる培養基材は、γ線や電子線などの放射線滅菌が可能である特徴を有する。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
モノマー（ａ）の使用により、骨髄由来細胞の初期接着性を低く維持でき、細胞増殖性と剥離性が良好な細胞培養基材が得られる。また、水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）は、これらの細胞培養基材をポリスチレンなどのプラスチック製基材等の支持体の表面に積層させる場合は、両者間の接着性が強く、製造が簡便にできる特徴も持っている。
【００２３】
水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）としては、実質的に水に溶解し、重合時に水膨潤性粘土鉱物（Ｂ）を微分散しうるものであり、例えばメトキシエチルアクリレート（ＭＥＡ）、エトキシエチルアクリレート、メトキシエチルメタクリレート、エトキシエチルメタクリレートなどが挙げられる。本発明の水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）から得られる重合体は、これら（メタ）アクリル酸エステルから選ばれる単独モノマーの重合体または複数モノマーの共重合体を含む。
【００２４】
また、培養性や物性に影響を及ぼさない程度に、必要に応じてその他の共重合モノマーとして、例えば、スルホン基やカルボキシル基のようなアニオン基を有するアクリル系モノマー、４級アンモニウム基のようなカチオン基を有するアクリル系モノマー、４級アンモニウム基と燐酸基とを持つ両性イオン基を有するアクリル系モノマー、カルボキシル基とアミノ基とをもつアミノ酸残基を有するアクリル系モノマー、糖残基を有するアクリル系モノマー、また、水酸基を有するアクリル系モノマー、更にポリエチレングリコールのような親水性鎖とノニルフェニル基のような疎水基を合わせ持つ両親媒性アクリル系モノマー、Ｎ−置換（メタ）アクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ−ジ置換（メタ）アクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドなどを併用することができる。
【００２５】
Ｎ−置換（メタ）アクリルアミド誘導体として、より具体的には、アルキル基の炭素数が１以上のアルキル（メタ）アクリルアミドであり、Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−エチル−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチル−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピロリディン、Ｎ−アクリロイルピペリディン、Ｎ−アクリロイルモルフォリン、Ｎ−アクリロイルメチルホモピペラジン、Ｎ−アクリロイルメチルピペラジンまたはＮ−メチルメタクリルアミド等が挙げられる。
【００２６】
本発明に用いる無機材料（Ｃ）は、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料である。水膨潤性粘土鉱物としては、層状に剥離可能な水膨潤性粘土鉱物が挙げられ、好ましくは水または水と有機溶剤との混合溶液中で膨潤し均一に分散可能な粘土鉱物、特に好ましくは水中で分子状（単一層）またはそれに近いレベルで均一分散可能な無機粘土鉱物が用いられる。具体的にはナトリウムを層間イオンとして含む水膨潤性ヘクトライト、水膨潤性モンモリライト、水膨潤性サポナイト、水膨潤性合成雲母、等が挙げられる。これらの粘土鉱物を混合して用いても良い。
【００２７】
本発明に用いるシリカ（ＳｉＯ２）としては、コロイダルシリカが挙げられ、好ましくは水溶液中で均一に分散可能で、粒径が１０ｎｍ〜５００ｎｍのコロイダルシリカ、特に好ましくは粒径が１０〜５０ｎｍのコロイダルシリカが用いられる。
【００２８】
本発明の細胞培養基材において、水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）の重合体（Ａ）とＮ−置換（メタ）アクリルアミドの重合体（Ｂ）との質量比（（Ｂ）／（Ａ））が、０．０１〜０．７であることが好ましく、０．０３〜０．５がより好ましく、０．１〜０．３が特に好ましい。質量比（（Ｂ）／（Ａ））がこの範囲であると、骨髄由来細胞に対し良好な培養性と高い剥離性を兼ね備えることができ、好ましい。
【００２９】
また、本発明の細胞培養基材において、重合体（Ａ）と無機材料（Ｃ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））が、０．０３〜０．７であることが好ましく、０．０５〜０．３がより好ましく、０．０７〜０．１が特に好ましい。質量比（（Ｃ）／（Ａ））がこの範囲であると、骨髄由来細胞に対し良好な培養性と高い剥離性を兼ね備えることができ、好ましい。
【００３０】
更に、本発明の細胞培養基材で培養した骨髄由来細胞を、培地温度を３０℃以下に下げ、静置して、細胞を自然に剥離させることもできるし、または培地温度を３０℃以下に下げた後、以下に列挙した方法と併用して、細胞を容易に剥離させることもできる。
（１）培養容器内の培地を軽く揺らして細胞を剥離させる方法。
（２）ピペットで培地を吸ったり出したりするピペッティング操作で剥離させる方法。
（３）ガラス棒、ピペットの先や、ゴムヘラ等を細胞シートと細胞培養基材間に差し込んで、細胞シートを持ち上げるように剥離させる方法、
（４）ストロー状の器材で吸引しながら剥離させる方法等がある。
【００３１】
本発明の培養方法で製造された骨髄由来細胞は、トリプシンなどのタンパク質分解酵素を使用しないため、細胞の基底タンパクがダメージを受けず、生体内の細胞形態により近い状態にあり、細胞活性も高く、移植後の定着性や治癒性が高いと考えられる。
【００３２】
本発明の培養基材の製造方法は、水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）重合体（Ａ）とＮ−置換（メタ）アクリルアミドの重合体（Ｂ）が、無機材料（Ｃ）と相互作用し、有機無機複合体を形成できるものであれば、特に限定されない。例えば、水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）と前記無機材料（Ｃ）および重合開始剤（Ｄ）とを混合した水媒体（Ｅ）を支持体に塗布して、前記水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）を重合させることにより、重合体（Ａ）と前記無機材料（Ｃ）との複合体（Ｘ）の薄層を形成する製造方法が挙げられる。
【００３３】
前記製造方法に用いる水媒体（Ｅ）は、モノマー（ａ）や無機材料（Ｃ）などを含むことができ、重合によって、物性のよい有機無機複合体が得られれば良く、特に限定されない。例えば水、または水と混和性を有する溶剤及び／またはその他の化合物を含む水溶液であってよく、その中には更に、必要に応じて防腐剤や抗菌剤、抗生物質、着色料、香料、酵素、たんぱく質、コラーゲン、糖類、アミノ酸類、ペプチド類、ＤＮＡ類、塩類、水溶性有機溶剤類、界面活性剤、高分子化合物、レベリング剤などを含むことができる。
本発明に用いられる重合開始剤（Ｄ）としては、公知のラジカル重合開始剤を適時選択して用いることができる。好ましくは水溶性または水分散性を有し、系全体に均一に含まれるものが好ましく用いられる。具体的には、重合開始剤として、水溶性の過酸化物、例えばペルオキソ二硫酸カリウムやペルオキソ二硫酸アンモニウム、水溶性のアゾ化合物、例えばＶＡ−０４４、Ｖ−５０、Ｖ−５０１（いずれも和光純薬工業株式会社製）の他、Ｆｅ２＋と過酸化水素との混合物などが例示される。
【００３４】
触媒としては、３級アミン化合物であるＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンなどは好ましく用いられる。但し、触媒は必ずしも用いなくてもよい。重合温度は、重合触媒や開始剤の種類に合わせて例えば０℃〜１００℃が用いられる。重合時間も数十秒〜数十時間の間で行うことが出来る。
【００３５】
一方、光重合開始剤は、酸素阻害の影響を受けにくく、重合速度が速いため、重合開始剤（Ｄ）として好適に用いられる。具体的には、ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルトリクロロアセトフェノンなどのアセトフェノン類、４，４’−ビスジメチルアミノベンゾフェノンなどのベンゾフェノン類、２−メチルチオキサントンなどのケトン類、ベンゾインメチルエーテルなどのベンゾインエーテル類、ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトンなどのα−ヒドロキシケトン類、メチルベンゾイルホルメートなどのフェニルグリオキシレート類、メタロセン類などが挙げられる。
【００３６】
本工程に用いられる光としては、電子線、γ線、Ｘ線、紫外線、可視光などを用いることができるが、中でも装置や取り扱いの簡便さやモノマー（ｂ）の重合と同時に架橋を起こさせない観点から紫外線を用いることが好ましい。照射する紫外線の強度は１０〜５００ｍＷ／ｃｍ２が好ましく、照射時間は一般に０．１秒〜２００秒程度である。通常の加熱によるラジカル重合においては、酸素が重合の阻害因子として働くが、本発明では、必ずしも酸素を遮断した雰囲気で溶液の調製および紫外線照射による重合を行う必要がなく、空気雰囲気でこれらを行うことが可能である。但し、紫外線照射を不活性ガス雰囲気下で行うことによって、更に重合速度を速めることが可能で、望ましい場合がある。
【００３７】
また、本発明の培養基材の第二の製造例としては、水媒体（Ｅ）中の前記無機材料（Ｃ）の濃度が下記式（１）又は式（２）で表される範囲となるように、前記モノマー（ａ）と前記無機材料（Ｃ）と重合開始剤（Ｄ）とを水媒体（Ｅ）に混合した後、前記モノマー（ａ）を重合させることにより重合体（Ａ）と前記無機材料（Ｃ）との複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）を製造する第１工程、
前記分散液（Ｌ）を基材に塗布し、その後乾燥することにより前記複合体（Ｘ）の薄層を形成する第２工程を順次行なうことを特徴とする細胞培養基材の製造方法が挙げられる。
式（１） Ｒａ＜０．１９のとき
無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＜１２．４Ｒａ＋０．０５
式（２） Ｒａ≧０．１９のとき
無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＜０．８７Ｒａ＋２．１７
（式中、無機材料（Ｃ）の濃度（質量％）は、無機材料（Ｃ）の質量を水媒体（Ｅ）と無機材料（Ｃ）の合計質量で除して１００を掛けた数値、Ｒａは無機材料（Ｃ）と重合体（Ａ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））である。）
【００３８】
無機材料（Ｃ）の水媒体に対する濃度（質量％）は式（１）又は式（２）で表される範囲内であると、良好な複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）が得られ、支持体への塗布が容易で、平滑で均一な薄い塗膜が得られ、好ましい。
【００３９】
本発明の製造方法で製造される分散液（Ｌ）は、そのまま使用してもよいし、水洗などによる精製工程を経てから使用してもよい。また該分散液（Ｌ）に更にレベリング剤や界面活性剤、ペプチド、たんぱく質、コラーゲン、アミノ酸類、高分子化合物などを添加して使用してもよい。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲がこれらの実施例にのみ限定されるものではない。
【００４１】
（実施例１） 重合体（A）と無機材料（C）からなる培養機材（重合体（B）を含まない）例。
［水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）、無機材料（Ｃ）、水媒体（Ｅ）を含む反応溶液の調製］
メトキシエチルアクリレート３．２ｇ、無機材料（Ｃ）として水膨潤性粘土鉱物Laponite XLG（Rockwood Additives Ltd.社製）０．２ｇ、水媒体（Ｅ）として水１００ｇ、を均一に混合して反応溶液（１）を調製した。
【００４２】
［重合開始剤（Ｄ）を溶媒（Ｆ）に溶解させた溶液の調整］
溶媒（Ｆ）として、メタノール９．８ｇ、重合開始剤（Ｄ）として１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン「イルガキュアー１８４」（チバガイギー社製）０．２ｇを、均一に混合して溶液（２）を調製した。
【００４３】
［複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）の調製（第１工程）］
上記反応溶液（１）全量に、溶液（２）を２５０μｌ入れ、均一に分散させた後、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１８０秒照射し乳白色の複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ１）を作製した。
【００４４】
この反応系のＲａ＝０．０６、無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＝０．２０（％）＜１２．４Ｒａ＋０．０５＝０．７９
【００４５】
［培養基材（複合体（Ｘ）の薄層）の調製（第２工程）］
直径３５ｍｍのポリスチレン製シャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）に、上記複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ１）を入れ、スピンコーターを用いて３０００回転で該分散液をシャーレの表面に薄く塗布した後、８０℃の熱風乾燥器中で１０分間乾燥させ、次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを４０℃、５時間乾燥させて、細胞培養基材１を得た。
【００４６】
［骨髄由来細胞の培養・回収］
上記得られた細胞培養基材１を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）後、培地DMEM（１０％血清含有）を適量入れ、GFP遺伝子組み換えマウス骨髄から採取した単核球を２．０×１０６個／Dish（３．３８ｃｍ２）播種して、５％二酸化炭素中、３７℃で６日間培養を行った。次いで、ディッシュ中の培地及び浮遊している単核球を除いて、予め冷蔵庫で冷やした冷培地を入れ、１０分間静置した後、ピペットで培地を吸ったり出したりするピペッティング操作を１０回程行ったところ、大部分の骨髄由来細胞が培養基材１の表面から剥離されたことが観察された。自然剥離された骨髄由来細胞を回収し、更にD-PBSと0.25% Trypsin‐EDTAを用いて、ディッシュに残った骨髄由来細胞を剥離回収して、それぞれ回収された細胞の数を計測したところ、低温処理で自然剥離・回収された細胞数は８．６×１０４個で、Trypsin処理で回収された細胞の数は１．８×１０４個であった。下記式（５）により低温処理による細胞の回収率を求めたところ、細胞回収率は約８２％であった。
式（５） 細胞回収率（％）＝｛低温処理で回収した細胞の数／（低温処理で回収した細胞の数＋Trypsin処理で回収した細胞の数）｝×１００
また、上記培養基材１から回収された骨髄由来細胞の総数（１０．４×１０４個）が、未コートシャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）を用いた場合（２．５×１０４個）の約４．２倍であった。
【００４７】
また、上記低温処理による自然剥離及びトリプシン処理で回収された骨髄由来細胞を、それぞれ顕微鏡で細胞形態が正常であることを確認した。
【００４８】
この実施例より、重合体（Ａ）と無機材料（C）からなる培養基材（重合体（B）を含まない）が、通常のティッシュカルチャデイッシュに比べ、細胞培養性が高く、また、培養基材表面と細胞間の接着性が低く、低温処理のみで細胞が容易に剥離できることが理解できる。
【００４９】
（実施例２） 重合体（A）、（B）と無機材料（C）からなる培養基材例。
［Ｎ−置換（メタ）アクリルアミドの重合体（B）の水溶液の調製］
Ｎ―イソプロピルアクリルアミド（株式会社興人製）１．７ｇ、水１０ｇ、溶液（２）１４０μｌ、を混合した後、該溶液を入れるガラス容器の周りを冷却しながら（約１０℃）、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１８０秒照射し、Ｎ-イソプロピルアクリルアミドを重合させた後、更に水を５ｇ添加し、重合体（Ｂ）の水溶液（ＰＮＩＰＡ２）を調製した。DIGITAL VISCOMATE粘度計（MODEL VM-100A、山一電機株式会社製）を用いてこの溶液の粘度を測定して、粘度は３６８ｍＰａ・ｓであった。測定時の溶液温度は２４．２℃であった。
【００５０】
また、Ｓｈｏｄｅｘ ＧＰＣ Ｓｙｓｔｅｍ−２１装置（昭和電工株式会社製）で測定した結果、このポリＮ―イソプロピルアクリルアミドの重量平均分子量Ｍｗは３．４０×１０６であった。測定時の溶媒として１０ｍｍｏｌ／ＬのＬｉＢｒを含有するＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液を使用した。分子量の計算に使用したポリスチレン標準物質としては、ＳＴＡＮＤＡＲＤ ＳＨ−７５とＳＭ−１０５キット（昭和電工株式会社製）を使用した。
【００５１】
［水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）、無機材料（Ｃ）、水媒体（Ｅ）を含む反応溶液の調製］
メトキシエチルアクリレート３．２ｇ、無機材料（Ｃ）として水膨潤性粘土鉱物Laponite XLG（Rockwood Additives Ltd.社製）０．２ｇ、水媒体（Ｅ）として水１００ｇ、を均一に混合して反応溶液（２）を調製した。
【００５２】
［複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）の調製（第１工程）］
上記反応溶液（２）全量に、前記溶液（２）を２５０μｌ入れ、均一に分散させた後、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１８０秒照射し乳白色の複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ２）を作製した。
【００５３】
この反応系のＲａ＝０．０６、無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＝０．２０（％）＜１２．４Ｒａ＋０．０５＝０．７９
【００５４】
［培養基材（複合体（Ｘ）の薄層）の調製（第２工程）］
上記分散液（Ｌ２）全量に、Ｎ―イソプロピルアクリルアミドの重合体（Ｂ）の水溶液（ＰＮＩＰＡ２）を７ｇ添加し、均一に混合した後、直径３５ｍｍのポリスチレン製シャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）に入れ、スピンコーターを用いて３０００回転で該分散液をシャーレの表面に薄く塗布した後、８０℃の熱風乾燥器中で１０分間乾燥させ、次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを４０℃、５時間乾燥させて、細胞培養基材２を得た。
【００５５】
［骨髄由来細胞の培養・回収］
上記得られた細胞培養基材２を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）後、培地DMEM（１０％血清含有）を適量入れ、GFP遺伝子組み換えマウス骨髄から採取した単核球を２．０×１０６個／Dish（３．３８ｃｍ２）播種して、５％二酸化炭素中、３７℃で６日間培養を行った。次いで、ディッシュ中の培地及び浮遊している単核球を除いて、予め冷蔵庫で冷やした冷培地を入れ、１０分間静置した後、ピペットで培地を吸ったり出したりするピペッティング操作を１０回程行ったところ、大部分の骨髄由来細胞が培養基材２の表面から剥離されたことが観察された。自然剥離された骨髄由来細胞を回収し、更にD-PBSと0.25% Trypsin‐EDTAを用いて、ディッシュに残った骨髄由来細胞を剥離回収して、それぞれ回収された細胞の数を計測したところ、低温処理で自然剥離・回収された細胞数１２．０×１０４個で、Trypsin処理で回収された細胞の数は０．７×１０４個であった。下記式（５）により低温処理による細胞の回収率を求めたところ、細胞回収率は９４％であった。
式（５） 細胞回収率（％）＝｛低温処理で回収した細胞の数／（低温処理で回収した細胞の数＋Trypsin処理で回収した細胞の数）｝×１００
また、上記培養基材２から回収された骨髄由来細胞の総数（１２．７×１０４個）が、未コートシャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）（比較例１）を用いた場合（２．５×１０４個）の約５．１倍であった。
【００５６】
また、上記低温処理による自然剥離及びトリプシン処理で回収された骨髄由来細胞を、それぞれ顕微鏡で細胞形態が正常であることを確認した。
【００５７】
この実施例より、重合体（Ａ）と無機材料（C）に更に温度応答性を有する重合体（B）を配合させた場合、良好な培養性を有すると同時に、低温処理による細胞の回収率が更に高くなることが理解できる。
【００５８】
（実施例３）
［水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）、無機材料（Ｃ）、水媒体（Ｅ）を含む反応溶液の調製］
メトキシエチルアクリレート３．２ｇ、無機材料（C）としてコロイダルシリカ２０質量％水溶液（商品名スノーテックス２０、日産化学工業株式会社製）１ｇ（ＳｉＯ２＝０．２ｇ）、水媒体（E）として水１００ｇ、を均一に混合して反応溶液（３）を調製した。
【００５９】
［複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）の調製（第１工程）］
上記反応溶液（３）全量に、前記溶液（２）を２５０μｌ入れ、均一に分散させた後、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１８０秒照射し乳白色の複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ３）を作製した。
【００６０】
この反応系のＲａ＝０．０６、無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＝０．２０（％）＜１２．４Ｒａ＋０．０５＝０．７９
【００６１】
［培養基材（複合体（Ｘ）の薄層）の調製（第２工程）］
上記分散液（Ｌ３）全量に、Ｎ―イソプロピルアクリルアミドの重合体（Ｂ）の水溶液（ＰＮＩＰＡ２）を１ｇ添加し、均一に混合した後、直径３５ｍｍのポリスチレン製シャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）に入れ、スピンコーターを用いて３０００回転で該分散液をシャーレの表面に薄く塗布した後、８０℃の熱風乾燥器中で１０分間乾燥させ、次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを４０℃、５時間乾燥させて、細胞培養基材３を得た。
【００６２】
［骨髄由来細胞の培養・回収］
上記得られた細胞培養基材３を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）後、培地DMEM（１０％血清含有）を適量入れ、GFP遺伝子組み換えマウス骨髄から採取した単核球を２．０×１０６個／Dish（９．８ｃｍ２）播種して、５％二酸化炭素中、３７℃で６日間培養を行った。次いで、ディッシュ中の培地及び浮遊している単核球を除いて、予め冷蔵庫で冷やした冷培地を入れ、１０分間静置した後、ピペットで培地を吸ったり出したりするピペッティング操作を１０回程行ったところ、大部分の骨髄由来細胞が培養基材３の表面から剥離されたことが観察された。自然剥離された骨髄由来細胞を回収し、更にD-PBSと0.25% Trypsin‐EDTAを用いて、ディッシュに残った骨髄由来細胞を剥離回収して、それぞれ回収された細胞の数を計測したところ、低温処理で自然剥離・回収された細胞数６．２×１０４個で、Trypsin処理で回収された細胞の数は１．１×１０４個であった。下記式（５）により低温処理による細胞の回収率を求めたところ、細胞回収率は８５％であった。
式（５） 細胞回収率（％）＝｛低温処理で回収した細胞の数／（低温処理で回収した細胞の数＋Trypsin処理で回収した細胞の数）｝×１００
また、上記培養基材３から回収された骨髄由来細胞の総数（７．３×１０４個）が、未コートシャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）を用いた場合（２.５×１０４個）の約２．９倍であった。
【００６３】
また、上記低温処理による自然剥離及びトリプシン処理で回収された骨髄由来細胞を、それぞれ顕微鏡で細胞形態が正常であることを確認した。
【００６４】
さらに同様に１８日間培養を行った。次いで、ディッシュ中の培地及び浮遊している単核球を除いて、予め冷蔵庫で冷やした冷培地を入れ、１０分間静置した後、ピペットで培地を吸ったり出したりするピペッティング操作を１０回程行ったところ、大部分の骨髄由来細胞が培養基材３の表面から剥離されたことが観察された。自然剥離された骨髄由来細胞を回収し、更にD-PBSと0.25% Trypsin‐EDTAを用いて、ディッシュに残った骨髄由来細胞を剥離回収して、それぞれ回収された細胞の数を計測したところ、低温処理で自然剥離・回収された細胞数７．０×１０５個で、Trypsin処理で回収された細胞の数は１．２×１０４個であった。上記式（５）により低温処理による細胞の回収率を求めたところ、細胞回収率は８５％であった。
【００６５】
また、上記培養基材３から回収された骨髄由来細胞の総数（７．０×１０５個）が、未コートシャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）を用いた場合（２.８×１０４個）の約２５倍であった。
【００６６】
この実施例より、無機材料（C）としてシリカを用いた場合の培養基材３が良好な培養性と自然剥離による高い回収率を有することが理解できる。
【００６７】
（実施例４） 上記培養基材３による無血清培養例
［骨髄由来細胞の培養・回収］
上記得られた細胞培養基材３を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）後、無血清培地として適量のSTEMPRO LIPOMAX SUPPLEMENT（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｊａｐａｎ Ａ１０８５００１）とGLUTAMAX I（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｊａｐａｎ ３５０５００６１）を含有したStemPro MSC SFM XenoFree（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｊａｐａｎ Ａ１０６７５０１）を適量入れ、GFP遺伝子組み換えマウス骨髄から採取した単核球を７．０×１０６個／Dish（9.８ｃｍ２）播種して、５％二酸化炭素中、３７℃で７日間培養を行った。次いで、ディッシュ中の培地及び浮遊している単核球を除いて、予め冷蔵庫で冷やした冷培地を入れ、１０分間静置した後、ピペットで培地を吸ったり出したりするピペッティング操作を１０回程行ったところ、大部分の骨髄由来細胞が培養基材３の表面から剥離されたことが観察された。自然剥離された骨髄由来細胞を回収し、更にD-PBSと0.25% Trypsin‐EDTAを用いて、ディッシュに残った骨髄由来細胞を剥離回収して、それぞれ回収された細胞の数を計測したところ、低温処理で自然剥離・回収された細胞数３．９×１０４個で、Trypsin処理で回収された細胞の数は９×１０３個であった。下記式（５）により低温処理による細胞の回収率を求めたところ、細胞回収率は８１％であった。
式（５） 細胞回収率（％）＝｛低温処理で回収した細胞の数／（低温処理で回収した細胞の数＋Trypsin処理で回収した細胞の数）｝×１００
一方、同様な無血清培地で、未コートシャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）（比較例２）を用いて培養したところ、骨髄由来細胞が殆ど培養されなかった。
【００６８】
また、上記低温処理による自然剥離及びトリプシン処理で回収された骨髄由来細胞を、それぞれ顕微鏡で細胞形態が正常であることを確認した。
【００６９】
この実施例より、培養基材３が、完全無血清系の培養でも、良好な培養性と自然剥離による高い回収率を有することが理解できる。
【００７０】
（実施例５） その他の高分子化合物を配合した例。
［水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）、無機材料（Ｃ）、水媒体（Ｅ）を含む反応溶液の調製］
メトキシエチルアクリレート３．２ｇ、無機材料（Ｃ）として水膨潤性粘土鉱物Laponite XLG（Rockwood Additives Ltd.社製）０．４ｇ、水媒体（Ｅ）として水１００ｇ、を均一に混合して反応溶液（６）を調製した。
【００７１】
［複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）の調製（第１工程）］
上記反応溶液（６）全量に、前記溶液（２）を２５０μｌ入れ、均一に分散させた後、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１８０秒照射し乳白色の複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ６）を作製した。
【００７２】
この反応系のＲａ＝０．１３、無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＝０．４０（％）＜１２．４Ｒａ＋０．０５＝１．６６
【００７３】
［培養基材（複合体（Ｘ）の薄層）の調製（第２工程）］
上記分散液（Ｌ６）全量に、γ-ポリグルタミン酸（日本ポリグル株式会社製）１ｇを添加し、均一に混合した後、直径３５ｍｍのポリスチレン製シャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）に入れ、スピンコーターを用いて３０００回転で該分散液をシャーレの表面に薄く塗布した後、８０℃の熱風乾燥器中で１０分間乾燥させ、次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを４０℃、５時間乾燥させて、細胞培養基材６を得た。
【００７４】
［骨髄由来細胞の培養・回収］
上記得られた細胞培養基材６を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）後、培地DMEM（１０％血清含有）を適量入れ、GFP遺伝子組み換えマウスから採取した単核球細胞を２．０×１０６個／Dish（９．８ｃｍ２）播種して、５％二酸化炭素中、３７℃で７日間培養を行った。次いで、ディッシュ中の培地及び浮遊している単核球を除いて、予め冷蔵庫で冷やした冷培地を入れ、１０分間静置した後、ピペットで培地を吸ったり出したりするピペッティング操作を１０回程行ったところ、大部分の骨髄由来細胞が培養基材６の表面から剥離されたことが観察された。自然剥離された骨髄由来細胞を回収し、更にD-PBSと0.25% Trypsin‐EDTAを用いて、ディッシュに残った骨髄由来細胞を剥離回収して、それぞれ回収された細胞の数を計測したところ、低温処理で自然剥離・回収された細胞数６．４×１０４個で、Trypsin処理で回収された細胞の数は３．２×１０４個であった。下記式（５）により低温処理による細胞の回収率を求めたところ、細胞回収率は６７％であった。
式（５） 細胞回収率（％）＝｛低温処理で回収した細胞の数／（低温処理で回収した細胞の数＋Trypsin処理で回収した細胞の数）｝×１００
また、上記培養基材６から回収された骨髄由来細胞の総数（６．４×１０４個）が、未コートシャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）（比較例１）を用いた場合（２.４×１０４個）の約４倍であった。
【００７５】
また、上記低温処理による自然剥離及びトリプシン処理で回収された骨髄由来細胞を、それぞれ顕微鏡で細胞形態が正常であることを確認した。
【００７６】
（比較例１）
市販の直径３５ｍｍのポリスチレン製シャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）を用いて、実施例１と同様にして、血清含有培地を用いてGFP遺伝子組み換えマウス骨髄から採取した単核球を３７℃で７日間培養して、同様な低温処理による細胞の剥離を行ったが、細胞は殆ど剥離しなかった。更に、D-PBSと0.25% Trypsin‐EDTAを用いて、ディッシュに残った骨髄由来細胞を剥離回収し、細胞数を計測した。細胞の数は２.５×１０４個であった。
【００７７】
この比較例より、通常のポリスチレン製ティッシュカルチャデイッシュでは、骨髄由来細胞に対する培養（増殖）性が低く、培養された細胞もディッシュ表面に強く接着し、薬剤（トリプシン）を使用しない場合、容易に剥離することができないことが理解できる。
【００７８】
（比較例２） 市販のディッシュで、無血清系での培養例
市販の直径３５ｍｍのポリスチレン製シャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）を用いて、無血清培地として適量のSTEMPRO LIPOMAX SUPPLEMENT（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｊａｐａｎ Ａ１０８５００１）とGLUTAMAX I（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｊａｐａｎ ３５０５００６１）を含有したStemPro MSC SFM XenoFree（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｊａｐａｎ Ａ１０６７５０１）を適量入れ、GFP遺伝子組み換えマウスから採取した単核球を７．０×１０６個／Dish（9.８ｃｍ２）播種して、５％二酸化炭素中、３７℃で７日間培養した。次いで、ディッシュ中の培地及び浮遊している単核球細胞を除いて、新しい培地を入れ、顕微鏡で観察したところ、骨髄由来細胞が殆ど見当たらなかった。
【００７９】
この比較例より、通常のポリスチレン製ティッシュカルチャデイッシュを用いて、無血清培地では、骨髄由来細胞はディッシュに接着することが殆どできないため、増殖できないことが理解できる。
【００８０】
（比較例３） 重合体（Ａ）のみの（無機材料（C）を含まない）基材の例
［水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）、水媒体（Ｅ）を含む反応溶液の調製］
メトキシエチルアクリレート３．２ｇ、水媒体（Ｅ）として水１００ｇ、を均一に混合して反応溶液（３’）を調製した。
【００８１】
実施例１と同様にして基材（３’）を製造した。実施例１と同様にして、血清含有培地を用いてGFP遺伝子組み換えマウス骨髄から採取した単核球を播種し、6日間培養したが、基材（３’）の表面に接着する細胞は殆ど見当たらなかった。
【００８２】
この比較例より、無機材料（C）を含まない、重合体（Ａ）のみの基材では、細胞との接着性が低過ぎて、細胞が増殖できないことが理解できる。
【００８３】
（参考例） 無機材料（C）を式（１）、（２）の領域を超えた例
［水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）、無機材料（Ｃ）、水媒体（Ｅ）を含む反応溶液の調製］
メトキシエチルアクリレート１２．８ｇ、無機材料（Ｃ）として水膨潤性粘土鉱物Laponite XLG（Rockwood Additives Ltd.社製）１．６ｇ、水媒体（Ｅ）として水１００ｇ、を均一に混合して反応溶液（４’）を調製した。
【００８４】
［複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）の調製（第１工程）］
上記反応溶液（４’）全量に、前記溶液（２）を２５０μｌ入れ、均一に分散させた後、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１８０秒照射したところ、反応液全体が白色のゲル状物になり、更に多量の水を入れ、攪拌しても、ゲル状物は細かく分散することなく、分散液は得られなかった。
【００８５】
この反応系のＲａ＝０．１２５、無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＝１．６（％）＝１２．４Ｒａ＋０．０５＝１．６
この比較例より、無機材料（C）の使用量が式（１）、（２）の領域を超えると、重合により反応液全体がゲルとなり、他の支持体への塗布はできず、培養基材を製造することができないことが理解できる。
【００８６】
（実施例６）
実施例１と同じ組成の分散液（Ｌ１）を作製し、該分散液（Ｌ１）全量に、実施例２のＮ―イソプロピルアクリルアミドの重合体（Ｂ）の水溶液（ＰＮＩＰＡ２）を１ｇ添加し、均一に混合した後、実施例１と同様にして細胞培養基材７を作製した。
【００８７】
［骨髄由来細胞の培養・回収］
上記得られた細胞培養基材７を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）後、実施例１と同様にしてＧＦＰ遺伝子組み換えマウス骨髄から採取した単核球の培養・回収を行った。その結果、低温処理で自然剥離・回収された細胞数は５．７×１０４個で、トリプシン処理で回収された細胞の数は１．２×１０４個であった。細胞回収率は約８３％であった。
【００８８】
また、上記培養基材７から回収された骨髄由来細胞の総数（６．９×１０４個）が、未コートシャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）を用いた場合（２．５×１０４個）の約２．８倍であった。
【００８９】
（実施例７）
実施例１と同じ組成の分散液（Ｌ１）を作製し、該分散液（Ｌ１）全量に、実施例２のＮ―イソプロピルアクリルアミドの重合体（Ｂ）の水溶液（ＰＮＩＰＡ２）を４ｇ添加し、均一に混合した後、実施例１と同様にして細胞培養基材８を作製した。
【００９０】
［骨髄由来細胞の培養・回収］
上記得られた細胞培養基材８を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）後、実施例１と同様にしてＧＦＰ遺伝子組み換えマウス骨髄から採取した単核球の培養・回収を行った。その結果、低温処理で自然剥離・回収された細胞数は９．７×１０４個で、トリプシン処理で回収された細胞の数は１．６×１０４個であった。細胞回収率は約８６％であった。
【００９１】
また、上記培養基材８から回収された骨髄由来細胞の総数（１１．３×１０４個）が、未コートシャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）を用いた場合（２．５×１０４個）の約４．５倍であった。
【００９２】
また、上記低温処理による自然剥離及びＴｒｙｐｓｉｎ処理で回収された骨髄由来細胞を、それぞれ顕微鏡で細胞形態が正常であることを確認した。
【００９３】
以上の実施例６、７及び１、２より、培養基材の組成成分にＮ―イソプロピルアクリルアミドの重合体（Ｂ）を含有させ、含有量（B／A）を増加させることにより、低温処理による細胞の回収率が大きく増加することが理解できる。
【００９４】
（実施例８） ヒト骨髄単核細胞の培養・回収例
実施例２の細胞培養基材２を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）後、実施例１のＧＦＰ遺伝子組み換えマウス骨髄から採取した単核球の代わりに、ヒト骨髄由来単核細胞ＣＬ２Ｍ−１２５Ａ（ロンザジャパン株式会社）を用いること以外は実施例１と同様にして細胞の培養・回収を行った。その結果、低温処理で自然剥離・回収された細胞数は２２．３×１０４個で、トリプシン処理で回収された細胞の数は０個であった（細胞が全て自然剥離した）。細胞回収率は約１００％であった。
【００９５】
また、上記培養基材２から回収された骨髄由来細胞の総数（２２．３×１０４個）が、未コートシャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）を用いた場合（８．３３×１０４個）の約２．７倍であった。
【００９６】
以上の実施例より、感受性の高いヒト由来の骨髄単核細胞に対しても、良好な培養性と高い細胞回収率を示すことが理解できる。
【００９７】
また、実施例２の細胞培養基材２を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）後、ヒト骨髄由来単核細胞ＣＬ２Ｍ−１２５Ａ（ロンザジャパン株式会社）を用いること以外は実施例１と同様にして細胞の培養・回収を行った。回収した細胞表面抗原をフローサイトメーター（ガリオス、ベックマン・コールター株式会社）で解析したところ、ＣＤ７３陽性細胞は９９．２％、ＣＤ１０５陽性細胞は９４．４％であり、ＣＤ４５陽性細胞は０．１％であった。
【００９８】
また、実施例２の細胞培養基材２を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）後、ロンザジャパン株式会社ヒト骨髄由来単核細胞ＣＬ２Ｍ−１２５Ａを用いること以外は実施例１と同様にして細胞の培養を行った。Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ・Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，Ｈｕｍａｎ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＳＣ００６）を用いて培養細胞の骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞への分化能を評価した。骨細胞への誘導培地で培養した細胞は、アリザリンレッド染色で陽性であった。脂肪細胞への誘導培地で培養した細胞は、オイルレッドオー染色で陽性であった。軟骨細胞への誘導培地で培養した細胞は、抗アグリカン抗体を用いた免疫染色で陽性であった。
【００９９】
以上の実施例より、ヒト骨髄由来単核細胞を実施例２の細胞培養基材２で培養することで間葉系幹細胞を含む細胞を効率よく培養することができると理解できる。
【０１００】
（実施例９）重合体（A）と無機材料（C）からなる培養基材（重合体（B）を含まない）
実施例３と同じ組成の分散液（Ｌ３）を作製し、また実施例１と同様にして細胞培養基材９を作製した。
【０１０１】
［骨髄由来細胞の培養・回収］
上記得られた細胞培養基材９を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）後、実施例１と同様にしてＧＦＰ遺伝子組み換えマウス骨髄から採取した単核球の培養・回収を行った。その結果、低温処理で自然剥離・回収された細胞数は２．０×１０４個で、トリプシン処理で回収された細胞の数は１．４×１０４個であった。細胞回収率は約５９％であった。
【０１０２】
また、上記培養基材９から回収された骨髄由来細胞の総数（３．４×１０４個）が、未コートシャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）を用いた場合（０．６×１０４個）の約５．７倍であった。
【０１０３】
また、上記低温処理による自然剥離及びトリプシン処理で回収された骨髄由来細胞を、それぞれ顕微鏡で細胞形態が正常であることを確認した。
【０１０４】
（比較例５） Ｂ／Ａ＞０．７の例
実施例３と同じ組成の分散液（Ｌ３）を作製し、該分散液（Ｌ３）全量に、実施例２のＮ―イソプロピルアクリルアミドの重合体（Ｂ）の水溶液（ＰＮＩＰＡ２）を２５ｇ添加し（B／A＝０．７８）、均一に混合した後、実施例３と同様にして基材５’を作製した。
【０１０５】
［骨髄由来細胞の培養・回収］
上記得られた基材５’を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）後、実施例１と同様にしてGFP遺伝子組み換えマウス骨髄から採取した単核球の培養・回収を行った。６日間培養したが、基材５’の表面に接着する細胞は殆ど見当たらなかった。
【０１０６】
この比較例より、重合体（Ｂ）の含有量（Ｂ／Ａ）が０．７を超えると、基材表面が細胞増殖に適さなくなることが理解できる。
【０１０７】
（比較例６） Ｃ／Ａ＜０．０３の例
［水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）、無機材料（Ｃ）、水媒体（Ｅ）を含む反応溶液の調製］
メトキシエチルアクリレート３．２ｇ、無機材料（C）としてコロイダルシリカ２０質量％水溶液（商品名スノーテックス２０、日産化学工業株式会社製）０．４ｇ（ＳｉＯ２＝０．０８ｇ）、水媒体（E）として水１００ｇ、を均一に混合して反応溶液（６’）を調製した。
【０１０８】
この反応系のＲａ＝０．０２５、無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＝０．０８（％）＜１２．４Ｒａ＋０．０５＝０．３６
実施例１と同様にして基材６’を作製した。該基材のＣ／Ａは０．０２５であった。
【０１０９】
［骨髄由来細胞の培養・回収］
上記得られた基材６’を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）後、実施例１と同様にして、血清含有培地を用いてＧＦＰ遺伝子組み換えマウス骨髄から採取した単核球を播種し、６日間培養したが、基材（６’）の表面に接着する細胞は殆ど見当たらなかった。
【０１１０】
（比較例７）
無機材料（Ｃ）としての水膨潤性粘土鉱物Ｌａｐｏｎｉｔｅ ＸＬＧの使用量を０．２から２．４ｇに変更したこと以外は、実施例１と同様にして淡い乳白色の複合体（Ｘ）の反応溶液（７’）を調整した。
【０１１１】
この反応系のＲａ＝０．７５、無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＝２．３４（％）＜０．８７Ｒａ＋２．１７＝２．８２
また、反応溶液（７’）を用いて、実施例１と同様にして細胞培養基材７’を得た。
【０１１２】
［骨髄由来細胞の培養・回収］
上記得られた細胞培養基材７’を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）後、培養日数を７日間から１４日間に変更したこと以外は、実施例１と同様にしてＧＦＰ遺伝子組み換えマウス骨髄から採取した単核球の培養・回収を行った。その結果、低温処理で自然剥離・回収された細胞数は０個で、トリプシン処理で回収された細胞の数は２．６×１０４個であった。細胞回収率は約０％であった。
【０１１３】
また、上記培養基材７’から回収された骨髄由来細胞の総数（２．６×１０４個）が、未コートシャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）を用いて１４日間培養した場合（０．５×１０４個）の約５．２倍であった。
【０１１４】
また、上記低温処理による自然剥離及びトリプシン処理で回収された骨髄由来細胞を、それぞれ顕微鏡で細胞形態が正常であることを確認した。
【０１１５】
これらの比較例より、無機材料（Ｃ）の含有量（Ｃ／Ａ）が少なすぎる（＜０．０３）と、細胞との接着性が低すぎて、細胞が増殖できないことが理解できる。
【０１１６】
同様に、Ｃ／Ａが０．０３〜０．７の範囲でも、Ｂ／Ａ＞０．７の場合は、培養できないケースが生じることが理解できる。
【０１１７】
【表１】
【０１１８】
注）TCPS:未コートシャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）
【０１１９】
【表２】
【０１２０】
注）TCPS:未コートシャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨髄由来細胞を培養するための細胞培養基材であって、水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）の重合体（Ａ）と無機材料（Ｃ）とを含有する細胞培養基材、骨髄由来細胞の培養方法、及びそれによって得られる培養骨髄由来細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、動物組織等の細胞培養基材としては、主にプラスチック（例えばポリスチレン）製容器が使用されてきた。これら容器は、細胞培養を有効に行うために、その表面にプラズマ処理や、シリコンや細胞接着因子等のコーティングなどの表面処理が施されている。これら細胞培養容器の培養性が細胞の種類により異なる。例えば骨髄由来間葉系細胞の場合、細胞の増殖が非常に遅く、特に培地中に血清を入れない場合、細胞が殆ど増殖しない。一方、増殖できる細胞例えば線維芽細胞などについては、培養（増殖）した細胞が容器表面に接着しており、細胞を単離・回収するためには、トリプシン等のタンパク質加水分解酵素や化学薬品、物理的操作を用いて、容器表面から剥離する必要があった。このような酵素や化学薬品、物理的操作により細胞を剥離する操作は、細胞と基材の結合部分が切断されるだけではなく、細胞同士の結合も切断されるため、細胞を増殖している形状（例えばシート状）のままで取り出すことができなかったり、細胞の基底タンパクがダメージを受けたりして、予期せぬ細胞の性質変化を引き起こす可能性があった。
【０００３】
近年、細胞培養容器の表面にポリＮ−置換（メタ）アクリルアミドのような下限臨界溶解温度（LCST）を有するポリマーを極薄く被覆した基材を使用して、細胞培養温度ではポリマーが疎水性状態を示し細胞がポリマーに接着し、培養後にポリマーを低温処理して親水性状態にすることにより、細胞とポリマーとの接着性を低下させ、細胞を加水分解酵素や化学薬品を使用せずに基材から細胞をシート状に剥離する技術が報告されている（例えば特許文献１及び２、非特許文献１参照）。
【０００４】
しかし、このような培養基材は放射線（例えばγ線）滅菌処理を行うと、LCSTを有するポリマーの温度応答性が大きく低下してしまい、本来の細胞の剥離しやすさが無くなる問題があった。
【０００５】
一方、（メタ）アクリル酸エステル系モノマー（ａ）を含むモノマーの重合体（Ｐ）と、水膨潤性粘土鉱物（Ｂ）とが三次元網目を形成してなる有機無機複合体粒子（Ｘ）の分散液を乾燥してなる有機無機複合体（Ｘ）の乾燥皮膜を表面に有する細胞培養基材が開示されている（例えば特許文献３参照）。
【０００６】
しかし、上記従来文献においては、骨髄由来細胞の培養及び剥離方法に関する具体的手段は開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特公平６−１０４０６１
【特許文献２】特開平５−１９２１３８
【特許文献３】特許第４４３０１２４
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】大和雅之、岡野光夫「ナノバイオテクノロジーの最前線」第６章、Ｐ．３４０−Ｐ．３４７、シーエムシー出版（２００３年出版）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明が解決しようとする課題は、培養基材表面と骨髄由来細胞間の接着力を制御し、高い培養（増殖）性と、培養後の低温処理による高い剥離性を有する骨髄由来細胞の培養基材、骨髄由来細胞の培養方法、及び培養骨髄由来細胞を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）の重合体（Ａ）と、無機材料（Ｃ）とを含有する細胞培養基材、及び水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）の重合体（Ａ）と、Ｎ−置換（メタ）アクリルアミドの重合体（Ｂ）と、無機材料（Ｃ）とを含有する細胞培養基材の上では、骨髄由来細胞が優れた増殖性を有し、また、上記培養基材を用いた場合、基材表面と細胞間の接着力を低く維持しながら、骨髄由来細胞を培養することができ、更に、培養後低温処理により、骨髄由来細胞を基材表面から容易に剥離できる、骨髄由来細胞の培養方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明は、骨髄由来細胞を培養するための細胞培養基材であって、
水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）の重合体（Ａ）と、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料（Ｃ）とを含有することを特徴とする骨髄由来細胞培養用細胞培養基材を提供する。
【００１２】
また、本発明は、更に、Ｎ−置換（メタ）アクリルアミドの重合体（Ｂ）を含有する上記の骨髄由来細胞培養用細胞培養基材を提供する。
【００１３】
また、本発明は、水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）の重合体（Ａ）と、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料（Ｃ）とを含有する細胞培養基材の上で、骨髄由来細胞を培養し、次いで培養細胞を基材から剥離することを特徴とする骨髄由来細胞の培養方法であって、
前記重合体（Ａ）と、前記無機材料（Ｃ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））が、０．０３〜０．７の範囲にある骨髄由来細胞の培養方法を提供する。
【００１４】
また、本発明は、前記細胞培養基材が、更に、Ｎ−置換（メタ）アクリルアミドの重合体（Ｂ）を含有する骨髄由来細胞の培養方法を提供する。
【００１５】
本方法では、前記重合体（Ａ）と重合体（Ｂ）との質量比（（Ｂ）／（Ａ））が、０．０１〜０．７の範囲にあることが好ましい。
【００１６】
また、本発明は、前記培養方法で製造された骨髄由来細胞を提供する。
【００１７】
本発明の細胞培養基材の最大の特徴は、上記無機材料（Ｃ）の構成部分が骨髄由来細胞の増殖を担い、水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）の重合体（Ａ）が細胞に対して低接着性を付与し、更に、Ｎ−置換（メタ）アクリルアミドの重合体（Ｂ）は温度変化による骨髄由来細胞の剥離を担うことにある。それぞれの部分を骨髄由来細胞の増殖、剥離の状況に応じてそれぞれ単独に調節できることにある。例えば、培養時（３７℃）、骨髄由来細胞が培養表面との間弱い接着性を維持しながら、高い増殖能で増殖し、培養終了後、温度を３０℃以下に下げることにより（例えば室温）、重合体（B）の部分がより高い親水性を示し、培養表面と細胞間の接着力が更に弱くなり、細胞が容易に剥離することができる。また、水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）の重合体（Ａ）と細胞との間の接着性が十分に弱い場合、重合体（Ｂ）を配合しなくても、培地の低温処理で、両者間の接着性が更に弱くなり、骨髄由来細胞を容易に剥離・回収することができる（実施例１、９を参照）。ここでいう骨髄由来細胞とは、ヒトまたはその他の動物の骨髄由来の細胞および不死化骨髄由来細胞のことをいう。
【００１８】
本発明の細胞培養基材のもう一つの特徴は、培養時動物由来の血清を使用しなくても、骨髄由来細胞に対し、高い増殖性を有し、また、培養後、薬剤（タンパク質分解酵素）を使用することなく、低温処理のみで、培養細胞を容易に基材表面から剥離し、細胞にダメージを与えずに、高い収率で細胞を回収することができることにある。
【００１９】
重合体（Ａ）は主にイオン結合や水素結合などにより無機材料（Ｃ）と相互作用し結合している。この結合力は強く、容易にポリマーと無機材料（Ｃ）を引き離すことはできない。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の骨髄由来細胞の培養方法は、細胞と培養表面の間に弱い接着力を維持しながら、高い増殖能を有し、培養した細胞を、薬剤（トリプシン等）を使用することなく、細胞を容易に培養基材表面から剥離、回収できる特徴を有する。
【００２１】
また、本培養方法に用いられる培養基材は、γ線や電子線などの放射線滅菌が可能である特徴を有する。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
モノマー（ａ）の使用により、骨髄由来細胞の初期接着性を低く維持でき、細胞増殖性と剥離性が良好な細胞培養基材が得られる。また、水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）は、これらの細胞培養基材をポリスチレンなどのプラスチック製基材等の支持体の表面に積層させる場合は、両者間の接着性が強く、製造が簡便にできる特徴も持っている。
【００２３】
水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）としては、実質的に水に溶解し、重合時に水膨潤性粘土鉱物（Ｂ）を微分散しうるものであり、例えばメトキシエチルアクリレート（ＭＥＡ）、エトキシエチルアクリレート、メトキシエチルメタクリレート、エトキシエチルメタクリレートなどが挙げられる。本発明の水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）から得られる重合体は、これら（メタ）アクリル酸エステルから選ばれる単独モノマーの重合体または複数モノマーの共重合体を含む。
【００２４】
また、培養性や物性に影響を及ぼさない程度に、必要に応じてその他の共重合モノマーとして、例えば、スルホン基やカルボキシル基のようなアニオン基を有するアクリル系モノマー、４級アンモニウム基のようなカチオン基を有するアクリル系モノマー、４級アンモニウム基と燐酸基とを持つ両性イオン基を有するアクリル系モノマー、カルボキシル基とアミノ基とをもつアミノ酸残基を有するアクリル系モノマー、糖残基を有するアクリル系モノマー、また、水酸基を有するアクリル系モノマー、更にポリエチレングリコールのような親水性鎖とノニルフェニル基のような疎水基を合わせ持つ両親媒性アクリル系モノマー、Ｎ−置換（メタ）アクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ−ジ置換（メタ）アクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドなどを併用することができる。
【００２５】
Ｎ−置換（メタ）アクリルアミド誘導体として、より具体的には、アルキル基の炭素数が１以上のアルキル（メタ）アクリルアミドであり、Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−エチル−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチル−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピロリディン、Ｎ−アクリロイルピペリディン、Ｎ−アクリロイルモルフォリン、Ｎ−アクリロイルメチルホモピペラジン、Ｎ−アクリロイルメチルピペラジンまたはＮ−メチルメタクリルアミド等が挙げられる。
【００２６】
本発明に用いる無機材料（Ｃ）は、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料である。水膨潤性粘土鉱物としては、層状に剥離可能な水膨潤性粘土鉱物が挙げられ、好ましくは水または水と有機溶剤との混合溶液中で膨潤し均一に分散可能な粘土鉱物、特に好ましくは水中で分子状（単一層）またはそれに近いレベルで均一分散可能な無機粘土鉱物が用いられる。具体的にはナトリウムを層間イオンとして含む水膨潤性ヘクトライト、水膨潤性モンモリライト、水膨潤性サポナイト、水膨潤性合成雲母、等が挙げられる。これらの粘土鉱物を混合して用いても良い。
【００２７】
本発明に用いるシリカ（ＳｉＯ２）としては、コロイダルシリカが挙げられ、好ましくは水溶液中で均一に分散可能で、粒径が１０ｎｍ〜５００ｎｍのコロイダルシリカ、特に好ましくは粒径が１０〜５０ｎｍのコロイダルシリカが用いられる。
【００２８】
本発明の細胞培養基材において、水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）の重合体（Ａ）とＮ−置換（メタ）アクリルアミドの重合体（Ｂ）との質量比（（Ｂ）／（Ａ））が、０．０１〜０．７であることが好ましく、０．０３〜０．５がより好ましく、０．１〜０．３が特に好ましい。質量比（（Ｂ）／（Ａ））がこの範囲であると、骨髄由来細胞に対し良好な培養性と高い剥離性を兼ね備えることができ、好ましい。
【００２９】
また、本発明の細胞培養基材において、重合体（Ａ）と無機材料（Ｃ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））が、０．０３〜０．７であることが好ましく、０．０５〜０．３がより好ましく、０．０７〜０．１が特に好ましい。質量比（（Ｃ）／（Ａ））がこの範囲であると、骨髄由来細胞に対し良好な培養性と高い剥離性を兼ね備えることができ、好ましい。
【００３０】
更に、本発明の細胞培養基材で培養した骨髄由来細胞を、培地温度を３０℃以下に下げ、静置して、細胞を自然に剥離させることもできるし、または培地温度を３０℃以下に下げた後、以下に列挙した方法と併用して、細胞を容易に剥離させることもできる。
（１）培養容器内の培地を軽く揺らして細胞を剥離させる方法。
（２）ピペットで培地を吸ったり出したりするピペッティング操作で剥離させる方法。
（３）ガラス棒、ピペットの先や、ゴムヘラ等を細胞シートと細胞培養基材間に差し込んで、細胞シートを持ち上げるように剥離させる方法、
（４）ストロー状の器材で吸引しながら剥離させる方法等がある。
【００３１】
本発明の培養方法で製造された骨髄由来細胞は、トリプシンなどのタンパク質分解酵素を使用しないため、細胞の基底タンパクがダメージを受けず、生体内の細胞形態により近い状態にあり、細胞活性も高く、移植後の定着性や治癒性が高いと考えられる。
【００３２】
本発明の培養基材の製造方法は、水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）重合体（Ａ）とＮ−置換（メタ）アクリルアミドの重合体（Ｂ）が、無機材料（Ｃ）と相互作用し、有機無機複合体を形成できるものであれば、特に限定されない。例えば、水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）と前記無機材料（Ｃ）および重合開始剤（Ｄ）とを混合した水媒体（Ｅ）を支持体に塗布して、前記水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）を重合させることにより、重合体（Ａ）と前記無機材料（Ｃ）との複合体（Ｘ）の薄層を形成する製造方法が挙げられる。
【００３３】
前記製造方法に用いる水媒体（Ｅ）は、モノマー（ａ）や無機材料（Ｃ）などを含むことができ、重合によって、物性のよい有機無機複合体が得られれば良く、特に限定されない。例えば水、または水と混和性を有する溶剤及び／またはその他の化合物を含む水溶液であってよく、その中には更に、必要に応じて防腐剤や抗菌剤、抗生物質、着色料、香料、酵素、たんぱく質、コラーゲン、糖類、アミノ酸類、ペプチド類、ＤＮＡ類、塩類、水溶性有機溶剤類、界面活性剤、高分子化合物、レベリング剤などを含むことができる。
本発明に用いられる重合開始剤（Ｄ）としては、公知のラジカル重合開始剤を適時選択して用いることができる。好ましくは水溶性または水分散性を有し、系全体に均一に含まれるものが好ましく用いられる。具体的には、重合開始剤として、水溶性の過酸化物、例えばペルオキソ二硫酸カリウムやペルオキソ二硫酸アンモニウム、水溶性のアゾ化合物、例えばＶＡ−０４４、Ｖ−５０、Ｖ−５０１（いずれも和光純薬工業株式会社製）の他、Ｆｅ２＋と過酸化水素との混合物などが例示される。
【００３４】
触媒としては、３級アミン化合物であるＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンなどは好ましく用いられる。但し、触媒は必ずしも用いなくてもよい。重合温度は、重合触媒や開始剤の種類に合わせて例えば０℃〜１００℃が用いられる。重合時間も数十秒〜数十時間の間で行うことが出来る。
【００３５】
一方、光重合開始剤は、酸素阻害の影響を受けにくく、重合速度が速いため、重合開始剤（Ｄ）として好適に用いられる。具体的には、ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルトリクロロアセトフェノンなどのアセトフェノン類、４，４’−ビスジメチルアミノベンゾフェノンなどのベンゾフェノン類、２−メチルチオキサントンなどのケトン類、ベンゾインメチルエーテルなどのベンゾインエーテル類、ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトンなどのα−ヒドロキシケトン類、メチルベンゾイルホルメートなどのフェニルグリオキシレート類、メタロセン類などが挙げられる。
【００３６】
本工程に用いられる光としては、電子線、γ線、Ｘ線、紫外線、可視光などを用いることができるが、中でも装置や取り扱いの簡便さやモノマー（ｂ）の重合と同時に架橋を起こさせない観点から紫外線を用いることが好ましい。照射する紫外線の強度は１０〜５００ｍＷ／ｃｍ２が好ましく、照射時間は一般に０．１秒〜２００秒程度である。通常の加熱によるラジカル重合においては、酸素が重合の阻害因子として働くが、本発明では、必ずしも酸素を遮断した雰囲気で溶液の調製および紫外線照射による重合を行う必要がなく、空気雰囲気でこれらを行うことが可能である。但し、紫外線照射を不活性ガス雰囲気下で行うことによって、更に重合速度を速めることが可能で、望ましい場合がある。
【００３７】
また、本発明の培養基材の第二の製造例としては、水媒体（Ｅ）中の前記無機材料（Ｃ）の濃度が下記式（１）又は式（２）で表される範囲となるように、前記モノマー（ａ）と前記無機材料（Ｃ）と重合開始剤（Ｄ）とを水媒体（Ｅ）に混合した後、前記モノマー（ａ）を重合させることにより重合体（Ａ）と前記無機材料（Ｃ）との複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）を製造する第１工程、
前記分散液（Ｌ）を基材に塗布し、その後乾燥することにより前記複合体（Ｘ）の薄層を形成する第２工程を順次行なうことを特徴とする細胞培養基材の製造方法が挙げられる。
式（１） Ｒａ＜０．１９のとき
無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＜１２．４Ｒａ＋０．０５
式（２） Ｒａ≧０．１９のとき
無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＜０．８７Ｒａ＋２．１７
（式中、無機材料（Ｃ）の濃度（質量％）は、無機材料（Ｃ）の質量を水媒体（Ｅ）と無機材料（Ｃ）の合計質量で除して１００を掛けた数値、Ｒａは無機材料（Ｃ）と重合体（Ａ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））である。）
【００３８】
無機材料（Ｃ）の水媒体に対する濃度（質量％）は式（１）又は式（２）で表される範囲内であると、良好な複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）が得られ、支持体への塗布が容易で、平滑で均一な薄い塗膜が得られ、好ましい。
【００３９】
本発明の製造方法で製造される分散液（Ｌ）は、そのまま使用してもよいし、水洗などによる精製工程を経てから使用してもよい。また該分散液（Ｌ）に更にレベリング剤や界面活性剤、ペプチド、たんぱく質、コラーゲン、アミノ酸類、高分子化合物などを添加して使用してもよい。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲がこれらの実施例にのみ限定されるものではない。
【００４１】
（実施例１） 重合体（A）と無機材料（C）からなる培養機材（重合体（B）を含まない）例。
［水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）、無機材料（Ｃ）、水媒体（Ｅ）を含む反応溶液の調製］
メトキシエチルアクリレート３．２ｇ、無機材料（Ｃ）として水膨潤性粘土鉱物Laponite XLG（Rockwood Additives Ltd.社製）０．２ｇ、水媒体（Ｅ）として水１００ｇ、を均一に混合して反応溶液（１）を調製した。
【００４２】
［重合開始剤（Ｄ）を溶媒（Ｆ）に溶解させた溶液の調整］
溶媒（Ｆ）として、メタノール９．８ｇ、重合開始剤（Ｄ）として１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン「イルガキュアー１８４」（チバガイギー社製）０．２ｇを、均一に混合して溶液（２）を調製した。
【００４３】
［複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）の調製（第１工程）］
上記反応溶液（１）全量に、溶液（２）を２５０μｌ入れ、均一に分散させた後、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１８０秒照射し乳白色の複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ１）を作製した。
【００４４】
この反応系のＲａ＝０．０６、無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＝０．２０（％）＜１２．４Ｒａ＋０．０５＝０．７９
【００４５】
［培養基材（複合体（Ｘ）の薄層）の調製（第２工程）］
直径３５ｍｍのポリスチレン製シャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）に、上記複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ１）を入れ、スピンコーターを用いて３０００回転で該分散液をシャーレの表面に薄く塗布した後、８０℃の熱風乾燥器中で１０分間乾燥させ、次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを４０℃、５時間乾燥させて、細胞培養基材１を得た。
【００４６】
［骨髄由来細胞の培養・回収］
上記得られた細胞培養基材１を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）後、培地DMEM（１０％血清含有）を適量入れ、GFP遺伝子組み換えマウス骨髄から採取した単核球を２．０×１０６個／Dish（３．３８ｃｍ２）播種して、５％二酸化炭素中、３７℃で６日間培養を行った。次いで、ディッシュ中の培地及び浮遊している単核球を除いて、予め冷蔵庫で冷やした冷培地を入れ、１０分間静置した後、ピペットで培地を吸ったり出したりするピペッティング操作を１０回程行ったところ、大部分の骨髄由来細胞が培養基材１の表面から剥離されたことが観察された。自然剥離された骨髄由来細胞を回収し、更にD-PBSと0.25% Trypsin‐EDTAを用いて、ディッシュに残った骨髄由来細胞を剥離回収して、それぞれ回収された細胞の数を計測したところ、低温処理で自然剥離・回収された細胞数は８．６×１０４個で、Trypsin処理で回収された細胞の数は１．８×１０４個であった。下記式（５）により低温処理による細胞の回収率を求めたところ、細胞回収率は約８２％であった。
式（５） 細胞回収率（％）＝｛低温処理で回収した細胞の数／（低温処理で回収した細胞の数＋Trypsin処理で回収した細胞の数）｝×１００
また、上記培養基材１から回収された骨髄由来細胞の総数（１０．４×１０４個）が、未コートシャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）を用いた場合（２．５×１０４個）の約４．２倍であった。
【００４７】
また、上記低温処理による自然剥離及びトリプシン処理で回収された骨髄由来細胞を、それぞれ顕微鏡で細胞形態が正常であることを確認した。
【００４８】
この実施例より、重合体（Ａ）と無機材料（C）からなる培養基材（重合体（B）を含まない）が、通常のティッシュカルチャデイッシュに比べ、細胞培養性が高く、また、培養基材表面と細胞間の接着性が低く、低温処理のみで細胞が容易に剥離できることが理解できる。
【００４９】
（実施例２） 重合体（A）、（B）と無機材料（C）からなる培養基材例。
［Ｎ−置換（メタ）アクリルアミドの重合体（B）の水溶液の調製］
Ｎ―イソプロピルアクリルアミド（株式会社興人製）１．７ｇ、水１０ｇ、溶液（２）１４０μｌ、を混合した後、該溶液を入れるガラス容器の周りを冷却しながら（約１０℃）、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１８０秒照射し、Ｎ-イソプロピルアクリルアミドを重合させた後、更に水を５ｇ添加し、重合体（Ｂ）の水溶液（ＰＮＩＰＡ２）を調製した。DIGITAL VISCOMATE粘度計（MODEL VM-100A、山一電機株式会社製）を用いてこの溶液の粘度を測定して、粘度は３６８ｍＰａ・ｓであった。測定時の溶液温度は２４．２℃であった。
【００５０】
また、Ｓｈｏｄｅｘ ＧＰＣ Ｓｙｓｔｅｍ−２１装置（昭和電工株式会社製）で測定した結果、このポリＮ―イソプロピルアクリルアミドの重量平均分子量Ｍｗは３．４０×１０６であった。測定時の溶媒として１０ｍｍｏｌ／ＬのＬｉＢｒを含有するＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液を使用した。分子量の計算に使用したポリスチレン標準物質としては、ＳＴＡＮＤＡＲＤ ＳＨ−７５とＳＭ−１０５キット（昭和電工株式会社製）を使用した。
【００５１】
［水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）、無機材料（Ｃ）、水媒体（Ｅ）を含む反応溶液の調製］
メトキシエチルアクリレート３．２ｇ、無機材料（Ｃ）として水膨潤性粘土鉱物Laponite XLG（Rockwood Additives Ltd.社製）０．２ｇ、水媒体（Ｅ）として水１００ｇ、を均一に混合して反応溶液（２）を調製した。
【００５２】
［複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）の調製（第１工程）］
上記反応溶液（２）全量に、前記溶液（２）を２５０μｌ入れ、均一に分散させた後、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１８０秒照射し乳白色の複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ２）を作製した。
【００５３】
この反応系のＲａ＝０．０６、無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＝０．２０（％）＜１２．４Ｒａ＋０．０５＝０．７９
【００５４】
［培養基材（複合体（Ｘ）の薄層）の調製（第２工程）］
上記分散液（Ｌ２）全量に、Ｎ―イソプロピルアクリルアミドの重合体（Ｂ）の水溶液（ＰＮＩＰＡ２）を７ｇ添加し、均一に混合した後、直径３５ｍｍのポリスチレン製シャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）に入れ、スピンコーターを用いて３０００回転で該分散液をシャーレの表面に薄く塗布した後、８０℃の熱風乾燥器中で１０分間乾燥させ、次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを４０℃、５時間乾燥させて、細胞培養基材２を得た。
【００５５】
［骨髄由来細胞の培養・回収］
上記得られた細胞培養基材２を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）後、培地DMEM（１０％血清含有）を適量入れ、GFP遺伝子組み換えマウス骨髄から採取した単核球を２．０×１０６個／Dish（３．３８ｃｍ２）播種して、５％二酸化炭素中、３７℃で６日間培養を行った。次いで、ディッシュ中の培地及び浮遊している単核球を除いて、予め冷蔵庫で冷やした冷培地を入れ、１０分間静置した後、ピペットで培地を吸ったり出したりするピペッティング操作を１０回程行ったところ、大部分の骨髄由来細胞が培養基材２の表面から剥離されたことが観察された。自然剥離された骨髄由来細胞を回収し、更にD-PBSと0.25% Trypsin‐EDTAを用いて、ディッシュに残った骨髄由来細胞を剥離回収して、それぞれ回収された細胞の数を計測したところ、低温処理で自然剥離・回収された細胞数１２．０×１０４個で、Trypsin処理で回収された細胞の数は０．７×１０４個であった。下記式（５）により低温処理による細胞の回収率を求めたところ、細胞回収率は９４％であった。
式（５） 細胞回収率（％）＝｛低温処理で回収した細胞の数／（低温処理で回収した細胞の数＋Trypsin処理で回収した細胞の数）｝×１００
また、上記培養基材２から回収された骨髄由来細胞の総数（１２．７×１０４個）が、未コートシャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）（比較例１）を用いた場合（２．５×１０４個）の約５．１倍であった。
【００５６】
また、上記低温処理による自然剥離及びトリプシン処理で回収された骨髄由来細胞を、それぞれ顕微鏡で細胞形態が正常であることを確認した。
【００５７】
この実施例より、重合体（Ａ）と無機材料（C）に更に温度応答性を有する重合体（B）を配合させた場合、良好な培養性を有すると同時に、低温処理による細胞の回収率が更に高くなることが理解できる。
【００５８】
（実施例３）
［水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）、無機材料（Ｃ）、水媒体（Ｅ）を含む反応溶液の調製］
メトキシエチルアクリレート３．２ｇ、無機材料（C）としてコロイダルシリカ２０質量％水溶液（商品名スノーテックス２０、日産化学工業株式会社製）１ｇ（ＳｉＯ２＝０．２ｇ）、水媒体（E）として水１００ｇ、を均一に混合して反応溶液（３）を調製した。
【００５９】
［複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）の調製（第１工程）］
上記反応溶液（３）全量に、前記溶液（２）を２５０μｌ入れ、均一に分散させた後、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１８０秒照射し乳白色の複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ３）を作製した。
【００６０】
この反応系のＲａ＝０．０６、無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＝０．２０（％）＜１２．４Ｒａ＋０．０５＝０．７９
【００６１】
［培養基材（複合体（Ｘ）の薄層）の調製（第２工程）］
上記分散液（Ｌ３）全量に、Ｎ―イソプロピルアクリルアミドの重合体（Ｂ）の水溶液（ＰＮＩＰＡ２）を１ｇ添加し、均一に混合した後、直径３５ｍｍのポリスチレン製シャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）に入れ、スピンコーターを用いて３０００回転で該分散液をシャーレの表面に薄く塗布した後、８０℃の熱風乾燥器中で１０分間乾燥させ、次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを４０℃、５時間乾燥させて、細胞培養基材３を得た。
【００６２】
［骨髄由来細胞の培養・回収］
上記得られた細胞培養基材３を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）後、培地DMEM（１０％血清含有）を適量入れ、GFP遺伝子組み換えマウス骨髄から採取した単核球を２．０×１０６個／Dish（９．８ｃｍ２）播種して、５％二酸化炭素中、３７℃で６日間培養を行った。次いで、ディッシュ中の培地及び浮遊している単核球を除いて、予め冷蔵庫で冷やした冷培地を入れ、１０分間静置した後、ピペットで培地を吸ったり出したりするピペッティング操作を１０回程行ったところ、大部分の骨髄由来細胞が培養基材３の表面から剥離されたことが観察された。自然剥離された骨髄由来細胞を回収し、更にD-PBSと0.25% Trypsin‐EDTAを用いて、ディッシュに残った骨髄由来細胞を剥離回収して、それぞれ回収された細胞の数を計測したところ、低温処理で自然剥離・回収された細胞数６．２×１０４個で、Trypsin処理で回収された細胞の数は１．１×１０４個であった。下記式（５）により低温処理による細胞の回収率を求めたところ、細胞回収率は８５％であった。
式（５） 細胞回収率（％）＝｛低温処理で回収した細胞の数／（低温処理で回収した細胞の数＋Trypsin処理で回収した細胞の数）｝×１００
また、上記培養基材３から回収された骨髄由来細胞の総数（７．３×１０４個）が、未コートシャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）を用いた場合（２.５×１０４個）の約２．９倍であった。
【００６３】
また、上記低温処理による自然剥離及びトリプシン処理で回収された骨髄由来細胞を、それぞれ顕微鏡で細胞形態が正常であることを確認した。
【００６４】
さらに同様に１８日間培養を行った。次いで、ディッシュ中の培地及び浮遊している単核球を除いて、予め冷蔵庫で冷やした冷培地を入れ、１０分間静置した後、ピペットで培地を吸ったり出したりするピペッティング操作を１０回程行ったところ、大部分の骨髄由来細胞が培養基材３の表面から剥離されたことが観察された。自然剥離された骨髄由来細胞を回収し、更にD-PBSと0.25% Trypsin‐EDTAを用いて、ディッシュに残った骨髄由来細胞を剥離回収して、それぞれ回収された細胞の数を計測したところ、低温処理で自然剥離・回収された細胞数７．０×１０５個で、Trypsin処理で回収された細胞の数は１．２×１０４個であった。上記式（５）により低温処理による細胞の回収率を求めたところ、細胞回収率は８５％であった。
【００６５】
また、上記培養基材３から回収された骨髄由来細胞の総数（７．０×１０５個）が、未コートシャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）を用いた場合（２.８×１０４個）の約２５倍であった。
【００６６】
この実施例より、無機材料（C）としてシリカを用いた場合の培養基材３が良好な培養性と自然剥離による高い回収率を有することが理解できる。
【００６７】
（実施例４） 上記培養基材３による無血清培養例
［骨髄由来細胞の培養・回収］
上記得られた細胞培養基材３を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）後、無血清培地として適量のSTEMPRO LIPOMAX SUPPLEMENT（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｊａｐａｎ Ａ１０８５００１）とGLUTAMAX I（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｊａｐａｎ ３５０５００６１）を含有したStemPro MSC SFM XenoFree（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｊａｐａｎ Ａ１０６７５０１）を適量入れ、GFP遺伝子組み換えマウス骨髄から採取した単核球を７．０×１０６個／Dish（9.８ｃｍ２）播種して、５％二酸化炭素中、３７℃で７日間培養を行った。次いで、ディッシュ中の培地及び浮遊している単核球を除いて、予め冷蔵庫で冷やした冷培地を入れ、１０分間静置した後、ピペットで培地を吸ったり出したりするピペッティング操作を１０回程行ったところ、大部分の骨髄由来細胞が培養基材３の表面から剥離されたことが観察された。自然剥離された骨髄由来細胞を回収し、更にD-PBSと0.25% Trypsin‐EDTAを用いて、ディッシュに残った骨髄由来細胞を剥離回収して、それぞれ回収された細胞の数を計測したところ、低温処理で自然剥離・回収された細胞数３．９×１０４個で、Trypsin処理で回収された細胞の数は９×１０３個であった。下記式（５）により低温処理による細胞の回収率を求めたところ、細胞回収率は８１％であった。
式（５） 細胞回収率（％）＝｛低温処理で回収した細胞の数／（低温処理で回収した細胞の数＋Trypsin処理で回収した細胞の数）｝×１００
一方、同様な無血清培地で、未コートシャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）（比較例２）を用いて培養したところ、骨髄由来細胞が殆ど培養されなかった。
【００６８】
また、上記低温処理による自然剥離及びトリプシン処理で回収された骨髄由来細胞を、それぞれ顕微鏡で細胞形態が正常であることを確認した。
【００６９】
この実施例より、培養基材３が、完全無血清系の培養でも、良好な培養性と自然剥離による高い回収率を有することが理解できる。
【００７０】
（実施例５） その他の高分子化合物を配合した例。
［水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）、無機材料（Ｃ）、水媒体（Ｅ）を含む反応溶液の調製］
メトキシエチルアクリレート３．２ｇ、無機材料（Ｃ）として水膨潤性粘土鉱物Laponite XLG（Rockwood Additives Ltd.社製）０．４ｇ、水媒体（Ｅ）として水１００ｇ、を均一に混合して反応溶液（６）を調製した。
【００７１】
［複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）の調製（第１工程）］
上記反応溶液（６）全量に、前記溶液（２）を２５０μｌ入れ、均一に分散させた後、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１８０秒照射し乳白色の複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ６）を作製した。
【００７２】
この反応系のＲａ＝０．１３、無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＝０．４０（％）＜１２．４Ｒａ＋０．０５＝１．６６
【００７３】
［培養基材（複合体（Ｘ）の薄層）の調製（第２工程）］
上記分散液（Ｌ６）全量に、γ-ポリグルタミン酸（日本ポリグル株式会社製）１ｇを添加し、均一に混合した後、直径３５ｍｍのポリスチレン製シャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）に入れ、スピンコーターを用いて３０００回転で該分散液をシャーレの表面に薄く塗布した後、８０℃の熱風乾燥器中で１０分間乾燥させ、次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを４０℃、５時間乾燥させて、細胞培養基材６を得た。
【００７４】
［骨髄由来細胞の培養・回収］
上記得られた細胞培養基材６を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）後、培地DMEM（１０％血清含有）を適量入れ、GFP遺伝子組み換えマウスから採取した単核球細胞を２．０×１０６個／Dish（９．８ｃｍ２）播種して、５％二酸化炭素中、３７℃で７日間培養を行った。次いで、ディッシュ中の培地及び浮遊している単核球を除いて、予め冷蔵庫で冷やした冷培地を入れ、１０分間静置した後、ピペットで培地を吸ったり出したりするピペッティング操作を１０回程行ったところ、大部分の骨髄由来細胞が培養基材６の表面から剥離されたことが観察された。自然剥離された骨髄由来細胞を回収し、更にD-PBSと0.25% Trypsin‐EDTAを用いて、ディッシュに残った骨髄由来細胞を剥離回収して、それぞれ回収された細胞の数を計測したところ、低温処理で自然剥離・回収された細胞数６．４×１０４個で、Trypsin処理で回収された細胞の数は３．２×１０４個であった。下記式（５）により低温処理による細胞の回収率を求めたところ、細胞回収率は６７％であった。
式（５） 細胞回収率（％）＝｛低温処理で回収した細胞の数／（低温処理で回収した細胞の数＋Trypsin処理で回収した細胞の数）｝×１００
また、上記培養基材６から回収された骨髄由来細胞の総数（６．４×１０４個）が、未コートシャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）（比較例１）を用いた場合（２.４×１０４個）の約４倍であった。
【００７５】
また、上記低温処理による自然剥離及びトリプシン処理で回収された骨髄由来細胞を、それぞれ顕微鏡で細胞形態が正常であることを確認した。
【００７６】
（比較例１）
市販の直径３５ｍｍのポリスチレン製シャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）を用いて、実施例１と同様にして、血清含有培地を用いてGFP遺伝子組み換えマウス骨髄から採取した単核球を３７℃で７日間培養して、同様な低温処理による細胞の剥離を行ったが、細胞は殆ど剥離しなかった。更に、D-PBSと0.25% Trypsin‐EDTAを用いて、ディッシュに残った骨髄由来細胞を剥離回収し、細胞数を計測した。細胞の数は２.５×１０４個であった。
【００７７】
この比較例より、通常のポリスチレン製ティッシュカルチャデイッシュでは、骨髄由来細胞に対する培養（増殖）性が低く、培養された細胞もディッシュ表面に強く接着し、薬剤（トリプシン）を使用しない場合、容易に剥離することができないことが理解できる。
【００７８】
（比較例２） 市販のディッシュで、無血清系での培養例
市販の直径３５ｍｍのポリスチレン製シャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）を用いて、無血清培地として適量のSTEMPRO LIPOMAX SUPPLEMENT（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｊａｐａｎ Ａ１０８５００１）とGLUTAMAX I（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｊａｐａｎ ３５０５００６１）を含有したStemPro MSC SFM XenoFree（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｊａｐａｎ Ａ１０６７５０１）を適量入れ、GFP遺伝子組み換えマウスから採取した単核球を７．０×１０６個／Dish（9.８ｃｍ２）播種して、５％二酸化炭素中、３７℃で７日間培養した。次いで、ディッシュ中の培地及び浮遊している単核球細胞を除いて、新しい培地を入れ、顕微鏡で観察したところ、骨髄由来細胞が殆ど見当たらなかった。
【００７９】
この比較例より、通常のポリスチレン製ティッシュカルチャデイッシュを用いて、無血清培地では、骨髄由来細胞はディッシュに接着することが殆どできないため、増殖できないことが理解できる。
【００８０】
（比較例３） 重合体（Ａ）のみの（無機材料（C）を含まない）基材の例
［水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）、水媒体（Ｅ）を含む反応溶液の調製］
メトキシエチルアクリレート３．２ｇ、水媒体（Ｅ）として水１００ｇ、を均一に混合して反応溶液（３’）を調製した。
【００８１】
実施例１と同様にして基材（３’）を製造した。実施例１と同様にして、血清含有培地を用いてGFP遺伝子組み換えマウス骨髄から採取した単核球を播種し、6日間培養したが、基材（３’）の表面に接着する細胞は殆ど見当たらなかった。
【００８２】
この比較例より、無機材料（C）を含まない、重合体（Ａ）のみの基材では、細胞との接着性が低過ぎて、細胞が増殖できないことが理解できる。
【００８３】
（参考例） 無機材料（C）を式（１）、（２）の領域を超えた例
［水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）、無機材料（Ｃ）、水媒体（Ｅ）を含む反応溶液の調製］
メトキシエチルアクリレート１２．８ｇ、無機材料（Ｃ）として水膨潤性粘土鉱物Laponite XLG（Rockwood Additives Ltd.社製）１．６ｇ、水媒体（Ｅ）として水１００ｇ、を均一に混合して反応溶液（４’）を調製した。
【００８４】
［複合体（Ｘ）の分散液（Ｌ）の調製（第１工程）］
上記反応溶液（４’）全量に、前記溶液（２）を２５０μｌ入れ、均一に分散させた後、３６５ｎｍにおける紫外線強度が４０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を１８０秒照射したところ、反応液全体が白色のゲル状物になり、更に多量の水を入れ、攪拌しても、ゲル状物は細かく分散することなく、分散液は得られなかった。
【００８５】
この反応系のＲａ＝０．１２５、無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＝１．６（％）＝１２．４Ｒａ＋０．０５＝１．６
この比較例より、無機材料（C）の使用量が式（１）、（２）の領域を超えると、重合により反応液全体がゲルとなり、他の支持体への塗布はできず、培養基材を製造することができないことが理解できる。
【００８６】
（実施例６）
実施例１と同じ組成の分散液（Ｌ１）を作製し、該分散液（Ｌ１）全量に、実施例２のＮ―イソプロピルアクリルアミドの重合体（Ｂ）の水溶液（ＰＮＩＰＡ２）を１ｇ添加し、均一に混合した後、実施例１と同様にして細胞培養基材７を作製した。
【００８７】
［骨髄由来細胞の培養・回収］
上記得られた細胞培養基材７を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）後、実施例１と同様にしてＧＦＰ遺伝子組み換えマウス骨髄から採取した単核球の培養・回収を行った。その結果、低温処理で自然剥離・回収された細胞数は５．７×１０４個で、トリプシン処理で回収された細胞の数は１．２×１０４個であった。細胞回収率は約８３％であった。
【００８８】
また、上記培養基材７から回収された骨髄由来細胞の総数（６．９×１０４個）が、未コートシャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）を用いた場合（２．５×１０４個）の約２．８倍であった。
【００８９】
（実施例７）
実施例１と同じ組成の分散液（Ｌ１）を作製し、該分散液（Ｌ１）全量に、実施例２のＮ―イソプロピルアクリルアミドの重合体（Ｂ）の水溶液（ＰＮＩＰＡ２）を４ｇ添加し、均一に混合した後、実施例１と同様にして細胞培養基材８を作製した。
【００９０】
［骨髄由来細胞の培養・回収］
上記得られた細胞培養基材８を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）後、実施例１と同様にしてＧＦＰ遺伝子組み換えマウス骨髄から採取した単核球の培養・回収を行った。その結果、低温処理で自然剥離・回収された細胞数は９．７×１０４個で、トリプシン処理で回収された細胞の数は１．６×１０４個であった。細胞回収率は約８６％であった。
【００９１】
また、上記培養基材８から回収された骨髄由来細胞の総数（１１．３×１０４個）が、未コートシャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）を用いた場合（２．５×１０４個）の約４．５倍であった。
【００９２】
また、上記低温処理による自然剥離及びＴｒｙｐｓｉｎ処理で回収された骨髄由来細胞を、それぞれ顕微鏡で細胞形態が正常であることを確認した。
【００９３】
以上の実施例６、７及び１、２より、培養基材の組成成分にＮ―イソプロピルアクリルアミドの重合体（Ｂ）を含有させ、含有量（B／A）を増加させることにより、低温処理による細胞の回収率が大きく増加することが理解できる。
【００９４】
（実施例８） ヒト骨髄単核細胞の培養・回収例
実施例２の細胞培養基材２を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）後、実施例１のＧＦＰ遺伝子組み換えマウス骨髄から採取した単核球の代わりに、ヒト骨髄由来単核細胞ＣＬ２Ｍ−１２５Ａ（ロンザジャパン株式会社）を用いること以外は実施例１と同様にして細胞の培養・回収を行った。その結果、低温処理で自然剥離・回収された細胞数は２２．３×１０４個で、トリプシン処理で回収された細胞の数は０個であった（細胞が全て自然剥離した）。細胞回収率は約１００％であった。
【００９５】
また、上記培養基材２から回収された骨髄由来細胞の総数（２２．３×１０４個）が、未コートシャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）を用いた場合（８．３３×１０４個）の約２．７倍であった。
【００９６】
以上の実施例より、感受性の高いヒト由来の骨髄単核細胞に対しても、良好な培養性と高い細胞回収率を示すことが理解できる。
【００９７】
また、実施例２の細胞培養基材２を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）後、ヒト骨髄由来単核細胞ＣＬ２Ｍ−１２５Ａ（ロンザジャパン株式会社）を用いること以外は実施例１と同様にして細胞の培養・回収を行った。回収した細胞表面抗原をフローサイトメーター（ガリオス、ベックマン・コールター株式会社）で解析したところ、ＣＤ７３陽性細胞は９９．２％、ＣＤ１０５陽性細胞は９４．４％であり、ＣＤ４５陽性細胞は０．１％であった。
【００９８】
また、実施例２の細胞培養基材２を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）後、ロンザジャパン株式会社ヒト骨髄由来単核細胞ＣＬ２Ｍ−１２５Ａを用いること以外は実施例１と同様にして細胞の培養を行った。Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ・Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，Ｈｕｍａｎ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＳＣ００６）を用いて培養細胞の骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞への分化能を評価した。骨細胞への誘導培地で培養した細胞は、アリザリンレッド染色で陽性であった。脂肪細胞への誘導培地で培養した細胞は、オイルレッドオー染色で陽性であった。軟骨細胞への誘導培地で培養した細胞は、抗アグリカン抗体を用いた免疫染色で陽性であった。
【００９９】
以上の実施例より、ヒト骨髄由来単核細胞を実施例２の細胞培養基材２で培養することで間葉系幹細胞を含む細胞を効率よく培養することができると理解できる。
【０１００】
（実施例９）重合体（A）と無機材料（C）からなる培養基材（重合体（B）を含まない）
実施例３と同じ組成の分散液（Ｌ３）を作製し、また実施例１と同様にして細胞培養基材９を作製した。
【０１０１】
［骨髄由来細胞の培養・回収］
上記得られた細胞培養基材９を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）後、実施例１と同様にしてＧＦＰ遺伝子組み換えマウス骨髄から採取した単核球の培養・回収を行った。その結果、低温処理で自然剥離・回収された細胞数は２．０×１０４個で、トリプシン処理で回収された細胞の数は１．４×１０４個であった。細胞回収率は約５９％であった。
【０１０２】
また、上記培養基材９から回収された骨髄由来細胞の総数（３．４×１０４個）が、未コートシャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）を用いた場合（０．６×１０４個）の約５．７倍であった。
【０１０３】
また、上記低温処理による自然剥離及びトリプシン処理で回収された骨髄由来細胞を、それぞれ顕微鏡で細胞形態が正常であることを確認した。
【０１０４】
（比較例５） Ｂ／Ａ＞０．７の例
実施例３と同じ組成の分散液（Ｌ３）を作製し、該分散液（Ｌ３）全量に、実施例２のＮ―イソプロピルアクリルアミドの重合体（Ｂ）の水溶液（ＰＮＩＰＡ２）を２５ｇ添加し（B／A＝０．７８）、均一に混合した後、実施例３と同様にして基材５’を作製した。
【０１０５】
［骨髄由来細胞の培養・回収］
上記得られた基材５’を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）後、実施例１と同様にしてGFP遺伝子組み換えマウス骨髄から採取した単核球の培養・回収を行った。６日間培養したが、基材５’の表面に接着する細胞は殆ど見当たらなかった。
【０１０６】
この比較例より、重合体（Ｂ）の含有量（Ｂ／Ａ）が０．７を超えると、基材表面が細胞増殖に適さなくなることが理解できる。
【０１０７】
（比較例６） Ｃ／Ａ＜０．０３の例
［水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）、無機材料（Ｃ）、水媒体（Ｅ）を含む反応溶液の調製］
メトキシエチルアクリレート３．２ｇ、無機材料（C）としてコロイダルシリカ２０質量％水溶液（商品名スノーテックス２０、日産化学工業株式会社製）０．４ｇ（ＳｉＯ２＝０．０８ｇ）、水媒体（E）として水１００ｇ、を均一に混合して反応溶液（６’）を調製した。
【０１０８】
この反応系のＲａ＝０．０２５、無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＝０．０８（％）＜１２．４Ｒａ＋０．０５＝０．３６
実施例１と同様にして基材６’を作製した。該基材のＣ／Ａは０．０２５であった。
【０１０９】
［骨髄由来細胞の培養・回収］
上記得られた基材６’を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）後、実施例１と同様にして、血清含有培地を用いてＧＦＰ遺伝子組み換えマウス骨髄から採取した単核球を播種し、６日間培養したが、基材（６’）の表面に接着する細胞は殆ど見当たらなかった。
【０１１０】
（比較例７）
無機材料（Ｃ）としての水膨潤性粘土鉱物Ｌａｐｏｎｉｔｅ ＸＬＧの使用量を０．２から２．４ｇに変更したこと以外は、実施例１と同様にして淡い乳白色の複合体（Ｘ）の反応溶液（７’）を調整した。
【０１１１】
この反応系のＲａ＝０．７５、無機材料（Ｃ）の濃度（質量%）＝２．３４（％）＜０．８７Ｒａ＋２．１７＝２．８２
また、反応溶液（７’）を用いて、実施例１と同様にして細胞培養基材７’を得た。
【０１１２】
［骨髄由来細胞の培養・回収］
上記得られた細胞培養基材７’を照射線量１０ｋＧｙの電子線で滅菌した（日本照射サービス株式会社）後、培養日数を７日間から１４日間に変更したこと以外は、実施例１と同様にしてＧＦＰ遺伝子組み換えマウス骨髄から採取した単核球の培養・回収を行った。その結果、低温処理で自然剥離・回収された細胞数は０個で、トリプシン処理で回収された細胞の数は２．６×１０４個であった。細胞回収率は約０％であった。
【０１１３】
また、上記培養基材７’から回収された骨髄由来細胞の総数（２．６×１０４個）が、未コートシャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）を用いて１４日間培養した場合（０．５×１０４個）の約５．２倍であった。
【０１１４】
また、上記低温処理による自然剥離及びトリプシン処理で回収された骨髄由来細胞を、それぞれ顕微鏡で細胞形態が正常であることを確認した。
【０１１５】
これらの比較例より、無機材料（Ｃ）の含有量（Ｃ／Ａ）が少なすぎる（＜０．０３）と、細胞との接着性が低すぎて、細胞が増殖できないことが理解できる。
【０１１６】
同様に、Ｃ／Ａが０．０３〜０．７の範囲でも、Ｂ／Ａ＞０．７の場合は、培養できないケースが生じることが理解できる。
【０１１７】
【表１】
【０１１８】
注）TCPS:未コートシャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）
【０１１９】
【表２】
【０１２０】
注）TCPS:未コートシャーレ（ＩＷＡＫＩティッシュカルチャデイッシュ３０００−０３５）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）の重合体（Ａ）と、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料（Ｃ）とを含有することを特徴とする骨髄由来細胞培養用細胞培養基材であって、
前記重合体（Ａ）と、前記無機材料（Ｃ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））が、０．０３〜０．７の範囲にある骨髄由来細胞培養用細胞培養基材。
【請求項２】
水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）の重合体（Ａ）、Ｎ−置換（メタ）アクリルアミドの重合体（Ｂ）、及び水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料（Ｃ）とを含有することを特徴とする骨髄由来細胞培養用細胞培養基材であって、
前記重合体（Ａ）と重合体（Ｂ）との質量比（（Ｂ）／（Ａ））が、０．０１〜０．７の範囲にあり、前記重合体（Ａ）と、前記無機材料（Ｃ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））が、０．０３〜０．７の範囲にある骨髄由来細胞培養用細胞培養基材。
【請求項３】
水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）の重合体（Ａ）と、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料（Ｃ）とを含有する細胞培養基材の上で、骨髄由来細胞を培養し、次いで培養細胞を基材から剥離することを特徴とする骨髄由来細胞の培養方法であって、
前記重合体（Ａ）と、前記無機材料（Ｃ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））が、０．０３〜０．７の範囲にある骨髄由来細胞の培養方法。
【請求項４】
水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）の重合体（Ａ）、Ｎ−置換（メタ）アクリルアミドの重合体（Ｂ）、及び水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料（Ｃ）とを含有する細胞培養基材の上で、骨髄由来細胞を培養し、次いで培養細胞を基材から剥離することを特徴とする骨髄由来細胞の培養方法であって、
前記重合体（Ａ）と重合体（Ｂ）との質量比（（Ｂ）／（Ａ））が、０．０１〜０．７の範囲にあり、前記重合体（Ａ）と、前記無機材料（Ｃ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））が、０．０３〜０．７の範囲にある骨髄由来細胞の培養方法。
【請求項５】
前記水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）が、メトキシエチルアクリレート、エトキシエチルアクリレート、メトキシエチルメタクリレート及びエトキシエチルメタクリレートから選択される少なくとも１種のモノマーである請求項１〜４のいずれかに記載の骨髄由来細胞の培養方法。
【請求項６】
動物由来の血清を使用せずに骨髄由来細胞を培養する請求項３〜５のいずれかに記載の骨髄由来細胞の培養方法。
【請求項７】
タンパク質分解酵素を使用せずに培養細胞を基材から剥離する請求項３〜５のいずれかに記載の骨髄由来細胞の培養方法。
【請求項８】
前記細胞培養基材で培養した骨髄由来細胞を２５℃以下の低温処理及び／または物理的な外部刺激により該基材から剥離する請求項３〜７のいずれかに記載の骨髄由来細胞の培養方法。
【請求項９】
請求項３〜８のいずれかに記載の培養方法で製造された骨髄由来細胞。
【請求項１】
水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）の重合体（Ａ）と、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料（Ｃ）とを含有することを特徴とする骨髄由来細胞培養用細胞培養基材であって、
前記重合体（Ａ）と、前記無機材料（Ｃ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））が、０．０３〜０．７の範囲にある骨髄由来細胞培養用細胞培養基材。
【請求項２】
水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）の重合体（Ａ）、Ｎ−置換（メタ）アクリルアミドの重合体（Ｂ）、及び水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料（Ｃ）とを含有することを特徴とする骨髄由来細胞培養用細胞培養基材であって、
前記重合体（Ａ）と重合体（Ｂ）との質量比（（Ｂ）／（Ａ））が、０．０１〜０．７の範囲にあり、前記重合体（Ａ）と、前記無機材料（Ｃ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））が、０．０３〜０．７の範囲にある骨髄由来細胞培養用細胞培養基材。
【請求項３】
水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）の重合体（Ａ）と、水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料（Ｃ）とを含有する細胞培養基材の上で、骨髄由来細胞を培養し、次いで培養細胞を基材から剥離することを特徴とする骨髄由来細胞の培養方法であって、
前記重合体（Ａ）と、前記無機材料（Ｃ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））が、０．０３〜０．７の範囲にある骨髄由来細胞の培養方法。
【請求項４】
水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）の重合体（Ａ）、Ｎ−置換（メタ）アクリルアミドの重合体（Ｂ）、及び水膨潤性粘土鉱物及びシリカから選択される１種以上の無機材料（Ｃ）とを含有する細胞培養基材の上で、骨髄由来細胞を培養し、次いで培養細胞を基材から剥離することを特徴とする骨髄由来細胞の培養方法であって、
前記重合体（Ａ）と重合体（Ｂ）との質量比（（Ｂ）／（Ａ））が、０．０１〜０．７の範囲にあり、前記重合体（Ａ）と、前記無機材料（Ｃ）との質量比（（Ｃ）／（Ａ））が、０．０３〜０．７の範囲にある骨髄由来細胞の培養方法。
【請求項５】
前記水溶性（メタ）アクリル酸エステル（ａ）が、メトキシエチルアクリレート、エトキシエチルアクリレート、メトキシエチルメタクリレート及びエトキシエチルメタクリレートから選択される少なくとも１種のモノマーである請求項１〜４のいずれかに記載の骨髄由来細胞の培養方法。
【請求項６】
動物由来の血清を使用せずに骨髄由来細胞を培養する請求項３〜５のいずれかに記載の骨髄由来細胞の培養方法。
【請求項７】
タンパク質分解酵素を使用せずに培養細胞を基材から剥離する請求項３〜５のいずれかに記載の骨髄由来細胞の培養方法。
【請求項８】
前記細胞培養基材で培養した骨髄由来細胞を２５℃以下の低温処理及び／または物理的な外部刺激により該基材から剥離する請求項３〜７のいずれかに記載の骨髄由来細胞の培養方法。
【請求項９】
請求項３〜８のいずれかに記載の培養方法で製造された骨髄由来細胞。
【公開番号】特開２０１２−２３１７８８（Ｐ２０１２−２３１７８８Ａ）
【公開日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−９５５４７（Ｐ２０１２−９５５４７）
【出願日】平成２４年４月１９日（２０１２．４．１９）
【出願人】（０００１７３７５１）一般財団法人川村理化学研究所 (206)
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年４月１９日（２０１２．４．１９）
【出願人】（０００１７３７５１）一般財団法人川村理化学研究所 (206)
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【Ｆターム（参考）】
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