髄膜炎菌付着因子
【課題】（ａ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ生化学に介入する方法；（ｂ）既知のＮｅｉｓｓｅｒｉａタンパク質についての新たな用途；（ｃ）既知のＮｅｉｓｓｅｒｉａタンパク質の代替形態および改良形態（例えば、酵素的に不活性な形態の、既知のタンパク質または既知のタンパク質のタンパク質分解性産物）；ならびに（ｄ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａの付着を研究および調節するために有用な物質、を提供する。
【解決手段】特定の配列のうちの１つ以上のアミノ酸配列を含むＮｅｉｓｓｅｒｉａ属細菌由来のＮａｄタンパク質、前記タンパク質をコードする核酸、およびＮａｄタンパク質および／またはＮａｄタンパク質をコードする核酸を含む免疫原性組成物。
【解決手段】特定の配列のうちの１つ以上のアミノ酸配列を含むＮｅｉｓｓｅｒｉａ属細菌由来のＮａｄタンパク質、前記タンパク質をコードする核酸、およびＮａｄタンパク質および／またはＮａｄタンパク質をコードする核酸を含む免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に引用される全ての文献は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、生化学の分野に関し、より具体的には、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属の病原性細菌（例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）の生化学に関する。
【背景技術】
【０００３】
特許文献１、特許文献２、特許文献３、および特許文献４は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｇｉｔｉｄｉｓおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来のタンパク質を開示する。血清群ＢのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの完全ゲノム配列は、公開されており［非特許文献１］、ワクチン抗原を同定するために分析にかけられている［非特許文献２］。このタンパク質の発現に対するアプローチは、特許文献５に開示される。血清群ＡのＮ．ｍｅｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの完全ゲノム配列もまた、公知である［非特許文献３］。
【０００４】
しかし、配列データのみでは、この病原体についての全てを表さない。本発明の目的としては、以下が挙げられる：（ａ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ生化学に介入する方法を提供すること；（ｂ）既知のＮｅｉｓｓｅｒｉａタンパク質についての新たな用途を提供すること；（ｃ）既知のＮｅｉｓｓｅｒｉａタンパク質の代替形態および改良形態（例えば、酵素的に不活性な形態の、既知のタンパク質または既知のタンパク質のタンパク質分解性産物）を提供すること；ならびに（ｄ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａの付着を研究および調節するために有用な物質を提供すること。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第９９／２４５７８号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９９／３６５４４号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９９／５７２８０号パンフレット
【特許文献４】国際公開第００／２２４３０号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０１／６４９２２号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔｅｔｔｅｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：１８０９−１８１５
【非特許文献２】Ｐｉｚｚａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：１８１６−１８２０
【非特許文献３】Ｐａｒｋｈｉｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ（２０００）４０４：５０２−５０６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（本明細書中で使用される命名法）
「ＯＲＦ４０」は、ＷＯ９９／３６５４４の実施例１に開示される。血清群ＡおよびＢのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の配列が、開示される（この中で、配列番号１〜６）。他の形態のタンパク質は、ＷＯ９９／３１１３２およびＷＯ９９／５８６８３に開示
され、ＧｅｎＢａｎｋにおいてもまた、見出され得る（ｇｉ登録番号：１１３５２９０２、７２２８５６２、１４５７８０１５、１２９５８１０７、７２２８５８６、７２２８５７２、７２２８５９４、７２２８５８８、１４５７８０１３、７２２８５６８、７２２８５４６、７２２８５４８、７２２８５９２、１４５７８００９、７２２８５５８、７２２８６００、７２２８５９６、７２２８５４２、７２２８５７４、７２２８５５２、７２２８５５４、１４５７８０２３、１４５７８０２１、１１３５４０８０、７２２８５８４および７２２８５９０を参照のこと）。
【０００８】
「Ａｐｐ」（付着および貫通タンパク質）は、ＷＯ９９／２４５７８の実施例７７に「ＯＲＦ１」として開示される。血清群ＡおよびＢのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の配列ならびにＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の配列が開示される（この中で、配列番号６４７〜６５４）。他の形態のタンパク質は、ＷＯ９９／５５８７３に開示され、ＧｅｎＢａｎｋにおいてもまた、見出され得る（ｇｉ登録番号：１１２８０３８６、７２２７２４６、１１０７１８６５、６９７７９４１、１１０７１８６３、１１２８０３８７、７３７９２０５を参照のこと）。
【０００９】
血清群ＢのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の「ＮａｄＡ」（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａの付着因子Ａ）は、タンパク質「９６１」として、ＷＯ９９／５７２８０（配列番号２９４３および２９４４）中に、そして「ＮＭＢ１９９４」としてＴｅｔｔｅｌｉｎらによって（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：１１３５２９０４および７２２７２５６もまた参照のこと）、および本明細書中の図９において開示される。
【００１０】
これらのタンパク質は、好ましくは、融合タンパク質以外として（例えば、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ｈｉｓタグまたは同様のものを伴わずに）発現される。
【００１１】
本発明に従う使用に好ましいタンパク質は、血清群ＢのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ
ＭＣ５８株、２９９６株または３９４／９８株（Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ株）のタンパク質である。しかし、本発明は、一般的には、株によって限定されないことが理解される−特定のタンパク質（例えば、「ＯＲＦ４０」、「Ａｐｐ」など）に対する言及は、任意の株由来のタンパク質を含むととられ得る。従って、一般的には、任意の特定のタンパク質に対する言及は、上記に開示された配列のうちの１つと配列同一性を共有するタンパク質を含む。「配列同一性」の程度は、好ましくは、５０％より高い（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上）。これは、変異体および対立遺伝子改変体を含む。本発明の状況下において、配列同一性は、好ましくは、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）中で実行されるようなＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。このプログラムは、以下のパラメータを用いるアフィンギャップ検索を使用する：ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝１２およびｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝ｌ。典型的には、２つのタンパク質間の５０％以上の同一性は、機能的に等価であることを示すと考えられる。
【００１２】
ＷＯ９９／２４５７８、ＷＯ９９／３６５４４およびＷＯ９９／５７２８０中で使用される命名法はまた、本明細書中においても使用される（例えば、ＷＯ９９／２４５７８およびＷＯ９９／３６５４４において使用されるような、「ＯＲＦ４」、「ＯＲＦ４０」、「ＯＲＦ４０−１」など；ＷＯ９９／５７２８０において使用されるような、「ｍ９１９」、「ｇ９１９」および「ａ９１９」など）。
【００１３】
（分泌されたＡｐｐ）
ＧＳＴまたはｈｉｓタグ融合パートナーを伴わずにＥ．ｃｏｌｉ中で発現される場合、Ａｐｐは、約１６０ｋＤａの前駆体として外膜に露出し、ここでＡｐｐは、プロセシングされ、培養物中に分泌されることが見出されている。
【００１４】
従って、本発明は、プロセシングされたＡｐｐタンパク質を精製するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：非−Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ宿主細胞中でＡｐｐタンパク質をコードする遺伝子を発現させる工程；および培養培地からプロセシングされたＡｐｐタンパク質を精製する工程。
【００１５】
本発明はまた、このプロセスによって得られ得る精製されたタンパク質を提供する。
【００１６】
Ａｐｐタンパク質は、好ましくは、Ｎ末端にその野生型４２残基シグナルペプチドを含む（すなわち、いかなるＮ末端融合パートナーも使用されない）。Ｃ末端融合パートナーを含まないこともまた、好ましい。
【００１７】
培養培地からタンパク質を精製するために、この培養物は、遠心分離され得、そしてこのタンパク質は、上清から回収され得る。
【００１８】
非−Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ宿主細胞は、好ましくは細菌であり、最も好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉである。
【００１９】
細菌発現技術は、当該分野において公知である。細菌性プロモーターは、細菌性ＲＮＡポリメラーゼに結合し得、かつｍＲＮＡ中にコード配列（例えば、構造遺伝子）の下流（３’側）転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、コード配列の５’側末端に近位に通常配置される転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。細菌性プロモーターは、オペレーターと呼ばれる第２ドメインもまた有し得、この第２ドメインは、ＲＮＡ合成が開始する、隣接ＲＮＡポリメラーゼ結合部位と重なり得る。このオペレーターは、遺伝子レプレッサータンパク質がオペレータに結合し得、その結果、特定の遺伝子の転写を阻害するので、負に調節された（誘導性）転写を可能にする。構成的な発現が、オペレーターのような負の調節エレメントの非存在化で生じ得る。さらに、正の調節が、遺伝子アクチベータータンパク質結合配列（これは、存在する場合、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列に対して通常近位（５’側）である）によって達成され得る。遺伝子アクチベータータンパク質の例は、異化代謝産物アクチベータータンパク質（ＣＡＰ）であり、これは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のｌａｃオペロンの開始転写を助ける［Ｒａｉｂａｕｄら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：１７３］。従って、調節された発現は、正または負のいずれかであり得、よって、転写を増強するか減弱するかのいずれかであり得る。
【００２０】
代謝経路酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）［Ｃｈａｎｇら（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ １９８：１０５６］およびマルトースのような糖代謝酵素に由来するプロモーター配列が挙げられる。さらなる例としては、トリプトファン（ｔｒｐ）［Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら（１９８１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：７３１；米国特許第４，７３８，９２１号；ＥＰ−Ａ−００３６７７６およびＥＰ−Ａ−０１２１７７５］のような生合成酵素に由来するプロモーター配列が挙げられる。このｇ−ラオタマーゼ（ｌａｏｔａｍａｓｅ）（ｂｌａ）プロモーター系［Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ（１９８１）「Ｔｈｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｍｉｓｔａｋｅｓ」Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ３（Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ編）］、バクテリオファージλ ＰＬ［Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８］およびＴ５［米国特許第４，６８９，４０６号］プロモーター系もまた、有用なプロモーター配列を提供する。
【００２１】
さらに、天然に存在しない合成プロモーターもまた、細菌性プロモーターとして機能する。例えば、ある細菌性プロモーターまたはバクテリオファージプロモーターの転写活性化配列は、別の細菌性プロモーターまたはバクテリオファージプロモーターのオペロン配列と連結され得、合成ハイブリッドプロモーター［米国特許第４，５５１，４３３号］を作製する。例えば、このｔａｃプロモーターは、ｔｒｐプロモータとｌａｃオペロン配列の両方から構成されるハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターであり、これは、ｌａｃレプレッサ−によって調節される［Ａｍａｎｎら（１９８３）Ｇｅｎｅ ２５：１６７；ｄｅ Ｂｏｅｒら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２１］。さらに、細菌性プロモーターは、細菌性ＲＮＡポリメラーゼに結合を有して転写を開始する能力を有する非細菌起源の天然に存在するプロモーターを含み得る。非細菌起源の天然に存在するプロモーターはまた、適合性ＲＮＡポリメラーゼと結合され、原核生物において、いくつかの遺伝子の高レベル発現を生じ得る。このバクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、結合されたプロモーター系の１つの例である［Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；Ｔａｂｏｒら（１９８５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：１０７４］。さらに、ハイブリッドプロモーターはまた、バクテリオファージプロモーターおよびＥ．ｃｏｌｉオペレーター領域から構成され得る（ＥＰＯ−Ａ−０ ２６７ ８５１）。
【００２２】
機能性プロモーター配列に加えて、有効なリボソーム結合部位もまた、原核生物における外来遺伝子の発現のために有用である。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、このリボソーム結合部位は、シャイン−ダルガーノ（ＳＤ）配列と呼ばれ、開始コドン（ＡＴＧ）およびその開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流に配置される３〜９ヌクレオチド長の配列を含む［Ｓｈｉｎｅら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５４：３４］。このＳＤ配列は、Ｅ．ｃｏｌｉ １６Ｓ ｒＲＮＡのＳＤ配列と３’側末端との間の塩基の対形成によって、ｍＲＮＡのリボソームへの結合を促進すると考えられる［Ｓｔｅｉｔｚら（１９７９）「Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｉｇｎａｌｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ．」Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ編）］。弱いリボソーム結合部位を用いて真核生物遺伝子および原核生物遺伝子を発現させる［Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ］。
【００２３】
プロモーター配列は、ＤＮＡ分子と直接連結され得、この場合、Ｎ末端の第１アミノ酸は、常にメチオニンであり、このメチオニンは、ＡＴＧ開始コドンによってコードされる。所望の場合、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンと共にインビトロでインキュベーションするかまたは細菌性メチオニンＮ末端ペプチダーゼと共にインビボもしくはインビトロでインキュベーションするかによってタンパク質から切断され得る（ＥＰ−Ａ−０２１９２３７）。
【００２４】
通常、細菌によって認識される転写終止配列は、翻訳終止コドンの３’側に配置される調節領域であり、従って、コード配列に隣接するプロモーターと一緒になる。ｍＲＮＡの転写を指示するこれらの配列は、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドへと翻訳され得る。転写終止配列は、転写の終止を助けるステムループ構造（ｓｔｅｍ ｌｏｏｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を形成し得る約５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列を頻繁に含む。例としては、強力なプロモーターを有する遺伝子（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ中のｔｒｐ遺伝子およびタンパク質の生合成遺伝子）に由来する転写終止配列が挙げられる。
【００２５】
通常、プロモーター、シグナル配列（所望の場合）、目的のコード配列、および転写終止配列を含む上記の要素は、発現構築物中に一緒に配置される。発現構築物は、しばしば
、レプリコン（例えば、細菌のような宿主中に安定に維持され得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド））中に維持される。このレプリコンは、複製系を有し、そのため、レプリコンが発現のためかまたはクローニングおよび増幅のためのいずれかで原核生物宿主中に維持されることが可能である。さらに、レプリコンは、高コピー数または低コピー数のいずれかのプラスミドであり得る。高コピー数のプラスミドは、一般的には約５〜約２００、通常は約１０〜約１５０の範囲のコピー数を有する。高コピー数のプラスミドを含む宿主は、好ましくは、少なくとも約１０、およびより好ましくは少なくとも約２０のプラスミドを含む。高コピー数または低コピー数いずれかのベクターが、宿主に対するベクターおよび外来タンパク質の効果に依存して選択され得る。
【００２６】
あるいは、発現構築物は、組み込みベクターと共に細菌性ゲノム中に組み込まれ得る。組み込みベクターは、通常、ベクターの組み込みを可能にする細菌性染色体と相同である少なくとも１つの配列を含む。組み込みは、ベクター中の相同ＤＮＡと細菌性染色体との間の組換えから生じるようである。例えば、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株由来のＤＮＡによって構築される組み込みベクターは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ染色体（ＥＰ−Ａ−０１２７３２８）中に組みこむ。組み込みベクターはまた、バクテリオファージまたはトランスポゾン配列から構成され得る。
【００２７】
通常、染色体外型発現構築物および組み込み型発現構築物は、選択マーカーを含み得、形質転換された細菌株の選択を可能にする。選択マーカーは、細菌宿主中で発現され得、そしてアンピリシン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン（ネオマイシン）、およびテトラサイクリンのような薬物に対する耐性を細菌に付与する遺伝子を含み得る［Ｄａｖｉｅｓら（１９７８）Ａｎｎｅ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：４６９］。選択マーカーはまた、ヒスチジン、トリプトファンおよびロイシンの生合成経路における遺伝子のような生合成遺伝子も含み得る。
【００２８】
あるいは、上記の要素のいくつかは、形質転換ベクター中に共に配置され得る。形質転換ベクターは、通常、上記のような、レプリコン中に維持されるかまたは組み込みベクター中で顕在化されるかのいずれかである選択マーカーを含む。
【００２９】
染色体外レプリコンまたは組み込みベクターのいずれかである、発現ベクターおよび形質転換ベクターは、多くの細菌への形質転換のために開発されている。例えば、発現ベクターは、とりわけ以下の細菌について開発されている：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ［Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：５５８２；ＥＰ−Ａ−０ ０３６ ２５９およびＥＰ−Ａ−０ ０６３ ９５３；ＷＯ
８４／０４５４１］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ［Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８；Ａｍａｎｎら（１９８５）Ｇｅｎｅ ４０：１８３；Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；ＥＰ−Ａ−０ ０３６ ７７６、ＥＰ−Ａ−０ １３６ ８２９およびＥＰ−Ａ−０ １３６ ９０７］、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ［Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５］；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ［Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５］、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ［米国特許第４，７４５，０５６号］。
【００３０】
外来性ＤＮＡを細菌宿主中に導入する方法は、当該分野で周知であり、通常ＣａＣ１２または他の薬剤（例えば、二価の陽イオンおよびＤＭＳＯ）で処理された細菌の形質転換を含む。ＤＮＡはまた、エレクトロポレーションによって細菌細胞に導入され得る。形質転換手順は、通常、形質転換される細菌種によって変化する。例えば、［Ｍａｓｓｏｎら（１９８９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６０：２７３；Ｐａｌｖａら（
１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：５５８２；ＥＰ−Ａ−０ ０３６ ２５９およびＥＰ−Ａ−０ ０６３ ９５３；ＷＯ ８４／０４５４１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ］、［Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８５６；Ｗａｎｇら（１９９０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：９４９、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ］、［Ｃｏｈｅｎら（１９７３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９：２１１０；Ｄｏｗｅｒら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６１２７；Ｋｕｓｈｎｅｒ（１９７８）「Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ｗｉｔｈ ＣｏｌＥ１−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｈ．Ｗ．ＢｏｙｅｒおよびＳ．Ｎｉｃｏｓｉａ編）；Ｍａｎｄｅｌら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３：１５９；Ｔａｋｅｔｏ（１９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９４９：３１８；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ］、［Ｃｈａｓｓｙら（１９８７）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．４４：１７３ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ］；［Ｆｉｅｄｌｅｒら（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １７０：３８、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ］；［Ａｕｇｕｓｔｉｎら（１９９０）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６６：２０３、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ］、［Ｂａｒａｎｙら（１９８０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４４：６９８；Ｈａｒｌａｎｄｅｒ（１９８７）「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ
ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ」：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊ．ＦｅｒｒｅｔｔｉおよびＲ．Ｃｕｒｔｉｓｓ ＩＩＩ編）；Ｐｅｒｒｙら（１９８１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５；Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５；Ｓｏｍｋｕｔｉら（１９８７）Ｐｒｏｃ．４ｔｈ Ｅｖｒ．Ｃｏｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １：４１２、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ］を参照のこと。
【００３１】
（付着性タンパク質）
国際特許出願ＷＯ０１／６４９２２の実施例２２は、ＮａｄＡタンパク質を発現するＥ．ｃｏｌｉが、ヒト上皮細胞に付着し得ることを開示する。この付着活性は、さらに研究されており、この付着活性は、ＡｐｐおよびＯＲＦ４０についても見出されている。
【００３２】
本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細胞の、上皮細胞への接着を防ぐための方法を提供する。
【００３３】
この章における「Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細胞」に対する言及は、任意の種のＮｅｉｓｓｅｒｉａ属細菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮ．ｌａｃｔａｍｉｃａを含む）を含む。しかし、好ましくは、この種は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓである。このＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、任意の血清群（血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹを含む）由来であり得る。しかし、最も好ましくは、これは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂである。
【００３４】
この章における「上皮細胞」に対する言及は、哺乳動物の上皮に見出されるかまたはその上皮由来の任意の細胞を含む。この細胞は、インビトロ（例えば、細胞培養物中）またはインビボに存在し得る。好ましい上皮細胞は、鼻咽頭由来である。この細胞は、最も好ましくは、ヒト細胞である。
【００３５】
（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ−上皮相互作用のブロック）
本発明は、上皮細胞へのＮｅｉｓｓｅｒｉａ細胞の付着を防止するための方法を提供し、ここで、上皮細胞に結合する１つ以上のＡｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡの
能力がブロックされる。
【００３６】
結合する能力は、種々の方法によりブロックされ得るが、最も簡便には、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡに特異的な抗体が用いられる。本発明はまた、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０またはＮａｄＡに特異的である抗体を提供する。この抗体は、好ましくは、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡに対して、少なくとも１０−７Ｍ、例えば、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ以上強いアフィニティーを有する。
【００３７】
本発明に従う使用のための抗体は、ポリクローナルであり得るが、好ましくは、モノクローナルである。用語「抗体」は、完全抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡなど）、抗原結合部位（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２など）を保持する完全抗体の誘導体、単鎖抗体（例えば、ｓＦｖ）、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、ヒト化抗体、一価抗体、ヒトモノクローナル抗体［例えば、Ｇｒｅｅｎ（１９９９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１１−２３；ＫｉｐｒｉｙａｎｏｖおよびＬｉｔｔｌｅ（１９９９）Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １２：１７３−２０１など］などを含むことが理解される。ヒト化抗体は、完全にヒトであることが好適であり得る［例えば、Ｆｌｅｔｃｈｅｒ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９：３９５−９６］。
【００３８】
抗体を用いることの代替として、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０またはＮａｄＡと、上皮細胞に対するそのレセプターとの間の相互作用のアンタゴニストが用いられ得る。さらなる代替物として、可溶性形態の上皮細胞レセプターが、デコイ（ｄｅｃｏｙ）として用いられ得る。これらは、レセプターの膜貫通領域、および、必要に応じて、細胞質領域を除去することにより生成され得る［例えば、ＥＰ−Ｂ２−０１３９４１７、ＥＰ−Ａ−０６０９５８０など］。
【００３９】
本発明の抗体、アンタゴニストおよび可溶性レセプターは、上皮細胞に対するＮｅｉｓｓｅｒｉａ細胞の付着を防止するための医薬として用いられ得る。
【００４０】
（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ遺伝子の発現の阻害）
本発明は、上皮細胞に対するＮｅｉｓｓｅｒｉａ細胞の付着を防止するための方法を提供し、ここで、１つ以上のＡｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡからのタンパク質発現が阻害される。この阻害は、転写および／または翻訳のレベルであり得る。
【００４１】
遺伝子の発現を阻害するための好ましい技術は、アンチセンスである［例えば、Ｐｉｄｄｏｃｋ（１９９８）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １：５０２−８；Ｎｉｅｌｓｅｎ（２００１）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ １０：３３１−４１；ＧｏｏｄおよびＮｉｅｌｓｅｎ（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６：３５５−３５８；Ｒａｈｍａｎら（１９９１）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ Ｄｅｖ １：３１９−３２７；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 第３１３巻および第３１４巻；Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（ＨａｒｔｍａｎｎおよびＥｎｄｒｅｓ編）；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ａｇｒａｗａｌ編）など］。抗菌性アンチセンス技術は、例えば、国際特許出願公開ＷＯ９９／０２６７３およびＷＯ９９／１３８９３に開示される。
【００４２】
本発明はまた、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０またはＮａｄＡをコードする核酸由来のｘ以上のヌクレオチドのフラグメントを含む核酸を提供し、ここで、ｘは、少なくとも８個（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０以上）である。この核酸は、代表的に、一本鎖である。
【００４３】
核酸は、好ましくは、式５’−（Ｎ）ａ−（Ｘ）−（Ｎ）ｂ−３’であり、ここで、０
≧ａ≧１５、０≧ｂ≧１５であり、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、そしてＸは、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０またはＮａｄＡをコードする核酸のフラグメントである。Ｘは、好ましくは、少なくとも８個（例えば、８個、１０個、１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２５個、３０個以上）のヌクレオチドを含む。ａおよびｂの値は、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５であり得る。核酸の−（Ｎ）ａ−および−（Ｎ）ｂ−における、個々のヌクレオチドＮの各々は、同じであっても、異なってもよい。核酸の長さ（すなわち、ａ＋ｂ＋Ｘの長さ）は、好ましくは、１００未満（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０など）である。
【００４４】
用語「核酸」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡおよびＲＮＡのアナログ（例えば、修飾した骨格（糖および／またはリン酸における修飾（例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミダイトなど）を有する）を含むもの）、ならびにペプチド核酸（ＰＮＡ）、ならびにプリン塩基およびピリミジン塩基、または天然のヌクレオチド塩基、化学的に修飾されたヌクレオチド塩基もしくは生化学的に修飾されたヌクレオチド塩基、非天然のヌクレオチド塩基、または誘導体化されたヌクレオチド塩基などを含む任意の他のポリマーもまた含む。本発明に従う核酸は、多くの方法で（例えば、化学合成により、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーから、生物自体からなど）調製され得、そして種々の形態（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プローブなど）をとり得る。
【００４５】
本発明のアンチセンス核酸は、上皮細胞に対するＮｅｉｓｓｅｒｉａ細胞の付着を防止するための医薬として用いられ得る。
【００４６】
（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ遺伝子のノックアウト）
本発明は、上皮細胞に対するＮｅｉｓｓｅｒｉａ細胞の付着を防止するための方法を提供し、ここで、１つ以上のＡｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡは、ノックアウトである。
【００４７】
本発明はまた、１つ以上のＡｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡがノックアウトされているＮｅｉｓｓｅｒｉａ細菌を提供する。
【００４８】
ノックアウト細菌を作製するための技術は周知であり、そしてノックアウトＮｅｉｓｓｅｒｉａは報告されている［例えば、Ｍｏｅら（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：３７６２−３７７１；Ｓｅｉｆｅｒｔ（１９９７）Ｇｅｎｅ １８８：２１５−２２０；Ｚｈｕら（２０００）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１８２：４３９−４４７など］。
【００４９】
ノックアウト変異は、遺伝子のコード領域に位置づけられ得るか、またはその転写制御領域内（例えば、プロモーター内）にあり得る。
【００５０】
ノックアウト変異は、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡをコードするｍＲＮＡのレベルを、野生型細菌により産生される１％未満、好ましくは、０．５％未満、より好ましくは、０．１％未満、および最も好ましくは、０％まで低下させる。
【００５１】
本発明のノックアウト変異体は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ感染を予防するための免疫原性組成物（例えば、ワクチン）として用いられ得る。このようなワクチンは、生存性が弱められた細菌としての変異体を含み得る。
【００５２】
（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ遺伝子の変異誘発）
本発明は、上皮細胞に対するＮｅｉｓｓｅｒｉａ細胞の付着を防止するための方法を提供し、ここで、１つ以上のＡｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡが、その活性を阻
害する変異を有する。
【００５３】
本発明はまた、変異タンパク質を提供し、ここで、変異タンパク質は、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡのアミノ酸配列、またはそのフラグメントを含むが、このアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸は変異される（例えば、Ａｐｐについて以下を参照のこと）。
【００５４】
変異されたアミノ酸は、好ましくは、上皮細胞に対する直接的もしくは間接的な付着の原因であるＡｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡの活性の低下または排除を生じる。例えば、変異は、酵素活性を阻害し得るか、またはタンパク質における結合部位を除去し得る。
【００５５】
本発明はまた、この変異タンパク質をコードする核酸を提供する。
【００５６】
本発明はまた、以下の工程を包含する、この核酸を産生する方法を提供する：（ａ）Ａｐｐ、ＯＲＦ４０またはＮａｄＡをコードする供給源核酸を提供する工程、および（ｂ）この供給源核酸に対して変異誘発（例えば、部位特異的変異誘発）を行って、変異タンパク質をコードする核酸を提供する工程。
【００５７】
変異としては、欠失、置換、および／または挿入（これらのいずれかは１つ以上のアミノ酸を含み得る）が挙げられ得る。代替として、変異は短縮を含み得る。
【００５８】
ビルレンス因子の変異誘発は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ［例えば、Ｐｏｗｅｒら（２０００）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４６：９６７−９７９；Ｆｏｒｅｓｔら（１９９９）Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３１：７４３−７５２；Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎら（１９９８）Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２７：６１１−６１６；Ｌｅｅら（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６３：２５０８−２５１５；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら（１９９３）Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ８：８９１−９０１など］を含む、多くの細菌［例えば、ＷＯ９３／１３２０２に記載される変異誘発；ＲａｐｐｕｏｌｉおよびＰｉｚｚａ，Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｏｘｉｎｓ（ＩＳＢＮ
０−１２−０５３０７８−３）の第１章；Ｐｉｚｚａら（２００１）Ｖａｃｃｉｎｅ １９：２５３４−４１；Ａｌａｐｅ−Ｇｉｒｏｎら（２０００）Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２６７：５１９１−５１９７；Ｋｉｔｔｅｎら（２０００）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６８：４４４１−４４５１；Ｇｕｂｂａら（２０００）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ
６８：３７１６−３７１９；Ｂｏｕｌｎｏｉｓら（１９９１）Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５：２６１１−２６１６など］について十分に確立されている。
【００５９】
変異誘発は、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡをコードする核酸に対して特異的に標的化され得る。あるいは、変異誘発は、全体的または無作為（照射、化学変異誘発などによって）であり得、これらは、代表的には、引き続いて、変異が、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡへと導入されているものについて細菌をスクリーニングされる。このようなスクリーニングは、ハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、サザンブロットまたはノーザンブロットなど）、プライマーベースの増幅（例えば、ＰＣＲ）、配列決定、プロテオミクス、異常なＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル移動などによるものであり得る。
【００６０】
本発明の変異タンパク質および核酸は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ感染を防止するための免疫原性組成物（例えば、ワクチン）として用いられ得る。
【００６１】
（スクリーニング方法）
本発明はまた、上皮細胞に対するＮｅｉｓｓｅｒｉａ細胞の結合を阻害するもの（アンタゴニスト）を同定するために化合物をスクリーニングするための方法を提供する。
【００６２】
スクリーニングのための潜在的アンタゴニストとしては、有機低分子、ペプチド、ペプトイド、ポリペプチド、脂質、金属、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリアミン、抗体、およびそれらの誘導体が挙げられる。有機低分子は、５０ダルトンと約２，５００ダルトンとの間、最も好ましくは、２００〜８００ダルトンの範囲の分子量を有する。物質の複合体混合物（例えば、天然物を含む抽出物、化合物ライブラリーまたは混合型コンビナトリアル合成の生成物）もまた、潜在的アンタゴニストを含む。
【００６３】
代表的には、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡのタンパク質は、上皮細胞および試験化合物と共にインキュベートされ、次いで、この混合物は、タンパク質と上皮細胞との間の相互作用が阻害されているか否かを確かめるために試験される。
【００６４】
阻害は、もちろん、標準（例えば、ネイティブのタンパク質／細胞相互作用）に対して決定される。好ましくは、この標準は、試験化合物の非存在下で測定されたコントロールの値である。標準は、本方法を行う前に決定され得るか、あるいは本方法が実施されている間、または本方法が実施された後に決定され得ることが理解される。これはまた、絶対的な標準であり得る。
【００６５】
タンパク質、細胞および化合物は、任意の順番で混合され得る。
【００６６】
好ましいハイスループットスクリーニング法について、このアッセイについての全ての生化学的工程は、例えば、試験管またはマイクロタイタープレート中の単一の溶液中で行われ、そして試験化合物は、初めに、単一の化合物濃度で分析される。ハイスループットスクリーニングの目的のために、実験条件は、スクリーニングされた全ての化合物の中から「ポジティブ（正）」の化合物として同定された試験化合物のある割合を達成するように調整される。
【００６７】
用いられ得る他の方法としては、例えば、リバースツーハイブリッドスクリーニング（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｗｏ ｈｙｂｒｉｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）［例えば、ＶｉｄａｌおよびＥｎｄｏｈ（１９９９）ＴＩＢＴＥＣＨ １７：３７４−３８１（ここで、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａレセプター相互作用の阻害は、転写を活性化することに失敗したとが報告されている）］が挙げられる。
【００６８】
本方法はまた、単純に、１つ以上の試験化合物を、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡと共にインキュベートし、そしてこれらが相互作用するか否かを決定する工程を包含する。次いで、タンパク質と相互作用する化合物は、タンパク質と上皮細胞との間の相互作用をブロックする、それらの能力について試験され得る。
【００６９】
本発明はまた、これらの方法を用いて同定された化合物を提供する。これらは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ感染を処置または予防するために用いられ得る。化合物は、好ましくは、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡに対して、少なくとも１０−７Ｍ（例えば、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ以上強い）アフィニティーを有する。
【００７０】
本発明はまた、（ａ）Ａｐｐおよび／またはＯＲＦ４０（および、必要に応じて、ＮａｄＡ）を発現するＥ．ｃｏｌｉ細菌、ならびに（ｂ）上皮細胞（例えば、ヒト上皮細胞）を含む組成物を提供する。
【００７１】
（外膜小胞（ＯＭＶ）における発現）
国際特許出願公報ＷＯ０１／５２８８５は、ＯＭＶワクチンに対するさらに規定された成分の添加が、それらの効力を有意に広げることを開示する。
【００７２】
ＮｍＢからのＯＭＶの調製は、当該分野で周知である。適切な調製物を得るための方法は、例えば、以下に開示される：Ｃｌａａｓｓｅｎら［Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９６）１４：１００１−１００８］；Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔら［Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９９）１７：２６１２−２６１９］；Ｐｅｅｔｅｒｓら［Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９６）１４：１００９−１０１５］；Ｆｕら［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＮＹ（１９９５）１２：１７０−７４］；Ｄａｖｉｅｓら［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．（１９９０）１３４：２１５−２２５］；Ｓａｕｎｄｅｒｓら［Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９９）６７：１１３−１１９］；Ｄｒａａｂｉｃｋら［Ｖａｃｃｉｎｅ（２０００）１８：１６０−１７２］；Ｍｏｒｅｎｏら［Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９８５）４７：５２７−５３３］；Ｍｉｌａｇｒｅｓら［Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９４）６２：４４１９−４４２４］；Ｎａｅｓｓら［Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９８）６６：９５９−９６５］；Ｒｏｓｅｎｑｖｉｓｔら［Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．（１９９８）９２：３２３−３３３］；Ｈａｎｅｂｅｒｇら［Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９８）６６：１３３４−４１］；Ａｎｄｅｒｓｅｎら［Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９７）１５：１２２５−３４］；Ｂｊｕｎｅら［Ｌａｎｃｅｔ（１９９１）３３８：１０９３−９６］など。
【００７３】
異種Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ遺伝子を発現するＥ．ｃｏｌｉから調製されたＯＭＶは、標準的な免疫源性試験において、精製した形態の抗原よりも、より良好な結果を与え得ることが本明細書中で見出されている。
【００７４】
従って、本発明は、細胞がＡｐｐ、ＯＲＦ４０またはＮａｄＡのタンパク質をコードする遺伝子を発現することを特徴とする、非Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ宿主細胞からＯＭＶを調製する方法を提供する。
【００７５】
本発明はまた、（ａ）このプロセスにより得られ得るＯＭＶ、および（ｂ）非Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ宿主細胞（この細胞は、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０またはＮａｄＡのタンパク質をコードする遺伝子を発現することを特徴とする）に由来する外膜小胞を提供する。
【００７６】
非Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ宿主細胞は、好ましくは、細菌であり、そして、最も好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉである。
【００７７】
より一般的には、本発明は、非Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ宿主細胞からＯＭＶを調製するための方法を提供し、この細胞が、以下のタンパク質の１つ以上をコードする遺伝子を発現することを特徴とする：
（Ａ） ＷＯ９９／２４５７８からの配列番号２〜８９２の偶数の配列番号；
（Ｂ） ＷＯ９９／３６５４４からの配列番号２〜８０の偶数の配列番号；
（Ｃ） ＷＯ９９／５７２８０からの配列番号２〜３０２０の偶数の配列番号：
（Ｄ） ＷＯ９９／５７２８０からの配列番号３０４０〜３１１４の偶数の配列番号；
（Ｅ） ＷＯ９９／５７２８０からの配列番号３１１５〜３２４１；
（Ｆ） Ｔｅｔｔｅｌｉｎら［前出］からの２１６０個のタンパク質（ＮＭＢ０００１〜ＮＭＢ２１６０）；
（Ｇ） （Ａ）〜（Ｆ）の１つ以上のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｈ） （Ａ）〜（Ｆ）の１つ以上のアミノ酸配列と配列同一性を共有するタンパク質；および
（Ｉ） （Ａ）〜（Ｆ）の１つ以上のフラグメントを含むタンパク質。
【００７８】
同様に、本発明はまた、（ａ）このプロセスにより得られ得るＯＭＶおよび（ｂ）非Ｎ
ｅｉｓｓｅｒｉａ宿主細胞（この細胞は、上記のタンパク質（Ａ）〜（Ｉ）の１つ以上をコードする遺伝子を発現することを特徴とする）に由来する外膜小胞を提供する。
【００７９】
（Ｈ）において言及される「配列同一性」の程度は、好ましくは、５０％より大きく（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上）、そしてこれは変異体および対立遺伝子改変体を含む。
【００８０】
（Ｉ）で言及される「フラグメント」は、（Ａ）〜（Ｆ）の１つ以上に由来する少なくともｎ個の連続するアミノ酸を含むべきであり、そして、特定の配列に依存して、ｎは７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００以上）である。好ましくは、フラグメントは、（Ａ）〜（Ｆ）の１つ以上のエピトープを含む。好ましいフラグメントは、ＷＯ００／７１５７４およびＷＯ０１／０４３１６に開示されるものである。
【００８１】
（Ａ）〜（Ｆ）について好ましいタンパク質は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ 血清抗原型Ｂにおいて見出される。
【００８２】
（Ａｐｐの変異体）
ＷＯ９９／２４５７８の配列番号６５０のアミノ酸２６７（本明細書中の配列番号３２）は、セリンである。Ａｐｐは、セリンプロテアーゼであると考えられており、そしてこのセリンは、その活性部位での触媒残基であると考えられる。標準的な配列整列技術が、任意の他のＡｐｐ配列についてこのＳｅｒ−２６７に対応するアミノ酸（例えば、ＷＯ９９／２４５７８の配列番号６５２の中のＳｅｒ−２６０、配列番号６５４の中のＳｅｒ−２６７など）を示す。
【００８３】
本発明は、Ａｐｐのアミノ酸配列（アミノ酸Ｓｅｒ−２６７、Ａｓｐ−１５８、およびＨｉｓ−１１５（配列番号３２に従って番号が付されている）の１つ以上が変異していることを除く）を含むタンパク質を提供する。変異は、欠失、挿入、または好ましくは、置換であり得る。置換は、好ましくは、１９個の他の天然に存在するアミノ酸のうちの１つとの置換であり、より好ましくは、グリシン、アラニン、チロシン、またはリジンとの置換である。
【００８４】
Ａｐｐは、アミノ酸１０６３と１１７１（配列番号３２に従い番号が付されている）との間の部位で切断されると考えられる。標準的な配列アラインメント技術により、任意の他のＡｐｐ配列についてのこれら２つの残基に対応するアミノ酸が明らかにされることが認識されている。
【００８５】
本発明は、Ａｐｐのアミノ酸配列（アミノ酸Ｓｅｒ−１０６４およびＡｒｇ−１１７１（配列番号３２に従って番号が付されている）の間の１つ以上のアミノ酸が変異していることを除く）を含むタンパク質を提供する。変異は、欠失、挿入、または好ましくは、置換であり得る。置換は、好ましくは、１９個の他の天然に存在するアミノ酸のうちの１つとの置換である。変異する残基は、好ましくは、Ｓ−１０６４、Ｄ−１０６５、Ｋ−１０６６、Ｌ−１０６７、Ｇ−１０６８、Ｋ−１０６９、Ａ−１０７０、Ｅ−１０７１、Ａ−１０７２、Ｋ−１０７３、Ｋ−１０７４、Ｑ−１０７５、Ａ−１０７６、Ｅ−１０７７、Ｋ−１０７８、Ｄ−１０７９、Ｎ−１０８０、Ａ−１０８１、Ｑ−１０８２、Ｓ１０８３、Ｌ−１０８４、Ｄ−１０８５、Ａ−１０８６、Ｌ−１０８７、Ｉ−１０８８、Ａ−１０８９、Ａ−１０９０、Ｇ−１０９１、Ｒ−１０９２、Ｄ−１０９３、Ａ−１０９４、Ｖ−１０９５、Ｅ−１０９６、Ｋ−１０９７、Ｔ−１０９８、Ｅ−１０９９、Ｓ−１１００、Ｖ−１１０１、Ａ−１１０２、Ｅ−１１０３、Ｐ−１１０４、Ａ−１１０５、Ｒ−１１０６、Ｑ−１１０７、Ａ−１１０８、Ｇ−１１０９、Ｇ−１１１０、Ｅ−１１１１、Ｎ−１
１１２、Ｖ−１１１３、Ｇ−１１１４、Ｉ−１１１５、Ｍ−１１１６、Ｑ１１１７、Ａ−１１１８、Ｅ−１１１９、Ｅ−１１２０、Ｅ−１１２１、Ｋ−１１２２、Ｋ−１１２３、Ｒ−１１２４、Ｖ−１１２５、Ｑ−１１２６、Ａ−１１２７、Ｄ−１１２８、Ｋ−１１２９、Ｄ−１１３０、Ｔ−１１３１、Ａ−１１３２、Ｌ−１１３３、Ａ−１１３４、Ｋ−１１３５、Ｑ−１１３６、Ｒ−１１３７、Ｅ−１１３８、Ａ−１１３９、Ｅ−１１４０、Ｔ−１１４１、Ｒ−１１４２、Ｐ−１１４３、Ａ−１１４４、Ｔ−１１４５、Ｔ−１１４６、Ａ−１１４７、Ｆ−１１４８、Ｐ−１１４９、Ｒ−１１５０、Ａ−１１５１、Ｒ−１１５２、Ｒ−１１５３、Ａ−１１５４、Ｒ−１１５５、Ｒ−１１５６、Ｄ−１１５７、Ｌ−１１５８、Ｐ−１１５９、Ｑ−１１６０、Ｌ−１１６１、Ｑ−１１６２、Ｐ−１１６３、Ｑ−１１６４、Ｐ−１１６５、Ｑ−１１６６、Ｐ−１１６７、Ｑ−１１６８、Ｐ−１１６９、Ｑ−１１７０、および／またはＲ−１１７１である。
【００８６】
あるいは、Ａｐｐは、アミノ酸９５６および／またはアミノ酸１１７８（配列番号３２に従い番号が付されている）で切断されると考えられる。標準的な配列アラインメント技術により、任意の他のＡｐｐ配列についてのこれら２つの残基に対応するアミノ酸が明らかにされることが認識されている。
【００８７】
本発明は、Ａｐｐのアミノ酸配列（アミノ酸Ｐｈｅ−９５６、Ａｓｎ−９５７、Ａｌａ−１１７８、およびＡｓｎ−１１７９（配列番号３２に従って番号が付されている）の１つ以上が変異していることを除く）を含むタンパク質を提供する。変異は、欠失、挿入、または好ましくは、置換であり得る。置換は、好ましくは、１９個の他の天然に存在するアミノ酸のうちの１つとの置換である。
【００８８】
本発明はまた、これらの変異タンパク質をコードする核酸を提供する。
【００８９】
本発明はまた、この核酸を生成する方法を提供する。この方法は、（ａ）Ａｐｐ、ＯＲＦ４０、またはＮａｄＡをコードするソース核酸を提供する工程；および（ｂ）このソース核酸に対して変異誘発（例えば、部位特異的変異誘発）を行い、変異タンパク質をコードする核酸を提供する工程を包含する。
【００９０】
本発明は、成熟Ａｐｐを提供する。
【００９１】
本発明はまた、プロセシングを受けたＡｐｐのアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。このプロセシングを受けたＡｐｐは、全長Ａｐｐ中の自己タンパク質分解切断部位の下流のＣ末端ドメインを含まない。例えば、全長Ａｐｐとして配列番号３２に基づき、本発明は、配列番号３３〜３６を提供する。自己タンパク質分解の間に除去され得るＣ末端ドメインは、配列番号３８および３９である。
【００９２】
本発明はまた、プロセシングを受けたＡｐｐのアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。ここで、プロセシングを受けたＡｐｐのＣ末端は、Ｐｈｅ−９５６である（配列番号３２に従って番号が付されている）。例えば、本発明は、配列番号３３および３５を提供する。他のＡｐｐ配列においてＰｈｅ−９５６に対応するアミノ酸は、標準的な配列アラインメント技術によって同定され得る。
【００９３】
本発明はまた、プロセシングを受けたＡｐｐのアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。ここで、プロセシングを受けたＡｐｐのＣ末端は、Ａｌａ−１１７８である（配列番号３２に従って番号が付されている）。例えば、本発明は、配列番号３４および３６を提供する。他のＡｐｐ配列においてＡｌａ−１１７８に対応するアミノ酸は、標準的な配列アラインメント技術によって同定され得る。
【００９４】
本発明はまた、プロセシングを受けたＡｐｐのアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。ここで、プロセシングを受けたＡｐｐは、配列番号３７、３８、および３９を含まない。
【００９５】
本発明はまた、配列番号３３、３４、３５、３６、３７、３８、および３９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。
【００９６】
本発明はまた、配列番号３３、３４、３５、３６、３７、３８、および３９の１つ以上に少なくともｐ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。特定の配列に基づき、ｐの値は、好ましくは、５０以上（例えば、６０、７０、８０、９０、９５、９９またはそれ以上）である。これらのタンパク質としては、ホモログ、オルソログ、対立遺伝子改変体、および機能的変異体が挙げられる。代表的に、２つのタンパク質の間の５０％以上の同一性は、機能的等価物であることを示すとみなされる。タンパク質間の同一性は、好ましくは、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）において、ギャップオープンペナルティー＝１２、ギャップエクステンションペナルティー＝１のパラメータのアフィンギャップ検索を用いて実行される、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。
【００９７】
本発明はさらに、配列番号３３、３４、３５、３６、３７、３８、および３９の１つ以上のフラグメントを含むタンパク質を提供する。このフラグメントは、この配列由来の少なくともｑ個の連続するアミノ酸を含むべきであり、そして特定の配列に依存して、ｑは７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上）である。好ましくは、このフラグメントは、この配列由来の１つ以上のエピトープを含む。
【００９８】
本発明はまた、本発明のこれらのタンパク質をコードする核酸を提供する。
【００９９】
（ＮａｄＡの対立遺伝子）
本発明は、配列番号１〜１４のうちの１つ以上のアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。
【０１００】
本発明はまた、配列番号１〜１４のうちの１つ以上に少なくともｘ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。ｘの値は、少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれ以上）である。これらのタンパク質としては、ホモログ、オルソログ、対立遺伝子改変体、および機能的変異体が挙げられる。
【０１０１】
本発明により使用するためのＮａｄＡの好ましい対立遺伝子は、配列番号３（または配列番号６）である。
【０１０２】
本発明はまた、配列番号１〜１４のうちの１つ以上のフラグメントを含むタンパク質を提供する。これらは、配列番号１〜１４のうちの１つ以上由来の少なくともｎ個の連続するヌクレオチドを含むべきであり、ここで、ｎは６以上（例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、またはそれ以上）である。このフラグメントは、配列番号１〜１４に共通の配列を含み得るか、または配列番号１〜１４に共通しない配列を含み得る。
【０１０３】
好ましいフラグメントは、配列番号１〜１４由来の１つ以上のエピトープを含む。他の好ましいフラグメントは、（ａ）配列番号１〜１４のＮ末端リーダーペプチド、（ｂ）ｋ
個のＮ末端アミノ酸残基を有さない配列番号１〜１４（ｋは１以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０など）である）、および（ｃ）ｌ個のＣ末端アミノ酸残基を有さない配列番号１〜１４（ｌは１以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０など）である）である。好ましいフラグメントは、（ｂ）または（ｃ）の両方に含まれる（すなわち、Ｃ末端およびＮ末端の両方での短縮物）。
【０１０４】
分類（ｂ）内の好ましいフラグメントは、Ｎ末端リーダーペプチドを欠く。従って、配列番号１、２、３、７、９、１１、および１３については、ｋの値は２３であり；配列番号４、５、６、８、１０、１２については、ｋの値は２５である。リーダーペプチドは、別のタンパク質によってか（すなわち、融合タンパク質を形成するため）または代替のＮ末端配列によって、別のタンパク質由来のリーダーペプチドと置換され得、効果的な発現がもたらされる。
【０１０５】
分類（ｃ）内の好ましいフラグメントは、Ｃ末端膜アンカーを欠く。従って、ｌの値は、５４である。このＣ末端欠失の小改変体が使用され得る（例えば、ｌは、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６）。
【０１０６】
Ｎ末端配列ＭＫＨまたはＭＱＨを有するタンパク質は、Ｎ末端配列ＭＳＭを有するタンパク質よりも好ましい。
【０１０７】
本発明のタンパク質は、７価配列（ＡＡ１ＡＡ２ＡＡ３ＡＡ４ＡＡ５ＡＡ６ＡＡ７）を含み得る。ここで、ＡＡ１はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、またはＭｅｔであり；ＡＡ２ＡＡ３ＡＡ４ＡＡ５ＡＡ６およびＡＡ７の各々は、独立して、任意のアミノ酸であり得；ｒは１以上の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）である。ｒが２以上である場合、各ＡＡ１ＡＡ２ＡＡ３ＡＡ４ＡＡ５ＡＡ６およびＡＡ７の意味は、ｒ個の７価反復の各々において同じであっても異なってもよい。この７価は、ロイシンジッパードメインを形成し得る。
【０１０８】
本発明のタンパク質は、多くの方法において（例えば、化学合成（少なくとも一部）によって、プロテアーゼを用いてより長いポリペプチドを消化することによって、ＲＮＡからの翻訳によって、細胞培養物から（例えば、組換え発現から）の精製によって、生物自体から（例えば、前立腺組織からの単離）の精製によって、細胞株供給源からの精製によって）調製され得る。
【０１０９】
本発明のタンパク質は、種々の形態（例えば、ネイティブ、融合、グリコシル化、非グリコシル化、リピド化、非リピド化など）において調製され得る。
【０１１０】
このタンパク質は、好ましくは、オリゴマー形態である。
【０１１１】
本発明のタンパク質は、固体支持体に結合または固定化され得る。
【０１１２】
本発明のタンパク質は、検出可能な標識（例えば、放射性標識、蛍光標識、またはビオチン標識）を含み得る。これは特に、免疫アッセイ技術において有用である。本発明のタンパク質は、好ましくは、単離された形態かまたは実質的に単離された形態である。
【０１１３】
一般的に、本発明のタンパク質は、天然で存在しない環境で提供される。例えば、それらは、それらの天然で存在する環境から分離される。特定の実施形態において、本発明の
タンパク質は、コントロールと比較してタンパク質に関して濃縮された組成物中に存在する。このように、精製されたタンパク質が提供され、それ故に、精製は、そのタンパク質が、他の発現タンパク質を実質的に含まない組成物中に存在することを意味し、実質的に含まないは、その組成物の９０％未満、通常６０％未満、およびより通常５０％未満が、他の発現タンパク質で構成されることを意味する。
【０１１４】
用語「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸ポリマーをいう。このポリマーは、直鎖状であっても分枝状であってもよく、改変アミノ酸を含み得、そして非アミノ酸によって割り込まれ得る。この用語はまた、天然で改変されたかまたは介入（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、リピド化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識要素との結合））によって改変されたアミノ酸ポリマーを包含する。例えば、１つ以上のアミノ酸のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを含む）および当該分野で公知の他の改変を含むタンパク質もまた、この定義の中に含まれる。タンパク質は、一本鎖または連結鎖として生じ得る。
【０１１５】
変異は、アミノ酸置換、付加、または欠失を含み得る。アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換または非必須アミノ酸を排除する置換（例えば、グリコシル化部位、リン酸化部位、もしくはアセチル化部位を改変するため、または機能に必要とされない１つ以上のシステイン残基の置換または欠失によるミスフォールディングを最小限に抑えるため）であり得る。保存的アミノ酸置換は、全体的な電荷、疎水性／親水性、および／または置換されたアミノ酸の立体的な量を保存する置換である。改変体は、このポリペプチドの特定の領域（例えば、機能的ドメインおよび／または、ポリペプチドがポリペプチドファミリーのメンバーである場合、コンセンサス配列に関連する領域）の増強された生物学的活性を保持するかまたは有するように設計され得る。改変体の生成のためのアミノ酸変更の選択は、アミノ酸のアクセシビリティ（内側 対 外側）、改変対ポリペプチドの熱安定性、所望のジスルフィド架橋、所望の金属結合部位などに基づき得る。
【０１１６】
本発明はまた、上記のような本発明のタンパク質をコードする核酸を提供する。本発明はまた、この核酸由来の少なくともｎ個の連続するヌクレオチドのフラグメントを含む核酸を提供する。ここで、ｎは１０以上（例えば、１２、１４、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００またはそれ以上）である。
【０１１７】
さらに、本発明は、好ましくは、「高ストリンジェンシー」条件下（例えば、０．１×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ溶液中で６５℃）で、本発明のタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズし得る核酸を提供する。
【０１１８】
本発明の核酸は、ハイブリダイゼーション反応（例えば、ノザンブロットもしくはサザンブロット、または核酸マイクロアレイもしくは「遺伝子チップ」）において、および増幅反応（例えば、ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＳＳＳＲ、ＬＣＲ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡなど）ならびに他の核酸技術において使用され得る。
【０１１９】
本発明の核酸は、多くの方法（例えば、全体または一部が化学合成によって、ヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）を用いてより長いポリヌクレオチドを消化することによって、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、細菌自体から、などで）調製され得る。
【０１２０】
本発明の核酸は、種々の形態（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プライマー、プローブ、標識化、非標識化など）をとり得る。
【０１２１】
本発明の核酸は、好ましくは、単離された形態または実質的に単離された形態である。
【０１２２】
本発明は、例えば、アンチセンスもしくはプロービングのために、またはプライマーとしての使用のために、上記の配列に相補的な配列を含む核酸を含む。
【０１２３】
用語「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡ、またそれらのアナログ（例えば、改変された骨格を有するアナログ）、またペプチド核酸（ＰＮＡ）などを含む。
【０１２４】
本発明に従う核酸は、例えば、放射性標識または蛍光標識で標識され得る。これは特に、核酸が、核酸検出技術において使用される場合（例えば、核酸が、ＰＣＲ、ＬＣＲ，ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡなどのような技術において使用するためのプライマーまたはプローブである場合）に有用である。
【０１２５】
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列を含むベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター（例えば、核酸免疫に適したベクター））およびこのようなベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【０１２６】
（免疫）
本発明は、（ａ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ＮａｄＡタンパク質および／または（ｂ）ＮａｄＡタンパク質をコードする核酸を含む免疫原性組成物を提供する。
【０１２７】
本発明はまた、哺乳動物において抗体応答を誘導する方法を提供する。この方法は、本発明の免疫原性組成物を哺乳動物に投与する工程を包含する。この抗体応答は、好ましくは、防御抗体応答である。この防御抗体は、好ましくは、上皮細胞へのＮａｄＡおよび／またはＡｐｐの結合をブロックする。
【０１２８】
本発明はまた、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ感染に対して哺乳動物を保護する方法を提供する。この方法は、本発明の免疫原性組成物を哺乳動物に投与する工程を包含する。
【０１２９】
本発明はまた、医薬として使用するためのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ＮａｄＡタンパク質を提供する。
【０１３０】
本発明はまた、哺乳動物においてＮｅｉｓｓｅｒｉａ感染を防止するための医薬の製造におけるＮａｄＡタンパク質の使用を提供する。
【０１３１】
本発明はまた、哺乳動物においてＮｅｉｓｓｅｒｉａ感染を防止するための医薬の製造におけるＮａｄＡタンパク質をコードする核酸の使用を提供する。
【０１３２】
哺乳動物は、好ましくは、ヒトである。ヒトは、成人であり得、または好ましくは、子供であり得る。
【０１３３】
ＮａｄＡタンパク質は、好ましくは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ＮａｄＡである。これは、好ましくは、配列番号１〜１４の１つ以上のアミノ酸配列、またはそれらに対する配列同一性を有するかもしくはそれらのフラグメントを含むアミノ酸配列を含む（上記を参照のこと）。ＮａｄＡタンパク質は、好ましくは、オリゴマー形態（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、またはそれ以上）である。配列番号１〜１４のうち、配列番号１〜１２が好ましい。なぜならば、これらのＮａｄＡタンパク質に対する抗体は、種々の超ビルレントな対立遺伝子に対して殺菌性であるからである。しかし、非超ビルレントＮａｄＡ＋株に対する免疫応答が所望される場合、配列番号１３または１４が好ましい。当然、ＮａｄＡ混合物もまた、可能であり、特に１つより多いＮａｄＡ対立遺伝子を含
む混合物が可能である。
【０１３４】
本発明の免疫原性組成物は、治療的（すなわち、既存の感染を処置するため）または予防的（すなわち、将来の感染を防ぐため）に使用され得る。
【０１３５】
本発明の使用および方法は、特に、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（血清群Ａ、ＢおよびＣを含む）の感染に対する処置／防御のために有用である。本発明の使用および方法は、特に、ハイパービルレント（ｈｙｐｅｒｖｉｒｕｌｅｎｔ）系統であるＥＴ−５、ＥＴ−３７およびクラスターＡ４由来のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの株に対して有用である。
【０１３６】
この使用および方法は、特に、髄膜炎（特に、細菌性髄膜炎）および菌血症を含むがこれらに限定されない疾患を予防／処置するために有用である。
【０１３７】
治療的処置の効力は、本発明の組成物の投与後にＮｅｉｓｓｅｒｉａ感染をモニタリングすることによって試験され得る。予防的処置の効力は、この組成物の投与後にＮａｄＡに対する免疫応答をモニタリングすることによって試験され得る。
【０１３８】
本発明の組成物はさらに、哺乳動物に対して投与された場合に、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの系統ＩＩＩの株に対して防御的である免疫応答を誘発する抗原を含み得る。
【０１３９】
本発明の組成物は一般に、患者に対して直接的に投与される。直接的な送達は、非経口注射（例えば、皮下的、腹腔内、静脈内、筋内、または組織の間隙腔に）によってか、または直腸投与、経口投与、経膣投与、局所的投与、経皮投与、鼻腔内投与、眼内投与、経耳投与、または肺投与によって、達成され得る。
【０１４０】
本発明は、全身性免疫および／または粘膜性免疫を誘発するために使用され得る。
【０１４１】
投薬処置は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールであり得る。
【０１４２】
本発明の免疫原性組成物は、一般に、薬学的に受容可能なキャリアを含む。薬学的に受容可能なキャリアは、それ自体ではこの組成物を受容する患者に対して有害な抗体の産生を誘導せず、かつ過度な毒性を伴わずに投与され得る任意の物質であり得る。適切なキャリアは、タンパク質、ポリサッカリド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒子のような、大きく緩徐に代謝される高分子であり得る。このようなキャリアは、当業者に周知である。薬学的に受容可能なキャリアとしては、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールのような液体が挙げられ得る。湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などのような補助物質もまた、このようなビヒクル中に存在し得る。リポソームは適切なキャリアである。薬学的なキャリアに関する全体的な考察は、Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ．第２０版，ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２において利用可能である。
【０１４３】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａの感染は身体の種々の領域に影響を及ぼす。そのため、本発明の組成物は、種々の形態で調製され得る。例えば、この組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、注射可能なように調製され得る。注射前の液体ビヒクルにおける溶液または懸濁液に適切な固体形態もまた調製され得る。この組成物は、例えば、軟膏、クリーム、粉末として、局所的投与のために調製され得る。この組成物は、例えば、錠剤もしくはカプセル剤としてか、またはシロップ剤（必要に応じて、風味付けされる）として、経口投与のために調製される。この組成物は、微粉末または噴霧を使用して、吸入剤として、
肺投与のために調製され得る。この組成物は、坐剤または腟坐薬として調製され得る。この組成物は、例えば、液滴剤として、鼻腔内投与、経耳投与または眼内投与のために調製され得る。
【０１４４】
この組成物は、好ましくは、無菌である。この組成物は、好ましくは、発熱物質を含まない。この組成物は、好ましくは、例えば、ｐＨ６とｐＨ８との間に、一般的には、約ｐＨ７に緩衝化される。
【０１４５】
免疫原性組成物は、免疫学的に有効な量の免疫原、および必要に応じて、任意の他の特定成分を含む。「免疫学的に有効な量」とは、単回用量または一連のもののなかの部分のいずれかにおいて、個体にその量を投与することが処置または予防のために有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康状態および身体状態、処置される個体の年齢、分類学的群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類、など）、その個体の免疫系が抗体を合成する能力、所望される防御の程度、ワクチンの処方、医学的状態に関する処置医の評価、および他の関連の要因に依存して変動する。この量は、慣用的な試験を通して決定され得る比較的広い範囲内にあると予期される。投薬処置は、単回投与スケジュールであっても、複数回投与スケジュール（例えば、ブースター投与を含む）であってもよい。この組成物は、他の免疫調節剤と組合せて投与され得る。
【０１４６】
この免疫原性組成物は、アジュバントを含み得る。組成物の効力を増強するための好ましいアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（Ａ）アルミニウム化合物（例えば、オキシ水酸化物のような水酸化アルミニウム、またはヒドロキシホスフェートまたはオルトホスフェートのようなリン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）、または異なるアルミニウム化合物の混合物であって、これらの化合物は任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶、アモルファスなど）をとり、そして吸収性が好ましい；（Ｂ）ＭＦ５９（５％スクアレン（Ｓｑｕａｌｅｎｅ）、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５、これはマイクロフルイダイザーを使用して、サブミクロンの粒子に処方される）；（Ｃ）リポソーム；（Ｄ）ＩＳＣＯＭ、これは、さらなる界面活性剤を欠き得る；（Ｅ）ＳＡＦ、これは１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニック−ブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含み、サブミクロンのエマルジョンに微小流動化されるか、またはより大きな粒子サイズのエマルジョンを生成するためにボルテックスされるかのいずれかである；（Ｆ）ＲｉｂｉＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）、これは、２％スクアレンと、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０と、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ｄｉｍｙｃｏｌａｔｅ）（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群由来の１つ以上の細菌細胞壁成分（好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ））とを含む；（Ｇ）サポニンアジュバント（例えば、ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１（ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭとしても公知））；（Ｈ）キトサン；（Ｉ）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（Ｊ）サイトカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＥＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、腫瘍壊死因子など；（Ｋ）微小粒子（すなわち、約１００ｎｍ〜約１５０μｍの直径、より好ましくは、約２００ｎｍ〜約３０μｍの直径、そして最も好ましくは、約５００ｎｍ〜約１０μｍの直径の粒子）、これは、生分解性かつ無毒性の物質（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）から形成される；（Ｌ）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−デアシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）；（Ｍ）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油エマルジョンとの組合せ；（Ｎ）ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（すなわち、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含む）であって、必要に応じて、５−メチルシトシンが、シトシンの代わりに使用される；（Ｏ）ポリオキ
シエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル；（Ｐ）オクトキシノールと組合せたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤、または少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤（例えば、オクトキシノール）と組合せたポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤もしくはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤；（Ｑ）免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）およびサポニン；（Ｒ）免疫刺激物質および金属塩の粒子；（Ｓ）サポニンおよび水中油エマルジョン；（Ｔ）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて、＋ステロール）；（Ｕ）Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン（「ＬＴ」）、またはその解毒された変異体（例えば、Ｋ６３変異体またはＲ７２変異体）；（Ｖ）コレラ毒素（「ＣＴ」）、またはその解毒された変異体；（Ｗ）微小粒子（すなわち、約１００ｎｍ〜約１５０μｍの直径、より好ましくは、約２００ｎｍ〜約３０μｍの直径、そして最も好ましくは、約５００ｎｍ〜約１０μｍの直径の粒子）、これは、生分解性かつ無毒性の物質（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）（例えば、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド））、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）から形成される；ならびに（Ｘ）この組成物の効力を増強するための免疫刺激剤として作用する他の物質。アルミニウム塩（リン酸アルミニウム、そして特に、ヒドロキシホスフェート、および／または水酸化物および特にオキシ水酸化物）およびＭＦ５９が、非経口的免疫化のための好ましいアジュバントである。毒素変異体は、好ましい粘膜性アジュバントである。
【０１４７】
ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）などが挙げられる。
【０１４８】
本発明の組成物は、ＮａｄＡの他に、抗原（例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓまたは他の生物に対する防御抗原）を含み得る（例えば、ＤＴＰ抗原、Ｈｉｂ抗原など）。
【０１４９】
本発明の免疫原性組成物は、治療的（すなわち、既存の感染を処置するため）または予防的（すなわち、将来の感染を防ぐため）に使用され得る。治療的な免疫化は特に、免疫無防備状態の被験体においてＣａｎｄｉｄａ感染を処置するために有用である。
【０１５０】
本発明の免疫原性組成物においてタンパク質抗原を使用する代わりとして、この抗原をコードする核酸（好ましくは、ＤＮＡ（例えば、プラスミド形態にある））が使用され得る。
・本発明はさらに、以下を提供し得る：
・（項目１） 配列番号１〜配列番号１４のうちの１つ以上のアミノ酸配列を含むタンパク質。
・（項目２） 配列番号１〜配列番号１４のうちの１つ以上に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
・（項目３） 配列番号１〜配列番号１４のうちの１つ以上のフラグメントを含むタンパク質。
・（項目４） 項目１、項目２、または項目３に記載のタンパク質であって、該タンパク質は、ヘプタッド配列（ＡＡ１ＡＡ２ＡＡ３ＡＡ４ＡＡ５ＡＡ６ＡＡ７）ｒを含み、ここで：ＡＡ１は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＭｅｔであり：ＡＡ２ＡＡ３ＡＡ４ＡＡ５ＡＡ６およびＡＡ７の各々は、独立して、任意のアミノ酸であり得；そしてｒは、１以上の整数である、タンパク質。
・（項目５） 配列番号３のアミノ酸２４〜アミノ酸３５１を含む、項目３に記載のタンパク質。
・（項目６） 項目１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸。
・（項目７） （ａ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ＮａｄＡタンパク質および／または（ｂ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ＮａｄＡタンパク質をコードする核酸を含む、免疫原性組成物。
・（項目８） 哺乳動物における抗体応答を惹起するための方法であって、該哺乳動物に、項目７に記載の免疫原性組成物を投与する工程を包含する、方法。
・（項目９） 哺乳動物を、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ感染から保護するための方法であって、
該哺乳動物に、項目７に記載の免疫原性組成物を投与する工程
を包含する、方法。
・（項目１０） 哺乳動物におけるＮｅｉｓｓｅｒｉａ感染を予防するための医薬の製造における、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ＮａｄＡタンパク質、またはＮａｄＡタンパク質をコードする核酸の使用。
・（項目１１） 医薬としての使用のための、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ＮａｄＡタンパク質、またはＮａｄＡタンパク質をコードする核酸。
・（項目１２） 項目８〜１１のいずれか１項に記載の方法、使用、またはタンパク質であって、ここで、前記ＮａｄＡタンパク質が、配列番号１〜配列番号１２のうち１つ以上のアミノ酸配列を含む、方法、使用、またはタンパク質。
・（項目１３） 項目８〜１２のいずれか１項に記載の方法、使用、またはタンパク質であって、ここで、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ感染が、高ビルレント系統であるＥＴ−５、ＥＹ−３７およびクラスターＡ４由来のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの感染である、方法、使用、またはタンパク質。
・（項目１４） 項目７に記載の組成物であって、該組成物は、
哺乳動物に投与されたときに、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの系統ＩＩＩ株に対して保護する免疫応答を誘発する抗原、
をさらに含む、組成物。
・（項目１５） プロセシングされたＡｐｐタンパク質を精製するための方法であって、該方法は、以下の工程：
非Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ宿主細胞においてＡｐｐタンパク質をコードする遺伝子を発現させる工程；および
培養培地から、プロセシングされたＡｐｐタンパク質を精製する工程、
を包含する、方法。
・（項目１６） 前記非Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉである、項目１５に記載の方法。
・（項目１７） 項目１５または項目１６に記載のプロセスにより得られる、精製されたタンパク質。
・（項目１８） 上皮細胞へのＮｅｉｓｓｅｒｉａ細胞の付着を予防するための方法であって、ここで、該上皮細胞にＡｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡのうち１つ以上が結合する能力が、ブロックされる、方法。
・（項目１９） 前記結合が、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡに特異的な抗体を用いてブロックされる、項目１８に記載の方法。
・（項目２０） 上皮細胞へのＮｅｉｓｓｅｒｉａ細胞の付着を予防するための方法であって、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡのうち１つ以上からのタンパク質発現が阻害される、方法。
・（項目２１） 発現が、アンチセンス技術を用いて阻害される、項目２０に記載の方法。
・（項目２２） 核酸であって、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０またはＮａｄＡをコードする核酸由来のｘ個以上のヌクレオチドのフラグメントを含み、ここで、ｘが少なくとも８である、核酸。
・（項目２３） 項目２２に記載の核酸であって、該核酸は、式５’−（Ｎ）ａ−（Ｘ）−（Ｎ）ｂ−３’を有し、ここで０＞ａ＞１５であり、０＞ｂ＞１５であり、Ｎは任意のヌクレオチドであり、そしてＸは、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０またはＮａｄＡをコードする核酸
由来の少なくとも８個連続するヌクレオチドのフラグメントである、核酸。
・（項目２４） Ａｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡのうちの１つ以上がノックアウトされている、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細菌。
・（項目２５） 上皮細胞へのＮｅｉｓｓｅｒｉａ細胞の付着を予防するための方法であって、ここで、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡのうち１つ以上が、変異を有し、該変異が、その活性を阻害する、方法。
・（項目２６） 変異タンパク質であって、ここで、該変異タンパク質が、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０および／もしくはＮａｄＡのアミノ酸配列、またはそれらのフラグメントを含むが、ここで、該アミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸が、変異している、変異タンパク質。
・（項目２７） 項目２６に記載の変異タンパク質をコードする、核酸。
・（項目２８） 項目２７に記載の核酸を産生する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）Ａｐｐ、ＯＲＦ４０またはＮａｄＡをコードする供給源核酸を提供する工程；および
（ｂ）変異タンパク質をコードする核酸を提供するために該供給源核酸の変異誘発を実施する工程、
を包含する方法。
・（項目２９） 上皮細胞へのＮｅｉｓｓｅｒｉａ細胞の結合を阻害する化合物についてスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）Ａｐｐタンパク質、ＯＲＦ４０タンパク質および／またはＮａｄＡタンパク質を、上皮細胞および試験化合物と共にインキュベートする工程；
（ｂ）該タンパク質と該上皮細胞との間の相互作用が阻害されたか否かを決定するために、該混合物を試験する工程、
を包含する、方法。
・（項目３０） 項目２９に記載の方法を用いて同定される、化合物。
・（項目３１） Ａｐｐおよび／またはＯＲＦ４０（および必要に応じて、ＮａｄＡ）を発現するＥ．ｃｏｌｉ細菌ならびに（ｂ）上皮細胞を含む、組成物。
・（項目３２） 非Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ宿主細胞由来の外膜小胞（ＯＭＶ）を調製するための方法であって、該方法は、該細胞がＡｐｐタンパク質、ＯＲＦ４０タンパク質またはＮａｄＡタンパク質をコードする遺伝子を発現することにおいて特徴付けられる、方法。・（項目３３） 非Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ宿主細胞由来のＯＭＶを調製するための方法であって、該方法は、該細胞が、以下のタンパク質：
（Ａ）ＷＯ９９／２４５７８からの偶数の配列番号２〜配列番号８９２；
（Ｂ）ＷＯ９９／３６５４４からの偶数の配列番号２〜配列番号９０；
（Ｃ）ＷＯ９９／５７２８０からの偶数の配列番号２〜配列番号３０２０；
（Ｄ）ＷＯ９９／５７２８０からの偶数の配列番号３０４０〜配列番号３１１４；
（Ｅ）ＷＯ９９／５７２８０からの配列番号３１１５〜配列番号３２４１；
（Ｆ）Ｔｅｔｔｅｌｉｎら（上記）からの２１６０種のタンパク質、ＮＭＢ０００１〜ＮＭＢ２１６０；
（Ｇ）（Ａ）〜（Ｆ）のうち１つ以上のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｈ）（Ａ）〜（Ｆ）のうち１つ以上のアミノ酸配列と配列同一性を共有するタンパク質；および
（Ｉ）（Ａ）〜（Ｆ）のうち１つ以上のフラグメントを含むタンパク質
のうち１つ以上のコードする遺伝子を発現することにおいて特徴付けられる、方法。
・（項目３４） 非Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細胞がＥ．ｃｏｌｉである、項目３２または項目３３に記載の方法。
・（項目３５） 前記項目３２、項目３３、または項目３４に記載のプロセスにより得られ得るＯＭＶ。
・（項目３６） 非Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ宿主細胞由来の外膜小胞であって、該外膜小胞は、該細胞がＡｐｐタンパク質、ＯＲＦ４０タンパク質またはＮａｄＡタンパク質をコード
する遺伝子を発現することにおいて特徴付けられる、外膜小胞。
・（項目３７） 非Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ宿主細胞由来の外膜小胞であって、該細胞が、項目３３に記載のタンパク質（Ａ）〜タンパク質（Ｉ）のうち１つ以上をコードする遺伝子を発現することにおいて特徴付けられる、外膜小胞。
・（項目３８） Ａｐｐのアミノ酸配列を含むタンパク質であって、Ａｓｐ−１５８、Ｈｉｓ−１１５および／またはＳｅｒ−２６７のアミノ酸が変異しているものを除く、タンパク質。
・（項目３９） Ｓｅｒ−２６７、Ａｓｐ−１５８またはＨｉｓ−１１５が１９種類の他の天然に存在するアミノ酸のうち１つで置換されている、項目３８のタンパク質。
・（項目４０） Ａｐｐのアミノ酸配列を含むタンパク質であって、Ｓｅｒ−１０６４とＡｒｇ−１１７１との間の１つ以上のアミノ酸が変異しているものを除く、タンパク質。・（項目４１） 前記変異が、欠失、挿入、短縮または置換である、項目４０に記載のタンパク質。
・（項目４２） 項目４０または項目４１に記載のタンパク質であって、変異している残基が、Ｓ−１０６４、Ｄ−１０６５、Ｋ−１０６６、Ｌ−１０６７、Ｇ−１０６８、Ｋ−１０６９、Ａ−１０７０、Ｅ−１０７１、Ａ−１０７２、Ｋ−１０７３、Ｋ−１０７４、Ｑ−１０７５、Ａ−１０７６、Ｅ−１０７７、Ｋ−１０７８、Ｄ−１０７９、Ｎ−１０８０、Ａ−１０８１、Ｑ−１０８２、Ｓ−１０８３、Ｌ−１０８４、Ｄ−１０８５、Ａ−１０８６、Ｌ−１０８７、Ｉ−１０８８、Ａ−１０８９、Ａ−１０９０、Ｇ−１０９１、Ｒ−１０９２、Ｄ−１０９３、Ａ−１０９４、Ｖ−１０９５、Ｅ−１０９６、Ｋ−１０９７、Ｔ−１０９８、Ｅ−１０９９、Ｓ−１１００、Ｖ−１１０１、Ａ−１１０２、Ｅ−１１０３、Ｐ−１１０４、Ａ−１１０５、Ｒ−１１０６、Ｑ−１１０７、Ａ−１１０８、Ｇ−１１０９、Ｇ−１１１０、Ｅ−１１１１、Ｎ−１１１２、Ｖ−１１１３、Ｇ−１１１４、Ｉ−１１１５、Ｍ−１１１６、Ｑ−１１１７、Ａ−１１１８、Ｅ−１１１９、Ｅ−１１２０、Ｅ−１１２１、Ｋ−１１２２、Ｋ−１１２３、Ｒ−１１２４、Ｖ−１１２５、Ｑ−１１２６、Ａ−１１２７、Ｄ−１１２８、Ｋ−１１２９、Ｄ−１１３０、Ｔ−１１３１、Ａ−１１３２、Ｌ−１１３３、Ａ−１１３４、Ｋ−１１３５、Ｑ−１１３６、Ｒ−１１３７、Ｅ−１１３８、Ａ−１１３９、Ｅ−１１４０、Ｔ−１１４１、Ｒ−１１４２、Ｐ−１１４３、Ａ−１１４４、Ｔ−１１４５、Ｔ−１１４６、Ａ−１１４７、Ｆ−１１４８、Ｐ−１１４９、Ｒ−１１５０、Ａ−１１５１、Ｒ−１１５２、Ｒ−１１５３、Ａ−１１５４、Ｒ−１１５５、Ｒ−１１５６、Ｄ−１１５７、Ｌ−１１５８、Ｌ−１１５９、Ｑ−１１６０、Ｌ−１１６１、Ｑ−１１６２、Ｐ−１１６３、Ｑ−１１６４、Ｐ−１１６５、Ｑ−１１６６、Ｐ−１１６７、Ｑ−１１６８、Ｐ−１１６９、Ｑ−１１７０および／またはＲ−１１７１である、タンパク質。
・（項目４３） Ａｐｐのアミノ酸配列を含むタンパク質であって、Ｐｈｅ−９５６、Ａｓｎ−９５７、Ａｌａ−１１７８およびＡｓｎ−１１７９（本明細書中に記載の配列番号３２に従って番号付けられている）のうちの１つ以上のアミノ酸が変異しているものを除く、タンパク質。
・（項目４４） 前記変異が、欠失、挿入、短縮または置換である、項目４３に記載のタンパク質。
・（項目４５） プロセシングされたＡｐｐのアミノ酸配列を含むタンパク質であって、ここで、該プロセシングされたＡｐｐが、全長Ａｐｐ中の自己タンパク溶解切断部位の下流にあるＣ末端ドメインを含まない、タンパク質。
・（項目４６） 配列番号３３〜配列番号３６のうち１つ以上を含む、項目４５に記載のタンパク質。
・（項目４７） プロセシングされたＡｐｐのアミノ酸配列を含むタンパク質であって、ここで、該プロセシングされたＡｐｐのＣ末端がＰｈｅ−９５６（本明細書中に記載の配列番号３２に従って番号付けられている）である、タンパク質。
・（項目４８） プロセシングされたＡｐｐのアミノ酸配列を含むタンパク質であって、ここで、該プロセシングされたＡｐｐのＣ末端がＡｌａ−１１７８（本明細書中に記載の
配列番号３２に従って番号付けられている）である、タンパク質。
・（項目４９） 配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、および配列番号３９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
・（項目５０） 配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、および配列番号３９のうち１つ以上に対して、少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、タンパク質。
・（項目５１） 配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、および配列番号３９のうち１つ以上のフラグメントを含む、タンパク質。
・（項目５２） 項目３８〜５１のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする核酸。・（項目５３） 項目５２に記載の核酸を生成するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）Ａｐｐ、ＯＲＦ４０またはＮａｄＡをコードする供給源核酸を提供する工程、および
（ｂ）該供給源核酸上で変異誘発を実施して、項目３８〜５１のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする核酸を提供する工程、
を包含する、方法。
【０１５１】
（ディスクレイマー）
本発明は、好ましくは、以下を排除する：（ａ）２００２年７月２６日より前、より好ましくは、２００１年７月２７日より前に、公的配列データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋまたはＧＥＮＥＳＥＱ）において利用可能であったアミノ酸配列および核酸配列；（ｂ）２００２年７月２６日より前、より好ましくは、２００１年７月２７日より前の出願日、または適用可能な場合には優先日、を有する特許出願に開示されたアミノ酸配列および核酸配列。特に、以下の特許出願における配列番号の実体が排除され得る：ＷＯ９９／２４５７８；ＷＯ９９／３６５４４；ＷＯ９９／５７２８０；ＷＯ００／２２４３０；ＷＯ００／６６７４１；ＷＯ００／６６７９１；ＷＯ００／７１５７４；ＷＯ００／７１７２５；ＷＯ０１／０４３１６；ＷＯ０１／３１０１９；ＷＯ０１／３７８６３；ＷＯ０１／３８３５０；ＷＯ０１／５２８８５；ＷＯ０１／６４９２０；ＷＯ０１／６４９２２。
【０１５２】
（定義）
用語「含む」は、「含有する」および「構成される」を意味し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、排他的にＸからなり得るか、またはさらなる何かを含み得る（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】図１は、ＯＲＦ４０についての発現データを示す。
【図２】図２は、Ａｐｐについての発現データを示す。
【図３】図３は、ＮａｄＡについての発現データを示す。
【図４】図４は、ヒト細胞に対する接着に関与するタンパク質のＦＡＣＳ分析を示す。図４において、データは、左側から右側に、ＯＲＦ４０（黒三角）、Ａｐｐ（黒丸）、ＮａｄＡ（黒菱形）、およびＧＮＡ２１３２（黒四角）についてである。
【図５】図５は、ヒト細胞に対する接着に関与するタンパク質のＦＡＣＳ分析を示す。図５において、データは、左側から右側に、ＯＲＦ４０（黒三角）、Ａｐｐ（黒丸）、ＮａｄＡ（黒菱形）、およびＧＮＡ２１３２（黒四角）についてである。
【図６】図６は、ヒト細胞に対する接着に関与するタンパク質のＦＡＣＳ分析を示す。図６において、データは、左側から右側に、ＯＲＦ４０（黒三角）、Ａｐｐ（黒丸）、ＮａｄＡ（黒菱形）、およびＧＮＡ２１３２（黒四角）についてである。
【図７】図７は、ＯＲＦ４０の相同性を示す。
【図８】図８は、Ａｐｐの相同性を示す。
【図９Ａ】図９は、ＮａｄＡ対立遺伝子のアラインメントを示す。
【図９Ｂ】図９は、ＮａｄＡ対立遺伝子のアラインメントを示す。
【図９Ｃ】図９は、ＮａｄＡ対立遺伝子のアラインメントを示す。
【図１０】図１０は、対立遺伝子１〜３の関係を示す。
【図１１】図１１は、ＮａｄＡについて推定される二次構造を示す。
【図１２】図１２は、ＮａｄＡの上流および下流の配列に関する分析を示す。
【図１３】図１３は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの異なる株におけるＮａｄＡの発現に関するＰＣＲ分析を示す。
【図１４】図１４は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの異なる株におけるＮａｄＡの発現に関するイムノブロット分析を示す。
【図１５】図１５は、培養時間に伴うＮａｄＡ発現の変化を示す。
【図１６】図１６は、同系カプセル化および非同系カプセル化されたＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ細胞のＮａｄＡ ＦＡＣＳを示す。
【図１７】図１７は、Ｃｈａｎｇ細胞（１７Ａ〜１７Ｃ）またはＨｅＬａ細胞（１７Ｄ）に対する抗ＮａｄＡを使用して得られた免疫蛍光の結果を示す。
【図１８】図１８は、（Ａ）３７℃または（Ｂ）４℃でのインキュベーション後に、Ｃｈａｎｇ細胞に対する抗ＮａｄＡを使用して得られた免疫蛍光の結果を示す。
【図１９】図１９は、サポニンで処理されたＣｈａｎｇ細胞ついての免疫蛍光の結果を示す。
【図２０】図２０は、単球を使用して得られた免疫蛍光の結果を示す。
【図２１】図２１は、マクロファージを使用して得られた免疫蛍光の結果を示す。
【図２２】図２２は、ＮａｄＡ処理に応答した単球によるＩＬ−αの分泌を示す。
【図２３】図２３は、単球によるＩＬ−αの分泌に対する抗ＣＤ１４の効果を示す。
【図２４】図２４は、ＮａｄＡを発現するように形質転換されたＥ．ｃｏｌｉに対して抗ＮａｄＡを使用して得られた免疫蛍光の結果を示す。
【図２５】図２５は、（Ａ）抗ＮａｄＡ、（Ｂ）抗Ｅ．ｃｏｌｉまたは（Ｃ）両方を使用して形質転換されたＥ．ｃｏｌｉの染色を示す。
【図２６】図２６は、Ａｐｐの特徴に関する模式図である。Ｎ末端のリーダーペプチド、パッセンジャードメインおよびＣ末端のβドメインが示される。セリンプロテアーゼ活性部位、ＡＴＰ／ＧＴＰ結合部位、２つのアルギニンリッチ部位およびプロリンリッチ領域の位置が示される。ボックス１において切断部位を示す。ボックス２において、異なる自己輸送体の既知のタンパク質分解性部位の比較を示し、そしてコンセンサスな特徴を導き出す。矢印は、切断点を同定する；Ｘ＝任意のアミノ酸；ｈｙｄ＝疎水性残基；（Ａ，Ｓ）＝アラニンまたはセリン。
【図２７】図２７は、Ａｐｐを研究するために使用された構築物の模式図である。
【図２８】図２８は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける外膜および細胞外タンパク質のウェスタンブロットを示す。
【図２９】図２９は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける外膜および細胞外タンパク質のＦＡＣＳ分析を示す。
【図３０】図３０は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける外膜および細胞外タンパク質の免疫蛍光を示す。
【図３１】図３１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された全Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質を示す。
【図３２】図３２は、Ａｐｐ−ｈｉｓに対するマウス抗血清を使用した、粗製沈殿された培養上清のイムノブロットを示す。
【図３３】図３３は、Ｅ．ｃｏｌｉに対するウサギ抗血清を使用した、ＦＡＣＳ接着データを示す。接着に対して陽性の細胞のパーセンテージが、蛍光プロフィールのそばに示される。
【図３４】図３４は、細菌性の接着および凝集を示す、免疫蛍光顕微鏡データを示す。
【図３５】図３５は、正味の蛍光強度平均（ＭＦＩ）として表されたＡｐｐ−Ｈｉｓ（黒菱形）、Ａｐｐα−Ｈｉｓ（黒四角）およびＮＭＢ２１３２（黒三角）の濃度依存性結合を示す。
【図３６】図３６は、酵素濃度の漸増を伴う、プロナーゼ（左手の柱）またはホスホリパーゼＡ２（右手の柱）とのプレインキュベーションのＡｐｐ−Ｈｉｓ（１００μｇ／ｍｌ）結合に対する効果を示す。プロナーゼを、０、２５０、５００、１０００μｇ／ｍｌで試験した；ホスホリパーゼＡ２を、０、５０、２００、８００μｇ／ｍｌで試験した。
【図３７】図３７は、種々の異なる細胞に対する、１００、２５または６．２５μｇ／ｍｌでのＡｐｐ−Ｈｉｓタンパク質の細胞結合特異性の比較である。
【図３８】図３８は、野生型またはＡｐｐノックアウトのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ＭＣ５８細菌の結合を示す。
【図３９】図３９は、０．５または０．８のＯＤ６２０ｎｍで収集されたＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ＭＣ５８由来の全溶解産物のウェスタンブロット分析を示す。レーン１および３は、野生型ＭＣ５８を示し、そしてレーン２および４は、Ａｐｐノックアウトを示す。
【図４０】図４０は、図３９と並行した上清のウェスタンブロット分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１５４】
（本発明を実施するための態様）
（ＮａｄＡ相同性）
ＮａｄＡは、（ａ）ビルレンスに関与する非ピリ線毛関連付着因子である腸病原性ＹｅｒｓｉｎｉａのＹａｄＡ［Ｃｏｒｎｅｌｉｓ（１９９８）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１３１５−１３５２］および（ｂ）血清耐性に関与するタンパク質でありかつ防御抗原であるＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓのＵｓｐＡ２［Ｃｈｅｎら（１９９９）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：１３１０−１３１６］に対して相同性を示す。配列類似性は、主に、カルボキシル末端領域に密集している（最後の７０アミノ酸において５６〜６３％同一性）。この領域の外側では、同一性のレベルは２３〜２５％に低下する。
【０１５５】
ＹａｄＡおよびＵｓｐＡ２は、付着因子として同定された［Ｈｏｉｃｚｙｋら（２０００）ＥＭＢＯ Ｊ １９：５９８９−５９９９］。両方のタンパク質は、外膜に固定された、非常に安定で解離の困難な高分子量オリゴマー（１５０〜２００ｋＤａ）を形成する。ＮａｄＡもまた、髄膜炎菌の外膜において非常に安定な高分子量の凝集体を形成することが見出された。
【０１５６】
ＮａｄＡのアミノ酸配列が、分析された［Ｎｉｅｌｓｅｎら（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０：１〜６；ＬｅｖｉｎおよびＧａｒｎｅｒ（１９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９５５：２８３〜２９５；Ｂｅｒｇｅｒら（１９９５）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９２：８２５９〜８２６３；Ｂｏｒｏｎｅｒｇ−Ｂａｕｅｒら（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：２７４０〜２７４６］。二次構造分析が、図１１に示される。球状Ｎ末端および両親媒性Ｃ末端が示され、同様に、リーダーペプチド（ＬＰ）の位置および膜アンカーの位置もまた、示される。カルボキシル末端領域（アミノ酸３１０〜３６２）は、推定両親媒性β構造（黒で示されるβ鎖）および末端芳香族アミノ酸を有し、これらは、外膜アンカードメインの代表的特徴である。アミノ末端領域（アミノ酸２３〜９０）は、明確な二次構造を有さないが、このタンパク質の残りは、主にα−ヘリックスの性向（８４．６％）を有する。この領域中で、残基９０〜１４６および残基１８３〜２８８は、コイルドコイルを形成する高い確率を有する。さらに、残基１２２〜１４３は、７個組反復の「ａ」位置に４つのロイシン残基を
含み（Ｌ−ｘ（６）−Ｌ−ｘ（６）−Ｌ−ｘ（６）−Ｌ）、これらのロイシン残基は、ロイシンジッパードメイン（・・・）を形成し得る。コイルドコイルおよびロイシンジッパー配列の両方が、ダイマー形成に関与すること、そして２つ以上のαヘリックスの会合を介してモノマーのオリゴマー形成を媒介し得ることが、公知である。
【０１５７】
ＮａｄＡと、ＹａｄＡと、ＵｓｐＡ２との間の一次構造類似性がＣ末端にてクラスター形成され、従って、この３つのタンパク質間の全体的類似性は、二次構造レベルで保存されている。推定ロイシンジッパーが、ＮａｄＡとＵｓｐＡ２との両方に存在する。ＮａｄＡ、ＹａｄＡおよびＵｓｐＡ２は、４つの両親媒性β鎖および内部αヘリックス領域により形成されるカルボキシル末端膜アンカーを有し、コイルドコイルを形成する性向がある。ＹａｄＡおよびＵｓｐＡ２において、これらのαヘリックスが、コイルドコイル領域を形成し、モノマーのオリゴマー形成を媒介することが、示されている［Ｈｏｉｃｚｙｋら（２０００）ＥＭＢＯ Ｊ １９：５９８９〜５９９９；Ｃｏｐｅら（１９９９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１：４０２６〜４０３４］。
【０１５８】
ＮａｄＡの成熟形態中にシステイン残基が存在しないことは、ＮａｄＡホモログと共有される別の特徴である。
【０１５９】
（ＮａｄＡのゲノム環境）
１０８６ｂｐのｎａｄＡコード領域は、その３’末端にターミネーター配列が隣接し、５’末端には（図１２Ａ）、このコード領域は、ＡＴＧ開始コドンの８塩基対および４７塩基対上流に、それぞれ、推定リボソーム結合部位（ＲＢＳ；５’−ＡＡＧＧ−３’）および推定プロモーター領域を示す。
【０１６０】
このコード領域の１３０ｂｐ上流は、テトラヌクレオチドＴＡＡＡ（図１２Ａにおいて影付きの黒）の９回反復であり、その前に、−１０領域および−３５領域を含む第２推定プロモーターが存在する。このＴＡＡＡ反復の存在が原因で、この遺伝子は、相変化を受け得る遺伝子の１つとして列挙されていたが、この反復は、コード領域中には存在しない［Ｔｅｔｔｅｌｉｎら］。その相同遺伝子ＵｓｐＡ２は、ｎａｄＡ中と同じ位置に位置するテトラヌクレオチド反復（ＡＧＡＴ）を有し、この反復は、種々の株において変動する［Ｃｏｐｅら（１９９９）Ｊ，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１：４０２６〜４０３４］。
【０１６１】
ｎａｄａ遺伝子およびその上流領域のＧ＋Ｃ含量は、平均より低く（そのゲノムの残りの平均５１．５％に対して４５％）、このことは、水平転移によりこの遺伝子が獲得されたことを示す。
【０１６２】
このＮａｄＡ遺伝子およびその上流領域は、血清群Ａの株Ｚ２４９１の公開されたゲノム配列中には存在しない［Ｐａｒｋｈｉｋｋら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０４：５０２〜５０６］。ＭｅｎＡゲノムにおいて、データベース中に相同性が存在しない１６ヌクレオチドの短い配列が、このｎａｄＡ遺伝子を置換し（図１２Ｂ）、一方、その上流遺伝子および下流遺伝子（ｎｍｂ１９９３およびｎｍｂ１９９５）は、十分に保存されている（９１％同一性および９７％同一性）。ｎａｄＡ領域にすぐ隣接し、Ｚ２４９１血清群Ａ株中は存在しない配列の分析によって、このセグメントにはＴＣＡＧＡＣ直接反復が隣接することが示される。このことは、組換えの機構を示し得る。このＡ株において、上記１６ヌクレオチドストレッチは、そのストレッチに隣接するＴＣＡＧＡＣ反復の破壊された対を有する。
【０１６３】
（ＮａｄＡ遺伝子型の変動）
血清型Ａと血清型Ｂとの間のｎａｄＡ配列の差異を考慮して、１７５個の異なるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株が分析のために選択された。１５０個の単離株が、５つの疾患
関連血清群（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＹおよびＷ−１３５）を示し、２５株が、健常キャリアから単離された。この分析はまた、Ｎ．ｇｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎ．ｃｉｎｅｒｅａおよびＮ．ｌａｃｔａｍｉｃａの各々株１つを含んだ。
【０１６４】
細菌は、Ｋｅｌｌｏｇｇ補充溶液（０．２２Ｍ Ｄ−グルコース、０．０３Ｍ Ｌ−グルタミン、０．００１Ｍ硝酸鉄（ＩＩＩ）および０．００２Ｍコカルボキシラーゼ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）を補充した淋菌（ＧＣ）培地寒天（Ｄｉｆｃｏ）上で、空気中５％ＣＯ２の加湿雰囲気下で、３７℃にて一晩、以前に記載されたようにして増殖された［Ｋｎａｐｐら（１９８８）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３２：７６５〜７６７；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９７７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３１：５５７〜５６３］。１つの細菌が、５００μｌのＰＢＳ中に溶解され、そして染色体ＤＮＡが、以前に記載されたようにして調製された［Ｔｉｎｓｌｅｙら（１９９６）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９３：１１１０９〜１１１１４］。
【０１６５】
この細菌は、ＰＣＲおよび／またはドットブロットハイブリダイゼーションによってスクリーニングされた。
【０１６６】
ｎａｄＡ遺伝子のＰＣＲ増幅は、ｎａｄＡのコード領域から３５０ｎｔ上流および下流にマッピングされるプライマー（順方向プライマー：配列番号１６；逆方向プライマー：配列番号１７）と、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｈｉｆｉ Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＧＩＢＣＯ）とを使用して、１０ｎｇの染色体ＤＮＡに対して実施された。ＰＣＲ条件は、（９５℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、そして６８℃で１分間の伸長）×３０サイクルであった。ＰＣＲ産物が、１％アガロースゲル上で分析され、そのサイズが、分子量マーカー１Ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（ＧＩＢＣＯ）を使用して決定された。増幅されたフラグメントは、Ｑｉａｑｕｉｃｋカラム（Ｑｉａｇｅｎ）にて精製され、その後、その増幅されたフラグメントの両方の鎖をウォーキングするプライマーによって、自動環状配列決定された（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３７７）。
【０１６７】
ドットブロッティングのために、使用されたプローブは、ｎａｄＡ遺伝子全体であり、これは、２９９６株から増幅され、そしてＲｏｃｈｅ ＤＩＧ Ｈｉｇｈ−Ｐｒｉｍｅ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、ジゴキシゲニンで標識された。各株の細胞懸濁物の１０μｌアリコートが、１０分間沸騰され、そしてナイロン膜（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）上にスポットされた。この膜は、ＵＶ光に２分間曝露すること、および製造業者により報告されたような調製およびシグナル検出のための標準的手順によって、ＤＮＡ架橋された。
【０１６８】
ｎａｄＡ遺伝子は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ中には存在せず、共生種であるＮ．ｌａｃｔａｍｉｃａおよびＮ，ｃｉｎｅｒｅａ中にも存在しなかった。しかし、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｔｉｄｉｓにおいて、単離株のうちの４７％が、ｎａｄＡ遺伝子の存在についてポジティブであった。
【０１６９】
ＰＣＲ（図１３）によって、ＮａｄＡ＋株であるＭＣ５８（レーン１）、９０／１８３１１株（レーン２）および２９９６株（レーン３）において、１８００ｂｐ産物が生成された。ＰＣＲによって、ＮａｄＡ−株であるＺ２４９１株およびＮＧ３／８８株（レーン５）において、４００ｂｐ産物が生成された。いくつかの株（例えば、９３／４２８６、Ｃ４６７８、２０２２、ＩＳＳ１１１３）は、２５００ｂｐのＰＣＲ産物（レーン４：Ｌ９３／４２８６）を生じた。
【０１７０】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの存在／非存在は、株の系統と相関性があった。侵襲性髄膜炎菌性疾患から単離された株は、多座酵素電気泳動（ＭＬＥＥ）によって、少数の過剰毒性系統：電気泳動型ＥＴ３７、ＥＴ５、クラスターＡ４、系統ＩＩＩ、亜群Ｉ、亜群ＩＩＩ、および亜群ＩＶ−１へと分類された［Ａｃｈｔｍａｎ（１９９５）Ｇｌｏｂａｌ
ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ ｄｉｓｅａｓｅ．，Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ ｄｉｓｅａｓｅ（Ｃａｒｔｗｉｇｈｔ編），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，Ｅｎｇｌａｎｄ．１５９〜１７５；Ｃａｕｇａｎｔ（１９９８）ＡＰＭＩＳ １０６：５０５〜２５］。最近、配列ベースの分類である多座配列型決定（ＭＬＳＴ）が導入された。これにより、上記の株は、それぞれ、配列型ＳＴ１１、ＳＴ３２、ＳＴ８、ＳＴ４１、ＳＴ１、ＳＴ５、ＳＴ４に分類される［Ｍａｉｄｅｎら（１９９８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９５：３１４０〜３１４５］。健常キャリアから単離された株は、多くの異なるＥＴ型およびＳＴ型に当てはまる。
【０１７１】
ｎａｄＡ遺伝子は、過剰毒性系統ＥＴ−５、ＥＴ−３７およびクラスターＡ４の５３個の株のうちの５１個（９６％）に存在したが、試験した系統ＩＩＩの株すべてに存在しなかった。２５個のキャリア株のうちの７個が、ポジティブであった。試験した血清群Ｃの株のうちのほとんどが、たとえ過剰毒性系統に属さないとしても、ポジティブであった。同じことは、血清群Ｂの株について、血清型２ａおよび２ｂとともに当てはまった。血清群Ａについて、亜群ＩＩＩに属する１つの株がポジティブであったが、亜群ＩＶ−１に属する他の２つの株は、ネガティブであった。
【０１７２】
系統ＩＩＩは、ほんの最近、欧州および米国において導入されただけであり、ニュージーランドにおける多年にわたる地理学的分離によって、この系統ＩＩＩが新規な遺伝子を獲得する能力が損なわれたようである。例えば、系統ＩＩＩをさらなる組換え事象から防ぐ周囲の染色体領域中に、変異が生じたかもしれない。可能な別の説明は、ＥＴ−５株、ＥＴ−４７株およびクラスターＡ４株は、ｎａｄＡがピークの適合を達成する必要があるが、系統ＩＩＩの単離株は、ｎａｄＡ挿入からいかなる有意な利益をも誘導し得ず、それによりネガティブ選択を受けるというものである。
【０１７３】
ｎａｄＡは、３つの過剰毒性Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ系統においてこのように過剰に提示される。ｎａｄＡは、過剰毒性株の部分集合に存在する外来遺伝子であるようである。
【０１７４】
（ｎａｄＡ対立遺伝子）
ＰＣＲ産物が差次的にサイズ分類され（図１３）、ＮａｄＡ＋株のうちのほとんどは、３つの異なるサイズにグループ分けされ得たので、各サイズを示す３６個の株について、遺伝子が配列決定された：２６個がポジティブ株であり、４株が長いＰＣＲ産物を有し、６株がＮａｄＡ−株であった。
【０１７５】
このネガティブ株において、公開された血清群Ａゲノム配列中に存在する配列と同一である、１６ｂｐ配列が見出された。
【０１７６】
４つの長いＰＣＲ産物株の配列の分析によって、１コピーのＩＳ１３０１による中断が示された。このＩＳ１３０１は、終止コドンを含む１６２アミノ酸の後でこのタンパク質を中断する。この挿入部位は、４つの株すべてにおいて同一であったが、ＩＳ１３０１の方向が異なった。このことは、独立した事象を示す。ＩＳ１３０１についての標的コンセンサス（５’−ＡＹＴＡＧ−３’）が、Ａ→Ｇ変異により生成されたヌクレオチド４７２位にて見出され、これには、ＴＡ重複が伴った。
【０１７７】
ｎａｄＡ＋株において、遺伝子サイズは１０８６ｂ〜１２１５ｂｐの範囲であり、結果
的なコードされるタンパク質のアミノ酸配列の変動は、３６２アミノ酸〜４０５アミノ酸であった。２６個のＮａｄＡ遺伝子のうちの２２個を十分に規定された３つの対立遺伝子にクラスター形成することが可能であった（図９および図１０；表Ｉ）。各対立遺伝子内のこのｎａｄＡ遺伝子の配列は同一であり、対立遺伝子間の全体的同一性は、９６％〜９９％の範囲である。この保存レベルは驚くべきものである。この保存レベルは、ｎａｄＡ遺伝子の弱い選択圧および／またはｎａｄＡ遺伝子が非常に最近獲得されたことを示唆する。後者の可能性は、この領域におけるゲノムの低Ｇ＋Ｃ含量と一致する（上記を参照のこと）。
【０１７８】
【表１】
図９Ａに示される配列は、そのＮ末端アミノ酸はオープンリーディングフレーム中の最初のＭｅｔである（配列番号４〜６）であるが、２番目のＭｅｔ（配列番号４〜６における残基３）は、より良好に位置するシャイン−ダルガーノモチーフを有する（図９Ｂ）ことを呈する。従って、この２番目のＭｅｔコドンから始まる配列が、好ましい（配列番号１〜３）。
【０１７９】
対立遺伝子１は、３６２アミノ酸（配列番号１）のタンパク質をコードし、株ＭＣ５８および配列決定されたＥＴ−５ポジティブ株すべてを包含する。対立遺伝子１に属する他の５つの株は、非常に最近の単離株であった。これらは、ＥＴ型に未だ分けられていないが、これらの株の血清型および血清亜型分類（Ｂ：１５：Ｐ１．７およびＢ：４：Ｐ．１．１５）は、これらの株をＥＴ−５複合群（ｃｏｍｐｌｅｘ）に加入させることを示唆する。
【０１８０】
対立遺伝子２は、残基２６８（配列番号１に従う番号付け）の後での２アミノ酸付加、残基２７１の後での４１アミノ酸付加、および１２２残基の後での７アミノ酸欠失（ロイシンジッパードメインの最初の７個組反復の欠失を生じる）から生じる、３９８アミノ酸（配列番号２）のタンパク質をコードする。固定された７残基の間隔にあるロイシン残基は、一般的に、ロイシンジッパーを同定する。その反復中の１つのロイシンは、ほとんどＭｅｔ、Ｖａｌ、またはＩｌｅによって、頻繁に置換されている。この場合、対立遺伝子２は、ロイシンジッパーモチーフを形成するために、上流または下流のＩｌｅを使用し得る。
【０１８１】
対立遺伝子３は、４０５アミノ酸（配列番号３）のタンパク質をコードし、対立遺伝子２と同様に、残基２６８および残基２７１に４３個の余分なアミノ酸を含むが、残基１２２の後に７アミノ酸欠失を有さないことによって対立遺伝子２とは異なる。対立遺伝子３は、血清群Ａ、血清群Ｂ、および血清群Ｃの株において見出される。
【０１８２】
２６個のポジティブ株のうちの残りの４株（ＩＳＳ１０２４、ＩＳＳ７５９、９７３−１７２０、９５３３０；表１において＊で印を付けている）は、対立遺伝子１〜３の微小改変体を含む：
血清群ＣのＩＳＳ１０２４株は、残基２２９〜２３５に１つの７個組反復欠失を含む、対立遺伝子２の改変体を有する（配列番号７／８）。この配列は、ものもと第４の対立遺伝子として分類されたが、対立遺伝子２の改変体として再分類されている。従って、対立
遺伝子２は、すべてのＥＴ−３７株、クラスターＡ４の１つの株およびさらなる３つの非ＥＴ型血清群Ｃ株において見出される；
血清群ＣのＩＳＳ７５９株および９７３−１７２０株の両方は、リーダーペプチド中に単一アミノ酸変異を含む対立遺伝子３の改変体を含み（配列番号９／１０）、この単一アミノ酸変異は、単一ヌクレオチド変異から生じる。対立遺伝子３の株すべてのうち、９７３−１７２０のみが、過剰毒性株（クラスターＡ４）に属する；
血清群Ｂの株９５３３０は、対立遺伝子１および対立遺伝子２の組換え体（キメラ）（配列番号１１／１２）を含み、ｎａｄＡが、対立遺伝子２のＮ末端部分と対立遺伝子１のＣ末端セグメントとの間の融合物である。推定組換え部位は、このタンパク質の残基１４１と残基２６５との間にほぼ位置する。
【０１８３】
すべての挿入および欠失は、コイルドコイル領域中で生じ、α−ヘリックスの２ターンまたは６ターンを示す、７アミノ酸または４１アミノ酸を含み、これにより、全体的構造を破壊することなく、このコイルドコイル領域の長さの変化が可能となる。さらに、ＩＳＳ１０２４における欠失は、ロイシンジッパードメインの最初の７個組反復の欠如をもたらすが、そのドメインを破壊はしない。なぜなら、固定された７残基間隔にあるロイシン残基は、ほとんど、Ｍｅｔ、ＶａｌまたはＩｌｅにより置換され得るからである。この場合、対立遺伝子２は、ロイシンジッパーモチーフを形成するために、上流または下流のＩｌｅを使用し得る（図１１）。
【０１８４】
これらの種々のＮａｄＡ配列および対立遺伝子のいずれも、本発明に従って使用され得る。
【０１８５】
配列分析が、推定プロモーター領域および推定ターミネーター領域（５０ｂｐ上流、３５０ｂｐ下流）まで拡張されたとき、その５’領域にのみ、変化が見出された。３つのイタリア株（ＩＳＳ１０７１、ＩＳＳ８３２およびＩＳＳ１１０４）は、一塩基変異について異なったが、９６１−５９４５株において、７塩基の差異（図１０において＊で示される）が存在した。変化はまた、ＴＡＡＡテトラヌクレオチドが異なる株において４回〜１２回反復される５’領域においても見出された（表１）。反復の数は、各対立遺伝子においても変化した（表１）。
【０１８６】
さらなる作業が、口腔咽頭スワブにより健常個体から単離されたキャリア株に対して、実施された。いくつかの株は、キャリアとして記載されているが、過剰毒性クラスターに属する。ＮａｄＡは、上記のそのようなキャリア株すべてにおいて見出された（すなわち、ＥＴ−５株において対立遺伝子１が見出され、ＥＴ−３７株において対立遺伝子２が見出された）。
【０１８７】
ＮａｄＡはまた、過剰毒性クラスターに属さない５つのキャリア株（ＮＧＥ２８、６５／９６、１４９／９６、１６２６９、１６２８２）において見出された。これらの５つの株は、患者から単離された株においては見出されない配列（配列番号１３および１４）を共有した。この対立遺伝子は、「対立遺伝子Ｃ」（キャリア）と呼ばれる。
【０１８８】
対立遺伝子Ｃと対立遺伝子１〜３とのアライメントが、図９Ｃに示される。そのタンパク質のコイルドコイルセグメント中での破壊が、明らかである。
【０１８９】
対立遺伝子１〜３とは異なり、対立遺伝子Ｃタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現された場合に、高分子量凝集体を容易には形成しない。しかし、対立遺伝子１〜３と同様に、対立遺伝子Ｃは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの表面上に露出される。なぜなら、対立遺伝子Ｃは、対立遺伝子Ｃ自体に対して惹起される細菌抗体の標的であるからである。しかし、これらの抗体は、対立遺伝子１〜３を保有する株に対して殺菌性ではない。同
様に、対立遺伝子１〜３に対して惹起される抗体は、対立遺伝子Ｃ株に対して殺菌性ではない。
【０１９０】
（細胞表面上のＮａｄＡオリゴマー） ＷＯ０１／６４９２２は、ＮａｄＡがオリゴマー構造を形成することを報告する。より詳細にＮａｄＡオリゴマーを研究するために、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの全細胞溶解物が、ウェスタンブロットによりプロービングされた。
【０１９１】
細菌コロニー［ＭＣ５８株（対立遺伝子１）、９０／１８３１１株（対立遺伝子２）、２９９６株（対立遺伝子３）、Ｌ９３／４２８６株（ＩＳ１３０１挿入物）およびＮＧ３／８８株（ｎａｄＡ−）］が、０．３％グルコースを補充されたＧＣブロス中で定常期まで増殖された。異なる時間にサンプルが採取され、３０００×ｇにて１０分間の遠心分離によってペレットにされ、そしてＰＢＳ中に再懸濁され、そして細菌溶解するまで融解／凍結された。等量のタンパク質が、１２．５％ポリアクリルアミドゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供され、ニトロセルロース膜上にエレクトロトランスファーされた。
【０１９２】
抗ＮａｄＡポリクローナル血清を調製するために、組換えＮａｄＡが発現され精製された。３つのｎａｄＡ対立遺伝子（対立遺伝子１：アミノ酸２４〜３６２；対立遺伝子２：アミノ酸２４〜３４３；対立遺伝子３：アミノ酸２４〜３５０）をコードする配列が、染色体ＤＮＡに対するＰＣＲにより増幅され、ｐＥＴ２１ｂ＋ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にクローニングされた。このプラスミドは、このタンパク質をＣ末端ヒスチジン融合物として発現するために、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）中に形質転換された。１ｍＭ
ＩＰＴＧをＯＤ６００ｎｍ０．３で添加し、その細菌をさらに３時間増殖させることによって、タンパク質発現が３０℃で誘導された；発現がＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価された。組換え融合タンパク質が、Ｎｉ２＋結合体化キレート形成速流Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
４Ｂ樹脂上でのアフィニティクロマトグラフィーによって精製された。２０μｇの精製タンパク質が、６週齢のＣＤ１雌マウス（４匹／群〜６匹／群）を免疫するために使用された。タンパク質が、最初の投与については完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）とともに、そして２回目（２１日目）および３回目（３５日目）のブースター投与については不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）とともに、腹腔内投与された。出血サンプルが、４９日目に採取され、そして血清学的分析のために使用された。
【０１９３】
これらのブロットは、ＭＣ５８株（図１４、レーン１）、９０／１８３１１（レーン２）および２９９６（レーン３）における高分子量反応性バンドを示した。このバンドは、ＮＧ３／８８株（レーン５）にはなかった。サンプル緩衝液を４０分煮沸してもこのパターンは変化しなかった。これらのタンパク質の種々のサイズは、対立遺伝子と一致していた。３５〜４０ｋＤａのモノマータンパク質の予測されるサイズの範囲を考慮して、観察されるバンドの高い分子量は、ＮａｄＡのオリゴマー形態の存在により説明され得る。この可能性は、ＩＳ１３０１挿入物（より短い１６２アミノ酸のタンパク質をコードし、そしてコイルドコイル領域の大部分を欠く）を含む株において、高分子量の反応性バンドが存在せず、そして、プロセシングされたモノマータンパク質の推定分子量と一致する１４．５ｋＤａのバンド（図１４、レーン４）で置き換えられているという事実により支持される。
【０１９４】
このオリゴマータンパク質は、機能的遺伝子を含む全ての株で見出されたが、発現レベルは株によって変化した（表Ｉ）。さらに、ＮａｄＡタンパク質の量は、増殖の間に同じ株内で変化した。
【０１９５】
多種多様な全体のＮａｄＡ発現レベルの代表として選択された４つの異なる株（ＭＣ５８、２９９６、Ｃ１１、Ｆ６１２４）を、定常期まで増殖の間追跡した。図１５は、試験
された株（低いＮａｄＡ発現の１５Ａ：ＭＣ５８；高いＮａｄＡ発現の１５Ｂ：２９９６）のうち２つの増殖を、ＯＤ６００を示す曲線を用いて示す。ＯＤ６００増殖曲線の各点において取られたサンプルのウエスタンブロットは、ＮａｄＡのバンドが、増殖の初めはほとんど見えず、増殖の間に、より強くなって、定常期には最大にまでなるということを示した。分析された全ての株は、同じ増殖期依存性の挙動を示した。
【０１９６】
高分子量ＮａｄＡはまた、外膜に固定されたＮａｄＡと一致して、外膜ベシクルのウエスタンブロットにおいて見られた。
【０１９７】
同様に、対数期増殖の間の生存細菌に対するＦＡＣＳ分析は、ＮａｄＡが、細菌の表面に結合する抗体に利用可能であることを示した。多糖類カプセルを有する株（ＮＭＢ株）におけるＦＡＣＳ強度は、同質遺伝子型非カプセル化変異株（Ｍ７）と比較して１ｌｏｇ減少したが、このタンパク質は、表面に露出されており、両方の株における結合に利用可能であった（図１６）。
【０１９８】
ＮａｄＡは、表面に露出されたオリゴマーを形成し、これは、熱、ＳＤＳ、およびβ−メルカプトエタノールによる還元に対して安定である。その成熟形態のシステイン残基の欠損のために、ジスルフィド結合形成は、この現象には関与し得ず；むしろこのことは、推定のコイルドコイル構造およびモノマー間の分子間相互作用を媒介し得るロイシンジッパーモチーフの存在と一致する［Ｌｕｐａｓ（１９９６） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：３７５−３８２；Ｏ’Ｓｈｅａら（１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：５３９−５４４］。オリゴマーのサイズは、約１７０ｋＤａであり、四量体構造を示唆する［ＷＯ０１／６４９２２］。しかし、剛直なコイルドコイル構造は、ＳＤＳ ＰＡＧＥで異常な移動度を有するようであり、従って１７０ｋＤａの形態は、三量体であり得る。
【０１９９】
（保護免疫原性）
ポリクローナル抗ＮａｄＡ血清を、補体源として使用されるプールされたウサギ新生児血清（ＣｅｄａｒＬａｎｅ）を用いて、以前に記載されたように殺菌活性について試験した［Ｐｉｚｚａら（２０００）；Ｐｅｅｔｅｒｓら（１９９９） Ｖａｃｃｉｎｅ １７：２７０２−２７１２］。血清殺菌力価を、反応混合物中の細菌の６０分のインキュベーション後の１ｍｌあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）において、０分の時点での１ｍｌあたりのコントロールＣＦＵと比較して５０％の減少を生じる血清希釈として規定した。代表的には、補体の存在下でネガティブコントロール抗体と共にインキュベートされた細菌は、６０分のインキュベーションの間、ＣＦＵ／ｍｌにおける１５０〜２００％の増加を示した。
【０２００】
結果は以下のとおりである：
【０２０１】
【表２】
示されるように、この血清は、ｎａｄＡ遺伝子を有する全ての株の補体媒介殺傷を誘導し、そしてこの遺伝子を有さない株に対しては不活性であった。しかし、殺菌力価は、株によって変化した。力価は、より多い量のタンパク質を発現する株に対してより高かった。この結果を、力価が増殖の初期および後期において決定された場合に確認した（図１５）。
【０２０２】
殺菌活性における差異が、異なる対立遺伝子配列に起因したのか否かをチェックするために、免疫血清（３つのＮａｄＡ型に対して惹起された）を産生させ、そして交差殺菌アッセイに使用した。この抗血清を用いて得られた結果は、上記に示される結果と同様であり、この殺菌活性は、対立遺伝子の多様性に影響されないが、抗原発現レベルに影響されることを示唆した。
【０２０３】
感染の間に菌血症から動物を保護する免疫血清の能力もまた、ラット新生児モデルを使用して試験した。使用された血清は、５０μｇの精製ｒＮａｄＡ（対立遺伝子３）を用いてモルモットを免疫することにより得た。異系交配したＷｉｓｔａｒラット（５〜７日齢）の免疫を、１回目の用量についてはＣＦＡと共に、そしてさらなる３回の用量（２８日、５８日、８４日）についてはＩＦＡと共に皮下に実施した。血液サンプルを、１０５日目に採取し、そして動物保護アッセイに使用した。
【０２０４】
２つの異なるＭｅｎＢ株（８０４７および２９９６）を使用して２回実験を行った。各株を、連続的に新生児ラットにおいて３回継代した。実験１において、４匹のラット群を、（ａ）８０４７株からの細菌（ラット１匹あたり７×１０３ＣＦＵ）および（ｂ）熱不活化モルモット抗血清または抗カプセルコントロールｍＡｂ（ＳＥＡＭ３［Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｌｅｙら（１９９２）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：３１５６］）の混合物１００μｌで腹腔内でチャレンジした。実験２において、６匹のラット群を、時間０の時点で、コントロールｍＡｂまたはモルモット血清の種々の希釈物で処理した。２時間後、これらを２９９６細菌でチャレンジした（ラット一匹あたり５．６×１０−３ＣＦＵ）。両方の実験において、血液培養物を、防腐剤なしで約２５Ｕのヘパリンを含有するシリンジおよび針で心臓を穿刺することにより、チャレンジ後１８時間で得た。血液培養物中の細菌の数を、１、１０、および１００μｌの血液をチョコレート寒天（ｃｈｏｃｏｌａｔｅ ａｇａｒ）上に一晩プレーティングすることにより得た。幾何平均ＣＦＵ／ｍｌの計算のために、滅菌培養を用いた動物に、１ＣＦＵ／ｍｌの値を割り当てた。
【０２０５】
結果は以下のとおりである：
【０２０６】
【表３】
従って、抗ＮａｄＡ抗血清は、このアッセイにおいて高度に保護的である。
【０２０７】
従って、全体として、ＮａｄＡは、良好なワクチン抗原であるといういくつかの特性を有する：（ｉ）表面に露出された分子であり、潜在的に細菌付着に関与する；（ｉｉ）疾患関連株の少なくとも５０％および３つの超毒性の系統のほとんど１００％に存在する；（ｉｉｉ）実験室動物において保護抗体および殺菌性抗体を誘発する；そして（ｉｖ）各対立遺伝子は、交差殺菌性抗体を誘導する。
【０２０８】
（ＯＲＦ４０）
ＯＲＦ４０は、Ｈｓｆおよびその対立遺伝子改変体Ｈｉａ（両方ともＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの付着因子）に対して相同性を示す。Ｈｉａ、ＨｓｆおよびＯＲＦ４０のサイズが異なることは、部分的に、Ｈｓｆにおける大きな繰り返しドメインの３つのコピーの存在により説明され、これは、Ｈｉａに単一のコピーとして存在し、そしてＯＲＦ４０には部分的にしか存在しない（図７）。ＭｅｎＢにおいて、ＯＲＦ４０は、約２００ｋＤａのタンパク質（成熟タンパク質についての５９ｋＤａの推定分子量を参照のこと）として外膜に見出される。
【０２０９】
（Ａｐｐ）
Ａｐｐは、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの付着および浸透タンパク質Ｈａｐに対して相同性を示し（図８）、これは、自己タンパク質分解切断および細胞外放出を受ける、セリンプロテアーゼ活性を有する付着因子である［Ｈｅｎｄｒｉｘｓｏｎら（１９９７） Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２６：５０５−５１８］。切断されない表面結合Ｈａｐは、上皮細胞への付着を媒介し、そして細菌凝集および集落形成を促進する。
【０２１０】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて、Ａｐｐは、外膜へと輸送され、プロセシングされ、そして分泌される。ＨａｐおよびＡｐｐは、両方とも自己輸送体ファミリーに属し、このファミリーは、独特の分泌機構により特徴付けられるグラム陰性細菌由来のタンパク質を含む。この系は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＩｇＡ１プロテアーゼについて最初に記載され、これは、このファミリーのプロトタイプと考えられる。自己輸送体ファミリーのタンパク質は、多くのグラム陰性病原体の毒性に関与していると示された［Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ＆ Ｎａｔａｒｏ（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６９：１２３１−１２４３］。これらは、以下の少なくとも３つの機能的ドメインを含む大きな前駆体タンパク質として合成される：代表的なＮ末端リーダー配列、内部ドメイン（パッセンジャードメイン）およびＣ末端ドメイン（転座ドメインまたはβ−ドメイン）。リーダー配列は、タンパク質のペリプラズムへの輸送（ｓｅｃ依存性）を媒介する。続けて、この転座ドメインは、β−バレル孔を形成する外膜に挿入されて、パッセンジャードメインの輸送を可能にする。一旦、細菌の表面にあると、このパッセンジャードメインは切断され得、そして周囲に放出される。切断は、パッセンジャードメイン自体におけるプロテアーゼ活性により生じる自己タンパク質分解事象により起こり得る。自己輸送体のパッセンジャードメインは、広く分岐しており、それらの顕著な異なる役割を反映している。反対に、β−ドメインは、それらの保存された機能と一致する高度の保存性を示す。
【０２１１】
Ａｐｐは、自己輸送体タンパク質の優勢ドメインおよび保存的セリンプロテアーゼモチーフ（ＧＤＳＧＳＰ）を保有する。このモチーフは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ＩｇＡ１プロテアーゼによるヒトＩｇＡの切断、およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＨａｐタンパク質の自己タンパク質切断を担うことが示された。Ａｐｐは、髄膜炎菌の間で保存された抗原であること、感染および輸送の間に発現されること、Ｂ細胞およびＴ細胞を刺激すること、そして殺菌性抗体応答を誘導することが、示された［Ｈａｄｉら（２００１） Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：６１１−６２３；Ｖａｎ Ｕｌｓｅｎら（２００１） ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３２：５３−６４］。
【０２１２】
血清群Ｂの２９９６株において、Ａｐｐは、１４５４個のアミノ酸および１５９，９６
５Ｄａの推定分子量を有する。図２６は、このタンパク質の推定の構造的特徴を示す。３つのドメインが見られる：ドメイン１（アミノ酸１〜４２）は、シグナルペプチドである；ドメイン２は、パッセンジャードメインであり、これは、機能的に活性なタンパク質である；ドメイン３は、βバレル構造を有するＣ末端転座ドメインである。
【０２１３】
パッセンジャードメインのＮ末端において、Ｈｉｓ−１１５、Ａｓｐ−１５８およびＳｅｒ−２６７は、Ｈａｐ由来のセリンプロテアーゼ触媒の三組み（ｔｒｉａｄ）Ｈｉｓ−９８、Ａｓｐ−１４０およびＳｅｒ−２４３に対応する［Ｆｉｎｋら（２００１） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：３９４９２−３９５００］。残基２８５〜３０２は、推定ＡＴＰ／ＧＴＰ結合部位（Ｐループ）であり、これは、外膜転座のためのエネルギー結合の機構を示唆する。パッセンジャードメインのＣ末端に向かって、２つのＡｒｇリッチ領域が存在する。第１の領域（ＲＲＳＲＲ）は、残基９３４〜９３８であり、そして第２の領域（ＲＲＡＲＲ）は、残基１１４９で始まる。これらのモチーフは、トリプシン様タンパク質分解切断部位（例えば、ジフテリア毒素中の部位、ならびにＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｈａｐ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ＩｇＡ−プロテアーゼおよびＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ＦｈａＢのｋ自己切断部位の上流の部位（図２６、枠１）の公知の標的の名残（ｒｅｍｉｎｉｓｃｅｎｔ）である。Ａｒｇリッチ領域の下流は、モチーフ９５４ＮＴＬ９５６および１１７６ＮＳＧ１１７８であり、これらは、自己輸送体Ｓｓｐ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、Ｐｒｎ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、Ｂｒｋａ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）［Ｊｏｓｅら（１９９５） Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８：３７８−３８０］およびＨａｐ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（図２６、枠２）における切断部位と同一であるかまたは類似する。共に、これらの配列モチーフは、２つのモチーフ９５４ＮＴＬ９５６および１１７６ＮＳＧ１１７８ならびにＲＲ（Ａ，Ｓ，Ｒ）２ＲＲパターンが、下流プロセシング部位の正しい局在化のためのシグナルとして作用し得ることを示唆する。
【０２１４】
Ａｐｐ配列の更なる分析は、プロリンリッチな領域（ここでジペプチドモチーフＰＱは、残基１１５６で始まって４回繰り返されることを示す。公知のタンパク質配列に対する相同性についての検索は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｉｚｉｅ ＰｓｐＡおよびＰｓｐＣの表面タンパク質、およびＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ外膜タンパク質ｐ６９ペルタクチン（ｐｅｒｔａｃｔｉｎ）のプロリンリッチ領域に対するいくらかの類似性を明らかにし、ここで（ＰＱＰ）５モチーフは、主要な免疫保護エピトープを含有するループに位置する。
【０２１５】
最後に、Ａｐｐ（ＹＲＷ）の最後の３つのアミノ酸は、Ｈａｐの最後の３つのアミノ酸と同一であり、これらは、外膜局在化およびタンパク質安定性に重要であると記載されている［Ｈｅｎｄｒｉｘｓｏｎら、１９９７］。
【０２１６】
（融合パートナーを伴わないＥ．ｃｏｌｉの発現）
ＯＲＦ４０、ＡｐｐおよびＮａｄＡの全長遺伝子を、ｐＥＴ２１ｂ＋ベクター中にクローン化し、そしてこのプラスミドで、Ｔ７プロモーターの制御下でこれらの遺伝子を発現させるために、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。
【０２１７】
発現は、このプロモーターをＩＰＴＧで活性化するか、または非誘導条件下で達成された。タンパク質の局在化および表面露出を、細胞分画実験（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット）、ＦＡＣＳ分析および全細胞免疫ブロットによりアッセイした。図１〜３に示されるように、これら三つのタンパク質は全て、Ｅ．ｃｏｌｉの表面に転座されている。
−ＯＲＦ４０は、モノマー形態で発現され、そしておそらくマルチマーも形成する（図１）。
−Ａｐｐは、約１６０ｋＤａの前駆体としてＥ．ｃｏｌｉ外膜に輸送され、プロセシング
されて培養上清に分泌される（図２）。
−ＮａｄＡは、約１８０ｋＤａの単一の高分子量バンドとして外膜の画分に存在することが見出される。これは、おそらくこのタンパク質のオリゴマー形態に対応する。このようなバンドは、Ｅ．ｃｏｌｉ発現細胞内ＮａｄＡには存在しない（図３）。
【０２１８】
Ａｐｐ発現を、より詳細に検討した。
【０２１９】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ２９９６株のゲノムＤＮＡを、以前に記載されたように調製した［Ｔｉｎｓｌｅｙ ＆ Ｎａｓｓｉｆ （１９９６）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９３：１１１０９−１１１１４］。シグナルペプチド（アミノ酸１〜４２）をコードする配列および終止コドンを欠くＤＮＡを、ＰＣＲプライマー配列番号１８および１９を使用して増幅し、次いで、ＮｈｅＩおよびＸｈｏｌで消化し、そしてｐＥＴ−２１ｂ発現ベクターのＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入して、「ｐＥＴ−Ａｐｐ−Ｈｉｓ」を得た（図２７）。このプラスミドを、Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、そしてＣ末端Ｈｉｓタグ融合タンパク質の発現に使用し、このタンパク質を、精製して抗体を惹起するために使用した。全長ａｐｐ遺伝子を、ＰＣＲプライマー配列番号２０および２１を使用して同様の方法で増幅し、そしてクローン化してプラスミド「ｐＥＴ−Ａｐｐ」を得た。
【０２２０】
プラスミドを。Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、そして１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して発現を誘導した。この発現されたタンパク質を、ウエスタンブロットにより検出した（図２８、レーン１）。このタンパク質がＥ．ｃｏｌｉの表面に輸送されたことを確かめるために、ＦＡＣＳ（図２９）および免疫蛍光顕微鏡法(図３０）を使用した。Ｆ
ＡＣＳ分析は、ｐＥＴ−Ａｐｐ形質転換体（全長遺伝子）においてポジティブな表面発現を示したが、Ａｐｐ−Ｈｉｓ（シグナルペプチドなし）または空のベクターでは表面発現を示さなかった。免疫蛍光の結果は、ＦＡＣＳに一致した。従って、全長ａｐｐ遺伝子の発現は、Ｅ．ｃｏｌｉの表面へのＡｐｐの輸送を生じたが、最初の４２個のアミノ酸の欠失は、表面局在化をなくした。
【０２２１】
ｐＥＴ−Ａｐｐ形質転換体由来の外膜たんぱく質のウエスタンブロット分析は、約１６０ｋＤａの特定の反応性バンドを明らかにした(図２８、レーン１）。この分子量は、全
長タンパク質の推定分子量に対応している。対応するバンドは、形質転換していないコントロール由来の外膜画分にはなかった(レーン３）。培養上清のウエスタンブロット分析
は、ｐＥＴ−Ａｐｐと共に約１００ｋＤａの分泌タンパク質を明らかにし(レーン２）、
これは、形質転換していないコントロールには存在しなかった（レーン４）。時々、非常に弱いバンドもまた、ｐＥＴ−Ａｐｐ形質転換体において約１４０ｋＤａに検出された。
【０２２２】
従って、全長ａｐｐ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉに導入された場合、Ａｐｐタンパク質の発現を誘導し、このタンパク質は、外膜に輸送され、切断され、そして培養上清に放出される。
【０２２３】
（ネイティブ発現は、免疫応答の質に影響を及ぼし得る）
免疫応答の誘導に対するタンパク質コンホメーションの役割を評価するために、ＯＲＦ４０、ＡｐｐまたはＮａｄＡを発現するＥ．ｃｏｌｉ由来の外膜小胞を単離し、これを使用してマウスを免役した。殺細菌活性について血清を試験し、結果を、融合タンパク質により得られた結果と比較した。殺細菌応答（株２９９６）は、そのタンパク質がＯＭＶ中でそれらの「ネイティブな」形態で生成される場合に、５〜１０倍改善された：
【０２２４】
【表４】
（Ａｐｐ自己タンパク質分解性切断）
Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＥＴ−Ａｐｐ形質転換体は、１００ｋＤａ産物を培養上清に分泌し、１６０ｋＤａ表面産物を示す。分泌App産物が自己タンパク質分解性プロセスから得られ
るか否かを試験するために、推定触媒性残基のうちの１つ（Ｓｅｒ−２６７）を、Ａｌａと置換した。
【０２２５】
pET-AppS267A変異体を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびプライマー（配列番号２２および２３）を用いた部位特異的変位誘発によって得た。
【０２２６】
ｐＥＴ−ＡｐｐＳ２６７Ａ形質転換体に由来する総タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図３１、レーン２）は、サイズがｐＥＴ−Ａｐｐ形質転換体（レーン１）に類似のタンパク質を示した。このタンパク質は、ＦＡＣＳ分析により表面に露出されることが示された（図２９）。培養上清のウェスタンブロット分析は、ｐＥＴ−Ａｐｐ形質転換体（図３２、レーン１）においてＡｐｐを示したが、ｐＥＴ−ＡｐｐＳ２６７Ａ形質転換体（レーン２）においては示さなかった。
【０２２７】
従って、Ｓｅｒ−２６７のＡｌａへの変異は、Ａｐｐ前駆体（これは、細胞に結合したままである）のプロセシングおよび分泌をなくす。これらのデータは、Ａｐｐがセリンプロテアーゼ活性（これは、自己タンパク質分解性プロセシングを担い、分泌Ａｐｐドメインの上清中に放出する）を有することを示唆する。
【０２２８】
９５４ＮＴＬ９５６での切断は、１０４１９０Ｄａの推定分子量を有するフラグメントを放出する。１１７６ＮＳＧ１１７８での切断は、１２８７９８Ｄａフラグメントを与える。これら２つの推定フラグメントは、培養上清中で観察された、約１４０ｋＤａおよび約１００ｋＤａの２つのバンドに適合しうる。切断は、第１に約１４０ｋＤａフラグメントを与え、次いで、第２に１００ｋＤａフラグメントを与えるように生じうる。従って、Ａｐｐのβドメインは、残基１１７７にて始まる。
【０２２９】
（付着因子としてのＮａｄＡ、ＯＲＦ４０およびＡｐｐの機能）
国際特許出願ＷＯ０１／６４９２２の実施例２２は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＮａｄＡ発現により、形質転換細菌がヒト上皮細胞に接着するようになることを開示する。この接着性の表現型は、ＮａｄＡについて、ＡｐｐおよびＯＲＦ４０についてもさらに研究された。
【０２３０】
非誘導性条件下または誘導性条件下で増殖させたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌（１０８ＣＦＵ）を、Ｃｈａｎｇヒト上皮細胞単層（１０５細胞）に接種し、３７℃で１時間または２時間インキュベートした。次いで、細胞を、ウサギ抗Ｅ．ｃｏｌｉおよびＰＥ−結合体二次抗体とともにインキュベートした。接着を、Ｃｈａｎｇ細胞に結合する特異的蛍光強度として、ＦＡＣＳにより検出した。ポジティブコントロールは、ｈｓｆを発現するＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５（ＤＨ５／ｐＤＣ６０１））であり；ネガティブコントロ
ールは、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ｂおよびＤＨ５ａ／ｐＴ７−７であった。図４における結果は、組換えＥ．ｃｏｌｉ株が、培養上皮細胞に接着する能力が、これら３つのタンパク質の発現と関連づけられることを示す。
【０２３１】
これら３つのタンパク質が宿主細胞との相互作用を促進しうることを確認するために、この組換えタンパク質自体を、上皮細胞への結合について研究した。１０５個のＣｈａｎｇヒト上皮細胞（Ｗｏｎｇ−Ｋｉｌｂｏｒｕｎｅ誘導体、クローン１−５ｃ−４、ヒト結膜）を、培地単独、または異なる濃度のＯＲＦ４０（１５０μｇ／ｍｌ）、Ａｐｐ（１５０μｇ／ｍｌ）もしくはＮａｄＡ（３００μｇ／ｍｌ）、あるいはネガティブコントロールとしてＧＮＡ２１３２（３００μｇ／ｍｌ）とともに、４℃にて３０分間インキュベートした［Ｐｉｚｚａら（２０００）を参照のこと］。結合を、単一の組換えタンパク質に対するポリクローナル抗血清および二次ＰＥ結合体抗体を使用して、ＦＡＣＳにより検出した。このＦＡＣＳシグナルシフト（図５）は、３つのタンパク質が、ヒト上皮細胞に結合しうる一方で、精製ＧＮＡ２１３２（ネガティブコントロール）は結合しないことを示す。
【０２３２】
図６Ａは、結合が、用量依存性様式にて増加することを示す。ＮａｄＡの結合は、約２００μｇ／ｍｌにてプラトーに達する。ＧＮＡ２１３２は、４００μｇ／ｍｌにおいてですら結合できない（図６Ｂ）。図６におけるデータは、タンパク質濃度（μｇ／ｍｌ）に対してプロットされた平均蛍光強度（ＭＦＩ）値である。
【０２３３】
ＦＡＣＳを使用すると、ＮａｄＡの細胞への結合が、Ｈｅｐ−２細胞およびＭＯＬＴ−４細胞でも認められたが、ＨｅＬａ細胞、Ａ５４９細胞、Ｈｅｃ−ｌＢ細胞、Ｈｅｐ−Ｇ２細胞、ＣＨＯ細胞またはＨＵＶＥＣ細胞では認められなかった。Ｃｈａｎｇ細胞への接着は、その細胞をプロナーゼで処理することによって排除され得、このことは、ＮａｄＡについてのヒトレセプターがタンパク質であることを示す。
【０２３４】
精製ＮａｄＡタンパク質のＣｈａｎｇ結膜細胞への接着はまた、免疫蛍光顕微鏡を使用して、観察された。タンパク質(そのC末端アンカードメインを欠く)を、種々の濃度でＣ
ｈａｎｇ細胞とともに完全培養培地中で、３７℃にて３時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、固定し、抗ＮａｄＡマウスポリクローナル抗体および二次テキサスレッド結合体化抗マウスＩｇＧ抗体で染色した後に、レーザー共焦点顕微鏡により分析した。０ｎＭにおいては結合が見られなかった（図１７Ａ）が、結合は、１７０ｎＭ（１７Ｂ）および２８０ｎＭ（１７Ｃ）にて明らかであり、クラスタ化は、より高濃度で明らかであった。対照的に、ＮａｄＡの結合は、２８０ｎＭタンパク質においてですら、ＨｅＬａ細胞で認められなかった（１７Ｄ）。
【０２３５】
結合は、４℃（図１８Ｂ）より、37℃ではるかにより明らかであった（図１８Ａ）。３７℃でのクラスタに比較して、４℃にて認められたドット様構造は、ＮａｄＡモノマー間の外側からの相互作用（ｌａｔｅｒａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）が温度依存性(膜流
動性により影響を受ける)であることを示唆する。
【０２３６】
表面タンパク質とエンドサイトーシスされるタンパク質とを区別するために、サポニン界面活性剤を、染色手順の間に添加した。エンドソームのサイズを有する細胞内クラスタは、サポニンが使用される場合により明らかであった（矢印）が、より高い割合のタンパク質は、細胞表面に存在したままであった（図１９）。
【０２３７】
免疫蛍光はまた、ＮａｄＡが単球に結合することを明らかにした（図２０Ａ）。ＮａｄＡ単独（染色抗体なし；２０Ｂ）および免疫前血清で染色したＮａｄＡは、（２０Ｃ）は、見えなかった。高倍率にて、小胞への取り込みの証拠(エンドソームまたはファゴソー
ムのいずれか)が見られた。
【０２３８】
図２１は、マウスマクロファージ（ｒａｗ ２６４．７）がＮａｄＡ（１２５ｎＭ、３時間、３７℃；細胞をＤＭＥＭ中で培養した）を結合し、そしてＮａｄＡをエンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｅ）する（１２５ｎＭ、３時間、３７℃；ＤＭＥＭ中で細胞培養）ことを示す。
【０２３９】
この細胞のＩＬ−αの分泌によって測定する場合、インキュベーション前に、ＮａｄＡを９５℃で１５分間加熱し、ＮａｄＡの単球への結合活性を除去した（図２２）。従って、ＮａｄＡ調製物の刺激活性は、熱不安定である。刺激活性はまた、抗ＣＤ１４（図２３）によるか、またはビーズ固定化抗ＣＤ１４（図２３）を用いた調製物からのＮａｄＡの除去によって、ブロックされた。
【０２４０】
免疫蛍光顕微鏡をまた用いて、Ｅ．ｃｏｌｉが発現するＮａｄＡの結合を検出した。形質転換したＥ．ｃｏｌｉは、強く結合し（図２４Ａ）、一方、非形質転換細菌は結合しなかった（図２３Ｂ）。単球によって放出されたＩＬ−αは、４０：１の細菌：単球比で、形質転換Ｅ．ｃｏｌｉを用いた場合、比形質転換細菌よりも１．５倍よりも高かった。
【０２４１】
形質転換したＥ．ｃｏｌｉを、ガラスカバースリップに結合させ、固定しそして抗ＮａｄＡ（図２５Ａ）および抗Ｅ．ｃｏｌｉ抗体（図２５Ｂ）を用いて二重染色した。両方が用いられた場合、抗ＮａｄＡのパッチは可視的であり、ＮａｄＡが細菌表面上で凝集体を形成する蛍光があり、これが抗体の他の表面抗原との相互作用を妨げることを示唆する。
【０２４２】
Ａｐｐに注目し、組換えＥ．ｃｏｌｉ株を、Ｃｈａｎｇ結膜上皮細胞（Ｗｏｎｇ−Ｋｉｌｂｏｕｒｎｅ誘導体、クローン１−５ｃ−４［ヒト結膜］、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２０．２）の単層とともにインキュベートし、そして接着を、ＦＡＣＳを用いて分析した。コンフルエントな単層から得た細胞を、１２ウェル組織培養プレート中に、１０５細胞／ウェルで播種し、そして２４時間インキュベートした。ＩＰＴＧ誘導後、細菌の培養物をＰＢＳ中で２回洗浄し、ＤＭＥＭ＋１％ ＦＢＳ中に再懸濁し、５×１０８細菌／ｍｌ濃度とした。各々の株の１ｍｌありコートに、Ｃｈａｎｇ細胞の単層培養物を添加し、５％ ＣＯ２中で、３７℃で３時間、インキュベートした。非接着性細菌を、ＰＢＳで３回洗浄することによって除去し、そして３００μｌの細胞培養液（Ｓｉｇｍａ）を、各々のマイクロタイターウェルに添加した。インキュベーションを、３７℃で１０分間継続した。細胞を収集し、次いでウサギポリクローナル抗Ｅ．ｃｏｌｉ抗血清（ＤＡＫＯ）とともに、４℃で１時間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳ＋５％ ＦＢＳ中で２回洗浄し、Ｒ−フィコエリトリン−結合体化ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともに４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳ＋５％ＦＢＳ中で洗浄し、そして１００μｌ ＰＢＳ中に再懸濁した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて蛍光を測定した。各々の蛍光プロファイルにつき、１００００細胞を分析した。図３３で報告される結果は、ｐＥＴ−Ａｐｐ形質転換体が、Ｃｈａｎｇ細胞に付着し得、９０．３％の蛍光シフトを与えることを示す。Ｓ２６７Ａ形質転換体もまた、付着し得る（９１．０％）。非形質転換Ｅ．ｃｏｌｉは、Ｃｈａｎｇ細胞に付着し得なかった（ＦＡＣＳプロットの底）。
【０２４３】
ＮａｄＡに関して、ＦＡＣＳの結果は、免疫蛍光顕微鏡データと一致した。図３４Ａおよび図３４Ｂに示されるように、単層とともにインキュベートしたｐＥＴ−Ａｐｐ形質転換体は、高いレベルの上皮細胞に対する接着および目に見える細菌−細菌凝集物を実証した。Ｓ２６７Ａ変異体について、接着および細菌凝集が増強された（図３４Ｃおよび３４Ｄ）。形質転換コントロールは、接着性を示さなかった（図３４Ｇ）。最初の４２アミノ
酸の欠失もまた、接着性を喪失させた。
【０２４４】
Ｃｈａｎｇ上皮細胞と対照的に、ＨＵＶＥＣ内皮細胞をｐＥＴ−Ａｐｐ形質転換体をもちいて試験した場合、接着性が見られなかった。敗血症および髄膜炎を発症させるために、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、ヒト内皮細胞との相互作用を必要とする。従って、Ａｐｐは、病理学的内皮レベルでのコロニー形成ではなく、ヒト呼吸器上に粘膜のレベルでのコロニー形成の第１工程に関与し得る。
【０２４５】
（Ａｐｐ結合活性の局在化および特異性）
Ａｐｐの結合領域を同定するために、Ａｐｐβと命名されたキメラタンパク質を使用した。このタンパク質は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＩｇＡ１プロテアーゼのリーダーペプチドに融合されたＡｐｐのＣ末端ドメイン（アミノ酸１０７７〜１４５４）からなる。淋菌のリーダー配列は、よく特徴づけられており、Ｅ．ｃｏｌｉ中で機能するので、それを選択した。プラスミドｐＥＴ−Ａｐｐβは、配列番号２６および２７を使用してたＰＣＲにより増幅された、１．１ｋｂｐＤＮＡフラグメントを含む。
【０２４６】
ｐＥＴ−Ａｐｐβ構築物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質導入した。ＦＡＣＳ局在化研究は、Ａｐｐβが、Ｅ．ｃｏｌｉの表面に局在化されることを確認した。Ｃｈａｎｇ上皮細胞を使用したインビトロ接着アッセイは、免疫蛍光法によって接着を示した（図３４Ｅおよび３４Ｆ）。ＦＡＣＳ分析は、ｐＥＴ−Ａｐｐβ形質転換体が、まだ上皮細胞に接着し得るが、それがｐＥＴ−Ａｐｐ形質転換体より低いレベル（７４．２％の移行）であることを示した。
【０２４７】
これらの結果は、Ａｐｐ結合ドメインが、そのＣ末端領域（残基１０７７と残基１１７６との間の１００マーのフラグメント中）に位置することを示す。
【０２４８】
精製された組換えタンパク質もまた研究した。Ａｐｐ−α−Ｈｉｓは、ポリＨｉｓタグに融合されたＡｐｐのＮ末端部分（アミノ酸４３〜１０８４）からなる。プラスミドｐＥＴ−Ａｐｐα−Ｈｉｓは、配列番号２４および２５を用いて、ＰＣＲにより増幅されたＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ ３．１ｋｂｐフラグメントを含む。ＦＡＣＳ結合アッセイにより、精製された組換えＡｐｐ−α−Ｈｉｓの結合活性を、Ａｐｐ−Ｈｉｓの結合活性と比較した。Ｃｈａｎｇ細胞を、漸増濃度のＡｐｐ組換えタンパク質またはリポタンパク質ＮＭＢ２１３２−Ｈｉｓ（ネガティブコントロール）とともにインキュベートした。Ａｐｐ−Ｈｉｓ（黒菱形）の結合は、用量依存的様式で増大し、そして約５０μｇ／ｍｌの濃度でプラトーに達したが、Ａｐｐα−Ｈｉｓ（黒四角）の結合は、非常に低かった（図３５）。コントロールＮＭＢ２１３２−Ｈｉｓ（黒三角）は、Ｃｈａｎｇ細胞に結合できなかった。
【０２４９】
Ａｐｐとの相互作用に関連する分子の生化学的性質を探究するために、Ｃｈａｎｇ細胞を、結合実験の前に、プロナーゼまたはホスホリパーゼＡ２で処理した。１ウェルあたり１０５細胞をマイクロプレート中に置き、ＦＣＳを含まないＤＭＥＭ中で、３７℃、５％ＣＯ２で３０分間、（ａ）プロナーゼ（２５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、もしくは１０００μｇ／ｍｌ）または（ｂ）ホスホリパーゼＡ２（５０μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、もしくは８００μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。酵素のインキュベーションの後、等量の完全培地を、各ウェルに添加して反応を止めた。続いて、細胞を１００μｇ／ｍｌのＡｐｐ−Ｈｉｓまたは培地単独と混合し、そして４℃で１時間インキュベートした。図３６に示すように、プロナーゼ処理（左側カラム）は、Ｃｈａｎｇ細胞へのＡｐｐα−Ｈｉｓタンパク質の結合を著明に低減し、一方、ホスホリパーゼＡ２での処理（右側カラム）は、この結合を低減しなかった。従って、Ｃｈａｎｇ細胞上のＡｐｐのためのレセプターは、タンパク質性である。
【０２５０】
異なる細胞株に対する接着もまた試験した（図３７）。培養細胞を異なる３つの濃度のＡｐｐ−Ｈｉｓ（１００μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌおよび６．２５μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした後、Ｃｈａｎｇ細胞およびＨｅｐＧ２細胞への高いレベルの結合、Ａ−５４９細胞への中程度のレベルの結合、およびＨｅＬａ細胞への最少のレベルの結合が見られた。Ｈｅｃ−ｌ−Ｂ上皮細胞株、Ｈｅｐ−２上皮細胞株、１６ＨＢＥ１４ｏ上皮細胞株またはＨＵＶＥＣ内皮細胞への結合は見られなかった。
【０２５１】
（Ａｐｐ ノックアウト）
Ａｐｐに対する接着機能を示唆するＥ．ｃｏｌｉでの研究の後、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの同系変異株を構築した。出発株はＭＣ５８であった。ＭＣ５８のａｐｐ遺伝子を短縮し、そしてプラスミドｐＢＳＵＤＡｐｐＥＲＭ（これは、対立遺伝子交換のため、短縮ａｐｐ遺伝子およびｅｒｍＣ遺伝子（エリスロマイシン耐性）を含む）を有する親株を形質転換することによって抗生物質カセットで置き換えた。簡潔に述べると、開始コドンを含む６００ｂｐの上流隣接領域および終始コドンを含む７００ｂｐの下流隣接領域を、配列番号２８〜３１のプライマーを使用してＭＣ５８から増幅した。フラグメントを、標準的な技術を使用して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔへとクローン化し、そしてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５へと形質転換した。全てのサブクローン化を完了すると、本質的にコンピテントなＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ＭＣ５８株を、ＧＣ寒天プレート上で一晩増殖したいくつかのコロニーを選択することによって形質転換し、そしてそれらを１μｇのプラスミドＤＮＡを含む２０μｌの１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．５）と混合した。この混合物を、ＧＣ寒天プレート上にスポットし、５％ＣＯ２、３７℃で６時間インキュベートし、次いでＰＢＳ中に希釈し、そして５μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含むＧＣ寒天プレート上に広げた。ＭＣ５８ゲノム中のａｐｐ遺伝子欠損をＰＣＲによって確認した。Ａｐｐ発現の欠損を、ウェスタンブロット分析によって確認した。
【０２５２】
野性ＭＣ５８型および同系ＭＣ５８Δａｐｐ変異株の接着を、Ｃｈａｎｇ細胞上で評価した。野生型株と比較したノックアウト変異体の結合は、約１／１０に（異なる実験において１／３〜１／２７の範囲である）減少した（図３８）。Ｈｅｐ２細胞株および１６ＨＢＥ１４ｏ細胞株を用いて、そしてＨＵＶＥＣ内皮細胞を用いて、ａｐｐ−変異体と親株との間での差異は、観察されなかった。このことは、Ａｐｐがこれらの細胞に対する接着を媒介しないことを確認した。
【０２５３】
カプセル化の背景において、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの接着に寄与する非繊毛付着因子は、以前に報告されたことはない。
【０２５４】
Ａｐｐ発現を、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ＭＣ５８において研究した。一晩増殖したプレートからのコロニーを、ＧＣブロス中に希釈し、そして３７℃にて、５％ＣＯ２でインキュベートした。ＯＤ６２０ｎｍが０．５（中程度の対数期）および０．８（安定期）の時にサンプルを採取し、そしてウェスタンブロットによって分析した。見かけの分子量（約１６０ｋＤａおよび約１４０ｋＤａ）を有する２つのバンドを、対数期細菌の全細胞溶解物で検出したが（図３９、レーン１）、安定期細菌は、約１４０ｋＤａでの弱いバンドのみを示した（レーン３）。予測されたように、ＡｐｐはΔＡｐｐ変異体中で観察されなかった（レーン２および４）。
【０２５５】
マークされた比較において、野生型ＭＣ５８の上清サンプルは、約１４０ｋＤａのバンドおよびその量が、対数期よりも安定期において高いことを示した（図４０、レーン３およびレーン１）。安定期のサンプルはまた、約１００ｋＤａで反応性のバンドを示した。
【０２５６】
本発明は、例示のみの方法によって上記され、そして本発明の範囲および精神内で維持したままで改変はなされ得ることが理解される。
【０２５７】
【表５】
【０２５８】
【表６−１】
【０２５９】
【表６−２】
【０２６０】
【表６−３】
【０２６１】
【表６−４】
【０２６２】
【表６−５】
【０２６３】
【表６−６】
【０２６４】
【表７】
【０２６５】
（配列表）
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に引用される全ての文献は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、生化学の分野に関し、より具体的には、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属の病原性細菌（例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）の生化学に関する。
【背景技術】
【０００３】
特許文献１、特許文献２、特許文献３、および特許文献４は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｇｉｔｉｄｉｓおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来のタンパク質を開示する。血清群ＢのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの完全ゲノム配列は、公開されており［非特許文献１］、ワクチン抗原を同定するために分析にかけられている［非特許文献２］。このタンパク質の発現に対するアプローチは、特許文献５に開示される。血清群ＡのＮ．ｍｅｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの完全ゲノム配列もまた、公知である［非特許文献３］。
【０００４】
しかし、配列データのみでは、この病原体についての全てを表さない。本発明の目的としては、以下が挙げられる：（ａ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ生化学に介入する方法を提供すること；（ｂ）既知のＮｅｉｓｓｅｒｉａタンパク質についての新たな用途を提供すること；（ｃ）既知のＮｅｉｓｓｅｒｉａタンパク質の代替形態および改良形態（例えば、酵素的に不活性な形態の、既知のタンパク質または既知のタンパク質のタンパク質分解性産物）を提供すること；ならびに（ｄ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａの付着を研究および調節するために有用な物質を提供すること。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第９９／２４５７８号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９９／３６５４４号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９９／５７２８０号パンフレット
【特許文献４】国際公開第００／２２４３０号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０１／６４９２２号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔｅｔｔｅｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：１８０９−１８１５
【非特許文献２】Ｐｉｚｚａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：１８１６−１８２０
【非特許文献３】Ｐａｒｋｈｉｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ（２０００）４０４：５０２−５０６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（本明細書中で使用される命名法）
「ＯＲＦ４０」は、ＷＯ９９／３６５４４の実施例１に開示される。血清群ＡおよびＢのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の配列が、開示される（この中で、配列番号１〜６）。他の形態のタンパク質は、ＷＯ９９／３１１３２およびＷＯ９９／５８６８３に開示
され、ＧｅｎＢａｎｋにおいてもまた、見出され得る（ｇｉ登録番号：１１３５２９０２、７２２８５６２、１４５７８０１５、１２９５８１０７、７２２８５８６、７２２８５７２、７２２８５９４、７２２８５８８、１４５７８０１３、７２２８５６８、７２２８５４６、７２２８５４８、７２２８５９２、１４５７８００９、７２２８５５８、７２２８６００、７２２８５９６、７２２８５４２、７２２８５７４、７２２８５５２、７２２８５５４、１４５７８０２３、１４５７８０２１、１１３５４０８０、７２２８５８４および７２２８５９０を参照のこと）。
【０００８】
「Ａｐｐ」（付着および貫通タンパク質）は、ＷＯ９９／２４５７８の実施例７７に「ＯＲＦ１」として開示される。血清群ＡおよびＢのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の配列ならびにＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の配列が開示される（この中で、配列番号６４７〜６５４）。他の形態のタンパク質は、ＷＯ９９／５５８７３に開示され、ＧｅｎＢａｎｋにおいてもまた、見出され得る（ｇｉ登録番号：１１２８０３８６、７２２７２４６、１１０７１８６５、６９７７９４１、１１０７１８６３、１１２８０３８７、７３７９２０５を参照のこと）。
【０００９】
血清群ＢのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の「ＮａｄＡ」（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａの付着因子Ａ）は、タンパク質「９６１」として、ＷＯ９９／５７２８０（配列番号２９４３および２９４４）中に、そして「ＮＭＢ１９９４」としてＴｅｔｔｅｌｉｎらによって（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：１１３５２９０４および７２２７２５６もまた参照のこと）、および本明細書中の図９において開示される。
【００１０】
これらのタンパク質は、好ましくは、融合タンパク質以外として（例えば、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ｈｉｓタグまたは同様のものを伴わずに）発現される。
【００１１】
本発明に従う使用に好ましいタンパク質は、血清群ＢのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ
ＭＣ５８株、２９９６株または３９４／９８株（Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ株）のタンパク質である。しかし、本発明は、一般的には、株によって限定されないことが理解される−特定のタンパク質（例えば、「ＯＲＦ４０」、「Ａｐｐ」など）に対する言及は、任意の株由来のタンパク質を含むととられ得る。従って、一般的には、任意の特定のタンパク質に対する言及は、上記に開示された配列のうちの１つと配列同一性を共有するタンパク質を含む。「配列同一性」の程度は、好ましくは、５０％より高い（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上）。これは、変異体および対立遺伝子改変体を含む。本発明の状況下において、配列同一性は、好ましくは、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）中で実行されるようなＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。このプログラムは、以下のパラメータを用いるアフィンギャップ検索を使用する：ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝１２およびｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝ｌ。典型的には、２つのタンパク質間の５０％以上の同一性は、機能的に等価であることを示すと考えられる。
【００１２】
ＷＯ９９／２４５７８、ＷＯ９９／３６５４４およびＷＯ９９／５７２８０中で使用される命名法はまた、本明細書中においても使用される（例えば、ＷＯ９９／２４５７８およびＷＯ９９／３６５４４において使用されるような、「ＯＲＦ４」、「ＯＲＦ４０」、「ＯＲＦ４０−１」など；ＷＯ９９／５７２８０において使用されるような、「ｍ９１９」、「ｇ９１９」および「ａ９１９」など）。
【００１３】
（分泌されたＡｐｐ）
ＧＳＴまたはｈｉｓタグ融合パートナーを伴わずにＥ．ｃｏｌｉ中で発現される場合、Ａｐｐは、約１６０ｋＤａの前駆体として外膜に露出し、ここでＡｐｐは、プロセシングされ、培養物中に分泌されることが見出されている。
【００１４】
従って、本発明は、プロセシングされたＡｐｐタンパク質を精製するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：非−Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ宿主細胞中でＡｐｐタンパク質をコードする遺伝子を発現させる工程；および培養培地からプロセシングされたＡｐｐタンパク質を精製する工程。
【００１５】
本発明はまた、このプロセスによって得られ得る精製されたタンパク質を提供する。
【００１６】
Ａｐｐタンパク質は、好ましくは、Ｎ末端にその野生型４２残基シグナルペプチドを含む（すなわち、いかなるＮ末端融合パートナーも使用されない）。Ｃ末端融合パートナーを含まないこともまた、好ましい。
【００１７】
培養培地からタンパク質を精製するために、この培養物は、遠心分離され得、そしてこのタンパク質は、上清から回収され得る。
【００１８】
非−Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ宿主細胞は、好ましくは細菌であり、最も好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉである。
【００１９】
細菌発現技術は、当該分野において公知である。細菌性プロモーターは、細菌性ＲＮＡポリメラーゼに結合し得、かつｍＲＮＡ中にコード配列（例えば、構造遺伝子）の下流（３’側）転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、コード配列の５’側末端に近位に通常配置される転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。細菌性プロモーターは、オペレーターと呼ばれる第２ドメインもまた有し得、この第２ドメインは、ＲＮＡ合成が開始する、隣接ＲＮＡポリメラーゼ結合部位と重なり得る。このオペレーターは、遺伝子レプレッサータンパク質がオペレータに結合し得、その結果、特定の遺伝子の転写を阻害するので、負に調節された（誘導性）転写を可能にする。構成的な発現が、オペレーターのような負の調節エレメントの非存在化で生じ得る。さらに、正の調節が、遺伝子アクチベータータンパク質結合配列（これは、存在する場合、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列に対して通常近位（５’側）である）によって達成され得る。遺伝子アクチベータータンパク質の例は、異化代謝産物アクチベータータンパク質（ＣＡＰ）であり、これは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のｌａｃオペロンの開始転写を助ける［Ｒａｉｂａｕｄら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：１７３］。従って、調節された発現は、正または負のいずれかであり得、よって、転写を増強するか減弱するかのいずれかであり得る。
【００２０】
代謝経路酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）［Ｃｈａｎｇら（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ １９８：１０５６］およびマルトースのような糖代謝酵素に由来するプロモーター配列が挙げられる。さらなる例としては、トリプトファン（ｔｒｐ）［Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら（１９８１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：７３１；米国特許第４，７３８，９２１号；ＥＰ−Ａ−００３６７７６およびＥＰ−Ａ−０１２１７７５］のような生合成酵素に由来するプロモーター配列が挙げられる。このｇ−ラオタマーゼ（ｌａｏｔａｍａｓｅ）（ｂｌａ）プロモーター系［Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ（１９８１）「Ｔｈｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｍｉｓｔａｋｅｓ」Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ３（Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ編）］、バクテリオファージλ ＰＬ［Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８］およびＴ５［米国特許第４，６８９，４０６号］プロモーター系もまた、有用なプロモーター配列を提供する。
【００２１】
さらに、天然に存在しない合成プロモーターもまた、細菌性プロモーターとして機能する。例えば、ある細菌性プロモーターまたはバクテリオファージプロモーターの転写活性化配列は、別の細菌性プロモーターまたはバクテリオファージプロモーターのオペロン配列と連結され得、合成ハイブリッドプロモーター［米国特許第４，５５１，４３３号］を作製する。例えば、このｔａｃプロモーターは、ｔｒｐプロモータとｌａｃオペロン配列の両方から構成されるハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターであり、これは、ｌａｃレプレッサ−によって調節される［Ａｍａｎｎら（１９８３）Ｇｅｎｅ ２５：１６７；ｄｅ Ｂｏｅｒら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２１］。さらに、細菌性プロモーターは、細菌性ＲＮＡポリメラーゼに結合を有して転写を開始する能力を有する非細菌起源の天然に存在するプロモーターを含み得る。非細菌起源の天然に存在するプロモーターはまた、適合性ＲＮＡポリメラーゼと結合され、原核生物において、いくつかの遺伝子の高レベル発現を生じ得る。このバクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、結合されたプロモーター系の１つの例である［Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；Ｔａｂｏｒら（１９８５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：１０７４］。さらに、ハイブリッドプロモーターはまた、バクテリオファージプロモーターおよびＥ．ｃｏｌｉオペレーター領域から構成され得る（ＥＰＯ−Ａ−０ ２６７ ８５１）。
【００２２】
機能性プロモーター配列に加えて、有効なリボソーム結合部位もまた、原核生物における外来遺伝子の発現のために有用である。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、このリボソーム結合部位は、シャイン−ダルガーノ（ＳＤ）配列と呼ばれ、開始コドン（ＡＴＧ）およびその開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流に配置される３〜９ヌクレオチド長の配列を含む［Ｓｈｉｎｅら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５４：３４］。このＳＤ配列は、Ｅ．ｃｏｌｉ １６Ｓ ｒＲＮＡのＳＤ配列と３’側末端との間の塩基の対形成によって、ｍＲＮＡのリボソームへの結合を促進すると考えられる［Ｓｔｅｉｔｚら（１９７９）「Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｉｇｎａｌｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ．」Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ編）］。弱いリボソーム結合部位を用いて真核生物遺伝子および原核生物遺伝子を発現させる［Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ］。
【００２３】
プロモーター配列は、ＤＮＡ分子と直接連結され得、この場合、Ｎ末端の第１アミノ酸は、常にメチオニンであり、このメチオニンは、ＡＴＧ開始コドンによってコードされる。所望の場合、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンと共にインビトロでインキュベーションするかまたは細菌性メチオニンＮ末端ペプチダーゼと共にインビボもしくはインビトロでインキュベーションするかによってタンパク質から切断され得る（ＥＰ−Ａ−０２１９２３７）。
【００２４】
通常、細菌によって認識される転写終止配列は、翻訳終止コドンの３’側に配置される調節領域であり、従って、コード配列に隣接するプロモーターと一緒になる。ｍＲＮＡの転写を指示するこれらの配列は、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドへと翻訳され得る。転写終止配列は、転写の終止を助けるステムループ構造（ｓｔｅｍ ｌｏｏｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を形成し得る約５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列を頻繁に含む。例としては、強力なプロモーターを有する遺伝子（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ中のｔｒｐ遺伝子およびタンパク質の生合成遺伝子）に由来する転写終止配列が挙げられる。
【００２５】
通常、プロモーター、シグナル配列（所望の場合）、目的のコード配列、および転写終止配列を含む上記の要素は、発現構築物中に一緒に配置される。発現構築物は、しばしば
、レプリコン（例えば、細菌のような宿主中に安定に維持され得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド））中に維持される。このレプリコンは、複製系を有し、そのため、レプリコンが発現のためかまたはクローニングおよび増幅のためのいずれかで原核生物宿主中に維持されることが可能である。さらに、レプリコンは、高コピー数または低コピー数のいずれかのプラスミドであり得る。高コピー数のプラスミドは、一般的には約５〜約２００、通常は約１０〜約１５０の範囲のコピー数を有する。高コピー数のプラスミドを含む宿主は、好ましくは、少なくとも約１０、およびより好ましくは少なくとも約２０のプラスミドを含む。高コピー数または低コピー数いずれかのベクターが、宿主に対するベクターおよび外来タンパク質の効果に依存して選択され得る。
【００２６】
あるいは、発現構築物は、組み込みベクターと共に細菌性ゲノム中に組み込まれ得る。組み込みベクターは、通常、ベクターの組み込みを可能にする細菌性染色体と相同である少なくとも１つの配列を含む。組み込みは、ベクター中の相同ＤＮＡと細菌性染色体との間の組換えから生じるようである。例えば、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株由来のＤＮＡによって構築される組み込みベクターは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ染色体（ＥＰ−Ａ−０１２７３２８）中に組みこむ。組み込みベクターはまた、バクテリオファージまたはトランスポゾン配列から構成され得る。
【００２７】
通常、染色体外型発現構築物および組み込み型発現構築物は、選択マーカーを含み得、形質転換された細菌株の選択を可能にする。選択マーカーは、細菌宿主中で発現され得、そしてアンピリシン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン（ネオマイシン）、およびテトラサイクリンのような薬物に対する耐性を細菌に付与する遺伝子を含み得る［Ｄａｖｉｅｓら（１９７８）Ａｎｎｅ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：４６９］。選択マーカーはまた、ヒスチジン、トリプトファンおよびロイシンの生合成経路における遺伝子のような生合成遺伝子も含み得る。
【００２８】
あるいは、上記の要素のいくつかは、形質転換ベクター中に共に配置され得る。形質転換ベクターは、通常、上記のような、レプリコン中に維持されるかまたは組み込みベクター中で顕在化されるかのいずれかである選択マーカーを含む。
【００２９】
染色体外レプリコンまたは組み込みベクターのいずれかである、発現ベクターおよび形質転換ベクターは、多くの細菌への形質転換のために開発されている。例えば、発現ベクターは、とりわけ以下の細菌について開発されている：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ［Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：５５８２；ＥＰ−Ａ−０ ０３６ ２５９およびＥＰ−Ａ−０ ０６３ ９５３；ＷＯ
８４／０４５４１］、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ［Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８；Ａｍａｎｎら（１９８５）Ｇｅｎｅ ４０：１８３；Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；ＥＰ−Ａ−０ ０３６ ７７６、ＥＰ−Ａ−０ １３６ ８２９およびＥＰ−Ａ−０ １３６ ９０７］、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ［Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５］；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ［Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５］、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ［米国特許第４，７４５，０５６号］。
【００３０】
外来性ＤＮＡを細菌宿主中に導入する方法は、当該分野で周知であり、通常ＣａＣ１２または他の薬剤（例えば、二価の陽イオンおよびＤＭＳＯ）で処理された細菌の形質転換を含む。ＤＮＡはまた、エレクトロポレーションによって細菌細胞に導入され得る。形質転換手順は、通常、形質転換される細菌種によって変化する。例えば、［Ｍａｓｓｏｎら（１９８９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６０：２７３；Ｐａｌｖａら（
１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：５５８２；ＥＰ−Ａ−０ ０３６ ２５９およびＥＰ−Ａ−０ ０６３ ９５３；ＷＯ ８４／０４５４１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ］、［Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８５６；Ｗａｎｇら（１９９０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：９４９、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ］、［Ｃｏｈｅｎら（１９７３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９：２１１０；Ｄｏｗｅｒら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６１２７；Ｋｕｓｈｎｅｒ（１９７８）「Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ｗｉｔｈ ＣｏｌＥ１−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｈ．Ｗ．ＢｏｙｅｒおよびＳ．Ｎｉｃｏｓｉａ編）；Ｍａｎｄｅｌら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３：１５９；Ｔａｋｅｔｏ（１９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９４９：３１８；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ］、［Ｃｈａｓｓｙら（１９８７）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．４４：１７３ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ］；［Ｆｉｅｄｌｅｒら（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １７０：３８、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ］；［Ａｕｇｕｓｔｉｎら（１９９０）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６６：２０３、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ］、［Ｂａｒａｎｙら（１９８０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４４：６９８；Ｈａｒｌａｎｄｅｒ（１９８７）「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ
ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ」：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊ．ＦｅｒｒｅｔｔｉおよびＲ．Ｃｕｒｔｉｓｓ ＩＩＩ編）；Ｐｅｒｒｙら（１９８１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５；Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５；Ｓｏｍｋｕｔｉら（１９８７）Ｐｒｏｃ．４ｔｈ Ｅｖｒ．Ｃｏｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １：４１２、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ］を参照のこと。
【００３１】
（付着性タンパク質）
国際特許出願ＷＯ０１／６４９２２の実施例２２は、ＮａｄＡタンパク質を発現するＥ．ｃｏｌｉが、ヒト上皮細胞に付着し得ることを開示する。この付着活性は、さらに研究されており、この付着活性は、ＡｐｐおよびＯＲＦ４０についても見出されている。
【００３２】
本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細胞の、上皮細胞への接着を防ぐための方法を提供する。
【００３３】
この章における「Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細胞」に対する言及は、任意の種のＮｅｉｓｓｅｒｉａ属細菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮ．ｌａｃｔａｍｉｃａを含む）を含む。しかし、好ましくは、この種は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓである。このＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、任意の血清群（血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹを含む）由来であり得る。しかし、最も好ましくは、これは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂである。
【００３４】
この章における「上皮細胞」に対する言及は、哺乳動物の上皮に見出されるかまたはその上皮由来の任意の細胞を含む。この細胞は、インビトロ（例えば、細胞培養物中）またはインビボに存在し得る。好ましい上皮細胞は、鼻咽頭由来である。この細胞は、最も好ましくは、ヒト細胞である。
【００３５】
（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ−上皮相互作用のブロック）
本発明は、上皮細胞へのＮｅｉｓｓｅｒｉａ細胞の付着を防止するための方法を提供し、ここで、上皮細胞に結合する１つ以上のＡｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡの
能力がブロックされる。
【００３６】
結合する能力は、種々の方法によりブロックされ得るが、最も簡便には、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡに特異的な抗体が用いられる。本発明はまた、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０またはＮａｄＡに特異的である抗体を提供する。この抗体は、好ましくは、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡに対して、少なくとも１０−７Ｍ、例えば、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ以上強いアフィニティーを有する。
【００３７】
本発明に従う使用のための抗体は、ポリクローナルであり得るが、好ましくは、モノクローナルである。用語「抗体」は、完全抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡなど）、抗原結合部位（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２など）を保持する完全抗体の誘導体、単鎖抗体（例えば、ｓＦｖ）、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、ヒト化抗体、一価抗体、ヒトモノクローナル抗体［例えば、Ｇｒｅｅｎ（１９９９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１１−２３；ＫｉｐｒｉｙａｎｏｖおよびＬｉｔｔｌｅ（１９９９）Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １２：１７３−２０１など］などを含むことが理解される。ヒト化抗体は、完全にヒトであることが好適であり得る［例えば、Ｆｌｅｔｃｈｅｒ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９：３９５−９６］。
【００３８】
抗体を用いることの代替として、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０またはＮａｄＡと、上皮細胞に対するそのレセプターとの間の相互作用のアンタゴニストが用いられ得る。さらなる代替物として、可溶性形態の上皮細胞レセプターが、デコイ（ｄｅｃｏｙ）として用いられ得る。これらは、レセプターの膜貫通領域、および、必要に応じて、細胞質領域を除去することにより生成され得る［例えば、ＥＰ−Ｂ２−０１３９４１７、ＥＰ−Ａ−０６０９５８０など］。
【００３９】
本発明の抗体、アンタゴニストおよび可溶性レセプターは、上皮細胞に対するＮｅｉｓｓｅｒｉａ細胞の付着を防止するための医薬として用いられ得る。
【００４０】
（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ遺伝子の発現の阻害）
本発明は、上皮細胞に対するＮｅｉｓｓｅｒｉａ細胞の付着を防止するための方法を提供し、ここで、１つ以上のＡｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡからのタンパク質発現が阻害される。この阻害は、転写および／または翻訳のレベルであり得る。
【００４１】
遺伝子の発現を阻害するための好ましい技術は、アンチセンスである［例えば、Ｐｉｄｄｏｃｋ（１９９８）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １：５０２−８；Ｎｉｅｌｓｅｎ（２００１）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ １０：３３１−４１；ＧｏｏｄおよびＮｉｅｌｓｅｎ（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６：３５５−３５８；Ｒａｈｍａｎら（１９９１）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ Ｄｅｖ １：３１９−３２７；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 第３１３巻および第３１４巻；Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（ＨａｒｔｍａｎｎおよびＥｎｄｒｅｓ編）；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ａｇｒａｗａｌ編）など］。抗菌性アンチセンス技術は、例えば、国際特許出願公開ＷＯ９９／０２６７３およびＷＯ９９／１３８９３に開示される。
【００４２】
本発明はまた、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０またはＮａｄＡをコードする核酸由来のｘ以上のヌクレオチドのフラグメントを含む核酸を提供し、ここで、ｘは、少なくとも８個（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０以上）である。この核酸は、代表的に、一本鎖である。
【００４３】
核酸は、好ましくは、式５’−（Ｎ）ａ−（Ｘ）−（Ｎ）ｂ−３’であり、ここで、０
≧ａ≧１５、０≧ｂ≧１５であり、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、そしてＸは、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０またはＮａｄＡをコードする核酸のフラグメントである。Ｘは、好ましくは、少なくとも８個（例えば、８個、１０個、１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２５個、３０個以上）のヌクレオチドを含む。ａおよびｂの値は、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５であり得る。核酸の−（Ｎ）ａ−および−（Ｎ）ｂ−における、個々のヌクレオチドＮの各々は、同じであっても、異なってもよい。核酸の長さ（すなわち、ａ＋ｂ＋Ｘの長さ）は、好ましくは、１００未満（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０など）である。
【００４４】
用語「核酸」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡおよびＲＮＡのアナログ（例えば、修飾した骨格（糖および／またはリン酸における修飾（例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミダイトなど）を有する）を含むもの）、ならびにペプチド核酸（ＰＮＡ）、ならびにプリン塩基およびピリミジン塩基、または天然のヌクレオチド塩基、化学的に修飾されたヌクレオチド塩基もしくは生化学的に修飾されたヌクレオチド塩基、非天然のヌクレオチド塩基、または誘導体化されたヌクレオチド塩基などを含む任意の他のポリマーもまた含む。本発明に従う核酸は、多くの方法で（例えば、化学合成により、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーから、生物自体からなど）調製され得、そして種々の形態（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プローブなど）をとり得る。
【００４５】
本発明のアンチセンス核酸は、上皮細胞に対するＮｅｉｓｓｅｒｉａ細胞の付着を防止するための医薬として用いられ得る。
【００４６】
（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ遺伝子のノックアウト）
本発明は、上皮細胞に対するＮｅｉｓｓｅｒｉａ細胞の付着を防止するための方法を提供し、ここで、１つ以上のＡｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡは、ノックアウトである。
【００４７】
本発明はまた、１つ以上のＡｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡがノックアウトされているＮｅｉｓｓｅｒｉａ細菌を提供する。
【００４８】
ノックアウト細菌を作製するための技術は周知であり、そしてノックアウトＮｅｉｓｓｅｒｉａは報告されている［例えば、Ｍｏｅら（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：３７６２−３７７１；Ｓｅｉｆｅｒｔ（１９９７）Ｇｅｎｅ １８８：２１５−２２０；Ｚｈｕら（２０００）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１８２：４３９−４４７など］。
【００４９】
ノックアウト変異は、遺伝子のコード領域に位置づけられ得るか、またはその転写制御領域内（例えば、プロモーター内）にあり得る。
【００５０】
ノックアウト変異は、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡをコードするｍＲＮＡのレベルを、野生型細菌により産生される１％未満、好ましくは、０．５％未満、より好ましくは、０．１％未満、および最も好ましくは、０％まで低下させる。
【００５１】
本発明のノックアウト変異体は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ感染を予防するための免疫原性組成物（例えば、ワクチン）として用いられ得る。このようなワクチンは、生存性が弱められた細菌としての変異体を含み得る。
【００５２】
（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ遺伝子の変異誘発）
本発明は、上皮細胞に対するＮｅｉｓｓｅｒｉａ細胞の付着を防止するための方法を提供し、ここで、１つ以上のＡｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡが、その活性を阻
害する変異を有する。
【００５３】
本発明はまた、変異タンパク質を提供し、ここで、変異タンパク質は、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡのアミノ酸配列、またはそのフラグメントを含むが、このアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸は変異される（例えば、Ａｐｐについて以下を参照のこと）。
【００５４】
変異されたアミノ酸は、好ましくは、上皮細胞に対する直接的もしくは間接的な付着の原因であるＡｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡの活性の低下または排除を生じる。例えば、変異は、酵素活性を阻害し得るか、またはタンパク質における結合部位を除去し得る。
【００５５】
本発明はまた、この変異タンパク質をコードする核酸を提供する。
【００５６】
本発明はまた、以下の工程を包含する、この核酸を産生する方法を提供する：（ａ）Ａｐｐ、ＯＲＦ４０またはＮａｄＡをコードする供給源核酸を提供する工程、および（ｂ）この供給源核酸に対して変異誘発（例えば、部位特異的変異誘発）を行って、変異タンパク質をコードする核酸を提供する工程。
【００５７】
変異としては、欠失、置換、および／または挿入（これらのいずれかは１つ以上のアミノ酸を含み得る）が挙げられ得る。代替として、変異は短縮を含み得る。
【００５８】
ビルレンス因子の変異誘発は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ［例えば、Ｐｏｗｅｒら（２０００）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４６：９６７−９７９；Ｆｏｒｅｓｔら（１９９９）Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３１：７４３−７５２；Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎら（１９９８）Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２７：６１１−６１６；Ｌｅｅら（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６３：２５０８−２５１５；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら（１９９３）Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ８：８９１−９０１など］を含む、多くの細菌［例えば、ＷＯ９３／１３２０２に記載される変異誘発；ＲａｐｐｕｏｌｉおよびＰｉｚｚａ，Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｏｘｉｎｓ（ＩＳＢＮ
０−１２−０５３０７８−３）の第１章；Ｐｉｚｚａら（２００１）Ｖａｃｃｉｎｅ １９：２５３４−４１；Ａｌａｐｅ−Ｇｉｒｏｎら（２０００）Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２６７：５１９１−５１９７；Ｋｉｔｔｅｎら（２０００）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６８：４４４１−４４５１；Ｇｕｂｂａら（２０００）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ
６８：３７１６−３７１９；Ｂｏｕｌｎｏｉｓら（１９９１）Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５：２６１１−２６１６など］について十分に確立されている。
【００５９】
変異誘発は、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡをコードする核酸に対して特異的に標的化され得る。あるいは、変異誘発は、全体的または無作為（照射、化学変異誘発などによって）であり得、これらは、代表的には、引き続いて、変異が、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡへと導入されているものについて細菌をスクリーニングされる。このようなスクリーニングは、ハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、サザンブロットまたはノーザンブロットなど）、プライマーベースの増幅（例えば、ＰＣＲ）、配列決定、プロテオミクス、異常なＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル移動などによるものであり得る。
【００６０】
本発明の変異タンパク質および核酸は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ感染を防止するための免疫原性組成物（例えば、ワクチン）として用いられ得る。
【００６１】
（スクリーニング方法）
本発明はまた、上皮細胞に対するＮｅｉｓｓｅｒｉａ細胞の結合を阻害するもの（アンタゴニスト）を同定するために化合物をスクリーニングするための方法を提供する。
【００６２】
スクリーニングのための潜在的アンタゴニストとしては、有機低分子、ペプチド、ペプトイド、ポリペプチド、脂質、金属、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリアミン、抗体、およびそれらの誘導体が挙げられる。有機低分子は、５０ダルトンと約２，５００ダルトンとの間、最も好ましくは、２００〜８００ダルトンの範囲の分子量を有する。物質の複合体混合物（例えば、天然物を含む抽出物、化合物ライブラリーまたは混合型コンビナトリアル合成の生成物）もまた、潜在的アンタゴニストを含む。
【００６３】
代表的には、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡのタンパク質は、上皮細胞および試験化合物と共にインキュベートされ、次いで、この混合物は、タンパク質と上皮細胞との間の相互作用が阻害されているか否かを確かめるために試験される。
【００６４】
阻害は、もちろん、標準（例えば、ネイティブのタンパク質／細胞相互作用）に対して決定される。好ましくは、この標準は、試験化合物の非存在下で測定されたコントロールの値である。標準は、本方法を行う前に決定され得るか、あるいは本方法が実施されている間、または本方法が実施された後に決定され得ることが理解される。これはまた、絶対的な標準であり得る。
【００６５】
タンパク質、細胞および化合物は、任意の順番で混合され得る。
【００６６】
好ましいハイスループットスクリーニング法について、このアッセイについての全ての生化学的工程は、例えば、試験管またはマイクロタイタープレート中の単一の溶液中で行われ、そして試験化合物は、初めに、単一の化合物濃度で分析される。ハイスループットスクリーニングの目的のために、実験条件は、スクリーニングされた全ての化合物の中から「ポジティブ（正）」の化合物として同定された試験化合物のある割合を達成するように調整される。
【００６７】
用いられ得る他の方法としては、例えば、リバースツーハイブリッドスクリーニング（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｗｏ ｈｙｂｒｉｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）［例えば、ＶｉｄａｌおよびＥｎｄｏｈ（１９９９）ＴＩＢＴＥＣＨ １７：３７４−３８１（ここで、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａレセプター相互作用の阻害は、転写を活性化することに失敗したとが報告されている）］が挙げられる。
【００６８】
本方法はまた、単純に、１つ以上の試験化合物を、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡと共にインキュベートし、そしてこれらが相互作用するか否かを決定する工程を包含する。次いで、タンパク質と相互作用する化合物は、タンパク質と上皮細胞との間の相互作用をブロックする、それらの能力について試験され得る。
【００６９】
本発明はまた、これらの方法を用いて同定された化合物を提供する。これらは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ感染を処置または予防するために用いられ得る。化合物は、好ましくは、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡに対して、少なくとも１０−７Ｍ（例えば、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ以上強い）アフィニティーを有する。
【００７０】
本発明はまた、（ａ）Ａｐｐおよび／またはＯＲＦ４０（および、必要に応じて、ＮａｄＡ）を発現するＥ．ｃｏｌｉ細菌、ならびに（ｂ）上皮細胞（例えば、ヒト上皮細胞）を含む組成物を提供する。
【００７１】
（外膜小胞（ＯＭＶ）における発現）
国際特許出願公報ＷＯ０１／５２８８５は、ＯＭＶワクチンに対するさらに規定された成分の添加が、それらの効力を有意に広げることを開示する。
【００７２】
ＮｍＢからのＯＭＶの調製は、当該分野で周知である。適切な調製物を得るための方法は、例えば、以下に開示される：Ｃｌａａｓｓｅｎら［Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９６）１４：１００１−１００８］；Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔら［Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９９）１７：２６１２−２６１９］；Ｐｅｅｔｅｒｓら［Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９６）１４：１００９−１０１５］；Ｆｕら［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＮＹ（１９９５）１２：１７０−７４］；Ｄａｖｉｅｓら［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．（１９９０）１３４：２１５−２２５］；Ｓａｕｎｄｅｒｓら［Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９９）６７：１１３−１１９］；Ｄｒａａｂｉｃｋら［Ｖａｃｃｉｎｅ（２０００）１８：１６０−１７２］；Ｍｏｒｅｎｏら［Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９８５）４７：５２７−５３３］；Ｍｉｌａｇｒｅｓら［Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９４）６２：４４１９−４４２４］；Ｎａｅｓｓら［Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９８）６６：９５９−９６５］；Ｒｏｓｅｎｑｖｉｓｔら［Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．（１９９８）９２：３２３−３３３］；Ｈａｎｅｂｅｒｇら［Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９８）６６：１３３４−４１］；Ａｎｄｅｒｓｅｎら［Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９７）１５：１２２５−３４］；Ｂｊｕｎｅら［Ｌａｎｃｅｔ（１９９１）３３８：１０９３−９６］など。
【００７３】
異種Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ遺伝子を発現するＥ．ｃｏｌｉから調製されたＯＭＶは、標準的な免疫源性試験において、精製した形態の抗原よりも、より良好な結果を与え得ることが本明細書中で見出されている。
【００７４】
従って、本発明は、細胞がＡｐｐ、ＯＲＦ４０またはＮａｄＡのタンパク質をコードする遺伝子を発現することを特徴とする、非Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ宿主細胞からＯＭＶを調製する方法を提供する。
【００７５】
本発明はまた、（ａ）このプロセスにより得られ得るＯＭＶ、および（ｂ）非Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ宿主細胞（この細胞は、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０またはＮａｄＡのタンパク質をコードする遺伝子を発現することを特徴とする）に由来する外膜小胞を提供する。
【００７６】
非Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ宿主細胞は、好ましくは、細菌であり、そして、最も好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉである。
【００７７】
より一般的には、本発明は、非Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ宿主細胞からＯＭＶを調製するための方法を提供し、この細胞が、以下のタンパク質の１つ以上をコードする遺伝子を発現することを特徴とする：
（Ａ） ＷＯ９９／２４５７８からの配列番号２〜８９２の偶数の配列番号；
（Ｂ） ＷＯ９９／３６５４４からの配列番号２〜８０の偶数の配列番号；
（Ｃ） ＷＯ９９／５７２８０からの配列番号２〜３０２０の偶数の配列番号：
（Ｄ） ＷＯ９９／５７２８０からの配列番号３０４０〜３１１４の偶数の配列番号；
（Ｅ） ＷＯ９９／５７２８０からの配列番号３１１５〜３２４１；
（Ｆ） Ｔｅｔｔｅｌｉｎら［前出］からの２１６０個のタンパク質（ＮＭＢ０００１〜ＮＭＢ２１６０）；
（Ｇ） （Ａ）〜（Ｆ）の１つ以上のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｈ） （Ａ）〜（Ｆ）の１つ以上のアミノ酸配列と配列同一性を共有するタンパク質；および
（Ｉ） （Ａ）〜（Ｆ）の１つ以上のフラグメントを含むタンパク質。
【００７８】
同様に、本発明はまた、（ａ）このプロセスにより得られ得るＯＭＶおよび（ｂ）非Ｎ
ｅｉｓｓｅｒｉａ宿主細胞（この細胞は、上記のタンパク質（Ａ）〜（Ｉ）の１つ以上をコードする遺伝子を発現することを特徴とする）に由来する外膜小胞を提供する。
【００７９】
（Ｈ）において言及される「配列同一性」の程度は、好ましくは、５０％より大きく（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上）、そしてこれは変異体および対立遺伝子改変体を含む。
【００８０】
（Ｉ）で言及される「フラグメント」は、（Ａ）〜（Ｆ）の１つ以上に由来する少なくともｎ個の連続するアミノ酸を含むべきであり、そして、特定の配列に依存して、ｎは７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００以上）である。好ましくは、フラグメントは、（Ａ）〜（Ｆ）の１つ以上のエピトープを含む。好ましいフラグメントは、ＷＯ００／７１５７４およびＷＯ０１／０４３１６に開示されるものである。
【００８１】
（Ａ）〜（Ｆ）について好ましいタンパク質は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ 血清抗原型Ｂにおいて見出される。
【００８２】
（Ａｐｐの変異体）
ＷＯ９９／２４５７８の配列番号６５０のアミノ酸２６７（本明細書中の配列番号３２）は、セリンである。Ａｐｐは、セリンプロテアーゼであると考えられており、そしてこのセリンは、その活性部位での触媒残基であると考えられる。標準的な配列整列技術が、任意の他のＡｐｐ配列についてこのＳｅｒ−２６７に対応するアミノ酸（例えば、ＷＯ９９／２４５７８の配列番号６５２の中のＳｅｒ−２６０、配列番号６５４の中のＳｅｒ−２６７など）を示す。
【００８３】
本発明は、Ａｐｐのアミノ酸配列（アミノ酸Ｓｅｒ−２６７、Ａｓｐ−１５８、およびＨｉｓ−１１５（配列番号３２に従って番号が付されている）の１つ以上が変異していることを除く）を含むタンパク質を提供する。変異は、欠失、挿入、または好ましくは、置換であり得る。置換は、好ましくは、１９個の他の天然に存在するアミノ酸のうちの１つとの置換であり、より好ましくは、グリシン、アラニン、チロシン、またはリジンとの置換である。
【００８４】
Ａｐｐは、アミノ酸１０６３と１１７１（配列番号３２に従い番号が付されている）との間の部位で切断されると考えられる。標準的な配列アラインメント技術により、任意の他のＡｐｐ配列についてのこれら２つの残基に対応するアミノ酸が明らかにされることが認識されている。
【００８５】
本発明は、Ａｐｐのアミノ酸配列（アミノ酸Ｓｅｒ−１０６４およびＡｒｇ−１１７１（配列番号３２に従って番号が付されている）の間の１つ以上のアミノ酸が変異していることを除く）を含むタンパク質を提供する。変異は、欠失、挿入、または好ましくは、置換であり得る。置換は、好ましくは、１９個の他の天然に存在するアミノ酸のうちの１つとの置換である。変異する残基は、好ましくは、Ｓ−１０６４、Ｄ−１０６５、Ｋ−１０６６、Ｌ−１０６７、Ｇ−１０６８、Ｋ−１０６９、Ａ−１０７０、Ｅ−１０７１、Ａ−１０７２、Ｋ−１０７３、Ｋ−１０７４、Ｑ−１０７５、Ａ−１０７６、Ｅ−１０７７、Ｋ−１０７８、Ｄ−１０７９、Ｎ−１０８０、Ａ−１０８１、Ｑ−１０８２、Ｓ１０８３、Ｌ−１０８４、Ｄ−１０８５、Ａ−１０８６、Ｌ−１０８７、Ｉ−１０８８、Ａ−１０８９、Ａ−１０９０、Ｇ−１０９１、Ｒ−１０９２、Ｄ−１０９３、Ａ−１０９４、Ｖ−１０９５、Ｅ−１０９６、Ｋ−１０９７、Ｔ−１０９８、Ｅ−１０９９、Ｓ−１１００、Ｖ−１１０１、Ａ−１１０２、Ｅ−１１０３、Ｐ−１１０４、Ａ−１１０５、Ｒ−１１０６、Ｑ−１１０７、Ａ−１１０８、Ｇ−１１０９、Ｇ−１１１０、Ｅ−１１１１、Ｎ−１
１１２、Ｖ−１１１３、Ｇ−１１１４、Ｉ−１１１５、Ｍ−１１１６、Ｑ１１１７、Ａ−１１１８、Ｅ−１１１９、Ｅ−１１２０、Ｅ−１１２１、Ｋ−１１２２、Ｋ−１１２３、Ｒ−１１２４、Ｖ−１１２５、Ｑ−１１２６、Ａ−１１２７、Ｄ−１１２８、Ｋ−１１２９、Ｄ−１１３０、Ｔ−１１３１、Ａ−１１３２、Ｌ−１１３３、Ａ−１１３４、Ｋ−１１３５、Ｑ−１１３６、Ｒ−１１３７、Ｅ−１１３８、Ａ−１１３９、Ｅ−１１４０、Ｔ−１１４１、Ｒ−１１４２、Ｐ−１１４３、Ａ−１１４４、Ｔ−１１４５、Ｔ−１１４６、Ａ−１１４７、Ｆ−１１４８、Ｐ−１１４９、Ｒ−１１５０、Ａ−１１５１、Ｒ−１１５２、Ｒ−１１５３、Ａ−１１５４、Ｒ−１１５５、Ｒ−１１５６、Ｄ−１１５７、Ｌ−１１５８、Ｐ−１１５９、Ｑ−１１６０、Ｌ−１１６１、Ｑ−１１６２、Ｐ−１１６３、Ｑ−１１６４、Ｐ−１１６５、Ｑ−１１６６、Ｐ−１１６７、Ｑ−１１６８、Ｐ−１１６９、Ｑ−１１７０、および／またはＲ−１１７１である。
【００８６】
あるいは、Ａｐｐは、アミノ酸９５６および／またはアミノ酸１１７８（配列番号３２に従い番号が付されている）で切断されると考えられる。標準的な配列アラインメント技術により、任意の他のＡｐｐ配列についてのこれら２つの残基に対応するアミノ酸が明らかにされることが認識されている。
【００８７】
本発明は、Ａｐｐのアミノ酸配列（アミノ酸Ｐｈｅ−９５６、Ａｓｎ−９５７、Ａｌａ−１１７８、およびＡｓｎ−１１７９（配列番号３２に従って番号が付されている）の１つ以上が変異していることを除く）を含むタンパク質を提供する。変異は、欠失、挿入、または好ましくは、置換であり得る。置換は、好ましくは、１９個の他の天然に存在するアミノ酸のうちの１つとの置換である。
【００８８】
本発明はまた、これらの変異タンパク質をコードする核酸を提供する。
【００８９】
本発明はまた、この核酸を生成する方法を提供する。この方法は、（ａ）Ａｐｐ、ＯＲＦ４０、またはＮａｄＡをコードするソース核酸を提供する工程；および（ｂ）このソース核酸に対して変異誘発（例えば、部位特異的変異誘発）を行い、変異タンパク質をコードする核酸を提供する工程を包含する。
【００９０】
本発明は、成熟Ａｐｐを提供する。
【００９１】
本発明はまた、プロセシングを受けたＡｐｐのアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。このプロセシングを受けたＡｐｐは、全長Ａｐｐ中の自己タンパク質分解切断部位の下流のＣ末端ドメインを含まない。例えば、全長Ａｐｐとして配列番号３２に基づき、本発明は、配列番号３３〜３６を提供する。自己タンパク質分解の間に除去され得るＣ末端ドメインは、配列番号３８および３９である。
【００９２】
本発明はまた、プロセシングを受けたＡｐｐのアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。ここで、プロセシングを受けたＡｐｐのＣ末端は、Ｐｈｅ−９５６である（配列番号３２に従って番号が付されている）。例えば、本発明は、配列番号３３および３５を提供する。他のＡｐｐ配列においてＰｈｅ−９５６に対応するアミノ酸は、標準的な配列アラインメント技術によって同定され得る。
【００９３】
本発明はまた、プロセシングを受けたＡｐｐのアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。ここで、プロセシングを受けたＡｐｐのＣ末端は、Ａｌａ−１１７８である（配列番号３２に従って番号が付されている）。例えば、本発明は、配列番号３４および３６を提供する。他のＡｐｐ配列においてＡｌａ−１１７８に対応するアミノ酸は、標準的な配列アラインメント技術によって同定され得る。
【００９４】
本発明はまた、プロセシングを受けたＡｐｐのアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。ここで、プロセシングを受けたＡｐｐは、配列番号３７、３８、および３９を含まない。
【００９５】
本発明はまた、配列番号３３、３４、３５、３６、３７、３８、および３９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。
【００９６】
本発明はまた、配列番号３３、３４、３５、３６、３７、３８、および３９の１つ以上に少なくともｐ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。特定の配列に基づき、ｐの値は、好ましくは、５０以上（例えば、６０、７０、８０、９０、９５、９９またはそれ以上）である。これらのタンパク質としては、ホモログ、オルソログ、対立遺伝子改変体、および機能的変異体が挙げられる。代表的に、２つのタンパク質の間の５０％以上の同一性は、機能的等価物であることを示すとみなされる。タンパク質間の同一性は、好ましくは、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）において、ギャップオープンペナルティー＝１２、ギャップエクステンションペナルティー＝１のパラメータのアフィンギャップ検索を用いて実行される、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。
【００９７】
本発明はさらに、配列番号３３、３４、３５、３６、３７、３８、および３９の１つ以上のフラグメントを含むタンパク質を提供する。このフラグメントは、この配列由来の少なくともｑ個の連続するアミノ酸を含むべきであり、そして特定の配列に依存して、ｑは７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上）である。好ましくは、このフラグメントは、この配列由来の１つ以上のエピトープを含む。
【００９８】
本発明はまた、本発明のこれらのタンパク質をコードする核酸を提供する。
【００９９】
（ＮａｄＡの対立遺伝子）
本発明は、配列番号１〜１４のうちの１つ以上のアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。
【０１００】
本発明はまた、配列番号１〜１４のうちの１つ以上に少なくともｘ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。ｘの値は、少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれ以上）である。これらのタンパク質としては、ホモログ、オルソログ、対立遺伝子改変体、および機能的変異体が挙げられる。
【０１０１】
本発明により使用するためのＮａｄＡの好ましい対立遺伝子は、配列番号３（または配列番号６）である。
【０１０２】
本発明はまた、配列番号１〜１４のうちの１つ以上のフラグメントを含むタンパク質を提供する。これらは、配列番号１〜１４のうちの１つ以上由来の少なくともｎ個の連続するヌクレオチドを含むべきであり、ここで、ｎは６以上（例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、またはそれ以上）である。このフラグメントは、配列番号１〜１４に共通の配列を含み得るか、または配列番号１〜１４に共通しない配列を含み得る。
【０１０３】
好ましいフラグメントは、配列番号１〜１４由来の１つ以上のエピトープを含む。他の好ましいフラグメントは、（ａ）配列番号１〜１４のＮ末端リーダーペプチド、（ｂ）ｋ
個のＮ末端アミノ酸残基を有さない配列番号１〜１４（ｋは１以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０など）である）、および（ｃ）ｌ個のＣ末端アミノ酸残基を有さない配列番号１〜１４（ｌは１以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０など）である）である。好ましいフラグメントは、（ｂ）または（ｃ）の両方に含まれる（すなわち、Ｃ末端およびＮ末端の両方での短縮物）。
【０１０４】
分類（ｂ）内の好ましいフラグメントは、Ｎ末端リーダーペプチドを欠く。従って、配列番号１、２、３、７、９、１１、および１３については、ｋの値は２３であり；配列番号４、５、６、８、１０、１２については、ｋの値は２５である。リーダーペプチドは、別のタンパク質によってか（すなわち、融合タンパク質を形成するため）または代替のＮ末端配列によって、別のタンパク質由来のリーダーペプチドと置換され得、効果的な発現がもたらされる。
【０１０５】
分類（ｃ）内の好ましいフラグメントは、Ｃ末端膜アンカーを欠く。従って、ｌの値は、５４である。このＣ末端欠失の小改変体が使用され得る（例えば、ｌは、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６）。
【０１０６】
Ｎ末端配列ＭＫＨまたはＭＱＨを有するタンパク質は、Ｎ末端配列ＭＳＭを有するタンパク質よりも好ましい。
【０１０７】
本発明のタンパク質は、７価配列（ＡＡ１ＡＡ２ＡＡ３ＡＡ４ＡＡ５ＡＡ６ＡＡ７）を含み得る。ここで、ＡＡ１はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、またはＭｅｔであり；ＡＡ２ＡＡ３ＡＡ４ＡＡ５ＡＡ６およびＡＡ７の各々は、独立して、任意のアミノ酸であり得；ｒは１以上の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）である。ｒが２以上である場合、各ＡＡ１ＡＡ２ＡＡ３ＡＡ４ＡＡ５ＡＡ６およびＡＡ７の意味は、ｒ個の７価反復の各々において同じであっても異なってもよい。この７価は、ロイシンジッパードメインを形成し得る。
【０１０８】
本発明のタンパク質は、多くの方法において（例えば、化学合成（少なくとも一部）によって、プロテアーゼを用いてより長いポリペプチドを消化することによって、ＲＮＡからの翻訳によって、細胞培養物から（例えば、組換え発現から）の精製によって、生物自体から（例えば、前立腺組織からの単離）の精製によって、細胞株供給源からの精製によって）調製され得る。
【０１０９】
本発明のタンパク質は、種々の形態（例えば、ネイティブ、融合、グリコシル化、非グリコシル化、リピド化、非リピド化など）において調製され得る。
【０１１０】
このタンパク質は、好ましくは、オリゴマー形態である。
【０１１１】
本発明のタンパク質は、固体支持体に結合または固定化され得る。
【０１１２】
本発明のタンパク質は、検出可能な標識（例えば、放射性標識、蛍光標識、またはビオチン標識）を含み得る。これは特に、免疫アッセイ技術において有用である。本発明のタンパク質は、好ましくは、単離された形態かまたは実質的に単離された形態である。
【０１１３】
一般的に、本発明のタンパク質は、天然で存在しない環境で提供される。例えば、それらは、それらの天然で存在する環境から分離される。特定の実施形態において、本発明の
タンパク質は、コントロールと比較してタンパク質に関して濃縮された組成物中に存在する。このように、精製されたタンパク質が提供され、それ故に、精製は、そのタンパク質が、他の発現タンパク質を実質的に含まない組成物中に存在することを意味し、実質的に含まないは、その組成物の９０％未満、通常６０％未満、およびより通常５０％未満が、他の発現タンパク質で構成されることを意味する。
【０１１４】
用語「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸ポリマーをいう。このポリマーは、直鎖状であっても分枝状であってもよく、改変アミノ酸を含み得、そして非アミノ酸によって割り込まれ得る。この用語はまた、天然で改変されたかまたは介入（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、リピド化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識要素との結合））によって改変されたアミノ酸ポリマーを包含する。例えば、１つ以上のアミノ酸のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを含む）および当該分野で公知の他の改変を含むタンパク質もまた、この定義の中に含まれる。タンパク質は、一本鎖または連結鎖として生じ得る。
【０１１５】
変異は、アミノ酸置換、付加、または欠失を含み得る。アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換または非必須アミノ酸を排除する置換（例えば、グリコシル化部位、リン酸化部位、もしくはアセチル化部位を改変するため、または機能に必要とされない１つ以上のシステイン残基の置換または欠失によるミスフォールディングを最小限に抑えるため）であり得る。保存的アミノ酸置換は、全体的な電荷、疎水性／親水性、および／または置換されたアミノ酸の立体的な量を保存する置換である。改変体は、このポリペプチドの特定の領域（例えば、機能的ドメインおよび／または、ポリペプチドがポリペプチドファミリーのメンバーである場合、コンセンサス配列に関連する領域）の増強された生物学的活性を保持するかまたは有するように設計され得る。改変体の生成のためのアミノ酸変更の選択は、アミノ酸のアクセシビリティ（内側 対 外側）、改変対ポリペプチドの熱安定性、所望のジスルフィド架橋、所望の金属結合部位などに基づき得る。
【０１１６】
本発明はまた、上記のような本発明のタンパク質をコードする核酸を提供する。本発明はまた、この核酸由来の少なくともｎ個の連続するヌクレオチドのフラグメントを含む核酸を提供する。ここで、ｎは１０以上（例えば、１２、１４、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００またはそれ以上）である。
【０１１７】
さらに、本発明は、好ましくは、「高ストリンジェンシー」条件下（例えば、０．１×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ溶液中で６５℃）で、本発明のタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズし得る核酸を提供する。
【０１１８】
本発明の核酸は、ハイブリダイゼーション反応（例えば、ノザンブロットもしくはサザンブロット、または核酸マイクロアレイもしくは「遺伝子チップ」）において、および増幅反応（例えば、ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＳＳＳＲ、ＬＣＲ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡなど）ならびに他の核酸技術において使用され得る。
【０１１９】
本発明の核酸は、多くの方法（例えば、全体または一部が化学合成によって、ヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）を用いてより長いポリヌクレオチドを消化することによって、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、細菌自体から、などで）調製され得る。
【０１２０】
本発明の核酸は、種々の形態（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プライマー、プローブ、標識化、非標識化など）をとり得る。
【０１２１】
本発明の核酸は、好ましくは、単離された形態または実質的に単離された形態である。
【０１２２】
本発明は、例えば、アンチセンスもしくはプロービングのために、またはプライマーとしての使用のために、上記の配列に相補的な配列を含む核酸を含む。
【０１２３】
用語「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡ、またそれらのアナログ（例えば、改変された骨格を有するアナログ）、またペプチド核酸（ＰＮＡ）などを含む。
【０１２４】
本発明に従う核酸は、例えば、放射性標識または蛍光標識で標識され得る。これは特に、核酸が、核酸検出技術において使用される場合（例えば、核酸が、ＰＣＲ、ＬＣＲ，ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡなどのような技術において使用するためのプライマーまたはプローブである場合）に有用である。
【０１２５】
本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列を含むベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター（例えば、核酸免疫に適したベクター））およびこのようなベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【０１２６】
（免疫）
本発明は、（ａ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ＮａｄＡタンパク質および／または（ｂ）ＮａｄＡタンパク質をコードする核酸を含む免疫原性組成物を提供する。
【０１２７】
本発明はまた、哺乳動物において抗体応答を誘導する方法を提供する。この方法は、本発明の免疫原性組成物を哺乳動物に投与する工程を包含する。この抗体応答は、好ましくは、防御抗体応答である。この防御抗体は、好ましくは、上皮細胞へのＮａｄＡおよび／またはＡｐｐの結合をブロックする。
【０１２８】
本発明はまた、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ感染に対して哺乳動物を保護する方法を提供する。この方法は、本発明の免疫原性組成物を哺乳動物に投与する工程を包含する。
【０１２９】
本発明はまた、医薬として使用するためのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ＮａｄＡタンパク質を提供する。
【０１３０】
本発明はまた、哺乳動物においてＮｅｉｓｓｅｒｉａ感染を防止するための医薬の製造におけるＮａｄＡタンパク質の使用を提供する。
【０１３１】
本発明はまた、哺乳動物においてＮｅｉｓｓｅｒｉａ感染を防止するための医薬の製造におけるＮａｄＡタンパク質をコードする核酸の使用を提供する。
【０１３２】
哺乳動物は、好ましくは、ヒトである。ヒトは、成人であり得、または好ましくは、子供であり得る。
【０１３３】
ＮａｄＡタンパク質は、好ましくは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ＮａｄＡである。これは、好ましくは、配列番号１〜１４の１つ以上のアミノ酸配列、またはそれらに対する配列同一性を有するかもしくはそれらのフラグメントを含むアミノ酸配列を含む（上記を参照のこと）。ＮａｄＡタンパク質は、好ましくは、オリゴマー形態（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、またはそれ以上）である。配列番号１〜１４のうち、配列番号１〜１２が好ましい。なぜならば、これらのＮａｄＡタンパク質に対する抗体は、種々の超ビルレントな対立遺伝子に対して殺菌性であるからである。しかし、非超ビルレントＮａｄＡ＋株に対する免疫応答が所望される場合、配列番号１３または１４が好ましい。当然、ＮａｄＡ混合物もまた、可能であり、特に１つより多いＮａｄＡ対立遺伝子を含
む混合物が可能である。
【０１３４】
本発明の免疫原性組成物は、治療的（すなわち、既存の感染を処置するため）または予防的（すなわち、将来の感染を防ぐため）に使用され得る。
【０１３５】
本発明の使用および方法は、特に、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（血清群Ａ、ＢおよびＣを含む）の感染に対する処置／防御のために有用である。本発明の使用および方法は、特に、ハイパービルレント（ｈｙｐｅｒｖｉｒｕｌｅｎｔ）系統であるＥＴ−５、ＥＴ−３７およびクラスターＡ４由来のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの株に対して有用である。
【０１３６】
この使用および方法は、特に、髄膜炎（特に、細菌性髄膜炎）および菌血症を含むがこれらに限定されない疾患を予防／処置するために有用である。
【０１３７】
治療的処置の効力は、本発明の組成物の投与後にＮｅｉｓｓｅｒｉａ感染をモニタリングすることによって試験され得る。予防的処置の効力は、この組成物の投与後にＮａｄＡに対する免疫応答をモニタリングすることによって試験され得る。
【０１３８】
本発明の組成物はさらに、哺乳動物に対して投与された場合に、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの系統ＩＩＩの株に対して防御的である免疫応答を誘発する抗原を含み得る。
【０１３９】
本発明の組成物は一般に、患者に対して直接的に投与される。直接的な送達は、非経口注射（例えば、皮下的、腹腔内、静脈内、筋内、または組織の間隙腔に）によってか、または直腸投与、経口投与、経膣投与、局所的投与、経皮投与、鼻腔内投与、眼内投与、経耳投与、または肺投与によって、達成され得る。
【０１４０】
本発明は、全身性免疫および／または粘膜性免疫を誘発するために使用され得る。
【０１４１】
投薬処置は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールであり得る。
【０１４２】
本発明の免疫原性組成物は、一般に、薬学的に受容可能なキャリアを含む。薬学的に受容可能なキャリアは、それ自体ではこの組成物を受容する患者に対して有害な抗体の産生を誘導せず、かつ過度な毒性を伴わずに投与され得る任意の物質であり得る。適切なキャリアは、タンパク質、ポリサッカリド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性ウイルス粒子のような、大きく緩徐に代謝される高分子であり得る。このようなキャリアは、当業者に周知である。薬学的に受容可能なキャリアとしては、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールのような液体が挙げられ得る。湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などのような補助物質もまた、このようなビヒクル中に存在し得る。リポソームは適切なキャリアである。薬学的なキャリアに関する全体的な考察は、Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ．第２０版，ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２において利用可能である。
【０１４３】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａの感染は身体の種々の領域に影響を及ぼす。そのため、本発明の組成物は、種々の形態で調製され得る。例えば、この組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、注射可能なように調製され得る。注射前の液体ビヒクルにおける溶液または懸濁液に適切な固体形態もまた調製され得る。この組成物は、例えば、軟膏、クリーム、粉末として、局所的投与のために調製され得る。この組成物は、例えば、錠剤もしくはカプセル剤としてか、またはシロップ剤（必要に応じて、風味付けされる）として、経口投与のために調製される。この組成物は、微粉末または噴霧を使用して、吸入剤として、
肺投与のために調製され得る。この組成物は、坐剤または腟坐薬として調製され得る。この組成物は、例えば、液滴剤として、鼻腔内投与、経耳投与または眼内投与のために調製され得る。
【０１４４】
この組成物は、好ましくは、無菌である。この組成物は、好ましくは、発熱物質を含まない。この組成物は、好ましくは、例えば、ｐＨ６とｐＨ８との間に、一般的には、約ｐＨ７に緩衝化される。
【０１４５】
免疫原性組成物は、免疫学的に有効な量の免疫原、および必要に応じて、任意の他の特定成分を含む。「免疫学的に有効な量」とは、単回用量または一連のもののなかの部分のいずれかにおいて、個体にその量を投与することが処置または予防のために有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康状態および身体状態、処置される個体の年齢、分類学的群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類、など）、その個体の免疫系が抗体を合成する能力、所望される防御の程度、ワクチンの処方、医学的状態に関する処置医の評価、および他の関連の要因に依存して変動する。この量は、慣用的な試験を通して決定され得る比較的広い範囲内にあると予期される。投薬処置は、単回投与スケジュールであっても、複数回投与スケジュール（例えば、ブースター投与を含む）であってもよい。この組成物は、他の免疫調節剤と組合せて投与され得る。
【０１４６】
この免疫原性組成物は、アジュバントを含み得る。組成物の効力を増強するための好ましいアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（Ａ）アルミニウム化合物（例えば、オキシ水酸化物のような水酸化アルミニウム、またはヒドロキシホスフェートまたはオルトホスフェートのようなリン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）、または異なるアルミニウム化合物の混合物であって、これらの化合物は任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶、アモルファスなど）をとり、そして吸収性が好ましい；（Ｂ）ＭＦ５９（５％スクアレン（Ｓｑｕａｌｅｎｅ）、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５、これはマイクロフルイダイザーを使用して、サブミクロンの粒子に処方される）；（Ｃ）リポソーム；（Ｄ）ＩＳＣＯＭ、これは、さらなる界面活性剤を欠き得る；（Ｅ）ＳＡＦ、これは１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニック−ブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含み、サブミクロンのエマルジョンに微小流動化されるか、またはより大きな粒子サイズのエマルジョンを生成するためにボルテックスされるかのいずれかである；（Ｆ）ＲｉｂｉＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）、これは、２％スクアレンと、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０と、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ｄｉｍｙｃｏｌａｔｅ）（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群由来の１つ以上の細菌細胞壁成分（好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ））とを含む；（Ｇ）サポニンアジュバント（例えば、ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１（ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭとしても公知））；（Ｈ）キトサン；（Ｉ）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（Ｊ）サイトカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＥＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、腫瘍壊死因子など；（Ｋ）微小粒子（すなわち、約１００ｎｍ〜約１５０μｍの直径、より好ましくは、約２００ｎｍ〜約３０μｍの直径、そして最も好ましくは、約５００ｎｍ〜約１０μｍの直径の粒子）、これは、生分解性かつ無毒性の物質（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）から形成される；（Ｌ）モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−デアシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）；（Ｍ）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油エマルジョンとの組合せ；（Ｎ）ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（すなわち、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含む）であって、必要に応じて、５−メチルシトシンが、シトシンの代わりに使用される；（Ｏ）ポリオキ
シエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル；（Ｐ）オクトキシノールと組合せたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤、または少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤（例えば、オクトキシノール）と組合せたポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤もしくはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤；（Ｑ）免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）およびサポニン；（Ｒ）免疫刺激物質および金属塩の粒子；（Ｓ）サポニンおよび水中油エマルジョン；（Ｔ）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて、＋ステロール）；（Ｕ）Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン（「ＬＴ」）、またはその解毒された変異体（例えば、Ｋ６３変異体またはＲ７２変異体）；（Ｖ）コレラ毒素（「ＣＴ」）、またはその解毒された変異体；（Ｗ）微小粒子（すなわち、約１００ｎｍ〜約１５０μｍの直径、より好ましくは、約２００ｎｍ〜約３０μｍの直径、そして最も好ましくは、約５００ｎｍ〜約１０μｍの直径の粒子）、これは、生分解性かつ無毒性の物質（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）（例えば、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド））、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）から形成される；ならびに（Ｘ）この組成物の効力を増強するための免疫刺激剤として作用する他の物質。アルミニウム塩（リン酸アルミニウム、そして特に、ヒドロキシホスフェート、および／または水酸化物および特にオキシ水酸化物）およびＭＦ５９が、非経口的免疫化のための好ましいアジュバントである。毒素変異体は、好ましい粘膜性アジュバントである。
【０１４７】
ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）などが挙げられる。
【０１４８】
本発明の組成物は、ＮａｄＡの他に、抗原（例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓまたは他の生物に対する防御抗原）を含み得る（例えば、ＤＴＰ抗原、Ｈｉｂ抗原など）。
【０１４９】
本発明の免疫原性組成物は、治療的（すなわち、既存の感染を処置するため）または予防的（すなわち、将来の感染を防ぐため）に使用され得る。治療的な免疫化は特に、免疫無防備状態の被験体においてＣａｎｄｉｄａ感染を処置するために有用である。
【０１５０】
本発明の免疫原性組成物においてタンパク質抗原を使用する代わりとして、この抗原をコードする核酸（好ましくは、ＤＮＡ（例えば、プラスミド形態にある））が使用され得る。
・本発明はさらに、以下を提供し得る：
・（項目１） 配列番号１〜配列番号１４のうちの１つ以上のアミノ酸配列を含むタンパク質。
・（項目２） 配列番号１〜配列番号１４のうちの１つ以上に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
・（項目３） 配列番号１〜配列番号１４のうちの１つ以上のフラグメントを含むタンパク質。
・（項目４） 項目１、項目２、または項目３に記載のタンパク質であって、該タンパク質は、ヘプタッド配列（ＡＡ１ＡＡ２ＡＡ３ＡＡ４ＡＡ５ＡＡ６ＡＡ７）ｒを含み、ここで：ＡＡ１は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＭｅｔであり：ＡＡ２ＡＡ３ＡＡ４ＡＡ５ＡＡ６およびＡＡ７の各々は、独立して、任意のアミノ酸であり得；そしてｒは、１以上の整数である、タンパク質。
・（項目５） 配列番号３のアミノ酸２４〜アミノ酸３５１を含む、項目３に記載のタンパク質。
・（項目６） 項目１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸。
・（項目７） （ａ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ＮａｄＡタンパク質および／または（ｂ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ＮａｄＡタンパク質をコードする核酸を含む、免疫原性組成物。
・（項目８） 哺乳動物における抗体応答を惹起するための方法であって、該哺乳動物に、項目７に記載の免疫原性組成物を投与する工程を包含する、方法。
・（項目９） 哺乳動物を、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ感染から保護するための方法であって、
該哺乳動物に、項目７に記載の免疫原性組成物を投与する工程
を包含する、方法。
・（項目１０） 哺乳動物におけるＮｅｉｓｓｅｒｉａ感染を予防するための医薬の製造における、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ＮａｄＡタンパク質、またはＮａｄＡタンパク質をコードする核酸の使用。
・（項目１１） 医薬としての使用のための、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ＮａｄＡタンパク質、またはＮａｄＡタンパク質をコードする核酸。
・（項目１２） 項目８〜１１のいずれか１項に記載の方法、使用、またはタンパク質であって、ここで、前記ＮａｄＡタンパク質が、配列番号１〜配列番号１２のうち１つ以上のアミノ酸配列を含む、方法、使用、またはタンパク質。
・（項目１３） 項目８〜１２のいずれか１項に記載の方法、使用、またはタンパク質であって、ここで、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ感染が、高ビルレント系統であるＥＴ−５、ＥＹ−３７およびクラスターＡ４由来のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの感染である、方法、使用、またはタンパク質。
・（項目１４） 項目７に記載の組成物であって、該組成物は、
哺乳動物に投与されたときに、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの系統ＩＩＩ株に対して保護する免疫応答を誘発する抗原、
をさらに含む、組成物。
・（項目１５） プロセシングされたＡｐｐタンパク質を精製するための方法であって、該方法は、以下の工程：
非Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ宿主細胞においてＡｐｐタンパク質をコードする遺伝子を発現させる工程；および
培養培地から、プロセシングされたＡｐｐタンパク質を精製する工程、
を包含する、方法。
・（項目１６） 前記非Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉである、項目１５に記載の方法。
・（項目１７） 項目１５または項目１６に記載のプロセスにより得られる、精製されたタンパク質。
・（項目１８） 上皮細胞へのＮｅｉｓｓｅｒｉａ細胞の付着を予防するための方法であって、ここで、該上皮細胞にＡｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡのうち１つ以上が結合する能力が、ブロックされる、方法。
・（項目１９） 前記結合が、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡに特異的な抗体を用いてブロックされる、項目１８に記載の方法。
・（項目２０） 上皮細胞へのＮｅｉｓｓｅｒｉａ細胞の付着を予防するための方法であって、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡのうち１つ以上からのタンパク質発現が阻害される、方法。
・（項目２１） 発現が、アンチセンス技術を用いて阻害される、項目２０に記載の方法。
・（項目２２） 核酸であって、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０またはＮａｄＡをコードする核酸由来のｘ個以上のヌクレオチドのフラグメントを含み、ここで、ｘが少なくとも８である、核酸。
・（項目２３） 項目２２に記載の核酸であって、該核酸は、式５’−（Ｎ）ａ−（Ｘ）−（Ｎ）ｂ−３’を有し、ここで０＞ａ＞１５であり、０＞ｂ＞１５であり、Ｎは任意のヌクレオチドであり、そしてＸは、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０またはＮａｄＡをコードする核酸
由来の少なくとも８個連続するヌクレオチドのフラグメントである、核酸。
・（項目２４） Ａｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡのうちの１つ以上がノックアウトされている、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細菌。
・（項目２５） 上皮細胞へのＮｅｉｓｓｅｒｉａ細胞の付着を予防するための方法であって、ここで、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０および／またはＮａｄＡのうち１つ以上が、変異を有し、該変異が、その活性を阻害する、方法。
・（項目２６） 変異タンパク質であって、ここで、該変異タンパク質が、Ａｐｐ、ＯＲＦ４０および／もしくはＮａｄＡのアミノ酸配列、またはそれらのフラグメントを含むが、ここで、該アミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸が、変異している、変異タンパク質。
・（項目２７） 項目２６に記載の変異タンパク質をコードする、核酸。
・（項目２８） 項目２７に記載の核酸を産生する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）Ａｐｐ、ＯＲＦ４０またはＮａｄＡをコードする供給源核酸を提供する工程；および
（ｂ）変異タンパク質をコードする核酸を提供するために該供給源核酸の変異誘発を実施する工程、
を包含する方法。
・（項目２９） 上皮細胞へのＮｅｉｓｓｅｒｉａ細胞の結合を阻害する化合物についてスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）Ａｐｐタンパク質、ＯＲＦ４０タンパク質および／またはＮａｄＡタンパク質を、上皮細胞および試験化合物と共にインキュベートする工程；
（ｂ）該タンパク質と該上皮細胞との間の相互作用が阻害されたか否かを決定するために、該混合物を試験する工程、
を包含する、方法。
・（項目３０） 項目２９に記載の方法を用いて同定される、化合物。
・（項目３１） Ａｐｐおよび／またはＯＲＦ４０（および必要に応じて、ＮａｄＡ）を発現するＥ．ｃｏｌｉ細菌ならびに（ｂ）上皮細胞を含む、組成物。
・（項目３２） 非Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ宿主細胞由来の外膜小胞（ＯＭＶ）を調製するための方法であって、該方法は、該細胞がＡｐｐタンパク質、ＯＲＦ４０タンパク質またはＮａｄＡタンパク質をコードする遺伝子を発現することにおいて特徴付けられる、方法。・（項目３３） 非Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ宿主細胞由来のＯＭＶを調製するための方法であって、該方法は、該細胞が、以下のタンパク質：
（Ａ）ＷＯ９９／２４５７８からの偶数の配列番号２〜配列番号８９２；
（Ｂ）ＷＯ９９／３６５４４からの偶数の配列番号２〜配列番号９０；
（Ｃ）ＷＯ９９／５７２８０からの偶数の配列番号２〜配列番号３０２０；
（Ｄ）ＷＯ９９／５７２８０からの偶数の配列番号３０４０〜配列番号３１１４；
（Ｅ）ＷＯ９９／５７２８０からの配列番号３１１５〜配列番号３２４１；
（Ｆ）Ｔｅｔｔｅｌｉｎら（上記）からの２１６０種のタンパク質、ＮＭＢ０００１〜ＮＭＢ２１６０；
（Ｇ）（Ａ）〜（Ｆ）のうち１つ以上のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｈ）（Ａ）〜（Ｆ）のうち１つ以上のアミノ酸配列と配列同一性を共有するタンパク質；および
（Ｉ）（Ａ）〜（Ｆ）のうち１つ以上のフラグメントを含むタンパク質
のうち１つ以上のコードする遺伝子を発現することにおいて特徴付けられる、方法。
・（項目３４） 非Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細胞がＥ．ｃｏｌｉである、項目３２または項目３３に記載の方法。
・（項目３５） 前記項目３２、項目３３、または項目３４に記載のプロセスにより得られ得るＯＭＶ。
・（項目３６） 非Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ宿主細胞由来の外膜小胞であって、該外膜小胞は、該細胞がＡｐｐタンパク質、ＯＲＦ４０タンパク質またはＮａｄＡタンパク質をコード
する遺伝子を発現することにおいて特徴付けられる、外膜小胞。
・（項目３７） 非Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ宿主細胞由来の外膜小胞であって、該細胞が、項目３３に記載のタンパク質（Ａ）〜タンパク質（Ｉ）のうち１つ以上をコードする遺伝子を発現することにおいて特徴付けられる、外膜小胞。
・（項目３８） Ａｐｐのアミノ酸配列を含むタンパク質であって、Ａｓｐ−１５８、Ｈｉｓ−１１５および／またはＳｅｒ−２６７のアミノ酸が変異しているものを除く、タンパク質。
・（項目３９） Ｓｅｒ−２６７、Ａｓｐ−１５８またはＨｉｓ−１１５が１９種類の他の天然に存在するアミノ酸のうち１つで置換されている、項目３８のタンパク質。
・（項目４０） Ａｐｐのアミノ酸配列を含むタンパク質であって、Ｓｅｒ−１０６４とＡｒｇ−１１７１との間の１つ以上のアミノ酸が変異しているものを除く、タンパク質。・（項目４１） 前記変異が、欠失、挿入、短縮または置換である、項目４０に記載のタンパク質。
・（項目４２） 項目４０または項目４１に記載のタンパク質であって、変異している残基が、Ｓ−１０６４、Ｄ−１０６５、Ｋ−１０６６、Ｌ−１０６７、Ｇ−１０６８、Ｋ−１０６９、Ａ−１０７０、Ｅ−１０７１、Ａ−１０７２、Ｋ−１０７３、Ｋ−１０７４、Ｑ−１０７５、Ａ−１０７６、Ｅ−１０７７、Ｋ−１０７８、Ｄ−１０７９、Ｎ−１０８０、Ａ−１０８１、Ｑ−１０８２、Ｓ−１０８３、Ｌ−１０８４、Ｄ−１０８５、Ａ−１０８６、Ｌ−１０８７、Ｉ−１０８８、Ａ−１０８９、Ａ−１０９０、Ｇ−１０９１、Ｒ−１０９２、Ｄ−１０９３、Ａ−１０９４、Ｖ−１０９５、Ｅ−１０９６、Ｋ−１０９７、Ｔ−１０９８、Ｅ−１０９９、Ｓ−１１００、Ｖ−１１０１、Ａ−１１０２、Ｅ−１１０３、Ｐ−１１０４、Ａ−１１０５、Ｒ−１１０６、Ｑ−１１０７、Ａ−１１０８、Ｇ−１１０９、Ｇ−１１１０、Ｅ−１１１１、Ｎ−１１１２、Ｖ−１１１３、Ｇ−１１１４、Ｉ−１１１５、Ｍ−１１１６、Ｑ−１１１７、Ａ−１１１８、Ｅ−１１１９、Ｅ−１１２０、Ｅ−１１２１、Ｋ−１１２２、Ｋ−１１２３、Ｒ−１１２４、Ｖ−１１２５、Ｑ−１１２６、Ａ−１１２７、Ｄ−１１２８、Ｋ−１１２９、Ｄ−１１３０、Ｔ−１１３１、Ａ−１１３２、Ｌ−１１３３、Ａ−１１３４、Ｋ−１１３５、Ｑ−１１３６、Ｒ−１１３７、Ｅ−１１３８、Ａ−１１３９、Ｅ−１１４０、Ｔ−１１４１、Ｒ−１１４２、Ｐ−１１４３、Ａ−１１４４、Ｔ−１１４５、Ｔ−１１４６、Ａ−１１４７、Ｆ−１１４８、Ｐ−１１４９、Ｒ−１１５０、Ａ−１１５１、Ｒ−１１５２、Ｒ−１１５３、Ａ−１１５４、Ｒ−１１５５、Ｒ−１１５６、Ｄ−１１５７、Ｌ−１１５８、Ｌ−１１５９、Ｑ−１１６０、Ｌ−１１６１、Ｑ−１１６２、Ｐ−１１６３、Ｑ−１１６４、Ｐ−１１６５、Ｑ−１１６６、Ｐ−１１６７、Ｑ−１１６８、Ｐ−１１６９、Ｑ−１１７０および／またはＲ−１１７１である、タンパク質。
・（項目４３） Ａｐｐのアミノ酸配列を含むタンパク質であって、Ｐｈｅ−９５６、Ａｓｎ−９５７、Ａｌａ−１１７８およびＡｓｎ−１１７９（本明細書中に記載の配列番号３２に従って番号付けられている）のうちの１つ以上のアミノ酸が変異しているものを除く、タンパク質。
・（項目４４） 前記変異が、欠失、挿入、短縮または置換である、項目４３に記載のタンパク質。
・（項目４５） プロセシングされたＡｐｐのアミノ酸配列を含むタンパク質であって、ここで、該プロセシングされたＡｐｐが、全長Ａｐｐ中の自己タンパク溶解切断部位の下流にあるＣ末端ドメインを含まない、タンパク質。
・（項目４６） 配列番号３３〜配列番号３６のうち１つ以上を含む、項目４５に記載のタンパク質。
・（項目４７） プロセシングされたＡｐｐのアミノ酸配列を含むタンパク質であって、ここで、該プロセシングされたＡｐｐのＣ末端がＰｈｅ−９５６（本明細書中に記載の配列番号３２に従って番号付けられている）である、タンパク質。
・（項目４８） プロセシングされたＡｐｐのアミノ酸配列を含むタンパク質であって、ここで、該プロセシングされたＡｐｐのＣ末端がＡｌａ−１１７８（本明細書中に記載の
配列番号３２に従って番号付けられている）である、タンパク質。
・（項目４９） 配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、および配列番号３９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
・（項目５０） 配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、および配列番号３９のうち１つ以上に対して、少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、タンパク質。
・（項目５１） 配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、および配列番号３９のうち１つ以上のフラグメントを含む、タンパク質。
・（項目５２） 項目３８〜５１のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする核酸。・（項目５３） 項目５２に記載の核酸を生成するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）Ａｐｐ、ＯＲＦ４０またはＮａｄＡをコードする供給源核酸を提供する工程、および
（ｂ）該供給源核酸上で変異誘発を実施して、項目３８〜５１のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする核酸を提供する工程、
を包含する、方法。
【０１５１】
（ディスクレイマー）
本発明は、好ましくは、以下を排除する：（ａ）２００２年７月２６日より前、より好ましくは、２００１年７月２７日より前に、公的配列データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋまたはＧＥＮＥＳＥＱ）において利用可能であったアミノ酸配列および核酸配列；（ｂ）２００２年７月２６日より前、より好ましくは、２００１年７月２７日より前の出願日、または適用可能な場合には優先日、を有する特許出願に開示されたアミノ酸配列および核酸配列。特に、以下の特許出願における配列番号の実体が排除され得る：ＷＯ９９／２４５７８；ＷＯ９９／３６５４４；ＷＯ９９／５７２８０；ＷＯ００／２２４３０；ＷＯ００／６６７４１；ＷＯ００／６６７９１；ＷＯ００／７１５７４；ＷＯ００／７１７２５；ＷＯ０１／０４３１６；ＷＯ０１／３１０１９；ＷＯ０１／３７８６３；ＷＯ０１／３８３５０；ＷＯ０１／５２８８５；ＷＯ０１／６４９２０；ＷＯ０１／６４９２２。
【０１５２】
（定義）
用語「含む」は、「含有する」および「構成される」を意味し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、排他的にＸからなり得るか、またはさらなる何かを含み得る（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】図１は、ＯＲＦ４０についての発現データを示す。
【図２】図２は、Ａｐｐについての発現データを示す。
【図３】図３は、ＮａｄＡについての発現データを示す。
【図４】図４は、ヒト細胞に対する接着に関与するタンパク質のＦＡＣＳ分析を示す。図４において、データは、左側から右側に、ＯＲＦ４０（黒三角）、Ａｐｐ（黒丸）、ＮａｄＡ（黒菱形）、およびＧＮＡ２１３２（黒四角）についてである。
【図５】図５は、ヒト細胞に対する接着に関与するタンパク質のＦＡＣＳ分析を示す。図５において、データは、左側から右側に、ＯＲＦ４０（黒三角）、Ａｐｐ（黒丸）、ＮａｄＡ（黒菱形）、およびＧＮＡ２１３２（黒四角）についてである。
【図６】図６は、ヒト細胞に対する接着に関与するタンパク質のＦＡＣＳ分析を示す。図６において、データは、左側から右側に、ＯＲＦ４０（黒三角）、Ａｐｐ（黒丸）、ＮａｄＡ（黒菱形）、およびＧＮＡ２１３２（黒四角）についてである。
【図７】図７は、ＯＲＦ４０の相同性を示す。
【図８】図８は、Ａｐｐの相同性を示す。
【図９Ａ】図９は、ＮａｄＡ対立遺伝子のアラインメントを示す。
【図９Ｂ】図９は、ＮａｄＡ対立遺伝子のアラインメントを示す。
【図９Ｃ】図９は、ＮａｄＡ対立遺伝子のアラインメントを示す。
【図１０】図１０は、対立遺伝子１〜３の関係を示す。
【図１１】図１１は、ＮａｄＡについて推定される二次構造を示す。
【図１２】図１２は、ＮａｄＡの上流および下流の配列に関する分析を示す。
【図１３】図１３は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの異なる株におけるＮａｄＡの発現に関するＰＣＲ分析を示す。
【図１４】図１４は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの異なる株におけるＮａｄＡの発現に関するイムノブロット分析を示す。
【図１５】図１５は、培養時間に伴うＮａｄＡ発現の変化を示す。
【図１６】図１６は、同系カプセル化および非同系カプセル化されたＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ細胞のＮａｄＡ ＦＡＣＳを示す。
【図１７】図１７は、Ｃｈａｎｇ細胞（１７Ａ〜１７Ｃ）またはＨｅＬａ細胞（１７Ｄ）に対する抗ＮａｄＡを使用して得られた免疫蛍光の結果を示す。
【図１８】図１８は、（Ａ）３７℃または（Ｂ）４℃でのインキュベーション後に、Ｃｈａｎｇ細胞に対する抗ＮａｄＡを使用して得られた免疫蛍光の結果を示す。
【図１９】図１９は、サポニンで処理されたＣｈａｎｇ細胞ついての免疫蛍光の結果を示す。
【図２０】図２０は、単球を使用して得られた免疫蛍光の結果を示す。
【図２１】図２１は、マクロファージを使用して得られた免疫蛍光の結果を示す。
【図２２】図２２は、ＮａｄＡ処理に応答した単球によるＩＬ−αの分泌を示す。
【図２３】図２３は、単球によるＩＬ−αの分泌に対する抗ＣＤ１４の効果を示す。
【図２４】図２４は、ＮａｄＡを発現するように形質転換されたＥ．ｃｏｌｉに対して抗ＮａｄＡを使用して得られた免疫蛍光の結果を示す。
【図２５】図２５は、（Ａ）抗ＮａｄＡ、（Ｂ）抗Ｅ．ｃｏｌｉまたは（Ｃ）両方を使用して形質転換されたＥ．ｃｏｌｉの染色を示す。
【図２６】図２６は、Ａｐｐの特徴に関する模式図である。Ｎ末端のリーダーペプチド、パッセンジャードメインおよびＣ末端のβドメインが示される。セリンプロテアーゼ活性部位、ＡＴＰ／ＧＴＰ結合部位、２つのアルギニンリッチ部位およびプロリンリッチ領域の位置が示される。ボックス１において切断部位を示す。ボックス２において、異なる自己輸送体の既知のタンパク質分解性部位の比較を示し、そしてコンセンサスな特徴を導き出す。矢印は、切断点を同定する；Ｘ＝任意のアミノ酸；ｈｙｄ＝疎水性残基；（Ａ，Ｓ）＝アラニンまたはセリン。
【図２７】図２７は、Ａｐｐを研究するために使用された構築物の模式図である。
【図２８】図２８は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける外膜および細胞外タンパク質のウェスタンブロットを示す。
【図２９】図２９は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける外膜および細胞外タンパク質のＦＡＣＳ分析を示す。
【図３０】図３０は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける外膜および細胞外タンパク質の免疫蛍光を示す。
【図３１】図３１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された全Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質を示す。
【図３２】図３２は、Ａｐｐ−ｈｉｓに対するマウス抗血清を使用した、粗製沈殿された培養上清のイムノブロットを示す。
【図３３】図３３は、Ｅ．ｃｏｌｉに対するウサギ抗血清を使用した、ＦＡＣＳ接着データを示す。接着に対して陽性の細胞のパーセンテージが、蛍光プロフィールのそばに示される。
【図３４】図３４は、細菌性の接着および凝集を示す、免疫蛍光顕微鏡データを示す。
【図３５】図３５は、正味の蛍光強度平均（ＭＦＩ）として表されたＡｐｐ−Ｈｉｓ（黒菱形）、Ａｐｐα−Ｈｉｓ（黒四角）およびＮＭＢ２１３２（黒三角）の濃度依存性結合を示す。
【図３６】図３６は、酵素濃度の漸増を伴う、プロナーゼ（左手の柱）またはホスホリパーゼＡ２（右手の柱）とのプレインキュベーションのＡｐｐ−Ｈｉｓ（１００μｇ／ｍｌ）結合に対する効果を示す。プロナーゼを、０、２５０、５００、１０００μｇ／ｍｌで試験した；ホスホリパーゼＡ２を、０、５０、２００、８００μｇ／ｍｌで試験した。
【図３７】図３７は、種々の異なる細胞に対する、１００、２５または６．２５μｇ／ｍｌでのＡｐｐ−Ｈｉｓタンパク質の細胞結合特異性の比較である。
【図３８】図３８は、野生型またはＡｐｐノックアウトのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ＭＣ５８細菌の結合を示す。
【図３９】図３９は、０．５または０．８のＯＤ６２０ｎｍで収集されたＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ＭＣ５８由来の全溶解産物のウェスタンブロット分析を示す。レーン１および３は、野生型ＭＣ５８を示し、そしてレーン２および４は、Ａｐｐノックアウトを示す。
【図４０】図４０は、図３９と並行した上清のウェスタンブロット分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１５４】
（本発明を実施するための態様）
（ＮａｄＡ相同性）
ＮａｄＡは、（ａ）ビルレンスに関与する非ピリ線毛関連付着因子である腸病原性ＹｅｒｓｉｎｉａのＹａｄＡ［Ｃｏｒｎｅｌｉｓ（１９９８）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１３１５−１３５２］および（ｂ）血清耐性に関与するタンパク質でありかつ防御抗原であるＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓのＵｓｐＡ２［Ｃｈｅｎら（１９９９）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：１３１０−１３１６］に対して相同性を示す。配列類似性は、主に、カルボキシル末端領域に密集している（最後の７０アミノ酸において５６〜６３％同一性）。この領域の外側では、同一性のレベルは２３〜２５％に低下する。
【０１５５】
ＹａｄＡおよびＵｓｐＡ２は、付着因子として同定された［Ｈｏｉｃｚｙｋら（２０００）ＥＭＢＯ Ｊ １９：５９８９−５９９９］。両方のタンパク質は、外膜に固定された、非常に安定で解離の困難な高分子量オリゴマー（１５０〜２００ｋＤａ）を形成する。ＮａｄＡもまた、髄膜炎菌の外膜において非常に安定な高分子量の凝集体を形成することが見出された。
【０１５６】
ＮａｄＡのアミノ酸配列が、分析された［Ｎｉｅｌｓｅｎら（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０：１〜６；ＬｅｖｉｎおよびＧａｒｎｅｒ（１９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９５５：２８３〜２９５；Ｂｅｒｇｅｒら（１９９５）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９２：８２５９〜８２６３；Ｂｏｒｏｎｅｒｇ−Ｂａｕｅｒら（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：２７４０〜２７４６］。二次構造分析が、図１１に示される。球状Ｎ末端および両親媒性Ｃ末端が示され、同様に、リーダーペプチド（ＬＰ）の位置および膜アンカーの位置もまた、示される。カルボキシル末端領域（アミノ酸３１０〜３６２）は、推定両親媒性β構造（黒で示されるβ鎖）および末端芳香族アミノ酸を有し、これらは、外膜アンカードメインの代表的特徴である。アミノ末端領域（アミノ酸２３〜９０）は、明確な二次構造を有さないが、このタンパク質の残りは、主にα−ヘリックスの性向（８４．６％）を有する。この領域中で、残基９０〜１４６および残基１８３〜２８８は、コイルドコイルを形成する高い確率を有する。さらに、残基１２２〜１４３は、７個組反復の「ａ」位置に４つのロイシン残基を
含み（Ｌ−ｘ（６）−Ｌ−ｘ（６）−Ｌ−ｘ（６）−Ｌ）、これらのロイシン残基は、ロイシンジッパードメイン（・・・）を形成し得る。コイルドコイルおよびロイシンジッパー配列の両方が、ダイマー形成に関与すること、そして２つ以上のαヘリックスの会合を介してモノマーのオリゴマー形成を媒介し得ることが、公知である。
【０１５７】
ＮａｄＡと、ＹａｄＡと、ＵｓｐＡ２との間の一次構造類似性がＣ末端にてクラスター形成され、従って、この３つのタンパク質間の全体的類似性は、二次構造レベルで保存されている。推定ロイシンジッパーが、ＮａｄＡとＵｓｐＡ２との両方に存在する。ＮａｄＡ、ＹａｄＡおよびＵｓｐＡ２は、４つの両親媒性β鎖および内部αヘリックス領域により形成されるカルボキシル末端膜アンカーを有し、コイルドコイルを形成する性向がある。ＹａｄＡおよびＵｓｐＡ２において、これらのαヘリックスが、コイルドコイル領域を形成し、モノマーのオリゴマー形成を媒介することが、示されている［Ｈｏｉｃｚｙｋら（２０００）ＥＭＢＯ Ｊ １９：５９８９〜５９９９；Ｃｏｐｅら（１９９９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１：４０２６〜４０３４］。
【０１５８】
ＮａｄＡの成熟形態中にシステイン残基が存在しないことは、ＮａｄＡホモログと共有される別の特徴である。
【０１５９】
（ＮａｄＡのゲノム環境）
１０８６ｂｐのｎａｄＡコード領域は、その３’末端にターミネーター配列が隣接し、５’末端には（図１２Ａ）、このコード領域は、ＡＴＧ開始コドンの８塩基対および４７塩基対上流に、それぞれ、推定リボソーム結合部位（ＲＢＳ；５’−ＡＡＧＧ−３’）および推定プロモーター領域を示す。
【０１６０】
このコード領域の１３０ｂｐ上流は、テトラヌクレオチドＴＡＡＡ（図１２Ａにおいて影付きの黒）の９回反復であり、その前に、−１０領域および−３５領域を含む第２推定プロモーターが存在する。このＴＡＡＡ反復の存在が原因で、この遺伝子は、相変化を受け得る遺伝子の１つとして列挙されていたが、この反復は、コード領域中には存在しない［Ｔｅｔｔｅｌｉｎら］。その相同遺伝子ＵｓｐＡ２は、ｎａｄＡ中と同じ位置に位置するテトラヌクレオチド反復（ＡＧＡＴ）を有し、この反復は、種々の株において変動する［Ｃｏｐｅら（１９９９）Ｊ，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１：４０２６〜４０３４］。
【０１６１】
ｎａｄａ遺伝子およびその上流領域のＧ＋Ｃ含量は、平均より低く（そのゲノムの残りの平均５１．５％に対して４５％）、このことは、水平転移によりこの遺伝子が獲得されたことを示す。
【０１６２】
このＮａｄＡ遺伝子およびその上流領域は、血清群Ａの株Ｚ２４９１の公開されたゲノム配列中には存在しない［Ｐａｒｋｈｉｋｋら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０４：５０２〜５０６］。ＭｅｎＡゲノムにおいて、データベース中に相同性が存在しない１６ヌクレオチドの短い配列が、このｎａｄＡ遺伝子を置換し（図１２Ｂ）、一方、その上流遺伝子および下流遺伝子（ｎｍｂ１９９３およびｎｍｂ１９９５）は、十分に保存されている（９１％同一性および９７％同一性）。ｎａｄＡ領域にすぐ隣接し、Ｚ２４９１血清群Ａ株中は存在しない配列の分析によって、このセグメントにはＴＣＡＧＡＣ直接反復が隣接することが示される。このことは、組換えの機構を示し得る。このＡ株において、上記１６ヌクレオチドストレッチは、そのストレッチに隣接するＴＣＡＧＡＣ反復の破壊された対を有する。
【０１６３】
（ＮａｄＡ遺伝子型の変動）
血清型Ａと血清型Ｂとの間のｎａｄＡ配列の差異を考慮して、１７５個の異なるＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株が分析のために選択された。１５０個の単離株が、５つの疾患
関連血清群（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＹおよびＷ−１３５）を示し、２５株が、健常キャリアから単離された。この分析はまた、Ｎ．ｇｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎ．ｃｉｎｅｒｅａおよびＮ．ｌａｃｔａｍｉｃａの各々株１つを含んだ。
【０１６４】
細菌は、Ｋｅｌｌｏｇｇ補充溶液（０．２２Ｍ Ｄ−グルコース、０．０３Ｍ Ｌ−グルタミン、０．００１Ｍ硝酸鉄（ＩＩＩ）および０．００２Ｍコカルボキシラーゼ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）を補充した淋菌（ＧＣ）培地寒天（Ｄｉｆｃｏ）上で、空気中５％ＣＯ２の加湿雰囲気下で、３７℃にて一晩、以前に記載されたようにして増殖された［Ｋｎａｐｐら（１９８８）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３２：７６５〜７６７；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９７７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３１：５５７〜５６３］。１つの細菌が、５００μｌのＰＢＳ中に溶解され、そして染色体ＤＮＡが、以前に記載されたようにして調製された［Ｔｉｎｓｌｅｙら（１９９６）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９３：１１１０９〜１１１１４］。
【０１６５】
この細菌は、ＰＣＲおよび／またはドットブロットハイブリダイゼーションによってスクリーニングされた。
【０１６６】
ｎａｄＡ遺伝子のＰＣＲ増幅は、ｎａｄＡのコード領域から３５０ｎｔ上流および下流にマッピングされるプライマー（順方向プライマー：配列番号１６；逆方向プライマー：配列番号１７）と、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｈｉｆｉ Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＧＩＢＣＯ）とを使用して、１０ｎｇの染色体ＤＮＡに対して実施された。ＰＣＲ条件は、（９５℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、そして６８℃で１分間の伸長）×３０サイクルであった。ＰＣＲ産物が、１％アガロースゲル上で分析され、そのサイズが、分子量マーカー１Ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（ＧＩＢＣＯ）を使用して決定された。増幅されたフラグメントは、Ｑｉａｑｕｉｃｋカラム（Ｑｉａｇｅｎ）にて精製され、その後、その増幅されたフラグメントの両方の鎖をウォーキングするプライマーによって、自動環状配列決定された（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３７７）。
【０１６７】
ドットブロッティングのために、使用されたプローブは、ｎａｄＡ遺伝子全体であり、これは、２９９６株から増幅され、そしてＲｏｃｈｅ ＤＩＧ Ｈｉｇｈ−Ｐｒｉｍｅ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、ジゴキシゲニンで標識された。各株の細胞懸濁物の１０μｌアリコートが、１０分間沸騰され、そしてナイロン膜（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）上にスポットされた。この膜は、ＵＶ光に２分間曝露すること、および製造業者により報告されたような調製およびシグナル検出のための標準的手順によって、ＤＮＡ架橋された。
【０１６８】
ｎａｄＡ遺伝子は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ中には存在せず、共生種であるＮ．ｌａｃｔａｍｉｃａおよびＮ，ｃｉｎｅｒｅａ中にも存在しなかった。しかし、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｔｉｄｉｓにおいて、単離株のうちの４７％が、ｎａｄＡ遺伝子の存在についてポジティブであった。
【０１６９】
ＰＣＲ（図１３）によって、ＮａｄＡ＋株であるＭＣ５８（レーン１）、９０／１８３１１株（レーン２）および２９９６株（レーン３）において、１８００ｂｐ産物が生成された。ＰＣＲによって、ＮａｄＡ−株であるＺ２４９１株およびＮＧ３／８８株（レーン５）において、４００ｂｐ産物が生成された。いくつかの株（例えば、９３／４２８６、Ｃ４６７８、２０２２、ＩＳＳ１１１３）は、２５００ｂｐのＰＣＲ産物（レーン４：Ｌ９３／４２８６）を生じた。
【０１７０】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの存在／非存在は、株の系統と相関性があった。侵襲性髄膜炎菌性疾患から単離された株は、多座酵素電気泳動（ＭＬＥＥ）によって、少数の過剰毒性系統：電気泳動型ＥＴ３７、ＥＴ５、クラスターＡ４、系統ＩＩＩ、亜群Ｉ、亜群ＩＩＩ、および亜群ＩＶ−１へと分類された［Ａｃｈｔｍａｎ（１９９５）Ｇｌｏｂａｌ
ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ ｄｉｓｅａｓｅ．，Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ ｄｉｓｅａｓｅ（Ｃａｒｔｗｉｇｈｔ編），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，Ｅｎｇｌａｎｄ．１５９〜１７５；Ｃａｕｇａｎｔ（１９９８）ＡＰＭＩＳ １０６：５０５〜２５］。最近、配列ベースの分類である多座配列型決定（ＭＬＳＴ）が導入された。これにより、上記の株は、それぞれ、配列型ＳＴ１１、ＳＴ３２、ＳＴ８、ＳＴ４１、ＳＴ１、ＳＴ５、ＳＴ４に分類される［Ｍａｉｄｅｎら（１９９８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９５：３１４０〜３１４５］。健常キャリアから単離された株は、多くの異なるＥＴ型およびＳＴ型に当てはまる。
【０１７１】
ｎａｄＡ遺伝子は、過剰毒性系統ＥＴ−５、ＥＴ−３７およびクラスターＡ４の５３個の株のうちの５１個（９６％）に存在したが、試験した系統ＩＩＩの株すべてに存在しなかった。２５個のキャリア株のうちの７個が、ポジティブであった。試験した血清群Ｃの株のうちのほとんどが、たとえ過剰毒性系統に属さないとしても、ポジティブであった。同じことは、血清群Ｂの株について、血清型２ａおよび２ｂとともに当てはまった。血清群Ａについて、亜群ＩＩＩに属する１つの株がポジティブであったが、亜群ＩＶ−１に属する他の２つの株は、ネガティブであった。
【０１７２】
系統ＩＩＩは、ほんの最近、欧州および米国において導入されただけであり、ニュージーランドにおける多年にわたる地理学的分離によって、この系統ＩＩＩが新規な遺伝子を獲得する能力が損なわれたようである。例えば、系統ＩＩＩをさらなる組換え事象から防ぐ周囲の染色体領域中に、変異が生じたかもしれない。可能な別の説明は、ＥＴ−５株、ＥＴ−４７株およびクラスターＡ４株は、ｎａｄＡがピークの適合を達成する必要があるが、系統ＩＩＩの単離株は、ｎａｄＡ挿入からいかなる有意な利益をも誘導し得ず、それによりネガティブ選択を受けるというものである。
【０１７３】
ｎａｄＡは、３つの過剰毒性Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ系統においてこのように過剰に提示される。ｎａｄＡは、過剰毒性株の部分集合に存在する外来遺伝子であるようである。
【０１７４】
（ｎａｄＡ対立遺伝子）
ＰＣＲ産物が差次的にサイズ分類され（図１３）、ＮａｄＡ＋株のうちのほとんどは、３つの異なるサイズにグループ分けされ得たので、各サイズを示す３６個の株について、遺伝子が配列決定された：２６個がポジティブ株であり、４株が長いＰＣＲ産物を有し、６株がＮａｄＡ−株であった。
【０１７５】
このネガティブ株において、公開された血清群Ａゲノム配列中に存在する配列と同一である、１６ｂｐ配列が見出された。
【０１７６】
４つの長いＰＣＲ産物株の配列の分析によって、１コピーのＩＳ１３０１による中断が示された。このＩＳ１３０１は、終止コドンを含む１６２アミノ酸の後でこのタンパク質を中断する。この挿入部位は、４つの株すべてにおいて同一であったが、ＩＳ１３０１の方向が異なった。このことは、独立した事象を示す。ＩＳ１３０１についての標的コンセンサス（５’−ＡＹＴＡＧ−３’）が、Ａ→Ｇ変異により生成されたヌクレオチド４７２位にて見出され、これには、ＴＡ重複が伴った。
【０１７７】
ｎａｄＡ＋株において、遺伝子サイズは１０８６ｂ〜１２１５ｂｐの範囲であり、結果
的なコードされるタンパク質のアミノ酸配列の変動は、３６２アミノ酸〜４０５アミノ酸であった。２６個のＮａｄＡ遺伝子のうちの２２個を十分に規定された３つの対立遺伝子にクラスター形成することが可能であった（図９および図１０；表Ｉ）。各対立遺伝子内のこのｎａｄＡ遺伝子の配列は同一であり、対立遺伝子間の全体的同一性は、９６％〜９９％の範囲である。この保存レベルは驚くべきものである。この保存レベルは、ｎａｄＡ遺伝子の弱い選択圧および／またはｎａｄＡ遺伝子が非常に最近獲得されたことを示唆する。後者の可能性は、この領域におけるゲノムの低Ｇ＋Ｃ含量と一致する（上記を参照のこと）。
【０１７８】
【表１】
図９Ａに示される配列は、そのＮ末端アミノ酸はオープンリーディングフレーム中の最初のＭｅｔである（配列番号４〜６）であるが、２番目のＭｅｔ（配列番号４〜６における残基３）は、より良好に位置するシャイン−ダルガーノモチーフを有する（図９Ｂ）ことを呈する。従って、この２番目のＭｅｔコドンから始まる配列が、好ましい（配列番号１〜３）。
【０１７９】
対立遺伝子１は、３６２アミノ酸（配列番号１）のタンパク質をコードし、株ＭＣ５８および配列決定されたＥＴ−５ポジティブ株すべてを包含する。対立遺伝子１に属する他の５つの株は、非常に最近の単離株であった。これらは、ＥＴ型に未だ分けられていないが、これらの株の血清型および血清亜型分類（Ｂ：１５：Ｐ１．７およびＢ：４：Ｐ．１．１５）は、これらの株をＥＴ−５複合群（ｃｏｍｐｌｅｘ）に加入させることを示唆する。
【０１８０】
対立遺伝子２は、残基２６８（配列番号１に従う番号付け）の後での２アミノ酸付加、残基２７１の後での４１アミノ酸付加、および１２２残基の後での７アミノ酸欠失（ロイシンジッパードメインの最初の７個組反復の欠失を生じる）から生じる、３９８アミノ酸（配列番号２）のタンパク質をコードする。固定された７残基の間隔にあるロイシン残基は、一般的に、ロイシンジッパーを同定する。その反復中の１つのロイシンは、ほとんどＭｅｔ、Ｖａｌ、またはＩｌｅによって、頻繁に置換されている。この場合、対立遺伝子２は、ロイシンジッパーモチーフを形成するために、上流または下流のＩｌｅを使用し得る。
【０１８１】
対立遺伝子３は、４０５アミノ酸（配列番号３）のタンパク質をコードし、対立遺伝子２と同様に、残基２６８および残基２７１に４３個の余分なアミノ酸を含むが、残基１２２の後に７アミノ酸欠失を有さないことによって対立遺伝子２とは異なる。対立遺伝子３は、血清群Ａ、血清群Ｂ、および血清群Ｃの株において見出される。
【０１８２】
２６個のポジティブ株のうちの残りの４株（ＩＳＳ１０２４、ＩＳＳ７５９、９７３−１７２０、９５３３０；表１において＊で印を付けている）は、対立遺伝子１〜３の微小改変体を含む：
血清群ＣのＩＳＳ１０２４株は、残基２２９〜２３５に１つの７個組反復欠失を含む、対立遺伝子２の改変体を有する（配列番号７／８）。この配列は、ものもと第４の対立遺伝子として分類されたが、対立遺伝子２の改変体として再分類されている。従って、対立
遺伝子２は、すべてのＥＴ−３７株、クラスターＡ４の１つの株およびさらなる３つの非ＥＴ型血清群Ｃ株において見出される；
血清群ＣのＩＳＳ７５９株および９７３−１７２０株の両方は、リーダーペプチド中に単一アミノ酸変異を含む対立遺伝子３の改変体を含み（配列番号９／１０）、この単一アミノ酸変異は、単一ヌクレオチド変異から生じる。対立遺伝子３の株すべてのうち、９７３−１７２０のみが、過剰毒性株（クラスターＡ４）に属する；
血清群Ｂの株９５３３０は、対立遺伝子１および対立遺伝子２の組換え体（キメラ）（配列番号１１／１２）を含み、ｎａｄＡが、対立遺伝子２のＮ末端部分と対立遺伝子１のＣ末端セグメントとの間の融合物である。推定組換え部位は、このタンパク質の残基１４１と残基２６５との間にほぼ位置する。
【０１８３】
すべての挿入および欠失は、コイルドコイル領域中で生じ、α−ヘリックスの２ターンまたは６ターンを示す、７アミノ酸または４１アミノ酸を含み、これにより、全体的構造を破壊することなく、このコイルドコイル領域の長さの変化が可能となる。さらに、ＩＳＳ１０２４における欠失は、ロイシンジッパードメインの最初の７個組反復の欠如をもたらすが、そのドメインを破壊はしない。なぜなら、固定された７残基間隔にあるロイシン残基は、ほとんど、Ｍｅｔ、ＶａｌまたはＩｌｅにより置換され得るからである。この場合、対立遺伝子２は、ロイシンジッパーモチーフを形成するために、上流または下流のＩｌｅを使用し得る（図１１）。
【０１８４】
これらの種々のＮａｄＡ配列および対立遺伝子のいずれも、本発明に従って使用され得る。
【０１８５】
配列分析が、推定プロモーター領域および推定ターミネーター領域（５０ｂｐ上流、３５０ｂｐ下流）まで拡張されたとき、その５’領域にのみ、変化が見出された。３つのイタリア株（ＩＳＳ１０７１、ＩＳＳ８３２およびＩＳＳ１１０４）は、一塩基変異について異なったが、９６１−５９４５株において、７塩基の差異（図１０において＊で示される）が存在した。変化はまた、ＴＡＡＡテトラヌクレオチドが異なる株において４回〜１２回反復される５’領域においても見出された（表１）。反復の数は、各対立遺伝子においても変化した（表１）。
【０１８６】
さらなる作業が、口腔咽頭スワブにより健常個体から単離されたキャリア株に対して、実施された。いくつかの株は、キャリアとして記載されているが、過剰毒性クラスターに属する。ＮａｄＡは、上記のそのようなキャリア株すべてにおいて見出された（すなわち、ＥＴ−５株において対立遺伝子１が見出され、ＥＴ−３７株において対立遺伝子２が見出された）。
【０１８７】
ＮａｄＡはまた、過剰毒性クラスターに属さない５つのキャリア株（ＮＧＥ２８、６５／９６、１４９／９６、１６２６９、１６２８２）において見出された。これらの５つの株は、患者から単離された株においては見出されない配列（配列番号１３および１４）を共有した。この対立遺伝子は、「対立遺伝子Ｃ」（キャリア）と呼ばれる。
【０１８８】
対立遺伝子Ｃと対立遺伝子１〜３とのアライメントが、図９Ｃに示される。そのタンパク質のコイルドコイルセグメント中での破壊が、明らかである。
【０１８９】
対立遺伝子１〜３とは異なり、対立遺伝子Ｃタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現された場合に、高分子量凝集体を容易には形成しない。しかし、対立遺伝子１〜３と同様に、対立遺伝子Ｃは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの表面上に露出される。なぜなら、対立遺伝子Ｃは、対立遺伝子Ｃ自体に対して惹起される細菌抗体の標的であるからである。しかし、これらの抗体は、対立遺伝子１〜３を保有する株に対して殺菌性ではない。同
様に、対立遺伝子１〜３に対して惹起される抗体は、対立遺伝子Ｃ株に対して殺菌性ではない。
【０１９０】
（細胞表面上のＮａｄＡオリゴマー） ＷＯ０１／６４９２２は、ＮａｄＡがオリゴマー構造を形成することを報告する。より詳細にＮａｄＡオリゴマーを研究するために、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの全細胞溶解物が、ウェスタンブロットによりプロービングされた。
【０１９１】
細菌コロニー［ＭＣ５８株（対立遺伝子１）、９０／１８３１１株（対立遺伝子２）、２９９６株（対立遺伝子３）、Ｌ９３／４２８６株（ＩＳ１３０１挿入物）およびＮＧ３／８８株（ｎａｄＡ−）］が、０．３％グルコースを補充されたＧＣブロス中で定常期まで増殖された。異なる時間にサンプルが採取され、３０００×ｇにて１０分間の遠心分離によってペレットにされ、そしてＰＢＳ中に再懸濁され、そして細菌溶解するまで融解／凍結された。等量のタンパク質が、１２．５％ポリアクリルアミドゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供され、ニトロセルロース膜上にエレクトロトランスファーされた。
【０１９２】
抗ＮａｄＡポリクローナル血清を調製するために、組換えＮａｄＡが発現され精製された。３つのｎａｄＡ対立遺伝子（対立遺伝子１：アミノ酸２４〜３６２；対立遺伝子２：アミノ酸２４〜３４３；対立遺伝子３：アミノ酸２４〜３５０）をコードする配列が、染色体ＤＮＡに対するＰＣＲにより増幅され、ｐＥＴ２１ｂ＋ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にクローニングされた。このプラスミドは、このタンパク質をＣ末端ヒスチジン融合物として発現するために、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）中に形質転換された。１ｍＭ
ＩＰＴＧをＯＤ６００ｎｍ０．３で添加し、その細菌をさらに３時間増殖させることによって、タンパク質発現が３０℃で誘導された；発現がＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価された。組換え融合タンパク質が、Ｎｉ２＋結合体化キレート形成速流Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
４Ｂ樹脂上でのアフィニティクロマトグラフィーによって精製された。２０μｇの精製タンパク質が、６週齢のＣＤ１雌マウス（４匹／群〜６匹／群）を免疫するために使用された。タンパク質が、最初の投与については完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）とともに、そして２回目（２１日目）および３回目（３５日目）のブースター投与については不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）とともに、腹腔内投与された。出血サンプルが、４９日目に採取され、そして血清学的分析のために使用された。
【０１９３】
これらのブロットは、ＭＣ５８株（図１４、レーン１）、９０／１８３１１（レーン２）および２９９６（レーン３）における高分子量反応性バンドを示した。このバンドは、ＮＧ３／８８株（レーン５）にはなかった。サンプル緩衝液を４０分煮沸してもこのパターンは変化しなかった。これらのタンパク質の種々のサイズは、対立遺伝子と一致していた。３５〜４０ｋＤａのモノマータンパク質の予測されるサイズの範囲を考慮して、観察されるバンドの高い分子量は、ＮａｄＡのオリゴマー形態の存在により説明され得る。この可能性は、ＩＳ１３０１挿入物（より短い１６２アミノ酸のタンパク質をコードし、そしてコイルドコイル領域の大部分を欠く）を含む株において、高分子量の反応性バンドが存在せず、そして、プロセシングされたモノマータンパク質の推定分子量と一致する１４．５ｋＤａのバンド（図１４、レーン４）で置き換えられているという事実により支持される。
【０１９４】
このオリゴマータンパク質は、機能的遺伝子を含む全ての株で見出されたが、発現レベルは株によって変化した（表Ｉ）。さらに、ＮａｄＡタンパク質の量は、増殖の間に同じ株内で変化した。
【０１９５】
多種多様な全体のＮａｄＡ発現レベルの代表として選択された４つの異なる株（ＭＣ５８、２９９６、Ｃ１１、Ｆ６１２４）を、定常期まで増殖の間追跡した。図１５は、試験
された株（低いＮａｄＡ発現の１５Ａ：ＭＣ５８；高いＮａｄＡ発現の１５Ｂ：２９９６）のうち２つの増殖を、ＯＤ６００を示す曲線を用いて示す。ＯＤ６００増殖曲線の各点において取られたサンプルのウエスタンブロットは、ＮａｄＡのバンドが、増殖の初めはほとんど見えず、増殖の間に、より強くなって、定常期には最大にまでなるということを示した。分析された全ての株は、同じ増殖期依存性の挙動を示した。
【０１９６】
高分子量ＮａｄＡはまた、外膜に固定されたＮａｄＡと一致して、外膜ベシクルのウエスタンブロットにおいて見られた。
【０１９７】
同様に、対数期増殖の間の生存細菌に対するＦＡＣＳ分析は、ＮａｄＡが、細菌の表面に結合する抗体に利用可能であることを示した。多糖類カプセルを有する株（ＮＭＢ株）におけるＦＡＣＳ強度は、同質遺伝子型非カプセル化変異株（Ｍ７）と比較して１ｌｏｇ減少したが、このタンパク質は、表面に露出されており、両方の株における結合に利用可能であった（図１６）。
【０１９８】
ＮａｄＡは、表面に露出されたオリゴマーを形成し、これは、熱、ＳＤＳ、およびβ−メルカプトエタノールによる還元に対して安定である。その成熟形態のシステイン残基の欠損のために、ジスルフィド結合形成は、この現象には関与し得ず；むしろこのことは、推定のコイルドコイル構造およびモノマー間の分子間相互作用を媒介し得るロイシンジッパーモチーフの存在と一致する［Ｌｕｐａｓ（１９９６） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：３７５−３８２；Ｏ’Ｓｈｅａら（１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：５３９−５４４］。オリゴマーのサイズは、約１７０ｋＤａであり、四量体構造を示唆する［ＷＯ０１／６４９２２］。しかし、剛直なコイルドコイル構造は、ＳＤＳ ＰＡＧＥで異常な移動度を有するようであり、従って１７０ｋＤａの形態は、三量体であり得る。
【０１９９】
（保護免疫原性）
ポリクローナル抗ＮａｄＡ血清を、補体源として使用されるプールされたウサギ新生児血清（ＣｅｄａｒＬａｎｅ）を用いて、以前に記載されたように殺菌活性について試験した［Ｐｉｚｚａら（２０００）；Ｐｅｅｔｅｒｓら（１９９９） Ｖａｃｃｉｎｅ １７：２７０２−２７１２］。血清殺菌力価を、反応混合物中の細菌の６０分のインキュベーション後の１ｍｌあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）において、０分の時点での１ｍｌあたりのコントロールＣＦＵと比較して５０％の減少を生じる血清希釈として規定した。代表的には、補体の存在下でネガティブコントロール抗体と共にインキュベートされた細菌は、６０分のインキュベーションの間、ＣＦＵ／ｍｌにおける１５０〜２００％の増加を示した。
【０２００】
結果は以下のとおりである：
【０２０１】
【表２】
示されるように、この血清は、ｎａｄＡ遺伝子を有する全ての株の補体媒介殺傷を誘導し、そしてこの遺伝子を有さない株に対しては不活性であった。しかし、殺菌力価は、株によって変化した。力価は、より多い量のタンパク質を発現する株に対してより高かった。この結果を、力価が増殖の初期および後期において決定された場合に確認した（図１５）。
【０２０２】
殺菌活性における差異が、異なる対立遺伝子配列に起因したのか否かをチェックするために、免疫血清（３つのＮａｄＡ型に対して惹起された）を産生させ、そして交差殺菌アッセイに使用した。この抗血清を用いて得られた結果は、上記に示される結果と同様であり、この殺菌活性は、対立遺伝子の多様性に影響されないが、抗原発現レベルに影響されることを示唆した。
【０２０３】
感染の間に菌血症から動物を保護する免疫血清の能力もまた、ラット新生児モデルを使用して試験した。使用された血清は、５０μｇの精製ｒＮａｄＡ（対立遺伝子３）を用いてモルモットを免疫することにより得た。異系交配したＷｉｓｔａｒラット（５〜７日齢）の免疫を、１回目の用量についてはＣＦＡと共に、そしてさらなる３回の用量（２８日、５８日、８４日）についてはＩＦＡと共に皮下に実施した。血液サンプルを、１０５日目に採取し、そして動物保護アッセイに使用した。
【０２０４】
２つの異なるＭｅｎＢ株（８０４７および２９９６）を使用して２回実験を行った。各株を、連続的に新生児ラットにおいて３回継代した。実験１において、４匹のラット群を、（ａ）８０４７株からの細菌（ラット１匹あたり７×１０３ＣＦＵ）および（ｂ）熱不活化モルモット抗血清または抗カプセルコントロールｍＡｂ（ＳＥＡＭ３［Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｌｅｙら（１９９２）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：３１５６］）の混合物１００μｌで腹腔内でチャレンジした。実験２において、６匹のラット群を、時間０の時点で、コントロールｍＡｂまたはモルモット血清の種々の希釈物で処理した。２時間後、これらを２９９６細菌でチャレンジした（ラット一匹あたり５．６×１０−３ＣＦＵ）。両方の実験において、血液培養物を、防腐剤なしで約２５Ｕのヘパリンを含有するシリンジおよび針で心臓を穿刺することにより、チャレンジ後１８時間で得た。血液培養物中の細菌の数を、１、１０、および１００μｌの血液をチョコレート寒天（ｃｈｏｃｏｌａｔｅ ａｇａｒ）上に一晩プレーティングすることにより得た。幾何平均ＣＦＵ／ｍｌの計算のために、滅菌培養を用いた動物に、１ＣＦＵ／ｍｌの値を割り当てた。
【０２０５】
結果は以下のとおりである：
【０２０６】
【表３】
従って、抗ＮａｄＡ抗血清は、このアッセイにおいて高度に保護的である。
【０２０７】
従って、全体として、ＮａｄＡは、良好なワクチン抗原であるといういくつかの特性を有する：（ｉ）表面に露出された分子であり、潜在的に細菌付着に関与する；（ｉｉ）疾患関連株の少なくとも５０％および３つの超毒性の系統のほとんど１００％に存在する；（ｉｉｉ）実験室動物において保護抗体および殺菌性抗体を誘発する；そして（ｉｖ）各対立遺伝子は、交差殺菌性抗体を誘導する。
【０２０８】
（ＯＲＦ４０）
ＯＲＦ４０は、Ｈｓｆおよびその対立遺伝子改変体Ｈｉａ（両方ともＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの付着因子）に対して相同性を示す。Ｈｉａ、ＨｓｆおよびＯＲＦ４０のサイズが異なることは、部分的に、Ｈｓｆにおける大きな繰り返しドメインの３つのコピーの存在により説明され、これは、Ｈｉａに単一のコピーとして存在し、そしてＯＲＦ４０には部分的にしか存在しない（図７）。ＭｅｎＢにおいて、ＯＲＦ４０は、約２００ｋＤａのタンパク質（成熟タンパク質についての５９ｋＤａの推定分子量を参照のこと）として外膜に見出される。
【０２０９】
（Ａｐｐ）
Ａｐｐは、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの付着および浸透タンパク質Ｈａｐに対して相同性を示し（図８）、これは、自己タンパク質分解切断および細胞外放出を受ける、セリンプロテアーゼ活性を有する付着因子である［Ｈｅｎｄｒｉｘｓｏｎら（１９９７） Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２６：５０５−５１８］。切断されない表面結合Ｈａｐは、上皮細胞への付着を媒介し、そして細菌凝集および集落形成を促進する。
【０２１０】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにおいて、Ａｐｐは、外膜へと輸送され、プロセシングされ、そして分泌される。ＨａｐおよびＡｐｐは、両方とも自己輸送体ファミリーに属し、このファミリーは、独特の分泌機構により特徴付けられるグラム陰性細菌由来のタンパク質を含む。この系は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＩｇＡ１プロテアーゼについて最初に記載され、これは、このファミリーのプロトタイプと考えられる。自己輸送体ファミリーのタンパク質は、多くのグラム陰性病原体の毒性に関与していると示された［Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ＆ Ｎａｔａｒｏ（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６９：１２３１−１２４３］。これらは、以下の少なくとも３つの機能的ドメインを含む大きな前駆体タンパク質として合成される：代表的なＮ末端リーダー配列、内部ドメイン（パッセンジャードメイン）およびＣ末端ドメイン（転座ドメインまたはβ−ドメイン）。リーダー配列は、タンパク質のペリプラズムへの輸送（ｓｅｃ依存性）を媒介する。続けて、この転座ドメインは、β−バレル孔を形成する外膜に挿入されて、パッセンジャードメインの輸送を可能にする。一旦、細菌の表面にあると、このパッセンジャードメインは切断され得、そして周囲に放出される。切断は、パッセンジャードメイン自体におけるプロテアーゼ活性により生じる自己タンパク質分解事象により起こり得る。自己輸送体のパッセンジャードメインは、広く分岐しており、それらの顕著な異なる役割を反映している。反対に、β−ドメインは、それらの保存された機能と一致する高度の保存性を示す。
【０２１１】
Ａｐｐは、自己輸送体タンパク質の優勢ドメインおよび保存的セリンプロテアーゼモチーフ（ＧＤＳＧＳＰ）を保有する。このモチーフは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ＩｇＡ１プロテアーゼによるヒトＩｇＡの切断、およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＨａｐタンパク質の自己タンパク質切断を担うことが示された。Ａｐｐは、髄膜炎菌の間で保存された抗原であること、感染および輸送の間に発現されること、Ｂ細胞およびＴ細胞を刺激すること、そして殺菌性抗体応答を誘導することが、示された［Ｈａｄｉら（２００１） Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：６１１−６２３；Ｖａｎ Ｕｌｓｅｎら（２００１） ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３２：５３−６４］。
【０２１２】
血清群Ｂの２９９６株において、Ａｐｐは、１４５４個のアミノ酸および１５９，９６
５Ｄａの推定分子量を有する。図２６は、このタンパク質の推定の構造的特徴を示す。３つのドメインが見られる：ドメイン１（アミノ酸１〜４２）は、シグナルペプチドである；ドメイン２は、パッセンジャードメインであり、これは、機能的に活性なタンパク質である；ドメイン３は、βバレル構造を有するＣ末端転座ドメインである。
【０２１３】
パッセンジャードメインのＮ末端において、Ｈｉｓ−１１５、Ａｓｐ−１５８およびＳｅｒ−２６７は、Ｈａｐ由来のセリンプロテアーゼ触媒の三組み（ｔｒｉａｄ）Ｈｉｓ−９８、Ａｓｐ−１４０およびＳｅｒ−２４３に対応する［Ｆｉｎｋら（２００１） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：３９４９２−３９５００］。残基２８５〜３０２は、推定ＡＴＰ／ＧＴＰ結合部位（Ｐループ）であり、これは、外膜転座のためのエネルギー結合の機構を示唆する。パッセンジャードメインのＣ末端に向かって、２つのＡｒｇリッチ領域が存在する。第１の領域（ＲＲＳＲＲ）は、残基９３４〜９３８であり、そして第２の領域（ＲＲＡＲＲ）は、残基１１４９で始まる。これらのモチーフは、トリプシン様タンパク質分解切断部位（例えば、ジフテリア毒素中の部位、ならびにＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｈａｐ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ＩｇＡ−プロテアーゼおよびＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ＦｈａＢのｋ自己切断部位の上流の部位（図２６、枠１）の公知の標的の名残（ｒｅｍｉｎｉｓｃｅｎｔ）である。Ａｒｇリッチ領域の下流は、モチーフ９５４ＮＴＬ９５６および１１７６ＮＳＧ１１７８であり、これらは、自己輸送体Ｓｓｐ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、Ｐｒｎ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、Ｂｒｋａ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）［Ｊｏｓｅら（１９９５） Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８：３７８−３８０］およびＨａｐ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（図２６、枠２）における切断部位と同一であるかまたは類似する。共に、これらの配列モチーフは、２つのモチーフ９５４ＮＴＬ９５６および１１７６ＮＳＧ１１７８ならびにＲＲ（Ａ，Ｓ，Ｒ）２ＲＲパターンが、下流プロセシング部位の正しい局在化のためのシグナルとして作用し得ることを示唆する。
【０２１４】
Ａｐｐ配列の更なる分析は、プロリンリッチな領域（ここでジペプチドモチーフＰＱは、残基１１５６で始まって４回繰り返されることを示す。公知のタンパク質配列に対する相同性についての検索は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｉｚｉｅ ＰｓｐＡおよびＰｓｐＣの表面タンパク質、およびＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ外膜タンパク質ｐ６９ペルタクチン（ｐｅｒｔａｃｔｉｎ）のプロリンリッチ領域に対するいくらかの類似性を明らかにし、ここで（ＰＱＰ）５モチーフは、主要な免疫保護エピトープを含有するループに位置する。
【０２１５】
最後に、Ａｐｐ（ＹＲＷ）の最後の３つのアミノ酸は、Ｈａｐの最後の３つのアミノ酸と同一であり、これらは、外膜局在化およびタンパク質安定性に重要であると記載されている［Ｈｅｎｄｒｉｘｓｏｎら、１９９７］。
【０２１６】
（融合パートナーを伴わないＥ．ｃｏｌｉの発現）
ＯＲＦ４０、ＡｐｐおよびＮａｄＡの全長遺伝子を、ｐＥＴ２１ｂ＋ベクター中にクローン化し、そしてこのプラスミドで、Ｔ７プロモーターの制御下でこれらの遺伝子を発現させるために、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。
【０２１７】
発現は、このプロモーターをＩＰＴＧで活性化するか、または非誘導条件下で達成された。タンパク質の局在化および表面露出を、細胞分画実験（ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット）、ＦＡＣＳ分析および全細胞免疫ブロットによりアッセイした。図１〜３に示されるように、これら三つのタンパク質は全て、Ｅ．ｃｏｌｉの表面に転座されている。
−ＯＲＦ４０は、モノマー形態で発現され、そしておそらくマルチマーも形成する（図１）。
−Ａｐｐは、約１６０ｋＤａの前駆体としてＥ．ｃｏｌｉ外膜に輸送され、プロセシング
されて培養上清に分泌される（図２）。
−ＮａｄＡは、約１８０ｋＤａの単一の高分子量バンドとして外膜の画分に存在することが見出される。これは、おそらくこのタンパク質のオリゴマー形態に対応する。このようなバンドは、Ｅ．ｃｏｌｉ発現細胞内ＮａｄＡには存在しない（図３）。
【０２１８】
Ａｐｐ発現を、より詳細に検討した。
【０２１９】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ２９９６株のゲノムＤＮＡを、以前に記載されたように調製した［Ｔｉｎｓｌｅｙ ＆ Ｎａｓｓｉｆ （１９９６）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９３：１１１０９−１１１１４］。シグナルペプチド（アミノ酸１〜４２）をコードする配列および終止コドンを欠くＤＮＡを、ＰＣＲプライマー配列番号１８および１９を使用して増幅し、次いで、ＮｈｅＩおよびＸｈｏｌで消化し、そしてｐＥＴ−２１ｂ発現ベクターのＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入して、「ｐＥＴ−Ａｐｐ−Ｈｉｓ」を得た（図２７）。このプラスミドを、Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、そしてＣ末端Ｈｉｓタグ融合タンパク質の発現に使用し、このタンパク質を、精製して抗体を惹起するために使用した。全長ａｐｐ遺伝子を、ＰＣＲプライマー配列番号２０および２１を使用して同様の方法で増幅し、そしてクローン化してプラスミド「ｐＥＴ−Ａｐｐ」を得た。
【０２２０】
プラスミドを。Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、そして１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して発現を誘導した。この発現されたタンパク質を、ウエスタンブロットにより検出した（図２８、レーン１）。このタンパク質がＥ．ｃｏｌｉの表面に輸送されたことを確かめるために、ＦＡＣＳ（図２９）および免疫蛍光顕微鏡法(図３０）を使用した。Ｆ
ＡＣＳ分析は、ｐＥＴ−Ａｐｐ形質転換体（全長遺伝子）においてポジティブな表面発現を示したが、Ａｐｐ−Ｈｉｓ（シグナルペプチドなし）または空のベクターでは表面発現を示さなかった。免疫蛍光の結果は、ＦＡＣＳに一致した。従って、全長ａｐｐ遺伝子の発現は、Ｅ．ｃｏｌｉの表面へのＡｐｐの輸送を生じたが、最初の４２個のアミノ酸の欠失は、表面局在化をなくした。
【０２２１】
ｐＥＴ−Ａｐｐ形質転換体由来の外膜たんぱく質のウエスタンブロット分析は、約１６０ｋＤａの特定の反応性バンドを明らかにした(図２８、レーン１）。この分子量は、全
長タンパク質の推定分子量に対応している。対応するバンドは、形質転換していないコントロール由来の外膜画分にはなかった(レーン３）。培養上清のウエスタンブロット分析
は、ｐＥＴ−Ａｐｐと共に約１００ｋＤａの分泌タンパク質を明らかにし(レーン２）、
これは、形質転換していないコントロールには存在しなかった（レーン４）。時々、非常に弱いバンドもまた、ｐＥＴ−Ａｐｐ形質転換体において約１４０ｋＤａに検出された。
【０２２２】
従って、全長ａｐｐ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉに導入された場合、Ａｐｐタンパク質の発現を誘導し、このタンパク質は、外膜に輸送され、切断され、そして培養上清に放出される。
【０２２３】
（ネイティブ発現は、免疫応答の質に影響を及ぼし得る）
免疫応答の誘導に対するタンパク質コンホメーションの役割を評価するために、ＯＲＦ４０、ＡｐｐまたはＮａｄＡを発現するＥ．ｃｏｌｉ由来の外膜小胞を単離し、これを使用してマウスを免役した。殺細菌活性について血清を試験し、結果を、融合タンパク質により得られた結果と比較した。殺細菌応答（株２９９６）は、そのタンパク質がＯＭＶ中でそれらの「ネイティブな」形態で生成される場合に、５〜１０倍改善された：
【０２２４】
【表４】
（Ａｐｐ自己タンパク質分解性切断）
Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＥＴ−Ａｐｐ形質転換体は、１００ｋＤａ産物を培養上清に分泌し、１６０ｋＤａ表面産物を示す。分泌App産物が自己タンパク質分解性プロセスから得られ
るか否かを試験するために、推定触媒性残基のうちの１つ（Ｓｅｒ−２６７）を、Ａｌａと置換した。
【０２２５】
pET-AppS267A変異体を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびプライマー（配列番号２２および２３）を用いた部位特異的変位誘発によって得た。
【０２２６】
ｐＥＴ−ＡｐｐＳ２６７Ａ形質転換体に由来する総タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図３１、レーン２）は、サイズがｐＥＴ−Ａｐｐ形質転換体（レーン１）に類似のタンパク質を示した。このタンパク質は、ＦＡＣＳ分析により表面に露出されることが示された（図２９）。培養上清のウェスタンブロット分析は、ｐＥＴ−Ａｐｐ形質転換体（図３２、レーン１）においてＡｐｐを示したが、ｐＥＴ−ＡｐｐＳ２６７Ａ形質転換体（レーン２）においては示さなかった。
【０２２７】
従って、Ｓｅｒ−２６７のＡｌａへの変異は、Ａｐｐ前駆体（これは、細胞に結合したままである）のプロセシングおよび分泌をなくす。これらのデータは、Ａｐｐがセリンプロテアーゼ活性（これは、自己タンパク質分解性プロセシングを担い、分泌Ａｐｐドメインの上清中に放出する）を有することを示唆する。
【０２２８】
９５４ＮＴＬ９５６での切断は、１０４１９０Ｄａの推定分子量を有するフラグメントを放出する。１１７６ＮＳＧ１１７８での切断は、１２８７９８Ｄａフラグメントを与える。これら２つの推定フラグメントは、培養上清中で観察された、約１４０ｋＤａおよび約１００ｋＤａの２つのバンドに適合しうる。切断は、第１に約１４０ｋＤａフラグメントを与え、次いで、第２に１００ｋＤａフラグメントを与えるように生じうる。従って、Ａｐｐのβドメインは、残基１１７７にて始まる。
【０２２９】
（付着因子としてのＮａｄＡ、ＯＲＦ４０およびＡｐｐの機能）
国際特許出願ＷＯ０１／６４９２２の実施例２２は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＮａｄＡ発現により、形質転換細菌がヒト上皮細胞に接着するようになることを開示する。この接着性の表現型は、ＮａｄＡについて、ＡｐｐおよびＯＲＦ４０についてもさらに研究された。
【０２３０】
非誘導性条件下または誘導性条件下で増殖させたＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌（１０８ＣＦＵ）を、Ｃｈａｎｇヒト上皮細胞単層（１０５細胞）に接種し、３７℃で１時間または２時間インキュベートした。次いで、細胞を、ウサギ抗Ｅ．ｃｏｌｉおよびＰＥ−結合体二次抗体とともにインキュベートした。接着を、Ｃｈａｎｇ細胞に結合する特異的蛍光強度として、ＦＡＣＳにより検出した。ポジティブコントロールは、ｈｓｆを発現するＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５（ＤＨ５／ｐＤＣ６０１））であり；ネガティブコントロ
ールは、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ｂおよびＤＨ５ａ／ｐＴ７−７であった。図４における結果は、組換えＥ．ｃｏｌｉ株が、培養上皮細胞に接着する能力が、これら３つのタンパク質の発現と関連づけられることを示す。
【０２３１】
これら３つのタンパク質が宿主細胞との相互作用を促進しうることを確認するために、この組換えタンパク質自体を、上皮細胞への結合について研究した。１０５個のＣｈａｎｇヒト上皮細胞（Ｗｏｎｇ−Ｋｉｌｂｏｒｕｎｅ誘導体、クローン１−５ｃ−４、ヒト結膜）を、培地単独、または異なる濃度のＯＲＦ４０（１５０μｇ／ｍｌ）、Ａｐｐ（１５０μｇ／ｍｌ）もしくはＮａｄＡ（３００μｇ／ｍｌ）、あるいはネガティブコントロールとしてＧＮＡ２１３２（３００μｇ／ｍｌ）とともに、４℃にて３０分間インキュベートした［Ｐｉｚｚａら（２０００）を参照のこと］。結合を、単一の組換えタンパク質に対するポリクローナル抗血清および二次ＰＥ結合体抗体を使用して、ＦＡＣＳにより検出した。このＦＡＣＳシグナルシフト（図５）は、３つのタンパク質が、ヒト上皮細胞に結合しうる一方で、精製ＧＮＡ２１３２（ネガティブコントロール）は結合しないことを示す。
【０２３２】
図６Ａは、結合が、用量依存性様式にて増加することを示す。ＮａｄＡの結合は、約２００μｇ／ｍｌにてプラトーに達する。ＧＮＡ２１３２は、４００μｇ／ｍｌにおいてですら結合できない（図６Ｂ）。図６におけるデータは、タンパク質濃度（μｇ／ｍｌ）に対してプロットされた平均蛍光強度（ＭＦＩ）値である。
【０２３３】
ＦＡＣＳを使用すると、ＮａｄＡの細胞への結合が、Ｈｅｐ−２細胞およびＭＯＬＴ−４細胞でも認められたが、ＨｅＬａ細胞、Ａ５４９細胞、Ｈｅｃ−ｌＢ細胞、Ｈｅｐ−Ｇ２細胞、ＣＨＯ細胞またはＨＵＶＥＣ細胞では認められなかった。Ｃｈａｎｇ細胞への接着は、その細胞をプロナーゼで処理することによって排除され得、このことは、ＮａｄＡについてのヒトレセプターがタンパク質であることを示す。
【０２３４】
精製ＮａｄＡタンパク質のＣｈａｎｇ結膜細胞への接着はまた、免疫蛍光顕微鏡を使用して、観察された。タンパク質(そのC末端アンカードメインを欠く)を、種々の濃度でＣ
ｈａｎｇ細胞とともに完全培養培地中で、３７℃にて３時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、固定し、抗ＮａｄＡマウスポリクローナル抗体および二次テキサスレッド結合体化抗マウスＩｇＧ抗体で染色した後に、レーザー共焦点顕微鏡により分析した。０ｎＭにおいては結合が見られなかった（図１７Ａ）が、結合は、１７０ｎＭ（１７Ｂ）および２８０ｎＭ（１７Ｃ）にて明らかであり、クラスタ化は、より高濃度で明らかであった。対照的に、ＮａｄＡの結合は、２８０ｎＭタンパク質においてですら、ＨｅＬａ細胞で認められなかった（１７Ｄ）。
【０２３５】
結合は、４℃（図１８Ｂ）より、37℃ではるかにより明らかであった（図１８Ａ）。３７℃でのクラスタに比較して、４℃にて認められたドット様構造は、ＮａｄＡモノマー間の外側からの相互作用（ｌａｔｅｒａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）が温度依存性(膜流
動性により影響を受ける)であることを示唆する。
【０２３６】
表面タンパク質とエンドサイトーシスされるタンパク質とを区別するために、サポニン界面活性剤を、染色手順の間に添加した。エンドソームのサイズを有する細胞内クラスタは、サポニンが使用される場合により明らかであった（矢印）が、より高い割合のタンパク質は、細胞表面に存在したままであった（図１９）。
【０２３７】
免疫蛍光はまた、ＮａｄＡが単球に結合することを明らかにした（図２０Ａ）。ＮａｄＡ単独（染色抗体なし；２０Ｂ）および免疫前血清で染色したＮａｄＡは、（２０Ｃ）は、見えなかった。高倍率にて、小胞への取り込みの証拠(エンドソームまたはファゴソー
ムのいずれか)が見られた。
【０２３８】
図２１は、マウスマクロファージ（ｒａｗ ２６４．７）がＮａｄＡ（１２５ｎＭ、３時間、３７℃；細胞をＤＭＥＭ中で培養した）を結合し、そしてＮａｄＡをエンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｅ）する（１２５ｎＭ、３時間、３７℃；ＤＭＥＭ中で細胞培養）ことを示す。
【０２３９】
この細胞のＩＬ−αの分泌によって測定する場合、インキュベーション前に、ＮａｄＡを９５℃で１５分間加熱し、ＮａｄＡの単球への結合活性を除去した（図２２）。従って、ＮａｄＡ調製物の刺激活性は、熱不安定である。刺激活性はまた、抗ＣＤ１４（図２３）によるか、またはビーズ固定化抗ＣＤ１４（図２３）を用いた調製物からのＮａｄＡの除去によって、ブロックされた。
【０２４０】
免疫蛍光顕微鏡をまた用いて、Ｅ．ｃｏｌｉが発現するＮａｄＡの結合を検出した。形質転換したＥ．ｃｏｌｉは、強く結合し（図２４Ａ）、一方、非形質転換細菌は結合しなかった（図２３Ｂ）。単球によって放出されたＩＬ−αは、４０：１の細菌：単球比で、形質転換Ｅ．ｃｏｌｉを用いた場合、比形質転換細菌よりも１．５倍よりも高かった。
【０２４１】
形質転換したＥ．ｃｏｌｉを、ガラスカバースリップに結合させ、固定しそして抗ＮａｄＡ（図２５Ａ）および抗Ｅ．ｃｏｌｉ抗体（図２５Ｂ）を用いて二重染色した。両方が用いられた場合、抗ＮａｄＡのパッチは可視的であり、ＮａｄＡが細菌表面上で凝集体を形成する蛍光があり、これが抗体の他の表面抗原との相互作用を妨げることを示唆する。
【０２４２】
Ａｐｐに注目し、組換えＥ．ｃｏｌｉ株を、Ｃｈａｎｇ結膜上皮細胞（Ｗｏｎｇ−Ｋｉｌｂｏｕｒｎｅ誘導体、クローン１−５ｃ−４［ヒト結膜］、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２０．２）の単層とともにインキュベートし、そして接着を、ＦＡＣＳを用いて分析した。コンフルエントな単層から得た細胞を、１２ウェル組織培養プレート中に、１０５細胞／ウェルで播種し、そして２４時間インキュベートした。ＩＰＴＧ誘導後、細菌の培養物をＰＢＳ中で２回洗浄し、ＤＭＥＭ＋１％ ＦＢＳ中に再懸濁し、５×１０８細菌／ｍｌ濃度とした。各々の株の１ｍｌありコートに、Ｃｈａｎｇ細胞の単層培養物を添加し、５％ ＣＯ２中で、３７℃で３時間、インキュベートした。非接着性細菌を、ＰＢＳで３回洗浄することによって除去し、そして３００μｌの細胞培養液（Ｓｉｇｍａ）を、各々のマイクロタイターウェルに添加した。インキュベーションを、３７℃で１０分間継続した。細胞を収集し、次いでウサギポリクローナル抗Ｅ．ｃｏｌｉ抗血清（ＤＡＫＯ）とともに、４℃で１時間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳ＋５％ ＦＢＳ中で２回洗浄し、Ｒ−フィコエリトリン−結合体化ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともに４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳ＋５％ＦＢＳ中で洗浄し、そして１００μｌ ＰＢＳ中に再懸濁した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて蛍光を測定した。各々の蛍光プロファイルにつき、１００００細胞を分析した。図３３で報告される結果は、ｐＥＴ−Ａｐｐ形質転換体が、Ｃｈａｎｇ細胞に付着し得、９０．３％の蛍光シフトを与えることを示す。Ｓ２６７Ａ形質転換体もまた、付着し得る（９１．０％）。非形質転換Ｅ．ｃｏｌｉは、Ｃｈａｎｇ細胞に付着し得なかった（ＦＡＣＳプロットの底）。
【０２４３】
ＮａｄＡに関して、ＦＡＣＳの結果は、免疫蛍光顕微鏡データと一致した。図３４Ａおよび図３４Ｂに示されるように、単層とともにインキュベートしたｐＥＴ−Ａｐｐ形質転換体は、高いレベルの上皮細胞に対する接着および目に見える細菌−細菌凝集物を実証した。Ｓ２６７Ａ変異体について、接着および細菌凝集が増強された（図３４Ｃおよび３４Ｄ）。形質転換コントロールは、接着性を示さなかった（図３４Ｇ）。最初の４２アミノ
酸の欠失もまた、接着性を喪失させた。
【０２４４】
Ｃｈａｎｇ上皮細胞と対照的に、ＨＵＶＥＣ内皮細胞をｐＥＴ−Ａｐｐ形質転換体をもちいて試験した場合、接着性が見られなかった。敗血症および髄膜炎を発症させるために、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、ヒト内皮細胞との相互作用を必要とする。従って、Ａｐｐは、病理学的内皮レベルでのコロニー形成ではなく、ヒト呼吸器上に粘膜のレベルでのコロニー形成の第１工程に関与し得る。
【０２４５】
（Ａｐｐ結合活性の局在化および特異性）
Ａｐｐの結合領域を同定するために、Ａｐｐβと命名されたキメラタンパク質を使用した。このタンパク質は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＩｇＡ１プロテアーゼのリーダーペプチドに融合されたＡｐｐのＣ末端ドメイン（アミノ酸１０７７〜１４５４）からなる。淋菌のリーダー配列は、よく特徴づけられており、Ｅ．ｃｏｌｉ中で機能するので、それを選択した。プラスミドｐＥＴ−Ａｐｐβは、配列番号２６および２７を使用してたＰＣＲにより増幅された、１．１ｋｂｐＤＮＡフラグメントを含む。
【０２４６】
ｐＥＴ−Ａｐｐβ構築物を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質導入した。ＦＡＣＳ局在化研究は、Ａｐｐβが、Ｅ．ｃｏｌｉの表面に局在化されることを確認した。Ｃｈａｎｇ上皮細胞を使用したインビトロ接着アッセイは、免疫蛍光法によって接着を示した（図３４Ｅおよび３４Ｆ）。ＦＡＣＳ分析は、ｐＥＴ−Ａｐｐβ形質転換体が、まだ上皮細胞に接着し得るが、それがｐＥＴ−Ａｐｐ形質転換体より低いレベル（７４．２％の移行）であることを示した。
【０２４７】
これらの結果は、Ａｐｐ結合ドメインが、そのＣ末端領域（残基１０７７と残基１１７６との間の１００マーのフラグメント中）に位置することを示す。
【０２４８】
精製された組換えタンパク質もまた研究した。Ａｐｐ−α−Ｈｉｓは、ポリＨｉｓタグに融合されたＡｐｐのＮ末端部分（アミノ酸４３〜１０８４）からなる。プラスミドｐＥＴ−Ａｐｐα−Ｈｉｓは、配列番号２４および２５を用いて、ＰＣＲにより増幅されたＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ ３．１ｋｂｐフラグメントを含む。ＦＡＣＳ結合アッセイにより、精製された組換えＡｐｐ−α−Ｈｉｓの結合活性を、Ａｐｐ−Ｈｉｓの結合活性と比較した。Ｃｈａｎｇ細胞を、漸増濃度のＡｐｐ組換えタンパク質またはリポタンパク質ＮＭＢ２１３２−Ｈｉｓ（ネガティブコントロール）とともにインキュベートした。Ａｐｐ−Ｈｉｓ（黒菱形）の結合は、用量依存的様式で増大し、そして約５０μｇ／ｍｌの濃度でプラトーに達したが、Ａｐｐα−Ｈｉｓ（黒四角）の結合は、非常に低かった（図３５）。コントロールＮＭＢ２１３２−Ｈｉｓ（黒三角）は、Ｃｈａｎｇ細胞に結合できなかった。
【０２４９】
Ａｐｐとの相互作用に関連する分子の生化学的性質を探究するために、Ｃｈａｎｇ細胞を、結合実験の前に、プロナーゼまたはホスホリパーゼＡ２で処理した。１ウェルあたり１０５細胞をマイクロプレート中に置き、ＦＣＳを含まないＤＭＥＭ中で、３７℃、５％ＣＯ２で３０分間、（ａ）プロナーゼ（２５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、もしくは１０００μｇ／ｍｌ）または（ｂ）ホスホリパーゼＡ２（５０μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、もしくは８００μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。酵素のインキュベーションの後、等量の完全培地を、各ウェルに添加して反応を止めた。続いて、細胞を１００μｇ／ｍｌのＡｐｐ−Ｈｉｓまたは培地単独と混合し、そして４℃で１時間インキュベートした。図３６に示すように、プロナーゼ処理（左側カラム）は、Ｃｈａｎｇ細胞へのＡｐｐα−Ｈｉｓタンパク質の結合を著明に低減し、一方、ホスホリパーゼＡ２での処理（右側カラム）は、この結合を低減しなかった。従って、Ｃｈａｎｇ細胞上のＡｐｐのためのレセプターは、タンパク質性である。
【０２５０】
異なる細胞株に対する接着もまた試験した（図３７）。培養細胞を異なる３つの濃度のＡｐｐ−Ｈｉｓ（１００μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌおよび６．２５μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした後、Ｃｈａｎｇ細胞およびＨｅｐＧ２細胞への高いレベルの結合、Ａ−５４９細胞への中程度のレベルの結合、およびＨｅＬａ細胞への最少のレベルの結合が見られた。Ｈｅｃ−ｌ−Ｂ上皮細胞株、Ｈｅｐ−２上皮細胞株、１６ＨＢＥ１４ｏ上皮細胞株またはＨＵＶＥＣ内皮細胞への結合は見られなかった。
【０２５１】
（Ａｐｐ ノックアウト）
Ａｐｐに対する接着機能を示唆するＥ．ｃｏｌｉでの研究の後、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの同系変異株を構築した。出発株はＭＣ５８であった。ＭＣ５８のａｐｐ遺伝子を短縮し、そしてプラスミドｐＢＳＵＤＡｐｐＥＲＭ（これは、対立遺伝子交換のため、短縮ａｐｐ遺伝子およびｅｒｍＣ遺伝子（エリスロマイシン耐性）を含む）を有する親株を形質転換することによって抗生物質カセットで置き換えた。簡潔に述べると、開始コドンを含む６００ｂｐの上流隣接領域および終始コドンを含む７００ｂｐの下流隣接領域を、配列番号２８〜３１のプライマーを使用してＭＣ５８から増幅した。フラグメントを、標準的な技術を使用して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔへとクローン化し、そしてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５へと形質転換した。全てのサブクローン化を完了すると、本質的にコンピテントなＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ＭＣ５８株を、ＧＣ寒天プレート上で一晩増殖したいくつかのコロニーを選択することによって形質転換し、そしてそれらを１μｇのプラスミドＤＮＡを含む２０μｌの１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．５）と混合した。この混合物を、ＧＣ寒天プレート上にスポットし、５％ＣＯ２、３７℃で６時間インキュベートし、次いでＰＢＳ中に希釈し、そして５μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含むＧＣ寒天プレート上に広げた。ＭＣ５８ゲノム中のａｐｐ遺伝子欠損をＰＣＲによって確認した。Ａｐｐ発現の欠損を、ウェスタンブロット分析によって確認した。
【０２５２】
野性ＭＣ５８型および同系ＭＣ５８Δａｐｐ変異株の接着を、Ｃｈａｎｇ細胞上で評価した。野生型株と比較したノックアウト変異体の結合は、約１／１０に（異なる実験において１／３〜１／２７の範囲である）減少した（図３８）。Ｈｅｐ２細胞株および１６ＨＢＥ１４ｏ細胞株を用いて、そしてＨＵＶＥＣ内皮細胞を用いて、ａｐｐ−変異体と親株との間での差異は、観察されなかった。このことは、Ａｐｐがこれらの細胞に対する接着を媒介しないことを確認した。
【０２５３】
カプセル化の背景において、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの接着に寄与する非繊毛付着因子は、以前に報告されたことはない。
【０２５４】
Ａｐｐ発現を、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ＭＣ５８において研究した。一晩増殖したプレートからのコロニーを、ＧＣブロス中に希釈し、そして３７℃にて、５％ＣＯ２でインキュベートした。ＯＤ６２０ｎｍが０．５（中程度の対数期）および０．８（安定期）の時にサンプルを採取し、そしてウェスタンブロットによって分析した。見かけの分子量（約１６０ｋＤａおよび約１４０ｋＤａ）を有する２つのバンドを、対数期細菌の全細胞溶解物で検出したが（図３９、レーン１）、安定期細菌は、約１４０ｋＤａでの弱いバンドのみを示した（レーン３）。予測されたように、ＡｐｐはΔＡｐｐ変異体中で観察されなかった（レーン２および４）。
【０２５５】
マークされた比較において、野生型ＭＣ５８の上清サンプルは、約１４０ｋＤａのバンドおよびその量が、対数期よりも安定期において高いことを示した（図４０、レーン３およびレーン１）。安定期のサンプルはまた、約１００ｋＤａで反応性のバンドを示した。
【０２５６】
本発明は、例示のみの方法によって上記され、そして本発明の範囲および精神内で維持したままで改変はなされ得ることが理解される。
【０２５７】
【表５】
【０２５８】
【表６−１】
【０２５９】
【表６−２】
【０２６０】
【表６−３】
【０２６１】
【表６−４】
【０２６２】
【表６−５】
【０２６３】
【表６−６】
【０２６４】
【表７】
【０２６５】
（配列表）
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載される発明。
【請求項１】
本明細書に記載される発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２２】
【図２３】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２４】
【図２５】
【図３０】
【図３４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２２】
【図２３】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２４】
【図２５】
【図３０】
【図３４】
【公開番号】特開２０１０−２６８８０１（Ｐ２０１０−２６８８０１Ａ）
【公開日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１４８２４０（Ｐ２０１０−１４８２４０）
【出願日】平成２２年６月２９日（２０１０．６．２９）
【分割の表示】特願２００３−５１５５５３（Ｐ２００３−５１５５５３）の分割
【原出願日】平成１４年７月２６日（２００２．７．２６）
【出願人】（５９２２４３７９３）カイロン ソチエタ ア レスポンサビリタ リミタータ (107)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月２９日（２０１０．６．２９）
【分割の表示】特願２００３−５１５５５３（Ｐ２００３−５１５５５３）の分割
【原出願日】平成１４年７月２６日（２００２．７．２６）
【出願人】（５９２２４３７９３）カイロン ソチエタ ア レスポンサビリタ リミタータ (107)
【Ｆターム（参考）】
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