高コレステロール血症を処置するための薬剤及び機序
有効量の微生物発酵生成物を投与し、そしてリポタンパク質代謝に関わる遺伝子を制御することによる哺乳類の高コレステロール血症を処置する方法。ＰＡＺ、ＰＡＺから単離された特異的成分、及びＰＡＺ成分の化学合成類似体からなる群から選ばれる有効量の組成物を投与し、そしてリポタンパク質代謝に関わる遺伝子の発現を制御することによる患者のコレステロールレベルを制御する方法。有効量の微生物発酵生成物を投与し、ＡＢＣＡ１、ＡｐｏＡ１及びＳＲ−Ｂ１をエンコードする少なくとも一種の遺伝子の発現を上方制御し、そしてＣＥＴＰをエンコードする遺伝子を下方制御することによる個体の高コレステロールを処置する方法。個体の高コレステロール及び／又は有害なリポタンパク質プロファイルの発症を防止する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、藻類からの抽出物に関する。本発明は、特に藻類からのコレステロール低減抽出物、及び哺乳類のＨＤＬ／ＬＤＬプロファイルを有利に変える能力を有する抽出物に関する。
【背景技術】
【０００２】
コレステロールは、肝臓で作られる蝋様で脂肪様の物質であり、酪農製品、卵や肉のような動物性食品等の一定の食品中に見つかる。生体は、細胞膜を適切に機能させるためにある程度のコレステロールを必要とし、エスストロゲン等のホルモンビタミンＤや、脂肪を消化して一定の老廃物を排泄するのを助ける胆汁酸を製造するために、コレステロールを必要とする。しかし、過剰な食事摂取量、過剰生産や過剰量の除去能力の減少のいずれであれ、あまりに多くのコレステロールが存在すると、心臓疾患等の健康問題が現れ得る。
【０００３】
過剰量のコレステロールに存在すると、プラーク（厚く硬い沈着物）が体内動脈中に形成され、血液が心臓、脳及びその他の組織を流れるための空間を狭窄する。時間が経つと、この蓄積は、アテローム性硬化症（動脈の硬化）の原因となり、これは、心循環系疾患を引き起こす。酸素を運搬する血液が十分に心臓に達しないと、胸痛（例えば狭心症）となる。もし冠動脈の完全な閉塞により心臓部への血液供給が完全に遮断されると、これらは心臓細胞の障害と死を生じ、通常、心臓麻痺と呼ばれる事象が生じる。これは、通常、先の狭窄上に形成する血餅からくる突発的な閉塞による。
【０００４】
リポタンパク質代謝は、アテローム班の蓄積であるアテローム形成の中核を演じる。リポタンパク質代謝は、脂質（特にコレステロール及びトリグリセリド類）の運搬やそれらの血液中で異なるリポタンパク質クラス間交換とともに、そのまわりに脂質が集まってリポタンパク質を形成するコアタンパク質（アポリポタンパク質と呼ばれる）のファミリーであるリポタンパク質レセプターが関与する複合的かつ互いに連動した一群のプロセスである。腸が食事脂肪を吸収し、それを乳状脂粒（大きなトリグリセリドリッチなリポタンパク質）の中に詰め、この乳状脂粒は血液を通って抹消組織へ運搬される。筋肉及び脂肪組織では、リポタンパク質リパーゼ酵素が乳状脂粒を破壊し、そして脂肪酸がこれらの組織中へ入る。乳状脂粒の残渣は、続いて肝臓により吸収される。肝臓は、脂質をＡｐｏＢへ積み込み、そして極めて低密度のリポタンパク質（ＶＬＤＬ）を分泌する。ＶＬＤＬは、リポタンパク質リパーゼによる脂肪分解を受け、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を形成する。次いで、ＬＤＬは、ＬＤＬレセプター（ＬＤＬＲ）への結合や他のパスウエイを介して肝臓へ取り込まれる。対照的に、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は、腸及び肝臓により脂質フリーＡｐｏＡ１の分泌を介して生成される。ＡｐｏＡ１は、その後、初期ＨＤＬを形成するトランスポーターＡＢＣＡ１の作用を介してこれらの器官からコレステロールを募り、そしてこれがＡｐｏＡ１を腎臓で迅速に分解されることから保護する。抹消組織では、初期ＨＤＬが、ＡＢＣＡ１の作用を介して、マクロファージを含む組織からのコレステロール流出を促進する。成熟ＨＤＬは、また、この流出を促進するが、それはＡＢＣＧ１の作用を介してである。（マクロファージでは、核内レセプターＬＸＲが、ＡＢＣＡ１及びＡＢＣＧ１の両方の産生を上方制御する。）初期ＨＤＬ内の遊離コレステロール（エステル化されない）は、成熟ＨＤＬを作るレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ酵素（ＬＣＡＴ）によりコレステリルエステルへエステル化される。ＨＤＬ中のコレステロールは、ＳＲ−ＢＩレセプターによる取り込みを介して直接的に、そしてコレステロールエステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）を介したＬＤＬ及びＶＬＤＬへの転換により非直接的に、肝臓へ戻される。ＨＤＬの脂質含量は、肝性リパーゼ及び内皮性リパーゼの酵素により、並びにＣＥＴＰ転移タンパク質及びＨＤＬ異化に影響するリン脂質転移タンパク質（ＰＬＴＰ）により、変更される。
【０００５】
ＬＤＬは、動脈壁上へのプラークの蓄積を誘発し、それらの大量の存在は心臓疾患のリスクの指標となる。対照的に、ＨＤＬは、体がＬＤＬを除去するのを助け、したがって心臓疾患を減じる。また、低レベルのＨＤＬは、ＬＤＬを除去する本来の機序が減じるにしたがい、体を循環器系疾患のリスクにさらす。存在するＬＤＬ及びＨＤＬの量にさまざまな因子が影響を与え、例えば食事、体重、運動、年齢、性別、糖尿病、遺伝及びその他の健康状態である。
【０００６】
スタチン類は、高コレステロールの個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）を処置するために最も普通に使用される。スタチン類は、ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ）酵素のインヒビターである。スタチン類は、ＨＭＧＣｏレダクターゼの抑制を介してコレステロール合成を減じ、そしてステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）を活性化する。ＳＲＥＢＰは、ステロール応答因子（ＳＲＥ）と結合する。これは、肝細胞性膜内のＬＤＬ−レセプターの発現増大とＬＤＬ分子の細胞内取込増大をもたらすＬＤＬ−Ｒ遺伝子の転写を上方制御する。スタチン類の使用には、ミオパシー、横紋筋融解−炎症増大、筋肉破壊及び腎負荷を含むいくつかの副作用が報告されている。いくつかのスタチン類、例えばリピトール及びクレストールは、ＣＥＴＰの機能を抑制するという付加的な有益な効果もまた示すようである。
【０００７】
高コレステロールと戦うための他のいくつかの処置、特に栄養補助食品が開発されている。ω−３脂肪酸は効果的であるが、豊富かつ環境に優しい源を欠く。レスベラトロールは、植物により天然に生産されるきわめて一般的な処置である。アサイベリーもまた使用されるが、今、副作用が明らかになりつつある。コケモモ及び他の抽出物は、臨床研究で試験されている。クルクミン及びイソフラボノイド類もまた人気を獲得しつつある。これらのサプリメントのそれぞれの優先事項は、心血管リスク因子、コレステロール制御、精神機能及び体重減を改善することである。
【０００８】
副作用を招くことなく、循環するコレステロールレベルを安全かつ効果的に減じ、そしてＨＤＬ／ＬＤＬ比率を管理するための処置に対する需要が、依然として存在する。さらに、コレステロール及び／又はリポタンパク質代謝を遺伝子レベルで制御するような、有害な副作用の少ない及び／又は異なる機序による機能を有する、現在のスタチン類療法の代替需要が存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、有効量の微生物発酵生成物を投与し、そしてリポタンパク質代謝に関わる遺伝子を制御することによる患者の高コレステロール血症を処置する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ＰＡＺ、ＰＡＺから単離された特異的成分、及びＰＡＺ成分の化学合成類似体からなる群から選ばれる有効量の組成物を投与し、そしてリポタンパク質代謝に関わる遺伝子の発現を制御することによる患者のコレステロールレベルを制御する方法を提供する。
【００１１】
本発明は、また、有効量の微生物発酵生成物を投与し、ＡＢＣＡ１、ＡｐｏＡ１及びＳＲ−Ｂ１をエンコードする少なくとも一種の遺伝子の発現を上方制御し、そしてＣＥＴＰをエンコードする遺伝子を下方制御することによる患者の高コレステロールを処置する方法を提供する。
【００１２】
本発明は、さらに、ＰＡＺ、ＰＡＺから単離された特異的成分、及びＰＡＺ成分の化学合成類似体からなる群から選ばれる有効量の組成物を投与し、リポタンパク質代謝に関わる遺伝子を制御し、そして高コレステロール発症を防止することによる高コレステロールの発症を防止する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
本発明の他の利点は、以下の詳細な説明を参照し、添付図面を関連させて検討されるときに、より良好に理解される。
【００１４】
【図１】図１は、ハムスターｉｎ ｖｉｖｏ予防的実験モデルで行った動物試験の概要を示すフローチャートである。ここで、高脂肪食を用いて高コレステロールレベルを作り、コレステロール代謝を変更する能力について、ＰＡＺ及びＰＡＺに由来し異なる化学特性に基づくフラクションの効果を評価した。
【００１５】
【図２】図２は、水を与えたハムスター、及びＰＡＺ、又はＰＡから単離したフラクションを含有する水を与えたハムスターに対する高脂肪食の平均食事摂取量（ｇ）のグラフである（図１の凡例参照）。
【００１６】
【図３】図３は、水を与えたハムスター、及びＰＡＺ又はＰＡＺから単離したフラクションを含有する水を与えたハムスターに対する試験中（週）の平均体重（ｇ）のグラフである（図１の凡例参照）。
【００１７】
【図４】図４は、水を与えたハムスター、及びＰＡＺ又はＰＡＺから単離したフラクションを含有する水を与えたハムスターに対する試験中（週）の平均水分摂取量（ｍＬ）のグラフである（図１の凡例参照）。
【００１８】
【図５】図５は、高脂肪食を給餌したハムスターの総コレステロールレベル（ｍｇ／ｄＬ）について、ＰＡＺ及びＰＡＺから単離したフラクションの効果を添加物無しの水と比較したグラフである。
【００１９】
【図６】図６は、高脂肪食を給餌したハムスターのＨＤＬ−コレステロールレベル（ｍｇ／ｄＬ）について、ＰＡＺ及びＰＡＺから単離したフラクションの効果を添加物無しの水と比較したグラフである。
【００２０】
【図７】図７は、高脂肪食を給餌したハムスターの総コレステロールレベルとＨＤＬ−コレステロールレベルとの比率について、ＰＡＺ及びＰＡＺから単離したフラクションの効果を添加物無しの水と比較したグラフである。
【００２１】
【図８】図８は、高脂肪食を給餌したハムスターの非ＨＤＬ（ＬＤＬ）−コレステロールレベル（ｍｇ／ｄＬ）について、ＰＡＺ及びＰＡＺから単離したフラクションの効果を添加物無しの水と比較したグラフである。
【００２２】
【図９】図９は、高脂肪食を給餌したハムスターの血漿トリグリセリドレベル（ｍｇ／ｄＬ）について、ＰＡＺ及びＰＡＺから単離したフラクションの効果を添加物無しの水と比較したグラフである。
【００２３】
【図１０】図１０は、高脂肪食を給餌したハムスターのリポタンパク質プロファイルについて、ＰＡＺ及びＰＡＺから単離したフラクションの効果を添加物無しの水と比較したグラフである。
【００２４】
【図１１】図１１は、高脂肪食＋ＰＡＺ及びＰＡＺから単離したフラクションを給餌したハムスターのリポタンパク質組成のシフトを、高脂肪食＋添加物無しの水を給餌したハムスターと比較した図示である。
【００２５】
【図１２】図１２は、高脂肪食＋ＰＦ３フラクションを給餌したハムスターのリポタンパク質組成のシフトを、高脂肪食＋添加物無しの水を給餌したハムスターと比較した図示である。
【００２６】
【図１３】図１３は、水又は無希釈ＰＦ４を添加した血清のＣＥＴＰ活性アッセイについて得られた結果の図示である。
【００２７】
【図１４】図１４は、水又は無希釈ＰＦ４を添加した血清のＰＬＴＰ活性アッセイについて得られた結果の図示である。
【００２８】
【図１５】図１５は、水又はＰＦ３（１：１０希釈）を添加した血清のＣＥＴＰ活性アッセイについて得られた結果の図示である。
【００２９】
【図１６】図１６は、水又はＰＦ３（１：１０希釈）を添加した血清のＰＬＴＰ活性アッセイについて得られた結果の図示である。
【００３０】
【図１７】図１７は、ＨＭＧＣｏＡレダクターゼ活性について、スタチン類（プレバスタチン類）対ＰＡＺに由来するＰＦ４フラクションの効果を比較する動力学アッセイの図示である。
【００３１】
【図１８】図１８は、コレステロール転送におけるさまざまなタンパク質及びリポタンパク質の役割の描写である。
【００３２】
【図１９】図１９は、定常（低脂肪）食＋水（ＣＷ）の対照群と比べた、高脂肪食＋完全（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）ＰＡＺ（ＰＰ）、高脂肪食＋一連のクロマトグラフィ工程でＰＡＺから単離した一フラクション（ＰＦ４として照合）、又は高脂肪食＋水（ＰＷ）を給餌したハムスター（４週予防的モデル）の肝臓中のコレステロール及びＨＤＬ代謝の制御に関わるキータンパク質をエンコードする遺伝子の発現の相対的レベルを測定するための定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）実験から得られた結果の図示である。
【００３３】
【図２０】図２０は、高脂肪食＋添加物無しの水（ＰＷ）を維持した対照群と比べた、高脂肪食＋完全ＰＡＺ（ＰＰ）又はＰＦ４フラクションのいずれかを給餌したハムスター（４週予防的モデル）の肝臓中のコレステロール及びＨＤＬ代謝の制御に関わるキータンパク質をエンコードする遺伝子の発現の相対的レベルを測定するための定量的リアルタイムＰＣＲ実験から得られた結果の別の図示である。
【００３４】
【図２１】図２１は、添加物無しで培養した対照細胞と比較した、二種類の異なるロットの完全ＰＡＺの少量を含有する培地中で培養したヒトＨＥＰＧ２細胞中のＣＥＴＰをエンコードする遺伝子の発現の相対レベルを測定するための定量的リアルタイムＰＣＲ実験で得られた結果の図示である。
【００３５】
【図２２】図２２は、添加物無しで培養した対照細胞と比較した、完全ＰＡＺのさまざまな希釈物を含有する培地中で培養したヒトＨＥＰＧ２細胞中のＣＥＴＰをエンコードする遺伝子の発現の相対レベルを測定するための定量的リアルタイムＰＣＲ実験で得られた結果の図示である。
【００３６】
【図２３】図２３は、ハムスターｉｎ ｖｉｖｏ治療学的実験モデルの総コレステロールレベル（ｍｇ／ｄＬ）、ＨＤＬ−コレステロールレベル（ｍｇ／ｄＬ）及びトリグリセリドレベル（ＴＧ）（ｍｇ／ｄＬ）について、ＰＡＺ及びＰＡＺに由来するＰＦ３フラクションの効果を、添加物無しの水と比較したグラフである。ここで、ハムスターは、最初に、高脂肪食を４週間給餌して高コレステロール血症を誘発させ、次いで、追加の２１日間、高脂肪食＋完全ＰＡＺ（１群１、Ｇ１）又はＰＡＺに由来するＰＦ３フラクション（２群、Ｇ２）で処置した。
【００３７】
【図２４】図２４は、ハムスターｉｎ ｖｉｖｏ治療学的実験モデルの血漿コレステロール対ＨＤＬコレステロールレベルの比率について、ＰＡＺ及びＰＡＺに由来するＰＦ３フラクションの効果を、添加物無しの水と比較したグラフである。ここで、ハムスターは、ハムスターは、最初に、高脂肪食を４週間給餌して高コレステロール血症を誘発させ、次いで、追加の２１日間、高脂肪食＋完全ＰＡＺ（１群１、Ｇ１）又はＰＡＺに由来するＰＦ３フラクション（２群、Ｇ２）で処置した。
【００３８】
【図２５】図２５は、ハムスターｉｎ ｖｉｖｏ治療学的実験モデルの肝臓中のＡＰＯＡ１及びＣＥＴＰタンパク質をエンコードする遺伝子の発現（ｑＰＣＲを用いる）について、ＰＡＺ及びＰＡＺに由来するＰＦ３フラクションの効果を、添加物無しの水と比較したグラフである。ここで、ハムスターは、最初に、高脂肪食を４週間給餌して高コレステロール血症を誘発させ、次いで、追加の２１日間、高脂肪食＋完全ＰＡＺ（１群）、ＰＡＺに由来するＰＦ３（２群）又は添加物無しの水（Ｗ、対照）のいずれかで処置した。
【００３９】
【図２６】図２６は、ハムスターｉｎ ｖｉｖｏ治療学的実験モデルの肝臓中のＡＰＯＡ１及びＣＥＴＰタンパク質をエンコードする遺伝子の発現（ｑＰＣＲを用いる）について、ＰＡＺフラクション（ＰＦ３、ＰＦ４）、ＰＦ４とその後のさまざま処理の効果を、添加物無しの水と比較したグラフである。ここで、ハムスターは、最初に、高脂肪食を４週間給餌して高コレステロール血症を誘発させ、次いで、追加の７日間、高脂肪食＋特定のＰＦ３、ＰＦ４フラクション、ＰＦ４フラクションとそれに続く特定の処置、又は添加物無しの水のいずれかで処置した。
【００４０】
【図２７】図２７は、ｉｎ ｖｉｖｏ治療学的実験モデルのハムスターで行った動物試験の概略を示すフローチャートであり、ここで、高コレステロールレベルを作るのに高脂肪食を使用し、そしてコレステロール代謝を変更する能力についてＰＡＺのＰＦ４フラクションの効果を評価した。
【００４１】
【図２８】図２８は、高コレステロール血症を誘発するために高脂肪食を４週間給餌し、そして追加の２１日間、高脂肪食＋ＰＡＺのＰＦ４フラクション又は添加物無しの水（対照）のいずれかで処置したハムスターのさまざまな時点の血漿総コレステロールレベル（ｍｇ／ｄＬ）に関するＰＡＺのＰＦ４フラクションの効果を添加物無しの水と比較したグラフである。
【００４２】
【図２９】図２９は、高コレステロール血症を誘発するために高脂肪食を４週間給餌し、そして追加の２１日間、高脂肪食＋ＰＡＺのＰＦ４フラクション又は添加物無しの水（対照）のいずれかで処置したハムスターのさまざまな時点の血漿ＨＤＬｃレベル（ｍｇ／ｄＬ）に関するＰＡＺのＰＦ４フラクションの効果のグラフである。
【００４３】
【図３０】図３０は、高コレステロール血症を誘発するために高脂肪食を４週間給餌し、そして追加の２１日間、高脂肪食＋ＰＡＺのＰＦ４フラクション又は添加物無しの水（対照）のいずれかで処置したハムスターのさまざまな時点の血漿トリグリセリドレベル（ｍｇ／ｄＬ）に関するＰＡＺのＰＦ４フラクションの効果のグラフである。
【００４４】
【図３１】図３１は、高コレステロール血症を誘発するために高脂肪食を４週間給餌し、そして追加の２１日間、高脂肪食＋ＰＡＺのＰＦ４フラクション又は添加物無しの水（対照）のいずれかで処置したハムスターのさまざまな時点のさまざまな血漿脂質パラメータ（ＴＣ、総コレステロール；ＨＤＬ；ＴＧ、トリグリセリド類；非ＨＤＬ）の変化を比較するグラフである。
【００４５】
【図３２】図３２は、ハムスターｉｎ ｖｉｖｏ治療学的実験モデルの肝臓中のＡＰＯＡ１及びＣＥＴＰタンパク質をエンコードする遺伝子の発現（ｑＰＣＲを用いる）について、ＰＡＺのＰＦ４フラクションの効果を、添加物無しの水と比較したグラフである。ここで、ハムスターは、最初に、高脂肪食を４週間給餌して高コレステロール血症を誘発させ、次いで、追加の２１日間、高脂肪食＋ＰＡＺのＰＦ４フラクション又は添加物無しの水（対照）のいずれかで処置した。ハムスター群を２１日間の処置期間中のさまざまな時点（３日目、７日目、１０日目、１４日目及び２１日目）に評価した。
【００４６】
【図３３】図３３は、ＰＡＺのＰＦ４フラクションのさまざまな血漿脂質パラメータに関する効果についてのさまざまな研究の結果を要約する表である。ＰＦ４ロット１／３０及びＰＦ４ｎロット３／３０は、ハムスターに、高脂肪食＋ＰＡＺロットの異なるＰＦ４フラクションを給餌した（代表的な水の対照の結果は、カラムＰＷ１に見られる）予防的実験モデルで得られた結果を表す。Ｔ２１／ＰＦ４ロット３は、ハムスターに、高脂肪食を４週間給餌して高コレステロール血症を誘発させ、次いで、追加の２１日間、高脂肪食＋ＰＡＺのＰＦ４フラクション又は添加物無しの水（ＰＷ２）のいずれかで処置した治療学的実験モデルから得られた結果を表す。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明は、一般に、コレステロールレベルが高いかあるいは異常、すなわち高コレステロール血症を有する個体（すなわち、ヒトの患者又は動物）を、複合的微生物発酵生成物の使用を介して処置する方法を提供する。本発明は、より特定的には、複合的微生物発酵生成物の一定の成分が、コレステロール代謝パスウエイに影響を及ぼし、そしてリポタンパク質代謝に関わる遺伝子を制御することによる作用機序を提供する。
【００４８】
「ＰｒｏＡｌｇａＺｙｍｅ（商標）」（ＰＡＺともいう）は、栄養補助食品として３０年間にわたって使用された淡水性藻類生態系の新規な発酵生成物である。ＰＡＺは、最初は、１９８０年代の米国において伝説上の若返りの泉と関連してポンセ・デ・レオン・メディカル・ディベロップメント社（Ｐｏｎｃｅ ｄｅ Ｌｅｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｐ．）によりレーベンスツァイト（Ｌｅｂｅｎｓｚｅｉｔ、商標、ドイツ語で「生涯」を意味する）という名で販売された。製品は、２００３年にはＰｒｏＡｌｇａＺｙｍｅ（登録商標、ＰＡＺ）として今日知られるものとなっている。浸出液（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）は、３０年以上前に自然発生源の中に発見された淡水生物の独自開発ブレンドの水性発酵生成物であり、以来、管理された条件下で培養されてきた。本発明のＰｒｏＡｌｇａＺｙｍｅ水性抽出物又はＰＡＺを生じる培養物の寄託物が、バージニア州、マナッサスのアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託＃ＰＴＡ−５８６３として置かれている。ＰｒｏＡｌｇａＺｙｍｅ経口液体栄養補助食品（る発酵プロセス消耗型ろ液（ｃｏｎｓｕｍａｂｌｅ ｆｉｌｔｒａｔｅ））は、典型的には、約９０％の塩（検出限界＜０．１ｐｐｍにて重金属フリー）及び有機成分の特異なブレンドからなる１００ｐｐｍ以下の全溶解固形物（ｔｏｔａｌ ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｓｏｌｉｄｓ）を有する。ＰＡＺは、また、以前、植物浸出物（ｐｈｙｔｏ−ｐｅｒｃｏｌａｔｅ）と呼ばれていた。
【００４９】
ＰＡＺ成分は、以下に記載されるＰｒｏＡｌｇａＺｙｍｅ藻類発酵培地から単離することができ、あるいは、従来知られるすべての適当な方法によって製造することができる。ＰＡＺ及び誘導体を製造する適当な方法は、例えば微生物を用いて組換え又は天然にタンパク質を発現する、誘導体を合成的に製造する（すなわち、化学的（無細胞）合成）、あるいは、ＡＴＣＣ寄託＃ＰＴＡ−５８６３内に存在する培養培地又は一種以上の種の細胞内容物から誘導体又は活性化合物を抽出することが挙げられる。微生物を使用してＰＡＺ又はその誘導体を製造する場合、すべての適当な天然に発生する又は組換えの微生物を使用可能である。ＰＡＺ又はその誘導体は、ＡＴＣＣ寄託＃ＰＴＡ−５８６３内に存在する天然発生種又はその組換えバリアントを用いて製造される。
【００５０】
発明性を有するＰＡＺを作る方法もまた開示する。ＰＡＺは、まず、ＡＴＣＣ寄託＃ＰＴＡ−５８６３内に見られる水性生物の混合物を培養することにより調製され、混合物は強化された藻類及び細菌培養液を形成する特別な栄養素ブレンドによって増大する。この強化培養物に添加されるものは、逆浸透、蒸留、脱イオン化又は他の手段で精製された精製淡水である。培養物を前記精製淡水及び栄養素ブレンドとともに、本質的に生物学的活性な抽出物を形成する所定の時間、インキュベートされる。強化された藻類及び細菌培養液から抽出物をデカンテーションし、次いで処理する。適当な抽出物処理方法には、ろ過、遠心分離、凍結乾燥、透析、精製、エバポレーション、濃縮、蒸留、処方（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）及び他の方法が挙げられる。デカンテーションされた抽出物の特別な一処理方法は、約０．２２μｍより大きい粒子を除去する精密ろ過である。
【００５１】
本明細書に編入される米国特許出願第１１／５８７，２６６では、ＰＡＺ源となる培養物を、ＡＴＣＣ寄託＃ＰＴＡ−５８６３中に見られる濃厚な藻類、苔、真菌及び細菌の細胞の約１００〜２００ｍＬ又は約０．１〜約５００ｇ以上（生体重）を約２．５ガロン（約１０L）の脱イオン化ろ過水に入れたものでできている。この方法では、培養物は、蛍光灯又は全光束灯（ｆｕｌｌ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｌｉｇｈｔｓ）の下で１２：１２時間光／暗サイクル、約１５〜３７℃の間、特に２５℃で育成される。培養物は、約２．５ガロン（約１０L）の容積を有し、大気とのガス交換を可能にする半透明蓋の付いた透明ドラム形金魚鉢型容器内で育成される。培養物には活性生酵母（ａｃｔｉｖｅ ｌｉｖｅ ｙｅａｓｔ）、又は３７℃〜約４３℃の無菌脱イオン化温水５０ｍＬに添加された１．０ｇの乾燥活性酵母から調製されているパン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が与えられた。酵母混合物を攪拌し、室温で１０〜３０分間、あるいは若干泡立つまでインキュベートさせる。以下に定義するように、培養物が充満され、収穫される回数の間に、１回以上、約１ｍＬの調製酵母混合物が各培養物に与えられる。他の酵母培養物及び方法を使用できることは、本発明の範囲内であると考えられる。さらに、従来技術で知られている他の培養条件、材料及び方法は、ＰＡＺ、その成分、活性化合物、及び誘導体の製造を支持するならば、使用可能と考えられ、それらは、多種培養物又は単一培養物、バッチ、半連続式、連続式又は他の培養系、バイオリアクター、光リアクター又は他の発酵技術、あるいは、他の適当なソース、支持体やキャリアーを含む。
【００５２】
培養液又はＰＡＺは、定期的に各培養物から上部を流し出すことにより回収することができる。このプロセスを「収穫」と呼び、得られる液体を「ＰＡＺ」、「ＰｒｏＡｌｇａＺｙｍｅ」又は「水性抽出物」と呼び、そしてそれをさらに処理にかけることができる。ここで、ＰＡＺが各培養物からデカンテーションされる間に実質的に乱されない培養容器底部に、培養物を形成する大部分の藻類細胞が残る。収穫するために、及び収穫後のデカンテーションされたＰＡＺをろ過又はさらなる処理の前後にバッチ化するために、従来技術で知られるさまざまな材料及び方法を使用可能である。収穫後、ＰＡＺはろ過され、望むままに消費される。生理活性を有すること及び消費が安全であることがわかっている。育成容器の液容は、室温（約２５℃）の逆浸透精製又は脱イオン化ろ過水を用いて元の容積へ戻すことができる。収穫、処理、精製や化合物単離の他の方法やシステムを、ＰＡＺ及びその誘導体の製造のために使用可能であると考えられ、適切なら、処理しないことを含む。さらに、ＰＡＺは、瓶詰め、濃縮、希釈、乾燥、あるいは他の材料（例えば別の方法で処理し、別の方法を採用する）とともに処方することができると考えられる。
【００５３】
ＰＡＺから単離した個々の活性化合物及びそれらの合成等価物であって、本明細書に記載された他の疾患を処置する機能のほかに、患者のコレステロールレベルを下げるのに有効であるものを、単独で使用でき、あるいはそれらを組み合わせてもよい。好ましくは、ＰＡＺから単離され、及びＰＡＺで特徴づけられる一種以上の物質であって、化学合成され及び不活性成分の不在の下で投与されるものに処置を限定することができる。
【００５４】
本明細書で使用する「治療学的有効量」は、疾患状態又は健康状態（ｍｅｄｉｃａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）の徴候を、好ましくは高いＬＤＬ又は総コレステロールレベル、及び低いＨＤＬコレステロールレベルを緩和する本発明の組成物の量を意味する。さらに、投薬計画は、以下の例に見ることができる。好ましくは、ＰＡＺを、液状経口サプリメントとして投与するが、検分される活性を保証することが明らかである合成化合物の投与は、毎日、ｍｇ又はμｇの範囲の濃縮物で経口的に投与されるカプセル形態と同様である。例えば、一般に、無徴候性の患者に１日当たり約１オンス以上、そして疾患患者に１日当たり３オンス以上投与することができる。さらに、投薬計画は、以下の例に見ることができる。
【００５５】
本発明は、有効量の微生物発酵生成物を投与し、そしてリポタンパク質代謝に関わる遺伝子を制御することによる患者の高コレステロール血症を処置する方法を提供する。微生物発酵生成物、すなわち、ＰＡＺ、その単離成分、又はその化学合成類似体を投与することにより、リポタンパク質代謝及び／又はコレステロールに関わる一種以上の遺伝子を上方又は下方制御することができる。この方法を以下に詳細に説明する。
【００５６】
本発明は、より特定的には、ＰＡＺ、ＰＡＺから単離された特異的成分、及びＰＡＺ成分の化学合成類似体からなる群から選ばれる有効量の組成物を投与し、そしてリポタンパク質代謝に関わる遺伝子の発現を制御することによる患者のコレステロールレベルを制御する方法を提供する。前記組成物は、好ましくは、液状の経口サプリメントの形態であるが、本明細書に記載された他の形態も使用可能である。前記組成物は、また、機能性食品の形態でもあり得、又は食品添加物でもあり得る。前記組成物の投与は、好ましくは、毎日であるが、本明細書に記載された他の投与プロファイルを使用可能である。
【００５７】
前記組成物を投与することによって、さまざまな遺伝子が上方制御及び下方制御される。ＡｐｏＡ１及びＳＲＢ１遺伝子の転写が上方制御され、一方、ＣＥＴＰをエンコードする遺伝子の転写が下方制御される。したがって、より一般には、ＡＢＣＡ１、ＡｐｏＡ１及びＳＲＢ１エンコードする少なくとも一種の遺伝子を上方制御する、及び／又はＣＥＴＰをエンコードする遺伝子を下方制御することにより、高いＬＤＬ及び総コレステロール（ＴＣ）、並びに低いＨＤＬコレステロールを処置することができる。より特定的には、ＰＡＺを投与することによって、ＴＣレベルを下げることが可能であり、ＬＤＬレベルを下げることが可能であり、そしてＨＤＬレベルを上げることが可能である。これらの遺伝子の上方制御及び下方制御は、患者から血漿又は血液サンプルを採取し、汎用の方法でＴＣ、ＨＤＬ及びＬＤＬを分析する等のアッセイを行うことにより確認することができる。
【００５８】
本発明は、また、有効量の微生物発酵生成物を投与し、ＡＢＣＡ１、ＡｐｏＡ１及びＳＲ−Ｂ１をエンコードする少なくとも一種の遺伝子の発現を上方制御し、及び／又は、ＣＥＴＰをエンコードする遺伝子を下方制御することによる個体の高コレステロールを処置する方法を提供する。微生物発酵生成物は、上記したように、ＰＡＺ、ＰＡＺから単離された特異的成分、及びＰＡＺ成分の化学合成類似体からなる群から選ばれる組成物である。微生物発酵生成物は、液状経口サプリメントの形態であるが、本明細書に記載された他の投与形態や投与プロファイルも使用可能である。上方制御及び下方制御が前に上記したように行われていることを確認するためにアッセイを行うことができる。
【００５９】
本発明は、さらに、ＰＡＺ、ＰＡＺから単離された特異的成分、及びＰＡＺ成分の化学合成類似体からなる群から選ばれる有効量の組成物を投与し、リポタンパク質代謝に関わる遺伝子を制御し、そして高コレステロールの発症を防止することによる高コレステロールの発症を防止する方法を提供する。これは、高コレステロールにかかるリスクをもつ個体がそれらを保護するための手段を講じる予防方法である。個体が、一旦、高コレステロールにかかるリスクにさらされると確認した場合、前記組成物の服用を開始することができる。前記組成物は、毎日投与され得る。前記組成物は、液状の経口サプリメント、機能性食品、又は食品添加物の形態であり得る。すべての他の投与形態や投与療法を使用可能である。
【００６０】
以下の実施例で、遺伝子制御及びコレステロールレベルを測定するために、ＰＡＺ及びそのフラクションを用いたさまざまな試験を行っている。遺伝子制御の同様のパターンが、ＰＡＺそれ自体と比較して比較的少ない成分を含有する、一定のクロマトグラフィで精製されたフラクション（例えば、ＰＦ３及びＰＦ４フラクション）で処置した動物に観測される。しかし、ＡｐｏＡ１をエンコードする遺伝子の発現は、ＰＦ３又はＰＦ４単独よりもＰＡＺでより顕著に強化され、これは、コレステロール代謝に関して有益な効果をもつ追加の成分がＰＡＺ内に存在すること、あるいはこれらの二つのフラクション中の成分の相乗効果を示している。したがって、より一般には、高コレステロールは、ＡｐｏＡ１及び／又はＳＲＢ１を上方制御し及び／又はＣＥＴＰを下方制御するために、ＰＡＺ又はそこに含有される化合物を用いて有利に処置することができる。
【００６１】
ＰＡＺ及びＰＦ４は、ＣＥＴＰ及びＨＭＧＣｏＡレダクターゼタンパク質の機能活性についての直接の効果を試験しており、そして効果がないことがわかっている。さらに、このデータは、機序が転写レベルにあることを支持する（実施例２参照）。
【００６２】
ＰＡＺ並びにＰＦ３及びＰＦ４成分がこれら三種類の遺伝子の一種以上のｉｎ ｖｉｖｏの発現を有利に変更すると証明された能力とは対照的に、培養ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２）におけるコレステロール代謝に関わる遺伝子の発現を影響する能力を試験すると、ＣＥＴＰをエンコードする遺伝子の発現にのみ有意な変化が観測された。血管上皮細胞（ＨＵＶＥＣ）でｉｎ ｖｉｔｒｏ試験すると、得られた結果は一貫性がなく、そしてｉｎ ｖｉｖｏのコレステロール代謝で観測された有益な効果と一致しなかった。したがって、観測された活性は、それについて非自明であり、現代の製薬リサーチで採用する方法、すなわち、最初にｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞株をスクリーニングする方法を用いてアプローチした時に、ＰＡＺは、コレステロール低減組成物としてさらに検討されることから除外されるであろう（実施例３参照）。
【００６３】
ＰＡＺの全体効果を実施例１に示すが、それは、ＬＤＬだけでなく総血漿コレステロール（ＴＣ）を低減する。ＰＡＺは、また、ＨＤＬを有意に増大させ、それは、ＴＣ／ＨＤＬ比率の改善を生じる。血漿コレステロールの変化は、また、リポタンパク質粒子でのシフトを伴う。これらの効果のそれぞれは、上記したように、特定の遺伝子の発現の上方制御及び／又は下方制御によって作られる。
【００６４】
本発明の化合物を用いてハムスターで実験を行ったが、その結果は、ヒトで期待されるものを予測できる。ハムスターは、ヒトでのコレステロール代謝における候補薬の効能の予測に使用の好ましいモデルである。
【００６５】
ＰＡＺ、若しくはＰＡＺに由来する調製物又は化合物を、医師により適当とされる投薬計画に従って、毎日投与可能である。この処置は、病的コレステロールレベルをもつと診断された患者へ、コレステロールをより望ましいレベルへ持ってゆくための治療学的療法として提供可能である。別法として、該処置は、さまざまな因子によって、高い総及びＬＤＬコレステロールレベル、及び低いＨＤＬコレステロールレベルに進展する傾向の患者の予防的療法として提供可能であり、この場合、ＰＡＺを予防的処置として投与可能である。
【００６６】
ＰＡＺは、また、機能性食品、又はさまざまな飲料又は他の食材中の食品添加物として投与可能である。
【００６７】
本発明の主題であるＰＡＺ、ＰＡＺに由来するフラクション、又はＰＡＺの活性成分と等価又は類似する合成化合物は、個々の患者の臨床状態、投与部位及び方法、投与計画、患者年齢、性別、体重、及び医師が知る他の因子を考慮しながら、良質な診療行為に従って投与又は投薬される。したがって、本明細書で目的とする薬学的「有効量」は、当業分野で知られるような検討によって決定される。量は、生存率の改善やより迅速な回復、若しくは、兆候の改善又は消失、及び当業者によって適当な尺度として選択される他の指標を含む（しかし限定されない）改善を達成するのに効果的であるべきである。
【００６８】
本発明の方法において、本発明の化合物は、さまざまな方法で投与可能である。それは、調剤として投与可能であり、そして単独に又は薬学的に許容可能な担体、希釈剤、アジュバント及びビークルと組み合わせる有効成分として投与可能であることが特記されるべきである。化合物は、経口的、皮下、又は静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、扁桃内及び鼻腔内投与、さらに髄腔内及び注入技術を含む非経口的に投与可能である。化合物のインプラントもまた有用である。処置される患者は、温血動物、特にヒトを含む哺乳類である。薬学的に許容可能な担体、希釈剤、アジュバント及びビークルとさらにインプラント担体は、一般に、不活性で無毒性の固体又は液体充填剤、希釈剤、又は本発明の有効成分と反応しないカプセル化材料を意味する。
【００６９】
投与は、数日間にわたって単回投与又は複数回投与であり得る。処置は、一般に、疾患過程及び薬効の長さ、並びに処置される患者の種類に比例した長さを有する。
【００７０】
本発明の化合物を非経口投与する場合、それは、一般に、単位投与量の注射剤型（溶液、懸濁液、乳濁液）に処方される。注射に適当な製薬処方には、無菌の水性溶液又は分散液、及び無菌の注射可能な溶液又は分散液に再構成するための無菌粉体が含まれる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、それらの適当な混合物、及び植物油を含有する溶剤又は分散媒体であり得る。
【００７１】
適当な流動性は、例えばレシチンのようなコーチング（ｃｏａｔｉｎｇ）の使用により、分散液の場合は要求される粒径の管理により、そして界面活性剤の使用により維持することができる。綿実油、ゴマ油、オリーブ油、大豆油、コーン油、ひまわり油、及びピーナッツ油等の非水性ビークル、ミリスチン酸イソプロピル等のエステルもまた、調剤組成物の溶剤系として使用可能である。さらに、抗菌性防腐剤、抗酸化剤、キレート化剤及び緩衝液を含む、前記組成物の安定性、無菌性及び等張性を強化するさまざまな添加物を添加可能である。微生物の作用の防止は、さまざまな抗菌性及び抗真菌薬、例えばパラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等により確保可能である。多くの場合、等張剤、例えば糖類、塩化ナトリウム等を含むことが望ましい。注射可能な薬剤形態の長びく吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によりもたらされる。しかし、本発明によれば、使用されるすべてのビークル、希釈剤、又は添加剤は、化合物と親和性（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）である必要があろう。
【００７２】
注射可能な無菌溶液は、本発明を実施する際に利用される化合物を、所望により他のさまざまな添加剤とともに必要量の適当な溶剤中に取り込むことにより調製可能である。
【００７３】
本発明の薬理学処方は、さまざまなビークル、アジュバント、添加剤、及び希釈剤等のすべての親和性担体を含有する注射可能な処方で患者に投与可能であり、また、本発明で利用される化合物を、モノクローナル抗体、ベクター送達、イオン泳動、高分子マトリックス、リポソーム及びマイクロスフィア等の徐放性皮下インプラントや標的送達系の形態で非経口的に患者に投与可能である。本は発明に有用な送達系の例には、米国特許５，２２５，１８２；５，１６９，３８３；５，１６７，６１６；４，９５９，２１７；４，９２５，６７８；４，４８７，６０３；４，４８６，１９４；４，４４７，２３３；４，４４７，２２４；４，４３９，１９６；及び４，４７５，１９６が含まれる。多くの他のインプラント、送達系及びモジュールは、当業者に周知である。
【実施例】
【００７４】
以下の実験的実施例を参照して、本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、説明のためにのみ提供され、特に言及しない限り、限定的な意図ではない。したがって、本発明は、以下の実施例に限定されるよう解釈されるのではなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として自明となるすべての変更を含むと解釈されるべきである。
【００７５】
実施例１
【００７６】
実験の特定の目的は、（ａ）生理活性は完全複合混合物を要求するかどうか、あるいはその成分の一又は数種によるものかを決定する、（ｂ）このプロセスに由来するＰＦフラクションをｉｎ ｖｉｔｒｏ（細胞培養物）及びｉｎ ｖｉｖｏ（ハムスター）の実験モデル系で評価するために、クロマトグラフィ技術を採用して完全ＰＡＺ培養ろ過物をその化学及び物理特性に基づくフラクションに分離することであった。
【００７７】
材料及び方法
【００７８】
血漿コレステロール分析のために、以下のアッセイキットを使用した：
【００７９】
ポインテ・サイエンティフィック社（Ｐｏｉｎｔｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）より：
【００８０】
コレステロール液体（Ｃ７５１０−血漿総コレステロール用）
【００８１】
トリグリセリドＧＰＯ液体試薬セット（Ｔ７５３１−血漿ＴＧ用）
【００８２】
ＨＤＬ／コレステロールＭｇ／Ｄｅｘ（Ｈ７５０７−マグネシウム沈殿による血漿ＨＤＬ用）
【００８３】
和光社（Ｗａｋｏ）より：
【００８４】
遊離コレステロールＥ（４３５−３５８０１）
【００８５】
リン脂質Ｃ（４３３−３６２０１）
【００８６】
ＰｒｏＡｌｇａＺｙｍｅTMをサブフラクションに分離した。
【００８７】
Ｆ１：多くのタンパク質を捕獲するための弱陰イオン交換
【００８８】
Ｆ２：カルボキシル基及び負に帯電したイオンをはじめとする負に帯電した他の官能基性を含有する分子を捕獲するための強陰イオン交換
【００８９】
Ｆ３：アミノ基及び正に帯電したイオンをはじめとする正に帯電した他の官能基性を含有する分子を捕獲するための強陽イオン交換
【００９０】
カラム４ 非極性有機分子を結合するＣ１８誘導（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）カラム
【００９１】
Ｆ４：採用した一連の樹脂（弱陰イオン交換、強陰イオン交換カラム、強陽イオン交換、及びＣ−１８カラム）に対して通過する（結合しない）液体。この「通過」フラクションをPF4と呼び、これは、カラム４により捕獲されず、そしてまた、生体機能が評価された低極性分子とともに、極性であるが無電荷の有機分子を含む比較的少数の分子を含有する。
【００９２】
研究デザインを図１に示す：
【００９３】
ＨＦ：高脂肪食（３０％カロリー、脂肪由来；飽和脂肪酸を含有するココナッツ油を主とし、＋１％大豆油）
【００９４】
ＰＡＺ：ＰｒｏＡｌｇａＺｙｍｅTM（完全溶液）
【００９５】
ＰＦ１、ＰＦ２、ＰＦ３及びＰＦ４は、ＰＡＺをクロマトグラフィで分離したフラクションである。
【００９６】
対照動物に、通常ハムスター飼料を給餌した。
【００９７】
Ｐ：高脂肪食（３０％カロリー、ココナッツ油由来）を意味する。
【００９８】
ＰＷ：高脂肪食＋水
【００９９】
ＰＰ：高脂肪食＋完全ＰｒｏＡｌｇａＺｙｍｅTM（２０ｍＬを１００ｍＬに希釈）
【０１００】
ＰＦ１：高脂肪食＋ＰｒｏＡｌｇａＺｙｍｅTMのフラクション１（５ｍＬを１００ｍＬに希釈）
【０１０１】
ＰＦ２：高脂肪食＋ＰｒｏＡｌｇａＺｙｍｅTMのフラクション２（５ｍＬを１００ｍＬに希釈）
【０１０２】
ＰＦ３：高脂肪食＋ＰｒｏＡｌｇａＺｙｍｅTMのフラクション３（５ｍＬを１００ｍＬに希釈）
【０１０３】
ＰＦ４：高脂肪食＋ＰｒｏＡｌｇａＺｙｍｅTMのフラクション４（２０ｍＬを１００ｍＬに希釈）
【０１０４】
ｐ値＝ＰＷに対する統計的有意差（Ｏｎｅ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、ＳＴＡＴＰＬＵＳ）；ｎ＝１０／群
【０１０５】
ｐ＜０．０５は、比較される２群間で、パラメータ（例えばＴＣ）の平均値が統計的に相違することを暗示する。ｐ値が低いほど、統計的有意差が高い。
【０１０６】
グラフ上、ＰＷと比較して統計的に相違するカラムを、＊（ｐ＜０．０５）又は＊＊（ｐ＜０．０１）で表示した。
【０１０７】
要約：コレステロール血症予防的モデル系ハムスターの血漿脂質に関するＰＡＺの予防効果
【０１０８】
ＰＡＺは、２８日予防的研究にわたって、血漿総コレステロール（ＴＣ）及び非ＨＤＬ（ＬＤＬ）の統計的有意な減少をもたらす。ＰＡＺは、ＨＤＬの統計的に有意な増大をもたらし、これは、ＴＣ／ＨＤＬ比率の顕著な改善につながる。血漿コレステロールの変化は、リポタンパク質粒子のシフトを伴う。結果を図Ｓ２−１２に示す。
【０１０９】
図２に示すように、飼料平均摂取量は、一般に、４週間にわたって減少した。図３に示すように、平均体重は４週間にわたって増大した。図４は、平均摂水量が４週間にわたって減少したことを示す。図５は、ＰＦ３給餌動物の平均ＴＣが水を与えた動物（ＰＷ）よりも有意に低かったことを示す。図６は、ＰＰ、ＰＦ３及びＰＦ４の場合の平均ＨＤＬコレステロールが、水給餌群（ＰＷ）と比較して有意に高かったことを示す。図７は、ＰＦ３及びＰＦ４の場合の平均ＴＣ／ＨＤＬ比率が、ＰＷと比較して有意に低かったことを示す。図８は、ＰＰ、ＰＦ３、及びＰＦ４の場合の平均ＬＤＬコレステロールが、ＰＷと比較して有意に減少したことを示す。図９は、トリグリセリドレベルの減少が統計的有意差に達しなかったことを示す。図１０は、各群のリポタンパク質プロファイルを示し、そして各ＰＡＺ組成物は、プロファイルのシフトを生じた。図１１は、水を給餌したハムスター（ＰＷ）と完全ＰｒｏＡｌｇａＺｙｍｅTMを給餌したハムスター（ＰＰ）との間に、リポタンパク質組成物の低密度から高密度粒子へのシフトが存在したことを示す。図１２は、水対ＰＦ３給餌ハムスターにおいて、リポタンパク質組成物の低密度から高密度へのシフトが存在することを示す。
【０１１０】
実施例２に記載された実験の目的は、（ａ）コレステロール代謝に関わるキータンパク質の機能を変更するＰＡＺ及びそのフラクションの活性の能力について試験すること、及びそのような機序（例えばスタチン類についての場合である）を同定すること、（ｂ）ＰＡＺ抽出物のさらなる分別及び活性成分の究極の特徴を促進させるようなアッセイを採用することであった。
【０１１１】
実施例２
【０１１２】
この実施例は、コレステロール代謝酵素であるコレステロールエステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）、リン脂質転移タンパク質（ＰＬＴＰ）及びＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）の酵素活性に関して有するＰＡＺ、ろ過物ＰＦ４及びＰＦ３の効果の定量分析を詳説する。
【０１１３】
手順：
【０１１４】
ＣＥＴＰ及びＰＬＴＰアッセイ：ＣＥＴＰインヒビター・ドラッグ・スクリーニング・キット（カタログ＃Ｋ６０２−１００）、及びＰＬＴＰインヒビター・ドラッグ・スクリーニング・キット（カタログ＃Ｋ６０２−１００）を、バイオビジョン・リサーチ・プロダクツ社（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、マウンテンビュー、カリフォルニア州）から入手した。酵素アッセイを製造者の指示に従って行った。詳細には、１６０μＬの脱イオン化（ＤＩ）水、ＰＦ４（無希釈）又はＰＦ３（ＤＩ水で１：１０希釈）を、９６ウエル黒色マイクロタイタープレートのウエルに分配した。次いで、容積を変更した対照ウサギ血清（ＣＥＴＰ及びＰＬＴＰの源）を、ウエルに添加した。いくつかのウエルは血清を受けつけなかったので、背景蛍光（ブランク）対対照として役立てた。１ウエルにつき、１部のアクセプター分子溶液、１部のドナー分子溶液、及び２部の１０´アッセイバッファーからなるマスターミックスを調製し、各アッセイに使用されるウエル数までスケールアップした。４０μＬのマスターミックスを各ウエルに添加し、プレートをシールし、３７℃の加湿器内で４５分間インキュベートした。各ウエルの蛍光強度を、４８５ｎｍ励起及び５２７ｎｍ放射のフィルタペアを持つラボシステム・フルオロスキャン・アスセント・エフエル・蛍光光度計（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ ＦＬ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）を用いて測定した。各状態を繰り返して行い、平均を報告した（各平均に標準偏差誤差バーを付けた）。
【０１１５】
ＨＭＧＲアッセイ：ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）アッセイキットを、シグマ−アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）から入手した。酵素アッセイを製造者の指示に従って行った。詳細には、１．５ｍＬのマイクロチューブに以下の試薬をその順番に加えた：１´アッセイバッファー、インヒビター（インヒビター対照及び試験サンプルに対する、提供されたプラバスタチンインヒビター、ＰＦ４（１５μＬ）又はＰＦ３（１：１０希釈の１５μＬ）のいずれか）、ＮＡＤＰＨ、ＨＭＧ−ＣｏＡサブストレート溶液、及びＨＭＧＲ。１つのチューブは、ＨＭＧＲを添加させず、ブランクとして使用した。陽性対照サンプルは、ＨＭＧＲを含有するが、インヒビターを含有しなかった。すべての反応を１ｍＬ容積で行った。チューブは、詳細には、ＨＭＧＲをミックスに添加した後、反応溶液をＵＶ−可視セルに移す前にボルテックスした。島津ＵＶ−１６０１ＵＶ−可視分光光度計で３４０ｎｍ吸収の示数を１５秒毎に５〜７分間、取得した。３４０ｎｍの吸収示数は、酵素活性を持つサンプル（例えば、陽性対照サンプル）でＮＡＤＰＨ濃縮のせいで減少した。
【０１１６】
結果：
【０１１７】
ＣＥＴＰ及びＰＬＴＰアッセイ：ＰＦ４によるＣＥＴＰ（図１３）又はＰＬＴＰ（図１４）酵素活性を、使用血清の容積にてＤＩ水中のこれらの酵素活性と比較したとき、有意な効果はなかった。
【０１１８】
ＰＦ３（１：１０希釈）が存在すると、高血清量（図１５）にてＣＥＴＰ活性のかすかな増大が観測される（結論参照）。ＰＦ３は、ＤＩ水と比較して、ＰＬＴＰ活性について負のすなわちインヒビター効果を有するようであった（図１６）。
【０１１９】
ＨＭＧＲアッセイ：インヒビターの存在無しでは、ＨＭＧＲ酵素活性は、明らかに下降（負）の傾きを形成する（図１７、ピンク色の実線（■）の近似曲線）。予期されるように、インヒビターのプラバスタチン類が存在するときのＨＭＧＲ活性は有意に減少した（図１７、ピンク色の実線（■）の近似曲線（ＨＭＧＲ）をオレンジ色の実線（▲）の近似曲線（ＨＭＧＲ＋プラバスタチン類）と対比）。ＨＭＧＲ活性の減少は、ＰＦ４がアッセイに存在したときは検出されなかった（図１７、ピンク色（■）の実線の近似曲線（ＨＭＧＲ）を青色の実線（×）の近似曲線（ＨＭＧＲ＋ＰＦ４）と対比）。しかし、ＰＦ３は、このアッセイで、ＨＭＧＲ活性についてインヒビター様の効果を有することが観察された（図１７、ピンク色の実線（■）の近似曲線（ＨＭＧＲ）を紫色の実線（●）の近似曲線（ＨＭＧＲ＋ＰＦ３）と対比）。
【０１２０】
結論：
【０１２１】
ＣＥＴＰ及びＰＬＴＰアッセイ：対照蛍光値の倍率の増大（対照血清を用いるか、あるいは用いないＤＩ水で得られたアッセイ測定結果）は、製造者の指示に報告されるとおりの期待された範囲にあり、これは、アッセイを予期するとおりに行っていることを示す。
【０１２２】
ＰＡＺのＰＦ４フラクションは、これらのアッセイキットを用いたＣＥＴＰ又はＰＬＴＰの活性のいずれにも効果を有しないようであった。ＰＡＺのＰＦ３フラクション（１：１０希釈）は、ＣＥＴＰ及びＰＬＴＰ活性の効果を有するようであった。しかし、効果は、これらの二種類の酵素の作用機序、及びｉｎ ｖｉｖｏ高コレステロール血症モデルでのＰＦ３のコレステロールを下げる可能性についての報告に基づいて予期されたものと反する。したがって、このデータ、特にＰＦ３についての解釈のもつ訓戒（ｃａｕｔｉｏｎ）は正当化される。これらのアッセイでは、ＰＦ３はＤＩ水中で１０倍希釈されたが、ＤＩ水単独やＰＦ４と比較して有意量の塩が存在する。これは、アッセイで使用された蛍光標識脂質で試験した酵素活性に関して逆効果を有し得た。さらに、これらのアッセイに先立って希釈ＰＦ３のｐＨが試験されなかったが、これもまた、同じく逆効果に寄与し得る。本研究の他の重要な面は、ＰＡＺが直接にリポタンパク質に作用せず、したがって、現在、高コレステロールを処置するのに使用されるスタチン類と同じ作用機序を持っていないことを示している。
【０１２３】
ＨＭＧＲアッセイ：この活性アッセイでは、経時的な３４０ｎｍの吸収の減少は、ＮＡＤＰＨ濃度としてのＨＭＧＲ活性が、ＨＭＧＲによるＮＡＤＰへの転換のせいで減少することを示している。ＰＡＺのＰＦ４フラクションは、このアッセイではＨＭＧＲ活性を抑制しなかったようである。しかし、ＰＡＺのＰＦ３ろ過物では特記される視認できる抑制が存在した。再び、ＣＥＴＰ及びＰＬＴＰ活性について観測されたＰＦ３の効果を考慮すると、これらの結果を解釈する際の警告となるべきものである。
【０１２４】
コレステロール代謝に関与する４つの酵素へのＰＡＺフラクションの効果について評価したことを以前に開示した。アッセイを行い、そして、上記したように、ＣＥＴＰ、ＰＬＴＰ及びＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼについての予備的データが得られた。４番目の酵素、レシチン−コレステロールアシルトランスフェラー（ＬＣＡＴ；血漿ＨＤＬ濃縮物の主要な決定因子（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ））は、評価できなかった。上記データに基づいて、ＣＥＴＰ、ＰＬＴＰ及びＨＭＧＲタンパク質へのＰＦ４及びＰＦ３の直接的効果に関する有意な発見はないと結論づけられる。
【０１２５】
これらのタンパク質は、ＬＣＡＴとともに、薬剤候補のＨＤＬ−コレステロールに関する効果を試験する際の、たびたび際立った評価ターゲットであるものの、ＨＤＬ−コレステロールレベルを増加させるよう導くコレステロール逆転送パスウエイでの他の機序が関与し、この際に評価を検討すべきと考えられる。例えば、ＡｐｏＡ１は、ＨＤＬ粒子のタンパク質成分の７０％を構成し、そしてほとんどすべてのＨＤＬ粒子に存在する。多くの研究が、ＨＤＬ−コレステロールレベルを上げる最良の策は、新規なＨＤＬコレステロールの前駆体であるＡｐｏＡ１をより多く作ることであると信じている。この理由のため、内因性ａｐｏＡ−１タンパク質発現の上方制御が、ＨＤＬ−コレステロールをターゲットとする新規な治療法を開発するための最も有望なアプローチのひとつである考えられる。検討されるべき追加の機序は、膜タンパク質であるクラスＢスカベンジャレセプタータイプ１（ＳＲ−Ｂ１）及びＡＴＰ−結合カセット１（ＡＢＣ１）（前者はＨＤＬの真性レセプター（ｂｏｎａ ｆｉｄｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）として、後者は脂質転送者として）の制御であり、両者は、コレステロール流出に重要であると強く関係づけられている。ＬＤＬレセプターの発現とリサイクルの制御、そしてしたがってその利用性もまた、機序であり、これにより、コレステロールレベルが生理学的に調節され、そして評価されるべきである。
【０１２６】
データは、ＣＥＴＰ、ＰＬＴＰ及びＨＭＧＲ活性へのＰＦ４及びＰＦ３フラクションの効果に関する有意な発見があるかどうかをほとんど明らかにしていない。しかし、ｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素アッセイで使用した同一のＰＡＺフラクションは、ｉｎ ｖｉｖｏ動物高コレステロール血症モデルにおいてＨＤＬ−コレステロールレベルを上昇させる能力を示した。これらの明らかに矛盾する結果は、（ａ）ｉｎ ｖｉｖｏでコレステロールレベルを下げるのに関与する機序は、われわれがｉｎ ｖｉｔｒｏで試験している特定の酵素と関係しない、（ｂ）これらのタンパク質の一種以上の発現又はターンオーバーを変更するような別の機序、及び／又は、活性代謝物質を生成するために、ＰＡＺの成分に作用するｉｎ ｖｉｖｏ前生物的変換（ｐｒｅｂｉｏｔｉｃ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）パスウエイの要求のためである。この生体内活性化プロセスは、ヒト及び動物の消化管又は血流内、あるいはヒト及び動物の消化管内に存続する細菌性ミクロフローラの中のいずれかで起こり得る。
【０１２７】
実施例３及び４に記載された実験の目的は、（ａ）ＰＡＺ及びＰＡＺのフラクションのコレステロール代謝に関与するキータンパク質をエンコードする遺伝子の発現を変更する能力を評価し、そしてそのような機序が同定できるかを評価すること、（ｂ）ＰＡＺ抽出物のさらなる分別と究極の特徴の活性成分を促進するようなアッセイを採用することである。
【０１２８】
実施例３
【０１２９】
一の特定目的は、高脂肪食と同時に完全ＰＡＺ（ＰＰ）及びＰＡＺのフラクション４（ＰＦ４）をハムスターに給餌することによりもたらされるより有益的な血漿脂質プロファイル（より低いＴＣ、より高いＨＤＬ）を説明することであった（すなわち予防的モデル）。したがって、実施例１で採用した４週間の予防的プロトコル後に回収したハムスター肝臓から採取した組織内のＨＤＬ代謝に関わる遺伝子ＡｐｏＡ１、ＡＢＣＡ１、ＳＲ−Ｂ１及びＣＥＴＰの発現レベルの評価を行った。もう一つの特定目的は、ＨｅｐＧ２及びＨＵＶＥＣ細胞系のいずれかを採用するｉｎ ｖｉｔｒｏＨＤＬ遺伝子制御についてＰＡＺ及びそのフラクションの効果を評価することであった（データは示さず）。この実施例では、５動物／群のデータを示し、１動物につき３回繰り返した。
【０１３０】
図１３は、コレステロール逆転送パスウエイ、及びアテローム性因子（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）の発病に関するＨＤＬ作用の他のサイトの主成分を示す。ＡｐｏＡ１は、初期のＨＤＬ粒子の生成に関与する。ＡＢＣＡ１は、脂質を抹消組織から初期ＨＤＬに転送して、より大きなＨＤＬ粒子を形成させる。大きいＨＤＬ粒子は肝臓上のＳＲ−Ｂ１レセプターを介して胆汁へと除去され、血漿からの除去が生起され、そしてＡｐｏ１はリサイクルされる。ＣＥＴＰは、脂質をＨＤＬから非ＨＤＬ（ＬＤＬ様）粒子へ転送する。この転送が減少することは有利である。
【０１３１】
細胞培養物、処置、ＲＮＡ単離
【０１３２】
Ｈｅｐ−Ｇ２細胞をＤＭＥＭ（＋１０％ＦＢＳ、＋５％ＰｅｎＳｔｒｅｐ、＋５％Ｌ−グルタミン）内で培養し、一方、ＨＵＶＥＣ細胞をＭｅｄｉｕｍ１９９（＋２５ｍｇ内皮性成長因子、＋５０ｍｇヘパリン、＋２０％ＦＢＳ、＋５％ＰｅｎＳｔｒｅｐ、＋５％Ｌ−グルタミン）内で培養した。３ｘ１０５細胞を６−ウエルプレートへ静置した。静置２４時間後、細胞を処理した（対照、Ｐａｚ １：１００、Ｐａｚ １−２０、Ｐａｚ １−１０、新フラクション−４（１：１００）、新フラクション−４（１：２０）、新フラクション−４（１：１０）、旧フラクション−４（１：１００）、旧フラクション−４（１：２０）、旧フラクション−４（１：１０））。細胞を１６時間処理した後、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ及び Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒを用いて、製造者により提供されるプロトコルに従って全ＲＮＡを分離した。
【０１３３】
ＲＮＡをｃＤＮＡへ
【０１３４】
Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ−ＣＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライド・バイオシステムズ社、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、製造者により提供されるプロトコルに従って、全ＲＮＡ１μｇから始めて、ＲＮＡをｃＤＮＡへ転換した。
【０１３５】
ＲＴ−ＰＣＲ
【０１３６】
４種類のプライマーをアプライド・バイオシステムズ社から取得した。
１）ホモサピエンスコレステロールエステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）：
ファワードプライマー配列 ＡＣＣＴＴＣＴＣＧＣＣＣＡＣＡＣＴＧＣＴ（配列番号：１）、
リバースプライマー配列 ＴＧＡＡＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＴＣＣＡＧＣ （配列番号：２）；
２）ホモサピエンスＡＴＰ−結合カセット、サブファミリーＡ（ＡＢＣＡ１）：
ファワードプライマー配列 ＡＡＧＡＣＣＣＴＧＧＣＴＴＣＧＧＧＡＣＣ（配列番号：３）、
リバースプライマー配列 ＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＧＡＡＣＴＧＧＧＧＣ（配列番号： ４）；
３ホモサピエンススカベンジャレセプタークラスＢ、メンバー １（ＳＲ−Ｂ１）：
ファワードプライマー配列 ＡＡＧＡＡＣＧＴＧＣＧＣＡＴＣＧＡＣＣＣ（配列番号：５）、
リバースプライマー配列 ＴＣＡＴＧＡＡＧＧＣＡＣＧＴＴＣＧＣＣＧ（配列番号：６）；
４）ＡＰＯＡ１：
ファワードプライマー配列 ＣＡＴＴＴＣＴＧＧＣＡＧＣＡＡＧＡＴＧＡ（配列番号：７）、
リバースプライマー配列 ＧＣＣＴＴＣＡＡＡＣＴＧＧＧＡＣＡＣＡＴ（配列番号：８）。
プライマーの最終濃度は、５μＭであった。リアルタイムＰＣＲを全２５μＬ反応混合物（２μＬｃＤＮＡ、１２．５μＬの２ｘＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライド・バイオシステムズ社製）、１．０μＬの各５μｍｏｌ／Ｌフォワード及びリバースプライマー、並びに１０μＬの蒸留水）で行った。ＰＣＲプログラムを、９５℃１０分間により開始した後、各サイクル９５℃３０秒間及び６０℃１分間のサーマルサイクル５０回を行った。データを、比較Ｃｔ法（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｃｔ ｍｅｔｈｏｄ）に従って解析し、各サンプル中のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ発現（インビトロジェン社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対して規格化した：
ファワードプライマー配列 ＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＣＴＧＴＧＧＡＴＧＧ（配列番号：９）、
リバースプライマー配列 ＣＡＧＴＧＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＡＧ （配列番号：１０）。
【０１３７】
ハムスター
【０１３８】
１．ＡＢＣＡ１
Ｆ：５’−ＡＴＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＡＡＣＣＣＴＧＡＣ−３’（配列番号：１１）
【０１３９】
Ｒ：５’−ＧＧＴＡＣＴＧＡＡＧＣＡＴＧＴＴＴＣＧＡＴＧＴＴ−３’（配列番号：１２）
【０１４０】
２．ＣＥＴＰ
Ｆ：Ｆ：５’−ＡＡＧＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＴＣＡＧＴＴＣＴ−−３’（配列番号：１３）
【０１４１】
Ｒ：Ｆ：５’−ＡＣＴＧＡＴＧＡＴＣＴＣＧＧＧＧＴＴＧＡＴ−−３’（配列番号：１４）
【０１４２】
３．ａｐｏＡ−Ｉ
Ｆ：５’−ＡＣＣ−ＧＴＴＣＡＧ−ＧＡＴ−ＧＡＡ−ＡＡＣ−ＴＧＴ−ＡＧ−３’（配列番号：１５）
【０１４３】
Ｒ：５’−ＧＴＧＡＣＴ−ＣＡＧ−ＧＡＧ−ＴＴＣ−ＴＧＧ−ＧＡＴ−ＡＡＣ−３’（配列番号：１６）
【０１４４】
４．ＳＲ−Ｂ１
Ｆ：５’−ＡＡＧ−ＣＣＴ−ＧＣＡ−ＧＧＴ−ＣＴＡ−ＴＧＡ−ＡＧＣ−３’（配列番号：１７）
【０１４５】
Ｒ：５’−ＡＧＡ−ＡＡＣ−ＣＴＴ−ＣＡＴ−ＴＧＧ−ＧＴＧ−ＧＧＴ−Ａ−３’（配列番号：１８）
【０１４６】
ヒト
【０１４７】
ＣＥＴＰ
Ｆ：ＡＣＣＴＴＣＴＣＧＣＣＣＡＣＡＣＴＧＣＴ（配列番号：１９）
【０１４８】
Ｒ：ＴＧＡＡＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＴＣＣＡＧＣ（配列番号：２０）
【０１４９】
配列（５’−＞３’）
【０１５０】
ＡＢＣＡ１
Ｆ：ＡＡＧＡＣＣＣＴＧＧＣＴＴＣＧＧＧＡＣＣ（配列番号：２１）
【０１５１】
Ｒ： ＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＧＡＡＣＴＧＧＧＧＣ（配列番号：２２）
【０１５２】
配列（５’−＞３’）
【０１５３】
ＳＲＢ１
Ｆ：ＡＡＧＡＡＣＧＴＧＣＧＣＡＴＣＧＡＣＣＣ（配列番号：２３）
【０１５４】
Ｒ：ＴＣＡＴＧＡＡＧＧＣＡＣＧＴＴＣＧＣＣＧ（配列番号：２４）
【０１５５】
ＡＰＯ−Ａ１
Ｆ：ＣＡＴＴＴＣＴＧＧＣＡＧＣＡＡＧＡＴＧＡ（配列番号：２５）
【０１５６】
Ｒ：ＧＣＣＴＴＣＡＡＡＣＴＧＧＧＡＣＡＣＡＴ（配列番号：２６）
【０１５７】
実施例４
【０１５８】
高脂肪食を給餌したハムスター（予防的モデル）へ完全ＰＡＺ（ＰＰ）及びＰＡＺのフラクション４（ＰＦ４）を投与することにより達成されるより有益な血漿脂質プロファイル（より低いＴＣ、ＨＤＬはより高い）の原因である機序を探求するために、別法のアプローチを採用した。ＨＤＬ代謝に関わる特定遺伝子、すなわち、ＡｐｏＡ１、ＡＢＣＡ１、ＳＲ−Ｂ１、及びＣＥＴＰの転写の相対レベルを評価するのに、定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用した。この実施例では、５動物／群のデータを示し、１動物につき３回繰り返した。
【０１５９】
図１９は、高脂肪食＋完全ＰＡＺ（ＰＰ）又はフラクション４（ＰＦ４）又は水（ＰＷ）を給餌した動物における特定遺伝子の相対的転写レベルを、定常（低脂肪）飼料及び水（ＣＷ）の対照群と対比したグラフである。高脂肪食及び水を給餌した動物はＣＥＴＰ発現の増大を示したが、これは、ＣＷ及びＰＰ／ＰＦ４群と比べて血漿ＬＤＬ及びＴＣが高いことを説明している。それらは、また、ＡｐｏＡ１発現の減少を示したが、これは、ＨＤＬＣの産生減少と互いに関係がある。それらは、また、ＳＲ−Ｂ１発現の減少を示したが、これは、コレステロール逆転送パスウエイを介したコレステロール除去の抑制と互いに関係がある。
【０１６０】
図２０は、高脂肪食＋完全ＰＡＺ（ＰＰ）又はフラクション４（ＰＦ４）又は水（ＰＷ）を給餌した動物における特定遺伝子の相対的転写レベルを、高脂肪食及び水（ＰＷ）の対照群と対比したグラフである。ＰＰ及びＰＦ４の場合のＡＢＣＡ１及びＣＥＴＰ発現レベルは同様であった。ＰＰでのＡｐｏＡ１発現は、ＰＦ４と比較してより高められたが、これは、初期ＨＤＬ粒子のより大量の生成と互いに関係がある。これは、ウエスタンブロット、及びＨＤＬ粒子径／密度によって同定することができる。ＳＲ−Ｂ１発現レベルは、ＰＦ４群でより高いが、これは、除去（ｃｌｅａｒａｎｃｅ）の増大と互いに関係がある。これは、ＴＣの有意な減少と互いに関係がある。
【０１６１】
要約すると、ハムスター肝臓サンプルからのｍＲＮＡを使用する遺伝子制御のｑＰＣＲ分析は、実施例１の研究で特記した脂質血漿プロファイルの変化を実証し、そしてＰＡＺ又はその成分の作用機序として、リポタンパク質代謝のキータンパク質をエンコードする遺伝子の発現を制御していることを支持する。
【０１６２】
実施例５
【０１６３】
たびたび究極のｉｎ ｖｉｖｏ効果（正及び負の両方）を予測するのに失敗する、現代の医薬開発に代表的に採用される高スループットスクリーニング法と対照的に、ＰＡＺの活性成分は、ｉｎ ｖｉｖｏ活性のための厳格な評価（ａｃｉｄ ｔｅｓｔ）を提供するものの、ＰＡＺの活性成分の分別は、長期のｉｎ ｖｉｖｏ法の主な用途によって著しく妨害されている。しかし、ＣＥＴＰ遺伝子発現をモニターするためにＨＥＰＧ２細胞を採用するｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイがスクリーニングの代替エンドポイント（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｅｎｄｐｏｉｎｔ）を提供するかもしれないことを示す初期結果を考慮して、培養ＨＥＰＧ２細胞でのＣＥＴＰ発現に関するＰＡＺの効果をさらに試験した。
【０１６４】
図２１は、ＰＡＺのさまざまな製造ロットが、ＨＥＰＧ２細胞でのＣＥＴＰ発現の減少に潜在的活性を有することを示す。
【０１６５】
図２２は、用量-反応研究結果を示し、ここで、培養培地中のＰＡＺの希釈物を増大させると、ＣＥＴＰ発現の抑制の増大と互いに関係があった。これらのデータは、（ａ）ＰＡＺはきわめて効能があり、有益な効果を達成するために低用量しか必要とされない、及び／又は、ある一定のレベルでＰＡＺの有益な効果を減じるＰＡＺの他の成分が存在し得ることを示す。
【０１６６】
実施例６
【０１６７】
コレステロール及びＨＤＬレベル並びにリポタンパク質代謝に関わる一定のキー遺伝子の発現レベルの有意で有益な変化を、ｉｎ ｖｉｖｏ予防的モデル系で観察された。しかし、高コレステロール血症を持った個体を処置するために新規な薬剤の需要を考慮し、治療学的モデルでのコレステロール及びリポタンパク質プロファイルを改善するために、ＰＡＺ及びＰＡＺに由来するフラクションの能力を評価することが重要であった。治療学的ハムスター実験モデルを採用し、ここで、動物（各群８動物）に、最初の２８日間、高脂肪食を投与して、次いで、屠殺までの追加の２１日間、高脂肪食＋ＰＡＺ又はＰＡＺに由来するフラクションを同時投与した。得られた結果を図２３−２５に示す。
【０１６８】
図２３は、このプロトコルで処置したハムスターの血漿の総コレステロール（ＴＣ）、ＨＤＬ、及びトリグリセリド類に関するＰＡＺ及びＰＡＺからのフラクション３の効果を表す。
【０１６９】
図２４は、ＰＡＺのフラクション３でハムスターを治療学的に処置することによって及ぼされるコレステロール対ＨＤＬの比率の減少を示す。
【０１７０】
図２５は、高コレステロール血症にためにＰＡＺの治療学的処置にかけられた動物の肝臓においてＡｐｏＡ１をエンコードする遺伝子の発現の有意な上昇を示す。
【０１７１】
実施例７
【０１７２】
ＰＡＺ及びＰＡＺに由来するフラクションの長期経口投与は、予防的及び治療学的モデル系の両方で有効であり、リポタンパク質代謝に関与する遺伝子の発現の有意で有益な変化が観察され、遺伝子発現を直接調節する薬剤がそのような変化を比較的迅速（リポタンパク質代謝のターンオーバー及びその結果のリポタンパク質プロファイルの変化は実質的に長く要求されるかもしれないが）に引き起こしそうであることを考慮し、動物を２８日間、高脂肪食で前処置し、次いでＰＦ３、ＰＦ４（その成分を濃縮するために様々な処理をするか、しない）を屠殺とｍＲＮＡ抽出及びｑＰＣＲ前の７日間（３動物／群）投与する短期治療学的モデルで、ＡＰＯＡ１及びＣＥＴＰ遺伝子の発現を変更するＰＡＺフラクションの能力を評価した。
【０１７３】
図２６は、これらの結果を表す。意外にも、ＰＦ４もそれらの誘導体も、ＡｐｏＡ１発現の有意な強化を作らなかった。しかし、ＰＦ３フラクションは、長期治療学的及び予防的研究で得られた結果と矛盾せずに、短期治療学的実験モデルでＡｐｏＡ１の発現を有意に強化し、これは、この遺伝子を直接活性化するＰＦ３中の成分の可能性を示唆している。これらのデータは、ＰＦ３について遺伝子発現の有益な変化が観察されたことを示すものの、ＰＦ４の短期治療学的研究については遺伝子発現の有益な変化が観察されなかった。しかし、長期治療学的及び予防的研究で得られた遺伝子発現の再現性のある有益な変化を考慮に入れると、これらのデータは、ＰＦ４成分中のＰＡＺ成分による遺伝子制御についてのより複合的、たぶん間接的な機序を支持する。
【０１７４】
実施例８
【０１７５】
治療学的状態（すなわち、ＰＦ４投与前に高コレステロール血症を誘発させた動物モデルを採用する）のｉｎ ｖｉｖｏコレステロール及びリポタンパク質代謝に関するＰＡＺに由来するＰＦ４フラクションの効果を評価するために時間研究を行った。図２７は、血漿脂質分析及び肝臓ｍＲＮＡ発現を含む研究デザインを示す。ＰＦ４は、実施例１に記載されたクラマトグラフィ法を用いてＰＡＺから導出したフラクション４である。得られた結果を図２７−３２に表す。異なる時点で、図２８は血漿総コレステロールを示し、図２９は血漿ＨＤＬ−ｃを示し、そして図３０は血漿トリグリセリドを示す。図３１は、異なる時点でＰＦ４で処置した血漿脂質パラメータ（ＴＣ、ＨＤＬ、ＴＧ）の変化を示し、図３２は、異なる時点のＡｐｏＡ１及びＣＥＴＰの遺伝子制御を示す。
【０１７６】
図３３は、ｉｎ ｖｉｖｏ実験モデルでのリポタンパク質代謝パラメータの多様研究におけるＰＡＺのフラクションＰＦ４の得られた結果の対比である。この時間研究は、治療学的アプローチ（４週間のＨＦ飼料に続いてＰＦ４での処理）を使用した。ここで、２１日目のＰＦ４（ロット３）は、２８日間予防的アプローチ（４週間の同時のＨＦ及びＰＦ４治療介入）後のＰＦ４（ロット１）と極めて類似した脂質プロファイルを示す。治療学的時間研究（ＰＦ４／ロット３）では、ＡｐｏＡ１及びＣＥＴＰ発現の両方とも、２１日目に増大した。ＰＦ４／ロットを使用する実施例４（図２０参照）ではＡｐｏＡ１が増大し、一方、ＣＥＴＰが減少した。これらの研究の中に観察されたＣＥＴＰ発現の相違は、治療学的モデル系で効果を妨害する薬剤がなくても長期ＨＦ給餌の影響を反映していることがあり得る。
【０１７７】
本願を通して、米国特許を含むさまざまな刊行物が著者及び年並びに特許番号により参照される。刊行物の全引用を以下にリストする。本願が関係する従来技術の状態をより充分に説明するために、これらの刊行物及び特許の開示の全体が本願に編入される。
【０１７８】
本発明は、例証の方式で記載されており、使用される用語は、限定するよりも単語の説明を意図するのが道理であると理解される。
【０１７９】
自明なことに、上記の観点から本発明の多くの改変及び変更が可能である。したがって、添付の特許請求の範囲内で、特に説明したのと別の方法で実施できると理解される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、藻類からの抽出物に関する。本発明は、特に藻類からのコレステロール低減抽出物、及び哺乳類のＨＤＬ／ＬＤＬプロファイルを有利に変える能力を有する抽出物に関する。
【背景技術】
【０００２】
コレステロールは、肝臓で作られる蝋様で脂肪様の物質であり、酪農製品、卵や肉のような動物性食品等の一定の食品中に見つかる。生体は、細胞膜を適切に機能させるためにある程度のコレステロールを必要とし、エスストロゲン等のホルモンビタミンＤや、脂肪を消化して一定の老廃物を排泄するのを助ける胆汁酸を製造するために、コレステロールを必要とする。しかし、過剰な食事摂取量、過剰生産や過剰量の除去能力の減少のいずれであれ、あまりに多くのコレステロールが存在すると、心臓疾患等の健康問題が現れ得る。
【０００３】
過剰量のコレステロールに存在すると、プラーク（厚く硬い沈着物）が体内動脈中に形成され、血液が心臓、脳及びその他の組織を流れるための空間を狭窄する。時間が経つと、この蓄積は、アテローム性硬化症（動脈の硬化）の原因となり、これは、心循環系疾患を引き起こす。酸素を運搬する血液が十分に心臓に達しないと、胸痛（例えば狭心症）となる。もし冠動脈の完全な閉塞により心臓部への血液供給が完全に遮断されると、これらは心臓細胞の障害と死を生じ、通常、心臓麻痺と呼ばれる事象が生じる。これは、通常、先の狭窄上に形成する血餅からくる突発的な閉塞による。
【０００４】
リポタンパク質代謝は、アテローム班の蓄積であるアテローム形成の中核を演じる。リポタンパク質代謝は、脂質（特にコレステロール及びトリグリセリド類）の運搬やそれらの血液中で異なるリポタンパク質クラス間交換とともに、そのまわりに脂質が集まってリポタンパク質を形成するコアタンパク質（アポリポタンパク質と呼ばれる）のファミリーであるリポタンパク質レセプターが関与する複合的かつ互いに連動した一群のプロセスである。腸が食事脂肪を吸収し、それを乳状脂粒（大きなトリグリセリドリッチなリポタンパク質）の中に詰め、この乳状脂粒は血液を通って抹消組織へ運搬される。筋肉及び脂肪組織では、リポタンパク質リパーゼ酵素が乳状脂粒を破壊し、そして脂肪酸がこれらの組織中へ入る。乳状脂粒の残渣は、続いて肝臓により吸収される。肝臓は、脂質をＡｐｏＢへ積み込み、そして極めて低密度のリポタンパク質（ＶＬＤＬ）を分泌する。ＶＬＤＬは、リポタンパク質リパーゼによる脂肪分解を受け、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を形成する。次いで、ＬＤＬは、ＬＤＬレセプター（ＬＤＬＲ）への結合や他のパスウエイを介して肝臓へ取り込まれる。対照的に、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は、腸及び肝臓により脂質フリーＡｐｏＡ１の分泌を介して生成される。ＡｐｏＡ１は、その後、初期ＨＤＬを形成するトランスポーターＡＢＣＡ１の作用を介してこれらの器官からコレステロールを募り、そしてこれがＡｐｏＡ１を腎臓で迅速に分解されることから保護する。抹消組織では、初期ＨＤＬが、ＡＢＣＡ１の作用を介して、マクロファージを含む組織からのコレステロール流出を促進する。成熟ＨＤＬは、また、この流出を促進するが、それはＡＢＣＧ１の作用を介してである。（マクロファージでは、核内レセプターＬＸＲが、ＡＢＣＡ１及びＡＢＣＧ１の両方の産生を上方制御する。）初期ＨＤＬ内の遊離コレステロール（エステル化されない）は、成熟ＨＤＬを作るレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ酵素（ＬＣＡＴ）によりコレステリルエステルへエステル化される。ＨＤＬ中のコレステロールは、ＳＲ−ＢＩレセプターによる取り込みを介して直接的に、そしてコレステロールエステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）を介したＬＤＬ及びＶＬＤＬへの転換により非直接的に、肝臓へ戻される。ＨＤＬの脂質含量は、肝性リパーゼ及び内皮性リパーゼの酵素により、並びにＣＥＴＰ転移タンパク質及びＨＤＬ異化に影響するリン脂質転移タンパク質（ＰＬＴＰ）により、変更される。
【０００５】
ＬＤＬは、動脈壁上へのプラークの蓄積を誘発し、それらの大量の存在は心臓疾患のリスクの指標となる。対照的に、ＨＤＬは、体がＬＤＬを除去するのを助け、したがって心臓疾患を減じる。また、低レベルのＨＤＬは、ＬＤＬを除去する本来の機序が減じるにしたがい、体を循環器系疾患のリスクにさらす。存在するＬＤＬ及びＨＤＬの量にさまざまな因子が影響を与え、例えば食事、体重、運動、年齢、性別、糖尿病、遺伝及びその他の健康状態である。
【０００６】
スタチン類は、高コレステロールの個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）を処置するために最も普通に使用される。スタチン類は、ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ）酵素のインヒビターである。スタチン類は、ＨＭＧＣｏレダクターゼの抑制を介してコレステロール合成を減じ、そしてステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）を活性化する。ＳＲＥＢＰは、ステロール応答因子（ＳＲＥ）と結合する。これは、肝細胞性膜内のＬＤＬ−レセプターの発現増大とＬＤＬ分子の細胞内取込増大をもたらすＬＤＬ−Ｒ遺伝子の転写を上方制御する。スタチン類の使用には、ミオパシー、横紋筋融解−炎症増大、筋肉破壊及び腎負荷を含むいくつかの副作用が報告されている。いくつかのスタチン類、例えばリピトール及びクレストールは、ＣＥＴＰの機能を抑制するという付加的な有益な効果もまた示すようである。
【０００７】
高コレステロールと戦うための他のいくつかの処置、特に栄養補助食品が開発されている。ω−３脂肪酸は効果的であるが、豊富かつ環境に優しい源を欠く。レスベラトロールは、植物により天然に生産されるきわめて一般的な処置である。アサイベリーもまた使用されるが、今、副作用が明らかになりつつある。コケモモ及び他の抽出物は、臨床研究で試験されている。クルクミン及びイソフラボノイド類もまた人気を獲得しつつある。これらのサプリメントのそれぞれの優先事項は、心血管リスク因子、コレステロール制御、精神機能及び体重減を改善することである。
【０００８】
副作用を招くことなく、循環するコレステロールレベルを安全かつ効果的に減じ、そしてＨＤＬ／ＬＤＬ比率を管理するための処置に対する需要が、依然として存在する。さらに、コレステロール及び／又はリポタンパク質代謝を遺伝子レベルで制御するような、有害な副作用の少ない及び／又は異なる機序による機能を有する、現在のスタチン類療法の代替需要が存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、有効量の微生物発酵生成物を投与し、そしてリポタンパク質代謝に関わる遺伝子を制御することによる患者の高コレステロール血症を処置する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ＰＡＺ、ＰＡＺから単離された特異的成分、及びＰＡＺ成分の化学合成類似体からなる群から選ばれる有効量の組成物を投与し、そしてリポタンパク質代謝に関わる遺伝子の発現を制御することによる患者のコレステロールレベルを制御する方法を提供する。
【００１１】
本発明は、また、有効量の微生物発酵生成物を投与し、ＡＢＣＡ１、ＡｐｏＡ１及びＳＲ−Ｂ１をエンコードする少なくとも一種の遺伝子の発現を上方制御し、そしてＣＥＴＰをエンコードする遺伝子を下方制御することによる患者の高コレステロールを処置する方法を提供する。
【００１２】
本発明は、さらに、ＰＡＺ、ＰＡＺから単離された特異的成分、及びＰＡＺ成分の化学合成類似体からなる群から選ばれる有効量の組成物を投与し、リポタンパク質代謝に関わる遺伝子を制御し、そして高コレステロール発症を防止することによる高コレステロールの発症を防止する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
本発明の他の利点は、以下の詳細な説明を参照し、添付図面を関連させて検討されるときに、より良好に理解される。
【００１４】
【図１】図１は、ハムスターｉｎ ｖｉｖｏ予防的実験モデルで行った動物試験の概要を示すフローチャートである。ここで、高脂肪食を用いて高コレステロールレベルを作り、コレステロール代謝を変更する能力について、ＰＡＺ及びＰＡＺに由来し異なる化学特性に基づくフラクションの効果を評価した。
【００１５】
【図２】図２は、水を与えたハムスター、及びＰＡＺ、又はＰＡから単離したフラクションを含有する水を与えたハムスターに対する高脂肪食の平均食事摂取量（ｇ）のグラフである（図１の凡例参照）。
【００１６】
【図３】図３は、水を与えたハムスター、及びＰＡＺ又はＰＡＺから単離したフラクションを含有する水を与えたハムスターに対する試験中（週）の平均体重（ｇ）のグラフである（図１の凡例参照）。
【００１７】
【図４】図４は、水を与えたハムスター、及びＰＡＺ又はＰＡＺから単離したフラクションを含有する水を与えたハムスターに対する試験中（週）の平均水分摂取量（ｍＬ）のグラフである（図１の凡例参照）。
【００１８】
【図５】図５は、高脂肪食を給餌したハムスターの総コレステロールレベル（ｍｇ／ｄＬ）について、ＰＡＺ及びＰＡＺから単離したフラクションの効果を添加物無しの水と比較したグラフである。
【００１９】
【図６】図６は、高脂肪食を給餌したハムスターのＨＤＬ−コレステロールレベル（ｍｇ／ｄＬ）について、ＰＡＺ及びＰＡＺから単離したフラクションの効果を添加物無しの水と比較したグラフである。
【００２０】
【図７】図７は、高脂肪食を給餌したハムスターの総コレステロールレベルとＨＤＬ−コレステロールレベルとの比率について、ＰＡＺ及びＰＡＺから単離したフラクションの効果を添加物無しの水と比較したグラフである。
【００２１】
【図８】図８は、高脂肪食を給餌したハムスターの非ＨＤＬ（ＬＤＬ）−コレステロールレベル（ｍｇ／ｄＬ）について、ＰＡＺ及びＰＡＺから単離したフラクションの効果を添加物無しの水と比較したグラフである。
【００２２】
【図９】図９は、高脂肪食を給餌したハムスターの血漿トリグリセリドレベル（ｍｇ／ｄＬ）について、ＰＡＺ及びＰＡＺから単離したフラクションの効果を添加物無しの水と比較したグラフである。
【００２３】
【図１０】図１０は、高脂肪食を給餌したハムスターのリポタンパク質プロファイルについて、ＰＡＺ及びＰＡＺから単離したフラクションの効果を添加物無しの水と比較したグラフである。
【００２４】
【図１１】図１１は、高脂肪食＋ＰＡＺ及びＰＡＺから単離したフラクションを給餌したハムスターのリポタンパク質組成のシフトを、高脂肪食＋添加物無しの水を給餌したハムスターと比較した図示である。
【００２５】
【図１２】図１２は、高脂肪食＋ＰＦ３フラクションを給餌したハムスターのリポタンパク質組成のシフトを、高脂肪食＋添加物無しの水を給餌したハムスターと比較した図示である。
【００２６】
【図１３】図１３は、水又は無希釈ＰＦ４を添加した血清のＣＥＴＰ活性アッセイについて得られた結果の図示である。
【００２７】
【図１４】図１４は、水又は無希釈ＰＦ４を添加した血清のＰＬＴＰ活性アッセイについて得られた結果の図示である。
【００２８】
【図１５】図１５は、水又はＰＦ３（１：１０希釈）を添加した血清のＣＥＴＰ活性アッセイについて得られた結果の図示である。
【００２９】
【図１６】図１６は、水又はＰＦ３（１：１０希釈）を添加した血清のＰＬＴＰ活性アッセイについて得られた結果の図示である。
【００３０】
【図１７】図１７は、ＨＭＧＣｏＡレダクターゼ活性について、スタチン類（プレバスタチン類）対ＰＡＺに由来するＰＦ４フラクションの効果を比較する動力学アッセイの図示である。
【００３１】
【図１８】図１８は、コレステロール転送におけるさまざまなタンパク質及びリポタンパク質の役割の描写である。
【００３２】
【図１９】図１９は、定常（低脂肪）食＋水（ＣＷ）の対照群と比べた、高脂肪食＋完全（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）ＰＡＺ（ＰＰ）、高脂肪食＋一連のクロマトグラフィ工程でＰＡＺから単離した一フラクション（ＰＦ４として照合）、又は高脂肪食＋水（ＰＷ）を給餌したハムスター（４週予防的モデル）の肝臓中のコレステロール及びＨＤＬ代謝の制御に関わるキータンパク質をエンコードする遺伝子の発現の相対的レベルを測定するための定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）実験から得られた結果の図示である。
【００３３】
【図２０】図２０は、高脂肪食＋添加物無しの水（ＰＷ）を維持した対照群と比べた、高脂肪食＋完全ＰＡＺ（ＰＰ）又はＰＦ４フラクションのいずれかを給餌したハムスター（４週予防的モデル）の肝臓中のコレステロール及びＨＤＬ代謝の制御に関わるキータンパク質をエンコードする遺伝子の発現の相対的レベルを測定するための定量的リアルタイムＰＣＲ実験から得られた結果の別の図示である。
【００３４】
【図２１】図２１は、添加物無しで培養した対照細胞と比較した、二種類の異なるロットの完全ＰＡＺの少量を含有する培地中で培養したヒトＨＥＰＧ２細胞中のＣＥＴＰをエンコードする遺伝子の発現の相対レベルを測定するための定量的リアルタイムＰＣＲ実験で得られた結果の図示である。
【００３５】
【図２２】図２２は、添加物無しで培養した対照細胞と比較した、完全ＰＡＺのさまざまな希釈物を含有する培地中で培養したヒトＨＥＰＧ２細胞中のＣＥＴＰをエンコードする遺伝子の発現の相対レベルを測定するための定量的リアルタイムＰＣＲ実験で得られた結果の図示である。
【００３６】
【図２３】図２３は、ハムスターｉｎ ｖｉｖｏ治療学的実験モデルの総コレステロールレベル（ｍｇ／ｄＬ）、ＨＤＬ−コレステロールレベル（ｍｇ／ｄＬ）及びトリグリセリドレベル（ＴＧ）（ｍｇ／ｄＬ）について、ＰＡＺ及びＰＡＺに由来するＰＦ３フラクションの効果を、添加物無しの水と比較したグラフである。ここで、ハムスターは、最初に、高脂肪食を４週間給餌して高コレステロール血症を誘発させ、次いで、追加の２１日間、高脂肪食＋完全ＰＡＺ（１群１、Ｇ１）又はＰＡＺに由来するＰＦ３フラクション（２群、Ｇ２）で処置した。
【００３７】
【図２４】図２４は、ハムスターｉｎ ｖｉｖｏ治療学的実験モデルの血漿コレステロール対ＨＤＬコレステロールレベルの比率について、ＰＡＺ及びＰＡＺに由来するＰＦ３フラクションの効果を、添加物無しの水と比較したグラフである。ここで、ハムスターは、ハムスターは、最初に、高脂肪食を４週間給餌して高コレステロール血症を誘発させ、次いで、追加の２１日間、高脂肪食＋完全ＰＡＺ（１群１、Ｇ１）又はＰＡＺに由来するＰＦ３フラクション（２群、Ｇ２）で処置した。
【００３８】
【図２５】図２５は、ハムスターｉｎ ｖｉｖｏ治療学的実験モデルの肝臓中のＡＰＯＡ１及びＣＥＴＰタンパク質をエンコードする遺伝子の発現（ｑＰＣＲを用いる）について、ＰＡＺ及びＰＡＺに由来するＰＦ３フラクションの効果を、添加物無しの水と比較したグラフである。ここで、ハムスターは、最初に、高脂肪食を４週間給餌して高コレステロール血症を誘発させ、次いで、追加の２１日間、高脂肪食＋完全ＰＡＺ（１群）、ＰＡＺに由来するＰＦ３（２群）又は添加物無しの水（Ｗ、対照）のいずれかで処置した。
【００３９】
【図２６】図２６は、ハムスターｉｎ ｖｉｖｏ治療学的実験モデルの肝臓中のＡＰＯＡ１及びＣＥＴＰタンパク質をエンコードする遺伝子の発現（ｑＰＣＲを用いる）について、ＰＡＺフラクション（ＰＦ３、ＰＦ４）、ＰＦ４とその後のさまざま処理の効果を、添加物無しの水と比較したグラフである。ここで、ハムスターは、最初に、高脂肪食を４週間給餌して高コレステロール血症を誘発させ、次いで、追加の７日間、高脂肪食＋特定のＰＦ３、ＰＦ４フラクション、ＰＦ４フラクションとそれに続く特定の処置、又は添加物無しの水のいずれかで処置した。
【００４０】
【図２７】図２７は、ｉｎ ｖｉｖｏ治療学的実験モデルのハムスターで行った動物試験の概略を示すフローチャートであり、ここで、高コレステロールレベルを作るのに高脂肪食を使用し、そしてコレステロール代謝を変更する能力についてＰＡＺのＰＦ４フラクションの効果を評価した。
【００４１】
【図２８】図２８は、高コレステロール血症を誘発するために高脂肪食を４週間給餌し、そして追加の２１日間、高脂肪食＋ＰＡＺのＰＦ４フラクション又は添加物無しの水（対照）のいずれかで処置したハムスターのさまざまな時点の血漿総コレステロールレベル（ｍｇ／ｄＬ）に関するＰＡＺのＰＦ４フラクションの効果を添加物無しの水と比較したグラフである。
【００４２】
【図２９】図２９は、高コレステロール血症を誘発するために高脂肪食を４週間給餌し、そして追加の２１日間、高脂肪食＋ＰＡＺのＰＦ４フラクション又は添加物無しの水（対照）のいずれかで処置したハムスターのさまざまな時点の血漿ＨＤＬｃレベル（ｍｇ／ｄＬ）に関するＰＡＺのＰＦ４フラクションの効果のグラフである。
【００４３】
【図３０】図３０は、高コレステロール血症を誘発するために高脂肪食を４週間給餌し、そして追加の２１日間、高脂肪食＋ＰＡＺのＰＦ４フラクション又は添加物無しの水（対照）のいずれかで処置したハムスターのさまざまな時点の血漿トリグリセリドレベル（ｍｇ／ｄＬ）に関するＰＡＺのＰＦ４フラクションの効果のグラフである。
【００４４】
【図３１】図３１は、高コレステロール血症を誘発するために高脂肪食を４週間給餌し、そして追加の２１日間、高脂肪食＋ＰＡＺのＰＦ４フラクション又は添加物無しの水（対照）のいずれかで処置したハムスターのさまざまな時点のさまざまな血漿脂質パラメータ（ＴＣ、総コレステロール；ＨＤＬ；ＴＧ、トリグリセリド類；非ＨＤＬ）の変化を比較するグラフである。
【００４５】
【図３２】図３２は、ハムスターｉｎ ｖｉｖｏ治療学的実験モデルの肝臓中のＡＰＯＡ１及びＣＥＴＰタンパク質をエンコードする遺伝子の発現（ｑＰＣＲを用いる）について、ＰＡＺのＰＦ４フラクションの効果を、添加物無しの水と比較したグラフである。ここで、ハムスターは、最初に、高脂肪食を４週間給餌して高コレステロール血症を誘発させ、次いで、追加の２１日間、高脂肪食＋ＰＡＺのＰＦ４フラクション又は添加物無しの水（対照）のいずれかで処置した。ハムスター群を２１日間の処置期間中のさまざまな時点（３日目、７日目、１０日目、１４日目及び２１日目）に評価した。
【００４６】
【図３３】図３３は、ＰＡＺのＰＦ４フラクションのさまざまな血漿脂質パラメータに関する効果についてのさまざまな研究の結果を要約する表である。ＰＦ４ロット１／３０及びＰＦ４ｎロット３／３０は、ハムスターに、高脂肪食＋ＰＡＺロットの異なるＰＦ４フラクションを給餌した（代表的な水の対照の結果は、カラムＰＷ１に見られる）予防的実験モデルで得られた結果を表す。Ｔ２１／ＰＦ４ロット３は、ハムスターに、高脂肪食を４週間給餌して高コレステロール血症を誘発させ、次いで、追加の２１日間、高脂肪食＋ＰＡＺのＰＦ４フラクション又は添加物無しの水（ＰＷ２）のいずれかで処置した治療学的実験モデルから得られた結果を表す。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明は、一般に、コレステロールレベルが高いかあるいは異常、すなわち高コレステロール血症を有する個体（すなわち、ヒトの患者又は動物）を、複合的微生物発酵生成物の使用を介して処置する方法を提供する。本発明は、より特定的には、複合的微生物発酵生成物の一定の成分が、コレステロール代謝パスウエイに影響を及ぼし、そしてリポタンパク質代謝に関わる遺伝子を制御することによる作用機序を提供する。
【００４８】
「ＰｒｏＡｌｇａＺｙｍｅ（商標）」（ＰＡＺともいう）は、栄養補助食品として３０年間にわたって使用された淡水性藻類生態系の新規な発酵生成物である。ＰＡＺは、最初は、１９８０年代の米国において伝説上の若返りの泉と関連してポンセ・デ・レオン・メディカル・ディベロップメント社（Ｐｏｎｃｅ ｄｅ Ｌｅｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｐ．）によりレーベンスツァイト（Ｌｅｂｅｎｓｚｅｉｔ、商標、ドイツ語で「生涯」を意味する）という名で販売された。製品は、２００３年にはＰｒｏＡｌｇａＺｙｍｅ（登録商標、ＰＡＺ）として今日知られるものとなっている。浸出液（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）は、３０年以上前に自然発生源の中に発見された淡水生物の独自開発ブレンドの水性発酵生成物であり、以来、管理された条件下で培養されてきた。本発明のＰｒｏＡｌｇａＺｙｍｅ水性抽出物又はＰＡＺを生じる培養物の寄託物が、バージニア州、マナッサスのアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託＃ＰＴＡ−５８６３として置かれている。ＰｒｏＡｌｇａＺｙｍｅ経口液体栄養補助食品（る発酵プロセス消耗型ろ液（ｃｏｎｓｕｍａｂｌｅ ｆｉｌｔｒａｔｅ））は、典型的には、約９０％の塩（検出限界＜０．１ｐｐｍにて重金属フリー）及び有機成分の特異なブレンドからなる１００ｐｐｍ以下の全溶解固形物（ｔｏｔａｌ ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｓｏｌｉｄｓ）を有する。ＰＡＺは、また、以前、植物浸出物（ｐｈｙｔｏ−ｐｅｒｃｏｌａｔｅ）と呼ばれていた。
【００４９】
ＰＡＺ成分は、以下に記載されるＰｒｏＡｌｇａＺｙｍｅ藻類発酵培地から単離することができ、あるいは、従来知られるすべての適当な方法によって製造することができる。ＰＡＺ及び誘導体を製造する適当な方法は、例えば微生物を用いて組換え又は天然にタンパク質を発現する、誘導体を合成的に製造する（すなわち、化学的（無細胞）合成）、あるいは、ＡＴＣＣ寄託＃ＰＴＡ−５８６３内に存在する培養培地又は一種以上の種の細胞内容物から誘導体又は活性化合物を抽出することが挙げられる。微生物を使用してＰＡＺ又はその誘導体を製造する場合、すべての適当な天然に発生する又は組換えの微生物を使用可能である。ＰＡＺ又はその誘導体は、ＡＴＣＣ寄託＃ＰＴＡ−５８６３内に存在する天然発生種又はその組換えバリアントを用いて製造される。
【００５０】
発明性を有するＰＡＺを作る方法もまた開示する。ＰＡＺは、まず、ＡＴＣＣ寄託＃ＰＴＡ−５８６３内に見られる水性生物の混合物を培養することにより調製され、混合物は強化された藻類及び細菌培養液を形成する特別な栄養素ブレンドによって増大する。この強化培養物に添加されるものは、逆浸透、蒸留、脱イオン化又は他の手段で精製された精製淡水である。培養物を前記精製淡水及び栄養素ブレンドとともに、本質的に生物学的活性な抽出物を形成する所定の時間、インキュベートされる。強化された藻類及び細菌培養液から抽出物をデカンテーションし、次いで処理する。適当な抽出物処理方法には、ろ過、遠心分離、凍結乾燥、透析、精製、エバポレーション、濃縮、蒸留、処方（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）及び他の方法が挙げられる。デカンテーションされた抽出物の特別な一処理方法は、約０．２２μｍより大きい粒子を除去する精密ろ過である。
【００５１】
本明細書に編入される米国特許出願第１１／５８７，２６６では、ＰＡＺ源となる培養物を、ＡＴＣＣ寄託＃ＰＴＡ−５８６３中に見られる濃厚な藻類、苔、真菌及び細菌の細胞の約１００〜２００ｍＬ又は約０．１〜約５００ｇ以上（生体重）を約２．５ガロン（約１０L）の脱イオン化ろ過水に入れたものでできている。この方法では、培養物は、蛍光灯又は全光束灯（ｆｕｌｌ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｌｉｇｈｔｓ）の下で１２：１２時間光／暗サイクル、約１５〜３７℃の間、特に２５℃で育成される。培養物は、約２．５ガロン（約１０L）の容積を有し、大気とのガス交換を可能にする半透明蓋の付いた透明ドラム形金魚鉢型容器内で育成される。培養物には活性生酵母（ａｃｔｉｖｅ ｌｉｖｅ ｙｅａｓｔ）、又は３７℃〜約４３℃の無菌脱イオン化温水５０ｍＬに添加された１．０ｇの乾燥活性酵母から調製されているパン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が与えられた。酵母混合物を攪拌し、室温で１０〜３０分間、あるいは若干泡立つまでインキュベートさせる。以下に定義するように、培養物が充満され、収穫される回数の間に、１回以上、約１ｍＬの調製酵母混合物が各培養物に与えられる。他の酵母培養物及び方法を使用できることは、本発明の範囲内であると考えられる。さらに、従来技術で知られている他の培養条件、材料及び方法は、ＰＡＺ、その成分、活性化合物、及び誘導体の製造を支持するならば、使用可能と考えられ、それらは、多種培養物又は単一培養物、バッチ、半連続式、連続式又は他の培養系、バイオリアクター、光リアクター又は他の発酵技術、あるいは、他の適当なソース、支持体やキャリアーを含む。
【００５２】
培養液又はＰＡＺは、定期的に各培養物から上部を流し出すことにより回収することができる。このプロセスを「収穫」と呼び、得られる液体を「ＰＡＺ」、「ＰｒｏＡｌｇａＺｙｍｅ」又は「水性抽出物」と呼び、そしてそれをさらに処理にかけることができる。ここで、ＰＡＺが各培養物からデカンテーションされる間に実質的に乱されない培養容器底部に、培養物を形成する大部分の藻類細胞が残る。収穫するために、及び収穫後のデカンテーションされたＰＡＺをろ過又はさらなる処理の前後にバッチ化するために、従来技術で知られるさまざまな材料及び方法を使用可能である。収穫後、ＰＡＺはろ過され、望むままに消費される。生理活性を有すること及び消費が安全であることがわかっている。育成容器の液容は、室温（約２５℃）の逆浸透精製又は脱イオン化ろ過水を用いて元の容積へ戻すことができる。収穫、処理、精製や化合物単離の他の方法やシステムを、ＰＡＺ及びその誘導体の製造のために使用可能であると考えられ、適切なら、処理しないことを含む。さらに、ＰＡＺは、瓶詰め、濃縮、希釈、乾燥、あるいは他の材料（例えば別の方法で処理し、別の方法を採用する）とともに処方することができると考えられる。
【００５３】
ＰＡＺから単離した個々の活性化合物及びそれらの合成等価物であって、本明細書に記載された他の疾患を処置する機能のほかに、患者のコレステロールレベルを下げるのに有効であるものを、単独で使用でき、あるいはそれらを組み合わせてもよい。好ましくは、ＰＡＺから単離され、及びＰＡＺで特徴づけられる一種以上の物質であって、化学合成され及び不活性成分の不在の下で投与されるものに処置を限定することができる。
【００５４】
本明細書で使用する「治療学的有効量」は、疾患状態又は健康状態（ｍｅｄｉｃａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）の徴候を、好ましくは高いＬＤＬ又は総コレステロールレベル、及び低いＨＤＬコレステロールレベルを緩和する本発明の組成物の量を意味する。さらに、投薬計画は、以下の例に見ることができる。好ましくは、ＰＡＺを、液状経口サプリメントとして投与するが、検分される活性を保証することが明らかである合成化合物の投与は、毎日、ｍｇ又はμｇの範囲の濃縮物で経口的に投与されるカプセル形態と同様である。例えば、一般に、無徴候性の患者に１日当たり約１オンス以上、そして疾患患者に１日当たり３オンス以上投与することができる。さらに、投薬計画は、以下の例に見ることができる。
【００５５】
本発明は、有効量の微生物発酵生成物を投与し、そしてリポタンパク質代謝に関わる遺伝子を制御することによる患者の高コレステロール血症を処置する方法を提供する。微生物発酵生成物、すなわち、ＰＡＺ、その単離成分、又はその化学合成類似体を投与することにより、リポタンパク質代謝及び／又はコレステロールに関わる一種以上の遺伝子を上方又は下方制御することができる。この方法を以下に詳細に説明する。
【００５６】
本発明は、より特定的には、ＰＡＺ、ＰＡＺから単離された特異的成分、及びＰＡＺ成分の化学合成類似体からなる群から選ばれる有効量の組成物を投与し、そしてリポタンパク質代謝に関わる遺伝子の発現を制御することによる患者のコレステロールレベルを制御する方法を提供する。前記組成物は、好ましくは、液状の経口サプリメントの形態であるが、本明細書に記載された他の形態も使用可能である。前記組成物は、また、機能性食品の形態でもあり得、又は食品添加物でもあり得る。前記組成物の投与は、好ましくは、毎日であるが、本明細書に記載された他の投与プロファイルを使用可能である。
【００５７】
前記組成物を投与することによって、さまざまな遺伝子が上方制御及び下方制御される。ＡｐｏＡ１及びＳＲＢ１遺伝子の転写が上方制御され、一方、ＣＥＴＰをエンコードする遺伝子の転写が下方制御される。したがって、より一般には、ＡＢＣＡ１、ＡｐｏＡ１及びＳＲＢ１エンコードする少なくとも一種の遺伝子を上方制御する、及び／又はＣＥＴＰをエンコードする遺伝子を下方制御することにより、高いＬＤＬ及び総コレステロール（ＴＣ）、並びに低いＨＤＬコレステロールを処置することができる。より特定的には、ＰＡＺを投与することによって、ＴＣレベルを下げることが可能であり、ＬＤＬレベルを下げることが可能であり、そしてＨＤＬレベルを上げることが可能である。これらの遺伝子の上方制御及び下方制御は、患者から血漿又は血液サンプルを採取し、汎用の方法でＴＣ、ＨＤＬ及びＬＤＬを分析する等のアッセイを行うことにより確認することができる。
【００５８】
本発明は、また、有効量の微生物発酵生成物を投与し、ＡＢＣＡ１、ＡｐｏＡ１及びＳＲ−Ｂ１をエンコードする少なくとも一種の遺伝子の発現を上方制御し、及び／又は、ＣＥＴＰをエンコードする遺伝子を下方制御することによる個体の高コレステロールを処置する方法を提供する。微生物発酵生成物は、上記したように、ＰＡＺ、ＰＡＺから単離された特異的成分、及びＰＡＺ成分の化学合成類似体からなる群から選ばれる組成物である。微生物発酵生成物は、液状経口サプリメントの形態であるが、本明細書に記載された他の投与形態や投与プロファイルも使用可能である。上方制御及び下方制御が前に上記したように行われていることを確認するためにアッセイを行うことができる。
【００５９】
本発明は、さらに、ＰＡＺ、ＰＡＺから単離された特異的成分、及びＰＡＺ成分の化学合成類似体からなる群から選ばれる有効量の組成物を投与し、リポタンパク質代謝に関わる遺伝子を制御し、そして高コレステロールの発症を防止することによる高コレステロールの発症を防止する方法を提供する。これは、高コレステロールにかかるリスクをもつ個体がそれらを保護するための手段を講じる予防方法である。個体が、一旦、高コレステロールにかかるリスクにさらされると確認した場合、前記組成物の服用を開始することができる。前記組成物は、毎日投与され得る。前記組成物は、液状の経口サプリメント、機能性食品、又は食品添加物の形態であり得る。すべての他の投与形態や投与療法を使用可能である。
【００６０】
以下の実施例で、遺伝子制御及びコレステロールレベルを測定するために、ＰＡＺ及びそのフラクションを用いたさまざまな試験を行っている。遺伝子制御の同様のパターンが、ＰＡＺそれ自体と比較して比較的少ない成分を含有する、一定のクロマトグラフィで精製されたフラクション（例えば、ＰＦ３及びＰＦ４フラクション）で処置した動物に観測される。しかし、ＡｐｏＡ１をエンコードする遺伝子の発現は、ＰＦ３又はＰＦ４単独よりもＰＡＺでより顕著に強化され、これは、コレステロール代謝に関して有益な効果をもつ追加の成分がＰＡＺ内に存在すること、あるいはこれらの二つのフラクション中の成分の相乗効果を示している。したがって、より一般には、高コレステロールは、ＡｐｏＡ１及び／又はＳＲＢ１を上方制御し及び／又はＣＥＴＰを下方制御するために、ＰＡＺ又はそこに含有される化合物を用いて有利に処置することができる。
【００６１】
ＰＡＺ及びＰＦ４は、ＣＥＴＰ及びＨＭＧＣｏＡレダクターゼタンパク質の機能活性についての直接の効果を試験しており、そして効果がないことがわかっている。さらに、このデータは、機序が転写レベルにあることを支持する（実施例２参照）。
【００６２】
ＰＡＺ並びにＰＦ３及びＰＦ４成分がこれら三種類の遺伝子の一種以上のｉｎ ｖｉｖｏの発現を有利に変更すると証明された能力とは対照的に、培養ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２）におけるコレステロール代謝に関わる遺伝子の発現を影響する能力を試験すると、ＣＥＴＰをエンコードする遺伝子の発現にのみ有意な変化が観測された。血管上皮細胞（ＨＵＶＥＣ）でｉｎ ｖｉｔｒｏ試験すると、得られた結果は一貫性がなく、そしてｉｎ ｖｉｖｏのコレステロール代謝で観測された有益な効果と一致しなかった。したがって、観測された活性は、それについて非自明であり、現代の製薬リサーチで採用する方法、すなわち、最初にｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞株をスクリーニングする方法を用いてアプローチした時に、ＰＡＺは、コレステロール低減組成物としてさらに検討されることから除外されるであろう（実施例３参照）。
【００６３】
ＰＡＺの全体効果を実施例１に示すが、それは、ＬＤＬだけでなく総血漿コレステロール（ＴＣ）を低減する。ＰＡＺは、また、ＨＤＬを有意に増大させ、それは、ＴＣ／ＨＤＬ比率の改善を生じる。血漿コレステロールの変化は、また、リポタンパク質粒子でのシフトを伴う。これらの効果のそれぞれは、上記したように、特定の遺伝子の発現の上方制御及び／又は下方制御によって作られる。
【００６４】
本発明の化合物を用いてハムスターで実験を行ったが、その結果は、ヒトで期待されるものを予測できる。ハムスターは、ヒトでのコレステロール代謝における候補薬の効能の予測に使用の好ましいモデルである。
【００６５】
ＰＡＺ、若しくはＰＡＺに由来する調製物又は化合物を、医師により適当とされる投薬計画に従って、毎日投与可能である。この処置は、病的コレステロールレベルをもつと診断された患者へ、コレステロールをより望ましいレベルへ持ってゆくための治療学的療法として提供可能である。別法として、該処置は、さまざまな因子によって、高い総及びＬＤＬコレステロールレベル、及び低いＨＤＬコレステロールレベルに進展する傾向の患者の予防的療法として提供可能であり、この場合、ＰＡＺを予防的処置として投与可能である。
【００６６】
ＰＡＺは、また、機能性食品、又はさまざまな飲料又は他の食材中の食品添加物として投与可能である。
【００６７】
本発明の主題であるＰＡＺ、ＰＡＺに由来するフラクション、又はＰＡＺの活性成分と等価又は類似する合成化合物は、個々の患者の臨床状態、投与部位及び方法、投与計画、患者年齢、性別、体重、及び医師が知る他の因子を考慮しながら、良質な診療行為に従って投与又は投薬される。したがって、本明細書で目的とする薬学的「有効量」は、当業分野で知られるような検討によって決定される。量は、生存率の改善やより迅速な回復、若しくは、兆候の改善又は消失、及び当業者によって適当な尺度として選択される他の指標を含む（しかし限定されない）改善を達成するのに効果的であるべきである。
【００６８】
本発明の方法において、本発明の化合物は、さまざまな方法で投与可能である。それは、調剤として投与可能であり、そして単独に又は薬学的に許容可能な担体、希釈剤、アジュバント及びビークルと組み合わせる有効成分として投与可能であることが特記されるべきである。化合物は、経口的、皮下、又は静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、扁桃内及び鼻腔内投与、さらに髄腔内及び注入技術を含む非経口的に投与可能である。化合物のインプラントもまた有用である。処置される患者は、温血動物、特にヒトを含む哺乳類である。薬学的に許容可能な担体、希釈剤、アジュバント及びビークルとさらにインプラント担体は、一般に、不活性で無毒性の固体又は液体充填剤、希釈剤、又は本発明の有効成分と反応しないカプセル化材料を意味する。
【００６９】
投与は、数日間にわたって単回投与又は複数回投与であり得る。処置は、一般に、疾患過程及び薬効の長さ、並びに処置される患者の種類に比例した長さを有する。
【００７０】
本発明の化合物を非経口投与する場合、それは、一般に、単位投与量の注射剤型（溶液、懸濁液、乳濁液）に処方される。注射に適当な製薬処方には、無菌の水性溶液又は分散液、及び無菌の注射可能な溶液又は分散液に再構成するための無菌粉体が含まれる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、それらの適当な混合物、及び植物油を含有する溶剤又は分散媒体であり得る。
【００７１】
適当な流動性は、例えばレシチンのようなコーチング（ｃｏａｔｉｎｇ）の使用により、分散液の場合は要求される粒径の管理により、そして界面活性剤の使用により維持することができる。綿実油、ゴマ油、オリーブ油、大豆油、コーン油、ひまわり油、及びピーナッツ油等の非水性ビークル、ミリスチン酸イソプロピル等のエステルもまた、調剤組成物の溶剤系として使用可能である。さらに、抗菌性防腐剤、抗酸化剤、キレート化剤及び緩衝液を含む、前記組成物の安定性、無菌性及び等張性を強化するさまざまな添加物を添加可能である。微生物の作用の防止は、さまざまな抗菌性及び抗真菌薬、例えばパラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等により確保可能である。多くの場合、等張剤、例えば糖類、塩化ナトリウム等を含むことが望ましい。注射可能な薬剤形態の長びく吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によりもたらされる。しかし、本発明によれば、使用されるすべてのビークル、希釈剤、又は添加剤は、化合物と親和性（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）である必要があろう。
【００７２】
注射可能な無菌溶液は、本発明を実施する際に利用される化合物を、所望により他のさまざまな添加剤とともに必要量の適当な溶剤中に取り込むことにより調製可能である。
【００７３】
本発明の薬理学処方は、さまざまなビークル、アジュバント、添加剤、及び希釈剤等のすべての親和性担体を含有する注射可能な処方で患者に投与可能であり、また、本発明で利用される化合物を、モノクローナル抗体、ベクター送達、イオン泳動、高分子マトリックス、リポソーム及びマイクロスフィア等の徐放性皮下インプラントや標的送達系の形態で非経口的に患者に投与可能である。本は発明に有用な送達系の例には、米国特許５，２２５，１８２；５，１６９，３８３；５，１６７，６１６；４，９５９，２１７；４，９２５，６７８；４，４８７，６０３；４，４８６，１９４；４，４４７，２３３；４，４４７，２２４；４，４３９，１９６；及び４，４７５，１９６が含まれる。多くの他のインプラント、送達系及びモジュールは、当業者に周知である。
【実施例】
【００７４】
以下の実験的実施例を参照して、本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、説明のためにのみ提供され、特に言及しない限り、限定的な意図ではない。したがって、本発明は、以下の実施例に限定されるよう解釈されるのではなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として自明となるすべての変更を含むと解釈されるべきである。
【００７５】
実施例１
【００７６】
実験の特定の目的は、（ａ）生理活性は完全複合混合物を要求するかどうか、あるいはその成分の一又は数種によるものかを決定する、（ｂ）このプロセスに由来するＰＦフラクションをｉｎ ｖｉｔｒｏ（細胞培養物）及びｉｎ ｖｉｖｏ（ハムスター）の実験モデル系で評価するために、クロマトグラフィ技術を採用して完全ＰＡＺ培養ろ過物をその化学及び物理特性に基づくフラクションに分離することであった。
【００７７】
材料及び方法
【００７８】
血漿コレステロール分析のために、以下のアッセイキットを使用した：
【００７９】
ポインテ・サイエンティフィック社（Ｐｏｉｎｔｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）より：
【００８０】
コレステロール液体（Ｃ７５１０−血漿総コレステロール用）
【００８１】
トリグリセリドＧＰＯ液体試薬セット（Ｔ７５３１−血漿ＴＧ用）
【００８２】
ＨＤＬ／コレステロールＭｇ／Ｄｅｘ（Ｈ７５０７−マグネシウム沈殿による血漿ＨＤＬ用）
【００８３】
和光社（Ｗａｋｏ）より：
【００８４】
遊離コレステロールＥ（４３５−３５８０１）
【００８５】
リン脂質Ｃ（４３３−３６２０１）
【００８６】
ＰｒｏＡｌｇａＺｙｍｅTMをサブフラクションに分離した。
【００８７】
Ｆ１：多くのタンパク質を捕獲するための弱陰イオン交換
【００８８】
Ｆ２：カルボキシル基及び負に帯電したイオンをはじめとする負に帯電した他の官能基性を含有する分子を捕獲するための強陰イオン交換
【００８９】
Ｆ３：アミノ基及び正に帯電したイオンをはじめとする正に帯電した他の官能基性を含有する分子を捕獲するための強陽イオン交換
【００９０】
カラム４ 非極性有機分子を結合するＣ１８誘導（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）カラム
【００９１】
Ｆ４：採用した一連の樹脂（弱陰イオン交換、強陰イオン交換カラム、強陽イオン交換、及びＣ−１８カラム）に対して通過する（結合しない）液体。この「通過」フラクションをPF4と呼び、これは、カラム４により捕獲されず、そしてまた、生体機能が評価された低極性分子とともに、極性であるが無電荷の有機分子を含む比較的少数の分子を含有する。
【００９２】
研究デザインを図１に示す：
【００９３】
ＨＦ：高脂肪食（３０％カロリー、脂肪由来；飽和脂肪酸を含有するココナッツ油を主とし、＋１％大豆油）
【００９４】
ＰＡＺ：ＰｒｏＡｌｇａＺｙｍｅTM（完全溶液）
【００９５】
ＰＦ１、ＰＦ２、ＰＦ３及びＰＦ４は、ＰＡＺをクロマトグラフィで分離したフラクションである。
【００９６】
対照動物に、通常ハムスター飼料を給餌した。
【００９７】
Ｐ：高脂肪食（３０％カロリー、ココナッツ油由来）を意味する。
【００９８】
ＰＷ：高脂肪食＋水
【００９９】
ＰＰ：高脂肪食＋完全ＰｒｏＡｌｇａＺｙｍｅTM（２０ｍＬを１００ｍＬに希釈）
【０１００】
ＰＦ１：高脂肪食＋ＰｒｏＡｌｇａＺｙｍｅTMのフラクション１（５ｍＬを１００ｍＬに希釈）
【０１０１】
ＰＦ２：高脂肪食＋ＰｒｏＡｌｇａＺｙｍｅTMのフラクション２（５ｍＬを１００ｍＬに希釈）
【０１０２】
ＰＦ３：高脂肪食＋ＰｒｏＡｌｇａＺｙｍｅTMのフラクション３（５ｍＬを１００ｍＬに希釈）
【０１０３】
ＰＦ４：高脂肪食＋ＰｒｏＡｌｇａＺｙｍｅTMのフラクション４（２０ｍＬを１００ｍＬに希釈）
【０１０４】
ｐ値＝ＰＷに対する統計的有意差（Ｏｎｅ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、ＳＴＡＴＰＬＵＳ）；ｎ＝１０／群
【０１０５】
ｐ＜０．０５は、比較される２群間で、パラメータ（例えばＴＣ）の平均値が統計的に相違することを暗示する。ｐ値が低いほど、統計的有意差が高い。
【０１０６】
グラフ上、ＰＷと比較して統計的に相違するカラムを、＊（ｐ＜０．０５）又は＊＊（ｐ＜０．０１）で表示した。
【０１０７】
要約：コレステロール血症予防的モデル系ハムスターの血漿脂質に関するＰＡＺの予防効果
【０１０８】
ＰＡＺは、２８日予防的研究にわたって、血漿総コレステロール（ＴＣ）及び非ＨＤＬ（ＬＤＬ）の統計的有意な減少をもたらす。ＰＡＺは、ＨＤＬの統計的に有意な増大をもたらし、これは、ＴＣ／ＨＤＬ比率の顕著な改善につながる。血漿コレステロールの変化は、リポタンパク質粒子のシフトを伴う。結果を図Ｓ２−１２に示す。
【０１０９】
図２に示すように、飼料平均摂取量は、一般に、４週間にわたって減少した。図３に示すように、平均体重は４週間にわたって増大した。図４は、平均摂水量が４週間にわたって減少したことを示す。図５は、ＰＦ３給餌動物の平均ＴＣが水を与えた動物（ＰＷ）よりも有意に低かったことを示す。図６は、ＰＰ、ＰＦ３及びＰＦ４の場合の平均ＨＤＬコレステロールが、水給餌群（ＰＷ）と比較して有意に高かったことを示す。図７は、ＰＦ３及びＰＦ４の場合の平均ＴＣ／ＨＤＬ比率が、ＰＷと比較して有意に低かったことを示す。図８は、ＰＰ、ＰＦ３、及びＰＦ４の場合の平均ＬＤＬコレステロールが、ＰＷと比較して有意に減少したことを示す。図９は、トリグリセリドレベルの減少が統計的有意差に達しなかったことを示す。図１０は、各群のリポタンパク質プロファイルを示し、そして各ＰＡＺ組成物は、プロファイルのシフトを生じた。図１１は、水を給餌したハムスター（ＰＷ）と完全ＰｒｏＡｌｇａＺｙｍｅTMを給餌したハムスター（ＰＰ）との間に、リポタンパク質組成物の低密度から高密度粒子へのシフトが存在したことを示す。図１２は、水対ＰＦ３給餌ハムスターにおいて、リポタンパク質組成物の低密度から高密度へのシフトが存在することを示す。
【０１１０】
実施例２に記載された実験の目的は、（ａ）コレステロール代謝に関わるキータンパク質の機能を変更するＰＡＺ及びそのフラクションの活性の能力について試験すること、及びそのような機序（例えばスタチン類についての場合である）を同定すること、（ｂ）ＰＡＺ抽出物のさらなる分別及び活性成分の究極の特徴を促進させるようなアッセイを採用することであった。
【０１１１】
実施例２
【０１１２】
この実施例は、コレステロール代謝酵素であるコレステロールエステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）、リン脂質転移タンパク質（ＰＬＴＰ）及びＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）の酵素活性に関して有するＰＡＺ、ろ過物ＰＦ４及びＰＦ３の効果の定量分析を詳説する。
【０１１３】
手順：
【０１１４】
ＣＥＴＰ及びＰＬＴＰアッセイ：ＣＥＴＰインヒビター・ドラッグ・スクリーニング・キット（カタログ＃Ｋ６０２−１００）、及びＰＬＴＰインヒビター・ドラッグ・スクリーニング・キット（カタログ＃Ｋ６０２−１００）を、バイオビジョン・リサーチ・プロダクツ社（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、マウンテンビュー、カリフォルニア州）から入手した。酵素アッセイを製造者の指示に従って行った。詳細には、１６０μＬの脱イオン化（ＤＩ）水、ＰＦ４（無希釈）又はＰＦ３（ＤＩ水で１：１０希釈）を、９６ウエル黒色マイクロタイタープレートのウエルに分配した。次いで、容積を変更した対照ウサギ血清（ＣＥＴＰ及びＰＬＴＰの源）を、ウエルに添加した。いくつかのウエルは血清を受けつけなかったので、背景蛍光（ブランク）対対照として役立てた。１ウエルにつき、１部のアクセプター分子溶液、１部のドナー分子溶液、及び２部の１０´アッセイバッファーからなるマスターミックスを調製し、各アッセイに使用されるウエル数までスケールアップした。４０μＬのマスターミックスを各ウエルに添加し、プレートをシールし、３７℃の加湿器内で４５分間インキュベートした。各ウエルの蛍光強度を、４８５ｎｍ励起及び５２７ｎｍ放射のフィルタペアを持つラボシステム・フルオロスキャン・アスセント・エフエル・蛍光光度計（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ ＦＬ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）を用いて測定した。各状態を繰り返して行い、平均を報告した（各平均に標準偏差誤差バーを付けた）。
【０１１５】
ＨＭＧＲアッセイ：ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）アッセイキットを、シグマ−アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）から入手した。酵素アッセイを製造者の指示に従って行った。詳細には、１．５ｍＬのマイクロチューブに以下の試薬をその順番に加えた：１´アッセイバッファー、インヒビター（インヒビター対照及び試験サンプルに対する、提供されたプラバスタチンインヒビター、ＰＦ４（１５μＬ）又はＰＦ３（１：１０希釈の１５μＬ）のいずれか）、ＮＡＤＰＨ、ＨＭＧ−ＣｏＡサブストレート溶液、及びＨＭＧＲ。１つのチューブは、ＨＭＧＲを添加させず、ブランクとして使用した。陽性対照サンプルは、ＨＭＧＲを含有するが、インヒビターを含有しなかった。すべての反応を１ｍＬ容積で行った。チューブは、詳細には、ＨＭＧＲをミックスに添加した後、反応溶液をＵＶ−可視セルに移す前にボルテックスした。島津ＵＶ−１６０１ＵＶ−可視分光光度計で３４０ｎｍ吸収の示数を１５秒毎に５〜７分間、取得した。３４０ｎｍの吸収示数は、酵素活性を持つサンプル（例えば、陽性対照サンプル）でＮＡＤＰＨ濃縮のせいで減少した。
【０１１６】
結果：
【０１１７】
ＣＥＴＰ及びＰＬＴＰアッセイ：ＰＦ４によるＣＥＴＰ（図１３）又はＰＬＴＰ（図１４）酵素活性を、使用血清の容積にてＤＩ水中のこれらの酵素活性と比較したとき、有意な効果はなかった。
【０１１８】
ＰＦ３（１：１０希釈）が存在すると、高血清量（図１５）にてＣＥＴＰ活性のかすかな増大が観測される（結論参照）。ＰＦ３は、ＤＩ水と比較して、ＰＬＴＰ活性について負のすなわちインヒビター効果を有するようであった（図１６）。
【０１１９】
ＨＭＧＲアッセイ：インヒビターの存在無しでは、ＨＭＧＲ酵素活性は、明らかに下降（負）の傾きを形成する（図１７、ピンク色の実線（■）の近似曲線）。予期されるように、インヒビターのプラバスタチン類が存在するときのＨＭＧＲ活性は有意に減少した（図１７、ピンク色の実線（■）の近似曲線（ＨＭＧＲ）をオレンジ色の実線（▲）の近似曲線（ＨＭＧＲ＋プラバスタチン類）と対比）。ＨＭＧＲ活性の減少は、ＰＦ４がアッセイに存在したときは検出されなかった（図１７、ピンク色（■）の実線の近似曲線（ＨＭＧＲ）を青色の実線（×）の近似曲線（ＨＭＧＲ＋ＰＦ４）と対比）。しかし、ＰＦ３は、このアッセイで、ＨＭＧＲ活性についてインヒビター様の効果を有することが観察された（図１７、ピンク色の実線（■）の近似曲線（ＨＭＧＲ）を紫色の実線（●）の近似曲線（ＨＭＧＲ＋ＰＦ３）と対比）。
【０１２０】
結論：
【０１２１】
ＣＥＴＰ及びＰＬＴＰアッセイ：対照蛍光値の倍率の増大（対照血清を用いるか、あるいは用いないＤＩ水で得られたアッセイ測定結果）は、製造者の指示に報告されるとおりの期待された範囲にあり、これは、アッセイを予期するとおりに行っていることを示す。
【０１２２】
ＰＡＺのＰＦ４フラクションは、これらのアッセイキットを用いたＣＥＴＰ又はＰＬＴＰの活性のいずれにも効果を有しないようであった。ＰＡＺのＰＦ３フラクション（１：１０希釈）は、ＣＥＴＰ及びＰＬＴＰ活性の効果を有するようであった。しかし、効果は、これらの二種類の酵素の作用機序、及びｉｎ ｖｉｖｏ高コレステロール血症モデルでのＰＦ３のコレステロールを下げる可能性についての報告に基づいて予期されたものと反する。したがって、このデータ、特にＰＦ３についての解釈のもつ訓戒（ｃａｕｔｉｏｎ）は正当化される。これらのアッセイでは、ＰＦ３はＤＩ水中で１０倍希釈されたが、ＤＩ水単独やＰＦ４と比較して有意量の塩が存在する。これは、アッセイで使用された蛍光標識脂質で試験した酵素活性に関して逆効果を有し得た。さらに、これらのアッセイに先立って希釈ＰＦ３のｐＨが試験されなかったが、これもまた、同じく逆効果に寄与し得る。本研究の他の重要な面は、ＰＡＺが直接にリポタンパク質に作用せず、したがって、現在、高コレステロールを処置するのに使用されるスタチン類と同じ作用機序を持っていないことを示している。
【０１２３】
ＨＭＧＲアッセイ：この活性アッセイでは、経時的な３４０ｎｍの吸収の減少は、ＮＡＤＰＨ濃度としてのＨＭＧＲ活性が、ＨＭＧＲによるＮＡＤＰへの転換のせいで減少することを示している。ＰＡＺのＰＦ４フラクションは、このアッセイではＨＭＧＲ活性を抑制しなかったようである。しかし、ＰＡＺのＰＦ３ろ過物では特記される視認できる抑制が存在した。再び、ＣＥＴＰ及びＰＬＴＰ活性について観測されたＰＦ３の効果を考慮すると、これらの結果を解釈する際の警告となるべきものである。
【０１２４】
コレステロール代謝に関与する４つの酵素へのＰＡＺフラクションの効果について評価したことを以前に開示した。アッセイを行い、そして、上記したように、ＣＥＴＰ、ＰＬＴＰ及びＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼについての予備的データが得られた。４番目の酵素、レシチン−コレステロールアシルトランスフェラー（ＬＣＡＴ；血漿ＨＤＬ濃縮物の主要な決定因子（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ））は、評価できなかった。上記データに基づいて、ＣＥＴＰ、ＰＬＴＰ及びＨＭＧＲタンパク質へのＰＦ４及びＰＦ３の直接的効果に関する有意な発見はないと結論づけられる。
【０１２５】
これらのタンパク質は、ＬＣＡＴとともに、薬剤候補のＨＤＬ−コレステロールに関する効果を試験する際の、たびたび際立った評価ターゲットであるものの、ＨＤＬ−コレステロールレベルを増加させるよう導くコレステロール逆転送パスウエイでの他の機序が関与し、この際に評価を検討すべきと考えられる。例えば、ＡｐｏＡ１は、ＨＤＬ粒子のタンパク質成分の７０％を構成し、そしてほとんどすべてのＨＤＬ粒子に存在する。多くの研究が、ＨＤＬ−コレステロールレベルを上げる最良の策は、新規なＨＤＬコレステロールの前駆体であるＡｐｏＡ１をより多く作ることであると信じている。この理由のため、内因性ａｐｏＡ−１タンパク質発現の上方制御が、ＨＤＬ−コレステロールをターゲットとする新規な治療法を開発するための最も有望なアプローチのひとつである考えられる。検討されるべき追加の機序は、膜タンパク質であるクラスＢスカベンジャレセプタータイプ１（ＳＲ−Ｂ１）及びＡＴＰ−結合カセット１（ＡＢＣ１）（前者はＨＤＬの真性レセプター（ｂｏｎａ ｆｉｄｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）として、後者は脂質転送者として）の制御であり、両者は、コレステロール流出に重要であると強く関係づけられている。ＬＤＬレセプターの発現とリサイクルの制御、そしてしたがってその利用性もまた、機序であり、これにより、コレステロールレベルが生理学的に調節され、そして評価されるべきである。
【０１２６】
データは、ＣＥＴＰ、ＰＬＴＰ及びＨＭＧＲ活性へのＰＦ４及びＰＦ３フラクションの効果に関する有意な発見があるかどうかをほとんど明らかにしていない。しかし、ｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素アッセイで使用した同一のＰＡＺフラクションは、ｉｎ ｖｉｖｏ動物高コレステロール血症モデルにおいてＨＤＬ−コレステロールレベルを上昇させる能力を示した。これらの明らかに矛盾する結果は、（ａ）ｉｎ ｖｉｖｏでコレステロールレベルを下げるのに関与する機序は、われわれがｉｎ ｖｉｔｒｏで試験している特定の酵素と関係しない、（ｂ）これらのタンパク質の一種以上の発現又はターンオーバーを変更するような別の機序、及び／又は、活性代謝物質を生成するために、ＰＡＺの成分に作用するｉｎ ｖｉｖｏ前生物的変換（ｐｒｅｂｉｏｔｉｃ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）パスウエイの要求のためである。この生体内活性化プロセスは、ヒト及び動物の消化管又は血流内、あるいはヒト及び動物の消化管内に存続する細菌性ミクロフローラの中のいずれかで起こり得る。
【０１２７】
実施例３及び４に記載された実験の目的は、（ａ）ＰＡＺ及びＰＡＺのフラクションのコレステロール代謝に関与するキータンパク質をエンコードする遺伝子の発現を変更する能力を評価し、そしてそのような機序が同定できるかを評価すること、（ｂ）ＰＡＺ抽出物のさらなる分別と究極の特徴の活性成分を促進するようなアッセイを採用することである。
【０１２８】
実施例３
【０１２９】
一の特定目的は、高脂肪食と同時に完全ＰＡＺ（ＰＰ）及びＰＡＺのフラクション４（ＰＦ４）をハムスターに給餌することによりもたらされるより有益的な血漿脂質プロファイル（より低いＴＣ、より高いＨＤＬ）を説明することであった（すなわち予防的モデル）。したがって、実施例１で採用した４週間の予防的プロトコル後に回収したハムスター肝臓から採取した組織内のＨＤＬ代謝に関わる遺伝子ＡｐｏＡ１、ＡＢＣＡ１、ＳＲ−Ｂ１及びＣＥＴＰの発現レベルの評価を行った。もう一つの特定目的は、ＨｅｐＧ２及びＨＵＶＥＣ細胞系のいずれかを採用するｉｎ ｖｉｔｒｏＨＤＬ遺伝子制御についてＰＡＺ及びそのフラクションの効果を評価することであった（データは示さず）。この実施例では、５動物／群のデータを示し、１動物につき３回繰り返した。
【０１３０】
図１３は、コレステロール逆転送パスウエイ、及びアテローム性因子（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）の発病に関するＨＤＬ作用の他のサイトの主成分を示す。ＡｐｏＡ１は、初期のＨＤＬ粒子の生成に関与する。ＡＢＣＡ１は、脂質を抹消組織から初期ＨＤＬに転送して、より大きなＨＤＬ粒子を形成させる。大きいＨＤＬ粒子は肝臓上のＳＲ−Ｂ１レセプターを介して胆汁へと除去され、血漿からの除去が生起され、そしてＡｐｏ１はリサイクルされる。ＣＥＴＰは、脂質をＨＤＬから非ＨＤＬ（ＬＤＬ様）粒子へ転送する。この転送が減少することは有利である。
【０１３１】
細胞培養物、処置、ＲＮＡ単離
【０１３２】
Ｈｅｐ−Ｇ２細胞をＤＭＥＭ（＋１０％ＦＢＳ、＋５％ＰｅｎＳｔｒｅｐ、＋５％Ｌ−グルタミン）内で培養し、一方、ＨＵＶＥＣ細胞をＭｅｄｉｕｍ１９９（＋２５ｍｇ内皮性成長因子、＋５０ｍｇヘパリン、＋２０％ＦＢＳ、＋５％ＰｅｎＳｔｒｅｐ、＋５％Ｌ−グルタミン）内で培養した。３ｘ１０５細胞を６−ウエルプレートへ静置した。静置２４時間後、細胞を処理した（対照、Ｐａｚ １：１００、Ｐａｚ １−２０、Ｐａｚ １−１０、新フラクション−４（１：１００）、新フラクション−４（１：２０）、新フラクション−４（１：１０）、旧フラクション−４（１：１００）、旧フラクション−４（１：２０）、旧フラクション−４（１：１０））。細胞を１６時間処理した後、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ及び Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒを用いて、製造者により提供されるプロトコルに従って全ＲＮＡを分離した。
【０１３３】
ＲＮＡをｃＤＮＡへ
【０１３４】
Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ−ＣＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライド・バイオシステムズ社、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、製造者により提供されるプロトコルに従って、全ＲＮＡ１μｇから始めて、ＲＮＡをｃＤＮＡへ転換した。
【０１３５】
ＲＴ−ＰＣＲ
【０１３６】
４種類のプライマーをアプライド・バイオシステムズ社から取得した。
１）ホモサピエンスコレステロールエステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）：
ファワードプライマー配列 ＡＣＣＴＴＣＴＣＧＣＣＣＡＣＡＣＴＧＣＴ（配列番号：１）、
リバースプライマー配列 ＴＧＡＡＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＴＣＣＡＧＣ （配列番号：２）；
２）ホモサピエンスＡＴＰ−結合カセット、サブファミリーＡ（ＡＢＣＡ１）：
ファワードプライマー配列 ＡＡＧＡＣＣＣＴＧＧＣＴＴＣＧＧＧＡＣＣ（配列番号：３）、
リバースプライマー配列 ＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＧＡＡＣＴＧＧＧＧＣ（配列番号： ４）；
３ホモサピエンススカベンジャレセプタークラスＢ、メンバー １（ＳＲ−Ｂ１）：
ファワードプライマー配列 ＡＡＧＡＡＣＧＴＧＣＧＣＡＴＣＧＡＣＣＣ（配列番号：５）、
リバースプライマー配列 ＴＣＡＴＧＡＡＧＧＣＡＣＧＴＴＣＧＣＣＧ（配列番号：６）；
４）ＡＰＯＡ１：
ファワードプライマー配列 ＣＡＴＴＴＣＴＧＧＣＡＧＣＡＡＧＡＴＧＡ（配列番号：７）、
リバースプライマー配列 ＧＣＣＴＴＣＡＡＡＣＴＧＧＧＡＣＡＣＡＴ（配列番号：８）。
プライマーの最終濃度は、５μＭであった。リアルタイムＰＣＲを全２５μＬ反応混合物（２μＬｃＤＮＡ、１２．５μＬの２ｘＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライド・バイオシステムズ社製）、１．０μＬの各５μｍｏｌ／Ｌフォワード及びリバースプライマー、並びに１０μＬの蒸留水）で行った。ＰＣＲプログラムを、９５℃１０分間により開始した後、各サイクル９５℃３０秒間及び６０℃１分間のサーマルサイクル５０回を行った。データを、比較Ｃｔ法（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｃｔ ｍｅｔｈｏｄ）に従って解析し、各サンプル中のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ発現（インビトロジェン社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対して規格化した：
ファワードプライマー配列 ＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＣＴＧＴＧＧＡＴＧＧ（配列番号：９）、
リバースプライマー配列 ＣＡＧＴＧＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＡＧ （配列番号：１０）。
【０１３７】
ハムスター
【０１３８】
１．ＡＢＣＡ１
Ｆ：５’−ＡＴＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＡＡＣＣＣＴＧＡＣ−３’（配列番号：１１）
【０１３９】
Ｒ：５’−ＧＧＴＡＣＴＧＡＡＧＣＡＴＧＴＴＴＣＧＡＴＧＴＴ−３’（配列番号：１２）
【０１４０】
２．ＣＥＴＰ
Ｆ：Ｆ：５’−ＡＡＧＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＴＣＡＧＴＴＣＴ−−３’（配列番号：１３）
【０１４１】
Ｒ：Ｆ：５’−ＡＣＴＧＡＴＧＡＴＣＴＣＧＧＧＧＴＴＧＡＴ−−３’（配列番号：１４）
【０１４２】
３．ａｐｏＡ−Ｉ
Ｆ：５’−ＡＣＣ−ＧＴＴＣＡＧ−ＧＡＴ−ＧＡＡ−ＡＡＣ−ＴＧＴ−ＡＧ−３’（配列番号：１５）
【０１４３】
Ｒ：５’−ＧＴＧＡＣＴ−ＣＡＧ−ＧＡＧ−ＴＴＣ−ＴＧＧ−ＧＡＴ−ＡＡＣ−３’（配列番号：１６）
【０１４４】
４．ＳＲ−Ｂ１
Ｆ：５’−ＡＡＧ−ＣＣＴ−ＧＣＡ−ＧＧＴ−ＣＴＡ−ＴＧＡ−ＡＧＣ−３’（配列番号：１７）
【０１４５】
Ｒ：５’−ＡＧＡ−ＡＡＣ−ＣＴＴ−ＣＡＴ−ＴＧＧ−ＧＴＧ−ＧＧＴ−Ａ−３’（配列番号：１８）
【０１４６】
ヒト
【０１４７】
ＣＥＴＰ
Ｆ：ＡＣＣＴＴＣＴＣＧＣＣＣＡＣＡＣＴＧＣＴ（配列番号：１９）
【０１４８】
Ｒ：ＴＧＡＡＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＴＣＣＡＧＣ（配列番号：２０）
【０１４９】
配列（５’−＞３’）
【０１５０】
ＡＢＣＡ１
Ｆ：ＡＡＧＡＣＣＣＴＧＧＣＴＴＣＧＧＧＡＣＣ（配列番号：２１）
【０１５１】
Ｒ： ＡＴＧＧＴＣＴＧＧＧＧＡＡＣＴＧＧＧＧＣ（配列番号：２２）
【０１５２】
配列（５’−＞３’）
【０１５３】
ＳＲＢ１
Ｆ：ＡＡＧＡＡＣＧＴＧＣＧＣＡＴＣＧＡＣＣＣ（配列番号：２３）
【０１５４】
Ｒ：ＴＣＡＴＧＡＡＧＧＣＡＣＧＴＴＣＧＣＣＧ（配列番号：２４）
【０１５５】
ＡＰＯ−Ａ１
Ｆ：ＣＡＴＴＴＣＴＧＧＣＡＧＣＡＡＧＡＴＧＡ（配列番号：２５）
【０１５６】
Ｒ：ＧＣＣＴＴＣＡＡＡＣＴＧＧＧＡＣＡＣＡＴ（配列番号：２６）
【０１５７】
実施例４
【０１５８】
高脂肪食を給餌したハムスター（予防的モデル）へ完全ＰＡＺ（ＰＰ）及びＰＡＺのフラクション４（ＰＦ４）を投与することにより達成されるより有益な血漿脂質プロファイル（より低いＴＣ、ＨＤＬはより高い）の原因である機序を探求するために、別法のアプローチを採用した。ＨＤＬ代謝に関わる特定遺伝子、すなわち、ＡｐｏＡ１、ＡＢＣＡ１、ＳＲ−Ｂ１、及びＣＥＴＰの転写の相対レベルを評価するのに、定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用した。この実施例では、５動物／群のデータを示し、１動物につき３回繰り返した。
【０１５９】
図１９は、高脂肪食＋完全ＰＡＺ（ＰＰ）又はフラクション４（ＰＦ４）又は水（ＰＷ）を給餌した動物における特定遺伝子の相対的転写レベルを、定常（低脂肪）飼料及び水（ＣＷ）の対照群と対比したグラフである。高脂肪食及び水を給餌した動物はＣＥＴＰ発現の増大を示したが、これは、ＣＷ及びＰＰ／ＰＦ４群と比べて血漿ＬＤＬ及びＴＣが高いことを説明している。それらは、また、ＡｐｏＡ１発現の減少を示したが、これは、ＨＤＬＣの産生減少と互いに関係がある。それらは、また、ＳＲ−Ｂ１発現の減少を示したが、これは、コレステロール逆転送パスウエイを介したコレステロール除去の抑制と互いに関係がある。
【０１６０】
図２０は、高脂肪食＋完全ＰＡＺ（ＰＰ）又はフラクション４（ＰＦ４）又は水（ＰＷ）を給餌した動物における特定遺伝子の相対的転写レベルを、高脂肪食及び水（ＰＷ）の対照群と対比したグラフである。ＰＰ及びＰＦ４の場合のＡＢＣＡ１及びＣＥＴＰ発現レベルは同様であった。ＰＰでのＡｐｏＡ１発現は、ＰＦ４と比較してより高められたが、これは、初期ＨＤＬ粒子のより大量の生成と互いに関係がある。これは、ウエスタンブロット、及びＨＤＬ粒子径／密度によって同定することができる。ＳＲ−Ｂ１発現レベルは、ＰＦ４群でより高いが、これは、除去（ｃｌｅａｒａｎｃｅ）の増大と互いに関係がある。これは、ＴＣの有意な減少と互いに関係がある。
【０１６１】
要約すると、ハムスター肝臓サンプルからのｍＲＮＡを使用する遺伝子制御のｑＰＣＲ分析は、実施例１の研究で特記した脂質血漿プロファイルの変化を実証し、そしてＰＡＺ又はその成分の作用機序として、リポタンパク質代謝のキータンパク質をエンコードする遺伝子の発現を制御していることを支持する。
【０１６２】
実施例５
【０１６３】
たびたび究極のｉｎ ｖｉｖｏ効果（正及び負の両方）を予測するのに失敗する、現代の医薬開発に代表的に採用される高スループットスクリーニング法と対照的に、ＰＡＺの活性成分は、ｉｎ ｖｉｖｏ活性のための厳格な評価（ａｃｉｄ ｔｅｓｔ）を提供するものの、ＰＡＺの活性成分の分別は、長期のｉｎ ｖｉｖｏ法の主な用途によって著しく妨害されている。しかし、ＣＥＴＰ遺伝子発現をモニターするためにＨＥＰＧ２細胞を採用するｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイがスクリーニングの代替エンドポイント（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｅｎｄｐｏｉｎｔ）を提供するかもしれないことを示す初期結果を考慮して、培養ＨＥＰＧ２細胞でのＣＥＴＰ発現に関するＰＡＺの効果をさらに試験した。
【０１６４】
図２１は、ＰＡＺのさまざまな製造ロットが、ＨＥＰＧ２細胞でのＣＥＴＰ発現の減少に潜在的活性を有することを示す。
【０１６５】
図２２は、用量-反応研究結果を示し、ここで、培養培地中のＰＡＺの希釈物を増大させると、ＣＥＴＰ発現の抑制の増大と互いに関係があった。これらのデータは、（ａ）ＰＡＺはきわめて効能があり、有益な効果を達成するために低用量しか必要とされない、及び／又は、ある一定のレベルでＰＡＺの有益な効果を減じるＰＡＺの他の成分が存在し得ることを示す。
【０１６６】
実施例６
【０１６７】
コレステロール及びＨＤＬレベル並びにリポタンパク質代謝に関わる一定のキー遺伝子の発現レベルの有意で有益な変化を、ｉｎ ｖｉｖｏ予防的モデル系で観察された。しかし、高コレステロール血症を持った個体を処置するために新規な薬剤の需要を考慮し、治療学的モデルでのコレステロール及びリポタンパク質プロファイルを改善するために、ＰＡＺ及びＰＡＺに由来するフラクションの能力を評価することが重要であった。治療学的ハムスター実験モデルを採用し、ここで、動物（各群８動物）に、最初の２８日間、高脂肪食を投与して、次いで、屠殺までの追加の２１日間、高脂肪食＋ＰＡＺ又はＰＡＺに由来するフラクションを同時投与した。得られた結果を図２３−２５に示す。
【０１６８】
図２３は、このプロトコルで処置したハムスターの血漿の総コレステロール（ＴＣ）、ＨＤＬ、及びトリグリセリド類に関するＰＡＺ及びＰＡＺからのフラクション３の効果を表す。
【０１６９】
図２４は、ＰＡＺのフラクション３でハムスターを治療学的に処置することによって及ぼされるコレステロール対ＨＤＬの比率の減少を示す。
【０１７０】
図２５は、高コレステロール血症にためにＰＡＺの治療学的処置にかけられた動物の肝臓においてＡｐｏＡ１をエンコードする遺伝子の発現の有意な上昇を示す。
【０１７１】
実施例７
【０１７２】
ＰＡＺ及びＰＡＺに由来するフラクションの長期経口投与は、予防的及び治療学的モデル系の両方で有効であり、リポタンパク質代謝に関与する遺伝子の発現の有意で有益な変化が観察され、遺伝子発現を直接調節する薬剤がそのような変化を比較的迅速（リポタンパク質代謝のターンオーバー及びその結果のリポタンパク質プロファイルの変化は実質的に長く要求されるかもしれないが）に引き起こしそうであることを考慮し、動物を２８日間、高脂肪食で前処置し、次いでＰＦ３、ＰＦ４（その成分を濃縮するために様々な処理をするか、しない）を屠殺とｍＲＮＡ抽出及びｑＰＣＲ前の７日間（３動物／群）投与する短期治療学的モデルで、ＡＰＯＡ１及びＣＥＴＰ遺伝子の発現を変更するＰＡＺフラクションの能力を評価した。
【０１７３】
図２６は、これらの結果を表す。意外にも、ＰＦ４もそれらの誘導体も、ＡｐｏＡ１発現の有意な強化を作らなかった。しかし、ＰＦ３フラクションは、長期治療学的及び予防的研究で得られた結果と矛盾せずに、短期治療学的実験モデルでＡｐｏＡ１の発現を有意に強化し、これは、この遺伝子を直接活性化するＰＦ３中の成分の可能性を示唆している。これらのデータは、ＰＦ３について遺伝子発現の有益な変化が観察されたことを示すものの、ＰＦ４の短期治療学的研究については遺伝子発現の有益な変化が観察されなかった。しかし、長期治療学的及び予防的研究で得られた遺伝子発現の再現性のある有益な変化を考慮に入れると、これらのデータは、ＰＦ４成分中のＰＡＺ成分による遺伝子制御についてのより複合的、たぶん間接的な機序を支持する。
【０１７４】
実施例８
【０１７５】
治療学的状態（すなわち、ＰＦ４投与前に高コレステロール血症を誘発させた動物モデルを採用する）のｉｎ ｖｉｖｏコレステロール及びリポタンパク質代謝に関するＰＡＺに由来するＰＦ４フラクションの効果を評価するために時間研究を行った。図２７は、血漿脂質分析及び肝臓ｍＲＮＡ発現を含む研究デザインを示す。ＰＦ４は、実施例１に記載されたクラマトグラフィ法を用いてＰＡＺから導出したフラクション４である。得られた結果を図２７−３２に表す。異なる時点で、図２８は血漿総コレステロールを示し、図２９は血漿ＨＤＬ−ｃを示し、そして図３０は血漿トリグリセリドを示す。図３１は、異なる時点でＰＦ４で処置した血漿脂質パラメータ（ＴＣ、ＨＤＬ、ＴＧ）の変化を示し、図３２は、異なる時点のＡｐｏＡ１及びＣＥＴＰの遺伝子制御を示す。
【０１７６】
図３３は、ｉｎ ｖｉｖｏ実験モデルでのリポタンパク質代謝パラメータの多様研究におけるＰＡＺのフラクションＰＦ４の得られた結果の対比である。この時間研究は、治療学的アプローチ（４週間のＨＦ飼料に続いてＰＦ４での処理）を使用した。ここで、２１日目のＰＦ４（ロット３）は、２８日間予防的アプローチ（４週間の同時のＨＦ及びＰＦ４治療介入）後のＰＦ４（ロット１）と極めて類似した脂質プロファイルを示す。治療学的時間研究（ＰＦ４／ロット３）では、ＡｐｏＡ１及びＣＥＴＰ発現の両方とも、２１日目に増大した。ＰＦ４／ロットを使用する実施例４（図２０参照）ではＡｐｏＡ１が増大し、一方、ＣＥＴＰが減少した。これらの研究の中に観察されたＣＥＴＰ発現の相違は、治療学的モデル系で効果を妨害する薬剤がなくても長期ＨＦ給餌の影響を反映していることがあり得る。
【０１７７】
本願を通して、米国特許を含むさまざまな刊行物が著者及び年並びに特許番号により参照される。刊行物の全引用を以下にリストする。本願が関係する従来技術の状態をより充分に説明するために、これらの刊行物及び特許の開示の全体が本願に編入される。
【０１７８】
本発明は、例証の方式で記載されており、使用される用語は、限定するよりも単語の説明を意図するのが道理であると理解される。
【０１７９】
自明なことに、上記の観点から本発明の多くの改変及び変更が可能である。したがって、添付の特許請求の範囲内で、特に説明したのと別の方法で実施できると理解される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の高コレステロール血症を処置する方法であって、
有効量の微生物発酵生成物を投与する、及び
リポタンパク質代謝に関わる遺伝子を制御する、
ステップを含む前記方法。
【請求項２】
患者のコレステロールレベルを制御する方法であって、
ＰＡＺ、ＰＡＺから単離された特異的成分、及びＰＡＺ成分の化学合成類似体からなる群から選ばれる有効量の組成物を投与する、並びに、
リポタンパク質代謝に関わる遺伝子の発現を制御する、
ステップを含む前記方法。
【請求項３】
前記組成物が液状の経口サプリメントである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物が機能性食品である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物が食品添加物である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記投与ステップが、前記組成物を毎日投与することとしてさらに規定される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記制御ステップが、総血漿コレステロール（ＴＣ）レベルを下げ、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レベルを下げ、及び高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）レベルを上げることとしてさらに規定される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記制御ステップが、ＡＢＣＡ１、ＡｐｏＡ１及びＳＲ−Ｂ１をエンコードする少なくとも一種の遺伝子の発現を上方制御することとしてさらに規定される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
さらに、ＣＥＴＰをエンコードする遺伝子を下方制御するステップを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
さらに、行われている上方制御及び下方制御ステップを確認するためのアッセイを行うステップを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
個体の高コレステロールを処置する方法であって、
有効量の微生物発酵生成物を投与する、
ＡＢＣＡ１、ＡｐｏＡ１及びＳＲ−Ｂ１をエンコードする少なくとも一種の遺伝子の発現を上方制御する、及び
ＣＥＴＰをエンコードする遺伝子を下方制御する、
ステップを含む前記方法。
【請求項１２】
前記微生物発酵生成物が、ＰＡＺ、ＰＡＺから単離された特異的成分、及びＰＡＺ成分の化学合成類似体からなる群から選ばれる組成物からなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記微生物発酵生成物が、液状の経口サプリメントである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
さらに、行われている上方制御及び下方制御ステップを確認するためのアッセイを行うステップを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
高コレステロールの発症を防止する方法であって、
ＰＡＺ、ＰＡＺから単離された特異的成分、及びＰＡＺ成分の化学合成類似体からなる群から選ばれる有効量の組成物を投与する、
リポタンパク質代謝に関わる遺伝子を制御する、及び
高コレステロールの発症を防止する、
ステップを含む前記方法。
【請求項１６】
前記組成物が、液状の経口サプリメントである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物が、機能性食品である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物が、食品添加物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物が、毎日投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記制御ステップが、ＡＢＣＡ１、ＡｐｏＡ１及びＳＲ−Ｂ１をエンコードする少なくとも一種の遺伝子の発現を上方制御することとしてさらに規定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
さらに、ＣＥＴＰをエンコードする遺伝子を下方制御するステップを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１】
患者の高コレステロール血症を処置する方法であって、
有効量の微生物発酵生成物を投与する、及び
リポタンパク質代謝に関わる遺伝子を制御する、
ステップを含む前記方法。
【請求項２】
患者のコレステロールレベルを制御する方法であって、
ＰＡＺ、ＰＡＺから単離された特異的成分、及びＰＡＺ成分の化学合成類似体からなる群から選ばれる有効量の組成物を投与する、並びに、
リポタンパク質代謝に関わる遺伝子の発現を制御する、
ステップを含む前記方法。
【請求項３】
前記組成物が液状の経口サプリメントである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物が機能性食品である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物が食品添加物である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記投与ステップが、前記組成物を毎日投与することとしてさらに規定される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記制御ステップが、総血漿コレステロール（ＴＣ）レベルを下げ、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レベルを下げ、及び高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）レベルを上げることとしてさらに規定される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記制御ステップが、ＡＢＣＡ１、ＡｐｏＡ１及びＳＲ−Ｂ１をエンコードする少なくとも一種の遺伝子の発現を上方制御することとしてさらに規定される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
さらに、ＣＥＴＰをエンコードする遺伝子を下方制御するステップを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
さらに、行われている上方制御及び下方制御ステップを確認するためのアッセイを行うステップを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
個体の高コレステロールを処置する方法であって、
有効量の微生物発酵生成物を投与する、
ＡＢＣＡ１、ＡｐｏＡ１及びＳＲ−Ｂ１をエンコードする少なくとも一種の遺伝子の発現を上方制御する、及び
ＣＥＴＰをエンコードする遺伝子を下方制御する、
ステップを含む前記方法。
【請求項１２】
前記微生物発酵生成物が、ＰＡＺ、ＰＡＺから単離された特異的成分、及びＰＡＺ成分の化学合成類似体からなる群から選ばれる組成物からなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記微生物発酵生成物が、液状の経口サプリメントである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
さらに、行われている上方制御及び下方制御ステップを確認するためのアッセイを行うステップを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
高コレステロールの発症を防止する方法であって、
ＰＡＺ、ＰＡＺから単離された特異的成分、及びＰＡＺ成分の化学合成類似体からなる群から選ばれる有効量の組成物を投与する、
リポタンパク質代謝に関わる遺伝子を制御する、及び
高コレステロールの発症を防止する、
ステップを含む前記方法。
【請求項１６】
前記組成物が、液状の経口サプリメントである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物が、機能性食品である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物が、食品添加物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物が、毎日投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記制御ステップが、ＡＢＣＡ１、ＡｐｏＡ１及びＳＲ−Ｂ１をエンコードする少なくとも一種の遺伝子の発現を上方制御することとしてさらに規定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
さらに、ＣＥＴＰをエンコードする遺伝子を下方制御するステップを含む、請求項１６に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【公表番号】特表２０１３−５２０４４４（Ｐ２０１３−５２０４４４Ａ）
【公表日】平成２５年６月６日（２０１３．６．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５４０９１（Ｐ２０１２−５５４０９１）
【出願日】平成２３年２月２２日（２０１１．２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２５７１３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０３５６９
【国際公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【出願人】（５１２２１６９４２）ヘルス エンハンスメント プロダクツ インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年６月６日（２０１３．６．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月２２日（２０１１．２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２５７１３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０３５６９
【国際公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【出願人】（５１２２１６９４２）ヘルス エンハンスメント プロダクツ インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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