高光学純度Ｌ−乳酸の製造方法
【課題】生物学的手法を用いた高光学純度Ｌ−乳酸の生産であって、乳酸溶液中のＤ−乳酸を選択的あるいは優先的に資化する菌によって簡便で効率的な高光学純度Ｌ−乳酸の製造方法を提供することにある。
【解決手段】Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸を含む乳酸溶液でＤ−乳酸資化性菌を培養し、該乳酸溶液中のＤ−乳酸を資化させる事によってＬ−乳酸の光学純度を高めるＤ−乳酸除去工程を有することを特徴とする高光学純度Ｌ−乳酸の製造方法によって解決する。
【解決手段】Ｄ−乳酸及びＬ−乳酸を含む乳酸溶液でＤ−乳酸資化性菌を培養し、該乳酸溶液中のＤ−乳酸を資化させる事によってＬ−乳酸の光学純度を高めるＤ−乳酸除去工程を有することを特徴とする高光学純度Ｌ−乳酸の製造方法によって解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いた高光学純度Ｌ−乳酸の製造方法に関し、詳しくは、Ｌ−乳酸及びＤ−乳酸を含む溶液からＤ−乳酸資化性菌によってＤ−乳酸を除去する高光学純度Ｌ−乳酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、化石資源の枯渇への危惧や地球環境保全の観点から、バイオマスを原料として生産が可能なバイオプラスチックに対する関心が高まっており、中でもポリ乳酸系バイオプラスチックが注目されている。
【０００３】
ポリ乳酸のモノマーである乳酸は、光学活性が異なるＬ−乳酸とＤ−乳酸の２つのエナンチオマーが存在する。どちらかのエナンチオマーのみ、すなわち、Ｌ−乳酸又はＤ−乳酸のみを原料としてポリ乳酸を合成した場合、ラセミ体であるＤＬ−乳酸を原料とした場合と比べて、結晶性や延伸性、耐熱性、成型加工性等が優れたポリマーができることはよく知られている。なお、Ｌ−乳酸で合成したポリ乳酸は、ポリ−Ｌ−乳酸といい、Ｄ−乳酸で合成した場合は、ポリ−Ｄ−乳酸という。
【０００４】
ポリ−Ｌ−乳酸又はポリ−Ｄ−乳酸を合成する場合、その原料モノマーであるＬ−乳酸又はＤ−乳酸の光学純度がポリ乳酸の重合度やガラス転移点に大きく影響する。さらに、原料モノマーへの他方のエナンチオマーの混入が合成されたポリ乳酸の融点を下げることも知られている。そのため、バイオプラスチック素材としてポリ乳酸を使用するためには、ポリ乳酸製造のための原料乳酸の光学純度を高める必要がある。
【０００５】
一般的な乳酸の生産方法は、合成法及び発酵法の２つが知られている。合成法では、アセトアルデヒドに青酸を作用させ、生成したシアンヒドリンを加水分解して乳酸を合成する場合と、アセトアルデヒドと一酸化炭素とを高圧下で反応させて合成する場合が知られている。一方、発酵法では、ショ糖、ブドウ糖、デンプン、ジャガイモ等のバイオマス原料を乳酸生産菌によって発酵させて得た発酵液を精製することで乳酸を生産する。
【０００６】
合成法によって合成された乳酸の光学純度は、Ｌ−乳酸：Ｄ−乳酸比が１：１のラセミ体となる。
【０００７】
一方、発酵法においては、発酵に用いる微生物を選択することによってＬ−乳酸又はＤ−乳酸の光学純度を高めることができる。例えば、Ｌ−乳酸生産菌を用いることによって、比較的光学純度の高いＬ−乳酸を生産することができる。
【０００８】
例えば、特開平９−１２１８４４号公報には、高光学純度のＬ−乳酸を生産する新規バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．ＳＨＯ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１５２３４）を培養し、この培養物から光学純度９５％以上のＬ−乳酸を採取することが開示されている（特許文献１）。また、特開２００６−３３３８４７号公報には、耐熱性微生物Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓＴＹ７を好熱性Ｌ乳酸生産菌とし、これを用い、糖質とその他の栄養成分を高く含有するバイオマス原料を、５０〜６０℃、ｐＨ５．８〜６．５において殺菌することなく直接培養基として発酵するＬ−乳酸液製造方法が開示されている（特許文献２）。さらに、ラクトバチルス マニホチボランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｖｏｒａｎｓ）ＬＭＧ１８０１１株を用い、可溶性デンプンと残飯を原料とした直接発酵による光学純度９９．２％のＬ−乳酸の生産が報告されている（非特許文献１）。
【０００９】
ところで、Ｌ−乳酸及びＤ−乳酸のように光学活性の異なる物質を分割する方法には、（１）ラセミ体にキラル化合物（光学分割剤）を作用させてジアステレオマーを形成させ、ジアステレオマー間の物理的な性質、例えば溶解度などの差異を利用して、それぞれのジアステレオマーを分別結晶化した後、得られた単一のジアステレオマーから光学分割剤を取り除くことで目的のエナンチオマーを得る結晶化による光学分割法、（２）不斉要素をもつ固定相を用いたカラムクロマトグラフィーによって、その保持時間の差異を利用して分割する光学分割法、（３）酵素の高い不斉識別能によって一方のエナンチオマーを選択的に反応させる酵素法の３つが知られている。さらに、結晶化による光学分割方法には、優先晶出法、ジアステレオマー法、包接錯体法、優先富化法がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平９−１２１８４４号公報
【特許文献２】特開２００６−３３３８４７号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｏｈｋｏｕｃｈｉ Ｙ． ａｎｄ Ｉｎｏｕｅ Ｙ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２００６，９７（１３），ｐ．１５５４−１５６２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
合成法によって合成された乳酸の光学純度は、上記のようにＬ−乳酸：Ｄ−乳酸比が１：１のラセミ体となるため、Ｌ−乳酸を高光学純度で製造することができないという問題がある。
【００１３】
乳酸菌を用いた発酵法で生産されるＬ−乳酸の光学純度は、高いもので９７〜９８％程度であり、バイオプラスチックに利用する際、数パーセント含まれる光学異性体の存在が、ポリ乳酸の結晶性や融点の低下とそれに伴うバイオプラスチック強度の低下や生産効率の悪化の一因となっている。
【００１４】
また、遺伝子工学的手法による高光学純度乳酸生産菌の育種などに関する検討も現在進められているが、組み換え菌においても、その培養を繰り返すことで遺伝情報の欠落やそれに伴う形質の変化が生じることや、遺伝子組換え体の取り扱いが非常に難しいことなどの問題がある。
【００１５】
さらに、物理化学的な光学分割法により、ＤＬ−混合乳酸から多量の高光学純度乳酸を製造することは必ずしも容易ではなく、コストも問題も発生する。
【００１６】
従って、本発明の目的は、生物学的手法を用いた簡便な高光学純度Ｌ−乳酸の生産であって、乳酸溶液中のＤ−乳酸を選択的あるいは優先的に資化する菌によって、簡便、効率的かつ低コストで高光学純度Ｌ−乳酸の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記課題を解決するため、本発明は、Ｌ−乳酸及びＤ−乳酸を含む乳酸溶液を調製する乳酸溶液調製工程と、該乳酸溶液中でＤ−乳酸資化性菌を培養し、該乳酸溶液中のＤ−乳酸を資化させることによってＬ−乳酸の光学純度を高めるＤ−乳酸除去工程と、を有する高光学純度Ｌ−乳酸の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係る高光学純度Ｌ−乳酸の製造方法によれば、Ｄ−乳酸を優先的に資化する能力が高いＤ−乳酸資化性菌を使用し、Ｌ−乳酸及びＤ−乳酸を含む乳酸溶液中のＤ−乳酸をこのＤ−乳酸資化性菌によって資化させることで、簡便、効率的かつ低コストでＤ−乳酸を除去し、高光学純度のＬ−乳酸を製造することが可能となる。また、所定の条件によって、光学純度が９８％以上のＬ−乳酸を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株の顕微鏡写真である。
【図２】Ｌ−乳酸発酵液から調製した発酵乳酸培地を用いたＤ−乳酸資化性菌のＤ−乳酸及びＬ−乳酸の選択的資化性を示す図である。
【図３】各種培養温度におけるＤＬ−乳酸を含むＬＹＰ培地でのゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株の増殖の様相を示す図である。
【図４】各種培養温度におけるＤＬ−乳酸を含むＬＹＰ培地でのゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株のＤ−乳酸及びＬ−乳酸の選択的資化性を示す図である。
【図５】異なる初発ｐＨのＤＬ−乳酸を含むＬＹＰ培地でのゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株の増殖を示す図である。
【図６】異なる初発ｐＨのＤＬ−乳酸を含むＬＹＰ培地でのゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株のＤ−乳酸及びＬ−乳酸の選択的資化性を示す図である。
【図７】異なる窒素源とＤＬ−乳酸を含むＬＹＰ培地でのゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株のＤ−乳酸及びＬ−乳酸の選択的資化性を示す図である。
【図８】異なるＤＬ乳酸比の乳酸を含むＬＹＰ培地でのゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株のＤ−乳酸及びＬ−乳酸の選択的資化性を示す図である。
【図９】異なる初発菌体濃度におけるＬ−乳酸発酵液から調製した発酵乳酸培地を用いたＤ−乳酸資化性菌のＤ−乳酸及びＬ−乳酸の選択的資化性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の高光学純度乳酸の製造方法は、Ｌ−乳酸及びＤ−乳酸を含む乳酸溶液を含む乳酸溶液を調製する乳酸溶液調製工程と、該乳酸溶液中でＤ−乳酸資化性菌を培養し、該乳酸溶液中のＤ−乳酸を資化させることによってＬ−乳酸の光学純度を高めるＤ−乳酸除去工程を有する。
【００２１】
本実施形態で使用されるＬ−乳酸及びＤ−乳酸を含む乳酸溶液は、公知の方法によって合成された合成乳酸又はショ糖、ブドウ糖、デンプン、ジャガイモなどを原料として乳酸生産菌による乳酸発酵によって生成された発酵乳酸を用いることができる。光学純度の高いＬ−乳酸を高い収量で生産する観点からは、乳酸溶液は、Ｌ−乳酸生産菌による乳酸発酵で生産された乳酸であることが好ましい。
【００２２】
本実施形態で使用されるＬ−乳酸生産菌としては、Ｄ−乳酸よりもＬ−乳酸を多く生成する乳酸菌であればよく、例えば、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物を挙げることができる。
【００２３】
前記Ｌ−乳酸生産菌を培養するための条件として、使用培地は、乳酸菌が増殖し、Ｌ−乳酸を生産するためのものであればよく、乳酸菌の培養に一般的に用いられる様々な液体培地を用いることができる。好適な培地としては、ＧＹＰ培地、ＭＲＳ培地などを挙げることができる。また、培養温度は、１５〜５０℃の範囲で適宜決定することできるが、乳酸菌の培養至適温度を考慮すると２５〜４５℃に設定することが好ましい。乳酸発酵は嫌気的条件下で行われるため、静置培養又は嫌気的条件下での撹拌培養若しくはこれらの組み合わせで培養することが好ましい。
【００２４】
本実施形態におけるＤ−乳酸除去工程は、Ｌ−乳酸及びＤ−乳酸を含む乳酸溶液からＤ−乳酸資化性菌によってＤ−乳酸を除去することにより、乳酸溶液中のＬ−乳酸の光学純度を高める工程である。
【００２５】
上述のように、Ｌ−乳酸生産菌で乳酸発酵を実施した場合であっても、実際のＬ−乳酸の光学純度は高いもので９７〜９８％程度であり、Ｄ−乳酸が数％混在している。そのため、１００％に近い光学純度が要求されるバイオプラスチック製造においては、数パーセント含まれるＤ−乳酸の存在が、ポリ乳酸の結晶性や融点の低下とそれに伴うバイオプラスチック強度の低下や生産効率の悪化の一因となっている。従って、本実施形態の高光学純度乳酸の製造方法においては、Ｄ−乳酸を特異的に資化し、Ｌ−乳酸を資化しない又はＬ−乳酸資化能の低いＤ−乳酸資化性菌を選択することが重要となる。
【００２６】
本実施形態に使用されるＤ−乳酸資化性菌は、ゲオトリクム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属に属する酵母であることが好ましく、Ｄ−乳酸資化性の観点から、ゲオトリクム ブルガレ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、ゲオトリクム ブリンゼ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｂｒｙｎｄｚａｅ）又はゲオトリクム シルビコラ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｉｌｖｉｃｏｌａ）であることがより好ましく、その中でもゲオトリクム ブルガレ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）と同種又は近縁種であるゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５株（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ１２２３）がＤ−乳酸の選択的資化能及び前記乳酸溶液からのＬ−乳酸生産収量の観点から特に好ましい。
【００２７】
前記Ｄ−乳酸除去工程の条件は適宜設定し得るが、乳酸溶液中のＬ−乳酸の光学純度を向上させる観点から、温度３０℃、初発ｐＨ３．０〜３．８で振とう培養（１２０ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ／ｍｉｎ）することが好ましい。
【００２８】
前記Ｄ−乳酸除去工程における乳酸溶液のＤＬ−乳酸量の比率は、特に制限はなく、例えば、乳酸溶液中のＤ−乳酸量が総乳酸量に対して５０％以下の乳酸溶液を用いることができる。
【００２９】
前記Ｄ−乳酸除去工程において、前記Ｄ−乳酸資化性菌を固定化した固定化Ｄ−乳酸資化性菌を添加することによって実施することもできる。
【００３０】
前記Ｄ−乳酸資化性菌を固定化する方法としては、担体結合法（物理的吸着法、イオン結合法、共有結合法、生化学特異結合法）、架橋法、包括法（格子型、マイクロカプセル型）などの方法を挙げることができる。
【実施例】
【００３１】
１．Ｄ−乳酸資化性菌の検索及び同定
（１）Ｄ−乳酸及び／又はＬ−乳酸資化性菌の分離
土壌、樹葉など６０種の試料を分離源として、Ｄ−乳酸及び／又はＬ−乳酸資化性菌の検索を行った。すなわち、常法に従い、ＬＹＰ液体培地を用いた集積培養及びＬＹＰ寒天培地を用いた純粋分離操作を繰り返し行い、乳酸資化性菌８９株を得た。なお、ＬＹＰ培地の組成は、ＤＬ−乳酸（純度８５．０〜９０．０％）（和光純薬株式会社製）２．５％、ペプトン（日本製薬株式会社製）０．２５％、酵母エキス（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）０．２５％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．０４％（ｐＨ３．８）である。
【００３２】
（２）発酵乳酸培地の調製
Ｌ−乳酸生産菌であるラクトバチルス マリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｉ）４３８株をＭＲＳ ｂｒｏｔｈ培地（Ｏｘｏｉｄ社製）５０ｍｌに１白金線接種し、３０℃で２４時間静置培養した。この前培養液３ｍｌと乾熱滅菌（１８０℃、１２０分）した炭酸カルシウム６ｇとをオートクレーブ滅菌（１２１℃、１０分）したＧＹＰ改変培地（グルコース２％、酵母エキス（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）１％、ペプトン（日本製薬株式会社製）０．５％、ＣＨ３ＣＯＯＮａ・３Ｈ２Ｏ ０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００１％、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ ０．００１％、ＮａＣｌ ０．００１％、Ｔｗｅｅｎ８０ ０．０５％）３００ｍｌに添加し、マグネティックスターラーによって液を穏やかに撹拌しながら、３０℃で４８時間培養して乳酸発酵液を調製した。また、この乳酸発酵液を遠心分離（４℃、１００００Ｇ、３０分）して得た上清をｐＨ３．８に調整した後、オートクレーブ滅菌（１２１℃、１０分）を行い、発酵乳酸培地（以下「Ｌ−ＬＡＢ培地」という。）とした。
【００３３】
（３）Ｄ−乳酸資化性菌の選抜
分離したＤ−乳酸及び／又はＬ−乳酸資化性菌８９株からＤ−乳酸を選択的に資化する乳酸菌を選抜することを目的に、Ｄ−乳酸及び／又はＬ−乳酸資化性菌８９株をＹＭ培地を用いてそれぞれ培養し、これら菌株の培養液をＬ−ＬＡＢ培地にそれぞれ添加して３０℃で７２時間振とう培養（１２０ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ／ｍｉｎ）を行った。また、この培養液中に残存するＤ−乳酸及びＬ−乳酸の濃度を以下の方法によって定量し、Ｄ−乳酸及び／又はＬ−乳酸資化性菌８９株のＤ−乳酸資化特性を評価した。
【００３４】
Ｌ−乳酸及びＤ−乳酸の分別定量は、酵素法（ＤＬ−乳酸測定用Ｆキット：ロシュ・ダイアグノスティックス社製）によって行った。なお、ＤＬ−乳酸の分別定量に供する培養液試料の調製は、以下の通りである。すなわち、マイクロチューブに、培養液の遠心分離（４℃、１２０００ｒｐｍ、１０分）上清を入れてキャップをロックした後、８０〜９０℃の温浴中で１５分間加温することにより、培養液中に含まれる各種酵素を失活させた。これを水浴中で冷却した後、遠心分離（４℃、１２０００ｒｐｍ、１０分）し、回収した上清を定量試験に用いた。また、対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）には試料液の代わりに同量の蒸留水を用いた。
【００３５】
その結果、培養液中のＤ−乳酸をＬ−乳酸よりも選択的に消費してＬ−乳酸の光学純度を向上させる菌株として、ＬＡＡＭ０１８株、ＬＡＡＭ０２９株、ＬＡＡＭ０４２株、ＬＡＡＭ０５０株、ＬＡＡＭ０５５株及びＬＡＡＭ０６５株の計６株を選抜した（図２）。
【００３６】
図２に示したように、ＬＡＡＭ０５０株は、培養終了後の培養液中のＤ−乳酸とＬ−乳酸の比がＤ−乳酸：Ｌ−乳酸＝０．５７：９９．４３と、Ｄ−乳酸を優先的に資化し、最もＬ−乳酸の光学純度が高かった。しかしながら、他の５菌株と比べて培養液中に残存したＬ−乳酸量が最も低く、初発Ｌ−乳酸量に対するＬ−乳酸残存率は４８．９％であった。
【００３７】
一方、ＬＡＡＭ０５５株は、培養終了後の培養液中のＤ−乳酸とＬ−乳酸の比がＤ−乳酸：Ｌ−乳酸＝０．８６：９９．１４と、Ｄ−乳酸を優先的に資化し、Ｌ−乳酸の光学純度が高かった。また、初発Ｌ−乳酸量に対するＬ−乳酸残存率は約７８％と、高光学純度Ｌ−乳酸を最も高い収率で得ることができた。
【００３８】
（４）Ｄ−乳酸資化性菌の同定
上記で選抜したＤ−乳酸資化性菌６株のうち、ＬＡＡＭ０５５株、ＬＡＡＭ０１８株及びＬＡＡＭ０６５株について、形態観察、炭素源資化性試験、２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列の解析を行い、これら菌の同定を行った。
【００３９】
ＬＡＡＭ０５５株は、白色で粉状〜白亜状のコロニーを形成し、コロニーの周縁部は乱糸状であった。また、顕微鏡観察を行ったところ、出芽した細胞は確認されず、隔壁のある菌糸および分節型分生子が認められ、有性生殖器官の形成は認められなかった（図１）。
【００４０】
また、ＬＡＡＭ０５５株の糖の発酵性、イノシトール資化性及び硝酸塩資化性がゲオトリクム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）
属の性質と一致していた（表１及び表２）。
【００４１】
【表１】
【００４２】
【表２】
【００４３】
さらに、ＬＡＡＭ０５５株の２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列を調べたところ、本菌株の２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列は、子のう菌系アナモルフ酵母の一種であるゲオトリクム ブルガレ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）の基準株であるゲオトリクム ブルガレ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）ＣＢＳ１００７３Ｔに対して９９．６％の相同率を示した。このように、ＬＡＡＭ０５５株は、ゲオトリクム ブルガレ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）と同種又は近縁種であることが明らかとなった。
【００４４】
一方、ＬＡＡＭ０１８株及びＬＡＡＭ０６５株についても同様に調べた結果、ＬＡＡＭ０１８株及びＬＡＡＭ０６５株とも、ＬＡＡＭ０５５株と同様、白色で粉状〜白亜状のコロニーを形成し、コロニーの周縁部は乱糸状であった。また、顕微鏡観察を行ったところ、出芽した細胞は確認されず、隔壁のある菌糸および分節型分生子が認められ、有性生殖器官の形成は認められなかった。
【００４５】
また、ＬＡＡＭ０１８株及びＬＡＡＭ０６５株の２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列は、子のう菌系アナモルフ酵母の一種であるゲオトリクム ブリンゼ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｂｒｙｎｄｚａｅ）の基準株であるゲオトリクム ブリンゼ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｂｒｙｎｄｚａｅ）ＮＲＲＬ Ｙ−２７６４１Ｔ及びゲオトリクム シルビコラ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｉｌｖｉｃｏｌａ）の基準株であるゲオトリクム シルビコラ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｉｌｖｉｃｏｌａ）ＣＢＳ９１９４Ｔに対してともに９９．４％の相同性を示した。このように、ＬＡＡＭ０１８株及びＬＡＡＭ０６５株は、ゲオトリクム ブリンゼ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｂｒｙｎｄｚａｅ）又はゲオトリクム シルビコラ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｉｌｖｉｃｏｌａ）と同種又は近縁種であることを明らかにした。
【００４６】
さらに、ＬＡＡＭ０５５株、ＬＡＡＭ０１８及びＬＡＡＭ０６５株の２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列について、マルチプルアライメントを行い、相互の遺伝学的関連性を調べた。その結果、ＬＡＡＭ０１８とＬＡＡＭ０６５株とは、解読した５４５塩基のすべての配列が一致していた。一方、ＬＡＡＭ０５５株の塩基配列をこれら２株の塩基配列と比較したところ、５４５塩基のうち１５塩基が異なっていた。このため、ＬＡＡＭ０５５株は、ＬＡＡＭ０１８及びＬＡＡＭ０６５株と系統的にやや距離を有することが明らかとなった。
【００４７】
以上の結果から、高光学純度Ｌ−乳酸を多量に調製するためのＤ−乳酸資化性菌として、分離菌ゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５株（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）を用いることとした。
【００４８】
２．ゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５の培養特性
（１）培養温度の検討
ゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株の培養温度条件を検討した。すなわち、本菌株をＹＭ培地を用いて３０℃で２４時間振とう培養（１２０ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ／ｍｉｎ）した（前培養）。この前培養液をＬＹＰ培地に１％（ｖ／ｖ）添加して、２５℃、３０℃、３５℃又は４０℃で７２時間振とう培養（１２０ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ／ｍｉｎ）を行った（本培養）。また、本培養液中の菌体濃度、ｐＨ及びＤＬ−乳酸量を経時的に測定した。なお、菌体濃度は、波長６６０ｎｍにおける培養液の濁度（ＯＤ６６０ｎｍ）として示した。また、ｐＨは、ｐＨメーターを用いて測定した。さらに、ＤＬ−乳酸量は、上記１．（３）と同様に酵素法によって分別定量した。これらの結果を図３及び４に示した。
【００４９】
図３に示したように、培養温度が２５又は３０℃の場合では菌体の増殖が認められたが、培養温度が３５℃以上では菌体の増殖が認められなかった。一方、本菌株の乳酸資化について、培養温度３０℃の場合に最も乳酸資化速度が高かった。また、培養開始７２時間後の培養液中のＤＬ−乳酸濃度は１１．１６ｇ／ｌであり、初発ＤＬ−乳酸濃度２５．４６ｇ／ｌの約５５％が資化された。さらに、図４に示したように、培養温度３０℃における培養７２時間後の培養液中に残存するＤＬ−乳酸比は、Ｄ−乳酸：Ｌ−乳酸＝６．９１：９３．０９であった。
【００５０】
他方、培養温度２５℃の場合では菌体濃度が最も高い値を示したが、培養温度３０℃の場合と比べて、乳酸資化速度及び乳酸資化量は低い値を示した（図３）。また、培養温度２５℃における培養開始７２時間後の培養液中のＤＬ−乳酸比は、Ｄ−乳酸：Ｌ−乳酸＝２８．４３：７１．５７であった（図４）。このように、Ｌ−乳酸の光学純度を向上させるためには、本菌株の培養温度を３０℃程度とすることが有効であることが分かった。
【００５１】
（２）初発ｐＨの検討
ゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株の培養時における培地の初発ｐＨについて検討した。すなわち、本菌株をＹＭ培地を用いて３０℃で２４時間振とう培養（１２０ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ／ｍｉｎ）した（前培養）。この前培養液を６ｍｏｌ／ｌのＨＣｌ又は６ｍｏｌ／ｌのＮａＯＨによって初発ｐＨを２．６〜７．０に調整したＬＹＰ培地に１％（ｖ／ｖ）添加して、３０℃で７２時間振とう培養（１２０ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ／ｍｉｎ）を行った（本培養）。また、培養７２時間後の本培養液中の菌体濃度、ｐＨ及びＤＬ−乳酸量を測定した。なお、菌体濃度及びｐＨは上記２．（１）と同様に測定し、ＤＬ−乳酸は、上記１．（３）と同様に酵素法によって分別定量した。これら結果を図５及び６に示した。
【００５２】
図５に示したように、培地の初発ｐＨが３．０〜７．０の範囲で本菌株の増殖が認められた。また、培養７２時間後の菌体濃度について、初発ｐＨが５．４の場合、菌体濃度（ＯＤ６６０ｎｍ値）が５．５９と最も高い値を示した。一方、初発ｐＨが３．０又は３．８の場合、菌体濃度（ＯＤ６６０ｎｍ値）が２．６３〜３．５２と、初発ｐＨ４．６以上で培養した場合と比べて低い値を示した。
【００５３】
他方、図６に示したように、初発ｐＨが３．０又は３．８で培養した場合、培養液中のＤ−乳酸がそれぞれ０．４２ｇ／ｌ又は０．７７ｇ／ｌと、初発ｐＨ４．６以上で培養した場合の３．７４ｇ／ｌ〜４．９２ｇ／ｌと比べては低い値を示した。一方、Ｌ−乳酸は、初発ｐＨが３．０では１０．３５ｇ／ｌ、初発ｐＨが３．８では１０．３９ｇ／ｌと、初発ｐＨ４．６以上で培養した場合の１０．８０ｇ／ｌ〜１１．０５ｇ／ｌとほぼ同様の値であった。このように、培地の初発ｐＨを３．０〜３．８で本菌株を培養すると培地中のＤ−乳酸が優先的に資化され、培養液中のＬ−乳酸の光学純度が向上することが分かった。
【００５４】
（３）窒素源の検討
ゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株の培養時における培地の窒素源として添加する素材の種類について検討を行った。すなわち、本菌株をＹＭ培地を用いて３０℃で２４時間振とう培養（１２０ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ／ｍｉｎ）した（前培養）。この前培養液を各種窒素源としたＬＹＰ培地に１％（ｖ／ｖ）添加して、３０℃で７２時間振とう培養（１２０ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ／ｍｉｎ）を行った（本培養）。
【００５５】
なお、窒素源は、０．２５％ペプトン及び０．２５％酵母エキス（条件Ｉ）、０．４％ペプトン及び０．１％酵母エキス（条件ＩＩ）、０．４％肉エキス及び０．１％酵母エキス（条件ＩＩＩ）、０．４％硫酸アンモニウム及び０．１％酵母エキス（条件ＩＶ）、０．４％尿素及び０．１％酵母エキス（条件Ｖ）、０．４％硝酸ナトリウム及び０．１％酵母エキス（条件ＶＩ）又は０．４％リン酸水素二アンモニウム及び０．１％酵母エキス（条件ＶＩＩ）とした。
【００５６】
また、培養７２時間後の本培養液中のＤＬ−乳酸量を測定した。なお、ＤＬ−乳酸は、上記１．（３）と同様に酵素法によって分別定量した。この結果を図７に示した。
【００５７】
図７に示したように、すべての場合においてＤ−乳酸は資化され、培地中のＬ−乳酸の光学純度は向上したが、窒素源を０．２５％ペプトン及び０．２５％酵母エキスとした場合（条件Ｉ）が最もＤ−乳酸が資化され、Ｌ−乳酸の光学純度が向上した。このように、Ｌ−乳酸の光学純度を向上させるためには、培地の窒素源を０．２５％ペプトン及び０．２５％酵母エキスとすることが有効であることが分かった。
【００５８】
（４）乳酸のＤＬ比の検討
ゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株の培養時における培地の初発乳酸のＤＬ比について検討を行った。すなわち、本菌株をＹＭ培地を用いて３０℃で２４時間振とう培養（１２０ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ／ｍｉｎ）した（前培養）。この前培養液を初発乳酸のＤＬ比をＤ−乳酸：Ｌ−乳酸＝１：１、２：８又は１：９としたＬＹＰ培地（乳酸濃度２．５％）に１％（ｖ／ｖ）添加して、３０℃で７２時間振とう培養（１２０ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ／ｍｉｎ）を行った（本培養）。また、培養７２時間後の本培養液中のＤＬ−乳酸量を測定した。なお、ＤＬ−乳酸量は、上記１．（３）と同様に酵素法によって分別定量した。この結果を図８に示した。
【００５９】
図８に示したように、すべての場合でＬ−乳酸の光学純度は向上しており、培地中の初発乳酸のＤＬ比がＤ−乳酸：Ｌ−乳酸＝１：９（初発Ｌ−乳酸の光学純度９０％）の場合、培養７２時間後の培養液中のＬ−乳酸の光学純度が９９．７％と最もＬ−乳酸の光学純度が高かった。一方、Ｄ−乳酸：Ｌ−乳酸＝２：８（初発Ｌ−乳酸の光学純度８０％）の場合ではＬ−乳酸の光学純度が９４．８％であり、Ｄ−乳酸：Ｌ−乳酸＝１：１の場合（初発Ｌ−乳酸の光学純度５０％）ではＬ−乳酸の光学純度が９６．１％であった。
【００６０】
３．乳酸発酵液からの高光学純度Ｌ−乳酸の生産
Ｌ−乳酸生産菌を乳酸発酵させて得た乳酸発酵液から調製した発酵乳酸培地を用いて、ゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株による高光学純度のＬ−乳酸生産について検討した。
【００６１】
（１）Ｄ−乳酸資化菌の添加量
まず始めに、Ｌ−乳酸生産菌であるラクトバチルス マリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｉ）４３８株の乳酸発酵液を用いて調製した発酵乳酸培地（Ｌ−ＬＡＢ培地）に添加するゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株の菌体濃度について検討した。
【００６２】
すなわち、初発グルコース濃度を２．０％としたＧＹＰ改変培地でラクトバチルス マリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｉ）４３８株を培養することで乳酸発酵液を調製した。この乳酸発酵液を用いて上記１．（２）と同様に調製した発酵乳酸培地（Ｌ−ＬＡＢ培地）（ｐＨ３．０）にゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株を初発菌体濃度（ＯＤ６６０ｎｍ値）が０．０９３（条件Ｉ）、１．６００（条件ＩＩ）又は１６．３００（条件ＩＩＩ）となるように添加して、３０℃で７２時間振とう培養（１２０ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ／ｍｉｎ）を行った。また、培養液中のＤＬ−乳酸量を経時的に測定した。なお、ＤＬ−乳酸量は、上記１．（３）と同様に酵素法によって分別定量した。この結果を図９に示した。
【００６３】
図９に示したように、すべての場合において、培養７２時間後の培養液中のＬ−乳酸の光学純度が高くなっており、菌体濃度（ＯＤ６６０ｎｍ値）が１６．３００の場合（条件ＩＶ）にＬ−乳酸の光学純度が９８．３６％、Ｌ−乳酸収率が８０．２２％と最も高い値を示した。
【００６４】
（２）乳酸発酵液からの高光学純度Ｌ−乳酸の生産
上記３．（１）の結果から、乳酸発酵用ＧＹＰ改変培地の初発グルコース濃度を２．０％とし、ゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株の菌体添加量を初発菌体濃度（ＯＤ６６０ｎｍ値）約１６として、発酵乳酸培地（Ｌ−ＬＡＢ培地）からの高光学純度Ｌ−乳酸生産の様相を調べた。
【００６５】
すなわち、初発グルコース濃度を２．０％としたＧＹＰ改変培地でラクトバチルス マリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｉ）４３８株を培養することで乳酸発酵液を調製した。この乳酸発酵液を用いて調製した発酵乳酸培地（Ｌ−ＬＡＢ培地）（ｐＨ３．０）にゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株を初発菌体濃度（ＯＤ６６０ｎｍ値）が約１６となるように添加して、３０℃で７２時間振とう培養（１２０ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ／ｍｉｎ）を行った。また、培養液中のＤＬ−乳酸量を経時的に測定した。なお、ＤＬ−乳酸量は、上記１．（３）と同様に酵素法によって分別定量した。この結果を表３に示した。
【００６６】
【表３】
【００６７】
表３に示したように、培養１４４時間後に培養液中のＬ−乳酸の光学純度が９９．８７％以上のＬ−乳酸が５．７０ｇ／ｌ生成され、高光学純度のＬ−乳酸を得ることができた。
【００６８】
４．固定化菌を用いた高光学純度Ｌ−乳酸の生産
固定化したゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株による発酵乳酸培地（Ｌ−ＬＡＢ培地）からの高光学純度のＬ−乳酸生産について検討した。
【００６９】
（１）固定化菌体の調製
ゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５株（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株をＹＭ培地６００ｍｌを用いて３０℃で２４時間振とう培養（１２０ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ／ｍｉｎ）した。この培養液を遠心分離（５０００Ｇ、３０分）し、回収した菌体をオートクレーブ滅菌した生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ溶液）１５ｍｌ中に懸濁した。この菌体懸濁液１５ｍｌ（ＯＤ６６０ｎｍ＝約１６）と５％アルギン酸ナトリウム溶液１００ｍｌとを混合し、これを５％塩化カルシウム溶液１００ｍｌ中に滴下してゲルビーズを形成させた。この後、マグネティックスターラーで穏やかに撹拌しながら液中で該ゲルビーズを３０分間保持することでゲルを硬化させ、これを固定化菌体とした。なお、調製した固定化菌体ビーズは、殺菌水で２度洗浄した後、以下の実験に供した。
【００７０】
（２）固定化菌体を用いた高光学純度Ｌ−乳酸の生産
上記４．（１）で調製したゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５株の固定化菌体ビーズを初発グルコース濃度を２．０％として調製したＬ−ＬＡＢ（ｐＨ３．０）に投入し、３０℃で７２時間振とう培養（１２０ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ／ｍｉｎ）を行った。また、培養液中のＤＬ−乳酸量を経時的に測定した。なお、ＤＬ−乳酸量は、上記１．（３）と同様に酵素法によって分別定量した。この結果を表４に示した。
【００７１】
【表４】
【００７２】
表４に示したように、培養４８時間後に光学純度が９１．２９％のＬ−乳酸を１２．３ｇ／ｌ（Ｌ−乳酸収率７０．７８％）生成した。また、培養７２時間後の培養液中のＬ−乳酸の光学純度は９４．０９％と、培養４８時間後の培養液と比べてＬ−乳酸の光学純度が向上したが、培養液中のＬ−乳酸が１０．９９ｇ／ｌ（Ｌ−乳酸収率６３．２３％）と乳酸収率が低下した。
【００７３】
以上の結果から、ゲル包括固定化ゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５株を用いてもＬ−ＬＡＢ培地から高光学純度のＬ−乳酸を生成することが可能であることが分かった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いた高光学純度Ｌ−乳酸の製造方法に関し、詳しくは、Ｌ−乳酸及びＤ−乳酸を含む溶液からＤ−乳酸資化性菌によってＤ−乳酸を除去する高光学純度Ｌ−乳酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、化石資源の枯渇への危惧や地球環境保全の観点から、バイオマスを原料として生産が可能なバイオプラスチックに対する関心が高まっており、中でもポリ乳酸系バイオプラスチックが注目されている。
【０００３】
ポリ乳酸のモノマーである乳酸は、光学活性が異なるＬ−乳酸とＤ−乳酸の２つのエナンチオマーが存在する。どちらかのエナンチオマーのみ、すなわち、Ｌ−乳酸又はＤ−乳酸のみを原料としてポリ乳酸を合成した場合、ラセミ体であるＤＬ−乳酸を原料とした場合と比べて、結晶性や延伸性、耐熱性、成型加工性等が優れたポリマーができることはよく知られている。なお、Ｌ−乳酸で合成したポリ乳酸は、ポリ−Ｌ−乳酸といい、Ｄ−乳酸で合成した場合は、ポリ−Ｄ−乳酸という。
【０００４】
ポリ−Ｌ−乳酸又はポリ−Ｄ−乳酸を合成する場合、その原料モノマーであるＬ−乳酸又はＤ−乳酸の光学純度がポリ乳酸の重合度やガラス転移点に大きく影響する。さらに、原料モノマーへの他方のエナンチオマーの混入が合成されたポリ乳酸の融点を下げることも知られている。そのため、バイオプラスチック素材としてポリ乳酸を使用するためには、ポリ乳酸製造のための原料乳酸の光学純度を高める必要がある。
【０００５】
一般的な乳酸の生産方法は、合成法及び発酵法の２つが知られている。合成法では、アセトアルデヒドに青酸を作用させ、生成したシアンヒドリンを加水分解して乳酸を合成する場合と、アセトアルデヒドと一酸化炭素とを高圧下で反応させて合成する場合が知られている。一方、発酵法では、ショ糖、ブドウ糖、デンプン、ジャガイモ等のバイオマス原料を乳酸生産菌によって発酵させて得た発酵液を精製することで乳酸を生産する。
【０００６】
合成法によって合成された乳酸の光学純度は、Ｌ−乳酸：Ｄ−乳酸比が１：１のラセミ体となる。
【０００７】
一方、発酵法においては、発酵に用いる微生物を選択することによってＬ−乳酸又はＤ−乳酸の光学純度を高めることができる。例えば、Ｌ−乳酸生産菌を用いることによって、比較的光学純度の高いＬ−乳酸を生産することができる。
【０００８】
例えば、特開平９−１２１８４４号公報には、高光学純度のＬ−乳酸を生産する新規バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ．ＳＨＯ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１５２３４）を培養し、この培養物から光学純度９５％以上のＬ−乳酸を採取することが開示されている（特許文献１）。また、特開２００６−３３３８４７号公報には、耐熱性微生物Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓＴＹ７を好熱性Ｌ乳酸生産菌とし、これを用い、糖質とその他の栄養成分を高く含有するバイオマス原料を、５０〜６０℃、ｐＨ５．８〜６．５において殺菌することなく直接培養基として発酵するＬ−乳酸液製造方法が開示されている（特許文献２）。さらに、ラクトバチルス マニホチボランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｖｏｒａｎｓ）ＬＭＧ１８０１１株を用い、可溶性デンプンと残飯を原料とした直接発酵による光学純度９９．２％のＬ−乳酸の生産が報告されている（非特許文献１）。
【０００９】
ところで、Ｌ−乳酸及びＤ−乳酸のように光学活性の異なる物質を分割する方法には、（１）ラセミ体にキラル化合物（光学分割剤）を作用させてジアステレオマーを形成させ、ジアステレオマー間の物理的な性質、例えば溶解度などの差異を利用して、それぞれのジアステレオマーを分別結晶化した後、得られた単一のジアステレオマーから光学分割剤を取り除くことで目的のエナンチオマーを得る結晶化による光学分割法、（２）不斉要素をもつ固定相を用いたカラムクロマトグラフィーによって、その保持時間の差異を利用して分割する光学分割法、（３）酵素の高い不斉識別能によって一方のエナンチオマーを選択的に反応させる酵素法の３つが知られている。さらに、結晶化による光学分割方法には、優先晶出法、ジアステレオマー法、包接錯体法、優先富化法がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平９−１２１８４４号公報
【特許文献２】特開２００６−３３３８４７号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｏｈｋｏｕｃｈｉ Ｙ． ａｎｄ Ｉｎｏｕｅ Ｙ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２００６，９７（１３），ｐ．１５５４−１５６２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
合成法によって合成された乳酸の光学純度は、上記のようにＬ−乳酸：Ｄ−乳酸比が１：１のラセミ体となるため、Ｌ−乳酸を高光学純度で製造することができないという問題がある。
【００１３】
乳酸菌を用いた発酵法で生産されるＬ−乳酸の光学純度は、高いもので９７〜９８％程度であり、バイオプラスチックに利用する際、数パーセント含まれる光学異性体の存在が、ポリ乳酸の結晶性や融点の低下とそれに伴うバイオプラスチック強度の低下や生産効率の悪化の一因となっている。
【００１４】
また、遺伝子工学的手法による高光学純度乳酸生産菌の育種などに関する検討も現在進められているが、組み換え菌においても、その培養を繰り返すことで遺伝情報の欠落やそれに伴う形質の変化が生じることや、遺伝子組換え体の取り扱いが非常に難しいことなどの問題がある。
【００１５】
さらに、物理化学的な光学分割法により、ＤＬ−混合乳酸から多量の高光学純度乳酸を製造することは必ずしも容易ではなく、コストも問題も発生する。
【００１６】
従って、本発明の目的は、生物学的手法を用いた簡便な高光学純度Ｌ−乳酸の生産であって、乳酸溶液中のＤ−乳酸を選択的あるいは優先的に資化する菌によって、簡便、効率的かつ低コストで高光学純度Ｌ−乳酸の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記課題を解決するため、本発明は、Ｌ−乳酸及びＤ−乳酸を含む乳酸溶液を調製する乳酸溶液調製工程と、該乳酸溶液中でＤ−乳酸資化性菌を培養し、該乳酸溶液中のＤ−乳酸を資化させることによってＬ−乳酸の光学純度を高めるＤ−乳酸除去工程と、を有する高光学純度Ｌ−乳酸の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係る高光学純度Ｌ−乳酸の製造方法によれば、Ｄ−乳酸を優先的に資化する能力が高いＤ−乳酸資化性菌を使用し、Ｌ−乳酸及びＤ−乳酸を含む乳酸溶液中のＤ−乳酸をこのＤ−乳酸資化性菌によって資化させることで、簡便、効率的かつ低コストでＤ−乳酸を除去し、高光学純度のＬ−乳酸を製造することが可能となる。また、所定の条件によって、光学純度が９８％以上のＬ−乳酸を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株の顕微鏡写真である。
【図２】Ｌ−乳酸発酵液から調製した発酵乳酸培地を用いたＤ−乳酸資化性菌のＤ−乳酸及びＬ−乳酸の選択的資化性を示す図である。
【図３】各種培養温度におけるＤＬ−乳酸を含むＬＹＰ培地でのゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株の増殖の様相を示す図である。
【図４】各種培養温度におけるＤＬ−乳酸を含むＬＹＰ培地でのゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株のＤ−乳酸及びＬ−乳酸の選択的資化性を示す図である。
【図５】異なる初発ｐＨのＤＬ−乳酸を含むＬＹＰ培地でのゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株の増殖を示す図である。
【図６】異なる初発ｐＨのＤＬ−乳酸を含むＬＹＰ培地でのゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株のＤ−乳酸及びＬ−乳酸の選択的資化性を示す図である。
【図７】異なる窒素源とＤＬ−乳酸を含むＬＹＰ培地でのゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株のＤ−乳酸及びＬ−乳酸の選択的資化性を示す図である。
【図８】異なるＤＬ乳酸比の乳酸を含むＬＹＰ培地でのゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株のＤ−乳酸及びＬ−乳酸の選択的資化性を示す図である。
【図９】異なる初発菌体濃度におけるＬ−乳酸発酵液から調製した発酵乳酸培地を用いたＤ−乳酸資化性菌のＤ−乳酸及びＬ−乳酸の選択的資化性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の高光学純度乳酸の製造方法は、Ｌ−乳酸及びＤ−乳酸を含む乳酸溶液を含む乳酸溶液を調製する乳酸溶液調製工程と、該乳酸溶液中でＤ−乳酸資化性菌を培養し、該乳酸溶液中のＤ−乳酸を資化させることによってＬ−乳酸の光学純度を高めるＤ−乳酸除去工程を有する。
【００２１】
本実施形態で使用されるＬ−乳酸及びＤ−乳酸を含む乳酸溶液は、公知の方法によって合成された合成乳酸又はショ糖、ブドウ糖、デンプン、ジャガイモなどを原料として乳酸生産菌による乳酸発酵によって生成された発酵乳酸を用いることができる。光学純度の高いＬ−乳酸を高い収量で生産する観点からは、乳酸溶液は、Ｌ−乳酸生産菌による乳酸発酵で生産された乳酸であることが好ましい。
【００２２】
本実施形態で使用されるＬ−乳酸生産菌としては、Ｄ−乳酸よりもＬ−乳酸を多く生成する乳酸菌であればよく、例えば、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物を挙げることができる。
【００２３】
前記Ｌ−乳酸生産菌を培養するための条件として、使用培地は、乳酸菌が増殖し、Ｌ−乳酸を生産するためのものであればよく、乳酸菌の培養に一般的に用いられる様々な液体培地を用いることができる。好適な培地としては、ＧＹＰ培地、ＭＲＳ培地などを挙げることができる。また、培養温度は、１５〜５０℃の範囲で適宜決定することできるが、乳酸菌の培養至適温度を考慮すると２５〜４５℃に設定することが好ましい。乳酸発酵は嫌気的条件下で行われるため、静置培養又は嫌気的条件下での撹拌培養若しくはこれらの組み合わせで培養することが好ましい。
【００２４】
本実施形態におけるＤ−乳酸除去工程は、Ｌ−乳酸及びＤ−乳酸を含む乳酸溶液からＤ−乳酸資化性菌によってＤ−乳酸を除去することにより、乳酸溶液中のＬ−乳酸の光学純度を高める工程である。
【００２５】
上述のように、Ｌ−乳酸生産菌で乳酸発酵を実施した場合であっても、実際のＬ−乳酸の光学純度は高いもので９７〜９８％程度であり、Ｄ−乳酸が数％混在している。そのため、１００％に近い光学純度が要求されるバイオプラスチック製造においては、数パーセント含まれるＤ−乳酸の存在が、ポリ乳酸の結晶性や融点の低下とそれに伴うバイオプラスチック強度の低下や生産効率の悪化の一因となっている。従って、本実施形態の高光学純度乳酸の製造方法においては、Ｄ−乳酸を特異的に資化し、Ｌ−乳酸を資化しない又はＬ−乳酸資化能の低いＤ−乳酸資化性菌を選択することが重要となる。
【００２６】
本実施形態に使用されるＤ−乳酸資化性菌は、ゲオトリクム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属に属する酵母であることが好ましく、Ｄ−乳酸資化性の観点から、ゲオトリクム ブルガレ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、ゲオトリクム ブリンゼ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｂｒｙｎｄｚａｅ）又はゲオトリクム シルビコラ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｉｌｖｉｃｏｌａ）であることがより好ましく、その中でもゲオトリクム ブルガレ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）と同種又は近縁種であるゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５株（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ１２２３）がＤ−乳酸の選択的資化能及び前記乳酸溶液からのＬ−乳酸生産収量の観点から特に好ましい。
【００２７】
前記Ｄ−乳酸除去工程の条件は適宜設定し得るが、乳酸溶液中のＬ−乳酸の光学純度を向上させる観点から、温度３０℃、初発ｐＨ３．０〜３．８で振とう培養（１２０ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ／ｍｉｎ）することが好ましい。
【００２８】
前記Ｄ−乳酸除去工程における乳酸溶液のＤＬ−乳酸量の比率は、特に制限はなく、例えば、乳酸溶液中のＤ−乳酸量が総乳酸量に対して５０％以下の乳酸溶液を用いることができる。
【００２９】
前記Ｄ−乳酸除去工程において、前記Ｄ−乳酸資化性菌を固定化した固定化Ｄ−乳酸資化性菌を添加することによって実施することもできる。
【００３０】
前記Ｄ−乳酸資化性菌を固定化する方法としては、担体結合法（物理的吸着法、イオン結合法、共有結合法、生化学特異結合法）、架橋法、包括法（格子型、マイクロカプセル型）などの方法を挙げることができる。
【実施例】
【００３１】
１．Ｄ−乳酸資化性菌の検索及び同定
（１）Ｄ−乳酸及び／又はＬ−乳酸資化性菌の分離
土壌、樹葉など６０種の試料を分離源として、Ｄ−乳酸及び／又はＬ−乳酸資化性菌の検索を行った。すなわち、常法に従い、ＬＹＰ液体培地を用いた集積培養及びＬＹＰ寒天培地を用いた純粋分離操作を繰り返し行い、乳酸資化性菌８９株を得た。なお、ＬＹＰ培地の組成は、ＤＬ−乳酸（純度８５．０〜９０．０％）（和光純薬株式会社製）２．５％、ペプトン（日本製薬株式会社製）０．２５％、酵母エキス（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）０．２５％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．０４％（ｐＨ３．８）である。
【００３２】
（２）発酵乳酸培地の調製
Ｌ−乳酸生産菌であるラクトバチルス マリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｉ）４３８株をＭＲＳ ｂｒｏｔｈ培地（Ｏｘｏｉｄ社製）５０ｍｌに１白金線接種し、３０℃で２４時間静置培養した。この前培養液３ｍｌと乾熱滅菌（１８０℃、１２０分）した炭酸カルシウム６ｇとをオートクレーブ滅菌（１２１℃、１０分）したＧＹＰ改変培地（グルコース２％、酵母エキス（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）１％、ペプトン（日本製薬株式会社製）０．５％、ＣＨ３ＣＯＯＮａ・３Ｈ２Ｏ ０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００１％、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ ０．００１％、ＮａＣｌ ０．００１％、Ｔｗｅｅｎ８０ ０．０５％）３００ｍｌに添加し、マグネティックスターラーによって液を穏やかに撹拌しながら、３０℃で４８時間培養して乳酸発酵液を調製した。また、この乳酸発酵液を遠心分離（４℃、１００００Ｇ、３０分）して得た上清をｐＨ３．８に調整した後、オートクレーブ滅菌（１２１℃、１０分）を行い、発酵乳酸培地（以下「Ｌ−ＬＡＢ培地」という。）とした。
【００３３】
（３）Ｄ−乳酸資化性菌の選抜
分離したＤ−乳酸及び／又はＬ−乳酸資化性菌８９株からＤ−乳酸を選択的に資化する乳酸菌を選抜することを目的に、Ｄ−乳酸及び／又はＬ−乳酸資化性菌８９株をＹＭ培地を用いてそれぞれ培養し、これら菌株の培養液をＬ−ＬＡＢ培地にそれぞれ添加して３０℃で７２時間振とう培養（１２０ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ／ｍｉｎ）を行った。また、この培養液中に残存するＤ−乳酸及びＬ−乳酸の濃度を以下の方法によって定量し、Ｄ−乳酸及び／又はＬ−乳酸資化性菌８９株のＤ−乳酸資化特性を評価した。
【００３４】
Ｌ−乳酸及びＤ−乳酸の分別定量は、酵素法（ＤＬ−乳酸測定用Ｆキット：ロシュ・ダイアグノスティックス社製）によって行った。なお、ＤＬ−乳酸の分別定量に供する培養液試料の調製は、以下の通りである。すなわち、マイクロチューブに、培養液の遠心分離（４℃、１２０００ｒｐｍ、１０分）上清を入れてキャップをロックした後、８０〜９０℃の温浴中で１５分間加温することにより、培養液中に含まれる各種酵素を失活させた。これを水浴中で冷却した後、遠心分離（４℃、１２０００ｒｐｍ、１０分）し、回収した上清を定量試験に用いた。また、対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）には試料液の代わりに同量の蒸留水を用いた。
【００３５】
その結果、培養液中のＤ−乳酸をＬ−乳酸よりも選択的に消費してＬ−乳酸の光学純度を向上させる菌株として、ＬＡＡＭ０１８株、ＬＡＡＭ０２９株、ＬＡＡＭ０４２株、ＬＡＡＭ０５０株、ＬＡＡＭ０５５株及びＬＡＡＭ０６５株の計６株を選抜した（図２）。
【００３６】
図２に示したように、ＬＡＡＭ０５０株は、培養終了後の培養液中のＤ−乳酸とＬ−乳酸の比がＤ−乳酸：Ｌ−乳酸＝０．５７：９９．４３と、Ｄ−乳酸を優先的に資化し、最もＬ−乳酸の光学純度が高かった。しかしながら、他の５菌株と比べて培養液中に残存したＬ−乳酸量が最も低く、初発Ｌ−乳酸量に対するＬ−乳酸残存率は４８．９％であった。
【００３７】
一方、ＬＡＡＭ０５５株は、培養終了後の培養液中のＤ−乳酸とＬ−乳酸の比がＤ−乳酸：Ｌ−乳酸＝０．８６：９９．１４と、Ｄ−乳酸を優先的に資化し、Ｌ−乳酸の光学純度が高かった。また、初発Ｌ−乳酸量に対するＬ−乳酸残存率は約７８％と、高光学純度Ｌ−乳酸を最も高い収率で得ることができた。
【００３８】
（４）Ｄ−乳酸資化性菌の同定
上記で選抜したＤ−乳酸資化性菌６株のうち、ＬＡＡＭ０５５株、ＬＡＡＭ０１８株及びＬＡＡＭ０６５株について、形態観察、炭素源資化性試験、２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列の解析を行い、これら菌の同定を行った。
【００３９】
ＬＡＡＭ０５５株は、白色で粉状〜白亜状のコロニーを形成し、コロニーの周縁部は乱糸状であった。また、顕微鏡観察を行ったところ、出芽した細胞は確認されず、隔壁のある菌糸および分節型分生子が認められ、有性生殖器官の形成は認められなかった（図１）。
【００４０】
また、ＬＡＡＭ０５５株の糖の発酵性、イノシトール資化性及び硝酸塩資化性がゲオトリクム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）
属の性質と一致していた（表１及び表２）。
【００４１】
【表１】
【００４２】
【表２】
【００４３】
さらに、ＬＡＡＭ０５５株の２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列を調べたところ、本菌株の２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列は、子のう菌系アナモルフ酵母の一種であるゲオトリクム ブルガレ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）の基準株であるゲオトリクム ブルガレ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）ＣＢＳ１００７３Ｔに対して９９．６％の相同率を示した。このように、ＬＡＡＭ０５５株は、ゲオトリクム ブルガレ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）と同種又は近縁種であることが明らかとなった。
【００４４】
一方、ＬＡＡＭ０１８株及びＬＡＡＭ０６５株についても同様に調べた結果、ＬＡＡＭ０１８株及びＬＡＡＭ０６５株とも、ＬＡＡＭ０５５株と同様、白色で粉状〜白亜状のコロニーを形成し、コロニーの周縁部は乱糸状であった。また、顕微鏡観察を行ったところ、出芽した細胞は確認されず、隔壁のある菌糸および分節型分生子が認められ、有性生殖器官の形成は認められなかった。
【００４５】
また、ＬＡＡＭ０１８株及びＬＡＡＭ０６５株の２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列は、子のう菌系アナモルフ酵母の一種であるゲオトリクム ブリンゼ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｂｒｙｎｄｚａｅ）の基準株であるゲオトリクム ブリンゼ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｂｒｙｎｄｚａｅ）ＮＲＲＬ Ｙ−２７６４１Ｔ及びゲオトリクム シルビコラ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｉｌｖｉｃｏｌａ）の基準株であるゲオトリクム シルビコラ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｉｌｖｉｃｏｌａ）ＣＢＳ９１９４Ｔに対してともに９９．４％の相同性を示した。このように、ＬＡＡＭ０１８株及びＬＡＡＭ０６５株は、ゲオトリクム ブリンゼ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｂｒｙｎｄｚａｅ）又はゲオトリクム シルビコラ（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｉｌｖｉｃｏｌａ）と同種又は近縁種であることを明らかにした。
【００４６】
さらに、ＬＡＡＭ０５５株、ＬＡＡＭ０１８及びＬＡＡＭ０６５株の２６ＳｒＤＮＡ−Ｄ１／Ｄ２塩基配列について、マルチプルアライメントを行い、相互の遺伝学的関連性を調べた。その結果、ＬＡＡＭ０１８とＬＡＡＭ０６５株とは、解読した５４５塩基のすべての配列が一致していた。一方、ＬＡＡＭ０５５株の塩基配列をこれら２株の塩基配列と比較したところ、５４５塩基のうち１５塩基が異なっていた。このため、ＬＡＡＭ０５５株は、ＬＡＡＭ０１８及びＬＡＡＭ０６５株と系統的にやや距離を有することが明らかとなった。
【００４７】
以上の結果から、高光学純度Ｌ−乳酸を多量に調製するためのＤ−乳酸資化性菌として、分離菌ゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５株（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）を用いることとした。
【００４８】
２．ゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５の培養特性
（１）培養温度の検討
ゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株の培養温度条件を検討した。すなわち、本菌株をＹＭ培地を用いて３０℃で２４時間振とう培養（１２０ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ／ｍｉｎ）した（前培養）。この前培養液をＬＹＰ培地に１％（ｖ／ｖ）添加して、２５℃、３０℃、３５℃又は４０℃で７２時間振とう培養（１２０ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ／ｍｉｎ）を行った（本培養）。また、本培養液中の菌体濃度、ｐＨ及びＤＬ−乳酸量を経時的に測定した。なお、菌体濃度は、波長６６０ｎｍにおける培養液の濁度（ＯＤ６６０ｎｍ）として示した。また、ｐＨは、ｐＨメーターを用いて測定した。さらに、ＤＬ−乳酸量は、上記１．（３）と同様に酵素法によって分別定量した。これらの結果を図３及び４に示した。
【００４９】
図３に示したように、培養温度が２５又は３０℃の場合では菌体の増殖が認められたが、培養温度が３５℃以上では菌体の増殖が認められなかった。一方、本菌株の乳酸資化について、培養温度３０℃の場合に最も乳酸資化速度が高かった。また、培養開始７２時間後の培養液中のＤＬ−乳酸濃度は１１．１６ｇ／ｌであり、初発ＤＬ−乳酸濃度２５．４６ｇ／ｌの約５５％が資化された。さらに、図４に示したように、培養温度３０℃における培養７２時間後の培養液中に残存するＤＬ−乳酸比は、Ｄ−乳酸：Ｌ−乳酸＝６．９１：９３．０９であった。
【００５０】
他方、培養温度２５℃の場合では菌体濃度が最も高い値を示したが、培養温度３０℃の場合と比べて、乳酸資化速度及び乳酸資化量は低い値を示した（図３）。また、培養温度２５℃における培養開始７２時間後の培養液中のＤＬ−乳酸比は、Ｄ−乳酸：Ｌ−乳酸＝２８．４３：７１．５７であった（図４）。このように、Ｌ−乳酸の光学純度を向上させるためには、本菌株の培養温度を３０℃程度とすることが有効であることが分かった。
【００５１】
（２）初発ｐＨの検討
ゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株の培養時における培地の初発ｐＨについて検討した。すなわち、本菌株をＹＭ培地を用いて３０℃で２４時間振とう培養（１２０ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ／ｍｉｎ）した（前培養）。この前培養液を６ｍｏｌ／ｌのＨＣｌ又は６ｍｏｌ／ｌのＮａＯＨによって初発ｐＨを２．６〜７．０に調整したＬＹＰ培地に１％（ｖ／ｖ）添加して、３０℃で７２時間振とう培養（１２０ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ／ｍｉｎ）を行った（本培養）。また、培養７２時間後の本培養液中の菌体濃度、ｐＨ及びＤＬ−乳酸量を測定した。なお、菌体濃度及びｐＨは上記２．（１）と同様に測定し、ＤＬ−乳酸は、上記１．（３）と同様に酵素法によって分別定量した。これら結果を図５及び６に示した。
【００５２】
図５に示したように、培地の初発ｐＨが３．０〜７．０の範囲で本菌株の増殖が認められた。また、培養７２時間後の菌体濃度について、初発ｐＨが５．４の場合、菌体濃度（ＯＤ６６０ｎｍ値）が５．５９と最も高い値を示した。一方、初発ｐＨが３．０又は３．８の場合、菌体濃度（ＯＤ６６０ｎｍ値）が２．６３〜３．５２と、初発ｐＨ４．６以上で培養した場合と比べて低い値を示した。
【００５３】
他方、図６に示したように、初発ｐＨが３．０又は３．８で培養した場合、培養液中のＤ−乳酸がそれぞれ０．４２ｇ／ｌ又は０．７７ｇ／ｌと、初発ｐＨ４．６以上で培養した場合の３．７４ｇ／ｌ〜４．９２ｇ／ｌと比べては低い値を示した。一方、Ｌ−乳酸は、初発ｐＨが３．０では１０．３５ｇ／ｌ、初発ｐＨが３．８では１０．３９ｇ／ｌと、初発ｐＨ４．６以上で培養した場合の１０．８０ｇ／ｌ〜１１．０５ｇ／ｌとほぼ同様の値であった。このように、培地の初発ｐＨを３．０〜３．８で本菌株を培養すると培地中のＤ−乳酸が優先的に資化され、培養液中のＬ−乳酸の光学純度が向上することが分かった。
【００５４】
（３）窒素源の検討
ゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株の培養時における培地の窒素源として添加する素材の種類について検討を行った。すなわち、本菌株をＹＭ培地を用いて３０℃で２４時間振とう培養（１２０ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ／ｍｉｎ）した（前培養）。この前培養液を各種窒素源としたＬＹＰ培地に１％（ｖ／ｖ）添加して、３０℃で７２時間振とう培養（１２０ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ／ｍｉｎ）を行った（本培養）。
【００５５】
なお、窒素源は、０．２５％ペプトン及び０．２５％酵母エキス（条件Ｉ）、０．４％ペプトン及び０．１％酵母エキス（条件ＩＩ）、０．４％肉エキス及び０．１％酵母エキス（条件ＩＩＩ）、０．４％硫酸アンモニウム及び０．１％酵母エキス（条件ＩＶ）、０．４％尿素及び０．１％酵母エキス（条件Ｖ）、０．４％硝酸ナトリウム及び０．１％酵母エキス（条件ＶＩ）又は０．４％リン酸水素二アンモニウム及び０．１％酵母エキス（条件ＶＩＩ）とした。
【００５６】
また、培養７２時間後の本培養液中のＤＬ−乳酸量を測定した。なお、ＤＬ−乳酸は、上記１．（３）と同様に酵素法によって分別定量した。この結果を図７に示した。
【００５７】
図７に示したように、すべての場合においてＤ−乳酸は資化され、培地中のＬ−乳酸の光学純度は向上したが、窒素源を０．２５％ペプトン及び０．２５％酵母エキスとした場合（条件Ｉ）が最もＤ−乳酸が資化され、Ｌ−乳酸の光学純度が向上した。このように、Ｌ−乳酸の光学純度を向上させるためには、培地の窒素源を０．２５％ペプトン及び０．２５％酵母エキスとすることが有効であることが分かった。
【００５８】
（４）乳酸のＤＬ比の検討
ゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株の培養時における培地の初発乳酸のＤＬ比について検討を行った。すなわち、本菌株をＹＭ培地を用いて３０℃で２４時間振とう培養（１２０ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ／ｍｉｎ）した（前培養）。この前培養液を初発乳酸のＤＬ比をＤ−乳酸：Ｌ−乳酸＝１：１、２：８又は１：９としたＬＹＰ培地（乳酸濃度２．５％）に１％（ｖ／ｖ）添加して、３０℃で７２時間振とう培養（１２０ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ／ｍｉｎ）を行った（本培養）。また、培養７２時間後の本培養液中のＤＬ−乳酸量を測定した。なお、ＤＬ−乳酸量は、上記１．（３）と同様に酵素法によって分別定量した。この結果を図８に示した。
【００５９】
図８に示したように、すべての場合でＬ−乳酸の光学純度は向上しており、培地中の初発乳酸のＤＬ比がＤ−乳酸：Ｌ−乳酸＝１：９（初発Ｌ−乳酸の光学純度９０％）の場合、培養７２時間後の培養液中のＬ−乳酸の光学純度が９９．７％と最もＬ−乳酸の光学純度が高かった。一方、Ｄ−乳酸：Ｌ−乳酸＝２：８（初発Ｌ−乳酸の光学純度８０％）の場合ではＬ−乳酸の光学純度が９４．８％であり、Ｄ−乳酸：Ｌ−乳酸＝１：１の場合（初発Ｌ−乳酸の光学純度５０％）ではＬ−乳酸の光学純度が９６．１％であった。
【００６０】
３．乳酸発酵液からの高光学純度Ｌ−乳酸の生産
Ｌ−乳酸生産菌を乳酸発酵させて得た乳酸発酵液から調製した発酵乳酸培地を用いて、ゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株による高光学純度のＬ−乳酸生産について検討した。
【００６１】
（１）Ｄ−乳酸資化菌の添加量
まず始めに、Ｌ−乳酸生産菌であるラクトバチルス マリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｉ）４３８株の乳酸発酵液を用いて調製した発酵乳酸培地（Ｌ−ＬＡＢ培地）に添加するゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株の菌体濃度について検討した。
【００６２】
すなわち、初発グルコース濃度を２．０％としたＧＹＰ改変培地でラクトバチルス マリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｉ）４３８株を培養することで乳酸発酵液を調製した。この乳酸発酵液を用いて上記１．（２）と同様に調製した発酵乳酸培地（Ｌ−ＬＡＢ培地）（ｐＨ３．０）にゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株を初発菌体濃度（ＯＤ６６０ｎｍ値）が０．０９３（条件Ｉ）、１．６００（条件ＩＩ）又は１６．３００（条件ＩＩＩ）となるように添加して、３０℃で７２時間振とう培養（１２０ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ／ｍｉｎ）を行った。また、培養液中のＤＬ−乳酸量を経時的に測定した。なお、ＤＬ−乳酸量は、上記１．（３）と同様に酵素法によって分別定量した。この結果を図９に示した。
【００６３】
図９に示したように、すべての場合において、培養７２時間後の培養液中のＬ−乳酸の光学純度が高くなっており、菌体濃度（ＯＤ６６０ｎｍ値）が１６．３００の場合（条件ＩＶ）にＬ−乳酸の光学純度が９８．３６％、Ｌ−乳酸収率が８０．２２％と最も高い値を示した。
【００６４】
（２）乳酸発酵液からの高光学純度Ｌ−乳酸の生産
上記３．（１）の結果から、乳酸発酵用ＧＹＰ改変培地の初発グルコース濃度を２．０％とし、ゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株の菌体添加量を初発菌体濃度（ＯＤ６６０ｎｍ値）約１６として、発酵乳酸培地（Ｌ−ＬＡＢ培地）からの高光学純度Ｌ−乳酸生産の様相を調べた。
【００６５】
すなわち、初発グルコース濃度を２．０％としたＧＹＰ改変培地でラクトバチルス マリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｉ）４３８株を培養することで乳酸発酵液を調製した。この乳酸発酵液を用いて調製した発酵乳酸培地（Ｌ−ＬＡＢ培地）（ｐＨ３．０）にゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株を初発菌体濃度（ＯＤ６６０ｎｍ値）が約１６となるように添加して、３０℃で７２時間振とう培養（１２０ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ／ｍｉｎ）を行った。また、培養液中のＤＬ−乳酸量を経時的に測定した。なお、ＤＬ−乳酸量は、上記１．（３）と同様に酵素法によって分別定量した。この結果を表３に示した。
【００６６】
【表３】
【００６７】
表３に示したように、培養１４４時間後に培養液中のＬ−乳酸の光学純度が９９．８７％以上のＬ−乳酸が５．７０ｇ／ｌ生成され、高光学純度のＬ−乳酸を得ることができた。
【００６８】
４．固定化菌を用いた高光学純度Ｌ−乳酸の生産
固定化したゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株による発酵乳酸培地（Ｌ−ＬＡＢ培地）からの高光学純度のＬ−乳酸生産について検討した。
【００６９】
（１）固定化菌体の調製
ゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５株（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株をＹＭ培地６００ｍｌを用いて３０℃で２４時間振とう培養（１２０ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ／ｍｉｎ）した。この培養液を遠心分離（５０００Ｇ、３０分）し、回収した菌体をオートクレーブ滅菌した生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ溶液）１５ｍｌ中に懸濁した。この菌体懸濁液１５ｍｌ（ＯＤ６６０ｎｍ＝約１６）と５％アルギン酸ナトリウム溶液１００ｍｌとを混合し、これを５％塩化カルシウム溶液１００ｍｌ中に滴下してゲルビーズを形成させた。この後、マグネティックスターラーで穏やかに撹拌しながら液中で該ゲルビーズを３０分間保持することでゲルを硬化させ、これを固定化菌体とした。なお、調製した固定化菌体ビーズは、殺菌水で２度洗浄した後、以下の実験に供した。
【００７０】
（２）固定化菌体を用いた高光学純度Ｌ−乳酸の生産
上記４．（１）で調製したゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５株の固定化菌体ビーズを初発グルコース濃度を２．０％として調製したＬ−ＬＡＢ（ｐＨ３．０）に投入し、３０℃で７２時間振とう培養（１２０ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ／ｍｉｎ）を行った。また、培養液中のＤＬ−乳酸量を経時的に測定した。なお、ＤＬ−乳酸量は、上記１．（３）と同様に酵素法によって分別定量した。この結果を表４に示した。
【００７１】
【表４】
【００７２】
表４に示したように、培養４８時間後に光学純度が９１．２９％のＬ−乳酸を１２．３ｇ／ｌ（Ｌ−乳酸収率７０．７８％）生成した。また、培養７２時間後の培養液中のＬ−乳酸の光学純度は９４．０９％と、培養４８時間後の培養液と比べてＬ−乳酸の光学純度が向上したが、培養液中のＬ−乳酸が１０．９９ｇ／ｌ（Ｌ−乳酸収率６３．２３％）と乳酸収率が低下した。
【００７３】
以上の結果から、ゲル包括固定化ゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５株を用いてもＬ−ＬＡＢ培地から高光学純度のＬ−乳酸を生成することが可能であることが分かった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−乳酸及びＤ−乳酸を含む乳酸溶液を調製する乳酸溶液調製工程と、
該乳酸溶液中でＤ−乳酸資化性菌を培養し、該乳酸溶液中のＤ−乳酸を資化させることによってＬ−乳酸の光学純度を高めるＤ−乳酸除去工程と、
を有する高光学純度Ｌ−乳酸の製造方法。
【請求項２】
前記乳酸溶液が、Ｌ−乳酸生産菌を培養して得られる乳酸発酵液である、
請求項１に記載の高光学純度Ｌ−乳酸の製造方法。
【請求項３】
前記Ｄ−乳酸資化性菌が、ゲオトリクム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属に属する酵母である、
請求項１又は２に記載の高光学純度Ｌ−乳酸の製造方法。
【請求項４】
前記Ｄ−乳酸資化性菌が、ゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株である、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の高光学純度Ｌ−乳酸の製造方法。
【請求項５】
前記Ｄ−乳酸除去工程が、３０℃、ｐＨ３．０〜３．８の好気的条件下で実施される、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の高光学純度Ｌ−乳酸の製造方法。
【請求項６】
前記Ｄ−乳酸資化性菌が、固定化された固定化菌体である、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の高光学純度Ｌ−乳酸の製造方法。
【請求項１】
Ｌ−乳酸及びＤ−乳酸を含む乳酸溶液を調製する乳酸溶液調製工程と、
該乳酸溶液中でＤ−乳酸資化性菌を培養し、該乳酸溶液中のＤ−乳酸を資化させることによってＬ−乳酸の光学純度を高めるＤ−乳酸除去工程と、
を有する高光学純度Ｌ−乳酸の製造方法。
【請求項２】
前記乳酸溶液が、Ｌ−乳酸生産菌を培養して得られる乳酸発酵液である、
請求項１に記載の高光学純度Ｌ−乳酸の製造方法。
【請求項３】
前記Ｄ−乳酸資化性菌が、ゲオトリクム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属に属する酵母である、
請求項１又は２に記載の高光学純度Ｌ−乳酸の製造方法。
【請求項４】
前記Ｄ−乳酸資化性菌が、ゲオトリクム エスピー（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ．）ＬＡＡＭ０５５（受領番号：ＮＩＴＥ ＡＰ−１２２３）株である、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の高光学純度Ｌ−乳酸の製造方法。
【請求項５】
前記Ｄ−乳酸除去工程が、３０℃、ｐＨ３．０〜３．８の好気的条件下で実施される、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の高光学純度Ｌ−乳酸の製造方法。
【請求項６】
前記Ｄ−乳酸資化性菌が、固定化された固定化菌体である、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の高光学純度Ｌ−乳酸の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１２−２２３１９２（Ｐ２０１２−２２３１９２Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１５日（２０１２．１１．１５）
【国際特許分類】
【公開請求】
【出願番号】特願２０１２−９８０１３（Ｐ２０１２−９８０１３）
【出願日】平成２４年４月２３日（２０１２．４．２３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 平成２３年度醸造学専攻修士論文最終発表会要旨集 第３７〜３８頁 東京農業大学大学院醸造学専攻 ２０１２年１月２７日
【出願人】（５９８０９６９９１）学校法人東京農業大学 (85)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月１５日（２０１２．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−９８０１３（Ｐ２０１２−９８０１３）
【出願日】平成２４年４月２３日（２０１２．４．２３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 平成２３年度醸造学専攻修士論文最終発表会要旨集 第３７〜３８頁 東京農業大学大学院醸造学専攻 ２０１２年１月２７日
【出願人】（５９８０９６９９１）学校法人東京農業大学 (85)
【Ｆターム（参考）】
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