高分子電解質および活性成分を基にした放出制御粒子および該粒子を含む製剤
本発明は、活性成分（ＡＰ）、特にタンパク質およびペプチド活性成分の輸送体である高分子電解質ポリマーを有する新規の粒子と、前記ＡＰ微粒子を有する新規の放出制御製剤とに関するものである。
これらＡＰを有する新規の粒子は、数日間、さらには数週間の長期間にわたってＡＰを放出する。
本発明は、第１態様において、
ａ）帯電状態で疎水側基（ＧＨ）を有する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）であって、ｐＨ３〜８のうち少なくとも一つのｐＨｍ値で粒子のコロイド溶液を水中で自発的に形成する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）と、
ｂ）第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）と異極性である第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）であって、前記ｐＨのうち少なくとも一つの前記ｐＨｍ値で溶液またはコロイド溶液を水中で形成する第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）と、
ｃ）第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド溶液の粒子と非共有で会合した少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）と、
を有する粒子に関し、前記粒子が、ｐＨｍと等しいｐＨで、活性成分（ＡＰ）と会合した粒子のコロイド溶液の形の第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）を、溶液またはコロイド溶液の形の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）と混合することで得られる。
本発明はまた、これらの粒子を調製する方法と、かかる粒子を有する製剤と、薬剤を調製する方法とに関するものである。
これらＡＰを有する新規の粒子は、数日間、さらには数週間の長期間にわたってＡＰを放出する。
本発明は、第１態様において、
ａ）帯電状態で疎水側基（ＧＨ）を有する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）であって、ｐＨ３〜８のうち少なくとも一つのｐＨｍ値で粒子のコロイド溶液を水中で自発的に形成する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）と、
ｂ）第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）と異極性である第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）であって、前記ｐＨのうち少なくとも一つの前記ｐＨｍ値で溶液またはコロイド溶液を水中で形成する第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）と、
ｃ）第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド溶液の粒子と非共有で会合した少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）と、
を有する粒子に関し、前記粒子が、ｐＨｍと等しいｐＨで、活性成分（ＡＰ）と会合した粒子のコロイド溶液の形の第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）を、溶液またはコロイド溶液の形の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）と混合することで得られる。
本発明はまた、これらの粒子を調製する方法と、かかる粒子を有する製剤と、薬剤を調製する方法とに関するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性成分（ＡＰ）、とくにタンパク質およびペプチド活性成分の新規の輸送体と、前記ＡＰの輸送体を有する新規の放出制御製剤とに関連するものである。本願はまた、これらの製剤の用途、とくに治療用途にも関連するものである。これらの活性製剤は、ヒトの治療および動物の治療の両方に関連するものである。
【０００２】
本明細書を通して用いる関連するＡＰは、少なくとも一つの活性成分を対象とする。
【背景技術】
【０００３】
薬剤ＡＰ、とくに治療用ペプチド／タンパク質の持続放出の分野において、その目的は、多くが、患者に可能な限り健康体において観測される値に近い血漿ペプチドまたはタンパク質血漿濃度を再現することである。
【０００４】
この目的は、血漿におけるタンパク質の短い寿命に抵触し、結果として、治療用タンパク質の反復投与を導く。そして、治療用タンパク質の血漿濃度は、高濃度ピークおよび最低濃度によって特徴づけられる「鋸歯」プロファイルを示す。濃度ピークは、健康体における基本濃度よりずっと高く、サイトカイン等の治療用タンパク質の高毒性のために非常に有害である。さらに、最低濃度は、治療効果を与えるのに必要な濃度より低く、その結果、患者に対して低い治療範囲および長期間の重篤な副作用をもたらす。
【０００５】
したがって、患者の治療に対して理想的な値に近い治療用タンパク質の血漿濃度を患者において再現するため、検討中の製剤にとって、時間と共に血漿濃度の変動を制限するように、長時間にわたって治療用タンパク質を放出できるようにすることが重要である。
【０００６】
さらに、この活性製剤は、好ましくは、当業者には既知である以下の要件を満たすべきである。
１．活性および非変性治療用プロテイン、例えば、ヒトタンパク質または合成タンパク質を持続放出し、血漿濃度を治療用の濃度に維持すること
２．容易に注入可能とするのに十分に低い注射での粘度
３．優れた毒性・耐性プロファイルを示す生体適合性および生分解性
【０００７】
これらの目的を達成する試みにおいて、従来技術において提示された最良のアプローチの一つは、治療用タンパク質を有するナノ粒子の比較的非粘性の液体懸濁液から成る治療用タンパク質の持続放出形態を開発したものである。これらの懸濁液によって、天然の治療用タンパク質を簡単に投与することが可能になった。
【０００８】
このようにして、フラメル・テクノロジーズは、治療用タンパク質が、疎水基および親水基を有するコポリアミノ酸のナノ粒子に会合する手段を提供してきた。
【０００９】
米国特許出願公開第２００６／００９９２６４号明細書（特許文献１）は、アスパラギン酸残基および／またはグルタミン酸残基を有する両親媒性ポリアミノ酸を開示し、これらの残基の少なくとも一部は、例えば、少なくとも一つのα−トコフェロール残基を有するグラフトを持つ（合成もしくは天然由来のα−トコフェロールとグラフトしたポリグルタミン酸塩またはポリアスパラギン酸塩）。これらの「疎水的に改質された」ホモポリアミノ酸は、ｐＨ７．４の水性懸濁液において少なくとも一つの活性タンパク質（インスリン）と容易に結合することができるナノ粒子のコロイド懸濁液を水中で自発的に形成する。
【００１０】
特許文献１に従う懸濁液によって「ベクトル化した」活性タンパク質（例えばインスリン）の生体内での放出時間は、長くなることによって効果が上がる。
【００１１】
放出時間の増加は、とくに国際公開第０５／０５１４１６号パンフレット（特許文献２）において開示されている製剤によって部分的に得られた。本明細書は、皮下注射後、内因性アルブミンに接触してその患者のインサイチューでゲルを形成するような濃度にて注射された、疎水的に改質されたポリ（グルタミン酸ナトリウム）のナノ粒子（０．００１〜０．５μｍ）のコロイド懸濁液を開示する。タンパク質は、その後、１週間の標準的な期間をかけてゆっくりと放出される。しかし、投与される治療用タンパク質の濃度が比較的高い場合、例えばヒト成長ホルモンのような場合、放出時間は数日に限定される。
【００１２】
これらの製剤の放出時間は、さらに長くなることで効果が上がる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／００９９２６４号明細書
【特許文献２】国際公開Ａ０５／０５１４１６号パンフレット
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の目的の一つは、ＡＰを、数日、更には数週間という長時間にわたって放出する、ＡＰを有する新規の粒子を提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的は、水溶液中で安定な懸濁液を形成する新規の粒子を提供することである。
【００１６】
本発明の他の目的は、凍結乾燥された形態で安定である、ＡＰを有する新規の粒子を提供することである。
【００１７】
本発明の他の目的は、凍結乾燥された形態で貯蔵することができる新規の粒子を提供することである。
【００１８】
本発明の他の目的は、凍結乾燥後に容易に再分散できる新規の粒子を提供することである。
【００１９】
本発明の他の目的は、生物活性を保持するタンパク質を放出する新規の粒子を提供することである。
【００２０】
本発明の他の目的は、これらの微粒子を準備する新規の方法を提供することである。
【００２１】
本発明の他の目的は、ＡＰを持続放出するための固体製剤を、特に吸入および肺内投与のための乾燥粉末の形態で提供することである。
【００２２】
これらの目的を達成するため、とりわけ、本発明者らが、長期にわたり忍耐を必要とする研究を行ったところ、全く驚くべきことで且つ予想外にも、二つの異極性の高分子電解質ポリマーであって、少なくとも一方が少なくとも一つのＡＰと会合した少なくとも一つの疎水器を有する該ポリマー（例えば、コポリアミノ酸）を特定の条件下で混合することで、長時間にわたって生体外または生体内でタンパク質またはペプチドを放出することが可能な、１〜１００ミクロンの大きさを持つ粒子をもたらすということを見出した。
【００２３】
これから判断すると、本発明は、まず、少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出する粒子に関するものであり、該粒子は、
ａ）帯電状態で疎水側基（ＧＨ）を有する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）であって、好ましくは直鎖α−ポリアミノ酸であり、ｐＨ３〜８のうち少なくとも一つのｐＨｍ値で粒子のコロイド溶液を水中で自発的に形成する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）と、
ｂ）第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）と異極性である第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）であって、好ましくは直鎖α−ポリアミノ酸であり、前記ｐＨのうち少なくとも一つの前記ｐＨｍ値で溶液またはコロイド溶液を水中で形成し、但し、第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）がポリアミノ酸である場合、第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）はポリリシンもしくはポリエチレンイミンのいずれでもない、第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）と、
ｃ）第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド溶液の粒子と非共有で会合する少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）と、
を有し、少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出する上記粒子が、ｐＨｍと等しいｐＨで、活性成分（ＡＰ）と会合した粒子のコロイド溶液の形の第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）を、溶液またはコロイド溶液の形の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）と混合することで得られる。
【００２４】
また、本発明は、少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出する粒子を調製する方法に関するものであり、該粒子は、とくに上述されたものであり、該方法は、
１）ｐＨ３〜８のｐＨｍ値で、帯電状態で疎水側基（ＧＨ）を有する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド水溶液を準備する工程であって、前記第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）が、ｐＨ３〜８のうち少なくとも一つのｐＨｍ値で粒子のコロイド溶液を水中で自発的に形成することができる工程と、
２）少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を、工程１）において得た第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）に加える工程であって、前記活性成分（ＡＰ）が、前記第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド溶液の粒子と非共有結合している工程と、
３）第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）と異極性の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）を準備する工程であって、前記第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）は、前記ｐＨの少なくとも一つの前記ｐＨｍ値で溶液またはコロイド溶液を水中で形成し、但し、第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）がポリアミノ酸である場合、第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）はポリリシンもしくはポリエチレンイミンのいずれでもない工程と、
４）ｐＨｍと等しいｐＨで、工程２）において得られた活性成分（ＡＰ）と会合した粒子のコロイド溶液の形の第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）を、工程３）において得られた溶液またはコロイド溶液の形の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）と混合する工程とを備える。
【００２５】
また、本発明は、少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出する粒子に関するものであり、該粒子は、
ａ）帯電状態で疎水側基（ＧＨ）を有する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）であって、好ましくは直鎖α−ポリアミノ酸であり、ｐＨ３〜８のうち少なくとも一つのｐＨｍ値で粒子のコロイド溶液を水中で自発的に形成する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）と、
ｂ）第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）と異極性で且つ疎水側基（ＧＨ）を有する第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）であって、好ましくは直鎖α−ポリアミノ酸であり、前記ｐＨのうち少なくとも一つの前記ｐＨｍ値で溶液またはコロイド溶液を水中で形成する第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）と、
ｃ）第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド溶液の粒子と非共有で会合する少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）と、
を有し、少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出する前記粒子が、ｐＨｍと等しいｐＨで、活性成分（ＡＰ）と会合した粒子のコロイド溶液の形の第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）を、溶液またはコロイド溶液の形の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）と混合することで得られる。
【００２６】
また、本発明は、少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出する粒子を調製する方法に関するものであり、該粒子は、とくに上述されたものであり、該方法は、
１）ｐＨ３〜８のｐＨｍ値で、帯電状態で疎水側基（ＧＨ）を有する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド水溶液を準備する工程であって、前記第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）が、ｐＨ３〜８のうち少なくとも一つのｐＨｍ値で粒子のコロイド溶液を水中で自発的に形成することができる工程と、
２）少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を、工程１）において得た第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）に加える工程であって、前記活性成分（ＡＰ）が、前記第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド溶液の粒子と非共有結合している工程と、
３）第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）と異極性で且つ疎水側基（ＧＨ）を有する第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）を準備する工程であって、前記第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）が、前記ｐＨのうち少なくとも一つの前記ｐＨｍ値で溶液またはコロイド溶液を水中で形成する工程と、
４）ｐＨｍと等しいｐＨで、工程２）において得られた活性成分（ＡＰ）と会合した粒子のコロイド溶液の形の第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）を、工程３）において得られた溶液またはコロイド溶液の形の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）と混合する工程とを備える。
【００２７】
また、本発明は、少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出する製剤に関するものであり、前記製剤は、上述した粒子を備える。
【００２８】
また、本発明は、特に、非経口、粘膜、皮下、筋内、皮内、経皮、腹腔内もしくは大脳内投与用、または腫瘍への投与用、或いは経口、経鼻、肺、膣もしくは眼球経路による投与用の薬剤を調製する方法であって、該薬剤は、先に規定した製剤の少なくとも一つから本質的になる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】例２（白丸）、例３．１（黒三角）、例３．２（黒ダイアモンド）、例３．３（黒四角）、例４（黒丸）および例５（直線）の粒子を有する製剤からのＩＦＮ−αの生体外での放出を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
定義
本明細書において、「溶液」という用語は、個々の鎖の形で溶媒とポリマーとの均一な混合物を意味すると理解される。
【００３１】
本明細書において、「コロイド溶液」という用語は、Ｔ'テストで測定したときにその平均径が０．５μｍ未満か又はそれに等しい粒子の懸濁液を意味すると理解される。
【００３２】
本明細書において、「半中和ｐＨ」という用語は、イオン性基の半分をイオン化するｐＨを意味すると理解される。
【００３３】
本明細書において、「ｐＨｍ」という用語は、活性成分（ＡＰ）と会合する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）との混合を行う際のｐＨを意味すると理解される。
【００３４】
本明細書において、生理学的ｐＨは、例えば、７．２±０．４に等しいことと定義される。
【００３５】
本明細書において、「高分子電解質」という用語は、水中でイオン化することが可能な基を有するポリマーであって、該ポリマー上で電荷を生成するポリマーを意味すると理解される。
【００３６】
本明細書において、「両性高分子電解質」という用語は、少なくとも２種類の基を有し、それぞれがアニオン性基とカチオン性基を与えるように解離する高分子電解質を意味すると理解される。
【００３７】
本明細書において、「を有する（to carry）」という表現は、有される基がペンダントであり、すなわち、前記基がポリマーの主鎖に対して側基であることを意味する。特に、ポリマーが「アミノ酸」残基を備えるポリアミノ酸である場合、前記ペンダント基は、「アミノ酸」残基に対して側基であり、該ペンダント基は、それを有する「アミノ酸」残基のγ位におけるカルボニル官能基の置換基である。
【００３８】
本明細書において、「高分子電解質の極性」という用語は、ｐＨのｐＨｍ値にてこの高分子電解質が持つ全体の電荷の極性を意味すると理解される。
【００３９】
本明細書において、「かさ密度」という用語は、粒子１ｇが占める体積を意味すると理解される。かさ密度は、密度勾配法等の当業者に知られるいずれかの方法で測定される。
【００４０】
本明細書において、「小分子」という用語は、分子量が１ｋＤａ未満の分子を意味すると理解される。
【００４１】
Ｔテストは、第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）の会合および第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）の会合に起因する、本発明に従う粒子の大きさを測定するのに使用される。Ｔ'テストを用いて、第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド溶液の粒子の大きさを評価するのが好ましい。
【００４２】
Ｔテストの結果は、中位径Ｄ５０であるので、サンプル内に存在する粒子の５０％は、この値（Ｄ５０）より低いか又はそれと等しい大きさを有する。
【００４３】
Ｔ'テストの結果は、平均流体力学的直径である。
【００４４】
レーザー回折による微粒子の大きさを測定するためのＴテスト
Ｄ５０に関するデータを得るが、該データは、分析される対象の５０％がそれ以下であることを見出す直径である。本発明に従う粒子のこの直径は、以下に規定される手順に従って測定される。
【００４５】
５ｍｌの試験管中、分析されるサンプル４００μｌを脱塩水６００μｌで希釈し、その用意したものに１０秒間（１０±５）渦を発生させて、粒子の溶液を調製する。その次に、それらの溶液を不明瞭化が５〜２０％の間になるまで滴下しながら測定セルに導入し、その後、４６６ｎｍおよび６３２ｎｍの二つの波長で動作するＭａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ ２０００型の装置を用いる光回折によって分析する。粒子のＤ５０は、標準ＩＳＯ １３３２０に説明されるように、
ｎ流体＝１．３３＋ｉ．０
ｎポリマー＝１．５９＋ｉ．０
という屈折率を用いたＭｉｅ理論及びフランフォーファー近似から算出される。
【００４６】
準弾性光散乱によってナノ粒子の大きさを測定するためのＴ'テスト
本発明に従うポリマーの粒子の平均流体力学的直径は、以下に規定する方法Ｍｄに従って測定される。
【００４７】
０．１５ＭのＮａＣｌ媒体中、ポリマー溶液を１または２ｍｇ／ｍｌの濃度で準備し、２４時間攪拌して置いておく。その次に、これらの溶液を０．８〜０．２μｍのフィルタに通して濾過した後、波長６３２．８ｎｍの垂直に偏光したＨｅ−Ｎｅレーザー光で動作するＭａｌｖｅｒｎ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｇｏｎｉｏｍｅｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ型の装置を用いた動的光散乱において分析する。ポリマーナノ粒子の流体力学的直径は、「Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｅｒｉｅｓ」，第２２巻，Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，編集Ｒ．Ｚａｎａ，第３章，Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，１９８４の研究に説明されるように、キュムラント法による電界の自己相関関数から算出される。
【００４８】
活性成分の放出を測定するためのＬテスト
３０ｍｇ／ｇのウシアルブミン画分Ｖ（Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．０１Ｍのリン酸緩衝液、０．００２７Ｍの塩化カリウム、０．１３７Ｍの塩化ナトリウム（ＡｌｄｒｉｃｈのＰＢＳ）および０．０１５Ｍの酢酸アンモニウム（Ａｌｄｒｉｃ）を備えた流量２．８３ｍｌ／ｈの水性媒体によって水浴したポリウレタン／ポリエーテル（ＰＵ−ＰＥ）発泡体からなる辺長１．５ｃｍの立方体中に、５０μｌの製剤を注入する。サンプルは、連続相から定期的に回収され、そのタンパク質含有量をＥＬＩＳＡ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，ＩＭ３１９３キット）によって分析する。
【００４９】
次いで、回収した各サンプルで測定した値を加算することで、放出されたタンパク質の全重量をプロットし、それを合計の注入量と関連付けることができる。
【００５０】
本発明の意義の範囲内で、「タンパク質」という用語は、タンパク質またはペプチドを意味し、ペプチドはオリゴペプチドであろうとポリペプチドであろうと問わない。このタンパク質またはこのペプチドは、例えば一つまたはそれ以上のポリオキシエチレン基をグラフトすることによって変性してもよいし、変性しなくてもよい。
【００５１】
第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）および第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）は、イオン化可能なアニオン性基および／またはカチオン性基、例えばアミン官能基またはカルボン酸官能基を有する生体適合性および生分解性の線状ポリマーである。好ましくは、ポリマー（ＰＥ１）または（ＰＥ２）は、所定の極性（アニオン性またはカチオン性）のイオン性基を有する。
【００５２】
かかるポリマーは、例えば、ポリアミノ酸類の他、硫酸デキストラン、カルボキシメチルセルロース、アラビアガム、ヒアルロン酸およびその誘導体等のアニオン性多糖類、ポリガラクツロン酸類またはポリグルクロン酸類、またはキトサン等のカチオン性多糖類、あるいはまたコラーゲンおよびゼラチン型のその誘導体である。
【００５３】
所定の極性のイオン性基を有するポリマーが更に逆の極性のイオン性基を１〜３０モル％の少数有する可能性は排除されない。イオン化可能なアニオン性またはカチオン性基および疎水基に加えて、第１または第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）または（ＰＥ２）もまた、任意に、ヒドロキシエチルアミノ−ラジカル、アルキレングリコールまたはポリアルキレングリコールから選択されるラジカル等の非イオン性基を有することもできる。
【００５４】
ポリマーの正味電荷は、ポリマーの半中和ｐＨに対するｐＨ値に依存する。したがって、アニオン性のカルボン酸官能基を有する高分子電解質については、ポリマーの正味電荷が半中和ｐＨより２単位下のｐＨでゼロの領域にある。実際、すべてのアニオン性官能基は、半中和ｐＨより２単位上のｐＨでイオン化する。一方、カチオン性官能基を有するポリマーに対し、その正味電荷は、ｐＨが半中和ｐＨを約２単位超えるとゼロに低下する。
【００５５】
本発明においては、ｐＨのｐＨｍ値での混合条件下にて第１または第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ１，ＰＥ２）が持つ電荷数は、従来の酸／塩基滴定法によって得られる。
【００５６】
０．１５Ｍの塩化ナトリウムを備えた２ｍｇ／ｍｌの高分子電解質濃縮溶液を、１Ｍの酢酸または１Ｍの水酸化ナトリウム溶液を加えることによってｐＨ３にする。その後、この溶液を、０．０５Ｍの水酸化ナトリウム溶液で滴定し、ｐＨの変化を、加えた水酸化ナトリウムの量の関数として記録する。当量点（量およびｐＨ）の検出は、例えば二重接線法によって行われるが、すべてのイオン性基がイオン化するｐＨ、すなわちイオン化度が１に等しい場合のｐＨを検出することができる。次いで、この点から、いずれのｐＨ値に対しても高分子電解質のイオン化度にまで戻すことができる。そして、半中和ｐＨ、すなわちイオン化度が０．５に等しいｐＨを規定することができる。また、ｐＨのｐＨｍ値での高分子電解質のイオン化度を規定することもできる。当量点がｐＨ３〜９の範囲外である特定の場合においては、すべてのイオン性基が、このｐＨの範囲にわたってイオン化するものと考えられ、すなわち、ｐＨ３〜９の値でのイオン化度は１に等しい。
【００５７】
有利には、第１および第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ１，ＰＥ２）が、直鎖ポリ（α−アミノ酸）であり、ＰＥ１が直鎖ポリアミノ酸であれば、ＰＥ２はポリリシンでもポリエチレンイミンでもないことを忘れてはならない。
【００５８】
本発明の意義の範囲内で且つこの説明を通して、「ポリアミノ酸」という用語は、天然ポリアミノ酸および合成ポリアミノ酸の両方に及び、また、２０より多い「アミノ酸」残基を有するポリアミノ酸と同様に、２〜２０の「アミノ酸」残基を有するオリゴアミノ酸にも及ぶ。
【００５９】
好ましくは、本発明において用いるポリアミノ酸は、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸の繰り返し単位を備えるオリゴマーもしくはホモポリマー、またはこれら２種の「アミノ酸」残基の混合物を備えるコポリマーである。これらのポリマーにおける検討中の残基は、ＤもしくはＬまたはＤ／Ｌ配置を有するアミノ酸であり、グルタミン酸塩もしくはグルタミン酸残基に関してはαまたはγ位を介して、またアスパラギン酸もしくはアスパラギン酸塩残基に関してはαまたはβ位を介して結合する。
【００６０】
ポリアミノ酸の主鎖の好ましい「アミノ酸」残基は、Ｌ配置およびα型の結合を有するものである。
【００６１】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、第１および第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ１，ＰＥ２）は、ポリアミノ酸、またはそれらの製剤可能な塩の一つとすることができ、その主鎖は、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基およびそれら組み合わせから成る群から選択した残基の形をしており、これらの単位の少なくとも一部は、少なくとも第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）に対して少なくとも一つの疎水基（ＧＨ）をグラフトすることによって変性される。
【００６２】
また、上記ポリマー（ＰＥ２）も疎水側基を有することができる。
【００６３】
第１の実施形態によれば、これらのポリアミノ酸は、ＰＣＴ特許出願の国際公開ＷＯ−Ａ−００／３０６１８号に記載される種類であり、その疎水基（ＧＨ）は、互いに同一でも異なっていてもよく、
（ｉ）直鎖または分岐の、好ましくは直鎖Ｃ１〜Ｃ２０、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ１８アルキル、アシルまたはアルケニル；
（ｉｉ）一つまたはそれ以上のヘテロ原子を有し、好ましくは酸素および／または硫黄を有し、より好ましくは下記式：
【化１】
（式中、
Ｒ６０ラジカルは、直鎖または分岐の、好ましくは直鎖Ｃ１〜Ｃ２０、より好ましくはＣ２〜Ｃ１８アルキル、アシルまたはアルケニルラジカルであり、
Ｒ６１およびＲ６２ラジカルは、互いに同一または異なり、水素または、直鎖もしくは分岐の、好ましくは直鎖Ｃ１〜Ｃ２０、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ１８アルキル、アシル、またはアルケニルラジカルと一致し、
ｑ＝１〜１００である）の炭化水素基；
（ｉｉｉ）アリール、アラルキル、またはアルキルアリール、好ましくはアリール；
（ｉｖ）疎水性誘導体、好ましくはホスファチジルエタノールアミノ−ラジカル、または、オクチルオキシ−ラジカル、ドデシルオキシ−ラジカル、テトラデシルオキシ−ラジカル、ヘキサデシルオキシ−ラジカル、オクタデシルオキシ−ラジカル、９−オクタデセニルオキシ−ラジカル、トコフェリルオキシ−ラジカルもしくはコレステリルオキシ−ラジカルから選択されるラジカル；
からなる群から選択される。
【００６４】
「炭化水素基」という用語は、本発明の意義の範囲内で、とくに水素原子および炭素原子を有する基を意味すると理解される。
【００６５】
好ましくは、この実施形態において、疎水基が、メチル、エチル、プロピル、ドデシル、ヘキサデシルおよびオクタデシルのラジカルの群から選択される。
【００６６】
とくに好ましくは、疎水基（ＧＨ）が、
・任意には少なくとも一つの不飽和結合および／または少なくとも一つのヘテロ原子を備えることができる直鎖または分岐Ｃ８〜Ｃ３０アルキル、
・任意には少なくとも一つの不飽和結合および／または少なくとも一つのヘテロ原子を備えることができるＣ８〜Ｃ３０アルキルアリールまたはアリールアルキル、
・任意には少なくとも一つの不飽和結合および／または少なくとも一つのヘテロ原子を備えることができるＣ８〜Ｃ３０（多）環式化合物、
から成る群から選択される。
【００６７】
さらに具体的には、少なくとも一つの疎水基（ＧＨ）が、オクタノール、ドデカノール、テトラデカノール、ヘキサデカノール、オクタデカノール、オレイルアルコール、トコフェロールおよびコレステロールから成る群から選択される前駆体から派生したグラフトによって得られる。
【００６８】
本発明の実施形態によれば、高分子電解質ポリマー（ＰＥ１，ＰＥ２）の一つまたはそれらの製剤可能な塩の一つは、以下の式（Ｉ）：
【化２】
（式（Ｉ）中、
・Ｒ１は、Ｈ、直鎖Ｃ２〜Ｃ１０もしくは分岐Ｃ３〜Ｃ１０アルキル、ベンジル、−Ｒ４−［ＧＨ］を示し、またはＲ１は、ＮＨと、末端アミノ酸残基を形成し；
・Ｒ２は、Ｈ、直鎖Ｃ２〜Ｃ１０もしくは分岐Ｃ３〜Ｃ１０アシル基、ピログルタメート、または−Ｒ４−［ＧＨ］を示し；
・Ｒ４は、直接結合または１〜４のアミノ酸残基を基にした「スペーサ」を示し；
・Ａ１およびＡ２は、独立して−ＣＨ２−（アスパラギン酸残基）または−ＣＨ２−ＣＨ２−（グルタミン酸残基）を示し；
・ｎ／（ｎ＋ｍ）は、モルグラフト度として定義され、その値は、ｐＨ７で２５℃の水中に溶解したポリマーがポリマー粒子のコロイド懸濁液を形成するのに十分に低く；
・ｎ＋ｍは１０〜１０００の範囲であり、好ましくは５０から３００の間であり；
・ＧＨは、６〜３０の炭素原子を有する疎水基を示すか、または上記項目（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）において定義されたラジカルを含む群から選択される）に一致する。
【００６９】
更に、式（Ｉ）のポリアミノ酸の調製および合成に関する詳細に関しては、特許出願ＦＲ ０２ ０７００８及びＦＲ ０３ ５０１９０を有効に参照されたい。
【００７０】
他の可能性によれば、高分子電解質ポリマーＰＥ２またはその製剤可能な塩の一つは、以下の式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）：
【化３】
（式中、
・ＧＨは、６〜３０個の炭素原子を有する疎水基を示し；
・Ｒ３０は、直鎖Ｃ２〜Ｃ６アルキル基であり；
・Ｒ５０は、Ｃ２〜Ｃ６ジアミノ、ジアルコキシ、またはアルキル基であり；
・Ｒ４は、直接結合または１〜４のアミノ酸残基を基にした「スペーサ」を示し；
・Ａ１およびＡ２は、独立して−ＣＨ２−（アスパラギン酸残基）または−ＣＨ２−ＣＨ２−（グルタミン酸残基）を示し；
・ｎ'＋ｍ'またはｎ''は、重合度として定義され、１０〜１０００の範囲であり、好ましくは５０〜３００の間である）の一つと一致する。
【００７１】
更に、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）のポリアミノ酸の調製および合成に関する詳細に関しては、特許出願ＦＲ ０３ ５０６４１を有効に参照されたい。
【００７２】
他の可能性によれば、高分子電解質ポリマー（ＰＥ１，ＰＥ２）の一つまたはそれらの製剤可能な塩の一つは、以下の式（Ｖ）：
【化４】
（式（Ｖ）中、
・Ｅは、独立して、
−ＮＨＲ基（ここで、Ｒは、Ｈ、直鎖Ｃ２〜Ｃ１０もしくは分岐Ｃ３〜Ｃ１０アルキルまたはベンジルを示す）、
次式：
【化５】
（式中：
Ｒ７は、ＯＨ、ＯＲ９またはＮＨＲ１０であり、
Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は、独立して、Ｈ、直鎖Ｃ２〜Ｃ１０もしくは分岐Ｃ３〜Ｃ１０アルキルまたはベンジルを示す）と一致する末端アミノ酸残基または末端アミノ酸誘導体、
を示し；
・Ｂは、直接結合、または二価、三価もしくは四価の結合基であり、好ましくは、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ１〜Ｃ５アルキル）−、アミノ酸（好ましくは天然アミノ酸）残基、ジオール残基、トリオール残基、ジアミン残基、トリアミン残基、アミノアルコール残基もしくは１〜６の炭素原子を有するヒドロキシ酸残基から選択され；
・Ｄは、Ｈ、直鎖Ｃ２〜Ｃ１０もしくは分岐Ｃ３〜Ｃ１０アシル基またはピログルタメートを示し；
・ＧＨは、６〜３０個の炭素原子を有する疎水基を示し；
・Ｒ７０は、以下の基：
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｗ−ＮＨ３＋（ここで、ｗは２〜６の間であり、好ましくはｗが４である）、
−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ３＋、
−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ３＋、
−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｎ＋（ＣＨ３）３、
【化６】
（式中、−Ｒ１１は、−Ｈ、−ＣＯ２Ｈ、アルキルエステル（好ましくは−ＣＯＯＭｅおよび−ＣＯＯＥｔ）、−ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ３または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）２を示す）；
次式：
【化７】
（式中、Ｘは、酸素または−ＮＨ−で、−Ｒ１２は、Ｈ、直鎖Ｃ２〜Ｃ１０もしくは分岐Ｃ３〜Ｃ１０アルキルまたはベンジルで、−Ｒ１３は、−（ＣＨ２）４−ＮＨ３＋、−（ＣＨ２）３−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ３＋、−（ＣＨ２）３ＮＨ３＋である）のアミノ酸残基またはアミノ酸誘導体；
から選択されるラジカルを示し、上記Ｒ７０基の対アニオンが、塩化物、硫酸塩、リン酸塩または酢酸塩、好ましくは塩化物であり；
・Ｒ９０は、ヒドロキシエチルアミノ−、アルキレングリコール残基またはポリオキシアルキレン残基であり；
・ｐ、ｑ、ｒおよびｓは、正の整数であり；
・（ｐ）／（ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は、疎水基ＧＨのモルグラフト度として定義され、２〜９９モル％の範囲であり、好ましくは５〜５０モル％の間であり、但し、各コポリマー鎖は、平均して、少なくとも３個の疎水性グラフトを有しており；
・（ｑ）／（ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は、カチオン性基のモルグラフト度として定義され、１〜９９モル％の範囲であり；
・（ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は、１０〜１０００の範囲であり、好ましくは３０〜５００の間であり；
・（ｒ）／（ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は、０〜９８モル％の範囲であり；
・（ｓ）／（ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は、０〜９８モル％の範囲である）と一致する。
【００７３】
リシン、オルニチンおよびアルギニン誘導体は、例えば、エチルおよびメチルエステル、アミドおよびメチル化アミドとすることができる。
【００７４】
好ましくは、この代替案に従えば、疎水基ＧＨおよびカチオン性基が、ペンダント基としてランダムに位置している。
【００７５】
さらに、疎水性単位を持つポリグルタミン酸塩のモルグラフト度は、２〜９９％の間であるのが好ましく、より好ましくは５〜５０％の間であり、但し、各コポリマー鎖は、平均して、少なくとも３個の疎水性グラフトを有する。
【００７６】
ポリグルタミン酸塩の比（ｑ）／（ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は、該ポリグルタミン酸塩がカチオン電荷を含む基を１〜約９７モル％を備えることができることを意味する。
【００７７】
ポリグルタミン酸塩の比（ｓ）／（ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は、該ポリグルタミン酸塩が中性ｐＨでアニオン性、中性またはカチオン性となることができることを意味する。
【００７８】
更に、ヒスチジンに由来する式（Ｖ）のポリアミノ酸の調製および合成に関する詳細に関しては、特許出願ＦＲ ０５ ５３３０２を有効に参照されたい。
【００７９】
ヒスチジンに由来するもの以外の式（Ｖ）のポリアミノ酸の調製および合成に関する詳細に関しては、特許出願ＦＲ ０７ ０３１８５を有効に参照されたい。
【００８０】
有利な実施形態によれば、前述の式中、Ｒ４またはＢ基が、直接結合を示す。
【００８１】
他の可能性によれば、高分子電解質ポリマー（ＰＥ１，ＰＥ２）の一つは、ヒドロキシアルキル（好ましくはエチル）グルタミン残基および複数のペンダント疎水基（ＧＨ）を有し、該疎水基は互いに同一でも異なっていてもよい。また、ヒドロキシアルキルグルタミン単位は、ヒドロキシアルキルアミン基を有する。これらヒドロキシアルキルアミン基は、好ましくは、アミド結合を介してコポリマーに結合する。これらヒドロキシアルキルグルタミン残基のグルタミン酸残基を官能基化するのに使用できるヒドロキシアルキルアミン基は、互いに同一でも異なっていてもよく、例えば、２−ヒドロキシエチルアミノ基、３−ヒドロキシプロピルアミノ基、２，３−ジヒドロキシプロピルアミノ基、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ基および６−ヒドロキシへキシルアミノ基から選択される。
【００８２】
有利には、本発明に用いる疎水基ＧＨの少なくとも一つが、疎水基（ＧＨ）をコポリグルタミン酸塩鎖（例えば、コポリグルタミン酸塩骨格の主鎖）に結合できる少なくとも一つのスペーサー接続部（または単位）（スペーサー）を備える疎水性グラフト中に含まれる。この接続部は、例えば、少なくとも一つの直接的な共有結合および／または少なくとも一つのアミド結合および／または少なくとも一つのエステル結合を備えることができる。例えば、接続部は、特に、コポリグルタミン酸塩の構成単量体単位以外の「アミノ酸」残基、アミノアルコールの誘導体、ポリアミン（例えばジアミン）の誘導体、ポリオール（例えばジオール）の誘導体およびヒドロキシ酸の誘導体からなる群に属するタイプとすることができる。ＧＨのコポリグルタミン酸塩またはポリアルキルグルタミン酸塩鎖へのグラフトは、コポリグルタミン酸塩鎖またはヒドロキシアルキルグルタミン酸残基へ結合できるＧＨ前駆体の使用を必要とする場合がある。ＧＨの前駆体は、実際には限定されず、アルコールおよびアミンから成る群から選択され、これらの化合物は当業者によって容易に官能基化できる。更に、これらのヒドロキシアルキル（好ましくはエチル）グルタミン残基に関する詳細に関しては、ＦＲ−Ａ−２ ８８１ １４０を有効に参照されたい。
【００８３】
有利な実施態様によれば、特に先に対象とした様々な可能性のうち少なくとも一つによると、本発明において用いる疎水基（ＧＨ）の全部または一部は、独立して、
・６〜３０個の炭素原子を有し、少なくとも一つのヘテロ原子（好ましくはＯおよび／またはＮおよび／またはＳ）および／または少なくとも一つの不飽和結合を有することができる直鎖または分岐アルコキシ、
・６〜３０個の炭素原子を有し、一つまたはそれ以上の環の炭素環を有し、任意に少なくとも一つの不飽和結合および／または少なくとも一つのヘテロ原子（好ましくはＯおよび／またはＮおよび／またはＳ）を有するアルコキシ、
・７〜３０個の炭素原子を有し、少なくとも一つの不飽和結合および／または少なくとも一つのヘテロ原子（好ましくはＯおよび／またはＮおよび／またはＳ）を有することができるアルコキシアリールまたはアリールオキシアルキル、
よりなるラジカルの群から選択される。
【００８４】
他の有利な実施形態によれば、特に先に対象とした様々な可能性のうち少なくとも一つによると、疎水基（ＧＨ）は、オクタノール、ドデカノール、テトラデカノール、ヘキサデカノール、オクタデカノール、オレイルアルコール、トコフェロールおよびコレステロールから成る群から選択したアルコール前駆体に由来し、また、Ｒ４は、直接結合を示す。
【００８５】
他の有利な実施形態によれば、特に先に対象とした様々な可能性のうち少なくとも一つによると、疎水基（ＧＨ）は、それぞれが互いに独立して、下記式：
【化８】
（式中：
Ｒ５は、メチル（アラニン）、イソプロピル（バリン）、イソブチル（ロイシン）、ｓｅｃ−ブチル（イソロイシン）またはベンジル（フェニルアラニン）を示し；
Ｒ６は、６〜３０個の炭素原子を有する疎水性ラジカルを示し；
ｌは、０〜６の範囲である）の一価のラジカルを示す。
【００８６】
本発明の注目すべき特徴によれば、疎水基（ＧＨ）の疎水性ラジカルＲ６の全部または一部が、独立して、
・６〜３０個の炭素原子を有し、少なくとも一つのヘテロ原子（好ましくはＯおよび／またはＮおよび／またはＳ）および／または少なくとも一つの不飽和結合を有することができる直鎖または分岐アルコキシ、
・６〜３０個の炭素原子を有し、一つまたはそれ以上の環の炭素環を有し、任意に少なくとも一つの不飽和結合および／または少なくとも一つのヘテロ原子（好ましくはＯおよび／またはＮおよび／またはＳ）を有するアルコキシ、
・７〜３０個の炭素原子を有し、少なくとも一つの不飽和結合および／または少なくとも一つのヘテロ原子（好ましくはＯおよび／またはＮおよび／またはＳ）を有することができるアルコキシアリールまたはアリールオキシアルキル、
よりなるラジカルの群から選択される。
【００８７】
実際には限定されず、上記疎水性ラジカルＲ６が、オクタノール、ドデカノール、テトラデカノール、ヘキサデカノール、オクタデカノール、オレイルアルコール、トコフェロールおよびコレステロールから成る群から選択したアルコール前駆体に由来する。
【００８８】
有利には、本発明に用いる高分子電解質ポリアミノ酸（ＰＥ１，ＰＥ２）の主鎖は、α−Ｌ−グルタミン酸塩ホモポリマー、α−Ｌ−グルタミン酸ホモポリマー、α−Ｌ−アスパラギン酸塩ホモポリマー、α−Ｌ−アスパラギン酸ホモポリマー、α−Ｌ−アスパラギン酸塩／α−Ｌ−グルタミン酸塩コポリマーおよびα−Ｌ−アスパラギン酸／α−Ｌ−グルタミン酸コポリマーから成る群から選択される。
【００８９】
注目すべき方法では、高分子電解質ポリマーＰＥ１またはＰＥ２のポリアミノ酸主鎖のアスパラギン酸および／またはグルタミン酸残基は、形成されたポリマーがランダム、ブロックタイプまたはマルチブロックタイプのいずれかであるように分布する。
【００９０】
他の規定方法によれば、高分子電解質ポリマーＰＥ１またはＰＥ２は、２０００〜１０００００ｇ／ｍｏｌの間、好ましくは５０００〜４００００ｇ／ｍｏｌの間のモル質量を有する。
【００９１】
第１および第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ１，ＰＥ２）の重合度は、５０〜５００の間で、好ましくは７０〜３００の間である。
【００９２】
主鎖中の疎水基で置換された結合部のモル分率は、１〜４０モル％の間で、好ましくは３〜３０モル％の間である。
【００９３】
本発明に用いるポリマーは、それらがｐＨｍと等しいｐＨにて全体としてカチオン性またはアニオン性となるように、上述の様々な群から選択される。
【００９４】
疎水側基を有する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）の必須の特性は、水中で自発的にコロイド溶液を形成することができることである。
【００９５】
理論に従うことを望むものではないが、疎水基の超分子会合により疎水性ドメインが形成される結果、ナノ粒子が形成されると仮定することができる。各ナノ粒子は、その疎水性ドメインの周囲で程度の差はあるが縮合したＰＥ１ポリマーの一つまたはそれ以上の鎖からなる。本発明に用いるポリマーはイオン性官能基を備え、該イオン性官能基は、ｐＨおよび組成に従って中性（例えば−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２）であるかイオン化（例えば−ＣＯＯ−、−ＮＨ３＋）していることを理解すべきである。このため、水相での溶解度は、イオン化した官能基のレベルによって直接決まり、従って、ｐＨによって直接決まる。水溶液では、カルボキシル官能基の場合、対イオンが、ナトリウム、カルシウムもしくはマグネシウム等の金属カチオン、またはトリエタノールアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンもしくはポリエチレンイミン等のポリアミン等の有機カチオンとすることができる。カチオン性基の対アニオンは、好ましくは、塩化物、硫酸塩、リン酸塩または酢酸塩から成る群から選択される。
【００９６】
当業者は、半中和ｐＨを知っているため、ｐＨを調整してポリマーのイオン化度を十分に高くし、コロイド溶液の安定性を確保する。
【００９７】
本発明に使用できるポリアミノ酸型の高分子電解質は、例えば、当業者に既知の方法で得られる。ランダムポリアミノ酸は、「スペーサー」によって予め官能基化した疎水性グラフトを通常のカップリング反応によってポリマーに直接グラフトすることから得られることができる。ブロックまたはマルチブロックポリアミノ酸の高分子電解質は、対応するＮ−カルボキシアミノ酸無水物（ＮＣＡ）の逐次重合によって得られることができる。
【００９８】
ポリアミノ酸、ホモポリグルタミン酸塩、ホモポリスパラギン酸塩またはブロック、マルチブロックもしくはランダムのグルタミン酸塩／アスパラギン酸塩コポリマーは、例えば、通常の方法に従って調製される。
【００９９】
α型のポリアミノ酸を得るために最も広く用いられている技術は、例えば、論文「Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，１９７６，１５，１８６９」およびＨ．Ｒ．Ｋｒｉｃｈｅｌｄｏｒｆによる研究「ａｌｐｈａ−Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ Ｎ−ｃａｒｂｏｘｙ Ａｎｈｙｄｒｉｄｅｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ」，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９８７）に記載されるように、Ｎ−カルボキシアミノ酸無水物（ＮＣＡ）の重合に基づいている。ＮＣＡ誘導体は、好ましくは、ＮＣＡ−Ｏ−Ｍｅ、ＮＣＡ−Ｏ−ＥｔまたはＮＣＡ−Ｏ−Ｂｚ誘導体（Ｍｅ＝メチル、Ｅｔ＝エチルおよびＢｚ＝ベンジル）である。その後、ポリマーは、酸の形でポリマーを得るための適切な条件下で加水分解される。これらの方法は、出願人の会社による特許ＦＲ−Ａ−２ ８０１ ２２６にて与えられた説明によって引き出される。本発明に従って使用できるいくらかのポリマーは、例えば、様々な重量を有するポリ（α−Ｌ−アスパラギン酸）、ポリ（α−Ｌ−グルタミン酸）、ポリ（α−Ｄ−グルタミン酸）およびポリ（γ−Ｌ−グルタミン酸）のタイプであり、商業的に入手できる。α，β型のポリアスパラギン酸は、アスパラギン酸の縮合（ポリコハク酸イミドを得る）と、その後の塩基性加水分解によって得られる（Ｔｏｍｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｌｙｍｅｒ，１９９７，３８，４７３３−３６参照）。
【０１００】
疎水性グラフトＧＨのポリマーの酸性官能基とのカップリングは、カップリング剤としてのカルボジイミドおよび任意に４−ジメチルアミノピリジン等の触媒の存在下、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の適切な溶媒中でのポリアミノ酸の反応によって容易に行われる。カルボジイミドは、例えば、ジシクロへキシルカルボジイミドまたはジイソプロピルカルボジイミドである。グラフト度は、成分および反応物質の化学量論または反応時間によって化学的に制御される。「スペーサー」によって官能基化した疎水性グラフトは、通常のペプチドカップリングまたは酸性触媒による直接縮合によって得られる。
【０１０１】
カチオン性基および任意には中性基のポリマーの酸性官能基とのカップリングは、カップリング剤としてのクロロホルマートの存在下、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の適切な溶媒中、第二の段階において同時に行われる。
【０１０２】
カチオン性基が化学的に差異がない２個のアミン官能基を有する場合（例えば、直鎖ジアミン）、２個の官能基のうち１個を保護する形でそれを導入することができる。その後、保護基を開裂する最終段階を加える。
【０１０３】
重合化学および基をカップリングする反応は、従来続けられており、当業者によく知られている（例えば、上述の出願人による特許および特許出願参照）。
【０１０４】
予め合成された疎水性グラフトを持つＮＣＡ誘導体は、ブロックまたはマルチブロックコポリマーの合成に用いられる。例えば、ＮＣＡ−疎水基の誘導体は、ＮＣＡ−Ｏ−ベンジルと共重合し、次いでベンジル基を加水分解により選択的に除去する。
【０１０５】
本発明に従う高分子電解質ポリマー（ＰＥ１およびＰＥ２）の特に好適な会合の例は、以下の例において説明される。
【０１０６】
本発明に用いるポリマーの必須の特性は、第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）がコロイド溶液の形態であり、第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）がｐＨ３〜８のうち少なくとも一つのｐＨｍ値で溶液またはコロイド溶液の形態であることである。
【０１０７】
この条件を満たすため、カチオン性ポリマーの半中和ｐＨは、十分に高くすることであり、例えば５．５より大きく、好ましくは６より大きく、さらには８より大きい。また、アニオン性ポリマーの半中和ｐＨは、十分に低くすることであり、例えば６．５より小さく、好ましくは、６．０より小さく、さらには５．５より小さい。
【０１０８】
特に、第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）がアニオン性であるという代替の態様においては、後者は、半中和ｐＨが３〜６．５の間、好ましくは４．５〜６．５の間を示すように選択される。この代案の態様によれば、第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）は、ｐＨ６〜８のｐＨｍ値に対してコロイド溶液を形成する。
【０１０９】
かかるポリマーＰＥ１は、特に例１ａ）にて説明される。
【０１１０】
この場合、第１の可能性によると、第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）は、カチオン性であり、８未満のｐＨでコロイド溶液を形成する。好ましくは、第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）は、８より大きい半中和ｐＨを示すように選択される。かかるポリマーＰＥ２は、特に例１ｄ）にて説明される。
【０１１１】
したがって、第１の可能性によれば、ｐＨ６〜８のｐＨｍ値に対して、第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）はコロイド溶液を形成し、第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）は溶液またはコロイド溶液を形成する。
【０１１２】
この場合、本発明の重要な特徴によると、第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）の重量の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）の重量に対する比は、電荷比Ｚのために選択され、イオン化したカチオン性基のモル数のイオン化したアニオン性基のモル数に対する比は、ｐＨｍで測定すると、０．２５〜３の間であり、好ましくは０．２５〜１．５の間である。
【０１１３】
第２の可能性によれば、第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）は、カチオン性であり、６未満のｐＨでコロイド溶液を形成し、６．５より大きいｐＨでは沈殿物を形成する。好ましくは、第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）は、半中和ｐＨが５．５〜７の間を示すように選択される。かかるポリマー（ＰＥ２）は、特に例１ｃ）にて説明される。この場合、本発明の重要な特徴によると、ｐＨ３〜６のｐＨｍ値に対して、第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）はコロイド溶液を形成し、第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）は溶液またはコロイド溶液を形成する。第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）の重量の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）の重量に対する比は、電荷比Ｚのために選択され、ｐＨｍで測定すると、３．５〜３０の間であり、好ましくは５〜１５の間であり、さらに好ましくは８〜１２の間である。
【０１１４】
第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）がカチオン性であるという他の代替の態様においては、後者は、５より大きい半中和ｐＨを示すように選択される。この場合、第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）は、アニオン性であり、半中和ｐＨが３〜６．５の間、好ましくは４．５〜６．５の間を示すように選択される。
【０１１５】
本発明に従う粒子は、生理学的ｐＨで、Ｔテストにて測定した大きさが１〜１００ミクロンの間を示す。
【０１１６】
有利には、本発明に従う粒子は、化学的に架橋されない。
【０１１７】
本発明の具体的な実施において、粒子は、生理学的ｐＨで、０．１５〜１．１の間、好ましくは０．３〜１．０の間、さらに好ましくは０．５〜１．０の間の高いポリマーかさ密度を示す。高いポリマーかさ密度は、密な網状構造のポリマー鎖の粒子内での存在を示す。理論に従うことを望むものではないが、この密な網状構造は、本発明に従う粒子中に存在する活性成分（ＡＰ）の外部媒体への拡散を遅らせて、そのため、その放出を遅らせることに寄与する。本発明に従う密集した粒子の驚くべき態様は、該粒子を構成するポリマー鎖の網状構造によって、活性成分（ＡＰ）の放出を遅らせることができるが、該粒子の中心でこの同じ活性成分（ＡＰ）を補足しないことである。したがって、本発明に従う輸送体は、活性成分（ＡＰ）の持続的放出と良好な生物学的利用能の両方を得ることができる。
【０１１８】
一部の場合、特に本発明に従う微粒子と強い親和性を有するペプチドまたはタンパク質の場合においては、放出を加速しおよび／またはその生物学的利用能を改善するため、ＡＰ放出速度を調節することが有利な場合がある。多くの試験の後、所定の極性を有するＰＥ１またはＰＥ２ポリマーが異極性のイオン性基および／またはヒドロキシエチルアミノ−置換基等の非イオン性基をも有する場合、タンパク質またはペプチドの放出を促進できることを出願人によって実証された。
【０１１９】
したがって、本発明の具体的な実施では、２つのポリマーＰＥ１またはＰＥ２のうち一つは、同時に、
１５〜５０モル％のグルタミン酸塩モノマー；
２０〜５５モル％のヒドロキシエチルアミノ−置換基等の非イオン性モノマー；
１０〜４０モル％の半中和ｐＨが８より大きいカチオン性基を有するモノマー；
３〜１５モル％の疎水基によって置換された非イオン性モノマー；
を備える。
【０１２０】
本発明の他の具体的な実施では、ＰＥ１またはＰＥ２ポリマーは、カチオン性であり、また、同時に、
０〜５モル％のグルタミン酸塩モノマー；
５０〜８５モル％のヒドロキシエチルアミノ−置換基等の非イオン性モノマー；
１０〜４０モル％の半中和ｐＨが８より大きいカチオン性基を有するモノマー；
３〜１５モル％の疎水基によって置換された非イオン性モノマー；
を備える。
【０１２１】
本発明の具体的な実施では、製剤中に存在するポリマー（ＰＥ１＋ＰＥ２）の全濃度は、特に活性成分（ＡＰ）が治療用タンパク質である場合に４〜１５ｍｇ／ｍｌの間である。この濃度の範囲内では、小口径の針、例えばゲージ２７、実際にはゲージ２９、更にはゲージ３１の針を介して、製剤を容易に注入することができる。例３および４は、かかる製剤を詳細に説明する。
【０１２２】
活性成分（ＡＰ）に関して、好ましくは、タンパク質、糖タンパク質、一つまたはそれ以上のポリアルキレングルコール鎖と結合したタンパク質［好ましくは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）：「ＰＥＧ化タンパク質」］、ペプチド、多糖類、リポ糖類、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびそれらの混合物から成る群から選択され、より好ましくは、エポエチンアルファ、エポエチンベータ、ダーベポエチン等のエリスロポエチン、ヘモグロビンラフィマー、それらの類似体もしくはそれらの誘導体；オキシトシン、バソプレシン、副腎皮質刺激ホルモン、上皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、造血を刺激する因子およびそれらの混合物の他、アルテプラーゼ、テネクテプラーゼ、第ＶＩＩ（ａ）因子または第ＶＩＩ因子等の血液因子；ヘモグロビン、シトクロム、アルブミン、プロラクチン、ルリベリンの他、ロイプロリド、ゴセレリン、トリプトレリン、ブセレリンまたはナファレリン等の黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）および類似体；ＬＨＲＨアンタゴニスト、ＬＨＲＨ競合体、ヒト、ブタまたはウシの成長ホルモン（ＧＨｓ）、成長ホルモン放出因子、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン、インターロイキンまたはそれらの混合体（ＩＬ−２，ＩＬ−１１，ＩＬ−１２）の他、インターフェロンアルファ、アルファ−２ｂ、ベータ、ベータ−１ａまたはガンマ等のインターフェロン；ガストリン、テトラガストリン、ペンタガストリン、ウロガストロン、セクレチン、カルシトニン、エンケファリン、エンドモルフィン、アンジオテンシン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）の他、ベクラペルミン、トラフェルミン、アンセスチムまたはケラチノサイト成長因子等の成長因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、ヘパリナーゼ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ｈＡＮＰ、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）、ＶＥＧ−Ｆ、組換えＢ型肝炎表面抗原（ｒＨＢｓＡｇ）、レニン、サイトカイン、ブラジキニン、バシトラシン、ポリミキシン、コリスチン、チロシジン、グラミシジン、エタネルセプト、イミグルセラーゼ、ドロトレコギンアルファ、シクロスポリンおよび合成類似体、並びに酵素、サイトカイン、抗体、抗原およびワクチンの製剤可能な修飾体および断片、リツキシマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、アダリムマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、エファリズマブおよびセツキシマブ等の抗体の部分群から選択される。
【０１２３】
他の活性成分は、多糖類（例えばヘパリン）およびオリゴ−またはポリヌクレオチド、ＤＮＡ，ＲＮＡ，ｉＲＮＡ，抗体および生細胞である。活性成分の他の分類は、中枢神経系で作用する医薬品物質、例えば、リスペリドン、ズクロペンチキソール、フルフェナジン、ペルフェナジン、フルペンチキソール、ハロペリドール、フルスピリレン、クエチアピン、クロザピン、アミスルプリド、スルピリド、ジプラシドン等を含む。
【０１２４】
実施態様によれば、活性成分は、アントラサイクリン、タキソイドもしくはカンプトテシンの群に属するタイプまたはロイプロリドもしくはシクロスポリン等のペプチドの群に属するタイプの疎水性、親水性または両親媒性の有機小分子、およびそれらの混合物である。
【０１２５】
本説明の意義の範囲内で、小分子は、特に非タンパク性小分子であり、例えばアミノ酸がない。
【０１２６】
他の実施態様によれば、活性成分は、有利には、以下に示す活性物質の群の内の少なくとも１種から選択される。アルコール依存症の治療薬、アルツハイマー病の治療薬、麻酔薬、末端肥大症の治療薬、鎮痛剤、抗ぜんそく薬、アレルギーの治療薬、抗癌剤、抗炎症薬、抗凝結剤および抗トロビン薬、抗けいれん剤、抗てんかん薬、抗糖尿病薬、制吐薬、抗緑内障薬、抗ヒスタミン剤、抗感染薬、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗パーキンソン薬、抗コリン作用薬、咳止め、炭酸脱水酵素阻害薬、心血管作動薬、脂質低下薬、抗不整脈剤、血管拡張剤、抗狭心症薬、降圧剤、血管保護剤、コリンエステラーゼ阻害剤、中枢神経系疾患の治療薬、中枢神経系の刺激剤、避妊薬、受精促進剤、子宮陣痛の誘導剤および阻害剤、嚢胞性線維症の治療薬、ドーパミン受容体作用薬、子宮内膜症の治療薬、勃起障害の治療薬、不妊治療の薬、消化器疾患の治療薬、免疫刺激剤および免疫抑制剤、記憶障害の治療薬、抗片頭痛薬、筋弛緩剤、ヌクレオシド類似体、骨粗鬆症の治療薬、副交感神経興奮薬、プロスタグランジン、精神刺激薬、鎮静剤、睡眠薬および精神安定剤、神経安定剤、抗不安薬、精神刺激薬、抗うつ剤、皮膚治療薬、ステロイドおよびホルモン、アンフェタミン、食欲抑制剤、ノンアナルジージクペインキラー（nonanalgesic painkiller）、バルビツール酸系催眠薬、ベンゾジアゼピン、下剤、向精神薬、およびこれらの製品の組み合わせである。
【０１２７】
他の態様によれば、本発明の対象は、少なくとも一つの活性成分を持続放出するための粒子を調製する方法であり、これらの粒子は、特に上述したものであり、該方法は、
１）ｐＨ３〜８のｐＨｍ値で、帯電状態で疎水側基（ＧＨ）を有する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド水溶液を準備する工程であって、前記第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）が、ｐＨ３〜８のうち少なくとも一つのｐＨｍ値で粒子のコロイド溶液を水中で自発的に形成することができる工程と、
２）少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を、工程１）において得た第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）に加える工程であって、前記活性成分が、前記第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド溶液の粒子と非共有結合している工程と、
３）第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）と異極性の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）を準備する工程であって、前記第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）は、前記ｐＨのうち少なくとも一つの前記ｐＨｍ値で溶液またはコロイド溶液を水中で形成し、但し、第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）がポリアミノ酸である場合、第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）はポリリシンもしくはポリエチレンイミンのいずれでもない工程と、
４）ｐＨｍと等しいｐＨで、工程２）において得られた活性成分（ＡＰ）と会合した粒子のコロイド溶液の形の第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）を、工程３）において得られた溶液またはコロイド溶液の形の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）と混合する工程と、
を備える。
【０１２８】
本発明の他の対象は、少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出するための粒子を調製する方法であり、これらの粒子は、特に上述したものの一部と一致しており、該方法は、
１）ｐＨ３〜８のｐＨｍ値で、帯電状態で疎水側基（ＧＨ）を有する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド水溶液を準備する工程であって、前記第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）が、ｐＨ３〜８のうち少なくとも一つのｐＨｍ値で粒子のコロイド溶液を水中で自発的に形成することができる工程と、
２）少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を、工程１）において得た第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）に加える工程であって、前記活性成分が、前記第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド溶液の粒子と非共有結合している工程と、
３）第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）と異極性で且つ疎水側基（ＧＨ）を有する第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）を準備する工程であって、前記第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）が、前記ｐＨのうち少なくとも一つの前記ｐＨｍ値で溶液またはコロイド溶液を水中で形成する工程と、
４）ｐＨｍと等しいｐＨで、工程２）において得られた活性成分（ＡＰ）と会合した粒子のコロイド溶液の形の第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）を、工程３）において得られた溶液またはコロイド溶液の形の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）と混合する工程と、
を備える。
【０１２９】
本発明に従う方法の必須の特徴は、活性成分（ＡＰ）を積んだ第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）の粒子のコロイド溶液をｐＨｍにて異極性の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）の溶液またはコロイド溶液と単純に混合することによって自発的に粒子を形成することである。
【０１３０】
タンパク質、ペプチドまたは小分子等の活性成分は、ポリアミノ酸型の第１ポリマー（ＰＥ１）と共に自発的に結合することができる。活性成分（ＡＰ）を有する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のナノ粒子の帯電は、活性成分（ＡＰ）の溶液を第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド溶液と単純に混合することによって行われる。この会合は、純粋に物理的であり、活性成分（ＡＰ）とポリマー（ＰＥ１）間の共有結合の形成を必要としない。理論に従うものではないが、この非特異的な会合は、ポリマー（ＰＥ１）と活性成分（ＡＰ）間の疎水的および／または静電気的な相互作用によって起こると考えられる。ＡＰをＰＥ１ナノ粒子に、ペプチドの性質を持つ特定の受容体または抗原／抗体もしくは酵素／基質型の特定の受容体を介して結合する必要がなく、多くの場合、望ましくないことさえあることに注意すべきである。
【０１３１】
本発明に従う方法の好ましい実施形態においては、得られた粒子の化学的な架橋の段階が与えられない。したがって、本発明に従う粒子は、化学的に架橋されないが、それでも長期間にわたって活性成分（ＡＰ）を放出する。この化学的な架橋がないことは、本発明に従う粒子の決定的な利点である。これは、化学的な架橋がないことによって、活性成分（ＡＰ）を有する粒子を架橋する間、活性成分（ＡＰ）の化学分解を避けることができるからである。これは、かかる化学的な架橋が一般に重合可能なものの活性化によって行われ、ＵＶ放射物またはグルタルアルデヒド等の変性剤を元来含むからである。
【０１３２】
有利には、本発明に従う方法は、乾燥粉末の形態で粒子を得るために、（例えば凍結乾燥または微粒化によって）得られた粒子の懸濁液を脱水する工程を備える。
【０１３３】
他の態様によれば、本発明の対象は、少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出するための製剤であり、該製剤は、上述の粒子の水性懸濁液または上述の方法により得た粒子の水性懸濁液を備える。
【０１３４】
また、本発明は、少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を長時間放出するための固体の製剤に関するものであり、該製剤は、
・少なくとも１つの活性成分（ＡＰ）を有する粒子に基づいた乾燥粉末の形態を備え、該粒子が、上述の粒子もしくは上述の方法によって得られた粒子であり、
・または、上述の水性懸濁液を備える製剤から得られた乾燥粉末の形態を備える。
【０１３５】
有利には、かかる固体製剤は、吸入投与および肺内投与に使用される。
【０１３６】
他の態様によれば、本発明の対象は、薬剤を調製する方法であり、特に、非経口、粘膜、皮下、筋内、皮内、経皮、腹腔内もしくは大脳内投与、または腫瘍への投与用、或いは経口、経鼻、肺、膣もしくは眼球経路による投与用の薬剤を調製する方法であり、前記方法は、上述の製剤の少なくとも一つを用いることから本質的になる。
【実施例】
【０１３７】
１）合成
ａ）疎水基を有するアニオン性高分子電解ポリマーＰＥ１−Ａの合成（合成起源のα−トコフェロールでグラフトしたポリグルタミン酸塩）
ポリ（α−Ｌ−グルタミン酸）１５ｇ（ポリオキシエチレン基準に対して約１６９００Ｄａに相当する重量であり、特許出願ＦＲ−Ａ−２ ８０１ ２２６に記載されるように、ＮＣＡ−ＧｌｕＯＭｅの重合と、その後の加水分解とによって得られる）を８０℃で加熱しながらジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２８８ｍｌ中に溶解させ、ポリマーを溶解させた。その溶液を１５℃に冷却し、あらかじめ８ｍｌのＤＭＦ中に溶解させた２．５ｇのＤ，Ｌ-α−トコフェロール（＞９８％、ＦＬｕｋａ（登録商標）から得られる）と、あらかじめ１ｍｌのＤＭＦ中に溶解させた２８０ｍｇの４−ジメチルアミノピリジンと、あらかじめ６ｍｌのＤＭＦ中に溶解させた１．６ｇのジイソプロピルカルボジイミドとを続けて加える。３時間攪拌した後、反応媒体を、１５％の塩化ナトリウムと塩酸を含む水１２００ｍｌ（ｐＨ２）に注入する。その後、沈澱したポリマーを濾過によって回収し、０．１Ｎの塩酸、水、およびジイソプロピルエーテルで洗浄する。その後、ポリマーを真空下４０℃のオーブン中で乾燥させる。およそ９０％の収率を得る。モル質量を立体排除クロマトグラフィーによって測定したところ、ポリオキシエチレン基準に対して１５５００である。グラフトしたトコフェロールのレベルをプロトンＮＭＲ分光法によって評価したところ、５．１モル％である。
【０１３８】
ｂ）アニオン性高分子電解ポリマーＰＥ１−Ｂの合成（ポリグルタミン酸ナトリウム）
特許出願ＦＲ−Ａ−２ ８０１ ２２６に記載のポリ（α−Ｌ−ポリグルタミン酸）の合成を適用する。
【０１３９】
モル質量を立体排除クロマトグラフィーによって測定したところ、ポリオキシエチレン基準に対して１６９００Ｄａである。
【０１４０】
ｃ）カチオン性高分子電解ポリマーＰＥ２−Ａの合成（合成起源のα−トコフェロールとヒスチジンアミドとでグラフトしたポリグルタミン酸塩）
【化９】
指数および基：ｍ＝１１、ｐ＝２０９、ｑ＝０、Ｔ＝Ｄ，Ｌ−α−トコフェリル（Ｔ）
【０１４１】
５％ラセミ体のα−トコフェロールでランダムにグラフトしたＤＰが２２０のポリ（グルタミン酸）３ｇをＮＭＰ３８ｍｌ中に８０℃で加熱することにより溶解させる。この溶液を０℃に冷却し、２．７４ｇのクロロギ酸イソブチルと、次いで２．２ｍｌのＮ−メチルモルホリンを加える。０℃の温度を維持しながら反応媒体を１０分間攪拌する。同時に、８．６５ｇのヒスチジンアミド・二塩酸塩を１０８ｍｌのＮＭＰ中に懸濁させる。その次に、１０．６ｍｌのトリエチルアミンを加え、得られた懸濁液を２０℃で数分間攪拌した後、０℃に冷却する。次いで、活性化したポリマーの溶液をヒスチジンアミド懸濁液に加える。反応媒体を０℃で２時間攪拌した後、２０℃で一晩攪拌する。その後、０．６２ｍｌの３５％ＨＣｌと、次いで８３ｍｌの水を加える。その後、得られた溶液をｐＨ３〜４の５００ｍｌの水に注ぎ込む。その後、その溶液を８分量の食塩水（０．９％のＮａＣｌ）と４分量の水に対してダイアフィルターで濾過する。その後、ポリマー溶液を３００ｍｌの体積に濃縮する（ポリマー濃度は１８ｍｇ／ｇである）。グラフトしたヒスチジンアミドの割合は、Ｄ２Ｏにて１ＨＮＭＲにより測定したところ、９５％である。
【０１４２】
ｄ）カチオン性高分子電解ポリマーＰＥ２−Ｂの合成（合成起源のα−トコフェロールとアルギニンとでグラフトしたポリグルタミン酸塩）
【化１０】
指数および基：Ｔ＝Ｄ，Ｌ−α−トコフェリル、ｐ＝ｓ＝１１、ｑ＝１９８、ｒ＝０
【０１４３】
５％ラセミ体のα−トコフェロールでランダムにグラフトしたＤＰが２２０のポリ（グルタミン酸）１０ｇをＮＭＰ１２５ｍｌ中に８０℃で溶解させる。この溶液を０℃に冷却し、８．７ｍｌのクロロギ酸イソブチルと、次いで７．３５ｍｌのＮ−メチルモルホリンを加える。この反応混合物を０℃で１５分間攪拌する。同時に、２４．６７ｇのアルギニンアミド・二塩酸塩を３０８ｍｌのＮＭＰ中に懸濁させ、１４．７ｍｌのトリエチルアミンを加える。得られた懸濁液を２０℃で数分間攪拌した後、０℃に冷却する。次いで、活性化したポリマーの乳濁液をこの懸濁液に加え、反応混合物を０℃で２時間攪拌した後、２０℃で一晩攪拌する。その次に、２．１ｍｌの３５％ＨＣｌ溶液と、次いで１００ｍｌの水とを加えた後、反応混合物を１．６ｌの水に滴下する。その後、得られた溶液を８分量の食塩水（０．９％）と４分量の水に対してダイアフィルターで濾過し、約２５０ｍｌの体積に濃縮する。グラフトしたアルギニンアミドの割合は、Ｄ２ＯにてプロトンＮＭＲにより測定したところ、９０％である。
【０１４４】
ｅ）カチオン性高分子電解ポリマーＰＥ２−Ｃの合成（合成起源のα−トコフェロールと、アルギニンと、エタノールアミンとでグラフトしたポリグルタミン酸塩）
【化１１】
指数および基：Ｔ＝Ｄ，Ｌ−α−トコフェリル、ｐ＝１１、ｑ＝８８、ｒ＝９９、ｓ＝２２
【０１４５】
５％ラセミ体のα−トコフェロールでランダムにグラフトしたＤＰが２２０のポリ（グルタミン酸）１０ｇをＮＭＰ１２５ｍｌ中に８０℃で溶解させる。この溶液を０℃に冷却し、９．１ｍｌのクロロギ酸イソブチルと、次いで７．７１ｍｌのＮ−メチルモルホリンを加える。この反応混合物を０℃で１５分間攪拌する。同時に、８．２ｇのアルギニンアミド・二塩酸塩を１０３ｍｌのＮＭＰ中に懸濁させ、９．３１ｍｌのトリエチルアミンを加える。更に、１．６ｍｌのエタノールアミンを加え、得られた懸濁液を２０℃で数分間攪拌した後、０℃に冷却する。次いで、活性化したポリマーの乳濁液をこの懸濁液に加え、反応混合物を０℃で２時間攪拌する。１．２ｍｌのエタノールアミンを加えた後、反応混合物を２０℃で一晩攪拌する。２．１ｍｌの３５％ＨＣｌ溶液と、次いで２００ｍｌの水とを加えた後、反応混合物を７００ｍｌの水に滴下し、ｐＨを７．４に調整する。得られた溶液を８分量の食塩水（０．９％）と４分量の水に対してダイアフィルターで濾過し、約２５０ｍｌの体積に濃縮する。グラフトしたアルギニンアミドとグラフトしたエタノールアミンの割合は、Ｄ２ＯにてプロトンＮＭＲにより測定したところ、それぞれ４０％と４５％である。
【０１４６】
ｆ）カチオン性高分子電解ポリマーＰＥ２−Ｄの合成（合成起源のα−トコフェロールと、アルギニンと、エタノールアミンとでグラフトしたポリグルタミン酸塩）
【化１２】
指数および基：Ｔ＝Ｄ，Ｌ−α−トコフェロール、ｐ＝１１、ｑ＝４８、ｒ＝１５０、ｓ＝１１
【０１４７】
５％ラセミ体のα−トコフェロールでランダムにグラフトしたＤＰが２２０のポリ（グルタミン酸）１０ｇをＮＭＰ１２５ｍｌ中に８０℃で溶解させる。この溶液を０℃に冷却し、８．７ｍｌのクロロギ酸イソブチルと、次いで７．３ｍｌのＮ−メチルモルホリンを加える。この反応混合物を０℃で１５分間攪拌する。同時に、４．６１ｇのアルギニンアミド・二塩酸塩を５８ｍｌのＮＭＰ中に懸濁させ、２．９ｍｌのトリエチルアミンを加える。更に、２．８ｍｌのエタノールアミンを加え、得られた懸濁液を２０℃で数分間攪拌した後、０℃に冷却する。次いで、活性化したポリマーの乳濁液をこの懸濁液に加え、反応混合物を０℃で４時間攪拌する。１．２ｍｌのエタノールアミンを加えた後、反応混合物を２０℃で一晩攪拌する。２．１ｍｌの３５％ＨＣｌ溶液を加えた後、反応混合物を７３０ｍｌの水に滴下し、ｐＨを７．４に調整する。得られた溶液を８分量の食塩水（０．９％）と４分量の水に対してダイアフィルターで濾過し、約３００ｍｌの体積に濃縮する。グラフトしたアルギニンアミドとグラフトしたエタノールアミンの割合は、Ｄ２ＯにてプロトンＮＭＲにより測定したところ、それぞれ２２％と６８％である。
【０１４８】
２）例１（比較）：疎水基を示さない高分子電解質の粒子の調製
（１）ポリマーＰＥ１−Ｂのコロイド溶液の調製
上述の合成ｂ）に従って得られたポリマーＰＥ１−Ｂを用いる。このポリマーは５．９８５に等しい半中和ｐＨを有する。
ポリマーＰＥ１−Ｂのコロイド溶液を水中に溶解させることで得、ＮａＯＨ溶液を加えることでｐＨを７．６３に調整する。必要量のＮａＣｌ水溶液を導入することによって、溶液のオスモル濃度を１００ｍＯｓｍに調整する。ポリマーＰＥ１−Ｂの濃度を８．３８ｍｇ／ｇに調整する。
【０１４９】
（２）タンパク質のポリマーＰＥ１−Ｂとの会合
濃縮された２．４ｍｇ／ｇのタンパク質ＩＦＮ−α（ＰＣ ＧＥＮ）を、先のポリマーＰＥ１−Ｂのコロイド溶液に加える。以下の特徴を有する会合が得られる。
【表１】
２５℃で一晩攪拌して会合を形成する。
【０１５０】
（３）ポリＬ−アルギニン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｐ７６３７）のコロイド溶液の調製
このポリマーは、９より大きい半中和ｐＨを有する。
まず、ＨＣｌ溶液でｐＨを０．９２に調整してポリ−Ｌ−アルギニンを水中に溶解し、次にＮａＯＨ溶液でｐＨを６．９１にまで戻し、４５℃で１５分間溶液を加熱することによって、ポリＬ−アルギニンのコロイド溶液を得る。ポリＬ−アルギニンのポリマー濃度を５．１３ｍｇ／ｇに調整する。
【０１５１】
（４）粒子を得るための混合
１．３７ｇのポリＬ−アルギニン溶液を１．０６ｇのＩＦＮ−α／ＰＥ１−Ｂ溶液へ４５℃で攪拌しながら滴下して加える。攪拌を４５℃で１５分間行う。次いで、攪拌を４℃で一晩行う。
以下、得られた粒子の特性を表Ｉに示す。
電荷比Ｚは、６．９５に等しいｐＨｍで測定した、イオン化したカチオン性基のモル数のイオン化したアニオン性基のモル数に対する比である。
粒径をＴテストに従って測定する。
【表２】
【０１５２】
（５）タンパク質のカプセル化の定量化
懸濁液を８０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、浮遊物中のＩＦＮ−αをヨーロッパ薬局方に記載の方法によって分析する（ＵＶ吸光度による比色分析）。
【表３】
実質的には、導入したタンパク質の３分の１が形成した微粒子中でカプセル化していない。この割合は、制御された放出をもたらすことができない。
【０１５３】
３）例２：疎水基を示す単一の高分子電解質（ＰＥ１）の粒子の調製
（１）ポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液の調製
上述の合成ａ）に従って得られたポリマーＰＥ１−Ａを用いる。このポリマーは５．４４５に等しい半中和ｐＨを有する。
ポリマーＰＥ１−Ａを水中に溶解することで、ポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液を得、ＮａＯＨ溶液を加えることでｐＨを７．５３に調整する。必要量のＮａＣｌ水溶液を導入することによって、溶液のオスモル濃度を１０１ｍＯｓｍに調整する。ポリマーＰＥ１−Ｂの濃度を８．４１ｍｇ／ｇに調整する。
【０１５４】
（２）タンパク質のポリマーＰＥ１−Ａとの会合
濃縮された２．４ｍｇ／ｇのタンパク質ＩＦＮ−αを先のポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液に加える。以下の特徴を有する会合が得られる。
【表４】
２５℃で一晩攪拌して会合を形成する。
【０１５５】
（３）ポリＬ−アルギニン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｐ７６３７）のコロイド溶液の調製
例１において説明した方法と同様にして、溶液を調製する。
【０１５６】
（４）粒子を得るための混合
１．２４ｇのポリＬ−アルギニン溶液を１．０７ｇのＩＦＮ−α／ＰＥ１−Ａ溶液へ４５℃で攪拌しながら滴下して加える。攪拌を４５℃で１５分間行う。次いで、攪拌を４℃で一晩行う。
以下、得られた粒子の特性を表ＩＩに示す。
電荷比Ｚを６．８８に等しいｐＨｍで測定する。
粒径をＴテストに従って測定する。
【表５】
【０１５７】
（５）タンパク質のカプセル化の定量化
懸濁液を８０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、浮遊物中のＩＦＮ−αをヨーロッパ薬局方に記載の方法によって分析する（ＵＶ吸光度による比色分析）。
【表６】
導入したタンパク質の全部が形成した微粒子中でカプセル化する。
【０１５８】
４）例３：ＩＦＮ−αを有する、ＰＥ１−ＡとＰＥ２−Ａとを基にした粒子の調製
４．１）例３．１：１０ｍｇ／ｇにほぼ等しいポリマーの最終濃度、約１に等しいＺ
（１）ポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液の調製
上述の合成ａ）に従って得られたポリマーＰＥ１−Ａを用いる。このポリマーは５．４４５に等しい半中和ｐＨを有する。
ポリマーＰＥ１−Ａを水中に溶解することで、ポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液を得、ＮａＯＨ溶液を加えることでｐＨを７．４５に調整する。必要量のＮａＣｌ水溶液を導入することによって、溶液のオスモル濃度を１０８ｍＯｓｍに調整する。ポリマーＰＥ１の濃度を２３．８８ｍｇ／ｇに調整する。
【０１５９】
（２）タンパク質のポリマーＰＥ１−Ａとの会合
濃縮された２．４ｍｇ／ｇのタンパク質ＩＦＮ−αおよび８９ｍＯｓｍのＮａＣｌを先のポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液に加える。以下の特徴を有する会合が得られる。
【表７】
２５℃で一晩攪拌して会合を形成する。その次に、会合をｐＨ５．０７に調整する。
【０１６０】
（３）ポリマーＰＥ２−Ａのコロイド溶液の調製
上述の合成ｃ）に従って得られたポリマーＰＥ２−Ａを用いる。このポリマーは６．０５に等しい半中和ｐＨを有する。
ポリマーＰＥ２−Ａを水中に溶解することで、ポリマーＰＥ２−Ａのコロイド溶液を得、ｐＨを５．１７に調整する。溶液のオスモル濃度を２８９ｍＯｓｍに調整し、ポリマーＰＥ２−Ａの濃度を５．７０ｍｇ／ｇに調整する。
【０１６１】
（４）粒子を得るための混合
４．９８ｇのＰＥ２−Ａ溶液を４．６１ｇのＩＦＮ−α／ＰＥ１−Ａ溶液へ攪拌しながら滴下して加える。攪拌を４℃で一晩行う。
以下、得られた粒子の特性を表ＩＩＩに示す。
電荷比Ｚを５．１７に等しいｐＨｍで測定する。
粒径をＴテストに従って測定する。
【表８】
【０１６２】
４．２）例３．２：５ｍｇ／ｇに等しいポリマーの最終濃度、約１０に等しいＺ
（１）ポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液の調製
上述の合成ａ）に従って得られたポリマーＰＥ１−Ａを用いる。
ポリマーＰＥ１を水中に溶解することで、ポリマーＰＥ１のコロイド溶液を得、ＮａＯＨ溶液を加えることでｐＨを７．５２に調整する。必要量のＮａＣｌ水溶液を導入することによって、溶液のオスモル濃度を１０８ｍＯｓｍに調整する。ポリマーＰＥ１の濃度を２０．２１ｍｇ／ｇに調整する。
【０１６３】
（２）タンパク質のポリマーＰＥ１−Ａとの会合
濃縮された２．４ｍｇ／ｇのタンパク質ＩＦＮ−αおよび８９ｍＯｓｍのＮａＣｌを先のポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液に加える。以下の特徴を有する会合が得られる。
【表９】
２５℃で一晩攪拌して会合を形成する。その後、会合をｐＨ４．８８に調整する。
【０１６４】
（３）ポリマーＰＥ２−Ａのコロイド溶液の調製
上述の合成ｃ）に従って得られたポリマーＰＥ２−Ａを用いる。
ポリマーＰＥ２−Ａを水中に溶解することで、ポリマーＰＥ２−Ａのコロイド溶液を得、ｐＨを５．０７に調整する。溶液のオスモル濃度を２８７ｍＯｓｍに調整し、ポリマーＰＥ２−Ａの濃度を８．１１ｍｇ／ｇに調整する。
【０１６５】
（４）粒子を得るための混合
５．１９ｇのＰＥ２−Ａ溶液を５．０２ｇのＩＦＮ−α／ＰＥ１−Ａ溶液へ攪拌しながら滴下して加える。攪拌を４℃で一晩行う。
以下、得られた粒子の特性を表ＩＶに示す。
電荷比Ｚを４．８１に等しいｐＨｍで測定する。
粒径をＴテストに従って測定する。
【表１０】
【０１６６】
４．３）例３．３：１０ｍｇ／ｇに等しいポリマーの最終濃度、約１０に等しいＺ
（１）ポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液の調製
上述の合成ａ）に従って得られたポリマーＰＥ１−Ａを用いる。
ポリマーＰＥ１−Ａを水中に溶解することで、ポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液を得、ＮａＯＨ溶液を加えることでｐＨを７．５２に調整する。必要量のＮａＣｌ水溶液を導入することによって、溶液のオスモル濃度を１０８ｍＯｓｍに調整する。ポリマーＰＥ１−Ａの濃度を２０．２１ｍｇ／ｇに調整する。
【０１６７】
（２）タンパク質のポリマーＰＥ１−Ａとの会合
濃縮された２．４ｍｇ／ｇのタンパク質ＩＦＮ−αおよび８９ｍＯｓｍのＮａＣｌを先のポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液に加える。以下の特徴を有する会合が得られる。
【表１１】
２５℃で一晩攪拌して会合を形成する。その後、会合をｐＨ５．０７に調整する。
【０１６８】
（３）ポリマーＰＥ２−Ａのコロイド溶液の調製
上述の合成ｃ）に従って得られたポリマーＰＥ２−Ａを用いる。
ポリマーＰＥ２−Ａを水中に溶解することで、ポリマーＰＥ２−Ａのコロイド溶液を得、ｐＨを５．０８に調整する。溶液のオスモル濃度を２８８ｍＯｓｍに調整し、ポリマーＰＥ２−Ａの濃度を１６．３７ｍｇ／ｇに調整する。
【０１６９】
（４）粒子を得るための混合
５．２５ｇのＰＥ２−Ａ溶液を５．１９ｇのＩＦＮ−α／ＰＥ１−Ａ溶液へ攪拌しながら滴下して加える。攪拌を４℃で一晩行う。
以下、得られた粒子の特性を表Ｖに示す。
電荷比Ｚを４．９５に等しいｐＨｍで測定する。
粒径をＴテストに従って測定する。
【表１２】
【０１７０】
５）例４：ＩＦＮ−αを有する、ＰＥ１−ＡとＰＥ２−Ｂとを基にした粒子の調製、５ｍｇ／ｇに等しいポリマーの最終濃度、Ｚ＝１
（１）ポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液の調製
上述の合成ａ）に従って得られたポリマーＰＥ１−Ａを用いる。
ポリマーＰＥ１−Ａを水中に溶解することで、ポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液を得、ＮａＯＨ溶液を加えることでｐＨを７．５２に調製する。必要量のＮａＣｌ水溶液を導入することによって、溶液のオスモル濃度を１０８ｍＯｓｍに調整する。ポリマーＰＥ１−Ａの濃度を２０．２１ｍｇ／ｇに調整する。
【０１７１】
（２）タンパク質のポリマーＰＥ１−Ａとの会合
濃縮された２．４ｍｇ／ｇのタンパク質ＩＦＮ−αおよび８９ｍＯｓｍのＮａＣｌを先のポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液に加える。以下の特徴を有する会合が得られる。
【表１３】
２５℃で一晩攪拌して会合を形成する。その後、会合をｐＨ６．８９に調整する。
【０１７２】
（３）ポリマーＰＥ２−Ｂのコロイド溶液の調製
上述の合成ｄ）に従って得られたポリマーＰＥ２−Ｂを用いる。このポリマーは９より大きい半中和ｐＨを有する。
ポリマーＰＥ２−Ｂを水中に溶解することで、ポリマーＰＥ２−Ｂのコロイド溶液を得、ｐＨを６．９８に調整する。溶液のオスモル濃度を２８８ｍＯｓｍに調整し、ポリマーＰＥ２−Ｂの濃度を６．３３ｍｇ／ｇに調整する。
【０１７３】
（４）粒子を得るための混合
４．０６ｇのＰＥ２−Ｂ溶液を４．５９ｇのＩＦＮ−α／ＰＥ１−Ａ溶液へ攪拌しながら滴下して加える。攪拌を４℃で一晩行う。
以下、得られた粒子の特性を表ＶＩに示す。
電荷比Ｚを６．８５に等しいｐＨｍで測定する。
粒径をＴテストに従って測定する。
【表１４】
【０１７４】
６）例５（比較）：ＩＦＮ−αを有し、ＰＥ１−Ａのみを基にした粒子の調製
上述の合成ａ）に従って得られたポリマーＰＥ１−Ａを用いる。
ポリマーＰＥ１−Ａを水中に溶解させることでポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液を得、ＮａＯＨ溶液を加えることでｐＨを７．５２に調整する。溶液のオスモル濃度を必要量のＮａＣｌ溶液を導入することで１０８ｍＯｓｍに調整する。ポリマーＰＥ１−Ａの濃度を２９．０５ｍｇ／ｇに調整する。
濃縮された２．４ｍｇ／ｇのタンパク質ＩＦＮ−αを先のポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液に加える。２５℃で一晩攪拌して会合を形成する。
以下、得られた粒子の特性を表ＶＩＩに示す。
粒径をＴ’テストに従って測定する。
【表１５】
【０１７５】
７）例２、３、４および５の生体外での結果
このために、本発明に従う粒子からの活性成分の放出をＬテストによって測定する。
Ｌテストにおける放出を時間と共に放出されるタンパク質の割合の形式で示す。
比較の例２の製剤は、ポリマーのうち一つのみが疎水基を有しており、２３時間後に放出されたタンパク質が１．６％という非常に弱い放出プロファイルを示す。
比較の例５の製剤は、ＰＥ１の粒子を２３ｍｇ／ｇで含んでおり、例３．１の粒子（ＰＥ１／ＰＥ２−Ａ、Ｚ＝１〜１０ｍｇ／ｇ）と類似のプロファイルを示す（それぞれ１０時間で９３％、４８時間で７２％である）。
例３．２の粒子（ＰＥ１／ＰＥ２−Ａ、Ｚ＝１０ｍｇ／ｇおよび５ｍｇ／ｇ）と例３．３の粒子（ＰＥ１／ＰＥ２−Ａ、Ｚ＝１０ｍｇ／ｇおよび１０ｍｇ／ｇ）の場合、実験の終わりでゼロにならない一定の放出流量の形成が観察され、それぞれ４８時間で注入したタンパク質の６５％および１９％を放出する。
例４の粒子（ＰＥ１／ＰＥ２−Ｂ、Ｚ＝１ｍｇ／ｇおよび５ｍｇ／ｇ）の場合、実験の終わりでゼロにならない一定の放出流量の形成が観察され、４８時間で注入したタンパク質の７％を放出する。
【０１７６】
８）例３、４および５の生体内での結果
４４匹のラットを８または１２匹の５グループに分け、並行して即時放出ＩＲ製剤もしくは比較の例５に対応する持続放出製剤または本発明の例３および４の製剤の一つを３００μｇ／ｋｇの投与量で受けた。
以下、薬物動態の結果を表ＶＩＩＩに示す。
【表１６】
【０１７７】
Ｃｍａｘは、すべての動物に対するタンパク質の平均最大血漿中濃度を示す。
Ｔｍａｘは、血漿中濃度が最大となる時間の中央値を示す。
ＡＵＣは、時間の関数として血漿中濃度の曲線下平均面積を示す。
Ｔ５０％ＡＵＣは、曲線下面積が合計値の５０％に到する平均時間を示す。
ＲＢＡは、検討中の製剤の曲線下面積のＩＦＮ ＩＲ製剤の曲線下面積に対する比を示す。
【０１７８】
すべての製剤は、ＩＲに対してＣｍａｘの低下を伴う持続放出プロファイルを示す。
例３．１の製剤（ＰＥ１／ＰＥ２−Ａ、Ｚ＝１〜１０ｍｇ／ｇ）を除いて、その放出プロファイルは、比較の例５の製剤に近く、終わりの傾きがより小さく、長期間にわたって残留する吸収を示す。
例３．３の製剤（ＰＥ１／ＰＥ２−Ａ、Ｚ＝１０ｍｇ／ｇおよび１０ｍｇ／ｇ）に関しては、一週間を超えるまでの放出に注目するべきである。
【０１７９】
９）例６：ＩＦＮ−αを有する、ＰＥ１−ＡおよびＰＥ２‐Ｃを基にした粒子の調製、５ｍｇ／ｇのポリマー最終濃度、Ｚ＝１
（１）ポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液の調製
上述の合成ａ）に従って得られたポリマーＰＥ１−Ａを用いる。
ポリマーＰＥ１−Ａを水中に溶解することでポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液を得、ＮａＯＨ溶液を加えることでｐＨを７．１５に調整する。溶液のオスモル濃度を必要量のＮａＣｌ水溶液を導入することで１４５ｍＯｓｍに調整する。ポリマーＰＥ１−Ａの濃度を３．１０ｍｇ／ｇに調整する。
【０１８０】
（２）治療用タンパク質のポリマーＰＥ１−Ａとの会合
濃縮された２．７ｍｇ／ｇのタンパク質ＩＦＮ−αおよび８９ｍＯｓｍのＮａＣｌを先のポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液に加える。以下の特徴を有する会合が得られる。
【表１７】
２５℃で一晩攪拌して会合を形成する。その後、会合をｐＨ７．０に調整する。
【０１８１】
（３）ポリマーＰＥ２−Ｃのコロイド溶液の調製
上述の合成ｅ）に従って得られたポリマーＰＥ２−Ｃを用いる。このポリマーは９より大きい半中和ｐＨを有する。
ポリマーＰＥ２−Ｃを水中で溶解させることでポリマーＰＥ２−Ｃのコロイド溶液を得、ｐＨを７．０４に調整し、２８８ｍＯｓｍに調整し、ＰＢＳ １４０ｍＯｓｍ中で７．９６ｍｇ／ｇに調整する。
【０１８２】
（４）粒子を得るための混合
１５．１４７ｇのＰＥ２−Ｃ溶液を１６．３７４ｇのＩＦＮ−α／ＰＥ１−Ａ溶液へ攪拌しながら滴下して加える。攪拌を４℃で一晩行う。
電荷比Ｚを７と等しいｐＨｍで測定する。
粒径をＴテストに従って測定する。
以下、得られた粒子の特性を表に示す。
【表１８】
【０１８３】
１０）例７：ＩＦＮ−αを有する、ＰＥ１−ＡおよびＰＥ２‐Ｄを基にした粒子の調製、５ｍｇ／ｇのポリマー最終濃度、Ｚ＝１
（１）ポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液の調製
上述の合成ａ）に従って得られたポリマーＰＥ１−Ａを用いる。
ポリマーＰＥ１−Ａを水中に溶解させることでポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液を得、ＮａＯＨ溶液を加えることでｐＨを７．０２に調整する。溶液のオスモル濃度を必要量のＮａＣｌ水溶液を導入することで１０１ｍＯｓｍに調整する。ポリマーＰＥ１−Ａの濃度を２．０ｍｇ／ｇに調整する。
【０１８４】
（２）タンパク質のポリマーＰＥ１−Ａとの会合
濃縮された２．７ｍｇ／ｇのタンパク質ＩＦＮ−αおよび８９ｍＯｓｍのＮａＣｌを先のポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液に加える。以下の特徴を有する会合が得られる。
【表１９】
２５℃で一晩攪拌して会合を形成する。その後、会合をｐＨ７．０に調整する。
【０１８５】
（３）ポリマーＰＥ２−Ｄのコロイド溶液の調製
上述の合成ｆ）に従って得られたポリマーＰＥ２−Ｄを用いる。このポリマーは９より大きい半中和ｐＨを有する。
ポリマーＰＥ２−Ｄを水中に溶解させることでポリマーＰＥ２−Ｄのコロイド溶液を得、０．１ＮのＨＣｌまたは０．１ＮのＮａＯＨによってｐＨを７．０に調整する。ＰＥ２−Ｄのポリマー濃度を８．８２ｍｇ／ｇに調整する。
【０１８６】
（４）粒子を得るための混合
１．２ｇのＰＥ２−Ｃ溶液を１．２ｇのＩＦＮ−α／ＰＥ１−Ａ溶液に攪拌しながら滴下して加える。攪拌を４℃で一晩行う。
電荷比Ｚを７と等しいｐＨｍで測定する。
粒径をＴテストに従って測定する。
以下、得られた粒子の特性を表に示す。
【表２０】
【０１８７】
１１）例８：（比較）ＩＦＮ−αを有する、ＰＥ１−Ａ／ＰＥ２−Ｄと、ＰＥ１−Ａ／ＰＥ２−Ｃとを基にした粒子の放出速度
上述の例６および７に記載の調製によって得た粒子を上述の連続フローセル放出のＬテストにおいて比較する。以下の表は、得られた結果を示す。
【表２１】
【０１８８】
結論として、この例は、程度の差はあれ特に中性基および／またはアニオン性基を有するカチオン性ポリマーを選択すれば、ＡＰ放出速度を調節できることを示す。したがって、１２時間後、放出は、ＰＥ２−Ｃから得られた微粒子に関しては９．５％で、ＰＥ２−Ｄから得られた微粒子に関しては３１％である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性成分（ＡＰ）、とくにタンパク質およびペプチド活性成分の新規の輸送体と、前記ＡＰの輸送体を有する新規の放出制御製剤とに関連するものである。本願はまた、これらの製剤の用途、とくに治療用途にも関連するものである。これらの活性製剤は、ヒトの治療および動物の治療の両方に関連するものである。
【０００２】
本明細書を通して用いる関連するＡＰは、少なくとも一つの活性成分を対象とする。
【背景技術】
【０００３】
薬剤ＡＰ、とくに治療用ペプチド／タンパク質の持続放出の分野において、その目的は、多くが、患者に可能な限り健康体において観測される値に近い血漿ペプチドまたはタンパク質血漿濃度を再現することである。
【０００４】
この目的は、血漿におけるタンパク質の短い寿命に抵触し、結果として、治療用タンパク質の反復投与を導く。そして、治療用タンパク質の血漿濃度は、高濃度ピークおよび最低濃度によって特徴づけられる「鋸歯」プロファイルを示す。濃度ピークは、健康体における基本濃度よりずっと高く、サイトカイン等の治療用タンパク質の高毒性のために非常に有害である。さらに、最低濃度は、治療効果を与えるのに必要な濃度より低く、その結果、患者に対して低い治療範囲および長期間の重篤な副作用をもたらす。
【０００５】
したがって、患者の治療に対して理想的な値に近い治療用タンパク質の血漿濃度を患者において再現するため、検討中の製剤にとって、時間と共に血漿濃度の変動を制限するように、長時間にわたって治療用タンパク質を放出できるようにすることが重要である。
【０００６】
さらに、この活性製剤は、好ましくは、当業者には既知である以下の要件を満たすべきである。
１．活性および非変性治療用プロテイン、例えば、ヒトタンパク質または合成タンパク質を持続放出し、血漿濃度を治療用の濃度に維持すること
２．容易に注入可能とするのに十分に低い注射での粘度
３．優れた毒性・耐性プロファイルを示す生体適合性および生分解性
【０００７】
これらの目的を達成する試みにおいて、従来技術において提示された最良のアプローチの一つは、治療用タンパク質を有するナノ粒子の比較的非粘性の液体懸濁液から成る治療用タンパク質の持続放出形態を開発したものである。これらの懸濁液によって、天然の治療用タンパク質を簡単に投与することが可能になった。
【０００８】
このようにして、フラメル・テクノロジーズは、治療用タンパク質が、疎水基および親水基を有するコポリアミノ酸のナノ粒子に会合する手段を提供してきた。
【０００９】
米国特許出願公開第２００６／００９９２６４号明細書（特許文献１）は、アスパラギン酸残基および／またはグルタミン酸残基を有する両親媒性ポリアミノ酸を開示し、これらの残基の少なくとも一部は、例えば、少なくとも一つのα−トコフェロール残基を有するグラフトを持つ（合成もしくは天然由来のα−トコフェロールとグラフトしたポリグルタミン酸塩またはポリアスパラギン酸塩）。これらの「疎水的に改質された」ホモポリアミノ酸は、ｐＨ７．４の水性懸濁液において少なくとも一つの活性タンパク質（インスリン）と容易に結合することができるナノ粒子のコロイド懸濁液を水中で自発的に形成する。
【００１０】
特許文献１に従う懸濁液によって「ベクトル化した」活性タンパク質（例えばインスリン）の生体内での放出時間は、長くなることによって効果が上がる。
【００１１】
放出時間の増加は、とくに国際公開第０５／０５１４１６号パンフレット（特許文献２）において開示されている製剤によって部分的に得られた。本明細書は、皮下注射後、内因性アルブミンに接触してその患者のインサイチューでゲルを形成するような濃度にて注射された、疎水的に改質されたポリ（グルタミン酸ナトリウム）のナノ粒子（０．００１〜０．５μｍ）のコロイド懸濁液を開示する。タンパク質は、その後、１週間の標準的な期間をかけてゆっくりと放出される。しかし、投与される治療用タンパク質の濃度が比較的高い場合、例えばヒト成長ホルモンのような場合、放出時間は数日に限定される。
【００１２】
これらの製剤の放出時間は、さらに長くなることで効果が上がる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／００９９２６４号明細書
【特許文献２】国際公開Ａ０５／０５１４１６号パンフレット
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の目的の一つは、ＡＰを、数日、更には数週間という長時間にわたって放出する、ＡＰを有する新規の粒子を提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的は、水溶液中で安定な懸濁液を形成する新規の粒子を提供することである。
【００１６】
本発明の他の目的は、凍結乾燥された形態で安定である、ＡＰを有する新規の粒子を提供することである。
【００１７】
本発明の他の目的は、凍結乾燥された形態で貯蔵することができる新規の粒子を提供することである。
【００１８】
本発明の他の目的は、凍結乾燥後に容易に再分散できる新規の粒子を提供することである。
【００１９】
本発明の他の目的は、生物活性を保持するタンパク質を放出する新規の粒子を提供することである。
【００２０】
本発明の他の目的は、これらの微粒子を準備する新規の方法を提供することである。
【００２１】
本発明の他の目的は、ＡＰを持続放出するための固体製剤を、特に吸入および肺内投与のための乾燥粉末の形態で提供することである。
【００２２】
これらの目的を達成するため、とりわけ、本発明者らが、長期にわたり忍耐を必要とする研究を行ったところ、全く驚くべきことで且つ予想外にも、二つの異極性の高分子電解質ポリマーであって、少なくとも一方が少なくとも一つのＡＰと会合した少なくとも一つの疎水器を有する該ポリマー（例えば、コポリアミノ酸）を特定の条件下で混合することで、長時間にわたって生体外または生体内でタンパク質またはペプチドを放出することが可能な、１〜１００ミクロンの大きさを持つ粒子をもたらすということを見出した。
【００２３】
これから判断すると、本発明は、まず、少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出する粒子に関するものであり、該粒子は、
ａ）帯電状態で疎水側基（ＧＨ）を有する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）であって、好ましくは直鎖α−ポリアミノ酸であり、ｐＨ３〜８のうち少なくとも一つのｐＨｍ値で粒子のコロイド溶液を水中で自発的に形成する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）と、
ｂ）第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）と異極性である第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）であって、好ましくは直鎖α−ポリアミノ酸であり、前記ｐＨのうち少なくとも一つの前記ｐＨｍ値で溶液またはコロイド溶液を水中で形成し、但し、第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）がポリアミノ酸である場合、第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）はポリリシンもしくはポリエチレンイミンのいずれでもない、第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）と、
ｃ）第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド溶液の粒子と非共有で会合する少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）と、
を有し、少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出する上記粒子が、ｐＨｍと等しいｐＨで、活性成分（ＡＰ）と会合した粒子のコロイド溶液の形の第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）を、溶液またはコロイド溶液の形の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）と混合することで得られる。
【００２４】
また、本発明は、少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出する粒子を調製する方法に関するものであり、該粒子は、とくに上述されたものであり、該方法は、
１）ｐＨ３〜８のｐＨｍ値で、帯電状態で疎水側基（ＧＨ）を有する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド水溶液を準備する工程であって、前記第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）が、ｐＨ３〜８のうち少なくとも一つのｐＨｍ値で粒子のコロイド溶液を水中で自発的に形成することができる工程と、
２）少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を、工程１）において得た第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）に加える工程であって、前記活性成分（ＡＰ）が、前記第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド溶液の粒子と非共有結合している工程と、
３）第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）と異極性の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）を準備する工程であって、前記第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）は、前記ｐＨの少なくとも一つの前記ｐＨｍ値で溶液またはコロイド溶液を水中で形成し、但し、第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）がポリアミノ酸である場合、第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）はポリリシンもしくはポリエチレンイミンのいずれでもない工程と、
４）ｐＨｍと等しいｐＨで、工程２）において得られた活性成分（ＡＰ）と会合した粒子のコロイド溶液の形の第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）を、工程３）において得られた溶液またはコロイド溶液の形の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）と混合する工程とを備える。
【００２５】
また、本発明は、少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出する粒子に関するものであり、該粒子は、
ａ）帯電状態で疎水側基（ＧＨ）を有する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）であって、好ましくは直鎖α−ポリアミノ酸であり、ｐＨ３〜８のうち少なくとも一つのｐＨｍ値で粒子のコロイド溶液を水中で自発的に形成する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）と、
ｂ）第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）と異極性で且つ疎水側基（ＧＨ）を有する第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）であって、好ましくは直鎖α−ポリアミノ酸であり、前記ｐＨのうち少なくとも一つの前記ｐＨｍ値で溶液またはコロイド溶液を水中で形成する第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）と、
ｃ）第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド溶液の粒子と非共有で会合する少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）と、
を有し、少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出する前記粒子が、ｐＨｍと等しいｐＨで、活性成分（ＡＰ）と会合した粒子のコロイド溶液の形の第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）を、溶液またはコロイド溶液の形の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）と混合することで得られる。
【００２６】
また、本発明は、少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出する粒子を調製する方法に関するものであり、該粒子は、とくに上述されたものであり、該方法は、
１）ｐＨ３〜８のｐＨｍ値で、帯電状態で疎水側基（ＧＨ）を有する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド水溶液を準備する工程であって、前記第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）が、ｐＨ３〜８のうち少なくとも一つのｐＨｍ値で粒子のコロイド溶液を水中で自発的に形成することができる工程と、
２）少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を、工程１）において得た第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）に加える工程であって、前記活性成分（ＡＰ）が、前記第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド溶液の粒子と非共有結合している工程と、
３）第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）と異極性で且つ疎水側基（ＧＨ）を有する第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）を準備する工程であって、前記第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）が、前記ｐＨのうち少なくとも一つの前記ｐＨｍ値で溶液またはコロイド溶液を水中で形成する工程と、
４）ｐＨｍと等しいｐＨで、工程２）において得られた活性成分（ＡＰ）と会合した粒子のコロイド溶液の形の第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）を、工程３）において得られた溶液またはコロイド溶液の形の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）と混合する工程とを備える。
【００２７】
また、本発明は、少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出する製剤に関するものであり、前記製剤は、上述した粒子を備える。
【００２８】
また、本発明は、特に、非経口、粘膜、皮下、筋内、皮内、経皮、腹腔内もしくは大脳内投与用、または腫瘍への投与用、或いは経口、経鼻、肺、膣もしくは眼球経路による投与用の薬剤を調製する方法であって、該薬剤は、先に規定した製剤の少なくとも一つから本質的になる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】例２（白丸）、例３．１（黒三角）、例３．２（黒ダイアモンド）、例３．３（黒四角）、例４（黒丸）および例５（直線）の粒子を有する製剤からのＩＦＮ−αの生体外での放出を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
定義
本明細書において、「溶液」という用語は、個々の鎖の形で溶媒とポリマーとの均一な混合物を意味すると理解される。
【００３１】
本明細書において、「コロイド溶液」という用語は、Ｔ'テストで測定したときにその平均径が０．５μｍ未満か又はそれに等しい粒子の懸濁液を意味すると理解される。
【００３２】
本明細書において、「半中和ｐＨ」という用語は、イオン性基の半分をイオン化するｐＨを意味すると理解される。
【００３３】
本明細書において、「ｐＨｍ」という用語は、活性成分（ＡＰ）と会合する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）との混合を行う際のｐＨを意味すると理解される。
【００３４】
本明細書において、生理学的ｐＨは、例えば、７．２±０．４に等しいことと定義される。
【００３５】
本明細書において、「高分子電解質」という用語は、水中でイオン化することが可能な基を有するポリマーであって、該ポリマー上で電荷を生成するポリマーを意味すると理解される。
【００３６】
本明細書において、「両性高分子電解質」という用語は、少なくとも２種類の基を有し、それぞれがアニオン性基とカチオン性基を与えるように解離する高分子電解質を意味すると理解される。
【００３７】
本明細書において、「を有する（to carry）」という表現は、有される基がペンダントであり、すなわち、前記基がポリマーの主鎖に対して側基であることを意味する。特に、ポリマーが「アミノ酸」残基を備えるポリアミノ酸である場合、前記ペンダント基は、「アミノ酸」残基に対して側基であり、該ペンダント基は、それを有する「アミノ酸」残基のγ位におけるカルボニル官能基の置換基である。
【００３８】
本明細書において、「高分子電解質の極性」という用語は、ｐＨのｐＨｍ値にてこの高分子電解質が持つ全体の電荷の極性を意味すると理解される。
【００３９】
本明細書において、「かさ密度」という用語は、粒子１ｇが占める体積を意味すると理解される。かさ密度は、密度勾配法等の当業者に知られるいずれかの方法で測定される。
【００４０】
本明細書において、「小分子」という用語は、分子量が１ｋＤａ未満の分子を意味すると理解される。
【００４１】
Ｔテストは、第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）の会合および第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）の会合に起因する、本発明に従う粒子の大きさを測定するのに使用される。Ｔ'テストを用いて、第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド溶液の粒子の大きさを評価するのが好ましい。
【００４２】
Ｔテストの結果は、中位径Ｄ５０であるので、サンプル内に存在する粒子の５０％は、この値（Ｄ５０）より低いか又はそれと等しい大きさを有する。
【００４３】
Ｔ'テストの結果は、平均流体力学的直径である。
【００４４】
レーザー回折による微粒子の大きさを測定するためのＴテスト
Ｄ５０に関するデータを得るが、該データは、分析される対象の５０％がそれ以下であることを見出す直径である。本発明に従う粒子のこの直径は、以下に規定される手順に従って測定される。
【００４５】
５ｍｌの試験管中、分析されるサンプル４００μｌを脱塩水６００μｌで希釈し、その用意したものに１０秒間（１０±５）渦を発生させて、粒子の溶液を調製する。その次に、それらの溶液を不明瞭化が５〜２０％の間になるまで滴下しながら測定セルに導入し、その後、４６６ｎｍおよび６３２ｎｍの二つの波長で動作するＭａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ ２０００型の装置を用いる光回折によって分析する。粒子のＤ５０は、標準ＩＳＯ １３３２０に説明されるように、
ｎ流体＝１．３３＋ｉ．０
ｎポリマー＝１．５９＋ｉ．０
という屈折率を用いたＭｉｅ理論及びフランフォーファー近似から算出される。
【００４６】
準弾性光散乱によってナノ粒子の大きさを測定するためのＴ'テスト
本発明に従うポリマーの粒子の平均流体力学的直径は、以下に規定する方法Ｍｄに従って測定される。
【００４７】
０．１５ＭのＮａＣｌ媒体中、ポリマー溶液を１または２ｍｇ／ｍｌの濃度で準備し、２４時間攪拌して置いておく。その次に、これらの溶液を０．８〜０．２μｍのフィルタに通して濾過した後、波長６３２．８ｎｍの垂直に偏光したＨｅ−Ｎｅレーザー光で動作するＭａｌｖｅｒｎ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｇｏｎｉｏｍｅｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ型の装置を用いた動的光散乱において分析する。ポリマーナノ粒子の流体力学的直径は、「Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｅｒｉｅｓ」，第２２巻，Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，編集Ｒ．Ｚａｎａ，第３章，Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，１９８４の研究に説明されるように、キュムラント法による電界の自己相関関数から算出される。
【００４８】
活性成分の放出を測定するためのＬテスト
３０ｍｇ／ｇのウシアルブミン画分Ｖ（Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．０１Ｍのリン酸緩衝液、０．００２７Ｍの塩化カリウム、０．１３７Ｍの塩化ナトリウム（ＡｌｄｒｉｃｈのＰＢＳ）および０．０１５Ｍの酢酸アンモニウム（Ａｌｄｒｉｃ）を備えた流量２．８３ｍｌ／ｈの水性媒体によって水浴したポリウレタン／ポリエーテル（ＰＵ−ＰＥ）発泡体からなる辺長１．５ｃｍの立方体中に、５０μｌの製剤を注入する。サンプルは、連続相から定期的に回収され、そのタンパク質含有量をＥＬＩＳＡ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，ＩＭ３１９３キット）によって分析する。
【００４９】
次いで、回収した各サンプルで測定した値を加算することで、放出されたタンパク質の全重量をプロットし、それを合計の注入量と関連付けることができる。
【００５０】
本発明の意義の範囲内で、「タンパク質」という用語は、タンパク質またはペプチドを意味し、ペプチドはオリゴペプチドであろうとポリペプチドであろうと問わない。このタンパク質またはこのペプチドは、例えば一つまたはそれ以上のポリオキシエチレン基をグラフトすることによって変性してもよいし、変性しなくてもよい。
【００５１】
第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）および第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）は、イオン化可能なアニオン性基および／またはカチオン性基、例えばアミン官能基またはカルボン酸官能基を有する生体適合性および生分解性の線状ポリマーである。好ましくは、ポリマー（ＰＥ１）または（ＰＥ２）は、所定の極性（アニオン性またはカチオン性）のイオン性基を有する。
【００５２】
かかるポリマーは、例えば、ポリアミノ酸類の他、硫酸デキストラン、カルボキシメチルセルロース、アラビアガム、ヒアルロン酸およびその誘導体等のアニオン性多糖類、ポリガラクツロン酸類またはポリグルクロン酸類、またはキトサン等のカチオン性多糖類、あるいはまたコラーゲンおよびゼラチン型のその誘導体である。
【００５３】
所定の極性のイオン性基を有するポリマーが更に逆の極性のイオン性基を１〜３０モル％の少数有する可能性は排除されない。イオン化可能なアニオン性またはカチオン性基および疎水基に加えて、第１または第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）または（ＰＥ２）もまた、任意に、ヒドロキシエチルアミノ−ラジカル、アルキレングリコールまたはポリアルキレングリコールから選択されるラジカル等の非イオン性基を有することもできる。
【００５４】
ポリマーの正味電荷は、ポリマーの半中和ｐＨに対するｐＨ値に依存する。したがって、アニオン性のカルボン酸官能基を有する高分子電解質については、ポリマーの正味電荷が半中和ｐＨより２単位下のｐＨでゼロの領域にある。実際、すべてのアニオン性官能基は、半中和ｐＨより２単位上のｐＨでイオン化する。一方、カチオン性官能基を有するポリマーに対し、その正味電荷は、ｐＨが半中和ｐＨを約２単位超えるとゼロに低下する。
【００５５】
本発明においては、ｐＨのｐＨｍ値での混合条件下にて第１または第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ１，ＰＥ２）が持つ電荷数は、従来の酸／塩基滴定法によって得られる。
【００５６】
０．１５Ｍの塩化ナトリウムを備えた２ｍｇ／ｍｌの高分子電解質濃縮溶液を、１Ｍの酢酸または１Ｍの水酸化ナトリウム溶液を加えることによってｐＨ３にする。その後、この溶液を、０．０５Ｍの水酸化ナトリウム溶液で滴定し、ｐＨの変化を、加えた水酸化ナトリウムの量の関数として記録する。当量点（量およびｐＨ）の検出は、例えば二重接線法によって行われるが、すべてのイオン性基がイオン化するｐＨ、すなわちイオン化度が１に等しい場合のｐＨを検出することができる。次いで、この点から、いずれのｐＨ値に対しても高分子電解質のイオン化度にまで戻すことができる。そして、半中和ｐＨ、すなわちイオン化度が０．５に等しいｐＨを規定することができる。また、ｐＨのｐＨｍ値での高分子電解質のイオン化度を規定することもできる。当量点がｐＨ３〜９の範囲外である特定の場合においては、すべてのイオン性基が、このｐＨの範囲にわたってイオン化するものと考えられ、すなわち、ｐＨ３〜９の値でのイオン化度は１に等しい。
【００５７】
有利には、第１および第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ１，ＰＥ２）が、直鎖ポリ（α−アミノ酸）であり、ＰＥ１が直鎖ポリアミノ酸であれば、ＰＥ２はポリリシンでもポリエチレンイミンでもないことを忘れてはならない。
【００５８】
本発明の意義の範囲内で且つこの説明を通して、「ポリアミノ酸」という用語は、天然ポリアミノ酸および合成ポリアミノ酸の両方に及び、また、２０より多い「アミノ酸」残基を有するポリアミノ酸と同様に、２〜２０の「アミノ酸」残基を有するオリゴアミノ酸にも及ぶ。
【００５９】
好ましくは、本発明において用いるポリアミノ酸は、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸の繰り返し単位を備えるオリゴマーもしくはホモポリマー、またはこれら２種の「アミノ酸」残基の混合物を備えるコポリマーである。これらのポリマーにおける検討中の残基は、ＤもしくはＬまたはＤ／Ｌ配置を有するアミノ酸であり、グルタミン酸塩もしくはグルタミン酸残基に関してはαまたはγ位を介して、またアスパラギン酸もしくはアスパラギン酸塩残基に関してはαまたはβ位を介して結合する。
【００６０】
ポリアミノ酸の主鎖の好ましい「アミノ酸」残基は、Ｌ配置およびα型の結合を有するものである。
【００６１】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、第１および第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ１，ＰＥ２）は、ポリアミノ酸、またはそれらの製剤可能な塩の一つとすることができ、その主鎖は、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基およびそれら組み合わせから成る群から選択した残基の形をしており、これらの単位の少なくとも一部は、少なくとも第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）に対して少なくとも一つの疎水基（ＧＨ）をグラフトすることによって変性される。
【００６２】
また、上記ポリマー（ＰＥ２）も疎水側基を有することができる。
【００６３】
第１の実施形態によれば、これらのポリアミノ酸は、ＰＣＴ特許出願の国際公開ＷＯ−Ａ−００／３０６１８号に記載される種類であり、その疎水基（ＧＨ）は、互いに同一でも異なっていてもよく、
（ｉ）直鎖または分岐の、好ましくは直鎖Ｃ１〜Ｃ２０、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ１８アルキル、アシルまたはアルケニル；
（ｉｉ）一つまたはそれ以上のヘテロ原子を有し、好ましくは酸素および／または硫黄を有し、より好ましくは下記式：
【化１】
（式中、
Ｒ６０ラジカルは、直鎖または分岐の、好ましくは直鎖Ｃ１〜Ｃ２０、より好ましくはＣ２〜Ｃ１８アルキル、アシルまたはアルケニルラジカルであり、
Ｒ６１およびＲ６２ラジカルは、互いに同一または異なり、水素または、直鎖もしくは分岐の、好ましくは直鎖Ｃ１〜Ｃ２０、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ１８アルキル、アシル、またはアルケニルラジカルと一致し、
ｑ＝１〜１００である）の炭化水素基；
（ｉｉｉ）アリール、アラルキル、またはアルキルアリール、好ましくはアリール；
（ｉｖ）疎水性誘導体、好ましくはホスファチジルエタノールアミノ−ラジカル、または、オクチルオキシ−ラジカル、ドデシルオキシ−ラジカル、テトラデシルオキシ−ラジカル、ヘキサデシルオキシ−ラジカル、オクタデシルオキシ−ラジカル、９−オクタデセニルオキシ−ラジカル、トコフェリルオキシ−ラジカルもしくはコレステリルオキシ−ラジカルから選択されるラジカル；
からなる群から選択される。
【００６４】
「炭化水素基」という用語は、本発明の意義の範囲内で、とくに水素原子および炭素原子を有する基を意味すると理解される。
【００６５】
好ましくは、この実施形態において、疎水基が、メチル、エチル、プロピル、ドデシル、ヘキサデシルおよびオクタデシルのラジカルの群から選択される。
【００６６】
とくに好ましくは、疎水基（ＧＨ）が、
・任意には少なくとも一つの不飽和結合および／または少なくとも一つのヘテロ原子を備えることができる直鎖または分岐Ｃ８〜Ｃ３０アルキル、
・任意には少なくとも一つの不飽和結合および／または少なくとも一つのヘテロ原子を備えることができるＣ８〜Ｃ３０アルキルアリールまたはアリールアルキル、
・任意には少なくとも一つの不飽和結合および／または少なくとも一つのヘテロ原子を備えることができるＣ８〜Ｃ３０（多）環式化合物、
から成る群から選択される。
【００６７】
さらに具体的には、少なくとも一つの疎水基（ＧＨ）が、オクタノール、ドデカノール、テトラデカノール、ヘキサデカノール、オクタデカノール、オレイルアルコール、トコフェロールおよびコレステロールから成る群から選択される前駆体から派生したグラフトによって得られる。
【００６８】
本発明の実施形態によれば、高分子電解質ポリマー（ＰＥ１，ＰＥ２）の一つまたはそれらの製剤可能な塩の一つは、以下の式（Ｉ）：
【化２】
（式（Ｉ）中、
・Ｒ１は、Ｈ、直鎖Ｃ２〜Ｃ１０もしくは分岐Ｃ３〜Ｃ１０アルキル、ベンジル、−Ｒ４−［ＧＨ］を示し、またはＲ１は、ＮＨと、末端アミノ酸残基を形成し；
・Ｒ２は、Ｈ、直鎖Ｃ２〜Ｃ１０もしくは分岐Ｃ３〜Ｃ１０アシル基、ピログルタメート、または−Ｒ４−［ＧＨ］を示し；
・Ｒ４は、直接結合または１〜４のアミノ酸残基を基にした「スペーサ」を示し；
・Ａ１およびＡ２は、独立して−ＣＨ２−（アスパラギン酸残基）または−ＣＨ２−ＣＨ２−（グルタミン酸残基）を示し；
・ｎ／（ｎ＋ｍ）は、モルグラフト度として定義され、その値は、ｐＨ７で２５℃の水中に溶解したポリマーがポリマー粒子のコロイド懸濁液を形成するのに十分に低く；
・ｎ＋ｍは１０〜１０００の範囲であり、好ましくは５０から３００の間であり；
・ＧＨは、６〜３０の炭素原子を有する疎水基を示すか、または上記項目（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）において定義されたラジカルを含む群から選択される）に一致する。
【００６９】
更に、式（Ｉ）のポリアミノ酸の調製および合成に関する詳細に関しては、特許出願ＦＲ ０２ ０７００８及びＦＲ ０３ ５０１９０を有効に参照されたい。
【００７０】
他の可能性によれば、高分子電解質ポリマーＰＥ２またはその製剤可能な塩の一つは、以下の式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）：
【化３】
（式中、
・ＧＨは、６〜３０個の炭素原子を有する疎水基を示し；
・Ｒ３０は、直鎖Ｃ２〜Ｃ６アルキル基であり；
・Ｒ５０は、Ｃ２〜Ｃ６ジアミノ、ジアルコキシ、またはアルキル基であり；
・Ｒ４は、直接結合または１〜４のアミノ酸残基を基にした「スペーサ」を示し；
・Ａ１およびＡ２は、独立して−ＣＨ２−（アスパラギン酸残基）または−ＣＨ２−ＣＨ２−（グルタミン酸残基）を示し；
・ｎ'＋ｍ'またはｎ''は、重合度として定義され、１０〜１０００の範囲であり、好ましくは５０〜３００の間である）の一つと一致する。
【００７１】
更に、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）のポリアミノ酸の調製および合成に関する詳細に関しては、特許出願ＦＲ ０３ ５０６４１を有効に参照されたい。
【００７２】
他の可能性によれば、高分子電解質ポリマー（ＰＥ１，ＰＥ２）の一つまたはそれらの製剤可能な塩の一つは、以下の式（Ｖ）：
【化４】
（式（Ｖ）中、
・Ｅは、独立して、
−ＮＨＲ基（ここで、Ｒは、Ｈ、直鎖Ｃ２〜Ｃ１０もしくは分岐Ｃ３〜Ｃ１０アルキルまたはベンジルを示す）、
次式：
【化５】
（式中：
Ｒ７は、ＯＨ、ＯＲ９またはＮＨＲ１０であり、
Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は、独立して、Ｈ、直鎖Ｃ２〜Ｃ１０もしくは分岐Ｃ３〜Ｃ１０アルキルまたはベンジルを示す）と一致する末端アミノ酸残基または末端アミノ酸誘導体、
を示し；
・Ｂは、直接結合、または二価、三価もしくは四価の結合基であり、好ましくは、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ１〜Ｃ５アルキル）−、アミノ酸（好ましくは天然アミノ酸）残基、ジオール残基、トリオール残基、ジアミン残基、トリアミン残基、アミノアルコール残基もしくは１〜６の炭素原子を有するヒドロキシ酸残基から選択され；
・Ｄは、Ｈ、直鎖Ｃ２〜Ｃ１０もしくは分岐Ｃ３〜Ｃ１０アシル基またはピログルタメートを示し；
・ＧＨは、６〜３０個の炭素原子を有する疎水基を示し；
・Ｒ７０は、以下の基：
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｗ−ＮＨ３＋（ここで、ｗは２〜６の間であり、好ましくはｗが４である）、
−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ３＋、
−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ３＋、
−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｎ＋（ＣＨ３）３、
【化６】
（式中、−Ｒ１１は、−Ｈ、−ＣＯ２Ｈ、アルキルエステル（好ましくは−ＣＯＯＭｅおよび−ＣＯＯＥｔ）、−ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ３または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）２を示す）；
次式：
【化７】
（式中、Ｘは、酸素または−ＮＨ−で、−Ｒ１２は、Ｈ、直鎖Ｃ２〜Ｃ１０もしくは分岐Ｃ３〜Ｃ１０アルキルまたはベンジルで、−Ｒ１３は、−（ＣＨ２）４−ＮＨ３＋、−（ＣＨ２）３−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ３＋、−（ＣＨ２）３ＮＨ３＋である）のアミノ酸残基またはアミノ酸誘導体；
から選択されるラジカルを示し、上記Ｒ７０基の対アニオンが、塩化物、硫酸塩、リン酸塩または酢酸塩、好ましくは塩化物であり；
・Ｒ９０は、ヒドロキシエチルアミノ−、アルキレングリコール残基またはポリオキシアルキレン残基であり；
・ｐ、ｑ、ｒおよびｓは、正の整数であり；
・（ｐ）／（ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は、疎水基ＧＨのモルグラフト度として定義され、２〜９９モル％の範囲であり、好ましくは５〜５０モル％の間であり、但し、各コポリマー鎖は、平均して、少なくとも３個の疎水性グラフトを有しており；
・（ｑ）／（ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は、カチオン性基のモルグラフト度として定義され、１〜９９モル％の範囲であり；
・（ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は、１０〜１０００の範囲であり、好ましくは３０〜５００の間であり；
・（ｒ）／（ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は、０〜９８モル％の範囲であり；
・（ｓ）／（ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は、０〜９８モル％の範囲である）と一致する。
【００７３】
リシン、オルニチンおよびアルギニン誘導体は、例えば、エチルおよびメチルエステル、アミドおよびメチル化アミドとすることができる。
【００７４】
好ましくは、この代替案に従えば、疎水基ＧＨおよびカチオン性基が、ペンダント基としてランダムに位置している。
【００７５】
さらに、疎水性単位を持つポリグルタミン酸塩のモルグラフト度は、２〜９９％の間であるのが好ましく、より好ましくは５〜５０％の間であり、但し、各コポリマー鎖は、平均して、少なくとも３個の疎水性グラフトを有する。
【００７６】
ポリグルタミン酸塩の比（ｑ）／（ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は、該ポリグルタミン酸塩がカチオン電荷を含む基を１〜約９７モル％を備えることができることを意味する。
【００７７】
ポリグルタミン酸塩の比（ｓ）／（ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は、該ポリグルタミン酸塩が中性ｐＨでアニオン性、中性またはカチオン性となることができることを意味する。
【００７８】
更に、ヒスチジンに由来する式（Ｖ）のポリアミノ酸の調製および合成に関する詳細に関しては、特許出願ＦＲ ０５ ５３３０２を有効に参照されたい。
【００７９】
ヒスチジンに由来するもの以外の式（Ｖ）のポリアミノ酸の調製および合成に関する詳細に関しては、特許出願ＦＲ ０７ ０３１８５を有効に参照されたい。
【００８０】
有利な実施形態によれば、前述の式中、Ｒ４またはＢ基が、直接結合を示す。
【００８１】
他の可能性によれば、高分子電解質ポリマー（ＰＥ１，ＰＥ２）の一つは、ヒドロキシアルキル（好ましくはエチル）グルタミン残基および複数のペンダント疎水基（ＧＨ）を有し、該疎水基は互いに同一でも異なっていてもよい。また、ヒドロキシアルキルグルタミン単位は、ヒドロキシアルキルアミン基を有する。これらヒドロキシアルキルアミン基は、好ましくは、アミド結合を介してコポリマーに結合する。これらヒドロキシアルキルグルタミン残基のグルタミン酸残基を官能基化するのに使用できるヒドロキシアルキルアミン基は、互いに同一でも異なっていてもよく、例えば、２−ヒドロキシエチルアミノ基、３−ヒドロキシプロピルアミノ基、２，３−ジヒドロキシプロピルアミノ基、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ基および６−ヒドロキシへキシルアミノ基から選択される。
【００８２】
有利には、本発明に用いる疎水基ＧＨの少なくとも一つが、疎水基（ＧＨ）をコポリグルタミン酸塩鎖（例えば、コポリグルタミン酸塩骨格の主鎖）に結合できる少なくとも一つのスペーサー接続部（または単位）（スペーサー）を備える疎水性グラフト中に含まれる。この接続部は、例えば、少なくとも一つの直接的な共有結合および／または少なくとも一つのアミド結合および／または少なくとも一つのエステル結合を備えることができる。例えば、接続部は、特に、コポリグルタミン酸塩の構成単量体単位以外の「アミノ酸」残基、アミノアルコールの誘導体、ポリアミン（例えばジアミン）の誘導体、ポリオール（例えばジオール）の誘導体およびヒドロキシ酸の誘導体からなる群に属するタイプとすることができる。ＧＨのコポリグルタミン酸塩またはポリアルキルグルタミン酸塩鎖へのグラフトは、コポリグルタミン酸塩鎖またはヒドロキシアルキルグルタミン酸残基へ結合できるＧＨ前駆体の使用を必要とする場合がある。ＧＨの前駆体は、実際には限定されず、アルコールおよびアミンから成る群から選択され、これらの化合物は当業者によって容易に官能基化できる。更に、これらのヒドロキシアルキル（好ましくはエチル）グルタミン残基に関する詳細に関しては、ＦＲ−Ａ−２ ８８１ １４０を有効に参照されたい。
【００８３】
有利な実施態様によれば、特に先に対象とした様々な可能性のうち少なくとも一つによると、本発明において用いる疎水基（ＧＨ）の全部または一部は、独立して、
・６〜３０個の炭素原子を有し、少なくとも一つのヘテロ原子（好ましくはＯおよび／またはＮおよび／またはＳ）および／または少なくとも一つの不飽和結合を有することができる直鎖または分岐アルコキシ、
・６〜３０個の炭素原子を有し、一つまたはそれ以上の環の炭素環を有し、任意に少なくとも一つの不飽和結合および／または少なくとも一つのヘテロ原子（好ましくはＯおよび／またはＮおよび／またはＳ）を有するアルコキシ、
・７〜３０個の炭素原子を有し、少なくとも一つの不飽和結合および／または少なくとも一つのヘテロ原子（好ましくはＯおよび／またはＮおよび／またはＳ）を有することができるアルコキシアリールまたはアリールオキシアルキル、
よりなるラジカルの群から選択される。
【００８４】
他の有利な実施形態によれば、特に先に対象とした様々な可能性のうち少なくとも一つによると、疎水基（ＧＨ）は、オクタノール、ドデカノール、テトラデカノール、ヘキサデカノール、オクタデカノール、オレイルアルコール、トコフェロールおよびコレステロールから成る群から選択したアルコール前駆体に由来し、また、Ｒ４は、直接結合を示す。
【００８５】
他の有利な実施形態によれば、特に先に対象とした様々な可能性のうち少なくとも一つによると、疎水基（ＧＨ）は、それぞれが互いに独立して、下記式：
【化８】
（式中：
Ｒ５は、メチル（アラニン）、イソプロピル（バリン）、イソブチル（ロイシン）、ｓｅｃ−ブチル（イソロイシン）またはベンジル（フェニルアラニン）を示し；
Ｒ６は、６〜３０個の炭素原子を有する疎水性ラジカルを示し；
ｌは、０〜６の範囲である）の一価のラジカルを示す。
【００８６】
本発明の注目すべき特徴によれば、疎水基（ＧＨ）の疎水性ラジカルＲ６の全部または一部が、独立して、
・６〜３０個の炭素原子を有し、少なくとも一つのヘテロ原子（好ましくはＯおよび／またはＮおよび／またはＳ）および／または少なくとも一つの不飽和結合を有することができる直鎖または分岐アルコキシ、
・６〜３０個の炭素原子を有し、一つまたはそれ以上の環の炭素環を有し、任意に少なくとも一つの不飽和結合および／または少なくとも一つのヘテロ原子（好ましくはＯおよび／またはＮおよび／またはＳ）を有するアルコキシ、
・７〜３０個の炭素原子を有し、少なくとも一つの不飽和結合および／または少なくとも一つのヘテロ原子（好ましくはＯおよび／またはＮおよび／またはＳ）を有することができるアルコキシアリールまたはアリールオキシアルキル、
よりなるラジカルの群から選択される。
【００８７】
実際には限定されず、上記疎水性ラジカルＲ６が、オクタノール、ドデカノール、テトラデカノール、ヘキサデカノール、オクタデカノール、オレイルアルコール、トコフェロールおよびコレステロールから成る群から選択したアルコール前駆体に由来する。
【００８８】
有利には、本発明に用いる高分子電解質ポリアミノ酸（ＰＥ１，ＰＥ２）の主鎖は、α−Ｌ−グルタミン酸塩ホモポリマー、α−Ｌ−グルタミン酸ホモポリマー、α−Ｌ−アスパラギン酸塩ホモポリマー、α−Ｌ−アスパラギン酸ホモポリマー、α−Ｌ−アスパラギン酸塩／α−Ｌ−グルタミン酸塩コポリマーおよびα−Ｌ−アスパラギン酸／α−Ｌ−グルタミン酸コポリマーから成る群から選択される。
【００８９】
注目すべき方法では、高分子電解質ポリマーＰＥ１またはＰＥ２のポリアミノ酸主鎖のアスパラギン酸および／またはグルタミン酸残基は、形成されたポリマーがランダム、ブロックタイプまたはマルチブロックタイプのいずれかであるように分布する。
【００９０】
他の規定方法によれば、高分子電解質ポリマーＰＥ１またはＰＥ２は、２０００〜１０００００ｇ／ｍｏｌの間、好ましくは５０００〜４００００ｇ／ｍｏｌの間のモル質量を有する。
【００９１】
第１および第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ１，ＰＥ２）の重合度は、５０〜５００の間で、好ましくは７０〜３００の間である。
【００９２】
主鎖中の疎水基で置換された結合部のモル分率は、１〜４０モル％の間で、好ましくは３〜３０モル％の間である。
【００９３】
本発明に用いるポリマーは、それらがｐＨｍと等しいｐＨにて全体としてカチオン性またはアニオン性となるように、上述の様々な群から選択される。
【００９４】
疎水側基を有する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）の必須の特性は、水中で自発的にコロイド溶液を形成することができることである。
【００９５】
理論に従うことを望むものではないが、疎水基の超分子会合により疎水性ドメインが形成される結果、ナノ粒子が形成されると仮定することができる。各ナノ粒子は、その疎水性ドメインの周囲で程度の差はあるが縮合したＰＥ１ポリマーの一つまたはそれ以上の鎖からなる。本発明に用いるポリマーはイオン性官能基を備え、該イオン性官能基は、ｐＨおよび組成に従って中性（例えば−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２）であるかイオン化（例えば−ＣＯＯ−、−ＮＨ３＋）していることを理解すべきである。このため、水相での溶解度は、イオン化した官能基のレベルによって直接決まり、従って、ｐＨによって直接決まる。水溶液では、カルボキシル官能基の場合、対イオンが、ナトリウム、カルシウムもしくはマグネシウム等の金属カチオン、またはトリエタノールアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンもしくはポリエチレンイミン等のポリアミン等の有機カチオンとすることができる。カチオン性基の対アニオンは、好ましくは、塩化物、硫酸塩、リン酸塩または酢酸塩から成る群から選択される。
【００９６】
当業者は、半中和ｐＨを知っているため、ｐＨを調整してポリマーのイオン化度を十分に高くし、コロイド溶液の安定性を確保する。
【００９７】
本発明に使用できるポリアミノ酸型の高分子電解質は、例えば、当業者に既知の方法で得られる。ランダムポリアミノ酸は、「スペーサー」によって予め官能基化した疎水性グラフトを通常のカップリング反応によってポリマーに直接グラフトすることから得られることができる。ブロックまたはマルチブロックポリアミノ酸の高分子電解質は、対応するＮ−カルボキシアミノ酸無水物（ＮＣＡ）の逐次重合によって得られることができる。
【００９８】
ポリアミノ酸、ホモポリグルタミン酸塩、ホモポリスパラギン酸塩またはブロック、マルチブロックもしくはランダムのグルタミン酸塩／アスパラギン酸塩コポリマーは、例えば、通常の方法に従って調製される。
【００９９】
α型のポリアミノ酸を得るために最も広く用いられている技術は、例えば、論文「Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，１９７６，１５，１８６９」およびＨ．Ｒ．Ｋｒｉｃｈｅｌｄｏｒｆによる研究「ａｌｐｈａ−Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ Ｎ−ｃａｒｂｏｘｙ Ａｎｈｙｄｒｉｄｅｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ」，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９８７）に記載されるように、Ｎ−カルボキシアミノ酸無水物（ＮＣＡ）の重合に基づいている。ＮＣＡ誘導体は、好ましくは、ＮＣＡ−Ｏ−Ｍｅ、ＮＣＡ−Ｏ−ＥｔまたはＮＣＡ−Ｏ−Ｂｚ誘導体（Ｍｅ＝メチル、Ｅｔ＝エチルおよびＢｚ＝ベンジル）である。その後、ポリマーは、酸の形でポリマーを得るための適切な条件下で加水分解される。これらの方法は、出願人の会社による特許ＦＲ−Ａ−２ ８０１ ２２６にて与えられた説明によって引き出される。本発明に従って使用できるいくらかのポリマーは、例えば、様々な重量を有するポリ（α−Ｌ−アスパラギン酸）、ポリ（α−Ｌ−グルタミン酸）、ポリ（α−Ｄ−グルタミン酸）およびポリ（γ−Ｌ−グルタミン酸）のタイプであり、商業的に入手できる。α，β型のポリアスパラギン酸は、アスパラギン酸の縮合（ポリコハク酸イミドを得る）と、その後の塩基性加水分解によって得られる（Ｔｏｍｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｌｙｍｅｒ，１９９７，３８，４７３３−３６参照）。
【０１００】
疎水性グラフトＧＨのポリマーの酸性官能基とのカップリングは、カップリング剤としてのカルボジイミドおよび任意に４−ジメチルアミノピリジン等の触媒の存在下、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の適切な溶媒中でのポリアミノ酸の反応によって容易に行われる。カルボジイミドは、例えば、ジシクロへキシルカルボジイミドまたはジイソプロピルカルボジイミドである。グラフト度は、成分および反応物質の化学量論または反応時間によって化学的に制御される。「スペーサー」によって官能基化した疎水性グラフトは、通常のペプチドカップリングまたは酸性触媒による直接縮合によって得られる。
【０１０１】
カチオン性基および任意には中性基のポリマーの酸性官能基とのカップリングは、カップリング剤としてのクロロホルマートの存在下、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の適切な溶媒中、第二の段階において同時に行われる。
【０１０２】
カチオン性基が化学的に差異がない２個のアミン官能基を有する場合（例えば、直鎖ジアミン）、２個の官能基のうち１個を保護する形でそれを導入することができる。その後、保護基を開裂する最終段階を加える。
【０１０３】
重合化学および基をカップリングする反応は、従来続けられており、当業者によく知られている（例えば、上述の出願人による特許および特許出願参照）。
【０１０４】
予め合成された疎水性グラフトを持つＮＣＡ誘導体は、ブロックまたはマルチブロックコポリマーの合成に用いられる。例えば、ＮＣＡ−疎水基の誘導体は、ＮＣＡ−Ｏ−ベンジルと共重合し、次いでベンジル基を加水分解により選択的に除去する。
【０１０５】
本発明に従う高分子電解質ポリマー（ＰＥ１およびＰＥ２）の特に好適な会合の例は、以下の例において説明される。
【０１０６】
本発明に用いるポリマーの必須の特性は、第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）がコロイド溶液の形態であり、第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）がｐＨ３〜８のうち少なくとも一つのｐＨｍ値で溶液またはコロイド溶液の形態であることである。
【０１０７】
この条件を満たすため、カチオン性ポリマーの半中和ｐＨは、十分に高くすることであり、例えば５．５より大きく、好ましくは６より大きく、さらには８より大きい。また、アニオン性ポリマーの半中和ｐＨは、十分に低くすることであり、例えば６．５より小さく、好ましくは、６．０より小さく、さらには５．５より小さい。
【０１０８】
特に、第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）がアニオン性であるという代替の態様においては、後者は、半中和ｐＨが３〜６．５の間、好ましくは４．５〜６．５の間を示すように選択される。この代案の態様によれば、第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）は、ｐＨ６〜８のｐＨｍ値に対してコロイド溶液を形成する。
【０１０９】
かかるポリマーＰＥ１は、特に例１ａ）にて説明される。
【０１１０】
この場合、第１の可能性によると、第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）は、カチオン性であり、８未満のｐＨでコロイド溶液を形成する。好ましくは、第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）は、８より大きい半中和ｐＨを示すように選択される。かかるポリマーＰＥ２は、特に例１ｄ）にて説明される。
【０１１１】
したがって、第１の可能性によれば、ｐＨ６〜８のｐＨｍ値に対して、第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）はコロイド溶液を形成し、第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）は溶液またはコロイド溶液を形成する。
【０１１２】
この場合、本発明の重要な特徴によると、第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）の重量の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）の重量に対する比は、電荷比Ｚのために選択され、イオン化したカチオン性基のモル数のイオン化したアニオン性基のモル数に対する比は、ｐＨｍで測定すると、０．２５〜３の間であり、好ましくは０．２５〜１．５の間である。
【０１１３】
第２の可能性によれば、第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）は、カチオン性であり、６未満のｐＨでコロイド溶液を形成し、６．５より大きいｐＨでは沈殿物を形成する。好ましくは、第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）は、半中和ｐＨが５．５〜７の間を示すように選択される。かかるポリマー（ＰＥ２）は、特に例１ｃ）にて説明される。この場合、本発明の重要な特徴によると、ｐＨ３〜６のｐＨｍ値に対して、第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）はコロイド溶液を形成し、第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）は溶液またはコロイド溶液を形成する。第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）の重量の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）の重量に対する比は、電荷比Ｚのために選択され、ｐＨｍで測定すると、３．５〜３０の間であり、好ましくは５〜１５の間であり、さらに好ましくは８〜１２の間である。
【０１１４】
第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）がカチオン性であるという他の代替の態様においては、後者は、５より大きい半中和ｐＨを示すように選択される。この場合、第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）は、アニオン性であり、半中和ｐＨが３〜６．５の間、好ましくは４．５〜６．５の間を示すように選択される。
【０１１５】
本発明に従う粒子は、生理学的ｐＨで、Ｔテストにて測定した大きさが１〜１００ミクロンの間を示す。
【０１１６】
有利には、本発明に従う粒子は、化学的に架橋されない。
【０１１７】
本発明の具体的な実施において、粒子は、生理学的ｐＨで、０．１５〜１．１の間、好ましくは０．３〜１．０の間、さらに好ましくは０．５〜１．０の間の高いポリマーかさ密度を示す。高いポリマーかさ密度は、密な網状構造のポリマー鎖の粒子内での存在を示す。理論に従うことを望むものではないが、この密な網状構造は、本発明に従う粒子中に存在する活性成分（ＡＰ）の外部媒体への拡散を遅らせて、そのため、その放出を遅らせることに寄与する。本発明に従う密集した粒子の驚くべき態様は、該粒子を構成するポリマー鎖の網状構造によって、活性成分（ＡＰ）の放出を遅らせることができるが、該粒子の中心でこの同じ活性成分（ＡＰ）を補足しないことである。したがって、本発明に従う輸送体は、活性成分（ＡＰ）の持続的放出と良好な生物学的利用能の両方を得ることができる。
【０１１８】
一部の場合、特に本発明に従う微粒子と強い親和性を有するペプチドまたはタンパク質の場合においては、放出を加速しおよび／またはその生物学的利用能を改善するため、ＡＰ放出速度を調節することが有利な場合がある。多くの試験の後、所定の極性を有するＰＥ１またはＰＥ２ポリマーが異極性のイオン性基および／またはヒドロキシエチルアミノ−置換基等の非イオン性基をも有する場合、タンパク質またはペプチドの放出を促進できることを出願人によって実証された。
【０１１９】
したがって、本発明の具体的な実施では、２つのポリマーＰＥ１またはＰＥ２のうち一つは、同時に、
１５〜５０モル％のグルタミン酸塩モノマー；
２０〜５５モル％のヒドロキシエチルアミノ−置換基等の非イオン性モノマー；
１０〜４０モル％の半中和ｐＨが８より大きいカチオン性基を有するモノマー；
３〜１５モル％の疎水基によって置換された非イオン性モノマー；
を備える。
【０１２０】
本発明の他の具体的な実施では、ＰＥ１またはＰＥ２ポリマーは、カチオン性であり、また、同時に、
０〜５モル％のグルタミン酸塩モノマー；
５０〜８５モル％のヒドロキシエチルアミノ−置換基等の非イオン性モノマー；
１０〜４０モル％の半中和ｐＨが８より大きいカチオン性基を有するモノマー；
３〜１５モル％の疎水基によって置換された非イオン性モノマー；
を備える。
【０１２１】
本発明の具体的な実施では、製剤中に存在するポリマー（ＰＥ１＋ＰＥ２）の全濃度は、特に活性成分（ＡＰ）が治療用タンパク質である場合に４〜１５ｍｇ／ｍｌの間である。この濃度の範囲内では、小口径の針、例えばゲージ２７、実際にはゲージ２９、更にはゲージ３１の針を介して、製剤を容易に注入することができる。例３および４は、かかる製剤を詳細に説明する。
【０１２２】
活性成分（ＡＰ）に関して、好ましくは、タンパク質、糖タンパク質、一つまたはそれ以上のポリアルキレングルコール鎖と結合したタンパク質［好ましくは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）：「ＰＥＧ化タンパク質」］、ペプチド、多糖類、リポ糖類、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびそれらの混合物から成る群から選択され、より好ましくは、エポエチンアルファ、エポエチンベータ、ダーベポエチン等のエリスロポエチン、ヘモグロビンラフィマー、それらの類似体もしくはそれらの誘導体；オキシトシン、バソプレシン、副腎皮質刺激ホルモン、上皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、造血を刺激する因子およびそれらの混合物の他、アルテプラーゼ、テネクテプラーゼ、第ＶＩＩ（ａ）因子または第ＶＩＩ因子等の血液因子；ヘモグロビン、シトクロム、アルブミン、プロラクチン、ルリベリンの他、ロイプロリド、ゴセレリン、トリプトレリン、ブセレリンまたはナファレリン等の黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）および類似体；ＬＨＲＨアンタゴニスト、ＬＨＲＨ競合体、ヒト、ブタまたはウシの成長ホルモン（ＧＨｓ）、成長ホルモン放出因子、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン、インターロイキンまたはそれらの混合体（ＩＬ−２，ＩＬ−１１，ＩＬ−１２）の他、インターフェロンアルファ、アルファ−２ｂ、ベータ、ベータ−１ａまたはガンマ等のインターフェロン；ガストリン、テトラガストリン、ペンタガストリン、ウロガストロン、セクレチン、カルシトニン、エンケファリン、エンドモルフィン、アンジオテンシン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）の他、ベクラペルミン、トラフェルミン、アンセスチムまたはケラチノサイト成長因子等の成長因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、ヘパリナーゼ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ｈＡＮＰ、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）、ＶＥＧ−Ｆ、組換えＢ型肝炎表面抗原（ｒＨＢｓＡｇ）、レニン、サイトカイン、ブラジキニン、バシトラシン、ポリミキシン、コリスチン、チロシジン、グラミシジン、エタネルセプト、イミグルセラーゼ、ドロトレコギンアルファ、シクロスポリンおよび合成類似体、並びに酵素、サイトカイン、抗体、抗原およびワクチンの製剤可能な修飾体および断片、リツキシマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、アダリムマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、エファリズマブおよびセツキシマブ等の抗体の部分群から選択される。
【０１２３】
他の活性成分は、多糖類（例えばヘパリン）およびオリゴ−またはポリヌクレオチド、ＤＮＡ，ＲＮＡ，ｉＲＮＡ，抗体および生細胞である。活性成分の他の分類は、中枢神経系で作用する医薬品物質、例えば、リスペリドン、ズクロペンチキソール、フルフェナジン、ペルフェナジン、フルペンチキソール、ハロペリドール、フルスピリレン、クエチアピン、クロザピン、アミスルプリド、スルピリド、ジプラシドン等を含む。
【０１２４】
実施態様によれば、活性成分は、アントラサイクリン、タキソイドもしくはカンプトテシンの群に属するタイプまたはロイプロリドもしくはシクロスポリン等のペプチドの群に属するタイプの疎水性、親水性または両親媒性の有機小分子、およびそれらの混合物である。
【０１２５】
本説明の意義の範囲内で、小分子は、特に非タンパク性小分子であり、例えばアミノ酸がない。
【０１２６】
他の実施態様によれば、活性成分は、有利には、以下に示す活性物質の群の内の少なくとも１種から選択される。アルコール依存症の治療薬、アルツハイマー病の治療薬、麻酔薬、末端肥大症の治療薬、鎮痛剤、抗ぜんそく薬、アレルギーの治療薬、抗癌剤、抗炎症薬、抗凝結剤および抗トロビン薬、抗けいれん剤、抗てんかん薬、抗糖尿病薬、制吐薬、抗緑内障薬、抗ヒスタミン剤、抗感染薬、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗パーキンソン薬、抗コリン作用薬、咳止め、炭酸脱水酵素阻害薬、心血管作動薬、脂質低下薬、抗不整脈剤、血管拡張剤、抗狭心症薬、降圧剤、血管保護剤、コリンエステラーゼ阻害剤、中枢神経系疾患の治療薬、中枢神経系の刺激剤、避妊薬、受精促進剤、子宮陣痛の誘導剤および阻害剤、嚢胞性線維症の治療薬、ドーパミン受容体作用薬、子宮内膜症の治療薬、勃起障害の治療薬、不妊治療の薬、消化器疾患の治療薬、免疫刺激剤および免疫抑制剤、記憶障害の治療薬、抗片頭痛薬、筋弛緩剤、ヌクレオシド類似体、骨粗鬆症の治療薬、副交感神経興奮薬、プロスタグランジン、精神刺激薬、鎮静剤、睡眠薬および精神安定剤、神経安定剤、抗不安薬、精神刺激薬、抗うつ剤、皮膚治療薬、ステロイドおよびホルモン、アンフェタミン、食欲抑制剤、ノンアナルジージクペインキラー（nonanalgesic painkiller）、バルビツール酸系催眠薬、ベンゾジアゼピン、下剤、向精神薬、およびこれらの製品の組み合わせである。
【０１２７】
他の態様によれば、本発明の対象は、少なくとも一つの活性成分を持続放出するための粒子を調製する方法であり、これらの粒子は、特に上述したものであり、該方法は、
１）ｐＨ３〜８のｐＨｍ値で、帯電状態で疎水側基（ＧＨ）を有する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド水溶液を準備する工程であって、前記第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）が、ｐＨ３〜８のうち少なくとも一つのｐＨｍ値で粒子のコロイド溶液を水中で自発的に形成することができる工程と、
２）少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を、工程１）において得た第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）に加える工程であって、前記活性成分が、前記第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド溶液の粒子と非共有結合している工程と、
３）第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）と異極性の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）を準備する工程であって、前記第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）は、前記ｐＨのうち少なくとも一つの前記ｐＨｍ値で溶液またはコロイド溶液を水中で形成し、但し、第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）がポリアミノ酸である場合、第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）はポリリシンもしくはポリエチレンイミンのいずれでもない工程と、
４）ｐＨｍと等しいｐＨで、工程２）において得られた活性成分（ＡＰ）と会合した粒子のコロイド溶液の形の第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）を、工程３）において得られた溶液またはコロイド溶液の形の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）と混合する工程と、
を備える。
【０１２８】
本発明の他の対象は、少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出するための粒子を調製する方法であり、これらの粒子は、特に上述したものの一部と一致しており、該方法は、
１）ｐＨ３〜８のｐＨｍ値で、帯電状態で疎水側基（ＧＨ）を有する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド水溶液を準備する工程であって、前記第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）が、ｐＨ３〜８のうち少なくとも一つのｐＨｍ値で粒子のコロイド溶液を水中で自発的に形成することができる工程と、
２）少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を、工程１）において得た第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）に加える工程であって、前記活性成分が、前記第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド溶液の粒子と非共有結合している工程と、
３）第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）と異極性で且つ疎水側基（ＧＨ）を有する第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）を準備する工程であって、前記第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）が、前記ｐＨのうち少なくとも一つの前記ｐＨｍ値で溶液またはコロイド溶液を水中で形成する工程と、
４）ｐＨｍと等しいｐＨで、工程２）において得られた活性成分（ＡＰ）と会合した粒子のコロイド溶液の形の第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）を、工程３）において得られた溶液またはコロイド溶液の形の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）と混合する工程と、
を備える。
【０１２９】
本発明に従う方法の必須の特徴は、活性成分（ＡＰ）を積んだ第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）の粒子のコロイド溶液をｐＨｍにて異極性の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）の溶液またはコロイド溶液と単純に混合することによって自発的に粒子を形成することである。
【０１３０】
タンパク質、ペプチドまたは小分子等の活性成分は、ポリアミノ酸型の第１ポリマー（ＰＥ１）と共に自発的に結合することができる。活性成分（ＡＰ）を有する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のナノ粒子の帯電は、活性成分（ＡＰ）の溶液を第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド溶液と単純に混合することによって行われる。この会合は、純粋に物理的であり、活性成分（ＡＰ）とポリマー（ＰＥ１）間の共有結合の形成を必要としない。理論に従うものではないが、この非特異的な会合は、ポリマー（ＰＥ１）と活性成分（ＡＰ）間の疎水的および／または静電気的な相互作用によって起こると考えられる。ＡＰをＰＥ１ナノ粒子に、ペプチドの性質を持つ特定の受容体または抗原／抗体もしくは酵素／基質型の特定の受容体を介して結合する必要がなく、多くの場合、望ましくないことさえあることに注意すべきである。
【０１３１】
本発明に従う方法の好ましい実施形態においては、得られた粒子の化学的な架橋の段階が与えられない。したがって、本発明に従う粒子は、化学的に架橋されないが、それでも長期間にわたって活性成分（ＡＰ）を放出する。この化学的な架橋がないことは、本発明に従う粒子の決定的な利点である。これは、化学的な架橋がないことによって、活性成分（ＡＰ）を有する粒子を架橋する間、活性成分（ＡＰ）の化学分解を避けることができるからである。これは、かかる化学的な架橋が一般に重合可能なものの活性化によって行われ、ＵＶ放射物またはグルタルアルデヒド等の変性剤を元来含むからである。
【０１３２】
有利には、本発明に従う方法は、乾燥粉末の形態で粒子を得るために、（例えば凍結乾燥または微粒化によって）得られた粒子の懸濁液を脱水する工程を備える。
【０１３３】
他の態様によれば、本発明の対象は、少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出するための製剤であり、該製剤は、上述の粒子の水性懸濁液または上述の方法により得た粒子の水性懸濁液を備える。
【０１３４】
また、本発明は、少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を長時間放出するための固体の製剤に関するものであり、該製剤は、
・少なくとも１つの活性成分（ＡＰ）を有する粒子に基づいた乾燥粉末の形態を備え、該粒子が、上述の粒子もしくは上述の方法によって得られた粒子であり、
・または、上述の水性懸濁液を備える製剤から得られた乾燥粉末の形態を備える。
【０１３５】
有利には、かかる固体製剤は、吸入投与および肺内投与に使用される。
【０１３６】
他の態様によれば、本発明の対象は、薬剤を調製する方法であり、特に、非経口、粘膜、皮下、筋内、皮内、経皮、腹腔内もしくは大脳内投与、または腫瘍への投与用、或いは経口、経鼻、肺、膣もしくは眼球経路による投与用の薬剤を調製する方法であり、前記方法は、上述の製剤の少なくとも一つを用いることから本質的になる。
【実施例】
【０１３７】
１）合成
ａ）疎水基を有するアニオン性高分子電解ポリマーＰＥ１−Ａの合成（合成起源のα−トコフェロールでグラフトしたポリグルタミン酸塩）
ポリ（α−Ｌ−グルタミン酸）１５ｇ（ポリオキシエチレン基準に対して約１６９００Ｄａに相当する重量であり、特許出願ＦＲ−Ａ−２ ８０１ ２２６に記載されるように、ＮＣＡ−ＧｌｕＯＭｅの重合と、その後の加水分解とによって得られる）を８０℃で加熱しながらジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２８８ｍｌ中に溶解させ、ポリマーを溶解させた。その溶液を１５℃に冷却し、あらかじめ８ｍｌのＤＭＦ中に溶解させた２．５ｇのＤ，Ｌ-α−トコフェロール（＞９８％、ＦＬｕｋａ（登録商標）から得られる）と、あらかじめ１ｍｌのＤＭＦ中に溶解させた２８０ｍｇの４−ジメチルアミノピリジンと、あらかじめ６ｍｌのＤＭＦ中に溶解させた１．６ｇのジイソプロピルカルボジイミドとを続けて加える。３時間攪拌した後、反応媒体を、１５％の塩化ナトリウムと塩酸を含む水１２００ｍｌ（ｐＨ２）に注入する。その後、沈澱したポリマーを濾過によって回収し、０．１Ｎの塩酸、水、およびジイソプロピルエーテルで洗浄する。その後、ポリマーを真空下４０℃のオーブン中で乾燥させる。およそ９０％の収率を得る。モル質量を立体排除クロマトグラフィーによって測定したところ、ポリオキシエチレン基準に対して１５５００である。グラフトしたトコフェロールのレベルをプロトンＮＭＲ分光法によって評価したところ、５．１モル％である。
【０１３８】
ｂ）アニオン性高分子電解ポリマーＰＥ１−Ｂの合成（ポリグルタミン酸ナトリウム）
特許出願ＦＲ−Ａ−２ ８０１ ２２６に記載のポリ（α−Ｌ−ポリグルタミン酸）の合成を適用する。
【０１３９】
モル質量を立体排除クロマトグラフィーによって測定したところ、ポリオキシエチレン基準に対して１６９００Ｄａである。
【０１４０】
ｃ）カチオン性高分子電解ポリマーＰＥ２−Ａの合成（合成起源のα−トコフェロールとヒスチジンアミドとでグラフトしたポリグルタミン酸塩）
【化９】
指数および基：ｍ＝１１、ｐ＝２０９、ｑ＝０、Ｔ＝Ｄ，Ｌ−α−トコフェリル（Ｔ）
【０１４１】
５％ラセミ体のα−トコフェロールでランダムにグラフトしたＤＰが２２０のポリ（グルタミン酸）３ｇをＮＭＰ３８ｍｌ中に８０℃で加熱することにより溶解させる。この溶液を０℃に冷却し、２．７４ｇのクロロギ酸イソブチルと、次いで２．２ｍｌのＮ−メチルモルホリンを加える。０℃の温度を維持しながら反応媒体を１０分間攪拌する。同時に、８．６５ｇのヒスチジンアミド・二塩酸塩を１０８ｍｌのＮＭＰ中に懸濁させる。その次に、１０．６ｍｌのトリエチルアミンを加え、得られた懸濁液を２０℃で数分間攪拌した後、０℃に冷却する。次いで、活性化したポリマーの溶液をヒスチジンアミド懸濁液に加える。反応媒体を０℃で２時間攪拌した後、２０℃で一晩攪拌する。その後、０．６２ｍｌの３５％ＨＣｌと、次いで８３ｍｌの水を加える。その後、得られた溶液をｐＨ３〜４の５００ｍｌの水に注ぎ込む。その後、その溶液を８分量の食塩水（０．９％のＮａＣｌ）と４分量の水に対してダイアフィルターで濾過する。その後、ポリマー溶液を３００ｍｌの体積に濃縮する（ポリマー濃度は１８ｍｇ／ｇである）。グラフトしたヒスチジンアミドの割合は、Ｄ２Ｏにて１ＨＮＭＲにより測定したところ、９５％である。
【０１４２】
ｄ）カチオン性高分子電解ポリマーＰＥ２−Ｂの合成（合成起源のα−トコフェロールとアルギニンとでグラフトしたポリグルタミン酸塩）
【化１０】
指数および基：Ｔ＝Ｄ，Ｌ−α−トコフェリル、ｐ＝ｓ＝１１、ｑ＝１９８、ｒ＝０
【０１４３】
５％ラセミ体のα−トコフェロールでランダムにグラフトしたＤＰが２２０のポリ（グルタミン酸）１０ｇをＮＭＰ１２５ｍｌ中に８０℃で溶解させる。この溶液を０℃に冷却し、８．７ｍｌのクロロギ酸イソブチルと、次いで７．３５ｍｌのＮ−メチルモルホリンを加える。この反応混合物を０℃で１５分間攪拌する。同時に、２４．６７ｇのアルギニンアミド・二塩酸塩を３０８ｍｌのＮＭＰ中に懸濁させ、１４．７ｍｌのトリエチルアミンを加える。得られた懸濁液を２０℃で数分間攪拌した後、０℃に冷却する。次いで、活性化したポリマーの乳濁液をこの懸濁液に加え、反応混合物を０℃で２時間攪拌した後、２０℃で一晩攪拌する。その次に、２．１ｍｌの３５％ＨＣｌ溶液と、次いで１００ｍｌの水とを加えた後、反応混合物を１．６ｌの水に滴下する。その後、得られた溶液を８分量の食塩水（０．９％）と４分量の水に対してダイアフィルターで濾過し、約２５０ｍｌの体積に濃縮する。グラフトしたアルギニンアミドの割合は、Ｄ２ＯにてプロトンＮＭＲにより測定したところ、９０％である。
【０１４４】
ｅ）カチオン性高分子電解ポリマーＰＥ２−Ｃの合成（合成起源のα−トコフェロールと、アルギニンと、エタノールアミンとでグラフトしたポリグルタミン酸塩）
【化１１】
指数および基：Ｔ＝Ｄ，Ｌ−α−トコフェリル、ｐ＝１１、ｑ＝８８、ｒ＝９９、ｓ＝２２
【０１４５】
５％ラセミ体のα−トコフェロールでランダムにグラフトしたＤＰが２２０のポリ（グルタミン酸）１０ｇをＮＭＰ１２５ｍｌ中に８０℃で溶解させる。この溶液を０℃に冷却し、９．１ｍｌのクロロギ酸イソブチルと、次いで７．７１ｍｌのＮ−メチルモルホリンを加える。この反応混合物を０℃で１５分間攪拌する。同時に、８．２ｇのアルギニンアミド・二塩酸塩を１０３ｍｌのＮＭＰ中に懸濁させ、９．３１ｍｌのトリエチルアミンを加える。更に、１．６ｍｌのエタノールアミンを加え、得られた懸濁液を２０℃で数分間攪拌した後、０℃に冷却する。次いで、活性化したポリマーの乳濁液をこの懸濁液に加え、反応混合物を０℃で２時間攪拌する。１．２ｍｌのエタノールアミンを加えた後、反応混合物を２０℃で一晩攪拌する。２．１ｍｌの３５％ＨＣｌ溶液と、次いで２００ｍｌの水とを加えた後、反応混合物を７００ｍｌの水に滴下し、ｐＨを７．４に調整する。得られた溶液を８分量の食塩水（０．９％）と４分量の水に対してダイアフィルターで濾過し、約２５０ｍｌの体積に濃縮する。グラフトしたアルギニンアミドとグラフトしたエタノールアミンの割合は、Ｄ２ＯにてプロトンＮＭＲにより測定したところ、それぞれ４０％と４５％である。
【０１４６】
ｆ）カチオン性高分子電解ポリマーＰＥ２−Ｄの合成（合成起源のα−トコフェロールと、アルギニンと、エタノールアミンとでグラフトしたポリグルタミン酸塩）
【化１２】
指数および基：Ｔ＝Ｄ，Ｌ−α−トコフェロール、ｐ＝１１、ｑ＝４８、ｒ＝１５０、ｓ＝１１
【０１４７】
５％ラセミ体のα−トコフェロールでランダムにグラフトしたＤＰが２２０のポリ（グルタミン酸）１０ｇをＮＭＰ１２５ｍｌ中に８０℃で溶解させる。この溶液を０℃に冷却し、８．７ｍｌのクロロギ酸イソブチルと、次いで７．３ｍｌのＮ−メチルモルホリンを加える。この反応混合物を０℃で１５分間攪拌する。同時に、４．６１ｇのアルギニンアミド・二塩酸塩を５８ｍｌのＮＭＰ中に懸濁させ、２．９ｍｌのトリエチルアミンを加える。更に、２．８ｍｌのエタノールアミンを加え、得られた懸濁液を２０℃で数分間攪拌した後、０℃に冷却する。次いで、活性化したポリマーの乳濁液をこの懸濁液に加え、反応混合物を０℃で４時間攪拌する。１．２ｍｌのエタノールアミンを加えた後、反応混合物を２０℃で一晩攪拌する。２．１ｍｌの３５％ＨＣｌ溶液を加えた後、反応混合物を７３０ｍｌの水に滴下し、ｐＨを７．４に調整する。得られた溶液を８分量の食塩水（０．９％）と４分量の水に対してダイアフィルターで濾過し、約３００ｍｌの体積に濃縮する。グラフトしたアルギニンアミドとグラフトしたエタノールアミンの割合は、Ｄ２ＯにてプロトンＮＭＲにより測定したところ、それぞれ２２％と６８％である。
【０１４８】
２）例１（比較）：疎水基を示さない高分子電解質の粒子の調製
（１）ポリマーＰＥ１−Ｂのコロイド溶液の調製
上述の合成ｂ）に従って得られたポリマーＰＥ１−Ｂを用いる。このポリマーは５．９８５に等しい半中和ｐＨを有する。
ポリマーＰＥ１−Ｂのコロイド溶液を水中に溶解させることで得、ＮａＯＨ溶液を加えることでｐＨを７．６３に調整する。必要量のＮａＣｌ水溶液を導入することによって、溶液のオスモル濃度を１００ｍＯｓｍに調整する。ポリマーＰＥ１−Ｂの濃度を８．３８ｍｇ／ｇに調整する。
【０１４９】
（２）タンパク質のポリマーＰＥ１−Ｂとの会合
濃縮された２．４ｍｇ／ｇのタンパク質ＩＦＮ−α（ＰＣ ＧＥＮ）を、先のポリマーＰＥ１−Ｂのコロイド溶液に加える。以下の特徴を有する会合が得られる。
【表１】
２５℃で一晩攪拌して会合を形成する。
【０１５０】
（３）ポリＬ−アルギニン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｐ７６３７）のコロイド溶液の調製
このポリマーは、９より大きい半中和ｐＨを有する。
まず、ＨＣｌ溶液でｐＨを０．９２に調整してポリ−Ｌ−アルギニンを水中に溶解し、次にＮａＯＨ溶液でｐＨを６．９１にまで戻し、４５℃で１５分間溶液を加熱することによって、ポリＬ−アルギニンのコロイド溶液を得る。ポリＬ−アルギニンのポリマー濃度を５．１３ｍｇ／ｇに調整する。
【０１５１】
（４）粒子を得るための混合
１．３７ｇのポリＬ−アルギニン溶液を１．０６ｇのＩＦＮ−α／ＰＥ１−Ｂ溶液へ４５℃で攪拌しながら滴下して加える。攪拌を４５℃で１５分間行う。次いで、攪拌を４℃で一晩行う。
以下、得られた粒子の特性を表Ｉに示す。
電荷比Ｚは、６．９５に等しいｐＨｍで測定した、イオン化したカチオン性基のモル数のイオン化したアニオン性基のモル数に対する比である。
粒径をＴテストに従って測定する。
【表２】
【０１５２】
（５）タンパク質のカプセル化の定量化
懸濁液を８０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、浮遊物中のＩＦＮ−αをヨーロッパ薬局方に記載の方法によって分析する（ＵＶ吸光度による比色分析）。
【表３】
実質的には、導入したタンパク質の３分の１が形成した微粒子中でカプセル化していない。この割合は、制御された放出をもたらすことができない。
【０１５３】
３）例２：疎水基を示す単一の高分子電解質（ＰＥ１）の粒子の調製
（１）ポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液の調製
上述の合成ａ）に従って得られたポリマーＰＥ１−Ａを用いる。このポリマーは５．４４５に等しい半中和ｐＨを有する。
ポリマーＰＥ１−Ａを水中に溶解することで、ポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液を得、ＮａＯＨ溶液を加えることでｐＨを７．５３に調整する。必要量のＮａＣｌ水溶液を導入することによって、溶液のオスモル濃度を１０１ｍＯｓｍに調整する。ポリマーＰＥ１−Ｂの濃度を８．４１ｍｇ／ｇに調整する。
【０１５４】
（２）タンパク質のポリマーＰＥ１−Ａとの会合
濃縮された２．４ｍｇ／ｇのタンパク質ＩＦＮ−αを先のポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液に加える。以下の特徴を有する会合が得られる。
【表４】
２５℃で一晩攪拌して会合を形成する。
【０１５５】
（３）ポリＬ−アルギニン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｐ７６３７）のコロイド溶液の調製
例１において説明した方法と同様にして、溶液を調製する。
【０１５６】
（４）粒子を得るための混合
１．２４ｇのポリＬ−アルギニン溶液を１．０７ｇのＩＦＮ−α／ＰＥ１−Ａ溶液へ４５℃で攪拌しながら滴下して加える。攪拌を４５℃で１５分間行う。次いで、攪拌を４℃で一晩行う。
以下、得られた粒子の特性を表ＩＩに示す。
電荷比Ｚを６．８８に等しいｐＨｍで測定する。
粒径をＴテストに従って測定する。
【表５】
【０１５７】
（５）タンパク質のカプセル化の定量化
懸濁液を８０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、浮遊物中のＩＦＮ−αをヨーロッパ薬局方に記載の方法によって分析する（ＵＶ吸光度による比色分析）。
【表６】
導入したタンパク質の全部が形成した微粒子中でカプセル化する。
【０１５８】
４）例３：ＩＦＮ−αを有する、ＰＥ１−ＡとＰＥ２−Ａとを基にした粒子の調製
４．１）例３．１：１０ｍｇ／ｇにほぼ等しいポリマーの最終濃度、約１に等しいＺ
（１）ポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液の調製
上述の合成ａ）に従って得られたポリマーＰＥ１−Ａを用いる。このポリマーは５．４４５に等しい半中和ｐＨを有する。
ポリマーＰＥ１−Ａを水中に溶解することで、ポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液を得、ＮａＯＨ溶液を加えることでｐＨを７．４５に調整する。必要量のＮａＣｌ水溶液を導入することによって、溶液のオスモル濃度を１０８ｍＯｓｍに調整する。ポリマーＰＥ１の濃度を２３．８８ｍｇ／ｇに調整する。
【０１５９】
（２）タンパク質のポリマーＰＥ１−Ａとの会合
濃縮された２．４ｍｇ／ｇのタンパク質ＩＦＮ−αおよび８９ｍＯｓｍのＮａＣｌを先のポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液に加える。以下の特徴を有する会合が得られる。
【表７】
２５℃で一晩攪拌して会合を形成する。その次に、会合をｐＨ５．０７に調整する。
【０１６０】
（３）ポリマーＰＥ２−Ａのコロイド溶液の調製
上述の合成ｃ）に従って得られたポリマーＰＥ２−Ａを用いる。このポリマーは６．０５に等しい半中和ｐＨを有する。
ポリマーＰＥ２−Ａを水中に溶解することで、ポリマーＰＥ２−Ａのコロイド溶液を得、ｐＨを５．１７に調整する。溶液のオスモル濃度を２８９ｍＯｓｍに調整し、ポリマーＰＥ２−Ａの濃度を５．７０ｍｇ／ｇに調整する。
【０１６１】
（４）粒子を得るための混合
４．９８ｇのＰＥ２−Ａ溶液を４．６１ｇのＩＦＮ−α／ＰＥ１−Ａ溶液へ攪拌しながら滴下して加える。攪拌を４℃で一晩行う。
以下、得られた粒子の特性を表ＩＩＩに示す。
電荷比Ｚを５．１７に等しいｐＨｍで測定する。
粒径をＴテストに従って測定する。
【表８】
【０１６２】
４．２）例３．２：５ｍｇ／ｇに等しいポリマーの最終濃度、約１０に等しいＺ
（１）ポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液の調製
上述の合成ａ）に従って得られたポリマーＰＥ１−Ａを用いる。
ポリマーＰＥ１を水中に溶解することで、ポリマーＰＥ１のコロイド溶液を得、ＮａＯＨ溶液を加えることでｐＨを７．５２に調整する。必要量のＮａＣｌ水溶液を導入することによって、溶液のオスモル濃度を１０８ｍＯｓｍに調整する。ポリマーＰＥ１の濃度を２０．２１ｍｇ／ｇに調整する。
【０１６３】
（２）タンパク質のポリマーＰＥ１−Ａとの会合
濃縮された２．４ｍｇ／ｇのタンパク質ＩＦＮ−αおよび８９ｍＯｓｍのＮａＣｌを先のポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液に加える。以下の特徴を有する会合が得られる。
【表９】
２５℃で一晩攪拌して会合を形成する。その後、会合をｐＨ４．８８に調整する。
【０１６４】
（３）ポリマーＰＥ２−Ａのコロイド溶液の調製
上述の合成ｃ）に従って得られたポリマーＰＥ２−Ａを用いる。
ポリマーＰＥ２−Ａを水中に溶解することで、ポリマーＰＥ２−Ａのコロイド溶液を得、ｐＨを５．０７に調整する。溶液のオスモル濃度を２８７ｍＯｓｍに調整し、ポリマーＰＥ２−Ａの濃度を８．１１ｍｇ／ｇに調整する。
【０１６５】
（４）粒子を得るための混合
５．１９ｇのＰＥ２−Ａ溶液を５．０２ｇのＩＦＮ−α／ＰＥ１−Ａ溶液へ攪拌しながら滴下して加える。攪拌を４℃で一晩行う。
以下、得られた粒子の特性を表ＩＶに示す。
電荷比Ｚを４．８１に等しいｐＨｍで測定する。
粒径をＴテストに従って測定する。
【表１０】
【０１６６】
４．３）例３．３：１０ｍｇ／ｇに等しいポリマーの最終濃度、約１０に等しいＺ
（１）ポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液の調製
上述の合成ａ）に従って得られたポリマーＰＥ１−Ａを用いる。
ポリマーＰＥ１−Ａを水中に溶解することで、ポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液を得、ＮａＯＨ溶液を加えることでｐＨを７．５２に調整する。必要量のＮａＣｌ水溶液を導入することによって、溶液のオスモル濃度を１０８ｍＯｓｍに調整する。ポリマーＰＥ１−Ａの濃度を２０．２１ｍｇ／ｇに調整する。
【０１６７】
（２）タンパク質のポリマーＰＥ１−Ａとの会合
濃縮された２．４ｍｇ／ｇのタンパク質ＩＦＮ−αおよび８９ｍＯｓｍのＮａＣｌを先のポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液に加える。以下の特徴を有する会合が得られる。
【表１１】
２５℃で一晩攪拌して会合を形成する。その後、会合をｐＨ５．０７に調整する。
【０１６８】
（３）ポリマーＰＥ２−Ａのコロイド溶液の調製
上述の合成ｃ）に従って得られたポリマーＰＥ２−Ａを用いる。
ポリマーＰＥ２−Ａを水中に溶解することで、ポリマーＰＥ２−Ａのコロイド溶液を得、ｐＨを５．０８に調整する。溶液のオスモル濃度を２８８ｍＯｓｍに調整し、ポリマーＰＥ２−Ａの濃度を１６．３７ｍｇ／ｇに調整する。
【０１６９】
（４）粒子を得るための混合
５．２５ｇのＰＥ２−Ａ溶液を５．１９ｇのＩＦＮ−α／ＰＥ１−Ａ溶液へ攪拌しながら滴下して加える。攪拌を４℃で一晩行う。
以下、得られた粒子の特性を表Ｖに示す。
電荷比Ｚを４．９５に等しいｐＨｍで測定する。
粒径をＴテストに従って測定する。
【表１２】
【０１７０】
５）例４：ＩＦＮ−αを有する、ＰＥ１−ＡとＰＥ２−Ｂとを基にした粒子の調製、５ｍｇ／ｇに等しいポリマーの最終濃度、Ｚ＝１
（１）ポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液の調製
上述の合成ａ）に従って得られたポリマーＰＥ１−Ａを用いる。
ポリマーＰＥ１−Ａを水中に溶解することで、ポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液を得、ＮａＯＨ溶液を加えることでｐＨを７．５２に調製する。必要量のＮａＣｌ水溶液を導入することによって、溶液のオスモル濃度を１０８ｍＯｓｍに調整する。ポリマーＰＥ１−Ａの濃度を２０．２１ｍｇ／ｇに調整する。
【０１７１】
（２）タンパク質のポリマーＰＥ１−Ａとの会合
濃縮された２．４ｍｇ／ｇのタンパク質ＩＦＮ−αおよび８９ｍＯｓｍのＮａＣｌを先のポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液に加える。以下の特徴を有する会合が得られる。
【表１３】
２５℃で一晩攪拌して会合を形成する。その後、会合をｐＨ６．８９に調整する。
【０１７２】
（３）ポリマーＰＥ２−Ｂのコロイド溶液の調製
上述の合成ｄ）に従って得られたポリマーＰＥ２−Ｂを用いる。このポリマーは９より大きい半中和ｐＨを有する。
ポリマーＰＥ２−Ｂを水中に溶解することで、ポリマーＰＥ２−Ｂのコロイド溶液を得、ｐＨを６．９８に調整する。溶液のオスモル濃度を２８８ｍＯｓｍに調整し、ポリマーＰＥ２−Ｂの濃度を６．３３ｍｇ／ｇに調整する。
【０１７３】
（４）粒子を得るための混合
４．０６ｇのＰＥ２−Ｂ溶液を４．５９ｇのＩＦＮ−α／ＰＥ１−Ａ溶液へ攪拌しながら滴下して加える。攪拌を４℃で一晩行う。
以下、得られた粒子の特性を表ＶＩに示す。
電荷比Ｚを６．８５に等しいｐＨｍで測定する。
粒径をＴテストに従って測定する。
【表１４】
【０１７４】
６）例５（比較）：ＩＦＮ−αを有し、ＰＥ１−Ａのみを基にした粒子の調製
上述の合成ａ）に従って得られたポリマーＰＥ１−Ａを用いる。
ポリマーＰＥ１−Ａを水中に溶解させることでポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液を得、ＮａＯＨ溶液を加えることでｐＨを７．５２に調整する。溶液のオスモル濃度を必要量のＮａＣｌ溶液を導入することで１０８ｍＯｓｍに調整する。ポリマーＰＥ１−Ａの濃度を２９．０５ｍｇ／ｇに調整する。
濃縮された２．４ｍｇ／ｇのタンパク質ＩＦＮ−αを先のポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液に加える。２５℃で一晩攪拌して会合を形成する。
以下、得られた粒子の特性を表ＶＩＩに示す。
粒径をＴ’テストに従って測定する。
【表１５】
【０１７５】
７）例２、３、４および５の生体外での結果
このために、本発明に従う粒子からの活性成分の放出をＬテストによって測定する。
Ｌテストにおける放出を時間と共に放出されるタンパク質の割合の形式で示す。
比較の例２の製剤は、ポリマーのうち一つのみが疎水基を有しており、２３時間後に放出されたタンパク質が１．６％という非常に弱い放出プロファイルを示す。
比較の例５の製剤は、ＰＥ１の粒子を２３ｍｇ／ｇで含んでおり、例３．１の粒子（ＰＥ１／ＰＥ２−Ａ、Ｚ＝１〜１０ｍｇ／ｇ）と類似のプロファイルを示す（それぞれ１０時間で９３％、４８時間で７２％である）。
例３．２の粒子（ＰＥ１／ＰＥ２−Ａ、Ｚ＝１０ｍｇ／ｇおよび５ｍｇ／ｇ）と例３．３の粒子（ＰＥ１／ＰＥ２−Ａ、Ｚ＝１０ｍｇ／ｇおよび１０ｍｇ／ｇ）の場合、実験の終わりでゼロにならない一定の放出流量の形成が観察され、それぞれ４８時間で注入したタンパク質の６５％および１９％を放出する。
例４の粒子（ＰＥ１／ＰＥ２−Ｂ、Ｚ＝１ｍｇ／ｇおよび５ｍｇ／ｇ）の場合、実験の終わりでゼロにならない一定の放出流量の形成が観察され、４８時間で注入したタンパク質の７％を放出する。
【０１７６】
８）例３、４および５の生体内での結果
４４匹のラットを８または１２匹の５グループに分け、並行して即時放出ＩＲ製剤もしくは比較の例５に対応する持続放出製剤または本発明の例３および４の製剤の一つを３００μｇ／ｋｇの投与量で受けた。
以下、薬物動態の結果を表ＶＩＩＩに示す。
【表１６】
【０１７７】
Ｃｍａｘは、すべての動物に対するタンパク質の平均最大血漿中濃度を示す。
Ｔｍａｘは、血漿中濃度が最大となる時間の中央値を示す。
ＡＵＣは、時間の関数として血漿中濃度の曲線下平均面積を示す。
Ｔ５０％ＡＵＣは、曲線下面積が合計値の５０％に到する平均時間を示す。
ＲＢＡは、検討中の製剤の曲線下面積のＩＦＮ ＩＲ製剤の曲線下面積に対する比を示す。
【０１７８】
すべての製剤は、ＩＲに対してＣｍａｘの低下を伴う持続放出プロファイルを示す。
例３．１の製剤（ＰＥ１／ＰＥ２−Ａ、Ｚ＝１〜１０ｍｇ／ｇ）を除いて、その放出プロファイルは、比較の例５の製剤に近く、終わりの傾きがより小さく、長期間にわたって残留する吸収を示す。
例３．３の製剤（ＰＥ１／ＰＥ２−Ａ、Ｚ＝１０ｍｇ／ｇおよび１０ｍｇ／ｇ）に関しては、一週間を超えるまでの放出に注目するべきである。
【０１７９】
９）例６：ＩＦＮ−αを有する、ＰＥ１−ＡおよびＰＥ２‐Ｃを基にした粒子の調製、５ｍｇ／ｇのポリマー最終濃度、Ｚ＝１
（１）ポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液の調製
上述の合成ａ）に従って得られたポリマーＰＥ１−Ａを用いる。
ポリマーＰＥ１−Ａを水中に溶解することでポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液を得、ＮａＯＨ溶液を加えることでｐＨを７．１５に調整する。溶液のオスモル濃度を必要量のＮａＣｌ水溶液を導入することで１４５ｍＯｓｍに調整する。ポリマーＰＥ１−Ａの濃度を３．１０ｍｇ／ｇに調整する。
【０１８０】
（２）治療用タンパク質のポリマーＰＥ１−Ａとの会合
濃縮された２．７ｍｇ／ｇのタンパク質ＩＦＮ−αおよび８９ｍＯｓｍのＮａＣｌを先のポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液に加える。以下の特徴を有する会合が得られる。
【表１７】
２５℃で一晩攪拌して会合を形成する。その後、会合をｐＨ７．０に調整する。
【０１８１】
（３）ポリマーＰＥ２−Ｃのコロイド溶液の調製
上述の合成ｅ）に従って得られたポリマーＰＥ２−Ｃを用いる。このポリマーは９より大きい半中和ｐＨを有する。
ポリマーＰＥ２−Ｃを水中で溶解させることでポリマーＰＥ２−Ｃのコロイド溶液を得、ｐＨを７．０４に調整し、２８８ｍＯｓｍに調整し、ＰＢＳ １４０ｍＯｓｍ中で７．９６ｍｇ／ｇに調整する。
【０１８２】
（４）粒子を得るための混合
１５．１４７ｇのＰＥ２−Ｃ溶液を１６．３７４ｇのＩＦＮ−α／ＰＥ１−Ａ溶液へ攪拌しながら滴下して加える。攪拌を４℃で一晩行う。
電荷比Ｚを７と等しいｐＨｍで測定する。
粒径をＴテストに従って測定する。
以下、得られた粒子の特性を表に示す。
【表１８】
【０１８３】
１０）例７：ＩＦＮ−αを有する、ＰＥ１−ＡおよびＰＥ２‐Ｄを基にした粒子の調製、５ｍｇ／ｇのポリマー最終濃度、Ｚ＝１
（１）ポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液の調製
上述の合成ａ）に従って得られたポリマーＰＥ１−Ａを用いる。
ポリマーＰＥ１−Ａを水中に溶解させることでポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液を得、ＮａＯＨ溶液を加えることでｐＨを７．０２に調整する。溶液のオスモル濃度を必要量のＮａＣｌ水溶液を導入することで１０１ｍＯｓｍに調整する。ポリマーＰＥ１−Ａの濃度を２．０ｍｇ／ｇに調整する。
【０１８４】
（２）タンパク質のポリマーＰＥ１−Ａとの会合
濃縮された２．７ｍｇ／ｇのタンパク質ＩＦＮ−αおよび８９ｍＯｓｍのＮａＣｌを先のポリマーＰＥ１−Ａのコロイド溶液に加える。以下の特徴を有する会合が得られる。
【表１９】
２５℃で一晩攪拌して会合を形成する。その後、会合をｐＨ７．０に調整する。
【０１８５】
（３）ポリマーＰＥ２−Ｄのコロイド溶液の調製
上述の合成ｆ）に従って得られたポリマーＰＥ２−Ｄを用いる。このポリマーは９より大きい半中和ｐＨを有する。
ポリマーＰＥ２−Ｄを水中に溶解させることでポリマーＰＥ２−Ｄのコロイド溶液を得、０．１ＮのＨＣｌまたは０．１ＮのＮａＯＨによってｐＨを７．０に調整する。ＰＥ２−Ｄのポリマー濃度を８．８２ｍｇ／ｇに調整する。
【０１８６】
（４）粒子を得るための混合
１．２ｇのＰＥ２−Ｃ溶液を１．２ｇのＩＦＮ−α／ＰＥ１−Ａ溶液に攪拌しながら滴下して加える。攪拌を４℃で一晩行う。
電荷比Ｚを７と等しいｐＨｍで測定する。
粒径をＴテストに従って測定する。
以下、得られた粒子の特性を表に示す。
【表２０】
【０１８７】
１１）例８：（比較）ＩＦＮ−αを有する、ＰＥ１−Ａ／ＰＥ２−Ｄと、ＰＥ１−Ａ／ＰＥ２−Ｃとを基にした粒子の放出速度
上述の例６および７に記載の調製によって得た粒子を上述の連続フローセル放出のＬテストにおいて比較する。以下の表は、得られた結果を示す。
【表２１】
【０１８８】
結論として、この例は、程度の差はあれ特に中性基および／またはアニオン性基を有するカチオン性ポリマーを選択すれば、ＡＰ放出速度を調節できることを示す。したがって、１２時間後、放出は、ＰＥ２−Ｃから得られた微粒子に関しては９．５％で、ＰＥ２−Ｄから得られた微粒子に関しては３１％である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出する粒子であって、該粒子は、
ａ）帯電状態で疎水側基（ＧＨ）を有する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）であって、好ましくは直鎖α−ポリアミノ酸であり、ｐＨ３〜８のうち少なくとも一つのｐＨｍ値で粒子のコロイド溶液を水中で自発的に形成する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）と、
ｂ）第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）と異極性である第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）であって、好ましくは直鎖α−ポリアミノ酸であり、前記ｐＨのうち少なくとも一つの前記ｐＨｍ値で溶液またはコロイド溶液を水中で形成する第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）と、
ｃ）第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド溶液の粒子と非共有で会合する少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）と、
を有し、但し、第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）がポリアミノ酸である場合、第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）はポリリシンもしくはポリエチレンイミンのいずれでもなく、
ｐＨｍと等しいｐＨで、活性成分（ＡＰ）と会合した粒子のコロイド溶液の形の第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）を、溶液またはコロイド溶液の形の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）と混合することで得られる、少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出する粒子。
【請求項２】
少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出する粒子であって、該粒子は、
ａ）帯電状態で疎水側基（ＧＨ）を有する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）であって、好ましくは直鎖α−ポリアミノ酸であり、ｐＨ３〜８のうち少なくとも一つのｐＨｍ値で粒子のコロイド溶液を水中で自発的に形成する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）と、
ｂ）第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）と異極性で且つ疎水側基（ＧＨ）を有する第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）であって、好ましくは直鎖α−ポリアミノ酸であり、前記ｐＨのうち少なくとも一つの前記ｐＨｍ値で溶液またはコロイド溶液を水中で形成する第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）と、
ｃ）第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド溶液の粒子と非共有で会合する少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）とを有し、
ｐＨｍと等しいｐＨで、活性成分（ＡＰ）と会合した粒子のコロイド溶液の形の第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）を、溶液またはコロイド溶液の形の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）と混合することで得られる、少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出する粒子。
【請求項３】
第１および第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ１，ＰＥ２）が、ポリアミノ酸またはそれらの製剤可能な塩の一つであり、その主鎖は、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基およびそれら組み合わせから成る群から選択される残基から形成され、該残基の少なくとも一部が、少なくとも第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）に対して少なくとも一つの疎水基（ＧＨ）をグラフトすることによって修飾されている、請求項１または２に記載の粒子。
【請求項４】
高分子電解質ポリマー（ＰＥ１，ＰＥ２）の一つ、またはそれらの製剤可能な塩の一つが、以下の式（Ｉ）：
【化１】
（式（Ｉ）中、
・Ｒ１は、Ｈ、直鎖Ｃ２〜Ｃ１０もしくは分岐Ｃ３〜Ｃ１０アルキル、ベンジル、−Ｒ４−［ＧＨ］を示し、またはＲ１は、ＮＨと末端アミノ酸残基を形成し、
・Ｒ２は、Ｈ、直鎖Ｃ２〜Ｃ１０もしくは分岐Ｃ３〜Ｃ１０アシル基、ピログルタメート、または−Ｒ４−［ＧＨ］を示し、
・Ｒ４は、直接結合または１〜４のアミノ酸残基を基にした「スペーサ」を示し、
・Ａ１およびＡ２は、独立して−ＣＨ２−または−ＣＨ２−ＣＨ２−を示し、
・ｎ／（ｎ＋ｍ）は、モルグラフト度として定義され、その値は、ｐＨ７で２５℃の水中に溶解したポリマーがポリマー粒子のコロイド懸濁液を形成するのに十分に低く、
・ｎ＋ｍは１０〜１０００の範囲であり、好ましくは５０から３００の間であり、
・ＧＨは、６〜３０の炭素原子を有する疎水基を示し、または、
（ｉ）直鎖または分岐の、好ましくは直鎖Ｃ１〜Ｃ２０、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ１８アルキル、アシルまたはアルケニル、
（ｉｉ）一つまたはそれ以上のヘテロ原子を有し、好ましくは酸素および／または硫黄を有し、より好ましくは下記式：
【化２】
（式中、
Ｒ６０ラジカルは、直鎖または分岐の、好ましくは直鎖Ｃ１〜Ｃ２０、より好ましくはＣ２〜Ｃ１８アルキル、アシルまたはアルケニルラジカルであり、
Ｒ６１およびＲ６２ラジカルは、互いに同一または異なり、水素または、直鎖もしくは分岐の、好ましくは直鎖Ｃ１〜Ｃ２０、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ１８アルキル、アシル、またはアルケニルラジカルと一致し、
ｑ＝１〜１００である）の炭化水素基、
（ｉｉｉ）アリール、アラルキル、またはアルキルアリール、好ましくはアリール、
（ｉｖ）疎水性誘導体、好ましくはホスファチジルエタノールアミノ−ラジカル、または、オクチルオキシ−ラジカル、ドデシルオキシ−ラジカル、テトラデシルオキシ−ラジカル、ヘキサデシルオキシ−ラジカル、オクタデシルオキシ−ラジカル、９−オクタデセニルオキシ−ラジカル、トコフェリルオキシ−ラジカルもしくはコレステリルオキシ−ラジカルから選択されるラジカル、
からなるラジカルの群から選択される）と一致する、請求項３に記載の粒子。
【請求項５】
高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）またはその製剤可能な塩の一つは、以下の式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）：
【化３】
（式中、
・ＧＨは、６〜３０個の炭素原子を有する疎水基を示し、
・Ｒ３０は、直鎖Ｃ２〜Ｃ６アルキル基であり、
・Ｒ５０は、Ｃ２〜Ｃ６ジアミノ、ジアルコキシ、またはアルキル基であり、
・Ｒ４は、直接結合または１〜４のアミノ酸残基を基にした「スペーサ」を示し、
・Ａ１およびＡ２は、独立して−ＣＨ２−または−ＣＨ２−ＣＨ２−を示し、
・ｎ'＋ｍ'またはｎ''は、重合度として定義され、１０〜１０００の範囲であり、好ましくは５０〜３００の間である）の一つと一致する、請求項３に記載の粒子。
【請求項６】
高分子電解質ポリマー（ＰＥ１，ＰＥ２）の一つまたはそれらの製剤可能な塩の一つは、以下の式（Ｖ）：
【化４】
（式（Ｖ）中、
・Ｅは、独立して、
−ＮＨＲ基（ここで、Ｒは、Ｈ、直鎖Ｃ２〜Ｃ１０もしくは分岐Ｃ３〜Ｃ１０アルキルまたはベンジルを示す）、
次式：
【化５】
（式中：
Ｒ７は、ＯＨ、ＯＲ９またはＮＨＲ１０であり、
Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は、独立して、Ｈ、直鎖Ｃ２〜Ｃ１０もしくは分岐Ｃ３〜Ｃ１０アルキルまたはベンジルを示す）と一致する末端アミノ酸残基または末端アミノ酸誘導体、
を示し、
・Ｂは、直接結合、または二価、三価もしくは四価の結合基であり、好ましくは、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ１〜Ｃ５アルキル）−、アミノ酸（好ましくは天然アミノ酸）残基、ジオール残基、トリオール残基、ジアミン残基、トリアミン残基、アミノアルコール残基または１〜６の炭素原子を有するヒドロキシ酸残基から選択され、
・Ｄは、Ｈ、直鎖Ｃ２〜Ｃ１０もしくは分岐Ｃ３〜Ｃ１０アシル基またはピログルタメートを示し、
・ＧＨは、６〜３０個の炭素原子を有する疎水基を示し、
・Ｒ７０は、以下の基：
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｗ−ＮＨ３＋（ここで、ｗは２〜６の間であり、好ましくはｗが４である）、
−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ３＋、
−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ３＋、
−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｎ＋（ＣＨ３）３、
【化６】
（式中、−Ｒ１１は、−Ｈ、−ＣＯ２Ｈ、アルキルエステル（好ましくは−ＣＯＯＭｅおよび−ＣＯＯＥｔ）、−ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ３または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）２を示す）、
次式：
【化７】
（式中、Ｘは、酸素または−ＮＨ−で、−Ｒ１２は、Ｈ、直鎖Ｃ２〜Ｃ１０もしくは分岐Ｃ３〜Ｃ１０アルキルまたはベンジルで、−Ｒ１３は、−（ＣＨ２）４−ＮＨ３＋、−（ＣＨ２）３−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ３＋、−（ＣＨ２）３ＮＨ３＋である）のアミノ酸残基またはアミノ酸誘導体、
から選択されるラジカルを示し、
前記Ｒ７０基の対アニオンが、塩化物、硫酸塩、リン酸塩または酢酸塩、好ましくは塩化物であり、
・Ｒ９０は、ヒドロキシエチルアミノ−、アルキレングリコール残基またはポリオキシアルキレン残基であり、
・ｐ，ｑ，ｒおよびｓは、正の整数であり、
・（ｐ）／（ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は、疎水基ＧＨのモルグラフト度として定義され、２〜９９モル％の範囲であり、好ましくは５〜５０モル％の間であり、但し、各コポリマー鎖は、平均して、少なくとも３個の疎水性グラフトを有しており、
・（ｑ）／（ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は、カチオン性基のモルグラフト度として定義され、１〜９９モル％の範囲であり、
・（ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は、１０〜１０００の範囲であり、好ましくは３０〜５００の間でり、
・（ｒ）／（ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は、０〜９８モル％の範囲であり、
・（ｓ）／（ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は、０〜９８モル％の範囲である）と一致する、請求項３に記載の粒子。
【請求項７】
前記Ｒ４またはＢ基が、直接結合を示す、請求項４〜６のいずれかに記載の粒子。
【請求項８】
疎水基（ＧＨ）の全部または一部が、独立して、
・６〜３０個の炭素原子を有し、少なくとも一つのヘテロ原子（好ましくはＯおよび／またはＮおよび／またはＳ）および／または少なくとも一つの不飽和結合を有することができる直鎖または分岐アルコキシ、
・６〜３０個の炭素原子を有し、一つまたはそれ以上の環の炭素環を有し、任意に少なくとも一つの不飽和結合および／または少なくとも一つのヘテロ原子（好ましくはＯおよび／またはＮおよび／またはＳ）を有するアルコキシ、
・７〜３０個の炭素原子を有し、少なくとも一つの不飽和結合および／または少なくとも一つのヘテロ原子（好ましくはＯおよび／またはＮおよび／またはＳ）を有することができるアルコキシアリールまたはアリールオキシアルキル、
よりなるラジカルの群から選択される、請求項１〜７のいずれかに記載の粒子。
【請求項９】
疎水基（ＧＨ）は、それぞれが互いに独立して、下記式：
【化８】
（式中：
Ｒ５は、メチル（アラニン）、イソプロピル（バリン）、イソブチル（ロイシン）、ｓｅｃ−ブチル（イソロイシン）またはベンジル（フェニルアラニン）を示し、
Ｒ６は、６〜３０個の炭素原子を有する疎水性ラジカルを示し、
ｌは、０〜６の範囲である）の一価のラジカルを示す、請求項４〜８のいずれかに記載の粒子。
【請求項１０】
疎水基（ＧＨ）の疎水性ラジカルＲ６の全部または一部が、独立して、
・６〜３０個の炭素原子を有し、少なくとも一つのヘテロ原子（好ましくはＯおよび／またはＮおよび／またはＳ）および／または少なくとも一つの不飽和結合を有することができる直鎖または分岐アルコキシ、
・６〜３０個の炭素原子を有し、一つまたはそれ以上の環の炭素環を有し、任意に少なくとも一つの不飽和結合および／または少なくとも一つのヘテロ原子（好ましくはＯおよび／またはＮおよび／またはＳ）を有するアルコキシ、
・７〜３０個の炭素原子を有し、少なくとも一つの不飽和結合および／または少なくとも一つのヘテロ原子（好ましくはＯおよび／またはＮおよび／またはＳ）を有することができるアルコキシアリールまたはアリールオキシアルキル、
よりなるラジカルの群から選択される、請求項９に記載の粒子。
【請求項１１】
二つのポリマーＰＥ１またはＰＥ２のうち一つは、同時に、
１５〜５０モル％のグルタミン酸塩モノマー、
２０〜５５モル％のヒドロキシエチルアミノ−置換基等の非イオン性モノマー、
１０〜４０モル％の半中和ｐＨが８より大きいカチオン性基を有するモノマー、
３〜１５モル％の疎水基によって置換された非イオン性モノマー、
を備える、請求項１〜１０のいずれかに記載の粒子。
【請求項１２】
二つのポリマーＰＥ１またはＰＥ２のうち一つが、カチオン性であり、また、同時に、
０〜５モル％のグルタミン酸塩モノマー、
５０〜８５モル％のヒドロキシエチルアミノ−置換基等の非イオン性モノマー、
１０〜４０モル％の半中和ｐＨが８より大きいカチオン性基を有するモノマー、
３〜１５モル％の疎水基によって置換された非イオン性モノマー、
を備える、請求項１１に記載の粒子。
【請求項１３】
生理学的ｐＨで、Ｔテストにおいて測定した粒径が１〜１００ミクロンの間であることを示す、請求項１〜１２のいずれかに記載の粒子。
【請求項１４】
生理学的ｐＨで、０．１５〜１．１のかさ密度を示す、請求項１〜１３のいずれかに記載の粒子。
【請求項１５】
少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出する粒子を調製する方法であって、
前記粒子は、特に請求項１および３〜１４のいずれかに記載されたものであり、
１）ｐＨ３〜８のｐＨｍ値で、帯電状態で疎水側基（ＧＨ）を有する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド水溶液を準備する工程であって、前記第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）が、ｐＨ３〜８のうち少なくとも一つのｐＨｍ値で粒子のコロイド溶液を水中で自発的に形成することができる工程と、
２）少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を、工程１）において得た第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）に加える工程であって、前記活性成分が、前記第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド溶液の粒子と非共有結合している工程と、
３）第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）と異極性の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）を準備する工程であって、前記第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）は、前記ｐＨのうち少なくとも一つの前記ｐＨｍ値で溶液またはコロイド溶液を水中で形成し、但し、第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）がポリアミノ酸である場合、第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）はポリリシンもしくはポリエチレンイミンのいずれでもない工程と、
４）ｐＨｍと等しいｐＨで、工程２）において得られた活性成分（ＡＰ）と会合した粒子のコロイド溶液の形の第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）を、工程３）において得られた溶液またはコロイド溶液の形の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）と混合する工程と、
を備える方法。
【請求項１６】
少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出する粒子を調製する方法であって、
前記粒子は、特に請求項２〜１２のいずれかに記載されたものであり、
１）ｐＨ３〜８のｐＨｍ値で、帯電状態で疎水側基（ＧＨ）を有する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド水溶液を準備する工程であって、前記第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）が、ｐＨ３〜８のうち少なくとも一つのｐＨｍ値で粒子のコロイド溶液を水中で自発的に形成することができる工程と、
２）少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を、工程１）において得た第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）に加える工程であって、前記活性成分が、前記第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド溶液の粒子と非共有結合している工程と、
３）第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）と異極性で且つ疎水側基（ＧＨ）を有する第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）を準備する工程であって、前記第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）が、前記ｐＨのうち少なくとも一つの前記ｐＨｍ値で溶液またはコロイド溶液を水中で形成する工程と、
４）ｐＨｍと等しいｐＨで、工程２）において得られた活性成分（ＡＰ）と会合した粒子のコロイド溶液の形の第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）を、工程３）において得られた溶液またはコロイド溶液の形の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）と混合する工程と、
を備える方法。
【請求項１７】
少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出する製剤であって、請求項１〜１４のいずれかに記載の粒子、または、請求項１５〜１６のいずれかに記載の方法によって得られた粒子の水性懸濁液を有する製剤。
【請求項１８】
少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出する固体の製剤であって、
・少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を有する粒子に基づいた乾燥粉末の形態を備え、前記粒子が、請求項１〜１４のいずれかに記載の粒子、または請求項１５〜１６のいずれかに記載の方法によって得られた粒子であり、
・または、請求項１７に記載の製剤から得られた乾燥粉末の形態を備える固体の製剤。
【請求項１９】
特に、非経口、粘膜、皮下、筋内、皮内、経皮、腹腔内もしくは大脳内投与用、または腫瘍への投与用、或いは経口、経鼻、肺、膣もしくは眼球経路による投与用の薬剤を調製する方法であって、前記薬剤が請求項１７または１８に記載の製剤の少なくとも一つを用いることから本質的になる、方法。
【請求項１】
少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出する粒子であって、該粒子は、
ａ）帯電状態で疎水側基（ＧＨ）を有する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）であって、好ましくは直鎖α−ポリアミノ酸であり、ｐＨ３〜８のうち少なくとも一つのｐＨｍ値で粒子のコロイド溶液を水中で自発的に形成する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）と、
ｂ）第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）と異極性である第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）であって、好ましくは直鎖α−ポリアミノ酸であり、前記ｐＨのうち少なくとも一つの前記ｐＨｍ値で溶液またはコロイド溶液を水中で形成する第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）と、
ｃ）第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド溶液の粒子と非共有で会合する少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）と、
を有し、但し、第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）がポリアミノ酸である場合、第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）はポリリシンもしくはポリエチレンイミンのいずれでもなく、
ｐＨｍと等しいｐＨで、活性成分（ＡＰ）と会合した粒子のコロイド溶液の形の第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）を、溶液またはコロイド溶液の形の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）と混合することで得られる、少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出する粒子。
【請求項２】
少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出する粒子であって、該粒子は、
ａ）帯電状態で疎水側基（ＧＨ）を有する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）であって、好ましくは直鎖α−ポリアミノ酸であり、ｐＨ３〜８のうち少なくとも一つのｐＨｍ値で粒子のコロイド溶液を水中で自発的に形成する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）と、
ｂ）第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）と異極性で且つ疎水側基（ＧＨ）を有する第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）であって、好ましくは直鎖α−ポリアミノ酸であり、前記ｐＨのうち少なくとも一つの前記ｐＨｍ値で溶液またはコロイド溶液を水中で形成する第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）と、
ｃ）第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド溶液の粒子と非共有で会合する少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）とを有し、
ｐＨｍと等しいｐＨで、活性成分（ＡＰ）と会合した粒子のコロイド溶液の形の第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）を、溶液またはコロイド溶液の形の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）と混合することで得られる、少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出する粒子。
【請求項３】
第１および第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ１，ＰＥ２）が、ポリアミノ酸またはそれらの製剤可能な塩の一つであり、その主鎖は、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基およびそれら組み合わせから成る群から選択される残基から形成され、該残基の少なくとも一部が、少なくとも第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）に対して少なくとも一つの疎水基（ＧＨ）をグラフトすることによって修飾されている、請求項１または２に記載の粒子。
【請求項４】
高分子電解質ポリマー（ＰＥ１，ＰＥ２）の一つ、またはそれらの製剤可能な塩の一つが、以下の式（Ｉ）：
【化１】
（式（Ｉ）中、
・Ｒ１は、Ｈ、直鎖Ｃ２〜Ｃ１０もしくは分岐Ｃ３〜Ｃ１０アルキル、ベンジル、−Ｒ４−［ＧＨ］を示し、またはＲ１は、ＮＨと末端アミノ酸残基を形成し、
・Ｒ２は、Ｈ、直鎖Ｃ２〜Ｃ１０もしくは分岐Ｃ３〜Ｃ１０アシル基、ピログルタメート、または−Ｒ４−［ＧＨ］を示し、
・Ｒ４は、直接結合または１〜４のアミノ酸残基を基にした「スペーサ」を示し、
・Ａ１およびＡ２は、独立して−ＣＨ２−または−ＣＨ２−ＣＨ２−を示し、
・ｎ／（ｎ＋ｍ）は、モルグラフト度として定義され、その値は、ｐＨ７で２５℃の水中に溶解したポリマーがポリマー粒子のコロイド懸濁液を形成するのに十分に低く、
・ｎ＋ｍは１０〜１０００の範囲であり、好ましくは５０から３００の間であり、
・ＧＨは、６〜３０の炭素原子を有する疎水基を示し、または、
（ｉ）直鎖または分岐の、好ましくは直鎖Ｃ１〜Ｃ２０、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ１８アルキル、アシルまたはアルケニル、
（ｉｉ）一つまたはそれ以上のヘテロ原子を有し、好ましくは酸素および／または硫黄を有し、より好ましくは下記式：
【化２】
（式中、
Ｒ６０ラジカルは、直鎖または分岐の、好ましくは直鎖Ｃ１〜Ｃ２０、より好ましくはＣ２〜Ｃ１８アルキル、アシルまたはアルケニルラジカルであり、
Ｒ６１およびＲ６２ラジカルは、互いに同一または異なり、水素または、直鎖もしくは分岐の、好ましくは直鎖Ｃ１〜Ｃ２０、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ１８アルキル、アシル、またはアルケニルラジカルと一致し、
ｑ＝１〜１００である）の炭化水素基、
（ｉｉｉ）アリール、アラルキル、またはアルキルアリール、好ましくはアリール、
（ｉｖ）疎水性誘導体、好ましくはホスファチジルエタノールアミノ−ラジカル、または、オクチルオキシ−ラジカル、ドデシルオキシ−ラジカル、テトラデシルオキシ−ラジカル、ヘキサデシルオキシ−ラジカル、オクタデシルオキシ−ラジカル、９−オクタデセニルオキシ−ラジカル、トコフェリルオキシ−ラジカルもしくはコレステリルオキシ−ラジカルから選択されるラジカル、
からなるラジカルの群から選択される）と一致する、請求項３に記載の粒子。
【請求項５】
高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）またはその製剤可能な塩の一つは、以下の式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）：
【化３】
（式中、
・ＧＨは、６〜３０個の炭素原子を有する疎水基を示し、
・Ｒ３０は、直鎖Ｃ２〜Ｃ６アルキル基であり、
・Ｒ５０は、Ｃ２〜Ｃ６ジアミノ、ジアルコキシ、またはアルキル基であり、
・Ｒ４は、直接結合または１〜４のアミノ酸残基を基にした「スペーサ」を示し、
・Ａ１およびＡ２は、独立して−ＣＨ２−または−ＣＨ２−ＣＨ２−を示し、
・ｎ'＋ｍ'またはｎ''は、重合度として定義され、１０〜１０００の範囲であり、好ましくは５０〜３００の間である）の一つと一致する、請求項３に記載の粒子。
【請求項６】
高分子電解質ポリマー（ＰＥ１，ＰＥ２）の一つまたはそれらの製剤可能な塩の一つは、以下の式（Ｖ）：
【化４】
（式（Ｖ）中、
・Ｅは、独立して、
−ＮＨＲ基（ここで、Ｒは、Ｈ、直鎖Ｃ２〜Ｃ１０もしくは分岐Ｃ３〜Ｃ１０アルキルまたはベンジルを示す）、
次式：
【化５】
（式中：
Ｒ７は、ＯＨ、ＯＲ９またはＮＨＲ１０であり、
Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は、独立して、Ｈ、直鎖Ｃ２〜Ｃ１０もしくは分岐Ｃ３〜Ｃ１０アルキルまたはベンジルを示す）と一致する末端アミノ酸残基または末端アミノ酸誘導体、
を示し、
・Ｂは、直接結合、または二価、三価もしくは四価の結合基であり、好ましくは、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ１〜Ｃ５アルキル）−、アミノ酸（好ましくは天然アミノ酸）残基、ジオール残基、トリオール残基、ジアミン残基、トリアミン残基、アミノアルコール残基または１〜６の炭素原子を有するヒドロキシ酸残基から選択され、
・Ｄは、Ｈ、直鎖Ｃ２〜Ｃ１０もしくは分岐Ｃ３〜Ｃ１０アシル基またはピログルタメートを示し、
・ＧＨは、６〜３０個の炭素原子を有する疎水基を示し、
・Ｒ７０は、以下の基：
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｗ−ＮＨ３＋（ここで、ｗは２〜６の間であり、好ましくはｗが４である）、
−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ３＋、
−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ３＋、
−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｎ＋（ＣＨ３）３、
【化６】
（式中、−Ｒ１１は、−Ｈ、−ＣＯ２Ｈ、アルキルエステル（好ましくは−ＣＯＯＭｅおよび−ＣＯＯＥｔ）、−ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ３または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）２を示す）、
次式：
【化７】
（式中、Ｘは、酸素または−ＮＨ−で、−Ｒ１２は、Ｈ、直鎖Ｃ２〜Ｃ１０もしくは分岐Ｃ３〜Ｃ１０アルキルまたはベンジルで、−Ｒ１３は、−（ＣＨ２）４−ＮＨ３＋、−（ＣＨ２）３−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ３＋、−（ＣＨ２）３ＮＨ３＋である）のアミノ酸残基またはアミノ酸誘導体、
から選択されるラジカルを示し、
前記Ｒ７０基の対アニオンが、塩化物、硫酸塩、リン酸塩または酢酸塩、好ましくは塩化物であり、
・Ｒ９０は、ヒドロキシエチルアミノ−、アルキレングリコール残基またはポリオキシアルキレン残基であり、
・ｐ，ｑ，ｒおよびｓは、正の整数であり、
・（ｐ）／（ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は、疎水基ＧＨのモルグラフト度として定義され、２〜９９モル％の範囲であり、好ましくは５〜５０モル％の間であり、但し、各コポリマー鎖は、平均して、少なくとも３個の疎水性グラフトを有しており、
・（ｑ）／（ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は、カチオン性基のモルグラフト度として定義され、１〜９９モル％の範囲であり、
・（ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は、１０〜１０００の範囲であり、好ましくは３０〜５００の間でり、
・（ｒ）／（ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は、０〜９８モル％の範囲であり、
・（ｓ）／（ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ）は、０〜９８モル％の範囲である）と一致する、請求項３に記載の粒子。
【請求項７】
前記Ｒ４またはＢ基が、直接結合を示す、請求項４〜６のいずれかに記載の粒子。
【請求項８】
疎水基（ＧＨ）の全部または一部が、独立して、
・６〜３０個の炭素原子を有し、少なくとも一つのヘテロ原子（好ましくはＯおよび／またはＮおよび／またはＳ）および／または少なくとも一つの不飽和結合を有することができる直鎖または分岐アルコキシ、
・６〜３０個の炭素原子を有し、一つまたはそれ以上の環の炭素環を有し、任意に少なくとも一つの不飽和結合および／または少なくとも一つのヘテロ原子（好ましくはＯおよび／またはＮおよび／またはＳ）を有するアルコキシ、
・７〜３０個の炭素原子を有し、少なくとも一つの不飽和結合および／または少なくとも一つのヘテロ原子（好ましくはＯおよび／またはＮおよび／またはＳ）を有することができるアルコキシアリールまたはアリールオキシアルキル、
よりなるラジカルの群から選択される、請求項１〜７のいずれかに記載の粒子。
【請求項９】
疎水基（ＧＨ）は、それぞれが互いに独立して、下記式：
【化８】
（式中：
Ｒ５は、メチル（アラニン）、イソプロピル（バリン）、イソブチル（ロイシン）、ｓｅｃ−ブチル（イソロイシン）またはベンジル（フェニルアラニン）を示し、
Ｒ６は、６〜３０個の炭素原子を有する疎水性ラジカルを示し、
ｌは、０〜６の範囲である）の一価のラジカルを示す、請求項４〜８のいずれかに記載の粒子。
【請求項１０】
疎水基（ＧＨ）の疎水性ラジカルＲ６の全部または一部が、独立して、
・６〜３０個の炭素原子を有し、少なくとも一つのヘテロ原子（好ましくはＯおよび／またはＮおよび／またはＳ）および／または少なくとも一つの不飽和結合を有することができる直鎖または分岐アルコキシ、
・６〜３０個の炭素原子を有し、一つまたはそれ以上の環の炭素環を有し、任意に少なくとも一つの不飽和結合および／または少なくとも一つのヘテロ原子（好ましくはＯおよび／またはＮおよび／またはＳ）を有するアルコキシ、
・７〜３０個の炭素原子を有し、少なくとも一つの不飽和結合および／または少なくとも一つのヘテロ原子（好ましくはＯおよび／またはＮおよび／またはＳ）を有することができるアルコキシアリールまたはアリールオキシアルキル、
よりなるラジカルの群から選択される、請求項９に記載の粒子。
【請求項１１】
二つのポリマーＰＥ１またはＰＥ２のうち一つは、同時に、
１５〜５０モル％のグルタミン酸塩モノマー、
２０〜５５モル％のヒドロキシエチルアミノ−置換基等の非イオン性モノマー、
１０〜４０モル％の半中和ｐＨが８より大きいカチオン性基を有するモノマー、
３〜１５モル％の疎水基によって置換された非イオン性モノマー、
を備える、請求項１〜１０のいずれかに記載の粒子。
【請求項１２】
二つのポリマーＰＥ１またはＰＥ２のうち一つが、カチオン性であり、また、同時に、
０〜５モル％のグルタミン酸塩モノマー、
５０〜８５モル％のヒドロキシエチルアミノ−置換基等の非イオン性モノマー、
１０〜４０モル％の半中和ｐＨが８より大きいカチオン性基を有するモノマー、
３〜１５モル％の疎水基によって置換された非イオン性モノマー、
を備える、請求項１１に記載の粒子。
【請求項１３】
生理学的ｐＨで、Ｔテストにおいて測定した粒径が１〜１００ミクロンの間であることを示す、請求項１〜１２のいずれかに記載の粒子。
【請求項１４】
生理学的ｐＨで、０．１５〜１．１のかさ密度を示す、請求項１〜１３のいずれかに記載の粒子。
【請求項１５】
少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出する粒子を調製する方法であって、
前記粒子は、特に請求項１および３〜１４のいずれかに記載されたものであり、
１）ｐＨ３〜８のｐＨｍ値で、帯電状態で疎水側基（ＧＨ）を有する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド水溶液を準備する工程であって、前記第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）が、ｐＨ３〜８のうち少なくとも一つのｐＨｍ値で粒子のコロイド溶液を水中で自発的に形成することができる工程と、
２）少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を、工程１）において得た第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）に加える工程であって、前記活性成分が、前記第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド溶液の粒子と非共有結合している工程と、
３）第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）と異極性の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）を準備する工程であって、前記第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）は、前記ｐＨのうち少なくとも一つの前記ｐＨｍ値で溶液またはコロイド溶液を水中で形成し、但し、第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）がポリアミノ酸である場合、第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）はポリリシンもしくはポリエチレンイミンのいずれでもない工程と、
４）ｐＨｍと等しいｐＨで、工程２）において得られた活性成分（ＡＰ）と会合した粒子のコロイド溶液の形の第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）を、工程３）において得られた溶液またはコロイド溶液の形の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）と混合する工程と、
を備える方法。
【請求項１６】
少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出する粒子を調製する方法であって、
前記粒子は、特に請求項２〜１２のいずれかに記載されたものであり、
１）ｐＨ３〜８のｐＨｍ値で、帯電状態で疎水側基（ＧＨ）を有する第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド水溶液を準備する工程であって、前記第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）が、ｐＨ３〜８のうち少なくとも一つのｐＨｍ値で粒子のコロイド溶液を水中で自発的に形成することができる工程と、
２）少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を、工程１）において得た第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）に加える工程であって、前記活性成分が、前記第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）のコロイド溶液の粒子と非共有結合している工程と、
３）第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）と異極性で且つ疎水側基（ＧＨ）を有する第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）を準備する工程であって、前記第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）が、前記ｐＨのうち少なくとも一つの前記ｐＨｍ値で溶液またはコロイド溶液を水中で形成する工程と、
４）ｐＨｍと等しいｐＨで、工程２）において得られた活性成分（ＡＰ）と会合した粒子のコロイド溶液の形の第１高分子電解質ポリマー（ＰＥ１）を、工程３）において得られた溶液またはコロイド溶液の形の第２高分子電解質ポリマー（ＰＥ２）と混合する工程と、
を備える方法。
【請求項１７】
少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出する製剤であって、請求項１〜１４のいずれかに記載の粒子、または、請求項１５〜１６のいずれかに記載の方法によって得られた粒子の水性懸濁液を有する製剤。
【請求項１８】
少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を持続放出する固体の製剤であって、
・少なくとも一つの活性成分（ＡＰ）を有する粒子に基づいた乾燥粉末の形態を備え、前記粒子が、請求項１〜１４のいずれかに記載の粒子、または請求項１５〜１６のいずれかに記載の方法によって得られた粒子であり、
・または、請求項１７に記載の製剤から得られた乾燥粉末の形態を備える固体の製剤。
【請求項１９】
特に、非経口、粘膜、皮下、筋内、皮内、経皮、腹腔内もしくは大脳内投与用、または腫瘍への投与用、或いは経口、経鼻、肺、膣もしくは眼球経路による投与用の薬剤を調製する方法であって、前記薬剤が請求項１７または１８に記載の製剤の少なくとも一つを用いることから本質的になる、方法。
【図１】
【公表番号】特表２０１０−５２６０４０（Ｐ２０１０−５２６０４０Ａ）
【公表日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０４７５５（Ｐ２０１０−５０４７５５）
【出願日】平成２０年５月５日（２００８．５．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５５５０５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３５５６１
【国際公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【出願人】（５０５４３７３２１）フラメル・テクノロジーズ (14)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月５日（２００８．５．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５５５０５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３５５６１
【国際公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【出願人】（５０５４３７３２１）フラメル・テクノロジーズ (14)
【Ｆターム（参考）】
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