高分泌型ウミボタル類縁発光酵素のタンパク質
【課題】短時間に起こる細胞内のわずかな遺伝子転写活性の変化を高分解能に発光活性として測定ないしは可視化できる分泌効率の高い発光酵素をクローン化し、その分泌シグナルの特性を利用して転写活性を速やかに細胞外で測定できるレポータタンパク質のベクター系の作成及び利用をはかる。
【解決手段】上記課題を解決するためには、ウミボタル近縁種Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａから細胞内に留まる発光酵素量が一般のＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉの約１／１０である分泌効率の高い発光酵素を同定し、遺伝子発現検出ベクターを構築する。
【解決手段】上記課題を解決するためには、ウミボタル近縁種Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａから細胞内に留まる発光酵素量が一般のＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉの約１／１０である分泌効率の高い発光酵素を同定し、遺伝子発現検出ベクターを構築する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，細胞内にとどまることなく細胞外に効率良く分泌されるウミボタル発光酵素のタンパク質並びに該タンパク質をコードするＤＮＡ配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般の発光性甲殻類ウミボタルＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉは分泌性の発光酵素を持ち、そのウミボタル発光酵素のタンパク質のｃＤＮＡは既にクローン化されている。ここで発光酵素とは、発光酵素のタンパク質が細胞内で何らかの修飾を受けたものを含むものとする。上記一般のウミボタル発光酵素はウミボタル発光基質Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェリンと反応して最大発光波長４６０ｎｍの青色の光を発する。
【０００３】
上記一般のウミボタル発光酵素は細胞外に分泌される特徴をもつことから、クローン化されたｃＤＮＡをレポータ遺伝子として利用すると、細胞を破壊することなく遺伝子転写活性が測定（非特許文献１）できるために、有為であり、既に特許化がなされている（特許文献１及び特許文献２）。特許化されている各種の発光酵素のうち、分泌可能なものは上記一般のＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ発光酵素のみである。
【０００４】
この発光酵素を利用した報告には、画像解析システムを用いて細胞からの発光酵素の分泌を可視化した例（非特許文献２）および、哺乳類細胞に成長ホルモン遺伝子の転写活性領域を挿入したウミボタルレポータ遺伝子を導入し、生細胞における転写活性の変化を連続的に測定した例（非特許文献３）がある。
【０００５】
上記一般のＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ発光酵素は、そのタンパク質合成後、小胞体膜を経てゴルジ体へ移行する段階で糖鎖修飾等を受け成熟型となり分泌することが知られており、分泌効率は分泌シグナル配列及び糖修飾の程度に依存すると考えられている。上記一般のＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ発光酵素の分泌効率測定例では、例えば一般的に良く用いられるＮＩＨ３Ｔ３細胞においては、２４時間培養後に、生産された発光酵素の７％が、ＨｅＬａ細胞では７１％が分泌されず細胞内に留まっている（非特許文献４）。
【０００６】
創薬ではタンパク発現阻害剤や分泌阻害剤などの開発及び探索が重要であり、細胞内におけるターゲットタンパク質の遺伝子転写活性の変化を指標としてスクリーニングが行われている。阻害剤の効果に伴う遺伝子転写活性の変化を伝えるのがレポータ遺伝子の役目である。そのレポータ遺伝子からつくられるレポータタンパク質は、単に遺伝子のＯＮ／ＯＦＦを知らせるだけでなく、阻害剤効果の経時変化が解析できること（時間分解能が高いこと）やレポータタンパク質自体が阻害効果を持たない、或いは細胞内機能を撹乱しない（細胞毒性がない）などの特性を持つ事が要求される。高い時間分解能を達成し且つ細胞毒性がないレポータ遺伝子としては、細胞内で作られたレポータタンパク質が速やかに分泌されるか、代謝される必要がある。
【０００７】
上記一般のＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ発光酵素は、効率は低くとも分泌されることから、細胞外で転写活性の変化を速やかに測定できるが、細胞内に留まった大量のタンパク質は安定、且つ壊れにくく、速やかな代謝は期待できない。また、分子内に３４個のシステイン残基を持つことから、細胞内に留まったタンパクは回りの酸化還元状態に大きな影響を及ぼす可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際特許公開番号ＷＯ９０／０１５４２
【特許文献２】特公平３−３０６７８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｎａｇａｔａ，Ｓ．＆ Ｔｓｕｊｉ，Ｆ．Ｉ．，Ｖａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ：ａ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｅｎｚｙｍｅｆｏｒ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｇｅｎｅ９６，２５７−６２（１９９０）
【非特許文献２】Ｉｎｏｕｙｅ，Ｓ．，Ｏｈｍｉｙａ，Ｙ．，Ｔｏｙａ，Ｙ．＆ Ｔｓｕｊｉ，Ｆ．，Ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ８９，９５８４−７（１９９２）
【非特許文献３】Ｔａｎａｈａｓｈｉ，Ｙ．，Ｏｈｍｉｙａ，Ｙ．，Ｈｏｎｍａ，Ｓ．，Ｋａｔｓｕｎｏ，Ｙ．，Ｏｈｔａ，Ｈ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｈ．，Ｈｏｎｍａ，Ｋ．，Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ａ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ，Ｖａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８９，２６０−６（２００１）
【非特許文献４】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｎａｇａｔａ，Ｓ．＆ Ｔｓｕｊｉ，Ｆ．Ｉ．，Ｖａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ：ａ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｅｎｚｙｍｅ ｆｏｒ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｇｅｎｅ ９６，２５７−６２（１９９０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、短時間に起こる細胞内のわずかな遺伝子転写活性の変化を高分解能に発光活性として測定ないしは可視化できる分泌効率の高い発光酵素をクローン化し、その分泌シグナルの特性を利用して転写活性を速やかに細胞外で測定できるレポータタンパク質のベクター系の作成及び利用をしようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するため、上記一般のＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉのウミボタル近縁種ではあるが浮遊性の特徴をもち、採取の難しいＣｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａから細胞内に留まる発光酵素量が上記一般のＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉの約１／１０である分泌効率の高い発光酵素を同定し、遺伝子発現検出ベクターを構築し、本発明の完成に至った。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は，遺伝子の転写活性モニタータンパク質及びそれをコードする遺伝子、及び分泌シグナル配列を提供する。このモニタータンパク質は従来の発光酵素と比べ、数倍から数十倍の効率で分泌する特性を持ち、且つ同様の生物発光活性を有している。合成された発光酵素はリアルタイムに分泌されることから、遺伝子の転写活性のわずかな変化もモニターすることが可能となり、高い時間分解能を有するモニタータンパク質として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】哺乳類発現用ベクターｐｃＤＮＡ３のＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩサイトへ挿入した発現用プラスミドｐｃＤＮＡ−ＣＬを示す図である。
【図２】ＮＩＨ３Ｔ３とＨｅＬａ細胞夫々の形質転換体によるＣｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素の培地と細胞破砕上清の積算発光活性値との関係を夫々Ａ，Ｂのグラフで示す。
【図３】人肺腫細胞Ａ５４９の形質転換体によるＣｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素の分泌測定結果を示すグラフである。
【図４】Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素についてはＡで、一般のＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ発光酵素についてはＢで夫々発光スペクトルの強度を示すグラフである。
【図５】Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素を○でプロットし、一般のＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ発光酵素を●でプロットした熱安定性を示すグラフである。
【図６】Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素の３７℃における安定性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００１５】
本発明で明らかにされたＣｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素は、全体として上記一般のＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ発光酵素と８０％程度の相同性があるが、Ｎ末端配列約３０残基のアミノ酸配列に限れば相同性が５０％となる特徴的な配列を有している。本Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素遺伝子を哺乳類細胞に形質導入すると、合成された発光酵素は、効率良く細胞外に分泌され、細胞内に留まる発光酵素は上記一般のＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ発光酵素の約１／１０となり、従来の分泌効率を凌駕する分泌型発光酵素が得られた。
【００１６】
本発明におけるＤＮＡ配列とＤＮＡ配列を含むベクターおよびベクターによって形質転換された形質転換体は、１、２として、以下ようにして得ることができる。
１．Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ より作成されたｃＤＮＡライブラリーより上記一般のＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ発光酵素遺伝子をプローブとして相同性の高いＣ末端領域の一部の配列がクローン化できる。この部分配列をもとに、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用して、本発明のＤＮＡ配列をクローン化する。これら一連の操作は、市販のキットを用いて行うことができる。
２．本発明のＤＮＡ配列を哺乳類細胞での発現プロモータ領域を持つ市販のベクターに挿入して、このベクターを哺乳類細胞に形質導入する。遺伝子導入後の、培地の一部を取り出し、その発光活性を測定することで、発現プロモータの転写活性を評価することができる。これら一連の操作は、市販のキットを用いて行うことができる。
本発明では、Ｎ末端に高効率の分泌シグナルを持つＣｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素のタンパク質の構造を配列表に明らかにした。
【００１７】
本発明にかかるタンパク質は次のように書き表わされる。
１）配列番号１記載のアミノ酸配列を有する高分泌型発光酵素のタンパク質。
２）配列番号１記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠出、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列により表わされる、高分泌型発光酵素のタンパク質。
３）配列番号２記載のＤＮＡ配列又はその相補配列によりコードされる高分泌型発光酵素。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明実施についての具体例を列挙しさらに詳細に説明する。
【００１９】
実施例１
Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ ｃＤＮＡの構築及び塩基配列の決定について。
Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａは伊豆半島下田にて採集し、採集個体は液体窒素で固定後、ｃＤＮＡ作成まで−８０℃で保存した。全ＲＮＡはＩＳＯＧＥＮ（商品名・日本ジーン）を用いて抽出した。続いてＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄｔ３０（商品名・宝酒造）を用いｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ合成をＴｉｍｅｓａｖｅｒ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（商品名・アマシャムバイオサイエンス）で行った。
【００２０】
合成されたｃＤＮＡはλＺＡＰＩＩベクター（商品名・ストラタジーン）に４℃、１２時間の条件下で挿入した。ライゲーション後、ＧｉｇａＰａｃｋＩＩＩ（商品名・ストラタジーン）を用いてインビトロパッケージングを行い、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅへ形質導入し、２．３×１０５ｐｆｕ／ｍｌ（増幅後２．９×１０８ｐｆｕ／ｍｌ）のｃＤＮＡライブラリーを得る。
【００２１】
ｃＤＮＡクローンの同定と塩基配列の決定は以下のように行う。ｃＤＮＡライブラリーからの発光酵素ｃＤＮＡクローンの同定はプラークハイブリダイゼーション法によって行った。プラーク（８．０×１０４プラーク分）をナイロンメンブレンに写し取り、ろ紙上で１０分乾燥させた。変性溶液（０．５Ｍ水酸化ナトリウム，１５Ｍ塩化ナトリウム）を染み込ませたろ紙にメンブレンを置き、５分間変性させた後、中和溶液（１．０Ｍトリスヒドロキシアミノメタン−塩酸（ｐＨ７．５），１．５Ｍ塩化ナトリウム）を染み込ませたろ紙にメンブレンを置き、５分間中和を行った。次に、ろ紙に２×ＳＳＣ（０．１５Ｍクエン酸ナトリウム，１．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０））を染み込ませ、その上にメンブレンを置き、１５分放置し、最後にメンブレンに１２５ｍＪのＵＶを照射し、ＤＮＡのクロスリンクを行った。
【００２２】
プローブはウミボタルＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ発光酵素ＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩで切断したＤＮＡ断片にアルカリフォスタファーゼをラベルしたものを用いた。ハイブリダイゼーションは、５５℃、１２−１４時間、Ａｌｋｐｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ（商品名・アマシャムバイオサイエンス）中で行った。ハイブリダイゼーション後、メンブレンは１ｓｔ洗浄緩衝液（２Ｍ尿素，０．１％ドデシル硫酸ナトリウム，５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０），１５０ｍＭ塩化ナトリウム，１ｍＭ塩化マグネシウム）で５５℃、１０分間、２回洗浄した。その後、２ｎｄ洗浄緩衝液（５０ｍＭトリスヒドロキシアミノメタン−塩酸（ｐＨ１０），１００ｍＭ塩化ナトリウム，２ｍＭ塩化マグネシウム）で室温、５分間、２回洗浄を行った。
【００２３】
検出はＣＤＰ−ｓｔａｒ（商品名・アマシャムバイオサイエンス）を用いて行った。ポジティブプラークはすべて再スクリーニングを行い同定し、ＥｘＡｓｓｉｓｔヘルパーファージ（商品名・ストラタジーン）を用いｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔファージミドとして切り出した。挿入したｃＤＮＡの塩基配列決定は、ＢｉｇＤｙｅＴＭ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（商品名・アプライドバイオシステム）を用いて行った。
【００２４】
プラークハイブリダイゼーションではポリＡを含む発光酵素ＤＮＡの３’側を同定した。５’末端側のクローニングはＰＣＲで行った。プライマーはファージスクリーニングにより得られた３’側ポジティブクローンの配列から設計した（ＣＬ−１Ｒ）５’−ＴＴＧＡＡＣＴＴＧＡＣＧＡＣＣＡＧＡＧＣ−３’、（ＣＬ−２Ｒ）５’−ＧＴＡＧＡＴＧＧＡＡＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧ−３’およびベクタープライマーを用いた。１ｓｔＰＣＲはＣＬ−１ＲとＭ１３ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ−３’を用い、１サイクル：９４℃，２ｍｉｎ；３５サイクル：９４℃，３０ｓｅｃ；５５℃，１ｍｉｎ；７２℃，１ｍｉｎ ３０ｓｅｃ；１サイクル：７２℃７ｍｉｎの条件下で行った。２ｎｄＰＣＲはＣＬ−２Ｒと、Ｔ３ ｐｒｉｍｅｒ５’−ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ−３’を用いて、１ｓｔＰＣＲと同じ反応サイクルで行った。その結果、電気泳動により約１．４ｋｂｐのシングルバンドが確認された。
【００２５】
このフラグメントをプラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（商品名・インビトロジェン）へ挿入し配列の確認を行った。配列番号２にその全塩基配列を示した。
【００２６】
実施例２
哺乳類細胞用ベクターの作成について。
哺乳類細胞でのＣｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素発現用ベクターを作成するため、完全長発光酵素オープンリーディングフレーム部位をプライマー１（ＣＬ−Ｎ）５’−ＡＴＧＡＡＧＡＣＣＴＴＡＡＴＴＣＴＴＧＣ−３’とプライマー２（ＣＬ−Ｃ）５’−ＣＴＡＴＴＴＧＣＡＴＴＣＡＴＣＴＧＧＴＡＣ−３’を用い、１サイクル：９４℃，３ｍｉｎ；３５サイクル：９４℃，３０ｓｅｃ；５５℃，３０ｓｅｃ；７２℃，１ｍｉｎ；１サイクル：７２℃，７ｍｉｎの条件下でｃＤＮＡライブラリーよりＤＮＡの増幅を行い、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターに挿入した。続いて制限酵素ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで発光酵素ｃＤＮＡを切断後、哺乳類発現用ベクターｐｃＤＮＡ３（商品名・インビトロジェン社）のＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩサイトへ挿入した図１の発現用プラスミドｐｃＤＮＡ−ＣＬを作成した。
【００２７】
実施例３
ＮＩＨ３Ｔ３及びＨｅＬａ細胞の形質転換体によるＣｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素の分泌特性について。
【００２８】
図２にＣｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素の分泌特性を示した。ＮＩＨ３Ｔ３及びＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレートの１ウェルにつき４．０×１０４個をまき、８０％コンフルエント時にＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮ ＰＬＵＳ（商品名・インビトロジェン）を用いてｐｃＤＮＡ−ＣＬ ０．４μｇをＮＩＨ３Ｔ３及びＨｅＬａ細胞に形質導入した。
【００２９】
形質導入２時間後、リン酸塩を含む生理的食塩水（ＰＢＳ）で２度細胞洗浄を行い、無血清のＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（商品名・インビトロジェン）２ｍＬを加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で１９時間細胞培養を行った。培地を回収後、培地５０μｌに対し５０ｎＭ Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェリン溶液５０μｌを加え、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＰＳＮ ＡＢ−２２００（商品名・アトー）を用いて２０秒間の積算発光活性値を測定した。培地回収後の細胞はＰＢＳで２度洗浄し、２５０μｌのＰＢＳを加え、超音波破砕を行い、遠心分離後上清を回収し、細胞破砕上清５０μｌ中の積算発光活性値を測定した。
【００３０】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞とＨｃＬａ細胞内に留まるＣｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞で０．５％（図２Ａ）、ＨｅＬａ細胞でも１０％（図２Ｂ）であった。これは、Ｔｈｏｍｐｓｏｎらにより報告された上記一般のＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ発光酵素が細胞内に留まる量、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の７％、ＨｅＬａ細胞の７１％と比較し、分泌効率において格段に優れていた。
【００３１】
実施例４
人肺腫細胞Ａ５４９の形質転換体によるＣｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素の分泌測定について。
【００３２】
図３に人肺腫細胞Ａ５４９にｐｃＤＮＡ−ＣＬを形質導入した後のＣｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素の分泌結果を示した。
【００３３】
２４ウェルプレートの１ウェルにつき人肺腫細胞Ａ５４９を４．０×１０４個まき、８０％コンフルエント時にＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮ ＰＬＵＳ（商品名・インビトロジェン）を用いてｐｃＤＮＡ−ＣＬ ０．４μｇを人肺腫細胞Ａ５４９に形質導入した。形質導入２時間後に、細胞をＰＢＳで二度洗浄し、培地をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（商品名・インビトロジェン）１ｍＬに交換した。培地交換後、一定時間毎に１ウェルから１０μＬを採取し活性測定用試料とし、ウェルにはＯｐｔｉ−ＭＥＭを１０μＬ添加した。採取した活性測定用試料にＯｐｔｉ−ＭＥＭ ４０μＬを加え全量を５０μＬにし、これに５０ｎＭ Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェリン５０μＬを加え、２０秒間の積算発光活性値を測定した。その結果、３時間後には分泌されてくるＣｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素を測定できた。採取する培地の量を増やすことにより、分単位での活性測定も可能である。時間の経過にともない、積算発光活性値が指数関数的に大きくなるのは、Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素の培地への蓄積が原因である。
【００３４】
なお参考のため実施に際しての更に具体的な例を申し述べる。
Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素の発光スペクトルについて。
【００３５】
発光スペクトルは、Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ＡＢ１８５０（商品名・アトー株式会社）を用いて測定を行った。ＣＯＳ−７細胞にｐｃＤＮＡ−ＣＬを形質導入後、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（商品名・インビトロジェン社）を用い、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で２９時間培養を行った。その発光酵素を含む培地１μｌに０．５μＭ Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェリン溶液２０μＬを加え、１０秒間の計測により相対発光強度を測定し、図４のＡの４６０ｎｍに発光極大のあるスペクトルが得られた。これは図４のＢの上記一般のＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ発光酵素による発光スペクトルと一致した。
Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素の熱安定性について。
【００３６】
ＣＯＳ−７細胞を２４ウェルプレートの１ウェルにつき４．０×１０４個をまき、８０％コンフルエント時にＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮ ＰＬＵＳ（商品名・インビトロジェン）を用いてｐｃＤＮＡ−ＣＬ ０．４μｇを形質導入した。形質導入２時間後に、細胞をＰＢＳで二度洗浄し、培地をＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（商品名・インビトロジェン）２ｍＬに交換した。その後１９時間培養し、培地を取り出し５０ｍＭモプス緩衝液ｐＨ７．０で１００倍に希釈したサンプルを作成した。
【００３７】
サンプルは０，２０，３７，５０，６０℃の各温度で３０分間インキュベートし、５分間氷上に置き、その後、１．１６ｎＭ Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェリン１００μｌを加え、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＰＳＮ ＡＢ−２２００（商品名・アトー株式会社）を用いて２０秒間の積算発光活性量を測定した。
【００３８】
図５にＣｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素及び上記一般のＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ発光酵素の熱安定性を示した。いずれも０℃サンプルの積算発光活性量を１００％とした相対活性値で示してある。図５○のＣｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素は３７℃で３０分間インキュベート後も約７０％の活性を保っており、この安定性は図５に●で示す上記一般のＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ発光酵素とほぼ同じであった。
Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素の３７℃における安定性について。
【００３９】
ＣＯＳ−７細胞を２４ウェルプレートの１ウェルにつき４．０×１０４個をまき８０％コンフルエント時にＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮ ＰＬＵＳ（商品名・インビトロジェン）を用いてｐｃＤＮＡ−ＣＬ ０．４μｇを形質導入した。形質導入２時間後に、細胞をＰＢＳで二度洗浄し、培地をＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（商品名・インビトロジェン）２ｍＬに交換した。培地交換後、２９時間培養後の培地を回収しサンプルを作成した。
【００４０】
取り出したサンプルは更に３７℃で２９、５３時間インキュベート後、培地に５０ｎＭ Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェリンを添加し積算発光活性量を測定した。図６に２９時間培養直後の積算発光活性量を１００％とした相対活性値を示した。２９時間培養直後に得られた発光酵素の活性値が半減するのに約５０時間を要した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は，細胞内にとどまることなく細胞外に効率良く分泌されるウミボタル発光酵素のタンパク質並びに該タンパク質をコードするＤＮＡ配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般の発光性甲殻類ウミボタルＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉは分泌性の発光酵素を持ち、そのウミボタル発光酵素のタンパク質のｃＤＮＡは既にクローン化されている。ここで発光酵素とは、発光酵素のタンパク質が細胞内で何らかの修飾を受けたものを含むものとする。上記一般のウミボタル発光酵素はウミボタル発光基質Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェリンと反応して最大発光波長４６０ｎｍの青色の光を発する。
【０００３】
上記一般のウミボタル発光酵素は細胞外に分泌される特徴をもつことから、クローン化されたｃＤＮＡをレポータ遺伝子として利用すると、細胞を破壊することなく遺伝子転写活性が測定（非特許文献１）できるために、有為であり、既に特許化がなされている（特許文献１及び特許文献２）。特許化されている各種の発光酵素のうち、分泌可能なものは上記一般のＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ発光酵素のみである。
【０００４】
この発光酵素を利用した報告には、画像解析システムを用いて細胞からの発光酵素の分泌を可視化した例（非特許文献２）および、哺乳類細胞に成長ホルモン遺伝子の転写活性領域を挿入したウミボタルレポータ遺伝子を導入し、生細胞における転写活性の変化を連続的に測定した例（非特許文献３）がある。
【０００５】
上記一般のＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ発光酵素は、そのタンパク質合成後、小胞体膜を経てゴルジ体へ移行する段階で糖鎖修飾等を受け成熟型となり分泌することが知られており、分泌効率は分泌シグナル配列及び糖修飾の程度に依存すると考えられている。上記一般のＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ発光酵素の分泌効率測定例では、例えば一般的に良く用いられるＮＩＨ３Ｔ３細胞においては、２４時間培養後に、生産された発光酵素の７％が、ＨｅＬａ細胞では７１％が分泌されず細胞内に留まっている（非特許文献４）。
【０００６】
創薬ではタンパク発現阻害剤や分泌阻害剤などの開発及び探索が重要であり、細胞内におけるターゲットタンパク質の遺伝子転写活性の変化を指標としてスクリーニングが行われている。阻害剤の効果に伴う遺伝子転写活性の変化を伝えるのがレポータ遺伝子の役目である。そのレポータ遺伝子からつくられるレポータタンパク質は、単に遺伝子のＯＮ／ＯＦＦを知らせるだけでなく、阻害剤効果の経時変化が解析できること（時間分解能が高いこと）やレポータタンパク質自体が阻害効果を持たない、或いは細胞内機能を撹乱しない（細胞毒性がない）などの特性を持つ事が要求される。高い時間分解能を達成し且つ細胞毒性がないレポータ遺伝子としては、細胞内で作られたレポータタンパク質が速やかに分泌されるか、代謝される必要がある。
【０００７】
上記一般のＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ発光酵素は、効率は低くとも分泌されることから、細胞外で転写活性の変化を速やかに測定できるが、細胞内に留まった大量のタンパク質は安定、且つ壊れにくく、速やかな代謝は期待できない。また、分子内に３４個のシステイン残基を持つことから、細胞内に留まったタンパクは回りの酸化還元状態に大きな影響を及ぼす可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際特許公開番号ＷＯ９０／０１５４２
【特許文献２】特公平３−３０６７８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｎａｇａｔａ，Ｓ．＆ Ｔｓｕｊｉ，Ｆ．Ｉ．，Ｖａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ：ａ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｅｎｚｙｍｅｆｏｒ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｇｅｎｅ９６，２５７−６２（１９９０）
【非特許文献２】Ｉｎｏｕｙｅ，Ｓ．，Ｏｈｍｉｙａ，Ｙ．，Ｔｏｙａ，Ｙ．＆ Ｔｓｕｊｉ，Ｆ．，Ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ８９，９５８４−７（１９９２）
【非特許文献３】Ｔａｎａｈａｓｈｉ，Ｙ．，Ｏｈｍｉｙａ，Ｙ．，Ｈｏｎｍａ，Ｓ．，Ｋａｔｓｕｎｏ，Ｙ．，Ｏｈｔａ，Ｈ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｈ．，Ｈｏｎｍａ，Ｋ．，Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ａ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ，Ｖａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８９，２６０−６（２００１）
【非特許文献４】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｎａｇａｔａ，Ｓ．＆ Ｔｓｕｊｉ，Ｆ．Ｉ．，Ｖａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ：ａ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｅｎｚｙｍｅ ｆｏｒ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｇｅｎｅ ９６，２５７−６２（１９９０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、短時間に起こる細胞内のわずかな遺伝子転写活性の変化を高分解能に発光活性として測定ないしは可視化できる分泌効率の高い発光酵素をクローン化し、その分泌シグナルの特性を利用して転写活性を速やかに細胞外で測定できるレポータタンパク質のベクター系の作成及び利用をしようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するため、上記一般のＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉのウミボタル近縁種ではあるが浮遊性の特徴をもち、採取の難しいＣｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａから細胞内に留まる発光酵素量が上記一般のＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉの約１／１０である分泌効率の高い発光酵素を同定し、遺伝子発現検出ベクターを構築し、本発明の完成に至った。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は，遺伝子の転写活性モニタータンパク質及びそれをコードする遺伝子、及び分泌シグナル配列を提供する。このモニタータンパク質は従来の発光酵素と比べ、数倍から数十倍の効率で分泌する特性を持ち、且つ同様の生物発光活性を有している。合成された発光酵素はリアルタイムに分泌されることから、遺伝子の転写活性のわずかな変化もモニターすることが可能となり、高い時間分解能を有するモニタータンパク質として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】哺乳類発現用ベクターｐｃＤＮＡ３のＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩサイトへ挿入した発現用プラスミドｐｃＤＮＡ−ＣＬを示す図である。
【図２】ＮＩＨ３Ｔ３とＨｅＬａ細胞夫々の形質転換体によるＣｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素の培地と細胞破砕上清の積算発光活性値との関係を夫々Ａ，Ｂのグラフで示す。
【図３】人肺腫細胞Ａ５４９の形質転換体によるＣｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素の分泌測定結果を示すグラフである。
【図４】Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素についてはＡで、一般のＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ発光酵素についてはＢで夫々発光スペクトルの強度を示すグラフである。
【図５】Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素を○でプロットし、一般のＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ発光酵素を●でプロットした熱安定性を示すグラフである。
【図６】Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素の３７℃における安定性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００１５】
本発明で明らかにされたＣｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素は、全体として上記一般のＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ発光酵素と８０％程度の相同性があるが、Ｎ末端配列約３０残基のアミノ酸配列に限れば相同性が５０％となる特徴的な配列を有している。本Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素遺伝子を哺乳類細胞に形質導入すると、合成された発光酵素は、効率良く細胞外に分泌され、細胞内に留まる発光酵素は上記一般のＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ発光酵素の約１／１０となり、従来の分泌効率を凌駕する分泌型発光酵素が得られた。
【００１６】
本発明におけるＤＮＡ配列とＤＮＡ配列を含むベクターおよびベクターによって形質転換された形質転換体は、１、２として、以下ようにして得ることができる。
１．Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ より作成されたｃＤＮＡライブラリーより上記一般のＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ発光酵素遺伝子をプローブとして相同性の高いＣ末端領域の一部の配列がクローン化できる。この部分配列をもとに、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用して、本発明のＤＮＡ配列をクローン化する。これら一連の操作は、市販のキットを用いて行うことができる。
２．本発明のＤＮＡ配列を哺乳類細胞での発現プロモータ領域を持つ市販のベクターに挿入して、このベクターを哺乳類細胞に形質導入する。遺伝子導入後の、培地の一部を取り出し、その発光活性を測定することで、発現プロモータの転写活性を評価することができる。これら一連の操作は、市販のキットを用いて行うことができる。
本発明では、Ｎ末端に高効率の分泌シグナルを持つＣｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素のタンパク質の構造を配列表に明らかにした。
【００１７】
本発明にかかるタンパク質は次のように書き表わされる。
１）配列番号１記載のアミノ酸配列を有する高分泌型発光酵素のタンパク質。
２）配列番号１記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠出、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列により表わされる、高分泌型発光酵素のタンパク質。
３）配列番号２記載のＤＮＡ配列又はその相補配列によりコードされる高分泌型発光酵素。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明実施についての具体例を列挙しさらに詳細に説明する。
【００１９】
実施例１
Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ ｃＤＮＡの構築及び塩基配列の決定について。
Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａは伊豆半島下田にて採集し、採集個体は液体窒素で固定後、ｃＤＮＡ作成まで−８０℃で保存した。全ＲＮＡはＩＳＯＧＥＮ（商品名・日本ジーン）を用いて抽出した。続いてＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄｔ３０（商品名・宝酒造）を用いｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ合成をＴｉｍｅｓａｖｅｒ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（商品名・アマシャムバイオサイエンス）で行った。
【００２０】
合成されたｃＤＮＡはλＺＡＰＩＩベクター（商品名・ストラタジーン）に４℃、１２時間の条件下で挿入した。ライゲーション後、ＧｉｇａＰａｃｋＩＩＩ（商品名・ストラタジーン）を用いてインビトロパッケージングを行い、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅへ形質導入し、２．３×１０５ｐｆｕ／ｍｌ（増幅後２．９×１０８ｐｆｕ／ｍｌ）のｃＤＮＡライブラリーを得る。
【００２１】
ｃＤＮＡクローンの同定と塩基配列の決定は以下のように行う。ｃＤＮＡライブラリーからの発光酵素ｃＤＮＡクローンの同定はプラークハイブリダイゼーション法によって行った。プラーク（８．０×１０４プラーク分）をナイロンメンブレンに写し取り、ろ紙上で１０分乾燥させた。変性溶液（０．５Ｍ水酸化ナトリウム，１５Ｍ塩化ナトリウム）を染み込ませたろ紙にメンブレンを置き、５分間変性させた後、中和溶液（１．０Ｍトリスヒドロキシアミノメタン−塩酸（ｐＨ７．５），１．５Ｍ塩化ナトリウム）を染み込ませたろ紙にメンブレンを置き、５分間中和を行った。次に、ろ紙に２×ＳＳＣ（０．１５Ｍクエン酸ナトリウム，１．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０））を染み込ませ、その上にメンブレンを置き、１５分放置し、最後にメンブレンに１２５ｍＪのＵＶを照射し、ＤＮＡのクロスリンクを行った。
【００２２】
プローブはウミボタルＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ発光酵素ＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩで切断したＤＮＡ断片にアルカリフォスタファーゼをラベルしたものを用いた。ハイブリダイゼーションは、５５℃、１２−１４時間、Ａｌｋｐｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ（商品名・アマシャムバイオサイエンス）中で行った。ハイブリダイゼーション後、メンブレンは１ｓｔ洗浄緩衝液（２Ｍ尿素，０．１％ドデシル硫酸ナトリウム，５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０），１５０ｍＭ塩化ナトリウム，１ｍＭ塩化マグネシウム）で５５℃、１０分間、２回洗浄した。その後、２ｎｄ洗浄緩衝液（５０ｍＭトリスヒドロキシアミノメタン−塩酸（ｐＨ１０），１００ｍＭ塩化ナトリウム，２ｍＭ塩化マグネシウム）で室温、５分間、２回洗浄を行った。
【００２３】
検出はＣＤＰ−ｓｔａｒ（商品名・アマシャムバイオサイエンス）を用いて行った。ポジティブプラークはすべて再スクリーニングを行い同定し、ＥｘＡｓｓｉｓｔヘルパーファージ（商品名・ストラタジーン）を用いｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔファージミドとして切り出した。挿入したｃＤＮＡの塩基配列決定は、ＢｉｇＤｙｅＴＭ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（商品名・アプライドバイオシステム）を用いて行った。
【００２４】
プラークハイブリダイゼーションではポリＡを含む発光酵素ＤＮＡの３’側を同定した。５’末端側のクローニングはＰＣＲで行った。プライマーはファージスクリーニングにより得られた３’側ポジティブクローンの配列から設計した（ＣＬ−１Ｒ）５’−ＴＴＧＡＡＣＴＴＧＡＣＧＡＣＣＡＧＡＧＣ−３’、（ＣＬ−２Ｒ）５’−ＧＴＡＧＡＴＧＧＡＡＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧ−３’およびベクタープライマーを用いた。１ｓｔＰＣＲはＣＬ−１ＲとＭ１３ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ−３’を用い、１サイクル：９４℃，２ｍｉｎ；３５サイクル：９４℃，３０ｓｅｃ；５５℃，１ｍｉｎ；７２℃，１ｍｉｎ ３０ｓｅｃ；１サイクル：７２℃７ｍｉｎの条件下で行った。２ｎｄＰＣＲはＣＬ−２Ｒと、Ｔ３ ｐｒｉｍｅｒ５’−ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ−３’を用いて、１ｓｔＰＣＲと同じ反応サイクルで行った。その結果、電気泳動により約１．４ｋｂｐのシングルバンドが確認された。
【００２５】
このフラグメントをプラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（商品名・インビトロジェン）へ挿入し配列の確認を行った。配列番号２にその全塩基配列を示した。
【００２６】
実施例２
哺乳類細胞用ベクターの作成について。
哺乳類細胞でのＣｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素発現用ベクターを作成するため、完全長発光酵素オープンリーディングフレーム部位をプライマー１（ＣＬ−Ｎ）５’−ＡＴＧＡＡＧＡＣＣＴＴＡＡＴＴＣＴＴＧＣ−３’とプライマー２（ＣＬ−Ｃ）５’−ＣＴＡＴＴＴＧＣＡＴＴＣＡＴＣＴＧＧＴＡＣ−３’を用い、１サイクル：９４℃，３ｍｉｎ；３５サイクル：９４℃，３０ｓｅｃ；５５℃，３０ｓｅｃ；７２℃，１ｍｉｎ；１サイクル：７２℃，７ｍｉｎの条件下でｃＤＮＡライブラリーよりＤＮＡの増幅を行い、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターに挿入した。続いて制限酵素ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで発光酵素ｃＤＮＡを切断後、哺乳類発現用ベクターｐｃＤＮＡ３（商品名・インビトロジェン社）のＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩサイトへ挿入した図１の発現用プラスミドｐｃＤＮＡ−ＣＬを作成した。
【００２７】
実施例３
ＮＩＨ３Ｔ３及びＨｅＬａ細胞の形質転換体によるＣｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素の分泌特性について。
【００２８】
図２にＣｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素の分泌特性を示した。ＮＩＨ３Ｔ３及びＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレートの１ウェルにつき４．０×１０４個をまき、８０％コンフルエント時にＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮ ＰＬＵＳ（商品名・インビトロジェン）を用いてｐｃＤＮＡ−ＣＬ ０．４μｇをＮＩＨ３Ｔ３及びＨｅＬａ細胞に形質導入した。
【００２９】
形質導入２時間後、リン酸塩を含む生理的食塩水（ＰＢＳ）で２度細胞洗浄を行い、無血清のＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（商品名・インビトロジェン）２ｍＬを加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で１９時間細胞培養を行った。培地を回収後、培地５０μｌに対し５０ｎＭ Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェリン溶液５０μｌを加え、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＰＳＮ ＡＢ−２２００（商品名・アトー）を用いて２０秒間の積算発光活性値を測定した。培地回収後の細胞はＰＢＳで２度洗浄し、２５０μｌのＰＢＳを加え、超音波破砕を行い、遠心分離後上清を回収し、細胞破砕上清５０μｌ中の積算発光活性値を測定した。
【００３０】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞とＨｃＬａ細胞内に留まるＣｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞で０．５％（図２Ａ）、ＨｅＬａ細胞でも１０％（図２Ｂ）であった。これは、Ｔｈｏｍｐｓｏｎらにより報告された上記一般のＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ発光酵素が細胞内に留まる量、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の７％、ＨｅＬａ細胞の７１％と比較し、分泌効率において格段に優れていた。
【００３１】
実施例４
人肺腫細胞Ａ５４９の形質転換体によるＣｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素の分泌測定について。
【００３２】
図３に人肺腫細胞Ａ５４９にｐｃＤＮＡ−ＣＬを形質導入した後のＣｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素の分泌結果を示した。
【００３３】
２４ウェルプレートの１ウェルにつき人肺腫細胞Ａ５４９を４．０×１０４個まき、８０％コンフルエント時にＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮ ＰＬＵＳ（商品名・インビトロジェン）を用いてｐｃＤＮＡ−ＣＬ ０．４μｇを人肺腫細胞Ａ５４９に形質導入した。形質導入２時間後に、細胞をＰＢＳで二度洗浄し、培地をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（商品名・インビトロジェン）１ｍＬに交換した。培地交換後、一定時間毎に１ウェルから１０μＬを採取し活性測定用試料とし、ウェルにはＯｐｔｉ−ＭＥＭを１０μＬ添加した。採取した活性測定用試料にＯｐｔｉ−ＭＥＭ ４０μＬを加え全量を５０μＬにし、これに５０ｎＭ Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェリン５０μＬを加え、２０秒間の積算発光活性値を測定した。その結果、３時間後には分泌されてくるＣｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素を測定できた。採取する培地の量を増やすことにより、分単位での活性測定も可能である。時間の経過にともない、積算発光活性値が指数関数的に大きくなるのは、Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素の培地への蓄積が原因である。
【００３４】
なお参考のため実施に際しての更に具体的な例を申し述べる。
Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素の発光スペクトルについて。
【００３５】
発光スペクトルは、Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ＡＢ１８５０（商品名・アトー株式会社）を用いて測定を行った。ＣＯＳ−７細胞にｐｃＤＮＡ−ＣＬを形質導入後、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（商品名・インビトロジェン社）を用い、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で２９時間培養を行った。その発光酵素を含む培地１μｌに０．５μＭ Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェリン溶液２０μＬを加え、１０秒間の計測により相対発光強度を測定し、図４のＡの４６０ｎｍに発光極大のあるスペクトルが得られた。これは図４のＢの上記一般のＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ発光酵素による発光スペクトルと一致した。
Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素の熱安定性について。
【００３６】
ＣＯＳ−７細胞を２４ウェルプレートの１ウェルにつき４．０×１０４個をまき、８０％コンフルエント時にＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮ ＰＬＵＳ（商品名・インビトロジェン）を用いてｐｃＤＮＡ−ＣＬ ０．４μｇを形質導入した。形質導入２時間後に、細胞をＰＢＳで二度洗浄し、培地をＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（商品名・インビトロジェン）２ｍＬに交換した。その後１９時間培養し、培地を取り出し５０ｍＭモプス緩衝液ｐＨ７．０で１００倍に希釈したサンプルを作成した。
【００３７】
サンプルは０，２０，３７，５０，６０℃の各温度で３０分間インキュベートし、５分間氷上に置き、その後、１．１６ｎＭ Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェリン１００μｌを加え、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＰＳＮ ＡＢ−２２００（商品名・アトー株式会社）を用いて２０秒間の積算発光活性量を測定した。
【００３８】
図５にＣｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素及び上記一般のＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ発光酵素の熱安定性を示した。いずれも０℃サンプルの積算発光活性量を１００％とした相対活性値で示してある。図５○のＣｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素は３７℃で３０分間インキュベート後も約７０％の活性を保っており、この安定性は図５に●で示す上記一般のＶａｒｇｕｌａ ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ発光酵素とほぼ同じであった。
Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ ｎｏｃｔｉｌｕｃａ発光酵素の３７℃における安定性について。
【００３９】
ＣＯＳ−７細胞を２４ウェルプレートの１ウェルにつき４．０×１０４個をまき８０％コンフルエント時にＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮ ＰＬＵＳ（商品名・インビトロジェン）を用いてｐｃＤＮＡ−ＣＬ ０．４μｇを形質導入した。形質導入２時間後に、細胞をＰＢＳで二度洗浄し、培地をＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（商品名・インビトロジェン）２ｍＬに交換した。培地交換後、２９時間培養後の培地を回収しサンプルを作成した。
【００４０】
取り出したサンプルは更に３７℃で２９、５３時間インキュベート後、培地に５０ｎＭ Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェリンを添加し積算発光活性量を測定した。図６に２９時間培養直後の積算発光活性量を１００％とした相対活性値を示した。２９時間培養直後に得られた発光酵素の活性値が半減するのに約５０時間を要した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記１），２）または３）のＤＮＡ；
１）配列番号１記載のアミノ酸配列を有する高分泌型発光酵素のタンパク質をコードするＤＮＡ、
２）前記１）のタンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、高分泌型発光酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
３）配列番号２に記載のＤＮＡまたはその相補鎖。
【請求項２】
配列番号１記載のアミノ酸配列を有する高分泌型発光酵素のタンパク質をコードするＤＮＡである、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＤＮＡ配列を含むベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターによって形質転換された形質転換体。
【請求項５】
前記形質転換体が哺乳類細胞の形質転換体形質転換体である、請求項４に記載の形質転換体。
【請求項６】
下記１），２）または３）のタンパク質；
１）配列番号１記載のアミノ酸配列を有する高分泌型発光酵素のタンパク質。
２）配列番号１記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠出、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列により表わされる、高分泌型発光酵素のタンパク質。
３）配列番号２記載のＤＮＡ配列によりコードされる高分泌型発光酵素のタンパク質。
【請求項１】
下記１），２）または３）のＤＮＡ；
１）配列番号１記載のアミノ酸配列を有する高分泌型発光酵素のタンパク質をコードするＤＮＡ、
２）前記１）のタンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、高分泌型発光酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
３）配列番号２に記載のＤＮＡまたはその相補鎖。
【請求項２】
配列番号１記載のアミノ酸配列を有する高分泌型発光酵素のタンパク質をコードするＤＮＡである、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＤＮＡ配列を含むベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターによって形質転換された形質転換体。
【請求項５】
前記形質転換体が哺乳類細胞の形質転換体形質転換体である、請求項４に記載の形質転換体。
【請求項６】
下記１），２）または３）のタンパク質；
１）配列番号１記載のアミノ酸配列を有する高分泌型発光酵素のタンパク質。
２）配列番号１記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠出、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列により表わされる、高分泌型発光酵素のタンパク質。
３）配列番号２記載のＤＮＡ配列によりコードされる高分泌型発光酵素のタンパク質。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１０−２９２１６（Ｐ２０１０−２９２１６Ａ）
【公開日】平成２２年２月１２日（２０１０．２．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２５７６３１（Ｐ２００９−２５７６３１）
【出願日】平成２１年１１月１１日（２００９．１１．１１）
【分割の表示】特願２００２−３８２９９６（Ｐ２００２−３８２９９６）の分割
【原出願日】平成１４年１２月６日（２００２．１２．６）
【出願人】（０００１０１４６６）アトー株式会社 (7)
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月１２日（２０１０．２．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月１１日（２００９．１１．１１）
【分割の表示】特願２００２−３８２９９６（Ｐ２００２−３８２９９６）の分割
【原出願日】平成１４年１２月６日（２００２．１２．６）
【出願人】（０００１０１４６６）アトー株式会社 (7)
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
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